KR20220038415A - 엔테로바이러스 d68에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

엔테로바이러스 d68에 대한 인간 모노클로날 항체 Download PDF

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KR20220038415A
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주니어 제임스 이. 크로웨
매튜 알. 보그트
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Abstract

본 개시는 엔테로바이러스 D68(EV-D68)에 결합하는 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

엔테로바이러스 D68에 대한 인간 모노클로날 항체
우선권 주장
본 출원은, 2019년 7월 26일, 2019년 9월 12일 및 2020년 7월 2일에 각각 출원된 미국 가출원 일련번호 제62/878,955호, 제62/899,503호 및 제63/047,330호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 각 출원의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
배경
1. 개시의 분야
본 개시는 일반적으로 의학, 감염성 질환 및 면역학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 엔테로바이러스 D68에 결합하는 인간 항체 및 엔테로바이러스 D68 감염을 진단 및 치료하기 위해 이러한 항체를 사용하여 방법에 관한 것이다.
2. 배경
엔테로바이러스-D68(EV-D68)은 피코르나비리다에(Picornaviridae) 과의 엔테로바이러스 속의 포지티브-센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 이 속 내의 기타 일반적 인간 병원체에는 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, 라이노바이러스, 및 엔테로바이러스-A71 등의 기타 넘버링 엔테로바이러스가 포함된다[참조: Zell et al., 2017]. 이들 바이러스는, 구조적으로나 유전적으로는 유사하지만, 신생아 패혈증, 심근염, 소아마비, 뇌수막염, 호흡기 감염, 수족구병을 포함하는 다양한 소아 질환을 유발한다. 라이노바이러스와 마찬가지로, EV-D68은 주로 호흡기 병원체이고, 산에 불안정하고 33℃에서 가장 잘 복제된다[참조: Oberste et al., 2004]. 이러한 유사성은 EV-D68의 균주가 최초로 라이노바이러스 87로서 보고된 것과 같다[참조: Blomqvist et al., 2002].
1962년 캘리포니아의 폐렴에 걸린 어린이의 최초의 동정[참조: Schieble et al., 1967]부터 세기의 전환기에 이르기까지, EV-D68은 거의 검출되지 않았다[참조: Khetsurani et al., 2006]. 그 이래, EV-D68은 주로 소아에서 발생하는 호흡기 질환의 발생에서 세계적으로 검출됨에 따라 점점 중요성이 증가하는 병원체로서 인식되고 있다[참조: Xiang and Wang, 2016]. 이제까지 공지된 최대의 발생은 2014년 미국에서 발생하여 알래스카를 제외한 모든 주에 걸쳐 1,152건의 확인된 사례가 발생했다[참조: Oermann et al., 2015]. 이 수치는 2014년의 EV-D68의 실제 사례 수를 대폭 과소평가했을 가능성이 있고, 이는 경도의 상부 호흡기 감염이 이 바이러스의 검출에 필요한 특수한 검사를 수행하지 않을 가능성이 높기 때문이다. 천식 어린이는 특히 심각한 감염을 경험했지만[참조: Biggs et al., 2017], 한 기관의 연구에서는 천식 어린이에서 EV-D68이 비-EV-D68 엔테로바이러스/라이노바이러스 감염보다 심각하지 않은 것으로 나타났다[참조: Overdahl et al. , 2016]. 입원 환자의 절반 이상이 중환자실에 입원했고, 80%는 산소 보충을 받고, 23%는 비침습적 인공호흡을 필요로 하고, 8%는 삽관 및 기계적 인공호흡을 필요로 하고, 1%는 사망했다[참조: Midgley et al., 2015].
2014년의 발생과 동시에, 콜로라도주에서 급성 발병 이완성 마비와 뇌신경 기능 장애를 수반하는 소수의 소아 환자 모집단이 관찰되었다[참조: Messacar et al., 2015]. 이 증후군은 급성 이완성 척수염(AFM)으로 지정되었고, 척수의 화상 검사로 발견되는, 전형적으로 비대칭의 이완성 사지 쇠약 및 주로 회백질의 척수염을 수반하는 소아마비 유사 질환으로 정의되어 있다[참조: Div. of Viral Diseases, CDC, 2018]. 2014년의 발생 이후, 보다 많은 AFM 사례 및 클러스터가 EV-D68과 관련되었다. 현재까지, 임의의 환자 공급원으로부터 EV-D68 검사가 양성인 74건의 AFM 사례가 6개 대륙에서 확인되었다[참조: Messacar et al., 2018]. 질병 통제 예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention; CDC)는 EV-D68을 AFM(Nat'l Center for Immun. Resp. Disease)의 입증된 원인으로서 공식적으로 인정하지 않지만, 다수의 전문가들은 인관관계가 있는 2개 사이의 관계를 검토하기에 충분한 설득력이 있는 증거의 우세를 발견한다[참조: Messacar et al. 2018]. 세계적 발생이 계속되기 때문에, 세계 보건 기구의 연구 개발 청사진에서는 EV-D68가 주요 공중 보건 위험으로서 수록되어 있다[참조: Ann. Rev. of Diseases, 2018].
EV-D68이 우선 병원체로서 매우 최근에 등장했기 때문에, 대부분의 초기 연구는 면역 반응을 특성화하는 것이 아니라, 바이러스의 역학을 정의하는 데 초점을 맞추었다. 따라서, EV-D68에 대한 체액성 면역의 연구는 초기 단계이다. 엔테로바이러스(Enterovirus) 속의 기타 바이러스로부터 보호하는 혈청 항체의 역할은 다양하다. 예를 들면, 비활성화된 폴리오바이러스 백신을 3회 접종하면, 혈청 중화 항체의 100% 유도에 근접하고, 마비성 소아마비의 예방에 80-96% 효과적이고; 그러나, 백신접종은 비강 또는 십이지장 IgA를 유도할 수 없기 때문에[참조: Sutter et al., 2018], 장 또는 비인두의 소아마비 바이러스 방출을 완전히 예방하지 못한다[참조: Vidor et al., 2018]. 라이노바이러스 감염의 연구에서는, 특정 혈청형 바이러스에 대한 체액성 면역이 수개월 이내에 동형 바이러스 재감염으로부터 확실히 보호하지 못하는 것을 나타낸다[참조: Howard et al., 2016]. 항체 반응과 관련된 보호의 정도의 이러한 차이는, 아마도 이러한 바이러스에 대한 병리의 상이한 부위: 폴리오바이러스의 최초 장내 감염 후의 이차 신경 확산 대 라이노바이러스의 국소 호흡기 감염 때문이다. EV-D68 감염은 호흡기 질환을 유발할 수 있고, 중추신경계 질환과 관련이 있기 때문에, 보호 및 질환 병인에서 항체의 역할은 복잡할 가능성이 있다. 이 역할을 보다 잘 이해하는 것은 EV-D68 감염에 대한 백신 및 치료법의 개발에 도움이 될 것이다.
따라서, 본 개시에 따르면, 대상체(subject)에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 감염을 검출하는 방법이 제공되고, 이는 (a) 상기 대상체로부터의 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍(clone-paired) 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 샘플 중의 EV-D68 항원에 결합시킴으로써 상기 샘플에서 EV-D68을 검출하는 단계를 포함한다. 샘플은 혈액, 가래, 눈물, 타액, 점액 또는 혈청, 정액, 자궁경부 또는 질 분비물, 양수, 태반 조직, 소변, 삼출물, 누출물, 조직 스크래핑(tissue scraping), 호흡기 비말 또는 에어로졸, 대변 등의 체액일 수 있다. 검출은, 예를 들면, ELISA, RIA, 측방 유동 검정(lateral flow assay), 웨스턴 블롯(Western blot) 등을 포함할 수 있다. 이 방법은 단계 (a) 및 (b)를 2회 수행하고, 제1 검정과 비교하여 EV-D68 항원 수준의 변화를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성(identity)을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화(encoding)될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄(single chain) 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 엔테로바이러스 D68(EV-D68)로 감염된 대상체를 치료하거나 EV-D68에 감염될 위험이 있는 대상체의 감염 가능성을 감소시키는 방법을 제공하고, 이는 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 것을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 임의의 아이소타입일 수 있고, 이로써 한정되지 않지만, IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)하고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된(engineered) 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체는 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 이중특이성 항체(bispecific antibody)일 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 감염 전 또는 감염 후, 예를 들면, 감염 후 약 7일, 약 5일, 약 3일, 약 2일 또는 약 1일 이내에 투여될 수 있다. 치료는 폐 감염 및/또는 신경계 감염을 치료할 수 있거나, 치료는 폐 감염 및/또는 신경계 감염을 감소시킨다. 전달은 에어로졸 전달 등에 의한 항체 또는 항체 단편의 전신 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 유전 전달을 포함할 수 있다. 상기 방법은 항바이러스 요법 또는 항염증 요법 등의 제2 요법으로 상기 대상체를 치료하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)가 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 임의의 아이소타입일 수 있고, 이로써 한정되지 않지만, IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)하고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이성 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide)를 추가로 포함할 수 있고/있거나 인트라바디(intrabody)이다.
항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하이브리도마 또는 조작된 세포가 제공되고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 한다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는 항체 또는 항체 단편을 암호화할 수 있다. 하이브리도마 또는 조작된 세포는, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 함유할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)하고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이성 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디이다.
또한, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 백신 제형(vaccine formulation)이 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)하고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이성 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디이다.
또 다른 실시양태는, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 백신 제형을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)하고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이성 항체일 수 있다. 발현 벡터(들)는 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 VEE 벡터(들)이다. 백신 제형은 바늘 주사, 제트(jet) 주사 또는 전기천공에 의한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 백신 제형은, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 별개의 항체 또는 항체 단편 등의 2차 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화된다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태는, 엔테로바이러스 D68로 감염되었거나 이의 감염 위험이 있는 임신 중의 대상체의 태반 및/또는 태아의 건강을 보호하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 것을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)하고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)하도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이성 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디이다.
항체 또는 항체 단편은, 감염 전 또는 감염 후, 예를 들면, 감염 후 약 7일, 약 5일, 약 3일, 약 2일 또는 약 1일 이내에 투여될 수 있다. 대상체는 임신 중의 여성, 성적으로 활발한 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성일 수 있다. 전달은 항체 또는 항체 단편의 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터에 의한 유전적 전달을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 무처리 대조군과 비교하여 태반의 크기를 증가시킬 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 무처리 대조군과 비교하여 태아의 바이러스 부하(viral load) 및/또는 병리를 감소시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 엔테로바이러스 D68 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 방법이 제공되고, 이 방법은 (a) 상기 항원을 포함하는 샘플을, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 1차 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항원에 대한 상기 1차 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 샘플은 재조합적으로 생산된 항원을 포함할 수 있거나, 백신 제형 또는 백신 생산 배치(batch)를 포함할 수 있다. 검출은 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계를 사용하는 바이오센서, 또는 유세포 분석 염색(flow cytometric staining)을 포함할 수 있다.
1차 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화된다. 1차 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 1차 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 이 방법은 단계 (a) 및 (b)를 2회 수행하여 시간 경과에 따른 항원의 항원 안정성을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 (c) 상기 항원을 포함하는 샘플을, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 2차 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 항원에 대한 상기 2차 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 2차 항체 또는 항체 단편은 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 의해, 표 1에 기재된 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 기재된 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화된다. 2차 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 2차 항체 단편은 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 상기 방법은 단계 (c) 및 (d)를 2회 수행하여 시간 경과에 따른 항원의 항원 안정성을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포가 제공되고, 여기서 상기 항체는 적어도 2개의 바이러스 클레이드(viral clade)를 가로질러 EV-D68에 결합한다.
추가 실시양태는 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 하이브리도마 또는 이를 생성하는 조작된 세포를 포함하고, 여기서 상기 항체는 EV-D68 VP1, VP2 및 VP3에 결합한다. 항체는 EV-D68 VP1 DE 루프, 및/또는 EV-D68 VP2 EE 루프, 및/또는 EV-D68 VP3 N-말단 루프에 결합할 수 있다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우의 "a" 또는 "an"이라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와도 일치한다. "약"이라는 단어는 명시된 수치의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 기타 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있음이 고려된다. 본 개시의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 예는, 본 개시의 특정 실시양태를 나타내면서, 예시로서만 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시는 본 명세서에 제시된 특정 실시양태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1. 항체 단리. 2014 EV-D68 발생으로부터 살아있는 바이러스 분리주를 ELISA 플레이트에 직접 코팅하는 간접 ELISA를 사용하여, 64개 인간 모노클로날 항체를 단리하고 스크리닝했다. 이어서, 임의의 히트는 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 제조하고, 이는 이론적으로 영구적으로 계속 분열할 것이다. 항체를 정제한 후, 이들의 표현형을 정의하기 위해, 다수의 시험관내 특성화 단계가 수행된다.
도 2. 시험관내 항체 중화. 세포 배양 50% 감염 용량 또는 CCID50 검정을 사용하여 시험관내 중화를 수행한다. 일부 항체는 매우 강력하고, 일부는 여전히 매우 강력하고, 다른 항체는 약하고, mAb의 약 1/3이 일부 검출 가능한 중화 활성을 나타낸다.
도 3. 클레이드 사이의 교차 반응성 결합. 모든 mAb를 비교하기 위해, ELISA로부터 절반 최대 유효 농도 또는 EC50을 사용하여 히트 맵을 생성했다. 일부는 모든 클레이드에 매우 잘 결합되는 반면, 일부는 현저한 드롭아웃을 갖고, 통상은 멀리 떨어진 A2 클레이드를 수반한다.
도 4. 경쟁은 적어도 4개의 주요 표면 에피토프를 나타낸다. 피어슨 상관관계를 사용하여, 본 발명자는 클러스터에 대한 컬러 판독치로서 관련성 값을 생성했다. 이 관련성은 항체의 분류에 도움이 되지만, 실제 간섭 비율은 아니다. 본 발명자들은 이제 서로 관련될 수 있는 3 내지 4개의 표현형을 기술했다. 이를 통해, 임상 개발 후보를 특정할 수 있다.
도 5. 임상 후보. 중화에 추가하여, 추가 특성화를 통해, 추가 임상 후보가 밝혀졌다. mAb 159는, 믿을 수 없을 정도로 강력하고 바이러스의 모의 조제물에 결합하지 않지만, ELISA 또는 CCID50에서 교차 반응하지 않는다. mAb 105는 여전히 매우 강력하지만, 교차 반응이 매우 양호하다.
도 6A-C. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가. EV-D68-228에 의한 치료는 감염 후 1일차(도 6A), 3일차(도 6B) 및 5일차(도 6C)에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 10, 3 또는 1mg/kg의 EV-D68-228로 치료된 마우스에서는 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. IVIg에 의한 치료는 감염 후 1일차에만 폐 바이러스 역가를 감소시킬 수 있었다. 구아니딘은 감염 후 1일차와 3일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰지만, 5일차에는 감소시키지 않았다. 위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ****P<0.0001.
도 7A-C. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. EV-D68-228 mAb에 의한 치료는 감염 후 1일차(도 7A), 3일차(도 7B) 및 5일차(도 7C)에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. IVIg에 의한 치료는 감염 후 1, 3, 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 구아니딘은 감염 후 1일차와 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰지만, 3일차에는 감소시키지 않았다. 위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 8. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α 및 IL-1β의 폐 농도. EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 후 3일차에 IL-1α 및 IL-1β의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg 또는 구아니딘에 의한 치료는 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 농도를 유의하게 감소시키지 않았다. 위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001. 그래프 내의 샘플의 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 9. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-6 및 MCP-1의 폐 농도. EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 후 3일차에 IL-6 및 MCP-1의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg 또는 구아니딘에 의한 치료는 감염 후 3일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. 위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 그래프 내의 샘플의 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 10. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 RANTES의 폐 농도. EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 후 3일차 및 5일차에 RANTES의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg 또는 구아니딘에 의한 치료는 감염 후 어느 날자에도 RANTES의 폐 농도를 유의하게 감소시키지 않았다. 위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 11. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-2, IL-3 및 IL-4의 폐 농도. EV-D68 감염 후, IL-2, IL-3 또는 IL-4 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 12. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-5, IL-10 및 IL-12p70의 폐 농도. EV-D68 감염 후, IL-5, IL-10 또는 IL-12p70 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 13. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-17, IFNγ 및 TNFα의 폐 농도. EV-D68 감염 후, IL-17, IFNγ 또는 TNFα 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 14. Expt. NIA-1849. EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 MIP-1α 및 GM-CSF의 폐 농도. EV-D68 감염 후, MIP-1α 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 15. Expt. NIA-1850. EV-D68에 감염되고 EV-D68-228로 치료된 10일령 AG129 마우스의 생존. (n=6 마우스/그룹). 10, 3 또는 1mg/kg의 EV-D68-228에 의한 치료는 마우스를 사망으로부터 완전히 보호했다. 10mg/kg의 IVIg 용량은 6마리 중 4마리의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 100mg/kg/일 용량의 구아니딘은 마우스를 사망으로부터 완전히 보호했다. 위약 치료된 마우스의 6마리 모두가 감염에 굴복했다. 위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01.
도 16. Expt. NIA-1850. EV-D68-228로 치료된 10일령의 EV-D68 감염 AG129 마우스의 평균 체중. 10, 3 또는 1mg/kg의 용량으로 처리하면 감염 관련 체중 감소로부터 마우스를 보호했다. 10mg/kg의 용량에서 IVIg를 사용한 치료는 또한 체중 감소로부터 마우스를 보호했다. 100mg/kg/일의 용량으로 구아니딘으로 처리된 마우스도 체중 감소로부터 보호되었다. 위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 17A-C. Expt. NIA-1850. EV-D68에 감염되고 EV-D68-228로 치료된 10일령의 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. 10, 3 또는 1mg/kg의 EV-D68-228 용량으로 치료된 마우스에서는 감염 후 1일차(도 17A), 3일차(도 17B) 또는 5일차(도 17C)에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 1, 3 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 혈액 바이러스 역가는 100mg/kg/일의 용량으로 구아니딘으로 치료함으로써 감염 후 1일, 3일 및 5일차에 유의하게 감소했다. 위약 처리 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.
도 18. Expt. NIA-1850. EV-D68에 감염되고 EV-D68-228로 치료된 10일령의 AG129 마우스의 신경학적 스코어. 10, 3 또는 1mg/kg 용량으로 EV-D68-228에 의한 치료는 신경학적 스코어에 의해 측정한 임상 마비 징후를 예방했다. 10mg/kg의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3, 4 및 5일차에 신경학적 스코어를 감소시켰다. 100mg/kg/일의 구아니딘으로 치료된 마우스에서는 신경학적 스코어가 관찰되지 않았다. 위약 처리 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 19A-B. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가. EV-D68-228에 의한 치료는 감염 후 3일차(도 19A) 및 5일차(도 19B)에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 24시간 이내에, 10mg/kg의 EV-D68-228로 치료된 마우스에서는 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 감염 후 48시간에 10 및 1mg/kg 용량으로 EV-D68-288에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. IVIg에 의한 치료는 감염 후 24시간에 치료한 경우 폐 바이러스 역가를 감소시키지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001).
도 20A-B. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. EV-D68-228 mAb에 의한 치료는 감염 후 3일차(도 20A) 및 5일차(도 20B)에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. 감염 후 48시간까지 EV-D68-228에 의한 치료는 감염 후 3일차와 5일차 모두에서 혈액 바이러스 역가를 검출 한계 미만으로 감소시켰다. IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차와 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ****P<0.0001).
도 21. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α 및 IL-1β의 폐 농도. EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 후 3일차 및 5일차에 IL-1α 및 IL-1β의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 22. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-5 및 IL-6의 폐 농도. 감염 후 48시간까지 EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료된 마우스와 비교하여 감염 후 3일차에 IL-5 및 IL-6의 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 및 IL-6의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 23. Expt. NIA-1849. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 MCP-1 및 RANTES의 폐 농도. 감염 후 48시간 이내에 EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료된 마우스와 비교하여 감염 후 3일차 및 5일차에 MCP-1 및 RANTES의 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일차 및 5일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 24. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-2, IL-3 및 IL-4의 폐 농도. EV-D68의 감염 후, IL-2, IL-3 또는 IL-4 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 25. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-10, IL-12p70 및 IL-17의 폐 농도. EV-D68의 감염 후, IL-5, IL-10 또는 IL-12p70 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 26. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IFNγ 및 TNFα의 폐 농도. EV-D68의 감염 후, IFNγ 또는 TNFα 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 27. Expt. NIA-1869. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 MIP-1α 및 GM-CSF의 폐 농도. EV-D68 감염 후, MIP-1α 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 28. Expt. NIA-1870. EV-D68에 감염되고 감염 후 EV-D68-228로 치료된 10일령의 AG129 마우스의 생존. (n=6 마우스/그룹, n=7 마우스/그룹은 감염 후 120시간 치료됨). 10mg/kg의 EV-D68-228에 의한 치료는 감염 후 24시간에 마우스를 사망으로부터 완전히 보호했다. 감염 후 48시간에 EV-D68-228에 의한 치료는 6마리의 마우스 중 4마리를 사망으로부터 보호했다. EV-D68-228에 의한 감염 72시간 후에 치료한 6마리 마우스 중 1마리만이 감염에서 생존했다. 감염 120시간 후에 EV-D68-228로 치료된 그룹에서는 7마리의 마우스 중 어느 것도 생존하지 않았음에도 불구하고, 사망일의 지연으로 인해, 생존 곡선은 위약-치료된 마우스와는 상이했다. 10mg/kg의 IVIg 용량은, 감염 24시간 후에 치료된 경우, 6마리의 마우스 모두를 사망으로부터 보호했다. 위약 치료된 마우스 6마리 모두는 감염에 굴복했다(위약 치료된 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 29. Expt. NIA-1870. 감염 후 EV-D68-228로 치료된 EV-D68 감염 10일령의 AG129 마우스의 평균 체중. 감염 후 24시간 또는 48시간에 10mg/kg 용량의 EV-D68-228에 의한 치료는 마우스를 감염 관련 체중 감소로부터 보호했다. 감염 후 24시간에 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 마우스를 체중 감소로부터 보호하지 못했다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01).
도 30A-C. Expt. NIA-1870. EV-D68에 감염되고 감염 후 EV-D68-228로 치료된 10일령 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 1일차(도 30A), 3일차(도 30B) 또는 5일차(도 30C)에 제시된다. 10mg/kg 용량으로 EV-D68-228에 의한 치료는, 감염 후 24, 48 또는 72시간에 투여한 경우, 감염 후 3일차와 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 24시간에 투여된 10mg/kg 용량의 IVIg도 감염 후 3일차 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001).
도 31A-B. Expt. NIA-1870. EV-D68에 감염되고 감염 후 EV-D68-228로 치료된 10일령 AG129 마우스의 신경학적 스코어. 신경학적 스코어는 감염 후 2일차 및 3일차(도 31A) 및 감염 후 4일차 및 5일차(도 31B)에 제시된다. 감염 후 24시간에 10mg/kg 용량으로 EV-D68-228에 의한 치료는, 신경학적 스코어로 측정한 바와 같이, 3일, 4일 및 5일차의 임상적 마비 징후를 예방했다. 감염 24시간 후 10mg/kg의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일, 4일 및 5일차에 신경학적 스코어를 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 32. EV-D68-면역 인간 대상체로부터의 mAb의 경쟁 결합 그룹. 관련성 스코어는 B1 클레이드 EV-D68 분리주를 사용하여 경쟁 결합 ELISA로부터 생성하고, mAb를 1~4로 지정된 4개의 경쟁 결합 그룹으로 클러스터링하는 데 사용했다. 적색 또는 청색으로 수록된 클론 번호는 강력하게 중화하는 mAb이고, 청색 클론 명칭은 이후 도면에서 상세히 연구된 2개의 mAb를 나타낸다.
도 33A-C. 인간 mAb의 중화 효능 및 결합 능력. (도 33A) MAb는 B1 클레이드 분리주를 사용하는 CCID50 중화 검정에서 IC50 값에 의해 경쟁-결합 그룹(비교 그룹, 그룹 5는 싱글톤의 잔류 컬렉션을 나타낸다) 내에서 순위가 매겨졌다. 본 발명자들은 또한 21개의 가장 강력하게 중화시키는 mAb에 대해 D 클레이드 및 페르몬(Fer.) 부리주의 중화를 시험했다. ">"는 최대 50μg/mL 농도에서 시험했을 때에 중화가 검출되지 않았음을 나타낸다. 공백 셀은 시험되지 않았음을 나타낸다. 적색 또는 청색으로 수록된 클론 번호는 강력하게 중화하는 mAb이고, 청색 클론 명칭은 이후 도면에서 상세히 연구된 2개의 mAb를 나타낸다. (도 33B) 생 바이러스 분리주 또는 모의 바이러스 조제물에 대한 결합 강도는 S자형 용량 반응 곡선에 적합하도록 정제된 mAb 희석액과 함께 간접 ELISA(도 33C)를 사용함으로써 생성된 EC50 값을 사용하여 표시된다. ">"는 EC50 값이 시험된 최대 농도인 100μg/mL를 초과하는 것을 나타내고, 이는 결합이 불충분하거나 없음을 시사한다.
도 34A-C. 2개 면역 복합체 사이의 구조적 특징 비교. (도 34A) EV-D68:Fab EV68-159(좌측) 또는 EV-D68:Fab EV68-228(우측)의 방사형 착색 크리오-EM 맵. 각 맵은 2개의 대칭 축을 따라 투영된다. 각 비대칭 단위의 5배, 3배 및 2배의 축은 각각 오각형 1개, 작은 삼각형 2개, 및 타원형 1개로 표지된 삼각형 윤곽을 사용하여 도시된다. (도 34B) 비대칭 단위에 대한 결합 위치 비교. 바이러스 단백질은 청색(VP1), 녹색(VP2) 및 적색(VP3)으로 착색된다. Fab 분자는 회색(EV68-159) 또는 자주색(EV68-228)으로 착색되고, 중쇄 또는 경쇄는 각각 암색 또는 명색 강도로 동일한 색상으로 표시된다. (도 34C) EV68-159 Fab(좌측) 또는 EV68-228 Fab(우측)의 풋프린트. 바이러스 표면의 방사형 착색된 2D 투영은 RIVEM을 사용하여 생성되었다. 4Å 거리 내에서 Fab 분자로부터의 임의의 원자와 대면하는 바이러스 표면 잔기는 밝은 청색(VP1), 밝은 녹색(VP2) 및 밝은 적색(VP3)으로 표시된다. 협곡 영역은 황색으로 도시된다. (도 34A) 및 (도 34C)의 스케일 바는 Å 단위로 측정된 반경 방향 거리를 나타낸다.
도 35. EV68-159 및 EV68-228의 결합 인터페이스의 확대도. 바이러스 캡시드는 표면으로 표시되고, Fab는 만화 표현으로 표시된다. VP1, VP2 및 VP3은 각각 백색, 짙은 회색 및 은색으로 착색되어 있다. 중쇄 또는 경쇄는 각각 주황색 또는 황색으로 착색된다. 상호작용을 수행하는 바이러스 잔류물은 중쇄와 경쇄를 기반으로 착색되고, 색상 강도는 VP 중 어느 것에 기초하여 변화한다. 결합 인터페이스에 관여하는 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(각각 HCDR 및 LCDR)은 화살표로 제시된다.
도 36A-D. 비리온-Fab 상호작용의 분자 상세. EV-D68:Fab EV68-159(도 36A-C) 및 EV-D68:Fab EV68-228(도 36D)의 결합 인터페이스에서의 대표적 상호작용. 수소 결합은 청록색으로 착색되고, 염 브릿지는 마젠타로 착색된다.
도 37A-D. MAb EV68-228은, 예방 또는 요법으로 사용되는 경우, EV-D68 유도된 호흡기 질환으로부터 마우스를 보호한다. 4주령의 AG129 계통 마우스(시점당 n = 4)에, 마우스-적응 B1 클레이드 EV-D68을 비강으로 접종하고, 항체를 복강내 투여하고; 표시된 조직에 대한 바이러스 역가를 CCID50 검정에 의해 측정했다. (도 37A-B) 지시된 항체 용량의 24시간 후에 마우스에게 바이러스를 접종하고, 이어서 지시된 시점에서 바이러스 역가를 측정했다. (도 37C-D) 마우스에게 바이러스를 접종하고, 4, 24 또는 48시간 후에 10mg/kg(지시된 경우 제외)의 항체를 접종하고, 이어서 바이러스 역가를 측정했다.
도 38A-F. MAb EV68-228은 EV-D68 감염 마우스에서 폐 염증을 감소시킨다. 4주령 AG129 마우스(시점당 n=4)(도 38A-C)은 지시된 항체 용량의 24시간 후에 비강내로 바이러스를 접종하거나, (도 38D-F)은 바이러스를 비강내로 접종하고, 이어서 4, 24 또는 48시간 후에 10mg/kg(지시된 경우 제외) 항체를 접종하고, 지시된 시점에서 사이토카인을 측정했다. ELISA를 사용하여 폐 균질액으로부터 사이토카인을 정량화했다. 둔네트(Dunnett)의 T3 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석을 사용하여, 각 시점에서 치료 그룹의 값을 위약 그룹과 비교했다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). IL-인터루킨; MCP-단핵 세포 주화성 단백질. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 39A-F. MAb EV68-228은, 예방 또는 요법으로 사용되는 경우, EV-D68 유도 신경계 질환으로부터 마우스를 보호한다. 10일령의 마우스에게 마우스-적응 B1 클레이드 EV-D68을 복강내 접종하고, 항체는 복강내 투여하고; 지시된 조직에 대한 바이러스 역가는 CCID50 검정에 의해 측정했다. (도 39A-C) 지시된 용량의 항체의 24시간 후에 마우스에게 바이러스를 접종하고, 이어서 (도 39A) 바이러스 역가를 측정하고(시점당 n = 3), (도 39B) 생존을 모니터링하고, (도 39C) 신경학적 스코어(시점당 n = 6)를 지시된 시점에서 기록했다. 스코어가 높으면, 운동 장애가 심각한 것을 나타낸다. (도 39D-F) 마우스에게 바이러스를 접종하고, 이어서 10mg/kg 용량의 항체를 접종하고, 이어서 (도 39D) 바이러스 역가를 측정하고(시점당 n = 3), (도 39E) 생존을 모니터링하고, (도 39F) 신경학적 스코어(시점당 n = 6, 120시간 후의 n = 9 제외)를 기록했다. 착색 수직 화살표는 치료 시간을 나타낸다.
도 40. 웨스턴 블롯 데이터. 모든 mAb는 웨스턴 블롯에 의해 B1 클레이드 바이러스를 염색하는 능력에 대해 시험되었다. 모든 긍정적 결과가 제시된다.
도 41. 인간 mAb의 상세한 특성. MAb는 B1 클레이드 분리주를 사용한 CCID50 중화 검정에서 IC50 값에 의해 경쟁 결합 그룹 내에서 순위가 매겨졌다. 본 발명자들은 또한 21개의 가장 강력하게 중화하는 mAb에 대해 D 클레이드 및 페르몬(Fer.) 분리주의 중화를 시험했다. ">"는 최대 50μg/mL 농도에서 시험할 때에 중화가 검출되지 않았음을 나타낸다. 공백 셀은 시험되지 않았음을 나타낸다. 적색 또는 청색 폰트로 수록된 클론 번호는 강력하게 중화하는 mAb이고, 청색 클론 명칭은 후속 도면에서 상세히 연구된 2개의 mAb를 나타낸다. 각 mAb에 대한 최종 IC50 값은 중복으로 수행된 3개의 개별 실험으로부터의 EC50 값의 로그 평균이다. 살아있는 바이러스 분리주에 대한 결합 강도는 S자형 용량 반응 곡선에 적합하도록 정제된 mAb 희석액과 함께 간접 ELISA를 사용하여 생성된 EC50 값을 기반으로 표시된다. ">"는 예측된 EC50 값이 시험된 최대 농도인 100μg/mL를 초과하는 것을 나타내고, 이는 결합이 불충분하거나 없음을 시사한다. 각 mAb에 대한 최종 EC50 값은 중복으로 수행된 3개의 개별 실험으로부터의 EC50 값의 로그 평균이다. IgG 서브타입은 표현형으로 결정되었다. 경쇄 유형은 카파(K) 또는 람다(L)이고, 유전적으로 결정되었다. WB는 웨스턴 블롯 반응성을 나타내고, 모든 mAb는 시험되었고, 공백 행은 반응성이 없음을 나타낸다.
도 42. 모든 mAb에 대한 간접 ELISA 데이터. 살아있는 바이러스 분리주에 대한 결합 강도는 S자형 용량 반응 곡선에 적합하도록 정제된 mAb 희석액과 함께 간접 ELISA를 사용하여 생성된 EC50 값으로 표시된다. 제시된 것은 3개의 실험 중 하나의 대표적 데이터이고, 에러 바는 중복 기술적 복제의 표준 편차를 나타낸다. 각 mAb에 대한 최종 EC50 값은 3개의 실험 모두로부터의 EC50 값의 로그 평균이다. 바이러스의 모의 조제물은 바이러스를 접종하지 않았지만 바이러스 감염 세포와 동일한 방식으로 제조된 RD 세포 단층으로부터의 것이다.
도 43. EV-D68로부터의 대표적 밀도: Fab EV68-228 전자 밀도 맵. 바이러스 단백질은 청색(VP1), 녹색(VP2), 적색(VP3) 및 마젠타색(VP4)으로 착색된다.
도 44. 면역 복합체 맵 해상도의 추정치. 맵 해상도는 금 표준 푸리에 쉘 상관관계(FSC) 컷오프 0.143을 기반으로 추정된다. EV68-159(적색 곡선) 또는 EV68-228(청색 곡선) 복합체의 최종적 해상도는 각각 2.9Å 또는 3.1Å이다.
도 45. Fab 결합 부위의 비교. EV68-159와 EV68-228은 각각 금색과 청색으로 착색되었고, 바이러스 표면은 청록색으로 착색되었다. 좌측 패널은 가변 도메인과 불변 도메인을 모두 표시하는 반면, 우측 패널은 가변 도메인만을 표시하고, 이는 2개 Fab의 풋프린트가 중첩하지 않음을 입증한다.
도 46. Fab 풋프린트의 확대도를 나타내는 로드맵. 바이러스 표면의 방사형 착색된 2D 투영은 RIVEM으로 생성되었다. 4Å 거리 내에서 Fab 분자로부터의 임의의 원자와 대면하는 바이러스 표면 잔기는 연한 청색(VP1), 연한 녹색(VP2) 및 연한 적색(VP3)으로 도시된다. 협곡 영역은 황색으로 도시된다.
도 47. EV68-228 Fab 중쇄의 벌키한 측쇄. 이 도면은 EV68-228 Fab를 안정화하기 위해 소수성 상호작용 네트워크를 형성하는 벌키한 측쇄의 예를 나타내고, 이는 EV68-159 Fab의 구조에서도 관찰된다.
도 48A-C. Expt. NIA-1930. 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가. 폐 바이러스 역가는 감염 후 1일차(도 48A), 3일차(도 48B) 및 5일차(도 48C)에 제시된다. 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ****P<0.0001)
도 49A-C. Expt. NIA-1930. 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 1일차(도 49A), 3일차(도 49B) 및 5일차(도 49C)에 제시된다. 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스의 혈액에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 1일, 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001)
도 50. 내선 NIA-1930. 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α, IL-1β, IL-2 및 IL-3의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 1일, 3일 및 5일차에 IL-1α의 농도를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료도 감염 후 3일차에 IL-1β의 농도를 감소시켰다. hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-1β의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-2 또는 IL-3의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 51. Expt. NIA-1930. 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5의 농도를, 감염 후 3일 및 5일차에 IL-6의 농도를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 및 IL-6의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-4 또는 IL-10의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 52. Expt. NIA-1930. 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-12p70, IL-17, MCP-1 및 IFN-γ의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 MCP-1 농도를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-12p70, IL-17 또는 IFN-γ의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 53. Expt. NIA-1930. 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 1일 및 3일차에 MIP-1α의 폐 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일 및 5일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다. 10mg/kg 용량의 hIVIG는 감염 후 1일과 3일차에 MIP-1α의 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일차에 RANTES의 농도도 감소시켰다. EV-D68 감염 후 TNFα 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 54A-B. Expt. NIA-1930. 감염 24시간 후 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가. 폐 바이러스 역가는 감염 후 3일차(도 54A) 및 5일차(도 54B)에 제시된다. 감염 후 3일차 또는 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001)
도 55A-B. Expt. NIA-1930. 감염 24시간 후 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 3일차(도 55A) 및 5일차(도 55B)에 제시된다. 감염 후 3일차 또는 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스의 혈액에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001).
도 56. Expt. NIA-1930. 감염 24시간 후 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α, IL-1β, IL-2 및 IL-3의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-1α 및 IL-1β의 농도를 유의하게 감소시켰다. IL-3의 농도는 감염 후 3일차에 EV68-228-TP로 치료된 마우스 및 hIVIg로 치료된 마우스에서 유의하게 감소했다. 감염 후 IL-2 농도에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 57. Expt. NIA-1930. 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5의 농도를, 감염 후 3일차 및 5일차에 IL-6의 농도를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-4 또는 IL-10의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 58. Expt. NIA-1930. 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-12p70, IL-17, MCP-1 및 IFN-γ의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 MCP-1 농도를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-12p70, IL-17 또는 IFN-γ의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 59. Expt. NIA-1930. 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 MIP-1α의 폐 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일차 및 5일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다. EV-D68의 감염 후, TNFα 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 60A-B. Expt. NIA-1930. 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가. 폐 바이러스 역가는 감염 후 3일차(도 60A) 및 5일차(도 60B)에 제시된다. EV68-228-CHO만이 감염 후 3일차 또는 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001).
도 61A-B. Expt. NIA-1930. 감염 48시간 후 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 3일차(도 61A) 및 5일차(도 61B)에 제시된다. 감염 후 3일차 또는 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스의 혈액에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001).
도 62. Expt. NIA-1930. 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α, IL-1β, IL-2 및 IL-3의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-CHO에 의한 치료만이 감염 후 3일차에 IL-1α 및 IL-1β의 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-2 또는 IL-3의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 **P<0.01). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 63. Expt. NIA-1930. 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 폐 농도. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-6 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 IL-4, IL-5 또는 IL-10의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. (위약 치료된 마우스와 비교하여 **P<0.01). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 64. Expt. NIA-1930. 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 IL-12p70, IL-17, MCP-1 및 IFN-γ의 폐 농도. 감염 후 IL-12p70, IL-17, MCP-1 또는 IFN-γ의 농도에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 65. Expt. NIA-1930. 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 AG129 마우스로부터의 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES의 폐 농도. EV-D68의 감염 후, TNFα, MIP-1α, GM-CSF 또는 RANTES 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 66. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염의 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 생존. (n=10 마우스/그룹). 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 치료는 사망으로부터 마우스를 완전히 보호했다. 10mg/kg의 EV68-228-CHO로 치료된 10마리의 마우스 모두 사망으로부터 보호되었다. 10mg/kg의 IVIg 용량은 10마리 중 8마리의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 위약 치료된 마우스 10마리 중 9마리가 감염에 굴복했다(위약 치료 마우스와 비교하여 ***P<0.001, ****P<0.0001).
도 67. Expt. NIA-1931. 감염 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 10일령의 AG129 마우스의 초기 체중의 백분율. 위약 치료 마우스와 비교하여 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 마우스에서는 체중 감소의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 체중 감소로부터 마우스를 보호하지 못했다.
도 68A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 감염 1일차 및 3일차의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 1일차(도 68A) 및 3일차(도 68B)에 제시된다. 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 감염 24시간 전의 치료는 감염 후 1일차 및 3일차에 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 EV68-228-CHO에 의한 감염 24시간 전의 치료는 감염 후 1일차 및 3일차에 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 전에 10mg/kg의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001).
도 69A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 감염 5일차 및 7일차 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 5일차(도 69A) 및 7일차(도 69B)에 제시된다. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 감염 24시간 전의 치료는 감염 후 5일차에 바이러스 역가를 감소시켰다. 감염 후 7일차에는 바이러스가 검출되지 않았다.
도 70A-C. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 감염 2 내지 10일 후에 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 신경학적 스코어. 신경학적 스코어는 감염 후 2-4일차(도 70A), 5-7일차(도 70B) 및 8-10일차(도 70C)에 제시된다. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 감염 24시간 전의 치료는 신경학적 스코어로 측정한 바와 같이 마비의 임상 징후를 완전히 예방했다. 감염 24시간 전에 10mg/kg 용량의 IVIg로 치료된 마우스에서는 신경학적 스코어가 관찰되지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 ****P<0.0001).
도 71. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 생존. (n=10 마우스/그룹). 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 치료는 사망으로부터 마우스를 완전히 보호했다. 10mg/kg의 EV68-228-CHO로 치료된 10마리의 마우스 모두 사망으로부터 보호되었다. 10mg/kg의 IVIg는 10마리 중 10마리의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 위약 치료된 마우스 10마리 중 8마리가 감염에 굴복했다(위약 치료된 마우스와 비교하여 ***P<0.001).
도 72. Expt. NIA-1931. 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 EV-D68 감염 10일령 AG129 마우스의 초기 체중의 백분율. 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 24시간 후에 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 체중 감소의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 체중 감소로부터 마우스를 보호하지 못했다.
도 73A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 감염 후 1일 및 3일차의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 1일차(도 73A) 및 3일차(도 73B)에 제시된다. 감염 24시간 후에 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 치료는 감염 후 3일차에 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 10mg/kg의 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 10mg/kg의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001).
도 74A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 감염 후 5일차 및 7일차에 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 5일차(도 74A) 및 7일차(도 74B)에 제시된다. 감염 후 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료한 후, 바이러스는 검출되지 않았다. 감염 후 7일차에서는 어떤 마우스로부터도 바이러스가 검출되지 않았다.
도 75A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 후 2-9일차에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령 AG129 마우스의 신경학적 스코어. 신경학적 스코어는 감염 후 2-5일차(도 75A) 및 6-9일차(도 75B)에 대해 제시된다. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 감염 24시간 후의 치료는 감염 후 2-9일차에 신경학적 스코어로 측정한 바와 같이 마비 징후를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 2일차 및 3일차에 신경학적 스코어만을 감소시켰다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 76A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 후 10-17일차에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 후 24시간 치료된 10일령 AG129 마우스의 신경학적 스코어. 신경학적 스코어는 감염 후 10-13일차(도 76A) 및 14-17일차(도 76B)에 대해 제시된다. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 감염 후 24시간 치료는 감염 후 10-16일차에 신경학적 스코어로 측정한 바와 같이 마비 징후를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 10mg/kg 용량의 hIVIg 치료는 신경학적 스코어를 유의하게 감소시키지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, **P<0.01). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
도 77. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 생존. (n=10 마우스/그룹). 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 치료는 10마리 중 9마리의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 10mg/kg의 EV68-228-CHO로 치료된 마우스의 10마리 중 8마리가 사망으로부터 보호되었다. 10mg/kg의 IVIg 용량은 10마리 중 6마리의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 위약 치료된 마우스의 10마리 중 9마리가 감염에 굴복했다(위약 치료된 마우스와 비교하여 **P<0.01, ***P<0.001).
도 78. Expt. NIA-1931. EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68 감염 10일령 AG129 마우스의 초기 체중 백분율. 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 24시간 후에 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 처리된 마우스에서는 체중 감소의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 체중 감소로부터 마우스를 보호하지 못했다.
도 79A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 감염 1일차 및 3일차의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 1일차(도 79A) 및 3일차(도 79B)에 제시된다. 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 감염 48시간 후의 치료는 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다. 감염 48시간 후에 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다.
도 80A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 10일령 AG129 마우스의 감염 5일차 및 7일차의 혈액 바이러스 역가. 혈액 바이러스 역가는 감염 후 5일차(도 80A) 및 7일차(도 80B)에 제시된다. 감염 후 5일차에 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 후 24시간 처리한 후, 바이러스는 검출되지 않았다. 감염 후 7일차에 어떤 마우스로부터도 바이러스는 검출되지 않았다.
도 81A-B. Expt. NIA-1931. EV-D68에 감염되고 감염 후 3-10일차에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 10일령 AG129 마우스의 신경학적 스코어. 신경학적 스코어는 감염 후 3-6일차(도 81A) 및 7-10일차(도 81B)에 대해 제시된다. 감염 48시간 후에 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 치료는 감염 후 3-5일차에 신경학적 스코어를 유의하게 감소시켰다. 감염 48시간 후에 10mg/kg 용량의 EV68-228-CHO를 단일 투여하면, 감염 후 3-6일차에 신경학적 스코어로 측정한 바와 같이 마비 징후가 유의하게 감소했다. 감염 48시간 후에 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 신경학적 스코어를 유의하게 감소시키지 않았다. (위약 치료 마우스와 비교하여 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001). 그래프 내의 샘플 지정은 좌측에서 우측에 대응하고, 수직 범례는 상부에서 하부에 대응한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 엔테로바이러스 D68(EV-D68)은 세계적으로 대부분 어린이에게 호흡기 질환의 발생을 유발할 수 있다. 소아마비-유사 신경근 약화 증후군인 급성 이완성 척수염의 클러스터는 종종 EV-D68 호흡기의 발생과 동시에 발생한다. 혈청역학 연구에 따르면, 2세 내지 5세 이상의 거의 모든 사람의 혈청에는 항-EV-D68 중화 항체가 포함되어 있고, 이는 EV-D68이 소아기의 유비쿼터스 병원체임을 시사한다. 그러나, 체액성 면역 반응이 지시되는 바이러스 에피토프에 대한 지식은 관련 바이러스에 대한 이전 연구로부터만 추론된다. 여기에서, 본 발명자들은 EV-D68에 대한 64개의 인간 모노클로날 항체를 생성했고, 그 중 일부는 강력하게 중화된다. 이들은 이 병원체에 대한 최초의 인간 mAb인 것으로 믿어지고, 본 발명자들은 EV-D68 감염의 검출, 치료 및 예방에서 이들의 사용을 제안한다. 본 개시의 이들 및 다른 측면은 하기에서 상세하게 설명된다.
I. 엔테로바이러스 D68
엔테로바이러스 68(EV68, EV-D68, HEV68)은 엔테로바이러스인 피코나비리다에(Picornaviridae) 과의 구성원이다. 1962년에 캘리포니아에서 처음 단리되고, 한때 희귀종으로 여겨졌지만, 21세기에는 전 세계적으로 급증했다. 급성 이완성 척수염이라는 소아마비-유사 장애를 유발하는 것으로 의심된다.
EV68은 100종류 초과의 엔테로바이러스 중의 하나이고, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 및 에코바이러스를 포함하는 ssRNA 바이러스 그룹이며, 외피가 없다. 다른 모든 엔테로바이러스와 달리, EV68은 산성 불안정성과 낮은 최적 성장 온도를 나타내고, 이들 둘 다는 인간 라이노바이러스의 특징이다. 이전에, 일부 연구자들은 인간 라이노바이러스 87이라고 불렀다. 천식과 면역억제를 갖는 성인의 질환도 보고되었지만, 5세 미만의 어린이와 천식을 갖는 어린이가 이 질환에 걸릴 위험이 가장 높은 것으로 보인다.
EV68이 발견된 이후로, EV68은 고립된 경우에 대부분 산발적으로 기술되었다. 2005년과 2011년 사이에 6개의 클러스터(10건 이상) 또는 발생이 필리핀, 일본, 네덜란드 및 미국의 조지아주, 펜실베니아주 및 애리조나주에서 보고되었다. EV68은 캘리포니아에서 2012/13년에 발생한 소아마비-유사 질환 클러스터의 5명의 어린이 중 2명에서 발견되었다. 2014년 8월, 이 바이러스는 미국에서 호흡기 질환의 클러스터를 유발했다. 10월 중순까지 46개 주와 컬럼비아 특별구에서 691명이 EV-D68에 의한 유발된 호흡기 질환에 걸렸고, 5명의 어린이가 사망했다. 2016년에는 유럽에서 29건의 사례가 보고되었다(프랑스와 스코틀랜드에서 5건, 스웨덴, 노르웨이 및 스페인에서 각각 3건).
2000년 이후, 원래의 바이러스 균주는 다양화하고, 유전적으로 상이한 발생 균주인 클레이드 B1을 진화시켰다. 이는 클레이드 B1이지만, AFM과 연관되어 있고 동물 모델에서 신경병증인 보다 오래된 균주는 아니다. 사례는 엔테로바이러스 시즌(대략 춘분과 추분 사이의 기간)에 발생하는 것으로 설명되었고, 이는 일반적으로 북반구에서 8월과 9월에 발생했다.
EV68은 거의 예외 없이 호흡기 질환을 유발하고, 이는 경증으로부터 중증까지 다양하지만, 전혀 증상이 없는 것으로부터 미묘한 독감 유사 증상, 쇠약성의 호흡기 질환 및 소아마비-유사 증후군의 증상에 드물게 관여하는 것으로 의심되는 관련 증상까지 다양한 증상을 유발할 수 있다. 모든 엔테로바이러스와 마찬가지로, 다양한 발진, 복통 및 연변을 유발할 수 있다. 초기 증상은 콧물, 인후통, 기침, 발열 등 감기의 증상과 유사하다. 질환이 진행됨에 따라, 폐렴과 같은 호흡곤란, 주의력 저하, 소변량 감소, 탈수 등의 보다 심각한 증상이 발생하고, 호흡부전을 유도할 수 있다.
경험한 증상의 중증도는 해당 인구통계학적 모집단에 따라 달라진다. 전문가들은 인구의 대다수가 실제로 엔테로바이러스에 노출됐지만, 건강한 성인에서는 증상이 나타나지 않는다고 추정한다. 대조적으로, EV-D68은 매우 약한 어린이뿐만 아니라, 매우 어린 어린이에게도 불균형적으로 쇠약해진다. 수백 명(472명)(대부분 청년)이 이 질환에 노출되었지만, 중증의 증상(예: 마비)으로 진단된 환자는 100명 미만이다.
이 바이러스는, 급성 이완 척수염의 희귀 근력 저하의 한 가지 원인으로 의심되고, 통상은 소아마비가 원인이고, 이는 바이러스의 검사에서 양성으로 된 2명의 캘리포니아 어린이는 발증으로부터 48시간 이내에 하나 이상의 사지가 마비되어 최고의 중증도에 도달했기 때문이다. 운동 기능의 회복은 6개월의 추적 관찰에서 불충분했다. 2014년 10월 시점에서, CDC는 엔테로바이러스 D68 활동의 증가와 일치하여, 콜로라도주 및 전국의 다른 보고서에서 마비 및/또는 두개 기능장애의 10건을 조사하고 있었다. 2014년 10월 현재, 실제의 사례 수는 100건 이상일 것으로 여겨졌다. 2018년 시점에서, EV-D68과 마비의 연관성은 강력하여, 브래드포드 힐(Bradford Hill)의 6개 기준을 완전히 충족하고, 2개를 부분적으로 충족한다. CDC는, 2018년 10월 17일에, "현재, 소아마비 바이러스가 이러한 AFM 사례의 원인이 아니라는 것을 알고 있다. CDC는 AFM 환자의 모든 대변 검체를 검사했지만, 소아마비 바이러스 양성의 검체는 없었다"고 말했다. 2014년에, 검출 속도를 높이기 위한 실시간 PCR 시험이 CDC에 의해 개발되었다.
특정한 치료법도 없고 백신도 없기 때문에, 질환은 이의 경과를 따라야 하고; 치료는 증상에 대해 수행된다(증상 치료). 대부분의 사람들은 완전히 회복되지만; 그러나, 일부는 입원해야 하고, 일부는 바이러스의 결과로서 사망했다. 5건의 EV68 마비 사례는 스테로이드, 정맥내 면역글로불린 및/또는 혈장 교환에 의한 치료에 실패했다. 운동 기능의 회복이 관찰되지 않았기 때문에, 치료는 명백한 이점이 없었다. 2015년 연구에서는 항바이러스제 플레코나릴이 EV-D68 치료에 유용할 수 있다고 시사했다.
이 바이러스는 대변뿐만 아니라 타액 및 가래를 통해 확산되기 때문에, 손을 씻는 것이 중요하다. 아픈 사람들은 재채기 또는 기침할 때에 코와 입을 가리는 것 등의 기본적 위생 대책에 의해 바이러스 확산을 감소시키려고 시도할 수 있다. 표면 및 장난감의 세정을 포함하는 기타 조치. EV-D68 감염으로 입원한 환자의 경우, CDC는 모든 엔테로바이러스에 권장되는 바와 같이 감염에 기초하는 예방 조치, 즉 표준 예방 조치, 접촉 예방 조치를 권장하고, 비말 예방 조치를 검토할 것을 권장한다. 2003년의 CDC에 따르면, 의료 시설의 표면은 몇몇 비외피 바이러스(예: 노로바이러스, 폴리오바이러스, 라이노바이러스)에 대해 EPA 라벨 표시된 병원 등급의 소독제로 세정해야 한다.
A. 바이러스 에피토프
혈청 항체 바이러스 중화 능력의 측정은 폴리클로날 항체 레퍼토리 전체의 활성을 반영한다. 그러나, 바이러스에 대한 체액성 반응을 완전히 이해하기 위해, 개별 항체가 결합하는 특정 바이러스 에피토프를 정의하고, 특정 에피토프에 결합하는 항체가 질환으로부터 보호하는지의 여부를 판단할 필요가 있다. 역사적으로, 엔테로바이러스 속의 바이러스에 대한 4개의 중화 면역에피토프(Nim)는 라이노바이러스-B14에 대해 생성된 뮤린 모노클로날 항체의 연구를 통해 동정되었다[참조: Rossmann et al., 1985]. EV-D68 특이적 모노클로날 항체 에피토프에 대한 연구는 현재까지 수행되지 않았다. 그러나, EV-D68의 결정 구조의 결정은 라이노바이러스와의 구조적 상동성을 관찰함으로써 EV-D68 비리온 상의 4개의 Nim의 위치의 가능성을 시사했다[참조: Liu et al., 2015a]. 미국[참조: Zhang et al., 2015] 또는 일본[참조: Imamura et al., 2014]로부터 EV-D68의 최근 인간 단리된 표면 단백질의 아미노산 서열을 페르몬(Fermon) 참조 바이러스 균주의 아미노산 서열과 비교한 연구는, Nim 및 근처의 인접 잔기에서 돌연변이가 특히 결정 구조가 무질서한 캡시드 단백질 VP1의 BC 및 DE 루프에서 발생했음을 시사한다[참조: Liu et al., 2015a]. 이러한 VP1 다형성은 기존의 체액성 면역을 회피함으로써 바이러스의 병원성의 증가에 기여하는 것이 가능하다. 뮤린 모노클로날 항체는 상업적으로 이용 가능하지만(출처에는 GeneTex, ThermoFisher 및 Sigma 포함), 면역원으로 사용된 특정 바이러스 표면 단백질의 목록을 제외하고, 이러한 항체의 에피토프에 대한 정보는 없다. 특히, 이러한 상용 항체 중 일부는 기타 엔테로바이러스 속 바이러스의 면역원으로부터 생성된 것이고, 이는 이형 항체가 EV-D68에 결합하는 능력을 시사한다. 이 가능성을 추가로 뒷받침하는 것으로서, 2개의 뮤린 mAb가 40개의 상이한 엔테로바이러스 종에 교차 반응했지만, 흥미롭게도 EV-D68이 반응하지 않은 유일한 시험 바이러스였다[참조: Miao et al., 2009]. 기타 유형의 엔테로바이러스에 의해 유도된 항체에 의한 EV-D68의 이형 분자 인식은 인생의 초기 단계에서 관찰된 보편적 EV-D68 혈청유병률에 기여할 수 있다. EV-D68 상의 인간 항체 에피토프의 미세한 특이성과 이러한 항체의 유형 특이성 또는 폭을 이해하는 것은 자연 감염에 의해 유도된 클론 인간 모노클로날 항체를 사용한 연구가 필요하다.
미국에서 2014년의 EV-D68이 발생하는 동안, 거의 모든 바이러스 분리주가 새로 출현한 B1 클레이드의 것이고, 밀접하게 관련된 B2 클레이드 또는 멀리 관련된 D 클레이드로부터의 바이러스의 검출은 보다 적었다[참조: Tan et al., 2016]. 이 연구의 1명을 제외한 모든 대상체는 B1 클레이드 분리주에 감염되었다(표 E). 2014년 이래, B3 클레이드 바이러스가 우세했고, B1 클레이드 바이러스는 더 이상 순환하지 않고[참조: Dyrdak et al., 2019], 2018년에, 미국 질병 예방 관리 센터에 의해 서열분석된 모든 EV-D68 분리주는 B3 클레이드로부터의 것이었다[참조: Kujawski et al., 2019]. 본 발명자들은 먼저 B1 클레이드 EV-D68 분리주를 사용하여 50% 세포 배양 감염 용량(CCID50) 검정에서 각 mAb의 시험관내 중화 능력을 측정했다(도 33A). 28개의 mAb는 50μg/mL 미만의 절반 최대 억제 농도(IC50)로 중화를 입증했고, mAb EV68-159는 0.32ng/mL의 IC50 값에서 가장 강력한 중화를 나타냈다(도 41). 본 발명자들은 D 클레이드 분리주에 대해 21개의 가장 강력하게 중화하는 mAb를 추가로 시험하고, 11개의 mAb가 그 바이러스를 중화시키고, 그 중 7개가 이종 바이러스의 IC50 값에 의해 적어도 10배의 효능 저하를 나타내는 것을 밝혀냈다. 페르몬(Fermon) 균주는 1962년으로부터의 분리주이고, 현대의 EV-D68 분리주와 매우 멀리 먼 관계에 있기 때문에, 클레이드 분류 체계에 적합하지 않다[참조: Tan et al., 2016]. 9개의 mAb는 페르몬 실험실 참조 균주를 중화했지만, 현대의 B1 클레이드 바이러스를 억제하는 것보다 덜 강력했다.
중화 검정은 교차 반응성을 과소평가할 수 있음을 인식하여, 본 발명자들은, 상기와 동일한 간접 ELISA 접근법을 사용하여, B1, B2 또는 D 클레이드으로부터의 대표적 EV-D68 분리주에 결합하기 위한 정제 mAb의 최대 유효 농도의 절반(EC50)을 생성했다(도 33B-C 및 도 42). ≤ 1 ㎍/mL의 B1 클레이드 분리주에 대한 결합에 대한 EC50 값을 갖는 mAb 중에서, 모두가 B2 클레이드 분리주에 결합하고, 약 절반은 D 클레이드 분리주에도 결합했다(도 33B 및 도 41). 일반적으로 약하게 결합하지만 시험된 모든 클레이드의 바이러스에 교차 반응하는 추가 부류의 mAb가 관찰되었다.
현재까지, 항체-EV-D68 상호작용의 구조적 연구는 마우스 mAb로 한정되었다[참조: Zheng et al., 2019]. 본 발명자들은 2개의 강력하게 중화하는 인간 mAb, 클레이드 특이적 mAb EV68-159 및 고도로 교차 반응성의 mAb EV68-228을 선택하여, 항원 결합 단편(Fab)과의 면역 복합체 및 크리오-전자 현미경(크리오-EM) 연구용의 B1 클레이드 EV-D68 분리주를 제조했다. 최종 밀도 맵은 2.9Å(EV68-159) 또는 3.1Å(EV68-228)의 해상도를 달성했다(도 34A, 도 43, 도 44 및 표 G). 구조는 2개의 상이한 결합 부위를 나타냈다: EV68-159는 3중 대칭 축 주위에 부착된 반면, EV68-228은 협곡 영역을 형성하는 함몰부 사이의 5중 축 주위에 결합했다(도 34A-C, 도 45). 따라서, 각 Fab에 대해, 총 60개의 카피가 바이러스 입자에 결합했다. 바이러스 표면과 상호작용하는 Fab 가변 도메인은 바이러스 캡시드 단백질과 유사한 강력한 밀도를 나타내고, 각 Fab의 원자 모델은 4개의 바이러스 캡시드 단백질과 함께 구축되었다. 대조적으로, 바이러스 표면에서 추가로 멀리 위치하는 Fab 불변 도메인은 보다 약한 밀도를 나타내고, 원자 모델의 구축으로부터 제외되었다. 폴리펩타이드 쇄의 백본과 아미노산 측쇄의 대부분은 밀도 맵에서 적절히 정렬되어 있고, 이는 바이러스 입자와 Fab 분자 사이의 결합 계면의 중요한 특징을 입증한다.
B. 신경 질환의 동물 모델
시험관내에서 항체에 의한 바이러스 중화를 측정하는 것은 통상 항체의 항바이러스 기능을 특성화하는 가장 신속하고 재현 가능한 방법이다. 그러나, 이 시험 방식은, 보체 활성화 또는 세포 표면 Fc 수용체와의 결합과 같이 생체내에서만 기능하는 항체의 Fc 부분에 의해 매개되는 이펙터 기능은 측정하지 않는다. 결과적으로, 시험관내 중화 능력의 크기는 바이러스 복제의 억제 수준 또는 생체내에서 관찰되는 질환에 대한 보호 수준과 완전하게 상관관계가 없을 수 있다[참조: (Lu et al., 2018)에서 검토]. 항체의 Fc 매개 이펙터 기능의 대부분은 완전한 보호 효과를 매개하기 위해 자연 면역계 또는 획득 면역계의 Fc 수용체 보유 세포를 필요로 한다. 전임상 연구에서 체액성 면역의 효능을 평가하기 위해서는 감염의 작은 동물 모델이 필요하다.
콜로라도[참조: Hixon et al., 2017a; 2017b], 유타[참조: Morrey et al., 2018] 및 중국[참조: Zhang et al., 2018]의 연구자는 2017년 초부터 EV-D68의 마우스 모델을 보고했다. 보고된 3개의 모델 모두에서, 10일령 이내의 마우스에게 바이러스를 접종한다. 이러한 모델 전체에서, EV-D68은 복강내[참조: Hixon et al., 2017a; 2017b; Morrey et al., 2018; Zhang et al., 2018], 근육내[참조: Hixon et al. 2017a; 2017b] 또는 뇌내 경로[참조: Hixon et al., 2017b] 투여될 때에 이완성 사지 마비 및 사망을 유발할 수 있는 것으로 나타났다. 특히, 비강내 접종은 시험된 73마리의 비근친교배 NIH 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스 중 2마리에서만 마비를 유도하고, 척수에서 바이러스가 검출된 반면[참조: Hixon et al., 2017b], 인터페론 유형-I 및 -II 수용체를 결여하는 AG129 마우스의 비강내 접종은 척수가 아닌 근육에서 바이러스가 검출된 4마리 마우스 중 2마리에서 마비를 유발했다[참조: Morrey et al., 2018]. 그러나, 마우스에서 체액성 면역이 평가된 모든 연구는 바이러스 접종의 비생리학적 경로를 사용했다.
바이러스 항원은 골격근[참조: Morrey et al., 2018; Zhang et al., 2018] 및 척수[참조: Hixon et al., 2017b; Morrey et al., 2018]의 면역염색에 의해 조직에서 시각화되었다. 근육과 척수 둘 다의 관여는, EV-D68이 2개 메커니즘에 의해 마비를 유도할 수 있음을 시사한다: 1) 골격근에 대한 직접적 병리학적 효과 및 2) 중추 운동 뉴런의 상실. 척수의 운동 뉴런이 감염되었는데, 이는 소아마비의 병인과 유사하다. 면역염색 연구에서 뮤린 뉴런의 관여의 이러한 패턴은 AFM 환자의 척수 이미징에서 회백질 변화의 소견과도 상관관계가 있다[참조: Hixon et al., 2017b; Morrey et al., 2018]. 보다 민감한 실시간 정량적 RT-PCR 시험은 주로 근육과 척수뿐만 아니라, 뇌, 심장, 폐, 장, 간, 비장, 신장 및 혈액에서도 EV-D68 RNA가 검출되었다[참조: Zhang et al., 2018]. 그러나, 척수와 근육 외에는, 검출된 RNA의 양은 의심스러운 의미가 있었고, 이러한 조직의 진정한 지향성보다는 이러한 조직 내의 혈액에 존재하는 바이러스 게놈 카피를 양호하게 반영할 수 있다.
마비 및 치사의 이러한 모델에 대한 연구는 신경 질환으로부터 보호하는 항체의 능력에 대한 예비 연구를 촉진했다. EV-D68이 뇌내 경로를 통해 직접 접종된 경우에도, 나이브 마우스에게 수동적으로 전달된 면역 마우스로부터의 열-불활성화 혈청은 신경 질환을 예방했다[참조: Hixon et al., 2017b]. 또한, 인간 IVIG의 치료적 투여는 마우스 감염 후 6일까지 운동 장애를 감소시켰고[참조: Hixon et al., 2017a], 이는 IVIG에서 EV-D68 특이적 항체의 높은 역가의 소견과 일치한다[참조: Zhang et al., 2015]. 이 관찰은, 개별 환자가 EV-D68과 일시적으로 연관되는 AFM의 특징을 갖는 것으로 확인된 후, 백신 또는 인간 모노클로날 항체가 치료 효과를 매개할 수 있다는 희망을 제공한다. 또한, EV-D68의 공지된 발생 기간 동안 모체 체액성 면역이 약화된 영아 및 유아 등의 인구 모집단의 표적 백신접종 또는 면역예방은 AFM 사례를 예방할 수 있다.
C. 호흡기 질환의 동물 모델
EV-D68 감염에 관한 현재 마우스 연구의 주요 제한은, 마비 및 사망을 유도하기 위한 비생리학적 접종 경로의 사용과, 인간에서 EV-D68 감염의 주요 증상인 호흡기 질환의 부족이다. 코튼 랫트(Sigmodon hispidus)(Patel et al., 2016)와 페렛(Mustela putorius furo)(Zheng et al., 2017a) 모두에 대해, 각각의 단일 연구에 의해, EV-D68의 비강내 접종이 코와 폐에서 바이러스 복제를 초래하고 폐에서 전염증성 자연 면역 분자 전사체의 증가를 유도한다는 것이 입증되었다. 상기도 감염(기침, 콧물, 코 건조)과 일치하는 임상 증상도, 접종된 페렛의 약 25%에서 발증했다. 근육 또는 중추신경계 조직에서 EV-D68의 존재를 평가한 연구도, 명백한 사지 약화 또는 마비도 인식하지 않았다. 코튼 랫트의 백신접종은 일부 수준의 기존 체액성 면역이 호흡기 감염을 완전히 보호하지 못했고, 하기 추가로 기재되는 발견에서 실제로 유해할 수 있음을 나타낸다[참조: Patel et al., 2016].
인간 호흡기 바이러스 감염에 대한 모델로서 코튼 랫트와 페렛의 이론적 이점은 각각의 호흡기 상피가 특히 상피 표면의 글리칸의 시알화와 관련하여 인간 호흡 상피를 보다 밀접하게 모방할 수 있다는 것이고, 이는 인간에서는 강력하게 α2,6-결합되지만, 마우스에서는 결합하지 않는다[참조: Gagneux et al., 2003]. EV-D68은 시험관내 글리칸 어레이에서 α2,3-결합 시알산보다 α2,6-결합 시알산에 우선적으로 결합했다[참조: Imamura et al., 2014]. 형광 표지된 렉틴에 의한 기도의 염색은, 코튼 랫트가 하부 기도에 α2,6-결합 시알산만을 갖고, 상부 기도에 α2,6- 및 α2,3-결합 시알산의 혼합물을 갖는 것을 나타냈다[참조: Blanco et al., 2018]. 유사한 렉틴-기반 방법을 사용하여, 페렛은 상부 기도의 상피 글리칸에 α2,6-결합 시알산을 갖고[참조: Leigh et al., 1995], 하부 기도에 α2,6- 및 α2,3-결합 시알산의 혼합물을 갖는 것을 나타냈다[참조: Zheng et al., 2017a]. 그러나, 인간(Walther et al., 2013), 마우스(Bern et al., 2013) 및 페렛(Jia et al., 2014) 호흡기 조직에 대한 보다 최근의 정교한 글리코믹 분석은, 단순한 α2,6-결합 시알화의 밀도보다 일련의 글리칸 변형이 상이한 동물 종의 호흡기 바이러스의 친화성을 결정할 가능성이 있음을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, 랫트와 페렛에서 인간 EV-D68 호흡기 질환의 모방에서 초기 연구의 성공은 인간 병인의 모델로서의 추가 개발에 고무적이다.
D. 백신
EV-D68에 대한 실험적 백신 후보는 아직 임상 개발에 들어가지 않았지만, 효모[참조: Zhang et al., 2018a] 또는 곤충 세포[참조: Dai et al., 2018]에서 생성된 바이러스 유사 입자(VLP) 백신 또는 베타-프로피오락톤 비활성화 EV-D68[참조: Zhang et al., 2018] 중의 어느 하나를 마우스에게 접종하는 초기 연구는 유망하다. VLP 백신은 이후의 치명적 복강내 챌린지로부터 마우스를 보호하는 항체 반응을 유도했다. 이러한 백신 후보 각각을 사용하여, 나이브 마우스에 대한 백신 면역 혈청의 수동적 전달은 치명적 복강내 챌린지로부터의 보호에 충분했다. VLP 기반 백신의 가능한 단점은 이러한 합성 작제물이 입자 표면의 모든 형태적으로 민감한 구조를 완전히 재현하는지의 여부에 대한 불확실성이다. 다른 바이러스에 대한 다수의 강력한 인간 바이러스 중화 항체는 엄격한 형태적 제약이 있는 복잡한 4차 항원 부위를 인식한다[참조: Crowe, JE, 2017]. VLP 상의 인간 항체 에피토프의 완전성은, 이러한 에피토프가 불명이기 않기 때문에, 현재 평가할 수 없다. 이러한 뮤린 백신 연구의 가능성을 추가로 완화하는 것은 살아있는 또는 UV 비활성화 EV-D68 중 어느 하나를 근육내 접종하고, 이어서, 나이브 동물의 감염과 비교하여 폐에서 염증의 향상이 관찰된 살아있는 동종 바이러스로 비강내 챌린지했다[참조: Patel et al., 2016]. 구체적으로, UV 비활성화 바이러스 백신접종은 폐 또는 코에서 바이러스 복제를 제한하지 않았고, 생 바이러스 백신접종으로부터의 면역에서 관찰된 균형 잡힌 Th1 및 Th2 표현형이 아닌 Th2 표현형을 향해 수득된 사이토카인 서명을 왜곡했다. 염증 및 질환의 향상은, 호흡기 합포체 바이러스[참조: Karron, R, 2018] 및 홍역[참조: Strebel et al., 2018]에 대한 비활성화 바이러스 백신 후보에서 주목되어 왔다. 이러한 혼합된 결과를 감안하면, EV-D68 백신 후보에 의해 유발된 보호 또는 향상의 면역 상관관계에 대한 추가의 신중한 연구가 필요하다.
II. 모노클로날 항체 및 이의 생산
"단리된 항체"는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질 또는 비단백질 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정된 항체의 95중량% 초과, 및 가장 특히 99중량% 초과까지; (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여, N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지; 또는 (3) 쿠마시에 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건에서 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제된다. 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 제자리에서의 항체가 포함된다. 그러나, 일반적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
기본적 4개-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 헤테로사량체 당단백질이다. IgM 항체는 5개의 기본 헤테로사량체 단위와 J 쇄라고 하는 추가 폴리펩타이드로 구성되어 있기 때문에, 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합하여, J 쇄와 함께 2-5개의 기본 4-쇄 단위를 포함하는 다가 집합체를 형성할 수 있다. IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L 쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 결합되어 있는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 쇄 내 디설파이드 브릿지를 갖고 있다. 각 H 쇄는 N-말단에 가변 영역(VH)을 갖고, 이어서 알파 및 감마 쇄의 각각에 3개의 불변 도메인(CH)과 뮤 및 아이소타입에 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 쇄는 N-말단에 가변 영역(VL)을 갖고, 다른 쪽 끝에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn ., 1994, page 71, and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 L 쇄는 불변 도메인(CL)의 아미노산 서열에 기초하여 카파와 람다라고 하는 2개의 명확하게 상이한 유형 중 어느 하나로 할당될 수 있다. 이들의 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입으로 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 부류가 있고, 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지정된 중쇄를 갖는다. 감마 및 알파 부류는 CH 서열 및 기능의 비교적 사소한 차이에 기초하여 서브클래스로 분류되고, 인간은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2의 서브클래스를 발현한다.
"가변"이라는 용어는 V 도메인의 특정 세그먼트가 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 범위 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 비교적 불변 스트레치로 구성되고, 각각 9-12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"이라고 하는 극단의 가변성의 보다 짧은 영역으로 분리된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR을 포함하고, 주로 베타 시트 구성을 채용하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 베타 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]. 불변 도메인은, 항체가 항원에 결합하는 데 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식세포 작용(ADCP), 항체 의존성 호중구 식세포 작용(ADNP) 및 항체 의존적 보체 침착(ADCD)에서 항체의 참여 등의 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기[예를 들면, 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 약 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서 약 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]; 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기[예를 들면, 초티아 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH에서 26-32(H1), 52-56 (H2) 및 95-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; 및/또는 "초가변 루프"/CDR로부터의 잔기[예를 들면, IMGT 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH에서 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3); Lefranc, MP et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212(1999), Ruiz, M. et al. al. Nucl. Acids Res. 28:219-221(2000)]을 포함한다. 임의로, 항체는 하기 포인트 중의 하나 이상에서 대칭적 삽입물[예를 들면, AHo에 따라 넘버링되는 경우, VL에서 28, 36(L1), 63, 74-75(L2) 및 123(L3) 및 VsubH에서 28, 36(H1), 63, 74-75(H2) 및 123(H3); Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670(2001)]을 갖는다.
"생식세포계 핵산 잔기"는 불변 또는 가변 영역을 암호화하는 생식세포계 유전자에서 자연적으로 존재하는 핵산 잔기를 의미한다. "생식세포계 유전자"는 생식 세포(즉, 난자 또는 정자로 되는 운명의 세포)에서 발견되는 DNA이다. "생식세포계 돌연변이"는 단일 세포 단계에서 생식 세포 또는 접합자에서 발생한 특정 DNA의 유전적 변화를 지칭하고, 자손에게 전달되면, 이러한 돌연변이는 신체의 모든 세포에 도입된다. 생식세포계 돌연변이는 단일 체세포에서 획득되는 체세포 돌연변이와 대조적이다. 일부 경우에, 가변 영역을 암호화하는 생식세포계 DNA 서열의 뉴클레오티드는 돌연변이되고(즉, 체세포 돌연변이), 다른 뉴클레오티드로 치환된다.
본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 존재 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 추가로, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 개시에 유용한 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 또는 항원 특이적 B 세포, 감염 또는 면역화에 응답하는 항원 특이적 형질아세포의 단일 세포 선별, 또는 벌크 선별된 항원 특이적 수집에서 단리 세포로부터 결합된 중쇄 및 경쇄의 포획 후에 박테리아, 진핵생물 동물 또는 식물 세포(참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호)에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 작제할 수 있다, "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
A. 일반 방법
EV-D68에 결합하는 모노클로날 항체는 몇몇 용도가 있음을 이해할 것이다. 여기에는 EV-D68 감염의 검출 및 진단 및 이의 치료용 진단 키트의 생산이 포함된다. 이러한 맥락에서, 이러한 항체를 진단제 또는 치료제에 연결하거나, 이들을 포획제 또는 경쟁 검정의 경쟁물질로서 사용하거나, 추가 약제를 첨가하지 않고 개별적으로 사용할 수 있다. 항체는 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 돌연변이시키거나 변형시킬 수 있다. 항체를 제조하고 특성화하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 미국 특허 제4,196,265호].
모노클로날 항체(MAb)를 생성하는 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하는 방법과 동일한 방침에 따라 개시된다. 이 양 방법의 제1 단계는 적절한 숙주의 면역화, 또는 이전의 자연 감염 또는 허가된 백신 또는 실험적 백신에 의한 백신접종으로 인해 면역성을 갖는 대상체의 특정이다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 면역화를 위한 소정 조성물은 이의 면역원성이 상이할 수 있다. 따라서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 면역원을 담체에 커플링함으로써 달성될 수 있는 바와 같이, 숙주 면역계를 부스팅하는 것이 종종 필요하다. 예시적 및 바람직한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 오브알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 래빗 혈청 알부민 등의 기타 알부민도 담체로서 사용할 수 있다. 폴리펩타이드를 담체 단백질에 접합시키는 수단은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 글루타르알데히드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조화 벤지딘을 포함한다. 또한, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 애주번트로서 공지된 면역 반응의 비특이적 자극제를 사용함으로써 향상될 수 있다. 동물에서 예시적 및 바람직한 애주번트는 완전 프로인트 애주번트(사멸된 마이코박테리움을 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 애주번트 및 수산화알루미늄 애주번트를 포함하고, 인간에서는 명반, CpG, MFP59 및 면역자극 분자의 조합("애주번트 시스템", 예컨대, AS01 또는 AS03)이 포함된다. EV-D68 특이적 B 세포를 유도하기 위한 추가의 실험 형태의 접종이 가능하다. 여기에는 나노입자 백신, 또는 물리적 전달 시스템(예: 지질 나노입자 또는 금 바이올리스틱 비드)에서 DNA 또는 RNA 유전자로서 전달되고 바늘, 유전자 총, 경피 전기천공 장치로 전달되는 유전자 암호화 항원이 포함된다. 항원 유전자는 또한, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스 또는 알파바이러스 레플리콘 등의 복제 적격 또는 결함이 있는 바이러스 벡터, 또는 대안적으로 바이러스 유사 입자에 의해 암호화되는 바와 같이 운반될 수 있다.
자연 병원체에 대한 인간 항체의 경우, 적절한 접근법은 병원체에 노출된 대상체, 예를 들면, 질환에 걸린 것으로 진단된 대상체 또는 백신접종을 받아 병원체에 대해 보호 면역성을 생성하거나 실험적 백신의 안전성 또는 효능을 시험한 대상체를 특정하는 것이다. 순환하는 항-병원체 항체를 검출할 수 있고, 이어서 항체-양성 대상체로부터 B 세포를 암호화하거나 생산하는 항체를 수득할 수 있다.
폴리클로날 항체의 생산에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 성질과 면역화에 사용되는 동물에 따라 상이하다. 면역원을 투여하기 위해 다양한 경로를 사용할 수 있다(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내). 폴리클로날 항체의 생산은 면역화 후의 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링함으로써 모니터링할 수 있다. 2차 부스팅 주사도 제공될 수 있다. 적절한 역가가 달성될 때까지, 부스팅 및 역가 측정의 프로세스를 반복한다. 원하는 수준의 면역원성이 수득되면, 면역화된 동물로부터 채혈하고, 혈청을 단리하여 저장하고/하거나, 동물을 사용하여 MAb를 생성할 수 있다.
면역화 후, 항체 생성 가능성이 있는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)가 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택된다. 이 세포는 생검된 비장, 림프절, 편도선 또는 아데노이드, 골수 흡인물 또는 생검, 폐 또는 위장관 등의 점막 기관으로부터의 조직 생검 또는 순환 혈액으로부터 수득할 수 있다. 이어서, 면역화된 동물 또는 면역화된 인간으로부터의 항체 생성 B 림프구를 면역화된 동물 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포와 일반적으로 동일한 종의 하나인 불사멸성 골수종 세포의 세포와 융합시킨다. 하이브리도마 생성 융합 절차에서의 사용에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비항체 생성이고, 높은 융합 효율을 갖고, 효소 결함에 의해, 따라서 원하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 서포트하는 특정 선택 배지에서 성장할 수 있게 된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 다수의 골수종 세포 중 어느 하나를 사용할 수 있다[참조: Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984]. HMMA2.5 세포 또는 MFP-2 세포는 이러한 세포의 특히 유용한 예이다.
항체 생성 비장 또는 림프절 세포와 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 일반적으로 체세포와 골수종 세포를 2:1 비율로 혼합하는 것을 포함하지만, 비율은 세포막의 융합을 촉진하는 약제(들)(화학적 또는 전기적)의 존재하에 각각 약 20:1로부터 약 1:1까지 변화할 수 있다. 일부 경우에는, 초기 단계로서 엡스타인 바르 바이러스(EBV)로 인간 B 세포를 형질전환하면, B 세포의 크기가 증가하여, 비교적 큰 크기의 골수종 세포와의 융합이 향상된다. EBV에 의한 형질전환 효율은 형질전환 배지에서 CpG 및 Chk2 억제제 약물을 사용함으로써 향상된다. 대안적으로, 인간 B 세포는, IL-21 및 TNF 상과의 유형 II 구성원인 인간 B 세포 활성화 인자(BAFF) 등의 추가 가용성 인자를 함유하는 배지에서 CD40 리간드(CD154)를 발현하는 형질감염된 세포주와의 공-배양함으로써 활성화될 수 있다. 센다이 바이러스를 사용한 융합 방법은 문헌[참조: Kohler and Milstein(1975; 1976)]에 의해 기재되었고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예: 37%(v/v) PEG)을 사용한 융합 방법은 문헌[참조: Gefter et al. (1977)]에 기재되었다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용도 적절하고[참조; Goding, pp. 71-74, 1986], 보다 양호한 효율성을 위한 프로세스가 있다[참조: Yu et al., 2008]. 융합 절차는 통상 약 1 × 10-6 내지 1 × 10-8의 낮은 빈도로 실행 가능한 하이브리드를 생산하지만, 최적화된 절차를 사용하면, 200분의 1에 근접하는 융합 효율을 달성할 수 있다[참조: Yu et al., 2008]. 그러나, 선택 배지에서 배양함으로써, 생존 가능한 융합된 하이브리드가 모체의 주입된 세포(특히 통상은 무기한으로 계속 분열하는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에, 융합 효율이 비교적 낮은 것은 문제를 일으키지 않는다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 드 노보 합성을 차단하는 약제를 포함하는 것이다. 예시적 및 바람직한 약제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 퓨린과 피리미딘 모두의 드 노보 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지에는 뉴클레오티드의 공급원으로서 하이포크산틴 및 티미딘이 보충된다(HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 배지에는 하이포크산틴이 보충된다. 골수종에 융합되지 않은 EBV 형질전환 세포주를 제거하기 위해, B 세포 공급원이 EBV 형질전환된 인간 B 세포주인 경우, 쿠아바인(Ouabain)이 추가된다.
바람직한 선택 매체는 HAT 또는 쿠아바인을 갖는 HAT이다. 뉴클레오티드 구조 경로를 조작할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 구조 경로의 중요한 효소(예: 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT))에 결함이 있고, 생존할 수 없다. B 세포는 이 경로를 조작할 수 있지만, 배양 수명은 제한되어 있고, 통상은 약 2주 이내에 사망한다. 따라서, 선택적 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종과 B 세포에서 형성된 하이브리드이다. 융합에 사용되는 B 세포의 공급원이 EBV-형질전환된 B 세포의 계통인 경우, 여기에서와 같이, EBV-형질전환된 B 세포는 약물 사멸에 감수성이 있기 때문에, 오우아바인은 하이브리드의 약물 선택에도 사용될 수 있지만, 사용되는 골수종 파트너는 오우아바인 내성으로 되도록 선택되었다.
배양은 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마 모집단을 제공한다. 일반적으로, 하이브리도마의 선택은 미세역가 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 세포를 배양하고, 이어서 개별 클론 상청액(약 2-3주 후)을 원하는 반응성에 대해 시험함으로써 수행된다. 분석은 방사면역분석, 효소 면역분석, 세포독성 분석, 플라크 분석 도트 면역결합 분석 등의 민감하고 간단하고 신속해야 한다. 이어서, 선택된 하이브리도마는 유세포 분석 분류에 의해 연속 희석하거나 단일 세포로 선별하고, 개별 항체 생산 세포주로 클로닝하고, 이어서 이 클론을 무기한으로 증식시켜 mAb를 제공할 수 있다. 세포주는 2개 기본 방식으로 MAb 생산에 이용될 수 있다. 하이브리도마 샘플은 동물(예: 마우스)에 (종종 복강으로) 주사할 수 있다. 임의로, 동물은 주사 전에 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜타데칸) 등의 오일로 프라이밍된다. 인간 하이브리도마를 이와 같이 사용하는 경우, 종양 거부반응을 방지하기 위해 SCID 마우스 등의 면역부전 마우스를 주사하는 것이 최적이다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특정 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발증시킨다. 이어서, 혈청 또는 복수액 등의 동물의 체액을 탭핑하여 고농도의 MAb를 제공할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관내에서 배양될 수 있고, 여기서 MAb는 배양 배지로 자연적으로 분비되고, 이로부터 고농도로 용이하게 수득할 있다. 또는, 인간 하이브리도마 세포주는 세포 상청액에서 면역글로불린을 생성하기 위해 시험관내에서 사용할 수 있다. 세포주는 무혈청 배지에서의 성장에 적합시켜, 고순도의 인간 모노클로날 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화할 수 있다.
어느 하나의 수단에 의해 생성된 MAb는, 필요에 따라, 여과, 원심분리 및 FPLC 또는 친화성 크로마토그래피 등의 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 본 개시의 모노클로날 항체의 단편은 펩신 또는 파파인 등의 효소에 의한 소화를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 정제된 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. 또는, 본 개시에 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동화된 펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
또한, 모노클로날 항체를 생성하기 위해 분자 클로닝 접근법을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 목적 항원으로 표지된 단일 B 세포는 상자성 비드 선택 또는 유세포 분석에 의한 선별을 사용하여 물리적으로 선별될 수 있고, 이어서 단일 세포로부터 RNA를 단리하고, RT-PCR에 의해 항체 유전자를 증폭시킬 수 있다. 또는, 항원 특이적 벌크 선별된 세포 모집단은 미세소포로 분리되고, 정합된 중쇄 및 경쇄 가변 유전자는 중쇄 및 경쇄 앰플리콘의 물리적 결합 또는 소포로부터의 중쇄 및 경쇄 유전자의 일반적 바코드를 사용하여 단일 세포에서 회수된다. 단일 세포를 형성하는 정합된 중쇄 및 경쇄 유전자는 RT-PCR 프라이머 및 세포당 하나의 바코드로 전사물을 마킹하기 위한 바코드를 함유하는 세포 투과성 나노입자로 세포를 처리함으로써 항원 특이적 B 세포의 모집단으로부터 수득할 수 있다. 항체 가변 유전자는 또한 하이브리도마 계통의 RNA 추출에 의해 단리할 수 있고, 항체 유전자는 RT-PCR에 의해 수득되고, 면역글로불린 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 또는, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고, 적절한 항체를 발현하는 파지미드는 바이러스 항원을 사용하여 패닝함으로써 선택된다. 종래 하이브리도마 기술에 대한 이 접근법의 장점은 1회 라운드에서 약 104배 보다 많은 항체를 생산 및 스크리닝할 수 있고, H 및 L 쇄의 조합에 의해 새로운 특이성이 생성되어 적절한 항체를 발견할 가능성이 보다 높아진다는 것이다.
본 개시에 유용한 항체의 생산을 교시하는, 각각이 참조에 의해 본 명세서에 도입되는 기타 미국 특허에는 조합 접근법을 사용한 키메라 항체의 생산을 기재하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 조제물을 기재하는 미국 특허 제4,816,567호; 및 항체-치료제 접합체를 기재하는 미국 특허 제4,867,973호가 포함된다.
B. 본 개시의 항체
본 개시에 따른 항체는 우선 이들의 결합 특이성에 의해 정의될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 소정의 항체의 결합 특이성/친화성을 평가함으로써, 당해 기술분야의 숙련가는 이러한 항체가 본 청구범위의 범위 내에 속하는지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 소정 항체가 결합하는 에피토프는 항원 분자 내에 위치한 3개 이상(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)의 아미노산의 단일 연속 서열(예: 도메인 내의 선형 에피토프)로 이루어질 수 있다. 또는, 에피토프는 항원 분자 내에 위치한 복수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 구성될 수 있다(예를 들면, 배좌 에피토프).
당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지의 여부를 결정할 수 있다. 예시적 기술은, 예를 들면, 문헌[참조: Antibodies, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)]에 기재된 것 등의 일상적 교차-차단 검정을 포함한다. 교차 차단은 ELISA, 생물층 간섭계 또는 표면 플라즈몬 공명 등의 다양한 결합 검정에서 측정할 수 있다. 다른 방법에는 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석[참조: Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63], 펩타이드 절단 분석, 단일 입자 재구성을 사용한 고해상도 전자 현미경 기술, cryoEM 또는 단층 촬영, 결정학 연구 및 NMR 분석이 포함된다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형 등의 방법을 사용할 수 있다[참조: Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496]. 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 동정하기 위해 사용할 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법은, 목적 단백질을 중수소로 표지한 후, 항체를 중수소로 표지된 단백질에 결합시키는 방식이다. 이어서, 단백질/항체 복합체는 물로 이동하고, 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환 가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환 가능한 양성자보다 느린 속도로 중수소로부터 수소로의 역교환을 받는다. 결과적으로, 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있기 때문에, 계면에 포함되지 않은 아미노산과 비교하여 비교적 높은 질량을 나타낼 수 있다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분석 분석에 제공되고, 이에 의해 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 대응하는 중수소 표지된 잔기가 명백해진다[참조: 예를 들면, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith(2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A]. 항체가 EV-D68을 중화하는 경우, 고농도의 항체 존재하에 EV-D68을 시험관내 또는 동물 모델에서 EV-D68을 전파함으로써 항체 회피 돌연변이 변이체를 단리할 수 있다. 항체에 의해 표적화된 항원을 암호화하는 EV-D68 유전자의 서열 분석에 의해, 항체 회피를 제공하는 돌연변이(들)가 명백해지고, 에피토프 내의 잔기 또는 에피토프의 구조에 알로스테릭하게 영향을 미치는 것이 나타난다.
용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B 세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상 변성 용매에 노출되어도 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상 변성 용매로 처리하면 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 배좌로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
항원 구조-기반 항체 프로파일링(Antigen Structure-based Antibody Profiling; ASAP)이라고도 하는 변형-지원 프로파일링(Modification-Assisted Profiling; MAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시된 다수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법이다[참조: US 2004/0101920, 참조에 의해 그 전체가 구체적으로 본 명세서에 도입됨). 각 카테고리는 다른 카테고리로 대표되는 에피토프와는 명백하게 상이하거나, 부분적으로 중복하는 고유한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술에 의해, 유전적으로 동일한 항체를 신속하게 필터링할 수 있고, 유전적으로 상이한 항체에 초점을 맞추어 특성화를 수행할 수 있다. 하이브리도마 스크리닝에 적용하는 경우, MAP는 목적하는 특성을 갖는 mAb를 생성하는 희귀 하이브리도마 클론의 동정을 용이하게 할 수 있다. MAP를 사용하여, 본 개시의 항체를 상이한 에피토프에 결합하는 항체 그룹으로 분류할 수 있다.
본 개시는 동일한 에피토프, 또는 에피토프의 일부에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시는 또한, 표적 또는 이의 단편에 대한 결합에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 특정 예시적 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 통상의 방법을 사용하여, 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 참조와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건에서 표적에 결합시킨다. 이어서, 표적 분자에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합 후에 표적 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 참조 항체와는 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 반면에, 참조 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 표적 분자에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 참조 항-EV-D68 항체와의 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위해, 상기에서 설명된 결합 방법을 2개 방향으로 수행한다. 제1 방향에서, 참조 항체는 포화 조건하에서 EV-D68 항원에 결합하고, 이어서 EV-D68 항원에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서, 시험 항체를 포화 조건하에서 EV-D68 항원 분자에 결합시키고, 이어서 EV-D68 항원에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 양 방향 모두에서, 제1(포화) 항체만이 EV-D68에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체와 참조 항체는 EV-D68에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론지어진다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 참조 항체와의 결합을 위해 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
각각이 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 2개의 항체는 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100배 과량의 하나의 항체는, 경쟁 결합 검정에서 측정하는 경우, 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제한다[참조: 예를 들면, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). 또는, 한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 한 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 경우, 2개의 항체는 중첩 에피토프를 갖는다.
이어서, 추가의 통상의 실험(예를 들면, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 실시하여, 관찰된 시험 항체의 결합의 결여가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 의한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여의 원인지를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 당해 기술분야에서 이용 가능한 임의의 기타 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행할 수 있다. EM 또는 결정학을 사용한 구조 연구는 결합을 위해 경쟁하는 2개의 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지의 여부를 입증할 수도 있다.
또 다른 측면에서, 각각 표 3 및 4에 예시된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄로부터 클론-쌍 CDR을 갖는 모노클로날 항체가 제공된다. 이러한 항체는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 하기 실시예 섹션에서 논의된 클론에 의해 생성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 항체는 추가의 "프레임워크" 영역을 포함하는 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 이들은 완전한 가변 영역을 암호화하거나 나타내는 표 1 및 2에 제공된다. 추가로, 항체 서열은, 임의로 하기에 보다 상세히 논의되는 방법을 사용하여 이들 서열과는 상이할 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열은 (a) 가변 영역이 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있고, (b) 핵산이 이에 의해 암호화된 잔기에 영향을 미치지 않고, 상기의 것과는 상이할 수 있고, (c) 핵산이 소정 백분율, 예를 들면, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성으로 상기 핵산과는 상이할 수 있고, (d) 핵산이, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M NaCl에 의해 제공되는 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건하에서 예시되는 바와 같이, 높은 엄격성 조건하에서 하이브리드화하는 능력으로 인해 상기의 것과는 상이할 수 있고, (e) 아미노산이 소정 백분율, 예를 들면, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성으로 상기 기재된 것과는 상이할 수 있고, 또는 (f) 아미노산이 보존적 치환(하기 설명됨)을 가능하게 함으로써 상기 기재된 것과는 상이할 수 있다는 점에서 상기 기재된 것들과는 상이할 수 있다. 상기의 각각은 표 1에 기재된 핵산 서열 및 표 2의 아미노산 서열에 적용된다.
폴리뉴클레오티드와 폴리펩타이드 서열을 비교하는 경우, 하기에 기재된 바와 같이, 최대 대응을 위해 정렬시킬 때에 2개의 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일한 경우, 2개 서열은 "동일한" 것이라고 한다. 2개 서열 간의 비교는 통상 비교 윈도우에서 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 특정 및 비교함으로써 수행된다. 본 명세서에 사용된 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 연속하는 위치, 통상 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 세그먼트를 지칭하고, 여기서 서열은, 2개 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 연속하는 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은 디펄트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene) 제품군(DNASTAR, Inc., Madison, WI)에서 메그얼라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 하기 참고 문헌에 설명된 몇몇 정렬 방식을 구현한다: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
또는, 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 스미스 및 워터슨(Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482)의 국소 동일성 알고리즘에 의해, 니들맨 및 운쉬(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443)의 동일성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립맨(Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실장(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 의해 또는 검사에 의해 수행할 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 한 특정 예는 문헌[참조: Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 파라미터와 함께, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 사용 가능하다. 항체 서열의 재배열된 특성과 각 유전자의 가변 길이는 단일 항체 서열에 대한 복수회 라운드의 BLAST 검색을 필요로 한다. 또한, 서로 상이한 유전자를 수동으로 조립하는 것은 곤란하고, 에러가 발생하기 쉽다. 서열 분석 도구 IgBLAST(월드 와이드 웹, ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)는 생식세포계 V, D 및 J 유전자에 대한 정합, 재배열 접합부의 상세, Ig V 도메인 프레임워크 영역 상보성 결정 영역의 묘사를 식별한다. IgBLAST는 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 분석하고, 서열을 배치로 처리하고, 생식세포계 유전자 데이터베이스 및 기타 서열 데이터베이스를 동시에 검색하여, 가장 정합하는 생식세포계 V 유전자를 누락될 가능성을 최소화한다.
예시적 일례에서, 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M(정합하는 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(부정합하는 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산할 수 있다. 각 방향의 단어 히트의 확장은 다음과 같은 경우에 중지된다: 누적 정렬 스코어가 최대 달성 값으로부터 수량 X만큼 저하되거나; 하나 이상의 음수 스코어의 잔기 정렬의 누적에 의해, 누적 스코어가 0 이하가 되거나; 또는 어느 서열의 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은, 디펄트로서, 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스[참조: Henikoff 및 Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 정렬, (B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다.
아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산할 수 있다. 각 방향의 단어 히트 확장은 다음과 같은 경우에 중지된다: 누적 정렬 스코어가 최대 달성 값에서 수량 X만큼 저하되거나; 하나 이상의 음의 스코어 잔기 정렬의 누적으로 인해 누적 스코어가 0 이하가 되거나, 또는 어느 서열의 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다.
하나의 접근법에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 통상 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 정합된 위치의 수를 산출하고, 정합된 위치의 수를 참조 서열의 위치의 총 수(즉, 윈도위 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
항체를 정의하는 또 다른 방법은 하기에 기술된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 임의의 "유도체"로 하는 것이다. 용어 "유도체"는 항원에 면역특이적으로 결합하지만, "모체"(또는 야생형) 분자와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 이러한 아미노산 치환 또는 부가는 천연 존재(즉, DNA 암호화됨) 또는 비-천연 존재 아미노산 잔기를 도입할 수 있다. 용어 "유도체"는, 예를 들면, 향상된 또는 손상된 이펙터 또는 결합 특성을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는, 예를 들면, 항체 등을 형성하기 위해 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 갖는 변이체를 포함한다. 용어 "유도체"는 비-아미노산 변형, 예를 들면, 글리코실화(예를 들면, 변화된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민산 등의 함량을 가짐), 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의해 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결될 수 있는 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 하기 중 하나 이상을 조절한다: 항체의 가용화, 항체의 세포내 수송 및 분비의 촉진, 항체 조립의 촉진, 형태적 완전성 및 항체 매개 이펙터 기능. 특정 실시양태에서, 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형을 결여하는 항체와 비교하여 항체 매개 이펙터 기능을 향상시킨다. 변경된 항체 매개된 이펙터 기능을 유도하는 탄수화물 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Shields, R. L. et al. (2002) “Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,” J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001) “Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII,” Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294]. 탄수화물 함량을 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Wallick, S. C. et al. (1988) “Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen,” J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989) “Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region,” J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995) “The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody,” Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003) “Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering,” Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002) “Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,” J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740].
유도체 항체 또는 항체 단편은, 비드-기반 또는 세포-기반 검정 또는 동물 모델에서 생체내 연구에 의해 측정하는 경우, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식세포 작용(ADCP), 항체 의존성 호중구 식세포 작용(ADNP) 또는 항체 의존성 보체 침착(ADCD) 기능에서 바람직한 수준의 활성을 부여하기 위해 조작된 서열 또는 글리코실화 상태로 생성될 수 있다.
유도체 항체 또는 항체 단편은 특정의 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 유도체는 모 항체와 유사하거나 동일한 기능을 가질 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 유도체는 모 항체와 비교하여 변화된 활성을 나타낼 것이다. 예를 들면, 유도체 항체(또는 이의 단편)는 모 항체보다도 이의 에피토프에 보다 강력하게 결합하거나, 또는 단백질 분해에 대해 보다 내성이 있을 수 있다.
C. 항체 서열의 조작
다양한 실시양태에서, 개선된 발현, 개선된 교차 반응성 또는 감소된 표적외 결합 등의 다양한 이유로 동정된 항체의 서열을 조작하도록 선택할 수 있다. 변형된 항체는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 발현, 또는 폴리펩타이드의 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현 방법은 이 문서의 다른 곳에서 취급한다. 하기는 항체 공학에 대한 관련 목표 기술에 대한 일반적 논의이다.
하이브리도마를 배양하고, 이어서 세포를 용해하고, 총 RNA를 추출할 수 있다. 랜덤 6량체를 RT와 함께 사용하여 RNA의 cDNA 카피를 생성하고, 이어서 모든 인간 가변 유전자 서열을 증폭할 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 다중 혼합물을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝하고, 표준 벡터 프라이머를 사용하여 자동화된 DNA 서열분석에 의해 서열분석할 수 있다. 결합 및 중화의 검정은 하이브리도마 상청액으로부터 수집된 항체를 사용하여 수행할 수 있고, 단백질 G 컬럼을 사용하여 FPLC로 정제할 수 있다.
재조합 전장 IgG 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 클로닝 벡터로부터 IgG 플라스미드 벡터로 서브클로닝하고, 293(예: Freestyle) 세포 또는 CHO 세포로 형질감염시킴으로써 생성할 수 있고, 항체는 293 또는 CHO 세포 상청액으로부터 수집 및 정제할 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포 시스템에는 대장균 등의 세균, 곤충 세포(S2, Sf9, Sf29, 하이 파이브(High Five)), 식물 세포(예: 담배, 인간-유사 글리칸에 대한 조작의 존재 또는 부재), 조류 또는 마우스, 랫트, 염소 또는 소 등의 다양한 비인간 유전자도입 환경이 포함된다.
후속 항체 정제 및 숙주의 면역화 둘 다의 목적으로, 항체를 암호화하는 핵산의 발현이 또한 고려된다. 항체 코딩 서열은 천연 RNA 또는 변형된 RNA 등의 RNA일 수 있다. 변형된 RNA는 mRNA에 안정성 증가와 면역원성의 저하를 부여하고, 이에 의해 치료적으로 중요한 단백질의 발현을 촉진하는 특정 화학적 변형을 고려한다. 예를 들면, N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ)은 번역 능력의 점에서 기타 몇몇 뉴클레오사이드 변형 및 이들의 조합을 능가한다. 면역/eIF2α 인산화 의존성의 번역 억제를 오프로 하는 것에 추가하여, 도입된 N1mΨ 뉴클레오티드는 리보솜의 일시 정지 및 mRNA의 밀도를 증가시킴으로써 번역 프로세스의 역학을 극적으로 변화시킨다. 변형된 mRNA의 리보솜 로딩의 증가는 동일한 mRNA에서 리보솜 재순환 또는 새로운 리보솜 동원을 조장함으로써 이들을 개시에 대해 보다 관대하게 한다. 이러한 변형은 RNA 접종 후에 생체내에서 항체 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. RNA는, 천연 또는 변형된 것이든, 네이키드 RNA로서 또는 지질 나노입자 등의 전달 비히클에서 전달될 수 있다.
또는, 항체를 암호화하는 DNA를 동일한 목적으로 사용될 수 있다. DNA는 그것이 설계된 숙주 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 포함된다. 발현 카세트는 유리하게는 종래의 플라스미드 또는 미니벡터 등의 복제 가능한 벡터에 포함된다. 벡터는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노-연관 바이러스 등의 바이러스 벡터를 포함하고, 렌티바이러스가 고려된다. VEE 바이러스 또는 신드비스(Sindbis) 바이러스에 기초한 알파바이러스 레플리콘 등의 항체 유전자를 암호화하는 레플리콘도 또한 고려된다. 이러한 벡터의 전달은 근육내, 피하 또는 피내 경로를 통한 바늘에 의해, 또는 생체내 발현이 요구되는 경우는 경피 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
최종 cGMP 제조 프로세스와 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 프로세스에서 생산된 항체의 신속한 가용성은 프로세스 개발 프로그램의 기간을 단축할 가능성이 있다. 론자(Lonza)는 CHO 세포에서 소량(최대 50g)의 항체를 신속하게 생산하기 위해 CDACF 배지에서 성장한 풀링된 형질감염체를 사용하는 일반적 방법을 개발했다. 진정한 일시적 시스템보다 약간 느리긴 하지만, 장점에는 보다 높은 제품 농도와 생산 세포주와 동일한 숙주 및 프로세스의 사용이 포함된다. 일회용 생물반응기에서 모델 항체를 발현하는 GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예: 유가-배치 모드로 작동되는 일회용 백 생물반응기 배양물(5L 작업 용적)에서는 2g/L의 수확 항체 농도가 형질전환으로부터 9주 이내에 달성되었다.
항체 분자는, 예를 들면, mAb의 단백질분해 절단에 의해 생산되는 단편(예: F(ab'), F(ab')2), 또는, 예를 들면, 재조합 수단을 통해 생산 가능한 일본쇄 면역글로불린을 포함할 것이다. F(ab') 항체 유도체는 1가인 반면, F(ab')2 항체 유도체는 2가이다. 일 실시양태에서, 이러한 단편은 서로 조합되거나 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 중요하게도, 이러한 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환기를 함유할 수 있다.
관련 실시양태에서, 항체는 개시된 항체의 유도체, 예를 들면, 개시된 항체의 것과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체 (예를 들면, 키메라 또는 CDR-이식된 항체)이다. 또는, 항체 분자에 보존적 변화를 도입하는 것 등의 변형을 수행하는 것을 원할 수 있다. 이러한 변경을 수행할 때, 아미노산의 소수성 지수를 고려할 수 있다. 단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여할 때의 수치료학적 아미노산 지수의 중요성은 당해 기술분야에서 일반적으로 이해된다[참조: Kyte and Doolittle, 1982]. 아미노산의 상대적 소수성 특성은 수득되는 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 인정되고, 이에 의해 단백질과 다른 분자(예: 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원, 등)와의 상호작용이 정의된다.
유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 수행될 수 있음이 또한 당해 기술분야에서 이해된다. 참조에 의해 본 명세서에서 도입된 미국 특허 제4,554,101호는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다고 서술하고 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌(+3.0), 라이신(+3.0) 및 히스티딘(-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트(+3.0±1), 글루타메이트(+3.0±1), 아스파라긴(+0.2) 및 글루타민(+0.2); 친수성, 비이온성 아미노산: 세린(+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2) 및 트레오닌(-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인(-1.0) 및 메티오닌(-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린(-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5±1), 알라닌(-0.5) 및 글리신(0); 소수성, 방향족 아미노산: 트립토판(-3.4), 페닐알라닌(-2.5) 및 티로신(-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 갖는 또 다른 것으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 더욱 특히 바람직하다.
상기에서 개설한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 전술한 다양한 특성을 고려하는 예시적 치환은 당업자에게 공지되어 있고, 하기를 포함한다: 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.
본 개시는 또한 아이소타입 변형을 고려한다. 상이한 이소타입을 갖도록 Fc 영역을 변형함으로써 상이한 기능을 달성할 수 있다. 예를 들면, IgG1으로 변경하면, 항체 의존성 세포독성이 증가할 수 있고, 클래스 A로 스위칭하면 조직 분포가 개선될 수 있으며, 클래스 M으로 스위칭하면 원자가가 개선될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 아미노산 변형을, IL-23p19 결합 분자의 Fc 영역의 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 기능을 변화시키는 하나 이상의 추가 아미노산 변형과 조합하는 것이 유용할 수 있다. 특정 목적의 결합 폴리펩타이드는, C1q에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 기존의 C1q 결합 활성을 갖고 임의로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 갖는 폴리펩타이드는 이들 활성 중 하나 또는 둘 모두가 향상되도록 변형될 수 있다. C1q를 변경하고/하거나 이의 보체 의존적 세포독성 기능을 변경하는 아미노산 변형은, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 도입되는 제WO/0042072호에 기재되어 있다.
예를 들면, C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형하고, 이에 의해 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 이펙터 기능이 변화된 항체의 Fc 영역을 설계할 수 있다. "이펙터 기능"은 생물학적 활성을 활성화 또는 감소시키는 역할을 한다(예: 대상체에서). 이펙터 기능의 예는 하기를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다: C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR) 등의 하향조절. 이러한 이펙터 기능은 Fc 영역을 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 결합시킬 필요가 있고, 다양한 검정(예: Fc 결합 검정, ADCC 검정, CDC 검정 등)을 사용하여 평가할 수 있다.
예를 들면, 개선된 C1q 결합 및 개선된 FcγRIII 결합(예를 들면, 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성 둘 모두를 가짐)을 갖는 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 또는, 이펙터 기능을 저하시키거나 제거하는 것이 바람직한 경우, 변이체 Fc 영역은 CDC 활성의 저하 및/또는 ADCC 활성의 저하를 수반하여 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들 활성 중 하나만을 증가시킬 수 있고, 임의로 다른 활성도 감소시킬 수 있다(예를 들면, 개선된 ADCC 활성을 갖지만, CDC 활성을 감소시킨 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해 및 그 반대의 경우).
FcRn 결합. Fc 돌연변이는 또한 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호작용을 변화시키고 약동학적 특성을 개선하기 위해 도입 및 조작할 수 있다. FcRn에 대한 결합이 개선된 인간 Fc 변이체의 콜렉션이 기재되어 있다[참조: Shields et al., (2001)]. FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1의 결합 부위의 고해상도 맵핑 및 FcγR에 대한 결합이 개선된 IgG1 변이체의 설계[참조: J. Biol. Chem. 276:6591-6604]. 반감기를 증가시킬 수 있는 다수의 방법이 공지되어 있고[참조: Kuo and Aveson, (2011)], 아미노산 변형을 포함하는 것은, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 랜덤 돌연변이유발, 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 및/또는 생체내 거동을 평가하기 위한 스크리닝을 포함하는 기술을 통해 생성될 수 있다. 컴퓨터 전략 및 이어서 돌연변이유발을 사용하여, 돌연변이시킬 아미노산 돌연변이 중의 하나를 선택할 수 있다.
따라서, 본 개시는 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 상기 변형은 상기 모 폴리펩타이드와 비교하여 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 Fc 영역의 아미노산 넘버링은 카바트(Kabat)의 EU 인덱스의 넘버링이다. 본 개시의 추가 측면에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
또한, 다양한 간행물은, FcRn 결합 폴리펩타이드를 분자에 도입하거나, FcRn 결합 친화성이 보존되어 있지만 다른 Fc 수용체에 대한 친화성은 크게 감소되어 있는 항체와 분자를 융합시키거나, 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴으로써 반감기가 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법을 설명한다[참조: 예를 들면, Kontermann (2009)].
유도체화된 항체는 포유동물, 특히 인간에서 모 항체의 반감기(예를 들면, 혈청 반감기)를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 변경은 15일 초과, 바람직하게는 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과 또는 5개월 초과의 반감기를 초래할 수 있다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 개시의 항체 또는 이의 단편의 반감기의 증가는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 보다 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나, 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 동정된 아미노산 잔기를 변형(예를 들면, 치환, 결실 또는 부가)함으로써 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편을 생성할 수 있다.
문헌[참조: Beltramello et al. (2010)]은, CH2 도메인의 위치 1.3과 1.2의 류신 잔기(C-도메인에 대한 IMGT 고유 넘버링에 따름)가 알라닌 잔기로 치환되어 있는 것을 생성함으로써, 뎅기 바이러스 감염을 향상시키는 경향이 있기 때문에, 중화 mAb의 변형을 이전에 보고했다. "LALA" 돌연변이로서도 공지된 이 변형은 문헌[참조: Hessell et al. (2007)]에 기재되어 있는 바와 같이, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa에 대한 항체 결합을 무력화한다. 변이체 및 비변형 재조합 mAb를 4개 뎅기열 바이러스 혈청형에 의한 감염을 중화하고 향상하는 능력에 대해 비교했다. LALA 변이체는 변형되지 않은 mAb와 동일한 중화 활성을 유지했지만, 향상 활성을 완전히 결여하고 있었다. 따라서, 이러한 성질의 LALA 돌연변이는 현재 개시된 항체와 관련하여 고려된다.
변경된 글리코실화. 본 개시의 특정 실시양태는, 시알산, 갈락토스 또는 푸코스를 포함하지 않는 실질적으로 균질한 글리칸을 함유하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이들 둘 모두는 각각 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 부착될 수 있다. 전술한 실질적으로 균질한 글리칸은 중쇄 불변 영역에 공유 결합될 수 있다.
본 개시의 또 다른 실시양태는 신규 Fc 글리코실화 패턴을 갖는 mAb를 포함한다. 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GNGN 또는 G1/G2 글리코형에 의해 표시되는 실질적으로 균질한 조성물로 존재한다. Fc 글리코실화는 치료용 mAb의 항바이러스 및 항암 특성에서 중요한 역할을 한다. 본 개시는 시험관내에서 푸코스를 포함하지 않는 항-HIV mAb의 항-렌티바이러스 세포-매개 바이러스 억제의 증가를 나타내는 최근 연구와 일치한다. 코어 푸코스를 결여하는 균질한 글리칸을 사용한 본 개시의 이 실시양태는 특정 바이러스에 대한 보호가 2배 초과의 증가를 나타냈다. 코어 푸코스의 제거는 천연 킬러(NK) 세포에 의해 매개되는 mAb의 ADCC 활성을 극적으로 개선하지만, 다형핵 세포(PMN)의 ADCC 활성에는 역효과를 갖는 것으로 보인다.
GNGN 또는 G1/G2 글리코형으로 표시되는 실질적으로 균질한 조성물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 실질적으로 균질한 GNGN 글리코형을 부재 및 G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF 또는 GNGNFX 함유 글리코형의 존재하에 동일한 항체와 비교하여 Fc 감마 RI 및 Fc 감마 RIII에 대한 결합 친화성의 증가를 나타낸다. 본 개시의 일 실시양태에서, 항체는 1 × 10-8 M 이하의 Kd로 Fc 감마 RI로부터 해리되고, 1 × 10-7 M 이하의 Kd로 Fc 감마 RIII로부터 해리된다.
Fc 영역의 글리코실화는 통상 N-연결 또는 O-연결 중 어느 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 부착을 지칭한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스 중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용할 수 있다. 아스파라긴 측쇄 펩타이드 서열에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착에 대한 인식 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다.
글리코실화 패턴은, 예를 들면, 폴리펩타이드에서 발견되는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 결실시키고/시키거나, 폴리펩타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 부가함으로써 변경될 수 있다. 항체의 Fc 영역에 대한 글리코실화 부위의 부가는 상기 기술된 트리펩타이드 서열(N-연결된 글리코실화 부위의 경우) 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 예시적 글리코실화 변이체는 중쇄의 잔기 Asn 297의 아미노산 치환을 갖는다. 변경은 또한, 원래의 폴리펩타이드의 서열(O-연결된 글리코실화 부위의 경우)에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환함으로써 수행할 수 있다. 추가로, Asn 297을 Ala로 변경하면, 글리코실화 부위 중 하나를 제거할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체는 베타 (1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnT III)를 발현하는 세포에서 발현되고, 그 결과, GnT III는 GlcNAc를 IL-23p19 항체에 부가한다. 이러한 방식으로 항체를 생산하는 방법은 WO/9954342, WO/03011878, 특허 공개 제20030003097A1호 및 문헌[참조: Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999]에 제공된다. 클러스터 정기적 산재된 짧은 팔린드롬 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 등의 게놈 편집 기술을 사용하여, 글리코실화 등의 특정 번역 후 변형을 향상, 감소 또는 제거하도록 세포주를 변경할 수 있다. 예를 들면, CRISPR 기술을 사용하여, 재조합 모노클로날 항체의 발현에 사용되는 293 또는 CHO 세포에서 글리코실화 효소를 암호화하는 유전자를 제거할 수 있다.
모노클로날 항체 단백질 서열에 대한 책임의 제거. 인간 B 세포에서 수득된 항체 가변 유전자 서열을 조작하여, 이들의 제조 가능성과 안전성을 향상시키는 것이 가능하다. 잠재적 단백질 서열의 책임은 하기를 포함하는 부위와 관련된 서열 모티프를 검색함으로써 특정할 수 있다.
1) 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기,
2) N-연결된 글리코실화,
3) Asn 탈아미드화,
4) Asp 이성질체화,
5) SYE 절단,
6) Met 산화,
7) Trp 산화,
8) N-말단 글루타메이트,
9) 인테그린 결합,
10) CD11c/CD18 결합, 또는
11) 단편화
이러한 모티프는 재조합 항체를 암호화하는 cDNA에 대한 합성 유전자를 변경하여 제거할 수 있다.
치료용 항체의 개발 분야에서 단백질 공학 노력은 특정 서열 또는 잔기가 용해도 차이와 관련되어 있음을 분명히 나타냈다[참조: Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22(10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106(29), 11937-11942, 2009, Voynov et al., Biocon. Chem., 21(2), 385-392, 2010]. 문헌에서 용해도-변경 돌연변이로부터의 증거는, 아스파르트산, 글루탐산 및 세린 등의 몇몇 친수성 잔기가 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 리신 및 아르기닌 등의 기타 친수성 잔기보다 현저히 유리하게 단백질 용해도에 기여하는 것을 나타낸다.
안정성. 항체는 생물물리학적 특성을 향상시키기 위해 조작될 수 있다. 평균 겉보기 용융 온도를 사용하여, 고온을 사용하여 항체를 전개하고 상대적 안정성을 결정할 수 있다. 시차 주사 열량계(DSC)는 분자의 열용량(Cp)(1도당 분자의 가온에 필요한 열)을 온도의 함수로서 측정한다. DSC를 사용하여, 항체의 열 안정성을 연구할 수 있다. mAb에 대한 DSC 데이터는, 종종 mAb 구조 내에서 개별 도메인의 전개를 해결하고, 서모그램에서 최대 3개의 피크(Fab, CH2 및 CH3 도메인의 전개로부터)를 생성하기 때문에 특히 흥미롭다. 통상, Fab 도메인의 전개는 가장 강력한 피크를 생성한다. DSC 프로파일 및 Fc 부분의 상대적 안정성은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스에 대한 특징적인 차이를 나타낸다[참조: Garber and Demarest, Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 751-757, 2007]. CD 분광기로 수행되는 원형 이색성(CD)을 사용하여, 평균 겉보기 용융 온도를 결정할 수도 있다. Far-UV CD 스펙트럼은 0.5nm 증분으로 200 내지 260nm 범위의 항체에 대해 측정된다. 최종 스펙트럼은 20회 누적의 평균으로 결정할 수 있다. 잔류 타원율 값은 배경을 차감한 후에 계산할 수 있다. 항체의 열 변성(0.1 mg/mL)은 235nm에서 25-95℃ 및 1℃/min의 가열 속도로 모니터링할 수 있다. 동적 광 산란(DLS)을 사용하여, 응집 경향을 평가할 수 있다. DLS는 단백질을 포함한 다양한 입자의 크기를 특성화하기 위해 사용된다. 시스템의 크기가 분산되지 않은 경우는 입자의 평균 유효 직경을 결정할 수 있다. 이 측정은 입자 코어의 크기, 표면 구조의 크기 및 입자 농도에 의존한다. DLS는 본질적으로 입자에 의한 산란 광 강도의 변동을 측정하기 위해 입자의 확산 계수를 결정할 수 있다. 상업용 DLA 기기의 DLS 소프트웨어는 다양한 직경의 입자 모집단을 표시한다. 안정성 연구는 DLS를 사용하여 편리하게 수행할 수 있다. 샘플의 DLS 측정은 입자의 유체역학적 반경이 증가하는지의 여부를 결정함으로써, 입자가 시간의 경과에 따라 응집되는지 또는 온도 변화에 따라 응집되는지의 여부를 나타낼 수 있다. 입자가 응집되면, 보다 큰 반경의 입자의 보다 큰 모집단을 볼 수 있다. 온도에 따른 안정성은 그 장소에서 온도를 제어하여 분석할 수 있다. 모세관 전기영동(CE) 기술에는 항체 안정성의 특징을 결정하기 위한 입증된 방법론이 포함된다. iCE 접근법을 사용하여, 탈아미드화, C-말단 라이신, 시알릴화, 산화, 글리코실화 및 단백질의 pI의 변화를 초래할 수 있는 단백질에 대한 기타 변화로 인한 항체 단백질 전하 변이체를 해결할 수 있다. 발현된 각각의 항체 단백질은, 단백질 심플 마우리스(Protein Simple Maurice) 기기를 사용하여, 모세관 컬럼(cIEF)에서 높은 처리량, 유리 용액 등전점 초점(IEF)에 의해 평가할 수 있다. 등전점(pIs)에 초점을 맞춘 분자를 실시간 모니터링하기 위해, 전체 컬럼 UV 흡수 검출을 30초마다 수행할 수 있다. 이 접근법은 종래의 겔 IEF의 고분해능과 컬럼 기반 분리에서 발견되는 정량 및 자동화의 장점을 조합하는 동시에 동원 단계의 필요성을 제거한다. 이 기술에 의해, 발현된 항체에 대한 동일성, 순도 및 불균일성 프로파일의 재현 가능한 정량 분석이 가능해진다. 이 결과는, 항체의 전하 불균일성 및 분자 크기를 특정하고, 흡광도 및 천연 형광 검출 모드로 0.7μg/mL까지의 검출 감도를 갖는다.
용해도. 항체 서열의 고유 용해도 스코어를 결정할 수 있다. 고유 용해도 스코어는 CamSol Intrinsic을 사용하여 계산할 수 있다[참조: Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015]. scFv 등의 각 항체 단편의 HCDR3에서 잔기 95-102(Kabat 넘버링)에 대한 아미노산 서열은 용해도 스코어를 계산하기 위해 온라인 프로그램을 통해 평가될 수 있다. 또한, 실험실 기술을 사용하여 용해도를 결정할 수 있다. 용액이 포화되어 용해도 한계에 도달할 때까지 동결건조된 단백질을 용액에 첨가하거나, 적절한 분자량 컷오프를 갖는 미세농축기에서 한외여과에 의한 농축을 포함하는 다양한 기술이 존재한다. 가장 간단한 방법은 무정형 침전을 유도하는 것이고, 이는 황산암모늄을 사용하여 단백질 침전을 포함하는 방법을 사용하여 단백질의 용해도를 측정한다[참조: Trevino et al., J Mol Biol, 366: 449-460, 2007]. 황산암모늄 침전은 상대적 용해도 값에 대한 신속하고 정확한 정보를 제공한다. 황산암모늄 침전은 명확한 수성 및 고체상을 구비한 침전 용액을 생성하고, 비교적 소량의 단백질을 필요로 한다. 황산암모늄에 의한 무정형 침전의 유도를 사용하여 수행되는 용해도 측정은 다른 pH 값에서도 용이하게 수행할 수 있다. 단백질의 용해도는 pH에 크게 의존하고, pH는 용해도에 영향을 미치는 가장 중요한 외인성 요인으로 간주된다.
자가반응성. 일반적으로, 자가반응 클론은 개체발생 동안 음성 선택에 의해 제거되어야 한다고 생각되지만, 자가반응 특성을 갖는 다수의 인간 천연 항체가 성숙한 레퍼토리에 존속되고 자가반응성이 병원체에 대한 다수의 항체의 항바이러스 기능을 향상시킬 수 있다는 것이 명백해졌다. 초기 B 세포 발달 동안 항체의 HCDR3 루프는 종종 양전하가 풍부하고 자가반응성 패턴을 나타내는 것으로 주목되었다[참조: Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003]. 현미경(부착형 HeLa 또는 HEp-2 상피 세포를 사용) 및 유세포 측정 세포 표면 염색(현탁액 Jurkat T 세포 및 293S 인간 배아성 신장 세포를 사용)에서 인간 기원 세포에 대한 결합 수준을 평가함으로써, 소정 항체의 자가반응성을 시험할 수 있다. 자가반응성은 또한 조직 어레이 내의 조직에 대한 결합 평가를 사용하여 조사할 수 있다.
바람직한 잔기("인간 유사성"). 혈액 공여자의 인간 B 세포에 대한 B 세포 레퍼토리 심층 서열분석은 다수의 최근 연구에서 광범위하게 수행되고 있다. 인간 항체 레퍼토리의 상당 부분에 대한 서열 정보는 건강한 인간에게 공통하는 항체 서열 특징의 통계적 평가를 용이하게 한다. 인간 재조합 항체 가변 유전자 참조 데이터베이스에서 항체 서열의 특징에 대한 지식에 의해, 항체 서열의 "인간 유사성"(HL)의 위치 특이적 정도를 추정할 수 있다. HL은 치료용 항체 또는 백신으로서의 항체 등의 임상 용도에서 항체 개발에 유용한 것으로 나타났다. 목표는 항체의 인간 유사성을 증가시켜, 항체 약물의 효능을 현저히 감소시키거나, 심각한 건강 영향을 유발할 수 있는 잠재적 부작용 및 항-항체 면역 반응을 감소시키는 것이다. 총 약 4억개 서열의 3명의 건강한 인간 혈액 공여자의 조합된 항체 레퍼토리의 항체 특성을 평가하고, 항체의 초가변 영역에 초점을 맞춘 새로운 "상대적 인간 유사성"(rHL) 스코어를 작성할 수 있다. rHL 스코어를 통해, 인간(양성 스코어)과 비인간 서열(음성 스코어)을 용이하게 구별할 수 있다. 항체는 인간 레퍼토리에서 일반적이지 않은 잔기를 제거하도록 조작될 수 있다.
D. 일본쇄 항체
일본쇄 가변 단편(scFv)은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합이고, 짧은(통상 세린, 글리신) 링커로 함께 연결된다. 이 키메라 분자는 불변 영역의 제거와 링커 펩타이드의 도입에도 불구하고, 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 이 변형은 통상 특이성을 변경시키지 않는다. 이러한 분자는 항원 결합 도메인을 단일 펩타이드로서 발현시키는 것이 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하기 위해 역사적으로 생성되었다. 또는, scFv는 하이브리도마 또는 B 세포로부터 유래하는 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 일본쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역을 결여하고 있으므로, 항체의 정제에 사용되는 공통 결합 부위(예: 단백질 A/G)가 없다. 단백질 L은 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에, 이러한 단편은 종종 단백질 L을 사용하여 정제/고정될 수 있다.
유연한 링커는 일반적으로 알라닌, 세린 및 글리신 등의 헬릭스 및 턴-촉진 아미노산 잔기로 구성된다. 그러나, 다른 잔류물도 기능할 수 있다. 문헌[참조: Tanget al. (1996)]은 단백질 링커 라이브러리로부터 일본쇄 항체(scFv)를 위해 조정된 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용했다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자가 가변 조성의 18-아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 세그먼트에 의해 연결된 랜덤 링커 라이브러리를 구축했다. scFv 레퍼토리(약 5 × 106개의 서로 상이한 구성원)를 필라멘트 파지에 표시하고, 합텐과의 친화성 선택을 수행했다. 선택된 변이체의 모집단은 결합 활성에서 유의한 증가를 나타냈지만, 상당한 서열 다양성을 유지했다. 이어서, 1054 개별 변이체를 스크리닝하면, 가용성 형태로 효율적으로 생성된 촉매 활성 scFv가 수득되었다. 서열 분석은 VH C 말단의 2개 잔기 후의 링커에 보존된 프롤린과, 선택된 테더의 유일한 공통 특징으로서 다른 위치에서 풍부한 아르기닌 및 프롤린을 나타냈다.
본 개시의 재조합 항체는 또한, 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 가능하게 하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 J-쇄와 조합하여 다량체의 형성을 가능하게 하는 IgA로부터 유래하는 서열을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 실시양태에서, 쇄는 2개의 항체의 조합을 가능하게 하는 비오틴/아비딘 등의 약제로 변형시킬 수 있다.
별도의 실시양태에서, 일본쇄 항체는 비-펩타이드 링커 또는 화학 단위를 사용하여 수용체의 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속적으로 적절한 방식으로 함께 연결될 것이다(즉, 중쇄의 N-말단이 적절한 화학 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착됨).
가교 시약은 2개의 상이한 분자의 작용기를 연결하는 분자 브릿지를 형성하기 위해 사용된다(예: 안정화제 및 응고제). 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 헤테로머 복합체가 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적으로 연결하기 위해, 불필요한 단독중합체의 형성을 제거하는 헤테로-이작용성 가교결합제를 사용할 수 있다.
예시적 헤테로-이작용성 가교제는 2개의 반응성 그룹을 함유한다: 하나는 1급 아민 그룹(예: N-하이드록시 석신이미드)와 반응하고, 다른 하나는 티올 그룹(예: 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)와 반응한다. 1급 아민 반응성 그룹을 통해, 가교제는 하나의 단백질(예: 선택된 항체 또는 단편)의 라이신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 그룹을 통해, 이미 제1 단백질에 결합된 가교제는 다른 단백질(예: 선택제)의 시스테인 잔기(유리 설프하이드릴 그룹)와 반응한다.
혈액 내에서 적당한 안정성을 갖는 가교제를 사용하는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합하기 위해 성공적으로 사용될 수 있는 다수 유형의 디설파이드 결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체 장애가 있는 디설파이드 결합을 포함하는 링커는 생체내에서 보다 큰 안정성을 제공하여, 작용 부위에 도달하기 전에 표적화 펩타이드의 방출을 방지하는 것을 증명할 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 연결제의 하나의 그룹이다.
또 다른 가교제는 SMPT이고, 이는 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체 장애"되는 디설파이드 결합을 포함하는 이관능성 가교제이다. 디설파이드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액에 존재할 수 있는 글루타티온 등의 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 하고, 이에 의해 표적 부위로 결합물의 전달 전에 접합체의 디커플링을 방지하는 역할을 하는 것으로 여겨진다.
SMPT 가교 시약은, 기타 다수의 공지된 가교 시약과 마찬가지로, 시스테인의 SH 또는 1급 아민(예: 라이신의 엡실론 아미노 그룹) 등의 작용기를 가교하는 능력을 제공한다. 다른 가능한 유형의 가교제는 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트 등의 절단 가능한 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로-이작용성 광반응성 페닐아지드를 포함한다. N-하이드록시-숙신이미딜 그룹은 1급 아미노 그룹과 반응하고, 페닐아지드(광분해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
장애된 가교제에 추가하여, 장애되지 않은 링커도 또한, 본 명세서에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 기타 유용한 가교제에는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란이 포함된다[참조: Wawrzynczak & Thorpe, 1987]. 이러한 가교제의 사용은 당해 기술분야에서 잘 이해되어 있다. 또 다른 실시양태는 유연한 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 아민-함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생성하기 위해, 특히 킬레이트제, 약물, 효소, 검출 가능한 표지 등과 항체 접합체를 형성하는 데 유용한 이작용성 링커를 기재한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건하에서 절단가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단 가능한 접합체를 개시하고 있다. 이 링커는 목적 약제가 링커에 직접 결합될 수 있고, 절단되어 활성제가 방출될 수 있다는 점에서 특히 유용한다. 특정 용도에는 항체 또는 약물 등의 단백질에 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴 그룹을 부가하는 것이 포함된다.
미국 특허 제5,856,456호는 폴리펩타이드 구성요소를 연결하여 융합 단백질, 예를 들면, 일본쇄 항체를 작제하기 위해 사용하기 위한 펩타이드 링커를 제공한다. 링커는 최대 약 50개 아미노산 길이이고, 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 라이신)의 적어도 하나의 발생과 이에 계속하여 프롤린을 포함하고, 보다 큰 안정성과 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역진단 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시-함유 링커를 개시하고 있다.
E. 다중특이성 항체
특정 실시양태에서, 본 개시의 항체는 이중특이성 또는 다중특이성이다. 이중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적 이중특이성 항체는 단일 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 기타 이러한 항체는 제1 항원 결합 부위를 제2 항원에 대한 결합 부위와 조합할 수 있다. 또는, 항-병원체 암(arm)은 T 세포 수용체 분자(예: CD3) 등의 백혈구 상의 유발 분자 또는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 Fc 감마 RIII(CD16) 등의 IgG의 Fc 수용체(FcγR)에 결합하는 암과 조합시킬 수 있고, 이에 의해 세포 방어 메커니즘을 감염된 세포에 집중시키고 국재화시킨다. 이중특이성 항체를 사용하여, 세포독성제를 감염된 세포에 국재화시킬 수 있다. 이 항체는 병원체 결합 암과 세포독성제(예: 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖고 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예: F(ab')2 이중특이성 항체)으로 제조할 수 있다. WO 제96/16673호는 이중특이성 항-ErbB2/항-Fc 감마 RIII 항체를 기재하고, 미국 특허 제5,837,234호는 이중특이성 항-ErbB2/항-Fc 감마 RI 항체를 개시한다. 이중특이성 항-ErbB2/Fc 알파 항체는 WO98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중특이성 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다.
이중특이성 항체의 제조 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이성 항체의 종래의 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현을 기반으로 하고, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다[참조: Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 랜덤으로 분류되어 있기 때문에, 이러한 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 이 중 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 통상, 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고 생성물의 수율이 낮다. 유사한 절차는 WO 제93/08829호 및 문헌[참조: Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 영역(항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 적어도 하나의 융합에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 세포에 동시 형질감염된다. 이것은, 작제에 사용된 3개의 폴리펩타이드 쇄의 비균등한 비율이 목적하는 이중특이성 항체의 최적 수율을 제공하는 경우, 실시양태에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정할 때에 보다 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄의 발현이 높은 수율을 초래하거나 비율이 목적하는 쇄 조합의 수율에 유의한 영향을 미치지 않는 경우, 2개 또는 3개의 모든 폴리펩타이드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
이 접근법의 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 한쪽 암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 쪽 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이성 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재함으로써 용이한 분리 방법이 제공되기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 목적하지 않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이중특이성 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 접근법은 WO 제94/04690호에 개시되어 있다. 이중특이성 항체의 생성에 대한 추가 상세는, 예를 들면, 문헌[참조: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 항체 분자의 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로이량체의 백분율을 최대화하도록 조작할 수 있다. 선호되는 인터페이스는 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는, 1차 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예: 티로신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예: 알라닌 또는 트레오닌)로 치환함으로써, 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동"은 2차 항체 분자의 계면에 생성된다. 이것은 호모이량체 등의 기타 불필요한 최종 생성물보다 헤테로이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이성 항체에는 가교 또는 "헤테로접합체" 항체가 포함된다. 예를 들면, 헤테로접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 결합되고, 다른 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들면, 면역계 세포를 목적하지 않는 세포로 표적화하기 위해(미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해(WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하는 기술도 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, 이중특이성 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. 문헌[참조: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재하고 있다. 이 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세나이트의 존재하에서 환원되어, 인접 디티올을 안정화하고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 메르캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이성 항체를 형성한다. 생성된 이중특이성 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 약제로 사용될 수 있다.
이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적 회수를 촉진하는 기술이 존재하고, 이는 화학적으로 결합하여 이중특이성 항체를 형성할 수 있다. 문헌[참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225(1992)]은 인간화 이중특이성 항체 F(ab')2 분자의 생산에 대해 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되었고, 시험관내에서 직접 화학적 커플링을 받아 이중특이성 항체를 형성했다. 이렇게 형성된 이중특이성 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있다.
재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이성 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되어 있다[참조: Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16, 677-681 (1998) doi:10.1038/nbt0798-677pmid:9661204]. 예를 들면, 이중특이성 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다[참조: Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 호모이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고, 이어서 재산화되어 항체 헤테로이량체를 형성했다. 이 방법은 또한 항체 호모이량체의 생산에도 이용될 수 있다. 문헌[참조: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 의해 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대체 메커니즘을 제공했다. 단편은, 동일한 쇄의 2개 도메인 사이의 페어링을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제적으로 페어링되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 일본쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이성 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고되었다[참조: Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994)].
특정 실시양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 DOCK-AND-LOCK™(DNL™) 복합체로서 형성될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제7,521,056호; 제7,527,787호; 제7,534,866호; 제7,550,143호 및 제7,666,400호 참조, 각각의 실시예의 섹션은 참조에 의해 본 명세서에 도입된다). 일반적으로, 이 기술은 cAMP 의존성 단백질 키나제(PKA)의 조절(R) 서브유닛의 이량체화 및 도킹 도메인(DDD) 서열과, 임의의 다양한 AKAP 단백질로부터 유래하는 앵커 도메인(AD) 서열 사이에서 발생하는 특이적으로 고친화성의 결합 상호작용을 이용한다[참조: Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264; Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5:959]. DDD 및 AD 펩타이드는 임의의 단백질, 펩타이드 또는 기타 분자에 부착될 수 있다. DDD 서열이 자발적으로 이량체화되어 AD 서열에 결합하기 때문에, 이 기술은 DDD 또는 AD 서열에 부착될 수 있는 선택된 분자 사이의 복합체의 형성이 가능해진다.
2가 이상의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다[참조: Tutt et al., J. Immunol. 147: 60, 1991; Xu et al., Science, 358(6359):85-90, 2017]. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본 개시의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체(예를 들면, 4가 항체)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다(또는 이로 구성된다). 이 시나리오에서는, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대한 아미노 말단의 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본 명세서에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다(또는 이들로 구성된다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄(및 바람직하게는 2개의 폴리펩타이드 쇄)를 포함하고, 여기서 폴리펩타이드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩타이드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서 VD1은 제1 가변 영역이고, VD2는 제2 가변 영역이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩타이드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들면, 폴리펩타이드 쇄(들)는 하기를 포함할 수 있다: VH-CH1-유연한 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본 명세서에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개(및 바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본 명세서의 다가 항체는, 예를 들면, 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
전하 변형은 다중특이성 항체의 상황에서 특히 유용하고, 여기서 Fab 분자의 아미노산 치환에 의해 경쇄와 부정합 중쇄(Bence-Jones 유형 부산물)와의 부정합이 감소하고, 이는 결합 아암 중 하나(또는 2개 이상의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에는 하나 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반 이중/다중특이성 항원 결합 분자의 생성에서 발생할 수 있다(PCT 공개 번호 WO 제2015/150447호 참조, 특히 그 중의 예는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입됨).
따라서, 특정 실시양태에서, 치료제에 포함된 항체는
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자
를 포함하고,
여기서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 치환되고,
제1 항원은 활성화 T 세포 항원이고 제2 항원은 표적 세포 항원이거나, 또는 제1 항원은 표적 세포 항원이고 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
여기서
i) a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따른 넘버링)으로 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환되거나; 또는
ii) b)하의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서는, 위치 124의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따른 넘버링)으로 치환되고, b)하의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서는, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)으로 치환된다.
항체는 i) 및 ii)에 서술된 변형을 모두 포함하지 않을 수 있다. 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 치환되지 않는다(즉, 교환되지 않은 상태로 유지됨).
항체의 또 다른 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)(한 가지 바람직한 실시양태에서, 독립적으로 라이신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해)에 의해 독립적으로 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
추가 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
특정 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)(하나의 바람직한 실시양태에서는, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따른 넘버링)(바람직한 일 실시양태에서는, 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R))에 의해 독립적으로 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
보다 특정한 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
추가로 특정한 실시양태에서, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)(카바트에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, a)하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환되고, 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 치환된다.
F. 키메라 항원 수용체
인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 키메라 항원 수용체(CAR)라고도 공지됨)는 면역 이펙터 세포에 임의의 특이성을 이식하는 조작된 수용체이다. 통상, 이러한 수용체는 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포에 이식하기 위해 사용되고, 레트로바이러스 벡터에 의해 코딩 서열의 전달이 촉진된다. 이러한 방식으로, 입양 세포 전달을 위해, 다수의 표적 특이적 T 세포가 생성될 수 있다. 이 접근법의 1상 임상 연구는 효능을 나타낸다.
이러한 분자의 가장 일반적 형태는 모노클로날 항체로부터 유래하는 일본쇄 가변 단편(scFv)의 융합물이고, CD3-제타 막관통 및 엔도도메인에 융합된다. 이러한 분자는 이의 표적의 scFv에 의한 인식에 대한 응답으로 제타 신호의 전달을 초래한다. 이러한 작제물의 예는 하이브리도마 14g2a(디시알로강글리오사이드 GD2를 인식함)로부터 유래하는 scFv의 융합물인 14g2a-제타이다. T 세포가 이 분자를 발현하면(통상은 온코레트로바이러스 벡터 형질도입에 의해 달성됨), GD2를 발현하는 표적 세포(예: 신경모세포종 세포)를 인식하고 사멸시킨다. 악성 B 세포를 표적화하기 위해, 연구자들은 B 계통 분자 CD19에 특이적인 키메라 면역수용체를 사용하여 T 세포의 특이성을 재지시했다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 유연한 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이 scFv의 전에 신호 펩타이드가 있고, 신생 단백질을 소포체로 지시하고, 후속 표면 발현을 지시한다(이는 절단됨). 유연한 스페이서에 의해, scFv를 상이한 방향으로 배양시켜 항원 결합을 가능하게 한다. 막관통 도메인은 통상 세포 내로 돌출되어 목적하는 신호를 전달하는 신호전달 엔도도메인의 원래 분자로부터 유래하는 전형적 소수성 알파 헬릭스이다.
유형 I 단백질은 실제로 그 사이에 막관통 알파 헬릭스에 의해 연결된 2개의 단백질 도메인이다. 막관통 도메인이 통과하는 세포막 지질 이중층은 내측 부분(엔도도메인)을 외측 부분(엑토도메인)으로부터 단리하도록 작용한다. 한 단백질의 엑토도메인을 또 다른 단백질의 엔도도메인에 부착하면, 전자의 인식을 후자의 신호와 조합시킨 분자가 수득된다는 것은 놀라운 것은 아니다.
엑토도메인. 신호 펩타이드는 신생 단백질을 소포체로 유도한다. 이것은 수용체가 글리코실화되고 세포막에 고정되는 경우에 필수적이다. 모든 진핵생물 신호 펩타이드 서열은 통상 정상으로 작동한다. 일반적으로, 아미노 말단의 대부분 성분에 자연적으로 부착된 신호 펩타이드가 사용된다(예: 경쇄-링커-중쇄의 방향을 갖는 scFv에서는 경쇄의 천연 신호가 사용된다).
항원 인식 도메인은 통상 scFv이다. 그러나, 다수의 대안이 있다. 천연 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 일본쇄로부터의 항원 인식 도메인은, 단순한 엑토도메인(예: HIV 감염 세포를 인식하는 CD4 엑토도메인) 및 연결된 사이토카인 등의 보다 이국적 인식 성분(이는 사이토카인 수용체를 갖는 세포의 인식을 유도함)을 갖는 것으로 기재되어 있다. 사실, 소정 표적에 높은 친화성으로 결합하는 거의 모든 것을 항원 인식 영역으로 사용할 수 있다.
스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결한다. 항원 인식을 용이하게 하기 위해, 항원 결합 도메인이 상이한 방향으로 배향될 수 있도록 충분히 유연해야 한다. 가장 단순한 형태는 IgG1의 힌지 영역이다. 대안으로는 면역글로불린의 CH2CH3 영역과 CD3의 일부가 포함된다. 대부분의 scFv 기반 작제물에서는 IgG1 힌지로 충분하다. 그러나, 최상의 스페이서는 종종 경험적으로 결정되어야 한다.
막관통 도메인. 막관통 도메인은 막을 가로지르는 소수성 알파 헬릭스이다. 일반적으로, 엔도도메인의 가장 막 근위의 구성요소로부터의 막관통 도메인이 사용된다. 흥미롭게도, CD3-제타 막관통 도메인을 사용하면, 인공 TCR을 천연 TCR에 도입할 수 있고, 이는 천연 CD3-제타 막관통 하전 아스파라긴산 잔기의 존재에 의존하는 요인이다. 상이한 막관통 도메인은 상이한 수용체의 안정성을 초래한다. CD28 막관통 도메인은 밝게 표시된 안정한 수용체를 초래한다.
엔도도메인. 이것은 수용체의 "비즈니스-말단"이다. 항원 인식 후, 수용체가 클러스터링되고, 신호가 세포로 전달된다. 가장 일반적으로 사용되는 엔도도메인 성분은 3개의 ITAM을 포함하는 CD3-제타이다. 이것은, 항원이 결합된 후, 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. CD3-제타는 완전히 유능한 활성화 신호를 제공하지 않을 수 있고, 추가 공-자극 신호가 필요하다.
"1세대" CAR은 통상 내인성 TCR로부터의 신호의 주요 전달물질인 CD3 ξ-쇄로부터의 세포내 도메인을 갖고 있다. "2세대" CAR은 다양한 공-자극 단백질 수용체(예: CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 꼬리에 추가하여, T 세포에 추가 신호를 제공한다. 전임상 연구에 따르면, 2세대 CAR 디자인이 T 세포의 항종양 활성을 개선하는 것을 나타낸다. 보다 최근에는, "3세대" CAR은 CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40 등의 복수의 신호전달 도메인을 조합하여 효능을 추가로 향상시킨다.
G. ADC
항체 약물 접합체 또는 ADC는 감염성 질환을 갖는 사람들의 치료를 위한 표적 요법으로서 설계된 새로운 부류의 매우 강력한 생물의약 약물이다. ADC는, 항체(mAb 전체 또는 일본쇄 가변 단편 또는 scFv)로 구성되는 복잡한 분자이고, 불안정한 결합을 갖는 안정한 화학적 링커를 통해 생물학적 활성 세포독성/항바이러스 페이로드 또는 약물에 연결된다. 항체 약물 접합체는 생체접합체 및 면역접합체의 예이다.
모노클로날 항체의 독자의 표적화 능력과 세포독성 약물의 암-사멸 능력을 조합함으로써, 항체-약물 접합체는 건강한 조직과 발병 조직을 민감하게 구별할 수 있다. 이는, 종래의 전신 접근법과 대조적으로, 항체-약물 접합체가 감염된 세포를 표적으로 하여 공격하기 때문에, 건강한 세포가 덜 심각하게 영향을 받는다는 것을 의미한다.
ADC 기반 항종양 요법의 개발에서, 항암제(예: 세포 독소 또는 세포독소)를, 특정 세포 마커를 특이적으로 표적화하는 항체(예: 이상적으로는, 감염된 세포 중 또는 상에서만 발견되는 단백질)에 커플링된다. 항체는 이러한 단백질을 체내에서 추적하여 암세포의 표면에 부착한다. 항체와 표적 단백질(항원) 사이의 생화학적 반응은 종양 세포에서 신호를 촉발하고, 이것이 세포독소와 함께 항체를 흡수하거나 내재화한다. ADC가 내재화된 후, 세포독성 약물이 방출되어 세포를 사멸하거나, 바이러스 복제를 손상시킨다. 이러한 표적화로 인해, 이상적으로는, 이 약물은 다른 약물보다 부작용이 적고 치료 윈도우가 더 넓어진다.
항체와 세포독성/항바이러스제 사이의 안정한 연결은 ADC의 중요한 측면이다. 링커는 디설파이드물, 하이드라존 또는 펩타이드(절단 가능) 또는 티오에테르(절단 불가능)를 포함한 화학적 모티프를 기반으로 하고, 세포독성제의 표적 세포로의 분포 및 전달을 제어한다. 절단 가능한 및 절단 불가능한 유형의 링커는 전임상 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 브렌툭시맙 베토틴에는 강력하고 독성이 강한 항미세소관제인 모노메틸 오리스타틴 E 또는 MMAE(합성 항종양제)를 인간 특이적 CD30-양성 악성 세포에 전달하는 효소 감수성의 절단 가능한 링커가 포함되어 있다. 튜불린의 중합을 차단하여 세포 분열을 억제하는 MMAE의 독성이 높기 때문에, 단일제 화학요법 약물로서 사용할 수 없다. 그러나, 항-CD30 모노클로날 항체(cAC10, 종양 괴사 인자 또는 TNF 수용체의 세포막 단백질)에 연결된 MMAE의 조합은 세포외 유체에서 안정하고, 카텝신에 의해 절단 가능하고, 치료에 안전한 것으로 입증되었다. 또 다른 승인된 ADC인 트라스투주맙 엠타신은 마이탄신의 유도체인 미소관-형성 억제제 메르타신(DM-1)과, 안정한 비절단 링커에 의해 부착된 항체 트라투주맙(Herceptin®/Genentech/Roche)의 조합이다.
보다 우수하고 보다 안정한 링커의 가용성은 화학 결합의 기능을 변경했다. 링커 유형은 절단 가능 또는 절단 불가능하고, 세포독성(항암) 약물에 특정의 특성을 부여한다. 예를 들면, 절단 불가능한 링커는 약물을 세포 내에 유지한다. 그 결과, 전체 항체, 링커 및 세포독성제는 표적화된 암세포로 유입하고, 여기서 항체가 아미노산 수준으로 분해된다. 수득되는 복합체(아미노산, 링커 및 세포독성제)는 이제 활성 약물로 된다. 대조적으로, 절단 가능한 링커는 세포독성제를 방출하는 숙주 세포 내의 효소에 의해 촉매된다.
현재 개발 중의 또 다른 유형의 절단 가능한 링커는 세포독성/항바이러스 약물과 절단 부위 사이에 추가 분자를 추가한다. 이 링커 기술에 의해, 연구자는 절단 속도의 변화를 걱정하지 않고 보다 유연성의 ADC를 생성할 수 있다. 연구자들은 또한, 펩타이드 중의 아미노산을 서열분석하는 방법인 에드만(Edman) 분해를 기반으로 하는 펩타이드 절단의 신규 방법을 개발하고 있다. ADC의 개발에서 장래의 방향성에는 안정성과 치료 지수를 추가로 개선하기 위한 부위 특이적 접합(TDC)의 개발, 및 α 방출 면역접합체 및 항체 접합 나노입자의 개발도 포함된다.
H. BiTES
이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE)는 항암제로서의 사용이 조사되는 인공 이중특이성 모노클로날 항체의 부류이다. 이들은 감염된 세포에 대하여 숙주의 면역계, 보다 구체적으로 T 세포의 세포독성 활성을 지시한다. BiTE는 마이크로메트 아게(Micromet AG)의 등록 상표이다.
BiTE는, 약 55킬로달톤의 단일 펩타이드 쇄 상의 서로 상이한 항체의 2개 일본쇄 가변 단편(scFv) 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 하나는 특정 분자를 통해 감염된 세포에 결합한다.
다른 이중특이성 항체와 마찬가지로 및 통상의 모노클로날 항체와는 달리, BiTE는 T 세포와 표적 세포 사이에 연결을 형성한다. 이것에 의해, T 세포는 MHC I 또는 공-자극 분자의 존재와 무관하게, 퍼포린 및 그랜자임 등의 단백질을 생성함으로써, 감염된 세포에 대해 세포독성/항바이러스 활성을 발휘한다. 이 단백질은 감염된 세포에 유입되어, 세포의 아폽토시스를 개시한다. 이 작용은 감염된 세포에 대한 T 세포 공격 동안 관찰되는 생리학적 프로세스를 모방한다.
I. 인트라바디
특정 실시양태에서, 항체는 세포 내에서의 작용에 적합한 재조합 항체이고, 이러한 항체는 "인트라바디"로서 공지되어 있다. 이러한 항체는 세포 내 단백질 수송의 변화, 효소 기능의 방해, 단백질-단백질 또는 단백질-DNA 상호작용의 차단 등, 다양한 메커니즘에 의해 표적 기능을 방해할 수 있다. 다수의 점에서, 이들의 구조는 상기 논의한 일본쇄 및 단일 도메인 항체의 구조를 모방 또는 유사하다. 실제로, 단일 전사물/일본쇄는 표적 세포에서의 세포내 발현을 가능하게 하고, 또한 세포막을 가로질러 단백질 수송을 보다 실현 가능하게 하는 중요한 기능이다. 그러나, 추가 기능이 필요하다.
인트라바디 치료의 실시에 영향을 미치는 2개의 주요 문제는 세포/조직의 표적화를 포함하는 전달 및 안정성이다. 전달과 관련하여, 조직-지시된 전달, 세포 유형 특이적 프로모터의 사용, 바이러스 기반의 전달 및 세포 투과성/막 전위 펩타이드의 사용 등, 다양한 접근법이 사용되었다. 안정성과 관련하여, 접근법은 일반적으로, 파지 디스플레이를 수반하고 컨센서스 서열의 서열 성숙 또는 발달을 포함할 수 있는 방법을 포함하여 무차별 힘에 의한 스크리닝, 또는 삽입 안정화 서열(예: Fc 영역, 샤페론 단백질 서열, 류신 지퍼) 및 디설파이드 치환/변형 등의 더욱 지시된 변형 중의 어느 하나이다.
인트라바디에 필요할 수 있는 추가 기능은 세포내 표적화를 위한 신호이다. 인트라바디(또는 기타 단백질)를 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 ER 등의 세포내 영역에 표적화할 수 있는 벡터가 설계되었고, 상업적으로 입수 가능하다(Invitrogen Corp.; Persic et al., 1997).
세포에 유입될 수 있는 능력에 비추어, 인트라바디에는 기타 유형의 항체가 달성할 수 없는 추가 용도가 있다. 본 발명의 항체의 경우, 살아있는 세포에서 MUC1 세포질 도메인과 상호작용하는 능력은 신호전달 기능(다른 분자에 결합) 또는 올리고머 형성 등의 MUC1 CD와 관련된 기능을 방해할 수 있다. 특히, 이러한 항체는 MUC1 이량체 형성을 억제하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
J. 정제
특정 실시양태에서, 본 개시의 항체는 정제될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "정제된"은, 단백질이 이의 자연적으로 수득할 수 있는 상태에 대하여 임의의 정도까지 정제되는, 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하는 것을 의도한다. 따라서, 정제된 단백질은 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 해방된 단백질을 지칭한다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이 명칭은 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예를 들면, 조성물에서 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성하는 조성물을 지칭한다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 기술은 어느 수준에서는 세포 환경의 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획으로 조 분별하는 것을 포함한다. 폴리펩타이드를 다른 단백질로부터 분리한 후, 목적 폴리펩타이드는 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성을 위한 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 초점이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법에는 황산암모늄, PEG, 항체 등에 의한 침전 또는 열 변성과 그에 계속하여 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 기타 기술의 조합이 포함된다.
본 개시의 항체를 정제할 때에, 원핵생물 또는 진핵생물의 발현 시스템에서 폴리펩타이드를 발현시키고, 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 태깅된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 사용하여 기타 세포 성분으로부터 정제할 수 있다. 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서를 변경할 수 있거나, 또는 특정 단계를 생략하여도, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드를 제조하기 위한 적합한 방법을 제공하는 것으로 믿어진다.
일반적으로 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 약제(즉, 단백질 A)를 사용하여 분획화된다. 또는, 항원은 적절한 항체의 정제와 선택을 동시에 수행하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종종 컬럼, 필터 또는 비드 등의 지지체에 결합된 선택 약제를 이용한다. 항체는 지지체에 결합하고, 오염 물질을 제거하고(예: 세척), 조건(염, 열 등)을 적용함으로써 항체를 방출시킨다.
단백질 또는 펩타이드의 정제의 정도를 정량화하는 다양한 방법이 본 개시에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 여기에는, 예를 들면, 활성 분획의 비활성을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것이 포함된다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비활성과 비교하여 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제의 단위는 물론 정제를 추적하기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출 가능한 활성을 나타내는지의 여부에 의존한다.
폴리펩타이드의 이동은, SDS/PAGE의 조건이 상이하면, 경우에 따라 현저히 변화할 수 있는 것으로 공지되어 있다[참조: Capaldi et al., 1977]. 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 정제 또는 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량이 변화할 수 있음이 이해될 것이다.
III. 엔테로바이러스 D68 감염의 능동/수동 면역 및 치료/예방
A. 제형 및 투여
본 개시는 항-EV-D68 항체 및 이를 생성하기 위한 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편, 또는 펩타이드 면역원, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나, 동물, 보다 구체적으로는 인간에서의 사용에 대해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 수록되어 있는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등의 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는, 물 및 오일 등의 멸균 액체일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우, 물은 특정한 담체이다. 식염수, 덱스트로스 및 글리세롤 수용액도 특히 주사용 용액의 액체 담체로 사용할 수 있다. 기타 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은 또한, 필요에 따라, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제의 예는 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은, 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께, 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공한다. 제형은 경구, 정맥내, 동맥내, 협측, 비강내, 분무, 기관지 흡입, 직장내, 질, 국소 또는 기계적 인공호흡에 의해 전달될 수 있는 투여 방식에 적합해야 한다.
공개된 것과 같은 항체가 EV-D68 감염 위험이 있는 대상체에서 생체내에서 생성되는 경우의 활성 백신도 상정된다. 이러한 백신은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고, 예를 들면, 피내, 정맥내, 근육내, 피하, 에어로졸 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 피내 및 근육내 경로에 의한 투여가 고려된다. 대안적으로, 백신은 점막에 국소 경로에 의해 점막에 직접 투여될 수 있고, 예를 들면, 점비제, 흡입, 분무기에 의해, 또는 직장내 또는 질 전달을 통해 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산성 염 및, 예를 들면, 염산 또는 인산 등의 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등의 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철 등의 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래할 수 있다.
인공적으로 획득한 수동 면역으로서 공지된 항체의 수동적 전달은 일반적으로 정맥내 주사 또는 근육내 주사의 사용을 수반한다. 항체의 형태는, 정맥내(IVIG) 또는 근육내(IG) 사용을 위한 풀링된 인간 면역글로불린으로서, 면역화되거나 질환으로부터 회복된 공여자로부터의 고역가 인간 IVIG 또는 IG으로서, 및 모노클로날 항체(MAb)로서, 인간 또는 동물의 혈장 또는 혈청일 수 있다. 이러한 면역은 일반적으로 짧은 기간 동안만 지속되고, 특히 비인간 기원의 감마 글로불린에 의한 과민 반응 및 혈청병의 잠재적 위험이 있다. 그러나, 수동 면역은 즉각적 보호를 제공한다. 항체는 주사에 적합한, 즉 멸균되고 주사 가능한 담체에서 제형화될 것이다.
일반적으로, 본 개시의 조성물의 성분은, 개별적으로 공급되거나, 예를 들면, 활성 물질의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀봉된 용기에 건조 동결건조 분말 또는 물-비함유 농축물로서 단위 투여 형태로 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플을 제공하여 투여 전에 성분을 혼합할 수 있다.
본 개시의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것 등의 음이온으로 형성된 염, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것 등의 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
2. ADCC
항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 면역 이펙터 세포에 의해 항체 코팅된 표적 세포의 용해를 유도하는 면역 메커니즘이다. 표적 세포는 일반적으로 Fc 영역의 N-말단인 단백질 부분을 통해 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 특이적으로 결합하는 세포이다. "항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)의 증가/감소를 갖는 항체"는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정되는 ADCC의 증가/감소를 갖는 항체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가/감소된 ADCC"는, 상기 정의된 ADCC의 메커니즘에 의해 표적 세포를 둘러싸고 있는 배지에서 소정 항체 농도에서 소정 시간에 용해되는 표적 세포 수의 증가/감소로서 정의되고/되거나, ADCC의 메커니즘에 의해 소정 시간에 소정 수의 표적 세포의 용해를 달성할 필요가 있는, 표적 세포를 둘러싸고 있는 배지에서 항체 농도의 감소/증가로서 정의된다. ADCC의 증가/감소는 동일한 표준적 생산, 정제, 제형 및 저장 방법(이는 당업자에게 공지됨)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC와 관련되지만, 이는 조작되지 않은 것이다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법에 의해, 변경된 글리코실화 패턴을 갖도록(예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제, GnTIII 또는 기타 글리코실트랜스퍼라제를 발현하도록) 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 항체에 의해 매개되는 ADCC의 증가는 동일한 유형의 조작되지 않은 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC와 비교된다.
3. CDC
보체 의존성 세포독성(CDC)은 보체 시스템의 기능이다. 면역계의 항체 또는 세포의 관여 없이 병원체의 막을 손상시킴으로써 병원체를 사멸시키는 것은 면역계의 프로세스이다. 3개의 주요 프로세스가 있다. 3개 모두가 치명적 콜로이드 삼투압 팽창, 즉 CDC를 유발하는 병원체에 하나 이상의 막 공격 복합체(MAC)를 삽입한다. 이는 항체 또는 항체 단편이 항바이러스 효과를 발휘하는 메커니즘 중 하나이다.
IV. 항체 접합체
본 개시의 항체는 항체 접합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 약제에 연결시킬 수 있다. 진단제 또는 치료제로서의 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 모이어티를 연결하거나, 공유 결합하거나, 또는 복합체를 형성하는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이펙터 분자는 목적하는 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비제한적 예에는 독소, 항종양제, 치료용 효소, 방사성핵종, 항바이러스제, 킬레이트제, 사이토카인, 성장 인자 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적 예에는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들면, 비오틴이 포함된다.
항체 접합체는 일반적으로 진단제로서 사용하기에 바람직하다. 항체 진단은 일반적으로 2개 부류, 다양한 면역검정 등의 시험관내 진단에 사용되는 것과, 일반적으로 "항체 지시 이미징"으로 공지된 생체내 진단 프로토콜에 사용되는 것으로 분류된다. 항체에 대한 이들의 부착을 위한 방법과 마찬가지로, 다수의 적절한 이미징제가 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호 및 제4,472,509호 참조). 사용된 이미징 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광색소, NMR 검출 가능한 물질 및 X선 이미징제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 예로서, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III) 등의 이온을 들 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X선 이미징 등의 기타 상황에서 유용한 이온에는 란탄(III), 금(III), 납(II), 특히 비스무트(III)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
치료 및/또는 진단용의 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 들 수 있다. 125I는 특정 실시양태에서의 사용에 종종 바람직하고, 테크니시움99m 및/또는 인듐111은 또한 이들의 낮은 에너지 및 장거리 감지에 대한 적합성으로 인해 종종 바람직하다. 본 개시의 방사성 표지된 모노클로날 항체는 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 차아염소산나트륨 등의 화학적 산화제 또는 락토퍼옥시다제 등의 효소적 산화제와 접촉시킴으로써 요오드화할 수 있다. 본 개시에 따른 모노클로날 항체는, 예를 들면, 퍼테크네이트를 제1주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 컬럼 상에 킬레이트화하고, 항체를 이 컬럼에 적용함으로써 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 또는, 예를 들면, 퍼테크네이트, SNCl2 등의 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액 등의 완충액 및 항체를 배양함으로써 직접 표지 기술을 사용할 수 있다. 금속 이온으로서 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키기 위해 자주 사용되는 중간 작용기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광성 표지에는 알렉사(Alexa) 350, 알렉사(Alexa) 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 카스카드 블루(Cascade Blue), Cy3, ,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine) 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)가 포함된다.
본 개시에서 고려되는 추가 유형의 항체는 주로 시험관내에서의 사용을 위한 것이고, 여기서 항체는 2차 결합 리간드 및/또는 발색성 기질과의 접촉시 착색된 생성물을 생성하는 효소(효소 태그)에 연결된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙트아비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
항체에 대한 분자의 부위-특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 항체를 합텐 기반 친화성 표지와 반응시키는 것을 포함한다. 기본적으로, 합텐-기반 친화성 표지는 항원 결합 부위의 아미노산과 반응하고, 이에 의해 이 부위를 파괴하고, 특정 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는, 항체 접합체에 의한 항원 결합의 손실을 초래하기 때문에, 유리하지 않을 수 있다.
아지도 그룹을 포함하는 분자는 또한 낮은 강도의 자외선에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 대한 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다[참조: Potter and Haley, 1983]. 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조 세포 추출물 중의 뉴클레오티드 결합 단백질을 동정하기 위한 부위 특이적 광프로브로로서 사용되었다[참조: Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985]. 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하기 위해 사용되었고[참조: Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989], 항체 결합제로서 사용될 수 있다.
접합체 모이어티에 대한 항체의 부착 또는 접합을 위한 몇몇 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들면, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA) 등의 유기 킬레이트제; 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 착체의 사용을 수반한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 모노클로날 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 페리오데이트 등의 커플링제의 존재하에 효소와 반응시킬 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이러한 커플링제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 이미징은 모노클로날 항체를 사용하여 달성되고, 검출 가능한 이미징 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트 등의 링커를 사용하여 항체에 결합시킨다.
다른 실시양태에서, 항체 결합 부위를 변화시키지 않는 반응 조건을 사용하여, 면역글로불린의 Fc 영역에 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 이 방법에 따라 생성된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 감도를 나타내는 것으로 개시되어 있다(미국 특허 제5,196,066호, 참조에 의해 본 명세서에 도입됨). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역의 탄수화물 잔기에 접합되어 있는, 이펙터 또는 리포터 분자의 부위 특이적 부착도 문헌에 개시되어 있다[참조: O'Shannessy et al., 1987]. 이 접근법은 현재 임상 평가 중의 진단 및 치료적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되었다.
V. 면역검출 방법
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 EV-D68 및 이의 관련 항원을 결합, 정제, 제거, 정량화 및 달리 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 종래의 의미에서 적용될 수 있지만, 백신 및 기타 바이러스 스톡의 품질 관리 및 모니터링에도 사용될 것이고, 여기서 본 개시에 따른 항체는 바이러스 중의 항원의 양 또는 완전성(즉, 장기 안정성)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 이 방법을 사용하여, 적절한/목적하는 반응성 프로파일에 대해 다양한 항체를 스크리닝할 수 있다.
다른 면역검출 방법에는 대상체에서 EV-D68의 존재를 결정하기 위한 특정 검정이 포함된다. 다양한 검정 형식이 고려되지만, 구체적으로는 타액, 혈액, 혈장, 가래, 정액, 소변, 호흡기 비말 또는 에어로졸 등의 대상체로부터 수득된 유체 중의 EV-D68을 검출하기 위해 사용되는 것들이다. 특히, 정액은 EV-D68을 검출하기 위한 실행 가능한 샘플로서 입증되었다[참조: Purpura et al., 2016; Mansuy et al., 2016; Barzon et al., 2016; Gornet et al., 2016; Duffy et al., 2009, CDC, 2016, Halfon et al., 2010, Elder et al. 2005]. 검정은 가정에서의 임신 검사와 유사한 회방향 유동 검정(하기 참조)을 포함하여 비의료(가정)에서의 사용을 위해 유리하게 포맷할 수 있다. 이러한 검정은 가족 구성원의 대상체에 의해 사용될 수 있도록 적절한 시약 및 지침을 포함하는 키트 형태로 팩키징될 수 있다.
일부 면역검출 방법에는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역 검정(RIA), 면역방사성 검정, 형광면역 검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정 및 웨스턴 블롯이 포함된다. 특히, 샘플 중의 특정 기생충 에피토프에 대해 지시된 EV-D68 항체의 검출 및 정량을 위한 경쟁 검정도 제공된다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는, 예를 들면, 문헌[참조: Doolittle 및 Ben-Zeev(1999), Gulbis and Galand(1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 EV-D68을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 경우에 따라, 면역복합체의 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에 본 개시에 따라 샘플을 제1 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.
이러한 방법에는 샘플로부터 EV-D68 또는 관련 항원을 정제하는 방법이 포함된다. 항체는 바람직하게는 컬럼 매트릭스 형태 등의 고체 지지체에 연결되고, EV-D68 또는 항원 성분을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 고정된 항체에 적용된다. 불필요한 성분은 컬럼으로부터 세척되어 EV-D68 항원이 고정된 항체에 면역복합체로 잔류하고, 이어서 고정화된 항체는 컬럼으로부터 생물 또는 항원을 제거함으로써 수집된다.
면역 결합 방법에는 또한 샘플 중의 EV-D68 또는 관련 성분의 양을 검출 및 정량화하는 방법 및 결합 프로세스 동안 형성된 면역 복합체의 검출 및 정량화 방법이 포함된다. 여기에서는, EV-D68 또는 이의 항원을 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 이 샘플을 EV-D68 또는 이의 성분에 결합하는 항체와 접촉시킨 후, 특정 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출하고 정량화한다. 항원 검출과 관련하여, 분석된 생물학적 샘플은 조직 절편 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 혈액 및 혈청을 포함한 생물학적 유체, 또는 대변 또는 소변 등의 분비물 등의 EV-D68 또는 EV-D68 항원을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다.
선택된 생물학적 샘플을 효과적 조건하에서 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 항체 조성물을 샘플에 단순히 첨가하고, 항체가 EV-D68 또는 존재하는 항원과의 면역 복합체를 형성하기에 충분한 시간, 즉 EV-D68 또는 존재하는 항원에 결합하기에 충분한 시간 동안 혼합물을 인큐베이팅하는 것이다. 이 시간 후, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 등의 샘플 항체 조성물을 일반적으로 세척하여 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여, 1차 면역 복합체 내에서 특이적으로 결합된 항체만이 검출되도록 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 다수의 접근법을 적용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 등의 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허에는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함된다. 물론, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 2차 항체 등의 2차 결합 리간드 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열을 사용함으로써 추가의 이점을 발견할 수 있다.
검출에 사용된 항체는 그 자체가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있고, 이어서 이 표지를 단순히 검출하고, 이에 의해 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양을 결정할 수 있다. 또는, 1차 면역 복합체 내에서 결합되는 1차 항체는 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 결합 리간드에 의해 검출할 수 있다. 이러한 경우, 2차 결합 리간드는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 2차 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이고, 따라서 "2차" 항체로 명명될 수 있다. 1차 면역 복합체는 효과적인 조건하에 2차 면역 복합체의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 이어서, 2차 면역 복합체를 일반적으로 세정하여, 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고, 이어서 2차 면역 복합체의 잔류 표지를 검출한다.
추가 방법에는 2단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출이 포함된다. 상기한 바와 같이, 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 항체 등의 제2 결합 리간드를 사용하여 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 다시 효과적 조건하에서 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 2차 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 3차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 3차 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어, 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이 시스템은, 이것이 바람직한 경우, 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역 검출의 한 가지 방법은 2개의 상이한 항체를 사용한다. 제1 비오틴화된 항체를 사용하여 표적 항원을 검출하고, 이어서 제2 항체를 사용하여 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출한다. 이 방법에서, 시험되는 샘플은 먼저 제1 단계의 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이팅된다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부는 항원에 결합하여 비오틴화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체는 스트렙트아비딘(또는 아비딘), 비오틴화된 DNA 및/또는 상보적 비오틴화된 DNA의 연속 용액에서 인큐베이션에 의해 증폭되고, 각 단계에서 항체/항원 복합체에 추가 비오틴 부위가 추가된다. 적절한 증폭 수준에 도달할 때까지 증폭 단계가 반복되고, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계의 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이팅된다. 이 제2 단계의 항체는, 예를 들면, 발색체 기질을 사용한 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있는 효소로 표지된다. 적절한 증폭에 의해, 육안으로 관찰 가능한 접합체를 생성할 수 있다.
면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR법은 비오틴화 DNA와의 인큐베이션까지는 캔토르(Cantor) 방법과 유사하지만, 스트렙트아비딘과 비오틴화 DNA의 인큐베이션을 복수회 사용하는 대신에, DNA/비오틴/스트렙트아비딘/항체 복합체를 낮은 pH 또는 높은 농도의 완충제로 세정하여 항체를 방출시킨다. 이어서, 수득된 세척 용액을 사용하여, 적절한 대조군을 갖는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론상으로는, PCR의 거대한 증폭 능력과 특이성을 이용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.
A. ELISA
면역검정은 가장 간단하고 직접적인 의미에서 결합 검정이다. 특정의 바람직한 면역검정은 당해 기술분야에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사선면역검정(RIA)이다. 조직 절편을 사용한 면역조직화학적 검출도 특히 유용하다. 그러나, 검출은 이러한 기술에 한정되지 않고, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등도 또한 사용될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
한 가지 예시적 ELISA에서, 본 개시의 항체는 폴리스티렌 미세적정 플레이트 내의 웰 등의 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상에 고정화시킨다. 이어서, EV-D68 또는 EV-D68 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 결합 및 세척한 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출은, 검출 가능한 표지에 연결된 또 다른 항-EV-D68 항체를 추가함으로써 달성할 수 있다. 이러한 유형의 ELISA는 단순히 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한, 제2 항-EV-D68 항체를 첨가하고, 이어서 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 항체를 첨가함으로써 달성할 수 있고, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
또 다른 예시적 ELISA에서, EV-D68 또는 EV-D68 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 웰 표면에 고정시키고, 이어서 본 개시의 항-EV-D68 항체와 접촉시킨다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 결합 및 세척한 후, 결합된 항-EV-D68 항체가 검출된다. 초기 항-EV-D68 항체가 검출 가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체를 직접 검출할 수 있다. 이 경우에도, 면역 복합체는 제1 항-EV-D68 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체를 사용하여 검출할 수 있고, 2차 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 있다.
사용된 포맷에 관계없이, ELISA는 코팅, 인큐베이션 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 결합된 면역 복합체의 검출 등 공통의 특정 기능을 갖고 있다. 이에 대해서 하기 설명한다.
플레이트를 항원 또는 항체로 코팅하는 경우, 일반적으로, 플레이트의 웰을 항원 또는 항체 용액과 함께 밤새 또는 지정된 시간 동안 인큐베이팅한다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 이어서, 웰의 나머지 이용 가능한 표면은 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"된다. 여기에는 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액이 포함된다. 코팅은 고정화 표면의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하고, 따라서 표면에 대한 항혈청의 비특이적 결합에 의해 유발된 배경을 감소시킨다.
ELISA에서는, 직접적 절차가 아닌, 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 보다 일반적일 수 있다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 비반응성 물질로 코팅하여 배경을 감소시키고, 세정하여 비결합된 물질을 제거한 후, 고정화 표면은 면역 복합체(항원/항체)의 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에서 시험되는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 면역 복합체의 검출에는, 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 조합하여 2차 결합 리간드 또는 항체가 필요하다.
"면역 복합체(항원/항체)의 형성을 가능하게 하기에 효과적인 조건하에서"는 조건이 바람직하게는 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산 완충 식염수(PBS)/트윈 등의 용액으로 항원 및/또는 항체를 희석하는 것을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 추가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소에도 역할을 하는 경향이 있다.
"적합한" 조건은 또한 인큐베이션이 효과적 결합을 가능하게 하기에 충분한 온도 또는 기간 동안 진행되는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 일반적으로 약 1~2~4시간 정도, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 또는 약 4℃ 정도에서 밤새 수행할 수 있다.
ELISA의 모든 인큐베이션 단계에 계속하여, 접촉된 표면을 세척하여 복합체를 형성하지 않은 물질을 제거한다. 바람직한 세척 절차에는 PBS/트윈 등의 용액 또는 붕산염 완충액으로 세척하는 것을 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이에 특정의 면역 복합체의 형성 및 후속 세척에 계속하여, 미량의 면역 복합체의 발생이 결정될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 2차 또는 3차 항체는 검출을 가능하게 하는 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이것은 적절한 발색성 기질과의 인큐베이션시에 발색을 생성하는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 추가 면역 복합체 형성의 발달을 조장하는 조건하에서 일정 기간 동안 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 과산화수소-접합 항체와 1차 및 2차 면역 복합체를 접촉시키거나 인큐베이팅하는 것을 원할 것이다(예를 들면, PBS-트윈 등의 PBS 함유 용액에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션).
표지된 항체와 함께 인큐베이션한 후 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 예를 들면, 요소, 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우에 H2O2에 의해 표지의 양을 정량화한다. 이어서, 예를 들면, 가시 스펙트럼 분광 광도계를 사용하여, 생성된 색상 정도를 측정함으로써 정량화를 달성한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 경쟁 포맷의 사용을 고려한다. 이것은 샘플에서 EV-D68 항체의 검출에 특히 유용하다. 경쟁 기반 검정에서, 미지의 양의 분석물 또는 항체는 공지된 양의 표지된 항체 또는 분석물을 치환하는 능력에 의해 결정된다. 따라서, 신호의 정량화 가능한 손실은 샘플에서 미지의 항체 또는 분석물의 양을 나타낸다.
여기에서, 본 발명자는, 샘플 중의 EV-D68 항체의 양을 결정하기 위해, 표지된 EV-D68 모노클로날 항체의 사용을 제안한다. 기본 포맷에는 미지 양의 EV-D68 모노클로날 항체(검출 가능한 표지에 연결됨)를 EV-D68 항원 또는 입자와 접촉시키는 것이 포함된다. EV-D68 항원 또는 생물은 바람직하게는 지지체에 부착된다. 표지된 모노클로날 항체를 지지체에 결합시킨 후, 샘플을 첨가하고, 샘플 중의 임의의 비표지 항체가 표지된 모노클로날 항체와 경쟁하고, 따라서 이를 치환할 수 있는 조건하에 인큐베이팅한다. 손실된 표지 또는 잔류하는 표지를 측정함으로써(및 결합된 표지의 원래 양으로부터 이를 차감), 비표지 항체의 양이 지지체에 결합되고, 따라서 샘플에 존재하는 항체의 양을 결정할 수 있다.
B. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯(또는 단백질 면역블롯)은 조직 균질물 또는 추출물의 소정 샘플에서 특정 단백질을 검출하기 위해 사용되는 분석 기술이다. 이는 겔 전기영동을 사용하여 폴리펩타이드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3차원 구조(천연/비변성 조건)에 따라 천연 또는 변성된 단백질을 분리한다. 이어서, 단백질은 막(일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 전송되고, 여기서 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙(검출)된다.
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양으로부터 채취할 수 있다. 대부분의 경우, 고형 조직은 먼저 블렌더(샘플 용적이 큰 경우), 균질화기(용적이 작은 경우) 또는 초음파 처리를 사용하여 기계적으로 분해된다. 세포는 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 파괴되어 개방될 수 있다. 그러나, 세균, 바이러스 또는 환경 샘플이 단백질의 공급원으로 될 수 있으므로, 웨스턴 블롯팅은 세포 연구에만 한정되지 않음에 주의해야 한다. 세포의 용해를 촉진하고 단백질을 가용화하기 위해, 각종 계면활성제, 염 및 완충액을 사용할 수 있다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 그 자체의 효소에 의한 샘플의 소화를 방지하기 위해 종종 첨가된다. 조직의 준비는 종종 단백질의 변성을 회피하기 위해 저온에서 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하 또는 이러한 요인의 조합에 의해 수행될 수 있다. 분리의 성질은 샘플의 처리와 겔의 성질에 따라 상이하다. 이것은 단백질을 결정하기 위한 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플로부터의 단백질을 2차원으로 확산하는 2차원(2-D) 겔을 사용하는 것도 가능하다. 단백질은 1차원에서는 등전점(중성의 순 전하를 갖는 pH)에 따라, 2차원에서는 분자량에 따라 분리된다.
단백질을 항체 검출에 이용할 수 있도록 하기 위해, 이들은 겔 내로부터 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 제조된 막으로 이동한다. 막을 겔 위에 놓고, 그 위에 여과지 스택을 놓는다. 전체 스택이 완충액에 배치되고, 모세관 작용에 의해 종이 위로 이동하고, 단백질이 함께 운반된다. 단백질을 전송하는 또 다른 방법은 전기블롯팅(electroblotting)이라고 하고, 전류를 사용하여 단백질을 겔로부터 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 막으로 끌어당긴다. 단백질은 겔 내의 조직을 유지하면서 겔 내로부터 막으로 이동한다. 이 블롯팅 프로세스의 결과, 단백질은 검출을 위해 얇은 표면층에 노출된다(하기 참조). 두 종류의 막은 비특이적 단백질 결합 특성을 위해 선택된다(즉, 모든 단백질에 동등하게 결합함). 단백질 결합은 소수성 상호작용, 및 막과 단백질 사이의 하전 상호작용을 기반으로 한다. 니트로셀룰로오스 막은 PVDF보다 저렴하지만, 훨씬 더 깨지기 쉽고, 반복되는 프로빙에 충분히 견디지 못한다. 겔로부터 막으로의 단백질의 이동의 균일성과 전반적 효과는 쿠마시에 브릴리언트 블루 또는 폰소(Ponceau) S 염료로 막을 염색하여 확인할 수 있다. 전송되면, 단백질은 표지된 1차 항체 또는 비표지된 1차 항체를 사용하여 검출하고, 이어서 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 표지된 단백질 A 또는 2차 표지된 항체를 사용하여 간접적으로 검출한다.
C. 측면 유동 검정
측면 유동 면역크로마토그래피 검정으로도 공지된 측면 유동 검정은 특수한 고가의 장비 없이도 샘플(매트릭스) 중의 표적 분석물의 존재(또는 부재)를 검출하는 것을 목적으로 하는 단순한 장치이지만, 판독 장치에 의해 서포트되는 다수의 실험실 기반 적용이 존재한다. 통상, 이러한 시험은 재택 시험, 포인트 케어 시험 또는 실험실 사용을 위해 낮은 리소스의 의료 진단으로 사용된다. 널리 보급되고 공지된 적용은 가정용 임신 시험이다.
이 기술은 다공성 종이 또는 소결 폴리머 등의 일련의 모세관 베드를 기반으로 한다. 이들 요소의 각각은 자발적으로 체액(예: 소변)을 수송하는 능력을 갖고 있다. 제1 요소(샘플 패드)는 스폰지 역할을 하고, 과량의 샘플 유체를 보유한다. 침지되면, 유체는 제2 요소(접합체 패드)로 이동하고, 이 요소에는 제조업체가 소위 접합체, 즉 생리활성 입자의 건조된 포맷(하기 참조)을 염-당 매트릭스에 보존하고, 이는 입자의 표면에 고정화된 표적 분자(예: 항원) 및 이의 화학 파트너(예: 항체) 사이의 최적화된 화학적 반응을 보증하기 위한 모두를 함유한다. 샘플 유체는 염-당 매트릭스를 용해하지만, 입자도 용해하고, 하나의 조합된 수송 작용으로, 샘플과 접합체가 다공성 구조를 통해 유동하면서 혼합한다. 이러한 방식으로, 분석물은 제3 모세관 베드를 통해 추가로 이동하면서 입자에 결합한다. 이 물질에는, 제조업자에 의해 제3 분자를 고정화시킨 하나 이상의 영역(종종 스트립으로 지칭)이 있다. 샘플-접합체 혼합물이 이러한 스트립에 도달할 때까지, 분석물은 입자에 결합하고, 제3 '포착' 분자는 복합체에 결합한다. 잠시 후, 보다 많은 액체가 스트립을 통과하면, 입자가 축적되고, 스트립 영역의 색상이 변화된다. 통상, 적어도 2개의 스트립이 있다. 하나(대조군)는 임의의 입자를 포착하고, 이에 의해 반응 조건과 기술이 정상으로 기능하는 것을 나타내고, 다른 하나는 특정 포착 분자를 포함하고, 분석물 분자가 고정화된 입자만을 포착한다. 이러한 반응 구역을 통과한 후, 유체는 최종적 다공성 재료(심지)로 유입되고, 이는 단순히 폐기물 용기로서 기능한다. 측면 유동 시험은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정으로 기능할 수 있다. 측면 유동 검정은 미국 특허 제6,485,982호에 개시되어 있다.
D. 면역조직화학
본 개시의 항체는 또한, 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된, 신선-동결 및/또는 포르말린-고정, 파라핀-포매 조직 블록 둘 모두와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자에 대한 이전의 IHC 연구에서 성공적으로 사용되었고, 해당 분야의 숙련자에게 공지되어 있다[참조: Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990].
간단히 말하면, 동결 절편은, 작은 플라스틱 캡슐 내의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 실온에서 50ng의 동결 "분쇄" 조직을 재수화하고; 원심분리에 의해 입자를 펠릿화하고; 점성 포매 매체(OCT)에 이들을 재현탁시키고; 캡슐을 반전시키고/시키거나 원심분리에 의해 다시 펠릿화하고; -70℃ 이소펜탄에서 급속 동결시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 동결된 조직 실린더를 제거하고; 크라이오스탯 마이크로톰 척에 조직 실린더를 고정하고/하거나; 캡슐로부터 25-50개의 연속 절편을 절단함으로써 제조할 수 있다. 또는, 전체 냉동 조직 샘플을 연속 절편 절단에 사용할 수 있다.
영구 절편은, 플라스틱 마이크로퓨지 튜브에서 50mg 샘플을 재수화하고; 펠릿화하고; 10% 포르말린에 재현탁하여 4시간 고정시키고; 세척/펠릿화하고; 온화한 2.5% 아가에 재현탁시키고; 펠릿화하고; 빙수에서 냉각하여 아가를 고화시키고; 튜브로부터 조직/아가 블록을 제거하고; 파라핀에 블록을 침윤 및/또는 포매하고/하거나; 최대 50개의 연속 영구 절편을 절단하는 것을 수반하는 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 전체 조직 샘플을 대용할 수 있다.
E. 면역검출 키트
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 상기 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항체는 EV-D68 또는 EV-D68 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 항체는 키트에 포함될 수 있다. 따라서, 면역검출 키트는 적절한 용기 수단에서 EV-D68 또는 EV-D68 항원에 결합하는 1차 항체, 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, EV-D68 항체는 컬럼 매트릭스 및/또는 미세역가 플레이트의 웰 등의 고체 지지체에 사전에 결합시킬 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 소정 항체와 연관되거나 연결된 검출 가능한 표지를 포함하여 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 연관되거나 부착된 검출 가능한 표지도 또한 고려된다. 예시적 2차 리간드는 1차 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 2차 항체이다.
본 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은 1차 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 2차 항체, 및 2차 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 3차 항체를 포함하는 2-성분 시약을 포함하고, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다. 상기 언급된 바와 같이, 다수의 예시적 표지가 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이러한 모든 표지를 본 개시와 관련하여 사용할 수 있다.
키트는, 검출 검정을 위한 표준 곡선을 작성하기 위해 사용될 수 있는 바와 같이, 표지되거나 표지되지 않든지, EV-D68 또는 EV-D68 항원의 적절하게 분취된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는, 완전히 접합된 형태로, 중간체의 형태로, 또는 키트 사용자에 의해 접합되는 별도의 모이어티로서 항체-표지 접합체를 포함할 수 있다. 키트의 구성요소는 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 팩키징될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로, 항체를 위치시킬 수 있거나, 또는 바람직하게는 적절하게 분취할 수 있는, 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함한다. 본 개시의 키트는 또한, 전형적으로, 상업적 판매를 위해 항체, 항원 및 기타 임의의 시약 용기를 긴밀하게 밀폐하여 수용하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 유지되는 주사 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
F. 백신 및 항원 품질 관리 검정
본 개시는 또한, 샘플 중의 바이러스 항원의 항원성 완전성을 평가할 때에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 항체 및 항체 단편의 사용을 고려한다. 백신과 같은 생물학적 의약품은 통상 분자적으로 특성화될 수 없다는 점에서 화학 의약품과 상이하다. 항체는 상당히 복잡한 큰 분자이고, 제조마다 광범위하게 달라지는 능력을 갖는다. 이들은 또한, 인생 초기의 어린이를 포함하여 건강한 개인에게 투여되고, 따라서 그 자체가 해를 유발하지 않으면서, 생명을 위협하는 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 것을 가능한 한 보장하기 위해, 이들의 품질에 중점을 두어야 한다.
백신의 생산 및 유통에서 세계화의 진전은 공중 위생상의 개념을 보다 적절하게 관리하기 위해 새로운 가능성을 열었지만, 다양한 공급원에서 조달된 백신의 동등성과 호환성에 대한 의문도 제기되었다. 따라서, 출발 물질, 생산 및 품질 관리 시험의 국제 표준화, 및 이러한 제품의 제조 및 사용 방식에 대한 규제 감독에 대한 높은 기대의 설정은 지속적 성공의 초석으로 되었다. 그러나, 이는 끊임없는 변화의 분야이고, 이 분야에서의 지속적 기술 발전은 가장 오래된 공중 위생의 위협, 및 새로운 위협(말라리아, 유행성 인플루엔자, HIV 등)에 대해 강력한 새로운 무기의 개발 약속을 제공하지만, 또한 제품이 달성 가능한 최고 수준의 품질을 지속적으로 충족하는 것을 보증하기 위해, 제조업체, 규제 당국 및 광범위한 의료계에 큰 압력을 가하고 있다.
따라서, 항원 또는 백신은 임의의 공급원으로부터 또는 제조 프로세스 중 임의의 시점에서 수득할 수 있다. 따라서, 품질 관리 프로세스는 바이러스 항원에 대한 본 명세서에 개시된 항체 또는 단편의 결합을 동정하는 면역검정을 위한 샘플을 조제하는 것으로부터 개시할 수 있다. 이러한 면역검정은 이 문서의 다른 부분에 개시되어 있고, 이들 중 어느 것을 사용하여, 항원의 구조적/항원성의 완전성을 평가할 수 있다. 허용 가능한 양의 항원적으로 정확한 및 무손상의 항원을 포함하는 샘플을 발견하기 위한 기준은 규제 당국에 의해 확립될 수 있다.
항원의 완전성이 평가되는 또 다른 중요한 실시양태는 저장 수명 및 저장 안정성을 결정하는 것이다. 백신을 포함한 대부분의 의약은 시간의 경과와 함께 악화될 수 있다. 따라서, 시간의 경과와 함께, 백신 등의 항원이 대상체에게 투여될 때 더 이상 항원성이 아니고/아니거나 면역 반응을 생성할 수 없도록, 분해 또는 불안정화하는 정도를 결정하는 것이 중요하다. 이 경우에도, 허용 가능한 양의 항원적으로 무손상 항원을 포함하는 샘플을 발견하기 위한 기준은 규제 당국에 의해 확립될 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이러스 항원은 하나 이상의 보호 에피토프를 함유할 수 있다. 이러한 경우, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 항체 등 하나 이상의 항체의 결합을 조사하는 검정을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 항체는, 밀접하게 관련된 에피토프에 결합하기 때문에, 서로 인접하거나 심지어 중첩된다. 한편, 이들은 항원의 상이한 부분으로부터 별개의 에피토프를 나타낼 수 있다. 복수의 에피토프의 완전성을 조사함으로써, 항원의 전체적 완전성에 대한 보다 완전한 그림, 및 따라서 보호 면역 반응을 생성하는 능력을 결정할 수 있다.
본 개시에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 단편은 또한 보호 EV-D68 항체의 존재를 검출함으로써 백신접종 절차의 효능을 모니터링하기 위한 키트에서 사용될 수 있다. 본 개시에 기재된 바와 같은 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체는 또한, 목적하는 면역원성을 갖는 백신 제조를 모니터링하기 위한 키트에서 사용될 수 있다.
VI. 실시예
하기 실시예는 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 실시양태의 실시에서 양호하게 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는, 본 개시에 비추어, 개시되는 특정 실시양태에서 다수의 변경을 수행할 수 있고, 여전히 개시의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서 유사하거나 유사한 결과를 수득할 수 있는 것을 인식해야 한다.
실시예 1 - 재료 및 방법
동물. 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(USTAR) 빌딩에서 유지되고 있는 특정 병원체 비함유 콜로니로부터의 4주령 수컷 및 암컷 AG129 마우스. 마우스를 유타 주립 대학의 USTAR 빌딩에서 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수된 수돗물로 사육 및 유지했다.
항체 및 화합물. 모노클로날 항체(mAb) EV-D68-228은 반더빌트 대학 의료 센터(Vanderbilt University Medical Center)의 제임스 크로우(James Crowe)로부터 제공되었다. EV-D68-228은 1.134mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 치료를 위해 10, 3 및 1mg/kg의 용량으로 멸균 식염수에 희석되었다. rRSV-90은 5mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 10mg/kg의 용량으로 음성 대조군 항체로 사용되었다. 정맥 면역글로불린(IVIg, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA)은 지역 약국으로부터 구입하여 EV-D68-228 mAb에 대한 비교대조로서 사용되었다. 구아니딘 HCl(구아니딘)은 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)(St. Louis, MO)로부터 수득하고, 양성 대조군으로서 사용되었다.
바이러스. 엔테로바이러스 D68은 BEI 리소스, NIAID, NIH: 엔테로바이러스 D68, US/MO/14-18949, NR-49130로부터 수득했다. 이 바이러스는 4주령의 AG129 마우스의 폐에서 30회 연속 계대하고, 이어서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)로부터 수득된 횡문근육종(RD) 세포에서 3회 플라크 정제되었다. 수득된 바이러스 스톡을 RD 세포에서 2회 증폭하여, 작업 스톡을 생성했다. 감염에 사용된 바이러스는 EV-D68 MP30 PP로 지정되었다.
실험 설계. 표 1에 제시된 바와 같이, 총 78마리의 마우스를 각각 12마리의 마우스로 이루어진 6개의 그룹으로 랜덤화하고, 6마리의 마우스 그룹을 정상 대조군으로 사용했다. 마우스는 감염 24시간 전에 EV-D68-228 mAb, IVIg 또는 위약 mAb의 복강내(IP) 투여에 의해 치료되었다. 마우스는, 90㎕ 용적의 MEM에서 EV-D68 MP30 PP의 1×104.5 CCID50을 비강내(IN) 주입하여 감염시켰다. 구아니딘에 의한 치료는 감염 4시간 후에 개시되었고, 5일 동안 1일 2회 계속되었다. 치료 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 및 폐 사이토카인 농도를 평가하기 위해, 감염 후 1일, 3일 및 5일차에 각 치료 그룹의 4마리 마우스를 안락사시켰다.
폐 사이토카인/케모카인 평가. 폐 균질액의 각 샘플은 제조업체의 지침(Quansys Biosciences Q-Plex™ Array, Logan, UT)에 따라 화학발광 ELISA 기반 검정을 사용하여 사이토카인 및 케모카인에 대해 시험되었다. 퀀시스 멀티플렉스(Quansys multiplex) ELISA는 16개의 상이한 포획 항체가 정의된 어레이의 96웰 플레이트의 각 웰에 적용된 정량적 시험이다. 각 샘플 상청액은 하기: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, MCP-1, IFN-γ, TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES에 대해 시험되었다. 약어의 정의는 다음과 같다: IL - 인터루킨; MCP - 단핵 세포 주화성 단백질; IFN - 인터페론; TNF - 종양 괴사 인자, MIP - 마크로파지 염증성 단백질; GM-CSF - 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자; 및 RANTES - 활성화시에 조절되고, 정상 T 세포가 발현 및 분비된다.
통계 분석. 모든 수치 및 통계 분석은 프리즘(Prism) 8.0.2를 사용하여 완료되었다(GraphPad Software Inc.). 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여, 감염 후 매일, 치료 그룹의 폐 및 혈액 바이러스 역가를 위약 치료 마우스의 폐 및 혈액 역가와 비교했다. 각 사이토카인/케모카인에 대해 이원 배치 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 치료 마우스의 농도를 위약 치료 마우스와 비교했다.
실험 동물의 윤리 규칙. 이 연구는 2019년 3월 2일자의 유타 주립 대학(Utah State University)의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다(2022년 3월 1일 만료). 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 정부(국립 위생 연구소(National Institutes of Health))의 승인이 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정: 2011)에 따라 2018년 3월 9일에 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
[표 I]
마우스에서 EV-D68 호흡기 감염의 치료를 위한 EV-D68-228의 효능을 텍스트화하기 위한 대한 실험 설계
Figure pct00001
실시예 2 - 결과
이 연구의 목적은 4주령 AG129 마우스에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 호흡기 감염에 대한 EV-D68-228에 의한 치료의 효능을 결정하는 것이었다. 이 연구는 4주령 AG129 마우스에서 EV-D68 호흡기 감염의 치료에 대한 EV-D68-228 mAb의 효능을 결정했다.
도 6A-C는 EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가를 나타낸다. 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228로 치료한 마우스에서는 감염 후 1, 3 또는 5일차에 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 1일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰지만, 감염 후 3일차 또는 5일차에는 감소시키지 않았다. 100mg/kg/일 용량의 구아니딘 치료는 감염 후 1일차 및 3일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰지만, 감염 후 5일차에는 감소시키지 않았다.
도 7A-C는 EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228로 치료한 마우스에서는 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 또한 감염 후 1, 3, 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. 구아니딘은 감염 후 1일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰지만, 3일차에는 감소시키지 않았다.
도 8은 EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α 및 IL-1β의 폐 농도를 나타낸다. EV-D68-228에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-1α 및 IL-1β의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg 또는 구아니딘에 의한 치료는 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 농도를 유의하게 감소시키지 않았다.
EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-6 및 MCP-1의 폐 농도는 도 9에 제시되어 있다. EV-D68-228에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-6 및 MCP-1의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg 또는 구아니딘에 의한 치료는 감염 후 3일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰지만, IL-6은 감소시키지 않았다.
EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 RANTES의 폐 농도는 도 10에 제시되어 있다. EV-D68-228에 의한 치료는 위약 치료 마우스와 비교하여 감염 후 3일 및 5일차에 RANTES 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg 또는 구아니딘에 의한 치료는 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 RANTES의 폐 농도를 유의하게 감소시키지 않았다.
도 11은 EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-2, IL-3 및 IL-4의 폐 농도를 나타낸다. EV-D68 감염 후, IL-2, IL-3 또는 IL-4 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 12는 EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-5, IL-10 및 IL-12p70의 폐 농도를 나타낸다. EV-D68 감염 후, IL-5, IL-10 또는 IL-12p70 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-17, IFNγ 및 TNFα의 폐 농도는 도 13에 제시되어 있다. EV-D68 감염 후, IL-17, IFNγ 또는 TNFα 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 MIP-1α 및 GM-CSF의 폐 농도는 도 14에 제시되어 있다. EV-D68 감염 후, MIP-1α 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
실시예 3 - 논의
이 연구는 4주령 AG129 마우스에서 EV-D68에 의해 유발된 호흡기 감염의 치료에 대한, EV-D68에 대한 mAb인 EV-D68-228의 효능을 결정했다.
10, 3 및 1mg/kg 용량의 EV-D68-228은 EV-D68 감염에 의해 유발되는 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 및 전염증성 사이토카인의 감소에 매우 효과적이었다. IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1 및 RANTES의 폐 농도는 EV-D68-228에 의한 치료에 의해 유의하게 감소되었다.
EV-D68-228은 EV-D68 감염의 예방에 매우 효과적이었다.
실시예 4 - 재료 및 방법
동물. 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(USTAR) 빌딩에서 유지되고 있는 특정 병원체 비함유 콜로니로부터의 10일령 AG129 마우스. 마우스를 유타 주립 대학의 USTAR 빌딩에서 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수된 수돗물로 사육 및 유지했다.
항체 및 화합물. 모노클로날 항체(mAb) EV-D68-228은 반더빌트 대학 의료 센터(Vanderbilt University Medical Center)의 제임스 크로우(James Crowe)로부터 제공되었다. EV-D68-228은 1.134mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 치료를 위해 10, 3 및 1mg/kg의 용량으로 멸균 식염수에 희석되었다. rRSV-90은 5mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 10mg/kg의 용량으로 음성 대조군 항체로서 사용되었다. 정맥 면역글로불린(IVIg, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA)은 지역 약국으로부터 구입하여 EV-D68-228 mAb에 대한 비교대조로서 사용되었다. 구아니딘 HCl(구아니딘)은 시그마-알드리히(St. Louis, MO)로부터 수득하고, 양성 대조군으로서 사용되었다.
바이러스. 엔테로바이러스 D68은 BEI 리소스, NIAID, NIH: 엔테로바이러스 D68, US/MO/14-18949, NR-49130로부터 수득했다. 바이러스는 4주령의 AG129 마우스의 폐에서 30회 연속 계대하고, 이어서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA)으로부터 수득된 횡문근육종(RD) 세포에서 3회 플라크 정제되었다. 수득된 바이러스 스톡을 RD 세포에서 2회 증폭하여, 작업 스톡을 생성했다. 감염에 사용된 바이러스는 EV-D68 MP30 PP로 지정되었다.
실험 설계. 표 II에 제시된 바와 같이, 총 42마리의 마우스를 각각 6마리의 마우스로 이루어진 7개 그룹으로 랜덤화했다. 마우스는 감염 24시간 전에 EV-D68-228 mAb, IVIg 또는 위약 mAb의 복강내(IP) 투여에 의해 치료되었다. 마우스는, 100㎕ 용적의 MEM에서 EV-D68 MP30 PP의 1 × 106.5 CCID50을 복강내(IP) 주입하여 감염시켰다. 구아니딘에 의한 치료는 감염 4시간 후에 개시되었고, 5일 동안 1일 2회 계속되었다. 처리 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 21일차까지, 모든 마우스의 이환율, 사망률 및 신경학적 스코어를 매일 관찰했다. 신경학적 스코어(NS)는 다음과 같이 기록되었다: NS0 - 관찰 가능한 마비 없음, NS1 - 뒷다리가 비정상적으로 벌렸지만 정상 또는 약간 느린 보행, NS2 - 전진 운동에 사용하는 동안, 뒷다리가 부분적으로 붕괴하고 발이 끌림, NS3 - 뒷다리 및 뒷다리의 경직성 마비가 전진 운동에 사용되지 않음, NS4 - 뒷다리의 경직 마비 및 전진 운동 없음. NS4 스코어로 관찰된 모든 동물을 인도적으로 안락사시켰다.
통계 분석. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선은 프리즘 8.0.2로 생성되었다(GraphPad Software Inc.). 로그 순위(Mantel-Cox) 검정, 및 이어서 게한-브레슬로우-윌콕손(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 검정을 사용하여 생존 곡선을 비교했다. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여, 감염 후 매일, 치료 그룹의 혈액 바이러스 역가를 위약 치료 마우스의 폐 및 혈액 역가와 비교했다. 일원 ANOVA를 사용하여 평균 체중을 비교했다. 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 및 이어서 둔(Dunn)의 다중 비교 검정을 사용하여 신경학적 스코어를 비교했다.
실험 동물의 윤리 규칙. 이 연구는 2019년 3월 2일자의 유타 주립 대학의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다(2022년 3월 1일 만료). 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 정부(국립 위생 연구소)의 승인이 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정: 2011)에 따라 2018년 3월 9일에 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
[표 II]
마우스에서 EV-D68 신경 감염의 치료를 위한 EV-D68-228의 효능을 텍스트화하기 위한 실험 설계
Figure pct00002
실시예 5 - 결과
이 연구의 목적은 10일령의 AG129 마우스에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 신경계 감염에 대한 EV-D68-228에 의한 치료의 효능을 결정하는 것이었다. 이 연구는 10일령의 AG129 마우스에서 EV-D68 신경 감염의 치료를 위한 EV-D68-228 mAb의 효능을 결정했다.
도 15는 EV-D68에 감염되고 EV-D68-228, IVIg 또는 구아니딘으로 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228은 EV-D68에 감염된 6마리 마우스의 각 그룹에서 사망으로부터 100% 보호를 제공했다. 10mg/kg 용량의 IVIg로 치료된 6마리의 마우스 중 2마리는 감염으로부터 생존하지 못했다. 100mg/kg/일 용량의 구아니딘 치료는 6마리의 마우스 모두를 사망으로부터 보호했다.
도 16은 EV-D68에 감염되고 EV-D68-228, IVIg 또는 구아니딘으로 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 평균 체중을 나타낸다. 10, 3 또는 1mg/kg의 용량은 감염과 관련된 체중 감소로부터 마우스를 보호했다. 10mg/kg 용량의 IVIg는 또한 체중 감소로부터 마우스를 보호했다. 또한, 100mg/kg/일 용량의 구아니딘은 마우스를 체중 감소로부터 보호했다.
도 17A-C는 EV-D68-228로 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228로 치료한 마우스에서는 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 또한 감염 후 1, 3, 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. 100mg/kg/일 용량의 구아니딘 치료는 감염 후 1일, 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다.
EV-D68에 감염되고 EV-D68-228, IVIg 또는 구아니딘으로 치료된 10일령의 AG129 마우스의 신경학적 스코어는 도 18에 제시되어 있다. 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228 Ab로 치료된 마우스에서는 신경학적 스코어가 관찰되지 않았다. 신경학적 스코어는 감염 후 4일, 5일 및 6일차에 10mg/kg 용량의 IVIg로 치료된 마우스에서 관찰되었다. 그러나, IVIg로 치료된 마우스의 신경학적 스코어는 위약 치료된 마우스와 비교하여 유의하게 감소했다. 100mg/kg/일 용량의 구아니딘으로 치료한 마우스에서는 신경학적 스코어가 관찰되지 않았다.
실시예 6 - 논의
이 연구에서는, 10일령의 AG129 마우스에서 EV-D68에 의해 유발된 신경 감염의 치료를 위한 EV-D68에 대한 mAb인 EV-D68-228의 효능을 결정했다.
10, 3, 및 1mg/kg 용량의 EV-D68-228은 EV-D68에 감염된 마우스의 사망률 및 체중 감소로부터 보호를 제공했다. 또한, EV-D68-228로 치료된 마우스에서는 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 신경학적 스코어로 측정한 경우, 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228으로 치료된 마우스에서는 마비가 관찰되지 않았다.
EV-D68-228은, 10mg/kg 용량의 IVIg로 치료한 마우스에서 관찰된 생존율, 혈액 바이러스 역가 및 신경학적 스코어에 의해 나타난 바와 같이, 상업용 IVIg와 비교하여 EV-D68 감염으로부터 보호를 제공하는 것으로 나타났다.
EV-D68-228은, 양성 대조군인 구아니딘에 의한 치료와 비교한 경우, 사망률 및 마비로부터 동등한 보호를 제공했다. 그러나, 감염 후 3일차에 구아니딘 치료된 마우스에서는 혈액 바이러스 역가가 여전히 검출되었지만, 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 10, 3 또는 1mg/kg 용량의 EV-D68-228로 치료된 마우스의 혈액에서는 바이러스가 검출되지 않았다.
실시예 7 - 마우스의 호흡기 감염에 대한 EV-D68-228의 효능
재료 및 방법
동물. 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(USTAR) 빌딩에서 유지되고 있는 특정 병원체 비함유 콜로니로부터의 4주령의 수컷 및 암컷 AG129 마우스. 마우스를 유타 주립 대학의 USTAR 빌딩에서 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수된 수돗물로 사육 및 유지했다.
항체 및 화합물. 모노클로날 항체(mAb) EV-D68-228은 반더빌트 대학 의료 센터의 제임스 크로우로부터 제공되었다. EV-D68-228은 1.134mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 치료를 위해 10 또는 1mg/kg의 용량으로 멸균 식염수에 희석되었다. rRSV-90은 5mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 10mg/kg의 용량으로 음성 대조군 항체로 사용되었다. 정맥 면역글로불린(IVIg, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA)은 지역 약국으로부터 구입하여 EV-D68-228 mAb에 대한 비교대조로서 사용했다.
바이러스. 엔테로바이러스 D68은 BEI 리소스, NIAID, NIH: 엔테로바이러스 D68, US/MO/14-18949, NR-49130로부터 수득했다. 바이러스는 4주령의 AG129 마우스의 폐에서 30회 연속 계대하고, 이어서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA)로부터 수득된 횡문근육종(RD) 세포에서 3회 플라크 정제되었다. 수득된 바이러스 스톡을 RD 세포에서 2회 증폭하여, 작업 스톡을 생성했다. 감염에 사용된 바이러스는 EV-D68 MP30 PP로 지정되었다.
실험 설계. 표 C에 제시된 바와 같이, 총 52마리의 마우스를 각각 8마리의 마우스로 이루어진 6개 그룹으로 랜덤화하고, 4마리의 마우스 그룹을 정상 대조군으로 사용했다. 마우스는 감염 후 4, 24 또는 48시간에 EV-D68-228 mAb, IVIg 또는 위약 mAb의 복강내(IP) 투여에 의해 치료되었다. 마우스는, 90㎕ 용적의 MEM에서 EV-D68 MP30 PP의 1×104.5 CCID50을 비강내(IN) 주입하여 감염시켰다. 치료 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 및 폐 사이토카인 농도의 평가를 위해, 감염 후 3일 및 5일차에 각 치료 그룹의 4마리 마우스를 안락사시켰다.
폐 사이토카인/케모카인 평가. 폐 균질액의 각 샘플은 제조업체의 지침(Quansys Biosciences Q-Plex™ Array, Logan, UT)에 따라 화학발광 ELISA 기반 검정을 사용하여 사이토카인 및 케모카인에 대해 시험되었다. 퀀시스 멀티플렉스(Quansys multiplex) ELISA는 16개의 상이한 포획 항체가 정의된 어레이의 96웰 플레이트의 각 웰에 적용된 정량적 시험이다. 각 샘플 상청액은 하기: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, MCP-1, IFN-γ, TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES에 대해 시험되었다. 약어의 정의는 다음과 같다: IL - 인터루킨; MCP - 단핵 세포 주화성 단백질; IFN - 인터페론; TNF - 종양 괴사 인자, MIP - 마크로파지 염증성 단백질; GM-CSF - 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자; 및 RANTES - 활성화시에 조절되고, 정상 T 세포가 발현 및 분비된다.
통계 분석. 모든 수치 및 통계 분석은 프리즘(Prism) 8.2.0을 사용하여 완료되었다(GraphPad Software Inc.). 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여, 감염 후 매일, 치료 그룹의 폐 및 혈액 바이러스 역가를 위약 치료 마우스의 폐 및 혈액 역가와 비교했다. 각 사이토카인/케모카인에 대해 이원 배치 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 치료 마우스의 농도를 위약 치료 마우스와 비교했다.
실험 동물의 윤리 규칙. 이 연구는 유타 주립 대학의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다. 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 국립 보건원(국립 위생 연구소(National Institutes of Health))의 승인은 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정, 2011)에 따라 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
[표 C]
Expt. NIA-1869. 실험 설계 - 마우스에서 EV-D68 호흡기 감염의 치료를 위한 EV-D68-228의 치료 효능.
Figure pct00003
결과 및 논의
이 연구에서는 4주령의 AG129 마우스에서 EV-D68 호흡기 감염의 치료를 위한 EV-D68-228 mAb의 치료 효능을 결정했다.
도 19는 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가를 나타낸다. 감염 후 4시간 또는 24시간에서 치료를 개시한 경우, 10mg/kg 용량의 EV-D68-228로 치료한 마우스에서는 감염 후 3일 또는 5일에 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 감염 후 48시간에서 치료된 마우스에서는 10mg/kg 용량의 EV-D68-228은 감염 후 3일 및 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 48시간에서 1mg/kg의 용량도 감염 후 3일 및 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 후 24시간에서 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 또는 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다.
도 20은 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 감염 후 4, 24 또는 48시간에 10mg/kg 용량의 EV-D68-228로 치료한 마우스에서는 감염 후 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 감염 후 48시간에 1mg/kg의 저용량의 EV-D68-228은 검출 한계 미만으로 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다.
도 21은 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α 및 IL-1β의 폐 농도를 나타낸다. EV-D68-228에 의한 치료적 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 IL-1α 및 IL-1β의 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg에 의한 치료는 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 농도를 유의하게 감소시켰지만, 감염 후 3일차에만 감소시켰다.
EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-5 및 IL-6의 폐 농도는 도 22에 제시되어 있다. EV-D68-228에 의한 치료적 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 및 IL-6의 농도를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 및 IL-6의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다.
EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 MCP-1 및 RANTES의 폐 농도가 도 23에 제시되어 있다. EV-D68-228에 의한 치료는, 위약 치료 마우스와 비교하여, 감염 후 3일차 및 5일차에 MCP-1 및 RANTES의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일 및 5일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다.
도 24는 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-2, IL-3 및 IL-4의 폐 농도를 나타낸다. EV-D68 감염 후, IL-2, IL-3 또는 IL-4 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 25는 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-10, IL-12p70 및 IL-17의 폐 농도를 나타낸다. EV-D68 감염 후, IL-10, IL-12p70 또는 IL-17 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IFNγ 및 TNFα의 폐 농도는 도 26에 제시되어 있다. EV-D68 감염 후, IFNγ 또는 TNFα 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 MIP-1α 및 GM-CSF의 폐 농도가 도 27에 제시되어 있다. EV-D68 감염 후, MIP-1α 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
따라서, 이 연구에서는 4주령의 AG129 마우스에서 EV-D68에 의해 유발된 호흡기 감염의 치료를 위한 EV-D68에 대한 mAb인 EV-D68-228의 치료 효능을 결정했다. 10 및 1mg/kg 용량의 EV-D68-228은, 감염 후 48시간 이내에 투여된 경우, 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 및 EV-D68 감염에 의해 유발된 전염증성 사이토카인의 감소에 매우 효과적이었다. IL-1α, IL-1β, IL-5, IL-6, MCP-1 및 RANTES의 폐 농도는 EV-D68-228에 의한 치료에 의해 유의하게 감소했다. EV-D68-228은 AG129 마우스의 EV-D68 호흡기 감염에 대한 치료적 치료로서 매우 효과적이었기 때문에, 폐 기능에 대한 EV-D68-228 치료의 영향을 결정하기 위해, 혈량측정법을 장래의 연구에서 사용할 수 있다.
실시예 8 - 마우스의 호흡기 감염에 대한 EV-D68-228의 효능
재료 및 방법
이 연구의 목적은 10일령의 AG129 마우스에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 신경계 감염에 대한 EV-D68-228에 의한 치료의 치료 효능을 결정하는 것이었다.
동물. 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(USTAR) 빌딩에서 유지되고 있는 특정 병원체 비함유 콜로니로부터의 10일령 AG129 마우스. 마우스를 유타 주립 대학의 USTAR 빌딩에서 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수된 수돗물로 사육 및 유지했다.
항체 및 화합물. 모노클로날 항체(mAb) EV-D68-228은 반더빌트 대학 의료 센터의 제임스 크로우로부터 제공되었다. EV-D68-228은 1.134mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 치료를 위해 멸균 식염수에서 10mg/kg의 용량으로 희석되었다. rRSV-90은 5mg/ml 농도의 용액으로 제공되었고, 10mg/kg의 용량으로 음성 대조군 항체로 사용되었다. 정맥 면역글로불린(IVIg, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA)은 지역 약국으로부터 구입하여 EV-D68-228 mAb에 대한 비교대조로서 사용되었다.
바이러스. 엔테로바이러스 D68은 BEI 리소스, NIAID, NIH: 엔테로바이러스 D68, US/MO/14-18949, NR-49130로부터 수득했다. 이 바이러스는 4주령의 AG129 마우스의 폐에서 30회 연속 계대하고, 이어서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA)으로부터 수득된 횡문근육종(RD) 세포에서 3회 플라크 정제되었다. 수득된 바이러스 스톡을 RD 세포에서 2회 증폭하여, 작업 스톡을 생성했다. 감염에 사용된 바이러스는 EV-D68 MP30 PP로 지정되었다.
실험 설계. 총 42마리의 마우스를 각각 6마리의 마우스로 이루어진 6개 그룹으로 랜덤화하고, 표 D에 제시된 바와 같이, 9마리 마우스의 한 그룹은 각각 치료 전에 사망을 설명하기 위한 것이다. 3마리의 마우스의 한 그룹을 정상 대조군으로 사용했다. 마우스는 100㎕ 용적의 MEM에서 EV-D68 MP30 PP의 1×106.5 CCID50의 복강내(IP) 투여에 의해 감염시켰다. 마우스는 감염 후 24, 48, 72, 또는 120시간에 EV-D68-228 mAb의 복강내(IP) 투여에 의해 치료되었다. IVIg 또는 위약 Ab에 의한 치료는 감염 후 24시간에 1회 수행되었다. 치료 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 21일차까지, 모든 마우스의 이환율, 사망률 및 신경학적 스코어를 매일 관찰했다. 신경학적 스코어(NS)는 다음과 같이 기록되었다: NS0 - 관찰 가능한 마비 없음, NS1 - 뒷다리가 비정상적으로 벌렸지만 정상 또는 약간 느린 보행, NS2 - 전진 운동에 사용하는 동안, 뒷다리가 부분적으로 붕괴하고 발이 끌림, NS3 - 뒷다리 및 뒷다리의 경직성 마비가 전진 운동에 사용되지 않음, NS4 - 뒷다리의 경직 마비 및 전진 운동 없음. NS4 스코어로 관찰된 모든 동물을 인도적으로 안락사시켰다.
통계 분석. 카플란-마이어 생존 곡선은 프리즘 8.2.0로 생성되었다(GraphPad Software Inc.). 로그 순위(Mantel-Cox) 검정, 및 이어서 게한-브레슬로우-윌콕손(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 검정을 사용하여 생존 곡선을 비교했다. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여, 감염 후 매일, 치료 그룹의 혈액 바이러스 역가를 위약 치료 마우스의 폐 및 혈액 역가와 비교했다. 일원 ANOVA를 사용하여 평균 체중을 비교했다. 크루스칼-왈리스 검정 및 이어서 둔의 다중 비교 검정을 사용하여 신경학적 스코어를 비교했다.
실험 동물의 윤리 규칙. 이 연구는 유타 주립 대학의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다. 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 국립 보건원(국립 위생 연구소)의 승인이 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정, 2011)에 따라 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
[표 D]
Expt. NIA-1870. 실험 설계 - 마우스에서 EV-D68 신경 감염 치료를 위한 EV-D68-228의 치료 효능.
Figure pct00004
결과 및 논의
이 연구에서는 10일령의 AG129 마우스에서 EV-D68 신경 감염의 치료적 치료를 위한 EV-D68-228 mAb의 효능을 결정했다.
도 28은 EV-D68로 감염되고 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV-D68-228을 단일 투여하면, 감염 후 24, 48 및 120시간에 치료된 마우스에서 유의한 생존 이점이 관찰되었다. 감염 후 120시간에 치료된 마우스의 생존 이점의 차이는 치료된 7마리의 마우스 모두가 여전히 감염에 굴복했기 때문에, 사망일의 증가에 의한 것이었다. 10mg/kg 용량의 IVIg는, 감염 후 24시간에 투여된 경우, 마우스를 완전히 사망으로부터 보호했다.
도 29는 EV-D68로 감염되고 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스의 평균 체중을 나타낸다. 10mg/kg 단일 용량의 EV-D68-228은, 감염 후 24시간 또는 48시간에 투여된 경우, 감염 관련 체중 감소로부터 마우스를 보호했다. 감염 후 24시간에 투여된 IVIg의 단일 용량은 체중 감소로부터 마우스를 보호하지 못했다.
도 30A-C는 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 감염 후 24시간, 48시간 또는 72시간에 10mg/kg의 EV-D68-228을 단일 투여하면, 감염 후 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가가 유의하게 감소했다. 감염 후 24시간에 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다. 감염 후 7일차에는 생존한 마우스의 어느 것에서도 바이러스 역가가 검출되지 않았다.
EV-D68로 감염되고 EV-D68-228로 감염 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스의 신경학적 스코어는 도 31A-B에 제시되어 있다. 3, 4, 5일차의 신경학적 스코어는 10mg/kg 용량의 EV-D68-228을 감염 후 24시간에 치료한 마우스에서 유의하게 감소했다. 감염 후 24시간에 제공된 10mg/kg 용량의 IVIg는 감염 후 3, 4, 및 5일에서 신경학적 스코어를 감소시켰다. 위약 치료된 모든 마우스가 사망했기 때문에, 감염 후 5일 이후는 신경학적 스코어의 비교가 완료되지 않았다.
따라서, 이 연구에서는 10일령의 AG129 마우스에서 EV-D68에 의해 유발된 신경 감염의 치료를 위한, EV-D68에 대한 mAb인 EV-D68-228의 치료 효능을 결정했다. 감염 후 48시간 이내에 투여한 경우, 10mg/kg 단일 용량의 EV-D68-228은 사망 및 체중 감소로부터 마우스를 보호했다. 감염 후 72시간 이내에 치료된 마우스에서는 혈액 바이러스 역가의 유의한 감소가 관찰되었다. 신경학적 스코어에 의해 측정된 마비의 감소는 감염 후 24시간에 10mg/kg의 EV-D68로 치료된 마우스에서 관찰되었다. EV-D68-228은 EV-D68의 발생 동안 예방적 요법으로 사용될 수 있기 때문에, 감염 전의 다양한 시점에서 투여된 경우에 EV-D68-228의 효능을 결정하는 것이 유익할 것이다.
실시예 9 - 재료 및 방법
연구 설계. 본 발명자들은 EV-D68 감염에 반응하여 인간이 작제할 수 있는 항체를 동정하기 위해 이 연구를 설계했다. 따라서, 이들은 간접 ELISA 스크린에서 살아있는 바이러스 분리주를 사용하여 EV-D68 결합 항체를 분비하는 B 세포를 특정하고, 이들 B 세포를 골수종 세포와 전기 융합시켜 모노클로날 항체 분비 하이브리도마를 생성했다. 이어서, 본 발명자들은 CCID50, ELISA 및 크리오-EM 기반 기술을 사용하여 시험관내에서 이들 개별 mAb의 중화 및 결합 특성을 특성화했다. 이들은 인간에서 예방 및/또는 치료제로서 mAb EV68-228의 개발을 서포트하는 전임상 데이터를 생성하기 위해 생체내 실험을 추구했다. 이를 위해, 이들은 이론적 이점에 기초하여 AFM으로 인간을 치료하기 위해 광범위하게 사용되는 인간 IVIG와 비교하여 EV-D68 감염으로부터 마우스를 보호하는 mAb EV68-228의 효과를 연구했지만, 이 IVIG 치료는 지금까지 효과적인 것으로 입증되지 않았다. AG129 뮤린 감염 모델의 장점은 본 발명자들이 호흡기 및 신경학적 감염 모델 모두에서 항체 치료의 효과를 측정할 수 있다는 점이다.
세포주. RD 세포(인간, 여성 기원)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC CCL-136)로부터 수득했다. RD 세포는, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(HI-FBS; HyClone), 1mM 나트륨 피루베이트 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B(ThermoFisher Scientific)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(ThermoFisher Scientific)에서 3℃의 5% CO2에서 배양했다. 구조 연구를 위해, RD 세포를 10% HI-FBS(Sigma-Aldrich) 및 비필수 아미노산(NEAA, Life Technologies)이 보충된 DMEM(Sigma-Aldrich)에서 배양했다. ExpiCHO(햄스터, 암컷 기원) 세포주는 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)으로부터 구입하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 배양했다. HMMA2.5 계통은 뮤린 골수종 세포주와 인간 골수종 세포주를 융합시킴으로써 생성된 비분비성 마우스-인간 헤테로골수종 세포주(성별 정보는 입수할 수 없음)이다[참조: Posner et al., 1987]. 이 세포주는 이전에 기재된 바와 같이 배양되었다[참조: Yu et al., 2008]. 모든 세포주는 마이코플라스마(Mycoplasma)에 대해 매월 시험되었고, 모든 경우에서 음성인 것으로 밝혀졌다.
바이러스. 이 연구에서 사용된 바이러스 분리주의 목록은 표 K를 참조한다. EV-D68 분리주는 하기 설명된 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에서 사용하기 위해 RD 세포 단층 배양에서 2세대 증식시켰다. RD 세포 단층에 소정 바이러스 분리주를 접종하고, 70~90% 세포 사멸이 관찰될 때까지 모니터링했다. 이어서, 이 세포 배양 플라스크를 -80℃로 동결하고, 해동하고, 내용물을 스크래핑하고, 50mL 원뿔형 튜브에 수집했다. 이 조제물을 최대 출력 설정(Fisherbrand)의 도립 컵 초음파 분쇄기에서 20초 동안 3회 초음파 처리하고, 30초 동안 와동시키고, 이어서 추가로 20초 동안 2회 초음파 처리했다. 세포 파편을 펠렛화하고, 바이러스 함유 상청액을 PBS(w/v) 쿠션 중의 30% 수크로스 상에서 100,000 × g에서 4시간 동안 10℃에서 회전시켰다. 상청액을 버리고, 펠렛을 NTE 완충액(20mM 트리스, 120mM NaCl, 1mM EDTA pH 8.0) 중의 0.01%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)에 4℃에서 밤새 침지시켰다. 이어서, 재현탁된 펠릿을 10분 동안 10,000 × g에서 원심분리하여 추가로 정화시키고, 바이러스 분취량을 사용 준비가 될 때까지 -80℃에서 저장했다.
구조 연구에는, US/MO/14-18947 분리주를 사용했다. 바이러스는 RD 세포에서 계대되었고, 대규모 증식 전에 -80℃에서 보관되었다. RD 세포를 80% 컨플루언시로 성장시키고, 0.01의 감염 다중도에서 EV-D68로 감염시켰다. 감염 2일 후, 세포를 상청액과 함께 수집하고, 회전시켰다. 세포 펠릿을 수집하고, 복수의 동결/해동 사이클 후, 세포 파편을 제거하기 위해 회전시켰다. 모든 상청액을 합하고, 210,000 × g에서 2시간 동안 펠렛화했다. 펠렛을 인큐베이팅하고, 250mM HEPES(pH = 7.5), 250mM NaCl 완충액에 재현탁하고, 이어서 최종 농도까지 5mM MgCl2, 0.01mg/mL DNAse(Sigma-Aldrich), 0.8mg/mL 트립신, 15mM EDTA 및 1%(w/v) n-라우릴-사르코신을 보충했다. 이어서, 샘플을 210,000 × g에서 2시간 동안 펠렛화하고, 재현탁하고, 칼륨 타르트레이트 구배(10 내지 40%, w/v)에 로딩하여, 2시간 동안 160,000 × g에서 초원심분리의 최후 라운드를 수행했다. 튜브 중앙에 청색 밴드가 관찰되는 정제된 바이러스 샘플을 추출하고, 완충액을 20mM 트리스, 120mM NaCl, 1mM EDTA(pH=8.0) 완충액으로 교환하여 칼륨 타르트레이트를 제거했다.
CCID 50 검정에 의한 바이러스 부하 검출. 뮤린의 혈액 또는 폐 샘플 중의 바이러스 스톡 또는 바이러스의 적정은 RD 세포 배양 단층에서의 CCID50 검정에 의해 수행되었다. 간단히 말해서, 샘플의 10배 희석액을 증가시켜 96웰 플레이트의 3중 웰(50μL)에서 RD 세포 단층에 적용하고, 33℃에서 5% CO2에서 5일 동안 인큐베이팅하고, 이어서 1% 파라포름알데히드로 고정하여 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 세포변성 효과를 갖는 웰은 바이러스에 대해 양성으로 평가되고, 역가는 스피어만-케르버(Spearman-Kaerber) 방정식(Ramakrishnan, 2016)에 기반한 공식을 사용하여 결정했고; 검출 한계는 136 CCID50/mL였다.
바이러스 중화 검정. 바이러스 중화 검정은, 본질적으로 소아마비 바이러스에 대해 이전에 기재된 바와 같이[참조: Weldon et al., 2016], 표시된 바이러스를 사용하여 CCID50 포맷으로 수행되었다. 바이러스를 상승하는 농도의 mAb와 함께 33℃에서 1시간 동안 중복하여 인큐베이팅하고, 이어서 각 현탁액을 96웰 플레이트의 기술적 4중 웰(50μL)에서 RD 세포의 단층에 첨가했다. 33℃의 5% CO2에서 5일 동안 인큐베이팅한 후, 세포를 1% 파라포름알데히드로 고정하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 세포변성 효과를 갖는 임의의 웰은 바이러스에 대해 양성으로 평가하고, 스피어만-케르버(Spearman-Kaerber) 방정식(Ramakrishnan, 2016)에 기반한 공식을 사용하여 최대 억제 농도의 절반(IC50)을 결정했고; 검출 한계는 57μg/mL 내지 4.8pg/mL였다.
마우스 모델. 10일령(신경학적 모델) 또는 4주령(호흡기 모델)의 수컷 및 암컷 AG129 마우스(인터페론 α/β 및 γ에 대한 수용체가 결핍됨)은 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(Utah Science Technology) 빌딩에서 유지된 특이적 병원체 비함유 콜로니로부터 수득했다. 마우스는 유타 주립 대학의 USTAR 빌딩에서 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수 수돗물로 사육 및 유지했다. 이 연구는 2019년 3월 2일자의 유타 주립 대학의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다(2022년 3월 1일 만료). 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 정부(국립 위생 연구소) 승인이 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정: 2011)에 따라 2018년 3월 9일에 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
항체 및 대조군 치료는 PBS에 희석하고 EV-D68 접종 전후에 지시된 시점에서 복강내 주사로 투여했다. 구아니딘 HCl(Sigma-Aldrich)은 치료에 대한 양성 대조군으로 사용되었고[참조: Hurst et al., 2019], 감염 후 4시간에 개시하여 5일 동안 1일 2회 계속했다. 마우스 적응 EV-D68의 현탁액은 복강내 주사(신경학적 모델; 100μL 용적의 MEM에서 106.5 CCID50) 또는 비강내 주입(호흡 모델, 90μL 용적의 MEM에서 104.5 CCID50)에 의해 투여되었다. 처리 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 지시된 바와 같이, 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 또는 폐 사이토카인 농도의 측정을 위해, 감염 후의 지시된 시점에서 마우스를 인도적으로 안락사시켰다. 신경학적 모델의 경우, 21일까지 모든 마우스의 이환율, 사망률 및 신경학적 스코어에 대해 매일 관찰했다. 신경학적 스코어(NS)는 다음과 같이 기록되었다: NS0 - 관찰 가능한 마비 없음, NS1 - 뒷다리가 비정상적으로 벌렸지만 정상 또는 약간 느린 보행, NS2 - 전진 운동에 사용하는 동안, 뒷다리가 부분적으로 붕괴하고 발이 끌림, NS3 - 뒷다리 및 뒷다리의 경직성 마비가 전진 운동에 사용되지 않음, NS4 - 뒷다리의 경직 마비 및 전진 운동 없음. NS4 스코어로 관찰된 모든 동물은 인도적으로 안락사시켰다.
폐 사이토카인/케모카인 평가. 폐 균질액의 각 샘플은 제조업체의 지침(Quansys Biosciences Q-Plex™ Array, Logan, UT)에 따라 정량적 화학발광 ELISA 기반 검정을 사용하여 사이토카인 및 케모카인에 대해 시험되었다. 퀀시스 멀티플렉스(Quansys multiplex) ELISA는 16개의 별개의 포획 항체가 정의된 어레이의 96 웰 플레이트의 각 웰에 적용하는 정량적 시험이다.
인간 모노클로날 항체(mAb)의 생성. 대상체는 EV-D68 상부 호흡기 감염(Bochkov et al., 2014)을 실험실에서 기록한 천식의 소아 발증(COAST) 출생 코호트(Lemanske, 2002)로부터 특정되었다. 서면에 의한 동의가 수득된 후, 말초혈액을 수집하고, 말초혈액 단핵 세포(PBMC)가 SepMate 튜브(Stemcell Technologies)를 사용하여 정제될 수 있을 때까지 제조업자의 프로토콜에 따라 실온에서 보관하고, 이어서 소 태아 혈청(FBS) 중의 10%(v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 동결 보존하고, 액체 질소의 기상으로 저장한다. 림프모구양 세포주(LCL)는 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 세포 주기 체크포인트 키나제 2(chk2) 억제제(Sigma-Aldrich), CpG( Sigma-Aldrich) 및 배지 A(STEMCELL Technologies) 중의 사이클로스포린 A(Sigma-Aldrich)와 혼합함으로써 PBMC 내의 메모리 B 세포로부터 전술한 바와 같이 생성했다[참조: Smith and Crowe, 2015]. 1주일 후, LCL을 계수하고, 무관계 공여자로부터의 γ-조사된 인간 PBMC의 피더 층에서 확장했다. 추가로 1주일 후, 2014년 임상 분리주로부터 생성된 세포 배양으로 성장한 EV-D68 바이러스를 포함하는 살아있는 EV-D68 바이러스를 항원으로서 사용하는 간접 ELISA에 의해 CLC 상청액은 EV-D68 반응성 IgG의 존재에 대해 스크리닝했다. 이전에 기재된 바와 같이[참조: Yu et al., 2008], 바이러스 반응성 항체를 포함하는 웰로부터의 LCL을 전기 융합에 의해 HMMA2.5 골수종 세포에 융합시켰다. 융합 반응 후, 하이브리도마 계통을, HAT 배지 보충제(Sigma-Aldrich) 및 오아바인(Sigma-Aldrich)을 함유하는 선택 배지에서 384-웰 플레이트에서 배양한 후, 항체 생산을 위한 상청액을 스크리닝했다. 2주 후, 수득된 하이브리도마 세포주의 상청액을, 항원으로서 살아있는 바이러스를 사용하여 간접 ELISA로 스크리닝하고, EV-D68 반응성 항체를 갖는 웰의 세포주를 배양물에서 확장하고, 이어서 단일-세포 유세포 분석 선별에 의해 384-웰 세포 배양 플레이트로 클로닝했다. 이들 클로닝된 세포는 12웰 조직 배양 처리 플레이트(Corning)에서 약 50% 컨플루언트로 될 때까지 배지 E에서 확장하고, 이들의 상청액은 ELISA에 의해 바이러스 결합에 대해 스크리닝했다. ELISA에서 최고의 신호를 나타내는 웰을, mAb-생산 하이브리도마 세포주로서 선택하여, 추가로 사용했다.
MAb 아이소타입 및 유전자 서열 분석. 분비된 항체의 아이소타입 및 서브클래스는 서양고추냉이 퍼옥시다제(Southern Biotech)와 접합된 마우스 항-인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체를 사용하여 결정되었다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자는 유세포 분석 선별에 의해 생물학적으로 클로닝된 하이브리도마 계통으로부터 수득된 RNA로부터 서열분석했다. RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출했다. 수정된 5' RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭) 접근법이 사용되었다[참조: Turchaninova et al., 2016]. 간단히 말해서, 5μL 총 RNA를 cDNA 합성 프라이머 믹스(각각 10μM)와 혼합하고, 70℃에서 2분 동안 인큐베이팅한 후, 인큐베이션 온도를 42℃로 저하시켜 합성 프라이머를 어닐링했다(1 내지 3분). 인큐베이션 후, 5× 제1-가닥 완충액(Clontech), DTT(20mM), 5' 주형 스위치 올리고(10μM), dNTP 용액(각각 10mM) 및 10× SMARTScribe 역전사 효소(Clontech)를 포함하는 혼합물을 프라이머 어닐링된 전체 RNA 반응에 첨가하고, 42℃에서 60분 동안 인큐베이팅했다. 제1-가닥 합성 반응은 암푸어 크기 선택 자기 비드 키트(Ampure Size Select Magnetic Bead Kit)를 1.8배의 비율로 사용하여 정제했다(Beckman Coulter). 이어서, 5μL의 제1-가닥 cDNA, 2× Q5 하이 피델리티 마스터믹스(High Fidelity Mastermix)(NEB), dNTP(각각 10mM), 전방향 범용 프라이머(10μM) 및 역방향 프라이머 믹스(중쇄 믹스에서 각각 0.2μM, 경쇄 믹스에서 각각 0.2μM)를 함유하는 단일 PCR 증폭 반응은 하기 조건으로 열 사이클링에 적용했다: 90초 동안 초기 변성, 이어서 98℃에서 10초 동안 30 사이클의 변성, 60℃에서 20초 동안 어닐링, 및 72℃에서 40초 동안 확장, 이어서 72℃에서 4분 동안 최종 확장 단계. 이 프로토콜에 사용된 모든 프라이머 서열은 이전에 기재되었다[참조: Turchaninova et al., 2016]. 제1 PCR 반응은 AMPure 크기 선택 자기 비드 키트를 0.6배의 비율로 사용하여 정제했다(Beckman Coulter). 이어서, 멀티플렉스 SMRT 서열분석 프로토콜(Pacific Biosciences)에 따라 앰플리콘 라이브러리를 제조하고, 세퀴얼 플랫폼 기기(Pacific Biosciences)에서 서열분석했다. 생 서열분석 데이터를 역다중화하고, 순환 컨센서스 서열(CCS)은 SMRT 분석 도구 쉬트(Pacific Biosciences)를 사용하여 결정했다. 유전자 절편, 상보성 결정 영역(CDR) 및 생식세포계 유전자로부터의 돌연변이의 동일성은 ImMunoGeneTics 데이터베이스[참조: Giudicelli and Lefranc, 2011]를 사용하여 정렬에 의해 결정되었다.
항체 생산 및 정제. 하이브리도마 유래의 mAb의 경우, 하이브리도마 세포를 하이브리도마 SFM(1X) 무혈청 배지(Gibco)에서 고갈될 때까지 성장시켰다. 재조합 mAb 생산을 위해, 중쇄 및 경쇄의 유전자를 암호화하는 cDNA를 합성하고, 전장 IgG1 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드 발현 벡터로 클로닝하고[참조: McLean et al., 2000], 이. 콜라이(E. coli) 세포로 형질전환시켰다. MAb 단백질은 제조사의 프로토콜에 따라 ExpiCHO 세포를 일시적으로 형질감염시킨 후에 생산되었다. 수득된 분비된 IgG는 단백질 G 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하는 AKTA 장치에서 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)에 의해 여과된 배양 상청액으로부터 정제했다. 정제된 mAb를 PBS로 완충제 교환하고, 0.45μm의 멸균 기공 크기 필터 장치(Millipore)를 사용하여 여과하고, 농축하고, 사용할 때까지 -80℃에서 분취량으로 저장했다. 각 mAb의 분취량도 또한, mAb에 대해 20배 몰 과량의 비오틴과 함께 EZ-Link NHS-PEG4-비오틴 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 96웰 포맷으로 직접 비오틴화하고, 이어서 탈염 플레이트(Zeba, 7kDa 컷오프)를 사용하여 PBS로 다시 완충제 교환했다. 하이브리도마 유래 mAb는 시험관내 실험에서 사용되었고, 재조합 mAb는 생체내 실험에서 사용되었다. 풀링된 인간 면역글로불린은 정맥내 면역글로불린으로 구입했다(IVIG, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA). RSV90은 본 발명자의 실험실에서 생산된 재조합 인간 IgG1 mAb이고, 마우스 실험에서 음성 대조군인 위약 mAb로 사용된다. 웨스턴 블롯에 사용된 폴리클로날 항-VP1, -VP2, -VP3 항체는 제네텍스(Genetex)에서 구입했다.
Fab 단편 생산. Fab 단편은 피어스(Pierce) Fab 제조 키트(ThermoFisher Scientific)를 통해 생성 및 정제했다. 고정된 파파인 바이알 스핀 컬럼 및 제바(Zeba) 스핀 탈염 컬럼은 사용 전에 소화 완충액(공급된 Fab 소화 완충액 10mL당 35mg 시스테인·HCl, pH 약 7.0)으로 평형화시켰다. NAb 단백질 A 플러스 스핀 컬럼은 사용 전에 PBS 완충액으로 평형화시켰다. 원래의 IgG 샘플을 제바 스핀 탈염 컬럼에 통과시키고, 제조된 IgG 샘플 0.5mL를 고정화 파파인 바이알에 적용하고, 5시간 Fab 소화 동안 37℃에서 인큐베이팅했다. 이어서, 최종 Fab 단편을 PBS로 완충액 교환하고, 4℃에서 저장했다.
EV-D68-특이적 ELISA. 배지 결합의 웰, 흑색 형광성 면역검정 미세역가 플레이트(Greiner Bio-One)를 100mM 중탄산염/탄산염 완충액, pH 9.6에 희석된 바이러스 스톡으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅했다. 플레이트는 0.05% 트윈-20(DPBS-T)을 함유하는 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS) 중의 2% BSA로 1시간 동안 차단시켰다. mAb 스크리닝 검정을 위해, 하이브리도마 배양 상청액을 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이팅했다. 결합된 항체는 HRP(Southern Biotech) 및 퀀타블루(QuantaBlu) 형광발생 퍼옥시다제 기질(ThermoFisher Scientific)과 접합된 Fc-특이적 염소 항-인간 IgG를 사용하여 검출되었다. 20분 후, 100mM 글리신(pH 10.5)을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 시너지(Synergy) H1 마이크로플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 325nm에서 여기한 후 420nm에서 발광을 측정했다. 용량-반응 및 교차-반응성 검정을 위해, 정제된 mAb의 연속 희석액을 이중 기술적 복제로 웰에 적용하고, mAb 결합을 상기한 바와 같이 검출했고; 실험은 적어도 3회 수행되었다. 경쟁 ELISA의 경우, 미세역가 플레이트를 먼저 바이러스로 코팅하고, 이어서 정제된 mAb를 100μg/mL로 첨가하고, 33℃에서 3시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 비오틴화된 mAb를 5㎍/mL의 최종 농도로 이 혼합물에 첨가하고, 주위 온도에서 1.5시간 동안 인큐베이팅했다. 세척 및 아비딘-퍼옥시다제(ThermoFisher Scientific)와의 30분간 인큐베이션한 후, mAb 결합이 상기한 바와 같이 검출되었다.
웨스턴 블롯. B1 클레이드 바이러스 조제물을 변성 및 환원 로딩 완충액과 혼합하고, 100℃에서 5분 동안 비등시킨 후, 노벡스(Novex) 샤프 사전-염색된 단백질 표준(ThermoFisher Scientific)과 함께 SDS-PAGE 겔에서 영동했다. 단백질을 막으로 전송하고, 차단 완충액(Li-Cor)으로 차단한 후, 스트립으로 절단하여, 개별 레인을 차단 완충액 중의 정제된 mAb로 염색할 수 있도록 했다. IRDye 800CW-접합된 염소 항-인간 2차 항체(Li-Cor)를 사용하여 mAb 결합을 검출했다. 분자량을 시각화하기 위해 스트립을 재조립하고, 오디세이(Odyssey) CLx 근적외선 이미저(Li-Cor)에서 이미지화했다.
크리오-EM 샘플의 준비 및 데이터 수집. EV-D68:Fab EV68-159 및 EV-D68:Fab EV68-228의 복합체 모두에 대해, 정제된 EV-D68 바이러스 및 Fab를 1:200의 몰비로 혼합했다. 실온에서 45 내지 60분 동안 인큐베이팅한 후, 3.5μL의 바이러스-Fab 혼합물 샘플을 글로우 방전된 400 메쉬의 레이시 탄소 필름 구리 그리드(Ted Pella Inc.)에 첨가했다. 그리드는 75 내지 80% 습도에서 3.5초 동안 블로팅한 후, 액체 에탄에서 플런지 동결(Cryoplunge 3 시스템, Gatan)했다. 크리오-EM 데이터 세트는 300kV 타이탄 크리오스 현미경(Titan Krios Microscope)(Thermo Fisher Scientific)에서 수집되었다. EV-D68:Fab EV68-228 데이터 세트의 경우, 64,000× 배율에서 K3 직접 검출 카메라(Gatan)를 구비한 레지논(Leginon)(Suloway et al., 2005) 프로그램을 사용하여 영상을 수집하고, 0.7 내지 2μm의 디포커스 범위와 함께 0.662Å의 초해상도 픽셀 크기를 수득했다. 2.6초의 노광 동안 44.2 전자/Å2의 총 전자 선량이 50프레임에 걸쳐 기록되었다. EV-D68:Fab EV68-159 데이터 세트는 K2 수미트(Summit) 직접 전자 검출기(Gatan)를 사용하여 81,000×의 공칭 배율에서 취득하여, 0.874Å의 초해상도 픽셀 크기, 0.7 내지 3.5μm의 디포커스 범위를 수득했다. 12초의 노광 동안 31.4 전자/Å2의 총 전자 선량이 60프레임으로 분할되었다. 전체적으로, EV-D68:Fab EV68-228 및 EV-D68:Fab EV68-159 데이터세트에 대해, 각각 462개의 무비 및 732개의 무비가 취득되었다.
이미지 처리. 양 데이터세트에 대해, 모션 보정은 데이터 수집 중에 아피온(Appion)(Lander et al., 2009)에서 실장된 MotionCor2(Zheng et al., 2017b)를 통해 생 무비 프레임에서 수행되었다. 콘트라스트 전달 함수(CTF)는 CTFFIND4를 사용하여 정렬된 프레임에서 추정했다[참조: Rohou and Grigorieff, 2015]. 입자 선택 주형은 아피온 매뉴얼 필커(Appion Manual Picker)[참조: Lander et al., 2009]를 사용하여 생성되었고, 자동 선택을 위한 주형은 XMIPP의 2차원(2D) 분류[참조: Sorzano et al., 2004]를 통해 수득되었다. 이어서, 이들 주형을 FindEM에서 자동 선택에 사용하고[참조: Roseman, 2004], RELION을 사용하여 입자를 추출했다. 이어서, 이들 입자는 RELION에서 복수회 라운드의 2D 및 3D 분류를 적용했다[참조: Scheres, 2012]. 그 결과, EV-D68:Fab EV68-228 및 EV-D68:Fab EV68-159 데이터세트에 대해 20,194개 및 30,554개의 입자가 생성되었고, 금 표준 정련 방법[참조: Guo and Jiang, 2014]에 따라 프로그램 JSPR을 사용하여 최종적 3D 20면체 재구성용으로 선택했다. 양 맵의 최종적 해상도는 0.143의 금 표준의 푸리에 쉘 상관관계 컷오프를 기반으로 추정되었다[참조: Scheres and Chen, 2012]. 맵 샤프닝은 RELION(Scheres, 2012)의 후처리에서 수행되었다. 데이터 수집 파라미터 및 관련 항목은 표 G에 요약되어 있다.
모델 구축, 정련 및 분석. EV-D68:Fab EV68-159 및 EV-D68:Fab EV68-228의 원자 구조에 동일한 방법이 사용되었다. EV-D68 페르몬(Fermon) 균주의 X선 결정학 모델(PDB 코드: 4WM8)이 모델 구축을 위한 개시 참조로서 선택되었고, 프로그램 키메라(Chimera)[참조: Pettersen et al., 2004]를 사용하여 밀도 맵에 수동으로 적합되었다. 초기 적합을 기본으로 사용하여, 모델을 쿠트(Coot)에서 재구축하고[참조: Emsley et al., 2010], PHENIX에서 실제 공간 정련[참조: Adams et al., 2010]을 사용하여 정련하여, 이상점과 불충분하게 적합한 로타머를 수정했다. 키메라[참조: Pettersen et al., 2004], 쿠트[참조: Emsley et al., 2010] 및 CCP4i2-PISA[참조: Potterton et al., 2018]를 사용하여 결합 계면 잔기를 결정했다. 최종 원자 모델은 MolProbity에서 검증되었다[참조: Chen et al., 2012]. 정련 통계는 표 G에 설명되어 있다.
중화 회피 돌연변이 바이러스의 선택. 클레이드 B1 EV-D68 분리주는 RD 세포에서 정제된 mAb의 양을 증가시키면서 선택하에 계대했다. mAb 및 바이러스를 33℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 후, 이 혼합물을 33℃에서 2시간 동안 세포 단층에 첨가했다. 이어서, 단층을 3회 세정하고, mAb 함유 배지를 다시 첨가했다. 이 배양물을 33℃에서 적어도 70%의 세포변성 효과가 관찰될 때까지 인큐베이팅하고(플레이트로부터 세포를 리프팅함), 이 시점에서 세포와 상청액을 함께 수집하고, -80℃로 동결했다. 이 샘플을 해동하고, 동일한 미세분리 튜브에서 도립 컵 초음파 처리기에서 최대 출력으로 30초 동안 초음파 처리하고, 다시 2×20초 초음파 처리했다. 세포 파편은 10,000×g에서 10분 동안 정화시켰다. 이어서, 바이러스 함유 상청액을 보다 높은 농도로 mAb를 함유하는 새로운 배지와 1:1로 혼합했다. 3회 계대에 걸쳐, mAb 농도는 5로부터 50, 500ng/mL로 증가했다. 바이러스 RNA는 TRI 시약 및 다이렉스-졸(Direct-zol) RNA MiniPrep 키트(Zymo Research)를 사용하여 회수했다. 3중으로, 본 발명자들은 cDNA 주형을 생성했고, 이로부터 바이러스 게놈의 P1 영역을 커버하는 3,080bp 앰플리콘을 PrimeScript 원 스텝(One Step) RT-PCR 키트 버젼 2(Takara) 및 프라이머 5'-CCTCCGGCCCCTGAAT(Fwd; 서열번호 641) 및 5'-CCATTGAATCCCTGGGCCTT(Rev; 서열번호 642)로 생성했다. 그들은 퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific Biosciences)(PacBio) 차세대 서열분석 플랫폼을 사용하여 3개의 복제물 각각의 서열을 생성했다. 각 서열분석 실행의 2,000개 판독을 사용하여, 각 돌연변이가 관찰된 판독의 백분율을 정량화했다. 돌연변이는 음성 대조군 선택 mAb 선택으로부터의 모든 판독의 야생형 컨센서스 서열과 비교하여 결정되었다.
정량화 및 통계 분석. 기술 및 생물학적 복제는 방법 및 도면 범례에 제시되어 있다. 프리즘 v8(GraphPad)을 사용하여 통계 분석을 수행했다.
경쟁 결합 검정. ELISA 형광 값은, 관련 없는 사전 경쟁 mAb를 첨가하지 않고서 대조군 웰로부터 결정된 최대 결합의 백분율로 정규화되었다. 각각의 기타 비오틴화된 mAb에 대한 각각의 비오틴화된 mAb의 피어슨 상관관계는 판다스 파이톤(Pandas Python) 팩키지의 코르(corr) 방법을 사용하여 3개의 상이한 실험으로부터 중앙 억제 백분율을 사용하여 계산했다[참조: McKinney, 2010]. 이어서, 시본 파이톤(Seaborn Python) 팩키지의 클러스터맵(clustermap) 방법을 사용하여, 이러한 피어슨 상관관계에 대해 계층적 클러스터링을 수행했다. 클러스터링 정보는 뉴윅(newick) 형식으로 수출되고, 인터액티브 트리 오브 라이프(Interactive Tree of Life) v4[참조: Letunic and Bork, 2019]로 수입하고, 이는 최종 표시를 위해 엑셀(Microsoft)로 수입하기 전에 계층적으로 클러스터링된 히트맵을 표시하기 위해 사용되었다.
항체 ELISA 결합 실험. mAb 결합에 대한 EC50 값은, 하한치를 제로로 한정하고 상한치를 최고 포화 형광 값을 갖는 mAb의 최대 형광 값 미만으로 한정한 4-파라미터 S자형 용량-반응 비선형 회귀 분석을 사용하여 항체 농도의 로그 변환 후에 결정되었다.
바이러스 검정. MAb IC50 값은 스피어만-케르버(Spearman-Kaerber) 방정식에 기반한 공식을 사용하여 계산되었다[참조: Ramkrishnan, 2016]. 일원 분산 분석(ANOVA)과 둔네트(Dunnett)의 다중 비교 검정을 사용하여, 단일 풀링 분산을 사용하여, 뮤린의 혈장과 폐의 바이러스 역가를 비교했다. p < 0.05의 값은 유의한 것으로 간주되었다.
폐 사이토카인/케모카인 평가. 각 사이토카인/케모카인에 대해, 브라운-포르사이트(Brown-Forsythe) 일원 ANOVA 시험 및 둔네트(Dunnett)의 T3 다중 비교 시험을 사용하여, 치료된 마우스의 농도를 위약 치료된 마우스와 비교하고, 각 비교에 대해 개별 분산을 계산했다. 이 분석을 선택한 것은 본 발명자들이 각 측정에 대해 동일한 표준 편차를 상정하지 않았기 때문이다.
생체내 보호 연구. 생존 곡선은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 생성되었고, 곡선은 로그 랭크 검정(Mantel-Cox)를 사용하여 비교되었다. 신경학적 스코어는 카이제곱 검정을 사용하여 비교되었다.
실시예 10 - 결과
사전 서면 동의를 획득한 후, 2014년 미국에서의 발병시에 EV-D68 호흡기 감염을 이전에 기록한 12명의 대상체가 혈액을 기증했고, 이로부터 본 발명자들은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리했다. 대상체는 감염 당시는 12~15세, 채혈 당시는 16~18세였다. 각 대상체는 EV-D68 관련 호흡기 질환의 병력이 있고, AFM의 증상은 없었다(표 E). 수집된 PBMC는 엡스타인-바 바이러스로 접종함으로써 시험관내에서 형질전환시켜, 항체를 분비하는 메모리 B 세포 유래 림프모구 세포주(LCL)를 생성했다, LCL 배양 상청액을 간접 ELISA에 사용하여 EV-D68 반응성 IgG의 존재를 스크리닝했다. 본 발명자들은, 2014년 임상 분리주로부터 생성된 EV-D68의 실험실 배양된 생 바이러스 조제물에 결합하지만 유사하게 제조된 비감염 세포 상청액에는 결합하지 않는 항체를 갖는 배양물을 선택했다. EV-D68 특이적 항체를 분비하는 LCL을 비분비성 골수종 세포주와 전기융합시킨 후, 수득된 하이브리도마 세포를 단일 세포로 선별하여, 완전한 인간 mAb를 분비하는 클론 하이브리도마를 생성했다(표 F).
본 발명자들은, 바이러스 표면 상의 얼마나 많은 주요 항원 부위가 자연 감염에 반응하여 제조된 인간 mAb에 의해 결합되는지를 결정하고자 했다. 유사한 에피토프를 인식하는 항체 그룹을 동정하기 위해, 간접 ELISA에서 mAb가 살아있는 바이러스에 대한 다른 mAb 각각의 결합과 경쟁할 수 있는지의 여부를 결정했다. 경쟁 결합 실험의 경우, 바이러스를 ELISA 플레이트에 직접 코팅하고, 이어서 고농도의 하나의 비표지 mAb와 함께 인큐베이팅했다. 이어서, 비오틴화에 의해 표지된 mAb를 보다 낮은 농도로 첨가하고, 1차 mAb의 존재하에 바이러스에 결합하는 2차 mAb의 능력을 결정했다. 이어서, 본 발명자들은, 억제 데이터와 피어슨 상관관계를 사용하여 항체 결합 패턴의 상호 관련성을 결정하고, 4개의 주요 경쟁-결합 그룹(도 32)을 동정했고, 이들을 그룹 1 내지 4로 명명했다. 이들은 각 mAb를 사용하여 EV-D68 조제물의 웨스턴 블롯을 염색하고, 경쟁 결합 그룹 2 및 3의 거의 모든 mAb가 VP1 단백질의 선형 에피토프에 결합한 반면, 기타 단일 mAb만이 바이러스 조제물 중의 임의의 단백질에 결합한다는 것을 발견했다(도 40).
2014년 미국에서 EV-D68의 발생 동안, 거의 모든 바이러스 분리주가 새롭게 출현한 B1 클레이드에 속했고, 밀접하게 관련된 B2 클레이드 또는 멀리 관련된 D 클레이드로부터의 바이러스의 검출은 보다 적었다[참조: Tan et al., 2016]. 이 연구의 대상자 중 1명을 제외한 모든 대상체는 B1 계통 분리주에 감염되었다(표 E). 2014년 이래, B3 클레이드 바이러스가 우세해졌고, B1 클레이드 바이러스는 더 이상 순환하지 않고[참조: Dyrdak et al., 2019]; 2018년에, 미국 질병 예방 관리 센터에 의해 서열분석된 모든 EV-D68 분리주는 B3 클레이드로부터의 것이었다[참조: Kujawski et al., 2019]. 본 발명자들은 먼저 B1 클레이드 EV-D68 분리주를 사용하여 50% 세포 배양 감염 용량(CCID50) 검정에서 각 mAb의 시험관내 중화 능력을 측정했다(도 33A). 28개의 mAb는 50μg/mL 미만의 절반 최대 억제 농도(IC50)로 중화를 입증했고, mAb EV68-159는 0.32ng/mL의 IC50 값에서 가장 강력한 중화를 나타냈다(도 41). 본 발명자들은 추가로, D 클레이드 분리주에 대해 21개의 가장 강력하게 중화하는 mAb를 시험하고, 11개의 mAb가 그 바이러스를 중화시키고, 이들 중의 7개가 이종 바이러스에 대한 IC50에 의해 적어도 10배의 효능 감소를 나타내는 것을 발견했다. 페르몬(Fermon) 균주는 1962년으로부터의 분리주이고, 현대 EV-D68 분리주와 너무 멀리 떨어져 있기 때문에, 클레이드 분류 체계에 적합하지 않다[참조: Tan et al., 2016]. 9개의 mAb는 페르몬 실험실 참조 균주를 중화했지만, 현대의 B1 클레이드 바이러스를 억제하는 것보다 덜 강력했다.
중화 검정은 교차 반응성을 과소평가할 수 있음을 인식하여, 본 발명자들은, 상기와 설명한 동일한 간접 ELISA 접근법을 사용하여, B1, B2 또는 D 클레이드로부터의 대표적 EV-D68 분리주에 결합하기 위해 정제된 mAb의 최대 유효 농도의 절반(EC50)을 생성했다(도 33B-C 및 도 42). B1 클레이드 분리주에 대한 ≤ 1㎍/mL의 결합에 대한 EC50 값을 갖는 mAb 중, 모두가 B2 클레이드 분리주에 결합된 반면, 약 절반은 D 클레이드 분리주에도 결합했다(도 33B 및 도 41). 일반적으로 약하게 결합하지만 시험된 모든 클레이드로부터의 바이러스에 교차 반응하는 추가 부류의 mAb가 관찰되었다.
현재까지, 항체-EV-D68 상호작용의 구조적 연구는 뮤린 mAb로 한정되었다[참조: Zheng et al., 2019]. 본 발명자들은, 2개의 강력하게 중화하는 인간 mAb, 클레이드 특이적 mAb EV68-159 및 고도 교차 반응성의 mAb EV68-228을 선택하여, 항원 결합 단편(Fabs)과의 면역 복합체 및 크리오-전자 현미경(cryo-EM) 연구용의 B1 클레이드 EV-D68 분리주를 제조했다. 최종 밀도 맵은 2.9Å(EV68-159) 또는 3.1Å(EV68-228)의 해상도를 달성했다(도 34A, 도 43, 도 44 및 표 G). 구조는 2개의 상이한 결합 부위를 나타냈다: EV68-159는 3중 대칭 축 주위에 부착된 반면, EV68-228은 협곡 영역을 형성하는 함몰부 사이의 5중 축 주위에 결합되었다(도 34A-C, 도 45). 따라서, 각 Fab에 대해, 총 60개 카피가 바이러스 입자에 결합된다. 바이러스 표면과 상호작용하는 Fab 가변 도메인은 바이러스 캡시드 단백질과 유사한 강력한 밀도를 나타내고, 각 Fab의 원자 모델은 4개의 바이러스 캡시드 단백질과 함께 구축되었다. 대조적으로, 바이러스 표면으로부터 추가로 멀리 위치한 Fab 불변 도메인은 보다 약한 밀도를 나타내고, 원자 모델의 구축으로부터 제외되었다. 폴리펩타이드 쇄의 백본과 대부분의 아미노산 측쇄는 밀도 맵에서 양호하게 정렬되어 있고, 이는 바이러스 입자와 Fab 분자 사이의 결합 계면의 중요한 특징을 입증한다.
양 모델 모두에 대해, Fab에 직면하고 Fab로부터 4Å의 거리 내에 있는 바이러스 표면 잔기가 풋프린트로서 식별되었다(도 34C, 도 46 및 표 H). 풋프린트는 양 Fab 분자가 1개의 프로토머 내에 있는 것을 나타낸다. EV-D68:Fab EV68-159 복합체에서는 각 Fab가 약 990Å2의 바이러스 표면적을 마스킹했다. 결합 계면(도 35)에서는, EV68-159 경쇄와 VP1의 C-말단의 3개 잔기: Glu271 및 Arg272(도 36A) 및 Asp285(도 36B) 사이에 본질적 상호작용이 발견되었다. 잔기 Glu271 및 Arg272는 CDR3 및 CDR1과 수소 결합을 형성했다. Arg272 및 Asp285는 각각 CDR3 및 CDR2 잔기와 염 브릿지를 형성했다. EV68-159의 중쇄는 마스킹된 표면적의 77%에 기여했다. 일련의 수소 결합이, 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및 CDR3과 B-β 가닥(βB) 전의 VP3 N-말단 루프 사이에서 발견되었다(도 36C).
EV-D68:Fab EV68-228 복합체에서는 각 Fab가 바이러스 캡시드 표면의 약 1,170Å2를 마스킹했다. EV68-159와 유사하게, EV68-228 Fab의 중쇄는 표면적의 약 84%를 마스킹함으로써 바이러스 캡시드와의 상호작용을 지배했다. 결합 계면(도 35)은 주로 중쇄 CDR과 VP1 βB 및 VP3 C-말단(도 36D) 사이에 형성된 수소 결합에 의해 안정화되었다. 경쇄 CDR1은 VP2 EF 루프와 상호작용했다. 또한, 중쇄 프레임워크 영역(FR) 3과 VP1 DE 루프 사이에 수소 결합이 형성되었다. 추가로, 경쇄 CDR3과 VP1의 C-말단 사이에 염 브릿지가 형성되었다. 전반적으로, EV68-228 Fab는 5중 축 주위의 바이러스 표면에 결합하고, 고전적 피코르나바이러스 중화 면역원성 부위(NIm) NIm-IB(VP1 DE 루프) 및 NIm-II(VP2 EF 루프)를 인식했다[참조: Rossmann et al., 1985].
벌키한 측쇄는 양 Fab의 계면에서 발견되었고, 소수성 상호작용 네트워크를 통해 구조를 안정화시키는 작용을 한다(도 47). 추가로, 중쇄 및 경쇄의 CDR1 및 CDR3 주변에서도 디설파이드 결합이 검출되었다. 또 다른 한 쌍의 시스테인인 Cys101 및 Cys106은 EV68-228 중쇄의 CDR3 내에서 발견되었고, 디설파이드 결합을 형성하기 위해 정확한 거리 및 방향에 있었다(도 36D). 구체적으로, 등고선 수준이 감소한 경우, 2개의 시스테인 측쇄의 밀도가 연결되었다. EV-D68:Fab EV68-228 복합체에 대해 상기에서 기재한 바와 같이, Cys101이 관여하는 협곡에 인접한 VP3 C-말단 잔기와 중쇄 CDR3 사이에 수소 결합이 관찰되었고, 이는 수소 결합과 디설파이드 결합을 모두 형성한다. 이러한 시스테인 잔기는 Fab 구조와 바이러스-Fab 결합 계면 모두를 안정화시키는 데 중요한 역할을 한다.
이어서, 본 발명자들은, 강력하게 중화되고 고도로 교차 반응성인 인간 mAb EV68-228이 EV-D68 감염의 작은 동물 모델에서 감염 및 질환을 예방하거나 치료할 수 있는지의 여부를 결정하고자 했다. 이들은 인터페론 α/β 및 γ에 대한 수용체가 결핍된 AG129 계통 마우스에서 호흡기 질환 또는 AFM-유사 신경계 질환을 유발하는 2개의 상이한 확립된 감염 모델을 사용하여 이 항바이러스 활성을 생체내에서 시험했다[참조: Evans et al., 2019; Hurst et al., 2019]. 먼저, 본 발명자들은 항체가 호흡기 감염 모델에서 바이러스혈증 및 폐 바이러스 복제를 감소시킬 수 있는지의 여부를 시험했다. 바이러스 접종 전일에 예방으로서 전신 투여된 MAb EV68-228은 시험된 각각의 농도에서 혈액(도 37A) 및 폐(도 37B)에 멸균 면역을 제공한 반면, 인간 IVIG는 혈액만을 멸균했다. 전염증성 사이토카인 분비의 유도는 EV68-228 치료된 마우스의 폐에서 억제되었다(도 38A-C). 바이러스 접종 후의 증가된 시간에 제공되는 치료제로 사용하는 경우, 다시 모든 치료제는 혈액 멸균에 매우 효과적이었지만(도 37C), EV68-228만이 폐에서 효능을 가졌다(도 37D). 본 발명자들은 유사하게 EV68-228-치료된 마우스의 폐에서 전염증성 사이토카인 수준의 감소를 관찰했다(도 38D-F).
이어서, 본 발명자들은 AFM 질환을 모방하는 감염의 신경학적 모델에서 항체의 수동적 전달의 효과를 평가했다. EV68-228 예방은 혈액의 멸균 면역(도 39A) 및 사망(도 39B) 또는 임의의 신경계 질환의 발병(도 39C)으로부터의 완전한 보호를 제공한 반면, IVIG 면역은 부분적으로만 보호되었다. 치료학적으로 제공되면, EV68-228 치료는 제공된 각각의 시점에서 투여 24시간 이내에 혈액을 멸균했다(도 39D). EV68-228은, 감염 후 48시간 이내에 제공되면, 생존율(도 39E) 및 신경 질환을 개선시켰고; 감염 후 72시간에 제공되었을 때, 생존한 마우스는 임상적으로 개선되었다(도 39F 및 표 I).
[표 E]
말초 혈액 단핵 세포를 제공한 대상체의 특성
Figure pct00005
1연령; 2F: 여성, M: 남성, 3Unk.: 불명, NHL: 히스패닉 또는 라틴계 아님; 4B: 흑인, W: 백인; 5C: 기침, H: 쉰 목소리, R: 비염, SP: 부비동 통증, W: 천명음, NR: 기록되지 않음; 6Mod.: 중등도, NR: 기록되지 않음.
[표 F]
인간 mAb의 서열 특성
Figure pct00006
월드 와이드 웹의 imgt.org에 있는 인터네셔널 ImMunoGeneTics(IMGT) 정보 시스템에 의해 동정된 서열 특성. IMGT가 복수의 유전자를 제외할 수 없는 경우, 제1 호출이 수록된다. ND: 미정.
[표 G]
크리오-EM 데이터 수집 파라미터 및 정제 통계
Figure pct00007
[표 H]
EV-D68 및 각각의 Fab의 구조적 접촉 아미노산 잔기
Figure pct00008
중쇄 및 경쇄는 각각 H 및 L로 표지된다. 특히, 고해상도의 전자 밀도 맵에서 명확하게 관찰되는 직접 상호작용만 수록되어 있다. 이것은, 최대 수소 결합 거리에서 전체 풋프린트를 표시하기 위해 4Å 컷오프를 사용하는 로드맵(도 34C 및 도 46)에서 강조 표시된 접촉 잔기와는 상이하다.
[표 I]
EV-68 접종 후에 항체로 치료된 개별 마우스의 신경학적 스코어
Figure pct00009
Figure pct00010
각 열은 도 39F의 그래프에 대응하는 지시된 치료 그룹 내의 개별 마우스로부터의 데이터이다. 일은 EV-D68 접종 후의 스코어가 결정된 일수를 나타낸다. 마우스는 4의 스코어에서 희생되거나 이미 사망했기 때문에, 4가 기록된 후의 일수에는 추가 스코어가 수록되지 않는다. 강조 표시된 세포는 임상적으로 개선되는 마우스의 예를 나타낸다.
[표 J]
중화 회피 아미노산 돌연변이
Figure pct00011
1 수록된 각 mAb는 RD 세포 배양에서 EV-D68의 3계대의 선택으로서 사용되었고, RSV-90은 생체내 실험을 위한 위약 치료로서 사용된 것과 동일한 음성 대조군 mAb이다. 각 치료에 대해, 구조 유전자는 3개의 기술적 복제에서 차세대 서열분석을 사용하여 서열분석되고, 복제당 2000개 서열이 분석된다. 수록된 수치는 이러한 복제의 평균이다. 2Fab 아미노산의 4Å 이내에 위치한 바이러스 아미노산인, 이 원고로부터의 크리오-EM 구조에 의해 결정된 접촉 잔기. 인접은 접촉 잔기에 직접 인접한 아미노산을 지칭한다. 3WT: 야생형. RSV-90 선택된 바이러스 서열의 컨센서스 서열을 나타낸다.
[표 K]
사용된 EV-68 분리주
Figure pct00012
ATCC: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션; BEI: 생물방어 및 신흥 감염 연구 리소스 리포지토리, NIAID, NIH; USU: 유타 주립 대학; NA: 해당 없음.
실시예 11 - 논의
이러한 연구는 EV-D68 감염에 대한 인간 B 세포 반응의 다양한 특징을 나타낸다. 본 발명자들은 스크리닝 항원으로서 살아있는 바이러스 분리주를 사용하여 이러한 mAb를 단리하기 위한 접근법에서 편견이 없도록 시도했다. 본 발명자들은, 결합 및 중화 둘 모두에서 EV-D68의 클레이드 사이의 광범위한 교차 반응성을 관찰했기 때문에, 그들이 회수한 항체 표현형의 다양성은 이러한 전략의 결과일 수 있다. 흥미롭게도, 살아있는 바이러스 입자에 대한 강력한 결합은 반드시 높은 중화 효능을 예측하는 것은 아니다. 관찰된 경쟁 결합 그룹 중에서, 그룹 2 및 3만이 표현형의 균일성을 나타냈다. 양 그룹의 MAb는 교차 반응성이었지만, 그룹 2 mAb는 바이러스를 중화한 반면, 그룹 3 mAb는 중화하지 않았다. 웨스턴 블롯에서는, 그룹 2 및 3의 거의 모든 mAb가 VP1에 결합했고(도 40 및 41), 이는 이들이 선형 에피토프에 결합하는 것을 시사한다. 특히, 경쟁 결합 연구는 전장 IgG 분자를 사용했기 때문에, 관찰되는 경쟁은 인간 조직에서 발생하는 것과 같이 기능적이고, 반드시 바이러스 표면에 구조적으로 상이한 에피토프가 4개만 있다는 것을 나타내는 것은 아니다.
EV68-159 및 EV68-228의 웨스턴 블롯 반응성의 결여는 양 에피토프가 3개의 주요 바이러스 표면 단백질 모두에 걸쳐 있는 것을 나타내는 구조 연구의 발견과 상관관계가 있다. 펩타이드 마이크로어레이[참조: Mishra et al., 2019] 및 파지 라이브러리[참조: Schubert et al., 2019] 기술을 사용한 최근 진단 기술에 의해, 선형 에피토프를 인식하는 AF 환자의 뇌척수액에서 항체를 스캔했기 때문에, 이들 2개의 강력한 중화 mAb의 에피토프의 입체배좌-의존적 특성은 주목할 가치가 있다. 선형 에피토프를 인식하는 항체의 검출은 현재 귀중한 진단 도구에 사용될 수 있고, 그러나, 이러한 연구는 이러한 검사가 엔테로바이러스 감염에 대한 반응으로 이러한 환자가 수행하는 항체 반응의 품질에 대해 기껏해야 부분적으로만 정보를 제공한다는 것을 나타낸다. 구조는 또한 항체 매개 중화에 대한 분자적 기초를 시사한다. 프로토머 내에서 3개의 구조 단백질 모두와 접촉함으로써, 양 mAb 모두는 감염에 필요한 동적 구조 전이를 억제할 수 있는 것으로 보이고, 이는 잘 알려져 있지 않다.
EV68-228 중쇄의 CDR3에서 디설파이드 결합은 C형 간염[참조: Flyak et al., 2018] 및 인플루엔자 A 바이러스[참조: Bangaru et al., 2019] 둘 다를 포함하는 다수의 바이러스의 항바이러스 인간 mAb를 광범위하게 중화할 때에 본 발명자들이 관찰한 구조 모이어티이다. 시스테인 사이에 개재된 4개 내지 5개의 아미노산은 완전한 CDR3 루프의 가장 원위부에 작은 구조화 루프를 형성하여 바이러스 항원 결합에 최적인 사전 구성된 상태에서 CDR3을 안정화시킨다. 특히 EV68-228의 경우, Cys101은 수소 결합을 통해 VP3와도 직접 상호작용하기 때문에, 시스테인은 CDR3 루프 안정화 및 표적과의 상호작용에 모두 관여한다.
EV68-159 경쇄와 상호작용하는 3개의 VP1 잔기(Glu271, Arg272 및 Asp285) 및 EV68-159 중쇄와 상호작용하는 VP3의 N-말단 루프 상의 Glu59는 시알산 수용체 결합 부위[참조: Liu et al., 2015]에 인접하고, 이는 EV68-159 Fab가 시알산 수용체에 대한 바이러스의 결합을 차단할 수 있음을 시사한다. 특히, 이들 3개의 VP1 잔기는 AFM 환자의 뇌척수액에서 발견되는 항체에 의해 결합되는 22개 아미노산 VP1 C-말단 펩타이드에 위치한다[참조: Mishra et al., 2019; Schubert et al., 2019]. 추가로, EV68-159 Fab 중쇄와 VP3 N-말단 루프와의 상호작용에 의해, 4개의 VP의 N-말단이 캡시드 안정성에 기여하기 때문에, 바이러스의 탈코팅이 방지될 수 있다[참조: Filman et al., 1989]. EV68-228은 VP1 βB에 결합하여 바이러스의 탈코팅을 방지하여 진입에 필요한 VP1의 N-말단의 외재화를 억제할 수 있다. 또한, 항체 풋프린트에는 VP3의 C-말단에 있는 잔기가 포함되고, 이는 종래의 NIm의 일부가 아니다. 이러한 잔기는 협곡 수용체 결합 부위에 인접하여, mAb EV68-228이 수용체에 대한 바이러스의 결합을 차단할 수도 있음을 시사한다.
마지막으로, 소아마비 바이러스 2형 및 3형이 근절된 시기에, AFM이 증가하고 있고, 이 마비성 질환의 유행을 유발하는 EV-D68의 역할이 점점 더 명백해지고 있다. 인간 mAb EV68-228에 의한 예방이 생체내에서 얼마나 양호하게 기능하는지를 감안할 때, 이러한 데이터는 효과적인 EV-D68 백신이 AFM 질환을 예방할 수 있음을 시사한다. 실제로, 최근 연구에서는, 바이러스-유사 입자[참조: Zhang et al., 2018a; Dai et al., 2018] 및 불활성화된 EV-D68[참조: Patel et al., 2016] 백신 후보는 면역원성이고, 마우스의 감염을 보호하는 것이 제시되어 있다. 그러나, 불활성화된 EV-D68을 백신접종한 코튼 랫트에 대한 연구에서는, 후속 EV-D68 감염시에 호흡기 질환이 악화되었을 수 있음이 시사되었다[참조: Messacar et al., 2016]. 이 발견은 EV-D68 감염의 항체 의존성 향상(ADE) 가능성을 시사할 수 있지만, 마우스에서 본 발명자들은 시험한 항체 농도의 범위 내에서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체에 의해 유발된 ADE를 관찰하지 못했다. 또한, 특히 이 항체가 인간 세포 재료에 대한 명백한 자가반응성 결합 없이 다양한 세트의 바이러스 분리주를 강력하게 중화시키기 때문에, EV-D68 감염의 초기에 요법으로서 mAb EV68-228을 사용하는 전망은 매력적이다(도 33C). IVIG는 이전의 생체내 연구에서 EV-D68에 의한 AFM-유사 질환으로부터 마우스를 보호했지만[참조: Hixon et al., 2017a], 지금까지의 IVIG는 AFM을 갖는 인간에게 이점을 부여하는 것으로 나타나지 않았다[참조: Messacar et al., 2016]. 그러나, IVIG는 EV-D68을 인식하는 작은 분획만을 갖는 폴리클로날 항체의 복잡한 혼합물이다. EV-D68 관련 AFM에 대한 MAb 예방 또는 요법은 사용할 수 있는 높은 특이성, 높은 효능 및 보다 낮은 항체 용량 때문에 IVIG보다 유망하다. 그러나, 복수의 에피토프에 대해 지시된 mAb 칵테일은 mAb 단독요법보다도 보호적일 수 있다. mAb 칵테일은 이론적으로 mAb 내성 바이러스의 출현에 대해 보다 높은 장벽을 제공할 것이지만, 본 발명자들은 생체내에서 내성을 관찰하지 않았다(도 37A-D 및 도 39A-F). 시험관내 EV68-228 내성 바이러스를 선택하기 위해 최적화된 조건하에서도, 본 발명자들은 중요성이 불명확한 돌연변이를 갖는 바이러스 게놈만을 동정할 수 있었다(표 J). 이러한 돌연변이를 갖는 재조합 바이러스를 제조하기 위한 역유전학 시스템이 없는 경우, 이들은 이러한 돌연변이가 중화로부터 탈출을 유발했는지의 여부를 구체적으로 확인할 수 없었다. 따라서, 잠재적 치료 사용 중에 내성이 출현할 가능성은 거의 없다. 이들 실험은 또한 EV-D68에 기인하는 중증 호흡기 질환 환자에서 치료 효능에 대한 희망을 제공하고, 이는 AFM과의 관련이 인정되기 이전에 2014 EV-D68의 발생을 공중 위생 당국의 주의를 환기시킨 임상 증후군이다[참조: Midgley et al., 2014]. 전반적으로, 여기에 제시된 연구는 인간의 자연적 EV-D68 감염이 호흡기와 신경계 모두에서 감염 및 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 광범위하고 강력한 중화 항체를 암호화하는 B 세포를 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 12
이 연구의 목적은 4주령의 AG129 마우스에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 호흡기 감염에 대한 담배 생산 EV68-228에 의한 치료의 효능을 결정하는 것이었다.
재료 및 방법
동물. 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(USTAR) 빌딩에서 유지되고 있는 특정 병원체 비함유 콜로니로부터의 4주령 수컷 및 암컷 AG129 마우스. 마우스를 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수된 수돗물에서 사육 및 유지했다.
항체 및 화합물. 담배 식물(EV68-228-TP) 및 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(EV68-228-CHO)에서 생산된 모노클로날 항체(mAb) EV68-228은 본 발명자들에 의해 제공되었다. 담배에서 생산된 항체와 CHO 항체는 모두 용액으로 제공되었고, 10mg/kg의 농도로 투여되었다. 담배 생산 항HIV(항-HIV-TP) 항체를 10mg/kg 용량으로 음성 대조군 항체로서 사용했다. 정맥 면역글로불린(HIVIg, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA)은 지역 약국으로부터 구입하여 양성 대조군으로서 사용했다.
바이러스. 엔테로바이러스 D68은 BEI 리소스, NIAID, NIH: 엔테로바이러스 D68, US/MO/14-18949, NR-49130으로부터 수득했다. 이 바이러스는 4주령의 AG129 마우스의 폐에서 30회 연속 계대하고, 이어서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA)로부터 수득된 횡문근육종(RD) 세포에서 3회 플라크 정제되었다. 수득된 바이러스 스톡을 RD 세포에서 2회 증폭하여, 작업 스톡을 생성했다. 감염에 사용된 바이러스는 EV-D68 MP30 PP로 지정되었다.
실험 설계. 표 1에 제시된 바와 같이, 총 118마리의 마우스를 각각 12마리로 이루어진 4개 그룹, 8마리 마우스로 이루어진 8개 그룹 및 정상 대조군에 사용되는 6마리 마우스로 이루어진 추가 그룹으로 랜덤화했다. 마우스는 감염 전 24시간 또는 감염 후 24시간 또는 48시간에 EV68-228 mAb, HIVIg 또는 위약 mAb의 복강내(IP) 투여에 의해 치료되었다. 90㎕ 용적의 MEM에서 1×104.5 CCID50의 EV-D68 MP30 PP를 비강내(IN) 주입함으로써 마우스를 감염시켰다. 처리 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 및 폐 사이토카인 농도의 평가를 위해, 감염 후 1일, 3일 및 5일차에 각 치료 그룹의 4마리의 마우스를 안락사시켰다. 감염 후 24시간 및 48시간 후에 치료된 마우스의 경우, 샘플은 감염 후 3일 및 5일차에만 수집되었다.
폐 사이토카인/케모카인 평가. 폐 균질액의 각 샘플은 제조업체의 지침(Quansys Biosciences Q-Plex™ Array, Logan, UT)에 따라 화학발광 ELISA 기반 검정을 사용하여 사이토카인 및 케모카인에 대해 시험되었다. 퀀시스 멀티플렉스 ELISA는 16개의 상이한 포획 항체가 정의된 어레이의 96웰 플레이트의 각 웰에 적용된 정량적 시험이다. 각 샘플 상청액은 하기: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, MCP-1, IFN-γ, TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES에 대해 시험되었다. 약어의 정의는 다음과 같다: IL - 인터루킨; MCP - 단핵 세포 주화성 단백질; IFN - 인터페론; TNF - 종양 괴사 인자, MIP - 마크로파지 염증 단백질; GM-CSF - 과립구/마크로파지 콜로니 자극 인자; 및 RANTES - 활성화시에 조절되고, 정상 T 세포가 발현 및 분비된다.
통계 분석. 모든 수치 및 통계 분석은 프리즘 8.4.2를 사용하여 완료되었다(GraphPad Software Inc.). 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여, 감염 후 매일, 치료 그룹의 폐 및 혈액 바이러스 역가를 위약 치료 마우스의 폐 및 혈액 역가와 비교했다. 각 사이토카인/케모카인에 대해 이원 배치 분산 분석(ANOVA)를 사용하여 치료 마우스의 농도를 위약 치료 마우스와 비교했다.
실험 동물의 윤리 규칙. 이 연구는 2019년 3월 2일자의 유타 주립 대학(Utah State University)의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다(2022년 3월 1일 만료). 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 정부(국립 위생 연구소) 승인이 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정: 2011)에 따라 2018년 3월 9일에 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
[표 L]
Expt. NIA-1930/실험 설계: 마우스에서 EV-D68 호흡기 감염 치료에 대한 EV68-228-TP의 효능
Figure pct00013
결과 및 논의
이 연구는 4주령의 AG129 마우스에서 EV-D68 호흡기 감염 치료에 대한 담배 생산 EV68-228 mAb의 효능을 결정했다.
도 48A-C는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 HIVIg에 의한 치료는 감염 후 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다.
도 49A-C는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 1일, 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 또한 감염 후 1, 3 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다.
도 50은 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α, IL-1β, IL-2 및 IL-3의 폐 농도를 나타낸다. 감염 후 1일 및 3일차에, EV68-228-TP로 치료된 마우스와 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서 IL-1α의 폐 농도의 현저한 감소가 관찰되었다. 담배 생산 및 CHO 생산 치료는 감염 후 3일차에 IL-1β의 농도를 감소시켰다. hIVIg에 의한 치료는 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 사이토카인 농도에 유의한 영향을 미치지 않았다. EV-D68 감염 후, IL-2 또는 IL-3의 폐 농도에 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 Il-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 폐 농도는 도 51에 제시되어 있다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일차 및 5일차에 IL-6 농도를 감소시켰다. hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 및 IL-6의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. EV-D68의 감염 후, IL-4 또는 IL-10의 폐 농도에는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
도 52는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-12p70, IL-17, MCP-1 및 IFNγ의 폐 농도를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. EV-D68의 감염 후, IL-12p70, IL-17 또는 IFNγ 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 53은 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES의 폐 농도를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 1일 및 3일차에 MIP-1α의 폐 바이러스 농도를 감소시켰고, 감염 3일 및 5일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다. 10mg/kg 용량의 hIVIg는 감염 후 1일 및 3일차에 MIP-1α의 폐 농도를 감소시켰고, 감염 후 3일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다. EV-D68의 감염 후, TNFα 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 54A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 3일 또는 5일차에 폐 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 HIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다.
도 55A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다.
도 56은 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α, IL-1β, IL-2 및 IL-3의 폐 농도를 나타낸다. 감염 후 3일차에, EV68-228-TP로 치료된 마우스 및 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서 IL-1α 및 IL-1β의 폐 농도의 유의한 감소가 관찰되었다. hIVIg에 의한 치료는 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 사이토카인 농도에 유의한 영향을 미치지 않았다. IL-3의 농도는 EV68-228-TP로 치료된 마우스 및 감염 후 3일차에 hIVIg로 치료된 마우스에서 유의하게 감소했다. EV-D68의 감염 후, IL-2의 폐 농도에는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 Il-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 폐 농도는 도 57에 제시되어 있다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5 농도를 유의하게 감소시켰고, 감염 후 3일 및 5일차에 IL-6 농도를 감소시켰다. hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-5의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. EV-D68의 감염 후, 폐 조직에서 IL-4 또는 IL-10 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 58은 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-12p70, IL-17, MCP-1 및 IFNγ의 폐 농도를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 MCP-1의 폐 농도를 유의하게 감소시켰다. EV-D68의 감염 후, IL-12p70, IL-17 또는 IFNγ 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 59는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES의 폐 농도를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 MIP-1α의 폐 바이러스 농도를 감소시켰고, 감염 후 3일 및 5일차에 RANTES의 농도를 감소시켰다. 10mg/kg 용량의 hIVIg는 감염 후 MIP-1α 또는 RANTES의 폐 농도를 유의하게 감소시키지 않았다. EV-D68의 감염 후, TNFα 또는 GM-CSF 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 60A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 폐 바이러스 역가를 나타낸다. 감염 48시간 후에 치료를 수행한 경우, 10mg/kg 용량의 EV68-228-CHO에 의한 치료만이 폐 바이러스 역가를 감소시켰다. 감염 48시간 후에 치료를 투여한 경우, 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 hIVIg에 의한 치료는 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다.
도 61A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 3일 또는 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다.
도 62는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-1α, IL-1β, IL-2 및 IL-3의 폐 농도를 나타낸다. 감염 후 3일차에, EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 IL-1α 및 IL-1β의 폐 농도의 현저한 감소가 관찰되었지만, EV68-228-TP로 치료된 마우스에서는 관찰되지 않았다. hIVIg에 의한 치료는 IL-1α 또는 IL-1β의 폐 사이토카인 농도에 유의한 영향을 미치지 않았다. EV-D68의 감염 후, IL-2 또는 IL-3의 폐 농도에 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 Il-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 폐 농도는 도 63에 제시되어 있다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3일차에 IL-6 농도를 유의하게 감소시켰다. EV68-228-TP 또는 hIVIg에 의한 치료는 IL-6의 폐 농도를 유의하게 감소시키지 않았다. EV-D68의 감염 후, 폐 조직에서 IL-4, IL-5 또는 IL-10 농도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 64는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 IL-12p70, IL-17, MCP-1 및 IFNγ의 폐 농도를 나타낸다. 감염 48시간 후에 치료를 수행한 경우, EV-D68에 감염된 마우스에서 IL-12p70, IL-17, MCP-1 또는 IFNγ의 폐 농도에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
도 65는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스로부터의 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 및 RANTES의 폐 농도를 나타낸다. 감염 48시간 후에 치료를 수행한 경우, EV-D68에 감염된 마우스에서 TNFα, MIP-1α, GM-CSF 또는 RANTES의 폐 농도에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
결론
이 연구는 4주령의 AG129 마우스에서 EV-D68에 의해 유발된 호흡기 감염 치료에서 EV-D68에 대한 담배 생산 EV68-228 mAb의 효능을 결정했다. CHO에서 생산된 EV68-228 Ab를 비교대조로서 사용했다.
감염 전 24시간 또는 감염 후 24시간에 치료를 수행한 경우, 담배에서 생산된 Ab는 CHO에서 생산된 Ab와 비교하여 폐 바이러스 역가, 혈액 바이러스 역가 및 폐 사이토카인 농도에서 유사한 감소를 생성했다.
감염 후 48시간에 투여된 경우, Ab의 효능에서 약간의 차이가 관찰되었다. CHO 생산 Ab는 감염 후 3일 및 5일차에 폐 바이러스 역가를 유의하게 감소시킬 수 있었던 반면, 담배 생산 Ab는 감염 후 3일 또는 5일차에 폐 바이러스 역가를 감소시킬 수 없었다. 담배 생산 및 CHO 생산 Ab 모두는 감염 후 3일 및 5일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시킬 수 있었다. 또한, CHO 생성 Ab는 IL-1α, IL-1β 및 IL-6의 폐 농도를 유의하게 감소시켰지만, 담배 생산 Ab는 사이토카인 농도에서 유사한 감소를 생성하지 않았다.
이러한 폐 바이러스 역가와 폐 사이토카인 농도의 차이는 감염 48시간 후에 치료가 수행된 경우에만 관찰되었고, 변동성은 감염 후의 Ab 치료의 한계로 인한 것일 수 있다. 그러나, CHO 생산 항체에 의한 EV-D68 호흡기 감염 후-치료를 평가한 이전의 연구(NIA-1869)에서, 1mg/kg의 용량은 IL-1α, IL-1β, IL-5, MCP-1 및 RANTES의 폐 농도를 감소시킬 수 있었다. 추가의 연구는, 담배 생산 항체와 CHO 생산 항체 사이에 유의한 차이가 있는지를 확인하기 위한 가치가 있을 것이다.
실시예 13
이 연구의 목적은 10일령의 AG129 마우스에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 신경계 감염에 대한 담배 생산 EV68-228 항체에 의한 치료의 효능을 결정하는 것이었다. 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산된 항체를 효능 비교대조로서 사용했다.
재료 및 방법
동물. 유타 주립 대학의 유타 과학기술연구소(USTAR) 빌딩에서 유지된 특정 병원체 비함유 콜로니로부터 10일령의 AG129 마우스. 마우스를 유타 주립 대학의 USTAR 빌딩에서 방사선 조사된 텍라드 설치류 다이어트(Harlan Teklad) 및 자동 급수된 수돗물로 사육 및 유지했다.
항체 및 화합물. 담배 식물(EV68-228-TP) 및 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(EV68-228-CHO)에서 생산된 모노클로날 항체(mAb) EV68-228은 반더빌드 대학 의료 센터의 발명자들에 의해 제공되었다. 담배 생산 항체와 CHO 항체는 모두 용액으로 제공되었고, 10mg/kg의 농도로 투여되었다. 담배 생산 항-HIV(항-HIV-TP) 항체는 10mg/kg의 용량에서 음성 대조군 항체로서 사용되었다. 정맥 면역글로불린(IVIg, Carimune, CSL Behring, King of Prussia, PA)은 지역 약국에서 구입하여 양성 대조군으로 사용했다.
바이러스. 엔테로바이러스 D68은 BEI 리소스, NIAID, NIH: 엔테로바이러스 D68, US/MO/14-18949, NR-49130에서 수득했다. 이 바이러스는 4주령의 AG129 마우스의 폐에서 30회 연속 계대하고, 이어서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA)으로부터 수득된 횡문근육종(RD) 세포에서 3회 플라크 정제되었다. 수득된 바이러스 스톡을 RD 세포에서 2회 증폭하여, 작업 스톡을 생성했다. 감염에 사용된 바이러스는 EV-D68 MP30 PP로 지정되었다.
실험 설계. 표 1에 제시된 바와 같이, 총 125마리의 마우스를 각각 10마리씩 12개 그룹으로 랜덤화하고, 추가로 5마리의 마우스를 체중 증가에 대한 정상 대조군으로 사용했다. 마우스는 감염 24시간 전, 감염 24시간 또는 48시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO, IVIg 또는 위약을 복강내(IP) 투여하여 치료했다. 0.1mL 용적의 MEM에서 1×106.5 CCID50의 EV-D68 MP30 PP를 복강내(IP) 투여하여 마우스를 감염시켰다. 치료 전 및 그 후 매일 마우스의 체중을 측정했다. 혈액 바이러스 역가의 평가를 위해, 감염 후 1일, 3일, 5일 및 7일차에 5마리 마우스의 그룹으로부터 혈액을 수집했다. 21일까지, 모든 마우스의 이환율, 사망률 및 신경학적 스코어를 매일 관찰했다. 신경학적 스코어(NS)는 다음과 같이 기록되었다: NS0 - 관찰 가능한 마비 없음, NS1 - 뒷다리가 비정상적으로 벌렸지만 정상 또는 약간 느린 보행, NS2 - 전진 운동에 사용하는 동안, 뒷다리가 부분적으로 붕괴하고 발 끌림, NS3 - 뒷다리, 및 뒷다리의 경직 마비가 전진 운동에 사용되지 않음, NS4 - 뒷다리의 경직 마비 및 전진 운동 없음. NS4 스코어로 관찰된 모든 동물은 인도적으로 안락사시켰다.
통계 분석. 카플란-마이어 생존 곡선은 프리즘 8.4.2에서 생성되었다(GraphPad Software Inc.). 로그 랭크(Mantel-Cox) 검정, 및 이어서 게한-브레스로우-윌콕손(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 검정을 사용하여 생존 곡선을 비교했다. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여, 감염 후 매일에 대해, 치료 그룹의 혈액 바이러스 역가를 위약 치료 마우스의 폐 및 혈액 역가와 비교했다. 일원 ANOVA를 사용하여 평균 체중을 비교했다. 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 감정과 둔(Dunn)의 다중 비교 검정을 사용하여 신경학적 스코어를 비교했다.
실험 동물의 윤리 규칙. 이 연구는 2019년 3월 2일자의 유타 주립 대학(Utah State University)의 시설내 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 수행되었다(2022년 3월 1일 만료). 이 작업은 유타 주립 대학의 AAALAC 인정의 실험 동물 연구 센터에서 수행되었다. 미국 정부(국립 위생 연구소) 승인이 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 국립 위생 연구소 가이드(개정: 2011)에 따라 2018년 3월 9일에 갱신되었다(PHS 보증 번호 D16-00468[A3801-01]).
[표 M]
Expt. NIA-1931/실험 설계: 마우스에서 EV-D68 신경학적 감염의 치료에 대한 EV68-228-TP의 효능
Figure pct00014
결과 및 논의
이 연구는 10일령의 AG129 마우스에서 EV-D68 신경 감염 치료에 대한 담배 생산 EV68-228 mAb의 효능을 결정했다.
도 66은 EV-D68로 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 감염 24시간 전에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO 치료 모두는 사망으로부터 완전한 보호를 제공했다. 10mg/kg 단일 용량의 hIVIG는 10마리 중 8마리(80%)의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 위약으로 치료된 10마리 중 9마리가 감염에 굴복했다.
도 67은 EV-D68로 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 초기 체중의 백분율을 나타낸다. EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 마우스에서는, 위약 치료 그룹에서 생존한 마우스 1마리가 감염으로부터 회복된 후에 체중이 증가했기 때문에, 체중 감소로부터 유의한 보호가 관찰되지 않았다.
68A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스에 대한 감염 후 1일 및 3일차의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 1일 또는 3일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 또한 감염 후 3일차에 혈액 바이러스 역가를 감소시켰다.
도 69A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스에 대한 감염 후 5일 및 7일차의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다. 감염 후 7일차에 어떤 치료 그룹의 혈액에서도 바이러스가 검출되지 않았다.
EV-D68로 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 10일령의 AG129 마우스에서 감염 후 2-10일차의 신경학적 스코어는 도 70A-B에 제시되어 있다. 감염 후 어느 일자에서든, 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 신경학적 스코어가 관찰되지 않았다. 또한, 감염 후 어느 시점에서든, 10mg/kg 용량의 IVIg로 치료한 마우스에서는 신경학적 스코어가 관찰되지 않았다. 유일한 생존 위약 치료 마우스는 마비의 징후를 나타내지 않았기 때문에, 감염 7일 후에 신경학적 스코어의 유의한 감소는 관찰되지 않았다.
EV-D68에 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선이 도 71에 제시되어 있다. 감염 24시간 후에 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료하면, 마우스는 사망으로부터 완전히 보호되었다. 감염 24시간 후에 제공된 단일 용량의 hIVIg은 또한 10마리의 마우스 모두(100%)를 사망으로부터 보호했다. 위약으로 치료된 10마리 마우스 중 8마리가 감염에 굴복했다.
도 72는 EV-D68로 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 초기 체중의 백분율을 나타낸다. 위약 치료 그룹에서 생존한 2마리의 마우스가 체중 감염을 획득했기 때문에, EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 마우스에서는 체중 감소로부터 유의한 보호가 관찰되지 않았다.
EV-D68로 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령의 마우스로부터의 감염 후 1일 및 3일차의 혈액 바이러스 역가는 도 73A-B에 제시되어 있다. 치료가 감염 24시간 후에 수행되었기 때문에, 감염 후 1일차에는 혈액 바이러스 역가의 유의한 감소가 관찰되지 않았다. 감염 후 3일차에, EV68-228-TP 및 EV68-228-CHO에 의한 치료는 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 hIVIg에 의한 치료는 감염 후 3일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시켰다.
EV-D68에 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령의 마우스로부터의 감염 후 5일 및 7일차의 혈액 바이러스 역가는 도 74A-B에 제시되어 있다. EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 마우스의 혈액에서는 바이러스가 검출되지 않았지만, 위약 치료된 마우스는 2마리만이 혈액 수집을 위해 여전히 생존했고 어느 동물의 혈액에서도 바이러스가 검출되지 않았다. 위약 치료 동물에서는 바이러스 역가가 없기 때문에, 치료 그룹에 대해 통계적 유의성을 결정할 수 없었다. 감염 후 7일차에 어떤 그룹의 혈액에서도 바이러스가 검출되지 않았다.
도 75A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스에서 감염 후 2-9일차의 신경학적 스코어를 나타낸다. 감염 24시간 후에 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO에 의한 치료는, 감염 후 2-9일차에 신경학적 스코어의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 마비 징후를 유의하게 감소시켰다. 감염 24시간 후에 10mg/kg 단일 용량의 hIVIg는 감염 후 2일 및 3일차에 신경학적 스코어를 감소시켰지만, 나머지 연구의 결과는 개선되지 않았다.
EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스에서 감염 후 10-17일차의 신경학적 스코어는 도 76A-B에 제시되어 있다. EV68-228-TP 및 EV68-228-CHO는 감염 후 10-15일차에 신경학적 스코어를 유의하게 감소시켰다. hIVIg의 투여는 감염 후 10-17일차에 신경학적 스코어를 유의하게 감소시키지 않았다.
도 77은 EV-D68에 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP에 의한 치료는 10마리 마우스 중 9마리(90%)의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 10마리 마우스 중 8마리(80%)는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 감염에서 생존했다. 10mg/kg 단일 용량의 hIVIG는 10마리 마우스 중 6마리(60%)의 마우스를 사망으로부터 보호했다. 위약 치료된 10마리 마우스 중 1마리는 감염에서 생존했다.
도 78은 EV-D68에 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 10일령의 AG129 마우스에 대한 초기 체중의 백분율을 나타낸다. EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 24시간 전에 치료된 마우스에서는, 위약 치료 그룹에서 생존한 1마리의 마우스가 감염 후에 체중을 획득했기 때문에, 체중 감소로부터 유의한 보호가 관찰되지 않았다.
도 79A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스에 대한 감염 후 1일 및 3일차의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 감염 후 1일차에, 그 시점에서 치료가 수행되지 않았기 때문에, 치료 그룹 중 어느 것도 유의차는 없었다. 감염 후 3일차에, 10mg/kg의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서 혈액 바이러스 역가는 낮았지만, 통계적으로 유의차는 없었다. 이는 3일차의 혈액 수집의 24시간 전에 치료가 수행된 것 때문일 수 있다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 1일차 또는 3일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다.
도 80A-B는 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후에 치료된 EV-D68-감염 AG129 마우스에 대한 감염 후 5일 및 7일차의 혈액 바이러스 역가를 나타낸다. 10mg/kg 용량의 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서는 감염 후 5일차에 혈액 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 10mg/kg 용량의 IVIg에 의한 치료는 감염 후 5일차에 혈액 바이러스 역가를 유의하게 감소시키지 않았다. 감염 후 7일차에는 어떤 치료 그룹의 혈액에서도 바이러스가 검출되지 않았다.
EV-D68에 감염되고 EV68-228-TP 또는 EV68-228-CHO로 감염 48시간 후 치료된 10일령의 AG129 마우스에서 감염 후 3-10일차의 신경학적 스코어는 도 81A-B에 제시되어 있다. 10mg/kg의 EV68-228-TP에 의한 치료는 감염 후 3-5일차에 신경학적 스코어를 유의하게 감소시켰다. 10mg/kg의 EV68-228-CHO에 의한 치료는 감염 후 3-6일차에 신경학적 스코어를 유의하게 감소시켰다. 신경학적 스코어는 감염 후 3-5일차에 10mg/kg의 hIVIG로 치료된 마우스에서 유의하게 감소했다. 감염 후 7-10일차에는 어떤 치료 그룹에서도 신경학적 스코어의 유의한 감소가 관찰되지 않았다.
결론
이 연구는 EV-D68 신경 감염의 10일령 AG129 마우스에 대한 담배 생산 EV68-228 mAb의 효능을 결정했다.
담배 생산 mAb는 감염 24시간 전 및 감염 24시간 후 또는 48시간 후에 치료를 수행한 경우, CHO 생산 mAb와 비교하여 사망으로부터 유사한 보호를 제공했다.
또한, EV-D68에 감염된 10일령의 AG129 마우스에서, EV68-228-TP 및 EV68-228-CHO mAb 둘 다로 치료된 마우스에서 혈액 바이러스 역가의 유사한 감소가 관찰되었다.
신경학적 스코어의 감소에 의해 나타난 바와 같이 마비로부터 유사한 보호는 EV68-228-TP 및 EV68-228-CHO로 치료된 마우스에서 관찰되었다.
요약하면, 담배 생산 EV68-228은, CHO 생산 EV68-228과 비교하는 경우, 사망으로부터의 유사한 보호, 혈액 바이러스 역가의 감소 및 마비로부터 보호를 제공했다.
항체 가변 영역에 대한 뉴클레오티드 서열
클론 서열번호 쇄 가변 서열 영역
EV-D68-37 1 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCATCTTCAGTCGCTACGCTCTGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGCAAGAAATTCATATTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAAAACACGCTGTTTCTGCAGATGAACAGTCTGAGAGCTGACGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGACCGACTTTGCCCTACAGCAACAACTGGTACGCGCCTGAATACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
2 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAAACGGCCAGGATCACCTGCTCTGGAGATGCATTACCAAAAAAATATGCTTCTTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGAAGACACCAAACGACCCTCCGGGATCCCTGAGAGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGACAATGGCCACCTTGACTATCAGTGGGGCCCAGGTGGAAGATGAAAGTGACTACTACTGTTCCTCGACAGACAGCAGTGGTAATCCTGTGCTATTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTA
EV-D68-40 3 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTAGAGTCTGGGGGAGACTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTTAGCAGCTATGCCATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGCAGTGGGTCTCATCTATTAGTGGTAACGGTAATGGGAGATCCTATGCAGATTCTCTGAAGGGCCGGTTCACCACCTCCAAAGACCTTTCCAAGTATACCCTGTATCTGCAAATGAACAATCTGAGACCCGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAAAGTTGTCCGTATAGCAGCTGTTTTGTATTACTTTGACTATTGGGGCCCGGGAACCCAGGTTACCGTCTCCTCA
4 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAACAAAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAAGCATCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCATCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATCACTGTCAGCAGCGCAGCTCCTGGCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTGAA
EV-D68-41 5 중쇄 GACGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGGGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGCAACTATGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCTAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTTCTATTAGTGGTAGTGGTGGCCTCACATATTTCGCACACTCCGTGAAGGGCCGGCTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGTGAAAAGTACAACTGGAACGACGGCGTTAGTTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCG
6 경쇄 CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTCACTTGTGGCTTGAGTTCTGGCTCAGTCTCTAGTAGTTACTACCCCAGTTGGTACCAGCAGACCCCAGGCCAGGCTCCACGCACGCTCATCTACAGTATAAACAGACGTTCTTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTTCATCCTTGGGAACAAAGCTGCCCTCACCATCAGGGGGGCCCAGGCAGATGATGAATCTGATTATTACTGTGGGCTGTATATGGGTAGTGGCATTTGGATCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-43 7 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCATTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAATGATGGAAGTTATAACTACGATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAAGGTTTATCTACAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTATTTCTGTGCGAAAGACAAACACGGTGACTTCGACTACTACGGTGTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCCCA
8 경쇄 GACGTCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGGGTCAGGGAATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGAACTTACTATTGTCAACAGGCTGACAGTTTCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-46 9 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCCTATGATGGAAGTGATAACACCTATGCACCTTTTGTGAACGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGCGTCGGCCTGGGAGCTTCCCAGGACTTTGCGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCCTCA
10 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCGCCTTCCACTATGTCTGCTTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAAGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCGTCTACCTTACAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGCATAATAGTTATTCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAG
EV-D68-48 11 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCAGCTTCAGCAGACTTACTATCATCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGCACATCCCTATCTTTGGAACAACAAACTACGCACTGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAAACCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAATGTATAGTGGCCATGACGGCGTTGATGTCTGGGGCCAAGGGACACTGGTCACCGTCTCTTCA
12 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGCTACTTAGCCTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCAAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCACCTGGCCTCCGGGAATGTTCGGCCAAGGGACCAGGGTGGAAATCAAA
EV-D68-71 13 중쇄 CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCATTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTTTTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTAGAGTGGATTGGGACTATCTATGATAGTGGGAGAACCTATGACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGCAGACACGTCCAAGAAGCAGTTCTCACTGACACTGAGGTCTGCGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTTCTGTGCGAGACACCTTACCCACCTCTACGGTGACTACGTCACCCCTGATGCTTTAGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
14 경쇄 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCCTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGCGTTAGTAGCAGCTTCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCGTCCAGCAGGGCCACCGGCATCCCAGACAGGTTCAGAGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTATATTACTGTCAGCAGTATAGTAACTCACGTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-72 15 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCACTACCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTTCATACATTAGTAGTGGTAGTAGTAACATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGAATCTGCAAATGAGCAGCCTGAGAGACGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGCCCACGGACGTATAGTGAATTCTGGAGTGGTTATTAGTAGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCA
16 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACTGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTTTGAGGTCACTTATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTTCTGCAGCTCCTATACAACCAGCAACACTCTCGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-74 17 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTAGGACTTCTGGATACACCTTCACGGCCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCCGGACAAGGGCCTGAGTGGATGGGAAGGATCAACCCGAGCAGTGGTGGCGCACAGTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAACCTACATGACCCTGAGCGGGCTGACATCTGACGACACGGCCGTGTTTTACTGTGCGAGAATGGGTTGTCGTAGTGACCGGTGCTATTCGACCAACTACAACTTTGACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
18 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTCCCTGTGGGGGAAACAACATTGGAACTAAAAGTGTTCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTCTAATGACAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATAGTGGTATTGATGTCGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-75 19 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTATCAGTCCCTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATTCATTAGTAGTAGTAGTCGTTACACATATTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGTTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATTCACTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGAGGGGCCATAGCACCTCGTCCTCATACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
20 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCATTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAACTAAAACTGTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATGTATTATGATAGTGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAACAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCGGGTGTGGGATAGTGATACTGATCATCGAGTGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-76 21 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACGCCTGGATTAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGGCCGTATTCAAACCAAAACTGATGGAGGGACAACAGACTACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGTTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCTTGTATTATTGTAGCACAGGACCGTATTACTATGATACTAGTGGTTACCCCCAACCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
22 경쇄 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGAGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATACCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-80 23 중쇄 GAGGTACAGATGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTCAGACTCTCCTGTTCAGTCTCTGGATTCGACTTCAGTAGATACACCATGAACTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGAAGTGGGTCTCGTCCATTAGTAGTACTAGTCTTTACACATTCTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAACGCCCAGGGTTCCCTGTCTCTACAAATGAGCAGCCTGAGACCCGAAGATACGGCTGTCTATTATTGTGCGAGAGTCGTTGGTCCCGCCGAGTTAGATTACTGGGGCCAGGGAGTGCTGGTCACCGTCTCCTCA
24 경쇄 GTCACCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCTTCTGTCGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTGGAGTTGACTTAGGTTGGTTTCAGCAGAGACCTGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGGTGCCTCCAGGTTGCAGAGTGGGGTCCCATCACGCTTCAGCGGGCGTGGATCTGGCACATTTTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTACAACTTACTTCTGTCTTCAAGATTATAATTACCCTTGGACGCTCGGCCAGGGGACCACGGTGGGAGTCAAA
EV-D68-84 25 중쇄 CAGGTGCACCTGGTGCAGTCTGGGTCTGCGGTGAGGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGACTACTATATTCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAAAACTGGTGGCTCAAATTATACACAGAGGTTTCAGGCCAGGGTCACCATGACCTGGGACACGTCCATCAGTACAGCCTACATGGAGTTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGGGCGGGCAGAAATGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
26 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGACGGCCAGGATCACCTGCTCTGCAGATGCATTGCCAAAGCAATATGCTTATTGGTACCAACAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGATGATATATCAAGACACTGAGAGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGGTCCAGCTCAGGGACAACAGTCACGTTGACCATCAGTGGAGTCCAGGCAGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTCAATCAGGAGACAGCAGTGGTACTTATCTAGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-85 27 중쇄 GAGGTACAGCTCTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAAATTTAGAAACTATGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTATTACTAGTGGTGGTAGTACAGAGTACGCAGACGCCGTGAAGGGCCGGTTCATCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGTTATATTTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCCGTATATTACTGTACAGTGCCGTGGGGTAACTACAATGACTACGTGTCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCCCCGTCTCCTCA
28 경쇄 GAAGTTGTATTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGCAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGCGTGTTGGCAACTCCTTAGCCTGGTACCAACAAAAACCTGGCCAGGCTCCCAGCCTCCTCATCTATGATGCTTCCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCATCAGCCTAGAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCACCAACATAGCACCTGGCCTCGGGGGACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
EV-D68-88 29 중쇄 CAGGTGCACCTGGTTGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATCTTCAGTAGATATCCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGTCTGGAGTGGGTGGCACTTATATCATATGATGGAAACAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTTTCTCCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGACATTTCCTCCCATATAGCAGTAGTTGGTACCAGGGCTTTAACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCA
30 경쇄 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGCCACCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCCCTATAATCTTTGAAGATAGTCAAAGACCGTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAATTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAGGACTGACGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAACAGCAATCGGGCTGTTGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-89 31 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGAAGCGTCTGGATTCCTCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCAGTTATATCGTATGATGGAAATAAGAAATATTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCAAAGAACACGTTGTATCTGCAAGTGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGGTGTCCCGTACGGTGACACCCTTACAGGGCTTGTCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
32 경쇄 AATTTTATGCTGACTCAGCCGCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGCACCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTGCCCCCACCACTGTAATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAACAGCGATCGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTT
EV-D68-95 33 중쇄 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTGACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGGAACGCTAGAATGGGAGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCTACAACACATCTCTGAAGAGCAGACTCTCCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTTACCATGACCAGCATGGACCCTTTGGACACAGCCACATATTTCTGTGCACGGCTACTGGTGGCTGGTACTTTCCTCCCCTCTCACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCA
34 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCAGTGACCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGACTTAAAAGTGTCTTCTGGTACCAGGAGAGGCCAGACCAGGCCCCTGTGGTGGTCATCTATTATGATAGCGCCCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGAATCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCACCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTTTTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTCGTAATCATCCGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTC
EV-D68-97 35 중쇄 GAGCTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTATAGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTAGTAGTACCATACAGTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTGTATTATTGTACGAGACAGGTCGGGGCGGATTTCAGTGGCCGCGGCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGCTCACCGTCTCCTCA
36 경쇄 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCACCATCACCTGCTTTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTACCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCAATGGATGAGGCTGACTATTACT-GT-CAGGCGTGGGACAGCAGCACTGCAGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTC
EV-D68-98 37 중쇄 GAGGTACAACTAGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAAGTTTTCCGTCTATGCCTTGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTTCATATATTAGTAGTAGTGGTTCTACCATATATTATTCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGTCGGGAACTCACTGTTTGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGGTATTTATTACTGTGCGACAGCCCGCCACATCACCAATGATGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGGACAATGGTCATCGTCTCTTCA
38 경쇄 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGTAGGTTTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCGTCCACTTTACAAAGGGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACAGATTTCACTCTCACAATCAGTAGCCTTCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAACTTAATAGTCACCCCCGAATGTTCACTTTCGGCCCTGGGACCACAGTGGATATCAAG
EV-D68-105 39 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTGTCTGGTTACTTAATCAGCAATGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCCGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATCATACTAGAAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCAGCATCTCAGTAGACACGTCCAAGAACCGGTTCTCCCTGAGGCTGAGGTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCTTTTATTACTGTGCGAGAGGCCCAGGCCACTGTTATGGTGATGACGACTGCTACGCGTACTACTTTGACCAGTGGGGCCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCCCCA
40 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTTCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAACCCAGGGAAAGCTCCTAAACTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
EV-D68-110 41 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGGTTTGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTCAGTGGATGGGAGGGATCCTCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATCCCTCCCCTATTGTACTAATGATGTATGCTCAAACCAGAACACATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
42 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGGCGGCCAGGATCACCTGCTCTGGAGATGCATTGCCTAAGCAATATGCTTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGGTGATATATGAAGACAATAAGAGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGGACAACAGTCACGTTGACCATCAGTGGAGTCCAGGCAGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTCAATCAGCAGACAGCAGTGGTACTTATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-111 43 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGTTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGCCGCTACGGTGACCCGATAGGGGACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
44 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCAGTGACCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGACTTAAAAGTGTCTTCTGGTACCAGGAGAGGCCAGACCAGGCCCCTGTGGTGGTCATCTATTATGATAGCGCCCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGAATCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCACCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTTTTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTCGTAATCATCCGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTC
EV-D68-114 45 중쇄 GAGGTGCAACTGTTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCCGGATTCAGGTTTAGCTTCTATGGCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGGTACTGGTGCTACCAGAAACTGCGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTCGACGACACGGCCGTTTTTTATTGTGTGAGACGGTTCCCGATGACCACGGTGACAAGCTTTGACTCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
46 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCGGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTTTGATGTCACTGGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCGCTGGGCTCCAGGCTGAAGATGAGGCTGATTATTATTGTGGCGCATATGCGGGCTTTAACGCTCTTTTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTA
EV-D68-116 47 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCGGGGGGAGGCTTGGTCCGGCCGGGGGGGTCCGTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCCCCTTCAATATGTTTTGGATGGGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCAATATAAAACAGGATGGCAGTGAGAAATACTATGTCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCTCTCTTTCTTCAAATGGACAGCCTGAGTGTCGGGGACACGGCCATCTATTATTGTGTCAGAGAGGGGGTGCGAAGGGTCGTCGTACGTAGTACCGGTTACTTCGACTTTTGGGGCCAGGGACAGCTGGTCACCGTCTCCTCA
48 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGATGTCAGTGTCCCCAGGACAAACGGCCAGGATCACCTGCTCTGGAGATGCAGTGCCAATAAAATATGTTTATTGGTACCAACAGAGGTCAGGCCAGGCCCCTGTATTAGTCATCTATGAAGACGACAGACGACCCTCCGGGATCTCTGAGAGATTCTCTGGCTCCAGTTCAGGGACAACGGCCACCTTGACTATCACTGGGGCCCAGGTGGAGGATGAAGGTGACTACTATTGCTATTCAACAGACAGTAGTGGTTATCAGAGAGCGTTCGGCGGGGGGACCACGCTGACCGTCCTA
EV-D68-150 49 중쇄 CGGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGCCCCAGGACTGGTGAGGCCTTCAGAGACCCTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCTGGTGGCCCCATCAGCAATGGTCCTTATTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATTCATCTTTTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCCGGGGGCGCGTAACCATGGCAGTGGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGACATGTGGTGACTGCGTCGGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
50 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCACCGACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGGTCCTCATCTATGATGCATTCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTCGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAGGTGGCCTCCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
EV-D68-151 51 중쇄 CGGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGCCCCAGGACTGGTGAGGCCTTCAGAGACCCTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCTGGTGGCCCCATCAGCAATGGTCCTTATTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATTCATCTTTTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCCGGGGGCGCGTAACCATGGCAGTGGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGACATGTGGTGACTGCGTCGGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
52 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCACCGACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGGTCCTCATCTATGATGCATTCAAGAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTCGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAGGTGGCCTCCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
EV-D68-152 53 중쇄 CAGGTGCATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGACTCTGGAGTCACCTTCAGTGACAATGCTTTGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAGTTATCTCATATGATGGAAGCAGTAGATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGGTTCACCATATCCAGAGACAATTCCAAGGACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGACTGAGAGCTGAGGACACGGCTATTTATTACTGTGCGAGAGTCACAGCGGATTACTATGAGAGTAGTGGCAAGGTGTTTTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCGTCGTCTCCTCA
54 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCTCCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCACAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATCAGACTTTTTCCTGGACGTTCGGCCAAGGGACCACGGTGGAAGTCAAA
EV-D68-154 55 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGCACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTGATCACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGCTACATCTATACCAGTGGGACCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACATCCAAGAAGCAGTTCTCCCTGAATCTGAGGTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGTCTAGAAACGGTGATCCGTTTCTACTACTACCACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTGATCGTCTCATCA
56 경쇄 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCAGAGTGATGGGTACAGCTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGTCATTGGATCAGGCACATATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGCGTTTATTTCTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-155 57 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCGCTGGCGGCTCCATCGGTGATTACCACTGGAACTGGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGCGTATACATAGCAGTGGGAACACTGACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGGTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCAAAATGTTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
58 경쇄 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTCTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATTCAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGAGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTTCTGTCAGCAATTTTATACTACTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
EV-D68-156 59 중쇄 CAGGTACAGATGCAGGAGTCGGGCCCAGGGCTGGTGAAGGCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCTGGTATCTCCATCAATAACTACTATTGGAGTTGGTTCCGCCAGCCCCCCGGGAAGGGCCTGGAGTGGATCGGATATGTCTATTCTACTGGGAGTTCCAAGTACAATCCCTCCCTCGAGCGTCGAGCCACCATGTCAGTAGACACGTCCAACAACAACTTCTCCCTGAGGCTGACGTCTGTGACCACTGCGGACACGGCCGTCTACTACTGTGCGCGGGGGAGTATGCCGCATATCTGGGGCCAGGGCCTCCTGGTCACCGTCTCCTCA
60 경쇄 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCCGGGACCCCCGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGTAGCACCTCCAACATCGAGACTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGGTCCCAGGAACGGCCCCCAAGCCCCTCGTCTATAGGAATGATCAGCGCCCCTCGGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCGGCCTCCCTGGTCATCAGTGGGCTCCGGACCGAGGATGAGGCTGCTTATTATTGTGCAGCTTGGGATGACAGTCTGAAAGCTCCGGTCTTCGGAGCTGGGACCAAGGTCGCCGTCCTC
EV-D68-157 61 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGATAAAGCCGGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCACTTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTTGGCCGTATTGAAAGCAAAATTGACGGTGGGACAATAGACTACGCTACACCCGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCAAAAAACACGCTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTACCACAGACCAGGGCTACTATGATAGAAGTGGTTATTGGGTCGTCGGGAACCACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCA
62 경쇄 CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCTGAGGGTCACCATCTCCTGTACTGGGAGCAGCACCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCACCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGACGATGCGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGAAGCCTGAGTACTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
EV-D68-158 63 중쇄 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTACTACAGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGGTGCATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATTCTCACTCCATGATAGTAGTTGATCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
64 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAATATTGGAACTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTTATAATGTTCATTATGTCTTCGGAACAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
EV-D68-159 65 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGGGGCCTGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTACTTATATCATGACCTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAGGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACCAGTAGTGTTTACACATTCTATGCAGATTCACTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATTCAGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGGGAAGAAGGGTTTCGAGCTTATAACCTATACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
66 경쇄 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCGTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGAATACAATTATGTTTACTGGTACCAGAAATTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAAAAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATTAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGGTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACATCCTGAGTGGTGTGGTTTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTC
EV-D68-160 67 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCAGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACGTTCAGTAGGTTTGGTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATTTCGTTTGATGGAAGTAATAGATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCACCAGAGACAATTCCAAGAACACATTGTATCTGCAAATGAACAACCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGCGCGAGAGATTGGGATAGGCTGGTTCGTTCGGCGGTTGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAGCGTCTCCTCA
68 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGTAATGATGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTATCAGCAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTAATGATTTTTGATGTCATTAGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGGTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCGACACGGCCTCCCTTATCATCTCTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCAGGCACCTACACCTGGGTATTCGGCGCAGGGACCACACTGACCGTCCTA
EV-D68-161 69 중쇄 CAGGTGCACCTGCAGGAGTCGGGCCCACGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCACTGCCACTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCCCAGGGAGGGGACTGGAGTGGATAGGATATATCTATTCCAGTGGTAACACCAACTACAACCCCTCCCTTAAGAGTCGAGTCACCATTTCTTTAGACACGCCCAACAACCAGCTCTCCCTGACGTTGACCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCATTTATTATTGTGAGAGGCGCTTACGTATTCTGAGTATTGAGAGGAACTACTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCCGGTCACCGTCTCCTCA
70 경쇄 GAAGTTGTGTTGACGCAGACTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCGGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGGGTTGTCAACAACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAGAGCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATTTTTGGTGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGGAAGCTGGAGCCCGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAATATGGTAGCCCGTGGACGTTCGGCCACGGGACCAAGGTGGAAATGAAA
EV-D68-162 71 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGCTATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAGGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGCAAGCAAGAAATACCACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACAATCTCCAGAGACAGTTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCATGTCCCCCCCAAGGATTGCAGTGATGGTAATTGCCACTCGGACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
72 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCGCCTTCCACTATGTCTGCTTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAAGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCGTCTACCTTACAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGCATAATAGTTATTCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAG
EV-D68-163 73 중쇄 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCTTGCAAGGCTTCTGGATACTCCTTCACTAACTTTGCTGTGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTGGCAATAGAAACACAAAGTATTCACACAACTTTCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAACACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTCAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTTCCGATAGCAGCAGCTGGCAGGGGCTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCC
74 경쇄 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATCAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCTCCCAGGGTCCTCATCTATGATGTATCCACCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTCTATTTCTGTCACCAGTATGGTAGTTCACCGGCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-164 75 중쇄 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATACTTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTGCCACCACTACCTTCTACTACGCAGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATTCACTATTTCTGCACATGAAGAGCCTGAGAGACGAAGACACGGCAGTTTATTACTGTGCGAGAGTCTATACTATGCTTCGCGGAGCGAGTATGGACGTCTGGGGCCACGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
76 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCACCTACCTGGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATTCAGCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCCGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCTGCGCATCACCTGGCCTCCTATATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATGTCAAA
EV-D68-165 77 중쇄 CAGGTGCACCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGTCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTTTGGATACACCTTCACCGCCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGGCCTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTATCAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCTCCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGGCCTGAGCAGGCTGAGACCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGTGAAGTGTAGTAGTGCCAACTGCTATGGGAACTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
78 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGAGAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGCAGGCAGCAACAATTTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-166 79 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGTGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCAACTACCGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCCGGTGGCTCTGATACCAGATACAGTCCGTCCCTCCAAGGCCAGGTCACCATGTCAGTCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGATGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCTCGACAGACCACTCAAAATAGTGGCTACGATAGATGGTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCACGTCACCGTCTCCTCA
80 경쇄 CAGTCTGTACTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCACCTCCAGCATCGGAAGTAATATTGTAAATTGGTACCAACACCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATATTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTG
EV-D68-181 81 중쇄 GAGGTGCAGGTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCACCTTTAGCAGGCATACTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGGAGTGGTGGTAGCACATATCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAGTTCCAAGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGATCTCCGTGCCATTATTACGATTTTTGGAGTGGTTTCAACACCCTTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
82 경쇄 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCTCCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGTCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGCACCTTAGCCTGGTACCAGCACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTCTGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTACTACTGTCACCAGTATATTAACTGGCCTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-183 83 중쇄 GAGGTGCGGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAACCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATACATATTCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCCTCCATTAGTAGTACCGGAAGTTACATATACAATGCAGACTCACTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGATTCACCATGACTACAGTGACTAACTTTGACTCATGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
84 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGCTTATAGCTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCTACAGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGGTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTACTACTGCTGCTCACATGCAGGCAGTCACACCTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTA
EV-D68-185 85 중쇄 CAGCTGCAGGTGGTGGCGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTAAAGCCTCTGGATTCACGTTCACCAATTATGGCATGCACTGGGTTCGCCAGGCGCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCTTTTATATCATACGATGGAGGTAATAAATTTTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACACGGTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTGGCGGACACGGCTATGTATTACTGTCCGAAGGTCATCCCCCACCCGTATTATGATAGTAGTGGTGATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCGCCATTTCTTCA
86 경쇄 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCTGGGCCAGTCAGAGTATTAGCCGCAACTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCTGGCCAGGCTCCCCGACTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCCGCCAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCGTCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGACCTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAGTAAGTTGCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
EV-D68-200 87 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTCAGTAGTTATAGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATACATAAGTGGTAGTGGTGGTGACATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAATGCCAGGAACTCACTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGGCTGGTAGCAACAACTGGTACAAGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
88 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGTTACTTAGCCTGGTACCAACAGAGACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGTCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCTACTGGCCTCCGTTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
EV-D68-208 89 중쇄 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCGGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGGAGGTTTGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCCTAGGTAGAGGAAAGTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCAGGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATTTATTTCGACAGCCTCCTATGTTCCGGGGACCTTCGAGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
90 경쇄 GACATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCGCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGAGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATGTTGCGGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCGACTGGCCTCCGGGGACTTTTGGCCAGGGGACCAACGTGGAGATCAAA
EV-D68-210 91 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGGAACTATAACATCAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTACTGGTAGTTACATACACTACGCAGATTTAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGCGAATGGTTAGGAATACGGTGACTGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCTCCGTCTCCTCA
92 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGCCAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGCTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACAGCCAGGCAGAGCCCCCAAACTCCTTATTTATGAAGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCGACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGGGGGTAACAACTCTTGGATGTTCGGCGGAGGGACCATGCTGACCGTCCTA
EV-D68-219 93 중쇄 CAGGTCCAGGTGGTACAGTCTGGGGCTGAGATGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACAGGCTCATTGATTTACCCTTGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGACTTTTTGATCCTGAAAAGGCTGAAGCCATCTACTCACAGAAATTCCAGGACAAGGTCACCATAAGCGAGGACACATCTATCGACACAGCCTACATGGAACTGAACAGCCTGCGCTCTGAAGACACGGCCGTCTACTACTGTGCAACTTGGGGAGTTGAGGTGGTGAATGGGAGAAGGGACTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
94 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGACGGCCAGGATCACATGCTATGCAGATGTGTTGTCAAACCAATATACTTACTGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGGTGATATATAAAGACACTGAGAGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTTGCTGGCTCCAGCTCAGGGACAACAGTCACCTTAGTCATCAATGGAGTCCGGGCAGAGGACGAGGCTTACTATTACTGTCAATCAGCCGACAACACCAGAATTACGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGTCCGTCCTA
EV-D68-220 95 중쇄 GGGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGATACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTTTGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTACTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAGGAACTCACTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGACGTGAGGGATTGTAGTGCTCTTACGTGCCCCCGAAGGGGAGATGCTTTTGATTTCTGGGGCCGTGGGACAAGGGTCACCGTCTCTTCA
96 경쇄 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGTCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACCGGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCCTCGCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
EV-D68-221 97 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTGTCTATCCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATAAGTAGTAGTAGTCGTTACATATCCTACGCAGACTCACTGAGGGGTCGAATCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAAAGTCGGGGGTAGCAAACACCAATACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGATCCCTGGTCACCGTCTCCTCA
98 경쇄 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAACGTCTGGGATCCCCGGGCAGACGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGGTCCAACATCGGAAGTTATACTGTTAACTGGTACGAGCAACTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCGTCATCTTTAATAATAATCAGCGTCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGGTGAAGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-224 99 중쇄 CAGGTTCAGTTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTTCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACGAATTATGACATCATCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGGCTGGATCAGCACTTACAATGGTAACACAAACTATGAACAGAACCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTACTATTGTGCGAGAGAGCGTTGTAGTACTAGTACCTGCTATAGTCGTTATGCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
100 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAATATCTATTTGAATTGGTATCAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCATCCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGACTTTGCAACCTACTACTGTCAACAGAGTTACAGGTCCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCGAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-225 101 중쇄 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGCACAGCCTGGAGAGTCCATGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTAAGTCGTTATGAAGTGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTAGAGTGGCTTTCATACATTAGCAGTGGTGGTCCTTCCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACGATCTCCAGAAACAGCGCCGAGAACTCACTGGAACTACAAATGTCCACCCTGAGGACCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGTATGAGAGAGGGTCTTACTTATTATGATAGTACTATTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCGCCGTCTCCTCA
102 경쇄 CAGAATGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAACTCACCTGCACTCTGAACAGTGGGCACAGCAGATACGCCATCGCATGGCATCAACATCAGCCACAGAGGGGCCCTCGGTTCCTGATGAAGATTAATAGTGATGGCAGACACATCAGGGGGGACGGCATCTCTGATCGCTTCTCAGGCTCCGCCTCTGGGGCTGAGCGTCATCTCACCATCTCCAGCCTCCAGCCTGAGGATGAGGCTGACTATTATTGTCAGACCTGGGGCACTGGCTTTCGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTA
EV-D68-227 103 중쇄 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGAATATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGTTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATGGTGGTAGCAAAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAACGCCAGGTATTCCCTGTCTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAGGACACGGCCTTATATTACTGCGCAAAAGATGATTACGAGGGGGCTGGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCTTCA
104 경쇄 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGGCTGGTACCAACAGAAATCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAATTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
EV-D68-228 105 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCTATTTAATTAGCAATGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGTCCCCCGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATACTAGGGACACCTACTACAACTGGTCCCTCAAGAGTCGAATCACCATATCAGTGGACACGTCCAAGAAACAGTTCTCCCTGAAGTTGTATTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAGACATGAGGGTTCTTGCAATGATGGAAGCTGTTACGGCTCGTTCGTTGACAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
106 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTGACCCTCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTCGCAACTTACTTTTGTCAACAGGCTGACAGTTTCATCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
EV-D68-231 107 중쇄 GAGGTGCAACTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGATTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAATGGGTCTCATCTATTAGTGGTGATGGTGTTAGCACAAAAAACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTTTTTCTGCAACTGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCTTTTATTACTGTGCGAGGGGGGGGACCTTCCATAACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCGTCTTGGTCACTGTCTCCTCA
108 경쇄 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAACAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCGACAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTCTGGTGCATCCACAAGGGCCACTGATTTCCCAGCCAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGACTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAAAAACTGGCCTCGGACGTTCGGCCGAGGGACCAAGGTGGAAGTCAGA
EV-D68-234 109 중쇄 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCACCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCCGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACAAACTACGCAGACTCTGCGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTATTGTGCGAAAGGGACCATTACTTACTCCTACTACTACATGGCCGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
110 경쇄 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGGCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACGCTCACCATCGGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTACCTCAATAACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
EV-D68-235 111 중쇄 CAGGTCCAGGTGGTACAATCTGGGGCTGAGATGAGGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAGGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACAGGCTCACTGATTTACCCTTGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAATGGATTGGATTTGTTGATCTTGAAAAGCGCGAAATCATCTACGCACAGAAATTTCAGGGCAAAGTCACCATAACCGAGGACACATCTGCAGACACCGCCTACATGGAACTGAACAGCCTGCGATCTGAAGACACGGCCGTCTACTACTGTGCAACTTGGGGAATTGAGGTGGTGAATGGGAGGGACGAATTCTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCTCCGTCTCCTCA
112 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGACGGCCAGGATCACATGCTATGCAGATGTGTTGTCAAAGCAATATACTTACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGGTGATATATAAAGACACTGAGAGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTTGCTGGCTCCAGCTCAGGGACAACAGTCACCTTGATCATCAATGGAGTCCGGACAGAGGACGAGGCGTACTATTACTGTCAATCAGCCGACACCAGAATTACGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGTCCGTCCTA
EV-D68-236 113 중쇄 CAGGTCCAGGTGGTCCAGTCTGGGGCTGAGATGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATATAGTCTCAGTGATTTACCCTTGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGGCTTGAGTGGATGGGACTTTTTGATCCTATAAACGGTGAAATCATCTACGCACAGACATTCCAGGGCAAAGTCACCATAAGCGAGGACACATCGATAGACACAGCCTACATGGAACTCAACAGCCTGCGATCTGAAGACACGGCCGTGTACTATTGTGCAACTTGGGGAGTTGCGGTGGTGAGTGGGAGAAGGGACTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
114 경쇄 TCCTATGAGCTGACACAGCCACCCTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGACAGACGGCCAGGATCACATGCTATGCAGCTGTATTGTCAAACCAATATACTTACTGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTTTTGGTGATATATAAAGACACTGAGAGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTTGCTGGCTCCAGCTCAGGGACAACAGTCACCTTGATCATCAATGGAGTCCGGACAGAGGACGAGGCTTACTATTACTGTCAAACAGCCGACACCAAATATACGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGTCCGTCCTA
EV-D68-241 115 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCACCAGTGGTGATTACTACTGGAATTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATCACAGTGGGACCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACAGGTTCTCCCTGAAGTTGTCCTCTGTGACTGCCGCAGACACGGCCGTGTATTTTTGTGCCAGAGCCTACGCTTATGAATTTTGGAGCGGTTACCCTAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCTGGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA
116 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGCGCATTAGTACCTATGTAAATTGGTATCAGGTGAAAGCAGGGACAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGCGTCCAGTTTGCAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTGTCAGTCTACAACCTGAAGATTTTACAACCTACTTCTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
EV-D68-247 117 중쇄 CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGTAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCATCTTCAATAGATATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTCGAGTGGGTGGCTCTTATATCATATGATGGAATTAATAAATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGTACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTCAGAGCTGAGGACACGGCTATCTTTTACTGTGCGAGAGGACTAGGATATTGTAGTGGTACCGGTGGTAGCTGTACACCCTTTGAATATTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCA
118 경쇄 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCACCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAAGAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAATGCCCCTAAGCTCCTCATCTATGGCGCATCCAATTTGCAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCGCTCTCTCCATCAGCAGTCTGGAAACTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTGACAGTGCCCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGTTCAAA
EV-D68-254 119 중쇄 CAGGTGCAGCTGCAACAGCGGGGCGCAGGGCTGTTGAAGCCCTCGGAGACCCTGTCCCTTACCTGCGAAATCTATGGTGCATCCCTCAATGATTACGACTGGACCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATTGGGGTCATCAATCGTCGTGACACTGTTGACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGGGTCACCCTCTCACTTGACACGTCCAAGAACCAACTTTCCCTGAGTCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTTTATTACTGTGTGAGAGTCCCACGTCGGGGCTTTGAAGGGTCTTTCGGATTTTGTGATGATACTGCCTGCCGCTACGGGCATACCTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
120 경쇄 GACATTCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGCGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTAGAGATTATTTAAATTGGTATCAACAAAGACCAGGGAAAGCCCCTAAAGTCCTGATCTTTGCTGGTTCCCGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCGAGGTTTAGAGGCCGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCGATCTGCAACCTGAGGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACCTTACACCTCCGACATTCGGCCAAGGGACCACCGTCGATATCAAA
EV-D68-260 121 중쇄 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTGACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCACTCCGCAATGGTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTTTGCGAGTGACGAAAAATCTTACAGTACATCTCAGAGGACCAGGCTCTCCATCTCCAGGGACACCTCCAAAAGCCAAGTGGTCCTTAGCATGACCGACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCGCGGATTTTGAAGTTTGGGACAATGAGGGCCGCATACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCCCCGTCTCCTCA
122 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAATCAACATTGGAATTAGAACTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTATGTTGGTCATCTATTATGATAGCGACCGGCCCTTAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTTGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGCCCTA
EV-D68-266 123 중쇄 CAGGTGCACTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTTTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGACTGGAGTGGCTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAGGAACTCACTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCTTTTATTACTGTGCGGGGTCAAAGGTTGGCTATACTACTGGTCGAAGGAACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
124 경쇄 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGCTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCTCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGCAGGCAACAACAATTTAGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-269 125 중쇄 CAGGTGCAGTTGCTGCAGTCTGGGTCTGAGGTGAGGAAACCTGGGGCCTCAGTGAACATTCACTGTAAGGCATCTGGATTCACTTTCACCGACTTCTATTTACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGATAATCAACCCTGAAACCGGTGAGACAACCTACTCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGTGTAGTGAATCTGGAAGTGAGGAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGATCTCGTTGTCGTAGTCCCCGTTGAAATGTCTCGGCGTGCCTTTGACATTTGGGGCCAAGGGATTATGGTCACAGTCTCCTCA
126 경쇄 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTCCCTGTGGGGGCAACAACATTGAACGTAAAAGTGTCCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTGTTGGTCGTCTATGATGATACTGTCCGGCCCTCAGGTATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCCGGGAGCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGGAGCCGGGGATGAGGGCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGACAGCACCACTGACCATGGGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
EV-D68-271 127 중쇄 CGGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTCAGACTTCTGGATACATTTTCAGCGCCTACTACATCTATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAGTGGATGGGACGGATGAACGCTAAGAGTGGAGGCGCAAACACTGCACAGCAGTTTCAGGGCAGACTCACCATGACCAGGGACATGTCCGTCAGCACAGCCTACATGGAACTGAGCAGGCTGCGATCGGACGACACGGCCGTCTATTATTGTGCGAGAGACTATAGGGATGACTACATGTGGGGGAGTTATCGGCCTTTAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
128 경쇄 GAAGTTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCTCCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCGGCTACTTAGCCTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCGCTGGCATCCCAGCCAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTAGCAACGGGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCGAGATCAAA
항체 가변 영역에 대한 단백질 서열
클론 서열번호 쇄 가변 서열
EV-D68-37 129 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSRYALHWVRQAPGKGLDWVAVISYDARNSYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRADDTAVYYCARPTLPYSNNWYAPEYWGQGTLVTVSS
130 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYASWYQQKSGQAPVLVIYEDTKRPSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDESDYYCSSTDSSGNPVLFGGGTKLTVL
EV-D68-40 131 중쇄 EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYAMAWVRQAPGKGLQWVSSISGNGNGRSYADSLKGRFTTSKDLSKYTLYLQMNNLRPEDTAIYYCAKVVRIAAVLYYFDYWGPGTQVTVSS
132 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLIISSLEPEDFAVYHCQQRSSWPITFGQGTRLEIE
EV-D68-41 133 중쇄 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMTWVRQALGKGLEWVSSISGSGGLTYFAHSVKGRLTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARVKSTTGTTALVFDIWGQGTMVTVSS
134 경쇄 QTVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSSSYYPSWYQQTPGQAPRTLIYSINRRSSGVPDRFSGFILGNKAALTIRGAQADDESDYYCGLYMGSGIWIFGGGTKLTVL
EV-D68-43 135 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFINYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGSYNYDADSVKGRFTISRDNSKNKVYLQMNSLRPEDTAVYFCAKDKHGDFDYYGVDVWGQGTTVTVSP
136 경쇄 DVQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRAGQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFGTYYCQQADSFPRTFGQGTKVEIK
EV-D68-46 137 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDNTYAPFVNGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCARRRPGSFPGLCDYWGQGALVTVSS
138 경쇄 DIQMTQSPSTMSASVGDRVTITCRASQSISKWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPDDFATYYCQQHNSYSYTFGQGTKVEIK
EV-D68-48 139 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGSFSRLTIIWVRQAPGQGLEWMGGHIPIFGTTNYALKFQGRVTITADKTTSTAYMELSSLRSEDTAIYYCARMYSGHDGVDVWGQGTLVTVSS
140 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQHKPGQAPRLLIYDASNRAKGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSTWPPGMFGQGTRVEIK
EV-D68-71 141 중쇄 QLQLQESGPGLVKHSETLSLTCTVSGGSISSGFYYWGWIRQPPGKGLEWIGTIYDSGRTYDNPSLKSRVTISADTSKKQFSLTLRSATAADTAVYFCARHLTHLYGDYVTPDALDIWGQGTMVTVSS
142 경쇄 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFRGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYSNSRLTFGQGTKVEIK
EV-D68-72 143 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTTYSMNWVRQAPGKGLEWISYISSGSSNIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLNLQMSSLRDEDTAVYYCARAHGRIVNSGVVISRFDPWGQGILVTVSS
144 경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQLHPGKAPKLMIFEVTYRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYFCSSYTTSNTLVVFGGGTKLTVL
EV-D68-74 145 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCRTSGYTFTAYYMHWVRQAPGQGPEWMGRINPSSGGAQYAQKFQGRVTMTRDTSISTTYMTLSGLTSDDTAVFYCARMGCRSDRCYSTNYNFDQWGQGTLVTVSS
146 경쇄 SYVLTQPPSVSVAPGQTARIPCGGNNIGTKSVHWYQQKPGQAPVLVVSNDSDRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGIDVVFGGGTKLTVL
EV-D68-75 147 중쇄 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTISPYGMNWVRQAPGKGLEWVSFISSSSRYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMNSLRAEDTAVYYCARERGHSTSSSYFDSWGQGTLVTVSS
148 경쇄 SYVLTQPPSVSLAPGKTARITCGGNNIGTKTVSWYQQKPGQAPVLVMYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTINRVEAGDEADYYCRVWDSDTDHRVFGGGTKLTVL
EV-D68-76 149 중쇄 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWISWVRQAPGKGLEWVGRIQTKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTALYYCSTGPYYYDTSGYPQPFDYWGQGTLVTVSS
150 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
EV-D68-80 151 중쇄 EVQMVESGGGLVKPGGSLRLSCSVSGFDFSRYTMNWFRQAPGEGLKWVSSISSTSLYTFYADSVKGRFSISRDNAQGSLSLQMSSLRPEDTAVYYCARVVGPAELDYWGQGVLVTVSS
152 경쇄 VTQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGVDLGWFQQRPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGRGSGTFFTLTISSLQPEDFTTYFCLQDYNYPWTLGQGTTVGVK
EV-D68-84 153 중쇄 QVHLVQSGSAVRKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPKTGGSNYTQRFQARVTMTWDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARAGRNGYDYWGQGTLVTVSS
154 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSADALPKQYAYWYQQKPGQAPVLMIYQDTERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSGDSSGTYLVFGGGTKLTVL
EV-D68-85 155 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKFRNYAMTWVRQAPGKGLEWVSTITSGGSTEYADAVKGRFIISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTAVYYCTVPWGNYNDYVSDYWGQGTLVPVSS
156 경쇄 EVVLTQSPATLSLSPGQRATLSCRASQRVGNSLAWYQQKPGQAPSLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTIISLESEDFAVYYCHQHSTWPRGTFGQGTRLEIK
EV-D68-88 157 중쇄 QVHLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSRYPMHWVRQAPGKGLEWVALISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARHFLPYSSSWYQGFNYWGQGILVTVSS
158 경쇄 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIATNYVQWYQQRPGSSPTPIIFEDSQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLRTDDEADYYCQSYDNSNRAVVFGGGTKLTVL
EV-D68-89 159 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCEASGFLFSRYGMHWVRQAPGKGLDWVAVISYDGNKKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQVNSLRVEDTAVYYCARGVPYGDTLTGLVYWGQGTLVTVSS
160 경쇄 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGTIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDNSDRVFGGGTKLTVL
EV-D68-95 161 중쇄 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLRNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYNTSLKSRLSISKDTSKSQVVLTMTSMDPLDTATYFCARLLVAGTFLPSHYFDYWGQGILVTVSS
162 경쇄 SYVLTQPPSVSVTPGKTARITCGGNNIGLKSVFWYQERPDQAPVVVIYYDSARPSGIPERISGSKSGNTATLTITRVEAGDEADYFCQVWDSSRNHPVFGGGTKLTVL
EV-D68-97 163 중쇄 ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIQYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQVGADFSGRGFDYWGQGTLLTVSS
164 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTATITCFGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL
EV-D68-98 165 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKFSVYALSWVRQAPGKGLEWISYISSSGSTIYYSDSVKGRFTISRDNVGNSLFVQMNSLRAEDTGIYYCATARHITNDGFDIWGQGTMVIVSS
166 경쇄 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISRFLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQRGVPSRFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSHPRMFTFGPGTTVDIK
EV-D68-105 167 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYLISNGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHTRSTYYNPSLKSRVSISVDTSKNRFSLRLRSVTAADTAFYYCARGPGHCYGDDDCYAYYFDQWGQGTPVTVSP
168 경쇄 DIQMTQSPSSVSSSVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQNPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK
EV-D68-110 169 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSRFAISWVRQAPGQGLQWMGGILPIFGTANYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSLPYCTNDVCSNQNTFDYWGQGTLVTVSS
170 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQAARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYEDNKRPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGTYVVFGGGTKLTVL
EV-D68-111 171 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASRYGDPIGDNWFDPWGQGTLVTVSS
172 경쇄 SYVLTQPPSVSVTPGKTARITCGGNNIGLKSVFWYQERPDQAPVVVIYYDSARPSGIPERISGSKSGNTATLTITRVEAGDEADYFCQVWDSSRNHPVFGGGTKLTVL
EV-D68-114 173 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRFSFYGMTWVRQAPGKGLEWVSSISGTGATRNCADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRVDDTAVFYCVRRFPMTTVTSFDSWGQGTLVTVSS
174 경쇄 QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIFDVTGRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTIAGLQAEDEADYYCGAYAGFNALFGGGTKLTVL
EV-D68-116 175 중쇄 EVQLVQSGGGLVRPGGSVRLSCVASGFPFNMFWMGWVRQTPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFAISRDNAKNSLFLQMDSLSVGDTAIYYCVREGVRRVVVRSTGYFDFWGQGQLVTVSS
176 경쇄 SYELTQPPSMSVSPGQTARITCSGDAVPIKYVYWYQQRSGQAPVLVIYEDDRRPSGISERFSGSSSGTTATLTITGAQVEDEGDYYCYSTDSSGYQRAFGGGTTLTVL
EV-D68-150 177 중쇄 RVQLQESAPGLVRPSETLSLTCSVSGGPISNGPYYWSWIRQHPGKGLEWIGFIFYSGSTNYNPSLRGRVTMAVDTSKNQFSLRLNSVTAADTAVYYCARHVVTASGWFDPWGQGTLVTVSS
178 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGTDLAWYQQKPGQAPRVLIYDAFKRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSRWPPPYTFGQGTKLEIK
EV-D68-151 179 중쇄 RVQLQESAPGLVRPSETLSLTCSVSGGPISNGPYYWSWIRQHPGKGLEWIGFIFYSGSTNYNPSLRGRVTMAVDTSKNQFSLRLNSVTAADTAVYYCARHVVTASGWFDPWGQGTLVTVSS
180 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGTDLAWYQQKPGQAPRVLIYDAFKRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSRWPPPYTFGQGTKLEIK
EV-D68-152 181 중쇄 QVHLVESGGGVVQPGRSLRLSCADSGVTFSDNALYWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSSRYYADSVRGRFTISRDNSKDTLYLQMNRLRAEDTAIYYCARVTADYYESSGKVFWGQGALVVVSS
182 경쇄 DIQMTQSPSTLSASVGDRVSITCRASQSVRSWLAWYQHKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQADDFATYYCQQYQTFSWTFGQGTTVEVK
EV-D68-154 183 중쇄 QVQLQESGPALVKPSETLSLTCTVSGGSISDHYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGTTNYNPSLKSRVTISVDTSKKQFSLNLRSVTAADTAVYYCARSLETVIRFYYYHYMDVWGKGTTVIVSS
184 경쇄 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLQSDGYSYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSVIGSGTYFTLKISRVEAEDVGVYFCMQALQTPWTFGQGTKVEIK
EV-D68-155 185 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVAGGSIGDYHWNWIRQPAGKGLEWIGRIHSSGNTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCARQNVFDIWGQGTMVTVSS
186 경쇄 DIVMTQSPDSLALSLGERATINCKSSQSVLFSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSETDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQFYTTPLTFGGGTKVEIK
EV-D68-156 187 중쇄 QVQMQESGPGLVKASETLSLTCSVSGISINNYYWSWFRQPPGKGLEWIGYVYSTGSSKYNPSLERRATMSVDTSNNNFSLRLTSVTTADTAVYYCARGSMPHIWGQGLLVTVSS
188 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSTSNIETNYVYWYQQVPGTAPKPLVYRNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLVISGLRTEDEAAYYCAAWDDSLKAPVFGAGTKVAVL
EV-D68-157 189 중쇄 EVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGITFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIESKIDGGTIDYATPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDQGYYDRSGYWVVGNHFDYWGQGILVTVSS
190 경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGLRVTISCTGSSTNIGAGYDVHWYQHLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQADDAADYYCQSYDRSLSTYVFGTGTKVTVL
EV-D68-158 191 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISGTTGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSHSMIVVDHAFDIWGQGTMVTVSS
192 경쇄 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGTKSVHWYQQRPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSYNVHYVFGTGTKVTVL
EV-D68-159 193 중쇄 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYIMTWVRQAPGRGLEWVSSISTSSVYTFYADSLKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRADDTAVYYCAREEGFRAYNLYWGQGTLVTVSS
194 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIEYNYVYWYQKFPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEGDYYCAAWDDILSGVVFGGGTKLTVL
EV-D68-160 195 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSQKLSCAASGFTFSRFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNRYYADSVKGRFTITRDNSKNTLYLQMNNLRPEDTAVYYCARDWDRLVRSAVGYWGQGTLVSVSS
196 경쇄 QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSNDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIFDVIRRPSGVPGRFSGSKSGDTASLIISGLQAEDEADYYCCSYAGTYTWVFGAGTTLTVL
EV-D68-161 197 중쇄 QVHLQESGPRLVKPSETLSLTCTVSGGSVSTATYYWSWIRQSPGRGLEWIGYIYSSGNTNYNPSLKSRVTISLDTPNNQLSLTLTSVTAADTAIYYCERRLRILSIERNYYAMDVWGQGTPVTVSS
198 경쇄 EVVLTQTPGTLSLSPGEGATLSCRASQRVVNNYLAWYQQRAGQAPRLLIFGASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIRKLEPEDFAVYYCQQYGSPWTFGHGTKVEMK
EV-D68-162 199 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGRGLEWVAVISYDASKKYHADSVKGRFTISRDSSKNTLFLQMNSLKPEDTAVYYCARDHVPPKDCSDGNCHSDYGMDVWGQGTTVTVSS
200 경쇄 DIQMTQSPSTMSASVGDRVTITCRASQSISKWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLQTGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPDDFATYYCQQHNSYSYTFGQGTKVEIK
EV-D68-163 201 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYSFTNFAVHWVRQAPGQRLEWMGWINPGNRNTKYSHNFQGRVTITRDTSANTAYMELSSLRSQDTAVYYCARLPIAAAGRGWFDPWGQGTLVTVSS
202 경쇄 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVISTYLAWYQQRPGQAPRVLIYDVSTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCHQYGSSPATFGQGTKVEIK
EV-D68-164 203 중쇄 EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYGMNWVRQAPGKGLEWVSYISSATTTFYYADSVRGRFTISRDNAKNSLFLHMKSLRDEDTAVYYCARVYTMLRGASMDVWGHGTTVTVSS
204 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGTYLAWYQQKPGQAPRLLIYDSANRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRITWPPIFTFGPGTKVDVK
EV-D68-165 205 중쇄 QVHLVQSGAEVKKSGASVKVSCKTFGYTFTAYYMHWVRQAPGQGPEWMGWINPISGGTNYAQKFQGRVSMTRDTSISTAYMGLSRLRPDDTAVYYCARVKCSSANCYGNFDYWGQGTLVTVSS
206 경쇄 QSALTQPPSASGSPGESVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNLVFGGGTKLTVL
EV-D68-166 207 중쇄 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYRFTNYRIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGGSDTRYSPSLQGQVTMSVDKSISTAYLMWSSLKASDTAMYYCARQTTQNSGYDRWFDSWGQGTHVTVSS
208 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSTSSIGSNIVNWYQHLPGTAPKLLIYINNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVL
EV-D68-181 209 중쇄 EVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFSRHTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYHADSVKGRFTISRDSSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAISVPLLRFLEWFQHPFDFWGQGTLVTVSS
210 경쇄 EIVMTQSPASLSVSPGERVTLSCRASQSVGSTLAWYQHKPGQAPRLLISGASTRATGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHQYINWPPWTFGQGTKVEIK
EV-D68-183 211 중쇄 EVRLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNTYSMSWVRQAPGKGLEWVASISSTGSYIYNADSLKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRVEDTAVYYCVRFTMTTVTNFDSWGQGTLVTVSS
212 경쇄 QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGAYSYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVYRRPSGVPGRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCCSHAGSHTWVFGGGTKVTVL
EV-D68-185 213 중쇄 QLQVVASGGGVVQPGRSLRLSCKASGFTFTNYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISYDGGNKFYADSVKGRFTISRDNSRNTVYLQMNSLRVADTAMYYCPKVIPHPYYDSSGDDAFDIWGQGTMVAISS
214 경쇄 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCWASQSISRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPAKFSGSGSGTDFTLTVSSLQSEDLAVYYCQQYSKLPITFGQGTRLEIK
EV-D68-200 215 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSYISGSGGDIYYADSVKGRFTISRDNARNSLSLQMNSLRADDTAVYYCARGLVATTGTRYFDYWGQGTLVTVSS
216 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQRPGQAPRLLIYDASNRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSYWPPFTFGGGTKVEIK
EV-D68-208 217 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRRFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGRGKYAQKFQGRVRITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFISTASYVPGTFEDVWGQGTTVTVSS
218 경쇄 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAAGIPARFSGSGSETDFTLTISSLEPEDVAVYYCQQRSDWPPGTFGQGTNVEIK
EV-D68-210 219 중쇄 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRNYNINWVRQAPGKGLEWVSSISSTGSYIHYADLVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCARMVRNTVTAFDYWGQGTLVSVSS
220 경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQQPGRAPKLLIYEVIKRPSGVSDRFSGSKSGDTASLTISGLQAEDEADYYCCSYGGNNSWMFGGGTMLTVL
EV-D68-219 221 중쇄 QVQVVQSGAEMKKPGASVKVSCKVSGYRLIDLPLHWVRQAPGKGLEWMGLFDPEKAEAIYSQKFQDKVTISEDTSIDTAYMELNSLRSEDTAVYYCATWGVEVVNGRRDYFDSWGQGTLVTVSS
222 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCYADVLSNQYTYWYQQKPGQAPVLVIYKDTERPSGIPERFAGSSSGTTVTLVINGVRAEDEAYYYCQSADNTRITVFGGGTKLSVL
EV-D68-220 223 중쇄 GVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSFEMNWVRQAPGKGLEWVSYISTSGSTIYYADSVKGRFTISRDNARNSLSLQMNSLRAEDTAVYYCARDVRDCSALTCPRRGDAFDFWGRGTRVTVSS
224 경쇄 DVVMTQSPLSLPVTLGQSASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPRTFGPGTKVDIK
EV-D68-221 225 중쇄 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSVYPMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSRYISYADSLRGRITISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCVKVGGSKHQYYFDYWGQGSLVTVSS
226 경쇄 QSVLTQPPSTSGIPGQTVTISCSGSRSNIGSYTVNWYEQLPGTAPKLVIFNNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEGEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVL
EV-D68-224 227 중쇄 QVQLVQSGAEVKRPGASVKVFCKASGYTFTNYDIIWVRQAPGQGLEWVGWISTYNGNTNYEQNLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARERCSTSTCYSRYADYWGQGTLVTVSS
228 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINIYLNWYQQKPGKAPKVLIYAASSLQSGVPSRFRGSGSGTDFILTISSLQPEDFATYYCQQSYRSPRTFGQGTEVEIK
EV-D68-225 229 중쇄 EVQLVESGGGLAQPGESMRLSCVASGFTLSRYEVNWVRQAPGKGLEWLSYISSGGPSIYYADSVKGRFTISRNSAENSLELQMSTLRTEDTAVYYCMREGLTYYDSTIWGQGTLVAVSS
230 경쇄 QNVLTQSPSASASLGASVKLTCTLNSGHSRYAIAWHQHQPQRGPRFLMKINSDGRHIRGDGISDRFSGSASGAERHLTISSLQPEDEADYYCQTWGTGFRVFGGGTKLTVL
EV-D68-227 231 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYAMHWVRQVPGKGLEWVSGISWNGGSKGYADSVKGRFTISRDNARYSLSLQMNSLRTEDTALYYCAKDDYEGAGFDIWGQGTVVTVSS
232 경쇄 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLGWYQQKSGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
EV-D68-228 233 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYLISNGYYWGWIRQSPGKGLEWIGSIYYTRDTYYNWSLKSRITISVDTSKKQFSLKLYSVTAADTAVYYCVRHEGSCNDGSCYGSFVDNWGQGTLVTVSS
234 경쇄 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTLTCRASQDISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYFCQQADSFITFGGGTKVEIK
EV-D68-231 235 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFTFSSYTMAWVRQAPGKGLEWVSSISGDGVSTKNADSVKGRFSVSRDNSKNTLFLQLNSLRAEDTAFYYCARGGTFHNWYFDLWGRGVLVTVSS
236 경쇄 EIVMTQSPATLSVSPGETATLSCRASQSIGDNLAWYQQKPGQAPRLLISGASTRATDFPARFRGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYKNWPRTFGRGTKVEVR
EV-D68-234 237 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGPEWVSGISGSGGSTNYADSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTITYSYYYMAVWGKGTTVTVSS
238 경쇄 EIVLTQSPGTLSLSPGERGTLSCRASQSVRSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYCQQYGTSITFGGGTKVEIK
EV-D68-235 239 중쇄 QVQVVQSGAEMRKPGASVRVSCKVSGYRLTDLPLHWVRQAPGKGLEWIGFVDLEKREIIYAQKFQGKVTITEDTSADTAYMELNSLRSEDTAVYYCATWGIEVVNGRDEFFDSWGQGTLVSVSS
240 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCYADVLSKQYTYWYQQKPGQAPVLVIYKDTERPSGIPERFAGSSSGTTVTLIINGVRTEDEAYYYCQSADTRITVFGGGTKLSVL
EV-D68-236 241 중쇄 QVQVVQSGAEMKKPGASVKVSCKVSGYSLSDLPLHWVRQAPGKGLEWMGLFDPINGEIIYAQTFQGKVTISEDTSIDTAYMELNSLRSEDTAVYYCATWGVAVVSGRRDYFDSWGQGTLVTVSS
242 경쇄 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCYAAVLSNQYTYWYQQKPGQAPVLVIYKDTERPSGIPERFAGSSSGTTVTLIINGVRTEDEAYYYCQTADTKYTVFGGGTKLSVL
EV-D68-241 243 중쇄 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSITSGDYYWNWIRQPPGKGLEWIGYIYHSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNRFSLKLSSVTAADTAVYFCARAYAYEFWSGYPNWFDPWGLGTLVTVSS
244 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISTYVNWYQVKAGTAPKVLIYAASSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTIVSLQPEDFTTYFCQQSYSPPWTFGQGTKVEIK
EV-D68-247 245 중쇄 QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFIFNRYAMHWVRQAPGKGLEWVALISYDGINKYYADSVKGRFSISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAIFYCARGLGYCSGTGGSCTPFEYWGQGILVTVSS
246 경쇄 DIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQSIKKYLNWYQQKPGNAPKLLIYGASNLQTGVPSRFSGSGSGTDFALSISSLETEDFATYYCQQSDSAPPTFGGGTKVEFK
EV-D68-254 247 중쇄 QVQLQQRGAGLLKPSETLSLTCEIYGASLNDYDWTWIRQPPGKRLEWIGVINRRDTVDYNPSLKSRVTLSLDTSKNQLSLSLSSVTAADTAVYYCVRVPRRGFEGSFGFCDDTACRYGHTWFDPWGQGTLVTVSS
248 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRDYLNWYQQRPGKAPKVLIFAGSRLESGVPSRFRGRGSGTEFTLTISDLQPEDFATYYCQQSYLTPPTFGQGTTVDIK
EV-D68-260 249 중쇄 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLRNGRMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFASDEKSYSTSQRTRLSISRDTSKSQVVLSMTDMDPVDTATYYCARILKFGTMRAAYYFDYWGQGALVPVSS
250 경쇄 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGINIGIRTVHWYQQKPGQAPMLVIYYDSDRPLGIPERFSGSKSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTAL
EV-D68-266 251 중쇄 QVHLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSMKGRFTISRDNARNSLYLQMNSLRVEDTAFYYCAGSKVGYTTGRRNWYFDLWGRGTLVTVSS
252 경쇄 QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVTKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGNNNLVFGGGTKLTVL
EV-D68-269 253 중쇄 QVQLLQSGSEVRKPGASVNIHCKASGFTFTDFYLHWVRQAPGQGLEWMGIINPETGETTYSQKFQGRVTMTRDTSTSVVNLEVRSLRSEDTAIYYCARDLVVVVPVEMSRRAFDIWGQGIMVTVSS
254 경쇄 SYVLTQPPSVSVAPGQTARIPCGGNNIERKSVHWYQQRPGQAPVLVVYDDTVRPSGIPERFSGSNSGSTATLTISRVGAGDEGDYYCQVWDSTTDHGVFGGGTKLTVL
EV-D68-271 255 중쇄 RVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQTSGYIFSAYYIYWVRQAPGQGLEWMGRMNAKSGGANTAQQFQGRLTMTRDMSVSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYRDDYMWGSYRPLDYWGQGTLVTVSS
256 경쇄 EVVLTQSPATLSLSPGERASLSCRASQSVSGYLAWYQHKPGQAPRLLIYDASNRAAGIPARFRGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQRSNGLTFGGGTKVEIK
CDR 중쇄 서열
클론 CDRH1
(서열번호) 		CDRH2
(서열번호) 		CDRH3
(서열번호)
EV-D68-37 GFIFSRYA ISYDARNS ARPTLPYSNNWYAPEY
(257) (258) (259)
EV-D68-40 GFSFSSYA ISGNGNGR AKVVRIAAVLYYFDY
(260) (261) (262)
EV-D68-41 GFTFSNYA ISGSGGLT ARVKSTTGTTALVFDI
(263) (264) (265)
EV-D68-43 GFTFINYG ISNDGSYN AKDKHGDFDYYGVDV
(266) (267) (268)
EV-D68-46 GFTFSSYG ISYDGSDN ARRRPGSFPGLCDY
(269) (270) (271)
EV-D68-48 GGSFSRLT HIPIFGTT ARMYSGHDGVDV
(272) (273) (274)
EV-D68-71 GGSISSGFYY IYDSGRT ARHLTHLYGDYVTPDALDI
(275) (276) (277)
EV-D68-72 GFTFTTYS ISSGSSNI ARAHGRIVNSGVVISRFDP
(278) (279) (280)
EV-D68-74 GYTFTAYY INPSSGGA ARMGCRSDRCYSTNYNFDQ
(281) (282) (283)
EV-D68-75 GFTISPYG ISSSSRYT ARERGHSTSSSYFDS
(284) (285) (286)
EV-D68-76 GFTFSNAW IQTKTDGGTT STGPYYYDTSGYPQPFDY
(287) (288) (289)
EV-D68-80 GFDFSRYT ISSTSLYT ARVVGPAELDY
(290) (291) (292)
EV-D68-84 GYTFTDYY INPKTGGS ARAGRNGYDY
(293) (294) (295)
EV-D68-85 GFKFRNYA ITSGGST TVPWGNYNDYVSDY
(296) (297) (298)
EV-D68-88 GFIFSRYP ISYDGNNK ARHFLPYSSSWYQGFNY
(299) (300) (301)
EV-D68-89 GFLFSRYG ISYDGNKK ARGVPYGDTLTGLVY
(302) (303) (304)
EV-D68-95 GFSLRNARMG IFSNDEK ARLLVAGTFLPSHYFDY
(305) (306) (307)
EV-D68-97 GFTFSTYS ISSSSSTI TRQVGADFSGRGFDY
(308) (309) (310)
EV-D68-98 GFKFSVYA ISSSGSTI ATARHITNDGFDI
(311) (312) (313)
EV-D68-105 GYLISNGYY IYHTRST ARGPGHCYGDDDCYAYYFDQ
(314) (315) (316)
EV-D68-110 GGTFSRFA ILPIFGTA ARSLPYCTNDVCSNQNTFDY
(317) (318) (319)
EV-D68-111 GGSISSGDYY IYYSGST ASRYGDPIGDNWFDP
(320) (321) (322)
EV-D68-114 GFRFSFYG ISGTGATR VRRFPMTTVTSFDS
(323) (324) (325)
EV-D68-116 GFPFNMFW IKQDGSEK VREGVRRVVVRSTGYFDF
(326) (327) (328)
EV-D68-150 GGPISNGPYY IFYSGST ARHVVTASGWFDP
(329) (330) (331)
EV-D68-151 GGPISNGPYY IFYSGST ARHVVTASGWFDP
(332) (333) (334)
EV-D68-152 GVTFSDNA ISYDGSSR ARVTADYYESSGKVF
(335) (336) (337)
EV-D68-154 GGSISDHY IYTSGTT ARSLETVIRFYYYHYMDV
(338) (339) (340)
EV-D68-155 GGSIGDYH IHSSGNT ARQNVFDI
(341) (342) (343)
EV-D68-156 GISINNYY VYSTGSS ARGSMPHI
(344) (345) (346)
EV-D68-157 GITFSNAW IESKIDGGTI TTDQGYYDRSGYWVVGNHFDY
(347) (348) (349)
EV-D68-158 GFTFSSYA ISGTTGST AKDSHSMIVVDHAFDI
(350) (351) (352)
EV-D68-159 GFTFSTYI ISTSSVYT AREEGFRAYNLY
(353) (354) (355)
EV-D68-160 GFTFSRFG ISFDGSNR ARDWDRLVRSAVGY
(356) (357) (358)
EV-D68-161 GGSVSTATYY IYSSGNT ERRLRILSIERNYYAMDV
(359) (360) (361)
EV-D68-162 GFTFSSYA ISYDASKK ARDHVPPKDCSDGNCHSDYGMDV
(362) (363) (364)
EV-D68-163 GYSFTNFA INPGNRNT ARLPIAAAGRGWFDP
(365) (366) (367)
EV-D68-164 GFTFNTYG ISSATTTF ARVYTMLRGASMDV
(368) (369) (370)
EV-D68-165 GYTFTAYY INPISGGT ARVKCSSANCYGNFDY
(371) (372) (373)
EV-D68-166 GYRFTNYR IYPGGSDT ARQTTQNSGYDRWFDS
(374) (375) (376)
EV-D68-181 GITFSRHT ISGSGGST AISVPLLRFLEWFQHPFDF
(377) (378) (379)
EV-D68-183 GFTFNTYS ISSTGSYI VRFTMTTVTNFDS
(380) (381) (382)
EV-D68-185 GFTFTNYG ISYDGGNK PKVIPHPYYDSSGDDAFDI
(383) (384) (385)
EV-D68-200 GFPFSSYS ISGSGGDI ARGLVATTGTRYFDY
(386) (387) (388)
EV-D68-208 GGTFRRFA IIPILGRG ARFISTASYVPGTFEDV
(389) (390) (391)
EV-D68-210 GFTFRNYN ISSTGSYI ARMVRNTVTAFDY
(392) (393) (394)
EV-D68-219 GYRLIDLP FDPEKAEA ATWGVEVVNGRRDYFDS
(395) (396) (397)
EV-D68-220 GFTFSSFE ISTSGSTI ARDVRDCSALTCPRRGDAFDF
(398) (399) (400)
EV-D68-221 GFSFSVYP ISSSSRYI VKVGGSKHQYYFDY
(401) (402) (403)
EV-D68-224 GYTFTNYD ISTYNGNT ARERCSTSTCYSRYADY
(404) (405) (406)
EV-D68-225 GFTLSRYE ISSGGPSI MREGLTYYDSTI
(407) (408) (409)
EV-D68-227 GFTFDEYA ISWNGGSK AKDDYEGAGFDI
(410) (411) (412)
EV-D68-228 GYLISNGYY IYYTRDT VRHEGSCNDGSCYGSFVDN
(413) (414) (415)
EV-D68-231 DFTFSSYT ISGDGVST ARGGTFHNWYFDL
(416) (417) (418)
EV-D68-234 GFTFSTYA ISGSGGST AKGTITYSYYYMAV
(419) (420) (421)
EV-D68-235 GYRLTDLP VDLEKREI ATWGIEVVNGRDEFFDS
(422) (423) (424)
EV-D68-236 GYSLSDLP FDPINGEI ATWGVAVVSGRRDYFDS
(425) (426) (427)
EV-D68-241 GGSITSGDYY IYHSGTT ARAYAYEFWSGYPNWFDP
(428) (429) (430)
EV-D68-247 GFIFNRYA ISYDGINK ARGLGYCSGTGGSCTPFEY
(431) (432) (433)
EV-D68-254 GASLNDYD INRRDTV VRVPRRGFEGSFGFCDDTACRYGHTWFDP
(434) (435) (436)
EV-D68-260 GFSLRNGRMG IFASDEK ARILKFGTMRAAYYFDY
(437) (438) (439)
EV-D68-266 GFTFSDYY ISSSGSTI AGSKVGYTTGRRNWYFDL
(440) (441) (442)
EV-D68-269 GFTFTDFY INPETGET ARDLVVVVPVEMSRRAFDI
(443) (444) (445)
EV-D68-271 GYIFSAYY MNAKSGGA ARDYRDDYMWGSYRPLDY
(446) (447) (448)
CDR 경쇄 서열
클론 CDRL1
(서열번호) 		CDRL2
(서열번호) 		CDRL3
(서열번호)
EV-D68-37 ALPKKY EDT SSTDSSGNPVL
(449) (450) (451)
EV-D68-40 QSVSTY EAS QQRSSWPIT
(452) (453) (454)
EV-D68-41 SGSVSSSYY SIN GLYMGSGIWI
(455) (456) (457)
EV-D68-43 QGISSW AAS QQADSFPRT
(458) (459) (460)
EV-D68-46 QSISKW KAS QQHNSYSYT
(461) (462) (463)
EV-D68-48 QSVRSY DAS QQRSTWPPGM
(464) (465) (466)
EV-D68-71 QSVSSSF GAS QQYSNSRLT
(467) (468) (469)
EV-D68-72 SSDVGGYNY EVT SSYTTSNTLVV
(470) (471) (472)
EV-D68-74 NIGTKS NDS QVWDSGIDVV
(473) (474) (475)
EV-D68-75 NIGTKT YDS RVWDSDTDHRV
(476) (477) (478)
EV-D68-76 KLGDKY QDT QAWDSSTVV
(479) (480) (481)
EV-D68-80 QDIGVD GAS LQDYNYPWT
(482) (483) (484)
EV-D68-84 ALPKQY QDT QSGDSSGTYLV
(485) (486) (487)
EV-D68-85 QRVGNS DAS HQHSTWPRGT
(488) (489) (490)
EV-D68-88 SGSIATNY EDS QSYDNSNRAVV
(491) (492) (493)
EV-D68-89 SGTIASNY EDN QSYDNSDRV
(494) (495) (496)
EV-D68-95 NIGLKS YDS QVWDSSRNHPV
(497) (498) (499)
EV-D68-97 KLGDKY QDS QAWDSSTAV
(500) (501) (502)
EV-D68-98 QGISRF SAS QQLNSHPRMFT
(503) (504) (505)
EV-D68-105 QGISNW DAS QQANSFPFT
(506) (507) (508)
EV-D68-110 ALPKQY EDN QSADSSGTYVV
(509) (510) (511)

EV-D68-111		 NIGLKS YDS
QVWDSSRNHPV
(512) (513) (514)
EV-D68-114 SSDVGGYNF DVT GAYAGFNAL
(515) (516) (517)
EV-D68-116 AVPIKY EDD YSTDSSGYQRA
(518) (519) (520)
EV-D68-150 QSVGTD DAF QQRSRWPPPYT
(521) (522) (523)
EV-D68-151 QSVGTD DAF QQRSRWPPPYT
(524) (525) (526)
EV-D68-152 QSVRSW KAS QQYQTFSWT
(527) (528) (529)
EV-D68-154 QSLLQSDGYSY LGS MQALQTPWT
(530) (531) (532)
EV-D68-155 QSVLFSSNNKNY WAS QQFYTTPLT
(533) (534) (535)
EV-D68-156 TSNIETNY RND AAWDDSLKAPV
(536) (537) (538)
EV-D68-157 STNIGAGYD GNS QSYDRSLSTYV
(539) (540) (541)
EV-D68-158 NIGTKS DDS QVWDSYNVHYV
(542) (543) (544)
EV-D68-159 SSNIEYNY KNN AAWDDILSGVV
(545) (546) (547)
EV-D68-160 SNDVGGYNF DVI CSYAGTYTWV
(548) (549) (550)
EV-D68-161 QRVVNNY GAS QQYGSPWT
(551) (552) (553)
EV-D68-162 QSISKW KAS QQHNSYSYT
(554) (555) (556)
EV-D68-163 QSVISTY DVS HQYGSSPAT
(557) (558) (559)
EV-D68-164 QSVGTY DSA QLRITWPPIFT
(560) (561) (562)
EV-D68-165 SSDVGGYNY EVS SSYAGSNNLV
(563) (564) (565)
EV-D68-166 TSSIGSNI INN AAWDDSLNGWV
(566) (567) (568)
EV-D68-181 QSVGST GAS HQYINWPPWT
(569) (570) (571)
EV-D68-183 SSDVGAYSY DVY CSHAGSHTWV
(572) (573) (574)
EV-D68-185 QSISRN GAS QQYSKLPIT
(575) (576) (577)
EV-D68-200 QSVRSY DAS QQRSYWPPFT
(578) (579) (580)
EV-D68-208 QSVSSY DAS QQRSDWPPGT
(581) (582) (583)
EV-D68-210 SSDVGGYNF EVI CSYGGNNSWM
(584) (585) (586)
EV-D68-219 VLSNQY KDT QSADNTRITV
(587) (588) (589)
EV-D68-220 QSLVYSDGNTY KVS MQGTHWPRT
(590) (591) (592)
EV-D68-221 RSNIGSYT NNN AAWDDSLNGVV
(593) (594) (595)
EV-D68-224 QSINIY AAS QQSYRSPRT
(596) (597) (598)
EV-D68-225 SGHSRYA INSDGRH QTWGTGFRV
(599) (600) (601)
EV-D68-227 QSVSSY GAS QQRSNWPIT
(602) (603) (604)
EV-D68-228 QDISSW AAS QQADSFIT
(605) (606) (607)
EV-D68-231 QSIGDN GAS QQYKNWPRT
(608) (609) (610)
EV-D68-234 QSVRSSY GAS QQYGTSIT
(611) (612) (613)
EV-D68-235 VLSKQY KDT QSADTRITV
(614) (615) (616)
EV-D68-236 VLSNQY KDT QTADTKYTV
(617) (618) (619)
EV-D68-241 QRISTY AAS QQSYSPPWT
(620) (621) (622)
EV-D68-247 QSIKKY GAS QQSDSAPPT
(623) (624) (625)
EV-D68-254 QSIRDY AGS QQSYLTPPT
(626) (627) (628)
EV-D68-260 NIGIRT YDS QVWDSSSDHVV
(629) (630) (631)
EV-D68-266 SSDVGAYNY EVT SSYAGNNNLV
(632) (633) (634)
EV-D68-269 NIERKS DDT QVWDSTTDHGV
(635) (636) (637)
EV-D68-271 QSVSGY DAS QQRSNGLT
(638) (639) (640)
*****************
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조 및 실행될 수 있다. 본 개시의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 관점에서 설명되었지만, 당해 기술분야의 당업자에게는, 본 개시의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법, 및 단계 또는 단계의 순서에 변경을 적용할 수 있음이 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 약제가 본 명세서에 기재된 약제를 대체하여도, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 것은 명백할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체물 및 수정은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 개시의 정신, 범위 및 개념의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
VII. 참조문헌
하기 참조문헌은 이들이 본 명세서에 기재된 것을 보충하는 예시적 절차 또는 기타 상세를 제공하는 범위에서 참조로 의애 본 명세서에 구체적으로 도입된다.
미국 특허 제3,817,837호
미국 특허 제3,850,752호
미국 특허 제3,939,350호
미국 특허 제3,996,345호
미국 특허 제4,196,265호
미국 특허 제4,275,149호
미국 특허 제4,277,437호
미국 특허 제4,366,241호
미국 특허 제4,472,509호
미국 특허 제4,554,101호
미국 특허 제4,680,338호
미국 특허 제4,816,567호
미국 특허 제4,867,973호
미국 특허 제4,938,948호
미국 특허 제5,021,236호
미국 특허 제5,141,648호
미국 특허 제5,196,066호
미국 특허 제5,563,250호
미국 특허 제5,565,332호
미국 특허 제5,856,456호
미국 특허 제5,880,270호
미국 특허 제6,485,982호
Figure pct00015
Figure pct00016
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SEQUENCE LISTING <110> VANDERBILT UNIVERSITY <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO ENTEROVIRUS D68 <130> VBLT.P0294WO <140> Unknown <141> 2020-07-24 <150> 62/878,955 <151> 2019-07-26 <150> 62/899,503 <151> 2019-09-12 <150> 63/047,330 <151> 2020-07-02 <160> 642 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcatgtgcag cctctggatt catcttcagt cgctacgctc tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggactg ggtggcagtt atatcatatg atgcaagaaa ttcatattac 180 acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgttt 240 ctgcagatga acagtctgag agctgacgac acggctgtct attactgtgc gagaccgact 300 ttgccctaca gcaacaactg gtacgcgcct gaatactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 2 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacaaac ggccaggatc 60 acctgctctg 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tcgctggcgg ctccatcggt gattaccact ggaactggat ccggcagccc 120 gccgggaagg ggctggagtg gattgggcgt atacatagca gtgggaacac tgactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aaactgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gcaaaatgtt 300 tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt ca 342 <210> 58 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctctgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta ttcagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg agacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttatttct gtcagcaatt ttatactact 300 ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339 <210> 59 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 caggtacaga tgcaggagtc gggcccaggg ctggtgaagg cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcagtg 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caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc ccagaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacgttcagt aggtttggta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcgtttg atggaagtaa tagatactac 180 gcagactccg tgaaggggcg attcaccatc accagagaca attccaagaa cacattgtat 240 ctgcaaatga acaacctgag acctgaggac acggctgtat attactgcgc gagagattgg 300 gataggctgg ttcgttcggc ggttggctac tggggccagg gaaccctggt cagcgtctcc 360 tca 363 <210> 68 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 68 cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagtaa tgatgttggt ggttataact ttgtctcctg gtatcagcaa 120 cacccaggca aagcccccaa actaatgatt tttgatgtca ttaggcggcc ctcaggggtc 180 cctggtcgct tctctggctc caagtctggc gacacggcct cccttatcat ctctggactc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggcaccta cacctgggta 300 ttcggcgcag ggaccacact gaccgtccta 330 <210> 69 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic 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tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acatgctatg cagatgtgtt gtcaaagcaa tatacttact ggtatcagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 tttgctggct ccagctcagg gacaacagtc accttgatca tcaatggagt ccggacagag 240 gacgaggcgt actattactg tcaatcagcc gacaccagaa ttacggtttt cggcggaggg 300 accaagctgt ccgtccta 318 <210> 113 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 113 caggtccagg tggtccagtc tggggctgag atgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tttccggata tagtctcagt gatttaccct tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggactt tttgatccta taaacggtga aatcatctac 180 gcacagacat tccagggcaa agtcaccata agcgaggaca catcgataga cacagcctac 240 atggaactca acagcctgcg atctgaagac acggccgtgt actattgtgc aacttgggga 300 gttgcggtgg tgagtgggag aagggactac tttgactcct ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 114 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 114 tcctatgagc tgacacagcc accctcggtg tcagtgtccc caggacagac ggccaggatc 60 acatgctatg cagctgtatt gtcaaaccaa tatacttact ggtatcaaca gaagccaggc 120 caggcccctg ttttggtgat atataaagac actgagaggc cctcagggat ccctgagcga 180 tttgctggct ccagctcagg gacaacagtc accttgatca tcaatggagt ccggacagag 240 gacgaggctt actattactg tcaaacagcc gacaccaaat atacggtttt cggcggaggg 300 accaagctgt ccgtccta 318 <210> 115 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 115 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcacc agtggtgatt actactggaa ttggatccgc 120 cagcccccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct atcacagtgg gaccacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtccaa gaacaggttc 240 tccctgaagt tgtcctctgt gactgccgca gacacggccg tgtatttttg tgccagagcc 300 tacgcttatg aattttggag cggttaccct aactggttcg acccctgggg cctgggaacc 360 ctggtcaccg tctcatca 378 <210> 116 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 116 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcgcattagt acctatgtaa attggtatca ggtgaaagca 120 gggacagccc ctaaggtcct gatctatgct gcgtccagtt tgcaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattgtcag tctacaacct 240 gaagatttta caacctactt ctgtcaacag agttacagtc ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 117 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 117 caggtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggtaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt catcttcaat agatatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctcgagtg ggtggctctt atatcatatg atggaattaa taaatattac 180 gcagactccg tgaagggccg attctccatc tccagagaca attccaagag tacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctcag agctgaggac acggctatct tttactgtgc gagaggacta 300 ggatattgta gtggtaccgg tggtagctgt acaccctttg aatattgggg ccagggaatc 360 ctggtcaccg tctcctca 378 <210> 118 <211> 321 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cctggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 405 <210> 120 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 120 gacattcaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgttggcga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtattaga gattatttaa attggtatca acaaagacca 120 gggaaagccc ctaaagtcct gatctttgct ggttcccgtt tggaaagtgg ggtcccatcg 180 aggtttagag gccgtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcga tctgcaacct 240 gaggattttg caacttacta ctgtcaacag agttacctta cacctccgac attcggccaa 300 gggaccaccg tcgatatcaa a 321 <210> 121 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 121 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctggatt ctcactccgc aatggtagaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt ttgcgagtga cgaaaaatct 180 tacagtacat ctcagaggac caggctctcc atctccaggg acacctccaa aagccaagtg 240 gtccttagca tgaccgacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcgcggatt 300 ttgaagtttg ggacaatgag ggccgcatac tactttgact actggggcca gggagccctg 360 gtccccgtct cctca 375 <210> 122 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 122 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gaatcaacat tggaattaga actgtacact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggccccta tgttggtcat ctattatgat agcgaccggc ccttagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaagtctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgatcatgt tgtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgc ccta 324 <210> 123 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 123 caggtgcact tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tttctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccggggaagg gactggagtg gctttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180 gcagactcta tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaggaa ctcactctat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggcctttt attactgtgc 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atctgaggac acggccatat attactgtgc gagagatctc 300 gttgtcgtag tccccgttga aatgtctcgg cgtgcctttg acatttgggg ccaagggatt 360 atggtcacag tctcctca 378 <210> 126 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 126 tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60 ccctgtgggg gcaacaacat tgaacgtaaa agtgtccact ggtaccagca gaggccaggc 120 caggcccctg tgttggtcgt ctatgatgat actgtccggc cctcaggtat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactccgg gagcacggcc accctgacca tcagcagggt cggagccggg 240 gatgagggcg actattattg tcaggtgtgg gacagcacca ctgaccatgg ggtcttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 127 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 127 cgggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgtcaga cttctggata cattttcagc gcctactaca tctattgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gatgggacgg atgaacgcta agagtggagg cgcaaacact 180 gcacagcagt ttcagggcag actcaccatg accagggaca tgtccgtcag 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sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 194 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Tyr Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Lys Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ile Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 195 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 195 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser 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sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 252 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Asn 85 90 95 Asn Asn Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 253 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 253 Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ser Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Asn Ile His Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 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peptide <400> 603 Gly Ala Ser 1 <210> 604 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 604 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 1 5 <210> 605 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 605 Gln Asp Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 606 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 606 Ala Ala Ser 1 <210> 607 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 607 Gln Gln Ala Asp Ser Phe Ile Thr 1 5 <210> 608 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 608 Gln Ser Ile Gly Asp Asn 1 5 <210> 609 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 609 Gly Ala Ser 1 <210> 610 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 610 Gln Gln Tyr Lys Asn Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 611 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 611 Gln Ser Val Arg Ser Ser Tyr 1 5 <210> 612 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 612 Gly Ala Ser 1 <210> 613 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 613 Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Ile Thr 1 5 <210> 614 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 614 Val Leu Ser Lys Gln Tyr 1 5 <210> 615 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 615 Lys Asp Thr 1 <210> 616 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 616 Gln Ser Ala Asp Thr Arg Ile Thr Val 1 5 <210> 617 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 617 Val Leu Ser Asn Gln Tyr 1 5 <210> 618 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 618 Lys Asp Thr 1 <210> 619 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 619 Gln Thr Ala Asp Thr Lys Tyr Thr Val 1 5 <210> 620 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 620 Gln Arg Ile Ser Thr Tyr 1 5 <210> 621 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 621 Ala Ala Ser 1 <210> 622 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 622 Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Trp Thr 1 5 <210> 623 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 623 Gln Ser Ile Lys Lys Tyr 1 5 <210> 624 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 624 Gly Ala Ser 1 <210> 625 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 625 Gln Gln Ser Asp Ser Ala Pro Pro Thr 1 5 <210> 626 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 626 Gln Ser Ile Arg Asp Tyr 1 5 <210> 627 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 627 Ala Gly Ser 1 <210> 628 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 628 Gln Gln Ser Tyr Leu Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 629 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 629 Asn Ile Gly Ile Arg Thr 1 5 <210> 630 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 630 Tyr Asp Ser 1 <210> 631 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 631 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val 1 5 10 <210> 632 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 632 Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 633 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 633 Glu Val Thr 1 <210> 634 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 634 Ser Ser Tyr Ala Gly Asn Asn Asn Leu Val 1 5 10 <210> 635 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 635 Asn Ile Glu Arg Lys Ser 1 5 <210> 636 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 636 Asp Asp Thr 1 <210> 637 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 637 Gln Val Trp Asp Ser Thr Thr Asp His Gly Val 1 5 10 <210> 638 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 638 Gln Ser Val Ser Gly Tyr 1 5 <210> 639 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 639 Asp Ala Ser 1 <210> 640 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 640 Gln Gln Arg Ser Asn Gly Leu Thr 1 5 <210> 641 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 641 cctccggccc ctgaat 16 <210> 642 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 642 ccattgaatc cctgggcctt 20

Claims (102)

  1. 엔테로바이러스 D68(EV-D68)에 감염된 대상체(subject)를 치료하거나 EV-D68에 감염될 위험이 있는 대상체의 감염 가능성을 감소시키는 방법으로서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍(clone-paired)의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍의 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화(encoding)되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같이 95% 동일성(identity)을 갖는 클론-쌍의 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성(identity)을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄(single chain) 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편이거나, 상기 항체가 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 이중특이성 항체(bispecific antibody)인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)시키고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된(engineered) 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)시키도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 요법, 예컨대, 항바이러스 요법 또는 항염증 요법으로 상기 대상체를 치료하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 감염 전 또는 감염 후에 투여되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 폐 감염 및/또는 신경계 감염을 치료하거나, 또는 치료가 폐 감염 및/또는 신경계 감염을 감소시키는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전달이 항체 또는 항체 단편의 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터에 의한 유전적 전달을 포함하는, 방법.
  14. 대상체에서 엔테로바이러스 D68(EV-D68) 감염을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체로부터의 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 샘플 중의 EV-D68 항원에 결합시킴으로써 상기 샘플 중의 EV-D68을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 샘플이 체액인, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 가래, 눈물, 타액, 점액 또는 혈청, 정액, 자궁경부 또는 질 분비물, 양수, 태반 조직, 소변, 삼출물, 누출물, 호흡기 비말 또는 에어로졸, 조직 스크래핑(tissue scraping) 또는 대변인, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출이 ELISA, RIA, 측방 유동 검정(lateral flow assay) 또는 웨스턴 블롯(western blot)을 포함하는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 2회 수행하고, 제1 검정과 비교하여 EV-D68 항원 수준의 변화를 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍의 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  20. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍의 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  21. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  22. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  24. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  26. 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 모노클로날 항체(monoclonal antibody).
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 모노클로날 항체.
  28. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 모노클로날 항체.
  29. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 모노클로날 항체.
  30. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  31. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 모노클로날 항체.
  33. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체이거나, 이중특이성 항체인, 모노클로날 항체.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)시키고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)시키도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 모노클로날 항체.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide)를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디(intrabody)인, 모노클로날 항체.
  36. 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하이브리도마 또는 조작된 세포로서, 상기 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  38. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  39. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 가변 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  40. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  41. 제36에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  42. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이성 항체인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  45. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)시키고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)시키도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  47. 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 백신 제형(vaccine formulation).
  48. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 백신 제형.
  49. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 백신 제형.
  50. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 대해 적어도 95% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 백신 제형.
  51. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 백신 제형.
  52. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 백신 제형.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편 중 적어도 하나가 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 백신 제형.
  54. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중 적어도 하나가 키메라 항체이거나 이중특이성 항체인, 백신 제형.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)시키고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)시키도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 백신 제형.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 세포 투과 펩타이드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디인, 백신 제형.
  57. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 1차 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 백신 제형.
  58. 제57항에 있어서, 상기 발현 벡터(들)가 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 VEE 벡터(들)인, 백신 제형.
  59. 제57항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 바늘 주사, 제트(jet) 주사 또는 전기천공에 의한 전달용으로 제형화된, 백신 제형.
  60. 제57항에 있어서, 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항의 별개의 항체 또는 항체 단편과 같은 2차 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함하는, 백신 제형.
  61. 엔테로바이러스 D68에 감염되었거나 이의 감염 위험이 있는 임신 중의 대상체의 태반 및/또는 태아의 건강을 보호하는 방법으로서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 것을 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같이 95% 동일성을 갖는 클론-쌍 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  64. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  67. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용을 변경(제거 또는 향상)시키고 반감기를 증가시키고/시키거나 치료 효능을 증가시키도록 돌연변이된 Fc 부분, 예컨대, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE, DHS 또는 LS 돌연변이를 포함하거나, 또는 FcR 상호작용, 예컨대, 글리칸의 효소적 또는 화학적 부가 또는 제거, 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주의 발현을 변경(제거 또는 향상)시키도록 변형된 글리칸을 포함하는 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  70. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이성 항체인, 방법.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 감염 전 또는 감염 후에 투여되는, 방법.
  72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 임신 중의 여성, 성적으로 활발한 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성인, 방법.
  73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 전달이 항체 또는 항체 단편의 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터에 의한 유전적 전달을 포함하는, 방법.
  74. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 미처리 대조군과 비교하여 태반의 크기를 증가시키는, 방법.
  75. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 미처리 대조군과 비교하여 태아의 바이러스 부하(viral load) 및/또는 병리를 감소시키는, 방법.
  76. 엔테로바이러스 D68 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 항원을 포함하는 샘플을, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 1차 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항원에 대한 상기 1차 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 샘플이 재조합적으로 생산된 항원을 포함하는, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 샘플이 백신 제형 또는 백신 생산 배치(batch)를 포함하는, 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계를 사용하는 바이오센서, 또는 유세포 분석 염색(flow cytometric staining)을 포함하는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  81. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  82. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  83. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  84. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  85. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  86. 제76항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  87. 제76항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 2회 수행하여, 시간 경과에 따른 항원의 항원 안정성을 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  88. 제76항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 상기 항원을 포함하는 샘플을, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 2차 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 항원에 대한 상기 2차 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 2차 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 2차 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 2차 항체 또는 항체 단편이 표 1에 기재된 바와 같은 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 암호화되는, 방법.
  92. 제89항에 있어서, 상기 2차 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 2차 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  94. 제89항에 있어서, 상기 2차 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  95. 제89항에 있어서, 상기 2차 항체 단편이 재조합 scFv(일본쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인, 방법.
  96. 제89항에 있어서, 단계 (c) 및 (d)를 2회 수행하여 시간 경과에 따른 항원의 항원 안정성을 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  97. 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포로서, 상기 항체가 적어도 2개의 바이러스 클레이드(viral clade)를 가로질러 EV-D68에 결합하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
  98. 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포로서, 상기 항체가 EV-D68 VP1, VP2 및 VP3에 결합하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
  99. 제98항에 있어서, 상기 항체가 EV-D68 VP1 DE 루프에 결합하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
  100. 제98항에 있어서, 상기 항체가 EV-D68 VP2 EE 루프에 결합하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
  101. 제98항에 있어서, 상기 항체가 EV-D68 VP3 N-말단 루프에 결합하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
  102. 제98항에 있어서, 상기 항체가 (a) EV-D68 VP3 N-말단 루프 및 EV-D68 VP2 EE 루프에 결합하거나, 또는 (b) EV-D68 VP2 EE 루프 및 EV-D68 VP1 DE 루프, 또는 (c) EV-D68 VP1 DE 루프 및 EV-D68 VP3 N-말단 루프, 또는 (d) EV-D68 VP3 N-말단 루프, EV-D68 VP1 DE 루프 및 EV-D68 VP2 EE 루프에 결합하는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 하이브리도마 또는 이를 생산하는 조작된 세포.
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