CN116196403A - Brachyury缺失突变体、编码该缺失突变体的非酵母载体及其用途 - Google Patents

Brachyury缺失突变体、编码该缺失突变体的非酵母载体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了Brachyury缺失突变多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述核酸的非酵母载体、非酵母细胞和使用方法。

Description

BRACHYURY缺失突变体、编码该缺失突变体的非酵母载体及其 用途
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2015年8月3日提交的美国临时专利申请第62/200,438号的权益，将其通过引用并入本文。
序列表
通过引用整体并入本文的是与本文同时提交的核苷酸/氨基酸序列表。
关于在政府资助的研究或开发中完成的发明的权利声明
本申请是由国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号Z01 BC010937的政府资助下完成的。政府享有本申请的某些权利。
发明背景
最初从特征在于中胚层形成停止的小鼠发育突变体克隆了Brachyury基因(Hermann等人，Nature 1990；343：617-22)，其已被认为是在原肠胚形成期间中胚层发育中重要的基因。Brachyury是转录因子家族的成员，被称为T-盒转录因子；这些因子的特征在于保守的DNA结合结构域(Papaioannou等人，Bioessays 1998；20：9-19)。这些转录因子在脊椎动物中胚层的形成和组织中发挥重要作用(参见，例如，Edwards等人，Genome Res1996；6：226-33)。除了T-盒蛋白在控制发育过程中的重要作用之外，这一家族的一些成员在癌症中失去控制。例如，已经报道人Tbx2基因在胰腺癌细胞系中被扩增(Mahlamaki等人，Genes Chromosomes Cancer 2002；35：353-8)，并且在BRCA-1-和BRCA-2-突变的乳腺肿瘤中被过表达(Sinclair等人，Cancer Res 2002；62：3587-91)。另外，已经显示在某些人乳腺癌细胞系中Tbx3表达被增强(Fan等人，Cancer Res 2004；64：5132-9)。Brachyury的表达还记录在人畸胎癌细胞系(生殖细胞肿瘤的子集，畸胎瘤是具有中胚层分化能力的胚胎癌细胞(Gokhale等人，Cell Growth Differ 2000；11：157-62))和脊索瘤(参见，例如Vojovic等人，J Pathol2006；209：157-65)中。Brachyury也在多种人类癌症(包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和肝细胞癌)以及B细胞来源的恶性肿瘤(诸如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤)等中被过表达。
针对癌症的免疫治疗干预取决于能够引起针对肿瘤细胞的宿主免疫应答的肿瘤抗原的鉴定。良好的靶标是由恶性细胞选择性表达并且对于恶性转化和/或肿瘤进展也是必需的分子。对能诱导针对癌症的有效免疫应答(包括CD4和CD8 T细胞应答)的试剂仍有需求。
发明概述
本发明提供了Brachyury缺失突变多肽，具体地，本发明提供了包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽。
本发明还提供了编码所述多肽的核酸、包含所述核酸的非酵母载体、细胞及其组合物，以及使用方法。
具体地，本发明提供了诱导对Brachyury的免疫应答的方法，其包括向对象施用有效量的多肽、核酸、非酵母载体、细胞或组合物，从而诱导免疫应答，其中所述免疫应答包含Brachyury特异性CD4+T细胞应答。
本发明提供了治疗或预防对象中的癌症的方法，其包括向所述对象施用有效量的多肽、核酸、非酵母载体、细胞或组合物，从而治疗或预防所述对象中的癌症。
本发明还提供了抑制对象中癌细胞生长的方法，所述方法包括使树突细胞与所述多肽接触以产生特异性抗原呈递细胞；以及向所述对象施用所述特异性抗原呈递细胞，从而诱导免疫应答并抑制所述癌细胞的生长。
附图简述
图1A和图1B是表示在用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1、Tri-Ad5和Ad5[E1-，E2b-]-空疫苗接种小鼠之后，分别分析IFN-γ–和IL-2-表达的脾细胞的图。用1010个VP(病毒颗粒)的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury(白色柱)、Ad5[E1-，E2b-]-CEA(灰色柱)、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1(黑色柱)或Tri-Ad5(每种1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1的1:1:1的混合物)(对角阴影柱)每隔2周对C57Bl/6小鼠(n＝5/组)疫苗接种，共进行3次。对照接受3x1010个VP的腺病毒-空(水平条纹柱)。在最终疫苗接种后14天收集脾细胞，并通过ELISPOT测定评估IFN-γ分泌细胞(A)或IL-2分泌细胞(B)。对于阳性对照，将脾细胞暴露于伴刀豆球蛋白A(ConA)。数据报道为每106个脾细胞中斑点形成细胞(SPF)的数量。误差棒表示SEM。以p值报告柱之间的显著差异(p<0.05)，不显著＝ns。
图2A-D是表示用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1、Tri-Ad5和Ad5[E1-，E2b-]-空疫苗接种之后，分析CD8+细胞群和CD4+细胞群和多功能细胞群的图。用1010个VP(病毒颗粒)的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury(白色柱)、Ad5[E1-，E2b-]-CEA(灰色柱)、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1(黑色柱)或Tri-Ad5(每种1010个VP(病毒颗粒)的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1的1:1:1的混合物)(对角阴影柱)每隔2周对C57Bl/6小鼠(n＝5/组)疫苗接种，共进行3次。对照接受3x1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-空(水平条纹柱)。在最终疫苗接种后14天收集脾细胞，并通过FACS评估CD8α+(A)和CD4+(B)IFN-γ表达细胞，或者分泌IFN-γ和TNF-α的CD8α+(C)和CD4+(D)细胞。对于阳性对照，将脾细胞暴露于伴刀豆球蛋白A(Con A)。误差棒表示SEM。以p值报告柱之间的显著差异(p<0.05)，不显著＝ns。
图3A和3B是表示来自用Ad5[E1-，E2b-]-CEA或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的血清的CEA抗体活性的图。通过ELISA(A)测定用1010个VP(病毒颗粒)的Ad5[E1-，E2b-]-CEA(灰色柱)、Tri-Ad5(斜线阴影柱)或3x1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-空(水平条纹柱)疫苗接种3次的小鼠中CEA IgG水平。(B)进行针对MC38-CEA2细胞的补体依赖性细胞毒性作用(CDC)。误差棒表示SEM。以p值报告柱之间的显著差异(p<0.05)，不显著＝ns。
图4是表示使用Ad5[E1-，E2b-]-MUC1对Tri-Ad5的MUC1表达肿瘤的免疫疗法比较的图。在左侧用106个MC-38-MUC1细胞皮下接种C57Bl/6小鼠(n＝7/组)。对小鼠施用1010个VP(病毒颗粒)的Ad5[E1-，E2b-]-MUC1或Tri-Ad5(每种1010个VP(病毒颗粒)的Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1和Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury的1:1:1的混合物，总共3x1010个VP)。对照组小鼠接受3×1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-空(无转基因)。监测肿瘤生长并计算体积。(*)表示当Ad5[E1-，E2b-]-MUC1处理的小鼠具有比对照小鼠显著更小(p<0.05)的肿瘤的天数，并且(^)表示当经Tri-Ad5-处理的小鼠具有比对照小鼠显著更小(p<0.05)的肿瘤的天数。在任何时间点，在Ad5[E1-，E2b-]-MUC1处理的小鼠对Tri-Ad5-处理的小鼠之间没有显著差异(p>0.1)。误差棒表示SEM。
发明详述
Brachyury(也称为“T-蛋白”)是在中胚层中转录的蛋白。全长Brachyury蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列(也参见
Figure BDA0004014272820000041
登录号NP_003172和/>
Figure BDA0004014272820000042
登录号NM_003181)。具有激动剂表位的全长Brachyury蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明提供了包含修饰的修饰的Brachyury多肽，其中Brachyury蛋白的DNA结合活性已经通过突变(例如通过Brachyury DNA结合区的足以降低或消除Brachyury蛋白的天然DNA结合活性的缺失、取代、插入或其它修饰)降低或消除。
在一实施方案中，本发明提供了Brachyury缺失突变体，其中所述序列已被修饰以缺失参与DNA结合的25个氨基酸的片段(DNA结合结构域)。DNA结合结构域对应于SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的残基198-222。
在本发明的一实施方案中，Brachyury缺失突变体是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽，其中残基229可以是Leu或Val。SEQ ID NO：3的多肽是Brachyury缺失突变体的一个实例，其中通过缺失第198-222位(即SEQ ID NO：1或2的第198-222位不存在于SEQ ID NO：3中)，其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的人Brachyury蛋白的氨基酸序列不同。SEQ ID NO：3是由SEQ ID NO：1或2的第1-197位与第223-435位直接融合组成的多肽。与全长Brachyury蛋白相比，该Brachyury缺失突变体具有破坏的DNA结合能力。
在一些实施方案中，Brachyury缺失突变多肽包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少95％相同的、至少96％相同的、至少97％相同的、至少98％相同的、至少99％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，Brachyury缺失突变多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列、SEQID NO：3的没有N端甲硫氨酸的氨基酸序列和/或在SEQ ID NO：3的第177位(分别为Aspvs.Gly)、第343位(分别为Thrvs.Ser)和第384位(分别为Asn vs.Asp)具有取代的氨基酸序列，或由以上的序列组成。
可以通过任何方法制备多肽，例如通过合成多肽或通过在细胞中表达编码合适氨基酸序列的核酸并从细胞中收获多肽。也可以使用这些方法的组合。从头合成多肽的方法和重组产生多肽的方法是本领域已知的(参见例如Chan等人，FmocSolidPhasepolypeptide Synthesis，Oxford University Press，Oxford，UnitedKingdom，2005；polypeptide andProtein DrugAnalysis，编辑Reid，R.，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，编辑Westwood等人，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2000；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY 2001；和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994)。
多肽可以是融合蛋白(例如，包含多肽和一种或多种另外的活性剂和/或标签的融合蛋白)的形式。也可以将多肽与载体连接。通常，载体是可以结合抗原性分子的免疫原性大分子。当与载体结合时，结合的多肽变得更具免疫原性。选择载体以增加结合的分子的免疫原性和/或引起诊断上、分析上和/或治疗上有益的针对载体的更高滴度的抗体。分子与载体的共价连接可赋予增强的免疫原性和T细胞依赖性(参见Pozsgay等人，PNAS 96：5194-97,1999；Lee等人，J.Immunol.116：1711-18,1976；Dintzis等人，PNAS 73：3671-75,1976)。有用的载体包括可以是天然的聚合物载体(例如来自细菌或病毒的多糖、多肽或蛋白)，含有可以连接反应物部分的一个或多个官能团的半合成或合成材料。细菌产物和病毒蛋白(如乙型肝炎表面抗原和核心抗原)，以及来自高等生物体的蛋白，诸如钥孔戚血蓝蛋白、鲎血蓝蛋白、麻仁球蛋白、哺乳动物血清白蛋白和哺乳动物免疫球蛋白，也可以被用作载体。合适的载体包括但不限于乙型肝炎小包膜蛋白HBsAg。这种蛋白具有自组装成聚集体的能力，并且可以形成病毒样颗粒。HBsAg的制备有充分的文献记载，参见例如欧洲专利申请公开第EP-A-0226846号、欧洲专利申请公开第EP-A-0299108号和PCT公开第WO 01/117554号，以及例如在Tiollais等人，Nature，317：489,1985和欧洲专利公开第EP-A-0278940号和PCT公开第WO 91/14703号中公开的氨基酸序列。
本发明还提供了编码多肽或融合蛋白的核酸。核酸可以包含DNA、cDNA和/或RNA，可以是单链或双链的，并且可以是天然存在的、合成的和/或重组的。此外，核酸可以包含核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸核苷酸等)。编码序列中的沉默突变由遗传密码的简并性(即丰余性)引起，由此一个以上的密码子可以编码相同的氨基酸残基。因此，例如，亮氨酸可以由CTT、CTC、CTA、CTG、TTA或TTG编码；丝氨酸可以由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC编码；天冬酰胺可以由AAT或AAC编码；天冬氨酸可以由GAT或GAC编码；半胱氨酸可以由TGT或TGC编码；丙氨酸可由GCT、GCC、GCA或GCG编码；谷氨酰胺可以由CAA或CAG编码；酪氨酸可以由TAT或TAC编码；并且异亮氨酸可以由ATT；ATC或ATA编码。显示标准遗传密码的表格可以在各种来源中找到(例如L.Stryer，1988，Biochemistry，第3增版，W.H.5Freeman和Co.，NY)。
核酸可以编码单独的或作为融合蛋白一部分的多肽。编码多肽的核酸可以作为构建体的一部分而提供，所述构建体包含核酸和能够将所述核酸递送至细胞和/或能够在细胞中表达所述核酸的元件。例如，可以将编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接至表达控制序列。连接与编码序列可操作地连接的表达控制序列使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。表达控制序列包括但不限于合适的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白编码基因之前的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号(维持基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译)和终止密码子。合适的启动子包括但不限于SV40早期启动子、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子、人CMV立即早期I启动子、痘病毒启动子、30K启动子、I3启动子、sE/L启动子、7.5K启动子、40K启动子和C1启动子。T DNA疫苗描述于美国专利第5,589,466号、美国专利第5,973,972号中，它们各自通过引用并入本文。除了在那些申请中描述的递送方案之外，递送DNA的可选择的方法描述于美国专利第4,945,050号和第5,036,006号中。
可以通过体外方法(诸如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自我维持序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB))来克隆或扩增编码多肽或融合蛋白的核酸。例如，编码多肽的多核苷酸可以使用基于该分子的DNA序列的引物通过cDNA的聚合酶链式反应来分离。各种各样的克隆和体外扩增方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。PCR方法描述于例如美国专利第4,683,195号；Mullis等人，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263,1987；和Erlich编辑，PCR Technology，(Stockton Press，NY，1989)中。也可以通过在严格杂交条件下用选自所需多核苷酸序列的探针筛选基因组或cDNA文库来分离多核苷酸。
本发明还提供了包含核酸的非酵母载体。合适载体的实例包括质粒(例如DNA质粒)、细菌载体和病毒载体(诸如痘病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、甲病毒、杆状病毒和辛德毕斯病毒)。当载体是质粒(例如DNA质粒)时，质粒可以与壳聚糖复合。
细菌载体：载体可以是细菌载体，诸如李斯特氏菌(Listeria)载体或沙门氏菌(Salmonella)载体。李斯特氏菌是革兰氏阳性杆菌。目前，李斯特氏菌属包含7个种：格雷氏李斯特氏菌(L.grayi)、英诺克李斯特氏菌(L.innocua)、伊凡诺夫李斯特氏菌(L.ivanovii)、单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、默里氏李斯特氏菌(L.murrayi)、西尔李斯特氏菌(L.seeligeri)和威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)。单核细胞增生李斯特氏菌是已经用作体外递送基因的载体的细胞内细菌。
沙门氏菌是杆状、革兰氏阴性、非芽孢形成、显著能动的肠杆菌属，其具有约0.7至1.5μm的直径，2至5μm的长度，以及在所有方向上分级的鞭毛(即，周生鞭毛的)。它们是化能有机营养生物，从使用有机源的氧化和还原反应获得它们的能量，并且是兼性厌氧菌。通过在宿主细胞中包括质粒(诸如具有截短的tetA基因的那些质粒)，沙门氏菌可被用作治疗性蛋白的递送载体。可以用DNA质粒(诸如但不限于pIRES(Invitrogen))转化减毒的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，并将其用作递送多肽和蛋白的载体。
痘病毒：载体可以是选自以下的痘病毒：正痘病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、兔痘病毒、羊痘病毒(例如山羊痘病毒和绵羊痘病毒)、野兔痘病毒和猪痘病毒(suipox)(例如猪痘病毒(swinepox))。禽痘病毒的实例包括鸡痘病毒、鸽痘病毒和金丝雀痘病毒(诸如ALVAC)。正痘病毒的实例包括牛痘病毒、改良的牛痘病毒安卡拉(MVA)、Wyeth、NYVAC、TROYVAC、Dry-Vax、POXVAC-TC(Schering-Plough公司)及其衍生物。例如，Wyeth株的衍生物包括但不限于缺乏功能性K1L基因的衍生物。
用于表达的示例性痘病毒载体描述于美国专利第6,165,460号。牛痘病毒基因组是本领域已知的。它由HIND F13L区、TK区和HA区组成。已经使用重组牛痘病毒来整合用于表达外源基因产物的外源基因(参见，例如，Perkus等人，Science 229：981-984,1985；Kaufman等人，Int.J.Cancer 48：900-907,1991；Moss Science 252：1662,1991)。Baxby和Paoletti(Vaccine 10：8-9,1992)公开了非复制型痘病毒作为载体的构建和使用，所述非复制型痘病毒包括金丝雀痘病毒、鸡痘病毒和其他鸟类物种。Sutter和Moss(Proc.Nat'l.Acad.Sci U.S.A.89：10847-10851,1992)以及Sutter等人(Virology1994)公开了在载体构建和使用中作为载体的非复制型重组安卡拉病毒(MVA，改良的牛痘病毒安卡拉)的构建和使用。
质粒：考虑到多种目的来设计质粒，诸如实现调节的高拷贝数并避免质粒在细菌中不稳定的潜在原因，以及提供与人类治疗性用途相容的质粒选择手段。基因治疗质粒的双重要求已受到特别关注。第一，它们适用于在大肠杆菌(E.coli)中的维持和发酵，从而可以生产和纯化大量的DNA。第二，它们是安全的并适用于人类患者和动物。第一个要求需要高拷贝数的质粒，这些质粒可以在细菌发酵期间选择并且相对容易地维持稳定。第二个要求需要关注元件，诸如选择标志物和其他编码序列。在一些实施方案中，编码多肽的质粒由以下组成：(1)高拷贝数复制起点，(2)选择标志物，诸如但不限于用卡那霉素进行抗生素选择的neo基因，(3)转录终止序列，(4)用于并入各种核酸盒的多克隆位点；以及(5)编码多肽的核酸序列。
有本领域已知的许多质粒载体用于诱导编码多肽的核酸。这些包括但不限于以下载体，其公开于美国专利第6,103,470号、美国专利第7,598,364号、美国专利第7,989,425号和美国专利第6,416,998号。
腺病毒载体：可以产生编码Brachyury蛋白或Brachyury多肽并且可用于本文公开的方法的腺病毒载体(Ad)的载体。这些载体用于本文公开的方法中，其包括复制型载体、复制缺陷型载体、其空壳形式载体和腺伴随病毒(AAV)载体。不受理论的束缚，已知腺病毒载体表现出在体外的强表达，极好的滴度和在体内转导分裂和非分裂细胞的能力(Hitt等人，Adv in Virus Res 55：479-505,2000)。当体内使用时，由于针对载体骨架引起的免疫应答，这些载体导致强烈但短暂的基因表达。
通常通过插入编码Brachyury蛋白的核酸来代替必需病毒序列(诸如存在于腺病毒的E1区的那些序列)或在必需病毒序列的中间插入编码Brachyury蛋白的核酸来构建腺病毒载体(Berkner，BioTechniques，6：616-629,1988；Graham等人，Methods in MolecularBiology，7：109-128，Ed：Murcy，The Human Press Inc.，1991)。必需病毒基因通过例如缺失或插入的失活使腺病毒的复制能力丧失。为了在细胞培养中使这些载体增殖，必须以反式方式提供缺失的基因(例如在E1缺失载体的情况下的E1A和E1B蛋白)。这些复制缺陷型腺病毒是在包装细胞中产生的，所述包装细胞被工程化为通过表达从其病毒基因组中缺失的遗传元件的子集来补充复制缺陷型病毒。用于在重组腺病毒载体中插入目的核酸(例如编码Brachyury蛋白的核酸)的潜在位点包括但不限于E1、E2、E3和E4区。在一些实施方案中，从E1区缺失并用编码Brachyury蛋白或Brachyury多肽的核酸置换的人腺病毒产生重组腺病毒载体。所得的病毒载体(其必需基因的一个或多个是失活的)是复制缺陷的(Statford-Perricaudet等人，Human Gene Therapy，1：241-256,1990)。
重组腺病毒载体可以包括：(1)使载体能够掺入复制缺陷型Ad病毒粒子中的包装位点；和(2)编码多肽的核酸。用于掺入感染性病毒粒子的其他元件包括5'和3'Ad ITR；E2和E3基因可以被包括在载体中。在一些实施方案中，将编码多肽的核酸插入到腺病毒的病毒基因组的缺失的E1A、E1B或E3区中。在一些实施方案中，腺病毒载体不表达一种或多种野生型腺病毒基因产物，如E1a、E1b、E2、E3、E4。在一些非限制性实例中，病毒粒子通常与补充E1、E2A、E4和任选地E3基因区的功能的包装细胞系一起使用(参见例如美国专利第5,872,005号、第5,994,106号、第6,133,028号和第6,127,175号)。在一实施方案中，可以使用在实施例中描述的腺病毒血清型5(Ad5)载体基因递送平台(Ad5[E1-，E2b-])，其中早期1(E1)、早期2(E2b)和早期3(E3)的基因区缺失。可以使用本领域已知的技术来纯化和制备腺病毒载体。
在一些实施方案中，包装细胞系诸如人胚肾293(“HEK-293”或“293”)细胞系(Graham等人，J.Gen.Virol.，36：59-72,1977)或人胚胎成视网膜细胞(“HER-911”或“911”)细胞系(Fallaux等人，Hum.Gene Ther.，7：215-222,1996)反式提供缺失区(诸如E1区)，使得缺失或修饰的腺病毒载体可以在这些细胞中复制。合适的腺病毒载体公开于例如美国专利公开第20080193484号中，其通过引用并入本文。可以通过本领域已知的标准技术使用包装细胞和包装技术制备包封重组腺病毒载体的复制缺陷型腺病毒病毒粒子。这些方法的实例可以在例如美国专利第5,872,005号中找到，其全部内容通过引用并入本文。
腺伴随载体(AAV)：重组AAV载体的特征在于它们能够指导所选转基因产物在靶细胞中的表达和产生。因此，重组载体至少包含衣壳化和用于感染靶细胞的物理结构所必需的全部AAV序列。
可以构建重组AAV(rAAV)病毒粒子，使得它们包括作为转录方向上的可操作连接组分的控制序列(包括转录起始和终止序列)，以及编码多肽的核酸。这些组分通过功能性AAV反向末端重复(ITR)序列被连接在5'和3'末端。“功能性AAV ITR序列”是指按照预期用于AAV病毒粒子的拯救、复制和包装而起作用的ITR序列。因此，用于载体中的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列，并且可以通过核苷酸的插入、缺失或取代来改变，或者AAV ITR可以来源于几种AAV血清型中的任何一种，只要它们是功能性的。AAV载体是来源于腺伴随病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8等。在一些实施方案中，AAV载体具有全部或部分缺失的野生型REP和CAP基因，但保留了功能性侧翼ITR序列。这些载体都可以用于(但不限于)表达Brachyury蛋白。
甲病毒：提供了编码多肽的甲病毒并且用于本文公开的方法中。甲病毒是一组披膜病毒家族的血清学相关的节肢动物传播病毒。利用血凝抑制(HI)试验已经将26种已知病毒和病毒亚型归入甲病毒属内。简而言之，HI试验将26种甲病毒分成三种主要复合体：委内瑞拉脑炎(VE)复合体、塞姆利基森林(SF)复合体和西部脑炎(WE)复合体。此外，另外四种病毒：东部脑炎(EE)、巴马森林、米德尔堡和恩杜姆，接受基于HI血清学试验的个体分类。合适的甲病毒的代表性实例包括Aura(美国典型培养物保藏中心(ATCC)VR-368)、Bebaru病毒(ATCC VR-600、ATCC VR-1240)、Cabassou(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCC VR-64、ATCCVR-1241)、东方马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡(ATCC VR-924)、盖塔病毒(ATCC VR-369、ATCC VR-1243)、孜拉加奇(ATCC VR-927)、马雅罗(ATCC VR-66)、马雅罗病毒(ATCC VR-1277)、米德尔堡(ATCC VR-370)、Mucambo病毒(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆(ATCC VR-371)、Pixuna病毒(ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、塞姆利基森林(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德毕斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托纳特(ATCC VR-925)、特里尼蒂(ATCC VR-469)、乌纳(ATCCVR-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎(ATCC VR-69)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-923、ATCC VR-1250、ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西部马脑脊髓炎(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、Whataroa(ATCC VR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)，参见美国专利第5,843,723号，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，甲病毒载体是Sinbis病毒。在一些实施方案中，使用重组甲病毒载体构建体，其包括能够启动甲病毒转录的5'序列、编码甲病毒非结构蛋白的核苷酸序列、已经失活使得病毒的亚基因组片段的转录被阻止的病毒连接区、甲病毒RNA聚合酶识别序列和编码多肽的核酸序列。具有失活的病毒连接区的甲病毒载体构建体不转录亚基因组片段，使其适用于各种各样的应用。
在一些实施方案中，提供甲病毒(诸如Sinbis病毒)构建体，其含有能够在体外从cDNA启动合成病毒RNA的5'启动子。5'启动子包括真核和原核启动子，诸如，例如β-半乳糖苷酶启动子、trpE启动子、lacZ启动子、T7启动子、T3启动子、SP6启动子、SV40启动子、CMV启动子和MoMLV LTR。此类序列的代表性实例包括野生型辛德毕斯病毒的核苷酸1-60和较小程度的核苷酸150-210，tRNA天冬酰胺的核苷酸10-75(Schlesinger等人，美国专利第5,091,309号)，和来自其他披膜病毒的启动转录的5'序列。
甲病毒载体可以含有编码甲病毒非结构蛋白(NSP)的序列。举例来说，对于辛德毕斯病毒，有四种非结构蛋白：NSP1、NSP2、NSP3和NSP4，它们编码能够使病毒自我复制的蛋白。非结构蛋白1至3(NSP1-NSP3)由野生型辛德毕斯病毒的核苷酸60至5750编码。这些蛋白作为多蛋白产生，然后被切割成非结构蛋白NSP1、NSP2和NSP3、NSP4。甲病毒载体构建体还可以包括已经失活的病毒连接区，从而阻止病毒的亚基因组片段的转录。简而言之，甲病毒病毒连接区通常控制亚基因组mRNA的转录起始。在辛德毕斯病毒的情况下，正常的病毒连接区通常在大约核苷酸编号7579处开始并持续通过至少核苷酸编号7612(并可能超过)，参见美国专利第5,843,723号的完整序列，通过引用并入本文。
甲病毒属的几个成员可以用作“复制子”表达载体。可以利用几种形式的任何一种的复制子载体，包括DNA载体构建体、RNA复制子载体和重组复制子颗粒(见下文)。这些包括例如SIN(Xiong等人，Science 243：1188-1191,1989；Dubensky等人，J.Virol.70：508-519,1996；Hariharan等人，J.Virol.72：950-958,1998；Polo等人，PNAS 96：4598-4603,1999)、塞姆利基森病毒(Liljestrom，Bio/Technology 9：1356-1361,1991；Berglund等人，Nat.Biotech.16:562-565,1998)、VEE(Pushko等人，Virology 239：389-401,1997)和多种甲病毒的嵌合体(美国专利第6,376,236号；PCT公开第WO2002099035号；Perri等人，J.Virol.77：10394-10403,2003)。
甲病毒载体构建体还公开于美国专利第5,789,245号、美国专利第5,843,723号、美国专利第5,814,482号和美国专利第6,015,694号、PCT公开第WO 00/61772号和PCT公开第WO 02/99035号。通常，这些载体包括启动甲病毒RNA转录的5'序列，编码甲病毒非结构蛋白的核苷酸序列、指导相邻异源核酸序列表达的病毒亚基因组连接区启动子、RNA聚合酶识别序列和聚腺苷酸序列。
可以将甲病毒用作复制子(重组甲病毒颗粒)，其是含有自我复制的甲病毒载体或“复制子”核酸的病毒样颗粒。通常认为复制子颗粒本身是复制缺陷型或“有缺陷的”，即当宿主细胞感染复制子颗粒时不会产生子代复制子颗粒，因为编码包装所需的一种或多种结构蛋白的基因缺失。
虽然甲病毒载体可以作为RNA直接施用于体内而使用，或者作为基于质粒的cDNA(例如，真核分层载体起始系统)被递送，但通常，对于体内疫苗和治疗性应用，首先将甲病毒RNA复制子载体或复制子RNA包装成包含甲病毒结构蛋白(例如衣壳蛋白和包膜糖蛋白)的病毒样颗粒。例如，使用的甲病毒和复制子公开于例如公布的美国专利申请第20110002958号中，其通过引用并入本文。由于它们的构型，载体复制子不表达包装成重组甲病毒复制子颗粒所必需的这些甲病毒结构蛋白。因此，为了产生复制子颗粒，必须以反式方式提供结构蛋白。
包装可以通过多种方法完成，包括瞬时方法，诸如共转染体外转录的复制子和缺陷型辅助RNA(Liljestrom，Bio/Technology 9：1356-1361,1991；Bredenbeek等人，Virol.67：6439-6446,1993；Frolov等人，J.Virol.71：2819-2829,1997；Pushko等人，Virology 239：389-401,1997；美国专利第5,789,245号和美国专利第5,842,723号)，或基于质粒DNA的复制子和缺陷型辅助构建体(Dubensky等人，J.Virol.70：508-519,1996)，以及将甲病毒复制子导入稳定的包装细胞系(PCL)(Polo等人，PNAS 96：4598-4603,1999；美国专利第5,789,245号、美国专利第5,842,723号、美国专利第6,015,694号)。
反式包装方法允许修饰一种或多种结构蛋白基因(例如，掺入甲病毒变体的序列，诸如减毒突变体，参见美国专利第5,789,245号、美国专利第5,842,723号)，随后将修饰的结构蛋白掺入最终复制子颗粒中。此外，这样的包装允许通过使用来源于不同于载体构建体的第二甲病毒的结构蛋白包装来源于第一甲病毒的载体构建体或RNA复制子来整体修饰甲病毒复制子颗粒。
麻疹病毒：提供了编码多肽的麻疹病毒并且用于本文公开的方法中。麻疹病毒的核酸序列公开于PCT公开第WO 98/13501号中，其提供了各种野生型疫苗麻疹株(包括Edmonston野生型株、Moraten株和Schwarz株)的正链(反基因组)信息正义RNA的DNA拷贝的序列。通过引用并入本文的PCT公开第WO 97/06270号公开了重组麻疹载体的产生。
也可以将减毒的麻疹病毒株用于递送多肽。病毒的Moraten减毒形式已被世界范围内用作疫苗并具有极好的安全性记录(Hilleman等人，J.Am.Med.Assoc.206：587-590,1968)。因此，在一实施方案中，使用Moraten株。Moraten疫苗可从
Figure BDA0004014272820000151
商购获得，并在小瓶中冻干提供，当其被复原至0.5ml时包含103pfu/ml。
在另一实施方案中，使用麻疹病毒的Edmonston-B疫苗株(MV-Edm)(Enders和Peebles，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.86：277-286,1954)。MV-Edm在肿瘤细胞中有效生长，但其在人外周血单核细胞，正常真皮成纤维细胞和血管平滑肌细胞的原代培养物中的生长严重受限。Enders减毒Edmonston株的形式可从Merck
Figure BDA0004014272820000152
商购获得。也可以使用其它减毒麻疹病毒株，诸如Leningrad-16株和Moscow-5株(Sinitsyna等人，Res.Virol.141(5)：517-31,1990)、Schwarz株(Fourrier等人，Pediatrie 24(1)：97-8,1969)、9301B株(Takeda等人，J.VIROL.72/11：8690-8696)、AIK-C株(Takehara等人，VirusRes 26(2)：167-75,1992)以及描述于Schneider-Shaulies等人，PNAS 92(2)：3943-7,1995)中的那些株。
在一些实施方案中，重组麻疹病毒核苷酸序列包含具有核苷酸总数为6的倍数的复制子。事实上“六位法则”表示为：重组cDNA中存在的核苷酸总数最终达到6的倍数的核苷酸总数，这是允许麻疹病毒的基因组RNA有效复制的规则。
在另外的实施方案中，将异源DNA(诸如编码Brachyury蛋白的核酸)克隆到麻疹病毒的额外转录单位(ATU)中，额外转录单位插入在对应于麻疹病毒反基因组RNA的cDNA中。ATU的位置可以沿着cDNA变化：然而它位于这样的位置，使它将受益于麻疹病毒的表达梯度。因此，ATU可以沿着cDNA扩展。在一实施方案中，将ATU插入序列的N-末端部分，尤其是在麻疹病毒L基因上游区域和病毒M基因上游区域内。在其他实施方案中，将ATU插入病毒N基因的上游，参见美国公开专利申请第2011/0129493号，其通过引用并入本文。麻疹病毒基因组中的特定顺反子可以被靶向以修饰其表达与减毒相关的基因(Schneider-Shaulies等人，PNAS 92(2)：3943-7,1995；Takeda等人，J.Virol.72/11：8690-8696,1998)。因此，在一实施方案中，产生编码H蛋白、V蛋白、C蛋白及其组合中的任一种多肽的重组麻疹病毒株。
重组麻疹病毒载体包括质粒pTM-MVSchw，其含有由麻疹病毒的反基因组RNA反向转录产生的cDNA和包括T7聚合酶启动子和终止子的适应性表达控制序列。载体也公开于例如美国公布的专利申请第2006/0013826号中。这些载体用于本文公开的方法中。
可以产生表达多肽的额外的减毒麻疹病毒株。通过病毒在细胞培养物(例如在非人类细胞中)的连续传代直至鉴定出是免疫原性但不是病原性的病毒来获得减毒病毒株。虽然野生型病毒会导致狨猴致命感染，但疫苗株不会。接受减毒麻疹病毒疫苗的个体不显示典型的麻疹症状。减毒与减少的病毒复制(如在体内通过不能在猴子中引起麻疹测量)、减少的病毒血症以及不能在组织中诱导细胞病理学效应(例如细胞-细胞融合、多核细胞)相关。参见美国专利第7,393,527号。
在一实施方案中，通过用包含减毒麻疹病毒Moraten株(或MMR原液的接种物)或MV-Edm株或上述任何其他毒株的原液的初始接种物感染原代细胞或连续细胞系产生编码多肽的减毒麻疹病毒的有效剂量，并在连续传代后扩增病毒。细胞或细胞系包括但不限于猴肾细胞或睾丸细胞或猴细胞系(例如Vero、KB、CV-1、BSC-1等)。当细胞-细胞融合和合胞体形成时，观察细胞中的病毒复制。
将减毒麻疹病毒扩增直至在标准细胞培养基中获得所需的剂量浓度。在一实施方案中，治疗有效剂量浓度为约103至1012pfu。在本发明的另一实施方案中，浓度为约105至108pfu。可以通过在培养皿(例如，诸如35mm平皿)中接种细胞(例如Vero细胞)来测定病毒滴度。在病毒吸附2-3小时后，除去接种物并用细胞培养基和琼脂糖或甲基纤维素的混合物(例如含有5％FCS和1％SeaPlaque琼脂糖的2ml DMEM)覆盖细胞。约3至约5天后，将培养物用1ml 10％的三氟乙酸固定约1小时，然后UV交联30分钟。除去琼脂糖覆盖层后，用结晶紫染色细胞单层并计数斑块以确定病毒滴度。通过从平皿刮下细胞，使细胞冻融(例如大约两轮)并离心，从细胞合胞体中收获病毒。清澈的上清液代表“斑块纯化的”病毒。
通过感染细胞单层(例如，在37℃下吸附约1.5小时)，随后将感染的细胞刮入合适的培养基(例如Opti-MEM、Gibco-BRL)并冷冻/解冻裂解(例如2轮)来产生病毒原液。将病毒原液分装、冷冻并储存在70℃-80℃，并且可以以高于治疗有效剂量的浓度进行储存。在一实施方案中，病毒原液储存在稳定溶液中。本领域已知稳定溶液，参见例如美国专利第4,985,244号和美国专利第4,500,512号。
脊髓灰质炎病毒：提供了编码多肽的脊髓灰质炎病毒并且用于本文公开的方法中。整个脊髓灰质炎病毒基因组已被克隆和测序，并鉴定出病毒蛋白。感染性脊髓灰质炎病毒cDNA也是可用的，其已允许病毒的进一步遗传操作(Racaniello V等人，Science214(4542)916-919,1981)。野生型基因组RNA分子长7433个核苷酸，在3'端聚腺苷酸化，并在5'末端具有小的共价连接的病毒蛋白(VPg)(Kitamura N等人，Nature 291：547-553；1981Racaniello VR等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：4887-4891,1981)。脊髓灰质炎病毒基因组的表达通过单一蛋白(多蛋白)的翻译发生，该单一蛋白随后由病毒编码的蛋白酶(2A和3C)加工以产生成熟的结构蛋白(衣壳)和非结构蛋白(Kitamura N等人，Nature 291：547-553,1981；Koch F等人，The Molecular Biology ofPoliovirus，Springer-Verlag，Vienna，1985)。脊髓灰质炎病毒复制由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶催化，该RNA聚合酶复制基因组RNA以产生互补的RNA分子，其然后用作进一步RNA产生的模板(Koch F等人，同上；Kuhn RJ等人，在DJ Rowlands等人(编辑)，Molecular Biology ofPositive StrandRNAviruses,Academic Press Ltd.,London,1987)。脊髓灰质炎病毒多蛋白的翻译和蛋白水解加工描述于Nicklin MJH等人，Bio/Technology 4：33-42,1986中。
病毒RNA基因组编码产生新子代RNA以及新RNA基因组的衣壳化所需的必需蛋白。在体外，脊髓灰质炎病毒是促使细胞溶解的，导致允许细胞的完全破坏。由于病毒复制周期不包括任何DNA中间体，因此不可能将病毒DNA整合到宿主染色体DNA中。
早期研究基于对抗体的反应性鉴定了三种脊髓灰质炎病毒类型(Koch F等人，同上，1985)。由于在非编码区和蛋白编码区中具有许多核苷酸差异，被命名为I型、II型和III型的这三种血清学类型已被进一步区分。所有三种毒株都适用于递送异源蛋白。此外，还有所有三种脊髓灰质炎病毒株的可获得的减毒形式。
复制子可以包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。复制子是缺乏病毒衣壳化所必需的野生型脊髓灰质炎病毒核酸的基于脊髓灰质炎病毒的多核苷酸。因此，在不存在缺失的核酸的情况下，在初始细胞进入之后不能产生新的衣壳化复制子。由于野生型脊髓灰质炎病毒核酸的任何修饰，包括但不限于缺失、插入和取代，包括插入编码多肽的核酸，复制子可以缺乏该核酸。在一些实施方案中，脊髓灰质炎病毒复制子缺少编码衣壳化所需的至少一部分蛋白的野生型脊髓灰质炎病毒核酸。复制子衣壳化所需的蛋白包括作为衣壳结构一部分的蛋白。这样的蛋白的实例是由脊髓灰质炎病毒P1衣壳前体区的VP1、VP2、VP3和VP4基因编码的那些蛋白、Vpg蛋白以及正确加工衣壳结构的结构蛋白所必需的那些蛋白(诸如负责切割病毒多蛋白的蛋白酶)。因此，在一些实施方案中，脊髓灰质炎病毒载体缺乏编码VP1、VP2、VP3和VP4中的一种或多种的核酸序列(脊髓灰质炎病毒P1衣壳前体区的基因)、编码Vpg蛋白的核酸序列，并且编码Brachyury蛋白或Brachyury多肽的核酸序列。
通常以RNA形式将复制子引入细胞中。衣壳化的复制子能够通过衣壳蛋白与脊髓灰质炎病毒受体的相互作用进入细胞。复制子在导入细胞后完全能够进行RNA复制(扩增)，并且在正确的阅读框中进行单个多蛋白的翻译，通过这样的翻译，发生整个复制子基因组的表达。复制子序列的翻译可能是短暂的，通常仅持续约24-48小时。高水平的复制子编码的蛋白可以在翻译期间积累。衣壳化的复制子能够通过衣壳蛋白与hPVR蛋白的相互作用进入细胞。
在一些实施方案中，复制子包含RNA(包括编码Brachyury蛋白的序列)，并且被衣壳化。在一些实例中，复制子具有衣壳(P1)基因的缺失并且来源于1型、2型、3型的脊髓灰质炎病毒的RNA基因组或其组合。此外，编码Brachyury蛋白或Brachyury多肽的核酸可以取代部分或全部衣壳(P1)基因，使得残留的部分衣壳(P1)基因(如果有的话)不足以支持体内衣壳化。通常，术语“P1复制子”是指其中编码P1衣壳前体蛋白的完整核酸已被缺失或改变，使得通常由该核酸编码的蛋白不被表达或以非功能性形式表达的复制子。通常由脊髓灰质炎病毒基因组的P1衣壳前体区编码的蛋白包括由VP1、VP2、VP3和VP4基因编码的蛋白。因此，P1复制子缺乏VP1、VP2、VP3和VP4基因或包含VP1、VP2、VP3和VP4基因的无法表达的形式或非功能性形式。P1复制子可以包括取代VP1、VP2、VP3和VP4基因的编码Brachyury蛋白或Brachyury多肽的核酸。
在一些实施方案中，可以通过将复制子和提供衣壳化所需的缺失核酸的互补表达载体反式引入宿主细胞来产生衣壳化的复制子。“复制子衣壳化载体”是指包含复制子衣壳化所需的核酸并且以反式提供所需核酸(或编码蛋白)的基于非脊髓灰质炎病毒的载体。可以在复制子引入之前、与其同时或在其之后将复制子衣壳化载体引入宿主细胞。用于衣壳化的合适方法公开于美国专利第6,680,169号中，其通过引用并入本文。可以用于制备衣壳化复制子的方法已经描述于Porter D C等人，J.Virol.67：3712-3719,1993；Porter D C等人，1995，J.Virol.69：1548-1555,1995；PCT公开第WO 96/25173号；美国专利第5,614,413号、美国专利第5,817,512号、美国专利第6,063,384号和美国专利第6,680,169号中。
可以将非衣壳化的复制子直接递送至靶细胞，例如通过直接注射入例如肌细胞(参见例如Acsadi G等人，Nature 352(6338)：815-818,1991；WolffJA等人，Science 247：1465-1468,1990)，或通过电穿孔，由磷酸钙介导的转染，由DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染或受体介导的核酸摄取(参见例如Wu G等人J.Biol.Chem.263：14621-14624,1988；Wilson JM等人，J.Biol.Chem.267：963-967,1992；和美国专利第5,166,320号)或递送裸核酸至靶细胞的其它方法。
逆转录病毒载体：提供了逆转录病毒载体，包括编码多肽的慢病毒载体并且将其用于本文公开的方法中。已经测试了逆转录病毒载体并且发现它们是用于将多种目的基因稳定引入大范围靶细胞的基因组DNA中的合适递送媒介物。不受理论束缚，逆转录病毒载体将未重排的单拷贝转基因递送到细胞中的能力使得逆转录病毒载体非常适合将基因转移入细胞。此外，逆转录病毒通过逆转录病毒包膜糖蛋白与宿主细胞上的特异性细胞表面受体的结合进入宿主细胞。因此，也可以使用假型逆转录病毒载体，其中编码的天然包膜蛋白被具有与天然包膜蛋白不同的细胞特异性(例如与天然包膜蛋白相比结合不同的细胞表面受体)的异源包膜蛋白代替。
通常，逆转录病毒含有编码必需病毒粒子蛋白的三个主要编码结构域gag、pol、env。逆转录病毒载体是有用的，其中gag、pol和/或env不存在或是非功能性的。逆转录病毒载体公开于例如美国公开专利申请第20060286634号中。
因此提供这样的逆转录病毒载体，其包括例如包含编码多肽的核酸的逆转录病毒转移载体和包含一种或多种包装元件的逆转录病毒包装载体。在一些实施方案中，提供了假型逆转录病毒载体，其编码用于产生假型逆转录病毒的异源或功能修饰的包膜蛋白。
有多种逆转录病毒，并且实例包括：鼠白血病病毒(MLV)、诸如人类免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)。其他适用的逆转录病毒包括但不限于禽白血病病毒、牛白血病病毒、水貂细胞病灶诱导病毒。逆转录病毒载体的核心序列可以来源于各种各样的逆转录病毒，包括例如B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒(参见RNA TumorViruses，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。适用于本文公开的组合物和方法的逆转录病毒的实例包括但不限于慢病毒。
一种慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如1型或2型(即HIV-1或HIV-2)。其它慢病毒载体包括绵羊脱髓鞘性脑白质炎/慢性进行性肺炎病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。
慢病毒共享共用的几种结构病毒粒子蛋白，包括由env基因编码的包膜糖蛋白SU(gp120)和TM(gp41)；由gag基因编码的CA(p24)、MA(p117)和NC(p7-11)；以及pol基因编码的RT、PR和IN。HIV-1和HIV-2含有参与调节病毒RNA的合成和加工以及其他复制功能的辅助蛋白和其他蛋白。由vif、vpr、vpu/vpx和nef基因编码的辅助蛋白可以从重组系统中被省略(或失活)。另外，tat和rev可以被省略或失活，诸如通过突变或缺失。
不受理论的限制，基于慢病毒的基因转移技术的使用通常依赖于体外产生携带高度缺失的病毒基因组的重组慢病毒颗粒，在高度缺失的病毒基因组中，容纳目的基因，诸如编码多肽的核酸。特别地，通过在允许细胞系中反式共表达以下来回收重组慢病毒：(1)包装构建体，即表达Gag-Pol前体以及Rev(可选地，以反式表达)的载体；(2)表达通常为异源性质的包膜受体的载体；和(3)转移载体，其存在于失去所有开放阅读框，但保留了复制、衣壳化和表达所需的序列(其中插入待表达序列)的病毒cDNA。在一实施方案中，描述于Lu，X.等人Journal ofgene medicine 6：963-973,2004中的Lentigen慢病毒载体用于表达多肽。合适的慢病毒载体也公开于例如美国公开专利申请第20100062524号中。
用于产生生产逆转录病毒的生产细胞和生产细胞系的逆转录病毒包装系统，以及制备这种包装系统的方法在本领域中是已知的。通常，逆转录病毒包装系统包括至少两种包装载体：第一包装载体，其包括包含gag、pol或gag和pol基因的第一核苷酸序列；和第二包装载体，其包括包含异源或功能修饰的包膜基因的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，逆转录病毒元件来源于慢病毒，诸如HIV。这些载体可缺乏功能性tat基因和/或功能性辅助基因(vif、vpr、vpu、vpx、nef)。在其他实施方案中，该系统还包含第三包装载体，其包含含rev基因的核苷酸序列。可以以含有第一、第二和任选地第三核苷酸序列的包装细胞的形式提供包装系统。
第一代慢病毒载体包装系统提供了针对gag/pol和env的单独的包装构建体，并且出于安全原因通常使用异源或功能修饰的包膜蛋白。在第二代慢病毒载体系统中，辅助基因vif、vpr、vpu和nef被缺失或失活。第三代慢病毒载体系统是其tat基因已经缺失或以其它方式失活(例如通过突变)的那些系统。可以通过使用强组成型启动子(诸如人巨细胞病毒立即早期(HCMV-IE)增强子/启动子)来提供通常由tat提供的对转录调节的补偿。如本领域所理解的，可以基于组成型启动子活性的强度，对靶组织的特异性(例如，肝特异性启动子)或与期望的表达控制有关的其他因素来选择其他启动子/增强子。例如，在一些实施方案中，可以使用诱导型启动子(诸如tet)来实现受控表达。可以在单独的表达构建体上提供编码rev的基因，使得典型的第三代慢病毒载体系统将包括四种质粒：针对gag、pol、rev包膜各一种和转移载体。无论使用哪一代包装系统，可以在单个构建体上或在单独的构建体上提供gag和pol。
通常，包装载体被包含在包装细胞中，并且通过转染、转导或感染被引入到细胞中。转染、转导或感染的方法是本领域技术人员熟知的。可以通过转染、转导或感染将本发明的逆转录病毒载体引入包装细胞系中以产生生产细胞或细胞系。可以通过标准方法(包括例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔)将包装载体引入人类细胞或细胞系。在一些实施方案中，将包装载体与显性选择标志物(诸如neo、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起引入细胞中，然后在适当的药物存在下进行选择并分离克隆。选择标志物基因可以与包装载体编码的基因物理连接。
稳定的细胞系是已知的，其中包装功能被配置为由合适的包装细胞表达。例如，参见美国专利第5,686,279号和Ory等人，Proc.Natl.Acad.Sci.93:11400-11406,1996，其描述了包装细胞。Zufferey等人，Nature Biotechnology 15：871-875,1997公开了慢病毒包装质粒，其中pol的3'序列包括HIV-1包膜基因缺失。构建体含有tat和rev序列，并且3'LTR被聚A序列取代。5'LTR序列和psi序列被另一个启动子(诸如可被诱导的启动子)取代。例如，可以使用CMV启动子。
包装载体可以包括对包装功能的额外改变以增强慢病毒蛋白表达并增强安全性。例如，gag上游的所有HIV序列都可以被去除。另外，可以去除包膜下游的序列。此外，可以采取修饰载体以增强RNA的剪接和翻译的步骤。
可以使用自灭活载体(SIN)，其通过缺失HIV-1长末端重复(LTR)来提高载体的生物安全性，如例如Zufferey等人，J.Virology 72(12)：9873-9880,1998中所描述的。也可以使用诱导型载体，诸如通过tet诱导型LTR。
当非酵母载体用于施用给宿主(例如人类)时，非酵母载体(例如痘病毒)优选地在靶细胞中具有低复制效率(例如，产生每个细胞不超过约1个子代，或更优选地，每个细胞不超过0.1个子代)。通过测定靶细胞感染后的病毒滴度可以容易地凭经验确定复制效率。
除了编码多肽的核酸之外，非酵母载体还可以包含编码一种或多种免疫刺激/调控分子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、细胞因子或可以增强免疫应答的其它分子(例如，其他肿瘤相关抗原，诸如前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)或其修饰形式诸如CEA-6D、以及粘蛋白(MUC)及其修饰形式)的多核苷酸/基因。编码多肽的核酸以及任何其它外源基因优选插入载体(例如痘病毒)的不影响所得重组病毒的病毒活力的位点或区域(插入区)中。可以通过测试病毒DNA片段的允许重组形成而不会严重影响重组病毒的病毒活力的区域，容易地鉴定这些区域。
胸苷激酶(TK)基因是可以容易地使用并存在于许多病毒中的插入区。特别是，在所有检测的痘病毒基因组中都发现了TK基因。另外的合适的插入位点描述于国际专利申请公开第WO 2005/048957号中。例如，在鸡痘中，插入区包括但不限于BamHI J片段、EcoRI-HindIII片段、BamHI片段、EcoRV-HindIII片段、长独特序列(LUS)插入位点(例如FPV006/FPV007和FPV254/FPV255)、FP14插入位点(FPV060/FPV061)和43K插入位点(FPV107/FPV108)。在牛痘中，插入位点包括但不限于44/45、49/50和124/125。
当非酵母载体是包含编码多肽和/或其他外源基因(例如，编码一种或多种免疫刺激/调控分子)的核酸的重组鸡痘病毒时，可以将编码多肽的核酸插入一个区域(例如，FP14区)中，并且可以将外源基因插入另一个区域(例如BamHI J区)中。
非酵母载体可以包括合适的启动子和调控元件，诸如转录调控元件或增强子。当载体是痘病毒载体时，可以使用痘病毒启动子，其包括但不限于牛痘7.5K启动子、牛痘30K启动子、牛痘40K启动子、牛痘I3启动子、合成早/晚(sE/L)启动子、7.5启动子、HH启动子、11K启动子和Pi启动子。尽管通常启动子将是组成型启动子，但也可以在本发明的载体中使用诱导型启动子。这种可诱导系统允许调节基因表达。
本文还提供了包含多肽、编码所述多肽的核酸或非酵母载体的非酵母细胞。合适的细胞包括原核细胞和真核细胞，诸如哺乳动物细胞、非酵母真菌和细菌(诸如大肠杆菌、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)或李斯特氏菌(例如单核细胞增生李斯特氏菌))。非酵母细胞可以在体外，这对于研究或生产多肽是有用的，或者非酵母细胞可以在体内。非酵母细胞可以是多肽脉冲的抗原呈递细胞，合适的抗原呈递细胞包括，但不限于，树突细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。
在一实施方案中，非酵母细胞是树突细胞。基于细胞表面表达标志物可以分离不同成熟阶段的树突细胞。例如，成熟的树突细胞不太能够捕获用于呈递的新蛋白，但在刺激静止的T细胞生长和分化方面好得多。因此，成熟的树突细胞可能是重要的。可以通过它们在形态学上的变化和各种标志物的存在来鉴定成熟的树突细胞。这样的标志物包括但不限于细胞表面标志物，诸如B7.2、CD40、CD11和MHC II类。可选择地，可以通过观察或测量促炎性细胞因子的产生来鉴定成熟。
可使用典型的细胞荧光照相术和细胞分选技术和装置(诸如荧光激活细胞分选仪(FACS))来收集和分析树突细胞。针对树突细胞成熟的不同阶段的细胞表面抗原的特异性抗体可商购获得。
在培养中繁殖哺乳动物细胞的技术是众所周知的(参见Jakoby和Pastan(编辑)，1979，Cell Culture.Methods in Enzymology，第58卷，Academic Press，Inc.，HarcourtBrace Jovanovich，NY)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、CHO细胞和WI38、BHK以及COS细胞系，尽管可以使用细胞系，诸如设计为提供更高表达期望的糖基化模式或其他特征的细胞。
如本领域技术人员所熟知的，可以通过常规技术进行用重组DNA对宿主细胞的转化。在宿主是原核生物(诸如但不限于大肠杆菌)的情况下，可以从指数生长期后收获的细胞制备能够摄取DNA的感受态细胞，并随后使用本领域熟知的方法通过CaCl2方法处理。可选择地，可以使用MgCl2或RbCl。也可以在形成非酵母宿主细胞的原生质体(如果需要)后或通过电穿孔进行转化。
当细胞是真核生物时，可以使用这种像磷酸钙共沉淀物一样转染DNA的方法，常规的机械方法(诸如显微注射)、电穿孔、包裹在脂质体中的质粒的插入或用病毒载体的感染。还可以用编码多肽的多核苷酸序列和编码选择性表型的第二外源DNA分子(诸如单纯疱疹胸苷激酶基因)共转化真核细胞。使用病毒载体转化非酵母真核细胞的方法是已知的(参见例如，Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。
可以分离多肽，核酸，非酵母载体或非酵母细胞。如本文所使用的术语“分离的”包括已从生物环境(例如细胞、组织、培养基、体液等)中移出或以其它方式增加纯度至任何程度(例如从合成介质中分离)的化合物或组合物。因此，分离的化合物和组合物可以是合成的或天然产生的。
可以将多肽、核酸、非酵母载体或非酵母细胞配制为包含多肽、核酸、非酵母载体或非酵母细胞以及载体(例如药学或生理学可接受的载体)的组合物(例如药物组合物)。此外，本发明的多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或组合物可以单独或作为药物制剂的一部分用于本文所述的方法中。
组合物(例如药物组合物)可以包含一种以上本发明的多肽、核酸、非酵母载体或非酵母细胞或组合物。可选择地或另外，组合物可以包含一种或多种其他药学活性剂或药物。可适用于药物组合物的此类其他药学活性剂或药物的实例包括抗癌剂(例如化学治疗药物)、抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物、环磷酰胺及其组合。合适的抗癌剂包括但不限于烷化剂、氮芥、叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、纺锤体毒素、拓扑异构酶抑制剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、鬼臼毒素、亚硝基脲、顺铂、卡铂、干扰素、天冬酰胺酶、他莫昔芬、亮丙瑞林、氟他胺、甲地孕酮、丝裂霉素、博来霉素、多柔比星、伊立替康、紫杉醇、格尔德霉素(例如17-AAG)以及本领域已知的各种抗癌多肽和抗体。
载体可以是常规使用的那些载体中的任何一种，并且仅受到物理化学考虑因素(诸如溶解度和缺乏与活性化合物的反应性)以及给药途径的限制。本文所述的药学上可接受的载体，例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂对于本领域技术人员来说是熟知的，并且容易为公众获取。优选的药学上可接受的载体为对活性剂(一种或多种)具有化学惰性的载体和在使用条件下不具有有害副作用或毒性的载体。
载体的选择将部分地由本发明的特定多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物和所用的其他活性剂或药物以及用于施用多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物的特定方法确定。
另外地或可选择地，组合物可以包含一种或多种免疫刺激/调控分子。可以使用任何合适的免疫刺激/调控分子，诸如白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-12、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、B7.1、B7.2、ICAM-1、LFA-3、CD70、RANTES、G-CSF、OX-40L、41BBL、抗CTLA-4及其组合。优选地，组合物包含B7.1、ICAM-1和LFA-3(也被称为TRICOM)的组合。可以以包含编码一种或多种免疫刺激/调控分子的核酸的载体(例如，重组病毒载体，诸如痘病毒载体)的形式施用一种或多种免疫刺激/调控分子。例如，可以在有或没有壳聚糖情况下的DNA质粒的形式施用一种或多种免疫刺激/调控分子(例如IL-12)。可选择地，一种或多种免疫刺激/调控分子可以作为蛋白(例如重组蛋白)(诸如与壳聚糖混合的蛋白(例如重组IL-12))被施用。
Brachyury蛋白在许多人类癌症中被表达，诸如小肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、支气管癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、其他基于B细胞的恶性肿瘤和乳腺癌(诸如乳腺浸润性导管癌)。多肽的施用可以被用于治疗或预防这些癌症。在具体的非限制性实例中，乳腺癌是雌性激素受体阴性和黄体酮受体阴性的乳腺癌。在另外的非限制性实例中，癌症是任何抗辐射和/或抗化疗的癌症。癌症可以表达Brachyury或具有表达Brachyury的潜能。
多肽、核酸、非酵母载体或非酵母细胞的施用可以被用于诱导CD4+Brachyury特异性T细胞和/或CD8+T细胞。因此，提供了用于诱导CD4+Brachyury特异性T细胞和/或CD8+T细胞的方法，其包括使用多肽、核酸、非酵母载体或非酵母细胞(例如树突细胞)诱导产生CD4+Brachyury特异性T细胞。
本发明还提供了治疗患有癌症的对象的方法，所述癌症诸如但不限于小肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、支气管癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、其他基于B细胞的恶性肿瘤或乳腺癌(诸如浸润性导管癌或雌性激素受体阴性和黄体酮受体阴性乳腺癌)。这些癌症中的任一种都可以是抗化疗和/或抗辐射的。癌症可以表达Brachyury或具有表达Brachyury的潜能。在具体的非限制性实例中，癌症是高级别前列腺上皮内瘤变、家族性腺瘤性息肉病或乳房的异型性。还公开了预防这些癌症的方法。
这些方法包括诱导CD4+Brachyury特异性T细胞。方法还可以包括诱导CD8+Brachyury特异性T细胞。可以单独或与第二种药剂(诸如放射疗法和/或化学疗法)联合向对象施用多肽、核酸、非酵母载体和非酵母细胞。
在另外的实施方案中，提供了抑制对象中癌细胞生长的方法。这些方法包括使树突细胞与多肽或表达多肽的宿主细胞接触，从而制备特异性抗原呈递细胞。这些方法还包括向对象施用抗原呈递细胞，从而诱导免疫应答并抑制癌细胞的生长。
方法可以包括选择需要治疗的对象，诸如患有表达Brachyury的癌症或具有表达Brachyury的潜能的癌症的对象。在几个实例中，方法包括选择患有以下癌症的对象：小肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、B细胞来源的肿瘤(诸如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤或霍奇金氏淋巴瘤)或乳腺癌，其中癌症表达Brachyury或具有表达Brachyury的潜能。在一些非限制性实例中，癌症是抗辐射和/或抗化疗的。在另外的非限制性实例中，对象患有乳腺癌，诸如导管癌，例如浸润性导管癌或雌性激素受体阴性和黄体酮受体阴性乳腺癌。在另外的实例中，对象具有高级别前列腺上皮内瘤变、家族性腺瘤性息肉病或乳房的异型性。
在示例性应用中，向对象施用足以引起对Brachyury表达细胞的免疫应答(例如CD4+T细胞应答)的量的组合物。使用本文公开的方法也可诱导Brachyury特异性CD8+T细胞应答。施用诱导足够的免疫应答以减缓Brachyury表达细胞的增殖，或抑制它们的生长，或减少癌症的病症或症状，或预防癌症。对这种用途有效的量将取决于疾病的严重程度、患者健康的一般状况以及患者免疫系统的健壮性。在一实例中，组合物的治疗有效量是提供症状的主观缓解或客观可识别的改善的量，如临床医生或其他有资格的观察者所注意到的那样。
可以通过本领域技术人员已知的任何方式施用组合物。因此，组合物可以被局部或全身施用，例如通过肌肉内注射、皮下注射、腹膜内注射或静脉内注射，但是甚至考虑口服施用、鼻腔施用、经皮施用或肛门施用。在一实施方案中，施用是通过皮下注射或肌肉内注射。
多肽可以作为植入物、油性注射剂、脂质体或微粒系统提供。微粒系统可以是微粒、微胶囊、微球、纳米囊或类似颗粒。基于合成聚合物的微粒载体除了提供控制释放之外，还已经显示出能充当佐剂以增强免疫应答。也可以将佐剂与蛋白组合使用，佐剂包括例如壳聚糖、铝盐、免疫刺激性寡脱氧核苷酸、脂质体和/或一种或多种细胞因子。可以以脂质体施用多肽。
在一具体的非限制性实例中，以引导免疫应答至细胞应答(即，Brachyury特异性CD4+应答和/或CD8+应答)而不是体液(抗体)应答的方式施用多肽。多肽可诱导Brachyury特异性CD4+T细胞应答和Brachyury特异性CD8+T细胞应答。用于测量CD4+和CD8+T细胞应答的方法是本领域已知的，并且包括生物测定、ELISPOT测定和荧光激活细胞分选。用于测量Brachyury特异性CD4+T细胞的示例性测定公开于以下实施例中。
在一具体的非限制性实例中，用于静脉内施用的药物组合物将包括每天每位患者约0.1μg至10mg的多肽。可以使用每天每位患者0.1至约100mg的剂量，特别是如果该药剂被施用于隐蔽部位而不是进入血液循环或淋巴系统，诸如进入体腔或进入器官内腔。制备可施用组合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并且更详细地描述于诸如Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1995的出版物中。
任选地，可以将一种或多种免疫刺激分子诸如IL-2、IL-6、IL-12、LFA(例如LFA-1、LFA-2和/或LFA-3)、CD72、RANTES、G–CSF、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、ICAM-1、B7-1、B7-2、其他B7相关分子、OX-40L和/或41BBL或这些分子的组合用作生物佐剂(参见例如Salgaller等人，1998，J.Surg.Oncol.68(2)：122-38；Lotze等人，2000，Cancer J Sci.Am.6(增刊1)：S61-6；Cao等人，1998，Stem Cells 16(增刊1)：251-60；Kuiper等人，2000，Adv.Exp.Med.Biol.465：381-90)。这些分子可以全身(或局部)施用于宿主。在几个实例中，施用IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、B7-1 B7-2、OX-40L、41BBL和/或ICAM-1。可以施用IL-15或IL-15/IL-15受体复合物。
已知许多用于在体外和体内诱导细胞应答的手段。脂质已经被鉴定作为能够在体内辅助引发T细胞对抗各种抗原的药剂。例如，如美国专利第5,662,907号所述，可以将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的α和ε氨基，然后连接(例如，通过一个或多个连接残基，诸如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)至免疫原性多肽或蛋白。然后可以将脂化的多肽直接以胶束形式注入，掺入脂质体中或乳化于佐剂中。作为另一个实例，当共价连接到合适的多肽或蛋白时，大肠杆菌脂蛋白(诸如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰-丝氨酸)可以用于引发肿瘤特异性T细胞(参见Deres等人，Nature 342：561,1989)。此外，因为也可以用与显示适当表位的蛋白缀合的同一分子引发中和抗体的诱导，所以可以将两种组合物组合以引发体液应答和细胞介导的应答(如果被认为是需要的话)。
在一实施方案中，将多肽与含有稳定洗涤剂、胶束形成剂和油中的两种或多种的佐剂混合。合适的稳定洗涤剂、胶束形成剂和油详述于美国专利第5,585,103号、美国专利第5,709,860号、美国专利第5,270,202号和美国专利第5,695,770号。稳定洗涤剂是允许乳液组分保持为稳定乳液的任何洗涤剂。这类洗涤剂包括聚山梨醇酯、80(TWEEN)(脱水山梨糖醇-单-9-硬脂酸酯-聚(氧-1,2-乙烷二基；由ICI Americas，Wilmington，DE制备)、TWEEN40TM、TWEEN 20TM、TWEEN60TM、ZwittergentTM 3-12、TEEPOL HB7TM和SPAN 85TM，这些洗涤剂通常以大约0.05-0.5％(诸如约0.2％)的量提供。胶束形成剂是能够稳定与其它组分形成的乳液使得形成胶束样结构的试剂。这类试剂通常在注射部位引起一些刺激以招募巨噬细胞增强细胞应答。这类试剂的实例包括由BASF Wyandotte出版物(例如Schmolka，JAm.Org.Chem.Soc.54：110,1977和Hunter等人，J.Immunol 129：1244,1981)描述的聚合物表面活性剂、PLURONIC TM L62LF、L101和L64、PEG1000以及TETRONICTM 1501、150R1、701、901、1301和130R1。这类试剂的化学结构在本领域中是众所周知的。在一实施方案中，选择具有0至2的亲水-亲脂平衡值(HLB)(如Hunter和Bennett，J.Immun.133:3167,1984所定义的)的试剂。可以以有效量提供试剂，例如0.5至10％，或1.25至5％的量。
选择包含在组合物中的油以促进抗原在水包油乳液中的保留，诸如为期望的抗原提供媒介物，并且其优选具有小于65℃的熔解温度，使得在室温(约20℃至25℃)下，或者一旦乳液的温度降至室温下形成乳液。这类油的实例包括角鲨烯、角鲨烷、EICOSANETM、四十四烷、甘油和花生油或其它植物油。在一具体的非限制性实例中，以1-10％或2.5-5％的量提供油。油应该是可生物降解的和生物相容的，以便身体能够随着时间分解油，并且以便在使用油时没有明显的不利影响(诸如肉芽肿)。
在一实施方案中，佐剂是在名称
Figure BDA0004014272820000301
(IDEC Pharmaceuticals，SanDiego，CA)下可获得的稳定洗涤剂、胶束形成剂和油的混合物。
可以通过任何方法向宿主施用多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物。例如，可以通过各种技术中的任一种将多肽或编码多肽的核酸(例如作为非酵母载体)引入细胞(例如在宿主中)，诸如通过使细胞与本文所述的多肽、核酸或包含作为构建体(能够进行核酸的递送和表达)的一部分的核酸的组合物接触。用于在细胞中引入和表达核酸的具体方案在本领域中是已知的(参见例如Sambrook等人(编辑)，同上；和Ausubel等人，同上)。
将多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞和组合物施用于宿主(对象)的合适方法是本领域已知的。宿主(对象)可以是任何合适的宿主，诸如哺乳动物(例如啮齿动物(诸如小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠)、兔、猫、狗、猪、山羊、奶牛、马、灵长类动物或人类)。
例如，可以通过将肿瘤细胞离体暴露于多肽、核酸或非酵母载体(例如重组痘病毒)或通过将多肽、核酸或非酵母载体注射到宿主中来将多肽、核酸或非酵母载体施用于宿主。可以通过直接注射到癌性病灶或肿瘤中或通过局部施加(例如，用药学上可接受的载体)而直接施用(例如局部施用)多肽、核酸、非酵母载体(例如重组痘病毒)或非酵母载体、非酵母细胞以及组合物的组合。
可以将多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物单独施用，或与佐剂、掺入脂质体中(描述于例如美国专利第5,643,599号、第5,464,630号、第5,059,421号和第4,885,172号中)、与细胞因子、与生物应答调节剂(例如干扰素、白细胞介素-2(IL-2)和集落刺激因子(CSF、GM-CSF和G-CSF))或与已知可增强免疫应答的本领域的其他试剂组合施用。
合适佐剂的例子包括明矾、铝盐、磷酸铝、氢氧化铝、铝硅石(aluminum silica)、磷酸钙、不完全弗氏佐剂、QS21、MLP-A和RIBIDETOXTM。
用于本发明的特别优选的佐剂是细胞因子GM-CSF。GM-CSF已被证实为有效的疫苗佐剂，因为它增强树突细胞的抗原加工和呈递。实验和临床研究表明，重组GM-CSF可以增强针对各种免疫原的宿主免疫力。
可以使用病毒载体(例如痘病毒载体)或作为药物制剂中的分离蛋白施用GM-CSF。可以在最初施用多肽、核酸、非酵母载体、细胞或其组合物之前、期间或之后向宿主施用GM-CSF以增强宿主中的抗原特异性免疫应答。例如，可以在疫苗接种多肽、核酸、非酵母载体、细胞或其组合物的每一天和接下来的3天中的每一天(即总共4天)向宿主施用重组GM-CSF蛋白。可以使用任何合适剂量的GM-CSF。例如，可以每天施用50-500μg(例如100μg、200μg、300μg、400μg及其范围)的重组GM-CSF。GM-CSF可以通过任何合适的方法(例如皮下地)被施用，并且优选地，在宿主疫苗接种多肽、核酸、非酵母载体、细胞或其组合物的位置或附近被施用。
在一实施方案中，可以将本发明的多肽与辅助肽或大载体分子缀合以增强多肽的免疫原性。这些分子包括但不限于流感肽、破伤风类毒素、破伤风类毒素CD4表位、假单胞菌外毒素A、聚-L-赖氨酸、脂质尾、内质网(ER)信号序列等。
还可以使用本领域可接受的方法将本发明的多肽缀合至免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子可以对存在于肿瘤细胞上，但不存在于或以非常低的量存在于正常细胞上的表面受体具有特异性。免疫球蛋白还可以对特定组织(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺组织)具有特异性。这样的多肽-免疫球蛋白缀合物允许将肽靶向特定的组织和/或细胞。
可以向宿主施用任何合适剂量的多肽、核酸、非酵母载体或其细胞或组合物。适当的剂量将根据诸如宿主的年龄、体重、身高、性别、一般身体状况、既往病史、疾病进展和肿瘤负荷等因素而变化，并且可由临床医生确定。例如，可以以宿主(例如哺乳动物，诸如人类)每次疫苗接种约0.05mg至约10mg(例如，0.1mg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg及其范围)的剂量来施用肽，并且优选每次疫苗接种约0.1mg至约5mg。可以提供几个剂量(例如1、2、3、4、5、6或更多)(例如，数周或数月的时间)。在一实施方案中，每月提供剂量持续3个月。
当非酵母载体是病毒载体时，合适的剂量可以包括约1×105至约1×1012个(例如1×106个、1×107个、1×108个、1×109个、1×1010个、1×1011个及其范围)斑块形成单位(pfus)，尽管可以向宿主施用更低或更高的剂量。例如，可以施用约2×108pfus(例如，约0.5mL的体积)。
可以以每次输注约1×105至2×1011个(例如1×106个、1×107个、1×108个、1×109个、1×1010个及其范围)细胞的剂量向宿主施用本发明的细胞(例如细胞毒性T细胞)。可以例如以一至三次(例如两次)输注施用细胞。除了施用细胞之外，可以向宿主施用生物应答调节剂，诸如白细胞介素2(IL-2)。当待被施用的细胞是细胞毒性T细胞时，可以在施用细胞毒性T细胞之后施用多肽、核酸、非酵母载体或其组合物以引发细胞毒性T细胞从而进一步扩增体内T细胞的数目。
当待被施用的细胞是树突细胞时，施用于对象的树突细胞的量将根据对象的病况而变化，并且应该由执业医生考虑所有适当的因素来确定。优选地，成年人使用约1×106至约1×1012个(例如约1×107个、约1×108个、约1×109个、约1×1010个或约1×1011个，包括本文所述任何细胞数的范围)树突细胞。这些量将根据对象的年龄、体重、身材、病况、性别、待治疗的肿瘤的类型、给药途径、治疗是局部还是全身以及其他因素而变化。本领域技术人员应该能够容易地得出适当的施用剂量和时间表以适应对象的具体情况和需要。
本发明包括引发和加强方案。特别地，方案包括使用包含一种或多种重组非酵母载体(其编码本发明的多肽和任选地一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式及其免疫原性表位)的组合物进行初始“引发”，随后使用含有本发明多肽或一种或多种非酵母载体(其编码本发明多肽以及任选地一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式及其免疫原性表位)的组合物进行一次或优选多次“加强”。
初始引发疫苗接种可以包含一种或多种非酵母载体。在一实施方案中，将单一的非酵母载体(例如痘病毒载体)用于递送本发明的多肽和任选地一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式及其免疫原性表位。在另一实施方案中，两种或更多种非酵母载体(例如痘病毒载体)包含引发疫苗接种，其在单次注射中被同时施用。
加强疫苗接种也可以包含一种或多种非酵母载体(例如痘病毒载体)。在一实施方案中，将单一的非酵母载体用于递送加强疫苗接种的本发明多肽和任选地一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式及其免疫原性表位。在另一实施方案中，两种或更多种非酵母载体包含加强疫苗接种，其在单次注射中被同时施用。
可以使用不同的非酵母载体(例如痘病毒载体)来提供异源引发/加强方案，其使用携带不同组治疗分子的载体以不同时间间隔进行接种。例如，在一种异源引发/加强组合中，将第一正痘病毒载体组合物用于引发，并将第二禽痘病毒载体组合物用于加强。
施用非酵母载体(例如痘病毒载体)的时间表通常涉及重复施用加强载体。可以以任何合适的时间段(例如，每2-4周)施用加强载体1-3次(例如，1、2或3次)，持续任何合适的时间长度(例如，6-12周总计至少5-15次加强疫苗接种)。例如，最初的疫苗接种可以包含重组牛痘载体或MVA载体，接着用禽痘载体进行多次加强疫苗接种。在具体的实施方案中，宿主接受一次引发载体的疫苗接种，之后每2周使用加强载体进行6次加强，之后每4周使用加强载体，并根据疾病进展继续使用加强载体一段时间。
本发明还提供了试剂盒，其具有在药学上可接受的载体中的至少第一重组非酵母载体(例如痘病毒载体)，其在其基因组或其部分中已并入编码本发明多肽的核酸。第一重组非酵母载体(例如痘病毒载体)还可以包含编码一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修饰形式及其免疫原性表位的一种或多种核酸。除了第一重组非酵母载体之外，试剂盒可以具有在药学上可接受的载体中的第二重组非酵母载体，其包含编码一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式及其的免疫原性表位的一种或多种核酸。试剂盒还提供容器、注射针以及如何使用试剂盒的说明书。在另一实施方案中，试剂盒还提供佐剂(诸如GM-CSF)和/或与试剂盒组分一起使用商购佐剂的说明书。
可以通过各种途径向宿主施用多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物，所述途径包括但不限于皮下、肌肉内、皮内、腹膜内、静脉内和瘤内。在给予多次施用时，施用可以位于宿主中的一个或多个部位。
多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物的施用可以是“预防性的”或“治疗性的”。当预防性提供时，在肿瘤形成之前提供多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物以允许宿主的免疫系统抵抗宿主易于发展的肿瘤。例如，具有遗传性癌症易感性的宿主是用这类预防性免疫进行治疗的优选的一组患者。多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物的预防性施用预防、改善或延迟癌症。当治疗性提供时，在诊断出癌症时或之后提供多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物。
当宿主已经被诊断为患有癌症或转移性癌症时，可以与其他治疗性处理(诸如化疗或辐射)联合施用多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物。
在优选的实施方案中，向宿主施用多肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或其组合物导致宿主细胞表达共同施用的本发明多肽和任选地一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式和其免疫原性表位。本发明的多肽可以在感染的宿主细胞的细胞表面被表达。一种或多种免疫刺激/调控分子和/或其他肿瘤相关抗原(例如CEA、MUC)、其修改形式及其免疫原性表位可以在细胞表面被表达或可以由宿主细胞主动分泌。表位和免疫刺激/调控分子的表达为特异性T细胞提供必需的MHC限制性肽，并向T细胞提供适当的信号以帮助抗原识别和抗原特异性T细胞的增殖或克隆扩增。总体结果是免疫系统的上调。优选地，免疫应答的上调是抗原特异性T辅助淋巴细胞和/或细胞毒性淋巴细胞的增加，其能够杀死或抑制癌症(例如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、头颈癌或前列腺癌)细胞的生长。
用于本发明方法的药物组合物有多种合适的制剂。用于肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内和腹膜内施用的以下制剂是示例性的，绝非限制性的。本领域技术人员将会理解，施用本发明的肽、核酸、非酵母载体、非酵母细胞或组合物的这些途径是已知的，并且尽管可以使用一种以上的途径来施用特定化合物，特定途径可以提供比另一途径更加直接和更有效的应答。
根据本发明优选的那些制剂中有可注射制剂。对于可注射组合物的有效药物载体的要求是本领域普通技术人员熟知的(参见例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice，JB Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers，编辑，第238-250页(1982)和ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。
适用于肠胃外施用的制剂包括含水和不含水的等渗无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质)，以及含水和不含水的无菌悬浮液(其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。可以在药物载体中的生理上可接受的稀释剂中施用肽、核酸、载体、细胞或其组合物，诸如无菌液体或液体混合物，其包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液、醇(诸如乙醇、异丙醇或十六烷醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲基亚砜、甘油缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)、醚(诸如聚(乙二醇)400)、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，其添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(诸如肥皂或洗涤剂)、悬浮剂(诸如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)、或乳化剂和其它药物佐剂。
可用于肠胃外制剂中的油包括石油、动物油、植物油和合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油和矿物油。用于肠胃外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于肠胃外制剂的合适的肥皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，诸如，例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶卤化物，(b)阴离子洗涤剂，诸如，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐，和磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，诸如，例如脂肪胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，诸如，例如烷基-b-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。
可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，这类组合物可以含有具有约12至约17的亲水-亲脂平衡值(HLB)的一种或多种非离子表面活性剂。这类制剂中表面活性剂的量通常以重量计将为约5％至约15％的范围。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(诸如脱水山梨糖醇单油酸酯)和通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的具有疏水基的环氧乙烷的高分子量加合物。
肠胃外制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封的容器中(诸如安瓿和小瓶)，并且可以储存在冷冻干燥(冻干的)条件中，其仅需要在使用前立即添加无菌液体赋形剂(例如水)用于注射。可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备临时注射溶液和混悬液。
以下实施例进一步说明本发明，但是，当然不应该以任何方式解释为限制其范围。
实施例1
本实施例提供了用于实施例2中描述的实验的材料和方法。
病毒构建
如先前Gabitzsch等人(Cancer Immunol Immunother.2010；59：1131-1135)和Amalfitano等人(J Virol.1998；72：926-933)中所描述的，构建和产生Ad5[E1-,E2b-]--Brachyury、Ad5[E1-,E2b-]--CEA以及Ad5[E1-,E2b-]--MUC1。简而言之，使用基于同源重组的方法将转基因亚克隆到Ad5[E1-，E2b-]载体的E1区中。将复制缺陷型病毒在E.C7包装细胞系中增殖，CsCl2纯化，并如先前在Amalfitano等人，同上中描述进行滴定。在E.C7细胞单层上将病毒感染滴度确定为斑块形成单位(PFU)。通过十二烷基硫酸钠(SDS)破坏和在260nm和280nm处的分光光度法测定VP浓度(ViraQuest，North Liberty，IA)。CEA转基因还含有包含高免疫原性表位CAP1-6D的修饰的CEA(参见Salazar等人，Int J Cancer.2000；85：829-838；和Zaremba等人，Cancer Res.1997；57：4570-4577)。
通过引入增强T细胞HLA-A2表位(WLLPGTSTV)(参见Tucker等人，Cancer ImmunolImmunother.2014；63：1307-1317)并去除参与DNA结合的25个氨基酸的片段来修饰编码人Brachyury蛋白的序列(NM_003181.3)。随后将所得构建体亚克隆到Ad5载体中以产生Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury构建体。
MUC1分子由两个区域组成：N-末端(MUC1-N)(其是MUC1的大胞外结构域)和C-末端(MUC1-C)(其具有三个区域：小的胞外结构域、单个跨膜结构域和胞质尾)(参见Lan等人，JBiol Chem.1990；265：15294-15299)。胞质尾含有与信号转导蛋白相互作用的位点，并且已显示其作为致癌基因和癌症运动性、侵袭性和转移的驱动因子(参见Wei等人，CancerRes.2007；67：1853-1858；和Li等人，J Biol Chem.2001；276：35239-35242)。
为了构建Ad5[E1-，E2b-]-MUC1，将先前描述的包括8个激动剂表位的整个MUC1转基因(参见Tsang等人，Clin Cancer Res.2004；10：2139-2149；和Jochems等人，CancerImmunol Immunother.2014；63：161-174)亚克隆到Ad5载体中。包括在Ad5[E1-，E2b-]-MUC1载体中的激动剂表位结合HLA-A2(N-末端的表位P93L、VNTR区的V1A和V2A，以及C-末端的C1A、C2A和C3A)、HLA-A3(表位C5A)和HLA-A24(C-末端的表位C6A)。Tri-Ad5疫苗通过以1：1：1的比例组合1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-CEA和Ad5[E1-，E2b-]-MUC1(总共3x1010 VP)来产生。
人DC从PBMC的产生
使用先前描述的方法(参见Cereda等人，Vaccine.2011；29：4992-4999)，从使用PSA-TRICOM疫苗与易普利姆玛(ipilimumab)(参见Madan等人，Lancet Oncol.2012；13：501-508)组合的临床试验中登记的前列腺癌患者(HLA-A2+和-A24+)的外周血单核细胞(PBMC)产生树突细胞(DC)。使用来自疫苗接种后的该位患者的PBMC，可以建立对CEA、MUC1和Brachyury具有特异性的各T细胞系。国立卫生研究院(NIH)临床中心的机构审查委员会批准了程序，并根据赫尔辛基宣言获得了知情同意书。简而言之，使用淋巴细胞分离培养基梯度(ICN Biochemicals，Aurora，VA)分离PBMC，重悬于AIM-V培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)(2×107个细胞)中并且允许其于6孔板中贴壁2小时。在含有100ng/ml重组人(rh)GM-CSF和20ng/ml rhIL-4的AIM-V培养基中培养贴壁细胞5天。每3天补充一次培养基。
用腺病毒载体感染人DC
在6孔板中用指定感染复数(MOI为10,000或20,000)的腺病毒载体(Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1和Ad5[E1-，E2b-]-BrachyuryAd5以及Ad5[E1-，E2b-]-空)感染1ml AIM-V培养基中的树突细胞(2x105)。然后将AIM-V培养基(4ml)加入每个孔中并再孵育2天。为了分析转基因表达的功效，使用流式细胞术和Western印迹收集DC并对其进行分析。对于表型分析，使用BV421缀合的抗CD80、PerCP Cy5.5缀合的抗CD83、APC-Cy7缀合的抗HLA-DR、PE缀合的抗CD86和FITC缀合的抗CEA针对CD80、CD83、CD86、CEA和HLA-DR的表达对DC进行染色。用于流式细胞术的抗体购自BD Bioscience(San Jose，CA)。
使用腺病毒感染的DC产生T细胞系
将改良的Tsang等人描述的方法(J Natl Cancer Inst.1995；87：982-990)用于产生CEA-、MUC1-和Brachyury-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。如上所述，用20,000MOI的Tri-Ad5感染树突细胞(在1ml AIM-V中1-2×105个/孔)。将感染的DC用作APC，以10：1的效应物-APC比例刺激自体非贴壁细胞。将培养物在含有5％CO2的加湿空气中于37℃孵育3天。
然后用rhIL-2补充培养物7天；每3天补充含有IL-2的培养基。10天的刺激构成了一个体外刺激(IVS)周期。将自体载体感染的DC用作APC，进行三个IVS。在三个IVS之后，使用自体肽脉冲的B细胞再刺激抗原特异性CTL。将T细胞系维持在含有IL-7和IL-15的培养基(10ng/ml；PeproTech，Rocky Hill，NJ)中。
细胞毒性测定
将改良的Tsang等人描述的方案(Cancer Res.2001；61：7568-7576)用于CTL分析。简而言之，用50μCi的111In氧化物(GE Health Care，Vienna，VA)在37℃下标记靶细胞20分钟，并在96孔圆底培养板中以3,000个细胞/孔使用。以不同的比例加入T细胞并在37℃下孵育16小时。收集上清液进行γ计数。一式三份进行测定并计算SD。通过单独用培养基孵育靶细胞来测定自发释放，并通过与0.25％Triton X-100孵育来测定完全溶解。使用以下公式计算特异性溶解：溶解(％)＝[观察到的释放(CPM)-自发释放(CPM)]/[完全释放(CPM)-自发释放(CPM)]×100。
肿瘤细胞培养
人类结肠癌SW620(HLA-A2+、HLA-A24+、Brachyury+、MUC1+、CEA+)和胰腺癌ASPC-1(HLA-A1+、HLA-A26+、MUC1+)细胞系获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。细胞培养物不含支原体，并被保持在完全培养基(补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640)(Mediatech，Herndon，VA)中。
细胞因子的检测
使用ELISA试剂盒(Invitrogen，Frederick，MD)评估在无IL-2培养基中用感染腺病毒载体的DC或肽脉冲的DC刺激24小时的T细胞上清液的IFN-γ分泌。先前已经报道了在该分析中使用的抗原特异性T细胞：(a)HLA-A2 CEA特异性CTL(Palena等人，Cytokine.2003；24：128-142)，(b)HLA-A2 MUC1特异性CTL(Tsang等人，Clin CancerRes.2004；10：2139-2149)，(c)HLA-A24 MUC1特异性CTL(Jochems等人，Cancer ImmunolImmunother.2014；63：161-174，和(d)HLA-A2Brachyury-特异性CTL(Tucker等人，CancerImmunol Immunother.2014；63：1307-1317)。
肽
在该研究中使用以下HLA-A2和HLA-A24结合肽：(a)HLA-A2结合CEA激动肽CAP1-6D(YLSGADLNL)(Zaremba等人，Cancer Res.1997；57：4570-4577)，(b)HLA-A2 MUC1激动肽P93L(ALWGQDVTSV)(Tsang等人，Clin Cancer Res.2004；10：2139-2149)，(c)HLA-A24结合MUC1激动肽C6A(KYHPMSEYAL)(Jochems等人，Cancer Immunol Immunother.2014；63：161-174)，和(d)HLA-A2结合Brachyury激动肽(WLLPGTSTV)(Tucker等人，Cancer ImmunolImmunother。2014；63：1307-1317)。所有肽纯度均大于96％，并由American PeptideCompany，Inc.(Sunnyvale，CA)制备。
小鼠
将8-10周龄的无特定病原体的雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)圈养在传染病研究所(IDRI)(Seattle，WA，USA)的动物设施中。根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行所有程序。
疫苗接种和脾细胞制备
用1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury或Ad5[E1-，E2b-]-CEA或Ad5[E1-，E2b-]-MUC1或1：1：1比例的1010个VP的所有三种病毒的组合(Tri-Ad5)皮下注射雌性C57BL/6小鼠(n＝5)。用3×1010个VP的Adeno-空(无转基因插入物)注射对照小鼠。以25μl注射缓冲液(含3％蔗糖的20mM HEPES)施用剂量，并以14天的间隔接种小鼠三次。最后一次注射后14天，收集脾脏和血清。血清在-20℃冷冻。通过用70μM尼龙细胞过滤网(BD Falcon，San Jose，CA)轻轻压碎脾脏产生脾细胞悬浮液。通过加入红细胞溶解缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)除去红细胞，并将脾细胞洗涤两次并重悬于R10(补充有L-谷氨酰胺(2mM)、HEPES(20mM)(Corning，Corning，NY)、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml(Hyclone，GE Healthcare LifeSciences，Logan，UT)以及10％胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640)中。通过ELISPOT和流式细胞术测定脾细胞的细胞因子产生。
ELISPOT测定
如上所述，通过ELISPOT测定从新鲜分离的小鼠脾细胞来确定分泌Brachyury-、CEA-和MUC1特异性IFN-γ或IL-2的T细胞。根据制造商的说明书(Affymetrix Bioscience，San Diego，CA)进行ELISPOT测定。简而言之，在来源于Brachyury或CEA(JPT PeptideTechnologies，Berlin，Germany)或MUC1的单个库中，用0.2μg/孔的重叠的15-mer肽刺激2x105个脾细胞。用浓度为0.0625μg/孔的伴刀豆球蛋白A(ConA)作为阳性对照刺激细胞，并将来源于SIV-Nef和SIV-Vif的重叠的15-mer完全肽库(艾滋病研究和参考试剂项目、艾滋病科、国家过敏和传染病研究所(NIAID)、国立卫生研究院(NIH))用作不相关的肽对照。使用Immunospot ELISpot平板阅读器(Cellular Technology，Shaker Heights，OH)确定SFC的数量，并将结果报告为每106个脾细胞中SFC的数量。
细胞内细胞因子刺激
如上所述制备脾细胞。在96孔U底板中使用每孔1×106个活的脾细胞进行刺激测定。将跨越Brachyury、CEA和MUC1的整个编码序列的重叠肽库合成为具有11个氨基酸重叠的15-mer(JPT GmbH)，并将冻干的肽库溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。类似地，将对应于SIV-Vif和SIV-Nef的构建的肽库用作脱靶对照。通过在37℃和5％CO2下以2μg/mL/肽加入肽库来刺激R10培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清和抗生素)中的脾细胞6小时，加入蛋白转运抑制剂(GolgiStop，BD)孵育2小时。然后将刺激的脾细胞针对淋巴细胞表面标志物CD8α和CD4进行染色、固定、透化，然后针对细胞内积累的IFN-γ和TNFα进行染色。从BD购买抗小鼠CD8α(克隆53-6.7)、CD4(克隆RM4-5)、IFN-γ(克隆XMG1.2)和TNFα(克隆MP6-XT22)的抗体，并且在抗CD-CD16/CD32(克隆2.4G2)存在下进行染色。使用Accuri C6流式细胞仪(BD)进行流式细胞术并在BD Accuri C6软件中分析。
检测抗CEA抗体的ELISA
在0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH9.6中用100ng人CEA(Sigma-Aldrich)包被ELISA平板(Maxisorp；Nunc，Rochester，NY)，并在室温下孵育过夜。用含有1％Tween-20(PBS-T)的磷酸盐缓冲盐水将平板洗涤三次，然后用含有1％BSA的PBS在室温下封闭60min。在另外三次洗涤后，将在PBS-T中1/50稀释的血清加入孔中，并将平板在室温下孵育1小时。洗涤后，将1:5000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G(γ链特异性)(Sigma-Aldrich)抗体加入孔中，并将平板孵育1小时。将平板洗涤三次，并向各孔中加入1,2-苯二胺底物溶液(Thermo-Fisher，Scientific，Waltham，MA)。通过加入10％磷酸终止反应。在SpectraMax 190ELISA阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上测量在492nm处的吸光度。通过参照使用纯化的小鼠IgG产生的标准曲线获得每孔结合CEA的纳克当量的IgG，并如先前所述(参见Gabitzsch等人，Vaccine.2011；29：8101-8107)与CEA ELISA(Sigma-Aldrich)同时显色。使用SoftMax Pro 6.3软件(Molecular Devices)分析和定量结果。
补体依赖性细胞毒性测定(CDC)
将MC38-CEA2肿瘤细胞以每孔2×104个细胞的密度在96孔组织培养微孔板中培养过夜。以1:50稀释度加入合并的热灭活的小鼠血清并在37℃孵育1小时。然后以1:50的稀释度加入兔血清作为补体来源，并将细胞在37℃再孵育2.5小时。根据制造商的说明书使用Promega Cytotox 96非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)测定细胞培养物上清液。通过公式％溶解＝(实验的-目标自发的)/(目标最大的-目标自发的)×100％计算MC38-CEA2细胞的溶解百分比。
肿瘤免疫疗法
对于体内肿瘤治疗研究，将106个MC38-MUC1细胞在左侧皮下植入8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠。使用1010个VP的Adeno-MUC1或Tri-Ad5以7天的间隔处理小鼠三次。用3×1010个VP的Adeno-空注射对照小鼠。通过测量两个相反的维度(a、b)来评估肿瘤生长，并如先前所述，根据公式V＝(axb)2/2(其中较短的维度是“a”)，计算体积(参见Tomayko等人，CancerChemother Pharmacol.1989；24：148-154)。当肿瘤达到1500m3或严重溃疡时，终止肿瘤研究。
实施例2
本实施例描述了包含Brachyury缺失突变多肽的载体的产生和表征。
如先前所述产生并表征重组Ad5[E1-，E2b-]-CEA(参见Gabitzsch等人，CancerImmunol Immunother.2010；59：1131-1135)。如实施例1中所述产生重组Ad5[E1-，E2b-]-MUC1和Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury。使用抗Brachyury特异性单克隆抗体(MAb 54-1)的Western印迹分析揭示当用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury感染人类树突细胞(DC)时Brachyury表达。使用没有任何转基因的Ad5[E1-，E2b-]载体(Ad5[E1-，E2b-]-空)作为阴性对照，并将内源表达Brachyury的SW620人结肠癌细胞用作阳性对照。
使用抗MUC1特异性MAb来检测Ad5[E1-，E2b-]-MUC1感染的人DC中MUC1的表达。使用SW620细胞(其还内源性表达MUC1)作为阳性对照。在人DC和SW620人癌细胞中观察到的分子量差异最有可能是由于MUC1蛋白的差异糖基化。
似乎MUC1-C在人DC中主要表达为非糖基化17或15kDa形式而不是25-20糖基化种类。对比未感染人DC，分析用Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1和Ad5[E1-，E2b-]-空感染的人DC的DC成熟的证据。Ad5[E1-，E2b-]-空和表达TAA的重组Ad5[E1-，E2b-]载体之间没有差异，因为各自均轻微上调表面CD80和CD83表达并强烈上调HLA-DR表面表达。因此很明显，DC成熟的任何变化都是由于单独的Ad5载体而不是任何TAA转基因插入。
先前报道了使用每种TAA的相应肽的Brachyury-、CEA-和MUC1特异性人CD8+T细胞的产生(参见Palena等人，Clin Cancer Res.2007；13：2471-2478；Tsang等人，Clin CancerRes.2004；10：2139-2149；Jochems等人，Cancer Immunol Immunother.2014；63：161-174；Tucker等人，Cancer Immunol Immunother.2014；63：1307-1317；Salazar等人，Int JCancer.2000；85：829-838；和Zaremba等人，Cancer Res.1997；57：4570-4577)。
如表1所示，Ad5[E1-，E2b-]-空不激活任何T细胞以产生IFN-γ。Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury感染的DC激活Brachyury特异性T细胞而非CEA特异性T细胞(作为阴性对照)。这表明Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury感染的DC可以以产生能够活化特异性T细胞的Brachyury-MHC I类复合体的方式加工Brachyury。
表1A.用编码CEA、MUC1或Brachyury的重组腺病毒载体感染的人树突细胞可以激活抗原特异性T细胞系
Figure BDA0004014272820000451
用20,000感染复数(MOI)的所示腺病毒载体感染人DC(在0.5ml AIM-V中2x104个细胞/孔，在IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的6天培养物)。48小时后，洗涤DC并用于刺激人抗原特异性T细胞。结果以每1×105个T细胞/ml的IFN-γ的pg/ml表示。粗体数字表示与未感染的DC相应的孔相比，IFN-γ分泌的显著增强。[-表示未进行测定。]表1B.用编码转基因的Tri-Ad5载体感染的人树突细胞可以激活抗原特异性T细胞系以产生IFN-γ
Figure BDA0004014272820000461
用Tri-Ad5载体感染来自HLA-A2和HLA-A24供体的人DC(在IL-4和GM-CSF中的6天培养物，以0.5ml AIM-V中的2×104个/孔(24孔板))。以20,000MOI使用Tri-Ad5载体1小时，然后将1.5ml AIM-V加入到每个孔中。将感染的DC孵育48小时，然后洗涤并用于刺激人抗原特异性T细胞。结果以每1×105个T细胞/ml的IFN-γ的pg表示。粗体数字表示与未感染的DC相应的孔相比，IFN-γ分泌的显著增强。
类似地，Ad5[E1-，E2b-]-CEA感染的DC特异性激活CEA特异性T细胞而非MUC1特异性T细胞系。先前已经产生了I类HLA-A2和HLA-A24 MUC1特异性T细胞系(参见Jochems等人，Cancer Immunol Immunother.2014；63：161-174)，并且Ad5[E1-，E2b-]-MUC1感染的DC能够激活这两种T细胞系而非CEA特异性T细胞系(表1A)。用Tri-Ad5载体类似地感染人DC。如表1B所示，CEA、MUC1和Brachyury特异性T细胞各自被激活以诱导相似水平的IFN-γ，如使用单独的Ad-5载体所见。
然后进行研究以确定用Tri-Ad5的CEA/MUC1/Brachyury混合物同时感染人DC是否能够产生对所有三种TAA具有特异性的T细胞系。如表2所示，当T细胞通过与用相应肽脉冲而不是对照肽脉冲的自体B细胞一起孵育而被激活时，观察到特异性T细胞激活。
表2.用Tri-Ad5感染的人树突细胞可以产生针对Brachyury、MUC1和CEA的抗原特异性T细胞，并且当用相应肽脉冲刺激的自体B细胞刺激时产生IFN-γ
Figure BDA0004014272820000471
以20,000MOI的Tri-Ad5感染来自前列腺癌患者的人树突细胞(DC)(在0.5ml AIM-V中2x104个细胞/孔，在IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的6天培养物)。48小时后，洗涤感染的DC，并将其使用自体外周血单核细胞(PBMC)作为效应物用于产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在体外刺激的3个循环之后，使用自体肽脉冲的B细胞作为抗原呈递细胞。结果以IFN-γ的pg/ml表示。[-表示未进行测定。]
例如，当与用Brachyury肽脉冲的自体DC孵育时，通过用Tri-Ad5感染人DC产生的Brachyury特异性T细胞系被刺激产生IFN-γ，但是与用CEA肽脉冲的相同的自体DC一起未被激活。用Tri-Ad5感染的DC产生的CEA和MUC1 T细胞系观察到类似的结果。这些结果表明在体外使用Tri-Ad5时缺乏所谓的“抗原竞争”。
然后研究使用用Tri-Ad5感染的DC产生的Brachyury-、MUC1-和CEA-特异性人T细胞是否能溶解内源表达这些TAA的人癌细胞。SW620人结肠癌细胞表达全部三种TAA并具有HLA-A2和-A24 I类等位基因。ASPC-1人胰腺癌细胞被用作阴性对照，因为它们表达三种TAA，但是在HLA-A1和HLA-A26分子的背景下。结果(表3)证明Tri-Ad5感染的人DC可以产生能够以MHC限制性方式溶解内源性表达Brachyury、CEA和MUC1的人肿瘤细胞的T细胞。
表3.用Tri-Ad5感染的人DC可以产生能有效溶解表达所有三种抗原的肿瘤细胞的Brachyury-、MUC1-和CEA-特异性CTL
Figure BDA0004014272820000481
用20,000MOI的Tri-Ad5感染人树突细胞(DC)。使用自体外周血单克隆细胞(PBMC)将感染的DC用于产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。将自体DC用作抗原呈递细胞，持续三轮体外刺激(IVS)。使用脉冲的自体肽脉冲B细胞重新刺激抗原特异性CTL，持续另外两轮IVS。使用的效应物比靶标的比率是30：1；在IVS5处使用CTL。结果以％特异性溶解(SD)表示。
接下来进行研究以确定Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1和Ad5[E1-，E2b-]-CEA是否可以在体内各自产生TAA特异性T细胞应答，以及Tri-Ad5混合物是否可以产生可比较的应答。用1010个病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1、Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury或Tri-Ad5(各自为1010个VP的1：1：1的混合物)以2周的间隔皮下注射(s.c.)C57Bl/6小鼠(每组n＝5)3次。另外一组小鼠(n＝5)接受3x1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-空(空载体对照)。
最终疫苗接种后两周，用相应的Brachyury、CEA或MUC1肽库刺激来自疫苗接种小鼠的脾细胞，并通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定分析IFN-γ和IL-2分泌细胞。用单一构建体或用Tri-Ad5疫苗接种的小鼠分别对Brachyury、CEA和MUC1肽有应答，与对照小鼠相比，IFN-γ和IL-2斑点形成细胞(SFC)显著增加(图1A和B)。与用Tri-Ad5疫苗相比，单独用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury或Ad5[E1-，E2b-]-CEA疫苗接种的小鼠中IFN-γSFC的平均数量没有显著差异。与单独的Ad5[E1-，E2b-]-MUC1相比，用Tri-Ad5疫苗处理的小鼠中的IFN-γSFC显著降低，尽管Tri-Ad5诱导的MUC1特异性免疫应答保持显著高于对照小鼠(p<0.0001)(图2A)。在用Tri-Ad5对比单一疫苗构建体处理的小鼠中IL-2应答相似；此外，当小鼠用Tri-Ad5疫苗对比单独的Ad5[E1-，E2b-]-CEA疫苗进行疫苗接种时，CEA特异性IL-2SFC有显著增加(p＝0.004)(图3B)。来自用空载体疫苗接种的小鼠的脾细胞对Brachyury、CEA或MUC1肽库没有应答。此外，在来自任何疫苗接种的组的脾细胞中没有对对照肽库(猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-Nef和SIV-Vif)的反应性。
总之，这些数据表明在Tri-Ad5疫苗混合物中将Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-CEA和Ad5[E1-，E2b-]-MUC1组合具有产生抗原特异性IFN-γ-和IL-2-产生细胞的效果，与使用单独的每种疫苗时实现的效果相似。
还使用来自用腺病毒载体疫苗接种并用各自合成肽的重叠库刺激的小鼠的脾细胞，通过流式细胞术评估在CD8+和CD4+淋巴细胞群中IFN-γ和TNF-α的细胞内积累(图2)。与分离自用Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的那些CD8+脾淋巴细胞相比，用分离自用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury疫苗接种的小鼠的CD8+脾淋巴细胞观察到的IFN-γ产生之间没有观察到显著差异(图2A)。观察到与单一构建体疫苗接种的小鼠相比，分离自用Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的CD8+脾细胞中的CEA特异性和MUC1特异性IFN-γ积累之间的显著减少，尽管SFC的相对数量保持显著高于对照(p<0.0001)(图2A)。然而，分离自每种单一构建体疫苗接种的小鼠或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的CD4+脾细胞之间没有发现IFN-γ积累的显著差异(图2B)。
还通过流式细胞术评估了肽刺激的脾细胞细胞内IFN-γ和TNF-α的积累。检测了用每种单一抗原载体以及用Tri-Ad5疫苗接种的小鼠中的抗原特异性多功能CD8+和CD4+脾细胞。当直接比较分离自用单一载体疫苗接种的小鼠的双功能性CD8+和CD4+脾细胞的频率与来自用Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的那些双功能性CD8+和CD4+脾细胞的频率时，观察到极少的差异(图2C和D)。与用分离自用Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的双功能性CD8+脾细胞相比，分离自用针对分别的抗原的Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury或Ad5[E1-，E2b-]-CEA疫苗接种的小鼠的双功能性CD8+脾细胞之间，没有检测到显著差异(图2C)。观察到与用Tri-Ad5相比，来自用Ad5[E1-，E2b-]-MUC1疫苗接种的小鼠的双功能性CD8+脾细胞的显著降低(p＝0.04)；然而，与对照相比，这种降低的频率显著升高(p<0.001)。在分离自每种单一构建体或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的多功能CD4+脾细胞的频率中没有发现显著差异(图2C)。
为了评估由Ad5[E1-，E2b-]-CEA、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1、Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury或Tri-Ad5疫苗是否诱导体液应答，使用抗原特异性定量酶联免疫吸附测定(ELISA)。在来自用Ad5[E1-，E2b-]-CEA或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的血清中检测到针对CEA的显著且可比较的抗体应答(图3A)。在用对照载体疫苗接种的小鼠(图3A)，或用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury或Ad5[E1-，E2b-]-MUC1疫苗接种的小鼠中未检测到针对CEA的抗体。在分别用Ad5[E1-，E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-，E2b-]-MUC1或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的血清中未检测到Brachyury或MUC1的抗原特异性抗体。
为了确定Ad5[E1-，E2b-]-CEA或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠的血清中CEA抗体溶解表达CEA的肿瘤细胞的倾向，使用补体依赖性细胞毒性(CDC)测定。将来自疫苗接种的小鼠的热失活血清与MC38-CEA2肿瘤细胞(用人CEA转染的鼠CEA结肠癌细胞)一起孵育，然后用兔血清作为补体来源。通过从MC38-CEA2细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)测定溶解。在来自用Tri-Ad5或Ad5[E1-，E2b-]-CEA疫苗接种的小鼠的血清中有显著的MC38-CEA2细胞溶解，并且这两组之间的效果相似(图3B)。
然后进行研究以确定Tri-Ad5疫苗方案是否与使用单一重组腺病毒构建体在引发抗肿瘤作用方面一样有效。将1x106个表达MUC1的MC38细胞(MC38-MUC1)在左侧皮下植入C57BL/6小鼠(n＝7/组)。分别使用1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-MUC1或Tri-Ad5在相对侧皮下注射来每周给小鼠进行疫苗接种。对照组小鼠接受3×1010个VP的Ad5[E1-，E2b-]-空(无转基因)。在第25天(p<0.01)和第29天(p<0.05)，用Ad5[E1-，E2b-]-MUC1或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠比对照小鼠具有显著更小的肿瘤(图4)。在所有时间点用Ad5[E1-，E2b-]-MUC1或Tri-Ad5疫苗接种的小鼠组的抗肿瘤效果上没有显著差异(p>0.1)。
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Claims (13)

1.用于治疗癌症用途的Tri-Ad5疫苗组合物，所述组合物包含等分的Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-,E2b-]-CEA和Ad5[E1-,E2b-]-MUC1。
2.如权利要求1所述用途的组合物，其中施用1x105至1x1012病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-,E2b-]-brachyury、Ad5[E1-,E2b-]-CEA和Ad5[E1-,E2b-]-MUC1中的每一种。
3.如权利要求1所述用途的组合物，其中施用1x1010至1x1012病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-,E2b-]-brachyury、Ad5[E1-,E2b-]-CEA和Ad5[E1-,E2b-]-MUC1中的每一种。
4.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury疫苗包含编码具有SEQ ID NO:3的序列的蛋白的核酸。
5.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述疫苗组合物与免疫刺激剂一起施用。
6.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述疫苗组合物与IL-15/IL-15受体复合物一起施用。
7.如权利要求1所述用途的组合物，其还包含化学治疗药物、抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物、环磷酰胺或以上的组合。
8.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述癌症为小肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、支气管癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、其他B细胞恶性肿瘤、或乳腺癌，诸如浸润性导管癌以及雌性激素受体阴性和黄体酮阴性的乳腺癌。
9.如权利要求8所述用途的组合物，其中所述癌症为结肠癌。
10.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述疫苗组合物经皮下施用。
11.如权利要求1所述用途的组合物，其中所述疫苗组合物作为引发疫苗接种和至少一次加强疫苗接种施用。
12.如权利要求11所述用途的组合物，其中每两周施用所述加强疫苗接种。
13.如权利要求11所述用途的组合物，其中每四周施用所述加强疫苗接种。
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