JP2023518976A - Ｒｎａを送達するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ナノエマルジョン組成物ならびに核酸などの生物活性剤を対象に送達するためにそれを製造して使用する方法を提供する。ナノエマルジョン組成物は、イメージングならびに核酸の送達を可能にする脂質ナノ粒子中の無機ナノ粒子に基づく疎水性コアを含む。処置およびワクチン接種のためにこれらの粒子を使用する方法も提供される。本開示は、ＲＮＡに結合し、処置を必要とする対象にＲＮＡを送達する無機化合物系のナノ粒子を提供する。この系は、１）ＲＮＡが単独で与えられる場合、またはナノ構造脂質担体などの他の担体技術を使用する場合よりもはるかに効率的にＲＮＡが送達される、２）ナノ粒子が、ＲＮＡを安定化し、ＲＮＡを分解から保護するカチオン性脂質を含有する、３）ナノ粒子が、体内の粒子の画像化および追跡を可能にするレポーター要素を有する、という多くの利点を有する。

Description

本出願は、２０２０年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／９９３，３０７号および２０２０年７月２１日に出願された米国仮出願第６３／０５４，７５４号に基づく優先権を主張し、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、一般に、ＲＮＡの送達に関する。より詳細には、本発明は、粒子内部の無機レポーターの使用によって画像化される能力を併せて有する薬学的に許容され得るナノ粒子によるＲＮＡのナノ粒子媒介送達に関する。
背景
ＲＮＡワクチンおよび治療薬は、ワクチン学および遺伝子治療において関心が高まっている分野である。ワクチンプラットフォームの基礎としての核酸コード化抗原の使用には、精製は比較的合理化されており、ＲＮＡ構築物は、ＤＮＡ合成技術と、これに続くＲＮＡ転写およびキャッピングを用いて数日で構築することができる、という多くの利点がある。これにより、新たな病原体の脅威への迅速な応答、広まっている新しい株に適応するための製造の戦略変更、または様々な疾患に対する治療的介入の個別化が可能になる。これらのワクチンおよび治療法は非常に有望であるが、場合によっては、ヒト試験において完全な有効性を欠いており（タンパク質ワクチンのように）、適応免疫応答を誘導する能力を増強するための方法が必要とされる場合がある。
いくつかのアプローチが試験され、開発中であるが、さらなる改良された核酸ワクチンおよび治療薬が依然として必要とされている。
要旨
端的に言えば、本開示は、ＲＮＡに結合し、処置を必要とする対象にＲＮＡを送達する無機化合物系のナノ粒子を提供する。この系は、１）ＲＮＡが単独で与えられる場合、またはナノ構造脂質担体などの他の担体技術を使用する場合よりもはるかに効率的にＲＮＡが送達される、２）ナノ粒子が、ＲＮＡを安定化し、ＲＮＡを分解から保護するカチオン性脂質を含有する、３）ナノ粒子が、体内の粒子の画像化および追跡を可能にするレポーター要素を有する、という多くの利点を有する。
本発明の一態様は、複数のナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する。各ナノエマルジョン粒子は、
液体油と１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
１または複数の脂質（カチオン性脂質など）と、
必要に応じて、１または複数の界面活性剤と、を含む。
本発明の一態様は、（ｉ）複数のナノエマルジョン粒子と、（ｉｉ）ナノエマルジョン粒子と複合体化した生物活性剤とを含むナノエマルジョン組成物に関する。各ナノエマルジョン粒子は、
液体油と１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
１または複数の脂質（カチオン性脂質など）と、
必要に応じて、１または複数の界面活性剤と、含む。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物と、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物と、必要に応じて１または複数のワクチンアジュバントとを含むワクチン送達系であって、生物活性剤が抗原または抗原をコードする核酸分子である、ワクチン送達系に関する。
本発明の別の態様は、生物活性剤を対象に送達するための方法であって、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。
本発明の別の態様は、対象において免疫応答を生じさせるための方法であって、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物と、必要に応じてアジュバントとを対象に投与することであって、生物活性剤が抗原または抗原をコードする核酸分子であること、を含む方法に関する。
本発明の別の態様は、対象の感染症または疾患を処置または予防する方法であって、治療有効量の本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物と、必要に応じて薬学的に許容され得る担体とを対象に投与することを含む方法に関する。
本発明の別の態様は、対象における生物活性剤送達を画像化および／または追跡する方法であって、
本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物を対象に投与することであって、無機ナノ粒子が磁気共鳴画像法によって検出可能な材料を含有すること、および、
磁気共鳴画像法を用いて前記ナノエマルジョン組成物を検出すること、を含む方法に関する。
本発明の別の態様は、ナノエマルジョン組成物を製造する方法であって、
（ａ）１または複数の無機ナノ粒子と、液体油と、１または複数の脂質（カチオン性脂質など）と、必要に応じて疎水性界面活性剤とを混合し、それによって油相混合物を形成すること、および
（ｂ）油相混合物を、必要に応じて親水性界面活性剤を含有する水溶液と混合して、ナノエマルジョン粒子を形成すること、および
（ｃ）必要に応じて、ナノエマルジョン粒子を生物活性剤を含有する水溶液と混合し、それにより生物活性剤をナノエマルジョン粒子と複合体化することを含む、方法に関する。
図１Ａ～図１Ｃは、様々な温度における３つの例示的な脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）製剤の粒径および安定性を時間の関数として示す。図１Ａは、実施例１で生成された７９－００４と表示されたＬＩＯＮを示す。図１Ｂは、実施例１で製造された７９－００６－Ａと表示されたＬＩＯＮを示す。図１Ｃは、実施例１で製造された７９－００６－Ｂと表示されたＬＩＯＮを示す。
図２は、裸の（製剤化されていない）ＲＮＡと比較して、１５の窒素：リン酸（Ｎ：Ｐ）比でＲＮＡ分子と複合体化した例示的なＬＩＯＮ製剤（実施例１で調製した、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａ、７９－００６－Ｂおよび７９－０１１と表示されるＬＩＯＮ）のゲル電気泳動を示し、ＲＮａｓｅの作用からＲＮＡを保護するＬＩＯＮ製剤の能力を示している。
図３Ａは、ＬＩＯＮ製剤（実施例１で調製した、７９－００４と表示されるＬＩＯＮ）を用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡコードＳＥＡＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける長期間にわたるタンパク質発現を示す。図３Ｂは、様々なＳＰＩＯサイズ（実施例１で調製した、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａおよび７９－００６－Ｂと表示されるＬＩＯＮ）を有する様々なＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡコードＳＥＡＰを注射後数日間筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるタンパク質発現を示す。図３Ｃは、ＬＩＯＮ製剤または対照としてのナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）を用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡコードＳＥＡＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、注射後数日間にわたるタンパク質発現を示す。図３Ｄは、４００ｎｇ／μｌおよび４０ｎｇ／μｌのＲＮＡ複合体濃度でＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡコードＳＥＡＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、注射後数日にわたるタンパク質発現をそれぞれ示す。図３Ｅは、ＬＩＯＮ製剤を（それぞれ０．５μｇ、２．５μｇおよび１２．５μｇ）用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡコードＳＥＡＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるタンパク質発現をＮ：Ｐ比の関数として示す。データを平均およびＳＥとして表示する。 同上。 同上。 同上。
図４Ａは、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ複合体から（１０、１、および０．１μｇのｓｒＲＮＡの投与量レベルで）発現された抗原が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメインに対する免疫応答を誘導したことを示す。図４Ｂは、ＳＰＩＯサイズが異なる様々なＬＩＯＮ製剤（ＬＩＯＮ－１０、ＬＩＯＮ－１５、ＬＩＯＮ－２５、ＬＩＯＮ－５）を用いて製剤化されたＲｅｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清中の、抗Ｓｐｉｋｅ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定された抗Ｓ ＩｇＧ濃度の結果を示す。データを平均およびＳＥとして表示し、１つの群につきｎ＝５である。図４Ｃは、様々なＬＩＯＮ製剤を用いて、混合方向（ＲＮＡへのＬＩＯＮの混合対ＬＩＯＮへのＲＮＡの混合）および希釈剤（スクロース（Ｓｕｃ）使用対デキストロース（Ｄｅｘ）使用の１：２００の希釈）を変えることによって製剤化されたＲｅｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの、筋肉内注射後１４日目（各群の最初のバー）または２１日目（各群の２番目のバー）における血清中の、抗ＳｐｉｋｅＥＬＩＳＡによって決定された抗Ｓ ＩｇＧ濃度の結果を示す。データを平均およびＳＥとして表示し、１つの群につきｎ＝５である。 同上。
図５Ａ～図５Ｂは、ＬＩＯＮ製剤中の鉄濃度の関数としての緩和時間Ｔ１（図５Ａ）およびＴ２（図５Ｂ）の増加を示す。
図６Ａは、動物のＬＩＯＮ－抗体配列ＲＮＡ複合体誘導ＺＩＫＶ－１１７抗体を示す。免疫化の７日後に動物から採血した。図６Ｂおよび図６Ｃは、生理食塩水（図６Ｂ）またはＬＩＯＮを用いて製剤化されたＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体をコードするｒｅｐＲＮＡ（図６Ｃ）で筋肉内経路によって免疫化された成体雌妊娠ウサギの抗ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４ＩｇＧ抗体の大きさおよび動態を示す。図６Ｄおよび図６Ｅは、生理食塩水（図６Ｄ）またはＬＩＯＮを用いて製剤化されたＺＩＫＶ ｐｒＭ－Ｅ抗原をコードするｒｅｐＲＮＡ（図６Ｅ）を筋肉内経路によって免疫化した成体雌妊娠ウサギの抗ＺＩＫＶ Ｅ ＩｇＧ抗体の大きさおよび動態を示す。１週目付近の網掛け領域は、ウサギが飼育された期間を示す。６週目と７週目の間の網掛け領域は、仔が送達された期間を示す。矢印は免疫化時点（０、４および１１週目）を示す。図６Ｆおよび図６Ｇは、雌ウサギから仔ウサギへの抗ＳＯＳＩＰ ＩｇＧの子宮内移行の評価の結果を示す。図６Ｆは、送達時の仔ウサギにおける抗ＳＯＳＩＰ ＩｇＧ応答を示す。１つの処置群あたりそれぞれ同腹仔由来の最低２匹の仔ウサギを安楽死させて、子宮内抗体移入を評価した。図６Ｇは、雌ウサギの抗体レベルと対応する仔ウサギとの間の正の相関（ピアソンｒ＝０．９４）を示すＸＹプロットを示す。図６Ｈおよび図６Ｉは、既存の母体抗体との関連におけるワクチン誘導性応答を示す。仔ウサギの血清抗ＳＯＳＩＰ ＩｇＧレベルを、追加免疫の４週間後（仔を離乳した３週間後）に収集した。生理食塩水を投与されていない雌ウサギ由来の仔ウサギまたはＬＩＯＮ＋ＲＮＡ－ｐｒＭ／Ｅを投与されている雌ウサギ由来の仔ウサギは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４に対する既存の母体抗体について陰性（－）としてグループ分けされる。ＬＩＯＮ＋ＲＮＡ－ＳＯＳＩＰまたはＡｄｄａＶａｘアジュバント添加組換えＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４を投与された雌ウサギ由来の仔ウサギは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４に対する既存の母体抗体について陽性（＋）としてグループ分けされる。ｌｏｇ１０変換データに対して、通常の一元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定を行った（ｎｓ＝有意ではない）。 同上。 同上。 同上。
図７は、インビトロでのｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓのキャラクタリゼーションを示す。図７Ａは、ｃ末端ｖ５エピトープタグに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離体Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）の２１，５３６から２５，３８４の位置に対応するＳ１ドメイン、Ｓ２ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（ＣＤ）ドメインを含むコドン最適化された全長スパイク（Ｓ）オープンリーディングフレームを、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのＴＣ－８３株の４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１－４）遺伝子をコードするアルファウイルスレプリコンにクローニングしたことを示す。図７Ｂおよび図７Ｃは、抗ｖ５免疫蛍光法（図７Ｂ）およびウエスタンブロット（図７Ｃ）による、ＢＨＫ細胞へのｒｅｐＲＮＡ－ＣＯＶ２Ｓのトランスフェクションの２４時間後の細胞の分析結果を、免疫検出のために回復期のヒト血清または抗ｖ５のいずれかを使用して示す。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質（ｒＣｏＶ２－Ｓｐｉｋｅ）およびｒｅｐＲＮＡ－ＧＦＰをそれぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。図７Ｂおよび図７Ｃのデータは、２つの独立した実験の代表である。
図８Ａ～図８Ｅは、ｒｅｐＲＮＡの例示的な脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）製剤を示す。図８Ａは、ｒｅｐＲＮＡと混合した後の例示的なＬＩＯＮおよびそのワクチン複合体の形成のグラフィック描写である。図８Ｂは、４℃、２５℃および４２℃で貯蔵した後の、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定したＬＩＯＮ粒径の時間発展を示すグラフである。図８Ｃは、ＬＩＯＮとｒｅｐＲＮＡとを混合した後のサイズ分布のシフトによって複合体が形成されたことの裏付けを示すグラフである。図８Ｄは、濃縮されたＲＮａｓｅチャレンジ後の、ＬＩＯＮから抽出されたｒｅｐＲＮＡの三連調製物のゲル電気泳動分析を示し、ＲＮＡｓｅチャレンジ後の、用量が一致した裸のＲＮＡの三連調製物と比較した実質的な保護を示す。図８Ｅは、フェノール－クロロホルム処理によって抽出されたｒｅｐＲＮＡのゲル電気泳動を示す。図８Ｆは、複合体の粒径を示す。図８Ｂ、図８Ｅ、および図８Ｆのデータは単一の実験から得られたものであるが、図８Ｃおよび図８Ｄのデータは３つの独立した実験の代表である。図８Ｂ、図８Ｄ、および図８Ｆのデータは、３回のテクニカルレプリケートの平均±ｓ．ｄ．として示されている。 同上。
図９Ａ～図９Ｆは、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＴｈ１偏向抗体および中和抗体を誘導したことを示す。６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、１０、１、または０．１μｇのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを筋肉内経路を介して投与した。初回免疫（ｐｒｉｍｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の１４日後、血清を採取した。図９Ａは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中の抗Ｓ ＩｇＧ濃度の結果を示す。図９Ｂは、シュードウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１シュードタイプ）中和アッセイによって測定した、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。図９Ｃおよび図９Ｄは、ＥＬＩＳＡによって求めた、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中の抗Ｓ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ濃度（図９Ｃ）ならびにＩｇＧ２ｃ：ＩｇＧ１濃度比（図９Ｄ）を示す。２８日目に、マウスにブースター免疫を投与し、１２日後に脾臓および肺を採取した。図９Ｅおよび図９Ｆは、Ｓタンパク質を包含し、１１のアミノ酸が重複する１５量体からなる１０ペプチドプールで１８時間刺激した後の、酵素結合免疫吸収スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）によって測定した、脾臓細胞（図９Ｅ）および肺細胞（図９Ｆ）におけるＩＦＮ－γ応答の結果を示す。図９Ａ、図９Ｃ、および図９Ｄのデータは、３つの独立した実験の代表であるが、図９Ｂ、図９Ｅ、および図９Ｆのデータは、単一の実験から得られたものであった。全てのデータは、個々の値ならびに平均±ｓ．ｄ．として表される（テューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、＊ｐ＜０．０５）。 同上。
図１０は、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体が高齢ＢＡＬＢ／ＣマウスにおいてＴｈ１偏向抗体を誘導したことを示す。２、８、または１７月齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ－５／群）に、筋肉内経路を介して１０または１μｇのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを投与した。初回免疫の１４日後、血清を採取した。図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、ＥＬＩＳＡによって求めた、高齢ＢＡＬＢ／Ｃマウスの血清中の抗Ｓ ＩｇＧ濃度（図１０Ａ）、ＩｇＧ１濃度およびＩｇＧ２ａ濃度（図１０Ｂ）、ならびにＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１濃度比（図１０Ｃ）の結果を示す。１７、８、および２ヶ月齢のＢＡＬＢ／Ｃのデータは単一の実験からのものであり、２ヶ月齢のＢＡＬＢ／Ｃのデータを第２の実験で再現した。全てのデータは、個々の値ならびに平均±ｓ．ｄ．として表される（１７月齢動物と８月齢または２月齢動物のいずれかとの間のテューキーの多重比較試験を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって決定される場合、＊ｐ＜０．０５）。
図１１Ａ～図１１Ｄは、単回用量のＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体が、アカゲザルにおいて中和抗体応答を誘導したことを示す。図１１Ａは、ピグテールマカクに２５０μｇ（ｎ＝３）または５０μｇ（ｎ＝２）のｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２－Ｓ複合体を筋肉内経路を介してワクチン接種し、１０、１４、２８、および４２日目に血液を採取した投与計画を示し、５０μｇの群は２８日目に追加免疫ワクチン接種を受け、１４日後に血液を採取した。図１１Ｂは、免疫前の採血によって確立されたベースラインに対して、免疫後の試料に対して行われた血清抗Ｓ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡの結果を示す。図１１Ｃは、免疫前の採血によって確立されたベースラインに対する、シュードウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１シュードタイプ）中和アッセイによって測定された各試料の平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の結果を示す。図１１Ｄは、確認されたＣＯＶＩＤ－１９患者から採取した７人の回復期のヒト試料から得た血清と一緒に、２８日目および４２日目に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２／ＷＡ／２０２０分離株に対する８０％プラーク減少中和抗体価（ＰＲＮＴ８０）を測定したことを示す。実験は１回行った。図１１Ｂおよび図１１Ｃの各線は、個々の各動物を表す。図１１Ｄのデータは、個々の値ならびに平均±ｓ．ｄ．として報告されている（１４日目および２８日目に２５０μｇの群を比較するスチューデントのｔ検定によって決定される場合、＊ｐ＜０．０５）。マン・ホイットニーＵ検定によって測定した場合、４２日目の５匹全ての動物の平均ＰＲＮＴ８０力価と７人の回復期のヒトの血清中の力価との間に有意差（ｎｓ）はなかった。 同上。
図１２は、ＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓを（それぞれ２５０μｇおよび１０μｇ用量レベルで）筋肉内注射したウサギにおける抗スパイクＩｇＧレベルを示す。ウサギを筋肉内注射後に一定時間ごとに採血し、抗Ｓｐｉｋｅ ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。各点は、個々の動物から得られたデータを表す。データを平均およびＳＥＭとして表示し、１つの群につきｎ＝４である。
図１３Ａは、ＬＩＯＮ製剤と複合体化した２．５μｇのｒｅｐＲＮＡ－ＲＳＶを筋肉内注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＦＩｇＧレベルを示す。図１３Ｂは、ＬＩＯＮ製剤と複合体化した２．５μｇのｒｅｐＲＮＡ－ＲＳＶを筋肉内注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗Ｇ（Ａ２）ＩｇＧレベルを示す。筋肉内注射の２８日後に血液を採取し、血清を調製し、ＥＬＩＳＡによって評価した。括弧内にレプリコン番号（６４５または６４６）を示す。各点は個々の動物から得られたデータを表し、ひげは最小値から最大値を表し、ボックスは四分位範囲を表し、水平バーは中央値を表す。
図１４Ａ～図１４Ｂは、ＲＮａｓｅチャレンジからの保護をもたらしたＬＩＯＮ製剤へのＰＡＭＰの結合を示す。図１４Ａは、ＲＮＡゲル上で泳動し、遊離ＲＮＡについて評価した、様々なＮ：Ｐ複合体化比（それぞれ０．０４、０．２、１、５、および２５）でのＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体のゲル電気泳動分析を示す。図１４Ｂは、裸のＰＡＭＰ（製剤化されていないＰＡＭＰ）と比較した、ＲＮａｓｅ Ａによるチャレンジ後のＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体のゲル電気泳動分析を示す。ＲＮＡをＬＩＯＮから抽出し、アガロースゲルに流してＲＮＡ分解を評価した。
図１５は、ＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体による、上清中のＳＥＡＰ活性およびルシフェラーゼ活性によってそれぞれ測定されたＩＦＮ－βプロモーターおよびＩＦＩＴ２の活性化をＮ：Ｐ比の関数として示す。破線は、ＰＡＭＰ単独の活性化レベルを表す。
図１６Ａおよび図１６Ｂは、製剤化されていないＲＮＡと比較した、上清中のＳＥＡＰ活性およびルシフェラーゼ活性によってそれぞれ測定された、ＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ製剤またはＲｉｂｏｘｘｉｍ－ＬＩＯＮ製剤によるＩＦＮ－βプロモーター（図１６Ａ）およびＩＦＩＴ２（図１６Ｂ）の活性化を示す。破線は、培地対照ウェルのＯＤ６３５読み取り値を表す。図１６Ｃは、製剤化されていないＲｉｂｏｘｘｉｍと比較した、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ－ＬＩＯＮ製剤によるＩＦＩＴ２の活性化を、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ用量レベルの関数として示す。図１６Ｄは、ナイーブ対照と比較した処置マウスの鼻腔における自然免疫遺伝子の用量依存的誘導を示す。図１６Ｅは、処置マウスの肺における自然免疫遺伝子の活性化を示す。図１６Ｆは、ＰＡＭＰ：ＬＩＯＮ製剤を３日間連続して鼻腔内投与した場合、マウスが体重を維持したことを示す。 同上。
図１７は、ＳＰＩＯ（Ｆｅ－ＬＩＯＮ）またはＴＯＰＯ被覆オキシ水酸化アルミニウムナノ粒子（Ａｌ－ＬＩＯＮ）をＬＩＯＮ製剤のコアとして使用した、ｎＬｕｃをコードするレプリコンＲＮＡとの例示的ＲＮＡ：ＬＩＯＮ複合体からのインビトロタンパク質発現を示す。
発明の詳細な説明
本開示は、ＲＮＡの担体としての脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の使用を提供する。具体的には、緩衝液中の荷電コーティングを有する脂質マトリックス中の固体無機コアが開示される。これらのナノ粒子の使用には、ＲＮＡを粒子に依存することなく複合体化することができ、粒子を、例えば、ＭＲＩまたは他のイメージング技術に使用可能な磁気信号を有するように設計することができる、という多くの利点がある。ＲＮＡは粒子によって保護され、それらは、細胞または生物に与えられたときに保護されたＲＮＡから抗原を含む多数の種類のタンパク質の発現を駆動する。
本発明の別の態様は、複数のナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する。各各ナノエマルジョン粒子は、
液体油と１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
１または複数の脂質（例えば、カチオン性脂質）と、
必要に応じて、１または複数の界面活性剤と、を含む。
本発明の別の態様は、（ｉ）複数のナノエマルジョン粒子と、（ｉｉ）ナノエマルジョン粒子と複合体化した生物活性剤とを含むナノエマルジョン組成物に関する。各ナノエマルジョン粒子は、
液体油と１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
１または複数の脂質（例えば、カチオン性脂質）と、
必要に応じて、１または複数の界面活性剤と、を含む。
ナノエマルジョン粒子
ナノエマルジョン粒子は、液体油と１または複数の無機固体ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアを有する。ナノエマルジョン粒子は、本明細書では脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）とも呼ばれ得る。
液体油は、１または複数の無機ナノ粒子と混合されて疎水性コアを形成する。液体油は、典型的には代謝可能である。適切な液体油は、植物油、動物油、または合成的に調製された油であり得る。
いくつかの実施形態では、液体油は魚油である。いくつかの実施形態では、液体油は、天然または合成テルペノイドである。
いくつかの実施形態では、液体油は、スクアレン、トリグリセリド（カプリン酸／カプリル酸トリグリセリドまたはミリスチン酸トリグリセリドなど）、ビタミンＥ、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、大豆レシチン、ヒマワリ油、大豆油、オリーブ油、ブドウ種子油、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、液体油は、スクアレン、トリグリセリド（カプリン酸／カプリル酸トリグリセリドまたはミリスチン酸トリグリセリドなど）、ビタミンＥ、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、大豆レシチン、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、液体油は、スクアレン、トリグリセリド（カプリン酸／カプリル酸トリグリセリドまたはミリスチン酸トリグリセリドなど）、ヒマワリ油、大豆油、オリーブ油、ブドウ種子油、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、液体油は、スクアレン（天然または合成のいずれか）であり、必要に応じて、上記の液体油のいずれかと組み合わせてもよい。
無機ナノ粒子は、１または複数の同じまたは異なる金属（遷移金属を含む任意の金属）から、例えば、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物および金属リン酸塩から形成され得る。例としては、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＦｅＯ、またはそれらの組み合わせ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯ（ＯＨ））、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）ｘ（ＰＯ４）ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、グルコン酸鉄または硫酸鉄が挙げられる。
いくつかの実施形態では、無機固体ナノ粒子は、遷移金属酸化物などの金属酸化物である。一実施形態では、無機固体ナノ粒子は、酸化鉄、例えばマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、ヘマタイト（α－Ｆｅ２Ｏ３）、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、無機固体ナノ粒子は、水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムなどの金属水酸化物である。
無機固体ナノ粒子は、体内で得られたナノエマルジョン粒子を画像化および追跡することを可能にするために、画像化方法によって検出可能なレポーター要素を含有し得る。例えば、無機固体ナノ粒子は、常磁性、超常磁性、フェリ磁性または強磁性化合物などの磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出可能なレポーター要素を含有し得る。ＭＲＩ検出可能な例示的な無機固体ナノ粒子材料は、酸化鉄、グルコン酸鉄および硫酸鉄である。
無機固体ナノ粒子は、典型的には、約３ｎｍから約５０ｎｍの範囲の平均直径（数加重平均直径）を有する。例えば、無機固体ナノ粒子は、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、または約５０ｎｍの平均直径を有し得る。
無機固体ナノ粒子は、液体油と混合する前に表面修飾されていてもよい。例えば、無機固体ナノ粒子の表面が親水性である場合、無機固体ナノ粒子を疎水性分子（または界面活性剤）でコーティングして、ナノエマルジョン粒子の「油」相中の液体油との無機固体ナノ粒子の混和性を促進することができる。ホスフェート末端脂質（例えば、ホスファチジル化脂質）、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤またはアミン末端界面活性剤を無機固体ナノ粒子の表面修飾に使用することができる。典型的なホスフェート末端脂質またはリン末端界面活性剤は、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）またはジステアリルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）である。典型的なサルフェート末端界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられるが、これに限定されない。典型的なカルボキシレート末端界面活性剤としては、オレイン酸が挙げられる。典型的なアミン末端界面活性剤としては、オレイルアミンが挙げられる。
一実施形態では、無機固体ナノ粒子は、酸化鉄などの金属酸化物であり、オレイン酸、オレイルアミン、ＳＤＳ、ＤＳＰＡ、またはＴＯＰＯなどの界面活性剤を使用して無機固体ナノ粒子をコーティングした後、液体油と混合して疎水性コアを形成する。
一実施形態では、無機固体ナノ粒子は、水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムなどの金属水酸化物であり、オレイン酸、オレイルアミン、ＳＤＳ、ＴＯＰＯまたはＤＳＰＡなどのホスフェート末端脂質または界面活性剤を使用して無機固体ナノ粒子をコーティングした後、液体油と混合して疎水性コアを形成する。
ナノエマルジョン粒子を形成するために使用される脂質は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、またはそれらの混合物であり得る。
いくつかの実施形態では、使用される脂質はカチオン性脂質である。例えば、負に荷電した生物活性剤（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）との好ましい相互作用を有することができる正に荷電した脂質をナノエマルジョン組成物に使用することができる。好適なカチオン性脂質として、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、および、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。典型的なカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。
適切な脂質の他の例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）など、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、および上記の脂質のいずれかのＰＥＧ化バージョンを含むＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ナノエマルジョン粒子は、疎水性界面活性剤または親水性界面活性剤であり得る、１または複数の界面活性剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、疎水性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、親水性界面活性剤をさらに含む。一実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、疎水性界面活性剤および親水性界面活性剤をさらに含む。
適切な疎水性界面活性剤としては、１０またはそれ未満、例えば、５またはそれ未満、１から５、または４から５の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）値を有するものが挙げられる。例示的な疎水性界面活性剤は、ソルビタンエステル（ソルビタンモノエステルまたはソルビタントリメスターなど）である。例えば、疎水性界面活性剤は、１から５または４から５のＨＬＢ値を有するソルビタンエステルであり得る。
いくつかの実施形態では、疎水性界面活性剤は、ソルビタンモノエステルまたはソルビタントリエステルである。例示的なソルビタンモノエステルとしては、ソルビタンモノステアレートおよびソルビタンモノオレエートが挙げられる。例示的なソルビタントリエステルとしては、ソルビタントリステアレートおよびソルビタントリオレエートが挙げられる。
適切な親水性界面活性剤としては、これらのポリエチレンオキシド系界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート）が挙げられる。いくつかの実施形態では、親水性界面活性剤はポリソルベートである。例示的なポリソルベートは、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリソルベート６０（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートまたはＴｗｅｅｎ（登録商標）４０）およびポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）である。一実施形態では、親水性界面活性剤はポリソルベート８０である。
ナノエマルジョン粒子は、約０．１：１から約２０：１、約０．５：１から約１２：１、約０．５：１から約９：１、約０．５：１から約５：１、約０．５：１から約３：１、または約０．５：１から約１：１の範囲の油と界面活性剤のモル比を有することができる。
ナノエマルジョン粒子は、約０．１：１から約２：１、約０．２：１から約１．５：１、約０．３：１から約１：１、約０．５：１から約１：１、または約０．６：１から約１：１の範囲の親水性界面活性剤と脂質（例えば、カチオン性脂質）の比を有することができる。
ナノエマルジョン粒子は、約０．１：１から約５：１、約０．２：１から約３：１、約０．３：１から約２：１、約０．５：１から約２：１、または約１：１から約２：１の範囲の疎水性界面活性剤と脂質（例えば、カチオン性脂質）の比を有することができる。
ナノエマルジョン粒子は、約０．２％から約４０％ｗ／ｖの液体油、約０．００１％から約１０％ｗ／ｖの無機固体ナノ粒子、約０．２％から約１０％ｗ／ｖの脂質（例えば、カチオン性脂質）、約０．２５％から約５％ｗ／ｖの疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および約０．５％から約１０％ｗ／ｖの親水性界面活性剤を含むことができる。
ある特定の実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、
ホスフェート末端脂質、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤で必要に応じてコーティングされた少なくとも１つの金属酸化物ナノ粒子を含有する１または複数の無機ナノ粒子と、天然または合成スクアレンを含有する液体油との混合物を含む疎水性コアと、
カチオン性脂質ＤＯＴＡＰと、
ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含む疎水性界面活性剤と、
ポリソルベートを含む親水性界面活性剤と、を含む。
一実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、
酸化鉄ナノ粒子を含有する１または複数の無機ナノ粒子と天然または合成スクアレンを含有する液体油と混合物を含む疎水性コアと、
カチオン性脂質ＤＯＴＡＰと、ソルビタンモノステアレートを含む疎水性界面活性剤と、
ポリソルベート８０を含む親水性界面活性剤と、
を含む。
このＬＩＯＮ組成物において、ＬＩＯＮ粒子は、約０．２％ｗ／ｖから約４０％ｗ／ｖのスクアレン、約０．００１％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖの酸化鉄ナノ粒子、約０．２％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含むことができる。
一実施形態では、ＬＩＯＮ粒子は、約２％ｗ／ｖから約６％ｗ／ｖのスクアレン、約０．０１％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖの酸化鉄ナノ粒子、約０．２％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含む。
特定の実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、
ホスフェート末端脂質、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤で必要に応じてコーティングされた少なくとも１つの金属水酸化物またはオキシ水酸化物ナノ粒子を含有する１または複数の無機ナノ粒子と、天然または合成スクアレンを含有する液体油との混合物を含む疎水性コアと、ＤＯＴＡＰを含むカチオン性脂質と、
ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含む疎水性界面活性剤と、
ポリソルベートを含む親水性界面活性剤と、
を含む。
一実施形態では、ナノエマルジョン粒子は、
必要に応じてＴＯＰＯでコーティングされた、水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子を含有する１または複数の無機ナノ粒子と、天然または合成スクアレンを含有する液体油との混合物を含む疎水性コアと、
カチオン性脂質ＤＯＴＡＰと、ソルビタンモノステアレートを含む疎水性界面活性剤と、
ポリソルベート８０を含む親水性界面活性剤と、
を含む。
このＬＩＯＮ組成物において、ＬＩＯＮ粒子は、約０．２％ｗ／ｖから約４０％ｗ／ｖのスクアレン、約０．００１％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖの水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子、約０．２％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含むことができる。
一実施形態では、ＬＩＯＮ粒子は、約２％ｗ／ｖから約６％ｗ／ｖのスクアレン、約０．０１％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖの水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子、約０．２％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含む。
ナノ粒子およびナノエマルジョンは文献に記載されており、この用語は本明細書では１０００ナノメートル未満のサイズを有する粒子を指すために使用される。
ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）は、典型的には、約２０ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均直径（動的光散乱によって測定されるｚ平均流体力学的直径）を有する。いくつかの実施形態では、ＬＩＯＮ粒子のｚ平均直径は、約２０ｎｍから約１５０ｎｍ、約２０ｎｍから約１００ｎｍ、約２０ｎｍから約８０ｎｍ、約２０ｎｍから約６０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態では、ＬＩＯＮ粒子のｚ平均直径は、約４０ｎｍから約２００ｎｍ、約４０ｎｍから約１５０ｎｍ、約４０ｎｍから約１００ｎｍ、約４０ｎｍから約９０ｎｍ、約４０ｎｍから約８０ｎｍ、または約４０ｎｍから約６０ｎｍの範囲である。一実施形態では、ＬＩＯＮ粒子のｚ平均直径は、約４０ｎｍから約８０ｎｍである。一実施形態では、ＬＩＯＮ粒子のｚ平均直径は、約４０ｎｍから約６０ｎｍである。
ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）の平均多分散指数（ＰＤＩ）は、約０．１から約０．５の範囲であり得る。例えば、ＬＩＯＮ粒子の平均ＰＤＩは、約０．２から約０．５、約０．１から約０．４、約０．２から約０．４、約０．２から約０．３、または約０．１から約０．３の範囲であり得る。
ＬＩＯＮ－生物活性剤複合体
ナノエマルジョン組成物は、ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）と会合／複合体化した生物活性剤をさらに含有することができる。生物活性剤は、非共有結合相互作用を介して、または可逆的共有結合相互作用を介してナノエマルジョン粒子と会合／複合体化され得る。
生物活性剤は、タンパク質またはタンパク質をコードする生物活性剤であり得る。例えば、生物活性剤は、タンパク質抗原またはタンパク質抗原をコードする生物活性剤であり得る。抗原は、感染性病原体および／または感染症、癌、もしくは自己免疫疾患に関連するエピトープ、生体分子、細胞もしくは組織に由来するか、またはそれらと免疫学的に交差反応性であり得る。
いくつかの実施形態では、生物活性剤は、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸である。自然免疫応答を調節するＲＮＡ、タンパク質または抗原をコードするＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡ、自己複製ＲＮＡなどの様々なＲＮＡを送達のためにＬＩＯＮ粒子と会合することができる。
一実施形態では、生物活性剤は、ｍＲＮＡである。一実施形態では、生物活性剤は、腫瘍溶解性ウイルスＲＮＡである。一実施形態では、生物活性剤は、レプリコンＲＮＡである。
［０１００］ 特定の実施形態では、生物活性剤は、抗原または抗体をコードするＲＮＡである。抗原は、細菌性疾患、ウイルス性疾患、原虫性疾患、非伝染性疾患、癌、または自己免疫疾患に由来し得る。特定の実施形態では、抗原は、ＲＮＡウイルス、例えば、肝炎ウイルス、コロナウイルス、蚊媒介ウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、またはＺＩＫＶウイルスなどのフラビウイルス）、またはＨＩＶウイルスに由来する。特定の実施形態では、抗原は、ＭＥＲＳウイルスおよびＳＡＲＳウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）からなる群より選択されるコロナウイルスに由来する。
特定の実施形態では、生物活性剤は、非コードＲＮＡである。
生物活性剤は、アジュバントでもあり得る。好適なアジュバントとして、ＴＬＲアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、サポニン、ペプチド、タンパク質、炭水化物、炭水化物ポリマー、コンジュゲート炭水化物、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、細胞断片、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
特定の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲアゴニストまたはＲＩＧ－Ｉアゴニストである。例示的なＴＬＲアゴニストとしては、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９アゴニストが挙げられる。典型的なＴＬＲアゴニストは、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、ポリ（ＬＣ）またはＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）などのＴＬＲ３アゴニストである。
特定の実施形態では、生物活性剤は、二本鎖ＲＮＡである。
特定の実施形態では、生物活性剤は、免疫刺激薬であるＲＮＡである。免疫刺激薬は、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９アゴニスト）またはＲＩＧ－Ｉアゴニスト（例えば、ＰＡＭＰ）であり得る。典型的なＴＬＲアゴニストは、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、ポリ（ＬＣ）またはＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）などのＴＬＲ３アゴニストである。
抗原としてのＲＮＡの送達の代替として、またはそれに加えて、組み合わせを使用することができ、例えば、自然免疫応答を刺激するＲＮＡ、または腫瘍溶解性ウイルスもしくは生弱毒化ウイルスを発現するＲＮＡと組み合わせたＲＮＡ抗原を使用することができる。
特定の実施形態では、ナノエマルジョン組成物中の生物活性剤は、ＲＮＡにコードされた抗原と、自然免疫応答を刺激することができるか、または腫瘍溶解性ウイルスもしくは生弱毒化ウイルスを発現することができる別のＲＮＡとの組み合わせを含むことができる。あるいは、ＲＮＡコード抗原を含有するナノエマルジョン組成物は、自然免疫応答を刺激することができるか、または腫瘍溶解性ウイルスもしくは弱毒生ウイルスを発現することができる別のＲＮＡを含有する製剤と組み合わせることができる。
ナノエマルジョン組成物において、（ｉ）ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）と（ｉｉ）生物活性剤のモル比は、窒素とリン酸のモル比によって特徴付けることができ、そのモル比は、約０．０１：１から約１０００：１、例えば、約０．２：１から約５００：１、約０．５：１から約１５０：１、約１：１から約１５０：１、約１：１から約１２５：１、約１：１から約１００：１、約１：１から約５０：１、約１：１から約５０：１、約５：１から約５０：１、約５：１から約２５：１、または約１０：１から約２０：１の範囲であり得る。ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）と生物活性剤のモル比は、生物活性剤の送達効率を増加させ、生物活性剤担持ナノエマルジョン組成物が抗原に対する免疫応答を誘発する能力を増加させ、生物活性剤担持ナノエマルジョン組成物が対象において抗原に対する抗体力価の産生を誘発する能力を増加させるように選択することができる。特定の実施形態では、窒素とリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比によって特徴付けられる、ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）と生物活性剤のモル比は、約１：１から約１５０：１、約５：１から約２５：１、または約１０：１から約２０：１の範囲である。一実施形態では、ナノエマルジョン組成物のＮ：Ｐモル比は約１５：１である。
生物活性剤と複合体化することにより、ナノエマルジョン組成物は生物活性剤を細胞に送達することができる。細胞は、必要とする対象に存在し得る。例えば、生物活性剤がタンパク質抗原であるか、またはタンパク質抗原をコードする場合、生物活性剤を担持するナノエマルジョン組成物は、抗原に対する免疫応答を対象において誘発することができる。ナノエマルジョン組成物は、対象において抗原に対する抗体価を誘発することによって、例えば、対象において中和抗体価を誘導することによって、それをなすことができる。
一実施形態では、ＬＩＯＮを含有するナノエマルジョン組成物は、有効量で対象に投与された場合、生物活性剤がＬＩＯＮなしで対象に投与された場合に誘発される免疫応答と同じか、またはそれを超える抗原に対する免疫応答を誘発することができる。
理論に束縛されるものではないが、ナノエマルジョン組成物中の疎水性界面活性剤は、ナノエマルジョン組成物が生物活性剤を細胞に送達する能力を増加させるか、または生物活性剤を担持するナノエマルジョン組成物が抗原に対する対象における免疫応答を誘発する能力を増加させるのに寄与し得る（生物活性剤がタンパク質抗原であるか、またはタンパク質抗原をコードする場合）。例えば、ナノエマルジョン組成物中の疎水性界面活性剤は、生物活性剤を担持するナノエマルジョン組成物の能力の増加に寄与し得る。
一実施形態では、疎水性界面活性剤はソルビタンエステルであり、同じナノエマルジョン組成物であるが、ソルビタンエステル疎水性界面活性剤を含まないものと比較して、ナノエマルジョン組成物が生物活性剤を細胞（または対象）に送達する能力を増加させるのに十分な量で存在する。
一実施形態では、疎水性界面活性剤はソルビタンエステルであり、同じナノエマルジョン組成物であるが、ソルビタンエステル疎水性界面活性剤を含まないものと比較して、生物活性剤を担持するナノエマルジョン組成物が抗原に対する免疫応答を誘発する能力を増加させるのに十分な量で存在する。
一実施形態では、疎水性界面活性剤はソルビタンエステルであり、対象に有効量を投与した場合、ナノエマルジョン組成物は、同じナノエマルジョン組成物（ただしソルビタンエステル疎水性界面活性剤を含まない）を対象に投与した場合に誘導される抗体力価よりも高いレベルで抗原に対する抗体力価を誘導する。
一実施形態では、疎水性界面活性剤はソルビタンエステルであり、対象に有効量を投与した場合、ナノエマルジョン組成物は、同じナノエマルジョン組成物（ただしソルビタンエステル疎水性界面活性剤を含まない）を対象に投与した場合に誘導される中和抗体力価よりも高いレベルで対象において中和抗体力価を誘導する。
ナノエマルジョン組成物の調製
本発明の別の態様は、ナノエマルジョン組成物を製造する方法であって、
（ａ）１または複数の無機ナノ粒子と、液体油と、１または複数の脂質（例えば、カチオン性脂質）と、必要に応じて疎水性界面活性剤とを混合し、それによって油相混合物を形成すること、および
（ｂ）油相混合物を、必要に応じて親水性界面活性剤を含有する水溶液と混合して、ナノエマルジョン粒子を形成すること
を含む方法に関する。
方法は、工程（ｃ）ナノエマルジョン粒子を生物活性剤を含有する水溶液と混合し、それにより生物活性剤をナノエマルジョン粒子と複合体化することをさらに含むことができる。
生物活性剤は、非共有結合相互作用を介して、または可逆的共有結合相互作用を介してナノエマルジョン粒子と会合／複合体化され得る。
ナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する本発明の態様およびナノエマルジョン粒子と生物活性剤とを含むナノエマルジョン組成物に関する本発明の態様において上述した、ナノエマルジョン組成物、ナノエマルジョン粒子（液体油、無機ナノ粒子、カチオン性脂質などの脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤を含む）および生物活性剤に関する全ての上記記載および全ての実施形態は、本発明のこの態様に適用可能である。
得られたナノエマルジョン組成物は、希釈形態または濃縮形態で調製することができる。
特定の実施形態では、ナノエマルジョン組成物は、（任意の適切な緩衝液によって）約１から約２００倍、例えば、約１から約１００倍、約２から約５０倍、約２から約３０倍、約２から約２０倍、約２から約１０倍、約２から約５倍に希釈してもよい。一実施形態では、ナノエマルジョン組成物を２倍に希釈する。
特定の実施形態では、ナノエマルジョン組成物は、約１から約１００倍、例えば、約２から約５０倍、約２から約３０倍、約２から約２０倍、約２から約１０倍、約２から約５倍に濃縮してもよい。
ナノエマルジョン組成物は、少なくとも約１００μｇ／ｍｌの生物活性剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸）の負荷容量を有することができる。
ナノエマルジョン組成物中の生物活性剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸）の投与量レベルは、約０．００１μｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌ、例えば、約０．００２μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌから約４００μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌから約４００μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌから約２５０μｇ／ｍｌの範囲であり得る。
ナノエマルジョン組成物の使用
本発明の様々な態様はまた、例えば、医薬組成物の形、ワクチン送達系の形、生物活性剤を細胞または対象に送達し、対象において免疫応答を生じさせ、必要とする対象を処置する形、といった形での、ナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物の使用に関する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物を含む医薬組成物を提供する。必要に応じて、本医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体または賦形剤」という用語は、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤、ならびに必要に応じて１または複数のワクチンアジュバントを含むナノエマルジョン組成物を含むワクチン送達系であって、生物活性剤が抗原または抗原をコードする核酸分子であるワクチン送達系を提供する。
ナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する本発明の態様、ナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物に関する本発明の態様、ならびにナノエマルジョン組成物を製造する方法に関する本発明の態様における、ナノエマルジョン組成物、ナノエマルジョン粒子（液体油、無機ナノ粒子、カチオン性脂質などの脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤を含む）、生物活性剤、および上記のナノエマルジョン組成物の調製に関する全ての上記記載および全ての実施形態は、医薬組成物およびワクチン送達系に関する本発明のこれら２つの態様に適用可能である。
医薬組成物およびワクチン送達系は、経口投与、または静脈内、筋肉内、皮内、皮下、眼内、鼻腔内、肺（例えば、吸入による）腹腔内、もしくは直腸内投与などの非経口投与を含む様々な投与経路用に製剤化することができる。
一実施形態では、送達経路は（例えば、肺に至る）肺送達であり、これは噴霧製剤、エアロゾル製剤、ミセル製剤または乾燥粉末製剤の使用などの異なるアプローチによって達成することができる。一実施形態では、医薬組成物またはワクチン送達系は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器、および／または乾燥粉末分散装置で投与されるように製剤化される。
本発明の一態様は、生物活性剤を細胞に送達する方法であって、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物と細胞を接触させることを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、生物活性剤を対象に送達する方法であって、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。
ナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する本発明の態様、ナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物に関する本発明の態様、ならびにナノエマルジョン組成物を製造する方法に関する本発明の態様における、ナノエマルジョン組成物、ナノエマルジョン粒子（液体油、無機ナノ粒子、カチオン性脂質などの脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤を含む）、生物活性剤、および上記のナノエマルジョン組成物の調製に関する全ての上記記載および全ての実施形態は、生物活性剤を送達する方法に関する本発明のこれら２つの態様に適用可能である。
本明細書に記載されるように、ナノエマルジョン粒子による生物活性剤の細胞または対象への送達の能力および効率は、ナノエマルジョン粒子の成分を調整すること、ナノエマルジョン粒子（ＬＩＯＮ）と生物活性剤のモル比を選択すること、および／または生物活性剤の投与量を選択することによって制御することができる。
本発明の一態様は、対象において免疫応答を生じさせるための方法であって、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤、ならびに必要に応じてアジュバントを含むナノエマルジョン組成物を対象に投与することであって、生物活性剤が抗原または抗原をコードする核酸分子である、投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、対象において免疫応答を生じさせる方法であって、
（ａ）治療有効量のタンパク質抗原をコードする腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与すること、および
（ｂ）本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤、ならびに必要に応じてアジュバントを含む治療有効量のナノエマルジョン組成物を対象に投与することであって、生物活性剤がタンパク質抗原またはタンパク質抗原をコードする核酸分子である、ナノエマルジョン組成物を対象に投与すること、を含む方法。
ナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する、ナノエマルジョン粒子と生物活性剤とを含むナノエマルジョン組成物に関し、ナノエマルジョン組成物を製造する方法に関し、医薬組成物に関し、かつ、ワクチン送達系に関する本発明の態様において、上記のナノエマルジョン組成物、ナノエマルジョン粒子（液体油、無機ナノ粒子、カチオン性脂質などの脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤を含む）、生物活性剤、ナノエマルジョン組成物の調製、医薬組成物、およびワクチン送達系に関する全ての上記説明および全ての実施形態は、免疫応答を生じさせる方法に関する本発明のこれら２つの態様に適用可能である。
これらの方法における投与経路は、医薬組成物およびワクチン送達系を投与するための上記の投与経路と同じである。
（ａ）工程の投与と（ｂ）工程の投与は同時に行うことができる。あるいは、（ａ）工程の投与および（ｂ）工程の投与は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年の間隔で行うことができる。
本発明の一態様はまた、対象の感染または疾患を処置または予防する方法であって、本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤と、必要に応じて薬学的に許容され得る担体とを含む治療有効量のナノエマルジョン組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
ナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する、ナノエマルジョン粒子と生物活性剤とを含むナノエマルジョン組成物に関し、ナノエマルジョン組成物を製造する方法に関し、医薬組成物に関し、かつ、ワクチン送達系に関する本発明の態様において、上記のナノエマルジョン組成物、ナノエマルジョン粒子（液体油、無機ナノ粒子、カチオン性脂質などの脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤を含む）、生物活性剤、ナノエマルジョン組成物の調製、医薬組成物、およびワクチン送達系に関する全ての上記説明および全ての実施形態は、感染症または疾患を処置または予防する方法に関する本発明のこの態様に適用可能である。
これらの方法における投与経路は、医薬組成物およびワクチン送達系を投与するための上記の投与経路と同じである。
処置される感染症または疾患は、細菌感染／疾患、ウイルス感染／疾患、原虫疾患、非伝染性疾患、癌、または自己免疫疾患であり得る。いくつかの実施形態では、感染症／疾患は、ＲＮＡウイルスによって引き起こされるウイルス感染症／疾患である。ＲＮＡウイルスは、肝炎ウイルス、コロナウイルス、蚊媒介ウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、またはＺＩＫＶウイルスなどのフラビウイルス）、またはＨＩＶであり得る。これらの疾患を予防または処置するために、ナノエマルジョン組成物中の生物活性剤は、コロナウイルスのゲノムに由来する抗原または抗原をコードする核酸分子であり得る。
特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＭＥＲＳウイルスおよびＳＡＲＳウイルスからなる群から選択されるコロナウイルスである。一実施形態では、ＳＡＲＳウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象におけるコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、「ＣＯＶＩＤ－１９」など）を処置または予防することに関し、本方法は、
ナノエマルジョン粒子および生物活性剤、ならびに必要に応じてアジュバントを含む治療有効量のナノエマルジョン組成物を対象に投与することであって、生物活性剤が、先天性アゴニストであるＲＮＡ、またはコロナウイルスのゲノム（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム）に由来する抗原もしくは抗原をコードする核酸分子である、投与すること、を含む。
特定の実施形態では、生物活性剤は、先天性アゴニストであるＲＮＡである。一実施形態では、ＲＮＡは、ＰＡＭＰなどのＲＩＧ－Ｉアゴニストである。一実施形態では、ＲＮＡは、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、ポリ（ＬＣ）、またはＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）などのＴＬＲ３アゴニストである。
特定の実施形態では、生物活性剤は、コロナウイルスゲノム（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム）に由来する抗原をコードするＲＮＡである。一実施形態では、ＲＮＡは自己複製する。一実施形態では、ＲＮＡはスパイク「Ｓ」タンパク質の全部または一部をコードする。
上記のように、無機固体ナノ粒子は、イメージング法によって検出可能なレポーター要素を含有する場合、得られたナノエマルジョン粒子は、ナノエマルジョン粒子が体内に投与された後に画像化および追跡することができる。例えば、無機固体ナノ粒子は、常磁性、超常磁性、フェリ磁性または強磁性化合物などの磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出可能なレポーター要素を含有し得る。
したがって、本発明の一態様はまた、対象における生物活性剤の送達を画像化および／または追跡する方法であって、
本明細書に記載のナノエマルジョン粒子および生物活性剤を含むナノエマルジョン組成物を対象に投与することであって、無機ナノ粒子が磁気共鳴画像法によって検出可能な材料を含有する、投与すること、
および
磁気共鳴画像法を用いてナノエマルジョン組成物を検出すること、を含む方法に関する。
一実施形態では、ＭＲＩ検出可能な無機固体ナノ粒子材料は、酸化鉄、グルコン酸鉄および硫酸鉄である。
ナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物に関する、ナノエマルジョン粒子と生物活性剤とを含むナノエマルジョン組成物に関し、ナノエマルジョン組成物を製造する方法に関し、医薬組成物に関し、かつ、ワクチン送達系に関する本発明の態様において、上記のナノエマルジョン組成物、ナノエマルジョン粒子（液体油、無機ナノ粒子、カチオン性脂質などの脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤を含む）、生物活性剤、ナノエマルジョン組成物の調製、医薬組成物、およびワクチン送達系に関する全ての上記説明および全ての実施形態は、生物活性剤の送達を画像化および／または追跡する方法に関する本発明のこの態様に適用可能である。
ナノエマルジョン組成物のイメージングアプリケーションは、対象におけるナノエマルジョン組成物（ＬＩＯＮ粒子）による生物活性剤の送達をリアルタイムで追跡することを可能にするので、非常に有用である。したがって、ＬＩＯＮは治療を送達することができるだけでなく、画像化によって疾患および処置を自己報告／追跡することもできる。
本発明は、本明細書において広範かつ一般的に記載されている。一般的な開示に含まれるより狭義の種および亜属の群も各々、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除外するという但し書きまたは否定的限定を伴う本発明の一般的な説明を含む。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、すべての材料、方法、および実施例は例示であり、限定することを意図するものではない。
実施例
以下の実施例は、例示のみを目的としており、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１、施例で使用した一般的な製造技術および材料
材料
脂質－無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造には、以下の材料を使用した。クロロホルム中２５ｍｇＦｅ／ｍｌの、様々な平均直径（５、１０、１５、２０、２５および３０ｎｍ）の酸化鉄ナノ粒子を、Ｏｃｅａｎ Ｎａｎｏｔｅｃｈ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。スクアレンおよびＳｐａｎ（登録商標）６０（ソルビタンモノステアレート）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート）およびクエン酸ナトリウム二水和物を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。カチオン性脂質の塩化物塩１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰクロリド）を、Ｃｏｒｄｅｎ Ｐｈａｒｍａから購入した。超純水（１８．２ ＭＯｈｍ－ｃｍの抵抗率）をＭｉｌｌｉ－Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）から入手した。
７９－００４と表示された脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造
これらのＬＩＯＮは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン、３７ｍｇ／ｍｌのＳｐａｎ（登録商標）６０、３７ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド、０．１ｍｇ／ｍｌの１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物を含む。ＬＩＯＮは、以下の手順を用いて作製した。
クロロホルム中の１０ｎｍの数加重平均直径を有する酸化鉄ナノ粒子（２５ｍｇＦｅ／ｍｌ）から０．４ｍｌを２００ｍｌビーカーに添加した。クロロホルムを換気フード内で蒸発させ、酸化鉄ナノ粒子の乾燥コーティングを残した。酸化鉄ナノ粒子に、３．７グラムのＳｐａｎ（登録商標）６０、３．７５グラムのスクアレン、および３グラムのＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６０℃に予熱した水浴中で３０分間超音波処理した。別に、１リットルガラス瓶中で、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した１，０００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物溶液に３９グラムのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を添加することによって「水」相を調製した。水相を３０分間撹拌して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を完全に溶解させた。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の完全溶解後、９６ｍｌの水相を２００ｍｌビーカーに移し、６０℃に予熱した水浴中でインキュベートした。加熱された油相に、予熱された水相９６ｍｌを添加した。混合物を、ミルク状の外観を有する均質なコロイドが生成されるまで、ＶＷＲ（登録商標）２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して直ちに乳化した。続いて、２０，０００ｐｓｉでＬＭ１０マイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバに流体を通すことによってコロイドを処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学的直径が、０．２の多分散指数で５４ｎｍになるまで通した。マイクロ流動化したＬＩＯＮ試料を、２００ｎｍの孔径のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルターで最終濾過した。
７９－００６－Ａと表示された脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造
これらのＬＩＯＮは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン、３７ｍｇ／ｍｌのＳｐａｎ（登録商標）６０、３７ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド、０．２ｍｇ／ｍｌの１５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物を含む。ＬＩＯＮは、以下の手順を用いて作製した。
クロロホルム中の１５ｎｍの数加重平均直径を有する酸化鉄ナノ粒子（２５ｍｇＦｅ／ｍｌ）から０．８ｍｌを２００ｍｌビーカーに添加した。クロロホルムを換気フード内で蒸発させ、酸化鉄ナノ粒子の乾燥コーティングを残した。酸化鉄ナノ粒子に、３．７グラムのＳｐａｎ（登録商標）６０、３．７５グラムのスクアレン、および３グラムのＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６０℃に予熱した水浴中で３０分間超音波処理した。別に、１リットルガラス瓶中で、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した１，０００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物溶液に３９グラムのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を添加することによって「水」相を調製した。水相を３０分間撹拌して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を完全に溶解させた。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の完全溶解後、９６ｍｌの水相を２００ｍｌビーカーに移し、６０℃に予熱した水浴中でインキュベートした。加熱された油相に、予熱された水相９６ｍｌを添加した。混合物を、ミルク状の外観を有する均質なコロイドが生成されるまで、ＶＷＲ（登録商標）２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して直ちに乳化した。続いて、２０，０００ｐｓｉでＬＭ１０マイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバに流体を通すことによってコロイドを処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学的直径が、０．２の多分散指数で５２ｎｍになるまで通した。マイクロ流動化したＬＩＯＮ試料を、２００ｎｍの孔径のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルターで最終濾過した。
７９－００６－Ｂと表示された脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造
これらのＬＩＯＮは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン、３７ｍｇ／ｍｌのＳｐａｎ（登録商標）６０、３７ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド、０．２ｍｇ／ｍｌの５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物を含む。ＬＩＯＮは、以下の手順を用いて作製した。
クロロホルム中の５ｎｍの数加重平均直径を有する酸化鉄ナノ粒子（２５ｍｇＦｅ／ｍｌ）から０．８ｍｌを２００ｍｌビーカーに添加した。クロロホルムを換気フード内で蒸発させ、酸化鉄ナノ粒子の乾燥コーティングを残した。酸化鉄ナノ粒子に、３．７グラムのＳｐａｎ（登録商標）６０、３．７５グラムのスクアレン、および３グラムのＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６０℃に予熱した水浴中で３０分間超音波処理した。別に、１リットルガラス瓶中で、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した１，０００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物溶液に３９グラムのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を添加することによって「水」相を調製した。水相を３０分間撹拌して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を完全に溶解させた。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の完全溶解後、９６ｍｌの水相を２００ｍｌビーカーに移し、６０℃に予熱した水浴中でインキュベートした。加熱された油相に、予熱された水相９６ｍｌを添加した。混合物を、ミルク状の外観を有する均質なコロイドが生成されるまで、ＶＷＲ（登録商標）２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して直ちに乳化した。続いて、２０，０００ｐｓｉでＬＭ１０マイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバに流体を通すことによってコロイドを処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学的直径が、０．２の多分散指数で５９ｎｍになるまで通した。マイクロ流動化したＬＩＯＮ試料を、２００ｎｍの孔径のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルターで最終濾過した。
７９－０１１と表示された脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造
これらのＬＩＯＮは、９．４ｍｇ／ｍｌのスクアレン、９．３ｍｇ／ｍｌのＳｐａｎ（登録商標）６０、９．３ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、７．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド、０．０５ｍｇ／ｍｌの２５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物を含む。ＬＩＯＮは、以下の手順を用いて作製した。
クロロホルム中の２５ｎｍの数加重平均直径を有する酸化鉄ナノ粒子（２５ｍｇＦｅ／ｍｌ）から０．２ｍｌを２００ｍｌビーカーに添加した。クロロホルムを換気フード内で蒸発させ、酸化鉄ナノ粒子の乾燥コーティングを残した。酸化鉄ナノ粒子に、０．９３グラムのＳｐａｎ（登録商標）６０、０．９４グラムのスクアレン、および０．７５グラムのＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６０℃に予熱した水浴中で３０分間超音波処理した。別に、１リットルガラス瓶中で、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した１，０００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物溶液に１０グラムのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を添加することによって「水」相を調製した。水相を３０分間撹拌して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を完全に溶解させた。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の完全溶解後、９９ｍｌの水相を２００ｍｌビーカーに移し、６０℃に予熱した水浴中でインキュベートした。加熱された油相に、予熱された水相９６ｍｌを添加した。混合物を、ミルク状の外観を有する均質なコロイドが生成されるまで、ＶＷＲ（登録商標）２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して直ちに乳化した。続いて、２０，０００ｐｓｉでＬＭ１０マイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバに流体を通すことによってコロイドを処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学的直径が、０．２の多分散指数で６０ｎｍになるまで通した。マイクロ流動化したＬＩＯＮ試料を、２００ｎｍの孔径のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルターで最終濾過した。
７９－０１４－Ａと表示された脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造
これらのＬＩＯＮは、９．４ｍｇ／ｍｌのスクアレン、０．６３ｍｇ／ｍｌのＤｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４（トリミリスチン）、９．３ｍｇ／ｍｌのＳｐａｎ（登録商標）６０、９．３ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、７．５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド、０．０５ｍｇ／ｍｌの１５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物を含む。ＬＩＯＮは、以下の手順を用いて作製した。
クロロホルム中の１５ｎｍの数加重平均直径を有する酸化鉄ナノ粒子（２５ｍｇＦｅ／ｍｌ）から０．２ｍｌを２００ｍｌビーカーに添加した。クロロホルムを換気フード内で蒸発させ、酸化鉄ナノ粒子の乾燥コーティングを残した。酸化鉄ナノ粒子に、０．９３グラムのＳｐａｎ（登録商標）６０、０．９４グラムのスクアレン、０．０６３グラムのＤｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４、および０．７５グラムのＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６０℃に予熱した水浴中で３０分間超音波処理した。別に、１リットルガラス瓶中で、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した１，０００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物溶液に１０グラムのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を添加することによって「水」相を調製した。水相を３０分間撹拌して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を完全に溶解させた。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の完全溶解後、９６ｍｌの水相を２００ｍｌビーカーに移し、６０℃に予熱した水浴中でインキュベートした。加熱された油相に、予熱された水相９９ｍｌを添加した。混合物を、ミルク状の外観を有する均質なコロイドが生成されるまで、ＶＷＲ（登録商標）２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して直ちに乳化した。続いて、２０，０００ｐｓｉでＬＭ１０マイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバに流体を通すことによってコロイドを処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学的直径が、０．２の多分散指数で６０ｎｍになるまで通した。マイクロ流動化したＬＩＯＮ試料を、２００ｎｍの孔径のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルターで最終濾過した。
実施例２、ＬＩＯＮ製剤の安定性
ＬＩＯＮ製剤は熱安定性である。
様々な製剤（実施例１で調製した、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａおよび７９－００６－Ｂと表示されるＬＩＯＮ）を指示された温度の安定性チャンバに入れた。安定性は、動的光散乱を用いた粒径測定によって求めた。結果は、ＬＩＯＮ製剤が４、２５および４２℃で保存した場合に安定なコロイドを形成したことを示す。図１Ａ～図１Ｃに示されているように、ＬＩＯＮ製剤中の粒子は、様々な温度範囲で、かつ経時的に優れた安定性を示す。
ＬＩＯＮ製剤はＲＮＡをＲＮａｓｅから保護する。
この実施例は、ＬＩＯＮ製剤がＲＮＡをリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の触媒分解から保護することを示す。ＲＮａｓｅチャレンジからの保護をゲル電気泳動によってキャラクライズした。ＲＮＡ分子を、所定の窒素：リン酸（Ｎ：Ｐ）比で混合することによってＬＩＯＮ製剤と複合体化させた。様々なＬＩＯＮ製剤をＲＮＡに結合させ、複合体をＲＮａｓｅに曝露した。
１００μｌの裸の（製剤化されていない）ＲＮＡ、または１５のＮ：ＰでＬＩＯＮ製剤（実施例１で調製した、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａ、７９－００６－Ｂおよび７９－０１１と表示されるＬＩＯＮ）と複合体化したＲＮＡを、１０ｍｇ／Ｌに希釈したＲＮａｓｅ Ａ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０５３Ｌ）と共に室温で３０分間インキュベートした。３０分後、１ｍｇ／ｍｌに希釈したプロテイナーゼＫ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＯ０４９１）を添加し、すべての試料を１０分間にわたって５５℃に加熱した。ＲＮＡを抽出するために、０．１２ｍｌのフェノール：クロロホルム溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９３－０３１）をすべての試料に添加し、試料を１５秒間ボルテックスし、１３，３００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。２０μｌの上清を抽出し、ＰＣＲチューブに移し、２０μｌのグリオキサール負荷色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ８５５１）を各チューブに添加した。すべての試料を５０℃で２０分間加熱した。２５０ｎｇのＲＮＡを含有する試料を、ゲル電気泳動箱中のＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｍａｘ Ｇｌｙ Ｇｅｌ Ｐｒｅｐランニングバッファー（アンビオン、ＡＭ８６７８）に浸漬した１％アガロースゲルのウェルにロードした。ゲルを１２０Ｖで４５分間流し、ゲル記録システムで画像化した。この結果を表２に示す。
図２は、裸の（製剤化されていない）ＲＮＡと比較して、１５の窒素：リン酸（Ｎ：Ｐ）比でＲＮＡ分子と複合体化した例示的なＬＩＯＮ製剤（実施例１で調製した、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａ、７９－００６－Ｂおよび７９－０１１と表示されるＬＩＯＮ）のゲル電気泳動を示している。図２は、ＲＮａｓｅの作用に対してＬＩＯＮ製剤によって保護されたＲＮＡの安定性を示す。図２に示すように、ＲＮａｓｅで処理した裸のＲＮＡ（ＬＩＯＮ製剤と複合体を形成していない）は完全に破壊されたが、全てのＬＩＯＮ製剤は複合体を形成しているＲＮＡを保護した。
実施例３、タンパク質発現のためのＬＩＯＮ製剤の使用－分泌胚性アルカリホスファターゼ「ＳＥＡＰ」発現
この実施例は、ＬＩＯＮ製剤が高レベルの分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現を駆動することを示す。目的のタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ分子をＬＩＯＮ製剤と複合体化させ、これを生物の細胞の細胞質に送達した。メッセンジャーＲＮＡは、細胞内翻訳を受け、目的のタンパク質を産生した。弱毒化複製アルファウイルスであるベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、ＴＣ－８３のサブゲノムを、ＶＥＥ構造タンパク質の代わりに分泌胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を用いることによって改変した。
ＳＥＡＰをコードする修飾レプリコンＲＮＡ（ＲＮＡ－ＳＥＡＰ）１μｇを、７９－００４（１０ｎｍ、実施例１）と表示されたＬＩＯＮ製剤と、１５のＮ：Ｐで複合体化させ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に筋肉内投与した（５０μｌ）。マウスから一定時間ごとに採血し、－１（注射前）、３、５、７、９、１１、１３、１５および２０日目にＳＥＡＰのマウス血清をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。注射後の数日間にわたるマウスにおけるＳＥＡＰ発現の結果を図３Ａに示す。
図３Ａは、メッセンジャーＲＮＡと複合体化したＬＩＯＮ製剤が、長期間（注射後２０日間）にわたって、ロバストなレベルの分泌タンパク質を発現し得ることを示す。
コア無機粒子のサイズの影響
ＲｅｐＲＮＡをコードするＳＥＡＰ（１μｇ）を、７９－００４、７９－００６－Ａ、または７９－００６－Ｂと表示されたＬＩＯＮ製剤（様々なＳＰＩＯサイズを有する、実施例１を参照）と１５のＮ：Ｐ比で複合体化し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／製剤）に筋肉内投与（５０μｌ）した。マウスから一定時間ごとに採血し、４、６、８、１１、１３、１５および２０日目にＳＥＡＰのマウス血清をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。注射後の数日間にわたるマウスにおけるＳＥＡＰ発現の結果を図３Ｂに示す。対数変換データを、二元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって分析した。
図３Ｂは、様々な平均直径を有するコア無機ＳＰＩＯナノ粒子を有するＬＩＯＮ製剤がすべて、長期間にわたってインビボで同様のロバストなレベルのタンパク質発現を誘導するように機能し、それらの製剤間でＳＥＡＰ発現に統計的有意差がなかったことを示す。したがって、ＳＰＩＯ粒子の直径は、ＬＩＯＮ製剤がｒｅｐＲＮＡ分子を送達する能力およびｒｅｐＲＮＡ分子からのタンパク質発現レベルに影響を与えないように見受けられた。
ＬＩＯＮ送達対ＮＬＣ送達
改変されたｒｅｐＲＮＡをコードするＳＥＡＰ（ＲＮＡ－ＳＥＡＰ）（１μｇ）を、７９－００４と表示されたＬＩＯＮ製剤（１０ｎｍ、実施例１）、または対照としてのナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）と、１５のＮ：Ｐで複合体化させた。得られたＲＮＡ－ＬＩＯＮ製剤をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に筋肉内投与した（５０μｌ）。マウスから一定時間ごとに採血し、マウス血清をＳＥＡＰについてアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。注射後の数日間にわたるマウスにおけるＳＥＡＰ発現の結果を図３Ｃに示す。
対照は、乳化時に半結晶性コアを形成する固体脂質（グリセリルトリミリステートダイナサン）および液体油（スクアレン）の混合物であるナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｒａｓｍｕｓら’’Ａ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｓｉｎｇｌｅ，Ｌｏｗ－Ｄｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｚｉｋａ，’’Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２６（１０）：２５０７－２２（２０１８）のＮＬＣに関するより詳細な説明を参照されたい。
図３Ｃに示されるように、ＬＩＯＮ製剤と複合体化されたｒｅｐＲＮＡをコードするＳＥＡＰは、ＮＬＣと複合体化されたｒｅｐＲＮＡをコードするＳＥＡＰと比較して、各時点においてより高いＳＥＡＰ発現レベルをもたらした。このことは、ＮＬＣと比較して、ＬＩＯＮ製剤がｒｅｐＲＮＡ分子のより良好な送達ビヒクルとして機能したことを示している。また、図３Ｃに示すように、ＳＥＡＰ発現は８日目頃にピークに達し、２１日目までに対照ＮＬＣ群についてはベースラインに戻り、ＬＩＯＮ群については０．５ｌｏｇのベースラインに戻った。
ＲＮＡ複合体化濃度の影響
ＲｅｐＲＮＡをコードするＳＥＡＰを、１５のＮ：Ｐ比でＬＩＯＮ製剤（実施例１の７９－００６Ａと同様の１５ｎｍ）と、複合体化濃度を変化させながら、複合体化させた。得られたＲＮＡ－ＬＩＯＮ製剤をＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内投与した（ｎ＝５／製剤）。筋肉内注射後、一定時間ごとにマウスから採血し、マウス血清をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。注射後の数日間にわたるマウスにおけるＳＥＡＰ発現の結果を図３Ｄに示す。
ＲＮＡ複合体の濃度は、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ複合体のサイズに影響を与えた。１０倍高いｒｅｐＲＮＡ濃度（４００ｎｇ／μｌ対４０ｎｇ／μｌ）を有するＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ複合体は、約４１％大きいＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰ複合体および２４％広いサイズ分布をもたらした。
図３Ｄに示すように、４００ｎｇ／μｌ対４０ｎｇ／μｌの濃度を有するＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ複合体について、（マン・ホイットニー検定を使用して）各時点での平均ＳＥＡＰ濃度に有意差はなく、複合体濃度がｒｅｐＲＮＡ送達およびタンパク質発現に実質的な影響を及ぼさなかったことが示唆された。いずれのｒｅｐＲＮＡ濃度（４００ｎｇ／μｌ対４０ｎｇ／μｌ）についても、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰ製剤で免疫したマウスの血清中のＳＥＡＰ発現濃度は、筋肉内注射後７日目にピークに達し、２１日目までにバックグラウンドレベルに戻った。
Ｎ：ＰおよびＲＮＡ用量の影響
ＲｅｐＲＮＡをコードするＳＥＡＰ（それぞれ０．５μｇ、２．５μｇおよび１２．５μｇで）を、様々なＮ：Ｐ比でＬＩＯＮ製剤（実施例１の７９－００６Ａと同様、１５ｎｍ）と複合体化させた。得られたＲＮＡ－ＬＩＯＮ製剤をＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内投与した（ｎ＝４／製剤）。筋肉内注射の７日後にマウスから採血し、マウス血清をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。Ｎ：Ｐ比の関数としてのマウスにおけるＳＥＡＰ発現の結果を図３Ｅに示す。
図３Ｅは、ＬＩＯＮ製剤化ｒｅｐＲＮＡの生物活性に対するＮ：Ｐ比およびＲＮＡ用量の影響を示す。
実施例４、ワクチン送達のためのＬＩＯＮ製剤の使用
この実施例は、ＬＩＯＮ複合体化ＲＮＡから発現される抗原が高度に免疫原性であり、抗体を誘導することを示す。ワクチン抗原をコードするＲＮＡ分子をＬＩＯＮ製剤と複合体化し、これを生物の細胞の細胞質に送達した。ＲＮＡは細胞内翻訳を受け、ワクチン抗原を産生した。生物は、抗原に対する抗体を産生することによって免疫応答を開始した。
スパイク「Ｓ」タンパク質全長の形態をコードする自己複製「ｓｒ」ＲＮＡ調製物をＬＩＯＮと混合し、製剤化した。マウスを、１０、１および０．１μｇのｓｒＲＮＡの投与量レベルで製剤化された試験品を用いて、筋肉内に１回免疫した。免疫後１４日目に、動物から採血し、血清を調製し、使用するまで－２０℃でアリコートに保存した。ポリクローナルＩｇＧ標準を使用して、切断型受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質断片に対する抗原特異的ＩｇＧ濃度を測定した。結果を図４Ａに示す。図４Ａに見られるように、様々な用量のＲＮＡ（それぞれ１０、１、および０．１μｇ）でＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ製剤から発現された抗原はすべて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメインに対して強くロバスト免疫応答を誘導した。非常に低濃度のＲＮＡ（０．１μｇ）であってもロバストな力価が見られた。
コア無機粒子のサイズの影響；ＬＩＯＮ送達対ＮＬＣ送達
ＳＰＩＯのサイズが異なる様々なＬＩＯＮ製剤（それぞれ、ＬＩＯＮ－１０、ＬＩＯＮ－１５、ＬＩＯＮ－２５、ＬＩＯＮ－５）または対照としてのナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）と複合体化したＲｅｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ ＲＮＡを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの筋肉内に投与した。ＬＩＯＮ－１０、ＬＩＯＮ－１５、ＬＩＯＮ－２５、およびＬＩＯＮ－５と表示された製剤は、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａ、７９－００６－Ｂ、７９－０１１、７９－０１４－Ａと表示されたＬＩＯＮ組成物に対応する（下記の表１を参照され、併せて実施例１も参照されたい）。筋肉内注射後、一定時間ごとにマウスから採血し、抗スパイク（抗Ｓ）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＩｇＧ濃度をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。注射後数週間にわたるＣ５７ＢＬ／６マウスの血清中の抗Ｓ ＩｇＧ濃度の結果を図４Ｂに示す。
図４Ｂは、異なる平均直径を有するコア無機ＳＰＩＯナノ粒子を含むＬＩＯＮ製剤がすべて、抗原の生物学的活性を保持するように作用し、長期間にわたってインビボでロバストなレベルの免疫応答を誘導したことを示す。さらに、ＬＩＯＮ製剤と複合体化した全てのＲｅｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ ＲＮＡは、対照ＮＬＣと複合体化したものよりも大きな応答を生じた。
混合方向および希釈の影響
混合方向（ＬＩＯＮをＲＮＡに混合する対ＲＮＡをＬＩＯＮに混合する）および希釈剤（スクロース（Ｓｕｃ）を使用した１：２００希釈対デキストロース（Ｄｅｘ）を使用した１：２００希釈）を変えることによって調製した様々なＬＩＯＮ製剤と複合体化したＲｅｐＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ ＲＮＡを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内投与した。筋肉内注射後１４日目（各群について最初のバー）または２１日目（各群について２番目のバー）にマウスから採血し、抗ＳｐｉｋｅＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。結果を図４Ｃに示す。
図４Ｃに示すように、混合の方向（ＬＩＯＮをＲＮＡに混合するか、またはＲＮＡをＬＩＯＮに混合するかにかかわらず）は、抗原の生物学的活性およびＲＮＡを送達するＬＩＯＮ製剤の能力に影響を及ぼさなかった。さらに、ＬＩＯＮ－ＲＮＡ製剤の希釈剤（デキストロースまたはスクロース）を変えることは、抗原の生物学的活性に影響を及ぼさなかった。
実施例５、ＬＩＯＮ製剤のイメージング
この実施例は、ＬＩＯＮ製剤がＭＲＩイメージングのためのシグナルを放出することができることを示す。ＲＮＡ分子に複合体化した、または分子とナノ粒子表面にコンジュゲートした、もしくは脂質コアにカプセル化された分子とコンジュゲートしたＬＩＯＮ製剤を生物に投与した。その後、生物をイメージング機器に入れ、電磁波に曝露すると、ＬＩＯＮナノ粒子はコントラストを高める働きをした。結果を図５Ａ～図５Ｂに示す。
図５Ａ～図５Ｂは、ＬＩＯＮ製剤中の鉄濃度の関数としての緩和時間Ｔ１（図５Ａ）およびＴ２（図５Ｂ）の増加を示す。図５Ａ～図５Ｂで特定されるＬＩＯＮ製剤の組成は、ＬＩＯＮ組成物中の酸化鉄の濃度が図中のＸ軸に基づいて変化したことを除いて、実施例１に従って、それぞれ７９－００４、７９－００６－Ａ、７９－００６－Ｂ、７９－０１１、７９－０１４－Ａ（以下の表１を参照）と表示されたＬＩＯＮ組成物のそれぞれに対応する。
図５は、ＬＩＯＮ粒子７９－００４、７９－００６－Ａ、７９－００６－Ｂ、７９－０１１および７９－０１４－Ａを使用した磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）におけるＴ１およびＴ２コントラストの両方を向上させる能力をまとめたものである。ｒ１、ｒ２緩和度およびｒ２／ｒ１比を表１にまとめる。
Figure 2023518976000002
 表１様々なコア直径を有する鉄酸化物コアを含有するＬＩＯＮ製剤のＭＲ緩和度（ｒ１およびｒ２）およびｒ２／ｒ１比
実施例６、抗体発現のためのＬＩＯＮ製剤の使用
この実施例は、抗体がＬＩＯＮ複合体ＲＮＡから発現され得ることを示す。抗体をコードするＲＮＡ分子をＬＩＯＮ製剤と複合体化し、生物の細胞の細胞質に送達した。メッセンジャーＲＮＡは、細胞内翻訳を受け、抗体を産生した。
ジカウイルスを標的とするモノクローナル抗体をコードするレプリコンＲＮＡを含むＬＩＯＮ製剤
図６Ａは、ＬＩＯＮ製剤のＳＰＩＯサイズが異なる、ＬＩＯＮ／抗体配列ＲＮＡ（４０μｇＲＮＡ）製剤（それぞれ、ＬＩＯＮ－１０、ＬＩＯＮ－１５、ＬＩＯＮ－２５、ＬＩＯＮ－５）で動物を免疫した後に産生されるジカウイルスを認識するヒトモノクローナル抗体（ＺＩＫＶ－１１７）のロバストなレベルを示す。免疫化の７日後に動物から採血した。結果は、ＬＩＯＮ製剤を使用して生体内で抗体を産生することができることを示している。抗体配列ＲＮＡを用いて製剤化されたナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）を対照として使用した。図６Ａに示すように、ＬＩＯＮ製剤と複合体化した抗体配列ＲＮＡは、ＮＬＣと複合体化した抗体配列ＲＮＡと比較して、各ＳＩＰＯサイズでより高い全レベルのＺＩＫＶ－１１７発現をもたらした。このことは、ＮＬＣと比較して、ＬＩＯＮ製剤が抗体配列ＲＮＡのより良好な送達ビヒクルとして機能したことを示している。
ウサギモデルにおける母体免疫化のためのＨＩＶおよびＺＩＫＶワクチン候補を含むＬＩＯＮ製剤
図６Ｂおよび図６Ｃは、生理食塩水（図６Ｂ）またはＬＩＯＮを用いて製剤化されたＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体をコードするｒｅｐＲＮＡ（図６Ｃ）で筋肉内経路によって免疫化された成体雌妊娠ウサギの抗ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４ＩｇＧ抗体の大きさおよび動態を示す。図６Ｄおよび図６Ｅは、生理食塩水（図６Ｄ）またはＬＩＯＮを用いて製剤化されたＺＩＫＶ ｐｒＭ－Ｅ抗原をコードするｒｅｐＲＮＡ（図６Ｅ）を筋肉内経路によって免疫化した成体雌妊娠ウサギの抗ＺＩＫＶ Ｅ ＩｇＧ抗体の大きさおよび動態を示す。１週目付近の網掛け領域は、ウサギが飼育された期間を示す。６週目と７週目の間の網掛け領域は、仔が送達された期間を示す。矢印は免疫化時点（０、４および１１週目）を示す。結果は、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ製剤から発現された抗原が強力かつロバストな免疫応答を誘導し、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ製剤の両方について強いレベルの抗体を産生したことを示している。
図６Ｆおよび図６Ｇは、雌ウサギ（雌のウサギ）から仔ウサギ（ウサギの乳児）への抗ＳＯＳＩＰ ＩｇＧの子宮内移行の評価の結果を示す。図６Ｆは、送達時の仔ウサギにおける抗ＳＯＳＩＰ ＩｇＧ応答を示す。１つの処置群あたりそれぞれ同腹仔由来の最低２匹の仔ウサギを安楽死させて、子宮内抗体移入を評価した。図６Ｇは、雌ウサギの抗体レベルと対応する仔ウサギとの間の正の相関（ピアソンｒ＝０．９４）を示すＸＹプロットを示す。これらの図は、飼育雌ウサギから仔ウサギへの抗体の物質移動を示している。
図６Ｈおよび図６Ｉは、既存の母体抗体との関連におけるワクチン誘導性応答を示す。仔ウサギの血清抗ＳＯＳＩＰ ＩｇＧレベルを、追加免疫の４週間後（仔を離乳した３週間後）に収集した。生理食塩水を投与されていない雌ウサギ由来の仔ウサギまたはＬＩＯＮ＋ＲＮＡ－ｐｒＭ／Ｅを投与されている雌ウサギ由来の仔ウサギは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４に対する既存の母体抗体について陰性（－）としてグループ分けされる。ＬＩＯＮ＋ＲＮＡ－ＳＯＳＩＰまたはＡｄｄａＶａｘアジュバント添加組換えＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４を投与された雌ウサギ由来の仔ウサギは、ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４に対する既存の母体抗体について陽性（＋）としてグループ分けされる。データは、既存の抗体は抗体のワクチン媒介誘導に有意な影響を及ぼさず、仔ウサギ内の受動的に移入された抗体は仔ウサギ内の抗体のワクチン媒介誘導に悪影響を及ぼさなかったことを示す。
実施例７、非ヒト霊長類におけるワクチン送達のためのＬＩＯＮ製剤の使用－単回用量複製ＲＮＡワクチンは非ヒト霊長類においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を誘導する
この実施例は、ワクチンの安定性、送達および免疫原性を増強するように設計された新規脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）を用いて製剤化されたＲＮＡレプリコンを含む安定で高度に免疫原性のワクチン候補であるｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓの開発を説明するものである。
ワクチンの設計、調製、およびキャラクタリゼーション
重度の急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＣＯＶＩＤ－１９）の感染によって引き起こされるコロナウイルス感染症２０１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、世界的なパンデミックと宣言されている。コロナウイルスは、大きなゲノム、ならびに４つの主要な構造タンパク質であるスパイク（Ｓ）、エンベロープ、膜およびヌクレオカプシドに対するオープンリーディングフレームを有する、エンベロープされた一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。Ｓタンパク質は、肺胞の上皮細胞などの様々な細胞型の表面でコロナウイルスのアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への結合を媒介する。関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶに対して開発された実験ワクチンのほとんどが、ロバストな中和応答を誘導することを目的として、Ｓタンパク質またはその受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を組み込んだことから、保護は、Ｓタンパク質に対する中和抗体によって媒介され得る。以前の報告では、ヒト中和抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶおよび中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－ＣｏＶでチャレンジしたマウスを保護したことが示されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護が抗Ｓ抗体を介して媒介され得ることが示唆されている。さらに、２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）応答を駆動するＳＡＲＳワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶによるチャレンジ後の肺免疫病理の増強に関連している一方で、１型Ｔヘルパー（Ｔｈ１）偏向免疫応答を有するものは、免疫病理の非存在下での保護の増強に関連している。したがって、有効なＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的中和抗体を含むＴｈ１偏向免疫応答を誘導する必要があり得る。
核酸ワクチンは、標的抗原の遺伝子配列のみを必要とし、病原体培養（不活化または生弱毒化ワクチン）またはスケールされた組換えタンパク質産物への依存を排除する、迅速なワクチン設計のための理想的なモダリティとして台頭してきている。さらに、核酸ワクチンは、ウイルスベクターワクチンの免疫原性を弱め得る既存の免疫を回避することができる。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いて製剤化されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチンおよびエレクトロポレーションによって送達されたＤＮＡワクチンを用いて臨床試験が開始された。しかしながら、ｍＲＮＡワクチンおよびＤＮＡワクチンは、不活性化ワクチンおよび組換えサブユニットタンパク質ワクチンと同様に、典型的には、有効になるために長期間にわたる複数回の投与を必要とするので、単回の免疫化後にヒトにおいて保護の有効性を誘導することができない可能性がある。
ウイルス由来レプリコンＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）ワクチンは、１９８９年に最初に報告され、ウイルス様ＲＮＡ粒子（ＶＲＰ）、インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ、およびプラスミドＤＮＡの形態で送達されている。ｒｅｐＲＮＡでは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体（最も一般的にはアルファウイルス属由来）をコードするオープンリーディングフレームは手付かずであるが、構造タンパク質遺伝子は抗原コード遺伝子で置き換えられる。従来のｍＲＮＡワクチンは、入ってくるＲＮＡ分子から直接翻訳されるが、細胞へのｒｅｐＲＮＡの導入は、抗原コードＲＮＡの継続的な生合成を開始し、体液性および細胞性免疫応答を有意に増強する発現および持続時間の劇的な増加をもたらす。さらに、ｒｅｐＲＮＡワクチンは、ウイルス感知ストレス因子がトリガーされ、Ｔｏｌｌ様受容体およびレチノイン酸誘導性遺伝子（ＲＩＧ）－Ｉを介して自然経路が活性化されて、インターフェロン、炎症誘発性因子および抗原提示細胞の走化性を産生し、抗原クロスプライミングを促進するという点で、アルファウイルス感染を模倣する。結果として、ｒｅｐＲＮＡはそれ自体のアジュバントとして作用し、通常、複数回かつ１，０００倍高い用量を必要とする従来のｍＲＮＡと比較して、単回用量後により強い免疫応答を誘発する。
したがって、ｒｅｐＲＮＡワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９のようなパンデミックの大流行を止めるためのワクチン候補として選ばれたが、これは、ｒｅｐＲＮＡワクチンが、ある程度の研究実績があり、多くの場合、効果的であるために１回の投与しか必要とせず、より少ない回数かつより少ない用量で迅速に保護レベルの免疫を誘導すると同時に、大規模な製造における負荷を軽減する可能性を有し得るからである。
図７Ａに示すように、全長Ｓ（ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質由来の配列を組み込んだｒｅｐＲＮＡを生成した。ｃ末端ｖ５エピトープタグに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離体Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）の２１，５３６から２５，３８４の位置に対応するＳ１ドメイン、Ｓ２ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（ＣＤ）ドメインを含むコドン最適化された全長スパイク（Ｓ）オープンリーディングフレームを、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのＴＣ－８３株の４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１－４）遺伝子をコードするアルファウイルスレプリコンにクローニングした。ＲＮＡ転写およびキャッピングの後、ｒｅｐＲＮＡ－ＣＯＶ２ＳをＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、陽性対照および陰性対照として組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質（ｒＣｏＶ２－Ｓｐｉｋｅ）およびｒｅｐＲＮＡ－ＧＦＰをそれぞれ使用して、免疫検出のために回復期のヒト血清または抗ｖ５のいずれかを使用して、抗ｖ５免疫蛍光法およびウエスタンブロットによって細胞を分析した。図７Ｂおよび図７Ｃの結果は、ＢＨＫ細胞におけるｖ５タグ付きＳタンパク質の効率的な発現を示す。図７Ｃはまた、ＣＯＶＩＤ－１９の発症の２９日後に回収された回復期の血清を免疫検出試薬として利用して、天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫血清と反応するＢＨＫ細胞におけるＳタンパク質の内因性発現を示す。
ＬＩＯＮを用いたｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓの製剤化
次に、ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを、ワクチンの安定性およびワクチンの細胞内送達を増強するように設計された例示的な脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）を用いて製剤化した。ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ製剤が抗体およびＴ細胞応答を迅速に生成する能力をマウスにおいて評価した。
ＬＩＯＮ組成物を調製するための一般的な製造法および材料は、実施例１に開示されたものに従った。例示的なＬＩＯＮは、疎水性油相に埋め込まれた１５ｎｍの超常磁性酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子（ＳＰＩＯ）を有する非常に安定したカチオン性スクアレンエマルジョンである。図８Ａは、ＬＩＯＮをｒｅｐＲＮＡと混合した後の例示的なＬＩＯＮおよびそのワクチン複合体の形成の簡単なグラフィック描写である。スクアレンはワクチンアジュバントである。ＳＰＩＯナノ粒子は、ＭＲＩ造影剤および静脈内鉄補充療法における臨床用途を有しており、ＳＰＩＯの独特の非線形磁気特性によって、画像化、標的化および治療用途の範囲におけるそれらの新規な用途も可能になった。ＬＩＯＮはまた、カチオン性脂質１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）も含んでおり、これによって、１：１（ｖ／ｖ）混合工程によって混ぜ合せた場合に、ＲＮＡ分子との静電的会合が可能になった。実施例１に示すように、本実施例のＬＩＯＮは、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定された強度加重平均径が５２ｎｍ（ＰＤＩ＝０．２）である。図８Ｂに示すように、ＬＩＯＮ製剤は、４℃および２５℃で保存した場合、少なくとも３ヶ月間コロイド安定性であった。
ＬＩＯＮをｒｅｐＲＮＡと混合すると、ＬＩＯＮの表面上のアニオン性ｒｅｐＲＮＡ分子とカチオン性ＤＯＴＡＰ分子との間の静電的会合が即時複合体形成を促進する。粒径がＤＬＳによって検出される９０ｎｍの強度加重平均直径へ増大したことによって、ＬＩＯＮ－ｒｅｐＲＮＡ複合体の形成が確認された（図８Ｃを参照のこと）。図８Ｄに示されるように、濃縮されたＲＮａｓｅチャレンジ後のフェノール－クロロホルム処理によって抽出されたＬＩＯＮ製剤化ｒｅｐＲＮＡ分子のゲル電気泳動分析は、製剤化されていないｒｅｐＲＮＡ（裸）と比較して、ＲＮａｓｅ触媒分解からの実質的な保護を示した。製剤化されたワクチンの短期安定性を評価するために、４℃および２５℃で混合および貯蔵した１、４および７日後に、フェノール－クロロホルム処理によって抽出されたｒｅｐＲＮＡのゲル電気泳動および複合体の粒径によって決定される、ｒｅｐＲＮＡの完全性および複合体の安定性を評価した。図８Ｅおよび図８Ｆに示すように、ＬＩＯＮはすべての時点でｒｅｐＲＮＡ分子の最大の完全性を維持し（図８Ｅ）、複合体はそのサイズを維持し（図８Ｆ）、製剤化されたワクチン複合体が混合後少なくとも１週間安定であることを示した。
マウスにおけるＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓの送達
ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体をマウスに投与した。６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、１０、１、または０．１μｇのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを筋肉内経路を介して投与した。初回免疫の１４日後、血清を採取した。図９Ａに示されるように、１０μｇまたは１μｇのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２ＳによるＣ５７ＢＬ／６マウスの単回筋肉内免疫化は、免疫後１４日までに１００％のセロコンバージョンおよびロバストな抗Ｓ ＩｇＧレベルを誘導し、平均結合力価はそれぞれ２００および１０９μｇ／ｍｌであり、０．１μｇ用量では部分的なセロコンバージョン（２／５）を誘導した。図９Ｂに示されるように、１０μｇおよび１μｇの初回のみの用量はいずれも中和抗体を誘導し、シュードウイルス中和アッセイ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１シュードタイプ）によって測定した場合に、平均５０％阻害濃度（ＩＣ５０）がそれぞれ１：６４３および１：２２６であった。ＩｇＧ１と比較した場合、有意に高いＩｇＧ２ｃ応答によって示されるように（図９Ｃを参照のこと）、全ての用量がＴｈ１偏向免疫応答を誘導する一方で、より高いＩｇＧ２ｃ：ＩｇＧ１比によって示されるように（図９Ｄを参照のこと）、より高い用量がさらに多くのＴｈ１偏向応答を誘導する傾向があった。
ＳＡＲＳおよびＭＥＲＳで、特に抗体応答およびメモリーＢ細胞応答の存在が減少する際に見られるように、Ｔ細胞が保護に寄与する可能性のある役割を考慮して、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓに対するＴ細胞応答もマウスにおいて評価した。２８日目に、この同じマウスコホートに２回目の免疫化を行った。１２日後、脾臓および肺を採取し、Ｓタンパク質の重複する１５ｍｅｒペプチドライブラリーで刺激し、ＩＦＮ－γ応答を酵素結合免疫吸収スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって測定した。図９Ｅに示されるように、１０、１および０．１μｇの初回／ブーストを受けたマウスは、ロバストな脾臓Ｔ細胞応答を示し、平均ＩＦＮ－γスポット／１０６細胞はそれぞれ、１６９８、６５０および８０１であった。ロバストなＴ細胞応答も肺で検出され、群間で類似しており、平均ＩＦＮ－γスポット／１０６細胞がそれぞれ７５６、７８４および７７７であった（図９Ｆを参照のこと）。
高齢者はＣＯＶＩＤ－１９に対して最も脆弱であるが、この集団の免疫老化は有効なワクチン接種に対する障壁をもたらす。免疫原性に対する免疫老化の影響を評価するために、２、８、または１７月齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ－５／群）に、筋肉内経路を介して１０または１μｇのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを投与した。初回免疫から１４日後に血清を採取し、抗Ｓ ＩｇＧ濃度を測定した。図１０Ａに示すように、２月齢および８月齢のマウスと比較した場合、１７月齢のマウスにおいていずれの用量でも有意に低い抗体力価が観察され、最も免疫老化した集団では、十分な免疫を誘導するためにより高い用量および／または追加のブースター用量が必要とされ得ることが示唆された。２月齢マウスと８月齢マウスとの間で差は見られなかった。ＢＡＬＢ／Ｃマウスはワクチン接種後により多くのＴｈ２免疫偏向応答を発現する傾向があるが、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓは、ＢＡＬＢ／Ｃマウスのすべての年齢群において１を超えるＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比を誘導し（図１０Ｂおよび図１０Ｃを参照のこと）、Ｔｈ１偏向免疫応答を示した。重篤で生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９が、Ｔヘルパー応答のタイプに関係なく、高齢個体においてより一般的であることが見受けられ、重篤なＳＡＲＳが不十分なＴｈ１応答を伴うＴｈ２抗体プロファイルへの偏向に関連することを考えると、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓが、８月齢および２月齢のマウスにおいて、Ｔｈ２偏向ＢＡＬＢ／ｃ株においてさえ、強いＴｈ１偏向応答を誘導する能力は、このワクチン複合体の安全性および免疫原性に関して肯定的な徴候を示した。
非ヒト霊長類におけるＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓの送達
マウスにおいてＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体でロバストな免疫原性を達成した後、ワクチン接種に対する免疫応答においてヒトによりよく似ている非ヒト霊長類モデルにおいてワクチン複合体が強い免疫応答を誘導することができるかどうかを調べるために、豚テールマカク（Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）の免疫化を行った。
図１１Ａに示す投与計画では、３匹のマカクにＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体を、０週目に２５０μｇの単回用量で筋肉内経路を介して投与し、２匹のマカクに５０μｇの初回用量を０週目に投与し、４週目に追加用量を筋肉内経路を介して投与した。ワクチンの安全性および免疫原性をモニタリングするために、ワクチン接種後１０、１４、２８、および４２日目に血液を採取した。５０μｇ群は２８日目に追加免疫ワクチン接種を受け、１４日後に血液を採取した。初回ワクチン接種後４２日まで、動物において、ワクチン注射部位の反応も有害反応も見られなかった。
図１１Ｂに示されるように、初回免疫後１０、１４、２８および４２日目に採取した血清の、免疫前採血によって確立されたベースラインに対するＥＬＩＳＡ分析は、単回の２５０μｇ用量で免疫化された３匹のマカクすべてが１０日目という早い時期に血清転換され、抗Ｓ ＩｇＧ濃度は、これらの３匹の動物において４２日目までに４８、５１および６１μｇ／ｍｌに増加し続けることを示した。５０μｇのｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを受けたマカクはいずれも、単回投与後に血清転換したが、この同じ時点での２５０μｇ群における７、２０および４５μｇ／ｍｌと比較して、抗Ｓ ＩｇＧ濃度で有意に低い抗体応答を発現し、２８日目までに１および０．５μｇ／ｍｌであった（図１１Ｂを参照のこと）。しかしながら、ブースター免疫化の１４日後、５０μｇ群は、この時点で２５０μｇの初回のみの群と同様のレベルの抗Ｓ ＩｇＧ濃度（１８および３７μｇ／ｍｌ）を発現した（４８、５１、６１μｇ／ｍｌ）（図１１Ｂを参照のこと）。さらに、図１１Ｃに示されるように、３匹のマカクから得た血清は、インビトロで細胞のただ１回の２５０μｇ用量の中和シュードウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１シュードタイプ）形質導入により免疫化され、２８日目までに相互ＩＣ５０力価が１：３８、１：２０および１：４７で、４２日目までにレベルが１：４７２、１：１０８および１：１４９まで増加したのに対して、５０μｇ群は、ブースター免疫化後にのみ、同様のロバストなＩＣ５０力価を達成し、４２日目までに１：２１８および１：３５８のシュードウイルスＩＣ５０力価に達した。
ワクチン接種の２８日後および４２日後に採取した血清を、８０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ８０）によって野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＷＡ／２０２０の中和についてさらに分析し、自然感染の１５～６４日後に採取した回復期のヒトから得た血清の中和力価と比較した。図１１Ｄに示されるように、５０μｇおよび２５０μｇのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓによる単一の免疫化は、２８日目までにそれぞれ１：３２および１：６６の平均ＰＲＮＴ８０力価を誘導した。４２日目までに、平均ＰＲＮＴ８０力価は、５０μｇ群ではブースター免疫後に１：１７６に、初回のみの２５０μｇ群では１：２１１に有意に増加した。５匹全てのマカクが、７人の回復期のヒトにおいて測定された力価と同じ範囲内のＰＲＮＴ８０力価を発現し（１：２０未満から１：１２８０、発症後１５から６４日に採取）、５匹全てのワクチン接種マカク（１：１９７）と回復期のヒト（１：５１８）との間で平均中和力価に有意差はなかった（Ｐ＝０．２７、図１１Ｄ）。最近、血清中和力価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を中和したＩＣ５０力価として測定され、不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンによるワクチン接種後に再感染またはチャレンジしたアカゲザルで報告された。前者の報告では、１：８という低いＩＣ５０力価が再感染からの保護に関連していたが、後者では、１：５０という低いＩＣ５０力価がウイルス量の減少および肺病変からの保護に関連していた。これらのデータは、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２ワクチンによる２５０μｇの初回のみの免疫化または５０μｇの初回／ブースト免疫化が、非ヒト霊長類を感染および疾患から保護するのに十分な中和抗体のレベルを誘導することができることを示唆している。
様々な感染症および癌に対するＲｅｐＲＮＡワクチンは、臨床試験において安全かつ強力であることが示されており、ＬＩＯＮなどの有効な合成製剤と共に使用される場合、ｒｅｐＲＮＡの無細胞かつ潜在的に高度にスケーラブルな製造プロセスは、ｍＲＮＡを超えるさらなる利点を示した。ワクチンはストックすることができ、必要に応じて現場で組み合わせることができるので、２バイアルのアプローチは、ＲＮＡをカプセル化するＬＮＰ製剤を超える有意な製造および流通の利点を提供するであろう。さらに、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ－２複合体は、マウスにおいて強いＳ特異的Ｔ細胞応答を誘導した。ヒトが関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶに自然感染した後、中和抗体およびメモリーＢ細胞応答は、一部の個体では短命（約３年）であるが、メモリーＴ細胞は少なくとも６年持続することが報告されており（５３）、このことは、長期応答における、特にロバストなメモリーＢ細胞応答を欠く個体におけるＴ細胞の潜在的な役割を示唆している。さらに、関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する抗ＳＴ細胞応答は、それぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染した正常マウスおよび老齢マウスのウイルスクリアランスに寄与する。
要するに、これらの結果は、ＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染からの迅速な免疫保護を誘導する大きな可能性を示している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して若齢集団と高齢集団の両方でロバストな免疫を１回の注射で誘導することができるスケーラブルなワクチンを広く流通させることによって、パンデミックの即時かつ効果的な封じ込めが実現するであろう。重要なことに、本ワクチンは、若齢マウスおよび高齢マウスの両方におけるＴｈ１偏向抗体およびＴ細胞応答、改善された回復に関連する属性、ならびに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染患者におけるより軽度の疾患転帰を誘導する。非ヒト霊長類における単回用量投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を強力に中和する抗体応答を誘発した。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から保護するためのワクチンとしてのＬＩＯＮ／ｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓ複合体の可能性を裏付けている。
実施例８、ウサギにおけるワクチン送達のためのＬＩＯＮ製剤の使用
動物：８匹のニュージーランド白ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（雄４匹および雌４匹）を、それぞれ雄２匹および雌２匹の２つの群に分けた。第１群には高用量ＬＩＯＮ－ＲＮＡ製剤（ＬＩＯＮ製剤を含む２５０μｇのｒｅｐＲＮＡ）を注射し、第２群には低用量ＬＩＯＮ－ＲＮＡ製剤（ＬＩＯＮ製剤を含む１０μｇのｒｅｐＲＮＡ）を注射した。
ワクチンの調製：ＬＩＯＮ担体およびｒｅｐＲＮＡ－ＣｏＶ２Ｓを、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび２０％スクロース緩衝液中、１５の窒素対リン酸モル比で複合体化し、２週間間隔で３回の０．５ｍＬ筋肉内投与量で試験動物に送達した。
ＥＬＩＳＡ：捕捉抗原として組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓを使用するＥＬＩＳＡによって抗原特異的ＩｇＧ応答を検出した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，ロチェスター、ニューヨーク州）を１μｇ／ｍＬ抗原または精製ポリクローナルＩｇＧの段階希釈でコーティングして、０．１ＭのＰＢＳ緩衝液中で標準曲線を作成し、０．２％ＢＳＡ－ＰＢＳでブロックした。次いで、連続した順序で、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中で洗浄した後、段階希釈した血清試料、抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（サウザン・バイオテック、アラバマ州バーミンガム）およびＴＭＢペルオキシダーゼ基質をプレートに添加し、続いてＨＣｌでクエンチした。プレートを４０５ｎｍで分析した（ＥＬＸ８０８、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、ウィノースキ、バーモント州）。各血清希釈点からの吸光度値を使用して力価を計算した。
図１２は、ＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化されたｒｅｐＲＮＡ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓを（それぞれ２５０μｇおよび１０μｇ用量レベルで）筋肉内注射したウサギにおける抗スパイクＩｇＧレベルを示す。実施例に示すように、動物は注射されたワクチンに対する免疫応答を迅速に開始した。４週目には、いずれの用量レベルでも抗体力価はほぼプラトーに達し、６週目または８週目には有意に増加しなかった。
実施例９、ワクチン送達のためのＬＩＯＮ製剤の使用－ＲＳＶワクチン
ＬＩＯＮ製剤と複合体化したＲＳＶ ｒｅｐＲＮＡ（２．５μｇ）を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内投与した。筋肉内注射の２８日後にマウス血液を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗ＦＩｇＧ濃度をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中の抗ＦＩｇＧレベルの結果を図１３Ａに示す。図１３Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスのいずれにおいても、レプリコン６４６によってＲＶＳＧタンパク質特異的応答が誘導された。
ＬＩＯＮ製剤と複合体化したＲＳＶ ｒｅｐＲＮＡ（２．５μｇ）を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内投与した。筋肉内注射の２８日後にマウス血液を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗Ｇ（Ａ２）ＩｇＧ濃度をアッセイすることによってタンパク質発現を調べた。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中の抗Ｇ（Ａ２）ＩｇＧレベルの結果を図１３Ｂに示す。図１３Ｂに示すように、ＲＶＳＧＡ２株タンパク質特異的応答は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてのみレプリコン６４５によって誘導された。
実施例１０、免疫調節ＲＮＡの送達のためのＬＩＯＮ製剤の使用
ＬＩＯＮ製剤は、ＲＮａｓｅから免疫調節ＲＮＡ ＰＡＭＰを保護する
ＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰを、例示的なＬＩＯＮ製剤（実施例１の７９－００６Ａと同様の１５ｎｍ）を用いて製剤化した。ＬＩＯＮ組成物を調製するための一般的な製造法および材料は、実施例１に開示されたものに従った。
図１４Ａ～図１４Ｂは、ＲＮａｓｅチャレンジからの保護をもたらしたＬＩＯＮ製剤へのＰＡＭＰの結合を示す。図１４Ａは、ＲＮＡゲル上で泳動し、遊離ＲＮＡについて評価した、様々なＮ：Ｐ複合体化比（それぞれ０．０４、０．２、１、５、および２５）でのＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体のゲル電気泳動分析を示す。図１４Ａに示すように、１、５および２５のＮ：Ｐ比のＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ製剤には遊離ＲＮＡは存在しなかった。図１４Ｂは、裸のＰＡＭＰ（製剤化されていないＰＡＭＰ）と比較した、ＲＮａｓｅ Ａによるチャレンジ後のＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体のゲル電気泳動分析を示す。ＲＮＡをＬＩＯＮから抽出し、アガロースゲルに流してＲＮＡ分解を評価した。この結果は、ＬＩＯＮへのＰＡＭＰの複合体化が、製剤化されていないＲＮＡ（裸）と比較して、ＲＮａｓｅ触媒分解からＲＮＡを保護したことを示す。
ＬＩＯＮによって送達されるＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰの免疫刺激
この実施例は、ＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体をＡ５４９－Ｄｕａｌ細胞に添加した場合の、ＬＩＯＮ製剤によって送達されるＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰの免疫刺激を示す。Ａ５４９－二重細胞は、ＳＥＡＰの発現を駆動するＩＦＮ－βプロモーターおよびルシフェラーゼの発現を駆動するＩＦＩＴ２プロモーターという２つのレポーター構築物を含む。
ＰＡＭＰを様々なＮ：Ｐ複合体化比（０．５、１．５、４．５、１３．５、４０．５、１２１．５）でＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化し、３．７ｎｇのＰＡＭＰ／ＬＩＯＮをＡ５４９－Ｄｕａｌ細胞に添加した。図１５は、ＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体による、上清中のＳＥＡＰ活性およびルシフェラーゼ活性によってそれぞれ測定されたＩＦＮ－βプロモーターおよびＩＦＩＴ２の活性化をＮ：Ｐ比の関数として示す。結果は、ＩＦＮ－βプロモーターおよびＩＦＩＴ２プロモーターの両方について、全てのＮ：Ｐ比でＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ製剤によって送達されたＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰの自然免疫刺激を示すが、４．５～４０．５のＮ：Ｐ比が、ＩＦＮ－βプロモーターに対してより良好な免疫刺激をもたらすように見受けられた。
ＬＩＯＮによって送達されるＲＩＧ－ＩアゴニストおよびＴＬＲ３アゴニストの免疫刺激
この実施例は、ＲＮＡ－ＬＩＯＮ複合体をＡ５４９－Ｄｕａｌ細胞に添加した場合の、ＬＩＯＮ製剤によって送達されるＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰおよびＴＬＲ３アゴニストであるＲｉｂｏｘｘｉｍの免疫刺激を例示する。
製剤化されていない（裸の対照）または８のＮ：Ｐ比でＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化された、ＰＡＭＰ（ＲＩＧ－Ｉアゴニスト）またはＲｉｂｏｘｘｉｍ（ＴＬＲ３アゴニスト）を、Ａ５４９－Ｄｕａｌ細胞に添加した。図１６Ａおよび図１６Ｂは、製剤化されていないＲＮＡと比較した、上清中のＳＥＡＰ活性およびルシフェラーゼ活性によってそれぞれ測定された、ＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ製剤またはＲｉｂｏｘｘｉｍ－ＬＩＯＮ製剤によるＩＦＮ－βプロモーター（図１６Ａ）およびＩＦＩＴ２（図１６Ｂ）の活性化を示す。結果は、自然免疫活性化を誘導するために働いたＬＩＯＮ製剤と複合体化することによって送達されるＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰおよびＴＬＲ３アゴニストであるＲｉｂｏｘｘｉｍの両方の自然免疫刺激を示し、それらの製剤化されていないネイキッドコントロールと比較して、ロバストなレベルのレポータータンパク質発現を誘発する。
図１６Ｃは、製剤化されていないＲｉｂｏｘｘｉｍと比較した、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ－ＬＩＯＮ製剤によるＩＦＩＴ２の活性化を、Ｒｉｂｏｘｘｉｍ用量レベルの関数として示す。結果は、試験した全ての用量レベルで、Ｒｉｂｏｘｘｉｍと複合体化したＬＩＯＮ製剤は、その製剤化されていない裸の対照と比較して、より高いレベルのＩＦＩＴ２活性化を誘導したが、より高い用量レベルのＲｉｂｏｘｘｉｍ－ＬＩＯＮ製剤は、より強いＩＦＩＴ２活性化を誘導したことを示す。
この実施例は、ＰＡＭＰ－ＬＩＯＮ複合体をＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内に送達した場合の、ＬＩＯＮ製剤によって送達されたＲＩＧ－ＩアゴニストであるＰＡＭＰの免疫刺激を示す。ＰＡＭＰを８のＮ：Ｐ比でＬＩＯＮ製剤を用いて製剤化し、０．２、１、または５μｇのＰＡＭＰ／ＬＩＯＮをＣ５７ＢＬ／６マウスの鼻孔に送達した。８時間後、マウスの鼻腔および肺を取り出し、直ちに凍結し、次いでＲＮＡを抽出し、様々な標的遺伝子についてＰＣＲに供した。
図１６Ｄは、ナイーブ対照と比較した処置マウスの鼻腔における自然免疫遺伝子の用量依存的誘導を示す。図１６Ｅは、処置マウスの肺における自然免疫遺伝子の活性化を示す。図１６Ｆは、ＰＡＭＰ：ＬＩＯＮ製剤を３日間連続して鼻腔内投与した場合、マウスが体重を維持したことを示す。
これらの結果は、ＬＩＯＮが鼻腔内接種による生物活性ＰＡＭＰの送達を支援したことを示しており、全ての試験用量レベルで、ＰＡＭＰと複合体化したＬＩＯＮ製剤は、製剤をマウスの鼻腔内に送達した場合、鼻腔および肺におけるタンパク質発現を上方制御した。
実施例１１、１０８－０１１と表示された水酸化アルミニウムコアを有する脂質無機ナノ粒子（ＬＩＯＮ）の製造
［０１１００］
これらのＬＩＯＮは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン、３７ｍｇ／ｍｌのＳｐａｎ（登録商標）６０、３７ｍｇ／ｍｌのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド、１ｍｇ Ａｌ／ｍｌの標的濃度のＴＯＰＯ被覆Ａｌ（ＯＯＨ）（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％）粒子、および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物を含む。ＬＩＯＮ粒子は、以下の手順で作製した。
５０ｍｌ遠心管に、１０ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）を加え、３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み水を除去し、等量のメタノールと交換した。粒子を再び３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、メタノール上清を除去し、等量のメタノールと交換した。この手順をさらに２回繰り返して、残留水を除去し、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）粒子をメタノール１０ｍｌ中に再懸濁させた。メタノールに分散したＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）のゼータ電位は＋１１．５ｍＶであった。この分散液に２５０ｍｇ／ｍｌのトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を１ｍｌ添加し、混合物を３７℃および毎分２５０回転に維持したオービタルシェーカー中に一晩放置した。これは、リガンド交換反応によってＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の表面にＴＯＰＯの層をコーティングするために行った。分散液中の過剰なＴＯＰＯをメタノールで洗浄することによって除去した。ＴＯＰＯ被覆Ａｌ（ＯＯＨ）粒子のゼータ電位は＋５ｍＶであると記録された。ゼータ電位の低下は、ＴＯＰＯによるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の表面修飾が成功したことを示している。このプロセスは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の親水性表面を疎水性に変換し、ひいてはＬＩＯＮの「油」相におけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の混和性を促進するために行われた。ＴＯＰＯ被覆Ａｌ（ＯＯＨ）分散液中のメタノールを、摂氏５５度で４５分間、換気フード内で蒸発させて、ＴＯＰＯ－Ａｌ（ＯＯＨ）粒子の乾燥コートを残した。乾燥したＴＯＰＯ－Ａｌ（ＯＯＨ）粒子に、３．７グラムのＳｐａｎ（登録商標）６０、３．７５グラムのスクアレンおよび３．０グラムのＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６５℃に予熱した水浴中で４５分間超音波処理した。
別に、１リットルガラス瓶中で、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で調製した５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物溶液に１９．５グラムのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を添加することによって「水」相を調製した。水相を３０分間撹拌して、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を完全に溶解させた。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０の完全溶解後、９２ｍｌの水相を２００ｍｌビーカーに移し、６５℃に予熱した水浴中でインキュベートした。
加熱された油相に、予熱された水相９２ｍｌを添加した。混合物を、ミルク状の外観を有する均質なコロイドが生成されるまで、ＶＷＲ（登録商標）２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して直ちに乳化した。続いて、３０，０００ｐｓｉでＭ１１０－ＰマイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバに流体を通すことによってコロイドを処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ）によって測定したｚ平均流体力学的直径が０．２４の多分散指数で６１．９ｎｍになるまで１７回通した。マイクロ流動化したＬＩＯＮ試料を、２００ｎｍの孔径のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）シリンジフィルターで最終濾過した。
表２は、アルファウイルス由来レプリコンＲＮＡ分子と複合体化する前後に得られたＡｌｕｍ－ＬＩＯＮナノ粒子のサイズおよびＰＤＩをまとめたものである。以下の表３は、得られたＡｌｕｍ－ＬＩＯＮナノ粒子の特徴をまとめたものである。
Figure 2023518976000003
Figure 2023518976000004
 実施例１２、例示的なＬＩＯＮ製剤によるＲＮＡ送達
サブゲノム中にｎＬｕｃ配列を含むＶＥＥレプリコンＲＮＡを６．４ｎｇ／μＬに希釈し、氷上で３０分間１５のＮ：Ｐ比でＬＩＯＮと複合体化させた。２種類のＬＩＯＮ製剤、すなわち、一方は、１５ｎｍの酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子（ＳＰＩＯ）をコアとして有するもの（実施例１に従って調製した７９－００６Ａと同様）、他方は、ＴＯＰＯ被覆オキシ水酸化アルミニウムナノ粒子をコアとして有するもの（実施例１１に従って調製）を使用した。
ＲＮＡ：ＬＩＯＮ複合体を緩衝液（１０％スクロース、５ｍＭクエン酸ナトリウム）で１：１０に希釈し、５０μＬ（１６ｎｇ ＲＮＡ）を、１５０μＬのＯｐｔｉｍｅｍ中のＡ５４９－Ｄｕａｌ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含む９６ウェルプレートのウェルに添加した。細胞を４時間トランスフェクトし、培地を完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎児血清、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）と交換し、５％ＣＯ２で、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の説明書に従って使用してｎＬｕｃ発現を評価した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してプレートを読み取った。
図１７は、ＳＰＩＯ（Ｆｅ－ＬＩＯＮ）またはＴＯＰＯ被覆オキシ水酸化アルミニウムナノ粒子（Ａｌ－ＬＩＯＮ）をＬＩＯＮ製剤のコアとして使用して、ｎＬｕｃをコードするレプリコンＲＮＡとのＲＮＡ：ＬＩＯＮ複合体から得られたインビトロタンパク質発現を示す。この図は、ＲＮＡをＬＩＯＮ製剤と複合体化した場合に、酸化鉄ナノ粒子またはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子のいずれかをコアとして含むＬＩＯＮ製剤がいずれもｎＬｕｃレプリコンのインビトロ送達に成功したことを示している。
特許文献および非特許文献を含む本明細書に開示される全ての文献は、それぞれが個別に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術で知られているその従来の意味を与えられるべきであることをさらに理解されたい。
本明細書を通して「一実施形態」または「実施形態」およびその変形への言及は、その実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれ、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すとは限らないことを意味する。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１または複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。略語「ｅ．ｇ．」は、非限定的な例を示すために本明細書で使用され、用語「例えば」と同義である。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象、すなわち１または複数のものを含み、名詞に続く文字「ｓ」は、内容および文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、その名詞の複数形および単数形の両方を示す。また、接続詞「および（ａｎｄ）」および「または（ｏｒ）」は、一般に、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む最も広い意味で使用され、これは、内容および文脈が場合により包括性または排他性を明確に示さない限り、関連する項目またはアイデアのすべてを含む実施形態、および関連する項目またはアイデアのすべてよりも少ないものを含む１または複数の他の代替実施形態を包含することを意図することに留意されたい。
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群を単位として記載される場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーおよびメンバーの任意のサブグループを包含し、それによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーおよびメンバーの任意のサブグループの観点から記載されることも意図され、出願人は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの任意のサブグループを具体的に指すように出願書類または特許請求の範囲を修正する権利を有する。
値の範囲が本明細書で示される場合、文脈上明確に指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値が本発明に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。例えば、本明細書に示される任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、特に明記しない限り、記載された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合はその分数（整数の１／１０および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特徴に関する本明細書に記載された任意の数の範囲は、特に明記しない限り、記載された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に明記しない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。

Claims (25)

  1. 複数のナノエマルジョン粒子を含むナノエマルジョン組成物であって、各ナノエマルジョン粒子が、
    液体油と１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
    １または複数の脂質と、
    必要に応じて、１または複数の界面活性剤と、を含むナノエマルジョン組成物。
  2. 前記各ナノエマルジョン粒子が、
    液体油と、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、金属ホスフェート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
    カチオン性脂質と、
    疎水性界面活性剤と、
    親水性界面活性剤と、を含む、
    請求項１に記載のナノエマルジョン組成物。
  3. 前記ナノエマルジョン粒子が、
    約０．２％から約４０％ｗ／ｖの液体油と、
    約０．００１％から約１０％ｗ／ｖの無機固体ナノ粒子と、
    約０．２％から約１０％ｗ／ｖのカチオン性脂質と、
    約０．２５％から約５％ｗ／ｖの疎水性界面活性剤と、
    約０．５％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖの親水性界面活性剤と、を含む、
    請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
  4. 前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、および、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
  5. 前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記親水性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエステルである、請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
  6. 前記各ナノエマルジョン粒子が、
    ホスフェート末端脂質、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤で必要に応じてコーティングされた少なくとも１つの金属酸化物ナノ粒子を含有する１または複数の無機ナノ粒子と、天然または合成スクアレンを含有する液体油との混合物を含む疎水性コアと、
    前記カチオン性脂質ＤＯＴＡＰと、
    ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含む疎水性界面活性剤と、
    ポリソルベートを含む親水性界面活性剤と、を含む、請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
  7. 前記各ナノエマルジョン粒子が、
    ホスフェート末端脂質、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤で必要に応じてコーティングされた少なくとも１つの金属水酸化物ナノ粒子またはオキシ水酸化物ナノ粒子を含有する１または複数の無機ナノ粒子と、天然または合成スクアレンを含有する液体油との混合物を含む疎水性コアと、
    前記カチオン性脂質ＤＯＴＡＰと、
    ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含む疎水性界面活性剤と、
    ポリソルベートを含む親水性界面活性剤と、を含む、請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
  8. 前記ナノエマルジョン粒子が、動的光散乱によって測定される、約４０ｎｍから約８０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学的直径を有し、平均多分散性指数が約０．２から約０．４の範囲である、請求項２に記載のナノエマルジョン組成物。
  9. ナノエマルジョン組成物であって、
    （ｉ）複数のナノエマルジョン粒子であって、各ナノエマルジョン粒子が、
    液体油と１または複数の無機ナノ粒子との混合物を含む疎水性コアと、
    １または複数の脂質と、
    必要に応じて、１または複数の界面活性剤とを含む、複数のナノエマルジョン粒子と、
    （ｉｉ）前記ナノエマルジョン粒子と複合化された生物活性剤と、を含むナノエマルジョン組成物。
  10. 前記生物活性剤がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項９に記載のナノエマルジョン組成物。
  11. 前記生物活性剤が、ｍＲＮＡ、腫瘍溶解性ウイルスＲＮＡ、レプリコンＲＮＡ、または非コードＲＮＡである、請求項１０に記載のナノエマルジョン組成物。
  12. 前記生物活性剤が、抗原または抗原に対する抗体をコードするＲＮＡであり、前記抗原が、細菌感染／疾患、ウイルス感染／疾患、原虫疾患、非伝染性疾患、癌または自己免疫疾患に由来する、請求項１０に記載のナノエマルジョン組成物。
  13. 前記抗原がＲＮＡウイルスに由来する、請求項１０に記載のナノエマルジョン組成物。
  14. 前記ＲＮＡウイルスが、肝炎ウイルス、コロナウイルス、蚊媒介ウイルスおよびＨＩＶウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載のナノエマルジョン組成物。
  15. 窒素とリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比によって特徴付けられる、前記ナノエマルジョン粒子と前記生物活性剤のモル比が、約１：１から約１５０：１の範囲である、請求項１０に記載のナノエマルジョン組成物。
  16. 前記生物活性剤がアジュバントである、請求項９に記載のナノエマルジョン組成物。
  17. 前記生物活性剤が、ＴＬＲアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、サポニン、ペプチド、タンパク質、炭水化物、炭水化物ポリマー、コンジュゲート炭水化物、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、細胞断片、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載のナノエマルジョン組成物。
  18. 請求項９に記載のナノエマルジョン組成物と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物。
  19. 請求項９に記載のナノエマルジョン組成物と、必要に応じて１または複数のワクチンアジュバントとを含むワクチン送達系であって、前記生物活性剤が抗原または抗原をコードする核酸分子である、ワクチン送達系。
  20. 生物活性剤を対象に送達するための方法であって、
    請求項９に記載のナノエマルジョン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  21. 対象において免疫応答を生じさせるための方法であって、
    治療有効量の請求項９に記載のナノエマルジョン組成物と、必要に応じてアジュバントとを前記対象に投与することであって、前記生物活性剤が抗原または抗原をコードする核酸分子であること、を含む方法。
  22. 対象の疾患を処置または予防する方法であって、
    治療有効量の請求項９に記載のナノエマルジョン組成物と、必要に応じて薬学的に許容され得る担体とを対象に投与することを含む方法。
  23. 対象における生物活性剤送達を画像化および／または追跡する方法であって、
    請求項９に記載のナノエマルジョン組成物を前記対象に投与することであって、前記無機ナノ粒子が磁気共鳴画像法によって検出可能な材料を含有すること、および、
    前記磁気共鳴画像法を用いて前記ナノエマルジョン組成物を検出すること、を含む方法。
  24. 前記無機ナノ粒子が、酸化鉄、グルコン酸鉄、および／または硫酸鉄から形成される、請求項２３に記載の方法。
  25. ナノエマルジョン組成物を製造する方法であって、
    （ａ）１または複数の無機ナノ粒子と、液体油と、１または複数の脂質と、必要に応じて疎水性界面活性剤とを混合し、それによって油相混合物を形成すること、および
    （ｂ）前記油相混合物を、必要に応じて親水性界面活性剤を含有する水溶液と混合して、ナノエマルジョン粒子を形成すること、および
    （ｃ）必要に応じて、前記ナノエマルジョン粒子を生物活性剤を含有する水溶液と混合し、それにより前記生物活性剤を前記ナノエマルジョン粒子と複合体化することを含む、方法。
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