KR20180057610A - 브라큐리 결실 돌연변이체, 브라큐리 결실 돌연변이체를 인코딩하는 비-효모 벡터, 및 이들의 용도 - Google Patents

브라큐리 결실 돌연변이체, 브라큐리 결실 돌연변이체를 인코딩하는 비-효모 벡터, 및 이들의 용도 Download PDF

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더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
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Abstract

본 발명은 브라큐리 결실 돌연변이 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

브라큐리 결실 돌연변이체, 브라큐리 결실 돌연변이체를 인코딩하는 비-효모 벡터, 및 이들의 용도
본 발명은 미국 국립보건원(NIH) 국립암연구소(NCI)에 의해 프로젝트 번호 제N01 BC010937호 하에 정부 지원을 받아 완성되었다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 잠조
본원은 2015년 8월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/200,438호(이의 전체내용이 참고로 본원에 혼입됨)를 우선권 주장한다.
서열 목록
본원과 동일자에 제출된 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 전체내용이 참고로 본원에 혼입된다.
브라큐리(Brachyury) 유전자는 중배엽 형성의 저지를 특징으로 하는 마우스 발생 돌연변이체로부터 초기에 클로닝되었고[헤르만(Hermann) 등의 문헌 "Nature 1990; 343: 617-22"] 배엽형성 동안 중배엽 발생에 있어서 중요한 유전자로서 인식되어 왔다. 브라큐리는 T-박스(box) 전사 인자로 지정된, 전사 인자의 한 계열의 구성원이고; 이들 인자는 보존된 DNA-결합 도메인을 특징으로 한다[파파이오아누(Papaioannou) 등의 문헌 "Bioessays 1998; 20: 9-19"]. 이들 전사 인자는 척추동물에서 중배엽의 형성 및 조직에서 필수 역할을 담당한다[예를 들어, 에드워즈(Edwards) 등의 문헌 "Genome Res 1996; 6: 226-33"]. 발생 과정의 제어시 T-박스 단백질의 중요한 역할에 더하여, 이러한 계열의 몇몇 구성원은 암에서 조절되지 않는다. 예를 들어, 인간 Tbx2 유전자는 췌장 암 세포주에서 증폭되는 것으로 보고되었고[마흘라마키(Mahlamaki) 등의 문헌 "Genes Chromosomes Cancer 2002; 35: 353-8"], BRCA-1- 및 BRCA-2-돌연변이된 유방 종양에서 과발현된다[신클레어(Sinclair) 등의 문헌 "Cancer Res 2002; 62: 3587-91"]. 또한, Tbx3 발현은 특정 인간 유방암 세포주에서 증대되는 것으로 보여졌다[팬(Fan) 등의 문헌 "Cancer Res 2004; 64: 5132-9"]. 브라큐리의 발현은 또한 인간 기형암종 주에 존재하는 것으로 기록되었고: 생식세포 종양의 부속집합인 기형암종은 중배엽 분화에 대해[고크할레(Gokhale) 등의 문헌 "Cell Growth Differ 2000; 11: 157-62"] 및 척삭종에서[예를 들어, 보조빅(Vojovic) 등의 문헌 "J Pathol 2006; 209: 157-65"] 반응능(competence)을 갖는 배아 암종 세포이다. 브라큐리는 또한 다양한 인간 암종, 예컨대 유방, 폐, 결장, 전립선 및 간세포 암종에서 및 B-세포 기원의 악성종양, 예컨대 무엇 보다도, 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), B-세포 림프종 및 다발성 골수종에서 과발현된다.
암에 대한 면역치료학적 개입은 종양 세포에 대항하는 숙주 면역 반응을 유발할 수 있는 종양 항원의 식별에 의존한다. 양호한 표적은 악성 세포에 의해 선택적으로 발현되고, 또한 악성 변환 및/또는 종양 진행에 필수적인 분자이다. 암에 대해 효과적인 면역 반응, 예컨대 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도하는 시약에 대한 요구가 남아있다.
본 발명은 브라큐리 결실 돌연변이 폴리펩티드를 제공하고, 특별히, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 비-효모 벡터, 세포, 및 이의 조성물, 뿐만 아니라 사용 방법을 제공한다.
특별히, 본 발명은 효과량의 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 세포, 또는 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함함으로써 면역 반응을 유도하고, 이때 면역 반응이 브라큐리 특이적 CD4+ T 세포 반응을 포함하는, 브라큐리에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 효과량의 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 세포, 또는 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 수지상 세포를 폴리펩티드와 접촉시켜 특이적 항원 제시 세포를 생산하는 단계; 및 특이적 항원 제시 세포를 피험체에게 투여하여 면역 반응을 유도하고 암 세포의 성장을 저해하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암의 성장을 저해하는 방법을 제공한다.
도 1A 및 1B는 각각 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, Tri-Ad5, 및 Ad5[E1-, E2b-]-null을 마우스에게 백신접종한 이후의, IFN-γ- 및 IL-2-발현 비장세포에 대한 분석을 도시하는 그래프이다. C57B1/6 마우스(n = 5/그룹)에게 1010 VP(바이러스 입자)의 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리(흰색 막대), Ad5[E1-, E2b-]-CEA(회색 막대), Ad5[E1-, E2b-]-MUC1(흑색 막대) 또는 Tri-Ad5(각각 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1의 1 : 1 : 1 혼합물)(사선으로 빗금쳐진 막대)를 2 주 간격으로 3 회 백신접종하였다. 대조군에게 3 x 1010 VP의 아데노-null을 공급하였다(수평 줄무늬 막대). 비장세포를 최종 백신접종 후 14 일째 수집하고, IFN-γ-분비 세포(A) 또는 IL-2-분비 세포(B)에 대해 ELISPOT 검정으로 평가하였다. 양성 대조군을 위해, 비장세포를 콘카나발린(Concanavalin) A(Con A)에 노출시켰다. 데이터는 106 비장세포 당 스팟 형성 세포(SPF: spot forming cell)의 수로서 기록되었다. 오차 막대는 SEM을 도시한다. 칼럼 사이의 유의적인 차이(p < 0.05)는 p-값으로 보고되고, 유의적이지 않음은 ns이다.
도 2A 내지 2D는 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, Tri-Ad5, 및 Ad5[E1-, E2b-]-null로 백신접종한 이후의 CD8+ 및 CD4+ 및 다작용성 세포 집단에 대한 분석을 도시하는 그래프이다. C57B1/6 마우스(n = 5/그룹)에게 1010 VP(바이러스 입자)의 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리(흰색 막대), Ad5[E1-, E2b-]-CEA(회색 막대), Ad5[E1-, E2b-]-MUC1(흑색 막대) 또는 Tri-Ad5(각각 1010 VP(바이러스 입자)의 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1의 1 : 1 : 1 혼합물)(사선으로 빗금쳐진 막대)를 2 주 간격으로 3 회 백신접종하였다. 대조군에게 3 x 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-null을 공급하였다(수평 줄무늬 막대). 비장세포를 최종 백신접종 후 14 일째 수집하고, CD8α+(A) 및 CD4+(B) IFN-γ-발현 세포에 대해, 또는 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하는 CD8α+(C) 및 CD4+(D) 세포에 대해 FACS로 평가하였다. 양성 대조군을 위해, 비장세포를 콘카나발린 A(Con A)에 노출시켰다. 오차 막대는 SEM을 도시한다. 칼럼 사이의 유의적인 차이(p < 0.05)는 p-값으로 보고되고, 유의적이지 않음은 ns이다.
도 3A 및 3B는 Ad5[E1-, E2b-]-CEA 또는 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스에서의 혈청으로부터의 CEA 항체 활성을 도시하는 그래프이다. 1010 VP(바이러스 입자)의 Ad5[E1-, E2b-]-CEA(회색 막대), Tri-Ad5(사선으로 빗금쳐진 막대)로 3 회 또는 3 x 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-null(수평 줄무늬 막대)로 백신접종된 마우스에서 CEA IgG 수준은 ELISA로 결정되었다(A). MC38-CEA2 세포에 대한 보체-의존성 세포독성(CDC: Complement-dependent cytotoxicity)이 수행되었다(B). 오차 막대는 SEM을 도시한다. 칼럼 사이의 유의적인 차이(p < 0.05)는 p-값으로 보고되고, 유의적이지 않음은 ns이다.
도 4는 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 대 Tri-Ad5를 사용하여 MUC1-발현 종양의 면역치료법을 비교하는 그래프이다. C57B1/6 마우스(n = 7/그룹)의 왼쪽 옆구리에 피하로 106 MC-38-MUC1 세포를 접종하였다. 마우스에게 1010 VP(바이러스 입자)의 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 또는 Tri-Ad5(각각 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, 및 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리의 1 : 1 : 1 혼합물, 총 3 x 1010 VP)를 투여하였다. 마우스 대조군에게 3 x 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-null을 공급하였다(전이유전자가 없음). 종양 성장을 모니터링하고 부피를 계산하였다. (*)는 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 치료된 마우스가 대조 마우스에 비해 유의적으로 더 작은(p < 0.05) 종양을 가졌을 때의 날짜를 지시하고, (^)는 Tri-Ad5-치료된 마우스가 대조군 마우스에 비해 유의적으로 더 작은(p < 0.05) 종양을 가졌을 때의 날짜를 지시한다. 임의의 시점에서 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 대 Tri-Ad5-치료된 마우스 사이에 유의적인 차이는 존재하지 않았다(p > 0.1). 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
브라큐리(또한 "T-단백질"로서 공지됨)는 중배엽에서 전사되는 단백질이다. 전장 브라큐리 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다[또한 진뱅크(GENBANK: 등록상표) 수탁 번호 NP_003172 및 진뱅크(등록상표) 수탁 번호 NM_003181]. 작용물질 에피토프를 갖는 전장 브라큐리 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 브라큐리 단백질의 DNA 결합 활성이 돌연변이(예를 들어, 브라큐리 단백질의 자연적인 DNA 결합 활성을 감소시키거나 무효화시키기에 충분한 브라큐리 DNA 결합 영역의 결실, 치환, 삽입 또는 기타 변형)에 의해 감소되거나 무효화된, 임의의 변형을 포함하는 변형된 브라큐리 폴리펩티드를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 서열이 DNA 결합에 관여하는 25개 아미노산 단편(DNA 결합 도메인)을 결실하도록 변형된 브라큐리 결실 돌연변이체를 제공한다. DNA 결합 도메인은 서열번호 1 및 서열번호 2의 잔기 198 내지 222에 상응한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 브라큐리 결실 돌연변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 폴리펩티드이고, 이때 잔기 228은 Ser 또는 Val일 수 있다. 서열번호 3의 폴리펩티드는 브라큐리 결실 돌연변이체의 일예이고, 이때 아미노산 서열은 위치 198 내지 222의 결실에 의해 서열번호 1의 인간 브라큐리 단백질의 아미노산 서열과 상이하다(즉, 서열번호 1 또는 2의 위치 198 내지 222는 서열번호 3에 존재하지 않는다). 서열번호 3은 서열번호 1 또는 2의 위치 223 내지 435에 직접 축합되는 위치 1 내지 197로 구성된 폴리펩티드이다. 이러한 브라큐리 결실 돌연변이체는 서열번호 3의 브라큐리 단백질과 비교하여 DNA 결합 능력이 방해된다.
몇몇 실시태양에서, 브라큐리 결실 돌연변이 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 브라큐리 결실 돌연변이 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, N-말단 메티오닌이 없는 서열번호 3의 아미노산 서열, 및/또는 위치 177(각각 Asp 대 Gly), 위치 343(각각 Thr 대 Ser) 및 위치 384(각각 Asn 대 Asp)에서 치환된 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
폴리펩티드는 임의의 방법에 의해, 예컨대 폴리펩티드를 합성하거나, 세포에서 적절한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 발현시키고 세포로부터 폴리펩티드를 수거함으로써 제조될 수 있다. 이러한 방법의 조합이 또한 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 드 노보(de novo) 합성 방법 및 폴리펩티드의 재조합 생산 방법은 당분야에 공지되어 있다[예를 들어, 찬(Chan) 등의 문헌 "Fmoc Solid Phase Polypeptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005"; "Polypeptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000"; "Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000"; 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ld ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001"; 및 어수벨(Ausubel) 등의 문헌 "Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994" 참조].
폴리펩티드는 융합 단백질(예를 들어, 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가적인 활성 제제 및/또는 태그(tag)를 포함하는 융합 단백질)의 형태로 존재할 수 있다. 폴리펩티드 또한 담체에 연결될 수 있다. 일반적으로, 담체는 항원성 분자가 결합될 수 있는 면역원성 거대분자이다. 담체에 결합될 경우, 결합된 폴리펩티드는 더욱 면역원성이 된다. 결합된 분자의 면역원성을 증가시키고/시키거나 담체에 대한 항체의 더 높은 역가를 유발하는 담체가 선택되고, 이는 진단학적, 분석학적 및/또는 치료학적으로 유리하다. 담체로의 분자의 공유적인 연결은 향상된 면역원성 및 T 세포 의존성을 부여할 수 있다[포즈스게이(Pozsgay) 등의 문헌 "PNAS 96: 5194-97, 1999"; 리(Lee) 등의 문헌 " J. Immunol. 116: 1711-18, 1976"; 및 딘치스(Dintzis) 등의 문헌 "PNAS 73: 3671-75, 1976" 참조]. 유용한 담체로는 중합체성 담체가 포함되고, 이는 반응물질 잔기가 결합될 수 있는 하나 이상의 작용기를 함유하는 천연(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스로부터의 다당류, 폴리펩티드 또는 단백질), 반-합성 또는 합성 물질일 수 있다. 박테리아 생성물 및 바이러스성 단백질(예컨대 간염 B 표면 항원 및 코어 항원)은 또한 담체로서, 뿐만 아니라 고등 유기체로부터의 단백질, 예컨대 키홀 림펫((keyhole limpet) 헤모시아닌, 호스슈 크랩(horseshoe crab) 헤모시아닌, 에데스틴(edestin), 포유동물 혈청 알부민, 및 포유동물 면역글로불린으로서 사용될 수 있다. 적합한 담체로는, 제한되지 않지만, 간염 B 작은 외피(envelope) 단백질 HBsAg가 포함된다. 이러한 단백질은 응집물로 자가-조립되는 능력을 갖고 바이러스-유사 입자를 형성할 수 있다. HBsAg의 제조는 문서로 기록되어 있고, 예를 들어 유럽 특허공개 제EP-A-0 226 846호, 유럽 특허공개 제EP-A-0 299 108호 및 PCT 공개 제WO 01/117554호, 및 예를 들어, 티올라이스(Tiollais) 등의 문헌 "Nature, 317: 489, 1985"에 개시된 아미노산 서열, 및 유럽 특허 공개 제EP-A-0 278 940호, 및 PCT 공개 제WO 91/14703호를 참조한다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA, cDNA, 및/또는 RNA를 포함할 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 천연-발생되고, 합성되고/되거나 재조합체일 수 있다. 더욱이, 핵산은 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체[예를 들어, 이노신(inosine) 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 등]를 포함할 수 있다. 코딩 서열에서의 잠재성 돌연변이는 유전자 코드의 축중(degeneracy)(즉 중복)으로부터 야기되고, 이로써 하나 보다 더 많은 코돈이 동일한 아미노산 잔기를 인코딩할 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 로이신은 CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, 또는 TTG에 의해 인코딩될 수 있고; 세린은 TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, 또는 AGC에 의해 인코딩될 수 있으며; 아스파라긴은 AAT 또는 AAC에 의해 인코딩될 수 있고; 아스파르트산은 GAT 또는 GAC에 의해 인코딩될 수 있으며; 시스테인은 TGT 또는 TGC에 의해 인코딩될 수 있고; 알라닌은 GCT, GCC, GCA, 또는 GCG에 의해 인코딩될 수 있으며; 글루타민은 CAA 또는 CAG에 의해 인코딩될 수 있고; 티로신은 TAT 또는 TAC에 의해 인코딩될 수 있으며; 이소로이신은 ATT, ATC, 또는 ATA에 의해 인코딩될 수 있다. 표준 유전자 코드를 제시하는 표들을 다양한 출처에서 찾아볼 수 있다[예를 들어, 스트라이어(L. Stryer)의 문헌 "1988, Biochemistry, 3.sup.rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NY"].
핵산은 폴리펩티드를 단독으로 또는 융합 단백질의 일부로서 인코딩할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 핵산 및 세포로 핵산을 전달하고/하거나 세포에서 핵산을 발현시킬 수 있는 요소들을 포함하는 구성물의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 발현 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열과 상용가능한 조건하에 달성되도록 결찰된다. 발현 제어 서열로는, 제한되지 않지만, 적절한 프로모터(promoter), 인헨서(enhancer), 전사 종결자, 단백질-인코딩 유전자 전방의 개시 코돈(즉, ATG), 인트론(intron)을 위한 스플라이싱(splicing) 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하는 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지, 및 종결 코돈이 포함된다. 적합한 프로모터로는, 제한되지 않지만, SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 CMV 전초기 I 프로모터, 폭스바이러스(poxvirus) 프로모터, 30K 프로모터, 13 프로모터, sE/L 프로모터, 7.5K 프로모터, 40K 프로모터, 및 CI 프로모터가 포함된다. T DNA 백신은 미국 특허 제5,589,466호; 미국 특허 제5,973,972호(각각 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있다. 이들 출원에 기재된 전달 프로토콜(protocol)에 더하여, DNA를 전달하는 다른 방법이 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있다.
폴리펩티드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 시험관내 방법, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction), 전사-기초 증폭 시스템(TAS: transcription-based amplification system), 자활 서열 복제 시스템(3SR: self-sustained sequence replication system) 및 Qβ 레플리카아제 증폭 시스템(QB: Qβ replicase amplification 시스템)에 의해 클로닝되거나 증폭될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분자의 DNA 서열에 기초하여 cDNA의 중합효소 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다. 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법론은 당분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. PCR 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호; 물리스(Mullis) 등의 문헌[Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1987]; 및 에르리치(Erlich) 등의 문헌[PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 엄격한 하이브리드화 조건하에 원하는 폴리뉴클레오티드의 서열로부터 선택된 탐침자에 의해 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 선별함으로써 단리될 수 있다.
본 발명은 추가로 핵산을 포함하는 비-효모 벡터를 제공한다. 적합한 벡터의 예로는 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드), 박테리아성 벡터, 및 바이러스성 벡터, 예컨대 폭스바이러스, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관된 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 폴리오(polio) 바이러스, 알파바이러스(alphavirus), 바큘로바이러스(baculorvirus), 및 신드비스(Sindbis) 바이러스가 포함된다. 벡터가 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드)인 경우, 플라스미드는 키토산과 복합체를 형성할 수 있다.
박테리아성 벡터: 벡터는 박테리아성 벡터일 수 있고, 예컨대 리스테리아(Listeria) 또는 살모넬라(Salmonella) 벡터이다. 리스테리아는 그램-양성 바실러스이다. 리스테리아 속은 현재 7가지 종을 포함한다: 리스테리아 그레이(L, grayi), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 뮤레이(Listeria murrayi), 리스테리아 씨리게리(Listeria seeligeri), 및 리스테리아 웰쉬메리(Listeria welshimeri). 리스테리아 모노사이토게네스는 시험관내 유전자를 전달하는 벡터로서 사용된 세포내 박테리아이다.
살모넬라는 약 0.7 내지 1.5 ㎛의 직경, 2 내지 5 ㎛의 길이, 및 모든 방향으로 나눠진 편모(flagella)를 갖고(즉 주모성), 막대 형상이며, 그램-음성인, 비-포자 형성의 주로 운동성인 장내세균이다. 이들은 유기 원료를 사용하여 산화 및 환원 반응으로부터 에너지를 수득하는 화학유기영양체이고, 조건부 혐기성균이다. 살모넬라는, 플라스미드, 예컨대 절단된 tetA 유전자를 갖는 플라스미드를 숙주 세포에 포함함으로써, 치료학적 단백질을 위한 전달 벡터로서 사용될 수 있다. 약화된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)은 DNA 플라스미드, 예컨대, 제한되지 않지만, pIRES[인비트로겐(Invitrogen)]에 의해 형질전환될 수 있고, 폴리펩티드 및 단백질의 전달을 위한 담체로서 사용될 수 있다.
폭스바이러스: 벡터는 오르토폭스(orthopox), 아비폭스(avipox), 계두(fowlpox), 너구리 폭스, 토끼 폭스, 카프리폭스(capripox)(예를 들어, 염소 폭스 및 양 폭스), 레포리폭스(leporipox), 및 수이폭스(suipox)(예를 들어, 돈두)로 구성된 군으로부터 선택된 폭스바이러스일 수 있다. 아비폭스 바이러스의 예로는 계두, 비둘기 폭스, 카나리아 폭스(canarypox), 예컨대 ALVAC가 포함된다. 오르토폭스의 예로는 백시니아(vaccinia), 변형된 백시니아 앙카라(MVA: modified vaccinia Ankara), 와이어스(Wyeth), NYVAC, TROYVAC, 드라이-백스(Dry-Vax), POXVAC-TC[쉐링-플라우 코포레이션(Schering-Plough Corporation)], 및 이의 유도체가 포함된다. 예를 들어, 와이어스 균주의 유도체로는, 제한되지 않지만, 작용성 K1L 유전자가 결핍된 유도체가 포함된다.
발현을 위한 예시적인 폭스 바이러스성 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제6,165,460호에 기재된 바와 같다. 백시니아 바이러스 게놈은 당분야에 공지되어 있다. 이는 HIND F13L 영역, TK 영역, 및 HA 영역으로 구성된다. 재조합 백시니아 바이러스는 외인성 유전자 생성물의 발현을 위한 외인성 유전자를 혼입하기 위해 사용되었다[예를 들어, 퍼쿠스(Perkus) 등의 문헌 "Science 229: 981-984, 1985"; 카우프만(Kaufman) 등의 문헌 "Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991"; 모스(Moss)의 문헌 "Science 252: 1662, 1991" 참조]. 백스비(Baxby) 및 파오레티(Paoletti)의 문헌[Vaccine 10: 8-9, 1992]에는 카나리아 폭스 바이러스, 계두 바이러스 및 기타 조류 종을 비롯한 비-복제 폭스바이러스의 구성 및 벡터로서의 용도가 개시되어 있다. 수터(Sutter) 및 모스의 문헌(Moss)[Proc. Nat'l. Acad. Sci U.S.A. 89: 10847-10851, 1992] 및 수터 등의 문헌[Virology 1994]에는 벡터로서의 구성 및 용도, 벡터의 구성 및 용도에서의 비-복제 재조합 앙카라 바이러스(MVA, 변형된 백시니아 앙카라)가 개시되어 있다.
플라스미드: 플라스미드는 다수의 목표, 예컨대 조절된 높은 복사물 수를 달성하고 박테리아에서의 플라스미드 불안정성의 잠재적 원인을 방지하는 것, 및 인간 치료 용도와 상용가능한 플라스미드 선택을 위한 수단을 제공하는 것을 염두에 두고 고안되었다. 유전자 치료 플라스미드에 대한 2중 요건에 특별한 주의가 기울어져 왔다. 첫 번째로, 이들은 다량의 DNA가 생산되고 정제될 수 있도록 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서의 유지 및 발효에 적합해야 한다. 두 번째로, 이들은 인간 환자 및 동물에서 사용하기에 안전하고 적합해야 한다. 첫 번째 요건은 박테리아 발효 동안 비교적 쉽게 선택되고 안정하게 유지될 수 있는 높은 복사물 수의 플라스미드를 필요로 한다. 두 번째 요건은 요소들, 예컨대 선택가능한 표지(marker) 및 기타 코딩 서열에 대한 주의를 필요로 한다. 몇몇 실시태양에서 폴리펩티드를 인코딩하는 플라스미드는: (1) 높은 복사물 수의 복제 기원, (2) 선택가능한 표지, 예컨대, 제한되지 않지만, 카나마이신(kanamycin)에 의한 항생제 선택을 위한 네오(neo) 유전자, (3) 전사 종결 서열, 및 (4) 다양한 핵산 카세트(cassette)의 혼입을 위한 다중클로닝 자리; 및 (5) 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열로 구성된다.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 유도하기 위한 다수의 플라스미드 벡터가 당분야에 공지되어 있다. 이들로는, 제한되지 않지만, 미국 특허 제6,103,470호; 미국 특허 제7,598,364호; 미국 특허 제7,989,425호; 및 미국 특허 제6,416,998호에 개시된 벡터가 포함된다.
아데노바이러스 벡터: 브라큐리 단백질 또는 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하고 본원에 개시된 방법에서 사용되는 아데노바이러스(Ad) 벡터가 생산될 수 있다. 이러한 벡터는, 이의 복제 가능 형태, 복제 결실 형태, 무능력 형태, 및 아데노-연관된 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 벡터를 포함하여, 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터는 시험관내에서의 강한 발현, 탁월한 역가, 및 생체내에서의 분할 세포 및 비분할 세포를 형질도입하는 능력을 나타내는 것으로 공지되어 있다[히트(Hitt) 등의 문헌 "Adv in Virus Res 55: 479-505, 2000"]. 생체내 사용될 경우, 이들 벡터는 벡터 주쇄에 유발된 면역 반응에 기인하여 강하지만 일시적인 유전자 발현을 이끌어 낸다.
아데노바이러스성 벡터는 종종 브라큐리 단백질을 인코딩하는 핵산을 필수 바이러스 서열, 예컨대 아데노바이러스의 E1 영역에서 발견되는 서열 대신 또는 이의 중간에 삽입함으로써 구성된다[베르크너(Berkner)의 문헌 "BioTechniques, 6: 616-629, 1988"; 그라함(Graham) 등의 문헌 "Methods in Molecular Biology, 7: 109-128, Ed: Murcy, The Human Press Inc., 1991"]. 예를 들어, 결실 또는 삽입에 의한 필수적인 바이러스 유전자의 비활성화는 복제하는 아데노바이러스의 능력을 불능화시킨다. 세포 배양액에서 이러한 벡터를 번식시키기 위해, 결실된 유전자는 트랜스(trans)로 제공되어야 한다(예를 들어, E1 결실 벡터의 경우 E1A 및 E1B 단백질). 이들 복제-결함성 아데노바이러스는 이들의 바이러스 게놈으로부터 결실된 유전적 요소의 부속집합을 발현시킴으로써 복제-불능 바이러스를 보완하도록 유전자조작된 패키징(packaging) 세포에서 생산된다. 재조합 아데노바이러스 벡터에서 흥미로운 핵산, 예컨대 브라큐리 단백질을 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 잠재적 자리로는, 제한 없이, E1, E2, E3 및 E4 영역이 포함된다. 몇몇 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스성 벡터는 E1 영역이 결실되고 브라큐리 단백질 또는 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로 대체된 인간 아데노바이러스로부터 생산된다. 하나 이상의 그의 필수 유전자가 비활성화된, 생성된 바이러스 벡터는 복제 결함성이다[스태트포드-페리카우뎃(Statford-Perricaudet) 등의 문헌 "Human Gene Therapy, 1: 241-256, 1990"].
재조합 아데노바이러스 벡터는: (1) 벡터가 복제-결함성 Ad 비리온(virion) 내로 혼입될 수 있게 만드는 패키징 자리; 및 (2) 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 감염성 비리온 내로 혼입하기 위해 사용되는 다른 요소들로는 5' 및 3' Ad ITR이 포함되고; E2 및 E3 유전자는 벡터에 포함될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 바이러스 게놈의 결실된 E1A, E1B 또는 E3 영역에서 아데노바이러스 내로 삽입된다. 몇몇 실시태양에서, 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 야생형 아데노바이러스 유전자 생성물, 예컨대 E1a, E1b, E2, E3, E4를 발현하지 않는다. 몇몇 비제한적인 예에서, 비리온은 E1, E2A, E4 및 임의적으로 E3 유전자 영역의 기능을 보완하는 패키징 세포주와 함께 전형적으로 사용된다(예를 들어, 미국 특허 제5,872,005호, 제5,994,106호, 제6,133,028호 및 제6,127,175호 참조). 하나의 실시태양에서, 초기 1(E1), 초기 2(E2b), 및 초기 3(E3) 유전자의 영역이 결실된, 예로서 기재된 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 벡터 유전자 전달 플랫폼(platform)(Ad5[E1-, E2b-])이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 당분야에 공지된 기법을 사용하여 정제되고 제형화될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 패키징 세포주, 예컨대 인간 배아 신장 293("HEK-293" 또는 "293") 세포주[그라함(Graham) 등의 문헌 "J. Gen. Virol., 36: 59-72, 1977"] 또는 인간 배아 망막모세포("HER-911" 또는 "911") 세포주[팔록스(Fallaux) 등의 문헌 "Hum. Gene Ther., 7: 215-222, 1996"]는, 트랜스로 소실된 영역, 예컨대 E1 영역을 제공하여, 결실되거나 변형된 아데노바이러스성 벡터가 이러한 세포에서 복제될 수 있도록 한다. 적합한 아데노바이러스성 벡터가, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0193484호에 개시되어 있고, 이는 본원에 참고로 인용된다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 캡슐화하는 복제-결함성 아데노바이러스 비리온은 패키징 세포 및 패키징 기술을 사용하여 당분야에 공지된 표준 기법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제5,872,005호(본원에 참고로 그의 전체가 인용됨)에서 찾아볼 수 있다.
아데노-연관된 벡터(AAV): 재조합 AAV 벡터는 선택된 유전자이식 생성물의 발현 및 생산을 표적 세포에서 유도할 수 있음을 특징으로 한다. 이와 같이, 재조합 벡터는 표적 세포의 감염을 위한 물리적 구조 및 캡시드화(encapsidation)에 필수적인 AAV의 서열의 적어도 전부를 포함한다.
재조합 AAV(rAAV) 비리온은, 이들이 전사 개시 및 종결 서열을 비롯한 제어 서열, 및 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 전사 방향으로 작동적으로 연결된 성분으로서 포함하도록 구성될 수 있다. 이들 성분은 작용성 AAV 반전 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat) 서열에 의해 5' 및 3' 단부상에 결합된다. "작용성 AAV ITR 서열"은 ITR 서열이 AAV 비리온의 구출, 복제 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 작용함을 의미한다. 그러므로, 벡터에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없고, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나, AAV ITR은 이들이 작용성이기만 하면 임의의 몇몇 AAV 혈청형들로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터는 아데노-연관된 바이러스 혈청형으로부터 유래되는 벡터, 예컨대 제한 없이, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 등이다. 몇몇 실시태양에서, AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 야생형 REP 및 CAP 유전자가 결실되지만, 작용성의 측면(flanking) ITR 서열을 보유한다. 이들 벡터는 모두, 제한 없이, 브라큐리 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다.
알파바이러스: 폴리펩티드를 인코딩하는 알파바이러스가 제공되고 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 알파바이러스는 토가바이러스(Togavirus) 계열의 혈청학적으로 관련된 절지동물-매개 바이러스의 집합이다. 26종의 공지된 바이러스 및 바이러스 아형이 적혈구응집 저해(HI: hemagglutination inhibition) 검정에 의해 알파바이러스 속으로 분류되어 졌다. 간단히, HI 시험은 26종의 알파바이러스를 다음의 3가지 주요 복합체로 구분한다: 베네수엘라 뇌염(VE: Venezuelan encephalitis) 복합체, 셈리키 삼림(SF: Semliki Forest) 복합체, 및 서부 뇌염(WE: western encephalitis) 복합체. 또한, 4종의 추가적인 바이러스, 즉 동부 뇌염(EE: eastern encephalitis), 바마 삼림(Barmah Forest), 미델뷔르흐(Middelburg), 및 엔두무(Ndumu)는, HI 혈청학적 검정에 기초하여 개별적으로 분류된다. 적합한 알파바이러스의 대표적인 예로는 오라(Aura)[미국 균주 은행(ATCC: American Type Culture Collection) VR-368], 베바루(Bebaru) 바이러스(ATCC VR-600, ATCC VR-1240), 카바소우(Cabassou)(ATCC VR-922), 치쿤군야(Chikungunya) 바이러스(ATCC VR-64, ATCC VR-1241), 동부 말 뇌척수염 바이러스(ATCC VR-65, ATCC VR-1242), 포트 모간(Fort Morgan)(ATCC VR-924), 게타(Getah) 바이러스(ATCC VR-369, ATCC VR-1243), 카이질라가흐(Kyzylagach)(ATCC VR-927), 마야로(Mayaro)(ATCC VR-66), 마야로 바이러스(ATCC VR-1277), 미델뷔르흐(ATCC VR-370), 무캄보(Mucambo) 바이러스(ATCC VR-580, ATCC VR-1244), 엔두무(ATCC VR-371), 픽수나(Pixuna) 바이러스(ATCC VR-372, ATCC VR-1245), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373, ATCC VR-1246), 셈리키 삼림(ATCC VR-67, ATCC VR-1247), 신드비스(Sindbis) 바이러스(ATCC VR-68, ATCC VR-1248), 토네이트(Tonate)(ATCC VR-925), 트리니티(Triniti)(ATCC VR-469), 우나(Una)(ATCC VR-374), 베네수엘라 말 뇌척수염(ATCC VR-69), 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스(ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), 서부 말 뇌척수염(ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), 와타로아(Whataroa)(ATCC VR-926), 및 Y-62-33(ATCC VR-375)이 포함되고, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,843,723호를 참조한다.
몇몇 실시태양에서, 알파바이러스 벡터는 신드비스 바이러스이다. 몇몇 실시태양에서, 알파바이러스의 전사를 개시할 수 있는 5' 서열, 알파바이러스 비구조 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 바이러스 접합 영역(이는 하위게놈 단편의 바이러스 전사를 방지하도록 비활성화됨), 알파바이러스 RNA 중합효소 인식 서열, 및 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 알파바이러스 벡터 구성물이 이용된다. 비활성화된 바이러스 접합 영역을 갖는 알파바이러스 벡터 구성물은 하위게놈 단편을 전사하지 않아, 이들을 다양한 적용분야에 적합하도록 만든다.
몇몇 실시태양에서, 바이러스의 RNA의 합성을 시험관내에서 cDNA로부터 개시할 수 있는 5' 프로모터를 함유한 알파바이러스, 예컨대 신드비스 바이러스 구성물이 제공된다. 5' 프로모터는 진핵 및 원핵 프로모터 둘 다, 예컨대, 예를 들어, β-갈락토시다아제(galactosidase) 프로모터, trpE 프로모터, lacZ 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, SP6 프로모터, SV40 프로모터, CMV 프로모터, 및 MoMLV LTR을 포함한다. 이러한 서열의 대표적인 예로는 야생형 신드비스 바이러스의 뉴클레오티드 1-60, 및 보다 적게는 뉴클레오티드 150-210, tRNA 아스파라긴의 경우 뉴클레오티드 10-75[슐레진저(Schlesinger) 등의 미국 특허 제5,091,309호], 및 전사를 개시하는 다른 토가바이러스로부터의 5' 서열이 포함된다.
알파바이러스 벡터는 알파바이러스 비구조 단백질(NSP)을 인코딩하는 서열을 함유한다. 일예로서, 신드비스 바이러스의 경우 4가지 비구조 단백질, NSP1, NSP2, NSP3 및 NSP4가 존재하고, 이는 바이러스가 자가-복제를 할 수 있게 만드는 단백질을 인코딩한다. 비구조 단백질 1 내지 3(NSP1-NSP3)은 야생형 신드비스 바이러스의 뉴클레오티드 60 내지 5750에 의해 인코딩된다. 이들 단백질은 다단백질로서 생산되고, 이후 비구조 단백질 NSP1, NSP2, 및 NSP3. NSP4로 분할된다. 알파바이러스 벡터 구성물은 또한 비활성화된 바이러스 접합 영역을 포함하여, 하위게놈 단편의 바이러스 전사가 방지되도록 할 수 있다. 간단히, 알파바이러스의 바이러스 접합 영역은 하위게놈 mRNA의 전사 개시를 정상적으로 제어한다. 신드비스 바이러스의 경우, 정상적인 바이러스 접합 영역은 전형적으로 대략 뉴클레오티드 번호 7579에서 시작하고, 적어도 뉴클레오티드 번호 7612(가능하게는 그 이상)를 통해 지속된다(완전한 서열을 위해, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,843,723호를 참조한다).
알파바이러스 속의 몇몇 구성원은 "레플리콘(replicon)" 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 레플리콘 벡터는 임의의 수 개의 형식으로 이용될 수 있고, 예컨대 DNA 벡터 구성물, RNA 레플리콘 벡터, 및 재조합 레플리콘 입자이다(하기 참조). 이들은, 예를 들어, SIN[슝(Xiong) 등의 문헌 "Science 243: 1188-1191, 1989"; 두벤스카이(Dubensky) 등의 문헌 "J. Virol. 70: 508-519, 1996"; 하리하란(Hariharan) 등의 문헌 "J. Virol. 72: 950-958, 1998"; 폴로(Polo) 등의 문헌 "PNAS 96: 4598-4603, 1999"], 셈리키 삼림 바이러스[릴제스트롬(Liljestrom)의 문헌 "Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991"; 버글룬드(Berglund) 등의 문헌 "Nat. Biotech. 16: 562-565, 1998"], VEE[푸쉬코(Pushko) 등의 문헌 "Virology 239: 389-401, 1997"], 및 다중 알파바이러스의 키메라(chimera)[미국 특허 제6,376,236호; PCT 공개 제WO2002/099035호; 페리(Perri) 등의 문헌 "J. Virol. 77: 10394-10403, 2003"]를 포함한다.
알파바이러스 벡터 구성물은 또한 미국 특허 제5,789,245호; 미국 특허 제5,843,723호; 미국 특허 제5,814,482호, 및 미국 특허 제6,015,694호; PCT 공개 제WO 00/61772호; 및 PCT 공개 제WO 02/99035호에 개시되어 있다. 일반적으로, 이들 벡터는 알파바이러스 RNA의 전사를 개시하는 5' 서열, 알파바이러스 비구조 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 인접한 이종성 핵산 서열의 발현을 유도하는 바이러스의 하위게놈의 접합 영역 프로모터, RNA 중합효소 인식 서열 및 폴리아데닐레이트 트랙(tract)을 포함한다.
알파바이러스는 자가-복제 알파바이러스 벡터 또는 "레플리콘" 핵산을 함유하는 바이러스-유사 입자인 레플리콘(재조합 알파바이러스 입자)으로서 사용될 수 있다. 레플리콘 입자는 그 자체로 복제 불능 또는 "결함성"인 것으로 일반적으로 고려되는데, 즉 패키징에 필요한 하나 이상의 구조 단백질을 인코딩하는 유전자가 결실되기 때문에, 숙주 세포가 레플리콘 입자로 감염될 경우 자손 레플리콘 입자는 생성되지 않을 것이다.
비록 알파바이러스 벡터가 직접적으로 생체내 RNA로서 투여되기 위해 사용될 수 있거나 플라스미드-기제 cDNA[예를 들어, 진핵의 층상화된 벡터 개시 시스템(Eukaryotic Layered Vector Initiation system)]로서 전달되지만, 종종, 생체내 백신 및 치료학적 적용을 위해, 알파바이러스 RNA 레플리콘 벡터 또는 레플리콘 RNA는 알파바이러스 구조 단백질(예를 들어, 캡시드(capsid) 단백질 및 외피 당단백질)을 포함하는 바이러스-유사 입자내로 우선 패키징된다. 사용되는 알파바이러스 및 레플리콘은, 예를 들어, 미국 특허공개 제2011/0002958호에 개시되고, 이는 본원에 참고로 인용된다. 벡터 레플리콘은, 이들의 입체배치 때문에, 재조합 알파바이러스 레플리콘 입자내로 패키징하는데 필수적인 이들 알파바이러스 구조 단백질을 발현하지 않는다. 이와 같이, 레플리콘 입자를 생성하기 위해, 구조 단백질은 트랜스로 제공되어야 한다.
패키징은 일시적 접근법, 예컨대 시험관내 전사된 레플리콘 및 결함성 헬퍼(helper) RNA(들)의 공동-형질감염[릴제스트롬(Liljestrom)의 문헌 "Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991"; 브레덴비이크(Bredenbeek) 등의 문헌 "J. Virol. 67: 6439-6446, 1993"; 프롤로브(Frolov) 등의 문헌 "J. Virol. 71: 2819-2829, 1997"; 푸쉬코(Pushko) 등의 문헌 "Virology 239: 389-401, 1997"; 미국 특허 제5,789,245호 및 미국 특허 제5,842,723호] 또는 플라스미드 DNA-기제 레플리콘 및 결함성 헬퍼 구성물의 공동-형질감염[두벤스카이(Dubensky) 등의 문헌 "J. Virol. 70: 508-519, 1996"], 뿐만 아니라 알파바이러스 레플리콘의 안정한 패키징 세포주(PCL)내로의 도입[폴로(Polo) 등의 문헌 "PNAS 96: 4598-4603, 1999"; 미국 특허 제5,789,245호; 미국 특허 제5,842,723호; 미국 특허 제6,015,694호]을 비롯한 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
트랜스 패키징 방법론은 하나 이상의 구조 단백질 유전자의 변형을 허용하고(예를 들어, 알파바이러스 변형체, 예컨대 약화된 돌연변이체의 서열을 혼입하기 위함; 미국 특허 제5,789,245호; 미국 특허 제5,842,723호; 미국 특허 제6,015,694호 참조), 이후 변형된 구조 단백질은 최종 레플리콘 입자 내로 후속적으로 혼입된다. 또한, 이러한 패키징은, 벡터 구성물과 상이한 제2 알파바이러스로부터 유래된 구조 단백질을 사용하여 제1 알파바이러스로부터 유래된 벡터 구성물 또는 RNA 레플리콘을 패키징함으로써 알파바이러스 레플리콘 입자의 전체 변형을 허용한다.
홍역 바이러스: 폴리펩티드를 인코딩하는 홍역 바이러스가 제공되고 본원에 개시된 방법에 사용된다. 홍역 바이러스의 핵산 서열은 PCT 공개 제WO 98/13501호에 개시되어 있고, 이는 에드몬스톤(Edmonston) 야생형 균주, 모라텐(Moraten) 균주 및 슈바르츠(Schwarz) 균주를 비롯한 다양한 야생형의 백신 홍역 균주의 양성 가닥(항게놈성) 메세지 센스(message sense) RNA의 DNA 복사물의 서열을 제공한다. 본원에 참고로 인용된 PCT 공개 제WO 97/06270호는 재조합 홍역 벡터의 생산을 개시한다.
홍역 바이러스의 약화된 균주는 폴리펩티드를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스의 모라텐 약화된 형태는 백신으로서 전세계적으로 사용되어 왔고, 그의 탁월한 안전성이 기록되어 있다[힐레만(Hilleman) 등의 문헌 "J. Am. Med. Assoc. 206: 587-590, 1968"]. 따라서, 하나의 실시태양에서, 모라텐 균주가 사용된다. 모라텐 백신은 메르크(MERCK: 등록상표)로부터 상업적으로 입수가능하고, 0.5 ㎖로 구성될 경우 103 pfu/㎖를 포함하는 바이알 내에 동결건조되어 제공된다.
추가의 실시태양에서, 홍역 바이러스의 에드몬스톤-B 백신 균주가 사용된다(MV-Edm)[엔더스(Enders) 및 피블스(Peebles)의 문헌 "Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286, 1954"]. MV-Edm은 종양 세포에서 효율적으로 성장하지만, 그의 성장은 인간 말초 혈액 단핵 세포, 정상적 진피 섬유아세포, 및 혈관 평활근 세포의 1차 배양에서 심각하게 제한된다. 엔더스의 약화된 에드몬스톤 균주의 형태는 메르크로부터 상업적으로 입수가능하다[어테뉴백스(ATTENUVAX: 등록상표)]. 기타 약화된 홍역 바이러스 균주가 또한 이용될 수 있고, 예컨대 레닌그라드(Leningrad)-16, 및 모스코(Moscow)-5 균주[시니트시나(Sinitsyna) 등의 문헌 "Res. Virol. 141(5): 517-31, 1990"], 슈바르츠 균주[푸리에르(Fourrier) 등의 문헌 "Pediatrie 24(1): 97-8, 1969"], 9301 B 균주[다케다(Takeda) 등의 문헌 "J. VIROL. 72/11: 8690-8696"], AIK-C 균주[다케하라(Takehara) 등의 문헌 "Virus Res 26(2): 167-75, 1992"], 및 슈나이더-샤울리에스(Schneider-Shaulies) 등의 문헌[PNAS 92(2): 3943-7, 1995]에 기재된 균주들이다.
몇몇 실시태양에서, 재조합 홍역 바이러스 뉴클레오티드 서열은 6의 배수인 뉴클레오티드의 총 수를 갖는 레플리콘을 포함한다. "6의 규칙"은 재조합 cDNA에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수가 최종적으로 6의 배수인 뉴클레오티드의 총 수에 해당한다는 사실로 표현되고, 이러한 규칙은 홍역 바이러스의 게놈 RNA의 효능적 복제를 허용한다.
추가적인 실시태양에서, 이종성 DNA, 예컨대 브라큐리 단백질을 인코딩하는 핵산은 홍역 바이러스에서 홍역 바이러스의 항게놈성 RNA에 상응하는 cDNA에 삽입된 추가적인 전사 단위(ATU: Additional Transcription Unit) 내에 클로닝된다. ATU의 위치는 cDNA에 따라 다양하지만, 이는 홍역 바이러스의 발현 구배로부터 이익을 얻을 자리에 위치된다. 따라서, ATU는 cDNA를 따라 펼쳐질 수 있다. 하나의 실시태양에서, ATU는 서열의 N-말단 부위 및 특별히 홍역 바이러스의 L-유전자로부터 상류의 영역 및 바이러스의 M 유전자로부터 상류의 영역 내에 삽입된다. 다른 실시태양에서, ATU는 바이러스의 N 유전자로부터 상류에 삽입되고, 본원에 참고로 인용된 미국 특허공개 제2011/0129493호를 참조한다. 홍역 바이러스 게놈에서 특정 시스트론(cistron)은 발현이 약화와 연관된 유전자를 변형시키는 것을 표적화할 수 있다[슈나이더-샤울리에스(Schneider-Shaulies) 등의 문헌 "PNAS 92(2): 3943-7, 1995"; 다케다(Takeda) 등의 문헌 "J. Virol. 72/11: 8690-8696, 1998"]. 이와 같이, 하나의 실시태양에서, H 단백질, V 단백질, C 단백질, 및 이들의 조합중 임의의 형태로 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 홍역 바이러스 균주가 생성된다.
재조합 홍역 바이러스 벡터는 홍역 바이러스의 항게놈성 RNA의 역전사로부터 생성된 cDNA 및 T7 중합효소를 위한 프로모터 및 종결자를 포함하는 적응된 발현 제어 서열을 함유하는 플라스미드 pTM-MVSchw를 포함한다. 벡터는 또한, 예를 들어, 미국 특허공개 제2006/0013826호에 개시되어 있다. 이들 벡터는 본원에 개시된 방법에 사용된다.
폴리펩티드를 발현하는 홍역 바이러스의 추가적인 약화된 균주가 생산될 수 있다. 바이러스의 약화된 균주는, 면역원성이지만 병원성이 아닌 바이러스가 식별될 때까지, 세포 배양물에서(예를 들어, 인간 이외의 세포에서) 바이러스를 연속 계대배양(serial passage)함으로써 수득된다. 야생형 바이러스는 마모셋(marmoset)에서 치명적 감염을 초래할 것이지만, 백신 균주는 그렇지 않다. 약화된 홍역 바이러스 백신을 수여받은 개별체는 전형적인 홍역 증후를 나타내지 않는다. 약화는 감소된 바이러스 복제(원숭이에서 홍역을 일으킬 수 없는 능력에 의해 생체내에서 측정됨), 감소된 바이러스 혈증, 및 조직에서의 세포병리 효과(예를 들어, 세포-세포 융합, 다핵화된 세포)를 유도하지 못함과 연관된다. 미국 특허 제7,393,527호를 참조한다.
하나의 실시태양에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 약화된 홍역 바이러스의 효과적인 용량은, 홍역 바이러스의 약화된 모라텐 균주를 포함하는 스톡의 개시 접종물(또는 MMR 스톡의 접종물) 또는 MV-Edm 균주 또는 상기 기재된 임의의 기타 균주로 1차 세포 또는 연속 세포주를 감염시키고, 연속 계대 배양 후 바이러스를 팽창시킴으로써 생산된다. 세포 또는 세포주로는, 제한되지 않지만, 원숭이 신장 또는 고환 세포 또는 원숭이 세포주[예를 들어, 베로(Vero), KB, CV-1, BSC-1 등]가 포함된다. 세포에서 바이러스 복제는 세포-세포 융합 및 신시튬(syncytium) 형성으로서 관찰된다.
약화된 홍역 바이러스는 표준 세포 배양 배지에서 원하는 용량 농도가 수득될 때까지 팽창된다. 하나의 실시태양에서, 치료학적 효과 용량은 약 103 내지 1012 pfu이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 농도는 약 105 내지 108 pfu이다. 바이러스 역가는 배양 접시(예를 들어, 예컨대 35 mm 접시)에 세포(예를 들어, 베로 세포)를 접종함으로써 검정될 수 있다. 바이러스가 흡착한지 2 내지 3 시간 후, 접종물을 제거하고 세포에 세포 배양 배지 및 아가로스 또는 메틸 셀룰로스의 혼합물[예를 들어, 5% FCS 및 1% 시플라크(SeaPlaque) 아가로스가 함유된 2 ㎖의 DMEM]을 덮어 씌운다. 약 3 내지 약 5 일 후, 배양물을 1 ㎖의 10% 트리플루오로아세트산에 의해 약 1 시간 동안 고정시키고, 이어서 30 분 동안 UV 교차-연결시킨다. 아가로스 덧층을 제거한 후, 세포 단일층을 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 플라크를 계수하여 바이러스 역가를 결정한다. 접시로부터 세포를 긁어냄으로써 바이러스를 수거하고, 이를 냉동/해동시키고(예를 들어, 대략 2 라운드), 원심분리한다. 청정한 상청액은 "플라크(plaque) 정제된" 바이러스를 나타낸다.
바이러스 스톡을 세포 단일층의 감염(예를 들어, 약 1.5 시간 동안 37℃에서 흡착)에 의해 생산하고, 이후 감염된 세포를 적합한 배지[예를 들어, 옵티(Opti)-MEM, 깁코(Gibco)-BRL] 내로 긁어 넣고 냉동/해동 용해한다(예를 들어, 2 라운드). 바이러스 스톡을 분취하고, 냉동하고 70℃ 내지 80℃에서 저장하고, 치료학적 효과 용량에 비해 더 높은 농도로 저장할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 바이러스 스톡은 안정화 용액으로 저장된다. 안정화 용액은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제4,985,244호, 및 미국 특허 제4,500,512호를 참조한다.
폴리오바이러스: 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리오바이러스가 제공되고 본원에 개시된 방법에 사용된다. 전체 폴리오바이러스 게놈은 클로닝되고 서열화되고, 바이러스 단백질이 식별되었다. 바이러스의 추가적인 유전적 조작을 허용하는 감염성 폴리오바이러스 cDNA가 또한 이용가능하다[라카니엘로((Racaniello VR) 등의 문헌 "Science 214(4542) 916-919, 1981"]. 야생형 게놈 RNA 분자는 7433개 뉴클레오티드 길이이고, 3' 단부에서 폴리아데닐화되며, 5' 말단에서 공유 결합된 작은 바이러스 단백질(VPg)을 갖는다[기타무라(Kitamura N) 등의 문헌 "Nature 291: 547-553, 1981"; 라카니엘로(Racaniello VR) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4887-4891, 1981"]. 폴리오바이러스 게놈의 발현은 단일 단백질(다단백질)의 번역을 통해 발생되고, 이는 후속적으로 바이러스 인코딩된 단백질분해효소(2A 및 3C)에 의해 가공되어 성숙한 구조적(캡시드) 및 비구조 단백질을 제공한다[기타무라(Kitamura N) 등의 문헌 "Nature 291: 547-553, 1981"; 코흐(Koch F) 등의 문헌 "The Molecular Biology of Polyovirus, Springer-Verlag, Vienna, 1985"]. 폴리오바이러스 복제는 바이러스-인코딩된 RNA-의존성 RNA 중합효소를 특징으로 하고, 이는 게놈성 RNA를 복사하여 상보성 RNA 분자를 제공하고, 이어서 이는 추가의 RNA 생산을 위해 주형으로서 작용한다[코흐(Koch F) 등의 상기 문헌; 쿤(Kuhn RJ) 등의 문헌 "DJ Rowlands et al. (ed.) Molecular Biology of Positive Strand RNA viruses, Academic Press Ltd., London, 1987"]. 폴리오바이러스 다단백질의 번역 및 단백질분해 과정은 닉클린(Nicklin MJH) 등의 문헌[Bio/Technology 4: 33-42, 1986]에 기재되어 있다.
바이러스 RNA 게놈은 신규한 자손 RNA의 생성, 뿐만 아니라 신규한 RNA 게놈의 캡시드화에 필요한 필수 단백질을 인코딩한다. 시험관내에서, 폴리오바이러스는 용해되어, 허용되는 세포의 완전한 파괴를 초래한다. 바이러스 복제 주기가 어떠한 DNA 중간체도 포함하지 않으므로, 바이러스 DNA가 숙주 염색체 DNA로 통합될 가능성은 없다.
초기 연구는 항체에 대한 반응성에 기초하여 3종의 폴리오바이러스 유형을 식별하였다[코흐(Koch F) 등의 상기 문헌, 1985]. 유형 I, 유형 II, 및 유형 III으로 지정된 이들 3종의 혈청학적 유형은 비-코딩 영역 및 단백질 코딩 영역 둘 다에서 다수의 뉴클레오티드 차이를 갖는 것으로 추가로 구별되었다. 3종의 균주 모두 이종성 단백질을 전달하는데 사용하기에 적합하다. 또한, 폴리오바이러스의 3종의 균주 모두의 약화된 형태는 입수가능하다.
레플리콘은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 레플리콘은 바이러스의 캡시드화를 위해 필수적인 야생형 폴리오바이러스 핵산이 결핍된 폴리오바이러스-기제 폴리뉴클레오티드이다. 결과적으로, 새롭게 캡시드화된 레플리콘은 소실된 핵산의 부재하에 초기 세포 진입 이후 생산될 수 없다. 레플리콘은 야생형 폴리오바이러스 핵산의 임의의 변형, 예컨대, 제한되지 않지만, 결실, 삽입, 및 치환, 예를 들어 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 삽입의 결과로서 상기 핵산이 결핍될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 폴리오바이러스 레플리콘은 캡시드화에 필요한 단백질의 적어도 일부를 인코딩하는 야생형 폴리오바이러스 핵산이 결핍된다. 레플리콘 캡시드화에 필수적인 단백질로는 캡시드 구조의 일부분인 단백질이 포함된다. 이러한 단백질의 예는 폴리오바이러스 P1 캡시드 전구체 영역의 VP1, VP2, VP3, 및 VP4 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, Vpg 단백질, 및 캡시드 구조물의 구조 단백질의 적절한 가공에 필수적인 단백질, 예컨대 바이러스 다단백질을 분해하는데에 책임이 있는 단백질분해효소이다. 이와 같이, 몇몇 실시태양에서, 폴리오바이러스 벡터는 하나 이상의 VP1, VP2, VP3, 및 VP4, 폴리오바이러스 P1 캡시드 전구체 영역의 유전자, Vpg 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 결핍되고, 브라큐리 단백질 또는 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩한다.
레플리콘은 전형적으로 RNA 형태로 세포 내로 도입된다. 캡시드화된 레플리콘은 캡시드 단백질과 폴리오바이러스 수용체의 상호작용을 통해 세포에 진입할 수 있다. 레플리콘은 세포내로 도입되고 정확한 판독 프레임에서 단일 다단백질의 번역(이를 통해 전체 레플리콘 게놈의 발현이 발생됨)시 RNA 복제(증폭)가 완전히 가능하다. 레플리콘 서열의 번역은 일시적이고, 대체적으로 약 24 내지 48 시간이다. 높은 수준의 레플리콘-인코딩된 단백질이 번역 기간 동안 축적될 수 있다. 캡시드화된 레플리콘은 캡시드 단백질과 hPVR 단백질의 상호작용을 통해 세포에 진입할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 레플리콘은 브라큐리 단백질을 인코딩하는 서열을 비롯하여 RNA를 포함하고, 캡시드화된다. 몇몇 예에서, 레플리콘은 캡시드(P1) 유전자의 결실을 갖고, 폴리오바이러스 유형 1, 유형 2, 유형 3 또는 이들의 조합물의 RNA 게놈으로부터 유래된다. 추가로, 브라큐리 단백질 또는 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 캡시드(P1) 유전자의 일부 또는 모두에 대해 치환할 수 있어서, 존재한다면 남아있는 캡시드(P1) 유전자의 일부는 생체내 캡시드화를 지지하기에 불충분하게 된다. 일반적으로, 용어 "P1 레플리콘"은 P1 캡시드 전구체 단백질을 인코딩하는 전체 핵산이 결실되거나 변경되어 이러한 핵산에 의해 정상적으로 인코딩되는 단백질이 발현되지 않거나 비-작용성 형태로 발현되도록 하는 레플리콘을 지칭한다. 폴리오바이러스 게놈의 P1 캡시드 전구체 영역에 의해 정상적으로 인코딩되는 단백질로는 VP1, VP2, VP3, 및 VP4 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 포함된다. P1 레플리콘은, 따라서, VP1, VP2, VP3, 및 VP4 유전자가 결핍되거나, VP, VP2, VP3, 및 VP4 유전자의 발현불가능한 형태 또는 비-작용성 형태를 포함한다. P1 레플리콘은 VP1, VP2, VP3, 및 VP4 유전자 대신 치환된 브라큐리 단백질 또는 브라큐리 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 캡시드화된 레플리콘은 레플리콘, 및 숙주 세포에 트랜스로 캡시드화하기에 필요한 소실 핵산을 제공하는 상보성 발현 벡터 둘 다를 도입함으로써 생산된다. "레플리콘 캡시드화 벡터"는 레플리콘 캡시드화에 필요한 핵산을 포함하고 필요한 핵산(또는 인코딩된 단백질)을 트랜스로 제공하는 비-폴리오바이러스-기제 벡터를 지칭한다. 레플리콘 캡시드화 벡터는 레플리콘 도입 이전에, 이와 동시에, 또는 이에 후속적으로 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 캡시드화를 위한 적합한 방법은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제6,680,169호에 개시되어 있다. 캡시드화된 레플리콘을 제조하기 위해 사용될 수 있는 방법은 포터(Porter DC) 등의 문헌[J. Virol. 67: 3712-3719, 1993]; 포터(Porter DC) 등의 문헌[J. Virol. 69: 1548-1555, 1995]; PCT 공개 제WO 96/25173호; 미국 특허 제5,614,413호, 미국 특허 제5,817,512호; 미국 특허 제6,063,384호; 및 미국 특허 제6,680,169호에 기재되어 있다.
비캡시드화된 레플리콘은, 예를 들어, 예컨대, 근육 세포내로 직접 주사함으로써[예를 들어, 악사디(Acsadi G) 등의 문헌 "Nature 352(6338): 815-818, 1991"; 볼프(Wolff JA) 등의 문헌 "Science 247:1465-1468, 1990" 참조], 또는 전기천공, 인산 칼슘에 의해 중재된 형질감염, DEAE-덱스트란에 의해 중재된 형질감염, 리포솜-중재된 형질감염 또는 수용체-중재된 핵산 섭취에 의해[예를 들어 우(Wu G) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 263: 14621-14624, 1988"; 윌슨(Wilson JM) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 267: 963-967, 1992"; 및 미국 특허 제5,166,320호 참조], 또는 표적 세포로 네이키드(naked) 핵산을 전달하는 기타 방법에 의해 표적 세포에 직접적으로 전달될 수 있다.
레트로바이러스성 벡터: 렌티바이러스성(lentiviral) 벡터를 비롯하여, 폴리펩티드를 인코딩하는 레트로바이러스성 벡터가 제공되고 본원에 개시된 방법에 사용된다. 레트로바이러스성 벡터는 시험되었고, 광범위한 표적 세포의 게놈 DNA 내로 흥미로운 다양한 유전자를 안정하게 도입하기 위한 적합한 전달 비히클인 것으로 밝혀졌다. 이론에 얽매이지 않지만, 재배열되지 않은 단일 복사물 전이유전자를 세포 내로 전달하는 레트로바이러스성 벡터의 능력은 레트로바이러스성 벡터가 세포 내로 유전자를 전이하기에 적합하도록 만든다. 추가로, 레트로바이러스는, 레트로바이러스 외피 당단백질을 숙주 세포 상의 특이적 세포 표면 수용체에 결합시킴으로써 숙주 세포에 진입한다. 결과적으로, 고유의 외피 단백질이 고유의 외피 단백질과 비교하여 상이한 세포 특이성을 갖는(예를 들어, 고유의 외피 단백질과 비교하여 상이한 세포-표면 수용체에 결합하는) 이종성 외피 단백질로 대체된 슈도타이핑된(pseudotyped) 레트로바이러스성 벡터가 사용될 수 있다.
일반적으로, 레트로바이러스는 3개의 주요 코딩 도메인, gag, pol, env를 함유하고, 이는 필수적인 비리온 단백질을 코딩한다. gag, pol 및/또는 env가 없거나 작용하지 않는 레트로바이러스성 벡터가 사용된다. 레트로바이러스성 벡터는, 예를 들어, 미국 특허공개 제20060286634호에 개시되어 있다.
이와 같이, 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스성 전이 벡터 및 하나 이상의 패키징 요소를 포함하는 레트로바이러스성 패키징 벡터를 포함하는 레트로바이러스성 벡터가 제공된다. 몇몇 실시태양에서, 슈도타이핑된 레트로바이러스를 생산하기 위해 이종성 또는 기능적으로 변형된 외피를 인코딩하는 슈도타이핑된 레트로바이러스성 벡터가 제공된다.
많은 레트로바이러스가 존재하고, 예로는 다음이 포함된다: 뮤린 백혈병 바이러스(MLV: murine leukemia virus), 렌티바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus), 말 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV: equine infectious anaemia virus), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV: mouse mammary tumor virus), 라우스 육종 바이러스(RSV: Rous sarcoma virus), 후지나미 육종 바이러스(FuSV: Fujinami sarcoma virus), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MLV: Moloney murine leukemia virus), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV: FBR murine osteosarcoma virus), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV: Moloney murine sarcoma virus), 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV: Abelson Moloney murine leukemia virus), 조류 골수세포증 바이러스-29(MC29: myelocytomatosis virus-29), 및 조류 적아세포증 바이러스(AEV: Avian erythroblastosis virus). 사용하기에 적합한 기타 레트로바이러스로는, 제한되지 않지만, 조류 백혈증 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 밍크 세포 초점 형성 바이러스(Mink-Cell Focus-Inducing Virus)가 포함된다. 레트로바이러스성 벡터의 코어 서열은 다양한 레트로바이러스, 예를 들어, B, C, 및 D 유형 레트로바이러스 뿐만 아니라 스푸마바이러스(spumavirus) 및 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다[문헌 "RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985" 참조]. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 레트로바이러스의 일예로는, 제한되지 않지만, 렌티바이러스가 포함된다.
하나의 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 예를 들어, 유형 1 또는 2(즉, HIV-1 또는 HIV-2)이다. 다른 렌티바이러스 벡터는 양 비스나(Visna)/ 매디(maedi) 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV: feline immunodeficiency virus), 소 렌티바이러스, 시미안 면역결핍 바이러스(SIV: simian immunodeficiency virus), 말의 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV), 및 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV: caprine arthritis-encephalitis virus)를 포함한다.
렌티바이러스는 흔히 수 개의 구조적 비리온 단백질을 공유하고, 예컨대 env 유전자에 의해 인코딩되는 외피 당단백질 SU(gp120) 및 TM(gp41); gag 유전자에 의해 인코딩되는 CA(p24), MA(p117) 및 NC(p7-11); 및 pol 유전자에 의해 인코딩되는 RT, PR 및 IN이 포함된다. HIV-1 및 HIV-2는 바이러스 RNA 및 다른 복제 기능을 합성하고 가공함을 조절하는데 관여하는 부속 단백질 및 기타 단백질을 함유한다. vif, vpr, vpu/vpx, 및 nef 유전자에 의해 인코딩되는 부속 단백질은 재조합 시스템으로부터 삭제(또는 비활성화)될 수 있다. 또한, tat 및 rev는, 예컨대 돌연변이 또는 결실에 의해 삭제 또는 비활성화될 수 있다.
이론에 얽매이지 않지만, 레트로바이러스-기제 유전자 전이 기법의 사용은 일반적으로 흥미로운 유전자, 예컨대 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 수용되는 고도로 결실된 바이러스 게놈을 운반하는 재조합 렌티바이러스 입자의 시험관내 생산에 의존한다. 특별히, 재조합 렌티바이러스는 (1) 패키징 구성물, 즉, Rev와 함께 Gag-Pol 전구체를 발현하는 벡터(다르게는 트랜스로 발현됨); (2) 일반적으로 이종성 성질의 외피 수용체를 발현하는 벡터; 및 (3) 모든 개방 판독 프레임이 제거된 바이러스 cDNA로 구성되지만 복제, 비캡시드화, 및 발현에 필요한 서열을 유지하는 전이 벡터(이때 발현되는 서열은 삽입됨)의 허용 세포주에서 트랜스로 공동-발현을 통해 회수된다. 하나의 실시태양에서, 루(Lu, X.) 등의 문헌[Journal of gene medicine 6: 963-973, 2004]에 기재된 렌티겐(lentigen) 렌티바이러스성 벡터가 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용된다. 적합한 렌티바이러스성 벡터는 또한, 예를 들어, 미국 특허공개 제2010/0062524호에 개시되어 있다.
레트로바이러스를 생산하는 생산자 세포 및 생산자 세포주를 생성하기 위한 레트로바이러스성 패키징 시스템, 및 이러한 패키징 시스템을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 레트로바이러스성 패키징 시스템은 적어도 2개의 패키징 벡터, 즉: gag, pol, 또는 gag 및 pol 유전자를 함유하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 패키징 벡터; 및 이종성 또는 기능적으로 변형된 외피 유전자를 함유하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 패키징 벡터를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 레트로바이러스성 요소는 렌티바이러스, 예컨대 HIV로부터 유래된다. 이들 벡터는 작용성 tat 유전자 및/또는 작용성 부속 유전자(vif, vpr, vpu, vpx, nef)가 결핍될 수 있다. 다른 실시태양에서, 이 시스템은 rev 유전자를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 패키징 벡터를 추가로 포함한다. 패키징 시스템은 제1, 제2, 및, 임의적으로, 제3 뉴클레오티드 서열을 함유하는 패키징 세포의 형태로 제공될 수 있다.
제1 세대 렌티바이러스성 벡터 패키징 시스템은 gag/pol 및 env를 위해 별도의 패키징 구성물을 제공하고, 전형적으로 안전성의 이유로 이종성 또는 기능적으로 변형된 외피 단백질을 이용한다. 제2 세대 렌티바이러스성 벡터 시스템에서, 부속 유전자, vif, vpr, vpu 및 nef는 결실되거나 비활성화된다. 제3 세대 렌티바이러스성 벡터 시스템은 유전자가 결실되거나 달리는 비활성화된(예를 들어, 돌연변이를 통해) 시스템이다. 일반적으로 tat에 의해 제공되는 전사의 조절에 대한 보상은 강한 구성 프로모터, 예컨대 인간 거대세포바이러스 전초기(HCMV-IE: human cytomegalovirus early) 인헨서/프로모터를 사용하여 제공될 수 있다. 다른 프로모터/인헨서는, 당분야에서 이해되는 바와 같이, 구성 프로모터 활성의 강도, 표적 조직에 대한 특이성(예를 들어, 간-특이적 프로모터), 또는 발현에 대한 원하는 제어와 관련한 기타 인자들에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 유도성 프로모터, 예컨대 tet는 제어된 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다. rev를 인코딩하는 유전자는, 전형적인 제3 세대 렌티바이러스성 벡터 시스템이 gagpol, rev, 외피 및 전이 벡터에 대해 각각 하나씩의 4개의 플라스미드를 포함하도록, 별도의 발현 구성물 상에 제공될 수 있다. 이용된 패키징 시스템의 세대와 무관하게, gag 및 pol은 단일 구성물 또는 별도의 구성물 상에 제공될 수 있다.
전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되고, 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염을 위한 방법은 당분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스성 벡터는 패키징 세포주 내로 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 도입되어, 생산자 세포 또는 세포주를 생성할 수 있다. 패키징 벡터는, 예를 들어, 인산 칼슘 형질감염, 리포펙션(lipofection) 또는 전기천공을 비롯한 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주 내로 도입될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 패키징 벡터는 우세한 선택가능한 표지, 예컨대 neo, DHFR, Gin 합성효소 또는 ADA와 함께 세포내로 도입되고, 이후 적절한 약물의 존재하에 선택되고 클론이 단리된다. 선택가능한 표지 유전자는 패키징 벡터에 의해 인코딩되는 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
패키징 기능이 적합한 패키징 세포에 의해 발현되도록 설정된 안정한 세포주가 공지되어 있다. 예를 들어, 패키징 세포를 기재하는 미국 특허 제5,686,279호; 및 오라이(Ory) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11400-11406, 1996]을 참조한다. 주퍼리(Zufferey) 등의 문헌[Nature Biotechnology 15: 871-875, 1997]은 렌티바이러스성 패키징 플라스미드를 개시하고, 이때 HIV-1 외피 유전자를 포함하는 pol의 서열 3'는 결실된다. 구성물은 tat 및 rev 서열을 함유하고 3' LTR은 폴리 A 서열로 대체된다. 5' LTR 및 psi 서열은 또 다른 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터로 대체된다. 예를 들어, CMV 프로모터가 사용될 수 있다.
패키징 벡터는 렌티바이러스성 단백질 발현을 향상시키고 안전성을 향상시키기 위해 패키징 기능에 추가적인 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, gag의 상류의 모든 HIV 서열은 제거될 수 있다. 또한, 외피의 하류 서열은 제거될 수 있다. 게다가, RNA의 스플라이싱 및 번역을 향상시키기 위해 벡터를 변형시키는 단계가 취해질 수 있다.
자가-비활성화 벡터(SIN)가 사용될 수 있고, 이는, 예를 들어, 주퍼리(Zufferey) 등의 문헌[J. Virology 72(12): 9873-9880, 1998]에 기재된 바와 같이, HIV-1 긴 말단 반복부(LTR: long terminal repeat)의 결실에 의해 벡터의 생물안전성을 개선시킨다. 유도성 벡터는 또한, 예컨대 tet-유도성 LTR을 통해 사용될 수 있다.
비-효모 벡터가 숙주(예를 들어, 인간)에 투여되는 경우, 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스)는 바람직하게는 표적 세포에서 낮은 복제 효능을 갖는다(예를 들어, 세포 당 단지 약 1개의 자손, 또는 더욱 바람직하게는, 세포 당 단지 0.1개의 자손이 생산된다). 복제 효능은 표적 세포의 감염 이후 바이러스 역가를 결정함으로써 실험적으로 쉽게 결정될 수 있다.
폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 더하여, 비-효모 벡터는 또한 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor), 사이토킨, 또는 면역 반응을 향상시킬 수 있는 기타 분자[예를 들어, 추가적인 종양-연관된 항원, 예컨대 전립선 특이적 항원(PSA: prostate specific antigen), 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen) 또는 이의 변형된 형태, 예컨대 CEA-6D, 및 뮤신(MUC: mucin) 및 이의 변형된 형태]를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)/유전자(들)를 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 임의의 기타 외래성 유전자(들)은, 바람직하게는 생성된 재조합 바이러스의 바이러스 생존력에 영향을 주지 않는 벡터(예를 들어, 폭스바이러스)에서 하나의 자리 또는 영역(삽입 영역) 내로 삽입된다. 이러한 영역은 재조합 바이러스의 바이러스 생존력에 그다지 영향을 미치지 않으면서 재조합 형성을 허용하는 영역에 대하여 바이러스 DNA의 부분들을 시험함으로써 쉽게 식별될 수 있다.
티미딘 키나아제(TK: thymidine kinase) 유전자는 쉽게 사용될 수 있고 많은 바이러스에 존재하는 삽입 영역이다. 특별히, TK 유전자는 모든 검사된 폭스바이러스 게놈에서 발견되었다. 추가적인 적합한 삽입 자리는 국제 특허공개 제WO 2005/048957호에 기재되어 있다. 예를 들어, 계두에서, 삽입 영역으로는, 제한되지 않지만 BamHI J 단편, EcoRI-HindIII 단편, BamHI 단편, EcoRV-HindIII 단편, 특유의 긴 서열(LUS: long unique sequence) 삽입 자리(예를 들어, FPV006/FPV007 및 FPV254/FPV255), FP14 삽입 자리(FPV060/FPV061), 및 43K 삽입 자리(FPV107/FPV108)가 포함된다. 백시니아에서, 삽입 자리로는, 제한되지 않지만, 44/45, 49/50, 및 124/125가 포함된다.
비-효모 벡터가 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및/또는 다른 외래성 유전자(들)(예를 들어,하나 이상의 면역자극성/조절성 분자를 인코딩함)를 포함하는 재조합 계두 바이러스인 경우, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 하나의 영역(예를 들어, FP14 영역)에 삽입될 수 있고, 외래성 유전자(들)는 또 다른 영역(예를 들어, BamHI J 영역)에 삽입될 수 있다.
비-효모 벡터는 적합한 프로모터 및 조절 요소, 예컨대 전사 조절 요소 또는 인헨서를 포함할 수 있다. 벡터가 폭스바이러스 벡터인 경우, 폭스바이러스 프로모터가 사용될 수 있고, 제한되지 않지만 백시니아 7.5K 프로모터, 백시니아 3OK 프로모터, 백시니아 40K 프로모터, 백시니아 13 프로모터, 합성 초기/후기(sE/L) 프로모터, 7.5 프로모터, HH 프로모터, 11K 프로모터, 및 Pi 프로모터가 포함된다. 프로모터는 전형적으로 구성 프로모터일 것이지만, 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 벡터에 사용될 수 있다. 이러한 유도성 시스템은 유전자 발현의 조절을 허용한다.
폴리펩티드, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-효모 벡터를 포함하는 비-효모 세포가 또한 본원에 제공된다. 적합한 세포로는 원핵 및 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 비-효모 곰팡이, 및 박테리아[예컨대 에스케리치아 콜라이, 살모넬라(예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움), 또는 리스테리아(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스)]가 포함된다. 비-효모 세포는, 폴리펩티드의 연구 또는 생산을 위해 유용하므로, 시험관내 존재할 수 있거나, 비-효모 세포는 생체내 존재할 수 있다. 비-효모 세포는 폴리펩티드-진동된(pulsed) 항원 제시 세포일 수 있다. 적합한 항원 제시 세포로는, 제한되지 않지만, 수지상 세포, B 림프구, 단핵구, 대식세포 등이 포함된다.
하나의 실시태양에서, 비-효모 세포는 수지상 세포이다. 상이한 돌연변이 단계의 수지상 세포는 세포 표면 발현 표지에 기초하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 수지상 세포는 제시를 위해 신규 단백질을 포획하는 능력이 덜하지만, 성장 및 분화를 위해 휴지 T 세포를 자극하는데 있어서 더욱 우수하다. 이와 같이, 성숙한 수지상 세포는 중요할 수 있다. 성숙한 수지상 세포는 이들의 형태 변화 및 다양한 표지의 존재에 의해 식별될 수 있다. 이러한 표지로는, 제한되지 않지만, 세포 표면 표지, 예컨대 B7.2, CD40, CD11, 및 MHC 부류 II가 포함된다. 다르게는, 성숙도는 염증전 사이토킨의 생산을 관찰하거나 측정함으로써 식별될 수 있다.
수지상 세포는 전형적인 유동세포 계수법(cytofluorography) 및 세포 분류 기법 및 장치, 예컨대 형광-활성화 세포 분류기(FACS: fluorescence-activated cell sorter)를 사용하여 수집되고 분석될 수 있다. 수지상 세포 성숙의 상이한 단계의 세포 표면 항원에 특이적인 항체는 상업적으로 입수가능하다.
배양시 포유동물 세포의 증식을 위한 기법은 잘 공지되어 있다[자코비(Jakoby) 및 파스탄(Pastan)(eds)의 문헌 "1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, N.Y." 참조]. 흔히 사용되는 포유동물 숙주 세포주의 예는 베로 및 헤라(HeLa) 세포, CHO 세포, 및 WI38, BHK, 및 COS 세포주이지만, 예컨대 더 높은 발현, 바람직한 글리코실화(glycosylation) 패턴 또는 다른 특징을 제공하도록 고안된 세포와 같은 세포주가 사용될 수 있다.
재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당분야의 숙련가에게 잘 공지된 종래의 기법에 의해 실행될 수 있다. 숙주가 원핵생물, 예컨대, 제한되지 않지만, 에스케리치아 콜라이인 경우, DNA 포착을 가능하게 하는 컴피턴트(competent) 세포는 대수 증식기 이후 수거된 세포로부터 제조될 수 있고, 후속적으로 당분야에 잘 공지된 절차를 사용하여 CaCl2 방법으로 처리된다. 다르게는, MgCl2 또는 RbCl이 사용될 수 있다. 형질전환은 또한, 원한다면, 비-효모 숙주 세포의 원형질체(protoplast)를 형성한 이후, 또는 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
세포가 진핵 세포인 경우, 인산 칼슘 공침전, 종래의 기계적 절차, 예컨대 미세주사, 전기천공, 리포솜에 매입된 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터에 의한 감염과 같은 DNA의 형질감염 방법이 사용될 수 있다. 진핵 세포는 또한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 선택가능한 표현형, 예컨대 단순포진 티미딘 키나아제 유전자를 인코딩하는 제2의 외래 DNA 분자에 의해 공동-형질전환된다. 비-효모 진핵 세포를 형질전환하기 위해 바이러스성 벡터를 사용하는 방법은 공지되어 있다[예를 들어, 문헌 "Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982" 참조].
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 비-효모 세포는 단리될 수 있다. 용어 "단리된"은 본원에 사용될 경우 생물학적 환경(예를 들어, 세포, 조직, 배양 배지, 체액 등)으로부터 제거되거나, 다르게는 임의의 정도로 순도가 증가된(예를 들어, 합성 배지로부터 단리된) 화합물 또는 조성물을 내포한다. 단리된 화합물 및 조성물은, 이와 같이, 합성적이거나 천연적으로 생산될 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 비-효모 세포는 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 비-효모 세포 및 담체(예를 들어, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체)를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)로서 제형화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 조성물은 본원에 기재된 방법에서 단독으로 또는 약학 제형의 일부로서 사용될 수 있다.
조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 하나 보다 더 많은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 비-효모 세포 또는 조성물을 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 조성물은 하나 이상의 기타 약학적으로 활성인 제제 또는 약물을 포함할 수 있다. 약학 조성물에 사용하기에 적합한 이러한 기타 약학적으로 활성인 제제 또는 약물의 예로는 항암제(예를 들어, 화학요법 약물), 항생제, 항바이러스성 약물, 항진균성 약물, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 및 이들의 조합물이 포함된다. 적합한 항암제로는, 제한 없이, 알칼리화제, 질소 머스타드(nitrogen mustard), 엽산 길항물질, 퓨린 길항물질, 피리미딘 길항물질, 방추체 저해제(spindle poison), 토포이소머라아제(topoisomerase) 저해제, 아포토시스(apoptosis) 유도제, 혈관신생 저해제, 포도필로톡신(podophyllotoxin), 니트로소요소(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 인터페론(interferon), 아스파라기나아제(asparginase), 타목시펜(tamoxifen), 류프롤리드(leuprolide), 플루타미드(flutamide), 메게스트롤(megestrol), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxorubicin), 이리노테칸(irinotecan), 탁솔(taxol), 겔다나마이신(geldanamycin)(예를 들어, 17-AAG), 및 당분야에 공지된 다양한 항암 폴리펩티드 및 항체가 포함된다.
담체는 임의의 관습적으로 사용된 담체일 수 있고, 단지 생리화학적 고려사항, 예컨대 용해도 및 활성 화합물(들)과의 반응성 결핍 및 투여 경로에 의해 제한된다. 본원에 기재된 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 비히클(vehicle), 보조제, 부형제, 및 희석제는 당분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있고, 대중들도 쉽게 이용가능하다. 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 제제(들)에 대해 화학적으로 비활성이고 사용 조건하에 해로운 부작용 또는 독성을 갖지 않는 것이 바람직하다.
담체의 선택은 부분적으로 본 발명의 특별한 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물 및 사용되는 기타 활성 제제 또는 약물에 의해, 뿐만 아니라 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특별한 방법에 의해 결정될 것이다.
조성물은 추가적으로 또는 다르게는 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 면역자극성/조절성 분자, 예컨대 인터류킨(IL: interleukin)-2, IL-4, IL-6, IL-12, 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor)-α, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-40L, 41 BBL, 항-CTLA-4, 및 이들의 조합물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 B7.1, ICAM-1, 및 LFA-3의 조합물(또한 TRICOM으로서 지칭됨)을 포함한다. 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자는 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스성 벡터, 예컨대 폭스바이러스 벡터)의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자(예를 들어, IL-12)는 키토산이 존재하거나 존재하지 않는 DNA 플라스미드의 형태로 투여될 수 있다. 다르게는, 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자는 단백질(예를 들어, 재조합 단백질), 예컨대 키토산과 혼합된 단백질(예를 들어, 재조합 IL-12)로서 투여될 수 있다.
브라큐리 단백질은 다수의 인간 암, 예컨대 소장, 위, 신장, 방광, 자궁, 난소, 고환, 폐, 결장, 전립선, 기관지의 암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 기타 B 세포-기제 악성종양 및 유방암, 예컨대 유방의 침윤성 관 암종으로 발현된다. 폴리펩티드의 투여는 이들 암을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 구체적인 비제한적 예에서, 유방암은 에스트로겐 수용체 음성 및 프로게스테론 수용체 음성 유방암이다. 추가적인 비제한적 예에서, 암은 방사선 내성 및/또는 화학요법 내성인 임의의 암이다. 암은 브라큐리를 발현할 수 있거나, 브라큐리를 발현하는 잠재성을 갖는다.
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 비-효모 세포의 투여는 CD4+ 브라큐리-특이적 T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, CD4+ 브라큐리-특이적 T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 유도하기 위한 방법들이 제공되고, 이는 CD4+ 브라큐리 특이적 T 세포의 생산을 유도하기 위해 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 비-효모 세포(예를 들어, 수지상 세포)의 사용을 포함한다.
본 발명은 또한 암, 예컨대, 제한되지 않지만, 소장, 위, 신장, 방광, 자궁, 난소, 고환, 폐, 결장, 전립선, 기관지의 암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 기타 B 세포-기초 악성종양, 또는 유방암, 예컨대 유방의 침윤성 관 암종 또는 에스트로겐 수용체 음성 및 프로게스테론 수용체 음성 유방암을 앓는 피험체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 임의의 이들 암은 화학요법 내성 및/또는 방사선 내성일 수 있다. 암은 브라큐리를 발현할 수 있거나, 브라큐리를 발현하는 잠재성을 갖는다. 구체적인 비제한적 예에서, 암은 고등급 전립선 상피내 종양, 가족성 선종성 용종증, 또는 유방의 이형성(atypia)이다. 이들 암을 예방하기 위한 방법이 또한 개시된다.
이들 방법은 CD4+ 브라큐리-특이적 T 세포를 유도하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 CD8+ 브라큐리-특이적 T 세포를 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 및 비-효모 세포는 단독으로 또는 제2의 제제, 예컨대 방사선 요법 및/또는 화학요법과 함께 피험체에게 투여될 수 있다.
추가적인 실시태양에서, 피험체에서 암 세포의 성장을 저해하는 방법이 제공된다. 이들 방법은 수지상 세포를 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포와 접촉시키는 단계를 포함함으로써 특이적 항원 제시 세포를 제조한다. 이들 방법은 또한 항원 제시 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 포함함으로써 면역 반응을 유도하고 암의 성장을 저해한다.
방법은 치료가 필요한 피험체, 예컨대 브라큐리를 발현하는 암 또는 브라큐리를 발현하는 잠재력을 갖는 암을 앓는 피험체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 방법은 소장, 위, 신장, 방광, 자궁, 난소, 고환, 폐, 결장, 전립선의 암, B 세포 기원의 종양[예컨대 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종 또는 호지킨(Hodgkin) 림프종] 또는 유방암을 앓는 피험체를 선택하는 단계를 포함하고, 이때 암은 브라큐리를 발현할 수 있거나, 브라큐리를 발현하는 잠재성을 갖는다. 몇몇 비제한적인 예에서, 암은 방사선 내성 및/또는 화학요법 내성이다. 추가적인 비제한적 예에서, 피험체는 유방암, 예컨대 관 암종, 예를 들어 침윤성 관 암종 또는 에스트로겐 수용체 음성 및 프로게스테론 수용체 음성 유방암을 앓는다. 추가의 예에서, 피험체는 고등급 전립선 상피내 종양, 가족성 선종성 용종증, 또는 유방의 이형성을 앓는다.
예시적인 적용에서, 조성물은 브라큐리-발현 세포에 대한 면역 반응, 예컨대 CD4+ T 세포 반응을 상승시키기에 충분한 양으로 피험체에 투여된다. 브라큐리 특이적 CD8+ T 세포 반응은 또한 본원에 개시된 방법을 사용하여 유도될 수 있다. 투여는 브라큐리-발현 세포의 증식을 둔화시키거나, 이들의 성장을 저해하거나, 암의 징후 또는 증후를 감소시키거나, 암을 예방하기에 충분한 면역 반응을 유도한다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질병의 위중성, 환자 건강의 일반적 상태, 및 환자의 면역 시스템의 강건함에 좌우될 것이다. 하나의 예에서, 조성물의 치료학적 효과량은 증후(들)의 주관적 완화 또는 임상가나 다른 자격이 있는 관찰가에 의해 주지된 바와 같이 객관적으로 식별가능한 개선을 제공하는 양이다.
조성물은 당분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 이와 같이, 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로, 예컨대 근육내, 피하, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있지만, 경구, 비강, 경피 또는 항문 투여 또한 고려된다. 하나의 실시태양에서, 투여는 피하 또는 근육내 주사에 의해서이다.
폴리펩티드는 이식물로서, 오일성 주사제로서, 리포솜으로 또는 미립자 시스템으로서 제공될 수 있다. 미립자 시스템은 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미소구체, 나노캡슐, 또는 유사한 입자일 수 있다. 합성 중합체에 기초한 미립자 담체는 제어된 방출을 제공하는데 더하여 면역 반응을 향상시키는 보조제로서 작용하는 것으로 제시되었다. 보조제는 또한 단백질과 함께 사용될 수 있고, 예를 들어, 키토산, 알루미늄 염, 면역자극성 올리고데옥시뉴클레오티드, 리포솜 및/또는 하나 이상의 사이토킨이 포함된다. 폴리펩티드는 리포솜으로 투여될 수 있다.
하나의 구체적인 비제한적 예에서, 폴리펩티드는 체액성(항체) 반응에 비하여 세포 반응(즉, 브라큐리 특이적 CD4+ 반응 및/또는 CD8+ 반응)으로 면역 반응을 유도하는 방식으로 투여된다. 폴리펩티드는 브라큐리 특이적 CD4+ T 세포 반응 및 브라큐리 특이적 CD8+ T 세포 반응 둘 다를 유도할 수 있다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 측정하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 생물학적 검정, ELISPOT 검정, 및 형광 활성화 세포 분류를 포함한다. 브라큐리 특이적 CD4+ T 세포를 측정하기 위한 예시적인 검정은 하기 실시예에 개시된다.
하나의 구체적인 비제한적 예에서, 정맥내 투여를 위한 약학 조성물은 1 일 당 환자 당 약 0.1 μg 내지 10 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 1 일 당 환자 당0.1 내지 약 100 mg의 투여량이 사용될 수 있고, 특별히 제제가 순환계나 림프계 내로가 아닌 고립된 자리, 예컨대 체강 내로 또는 기관의 내강 내로 투여되는 경우 그러하다. 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 공지되어 있거나 당분야의 숙련가에게 분명할 것이며, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995]과 같은 출판물에 더욱 상세히 기재되어 있다.
임의적으로, 하나 이상의 면역자극성 분자, 예컨대 IL-2, IL-6, IL-12, LFA(예를 들어, LFA-1, LFA-2 및/또는 LFA-3), CD72, RANTES, G-CSF, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, ICAM-1, B7-1, B7-2, 기타 B7 관련 분자, OX-40L 및/또는 41 BBL, 또는 이들 분자의 조합물이 생물학적 보조제로서 사용될 수 있다[예를 들어, 살갈러(Salgaller) 등의 문헌 "1998, J. Surg. Oncol. 68(2): 122-38"; 로체(Lotze) 등의 문헌 "2000, Cancer J Sci. Am. 6(Suppl l): S61-6"; 카오(Cao) 등의 문헌 "1998, Stem Cells 16(Suppl 1): 251-60"; 쿠이퍼(Kuiper) 등의 문헌 "2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465: 381-90" 참조]. 이들 분자는 숙주에 전신으로(또는 국소로) 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, B7-1 B7-2, OX-40L, 41 BBL 및/또는 ICAM-1이 투여된다. IL-15 또는 IL-15/IL-15 수용체 복합체가 투여될 수 있다.
시험관내 및 생체내 둘 다에서 세포 반응을 유도하기 위한 다수의 수단이 공지되어 있다. 지질은, 생체내에서 다양한 항원에 대해 T 세포를 프라이밍(priming)하는 것을 도울 수 있는 제제로서 식별되었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,662,907호에 기재된 바와 같이, 팔미트산 잔기는 라이신 잔기의 알파 및 엡실론 아미노 기에 부착되고, 이어서 (예를 들어, 하나 이상의 연결 잔기, 예컨대 글리신, 글리신-글리신, 세린, 세린-세린 등을 경유하여) 면역원성 폴리펩티드 또는 단백질에 연결될 수 있다. 이어서 지질화된 폴리펩티드는 미셀(micell) 형태로 직접적으로 주사되거나, 리포솜으로 혼입되거나, 보조제에 유화될 수 있다. 또 다른 예로서, 에스케리치아 콜라이 지방단백질, 예컨대 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인라이세릴-세린은, 적절한 폴리펩티드 또는 단백질에 공유적으로 결합될 경우 종양 특이적 T 세포를 프라이밍하기 위해 사용될 수 있다[데레스(Deres) 등의 문헌 "Nature 342: 561, 1989" 참조]. 추가로, 중화 항체의 도입은 또한 적절한 에피토프를 표시하는 단백질에 컨주게이션(conjugation)된 동일한 분자에 의해 프라이밍될 수 있으므로, 2가지 조성물이 조합되어 체액성 및 세포-중재된 반응 둘 다를 이끌어낼 수 있고, 이때 이는 바람직하게 여겨진다.
하나의 실시태양에서, 폴리펩티드는 둘 이상의 안정화 세제, 미셀-형성 제제, 및 오일을 함유하는 보조제와 혼합된다. 적합한 안정화 세제, 미셀-형성 제제, 및 오일은 미국 특허 제5,585,103호; 미국 특허 제5,709,860호; 미국 특허 제5,270,202호; 및 미국 특허 제5,695,770호에 상세화되어 있다. 안정화 세제는 유화액의 성분들이 안정한 유화액으로서 남아있도록 허용하는 임의의 세제이다. 이러한 세제로는 폴리소르베이트, 트윈(TWEEN) 80[소르비탄-모노-9-옥타데세노에이트-폴리(옥시-1,2-에탄디일; 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재의 ICI 아메리카스(Americas)에 의해 제작됨], 트윈 40(상표명), 트윈 20(상표명) 트윈 60(상표명), 쯔비터겐트(Zwittergent: 상표명) 3-12, 티폴(TEEPOL) HB7(상표명) 및 스판(SPAN) 85(상표명)이 포함된다. 이들 세제는 보통 약 0.05 내지 0.5%, 예컨대 약 0.2%의 양으로 제공된다. 미셀 형성 제제는 미셀-유사 구조가 형성되도록 다른 성분들과 함께 형성된 유화액을 안정화시킬 수 있는 제제이다. 이러한 제제는 세포 반응을 향상시키도록 대식세포를 소집하기 때문에 일반적으로 주사 자리에서 약간의 자극을 야기한다. 이러한 제제의 예로는 BASF 와이언도트(Wyandotte) 출판물, 예를 들어, 슈몰카(Schmolka)의 문헌[J. Am. Oil. Chem. Soc. 54: 110, 1977], 및 헌터(Hunter) 등의 문헌[J. Immunol 129: 1244, 1981]에 기재된 중합체 계면활성제, 플루로닉(PLURONIC: 상표명) L62LF, L101, 및 L64, PEG1000, 및 테트로닉(TETRONIC: 상표명) 1501, 150R1, 701, 901, 1301, 및 130R1이 포함된다. 이러한 제제의 화학적 구조는 당분야에 잘 공지되어 있다. 하나의 실시태양에서, 제제는, 헌터(Hunter) 및 베네트(Bennett)의 문헌[J. Immun. 133: 3167, 1984]에 정의된 바와 같이, 0 내지 2의 친수성-친유성 균형(HLB: hydrophile-lipophile balance)을 갖도록 선택된다, 제제는 효과적인 양으로, 예를 들어 0.5 내지 10%, 또는 1.25 내지 5%의 양으로 제공될 수 있다.
조성물에 포함되는 오일은 수중유적형 유화액 내에서의 항원의 보유를 촉진시키기 위해, 예컨대 원하는 항원을 위한 비히클을 제공하기 위해 선택되고, 바람직하게는 유화액이 실온(약 20℃ 내지 25℃)에서 형성되도록, 또는 일단 유화액의 온도가 실온으로 떨어질 경우, 65℃ 미만의 용융 온도를 갖는다. 이러한 오일의 예로는 스쿠알렌(squalene), 스쿠알란(Squalane), 에이코산(EICOSANE: 상표명), 테트라테트라콘탄(tetratetracontane), 글리세롤, 및 땅콩 오일 또는 기타 식물성 오일이 포함된다. 하나의 구체적인 비제한적 예에서, 오일은 1 내지 10%, 또는 2.5 내지 5%의 양으로 제공된다. 오일은, 시간에 따라 체내에서 오일이 분쇄될 수 있고 오일의 사용시 부작용, 예컨대 육아종이 나타나지 않도록, 생분해가능하면서 생물화합성이어야 한다.
하나의 실시태양에서, 보조제는 안정화 세제, 미셀-형성 제제, 및 오일의 혼합물로서, 프로백스(PROVAX: 등록상표)[미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 IDEC 파마슈티칼스(Pharmaceuticals)]라는 명칭하에 입수가능하다.
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물은 임의의 방법에 의해 숙주에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 비-효모 벡터로서)은 임의의 다양한 기법에 의해, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이, 세포를 폴리펩티드, 핵산, 또는 구성물의 일부로서 핵산을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 세포내로(예를 들어, 숙주에) 도입될 수 있고, 이는 핵산의 전달 및 발현을 가능하게 한다. 세포에 핵산을 도입하고 발현시키기 위한 구체적인 프로토콜은 당분야에 공지되어 있다[예를 들어, 샘브룩(Sambrook) 등(편집)의 상기 문헌; 및 어수벨(Ausubel) 등의 상기 문헌 참조].
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 및 조성물을 숙주(피험체)에게 투여하는 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 숙주(피험체)는 임의의 적합한 숙주, 예컨대 포유동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 또는 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 소, 말, 영장류, 또는 인간)일 수 있다.
예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 또는 비-효모 벡터(예를 들어, 재조합 폭스바이러스)는, 종양세포를 폴리펩티드, 핵산, 또는 비-효모 벡터에 생체외 노출시키거나, 폴리펩티드, 핵산, 또는 비-효모 벡터를 숙주내로 주사함으로써 숙주에 투여될 수 있다. 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터(예를 들어, 재조합 폭스바이러스) 또는 비-효모 벡터의 조합물, 비-효모 세포, 및 조성물은, 암 병변 또는 종양 내에 직접 주사함으로써, 또는 국부적 적용에 의해(예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께) 직접적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 국소적으로 투여됨).
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물은 단독으로, 또는 보조제와 함께, 리포솜 내로 혼입되어(예를 들어, 미국 특허 제5,643,599호, 제5,464,630호, 제5,059,421호, 및 제4,885,172호에 기재된 바와 같음), 사이토킨과 함께, 생물학적 반응 변형제[예를 들어, 인터페론, 인터류킨-2(IL-2), 및 집락-자극 인자(CSF, GM-CSF, 및 G-CSF)], 또는 면역 반응을 향상시키는 것으로 당분야에 공지된 기타 시약과 함께 투여될 수 있다.
적합한 보조제의 예로는 명반, 알루미늄 염, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄, 알루미늄 실리카, 인산 칼슘, 불완전한 프로인트(Freund) 보조제, QS21, MLP-A, 및 리비 데톡스(RIBI DETOX: 상표명)가 포함된다.
본 발명에 사용하기에 특별히 바람직한 보조제는 사이토킨 GM-CSF이다. GM-CSF는 효과적인 백신 보조제인 것으로 제시되었는데, 이는 수지상 세포에 의한 제시 및 항원 가공을 향상시키기 때문이다. 실험적 및 임상적 연구에 따르면, 재조합 GM-CSF는 다양한 면역원에서 유도되는 숙주 면역력을 증강(boost)시킬 수 있다.
GM-CSF는 바이러스성 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)를 사용하여, 또는 약학 제형에서의 단리된 단백질로서 투여될 수 있다. GM-CSF는, 숙주에서 항원-특이적 면역 반응을 향상시키기 위해, 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 세포, 또는 이의 조성물을 초기에 투여하기 전, 투여하는 동안, 또는 투여한 후에 숙주에 투여될 수 있다. 예를 들어, 재조합 GM-CSF 단백질은 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 세포, 또는 이의 조성물이 백신접종된 각각의 날짜, 및 각각 후속되는 3 일 동안 숙주에 투여될 수 있다(즉 총 4 일). GM-CSF의 임의의 적합한 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 50 내지 500 μg(예를 들어, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 및 이들의 범위)의 재조합 GM-CSF가 1 일 당 투여될 수 있다. GM-CSF는 임의의 적합한 방법에 의해(예를 들어, 피하로) 투여될 수 있고, 바람직하게는, 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 세포, 또는 이의 조성물을 숙주에 백신접종한 자리에 또는 그 부근에 투여된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 면역원성을 향상시키기 위해 헬퍼 펩티드 또는 큰 담체 분자에 컨주게이션될 수 있다. 이들 분자로는, 제한되지 않지만, 인플루엔자 펩티드, 파상풍 변독소, 파상풍 변독소 CD4 에피토프, 슈도모나스 외독소 A, 폴리-L-라이신, 지질 꼬리(lipid tail), 소포체(ER: endoplasmic reticulum) 신호 서열 등이 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 당분야에 허용된 방법을 사용하여 면역글로불린 분자에 컨주게이션될 수 있다. 면역글로불린 분자는 종양 세포 위에 제시되지만 정상 세포 상에서는 존재하지 않거나 매우 적은 양인 표면 수용체에 특이적일 수 있다. 면역글로불린은 또한 특정 조직(예를 들어, 유방, 난소, 결장, 또는 전립선 조직)에 대해 특이적일 수 있다. 이러한 폴리펩티드-면역글로불린 컨주게이트(conjugate)는 펩티드를 특정 조직 및/또는 세포에 대해 표적화시킬 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 세포 또는 이의 조성물의 임의의 적합한 용량이 숙주에 투여될 수 있다. 적절한 용량은 숙주의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적인 의학적 상태, 이전의 병력, 질환 진행, 및 종양 크기와 같은 인자들에 따라 달라질 것이고, 임상가에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 펩티드는 숙주(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)의 백신접종 당 약 0.05 mg 내지 약 10 mg(예를 들어, 0.1 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 및 이들의 범위)의 용량으로, 바람직하게는 백신접종 당 약 0.1 mg 내지 약 5 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 몇몇 용량(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상)이 제공될 수 있다(예를 들어, 수 주 또는 수 개월의 기간에 걸쳐). 하나의 실시태양에서 용량은 3 개월 동안 매 달 제공된다.
비-효모 벡터가 바이러스성 벡터인 경우, 적합한 용량은 약 1 x 105 내지 약 1 x 1012(예를 들어, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 및 이들의 범위)의 플라크 형성 단위(pfu: plaque forming unit)를 포함할 수 있지만, 더 낮거나 더 높은 용량이 숙주에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약 2 x 108 pfu가 투여될 수 있다(예를 들어, 약 0.5 ㎖의 부피로).
본 발명의 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포)는 주입 당 약 1 x 105 내지 2 x 1011(예를 들어, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 및 이들의 범위) 세포의 용량으로 숙주에 투여될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 1 내지 3(예를 들어, 2) 회 주입으로 투여될 수 있다. 세포의 투여에 더하여, 숙주에 생물학적 반응 변형제, 예컨대 인터류킨 2(IL-2)가 투여될 수 있다. 투여되는 세포가 세포독성 T 세포인 경우, 세포독성 T 세포를 프라이밍하여 T 세포 수를 생체내에서 추가로 팽창시키기 위해, 세포독성 T 세포의 투여 이후 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 또는 이의 조성물의 투여가 수반될 수 있다.
투여되는 세포가 수지상 세포인 경우, 피험체에 투여되는 수지상 세포의 양은 피험체의 조건에 따라 달라질 것이고, 의사가 모든 적절한 인자들을 고려하여 결정해야 할 것이다. 바람직하게는, 약 1 x 1O6 내지 약 1 x 1O12(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포 수의 범위를 포함하여, 약 1 x 1O7, 약 1 x 1O8, 약 1 x 1O9, 약 1 x 1O10, 또는 약 1 x 1O11)의 수지상 세포가 성인을 위해 이용된다. 이들 양은 피험체의 연령, 체중, 크기, 증상, 성별, 치료되는 종양의 유형, 투여 경로, 치료가 국소적인지 전신적인지의 여부, 및 기타 인자들에 따라 달라질 것이다. 당분야의 숙련가라면 적절한 투여량, 및 특정한 환경 및 피험체의 요구에 맞춘 투여 계획을 쉽게 도출해야 한다.
본 발명은 프라이밍 및 증강 프로토콜을 포함한다. 특별히, 이러한 프로토콜은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 재조합 비-효모 벡터 및 임의적으로 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 포함하는 조성물에 의한 초기 "프라이밍"을 포함하고, 이후 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 재조합 비-효모 벡터 및 임의적으로 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 포함하는 조성물에 의한 1 회 또는 바람직하게는 다수 회의 "증강"이 수반된다.
초기 프라이밍 백신접종은 하나 이상의 비-효모 벡터를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 임의적으로 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 전달하기 위해 단일 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)가 사용된다. 또 다른 실시태양에서, 둘 이상의 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)가 프라이밍 백신접종을 구성하고, 이는 단일 주사로 동시에 투여된다.
증강 백신접종은 또한 하나 이상의 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 증강 백신접종의 본 발명의 폴리펩티드 및 임의적으로 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 전달하기 위해 단일 비-효모 벡터가 사용된다. 또 다른 실시태양에서, 둘 이상의 비-효모 벡터가 증강 백신접종을 구성하고, 이는 단일 주사로 동시에 투여된다.
상이한 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)는, 상이한 시간 간격에서의 접종을 위해 치료 분자의 상이한 집합을 운반하는 벡터를 사용하는 이종성 프라이밍/증강 프로토콜을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 이종성 프라이밍/증강 조합에서, 제1 오르토폭스 벡터 조성물은 프라이밍을 위해 사용되고, 제2 아비폭스 벡터 조성물은 증강을 위해 사용된다.
비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)의 투여를 위한 계획은 전형적으로 증강 벡터의 반복된 투여를 포함한다. 증강 벡터는 임의의 적합한 시간 간격에(예를 들어, 2 내지 4 주 마다) 임의의 적합한 시간 길이 동안(예를 들어, 적어도 총 5 내지 15 회의 증강 백신접종을 위해 6 내지 12 주 동안) 1 내지 3 회(예를 들어, 1, 2, 또는 3 회) 투여될 수 있다. 예를 들어, 1차 백신접종은 재조합 백시니아 또는 MVA 벡터를 포함할 수 있고, 이후 아비폭스 벡터에 의한 다수의 증강 백신접종이 수반된다. 특별한 실시태양에서, 숙주는 프라이밍 벡터에 의한 1 회의 백신접종을 받고, 이후 2 주 마다 6 회의 증강을 위해 증강 벡터에 의해 백신접종을 받고, 이후 4 주 마다 증강 벡터에 의해 백신접종을 받고, 질환 진행에 따라서 일정 기간 동안 증강 벡터에 의한 백신접종이 지속된다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체에서 적어도 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 게놈 내로 또는 일부에 혼입된 제1 재조합 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)를 갖는 키트를 추가로 제공한다. 제1 재조합 비-효모 벡터(예를 들어, 폭스바이러스 벡터)는 또한 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 제1 재조합 비-효모 벡터에 더하여, 키트는 약학적으로 허용가능한 담체에서 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 제2 재조합 비-효모 벡터를 가질 수 있다. 키트는 추가로 용기, 주사 바늘, 및 키트의 사용 방법에 대한 지침서를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 키트는 추가로 보조제, 예컨대 GM-CSF, 및/또는 상업적으로 입수가능한 보조제를 키트 성분들과 함께 사용하기 위한 지침서를 제공한다.
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물은 다양한 경로로, 예컨대, 제한되지 않지만, 피하, 근육내, 피내, 복강내, 정맥내, 및 종양내로 투여될 수 있다. 다중 투여가 제공될 경우, 숙주에서 하나 이상의 자리에 투여될 수 있다.
폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물의 투여는 "예방학적" 또는 "치료학적"일 수 있다. 예방학적으로 제공될 경우, 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물은 종양 형성 이전에 제공되어, 숙주의 면역 시스템이 숙주에서 진행될 수 있는 종양에 대항하여 싸울 수 있도록 허용한다. 예를 들어, 유전적인 암 감수성을 갖는 숙주는 이러한 예방학적 면역법으로 치료되는 바람직한 환자 그룹이다. 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물의 예방학적 투여는 암을 예방하거나, 개선시키거나, 지연시킬 수 있다. 치료학적으로 제공되는 경우, 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물은 암의 진단시 또는 진단 후에 제공된다.
숙주가 암 또는 전이성 암을 갖는 것으로 진단된 경우, 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물은 다른 치료학적 처치, 예컨대 화학요법 또는 방사선과 요법과 함께 투여될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 숙주로의 폴리펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 이의 조성물의 투여는 본 발명의 폴리펩티드 및 (공동-투여되는) 임의적으로 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프를 발현하는 숙주 세포를 생성한다. 본 발명의 폴리펩티드는 감염된 숙주 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있다. 하나 이상의 면역자극성/조절성 분자 및/또는 기타 종양-연관된 항원(예를 들어, CEA, MUC), 이의 변형된 형태, 및 이의 면역원성 에피토프는 세포 표면에서 발현될 수 있거나, 숙주 세포에 의해 활성적으로 분비될 수 있다. 에피토프 및 면역자극성/조절성 분자 둘 다의 발현은 특이적 T 세포에 대한 필수적인 MHC 제한된 펩티드 및 T 세포에 대한 적절한 신호를 제공하여, 항원 특이적 T 세포의 항원 인식, 및 증식 또는 클론 팽창을 돕는다. 전체적으로, 면역 시스템이 상향조절된다. 바람직하게는, 면역 반응의 상향조절은 항원 특이적 T-헬퍼 림프구 및/또는 세포독성 림프구의 증가이고, 이는 암(예를 들어, 유방암, 난소암, 결장암, 폐암, 갑상선암, 위암, 두경부암, 또는 전립선암) 세포의 성장을 사멸시키거나 저해할 수 있다.
본 발명의 방법을 위한 약학 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 및 복강내 투여를 위한 하기 제형들은 예시적이고, 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 당분야의 숙련가라면, 본 발명의 펩티드, 핵산, 비-효모 벡터, 비-효모 세포, 또는 조성물을 투여하는 이들 경로는 공지되어 있고, 특정 화합물을 투여하기 위해 여러 경로들이 사용될 수 있지만, 특정 경로는 또 다른 경로에 비해 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인식할 것이다.
이들 제형중 주사가능한 제형이 본 발명에 따라 바람직하다. 주사가능한 조성물을 위해 효과적인 약학 담체의 요건은 당분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다[예를 들어, 문헌 "Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250(1982)", 및 "ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)" 참조].
비경구적 투여에 적합한 제형은 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사 용액(이는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 의도된 수용자의 혈액과 제형을 등장성이도록 만드는 용질을 함유할 수 있음), 및 수성 및 비-수성 멸균 현탁액(이는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 함유할 수 있음)을 포함한다. 펩티드, 핵산, 벡터, 세포, 또는 이의 조성물은, 약학적으로 허용가능한 계면활성제, 예컨대 비누 또는 세제, 현탁제, 예컨대 펙틴, 카보머(carbomer), 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 또는 카복시메틸셀룰로스, 또는 유화제 및 기타 약학 보조제의 첨가 또는 부재하에, 약학 담체, 예컨대 물, 염수, 수성 덱스트로즈 및 관련된 당 용액, 알코올, 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 또는 헥사데실 알코올, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 글리세롤 케탈, 예컨대 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올, 에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 400, 오일, 지방산, 지방산 에스테르 또는 글리세라이드, 또는 아세틸화 지방산 글리세라이드를 비롯한 멸균 액체 또는 액체들의 혼합물에서 생리학적으로 허용가능한 희석액으로 투여될 수 있다.
비경구적 제형에 사용될 수 있는 오일로는 석유, 동물성 오일, 식물성 오일, 및 합성 오일이 포함된다. 오일의 구체적인 예로는 땅콩유, 대두유, 참깨유, 목화씨유, 올리브유, 광유(petrolatum), 및 미네랄 오일이 포함된다. 비경구적 제형에 적합한 지방산으로는 올레산, 스테아르산, 및 이소스테아르산이 포함된다. 에틸 올리에이트 및 이소프로필 미리스테이트가 적합한 지방산 에스테르의 예이다.
비경구적 제형에 사용하기에 적합한 비누로는 지방 알칼리 금속, 암모늄, 및 트리에탄올아민 염이 포함되고, 적합한 세제로는 (a) 양이온성 세제, 예컨대, 예를 들어, 디메틸 디알킬 암모늄 할로겐화물, 및 알킬 피리디늄 할로겐화물, (b) 음이온성 세제, 예컨대, 예를 들어, 알킬, 아릴, 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에테르, 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포석시네이트, (c) 비이온성 세제, 예컨대, 예를 들어, 지방 산화 아민, 지방산 알카놀아미드, 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체, (d) 양쪽성 세제, 예컨대, 예를 들어, 알킬-b-아미노프로피오네이트, 및 2-알킬-이미다졸린 4급 암모늄 염, 및 (e) 이의 혼합물이 포함된다.
보존제 및 완충제가 사용될 수 있다. 주사 자리에서 자극을 최소화하거나 없애기 위해, 이러한 조성물은 약 12 내지 약 17의 친수성-친유성 균형(HLB)을 갖는 하나 이상의 비이온성 계면활성제를 함유할 수 있다. 이러한 제형에서 계면활성제의 양은 전형적으로 약 5% 내지 약 15%(중량) 범위일 것이다. 적합한 계면활성제로는 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올리에이트, 및 산화 프로필렌과 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성되는, 산화 에틸렌과 소수성 염기의 고분자량 부가물이 포함된다.
비경구적 제형은 단위-용량 또는 다중-용량의 밀봉된 용기, 예컨대 앰플(ampoule) 및 바이알(vial) 내에 제공될 수 있고, 사용 직전에 주사를 위해 멸균 액체 부형제, 예를 들어, 물만 첨가하면 되는 냉동-건조(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론, 이의 범주를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는 실시예 2에 기재된 실험을 위한 재료 및 방법을 제공한다.
바이러스성 구성
가비츠쉬(Gabitzsch) 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother. 2010; 59: 1131-1135] 및 아말피타노(Amalfitano) 등의 문헌[J Virol. 1998; 72: 926-933]에 이전에 기재된 바와 같이, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA 및 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1을 구성하고 생산하였다. 간단히, 상동 재조합-기반 접근법을 사용하여 전이유전자를 서브클로닝(subcloning)하였다. 복제 결핍 바이러스를 E.C7 패키징 세포주에서 번식시키고, CsC12 정제하고, 아말피타노(Amalfitano) 등의 상기 문헌에 이전에 기재된 바와 같이 적정하였다. 바이러스 감염 역가를 E.C7 세포 단일층 상에서 플라크 형성 단위(PFU)로서 결정하였다. VP 농도를 도데실 황산 나트륨(SDS: sodium dodecyl sulfate) 파열, 및 260 nm 및 280 nm에서의 분광광도법[비라퀘스트(ViraQuest), 아이오와주 노쓰 리버티]에 의해 결정하였다. CEA 전이유전자는 또한 고 면역원성 에피토프 CAP1-6D를 포함하는 변형된 CEA를 포함한다[살라자르(Salazar) 등의 문헌 "Int J Cancer. 2000; 85: 829-838"; 및 자렘바(Zaremba) 등의 문헌 "Cancer Res. 1997; 57: 4570-4577" 참조].
인간 브라큐리 단백질(NM_003181.3)을 인코딩하는 서열을 인헨서 T-세포 HLA-A2 에피토프(WLLPGTSTV)의 도입[투커(Tucker) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317" 참조] 및 DNA 결합에 관여된 25개 아미노산 단편의 제거에 의해 변형시켰다. 생성된 구성물을 후속적으로 Ad5 벡터 내로 서브클로닝하여 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리 구성물을 생성하였다.
MUC1 분자는 다음의 2개의 영역으로 구성된다: MUC1의 대형 세포외 도메인인 N-말단(MUC1-N); 및 3개의 영역, 즉 소형 세포외 도메인, 단일 막간 도메인, 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 갖는 C-말단(MUC1-C)[란(Lan) 등의 문헌 "J Biol Chem. 1990; 265: 15294-15299" 참조]. 세포질 꼬리는 신호발생 단백질과 상호작용하기 위한 자리를 함유하고, 종양유전자 및 암 이동, 침입 및 전이의 구동체로서 작용하는 것으로 제시되었다[웨이(Wei) 등의 문헌 "Cancer Res. 2007; 67: 1853-1858"; 및 리(Li) 등의 문헌 "J Biol Chem. 2001; 276: 35239-35242" 참조].
Ad5[E1-, E2b-]-MUC1의 구성을 위해, 이전에 기재된 8개의 작용물질 에피토프[창(Tsang) 등의 문헌 "Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149"; 및 조켐스(Jochems) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174" 참조]를 포함하는 전체 MUC1 전이유전자를 Ad5 벡터 내로 서브클로닝하였다. Ad5[E1-, E2b-J-MUC1 벡터에 포함된 작용물질 에피토프는 HLA-A2(N-말단중의 에피토프 P93L, VNTR 영역중의 V1A 및 V2A, 및 C-말단중의 C1A, C2A 및 C3A), HLA-A3(에피토프 C5A), 및 HLA-A24(C-말단중의 에피토프 C6A)에 결합된다. 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA 및 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1을 1 : 1 : 1의 비(총 3 x 1010 VP)로 조합함으로써 트리-Ad5 백신을 생산하였다.
PBMC로부터의 인간 DC의 생성
이전에 기재된 방법[세레다(Cereda) 등의 문헌 "Vaccine. 2011; 29: 4992-4999" 참조]을 사용하여, 이필리무맙(ipilimumab)과 조합된 PSA-TRICOM 백신[마단(Madan) 등의 문헌 "Lancet Oncol. 2012; 13: 501-508" 참조]에 의해, 임상 실험에 등록한 전립선 암 환자(HLA-A2+ 및 -A24+)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)로부터 수지상 세포(DC)를 생성하였다. 백신접종 후, 이러한 환자로부터의 PBMC를 사용하여, CEA, MUC1, 및 브라큐리에 특이적인 개별 T-세포주를 확립할 수 있었다. 미국 국립 보건원(NIH: National Institutes of Health) 임상 센터의 기관 감시 위원회(Institutional Review Board)는 이러한 절차를 승인하였고, 사전 동의는 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 얻었다. 간단히, 림프구 분리 배지 구배[ICN 바이오케미칼스(Biochemicals), 버지니아주 오로라]를 사용하여 PBMC를 단리하고, AIM-V 배지(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드)에 재현탁시키고(2 x 107 세포), 6-웰 플레이트에서 2 시간 동안 접착되도록 하였다. 접착성 세포를 100 ng/㎖의 재조합 인간(rh) GM-CSF 및 20 ng/㎖의 rhIL-4가 함유된 AIM-V 배지에서 5 일 동안 배양하였다. 배양 배지를 3일 마다 보충하였다.
아데노바이러스 벡터에 의한 인간 DC의 감염
1 ㎖의 AIM-V 배지중 수지상 세포(2 x 105)를 지시된 감염 다중도(10,000 또는 20,000의 MOI)로 아데노바이러스 벡터(Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, 및 Ad5[E1-, E2b-]-null)에 의해 1 시간 동안 6-웰 플레이트에서 감염시켰다. 이어서 AIM-V 배지(4 ㎖)를 각각의 웰에 첨가하고 추가적인 2 일 동안 항온처리하였다. 전이유전자 발현의 효능을 분석하기 위해, DC를 수거하고, 유세포분석 및 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 분석하였다. 표현형 분석의 경우, CD80, CD83, CD86, CEA, 및 HLA-DR의 발현을 위해 BV421-컨주게이션된 항-CD80, PerCP Cy5.5-컨주게이션된 항-CD83, APC-Cy7-컨주게이션된 항-HLA-DR, PE-컨주게이션된 항-CD86, 및 FITC-컨주게이션된 항-CEA를 사용하여 DC를 염색하였다. 유세포분석을 위한 항체를 BD 바이오사이언스(Bioscience)(캘리포니아주 산 호세)로부터 구입하였다.
아데노바이러스-감염된 DC를 사용하는 T-세포주의 생산
창(Tsang) 등의 문헌[J Natl Cancer Inst. 1995; 87: 982-990]에 기재된 방법을 변형시켜서 CEA-, MUC1- 및 브라큐리-특이적 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte)를 생성하였다. 수지상 세포(1 ㎖의 AIM-V에서 1-2 x 105/웰)를, 상기 기재된 바와 같이, 20,000 MOI의 Tri-Ad5에 의해 감염시켰다. 자가유래 비접착성 세포의 자극을 위해 감염된 DC를 10 : 1의 효과자-APC 비에서 APC로서 사용하였다. 배양물을 3 일 동안 37℃에서 5% C02가 함유된 습윤 대기하에 항온처리하였다.
이어서 배양액에 7 일 동안 rhIL-2를 보충하였고; IL-2 함유 배지를 3 일 마다 보충하였다. 10-일 자극은 1 회의 시험관내 자극(1VS) 주기로 구성되었다. 자가유래 벡터-감염된 DC를 3 회의 IVS를 위한 APC로서 사용하였다. 3 회의 IVS 이후 자가유래 펩티드-진동된 B 세포를 사용하여 항원-특이적 CTL을 재자극하였다. T-세포주를 IL-7 및 IL-15[10 ng/㎖; 페프로테크(PeproTech), 뉴저지주 록키 힐]가 함유된 배지에서 유지시켰다.
세포독성 검정
창(Tsang) 등의 문헌[Cancer Res. 2001; 61: 7568-7576]에 기재된 프로토콜을 변형시켜서 CTL 분석을 수행하였다. 간단히, 표적 세포를 50 μCi의 111인듐 산화물[지이 헬쓰 케어(GE Health Care), 버지니아주 비에나]에 의해 37℃에서 20 분 동안 표지화하고, 96-웰 환저 배양 플레이트에서 3,000 세포/웰로 사용하였다. T 세포를 상이한 비로 첨가하고 37℃에서 16 시간 동안 항온처리하였다. 감마 계수를 위해 상청액을 수거하였다. 3중으로 측정을 실행하고 SD를 계산하였다. 단지 배지와 함께 표적 세포를 항온처리하여 자발적 방출을 결정하였고, 0.25% 트리톤(Triton) X-100과 함께 항온처리하여 완전한 용해를 결정하였다. 하기 식을 사용하여 특이적 용해를 계산하였다: 용해율(%) = [관찰된 방출(CPM) - 자발적 방출(CPM)] / [완전한 방출(CPM) - 자발적 방출(CPM)] x 100.
종양 세포 배양
인간 결장 암종 SW620(HLA-A2+, HLA-A24+, 브라큐리+, MUC1+, CEA+) 및 췌장 암종 ASPC-1(HLA-A1+, HLA-A26+, MUC1+) 세포주를 미국 균주 은행(버지니아주 마나사스)으로부터 수득하였다. 세포 배양물에는 마이코플라스마(mycoplasma)가 존재하지 않았고, 완전 배지(10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 μg/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640)[메디아테크(Mediatech), 버지니아주 헤른돈]에 유지시켰다.
사이토킨의 검출
IL-2-부재 배지에서 아데노바이러스 벡터로 감염된 DC 또는 펩티드-진동된 DC에 의해 24 시간 동안 자극된 T 세포의 상청액을 ELISA 키트(인비트로겐, 매릴랜드주 프레더릭)에 의해 IFN-γ의 분비에 대해 평가하였다. 이러한 분석에 사용된 항원-특이적 T-세포주는 이전에 보고되었다: (a) HLA-A2 CEA-특이적 CTL[팔레나(Palena) 등의 문헌 "Cytokine. 2003; 24: 128-142"], (b) HLA-A2 MUC1-특이적 CTL[창(Tsang) 등의 문헌 "Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149"], (c) HLA-A24 MUC1-특이적 CTL[조켐스(Jochems) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174"], 및 (d) HLA-A2 브라큐리-특이적 CTL[투커(Tucker) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317"].
펩티드
하기 HLA-A2 및 HLA-A24 결합 펩티드를 본 연구에 사용하였다: (a) HLA-A2 결합 CEA 작용물질 펩티드 CAP1-6D(YLSGADLNL)[자렘바(Zaremba) 등의 문헌 "Cancer Res. 1997; 57: 4570-4577"], (b) HLA-A2 MUC1 작용물질 펩티드 P93L(ALWGQDVTSV)[창(Tsang) 등의 문헌 "Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149"], (c) HLA-A24 결합 MUC1 작용물질 펩티드 C6A(KYHPMSEYAL)[조켐스(Jochems) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174"], 및 (d) HLA-A2 결합 브라큐리 작용물질 펩티드(WLLPGTSTV)[투커(Tucker) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317"]. 모든 펩티드는 96% 이상 순수하고 아메리칸 펩티드 캄파니 인크.(American Peptide Company, Inc.)(캘리포니아주 서니베일)에 의해 제작되었다.
마우스
8 내지 10 주령의, 특이적 병원체-부재의 암컷 C57BL/6 마우스[잭슨 래보레이토리(Jackson Laboratory), 메인주 바 하버]를 감염성 질병 연구 기관(IDRI: Infectious Disease Research Institute)(미국 워싱턴주 시애틀)에 있는 동물 시설에서 사육하였다. 모든 절차를 실험 동물 운영 위원회(IACUC: Institutional Animal Care and Usage Committee) 승인된 프로토콜에 따라 실행하였다.
백신접종 및 비장세포 제조
암컷 C57BL/6 마우스(n = 5)에게 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA 또는 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, 또는 1010 VP의 모든 3가지 바이러스의 1 : 1 : 1 비율의 조합물(Tri-Ad5)을 피하 주사하였다. 대조 마우스에게 3 x 1010 VP의 아데노-null(전이유전자 삽입물이 없음)을 주사하였다. 25 ㎕의 주사 완충액(3% 수크로스를 갖는 20mM HEPES)중의 용량을 투여하였고, 마우스에게 14 일 간격으로 3 회 백신접종하였다. 최종 주사 후 14 일째, 비장 및 혈청을 수집하였다. 혈청을 -20℃에서 냉동시켰다. 70 μΜ 나일론 세포 스트레이너(strainer)[BD 팔콘(Falcon), 캘리포니아주 산 호세]를 통해 비장을 온화하게 밀어 넣음으로써 비장세포 현탁액을 생성하였다. 적혈구 용해 완충액[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스]을 첨가하여 적혈구를 제거하고 비장세포를 2 회 세척하고 R10{L-글루타민(2 mM), HEPES(20 mM)[코닝(Corning), 뉴욕주 코닝], 페니실린 100 U/㎖ 및 스트렙토마이신 100 μg/㎖[하이클론(Hyclone), GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(Healthcare Life Sciences), 유타주 로간], 및 10% 소 태아 혈청(하이클론)이 보충된 RPMI 1640}에 재현탁시켰다. 비장세포를 ELISPOT 및 유세포분석에 의해 사이토킨 생산에 대해 검정하였다.
ELISPOT 검정
상기 기재된 바와 같이, 신선하게 단리된 마우스 비장세포로부터 브라큐리-, CEA- 및 MUC1-특이적 IFN-γ- 또는 IL-2-분비 T 세포를 ELISPOT 검정에 의해 결정하였다. ELISPOT 검정을 제조업체[어피메트릭스 바이오사이언스(Affymetrix Bioscience), 캘리포니아주 산 디에고]의 설명서에 따라 수행하였다. 간단히, 브라큐리 또는 CEA[JPT 펩티드 테크놀로지스(Peptide Technologies), 독일 베를린] 또는 MUC1으로부터 유래된 단일 푸울(pool)에서 0.2 ㎍/웰의 중첩 15량체 펩티드에 의해 2 x 1O5 비장세포를 자극하였다. 양성 대조군으로서 세포를 콘카나발린 A(Con A)에 의해 0.0625 μg/웰의 농도로 자극하였고, SIV-Nef 및 SIV-Vif[미국 국립 보건원(NIH: National Institutes of Health)의 국립 알레르기 감염 질환 연구소(NIAID: National Institute of Allergy and Infectious Diseases), AIDS 분과의 AIDS 연구 및 기준 시약 프로그램(AIDS Research and Reference Reagent Program)]로부터 유래된 중첩 15량체 완전 펩티드 푸울을 비관련 펩티드 대조군으로서 사용하였다. 이뮤노스팟 엘리스팟(Immunospot ELISpot) 플레이트 판독기[셀룰라 테크놀로지(Cellular Technology), 오하이오주 쉐이커 하이츠]를 사용하여 SFC의 수를 결정하고, 결과를 106 비장세포 당 SFC의 수로서 보고하였다.
세포내 사이토킨 자극
비장세포를 상기 지시된 바와 같이 제조하였다. 96-웰 U-형 바닥 플레이트에서 웰 당 1 x 106의 생 비장세포를 사용하여 자극 검정을 수행하였다. 브라큐리, CEA 및 MUC1의 전체 코딩 서열을 포괄하는 중첩 펩티드의 푸울을 11-아미노산 중첩부(overlap)(JPT GmbH)에 의해 15량체로서 합성하였고, 동결건조된 펩티드 푸울을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켰다. SIV-Vif 및 SIV-Nef에 상응하는 유사하게 구성된 펩티드 푸울은 표적-제외(off-target) 대조군으로서 작용하였다. 2 μg/㎖/펩티드로 펩티드 푸울을 6 시간 동안 37℃ 및 5% C02하에 첨가함으로써 R10 배지(RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청, 및 항생제)중의 비장세포를 자극하였고, 단백질 수송 저해제[골기스탑(GolgiStop), BD]를 항온처리물에 2 시간 첨가하였다. 이어서 자극된 비장세포를 림프구 표면 표지 CD8α 및 CD4를 위해 염색시키고, 고정시키고, 투과시킨 다음 IFN-γ 및 TNFα의 세포내 축적을 위해 염색시켰다. 마우스 CD8α(클론 53-6.7), CD4(클론 RM4-5), IFN-γ(클론 XMG1.2), 및 TNFα(클론 MP6-XT22)에 대한 항체를 BD로부터 구입하고 염색을 항-CD16/CD32(클론 2.4G2)의 존재하에 수행하였다. 어큐리(Accuri) C6 유세포분석기(BD)를 사용하여 유세포분석을 수행하고, BD 어큐리 C6 소프트웨어에서 분석하였다.
CEA에 대한 항체를 검출하기 위한 ELISA
ELISA 플레이트[맥시소프(Maxisorp); 눈크(Nunc), 뉴욕주 로체스터]를 0.05M 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.6)중 1OO ng의 인간 CEA(시그마-알드리치)에 의해 코팅하고 하룻밤 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 1% 트윈-20(PBS-T)이 함유된 인산염 완충된 염수로 3 회 세척하고, 이어서 1% BSA가 함유된 PBS로 60 분 동안 실온에서 차단시켰다. 추가적인 3 회 세척 후, PBS-T에서 1/50 희석된 혈청을 웰에 첨가하고 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 퍼옥시다아제(peroxidase) 표지화된 염소 항-마우스 면역글로불린(Ig) G(γ-쇄 특이적)(시그마-알드리치) 항체(1 : 5000의 희석율)를 세척 후 웰에 첨가하고 플레이트를 1 시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3 회 세척하고 1,2-페닐렌-디아민 기질 용액[써모-피셔(Thermo-Fisher), 사이언티픽(Scientific), 매사추세츠주 왈탐]을 각각의 웰에 첨가하였다. 10% 인산을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 흡광도를 492 nm에서 스펙트라맥스(SpectraMax) 190 ELISA 판독기[몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일] 상에서 측정하였다. 이전에 기재된 바와 같이[가비츠쉬(Gabitzsch) 등의 문헌 "Vaccine. 2011; 29: 8101-8107"], 정제된 마우스 IgG에 의해 생성되고 CEA ELISA(시그마-알드리치)와 동시에 개발된 표준 곡선을 참조하여 웰 당 CEA에 결합하는 IgG의 나노그램 당량을 수득하였다. 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 6.3 소프트웨어(몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 결과를 분석하고 정량화하였다.
보체-의존성 세포독성 검정(CDC)
MC38-CEA2 종양 세포를 하룻밤 웰 당 2 x 104 세포의 밀도로 96-웰 조직 배양 마이크로플레이트에서 배양하였다. 열에 의해 비활성화된 마우스 혈청 푸울을 1 : 50의 희석율로 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 이어서 토끼 혈청을 1 : 50의 희석율로 보체의 공급원으로서 첨가하고 세포를 추가적인 2.5 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 프로메가 사이토톡스(Promega Cytotox) 96 비-방사성 세포독성 검정[프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨]을 사용하여, 제조업체의 지시에 따라, 세포 배양 상청액을 검정하였다. MC38-CEA2 세포의 용해율을 하기 식에 의해 계산하였다: 용해율% = (실험값 - 자발성 표적) / (표적 최대값 - 자발성 표적) x 100%.
종양 면역요법
생체내 종양 치료 연구를 위해, 8 내지 10 주령의 암컷 C57BL/6 마우스의 왼쪽 옆구리에 106 MC38-MUC1 세포를 피하로 이식하였다. 마우스를 7-일 간격으로 1010 VP의 아데노-MUC1 또는 Tri-Ad5에 의해 3 회 처리하였다. 대조 마우스에 3 x 1010 VP의 아데노-null을 주사하였다. 2개의 맞은편 치수(a, b)를 측정함으로써 종양 성장을 평가하였고, 부피를 하기 식에 따라서 이전에 기재된 바와 같이 계산하였다[토메이코(Tomayko) 등의 문헌 "Cancer Chemother Pharmacol. 1989; 24: 148-154" 참조]: V = (a x b)2/2(이때 더 짧은 치수는 "a"임). 종양이 1500 m3에 도달하거나 심하게 궤양화될 경우 종양 연구를 종결하였다.
실시예 2
본 실시예는 브라큐리 결실 돌연변이 폴리펩티드를 포함하는 벡터의 생성 및 특징화를 기재한다.
이전에 기재된 바와 같이[가비츠쉬(Gabitzsch) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2010; 59: 1131-1135" 참조], 재조합 Ad5[E1-, E2b-]-CEA를 생성하고 특징지웠다. 재조합 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 및 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리를 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 항-브라큐리-특이적 단일클론 항체(MAb 54-1)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석한 결과, 인간 수지상 세포(DC)가 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리로 감염되는 경우 브라큐리가 발현되는 것으로 밝혀졌다. 임의의 전이유전자가 없는 Ad5[E1-, E2b-] 벡터(Ad5[E1-, E2b-]-null)를 음성 대조군으로서 사용하였고, 브라큐리를 내생성으로 발현하는 SW620 인간 결장 암종 세포을 양성 대조군으로서 사용하였다.
항-MUC1-특이적 MAb를 사용하여 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1-감염된 인간 DC에서의 MUC1의 발현을 검출하였다. 또한 MUC1을 내생성으로 발현하는 SW620 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. 인간 DC 대 SW620 인간 암종 세포에서 보여지는 분자량의 차이는 아마도 MUC1 단백질의 차등적 글리코실화에 대부분 기인할 것이다.
MUC1-C는 인간 DC에서 주로 비글리코실화된 17 또는 15 kDa 형태로서 발현되고 25 내지 20 kDa의 글리코실화된 종은 아닌 것으로 보인다. Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 및 Ad5[E1-, E2b-]-null에 의해 감염된 인간 DC를, 감염되지 않은 인간 DC에 대하여 DC 성숙을 입증하기 위해 분석하였다. 각각 표면 CD80 및 CD83 발현을 약간 상향조절하고 HLA-DR 표면 발현을 매우 상향조절하였다는 점에서 TAA를 발현하는 재조합 Ad5[E1-, E2b-] 벡터 및 Ad5[E1-, E2b-]-null 사이에 차이가 없었다. 이와 같이, DC 성숙에서의 임의의 변화는 TAA 전이유전자 삽입 때문이 아니라 Ad5 벡터 때문인 것으로 보인다.
각각의 TAA에 대한 상응하는 펩티드를 이용하는 브라큐리-, CEA-, 및 MUC1-특이적 인간 CD8+ T 세포의 생성은 이전에 보고되어 있다[팔레나(Palena) 등의 문헌 "Clin Cancer Res. 2007; 13: 2471-2478"; 창(Tsang) 등의 문헌 "Clin Cancer Res. 2004; 10: 2139-2149"; 조켐스(Jochems) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174"; 투커(Tucker) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 1307-1317"; 살라자르(Salazar) 등의 문헌 "Int J Cancer. 2000; 85: 829-838"; 및 자렘바(Zaremba) 등의 문헌 "Cancer Res. 1997; 57: 4570-4577" 참조].
표 1에 제시된 바와 같이, Ad5[E1-, E2b-]-null은 IFN-γ을 생산하기 위해 어떠한 T 세포도 활성화시키지 않았다. Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리-감염된 DC는 브라큐리-특이적 T 세포를 활성화시켰고, CEA-특이적 T 세포(음성 대조군으로서)를 활성화시키지 않았다. 이로써, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리-감염된 DC는 특이적 T-세포를 활성화시킬 수 있는 브라큐리-MHC 유형 I 착체를 생성하는 방식으로 브라큐리를 처리할 수 있음이 입증되었다.
[표 1A]
CEA, MUC1 또는 브라큐리를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터에 의한 인간 수지상 세포의 감염은 항원-특이적 T-세포주를 활성화시킬 수 있다.
Figure pct00001
[표 1B]
전이유전자를 인코딩하는 Tri-Ad5 벡터에 의한 인간 수지상 세포의 감염은 항원-특이적 T 세포주를 활성화시켜 IFN-γ를 생산할 수 있다.
Figure pct00002
유사하게, Ad5[E1-, E2b-]-CEA-감염된 DC는 CEA-특이적 T 세포를 특이적으로 활성화시키지만 MUC1-특이적 T-세포주를 활성시키지는 않는다. 부류 I HLA-A2 및 -A24 MUC1-특이적 T-세포주는 둘 다 이전에 생성되었고[조켐스(Jochems) 등의 문헌 "Cancer Immunol Immunother. 2014; 63: 161-174"], Ad5[E1-, E2b-]-MUC1-감염된 DC는 이들 T-세포주 둘 다를 활성화시킬 수 있지만 CEA-특이적 T-세포주를 활성하시키지 않았다(표 1A). 인간 DC를 Tri-Ad5 벡터에 의해 유사하게 감염시켰다. 표 1B에서 볼 수 있듯이, CEA, MUC1, 및 브라큐리에 특이적인 T 세포는 각각 활성화되어, 개개의 Ad-5 벡터의 사용에 의해 볼 수 있는 것과 유사한 수준의 IFN-γ를 유도하였다.
이어서 Tri-Ad5의 CEA/MUC1/브라큐리 혼합물에 의한 인간 DC의 동시적인 감염이 모든 3가지 TAA에 대해 특이적인 T-세포주를 생성할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 연구를 착수하였다. 표 2에서 볼 수 있듯이, T 세포가, 상응하는 펩티드(대조 펩티드는 아님)에 의해 진동된 자가유래 B 세포와의 항온처리에 의해 활성화된 경우, 특이적 T-세포 활성화가 관찰되었다.
[표 2]
Tri-Ad5에 의한 인간 수지상 세포의 감염은 브라큐리, MUC1 및 CEA에 대한 항원-특이적 T 세포를 생성하고, 상응하는 펩티드에 의해 진동된 자가유래 B 세포에 의해 자극될 경우 IFN-γ를 생산할 수 있다.
Figure pct00003
예를 들어, 인간 DC를 Tri-Ad5에 의해 감염시킴으로써 생성된 브라큐리-특이적 T-세포주는, 브라큐리 펩티드에 의해 진동된 자가유래 DC와 함께 항온처리될 경우 자극되어 IFN-γ를 생산하지만, CEA 펩티드에 의해 진동된 동일한 자가유래 DC에 의해서는 활성화되지 않는다. 유사한 결과가 Tri-Ad5-감염된 DC에 의해 생성된 CEA 및 MUC1 T-세포주에 의해 나타났다. 이들 결과는 Tri-Ad5의 시험관내 사용시 소위 "항원 경쟁"이 없음을 지시한다.
이어서 Tri-Ad5에 의해 감염된 DC를 사용하여 생성된 브라큐리-, MUC1-, 및 CEA-특이적 인간 T 세포가 이들 TAA를 내생성으로 발현하는 인간 암종 세포를 용해시킬 수 있는지의 여부를 조사하였다. SW620 인간 결장 암종 세포는 모든 3가지 TAA를 발현하고 HLA-A2 및 -A24 부류 I 대립유전자를 소유한다. ASPC-1 인간 췌장 암종 세포를 음성 대조군으로서 사용하였는데, 이는 이들이 3가지 TAA를 발현하지만 HLA-A1 및 -A26 분자에 관하여는 그렇지 않기 때문이다. 결과(표 3)는, Tri-Ad5-감염된 인간 DC가 브라큐리, CEA, 및 MUC1를 내생성으로 발현하는 인간 종양 세포를 MHC-제한된 방식으로 용해시킬 수 있는 T 세포를 생성할 수 있음을 입증하였다.
[표 3]
Tri-Ad5에 의한 인간 DC의 감염은 모든 3가지 항원을 발현하는 종양 세포를 효율적으로 용해하는 브라큐리-, MUC1- 및 CEA-특이적 CTL을 생성할 수 있다.
Figure pct00004
그런 다음, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, 및 Ad5[E1-, E2b-]-CEA가 각각 TAA-특이적 T-세포 반응을 생체내에서 생성할 수 있는지의 여부, 및 Tri-Ad5 혼합물이 필적가능한 반응을 생성할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 연구를 착수하였다. C57B1/6 마우스(그룹 당 n = 5)에게 1010 바이러스 입자(VP)의 Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, 또는 Tri-Ad5(각각 1010 VP의 1 : 1 : 1 혼합물)를 2-주 간격으로 피하(s.c.)로 3 회 주사하였다. 마우스의 추가적인 그룹(n = 5)에게 3 x 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-null(비어 있는 벡터 대조군)을 공급하였다.
최종 백신접종 후 2 주째, 백신접종된 마우스로부터의 비장세포를 상응하는 브라큐리, CEA, 또는 MUC1 펩티드 푸울로 자극하고, IFN-γ 및 IL-2 분비 세포에 대해 효소-결합 면역스팟(ELISPOT: enzyme-linked immunospot) 검정에 의해 분석하였다. 단일 구성물 또는 Tri-Ad5에 의해 백신접종된 마우스는 각각 브라큐리, CEA, 및 MUC1 펩티드에 반응하였고, 대조 마우스와 비교하여 IFN-γ 및 IL-2 스팟 형성 세포(SFC)가 유의적으로 증가하였다(도 1A 및 B). Tri-Ad5 백신과 비교할 경우, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리 또는 Ad5[E1-, E2b-]-CEA에 의해 개별적으로 백신접종된 마우스에서 IFN-γ SFC의 평균 수에 있어서 유의적인 차이는 없었다. Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 단독 치료된 경우와 비교할 경우, Tri-Ad5 백신으로 치료된 마우스에서 IFN-γ SFC는 유의적으로 감소하였지만, Tri-Ad5에 의해 유도된 MUC1-특이적 면역 반응은 대조 마우스에 비해 유의적으로 상승된채 유지되었다(p < 0.0001)(도 2A). IL-2 반응은 Tri-Ad5 치료된 마우스 대 단일 백신 구성물 치료된 마우스에서 유사하였고; 게다가, 마우스가 Tri-Ad5 백신으로 백신접종된 경우 Ad5[E1-, E2b-]-CEA 백신 단독에 비해 CEA-특이적 IL-2 SFC가 유의적으로 증가하였다(p = 0.004)(도 3B). 빈 벡터로 백신접종된 마우스로부터의 비장세포는 브라큐리, CEA, 또는 MUC1 펩티드 푸울에 반응하지 않았다. 또한, 백신접종된 어떠한 그룹으로부터의 비장세포에서도 대조 펩티드 푸울(시미안 면역결핍 바이러스(SIV)-Nef 및 SIV-Vif)에 대한 반응성은 존재하지 않았다.
이들 데이터를 취합한 결과, Tri-Ad5 백신 혼합물에서 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-CEA, 및 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1을 조합하면 각각의 백신을 단독으로 사용한 경우에 달성되는 것과 유사한 항원-특이적 IFN-γ- 및 IL-2-생산 세포를 생성하는 효과를 가짐을 알 수 있다.
아데노바이러스 벡터로 백신접종되고 개별 합성 펩티드의 중첩 푸울로 자극된 마우스로부터의 비장세포를 사용하여, 유세포분석에 의해 CD8+ 및 CD4+ 림프구 집단에서의 IFN-γ 및 TNF-α의 세포내 축적을 평가하였다(도 2). Tri-Ad5로 백신접종된 마우스로부터 단리된 경우와 비교하여 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리로 백신접종된 마우스로부터의 CD8+ 비장 림프구에 의해 관찰된 IFN-γ 생산 사이에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(도 2A). 단일 구성물 백신접종된 마우스와 비교하여 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스로부터 단리된 CD8+ 비장세포에서 CEA-특이적 및 MUC1-특이적 IFN-γ 축적 사이에 유의적인 감소가 관찰되었지만, SFC의 상대적인 수는 대조군에 비해 유의적으로 상승된 채로 남아있었다(p < 0.0001)(도 2A). 그러나, 각각 단일 구성물 백신접종된 마우스 또는 Tri-Ad5 백신접종된 마우스로부터 단리된 CD4+ 비장세포에서의 IFN-γ 축적에서 유의적인 차이는 발견되지 않았다(도 2B).
펩티드-자극된 비장세포를 IFN-γ 및 TNF-α 둘 다의 세포내 축적에 대해 유세포분석에 의해 평가하였다. 각각 단일-항원 벡터 뿐만 아니라 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스에서의 항원-특이적 다작용성 CD8+ 및 CD4+ 비장세포를 검출하였다. 단일 벡터로 백신접종된 마우스 대 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스로부터 단리된 이중-작용성 CD8+ 및 CD4+ 비장세포의 빈도를 직접적으로 비교할 경우, 거의 차이가 관찰되지 않았다(도 2C 및 2D). Tri-Ad5로 백신접종된 마우스로부터 단리된 경우와 비교하여, 개개의 항원에 대항하는 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리 또는 Ad5[E1-, E2b-]-CEA로 백신접종된 마우스로부터 단리된 이중-작용성 CD8+ 비장세포 사이에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(도 2C). Tri-Ad5와 비교할 경우 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1로 백신접종된 마우스로부터의 이중-작용성 CD8+ 비장세포에서 유의적인 감소가 관찰되었지만(p = 0.04); 이러한 감소된 빈도는 대조군과 비교할 경우 유의적으로 상승되었다(p < 0.001). 각각 단일 구성물 또는 Tri-Ad5 백신접종된 마우스로부터 단리된 다작용성 CD4+ 비장세포의 빈도에는 유의적인 차이가 발견되지 않았다(도 2C).
체액성 반응이 Ad5[E1-, E2b-]-CEA, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, 또는 Tri-Ad5 백신에 의해 유도되는지의 여부를 평가하기 위해, 항원-특이적 정량적 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하였다. 유의적이고 필적가능한 항체 반응을 Ad5[E1-, E2b-]-CEA 또는 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스로부터의 혈청에서 CEA에 대하여 검출하였다(도 3A). CEA에 대한 항체는 대조 벡터로 백신접종된 마우스(도 3A), 또는 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, 또는 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1로 백신접종된 마우스에서 검출되지 않았다. 브라큐리 또는 MUC1에 대한 항원-특이적 항체는 각각 Ad5[E1-, E2b-]-브라큐리, Ad5[E1-, E2b-]-MUC1, 또는 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스의 혈청에서 검출되지 않았다.
Ad5[E1-, E2b-]-CEA 또는 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스의 혈청에서 CEA 항체가 CEA를 발현하는 종양 세포를 용해시키는 경향을 결정하기 위해, 보체-의존성 세포독성(CDC) 검정을 이용하였다. 백신접종된 마우스로부터의 열-비활성화된 혈청을 MC38-CEA2 종양 세포(인간 CEA에 의해 형질감염된 뮤린 CEA 결장 암종 세포)와 함께 항온처리한 후, 보체의 공급원으로서의 토끼 형철과 함께 항온처리하였다. MC38-CEA2 세포로부터의 락트산 탈수소효소(LDH: lactate dehydrogenase)의 방출에 의해 용해를 결정하였다. Tri-Ad5 또는 Ad5[E1-, E2b-]-CEA로 백신접종된 마우스로부터의 혈청에서 MC38-CEA2 세포가 유의적으로 용해되었고, 이러한 효과는 두 그룹 사이에서 유사하였다(도 3B).
이어서 Tri-Ad5 백신 섭생이 항종양 효과를 유발하는데 있어서 단일 재조합 아데노바이러스 구성물의 용도로서 효과적인지의 여부를 결정하기 위해 연구를 착수하였다. C57BL/6 마우스(n = 7/그룹)의 왼쪽 옆구리에 MUC1(MC38-MUC1)을 발현하는 1 x lO6의 MC38 세포를 피하로 이식하였다. 각각 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 또는 Tri-Ad5를 사용하여 마우스의 반대쪽 옆구리에 매주 피하 주사로 백신접종하였다. 마우스의 대조군에게 3 x 1010 VP의 Ad5[E1-, E2b-]-null(전이유전자 없음)을 공급하였다. Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 또는 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스는 25 일(p < 0.01) 및 29 일(p < 0.05)째 대조 마우스에 비해 종양이 유의적으로 더 작았다(도 4). 모든 시점에서 Ad5[E1-, E2b-]-MUC1 또는 Tri-Ad5로 백신접종된 마우스의 그룹의 경우 항-종양 효과에는 유의적인 차이가 없었다(p > 0.1).
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본 발명을 기재함에 있어서(특별히 하기 특허청구범위와 관련하여) 단수형 및 "적어도 하나의"라는 용어 및 유사한 언급은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 하나 이상의 항목에 대한 열거가 수반되는 "적어도 하나의"라는 용어의 사용(예를 들어, "A 및 B중 적어도 하나")은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 열거된 항목으로부터 선택된 하나의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목 중 둘 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "포함하는", "갖는", "포함되는" 및 "함유하는"이라는 용어는, 달리 주지되지 않는 한, 확장가능한 용어(즉, "제한되지 않고 포함함"을 의미함)인 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 값들의 범위에 대한 언급은, 달리 본원에 지시되지 않는 한, 단지 그 범위내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 작용하고자 할 뿐이고, 각각의 별도의 값은 이것이 개별적으로 본원에 언급되는 것과 마찬가지로 본 명세서에 혼입되는 것이다. 본원에 언급된 모든 방법은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은, 단지 본 발명을 좀 더 잘 설명하려는 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 제한을 두는 것이 아니다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실행에 필수적임을 지시하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 발명의 바람직한 실시태양, 예컨대 본 발명을 실행하기 위해 발명자들에게 공지된 최적의 방식이 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 실시태양의 변경은 선행 기재내용을 살펴볼 경우 당분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 본 발명자들은 숙련가라면 이러한 변경을 적절히 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실행될 수 있을 것으로 생각한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용될 경우 특허청구범위에 인용된 대상발명의 모든 변형 및 대등물을 포함한다. 게다가, 이의 모든 가능한 변경에서 상기 기재된 요소의 임의의 조합은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 본 발명에 의해 내포된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> BRACHYURY DELETION MUTANTS, NON-YEAST VECTORS ENCODING BRACHYURY DELETION MUTANTS, AND THEIR USE <130> 725858 <140> PCT/US2016/045289 <141> 2016-08-03 <150> US 62/200,438 <151> 2015-08-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val 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Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 2 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (246)..(254) <223> agonist peptide <400> 2 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys 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Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 3 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (229)..(229) <223> wherein Xaa is Ser or Val <400> 3 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro 195 200 205 Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro 210 215 220 Gly Thr Ser Thr Xaa Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln 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Claims (38)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 따른 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산.
  3. 제2항에 따른 핵산을 포함하는 비-효모 벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    플라스미드, 폭스바이러스(poxvirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스(herpes) 바이러스, 폴리오(polio) 바이러스, 알파바이러스(alphavirus), 바큘로바이러스(baculorvirus), 신드비스(Sindbis) 바이러스 및 박테리아성 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 비-효모 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    박테리아성 벡터가 리스테리아(Listeria) 또는 살모넬라(Salmonella) 벡터인, 비-효모 벡터.
  6. 제4항에 있어서,
    오르토폭스(orthopox), 아비폭스(avipox), 카프리폭스(capripox) 및 수이폭스(suipox) 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 폭스바이러스인 비-효모 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    폭스바이러스가 백시니아(vaccinia), 계두(fowlpox), 및 카나리아 폭스(canarypox) 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 비-효모 벡터.
  8. 제3항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    면역자극성/조절성 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 비-효모 벡터.
  9. 제8항에 있어서,
    면역자극성/조절성 분자가 인터류킨(IL: interleukin)-2, IL-4, IL-6, IL-12, 인터페론(IFN: interferon)-γ, 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor)-α, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-40L, 41 BBL, 항-CTLA-4 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 비-효모 벡터.
  10. 제3항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 종양 연관된 항원을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 비-효모 벡터.
  11. (i) 제1항에 따른 폴리펩티드;
    (ii) 제2항에 따른 핵산; 또는
    (iii) 제3항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 비-효모 벡터
    를 포함하는 비-효모 세포.
  12. 제10항에 있어서,
    항원 제시 세포 또는 종양 세포인 비-효모 세포.
  13. (a) (i) 제1항에 따른 폴리펩티드, (ii) 제2항에 따른 핵산, (iii) 제3항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 비-효모 벡터, 또는 (iv) 제11항 또는 제12항에 따른 비-효모 세포; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    면역자극성/조절성 분자를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    면역자극성/조절성 분자가 인터류킨(IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, B7.1, B7.2, ICAM-1, LFA-3, CD70, RANTES, G-CSF, OX-40L, 41 BBL, 항-CTLA-4 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    면역자극성/조절성 분자가 (i) 키토산과 복합체를 형성하는 IL-12를 인코딩하는 플라스미드, 및 (ii) 키토산과 혼합된 재조합 IL-12로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
    화학요법 약물, 항생제, 항바이러스 약물, 항곰팡이 약물, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    하나 이상의 보조제가 명반, 알루미늄 염, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄, 알루미늄 실리카, 인산 칼슘, 불완전한 프로인트(Freund) 보조제, QS21, MPL-A, 리비 데톡스(RIBI DETOX) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  20. 제13항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서,
    과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor)를 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제13항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜을 추가로 포함하는 조성물.
  22. 효과량의 (i) 제1항에 따른 폴리펩티드, (ii) 제2항에 따른 핵산, (iii) 제3항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 비-효모 벡터, (iv) 제11항 또는 제12항에 따른 비-효모 세포, 또는 (v) 제13항 내지 제21항중 어느 한 항에 따른 조성물을 피험체에게 투여하여 브라큐리(Brachyury) 특이적 CD4+ T 세포 반응을 포함하는 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 브라큐리에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    면역 반응이 브라큐리 특이적 CD8+ T 세포 반응을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    브라큐리 특이적 CD4+ T 세포 반응을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 효과량의 (i) 제1항에 따른 폴리펩티드, (ii) 제2항에 따른 핵산, (iii) 제3항 내지 제10항중 어느 한 항에 따른 비-효모 벡터, (iv) 제11항 또는 제12항에 따른 비-효모 세포, 또는 (v) 제13항 내지 제21항중 어느 한 항에 따른 조성물을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법.
  26. 제22항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서,
    피험체가 인간인, 방법.
  27. 제22항 내지 제26항중 어느 한 항에 있어서,
    피험체가 암을 앓는, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    암이 유방암, 소장암, 위암, 신장암, 방광암, 자궁암, 난소암, 고환암, 폐암, 결장암, 전립선암, 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia), B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종 및 호지킨(Hodgkin) 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제22항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드를 포함하는 리포솜을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제22항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서,
    효과량의 보조제를 피험체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    보조제가 키토산인, 방법.
  32. 제22항 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서,
    치료 효과량의 제2 제제를 피험체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 제2 제제가 화학요법제, 방사선, 소분자 표적화된 치료제, 호르몬 치료제 및 체크포인트(checkpoint) 저해제로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    체크포인트 저해제가 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    제2 제제가 상피 성장 인자 수용체 저해제, 형질전환 성장 인자(TGF: transforming growth factor)-β 저해제 및 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 저해제로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 수지상 세포를 제1항에 따른 폴리펩티드와 접촉시켜 특이적 항원 제시 세포를 생산하는 단계; 및
    특이적 항원 제시 세포를 피험체에게 투여하여 면역 반응을 유도하고 암 세포의 성장을 저해하는 단계
    를 포함하는, 피험체에서 암 세포의 성장을 저해하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    피험체가 인간인, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    암이 유방암, 소장암, 위암, 신장암, 방광암, 자궁암, 난소암, 고환암, 폐암, 결장암, 전립선암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 림프종, 버킷 림프종 및 호지킨 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    피험체가 고등급 전립선 상피내 종양, 가족성 선종성 용종증, 또는 유방의 이형성(atypia)을 앓는, 방법.
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