KR20200111729A - 재조합 레플리콘 시스템을 이용한 면역 반응 유도 및 증진 - Google Patents
재조합 레플리콘 시스템을 이용한 면역 반응 유도 및 증진 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시는 일반적으로 면역 반응, 예컨대 예방적 백신접종 또는 치료적 투여에 뒤따른 면역 반응을 증진하기 위한 상이한 자가증폭 RNA 분자의 용도에 관한다. 몇몇 구현예는 프라임-부스트 면역화 요법을 이용한 대상체에서의 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한다.
Description
관련된 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2018년 1월 19일자로 출원된 미국 출원 제62/619,540의 35 U.S.C. §119(e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 기재사항은 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다.
서열 목록의 통합
수반되는 서열 목록의 내용은 본 출원에 참조로서 통합된다. 파일명 SGI2230_1WO_Sequence_Listing.txt의 수반되는 서열 목록 텍스트 파일은 2019년 1월 16일에 형성되고 3kb이다. 상기 파일은 Windows OS 를 사용하는 컴퓨터 상에서 Microsoft Word 를 사용하여 접근될 수 있다.
기술분야
본 개시의 양태는 바이러스학, 감염 질환, 및 면역학 분야에 관한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 상이한 RNA 레플리콘을 포함하는 적어도 두 개의 면역원적 조성물의 순차적 투여에 의하여 대상체에서 면역 반응을 유도 및/또는 증진하기 위한 조성물 및 방법에 관한다.
배경기술
항원-특이적 기억 CD8 T 세포의 큰 군집을 생성하는 것은 다양한 동물 및 인간 질환에 대한 백신 설계의 요망되는 목표이다. 실험 모델 상에 수행된 많은 연구들은 감염 시점에 존재하는 항원-특이적 기억 CD8 T 세포의 총 수는 상이한 병원체의 범위에 대한 숙주 보호를 부여하는 능력에 크게 연관됨을 입증했다. 현재, 큰 군집의 기억 CD8 T 세포를 신속하게 생성하기 위한 가장 가능성 있는 접근 중 하나는 프라임-부스트 백신접종의 이용을 통한 것이다. 결국, 치료 또는 질병 예방을 위한, 다중 용량 면역화가 단일 용량 면역화에 비하여 흔히 보다 효과적인 것으로 보고되어왔다. 이 차이는, 약독화 생백신, 불활성화 백신, 재조합 단백질 서브유닛 백신 및 다당류 백신을 포함하는 상이한 유형의 백신에서 관찰되어왔다. 보다 효과적인 이종성 프라임-부스트 요법에 대한 요구가 여전히 있다.
개요
본 섹션은 본 출원의 일반적 개요를 제공하며 전체 범위 또는 그 모든 특징을 망라하는 것이 아니다.
본 개시는 다양한 적용을 위하여 대상체 내로 두 개의 RNA 레플리콘을 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 대상체에서 면역 반응을 유도 및/또는 증진시킬 수 있게 한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 예컨대, 치료적 폴리펩티드와 같은 관심 분자의 대상체에서의 생산을 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관하고, 상기 방법은 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 포함하는 프라이밍 조성물의 적어도 하나의 용량을 대상체에 투여하는 단계; 및 구 후 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 포함하는 부스팅 조성물의 적어도 하나의 용량을 대상체에 투여하는 단계;를 포함하되, 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이하다. 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 본 명세서에 기술된 임의의 것일 수 있다.
다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는 대상체 내로 두 개의 RNA 레플리콘을 전달하는 방법에 관하며, 상기 방법은 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 대상체에 투여하는 단계; 및 그 후 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘을 서로 상이하다. 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 본 명세서에 기술된 임의의 것일 수 있다.
본 명세서에 따른 방법의 구현예의 수행은 이하의 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원의 아미노산 서열은 서로 동종성이다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 대상체에서 실질적으로 동일한 면역 반응을 유도한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 RNA 레플리콘은 면역 시스템이 제2 RNA 레플리콘에 의하여 활성화될 수 있는 면역 기전과 상이한 적어도 하나의 면역 기전을 통하여 대상체의 면역 시스템을 활성화시킬 수 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 면역 기전은 단백질 키나아제 R(PKR), 레티노산-유도성 유전자 I(RIG-I), 오토파지 경로(autophagy pathway), 톨-유사 수용체(TLRs), 스트레스 과립(stress granules), RNase R, 및 올리고아데닐산 합성효소(OAS)의 차등적 활성화로 이루어진 군에서 선택된다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 변형된 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 양성-가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 토가바이러스(Togaviridae)과, 플라비바이러스(Flaviviridae)과, 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과, 랍도바이러스(Rhabdoviridae)과, 아테로바이러스(Arteroviridae)과, 피코르나바이러스(Picornaviridae)과, 아스트로바이러스(Astroviridae)과, 코로나바이러스(Coronaviridae)과, 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae)과로 이루어진 군에서 선택되는 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 알파파이러스(Alphavirus) 또는 아테리바이러스(Arterivirus)로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus, EVEV), 무캄보 바이러스(Mucambo virus, MUCV), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus, SFV), 픽수나 바이러스(Pixuna virus, PIXV), 미들버그 바이러스(Middleburg virus, MIDV), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV), 오뇽뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus, ONNV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus, RRV), 바르마 숲 바이러스(Barmah Forest virus, BF), 게타 바이러스(Getah virus, GET), 사기야마 바이러스(Sagiyama virus, SAGV), 베바루 바이러스(Bebaru virus, BEBV), 마야로 바이러스(Mayaro virus, MAYV), 우나 바이러스(Una virus, UNAV), 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SINV), 아우라 바이러스(Aura virus, AURAV), 와타로아 바이러스(Whataroa virus, WHAV), 바반키 바이러스(Babanki virus, BABV), 키질라가시 바이러스(Kyzylagach virus, KYZV), 웨스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus, WEEV), 하일랜드 제이 바이러스(Highland J virus, HJV), 포트모건 바이러스(Fort Morgan virus, FMV), 엔두무 바이러스(Ndumu virus, NDUV), 살모니드 알파바이러스(Salmonid alphavirus, SAV), 및 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus, BCRV)로 이루어진 군에서 선택되는 알파바이러스 종으로부터 유래한다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 둘 다는 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 동일한 알파바이러스 종으로부터 또는 두 개의 상이한 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 비-알파바이러스 종으로부터 유래한다. 다른 구현예에서 제1 RNA 레플리콘은 비-알파바이러스로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스(예컨대, EAV)로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스(예컨대 VEEV)로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 위치 1, 2, 4 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는 변형된 5'-UTR을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환이다. 몇몇 구현예에서, 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환은 U->G 치환이다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR을 포함하는 변형된 RNA 레플리콘이고 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일 부분이 결여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 실질적 부분이 결여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 바이러스 캡시드 인핸서의 구조 요소 내의 하나 이상의 RNA 스템-루프를 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이종성 비-구조 단백질 nsP3를 위한 코딩 서열을 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 상기 이종성 비-구조 단백질 nsP3는 치쿤군야바이러스(CHIKV) nsP3 또는 신드비스바이러스(SINV) nsP3이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원 중 적어도 하나는 26S 서브게놈 프로모터 또는 그 변이체의 조절 하에 발현된다. 몇몇 구현예에서, 상기 26S 서브게놈 프로모터는 SINV 26S 서브게놈 프로모터, RRV 26S 서브게놈 프로모터, 또는 그 변이체이다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이콰인 아테리티스 바이러스(EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(LDV), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV)로 이루어진 군에서 선택되는 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 둘 다는 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 동일한 아테리바이러스 종으로부터 또는 두 개의 상이한 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스로부터 유래하고, 제2 RNA 레플리콘은 비-아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스로부터 유래하고, 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 비변형 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 변형된 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 RNA 레플리콘이고 제2 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 비변형 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 변형된 RNA 레플리콘이다.
본 명세서에서 개시된 몇몇 구현예에서, 개시의 본 양태 및 다른 양태에 따른 방법은 하나 이상의 후속적 부스팅 단계, 예컨대 부스팅 조성물의 하나 이상의 후속적 투여를 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물은 약학적 허용가능 담체를 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 수생 동물이다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 조류(avian) 종, 갑각류(crustacean) 종, 또는 어류(fish) 종이다. 몇몇 구현예에서, 상기 조류 종은 음식 소비를 위한 조류 종이다. 몇몇 구현예에서, 상기 갑각류는 새우이다. 몇몇 구현예에서, 상기 어류 종은 양식에 사용되는 어류 종이다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 몇몇 구현예에서, 상기 포유류는 인간, 말, 돼지(pig), 영장류, 마우스, 페렛, 래트, 코튼래트(cotton rat), 소, 돼지(swine), 양, 토끼, 고양이, 개, 염소, 당나귀, 햄스터 또는 버팔로이다.
일 양태에서, 본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는: 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 포함하는 프라이밍 조성물; 및 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 포함하는 부스팅 조성물을 포함하되, 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이한 조성물에 관한다.
다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는: 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하되, 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이하며, 상기 제1 레플리콘 및 제2 레플리콘은 관심 분자를 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 조성물에 관한다. 상기 제1 RNA 레플리콘 및 제2 RNA 레플리콘은 본 명세서에 기술된 임의의 것일 수 있다.
본 개시의 상기 양태들에 따른 조성물의 구현예의 수행은 이하의 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원의 아미노산 서열은 서로 동종성이다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원은 제2 항원의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 대상체에서 실질적으로 동일한 면역 반응을 유도한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 RNA 레플리콘은 면역 시스템이 제2 RNA 레플리콘에 의하여 활성화될 수 있는 면역 기전과 상이한 적어도 하나의 면역 기전을 통하여 대상체의 면역 시스템을 활성화시킬 수 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 면역 기전은 단백질 키나아제 R(PKR), 레티노산-유도성 유전자 I(RIG-I), 오토파지 경로(autophagy pathway), 톨-유사 수용체(TLRs), 스트레스 과립(stress granules), RNase R, 및 올리고아데닐산 합성효소(OAS)의 차등적 활성화로 이루어진 군에서 선택된다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 변형된 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 양성-가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 토가바이러스(Togaviridae)과, 플라비바이러스(Flaviviridae)과, 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과, 랍도바이러스(Rhabdoviridae)과, 아테로바이러스(Arteroviridae)과, 피코르나바이러스(Picornaviridae)과, 아스트로바이러스(Astroviridae)과, 코로나바이러스(Coronaviridae)과, 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae)과로 이루어진 군에서 선택되는 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 알파파이러스(Alphavirus) 또는 아테리바이러스(Arterivirus)로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus, EVEY), 무캄보 바이러스(Mucambo virus, MUCV), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus, SFV), 픽수나 바이러스(Pixuna virus, PIXV), 미들버그 바이러스(Middleburg virus, MIDV), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV), 오뇽뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus, ONNV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus, RRV), 바르마 숲 바이러스(Barmah Forest virus, BF), 게타 바이러스(Getah virus, GET), 사기야마 바이러스(Sagiyama virus, SAGV), 베바루 바이러스(Bebaru virus, BEBV), 마야로 바이러스(Mayaro virus, MAYV), 우나 바이러스(Una virus, UNAV), 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SINV), 아우라 바이러스(Aura virus, AURAV), 와타로아 바이러스(Whataroa virus, WHAV), 바반키 바이러스(Babanki virus, BABV), 키질라가시 바이러스(Kyzylagach virus, KYZV), 웨스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus, WEEV), 하일랜드 제이 바이러스(Highland J virus, HJV), 포트모건 바이러스(Fort Morgan virus, FMV), 엔두무 바이러스(Ndumu virus, NDUV), 살모니드 알파바이러스(Salmonid alphavirus, SAV), 및 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus, BCRV) 중 어느 하나 이상으로 이루어진 군에서, 또는 모든 가능한 바이러스의 조합 또는 서브-조합으로 이루어진 군에서 선택되는 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 예를 들어 몇몇 구현예에서 상기 알파바이러스 종은 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 및 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus, EVEV)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 둘 다는 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 동일한 알파바이러스 종으로부터 또는 두 개의 상이한 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 비-알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 위치 1, 2, 4 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는 변형된 5'-UTR을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환이다. 몇몇 구현예에서, 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환은 U->G 치환이다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR을 포함하는 변형된 RNA 레플리콘이고 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일 부분이 결여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 실질적 부분이 결여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 바이러스 캡시드 인핸서 또는 그 변이체의 구조 요소 내의 하나 이상의 RNA 스템-루프를 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이종성 비-구조 단백질 nsP3를 위한 코딩 서열을 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 상기 이종성 비-구조 단백질 nsP3는 치쿤군야바이러스(CHIKV) nsP3, 신드비스바이러스(SINV) nsP3, 또는 그 변이체이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원 중 적어도 하나는 26S 서브게놈 프로모터 또는 그 변이체의 조절 하에 발현된다. 몇몇 구현예에서, 상기 26S 서브게놈 프로모터는 SINV 26S 서브게놈 프로모터, RRV 26S 서브게놈 프로모터, 또는 그 변이체이다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이콰인 아테리티스 바이러스(EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(LDV), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV)로 이루어진 군에서 선택되는 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 둘 다는 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 동일한 아테리바이러스 종으로부터 또는 두 개의 상이한 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스로부터 유래하고, 제2 RNA 레플리콘은 비-아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스로부터 유래하고, 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 비변형 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 변형된 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 RNA 레플리콘이고 제2 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 비변형 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 변형된 RNA 레플리콘이다.
본 명세서에서 개시된 몇몇 구현예에서, 본 개시에 따른 조성물은 하나 이상의 후속적 부스팅 단계, 예컨대 부스팅 조성물의 하나 이상의 후속적 투여를 위한 조성물을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물은 약학적 허용가능 담체를 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에서, 포유류이다. 몇몇 구현예에서, 상기 포유류는 인간, 말, 돼지(pig), 영장류, 마우스, 페렛, 래트, 코튼래트(cotton rat), 소, 돼지(swine), did, xhRl, 고양이, 개, 염소, 당나귀, 햄스터 또는 버팔로이다.
앞서 말한 개요는 오로지 예시적이며 어떠한 방식으로도 한정을 의도한 것이 아니다. 본 명세서에 기술된 예시적인 구현예 및 특징에 더하여, 본 출원의 추가적 양태, 구현예, 대상 및 특징은 도면, 상세한 설명 및 청구항으로부터 충분히 명백해질 것이다.
도 1은 본 개시의 몇몇 구현예에 따른 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법의 비제한적 예시의 개략적 도시이다. 본 예시에서, 종래 프라임-부스트 요법(파선) 또는 이종성 프라임-부스트 요법(실선)에 대한, 항원 특이적 CD8 T 세포의 총 수에 의하여 판별된 면역 반응의 규모는 경시적으로 나타낸다.
도 2a 및 2b는 본 개시의 몇몇 구현예에 따른 다양한 프라임-부스트 스케쥴 후 마우스에서의 면역 반응을 분석하기 위하여 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 2a에서, 이펙터 IFN-γ-분비 CD8+ T 세포 반응의 평균 빈도는 부스트 후 14일의 면역화된 BALB/c 마우스로부터 유래한 비장세포 상에서 효소-결합 면역점(ELISpot) 검정에 의하여 판별되었다(α는 알파바이러스 레플리콘을 의미한다). 도 2b에서, 부스트 후 14일에서의 총 IgG 역가(ED20%의 역수)의 기하 평균은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의하여 판별되었다. 모든 면역 반응은 95% 신뢰구간을 나타냈고 표현된 통계는 비-파라미터 비페어링된 Mann-Whitney 검정을 사용하였다.
본 개시의 전술한 특징 및 다른 특징은 첨부 도면과 함께 다음의 설명 및 첨부 된 청구 범위로부터 보다 완전히 명백해질 것이다. 이들 도면은 본 개시에 따른 몇몇 실시예 만을 도시하고 그 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다는 것을 이해하고, 본 개시는 첨부된 도면을 사용하여 추가적인 구체적이고 상세하게 설명될 것이다.
도 2a 및 2b는 본 개시의 몇몇 구현예에 따른 다양한 프라임-부스트 스케쥴 후 마우스에서의 면역 반응을 분석하기 위하여 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 2a에서, 이펙터 IFN-γ-분비 CD8+ T 세포 반응의 평균 빈도는 부스트 후 14일의 면역화된 BALB/c 마우스로부터 유래한 비장세포 상에서 효소-결합 면역점(ELISpot) 검정에 의하여 판별되었다(α는 알파바이러스 레플리콘을 의미한다). 도 2b에서, 부스트 후 14일에서의 총 IgG 역가(ED20%의 역수)의 기하 평균은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의하여 판별되었다. 모든 면역 반응은 95% 신뢰구간을 나타냈고 표현된 통계는 비-파라미터 비페어링된 Mann-Whitney 검정을 사용하였다.
본 개시의 전술한 특징 및 다른 특징은 첨부 도면과 함께 다음의 설명 및 첨부 된 청구 범위로부터 보다 완전히 명백해질 것이다. 이들 도면은 본 개시에 따른 몇몇 실시예 만을 도시하고 그 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다는 것을 이해하고, 본 개시는 첨부된 도면을 사용하여 추가적인 구체적이고 상세하게 설명될 것이다.
본 개시는 일반적으로 면역 반응, 예컨대 예방적 백신접종 및/또는 치료적 투여에 따른 면역반응을 증진하기 위한 상이한 자가 증폭 mRNA 분자의 사용에 관한다. 본 개시의 몇몇 구현예는 예방적 및/또는 치료적으로 사용될 수 있는 이종성 프라임-부스트 면역화를 사용한 대상체에서 면역반응을 증진하는 조성물 및 방법에 관한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 상기 조성물 및 방법은 관심 분자, 예컨대 치료적 폴리펩티드를 대상체 내에서 생산하기 위하여 사용될 수 있다.
항원-특이적 기억 CD8 T 세포의 큰 군집을 생성하는 것은 다양한 동물 및 인간 질환에 대한 백신 설계의 요망되는 목표이다. 큰 군집의 기억 CD8 T 세포를 효과적으로 생성하기 위한 하나의 접근은, 하나의 벡터로 전달된 항원으로 기억 CD8 T 세포의 생성을 프라이밍하고, 그리고 나서 후속 시점에서 상이한 벡터의 맥락에서 동일 항원 또는 본질적으로 동일 항원을 투여하는 것을 수반하는,“이종성” 프라임-부스트 형태의 프라임-부스트 백신접종의 사용을 통하는 것이다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는 대상체에서 보다 우수한 면역 반응을 도출하기 위한 전략으로서 두개의 상이한 양식을 사용한 동일 면역원의 순차적 투여를 수반하는 이종성 프라임-부스트 요법에 관한다. 이 전략은 비제한적으로 말라리아, HIV, TB 및 에볼라를 포함하는, 다양한 챌린지 병원체를 위하여 이용될 수 있다. 이종성 프라임-부스트는 보다 우수한 기억 반응, 보다 높은 규모의 CD8+ T 세포 반응, 면역 시스템에 의하여 인식되는 T 세포 에피토프의 확장, 및 T 세포의 다기능성 증가를 초래할 수 있다. 알파바이러스-유래 레플리콘(예컨대, 신드비스, VEE 및 셈리키 숲 바이러스)이 단백질, DNA 및 비로좀(virosome)과 조합하여 이종성 프라임-부스트 세팅에 이용되어왔다. 이들은 인간 유두종바이러스(HPV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 마우스의 소동물 모델뿐만 아니라 뎅기(Dengue)에 대한 입자 형태로 전달되는 레플리콘을 가지는 비-인간 유인원(NHP)에서 효율적인 것으로 입증되어왔다. 더욱이, 완전 합성 알파바이러스-유래 레플리콘은 동종성 프라임-부스트 요법에서 광범위하게 사용되어왔다. 본 발명은 이종성 프라임-부스트 요법에서 사용하기 위한 두 면역학적으로 상이한 레플리콘을 가지는 요법을 제공한다. 본 발명은 또한 동종성 또는 이종성 투여 요법 각각을 이용할 수 있는 치료적 단백질을 발현하는 알파바이러스-유래 레플리콘의 반복적 투여를 갖는 요법을 제공한다.
본 명세서에서 개시되는 바와 같이, 두 면역학적으로 상이한 RNA 레플리콘으로 기억 CD8 T 세포의 생성을 프라이밍 및 부스팅하는 것에 의하여, 면역 반응은 보다 복잡한 병원체에 맞서도록 전략적으로 향상될 수 있다. 예를 들어, 백신에 관하여, 회상 반응은 기존 항체 또는 항원을 전달하는 플랫폼에 대한 T 세포 반응(항-벡터 면역)에 의하여 부정적 영향을 받을 수 있다. 유사하게, 동일 플랫폼을 사용한 항원의 다중 투여는 정확히 동일한 방식으로 면역 시스템을 자극하지만, 면역 검출의 대체 기전과 시너지화할 수 없기 때문에 보다 본질적으로 자기 제한적일 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으나, 이종성 프라임-부스트 면역화는 이것이 감소된 반응의 원인 기전에 따라 기존 항체 또는 T 세포 반응을 우회하도록 설계될 수 있기 때문에 첫번째 문제를 회피하기 위하여 기능하는 것으로 믿어진다. 더욱이, 두 면역학적으로 상이한 레플리콘을 사용한 이종성 프라임-부스트는 후속적 투여가 초기 투여와 시너지화되는 것과 상이한 방식으로 면역 시스템을 활성화하도록 조작될 수 있다.
또 다른 예시에서, 치료요법에 관하여, 회상 반응은 벡터에 대한 면역 반응이 치료적 단백질을 발현하는 세포의 제거를 초래할 수 있기 때문에 이종성 단백질 발현의 지속기간 및 규모를 감소시킬 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않으나, 이종성 프라임-부스트 면역화는 면역 시스템이 반복 투여 시 단백질을 발현하는 레플리콘을 인식하는 능력을 감소시켜 제거를 지연시키는 것에 의하여 이 문제를 우회하는 것으로 믿어진다.
이하의 상세한 설명에서, 그 일부를 형성하는 첨부된 도면이 참조된다. 도면에서, 유사한 기호는 맥락에서 달리 지시하지 않는 한 전형적으로 유사한 구성요소를 나타낸다. 상세한 설명, 도면 및 청구항에 기술된 예시적 대안은 제한을 의도하지 않는다. 본 명세서에 제시된 주제의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다른 대안이 사용될 수 있고 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 일반적으로 기술되며 도면에 예시된 양태들은 매우 다양한 상이한 구성으로 배열, 대체 결합 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 명시적으로 고려되며 본 출원의 일부를 이룬다는 것을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어 또는 용어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 이러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 설명되거나 참조된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적 인 방법론을 사용하여 잘 이해되고 일반적으로 사용된다.
몇몇 정의
단수 형태 “a”, “an”, 및 “the”는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수형의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 “세포”는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 “A 및/또는 B”는 이하의 모든 대안을 포함한다: “A”, “B”, “A 또는 B” 및 “A 및 B”.
본 명세서에서 사용되는 용어 “약”은 대략의 일반적 의미를 갖는다. 근사의 정도가 문맥으로부터 명확하지 않은 경우 “약”은 제공된 값의 플러스 또는 마이너스 10 % 이내를 의미하거나, 제공된 값을 포함하여 모든 경우에 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된다. 범위가 제공되는 경우 경계값이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항원결정인자(antigenic determinant)” 또는 “에피토프”는 면역 시스템, 예를 들어 항체, B 세포(예컨대, B 림프구) 및/또는 T 세포에 의하여 인식되는, 항원(예컨대 폴리펩티드)의 일부, 예를 들어 항원의 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조의 일부를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 항원결정인자는 항원의 표면 상의 부위이다. 몇몇 구현예에서, 항원결정인자는 항체 분자가 항원에 결합하는 부위이다. 용어 “교차 반응성 항원결정인자”는 2 이상의 상이한 항원 분자(예컨대, 폴리펩티드) 상에 존재하는 항원결정인자의 동일 항체에 의하여 결합되는 능력을 지칭한다. 더욱이, 동일 항체에 의해 결합될 수 있는 항원결정인자를 포함하는 2 이상의 항원 분자는 예컨대, 동일 분자 또는 그 단편, 서로의 변이체, 또는 상이한 분자일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 동일한 항체에 결합될 수 있는 교차 반응성 항원결정인자를 포함하는 폴리펩티드와 관련하여, 폴리펩티드는 동일 또는 상이한 1차 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 폴리펩티드 각각은 동일 항체에 의하여 결합될 수 있는 항원결정인자를 포함한다 (예컨대 "교차 반응성").
본 명세서에서 사용되는 용어 “로부터 유래한”은 기원 또는 출처를 지칭하며, 천연, 재조합, 비정제 또는 정제 분자를 포함할 수 있다. 본 개시의 분자는 바이러스 또는 비-바이러스 분자로부터 유래할 수 있다. 본래의 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래한 단백질 또는 폴리펩티드는 본래의 단백질 또는 폴리펩티드를 부분 또는 전체로 포함할 수 있으며, 본래의 단백질 또는 폴리펩티드의 단편 또는 변이체일 수 있다. 몇몇 구현예에서 RNA 레플리콘은 실질적으로 바이러스 게놈이며, 서열이 레플리콘이 숙주 세포 또는 처리된 유기체 내에서 자율적으로 복제하기에 충분한 유전적 정보를 포함하지만 완전한 야생형 바이러스 게놈이 아님을 의미한다.
용어 “유전자”는 단백질을 인코딩하거나 기능적 RNA로 전사될 수 있는 핵산 분자의 임의의 세그먼트를 지칭하는 데에 널리 사용된다. 유전자는 전사되지만 최종, 성숙 및/또는 기능적 RNA 전사체의 일부가 아닌 서열을 포함할 수 있고, 단백질을 인코딩하는 유전자는 전사되지만 번역되지 않는 서열, 예컨대, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 인트론 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 유전자는 선택적으로 그 발현에 필요한 조절 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 예컨대, 전사 또는 번역되지 않는 서열일 수 있다. 유전자는 관심 출처로부터 클로닝 또는 알려진 또는 예측되는 서열 정보로부터 합성을 포함하는 다양한 출처로부터 얻어질 수 있으며, 요망하는 파라미터를 가지기 위해 설계된 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 “면역 반응” 또는 “면역성”은 체액반응(예컨대, B 세포) 및/또는 세포 반응(예컨대, T 세포)의 유도를 의미한다. 적합하게, 체액 면역 반응은 숙주 내로의 하나 이상의 항원의 도입에 대한 반응으로 면역화된 동물의 혈청에 존재하는 항원 특이적 항체를 측정하는 것에 의하여 평가될 수 있다. 이하의 몇몇 예시적 구현예에서, 면역 반응은 이하의 실시예 1에서 논의된 바와 같이, 면역화된 동물로부터 유래한 비장세포에 대한 효소 결합 면역점(ELISpot) 검정에 의하여, 또는 면역화된 동물의 혈청의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의하여 평가된다. 용어 “면역원” 또는 “면역원적”은 특정 면역 반응을 유도하는 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 핵산 분자, 폴리펩티드 및 RNA 레플리콘과 관련하여 사용되는 용어 “변형된” 및 “서열 변형”은 천연형(예컨대, 야생형 또는 비변형)과 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 상이한 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 RNA 레플리콘을 규정하는 것을 의도한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “천연(naturally-occurring)” 및 “야생형(wild-type)”은 자연에서 발견되는 형태를 지칭한다. 예를 들어, 천연, 비변형, 또는 야생형 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열, RNA 레플리콘 또는 단백질은 자연 출처에 존재하고 이로부터 단리된 것일 수 있으며, 인간 조작에 의해 의도적으로 변형되지 않은 것이다. 이하에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 명세서의 몇몇 구현예에 따른 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 RNA 레플리콘은 변형된 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 RNA 레플리콘이며, 따라서 이들은 비천연 RNA 레플리콘이다.
용어 “프라임” 및 “부스트”는 기술분야에서의 그들의 일반적인 의미를 가지는 것으로 의도된다. “프라이밍”은 동일 항원 또는 유사 항원에 대한 후속적 노출(들) 시에회상(recall)될 수 있는 항원에 대하여 대상체의 면역을 유도하기 위하여 대상체를 제1 항원성 조성물로 면역화하는 것을 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍은 동일 항원성 조성물 또는 관련 항원성 조성물(예컨대, 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 가지는 항원을 포함하는 조성물)로의 후속적 면역화(“부스팅”) 시 단일 항원성 조성물, 예컨대 프라이밍 조성물 단독 또는 부스팅 조성물 단독으로의 면역화에 의하여 얻어지는 면역 반응 수준에 비하여 보다 높은 수준의 항원에 대한 면역 반응을 유도한다. “부스터 용량”은 선행(프라임) 용량 후 항원성 조성물(예컨대, 백신)의 투여를 지칭한다. 대상체에 초기 면역화(예컨대, 프라이밍 조성물의 투여) 후, 몇몇 구현예에서, 부스터 용량은 동일 대상체에 동일 면역원적 항원 또는 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 가지는 항원에 대한 재노출을 위하여 프라이밍 조성물에서 사용된 항원으로 1회 이상 투여될 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 “RNA 레플리콘” 및 “레플리콘 RNA”는 허용성 세포 내에서 스스로의 증폭 또는 자가 복제를 지시하기 위하여 요구되는 모든 유전적 정보를 포함하는 RNA를 지칭한다. 스스로의 복제를 지시하기 위하여, RNA 분자는 1) RNA 증폭 과정을 촉매하기 위하여 폴리머라제, 레플리카제, 또는 바이러스 또는 숙주 세포 유래 단백질, 핵산 또는 리보핵산단백질과 상호작용할 수 있는 다른 단백질을 인코딩하고; 2) 서브게놈 레플리콘-인코딩된 RNA의 복제 및 전사를 위해 요구되는 시스-액팅(cis-acting) RNA 서열을 포함한다. 이들 서열은 복제 과정 중에 이들의 자가-인코딩된 단백질, 또는 비-자가-인코딩된 세포 유래 단백질, 핵산 또는 리보핵산 단백질, 또는 이들 구성요소 간의 임의의 복합체에 결합될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 변형된 RNA 레플리콘 분자는 전형적으로 이하의 순서화된 요소를 포함한다: 복제를 위해 시스로(in cis) 요구되는 5' 바이러스 RNA 서열, 생물학적 활성 비구조 단백질을 코딩하는 서열, 서브게놈 RNA를 위한 프로모터, 복제를 위해 시스로(in cis) 요구되는 3' 바이러스 RNA 서열, 및 폴리아데닐화 구역. 또한, RNA 레플리콘은 양성 극성, 또는 “메시지” 센스 분자일 수 있고, RNA 레플리콘은 임의의 알려진 천연 RNA 바이러스와 상이한 길이일 수 있다. 본 개시의 몇몇 구현예에서, RNA 레플리콘은 야생형 바이러스 게놈에 존재하는 구조 바이러스 단백질의 적어도 하나의 서열이 결여 또는 기능적으로 결여될 수 있다. 기능적으로 결여된다는 것은 구조 바이러스 단백질이 그 통상적 및 자연적 기능을 수행할 수 있도록 허용하는 양 또는 형태로 존재하지 않는 것을 의미한다. 많은 구현예에서, 구조 유전자를 인코딩하는 서열은 하나 이상의 이종성 서열, 예컨대, 관심 유전자(gene of interest, GOI)를 인코딩하는 서열로 치환될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 GOI는, 예컨대, 항원 또는 대상체 환자에 대한 항원결정인자(예컨대 본 명세서에 기술된 항원), 항체, 또는 항체의 단편인 폴리펩티드를 인코딩하는 서열일 수 있다. RNA 레플리콘이 재조합 알파바이러스 입자 내로 패키징되는 예에서, 입자 형성을 야기하는 알파바이러스 구조 단백질과 상호작용을 개시하는 데에 작용하는, 하나 이상의 서열, 소위 패키징 신호를 포함해야 한다. 본 발명의 RNA 레플리콘은 자가 증폭할 수 있는 능력을 가지며 숙주 세포 또는 동물 세포 내에서 자가 증폭할 수 있다. 다양한 구현예에서, RNA 레플리콘은 크기가 적어도 1 kb 또는 적어도 2kb 또는 적어도 3 kb 또는 적어도 4 kb 또는 적어도 5 kb 또는 적어도 6 kb 또는 적어도 7 kb 또는 적어도 8 kb 또는 적어도 10 kb 또는 적어도 12 kb 또는 적어도 15 kb 또는 적어도 17 kb 또는 적어도 19 kb 또는 적어도 20 kb 일 수 있고, 또는 크기가 100 bp-8 kb 또는 500 bp-8 kb 또는 500 bp-7 kb 또는 1-7 kb 또는 1-8 kb 또는 2-15 kb 또는 2-20 kb 또는 5-15 kb 또는 5-20 kb 또는 7-15 kb 또는 7-18 kb 또는 7-20 kb 일 수 있다. 분자(예컨대, 핵산, 폴리펩티드, 또는 항체 분자)의 “단편”은 적어도 10 또는 적어도 20 또는 적어도 30 또는 적어도 50 또는 적어도 75 또는 적어도 100 또는 적어도 200 또는 적어도 300 또는 적어도 500 또는 적어도 1 kb 또는 적어도 2 kb 또는 적어도 3 kb 또는 적어도 5 kb 의, 핵산을 위해서는 뉴클레오티드, 폴리펩티드를 위해서는 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 또한 특정 결합 분자의 결합 도메인일 수 있다. 몇몇 구현예에서, RNA 레플리콘은 그 핵산을 숙주 세포 내로 전달하기 위해 바이러스 단백질(예컨대, 바이러스 벡터 상에 인코딩되는 캡시드 단백질)을 사용하는, 바이러스 벡터가 아니다. 본 발명의 RNA 레플리콘은 캡시드 또는 바이러스 입자를 결여, 기능적으로 결여 또는 가질 수 없거나, 캡시드 내로 봉입되거나 바이러스 입자에 포함될 수 없다.
본 발명의 RNA 레플리콘은 천연 또는 야생형 바이러스(예컨대, 본 명세서에 기술된 RNA 바이러스 또는 레트로바이러스)로부터 유래할 수 있으며, 야생형 바이러스 게놈으로부터 변형된 레플리콘 임을 의미한다. 본 발명의 RNA 레플리콘은 야생형 바이러스 게놈에 존재하지 않는 서열, 예를 들어 하나 이상의 이종성 서열(예컨대, 하나 이상의 관심 유전자) 및/또는 다른 서열 또는 본 명세서에 기술된 변형을 포함할 수 있다. RNA 레플리콘은 또한 야생형 게놈으로부터 결실 또는 기능적으로 결실된 하나 이상의 서열(예컨대, 바이러스 구조 단백질)을 가질 수 있다. 서열은 그 통상적 및 자연적 기능을 수행할 수 있도록 하는 양 또는 형태로 존재하지 않을 때 기능적으로 결실된다. 예를 들어, 서열은 완전히 또는 실질적으로 결실되거나 단축되어 그 통상적 및 자연적 기능을 수행할 수 없게 될 수 있다. 상이한 구현예에서, 본 발명의 RNA 레플리콘은 야생형 게놈의 서열과 적어도 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 80-99% 또는 90-95% 또는 90-99% 또는 95-99% 또는 97-99% 또는 98-99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서 서열 동일성 퍼센트는 레플리콘 상에 존재할 수 있는 하나 이상의 이종성 서열(예컨대 관심 유전자)를 계수하지 않고, 및/또는 야생형 게놈에 자연적으로 존재할 하나 이상의 서열(예컨대, 하나 이상의 구조 유전자)의 결실을 계수하지 않고 계산될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 RNA 레플리콘은 조작, 합성, 또는 재조합 RNA 레플리콘이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 재조합은 임의의 분자(예컨대, DNA, RNA 등)으로서, 폴리뉴클레오티드의 인간 조작으로부터의, 또는 그로부터 간접적으로 초래된 것을 의미한다. 비제한적 예시로서, cDNA는 시험관내(in vitro) 폴리머라제 반응에 의해 생성되거나, 링커가 부착되거나 벡터, 예컨대 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 내로 삽입된 임의의 핵산 분자인 재조합 DNA 분자이다. 비제한 예시로서, 재조합 RNA 레플리콘은 이하 중 하나 이상일 수 있다: 1) 예컨대, 화학 또는 촉매 기술(예컨대, 화학적 핵산 합성을 사용하여, 또는 복제, 중합, 엑소뉴클레오리틱 분해(exonucleolytic digestion), 엔도뉴클레오리틱 분해(endonucleolytic digestion), 라이게이션(ligation), 역전사, 전사, 염기 변형(예컨대 메틸화를 포함), 또는 핵산 분자의 재조합(동종성 및 위치 특이적 재조합)을 이용하여 시험관내(in vitro) 합성 또는 변형되거나; 2)자연에서 결합되지 않는 뉴클레오티드 서열이 결합(conjoin)되거나; 3) 분자 클로닝 기술을 사용하여 천연 뉴클레오티드 서열에 관하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실되게 조작되거나; 및 4) 천연 뉴클레오티드 서열에 관하여 하나 이상의 변경 또는 재배치를 가지도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단백질의 “변이체”는 적어도 하나의 변형된, 예컨대, 각각 결실된, 삽입된 또는 교체된, 아미노산을 갖는 것을 제외하고는 기준(reference) 단백질과 동일 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 아미노산 교체는, 바람직하게는 단백질의 비본질적 아미노산 잔기에서의, 보존적 아미노산 치환일 수 있다. “보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 기술분야에 알려져 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산 및 글루타믹산), 비하전 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 및 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판), 베타-분지 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 및 이소류신) 및방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)를 가지는 아미노산을 포함한다. 단백질의 변이체는 단백질의 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%, 바람직하게 적어도 약 90%, 보다 바람직하게 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게, 변이체는 단백질과 동일 기능을 보유하는 기능적 변이체이다.
또한 본 개시의 관심대상은 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이제이다. 이러한 변이체는 동일 또는 상이한 종으로부터의 동종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 천연일 수 있으며, 또는 비천연 변이체, 예컨대 화학적 합성 방법을 사용하여 합성되거나 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 서열에 관하여, 유전자 코드의 축퇴성이 유전자로부터 생산되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 유전자의 단백질 인코딩 서열의 적어도 하나의 염기를 상이한 염기로 치환할 수 있는 가능성을 제공한다. 따라서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 또한 유전자 코드의 축퇴성에 따른 치환에 의해 본 명세서에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 변경된 임의의 염기 서열을 가질 수 있다. 코돈 사용을 설명하는 참고자료는 쉽게 공개적으로 사용 가능하다. 추가적 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 다양한 이유로, 예컨대 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 생산될 수 있다(예컨대, 바이러스 mRNA의 코돈을 포유류 또는 어종과 같은 다른 유기체에 의해 선호되는 코돈으로 변경).
당업자에게 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 예를 들어 서면 설명을 제공하는 것과 관련하여, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 모든 가능한 하위 범위 및 그의 하위 범위의 조합을 포함한다. 나열된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3 분의 1, 4 분의 1, 5 분의 1, 10 분의 1 등으로 분류할 수 있도록 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식 될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 본 명세서에서 논의된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 분류 될 수 있다. 또한, 당업자에게 이해되는 바와 같이 "최대", "적어도", "이상(greater than)", "이하(less than)" 등과 같은 모든 용어는 인용된 숫자를 포함하고 상기에서 논의한 바와 같이 후속적으로 하위 범위로 나눌 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 당업자에게 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3 개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2 또는 3 개의 물품을 갖는 그룹을 의미한다. 유사하게, 1-5 개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 물품 등을 갖는 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기술된 방법 또는 과정의 몇몇 구현예에서, 단계는 시간적 또는 작동적 순서가 명시적으로 언급되는 경우를 제외하고는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 더욱이, 몇몇 구현예에서, 명시적인 청구 언어가 개별적으로 수행된다고 언급하지 않는 한, 명시된 단계는 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, X를 수행하는 청구된 단계 및 Y를 수행하는 청구된 단계는 단일 작업으로 동시에 수행될 수 있으며, 초래되는 과정은 청구된 가정의 문언적 범위 내에 속할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 “포함하는(comprising)”은"포함하는(including)", "포함하는(containing)", 또는 “특징으로 하는(characterized by)”과 동의어이고, 포괄적이거나 개방형(open-ended)이고, 추가적인, 언급되지 않은 요소들 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는, “∼로 구성된(consisting of)”은 청구항 조성물 또는 방법에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용되는, “본질적으로 구성된(consisting essentially of)”은 청구항 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 예를 들어 조성물의 구성요소의 설명 또는 방법의 단계의 설명에서 본 명세서의 용어 “포함하는(comprising)”의 임의의 언급은 언급된 구성요소 또는 단계로 본질적으로 구성되고 구성된 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
예컨대 (a), (b), (c) 등의 표목은 명세서 및 청구항을 쉽게 읽을 수 있도록 제시된 것이며, 본 명세서 또는 그 대안의 범위를 어떤 방식으로든 제한하지 않는다. 명세서 또는 청구항에서 표목의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳순 또는 숫자 순 또는 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.
이종성 프라임-부스트 면역화 방법
치료 또는 질환 예방을 위한 다중 접종이 단일 접종보다 더 효과적인 것으로 보고된 바 있다. 일반적으로 백신접종 후 다수의 항원 특이적 기억 CD8 T 세포를 생성하는 것이 다양한 동물 및 인간 질환에 대한 백신 설계에 바람직한 목표라고 여겨지는데 이는 이 수가 숙주 면역 및 보호와 밀접한 관련이 있기 때문이다. 이러한 많은 수의 세포를 생성하는 한 가지 접근법은 1차 기억 형성 후 항원 특이적 면역 세포의 재자극에 의존하는 프라임-부스트 면역화 과정을 사용하는 것이다. 이러한 과정에서, 먼저 대상체에게 투여되는 "프라이밍" 조성물 및 후속 적으로 1회 이상 투여되는 "부스팅"조성물이 있다. 특정 이론에 구속되지 않으나, 백신에 의한 면역 반응의 부스팅은 감염 시점의 병원체에 대한 보호를 매개하기 위하여 필요한 다수의 이펙터 세포를 생성하는 것으로 널리 알려져 있다.
백신의 초기 개발 이래로 동일 면역화 제제의 재투여를 이용하는 동종성 프라임-부스트 면역화가 사용되어 왔다. 고전적인 백신접종 접근법은 동종성 프라임-부스트 요법에 의존했으며 전통적으로 보다 어려운 질환에 대처하기에 충분히 강력한 면역 반응을 도출할 수 없었다. 예를 들어, 이 방법은 일반적으로 항원에 대한 체액 반응을 부스팅시키는 데 효과적이지만, 일반적으로 프라임 된 면역 시스템에 의한 동종성 부스팅 제제의 신속한 제거로 인해 증가된 수의 CD8 T 세포를 생성하는 데 훨씬 덜 효과적이며 세포 면역(CMI)을 강화하지 못하는 것으로 간주되어 왔다.
다른 한편으로, 이종성 프라임-부스트 면역화 또는 두 다른 양식을 사용한동일 면역원의 투여는 것은 근래 대상체에서 보다 우수한 면역 반응을 이끌어 내기위한 전략으로 개발되었다. 특히, 이종성 프라임-부스트와 같은 새로운 백신 양식은 말라리아, 결핵(TB), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 에볼라와 같은 복잡한 병원체에 대하여 성공적으로 이용되었다. 이종성 프라임-부스트 면역화에 의해 초래되는 보다 우수한 기억 반응에는 더 높은 규모의 CD8 + T 세포 반응, 면역 시스템에 의해 인식되는 T 세포 에피토프의 확장 및 T 세포의 다기능성 증가가 비제한적으로 포함된다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 프라임-부스트 방법은 처리된 대상체에서 IFN-γ-분비 CD8 + T 세포의 현저한 증가를 초래한다. 다양한 구현예에서, 현저한 증가는 단일 용량 투여대비 또는 동종성 프라임-부스트 요법 대비 적어도 25 % 또는 적어도 50 % 또는 적어도 100 % 또는 적어도 150 % 또는 적어도 200 %또는 적어도 250 % 또는 적어도 300 %의 증가 일 수 있다. 또한, 이종성 프라임 부스트 접근법은 특히 벡터 기반 백신 후보를 사용할 때, 프라이밍 후 생성되는 항 벡터 면역에 의한 간섭을 최소화시키므로 CMI를 효과적으로 부스트시키는 것으로 보고되었다. 이펙터 세포를 정량적으로 증진시키는 것 외에도 부스팅 후에 2차 기억 세포의 질적 차이도 볼 수 있다. 2차 기억 CD8 T 세포는, 1차 기억 세포와 반대로, 말초 조직으로 훨씬 더 효율적으로 이동하며 진입 부위에서 병원체의 효과적인 대응을 촉진하는 증진된 세포 분해(cytolysis)를 나타낸다. 또한, 이종성 프라임-부스트 전략은 면역 반응의 시너지적 증진을 초래하여 항원 특이적 T 세포의 수를 증가시키고, 고결합성 T 세포의 선택적 농축 및 면역 반응의 폭과 깊이를 증가시킬 수 있다. 예로써, 도 1은 면역 기억 반응의 규모, 길이 및 품질을 모두 향상시킬 수 있다는 점에서 이종성 프라임-부스트 요법의 이점을 개략적으로 도시한다(도면은 Nolz JC 및 Harty JT, Adv. Exp. Med. Biol., 2011로부터 개작). 이 예시에서, 부스터 백신접종은 증가된 수의 기억 CD8 T 세포를 생성시키는 데 사용된다. 항원 특이적 CD8 T 세포의 총 수에 의해 결정되는 전통적인 프라임-부스트 요법 또는 이종성 프라임-부스트 요법에 대한 면역 반응의 크기는 시간에 따라 플로팅 된다. 일차 백신 챌린지 후, CD8 T 세포는 확장, 수축을 거쳐 일차 기억 개체군을 형성한다. CD8 T 세포의 이 1차 기억 개체군이 동일한 백신접종(동종성 부스트, 파선)의 2차 챌린지에 노출되면, 더 큰 2차 기억 개체군의 또 다른 확장, 수축 및 형성 라운드가 발생한다. 동종성 부스터 백신접종과는 대조적으로, 상이한 벡터 (이종성 부스트, 실선)의 맥락에서 전달된 CD8 T 세포 항원의 투여는 1차 기억 CD8 T 세포의 더 큰 확장을 유도하며, 동종성 추가 백신접종에서 볼 수 있는 것 보다 더 큰 2차 기억 개체군을 초래한다.
이종성 프라임-부스트가 특정 세팅에서 반응을 증가시키는 것으로 보고되었지만, 모든 조합이 어느 조합이 효과적인지를 결정하는 중요성을 보여주는 향상된 면역성을 나타내지는 않는다. 광범위하고, 내구적(durable)이고, 장기 지속적 면역성을 도출하는 백신 조합을 찾는 것은 강력한 보호를 제공에 중요하다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스, VEE 바이러스 및 셈리키숲(Semliki-forest) 바이러스와 같은 알파 바이러스 유래 레플리콘은 모두 단백질, DNA 및 비로좀과 조합되어 이종성 프라임-부스트 세팅에 이용되어 왔다. 이들은 인간 유두종 바이러스(HPV) 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대한 마우스와 같은 소동물 모델뿐만 아니라 뎅기(Dengue)에 대한 입자 형태로 전달되는 레플리콘이 있는 NHP에서 효과적인 것으로 입증되다. 더욱이, 완전 합성 알파 바이러스 유래 레플리콘은 동종성 프라임-부스트 요법에서 광범위하게 사용되어 왔다. 종래, 널리 이용된 유일한 완전 합성 레플리콘 시스템은 알파 바이러스패밀리의 바이러스로부터 유래되었으며, 여기서 비구조 단백질은 보유되고 구조 단백질은 관심 유전자로 대체되었다. 그러나 최근 새로운 레플리콘 조작의 발전은 새로운 유형의 레플리콘 생산을 초래하였으며 합성 레플리콘만을 사용하는 새로운 백신 양식을 발견할 수 있게 되었다.
유사하게, 단백질의 치료적 투여에 대한 고전적인 접근법은 전통적으로 요망하는 임상 효과를 갖기에 충분히 높은 용량의 단백질의 외인성 주입에 의존 해왔다. 보다 최근에, 숙주 세포에 서열을 전달하여 원하는 관심 단백질을 발현시키는 데에 핵산 또는 바이러스 기반 벡터가 사용되어 왔다. 그러나, mRNA와 같은 엄격하게 핵산 기반의 전달 방법은 상대적으로 비면역원성이지만 단백질의 내구적이고 지속적인 발현을 가지지 않았다. 대조적으로, 바이러스 유래 방법은 보다 내구적이고 지속적인 단백질 발현이 가능하지만, 또한 본질적으로 면역원성이다. 이것은 단백질을 생산하는 세포에 대한 면역 반응을 초래할 수 있으며, 때로는 단백질 자체가 항-약물 항체 형태이다. 바이러스 기반 단백질 전달 방법은 비용이 많이 들고 제조가 더 복잡한 경향이 있어, 이 기술을 이용할 수 있는 범위를 제한한다. 이러한 이유로, 면역학적으로 상이한 면역 시스템 활성화 기전을 갖는 레플리콘을 사용하면 치료적 단백질의보다 지속적인 발현을 허용하는 증가된 또는 보다 다양한 수의 반복적 주입(injection)이 허용될 수 있다. 이 접근법은 또한 생산되는 치료적 단백질의 수준을 감소시키는 항-약물 항체의 형성을 제한하는 데 도움이 될 것으로 예상된다.
일 양태에서, 본 개시의 다양한 구현예는 일반적으로, 예를 들어 백신접종 및/또는 면역화 적용과 같은 치료적 및/또는 예방적 적용을 위해 2개의 RNA 레플리콘을 대상체에 전달하는 방법에 관한다. 일 양태에서, 본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체에 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 포함하는 프라이밍 조성물의 적어도 1 용량을 투여하는 단계; 및 후속적으로 대상체에 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 포함하는 부스팅 조성물의 적어도 1 용량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이하다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원의 아미노산 서열은 서로 동종성이다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 RNA 레플리콘 및 제2 RNA 레플리콘은 상이한 속(genus)의 RNA 바이러스의 게놈으로부터 유래된다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 하나 이상의 교차 반응성 항원결정인자를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 대상체에서 실질적으로 동일한 면역 반응을 유도한다.
몇몇 구현예에서, 상기 프라이밍 조성물은 단일 용량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 상기프라이밍 조성물은 다중 용량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 단일 용량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 부스팅 조성물은 대상체에 다중 용량으로 투여된다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 10 연속 투여량 또는 이들 사이의 임의의 수의 투여량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 또는 적어도 20 연속 투여량 또는 이들 사이의 임의의 수의 투여량으로 대상체에 투여된다. 특정 이론에 구속되지 않으나, 일반적으로 프라이밍 시 보다 높은 항원 용량은 일반적으로 이펙터 세포의 유도에 유리한 반면, 낮은 용량은 우선적으로 면역 기억의 유도를 추진할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 더 높은 용량의 프라이밍 조성물은 즉각적인 반응에 바람직하지만, 기억 세포의 발달에 영향을 미치고 고용량의 효과를 역으로 방해할 수 있다. 프라임 용량과 반대로, 보다 높은 용량의 부스트 조성물은 항원의 더 큰 가용성이 더 많은 수의 기억 B 세포가 분화되도록 추진하여 반응을 증폭시킬 수 있기 때문에, 더 큰 규모의 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중 범위의 다중 투여량으로 대상체에 투여 될 수 있다. 이 용량 범위는 25g 마우스에 대해 제제화된 상태의 RNA 레플리콘 약 0.025 μg 내지 50 μg에 해당한다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물의 바람직한 용량은 제제화된 상태의 1 ㎍ 이하의 RNA 레플리콘을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물의 바람직한 용량은 제형화 된 상태(예컨대, 식염수 내의 네이키드 RNA)에서 약 100 μg, 약 200 μg, 약 300 μg, 약 400 μg, 약 500 μg, 약 600 μg, 약 700 μg의 RNA 레플리콘을 포함한다. 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 하나 또는 둘 모두는 네이키드 RNA(예컨대, 식염수 내)로 투여 될 수 있거나 또는 둘 중 하나 또는 둘 모두가 나노 입자에 포함되어 투여 될 수 있다; 또는 하나는 네이키드 RNA로 투여되고 다른 하나는 나노 입자로 투여 될 수 있다. 소동물 모델이 수반되는 일부 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 약 0.01μg 내지 약 30μg범위의 하나 이상의 투여량으로 대상체에 투여될 수 있다. 대 동물 모델 및 인간이 관련된 일부 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 약 0.1 μg 내지 약 100 μg 범위의 하나 이상의 투여량으로 대상체에 투여될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 소동물 모델에 적합한 용량은 약 5x10-5 μg/100mg 내지 약 0.15 μg/100mg 범위이다. 이 용량 범위는 20g 마우스에 대해 약 0.01 μg 내지 약 30 μg과 동등하다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 20g 마우스에 대해 1 용량 당 약 15 μg 의 다중 투여량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어 인간과 같은 대동물 모델의 경우, 적합한 투여량은 약 1.25x10-7 μg/100mg 내지 1.25x10-4 μg/100mg 범위이다. 이 용량 범위는 80kg 숙주에 대해 약 0.1μg 내지 약 100μg용량과 동등하다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 제형화 된 상태에서 전신 용량 당 RNA 약 0.001 μg, 약 0.01 μg, 약 0.1 μg, 약 1 μg, 약 10 μg, 약 100 μg, 약 200 μg, 약 300 μg의 다중 투여량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 전신 투여량당 약 50 μg RNA의 다중 투여량으로 대상체에 투여된다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 경시적으로 점진적으로 증가하는 투여량으로 투여된다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및/또는 부스팅 조성물은 경시적으로 점진적으로 감소하는 투여량으로 투여된다.
본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 구현예에서, 면역화 일정이 중요할 수 있다. 예를 들어, 지연된 부스팅은 프라임에 의해 유도된 1차 응답의 경합을 피하는 데 도움이 될 것이다. 근접하게 간격을 둔(예컨대, 1-2 주) 백신 용량은 면역 반응의 신속한 유도를 야기할 수 있지만, 몇몇 구현예에서, 동일한 수의 백신 용량을 보다 긴 간격으로(예컨대, 1-2 개월) 투여했을 때보다 반응이 덜 지속적일 수 있다. 1-2주의 최소 간격은 또한 기억 B 세포의 최적 친화성 성숙을 보장 할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물의 적어도 1 용량은 약 1주, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 1-2 주 또는 2-4 주 또는 3-4 주의 간격으로 대상체에 투여된다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물의 적어도 1 용량은 약 4주의 간격으로 대상체에게 투여된다. 당업자는 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여량 요법이 개별적인 필요 및 조성물의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조정될 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 및/또는 실험실 값과 같은 투여되는 조성물의 임상 효과에 기반하여 조정될 수 있다. 최적의 원하는 효과를 제공하기 위해 투여량 요법을 조정할 수 있다. 예를 들어, 상기에서 논의된 바와 같이, 단일 용량이 투여될 수 있고, 여러 분할 용량이 경시적으로 투여 될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 권고되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물의 투여를 위한 적절한 투여량 및 요법을 결정하는 것은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 개시된 교시가 제공되면 숙련된 기술자에게 포괄되는 것으로 이해될 것이다.
따라서, 당업자는 본 명세서에 제공된 개시 내용에 기초하여, 용량 및 투약 요법이 치료 분야에 잘 알려진 방법에 따라 조정된다는 것을 인식할 것이다. 즉, 최대 관용 용량이 쉽게 설정될 수 있고, 환자에게 검출 가능한 치료적 이점을 제공하기 위해 각 제제를 투여하기 위한 시간적 요건과 같이, 대상에게 검출 가능한 치료적 이점을 제공하는 유효량도 결정될 수 있다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법이 본 명세서에 예시되어 있지만, 이들 예시는 본 개시를 실시함에 있어 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 결코 제한하지 않는다.
본 명세서에 개시된 프라이밍 및 부스팅 조성물의 투여는 작용 부위에 조성물을 전달할 수 있는 임의의 방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 방법은 경구 경로, 십이지장 내 경로, 비경구 주사(정맥 내, 피하, 근육 내, 혈관 내 또는 주입을 포함), 국소 투여 및 직장 투여를 포함한다. 주입은 드립(drip), 연속 주입, 주입 펌프, 계량 펌프, 데포 제제(depot formulation) 또는 다른 적절한 수단으로 투여할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물의 적어도 1 용량은 대상체에 근육 내 투여된다. 몇몇 구현예에서, 부스팅 조성물의 적어도 1 용량은 대상체에 근육 내 투여된다.
몇몇 구현예에서, 부스팅 조성물의 적어도 1 용량은 적어도 하나의 교차 반응성 에피토프를 포함하는 상이한 유형의 항원을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 이종성 프라임-부스트 면역화 방법은 다중 투여 중 적어도 하나가 프라이밍 조성물에 사용된 것과 상이한 RNA 레플리콘을 포함하는 한, 동일 또는 상이한 용량으로, 다중 부스팅 조성물 중 하나가 프라이밍 조성물에 사용된 것과 동일한 RNA 레플리콘을 포함하는 결국 "동종성 부스트"를 포함하는 면역화 요법을 포함하는 것을 의도한다.
몇몇 구현예에서, 상기 프라이밍 조성물 내의 제1 항원은 부스팅 조성물 내의 제2 항원과 동일할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 동일 아미노산 서열을 가진다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열의 일부(예컨대, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)이다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 서로 동종성(예컨대 실질적으로 동일)인 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 2 이상의 중합성 분자, 예컨대 폴리펩티드의 아미노산 서열의 맥락에서 사용되는 용어 “동일” 또는 “퍼센트 동일성”은 중합성 분자 간의 서열 유사성을 지칭한다. 그들의 서열 간 부분적 또는 완전 동일성이 있다면 두 아미노산 서열은 동종성(예컨대, 실질적 동일)이다. 예를 들어, 80% 동일은 두 서열이 최대 매칭을 위해 정렬된 경우 80%의 아미노산이 동일하다는 것을 의미한다. 이와 같이, 용어 “실질적으로 동일”은 제1 및 제2 아미노산 서열이 면역학적 항원결정인자(예컨대, 에피토프)와 같은 공통 도메인을 가지도록 충분한 또는 최소한의 수의 제2 아미노산 서열에 동일 또는 동등한(예컨대, 유사한 측쇄를 가지는) 아미노산을 포함하는 제1 아미노산을 지칭한다. 예를 들어, 상기 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 중 어느 두 값 사이의 범위의 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 80% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 90% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 99% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열에 적어도 100% 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열과 동일하다.
본 명세서에서, 2 이상의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용되는 용어 “동일” 또는 퍼센트 “동일성”은, 비교창에서 최대 대응을 위하여 대비 및 정렬되었을 때, 동일하거나, 특정 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2 이상의 서열 또는 아서열을 지칭한다. 달리 특정하지 않는 한, 선택된 서열 예컨대 “SEQ ID NO: X”을 위한 비교창은 총장의 SEQ ID NO: X, 그리고, 예컨대, “SEQ ID NO: X의 100 bp”를 위한 비교창은 명시된 100 bp이다. 아미노산 또는 핵산 서열의 동일성 정도는 지정된 프로그램 파라미터에 기반하여 비교될 서열들을 정렬하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열은 Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482-89, 1981의 국소 동종성 알고리즘, Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48:443-53, 1970의 동종성 정렬 알고리즘, 또는 Pearson & Lipman Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444-48의 유사도 검색 방법을 이용하여 정렬 및 비교될 수 있으며, 육안 검사를 기반으로 정렬 및 비교될 수 있으며, 또는 분석을 위한 컴퓨터 프로그램(예컨대, GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)를 사용할 수 있다.
퍼센트 서열 동일성의 계산에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사도의 통계적 분석을 수행할 수 있다(예컨대, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993 참고). 최소 합계 확률(P(N))은 우연히 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 테스트 핵산을 기준 핵산에 대하여 대비할 때 최소 합계 확률이 약 0.1 이하, 바람직하게, 약 0.01 이하, 그리고 보다 바람직하게 약 0.001 이하이면 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원은 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 포함한다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 “에피토프" 또는 “항원결정인자”는 B 세포(예컨대, B 림프구) 및 B 세포에 의해 분비되는 항체에 의하여 인식되는 1차, 2차, 3차 또는 4차 구조의 항원성 분자(예컨대, 폴리펩티드)를 지칭한다. 에피토프는 선형 또는 입체형태적(conformational)일 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 고유의 공간적 입체구조 내에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 연속 또는 비연속 아미노산을 포함한다. 용어 "에피토프" 및 "항원결정인자"는 단지 몇 개의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단순 에피토프뿐만 아니라 불연속 아미노산 잔기를 포함하는 복합 에피토프를 포괄한다. 일부 경우에, 복합 에피토프는 1차 서열에서 분리되지만 항원의 3차원 접힌 구조에서 매우 근접한 아미노산 잔기를 포함한다. 용어 "교차 반응성 항원결정인자" "또는 교차 반응성 에피토프"는 2개 이상의 항원 분자(예컨대, 폴리펩티드) 상에 존재하는 항원 결정기의 동일 항체에 의해 결합되는 능력을 지칭한다. 또한, 동일 항체에 결합 될 수 있는 항원결정인자를 포함하는 2개 이상의 분자는 예를 들어 동일한 분자 또는 이의 단편, 서로의 변이체, 또는 상이한 분자 일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 동일 항체에 결합될 수 있는 항원결정인자를 포함하는 폴리펩티드와 관련하여, 폴리펩티드는 동일하거나 상이한 1차 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 폴리펩티드 각각은 동일 항체에 의하여 결합될 수 있는 항원결정인자(예컨대, "교차 반응성")를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원은 대상체에서 실질적으로 동일한 면역 반응을 유도한다. 몇몇 구현예에서, 용어 "실질적으로 동일한 면역 반응"은 예를 들어, 제1 항원에 대해 유도된 항체의 농도가 동일한 조건에서 시험 된 제2 항원에 대해 유도된 항체 농도와거의 동일하거나, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 적어도 약 90 %, 또는 적어도 약 95 %, 또는 적어도 약 99 %인 경우를 지칭 할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원은 대상체에서 동일한 면역 반응을 유도하고, 예컨대, 제1 항원에 대해 유도된 항체의 농도는 동일한 조건 하에서 시험된 제2 항원에 대해 유도된 항체의 농도와 동일하다.
몇몇 구현예에서, 용어 "실질적으로 동일한 면역 반응"은 예를 들어, 제1 항원에 대해 유도된 항체 프로파일의 유형이 동일한 조건에서 시험된 제2 항원에 대해 유도된 항체 프로파일의 유형과 거의 동일하거나, 적어도 약 75 %, 또는 적어도 약 80 %, 또는 적어도 약 90 %, 또는 적어도 약 95 %, 또는 적어도 약 99 % 동일한 것을 지칭할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원은 대상체에서 동일한 면역 반응을 유도하고, 예를 들어, 제1 항원에 대해 유도된 항체 프로파일의 유형은 동일한 조건하에서 시험된 제2 항원에 대해 유도된 항체 프로파일의 유형과 동일하다.
본 명세서에서 개시된 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은, 예컨대, 대상체 환자의 면역 시스템을 상이하게 관여 또는 활성화시키는, 상이한 면역학적 기전을 통해 대상체의 면역 시스템을 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 제2 RNA 레플리콘이 대상체에서 면역 시스템을 활성화시킬 수 있는 하나 이상, 또는 임의의 면역학적 기전과 상이한 면역학적 기전을 통하여 대상체의 면역 시스템을 활성화시킬 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 각각은 독립적으로 1, 2, 3, 또는 그 이상의 면역학적 기전을 통하여 대상체의 면역 시스템을 활성화시킬 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 1, 2, 3, 또는 그 이상의 공통 면역학적 기전을 통하여 면역 시스템을 활성화 시킬 수 있으나; 제1 RNA 레플리콘에 의하여 이용되는 적어도 하나의 면역학적 기전은 제2 RNA 레플리콘에 의하여 이용되는 면역학적 기전 각각과 상이하다. 이를 통하여 제1 및/또는 제2 레플리콘이 면역 시스템을 활성화 시킬 수 있는 비제한적 면역학적 기전의 비제한적 예시는 (1) 별개의 또는 관련된 레플리콘의 비구조 단백질에 의해 인코딩되는 숙주 세포 면역 회피의 상이한 활성 기전; (2) 레플리콘 스스로를 인식하기 위한 숙주 세포 면역성을 위한 상이한 수동 기전; 및 (3) 제1 및 제2 주입 동안 면역 시스템을 상이하게 관여시키거나 활성화시키는 기능을 하는 면역 조절 단백질의 공동 인코딩; 을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 2 이상의 면역학적 기전 중 적어도 하나는 단백질 키나아제 R(protein kinase R, PKR), 레티노산 유도성 유전자 I(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I), 오토파지 경로(autophagy pathways), 톨 유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs), 스트레스 과립(stress granules), RNase R, 및 올리고아데닐레이트 합성효소(oligoadenylate synthetases, OAS)의 차등 활성화로 이루어진 군에서 선택된다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 변형된 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 양성 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 토가바이러스(Togaviridae) 과, 플라비바이러스(Flaviviridae) 과, 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 과, 랍도바이러스(Rhabdoviridae) 과, 아테로바이러스(Arteroviridae) 과, 피코르나바이러스(Picornaviridae) 과, 아스트로바이러스(Astroviridae) 과, 코로나바이러스(Coronaviridae) 과, 및파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 과로 이루어진 군에서 선택되는 과(family)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 음성 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 적합한 음성 가닥 RNA 바이러스 종은 비제한적으로 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae), 랍도바이러스(Rhabdoviridae), 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae)의 과(family)의 바이러스 종을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 인플루엔자 바이러스 A(Influenza virus A), 인플루엔자 바이러스 B(Influenza virus B), 인플루엔자 바이러스 C(Influenza virus C), 인플루엔자 바이러스 D(Influenza virus D), 이자바이러스(Isavirus), 토고토바이러스(Thogotovirus) 및 쿼런자바이러스(Quaranjavirus)로 이루어진 군에서 선택되는 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 인플루엔자 바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 인플루엔자 바이러스 A로부터 유래한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 랍도바이러스(Rhabdoviridae) 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는큐리오바이러스(Curiovirus), 사이토랍도바이러스(Cytorhabdovirus), 디코라바이러스(Dichorhavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 하파바이러스(Hapavirus), 레단테바이러스(Ledantevirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 노버랍도바이러스(Novirhabdovirus), 뉴클레오랍도바이러스(Nucleorhabdovirus), 퍼랍도바이러스(Perhabdovirus), 시그마바이러스(Sigmavirus), 스프리비바이러스(Sprivivirus), 스리푸바이러스(Sripuvirus), 티브로바이러스(Tibrovirus), 투파바이러스(Tupavirus), 바리코사바이러스(Varicosavirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus)로 이루어진 군에서 선택되는 랍도바이러스(Rhabdovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 바람직한 랍도바이러스(Rhabdovirus) 종의 비제한적 예시는, 비제한적으로 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 및 광견병 바이러스(rabies virus, RABV)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 뉴모비리내(Pneumovirinae) 아과(subfamily) 또는 파라믹소비리내(Paramyxovirinae) 아과에 속하는 파라믹소바이러스(Paramyxovirusvirus) 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 아쿠아파라믹소바이러스(Aquaparamyxovirus), 아불라바이러스(Avulavirus), 펠라바이러스(Ferlavirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 모빌리바이러스(Morbillivirus), 뉴모바이러스(Pneumovirus), 레스피로바이러스(Respirovirus), 및 루불라바이러스(Rubulavirus)로 이루어진 군에서 선택되는 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 바람직한 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 속의 비제한적 예시는, 비제한적으로 인간 호흡기 세포 융합 바이러스(human respiratory syncytial virus; hRSV, 서브그룹 A), 소 호흡기 세포 융합 바이러스(bovine respiratory syncytial virus, bRSV), 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus, hMPV), 소-인간 파라인플루엔자 바이러스1(bovine-human parainfluenza virus 3, b/hPIV3), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(human parainfluenza virus 1, hPIV1), 재조합 소-인간 파라인플루엔자 바이러스 3(recombinant bovine-human parainfluenza virus 3, rB/HPIV3), 센다이 바이러스(Sendai virus, SeV), 안데스 바이러스(Andes virus, ANDV), 유행성이하선염바이러스(Mumps virus, MuV), 시미안 바이러스(Simian virus 5, SV5), 및 홍역 바이러스(Measles virus, MeV)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 토가바이러스(Togaviridae) 과 또는 플라비바이러스(Flaviviridae) 과에 속하는 양성 가닥 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 예컨대, 플라비바이러스(Flavivirus) 및 페스티바이러스(Pestivirus) 속(genus)에 속하는 바이러스와 같은 토가바이러스(Togaviridae) 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 플라비바이러스(Flavivirus) 속(genus)에 속하는 바이러스의 비제한적 예시는 황열병 바이러스(yellow fever virus, YFV), 뎅기열 바이러스(Dengue fever virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus, WNV) 및 지카 바이러스(Zika virus)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 황열병 바이러스 또는 뎅기열 바이러스로부터 유래한다. 독성(virulent) 및 무독화(avirulent) 플라비바이러스 균주가 모두 적합하다. 바람직한 플라비바이러스 균주의 비제한적 예시는, 비제한적으로 YFV (17D), DEN4 (814669 및 유도체), DEN2 (PDK-53), 쿤진 바이러스(Kunjin virus, KUN), JEV (SA14-14-2), 머레이밸리 뇌염바이러스(Murray Valley encephalitis virus, MVEV, IRES 약독화), WNV (SCFV), 소 바이러스성 설사 바이러스(Bovine viral diarrhea virus, BVDV) CP7, BVDV-SD1, BVDV-NADL, 및 고전적 돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 양성 가닥 바이러스 종, 예를 들어, 토가바이러스(Togaviridae) 과의 알파바이러스(Alphavirus) 속에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 아테리바이러스(Arteriviridae) 과의 아테리바이러스(Arterivirus) 속에 속하는 양성 가닥 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 아테리바이러스(Arteriviridae) 과의 아테리바이러스(Arterivirus) 속에 속하는 양성 가닥 바이러스 종으로부터 유래하고, 다른 RNA 레플리콘은 토가바이러스(Togaviridae) 과의 알파바이러스(Alphavirus) 속에 속하는 종으로부터 유래한다.
알파바이러스
알파바이러스(Alphavirus)는 그룹 IV 토가바이러스 과와 유전적, 구조적, 및 혈청학적으로 관련된 바이러스의 속(genus)으로 각각이 바이러스 스파이크 단백질을 포함하는 외피로 둘러싸인 뉴클레오캡시드 내에 봉입된 양성 극성의 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 적어도 30 구성원을 포함한다. 현재, 알파바이러스 속은 특히 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SIN), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus, SFV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus, RRV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 및 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV)를 포함하며, 이들은 모두 밀접하게 연관되며 다양한 척추동물 예컨대 포유류, 설치류, 어류, 조류 종 및 인간 및 말과 같은 대동물 뿐만 아니라 갑각류 및 곤충과 같은 무척추동물도 감염시킬 수 있다. 종과 개체 간의 전파는 주로 모기를 통하여 발생하며 알파바이러스를 아르보바이러스(Arbovirus) 또는 절지동물 매개 바이러스(Arthropod-Borne Virus)의 수집에 대한 기여인자가 되게 한다. 특히, 신드비스 및 셈리키 숲 바이러스는 널리 연구되어 왔고, 이들 바이러스의 생활 주기, 복제 방식 등은 잘 특성 규명되어 있다. 예를 들어, 알파바이러스는 동물 세포에서 매우 효율적으로 복제되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 알파바이러스를 그러한 세포에서의 단백질 및 핵산의 생성을 위한 벡터로서 가치가 있게 한다.
알파바이러스 입자는 외피가 있고, 직경이 70 nm이고, (다소 다형성이긴 하지만) 구형이 되려는 경향이 있고, 대략 40 nm의 등척성(isometric) 뉴클레오캡시드를 갖는다. 알파바이러스 게놈은 대략 11 내지 12 kb 길이의 양의 극성의 단일 가닥 RNA로서, 5' 캡, 3' 폴리-A 테일, 및 효소 기능을 갖는 비구조 단백질을 인코딩하는 제1 프레임과 바이러스 구조 단백질(예를 들어, 캡시드 단백질 C, E1 당단백질, E2 당단백질, E3 단백질 및 6K 단백질)을 인코딩하는 제2 프레임을 갖는 2개의 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
알파바이러스 게놈의 5'의 2/3은 바이러스 RNA의 전사 및 복제에 필요한 다수의 비구조 단백질을 인코딩한다. 이들 단백질은 RNA로부터 직접 번역되고, 세포 단백질과 함께 바이러스 게놈 복제 및 서브게놈 RNA의 전사에 필수적인 RNA 의존성 RNA 중합효소를 형성한다. 4개의 비구조 단백질(nsP1-4)은 단일 폴리프로테인으로서 생성되고, 바이러스의 복제 기구를 구성한다. 폴리프로테인의 처리는 고도로 조절된 방식으로 일어나며, 이때 P2/3 접합부에서의 절단은 게놈 복제 동안 RNA 주형 사용에 영향을 준다. 이 부위는 좁은 틈의 기저부에 위치하고 쉽게 접근할 수 없다. 일단 절단되면, nsP3는 nsP2를 둘러싸는 고리 구조를 생성한다. 이러한 두 단백질은 광범위한 계면을 갖는다. P2/P3 계면 영역에서 비세포변성 바이러스 또는 온도 민감성 표현형을 생성하는 nsP2에서의 돌연변이는 P2/P3 계면 영역에 밀집되어 있다. nsP2 비세포변성 돌연변이의 위치와 반대쪽에 있는 P3 돌연변이는 P2/3의 효율적인 절단을 방지한다. 이는 이어서 RNA 감염성에 영향을 주어 바이러스 RNA 생성 수준을 변경할 수 있다.
게놈의 3'의 1/3은 바이러스 입자를 형성하는 데 필요한 모든 구조 단백질, 즉, 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 및 이종이량체로서 회합하는 외피 단백질인 p62 및 E1의 번역을 위한 주형으로 작용하는 서브게놈 RNA를 포함한다. 바이러스 막 고정 표면 당단백질은 수용체 인식 및 막 융합을 통한 표적 세포 내로의 진입을 담당한다. 서브게놈 RNA는 nsp4 단백질을 인코딩하는 RNA 서열의 3' 단부에 존재하는 p26S 서브게놈 프로모터로부터 전사된다. E2 및 E3로의 P62의 단백분해 성숙은 바이러스 표면의 변화를 가져온다. E1, E2, 및 때로는 E3 당단백질 "스파이크(spike)"는 함께 E1/E2 이량체 또는 E1/E2/E3 삼량체를 형성하며, 여기서 E2는 중심부으로부터 정점까지 연장되고, E1은 정점들 사이의 공간을 채우고, E3은, 존재하는 경우, 스파이크의 원위 단부에 있다. 엔도솜의 산성으로의 바이러스의 노출 시에, E1은 E2로부터 해리되어 E1 동종삼량체를 형성하며, 이는 세포 및 바이러스 막을 함께 구동시키기 위한 융합 단계에 필요하다. 알파바이러스 당단백질 E1은 클래스 II 바이러스 융합 단백질이며, 이는 인플루엔자 바이러스 및 HIV에서 발견되는 클래스 I 융합 단백질과 구조적으로 상이하다. E2 당단백질은 그의 세포질 도메인을 통해 뉴클레오캡시드와 상호 작용하는 기능을 하는 한편, 그의 엑토도메인(ectodomain)은 세포 수용체와의 결합을 담당한다. 대부분의 알파바이러스는 말초 단백질 E3를 손실하는 반면, 셈리키 바이러스에서 이는 바이러스 표면과 회합된 상태로 유지된다. 몇몇 구현예에서, 제1 및/또는 제2 RNA 레플리콘은 임의의 바이러스 구조 단백질을 코딩하지 않거나, E1 또는 E2 또는 E3, 또는 이들 중 하나 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하지 않는다. 예를 들어, RNA 레플리콘이 알파바이러스로부터 유래된 경우 이는 E1 또는 E2 또는 E3, 또는 이들의 임의의 조합 또는 하위조합을 인코딩할 수 없다.
알파바이러스 복제는 숙주 세포 내에서 일어나는 막-연관 과정이다. 감염 주기의 제1 단계에서, 게놈 RNA의 5' 단부는 게놈 RNA에 상보적인 음성 가닥을 생성하는 RNA 중합효소 활성을 갖는 폴리프로테인(nsP1-4)으로 번역된다. 제2 단계에서, 음성 가닥은 다음과 같은 2개의 RNA 각각의 생성을 위한 주형으로서 사용된다: (1) 번역에 의해 다른 nsp 단백질을 생성하는 2차 바이러스의 게놈에 상응하고 바이러스에 대한 게놈으로서 작용하는 양성 게놈 RNA; 및 (2) 감염성 입자를 형성하는 바이러스의 구조 단백질을 인코딩하는 서브게놈 RNA. 양성 게놈 RNA/서브게놈 RNA의 비는 nsp 1, nsp 2, nsp 3 및 nsp 4로의 폴리프로테인의 단백분해 자가절단에 의해 조절된다. 실제로, 바이러스 유전자 발현은 두 단계로 일어난다. 제1 단계에서는, 양성 게놈 가닥 및 음성 가닥의 주된 합성이 존재한다. 제2 단계 동안, 서브게놈 RNA의 합성은 사실상 배타적이며, 이에 따라 다량의 구조 단백질의 생성을 가져온다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 알파바이러스 RNA 레플리콘은 VEEV/EEEV 그룹, 또는 SF 그룹 또는 SIN 그룹에 속하는 알파바이러스로부터 유래한다(예컨대, Strauss and Strauss. Microbiol. Rev., 58:3 p 492-562, 1994 참고). SF 그룹 알파바이러스의 비제한적 예시는 셈리키 숲 바이러스, 오뇽뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 미델버그(Middelburg) 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 바르마 숲 바이러스, 게타 바이러스, 마야로 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스 및 우나 바이러스를 포함한다. SIN 그룹 알파바이러스의 비제한적 예시는신드비스 바이러스(Sindbis virus), 거드우드 에스.에이. 바이러스(Girdwood S.A. virus), 남아프리카 아르보바이러스 넘버86(South African Arbovirus No. 86), 오켈보 바이러스(Ockelbo virus), 아우라 바이러스(Aura virus), 반비키 바이러스(Babanki virus), 와타로아 바이러스(Whataroa virus), 및키질라카시 바이러스(Kyzylagach virus)를 포함한다. VEEV/EEEV 그룹 알파바이러스의 비제한적 예시는 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV), 웨스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus, WEEV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus, EVEV), 무캄보 바이러스(Mucambo virus, MUCV), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus, SFV), 픽수나 바이러스(Pixuna virus, PIXV), 미들버그 바이러스(Middleburg virus, MIDV), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV), 오뇽뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus, ONNV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus, RRV), 바르마 바이러스(Barmah Forest virus, BF), 게타 바이러스(Getah virus, GET), 사기야마 바이러스(Sagiyama virus, SAGV), 베바루 바이러스(Bebaru virus, BEBV), 마야로 바이러스(Mayaro virus, MAYV), 및 우나 바이러스(Una virus, UNAV)를 포함한다. 독성 및 무독화 알파바이러스 균주 모두 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 적합하다. 몇몇 특정 구현예에서, 알파바이러스 RNA 레플리콘은 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SIN), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus, SFV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus, RRV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 또는 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV)로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 알파바이러스 RNA 레플리콘은 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV)로부터 유래한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 둘 다는 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 동일 알파바이러스 종으로부터 또는 2가지 상이한 알파바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 비-알파바이러스 종으로부터 유래한다. 비-알파바이러스 RNA 레플리콘의 비제한적 예시는 토가바이러스(Togaviridae) 과, 플라비바이러스(Flaviviridae) 과, 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 과, 랍도바이러스(Rhabdoviridae) 과, 아테로바이러스(Arteroviridae) 과, 피코르나바이러스(Picornaviridae) 과, 아스트로바이러스(Astroviridae) 과, 코로나바이러스(Coronaviridae) 과, 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 과로 이루어진 군에서 선택되는 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한 RNA 레플리콘을 포함한다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 음성 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한다. 적합한 음성 가닥 RNA 바이러스 종은 비제한적으로 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae), 랍도바이러스(Rhabdoviridae), 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae)의 과(family)의 바이러스 종을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 음성 가닥 RNA 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 인플루엔자 바이러스 A(Influenza virus A), 인플루엔자 바이러스 B(Influenza virus B), 인플루엔자 바이러스 C(Influenza virus C), 인플루엔자 바이러스 D(Influenza virus D), 이자바이러스(Isavirus), 토고토바이러스(Thogotovirus) 및 쿼런자바이러스(Quaranjavirus) 로 이루어진 군에서 선택되는 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 인플루엔자 바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 인플루엔자 바이러스 A로부터 유래한다.
몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 랍도바이러스(Rhabdoviridae) 과에 속하는 음성 가닥 RNA 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 큐리오바이러스(Curiovirus), 사이토랍도바이러스(Cytorhabdovirus), 디코라바이러스(Dichorhavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 하파바이러스(Hapavirus),레단테바이러스(Ledantevirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 노버랍도바이러스(Novirhabdovirus), 뉴클레오랍도바이러스(Nucleorhabdovirus), 퍼랍도바이러스(Perhabdovirus), 시그마바이러스(Sigmavirus), 스프리비바이러스(Sprivivirus), 스리푸바이러스(Sripuvirus), 티브로바이러스(Tibrovirus), 투파바이러스(Tupavirus), 바리코사바이러스(Varicosavirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus)로 이루어진 군에서 선택되는 랍도바이러스(Rhabdovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 바람직한 랍도바이러스(Rhabdovirus) 종의 비제한적 예시는, 비제한적으로 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 및 광견병 바이러스(rabies virus, RABV)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 과에 속하는 음성 가닥 RNA 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 뉴모비리내(Pneumovirinae) 아과(subfamily) 또는 파라믹소비리내(Paramyxovirinae) 아과에 속하는 파라믹소바이러스(Paramyxovirusvirus) 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Metapneumovirus, Morbillivirus, Pneumovirus, Respirovirus, 및 Rubulavirus 로 이루어진 군에서 선택되는 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 바람직한파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 속의 비제한적 예시는, 비제한적으로 인간 호흡기 세포 융합 바이러스(human respiratory syncytial virus; hRSV, 서브그룹 A), 소 호흡기 세포 융합 바이러스(bovine respiratory syncytial virus, bRSV), 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus, hMPV), 소-인간 파라인플루엔자 바이러스1(bovine-human parainfluenza virus 3, b/hPIV3), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1(human parainfluenza virus 1, hPIV1), 재조합 소-인간 파라인플루엔자 바이러스 3(recombinant bovine-human parainfluenza virus 3, rB/HPIV3), 센다이 바이러스(Sendai virus, SeV), 안데스 바이러스(Andes virus, ANDV), 유행성이하선염바이러스(Mumps virus, MuV), 시미안 바이러스(Simian virus 5, SV5), 및 홍역 바이러스(Measles virus, MeV)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 토가바이러스(Togaviridae) 과 또는 플라비바이러스(Flaviviridae) 과에 속하는 양성 가닥 바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 예컨대, 플라비바이러스(Flavivirus)및 페스티바이러스(Pestivirus) 속(genus)에 속하는 바이러스와 같은 토가바이러스(Togaviridae) 과에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한다. 플라비바이러스(Flavivirus) 속(genus)에 속하는 바이러스의 비제한적 예시는 황열병 바이러스(yellow fever virus, YFV), 뎅기열 바이러스(Dengue fever virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus, WNV) 및 지카 바이러스(Zika virus)를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 황열병 바이러스 또는 뎅기열 바이러스로부터 유래한다. 독성(virulent) 및 무독화(avirulent) 플라비바이러스 균주가 모두 적합하다. 바람직한 플라비바이러스 균주의 비제한적 예시는, 비제한적으로 YFV (17D), DEN4 (814669 및 유도체), DEN2 (PDK-53), 쿤진 바이러스(Kunjin virus, KUN), JEV (SA14-14-2), 머레이밸리 뇌염바이러스(Murray Valley encephalitis virus, MVEV, IRES 약독화), WNV (SCFV), 소 바이러스성 설사 바이러스(Bovine viral diarrhea virus, BVDV) CP7, BVDV-SD1, BVDV-NADL, 및 고전적 돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 비-알파바이러스 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 속의 바이러스일 수 있는, 아테리바이러스 과에 속하는 양성 가닥 바이러스 종으로부터 유래한다. 적합한 아테리바이러스 종은 비제한적으로 이콰인 아테리티스 바이러스(equine arteritis virus, EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus, LDV), 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV), 및 우블리 파썸 질환 바이러스(wobbly possum disease virus, WPDV)의 종을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 위치 1, 2, 4 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는 변형된 5'-UTR을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR의 위치 1에서의 뉴클레오티드 치환이다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환이다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR의 위치 4에서의 뉴클레오티드 치환이다. 몇몇 구현예에서, 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환은 U->G 치환이다. 몇몇 구현예에서, 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환은 U->A 치환이다. 몇몇 구현예에서, 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환은 U->C 치환이다.
본 개시의 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 RNA 레플리콘 내에서 하나 이상의 바이러스 구조 단백질의 코딩 서열의 일부 또는 전체가 부재 또는 변형된다. 따라서, 몇몇 특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 RNA 레플리콘은 변형된 5'-UTR을 포함하고 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 일부가 결여되며, 예컨대, 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 뉴클레오티드가 결여된다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 구조 폴리펩티드 E1, E2, E3, 6K, 및 캡시드 단백질 C 중 하나 이상을 인코딩하는 서열의, 또는 다른 구조 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 서열의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상이 결여될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 구조 폴리펩티드 E1, E2, E3, 6K, 및 캡시드 단백질 C 중 하나 이상을 인코딩하는 서열의 실질적 부분 또는 전체 서열, 또는 다른 구조 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 서열이 결여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 “실질적 부분”은 당업자에 의한 수동 평가에 의하여 또는 BLAST와 같은 알고리즘을 사용한 컴퓨터 자동화된 서열 대비 및 식별에 의하여(예컨대, 상술한 Karlin & Altschul, 1993 참조), 그 단백질의 추정적 식별을 제공하기에 충분한 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 변형된 RNA 레플리콘은 구조 폴리펩티드 E1, E2, E3, 또는 이들의 조합 또는 하위조합 중 하나 이상을 인코딩하는 적어도 하나 또는 전체 서열이 결여된다. 상기 변형된 RNA 레플리콘은 또한 단백질 6K, 및/또는 캡시드 단백질 C의 적어도 일부 또는 전체 서열이 결여될 수 있다.
바이러스 캡시드 인핸서 서열
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 바이러스 캡시드 인핸서의 구조 요소 내의 하나 이상의 RNA 스템-루프를 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다.
몇몇 바이러스는 예컨대 이종성 바이러스 게놈 내에서 그 하류에 위치한 코딩 서열의 번역을 증진하기 위하여 사용될 수 있는 하나 이상의 스템-루프 요소/구조를 형성할 수 있는 서열을 갖는다. 예를 들어, 신드비스 바이러스의 서브게놈 mRNA는 바이러스 캡시드 단백질(예컨대,캡시드 인핸서)의 야생형 AUG개시자 코돈의 하류에 위치한 안정한 RNA 헤어핀 루프를 가진다. 이 스템-루프 RNA 구조는 보통 다운스트림 LooP(또는 DLP 모티프)라 지칭된다. DLP 구조는 신드비스 바이러스(SINV) 26S mRNA에서 최초 특성화되었으며 셈리키 숲 바이러스(SFV)에서도 검출되었다. 최근 유사한 DLP 구조가 신세계(MAYV, UNAV, EEEV (NA), EEEV (SA), AURAV) 및 구세계(SV, SFV, BEBV, RRV, SAG, GETV, MIDV, CHIKV, ONNV))를 포함하는 알파바이러스 속의 적어도 14개 구성원에 존재하는 것으로 보고되었다. 이러한 알파 바이러스 26S mRNA의 예측된 구조는 SHAPE(선택적 2'- 하이드록실 아실화 및 프라이머 확장) 데이터를 기반으로 구축되었다(Toribio et al., Nucleic Acids Res. May 19; 44 (9) : 4368-80, 2016), 그 내용은 여기에 참조로 통합됨). 신드비스 바이러스의 경우 DLP 모티프는 신드비스 서브게놈 RNA의 처음~150개 뉴클레오티드에서 발견된다. 헤어핀은 신드비스 캡시드 AUG 개시 코돈(신드비스 서브게놈 RNA의 뉴클레오티드 50에 있는 AUG)의 하류에 위치하며 정확한 캡시드 유전자 AUG가 번역을 시작하는 데 사용되도록 리보솜을 정지시킨다. 헤어핀이 리보솜을 일시 중지시키기 때문에 eIF2α는 번역 개시를 지원하는 데 필요하지 않다. 특정 이론에 구속되지 않으나, 관심 유전자 GOI)에 대한 코딩 서열의 상류에 DLP 모티프를 배치하면 GOI AUG가 아닌 캡시드 AUG에서 개시가 일어나기 때문에 일반적으로 GOI-인코딩 단백질에 대한 헤어핀 영역에서 코딩되는 N-말단 캡시드 아미노산의 융합 단백질이 생성되는 것으로 여겨진다. 또한 비변형 RNA 레플리콘은 보통 그들이 도입된 세포의 초기 선천 면역 시스템 상태에 민감하다. 세포/개체가 고도로 활동적인 선천 면역 시스템 상태에 있는 경우 RNA 레플리콘 성능(예컨대 GOI의 복제 및 발현)에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 단백질, 특히 비구조 단백질의 번역 개시를 제어하기 위해 DLP를 조작함으로써, 효율적인 RNA 레플리콘 복제에 영향을 주는 선천 면역 시스템의 기존 활성화 상태의 영향이 제거되거나 감소된다. 그 결과 백신 효능 또는 치료의 치료 효과에 영향을 미칠 수 있는 GOI의보다 균일한 발현이 이루어진다. 알파바이러스 DLP에 관한 추가 정보는 예를 들어 미국특허출원 15/831,230에서 찾을 수 있다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서는 바이러스 종의 다운스트림 루프(DLP) 모티프를 포함하고, 여기서 DLP 모티프는 하나 이상의 RNA 스템-루프 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서는 서열번호 2-9 중 어느 하나 이상에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서는 서열번호 2-9 중 어느 하나 이상에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 중 임의의 둘 사이의 범위의 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 2-9 중 어느 하나 이상에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 하나 또는 둘 다는 바이러스 캡시드 단백질의 5' 코딩 서열로부터 적어도 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300개 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서,바이러스 캡시드 인핸서는 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus, EVEY), 무캄보 바이러스(Mucambo virus, MUCV), 픽수나 바이러스(Pixuna virus, PIXV), 미들버그 바이러스(Middleburg virus, MIDV), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV), 오뇽뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus, ONNV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus, RRV), 바르마 바이러스(Barmah Forest virus, BF), 게타 바이러스(Getah virus, GET), 사기야마 바이러스(Sagiyama virus, SAGV), 베바루 바이러스(Bebaru virus, BEBV), 마야로 바이러스(Mayaro virus, MAYV), 우나 바이러스(Una virus, UNAV), 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SINV), 아우라 바이러스(Aura virus, AURAV), 와타로아 바이러스(Whataroa virus, WHAV), 바반키 바이러스(Babanki virus, BABV), 키질라가시 바이러스(Kyzylagach virus, KYZV), 웨스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus, WEEV), 하일랜드 제이 바이러스(Highland J virus, HJV), 포트모건 바이러스(Fort Morgan virus, FMV), 엔두무 바이러스(Ndumu virus, NDUV), 및 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus, BCRV)로 이루어진 군에서 선택된 알파바이러스 종의 캡시드 유전자로부터 유래한다. 몇몇 특정 구현예에서,바이러스 캡시드 인핸서는 신드비스 바이러스 종 또는 셈리키 숲 바이러스 종의 캡시드 유전자로부터 유래한다. 또한 몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서는 신드비스 바이러스 종의 캡시드 유전자로부터 유래한다. 추가적으로, 당업자는 바이러스 캡시드 단백질로부터 5' 코딩 서열에서 실질적으로 그 증진 활성을 감소시키지 않으면서 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다(예컨대, Frolovet al., J. Virology 70:1182, 1994; Frolovet al., J. Virology 68:8111, 1994 참조). 바람직하게, 이러한 돌연변이는 5' 캡시드 코딩 서열에 의하여 형성되는 RNA 헤어핀 구조를 실질적으로 보존한다.
몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서 서열은 헤어핀 구조의 상류에 있는 바이러스 캡시드 단백질의 모든 5 '코딩 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서 서열은 캡시드 단백질의 전부 또는 일부를 코딩 할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 캡시드 인핸서 영역은 전체 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하지 않을 것이다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 캡시드 인핸서 서열은 바이러스 캡시드 단백질로부터의 아미노 말단 단편을 코딩할 것이다. 다른 기능성 캡시드가 캡시드 인핸서 서열에 의해 인코딩되는 이러한 구현예에서, 캡시드 오토프로테아제 활성을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 개시의 RNA 레플리콘에 포함된 바이러스 캡시드 인핸서 서열은 임의의 다른 변이체 서열, 예컨대 바이러스 캡시드 인핸서에 대해 예측되고 RNA 스템-루프 중 하나 이상에 기능적으로 또는 구조적으로 동등한 RNA 헤어핀을 형성할 수 있고 그 하류에 작동적으로 연결된 RNA서열(예컨대, 관심 유전자의 코딩 서열)의 번역을 증진시키는 작용을 할 수 있는 합성 서열 또는 이종성 서열일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 이종성 비구조 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 변형된 알파바이러스 레플리콘은 이종성 비구조 단백질 nsP3에 대한 코딩 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 이종성 비구조 단백질 nsP3는 치쿤구니아 바이러스(CHIKV) nsP3 또는 신드비스 바이러스(SINV) nsP3이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원 중 적어도 하나는 26S 서브게놈 프로모터 또는 그 변이체의 제어 하에 발현된다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원 중 적어도 하나는 알파바이러스 26S 서브게놈 프로모터 또는 그 변이체의 제어하에 발현된다. 몇몇 구현예에서, 26S 서브게놈 프로모터는 SINV 26S 서브게놈 프로모터, RRV 26S 서브게놈 프로모터 또는 그 변이체이다.
아테리바이러스
아테리바이러스(아테리바이러스(Arterivirida) 과, 아테리바이러스(Arterivirus) 속)은 가축 및 야생동물을 감염시키는 외피, 단일가닥, 양성-센스 RNA 바이러스의 중요 군을 포괄한다. 아테리바이러스는 코로나바이러스(Coronaviridae) (코로나바이러스(Coronavirus) 및 토로바이러스(Torovirus) 속) 과(family)의 구성원과 유사한 게놈 구성 및 복제 전략을 공유하지만, 유전적 복잡성, 게놈 길이, 생물물리적 특성, 크기, 구조 및 바이러스 입자(예컨대, 비리온)의 구조 단백질 조성이 상당히 상이하다. 현재, 아테리바이러스(Arterivirus) 속은 이콰인 아테리티스 바이러스(EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 마우스의 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(LDV), 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV) 및 우블리 파썸 질환 바이러스(wobbly possum disease virus, WPDV)을 포함하는 것으로 고려된다. 최근 연구는 새롭게 확인된 우블리 파썸 질환 바이러스(wobbly possum disease virus, WPDV) 또한 아테리바이러스 속에 속하는 것으로 보고하였다.
전형적인 아테리바이러스 게놈은 길이에서 12.7 내지 15.7 kb로 다양하지만 그것의 게놈 조직은 일부 사소한 변이로 상대적으로 일치한다. 아테리바이러스 게놈은 10-15개 알려진 ORF가 배열된 5' 및 3' 비-번역된 영역 (NTR)을 갖는 다시스트론성(polycistronic) 양성 가닥 RNA이다. 큰 레플리카제 ORF 1a 및 1b는 ORF1b의 것보다 훨씬 더 가변성인 ORF1a의 크기로, 게놈의 5'-근위 4분의 3을 점한다. ORF1a의 번역은 레플리카제 다단백질 (pp) 1a를 생산하고, 반면에 ORF1b는 pp1a가 pp1ab 내로 C-말단으로 신장하는 -1 프로그래밍된 리보솜 프레임 이동 (PRF)에 의해 발현된다. 또한, 짧은 트랜스프레임 ORF은 +1 프레임에서 ORF1a의 nsp2-코딩 영역을 중첩하고 -2 PRF에 의해 발현되는 것으로 보고되었다. 3'-근위 게놈 일부는 조밀한 조직화를 가지고 8 내지 12개의 비교적 작은 유전자를 함유하며, 그 대부분은 인접하는 유전자와 중첩한다. 이들 ORF는 구조 단백질을 인코딩하고 서브게놈 mRNA의 3'-공동말단 내포된 세트로부터 발현된다. 이들 ORF의 조직화는 보존되지만, ORF1b, SHFV 및 모든 최근에 확인된 SHFV-유사바이러스의 다운스트림은 ORF 2-4개의 오래된 중복으로부터 유래될 수 있는 3개 또는 4개의 추가의 ORF (~1.6 kb)를 함유한다. ORF1a에서의 크기 변이와 함께, 이 추정된 중복은 아테리바이러스 간의 게놈 크기 차이를 설명한다.
이콰인 아테리티스 바이러스(EAV)에 관하여, 야생형 EAV 게놈은 크기가 대략 12.7 Kb이다. 게놈의 5' 4분의 3은 2개의 큰 레플리카제 단백질 1a 및 1ab을 코딩한다; 2개 단백질의 아미노산 서열은 N-말단으로 동일하지만 리보솜 프레임 이동에 기인하여 1ab의 C-말단 영역의 아미노산 서열은 고유하다. EAV 게놈의 3' 4분의 1은 바이러스의 구조적 단백질 유전자를 코딩하고, 이들 모두는 서브게놈 RNA로부터 발현된다. 서브게놈 RNA는 불연속 전사 기전을 통해 생성된 3' 공동-말단 RNA의 내포된 세트를 형성한다. 서브게놈 RNA는 게놈 RNA와 인접하지 않는 서열로 구성된다. 모든 EAV 서브게놈 RNA는 게놈 5' 서열과 동일한 공통 5' 리더 서열(길이로 156 내지 221 뉴클레오티드)을 공유한다. 서브게놈 RNA의 리더 및 바디 부분은 전사조절 서열(TRS)이라 지칭되는 보존 서열에 의해 연결된다. TRS는 리더의 3' 말단(리더 TRS)뿐만 아니라 각각의 구조 단백질 유전자의 상류에 위치한 서브게놈 프로모터 영역(바디 TRS)에서 발견된다. 서브게놈 RNA는 음성 가닥 복제 중간체 RNA가 전사됨에 따라 생성된다. 전사가 일어날 때, 복제 복합체는 각각의 바디 TRS에 올 때 일시 정지하고 그 다음 발생기 음성 염기 RNA가 음성 가닥 RNA 전사가 계속되는 상보적 양성 가닥 리더 TRS와 연합되게 된다. 이 불연속 전사 기전은 5' 및 3' EAV 보존 서열 둘 다를 갖는 서브게놈 RNA를 초래한다. 음성 가닥 서브게놈 RNA는 그런 다음 서브게놈 양성 센스 mRNA의 생산을 위한 템플레이트가 된다.
EAV의 전체 게놈을 대표하는 감염성 cDNA 클론이 보고되었고(van Dinten 1997; de Vrieset al., 2000, 2001; Glaser et al., 1999), 이들은 거의 이십년 동안 EAV RNA 복제 및 전사를 연구하는데 사용되어 왔다(van Marle 1999, van Marle 1999a, Molenkamp 2000, Molenkamp 2000a, Pasternak 2000, Tijms 2001, Pasternak 2001, Pasternak 2003, Pasternak 2004, van den Born 2005, Beerens&Snijder 2007, Tijms 2007, Kasteren 2013). 또한, ORF2 및 ORF7 대신에 삽입된 클로르암페니콜 아세틸전달효소(CAT) 유전자를 함유하는 감염성 클론이 생성되어 왔고, 그리고 CAT 단백질은 이들 RNA로 전기천공된 세포에서 발현되는 것으로 나타났다(van Dinten 1997, van Marle 1999). 구조 단백질 유전자 영역의 부위 지정 돌연변이 유발 및 결실을 통해 감염성 클론의 변형은 RNA 복제의 지지에서 각각의 구조 유전자에 대한 요건을 결정하기 위해 사용되어 왔다(Molenkamp 2000). Molenkamp 2000에 의해 보고된 연구는 구조적 유전자가 RNA 복제를 지지하기 위해 요구되지 않는다고 결론지었다. 서브게놈 RNA 생산에서 TRS 활성에 대한 서열 상동성 요건의 분석은 불연속적 전사가 어떻게 기계론적으로 일어나는지(van Marle 1999, Pasternak 2000, Pasternak 2001, Pasternak 2003, van den Born 2005)와 바이러스 입자 안으로 RNA의 복제 및 패키징을 위해 필요한 최소 유전자 서열을 이해하기 위해 결함적 간섭 RNA가 어떻게 사용되는지(Molenkamp 2000a)를 더 잘 정의하기 위해 수행되고 사용되었다. 이와 관련한 추가적 정보는 예컨대, 그 전체가 본 명세서에 참조로서 통합되는 미국특허출원 제15/486131호에서 찾을 수 있다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 적합한 아테리바이러스 종은 이콰인 아테리티스 바이러스(equine arteritis virus, EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus, LDV), 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV), 및 우블리 파썸 질환 바이러스(wobbly possum disease virus, WPDV)의 종을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이콰인 아테리티스 바이러스(equine arteritis virus, EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus, LDV), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV)으로 이루어진 군에서 선택되는 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 아테리바이러스 RNA 레플리콘은 이콰인 아테리티스 바이러스(equine arteritis virus, EAV)로부터 유래한다. 독성 및 무독화 아테리바이러스 균주 둘 다가 적합하다. 바람직한 아테리바이러스 균주의 비제한적 예시는, EAV-독성 부사이러스(Bucyrus)균주(VBS), LDV-Plagemann, LDV-C, PRRSV-type 1, 및 PRRSV-type 2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 EAV 균주의 예시는 EAV VB53, EAV ATCC VR-796, EAV HK25, EAV HK116, EAV ARVAC MLV, EAV 부사이러스 균주(EAV Bucyrus strain, Ohio), 변형된 EAV 부사이러스, 무독화 균주 CA95, 레드마일(Red Mile, Kentucky), 84KY-A1(Kentucky), Wroclaw-2(Poland), Bibuna(Switzerland), 및 Vienna(Australia)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. PRRSV 균주의 비제한적 바람직한 예는 PRRSVLV4.2.1, PRRSV16244B, PRRSV HB-1(sh)/2002, PRRSV HB-2(sh)/2002, PRRSVHN1, PRRSV SD 01-08, PRRSV SD0802, PRRSV SD0803, PRRSV VR2332를 포함한다. SHFV 균주 및 변이체의 비제한적 바람직한 예는 SHFV 변이체 SHFV-krtg1a 및 -krtg1b(SHFV-krtg1a/b), SHFVkrtg2a/b GenBank accession # JX473847 내지 JX473850), SHFV-LVR, SHFV 프로토타입 변이체 LVR 42-0/M6941(NC_003092), Kibale red colobus로부터의 SHFV-krc1 및 SHFVkrc2(각각 HQ845737 및 HQ845738)를 포함한다. 바람직한 아테리바이러스의 다른 비제한적 예는 PRRSV-Lelystad, 유럽형(type 1) 균주 (M96262); PRRSVVR2332, 북부아메리카형(type 2) 균주(U87392); EAV-부사이러스(NC_002532); EAV-s3685(GQ903794); LDV-P, the Plagemann 균주(U15146); 및 LDV-C, 신경독성 type C 균주(L13298)를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 동일 아테리바이러스 종으로부터 또는 두개의 상이한 아테리바이러스 종으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 비-아테리바이러스 속으로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래한다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 비변형 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스종으로부터 유래한 변형된 RNA 레플리콘이다.
몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래하고 제2 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 속으로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종로부터 유래한 비변형 RNA 레플리콘이다. 몇몇 구현예에서, 제1 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 변형된 RNA 레플리콘이다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 본 개시의 방법은 추가로 하나 이상의 후속적 부스팅 투여를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본 개시의 방법은 추가로 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 10 회 연속적 부스팅 투여 또는 그 사이의 임의의 횟수의 투여를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 후속적 부스팅 투여는 경시적으로 점진적으로 증가하는 투여량으로 수행된다. 몇몇 구현예에서, 후속적 부스팅 투여는 경시적으로 점진적으로 감소하는 투여량으로 수행된다.
몇몇 구현예에서, 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물 중 하나 이상은 추가로 약학적 허용가능 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “약학적 허용가능 담체”은 일반적으로, 안전하고, 비독성이고, 생물학적으로나 그 외로도 바람직하지 않지 않고, 수의적 용도뿐만 아니라 인간 약학적 용도에도 허용 가능한 조성물 또는 제형을 제조하는데에 유용한 담체를 의미한다. 몇몇 구현예에서, 약학적 허용가능 담체는 간단하게는 물이지만, 또한, 에컨대, 생리적 염 농도의 용액 또는 식염수일 수 있다. 이는 또한 지질 나노입자일 수 있다. 적합한 물질은 폴리아미도아민(polyamidoamine, PAMAM) C12 덴드리머(dendrimer), 및/또는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-dimyristoiyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000])을 포함한다. 폴리에틸렌아민(Polyethleneimine, PEI) 및/또는 G5 및 G9 NH2 PAMAM 덴드리머(dendrimer) 또한 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 약학적 허용가능 담체는 안정화제, 희석제 및 완충액이거나 이를 포함할 수 있다. 적합한 안정화제는 예컨대 SPGA, 탄수화물(예컨대 건조된 밀크, 혈청 알부민 또는 카세인) 또는 이들의 분해 생성물이다. 적합한 완충액은 예를 들어 알칼리금속 포스페이트이다. 희석제는 물, 수성 완충액(예컨대 완충 식염수), 알코올 및 폴리올(예컨대 글리세롤)을 포함한다. 동물 또는 인간에 투여를 위해, 본 출원에 따른 조성물은 특히 비경구적으로, 분무에 의해 비강내로, 진피내로, 피하로, 에어로졸에 의해 경구로, 또는 근육내로 주어질 수 있다.
몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 각각 관심 유전자(GOI)의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “발현 카세트”는 생체내(in vivo) 및/또는 생체외(ex vivo)에서 수령체 세포 내의 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보를 가지는 프로모터와 같은, 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 단백질 또는 기능적 RNA의 코딩 서열을 포함하는 유전적 물질의 작제물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “작동적으로 연결”은 2 이상의 서열 간의 기능적 연결을 나타낸다. 예를 들어, 관심 및 조절 서열(예컨대, 프로모터)의 폴리뉴클레오티드 간의 작동적 연결은 관심 뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 이 관점에서, 용어 “작동적으로 연결”은 조절 영역이 관심 코딩 서열의 전사 및 번역을 조절하기에 효율적이도록 조절 영역 및 전사될 코딩 서열의 위치를 결정하는 것을 지칭한다. 본 명세서에서 개시된 몇몇 구현예에서, 용어 “작동적으로 연결”은 조절 서열이 발현 또는 세포 국소화를 지시하거나 조절하도록 폴리펩티드 또는 기능성 RNA를 코딩하는 서열에 관하여 적절한 위치에 배치되는 구성을 나타낸다. 따라서, 프로모터는 핵산 서열의 전사를 매개할 수 있는 경우 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된 요소는 연속적이거나 비연속적일 수 있다.
DNA의 2 이상의 서열을 함께 작동적으로 연결하는 기술은 당업자에게 친숙하며, 이러한 기술은 표준 분자생물학적 조작을 위한 다수의 텍스트에 기술되어 왔다(예컨대, Maniatiset al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Gibson et al., Nature Methods 6:343-45, 2009 참조).
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 RNA 레플리콘은 하나 이상의 발현카세트를 포함할 수 있다. 원칙적으로, 본 명세서에 개시된 RNA 레플리콘은 일반적으로 임의의 수의 발현카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, RNA 레플리콘은 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 발현카세트를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 발현카세트 중 적어도 하나는 아테리바이러스 RNA 레플리콘의 전사 조절 서열(TRS)의 하류에 작동적으로 배치되고, 여기서 상기 TRS는 TRS1, TRS2, TRS3, TRS4, TRS5, TRS6, 또는 TRS7로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 특정 구현예에서, 하나 이상의 발현카세트 중 적어도 하나는 아테리바이러스 RNA 레플리콘의 TRS7의 하류에 작동적으로 배치된다.
몇몇 구현예에서, GOI의 코딩 서열은 기준 코딩 서열의 발현 수준보다 높은 수준에서의 발현을 위해 최적화된다. 몇몇 구현예에서, 기준 코딩 서열은 최적화되지 않은 서열이다. 몇몇 구현예에서, GOI 코딩 서열의 최적화는 코돈 최적화를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화와 관련하여, 유전자 코드의 축퇴성는 유전자로부터 생성된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키지 않으면서 유전자의 단백질 코딩 서열의 적어도 하나의 염기를 다른 염기로 대체 할 수 있는 가능성을 제공한다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 유전 코드의 축퇴성에 따라 치환에 의해 본 명세서에 기재된 임의의 폴리 뉴클레오티드 서열로부터 변경된 임의의 염기 서열을 가질 수 있다. 코돈 사용을 설명하는 참고 자료는 쉽게 공개적으로 입수 가능하다. 본 개시의 일부 추가 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 생성 될 수 있다(예컨대, 아테리바이러스 mRNA에서 코돈을 인간, 햄스터, 마우스 또는 원숭이와 같은 다른 유기체에 의해 선호되는 코돈으로 변경).
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예에서, GOI는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 폴리펩티드는 일반적으로 임의의 폴리펩티드 일 수 있으며, 예를 들어 치료적 폴리펩티드, 예방적 폴리펩티드, 진단적 폴리펩티드, 기능식품적 폴리펩티드, 산업 효소 및 리포터 폴리펩티드일 수 있다. 몇몇 구현예에서, GOI는 항체, 항원, 면역 조절제 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다. 몇몇 구현예에서, GOI는 치료적 폴리펩티드, 예방적 폴리펩티드, 진단적 폴리펩티드, 기능식품적 폴리펩티드, 산업 효소 및 리포터 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 인코딩한다.
몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 RNA 레플리콘은 제3 뉴클레오티드 서열의 하류 및 GOI에 대한 코딩 서열의 상류에서 작동적으로 연결된 단백질분해 절단 부위에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 일반적으로, 당업계에 공지된 임의의 단백질 분해 절단 부위는 본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 RNA 레플리콘에 통합될 수 있고, 예를 들어 프로테아제에 의해 생산 후 절단되는 단백질 분해 절단 서열일 수 있다. 추가로 적합한 단백질 분해 절단 부위는 또한 외부 프로테아제의 첨가 후에 절단될 수 있는 단백질 분해 절단 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본원에 개시된 RNA 레플리콘은 제 3 뉴클레오티드 서열의 하류 및 GOI에 대한 코딩 서열의 상류에 작동적으로 연결된 오토프로테아제 펩티드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "오토프로테아제(autoprotease)"는 자가 단백 분해 활성을 보유하고 더 큰 폴리펩티드 모이어티로부터 스스로를 절단할 수 있는 "자가 절단" 펩티드를 의미한다. 피코르나 바이러스 그룹의 구성원인 구제역 바이러스(FMDV)에서 처음 확인된 후, 예를 들어 이콰인 리니티스 A 바이러스(equine rhinitis A virus, E2A), 돼지 테스코바이러스-1(porcine teschovirus-1, P2A) 및 토시 아시냐 바이러스(Thosea asigna virus, T2A)로부터의 "2A 유사"펩티드와 같은 여러 오토프로테아제가 후속적으로 확인되었고, 단백질 분해 절단에서의 이들의 활성은 다양한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 진핵 시스템에서 나타났다. 이와 같이, 오토프로테아제의 개념은 많은 천연 오토프로테아제 시스템이 확인된 분야에서 당업자에게 이용 가능하다. 잘 연구된 오토프로테아제 시스템에는 바이러스 프로테아제, 발달 단백질(예컨대, HetR, Hedgehog 단백질), RumA오토프로테아제 도메인, UmuD 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 조성물 및 방법에 적합한 오토프로테아제 펩티드의 비제한적인 예는 돼지 테스코바이러스-1 2A(porcine teschovirus-1 2A, P2A), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 2A (F2A), 이콰인 리니티스 A 바이러스(Equine Rhinitis A Virus, ERAV) 2A (E2A), 토시 아시냐 바이러스 2A(Thosea asigna virus 2A, T2A), 세포질 다각체병 바이러스 2a(cytoplasmic polyhedrosis virus 2a, BmCPV2A), 연화병 바이러스 2A(Flacherie Virus 2A, BmIFV2A), 또는 이들의 조합으로부터의 펩티드 서열을 포함한다.
개시된 조성물
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는: 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 포함하는 프라이밍 조성물; 및 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 포함하는 부스팅 조성물을 포함하되, 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이한 조성물에 관한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2항원의 아미노산 서열은 서로 동종성이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2항원은 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2항원은 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2항원은 대상체에서 실질적으로 동일한 면역 반응을 유도한다. 상기 조성물은,예를 들어, 약학적 허용 담체 또는 그 혼합물을 포함하는 예방적 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 출원의 조성물은 백신으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 몇몇 구현예는: 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하되, 상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이하며, 상기 제1 레플리콘 및 제2 레플리콘은 관심 분자를 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 조성물에 관한다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 항원의 아미노산 서열은 서로 동종성이다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 서로 동일하다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 및 제2 항원은 적어도 하나의 교차 반응성 항원결정인자를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 제1 항원의 아미노산 서열은 제2 항원의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 상기 조성물은 관심 분자의 생산을 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 상기 관심 분자는 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 일반적으로 임의의 폴리펩티드일 수 있으며, 예컨대 치료적 폴리펩티드, 예방적 폴리펩티드, 진단적 폴리펩티드, 기능식품적 폴리펩티드, 산업 효소 및 리포터 폴리펩티드일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 관심 분자는 항체, 항원, 면역 조절제 및 사이토카인으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드이다. 몇몇 구현예에서, 관심 분자는 치료적 폴리펩티드, 예방적 폴리펩티드, 진단적 폴리펩티드, 기능식품적 폴리펩티드, 산업 효소 및 리포터 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된다.
관심 분자의 생산 방법
본 개시의 조성물 및 방법은 예컨대 폴리펩티드와 같은, 본 명세서에 개시된 관심 유전자(GOI)의 오픈 리딩 프레임에서 인코딩되는 관심 분자를 생산(예컨대, 발현)하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 출원은 추가로 예컨대, 폴리펩티드와 같은, 관심 분자를 생산하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이와 관련한 추가적 정보는 예컨대 미국 특허출원 제15/486131호; 제15/723658호, 및 제15/831,230호에서 찾을 수 있다.
따라서, 몇몇 구현예는 대상체에서 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법에 관하며, 상기 방법은 상기 양태 및 구현예 중 어느 하나에 따른 제1 및 제2 RNA 레플리콘을 대상체에 순차적으로 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물은, 예를 들어 양식, 농업, 축산에 중요하고 흥미로운 대상체 와 함께 사용될 수 있고, 및/또는 백신, 의약품, 공산품, 화학물질, 및 기타 동종의 것의 제조에 사용되는 폴리펩타이드의 생산을 포함하여, 치료적 및 의료적 응용에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물은 설치류, 마우스, 물고기, 새, 및 더 큰 포유동물 예컨대 인간, 말, 돼지, 원숭이, 및 유인원뿐만 아니라 무척추동물과 같은 알파바이러스의 천연 숙주인 종으로부터의 대상체와 함께 사용될 수 있다. 적용의 일부 구현예에서, 특히 바람직한 종은 척추동물 종 및 무척추동물 종이다. 원칙적으로, 임의의 동물 종이 일반적으로 사용될 수 있고, 예를 들어, 인간, 말, 돼지, 영장류, 마우스, 페렛, 래트, 코튼 래트, 흰 담비, 소, 돼지, 양, 토끼, 고양이, 개, 염소, 당나귀, 햄스터, 또는 버팔로와 같은 포유동물일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 조류종, 갑각류 종, 또는 어류 종이다. 몇몇 구현예에서, 조류종은 음식 소비용 조류 종이다. 적합한 조류 종의 비제한적인 예는 닭, 오리, 거위, 칠면조, 타조, 에뮤, 메추라기,비둘기,백조, 공작, 꿩, 자고, 및 뿔닭을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는용어 “갑각류”는 예를 들어 통상적으로“새우(shrimp)”, “랍스터(lobster)”, “가재(crawfish)”, 및 “게(crab)”로 지칭되는, Penaeus, Litopenaeus, Marsupenaeus, Fenneropenaeus, 및Farfantepenaeus 와 같은 모든 갑각류 종을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 갑각류 종은 새우 종, 특히 Litopenaeus vannamei, Penaeus vannamei, Penaeus styllirostris, Penaeus monodon, Pandalus borealis, Acetes japonicas, Trachysalambria curvirostris, 및 Fenneropenaeus chinensis와 같은 양식으로 길러진 것이다. 몇몇 구현예에서, 어류는 장어, 연어, 송어, 잉어, 메기, 농어, 및 틸라피아와 같은 관상용 어류 또는 소비를 위한 양식에 사용되는 어종이다. 몇몇 구현예에서, 어류 종은 연어(Salmonidae) 과 계열의 임의의 종이다.
상기 언급된 광범위한 주제를 형질전환 또는 형질감염시키는 기술은 당 업계에 공지되어 있으며 기술 및 과학 문헌에 기재되어있다.
본 개시에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본 출원에 참조로 포함된다.
비록 과학 저널 기사, 특허 문서 및 교과서를 포함하는 많은 정보 소스가 여기에서 언급되지만; 이 참고 문헌은 이러한 문서가 해당 기술 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하지 않는다.
본 명세서에 제공된 일반적인 방법에 대한 논의는 예시 목적으로만 의도된다. 다른 대안적인 방법 및 대안은 본 개시를 검토할 때 당업자에게 명백할 것이며 본 출원의 정신 및 범위 내에 포함되어야 한다.
실시예
추가적 대안이 이하의 실시예에서 보다 구체적으로 개시되나, 이는 어떤 방식으로도 청구항의 범위를 한정하는 것을 의도하지 않는다.
실시예 1
상이한 RNA 레플리콘을 사용한 이종성 프라임-부스트에 뒤따른 증가된 면역 반응
이 실시예는 면역학적으로 구별되는 기전을 통해 대상체의 면역 시스템을 활성화시키는 RNA 레플리콘으로 수행되는 이종성 프라임-부스트 면역화에 뒤따른 면역 반응의 유도를 예시하는 실험을 요약한다. 상술한 바와 같이, 이종성 프라임-부스트 면역화는 (1) 항-벡터 면역성의 회피, 및 (2) 면역 반응의 차등적 및 시너지적 활성화를 통하여 증진된 면역 반응을 생성하는 것으로 여겨진다. 이종성 프라임 부스트 스케쥴은 전달을 위해 별개의 플랫폼을 사용하여 효능을 입증했지만 이 접근법은 레플리콘의 합리적인 조작을 통해 사용할 수 없었다. 현재까지 면역 시스템에 차등적으로 관여하는 레플리콘은 T 또는 B 세포 반응의 향상에 사용되지 않았다. 또한, 치료적 단백질을 암호화하는 레플리콘에 대한 항-벡터 반응을 회피하기 위해 두 가지 별개의 시스템을 사용하는 것은 종래에는 단백질 발현의 크기 또는 내구성을 향상시키는 방법으로서 가능하지 않았다.
본 명세서에서 이종성 프라임-부스트 포맷으로 면역 반응을 증진시키는 수단으로서 2개의 상이한 완전 합성 레플리콘 시스템의 사용이 기술된다. 비록 이종성 프라임 부스트를 위한 2개의 시스템을 사용하는 것이 항 벡터 면역성의 회피 및 면역 시스템의 차등적 활성화로 인해 다른 백신에서 효과적이었지만, 이것은 종래에는 레플리콘을 사용하여서는 가능하거나 입증되지 않았다. 그 이유는 두가지이다. 첫째, 알파바이러스 레플리콘은 현재 사용가능한 유일한 레플리콘 시스템이며, EAV의 신규 조작기술이 이 면역화 또는 단백질 투여 방법을 허용하였다. 둘째, 이종성 프라임 부스트 포맷에서 차등적 면역 반응을 추진하기 위해 두 개의 다른 레플리콘 사이의 면역 활성화 메커니즘을 현저하게 변경하는 동일 바이러스 패밀리 내에서 합리적 조작의 부족이 입증되지 않았다.
본 실시예에서 기술되는 실험에서,두 상이한 바이러스로부터 유래한 RNA 레플리콘: 아테리바이러스(이콰인 아테리티스 바이러스-EAV) 및 (베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스-VEEV)가 이종성 RNA 레플리콘 프라임-부스트 접근법의 대표로서 사용되었다. 재조합 EAV-기반 및 VEEV-기반 RNA 레플리콘이 설계되고 후속적으로 이종성 프라임-부스트 백신접종 요법에서 마우스를 백신접종하기 위하여 사용되었다. 이하에서 보다 구체적으로 기술되는 바와 같이, 이들 재조합 RNA 레플리콘은 마우스 모델에서 생체내(in vivo) 시험되었고 동종성 프라임-부스트 요법을 수용한 대조군 동물과의 비교에서 차등적 및 증진된 면역 반응을 나타냈다. 예를 들어, 출원인은 식염수 제형에서 인플루엔자 A/Vietnam/1203/2003 (H5N1) 균주로부터 유래한 헤마글루티닌(HA) 항원을 사용한 EAV-EAV 면역화 또는 VEEV-VEEV 면역화와 비교할 때 이종성 프라임-부스트 요법이 부스팅 단계 후 우월한 T 세포 반응을 생성함을 입증하였다.
면역원성 상의 이종성 프라임-부스트의 효과를 분석하기 위하여, 마우스를 다운스트림 LooP 서열(또는 DLP 모티프)를 포함하는 EAV 레플리콘 또는 VEE 레플리콘의 조합으로 면역화하였다. 각각의 레플리콘은 인플루엔자 A/Vietnam/1203/2003 (H5N1)로부터 유래한 헤마글루티닌(HA) 항원의 코딩 서열을 포함한다. 이들 실험에서, BALB/c마우스는 식염수 내에 제형화된 15 μg의 용량으로 4주 간격으로 근육 내 주사되어 면역화되었다. 마지막 주사 14일 후, HA에 대한 면역 반응을 분석하기 위하여 비장 및 혈청을 수집하였다. 이들 실험 결과의 요약은 도 2a-2b에 제시된다.
도 2a에 나타나는 바와 같이, 비장세포는 보존적 T 세포 에피토프(H-2 Kd: IYSTVASSL; 서열번호 1)로 자극되었고 동종성 프라임된 군 또는 단일 용량 군과 비교할 때, 이종성 프라임-부스트 요법을 수용한 군에서 IFN-γ분비 CD8+ T 세포의 현저한 증가를 보였으며, 여기서 프라이밍 조성물은 EAV 레플리콘을 포함하고 부스팅 조성물은 VEEV 레플리콘을 포함하였다.
상기 관찰은 프라이밍 조성물이 VEEV 레플리콘을 포함하고 부스팅 조성물이 EAV 레플리콘을 포함하는 이종성 프라임-부스트 요법을받은 동물과 상이하여, 동종성 프라임과 비교하여 이종성 프라임-부스트 요법의 차등적 효과를 입증한다. 특정 이론에 구속되지 않으나, 이종성 EAV-VEEV 투여군 대 동종성 VEEV-VEEV 군에서 증가된 CD8 + T 세포 반응에 대한 한 가지 가능한 설명은레플리콘에 의해 인코딩되는 바이러스 비구조 단백질에 대한 감소된 항-벡터 면역이다. 상기에서 논의된 바와 같이, 항-벡터 면역은 레플리콘을 발현하는 세포의 보다 빠른 제거를 초래하여 부스트시 발현된 항원의 제한을 초래할 것이다.
상기에서 제시된 데이터는 또한 각각의 레플리콘의 투여 순서가 생성되는 T 세포 반응에 영향을 미친다는 점을 시사한다. 특히, 먼저 VEEV-기반 레플리콘 후 EAV-기반 레플리콘을 이용하는 동종성 프라임-부스트 스케쥴은, EAV 프라이밍 먼저 후속적으로 VEEV 부스트를 이용하는 이종성 프라임-부스트 요법에 비해 IFNγ+ 항원-특이적 CD8+ T 세포를 동일 빈도로 생성하지 않았다. 상기 관찰과 일치하게, 투여 순서는 다른 이종 프라임-부스트 백신 모델 시스템에서 차등적 T 세포 반응을 제공하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 바이러스 기반 벡터를 사용하여 말라리아에 대한 보호를 위해, 말라리아 항원 ME.TRAP을 인코딩하는 아데노바이러스-기반 벡터로 프라이밍하고, 이후 동일 항원을 인코딩하는 변형된 백시니아 앙카라(Vaccinia Ankara) 기반 벡터로 부스트하는 것은 역순으로 투여하는 것에 비해 보다 우수한 T 세포 기억 반응 및 증진된 보호를 초래하였다.
도 2b에 나타나는 바와 같이, 다양한 이종성 프라임-부스트 요법에서의 B 세포 반응 또한 시험되었다. 마지막 주사 후 14일 후에 동물로부터 혈청을 수집하고 HA-특이적 총 IgG 반응이 평가되었다. 상승된 CD8+ T 세포 반응과 대조적으로, 이종성 EAV-VEE 프라임-부스트 요법을 수용한 동물로부터의 B 세포 반응은 VEEV-VEEV동종성 요법군과 비교할 때 근소하게 그리고 약간 감소된 수준의 항원-특이적 총 IgG를 나타냈다. 그러나, 두 이종성 프라임-부스트 군(즉, EAV-VEEV 및 VEEV-EAV) 모두에서 관찰된 B 세포 반응은 단일 용량을 수용한 동물에 비해 현저하게 높았다. 이러한 방식으로, 이종성 프라임-부스트는 현저하게 향상된 이펙터 CD8+ 세포 반응으로 B 세포 반응을 도출하는데에 사용될 수 있다.
동종성 프라임-부스트 요법과 반대로 2개의 상이한 레플리콘을 사용하여 부스트 후 14 일에 T 세포 반응이 개선되었다는 것은 예상치 못한 일이었다. 그러나 이전에 시도된 적이 없기 때문에 면역 반응의 차이는 개념적으로 예상치 못한 것이다. 특히, VEEV 레플리콘 프라임에 이어 EAV 레플리콘 부스트하는 것이 EAV 레플리콘 프라임 및 VEEV 레플리콘 부스트에 비해 열등한 T 세포 반응을 생성한다는 것은 예상치 못한 일이었다. 또한, 이종성 프라임 부스트는 EAV-EAV 레플리콘 동종성 프라임 부스트와 비교할 때 T 및 B 세포 반응을 모두 증진 시켰지만, VEEV-VEEV 레플리콘 동종성 프라임 부스트와 비교할 때 오직 우월한 T 세포 반응만을 증진시켰다는 것은 예상치 못한 일이었다. 마지막으로, 이종성 프라임 부스트의 다른 입증과는 달리, 화학적으로 유사한, 자가 증폭이 가능한 mRNA가 투여 후 하류 면역 반응에 차등적으로 영향을 미칠 수 있다는 관찰도 예상치 못한 것이다.
특히, EAV-기반 레플리콘을 이용한 프라임 면역화 후 알파바이러스-기반 레플리콘을 이용한 부스트 면역화가 최상의 T 세포 반응을 나타내었기 때문에, EAV-기반 레플리콘으로 면역 시스템을 프라이밍하고 아래 표 1에 나열된 각 알파바이러스-기반 레플리콘을 사용한 부스트 면역화가 이어지는 추가 실험 또한 수행된다.
| 프라임 | 부스트 | |
| 1 | EAV 레플리콘 | 알파바이러스 레플리콘의 nt2 점 돌연변이* |
| 2 | 알파바이러스 레플리콘의 nt2 점 돌연변이 | EAV 레플리콘 |
| 3 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 | 알파바이러스 레플리콘의 nt2 점 돌연변이 |
| 4 | 알파바이러스 레플리콘의 nt2 점 돌연변이 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 |
| 5 | EAV 레플리콘 | CHIKV nsP3 변이체 알파바이러스 레플리콘 |
| 6 | EAV 레플리콘 | SINV nsP3 변이체 알파바이러스 레플리콘 |
| 7 | EAV 레플리콘 | RRV 26S 프로모터 변이체 알파바이러스 |
| 8 | EAV 레플리콘 | SINV 26S 프로모터 변이체 알파바이러스 |
| 9 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 | CHIKV nsP3 변이체 알파바이러스 레플리콘 |
| 10 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 | SINV nsP3 변이체 알파바이러스 레플리콘 |
| 11 | CHIKV nsP3 변이체 알파바이러스 레플리콘 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 |
| 12 | SINV nsP3 변이체 알파바이러스 레플리콘 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 |
| 13 | RRV 26S 프로모터 변이체 알파바이러스 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 |
| 14 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 | RRV 26S 프로모터 변이체 알파바이러스 |
| 15 | SINV 26S 프로모터 변이체 알파바이러스 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 |
| 16 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 | SINV 26S 프로모터 변이체 알파바이러스 |
| 17 | WT 알파바이러스 레플리콘 ** | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 |
| 18 | DLP 모티프-함유 알파바이러스 레플리콘 | WT 알파바이러스 레플리콘 |
* 2 위치에서 뉴클레오티드치환을 갖는 변형된 5'-UTR을 포함하는 알파바이러스 레플리콘
** 야생형 / 비변형 알파바이러스 레플리콘
이하를 입증하기 위하여 또한 추가적 실험이 수행되었다: (1) 식염수 내 또는 LNP(양이온성 지질 나노입자) 제형에서의 EAV-VEEV 또는 VEEV-EAV의 면역 반응 우월성, (2) 면역 활성의 면역학적 기전의 두 VEEV 레플리콘의 우월성, 및 (3) 치료적 세팅에서 이종성-부스트의 우월성.
본 개시의 특정 대안이 개시되었지만, 다양한 수정 및 조합이 가능하고 첨부 된 청구항의 진정한 사상 및 범위 내에서 고려된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 여기에 제시된 정확한 요약 및 개시에 대한 제한의 의도는 없다.
본 발명이 상기 실시예를 참조하여 설명되었지만, 수정 및 변경이 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 청구항에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING
<110> SYNTHETIC GENOMICS INC
<120> INDUCE AND ENHANCE IMMUNE RESPONSE USING RECOMBINANT
REPLICON SYSTEMS
<130> SGI.014PR
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> conserved T cell epitope
<400> 1
Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu
1 5
<210> 2
<211> 145
<212> DNA
<213> Sindbis virus
<400> 2
atagtcagca tagtacattt catctgacta atactacaac accaccacca tgaatagagg 60
attctttaac atgctcggcc gccgcccctt cccggccccc actgccatgt ggaggccgcg 120
gagaaggagg caggcggccc cgatg 145
<210> 3
<211> 104
<212> DNA
<213> Sindbis virus
<400> 3
atgaatagag gattctttaa catgctcggc cgccgcccct tcccggcccc cactgccatg 60
tggaggccgc ggagaaggag gcaggcggcc ccgatgcctg cccg 104
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> Aura virus
<400> 4
atgaactctg tcttttacaa tccgtttggc cgaggtgcct acgctcaacc tccaatagca 60
tggaggccaa gacgtagggc tgcacctgcg cctcgaccat ccgggttgac tacccagatc 120
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> Eastern Equine Encephalitis virus SA
<400> 5
atgtttccgt atccaacatt gaactacccg cctatggcac cggttaatcc gatggcatac 60
agggacccca a 71
<210> 6
<211> 91
<212> DNA
<213> O'Nyong-Nyong virus
<400> 6
atggagttca taccagcaca aacttactac aatagaagat accagcctag accctggact 60
caacgcccta ctatccaggt gatcaggcca a 91
<210> 7
<211> 67
<212> DNA
<213> Semliki Forest virus
<400> 7
atgaattaca tccctacgca aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc 60
cgtcctt 67
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> Ross River virus
<400> 8
atgaattaca taccaaccca gactttttac ggacgccgtt ggcggcctcg cccggcgttc 60
cgtccatgg 69
<210> 9
<211> 91
<212> DNA
<213> Mayaro virus
<400> 9
atggatttcc taccaacaca agtgttttat ggcaggcgat ggagaccacg aatgccgcca 60
cgcccttgga ggccacgccc acctacaatt c 91
Claims (33)
- 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이고, 상기 방법은:
제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 포함하는 프라이밍 조성물의 적어도 하나의 용량을 상기 대상체에 투여하는 단계; 및
그 후 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 포함하는 부스팅 조성물의 적어도 하나의 용량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 제1 및 제2 레플리콘은 서로 상이한 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 및 제2 항원은 적어도 하나의 교차 반응성(cross-reactive) 항원결정인자(antigenic determinant)를 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 RNA 레플리콘은, 제2 RNA 레플리콘의 면역 시스템을 활성화시키는 면역 기전과 상이한 적어도 하나의 면역 기전을 통하여 대상체의 면역 시스템을 활성화시키는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 양성 가닥 RNA 바이러스로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 토가바이러스(Togaviridae) 과(family), 플라비바이러스(Flaviviridae) 과, 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 과, 랍도바이러스(Rhabdoviridae) 과, 아테로바이러스(Arteroviridae) 과, 피코르나바이러스(Picornaviridae) 과, 아스트로바이러스(Astroviridae) 과, 코로나바이러스(Coronaviridae) 과, 및 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae) 과로 이루어진 군에서 선택되는 과(family)에 속하는 바이러스 종으로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 RNA 레플리콘은 비-알파바이러스로부터 유래한 것이고, 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스 종으로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스(Arterivirus)로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 RNA 레플리콘은 이스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus, EEEV), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV), 에버글레이즈 바이러스(Everglades virus, EVEY), 무캄보 바이러스(Mucambo virus, MUCV), 셈리키 숲 바이러스(Semliki forest virus, SFV), 픽수나 바이러스(Pixuna virus, PIXV), 미들버그 바이러스(Middleburg virus, MIDY), 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV), 오뇽뇽 바이러스(O'Nyong-Nyong virus, ONNV), 로스 리버 바이러스(Ross River virus,RRV), 바르마 숲 바이러스(Barmah Forest virus, BF), 게타 바이러스(Getah virus, GET), 사기야마 바이러스(Sagiyama virus, SAGV), 베바루 바이러스(Bebaru virus, BEBV), 마야로 바이러스(Mayaro virus, MAYV), 우나 바이러스(Una virus, UNAV), 신드비스 바이러스(Sindbis virus, SINV), 아우라 바이러스(Aura virus, AURAV), 와타로아 바이러스(Whataroa virus, WHAV), 바반키 바이러스(Babanki virus, BABY), 키질라가시 바이러스(Kyzylagach virus, KYZV), 웨스턴 이콰인 뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus, WEEV), 하일랜드 제이 바이러스(Highland J virus, HJV), 포트모건 바이러스(Fort Morgan virus, FMV), 엔두무 바이러스(Ndumu virus, NDUV), 살모니드 알파바이러스(Salmonid alphavirus, SAV), 및 버기 크릭 바이러스(Buggy Creek virus,BCRV)로 이루어진 군에서 선택되는 알파바이러스 종으로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 RNA 레플리콘은 이콰인 아테리티스 바이러스(equine arteritis virus, EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 마우스의 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(lactate dehydrogenase elevating virus, LDV), 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV), 및 우블리 파썸 질환 바이러스(wobbly possum disease virus, WPDV)로 이루어진 군에서 선택되는 아테리바이러스 종으로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 위치 1, 2, 4 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 가지는 변형된 5'-UTR 을 포함하는 것인, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 하나 이상의 뉴클레오티드 치환은 변형된 5'-UTR의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환인, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 변형된 5'-UTR 의 위치 2에서의 뉴클레오티드 치환은 U->G 치환인, 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 변형된 5'-UTR을 포함하는 변형된 RNA 레플리콘이고, 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 적어도 한 부분이 결여된 것인, 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 바이러스 캡시드 인핸서의 구조 요소에 하나 이상의 RNA 스템-루프를 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘 또는 그 변이체인, 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘 중 적어도 하나는 이종성 비구조 단백질 nsP3를 위한 코딩 서열을 포함하는 변형된 알파바이러스 레플리콘인, 방법. - 제15항에 있어서,
상기 이종성 비구조 단백질 nsP3 은 치쿤구니아 바이러스(CHIKV) ns P3, 신드비스 바이러스(SINV) ns P3 또는 그 변이체인, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 항원 중 적어도 하나는 26S 서브게놈 프로모터 또는 그 변이체의 조절 하에 발현되는 것인, 방법. - 제17항에 있어서,
상기 26S 서브게놈 프로모터는 SINV 26S 서브게놈 프로모터, RRV 26S 서브게놈 프로모터, 또는 그 변이체인, 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 RNA 레플리콘은 아테리바이러스 종으로부터 유래한 것이고, 제2 RNA 레플리콘은 비-아테리바이러스 종으로부터 유래한 것인, 방법. - 제19항에 있어서,
상기 아테리바이러스 종은 이콰인 아테리티스 바이러스(EAV), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 젖산 탈수소효소 상승 바이러스(LDV), 및 시미안 출혈열 바이러스(simian hemorrhagic fever virus, SHFV)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 RNA 레플리콘은 EAV로부터 유래한 것이고, 제2 RNA 레플리콘은 알파바이러스로부터 유래한 것인, 방법. - 제22항에 있어서,
상기 알파바이러스는 VEEV로부터 유래한 것인, 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 RNA 레플리콘 및 제2 RNA 레플리콘은 각각 관심 유전자를 인코딩하는 서열을 포함하는, 방법. - 제24항에 있어서,
상기 관심 유전자는 대상체에 대한 항원결정인자인 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 2 이상의 용량의 부스팅 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프라이밍 조성물 및 부스팅 조성물 중 하나 이상은 약학적 허용가능 담체를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체는 조류(avian) 종, 갑각류(crustacean) 종, 또는 어류(fish) 종인, 방법. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체는 포유류인, 방법. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체는 수생동물(aquatic animal) 또는 조류 종인, 방법. - 두 개의 RNA 레플리콘을 대상체에 전달하는 방법으로, 상기 방법은
제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 대상체에 투여하는 단계; 및
그 후 제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘을 서로 상이한 것인, 방법. - 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 포함하는 프라이밍 조성물; 및
제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 포함하는 부스팅 조성물을 포함하고,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이한 것인, 조성물. - 제1 항원을 인코딩하는 제1 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및
제2 항원을 인코딩하는 제2 RNA 레플리콘을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고,
상기 제1 및 제2 RNA 레플리콘은 서로 상이하고,
상기 제1 레플리콘 및/또는 제2 레플리콘은 관심 분자를 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 것인, 조성물.
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|---|---|---|---|
| US201862619540P | 2018-01-19 | 2018-01-19 | |
| US62/619,540 | 2018-01-19 | ||
| PCT/US2019/014210 WO2019143949A2 (en) | 2018-01-19 | 2019-01-18 | Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems |
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| KR20200111729A true KR20200111729A (ko) | 2020-09-29 |
Family
ID=67298446
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|---|---|---|---|
| KR1020207023734A KR20200111729A (ko) | 2018-01-19 | 2019-01-18 | 재조합 레플리콘 시스템을 이용한 면역 반응 유도 및 증진 |
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