KR20220098003A - 한타바이러스에 대한 인간 모노클로날 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

한타바이러스에 대한 인간 모노클로날 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 한타바이러스에 결합하여 중화시키는 항체 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

한타바이러스에 대한 인간 모노클로날 항체 및 이의 사용 방법
우선권 주장
본 출원은 2019년 11월 11일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/933,755에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
정부 지원 조항
본 발명은 국립 보건원이 수여한 보조금 번호 T32GM008320-29 및 TR002243 하에서 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
1. 개시내용의 분야
본 개시내용은 일반적으로 의학, 감염 질환 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 개시내용은 한타바이러스에 결합하는 인간 항체에 관한 것이다.
2. 배경
한타바이러스는 분야비랄레스 목(the order Bunyavirales)의 구성원이며, 설치류에 의해 전염되는 전세계적으로 출현하는 병원체이다(Plyusnin et al., 1996). 한타바이러스는 전세계적으로 많은 지역에서 풍토병이며, 지리학 및 감염의 병인에 기초하여 두 그룹으로 분류된다. 안데스 바이러스(Andes virus; ANDV) 및 신 놈브레 바이러스(Sin Nombre virus; SNV)를 포함하는 신세계 한타바이러스(NWH)는 한타바이러스 심폐증후군(hantavirus cardiopulmonary syndrome; HCPS)을 유발하며, 치사율이 약 40%인 북미 및 남미에서 새로 출현하는 바이러스이다(Kruger et al., 2015; Morens and Fauci, 2020). 한타바이러스는 주로 에어로졸화된 설치류 대변의 흡입을 통해 확산되지만, 최근 ANDV 감염의 발생에는 인간-대-인간 전염 사례도 포함되었다(Alonso et al., 2020; Martinez et al., 2005). 한탄(Hantaan)(HTNV), 푸우말라(Puumala)(PUUV), 도브라바-베오그라드(Dobrava-Belgrade)(DOBV), 및 서울(Seoul)(SEOV)을 포함하는 구세계 한타바이러스(OWH)는 1 내지 15% 사망률로 신증후군을 동반한 출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome; HFRS)을 유발한다(Kruger et al., 2015). 현재 한타바이러스 감염(hantavirus infection)에 대한 FDA 승인 백신 또는 치료제는 없지만; 임상 시험은 직접 면역화 DNA 백신 또는 면역 혈청의 수동적 전달을 사용하여 시작되었다(Boudreau et al., 2012; Brocato et al., 2013; Custer et al., 2003; Hooper et al., 2014a; Hooper et al., 2001a; Hooper et al., 2008; Hooper et al., 2014b). ANDV 감염의 인간 생존자의 B 세포로부터 단리된 인간 모노클로날 항체(monoclonal antibody; mAb)는 치사성 질환의 동물 모델에서 치료 효능을 나타내었고, 면역화 마우스의 B 세포로부터 유래되는 뮤린 mAb도 유사한 모델에서 효능을 나타낸다(Duehr et al., 2020; Garrido et al., 2018). 마지막으로, 임상 연구는 인간에서 높은 역가의 혈청 중화 항체의 유도가 인간 NWH 감염 후 생존의 증가와 관련이 있음을 보여주었다(Bharadwaj et al., 2000). 따라서, NWH 감염에 대한 강력한 체액성 면역 반응은 생존 감염에 중요하지만, NWH 종에 대한 인간 중화 항체 반응의 분자 및 유전적 기초는 불량하게 특성화된다.
중화 항체는 엔벨로프화 당단백질 Gn 및 Gc로 구성된 이종사량체인 표면 당단백질 스파이크에 대해 유도된다(Huiskonen et al., 2010; Li et al., 2016; Serris et al., 2020). Gn은 스파이크의 원위 말단에서 정사각형 복합체를 형성하고, 바이러스 부착 및 융합 제어에 역할을 할 것으로 제안된다(Serris et al., 2020). Gc는 후기 엔도솜에서 낮은 pH 조간하에 형태를 변화시키고 바이러스 및 숙주 막의 융합을 유도하는 부류 II 융합 단백질이다(Allen et al., 2018; Guardado-Calvo et al., 2016; Willensky et al., 2016). B 세포 에피토프는 펩티드 스캐닝을 통해 Gn 및 Gc에 맵핑되지만, 어느 에피토프가 면역 우세하거나 억제 활성이 있는 항체에 의한 인식에 상응하는지는 현재 공지되지 않았다(Arikawa et al., 1989; Engdahl and Crowe, 2020; Heiskanenetal., 1999; Koch et al., 2003).
광범위한 중화 항체(bnAb)는 코로나바이러스(Wec et al., 2020), 알파바이러스(Fox et al., 2015; Powell et al., 2020b), 인플루엔자 바이러스(Bangaru et al., 2019; Corti et al., 2011) 및 에볼라바이러스(Flyak et al., 2018; Wec et al., 2016)를 포함한 다수의 바이러스 계열에 대해 특성화되었다. 그러나, 한타바이러스 감염에 대한 교차 중화 면역을 특징으로 하는 연구는 거의 없다(Bharadwaj et al., 2000; Chu et al., 1995; Li et al., 2016; Lundkvist et al., 1997; Tischler et al., 2005). HFRS 환자 혈청의 혈청학적 연구는 적어도 2종의 OWH에 대해 중간 정도의 중화 활성을 입증한 반면, 대부분의 HCPS 환자 혈청은 다양한 OWH 및 NWH 종에 대한 중화 활성을 나타냈다(Chu et al., 1995; Lundkvist et al., 1997). 상이한 한타바이러스 종의 M 세그먼트 (Gn/Gc 단백질 인코딩(encoding)) 유전자의 후보 DNA 백신에 대한 이전의 연구는 보호에서 표면 당단백질에 대한 체액성 면역 반응의 중요성을 입증했다(Hooper et al., 2014b). 교차 반응성 및 교차 보호는 동물에서의 실험적 DNA 백신 접종의 설정에서 평가되었지만, 지금까지 시험된 작제물은 광범위하게 교차 반응성 중화 항체 반응을 유도하지 않는다(Boudreau et al., 2012; Brocato et al., 2013; Custer et al., 2003; Hooper et al., 2001a; Hooper et al., 2014b). 또한, 뮤린 mAb는 다른 OWH 종에 대한 교차 반응성 결합을 나타내는 HTNV Gc 단백질에 대해 생성되었지만, 교차 중화 활성을 보유하지 않았다(Arikawa et al., 1989; Wang et al., 1993). SNV에 대한 인간 mAb의 연구는 지금까지 공개되지 않았으며, 한타바이러스 감염에 대한 교차 중화 체액성 면역 반응에 대한 정보는 여전히 거의 없다.
한타바이러스는 매우 치명적이며, 한타바이러스의 유형에 따라 사망률이 40%에 접근할 수 있다. 불행히도, 이용 가능한 FDA 또는 WHO 승인 백신은 없다. 따라서, 백신 및 개선된 요법의 개발이 매우 중요하다.
요약
따라서, 본 개시내용에 따라서, 대상체(subject)에서 한타바이러스 감염을 검출하는 방법은 (a) 상기 대상체로부터의 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍(clone-paired)을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 샘플 중의 한타바이러스 항원에 결합시킴으로써 상기 샘플 중의 한타바이러스를 검출하는 단계를 포함한다. 샘플은 체액, 예를 들어, 혈액, 객담, 눈물, 타액, 점액 또는 혈청, 정액, 자궁 경부 또는 질 분비물, 양수, 태반 조직, 소변, 삼출물, 삼출액, 조직 긁힘(tissue scraping) 또는 대변일 수 있다. 검출은 ELISA, RIA, 측방 유동 검정(lateral flow assay), 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함할 수 있다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계 및 제1 검정과 비교하여 한타바이러스 항원 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성(identity)을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합(recombinant) scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 한타바이러스에 감염된 대상체를 치료하거나 한타바이러스에 감염될 위험이 있는 대상체의 감염 가능성을 감소시키는 방법으로서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적(bispecific) 항체일 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 감염 전 또는 감염 후에 투여될 수 있다. 대상체는임신한 여성, 성적으로 활동적인 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성일 수 있다. 전달은 항체 또는 항체 단편 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터(vector)에 의한 유전자 전달(genetic delivery)을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 상기 항체 또는 항체 단편으로 치료되지 않은 환자 집단과 비교하여 환자 집단의 사망률을 감소시킬 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 상기 항체 또는 항체 단편으로 치료되지 않은 대상체와 비교하여 대상체에서 한타바이러스 감염의 증상을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 모노클로날 항체가 제공되며, 여기서 항체 또는 항체 단편은 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 한다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나 인트라바디(intrabody)이다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하이브리도마 또는 조작된 세포가 제공되며, 여기서 항체 또는 항체 단편은 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 한다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나 인트라바디이다.
추가 구현예는 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 백신 제형(vaccine formulation)을 포함한다. 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나는 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다.
백신 제형은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인 적어도 하나의 항체 단편을 포함할 수 있다. 백신 제형은 키메라 항체이거나 이중특이적 항체인 적어도 하나의 항체를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편은 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나 인트라바디이다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제1 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 백신 제형이 제공된다. 발현 벡터(들)는 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 VEE 벡터(들)일 수 있다. 백신 제형은 바늘 주사, 제트 주사, 또는 전기천공에 의한 전달용으로 제형화될 수 있다. 백신 제형은 본원에 기재된 별개의 항체 또는 항체 단편과 같은 제2 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
한타바이러스에 감염되거나 감염 위험이 있는 임신 대상체의 태반 및/또는 태아의 건강을 보호하는 방법으로서, 상기 대상체에게 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 전달하는 단계를 포함하는, 방법이 또한 제공된다. 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 항체는 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 키메라 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함할 수 있고/있거나 인트라바디이다.
항체 또는 항체 단편은 감염 전 또는 감염 후에 투여될 수 있다. 대상체는 임신한 여성, 성적으로 활동적인 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성일 수 있다. 전달은 항체 또는 항체 단편 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터에 의한 유전적 전달을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 태반의 크기를 증가시킬 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 태아의 바이러스 부하(viral load) 및/또는 병리를 감소시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, (a) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제1 항체 또는 항체 단편과 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 항원에 대한 상기 제1 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 한타바이러스 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 방법이 제공된다. 샘플은 재조합적으로 생성된 항원 또는 백신 제형 또는 백신 생산 뱃치(batch)를 포함할 수 있다. 검출은 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭 측정법을 사용하는 바이오센서, 또는 유세포 계측 염색(flow cytometric staining)을 포함할 수 있다. 제1 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 제1 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 또는 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 제1 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하여 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 (c) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제2 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 항원에 대한 상기 제2 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제2 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해, 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해, 또는 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 제2 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있고, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있거나, 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 제2 항체 단편은 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 상기 방법은 단계 (c) 및 (d)를 두 번째로 수행하여 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 이를 생성하는 하이브리도마 또는 조작된 세포, 또는 한타바이러스 요법에서 이를 사용하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 항체는 한타바이러스 바이러스 융합 단백질(Gc)에 결합하고 시 놈브레 바이러스(SNV), 안데스 바이러스(ANDV), 푸우말라 바이러스(PUUV), 한탄 바이러스(HNTV), 서울 바이러스(SEOV), 도브라바 바이러스(DOB)를 중화시킨다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "1개"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다. 단어 "약"은 명시된 수의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.
본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시내용의 특정 구현예를 나타내면서, 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다.
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-c. 이전에 SNV 또는 ANDV로 감염된 개체로부터 단리된 NWH- 반응성 mAb 는 다양한 패턴의 중화 효능, 교차 반응성 및 중화 메커니즘을 나타낸다. 의사유형화 VSV 입자(pVSV/SNV 또는 pVSV/ANDV), SNV 균주 SN77734(wt SNV), 또는 ANDV 균주 Chile-9717869(wt ANDV)에 대한 SNV 반응성 mAb(도 1a) 또는 ANDV 반응성 mAb(도 1b)의 중화 효능. 농도가 감소하는 희석 시리즈의 항체를 pVSV 또는 진본 바이러스와 함께 배양하고, 현탁액을 사용하여 세포를 접종한 다음, GFP+ 세포 또는 병소를 계수하여 상대적 감염성을 결정하였다. IC50 또는 IC90 값은 Prism 소프트웨어 버전 7(GraphPad Software)을 사용하여 곡선의 상단을 100으로 제한하고, 곡선의 하단을 0으로 제한하는 비선형 적합 분석을 사용하여 수득되었다. 색상은 항체의 상대적 효능을 나타낸다. 표시된 데이터는 2 내지 3개의 독립 실험의 평균값이다. 각각의 한타바이러스 종에 대한 단백질에 대한 결합은 유세포 계측 분석에 의해 결정되었다. Gn 및 Gc는 포유류 세포의 표면에 나타내고, 감소하는 농도의 mAb와 함께 배양했다. EC50 결합 값은 Prism 소프트웨어를 사용하여 곡선의 하단을 0으로 제한하는 비선형 적합 분석을 사용하여 수득되었다. %PE 양성 세포의 값은 2차 항체로만 염색된 세포 상에 게이팅함으로써 결정되었다. 색상은 항체의 상대적 효능을 나타낸다. >는 중화 또는 반응성이 시험된 최고 농도인 20μg/mL에서 검출되지 않았음을 나타낸다. NT는 mAb가 시험되지 않았음을 나타낸다. 표시된 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균값이다. PCDH-1 차단(%)은 유세포 계측 검정을 통해 결정되었으며, 여기서 mAb는 Alexa Fluor 647 염료로 표지된 가용성 PCDH-1 도메인, sEC1을 첨가하기 전에 포화 농도로 첨가되었다. PCDH-1 차단은 경쟁하지 않는 결합의 50% 미만으로 최대 결합 점수의 감소에 의해 정의되었다(녹색 상자). 표시된 데이터는 3개의 독립 실험의 평균값이다. 융합 지수(%)는 SNV 또는 ANDV Gn/Gc를 인코딩하는 cDNA로 형질감염된 베로(Vero) 세포에 mAb를 첨가한 다음, 낮은 pH 배지에의 노출을 통해 융합을 유도하고 형광 현미경으로 다핵 세포의 %를 계수함으로써 결정되었다. 이어서, mAb 처리된 샘플에서의 다핵 세포의 %를 비-mAb 처리된 샘플에서의 다핵 세포의 %로 나누었다(최대 융합 지수를 나타냄). 융합 억제성 mAb는 비-mAb 처리된 세포의 50% 미만으로 최대 융합 지수의 감소로 정의되었다(노란색 상자). 표시된 데이터는 3개의 독립 실험의 평균값이다. (도 1c) wt SNV(왼쪽) 또는 wt ANDV(오른쪽)의 완전한(상단) 또는 불완전한(하단) 중화를 매개하는 중화 항체의 대표적인 결합 곡선. 점선은 10% 또는 50% 상대적 감염성을 나타낸다. 표시된 데이터는 기술 복제에 대한 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 2 내지 3회 독립적으로 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다.
도 2a-c. NWH- 반응성 mAb는 OWH 종에 대한 결합 및 중화 활성을 나타낸다. (도 2a) SNV 면역 인간 개체로부터 단리된 mAb의 4개의 OWH 종, 푸우말라(PUUV), 도브라바-베오그라드(DOBV), 한탄(HTNV) 및 서울(SEOV)에 대한 결합 및 중화 효능. (도 2b) ANDV 면역 인간 개체로부터 단리된 mAb의 4개의 병원성 OWH 종에 대한 결합 및 중화 효능. 중화 활성은 PUUV(pVSV/PUUV), DOBV(pVSV/DOBV), HTNV(pVSV/HTNV) 및 SEOV(pVSV/SEOV)로부터의 당단백질을 보유하는 pVSV를 사용하여 이전에 기재된 의사 바이러스 중화 검정을 통해 결정되었다. 결합은 이전에 기재된 바와 같이 유세포 계측법 기반 결합 검정을 통해 결정되었다. IC50 값은 Prism 소프트웨어 버전 7(GraphPad Software)을 사용하여 곡선 상단을 100으로 제한하고 곡선 하단을 0으로 제한하는 비선형 적합 분석을 사용하여 수득되었다. EC50 결합 값은 Prism 소프트웨어를 사용하여 곡선의 하단을 0으로 제한하는 비선형 적합 분석을 사용하여 수득되었다. 데이터는 3개의 독립 실험의 평균값으로 표시된다. 색상은 항체의 상대적 효능을 보여준다. >는 20μg/m보다 높은 농도에서 검출 가능한 중화 또는 반응성이 없음을 나타낸다. (도 2c) 4개의 bnAb, SNV-24, SNV-53, SNV-57 및 SNV-68로부터의 대표적인 중화 곡선. 표시된 데이터는 기술 복제의 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 3회 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다.
도 3. NWH 반응성 항체는 경쟁 결합 분석에 기초하여 적어도 8개의 주요 항원 부위에 결합한다. 비표지된 항체는 포화 농도에서 ANDV Gn/Gc를 인코딩하는 cDNA로 형질감염된 Expi293F 세포와 배양한 다음, Alexa Fluor 647로 표지된 제2 항체와 경쟁하였다. 경쟁 퍼센트는 제2 mAb의 비경쟁 결합과 비교하여 유세포 계측법을 통해 분석 및 정량화되었다. 경쟁 항체는 표지되지 않은 제1 항체의 존재하에서 33% 미만의 최대 비경쟁 결합을 갖는 것들로 정의되었다(흑색). 비경쟁 항체는 66% 초과의 최대 비경쟁 결합을 갖는 것들로 정의되었다(흰색). 중간 경쟁 항체는 33 내지 66%의 최대 비경쟁 결합을 갖는 것들로서 정의되었다(회색). 항체는 ANDV 및 SNV에 대한 중화 효능에 기초하여 착색된다. 항체는 정규화된 경쟁 값에 기초하여 피어슨 상관관계 생성 관련성 점수에 기초하여 클러스터링되었다. 값은 3개의 독립 실험으로부터의 평균이다.
도 4a-c. NWH mAb는 ANDV 챌린지(challenge)에서 시리아 햄스터를 보호한다. (도 4a) 8 주령 시리아 햄스터(n = 6/치료 그룹)는 200PFU의 ANDV i.m.으로 접종하고, 5mg/kg의 지시된 mAb를 3 및 8dpi에서 i.p.로 투여하였다. 동물을 아이소타입 대조군으로 작용하기 위해 뎅기열 특이적 mAb(rDENV 2D22)로 처리하였다. 통계 분석은 각 그룹을 대조군(rDENV 2D22)과 비교하는 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 수행하였다: *p < 0.01, **p < 0.01, ***p < 0.001, ns= 유의하지 않다. (도 4b) 각 치료 그룹에 대해 평균된 체중 측정치. (도 4c) 안락사시 폐 및 간이 수집되고 조직에서 바이러스 역가를 결정하는 데 사용되었다. 검은색 테두리가 있는 점은 연구 종료 전에 IACUC 프로토콜에 따라 사망하거나 안락사된 것으로 밝혀진 동물을 나타낸다.
도 5, 도 1a-c와 관련됨. ANDV 또는 SNV Gn 및 Gc로 형질감염된 Expi293F 세포에 대한 모든 신세계 반응성 mAb에 대한 대표적인 결합 곡선. 표시된 데이터는 기술 복제의 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 3회 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다. 각 mAb에 대해 도 1a-c에 표시된 EC50 값은 모두 3개의 실험의 EC50 값의 평균이다.
도 6, 도 1a-c와 관련됨. ANDV 또는 SNV Gn 및 Gc로 의사유형화된 VSV에 대한 모든 신세계 반응성 mAb의 대표적인 중화 곡선. 표시된 데이터는 기술 복제의 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 3회 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다. 각 mAb에 대해 도 1a-c에 표시된 IC50 값은 모두 3개의 실험의 IC50 값의 평균이다.
도 7a-b, 도 1a-c와 관련됨. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 상에서 적정된 pVSV / SNV 또는 pVSV / ANDV에 대한 SNV- 반응성 mAb 중화 활성. ( 도 7a) pVSV 중화 검정은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었고, IC50 값은 비선형 회귀에 의해 생성되었다. 값은 효능에 따라 착색되었다. (도 7b) SNV 반응성 항체의 대표적인 결합 곡선. 표시된 데이터는 기술 복제의 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 3회 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다.
도 8a-b, 도 1a-c와 관련됨. 신세계 mAb에 의한 융합 억제 활성. 신세계 한타바이러스 mAb의 융합 지수를 계산하는 데 사용되는 대표적인 형광 현미경 이미지. SNV(도 8a) 또는 ANDV(도 8b) M 세그먼트로 형질감염된 베로 세포는 낮은 pH 처리 전에 SNV(도 8a) 또는 ANDV(도 8b) mAb와 함께 배양했다. 핵은 DAPI(청색 형광)로 표지되었고, Gn/Gc는 인간 한타바이러스 mAb(SNV-27, SNV-56 및 ANDV-44)와 항-인간 IgG Alexa Fluor 568(적색 형광)의 조합으로 검출되었다. 노란색 화살표는 다핵 세포를 나타낸다. 흰색 스케일 바는 100μm를 나타낸다.
도 9, 도 2a-c와 관련됨. PUUV , DOBV , HTNV , 또는 SEOV Gn 및 Gc로 형질감염된 Expi293F 세포에 대한 모든 신세계 반응성 mAb의 대표적인 결합 곡선. 표시된 데이터는 기술 복제의 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 3회 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다. 각 mAb에 대해 도 2a-c에 표시된 EC50 값은 모두 3개의 실험의 EC50 값의 평균이다.
도 10, 도 2a-c와 관련됨. PUUV , DOBV , HTNV , 또는 SEOV로부터의 Gn 및 Gc로 의사유형화된 VSV에 대한 모든 신세계 반응성 mAb의 대표적인 중화 곡선. 표시된 데이터는 기술 복제의 평균값 ± S.D이다. 실험은 유사한 결과로 독립적으로 3회 수행되었고; 하나의 실험이 표시된다. 각 mAb에 대해 도 2a-c에 표시된 IC50 값은 모두 3개의 실험의 IC50 값의 평균이다. VSV-G로 의사유형화된 VSV는 대조군으로 사용되었다.
도 11, 도 3과 관련됨. SNV- 반응성 항체는 경쟁-결합 분석에 기초하여, 적어도 4개의 주요 항원 부위에 결합한다. 비표지된 항체는 SNV Gn/Gc 단백질을 인코딩하는 cDNA로 형질감염된 Expi293F 세포와 함께 포화 농도에서 배양된 후, Alexa Fluor 647로 표지된 제2 항체를 적용하였다. 제2 mAb의 결합 퍼센트는 그 mAb의 경쟁하지 않는 결합과 비교하여 유세포 계측법을 통해 분석 및 정량화되었다. 경쟁의 존재는 표지되지 않은 제1 항체의 존재하에서 최대 비경쟁 결합의 33% 미만으로 정의되었다(흑색). 비경쟁 항체는 최대 비경쟁 결합의 66% 초과를 갖는 것들로 정의되었다(흰색). 중간 경쟁은 최대 비경쟁 결합(회색)의 33 내지 66%를 갖는 것들로 정의되었다(회색). 항체는 정규화된 경쟁 값에 기초하여 피어슨 상관관계 생성 관련성 점수에 기초하여 클러스터링되었다. 값은 3개의 독립 실험으로부터의 평균이다.
도 12, 도 4a-c와 관련됨. mAb로 처리된 동물의 폐 병리학 점수. 폐는 사망 또는 안락사시 채점되었다.
도 13. mAb 기능 및 범위의 요약 표.
상기 논의된 바와 같이, 한타바이러스 감염은 높은 비율의 희생자에게 치명적일 수 있으므로 백신과 개선된 요법에 대한 필요성이 긴급한 의료 요구가 된다. 여기서, 본 발명자들은 광범위하게 중화되는 인간 모노클로날 항체의 개발 및 한타바이러스 감염을 예방 및 치료하는 데 있어서 그들의 용도를 보고한다.
본 개시내용의 이들 및 다른 측면은 이하 상세히 기재된다.
I. 한타바이러스
오르토한타바이러스 또는 한타바이러스는 분야비랄레스 목(the order Bunyavirales)의 한타바리대 과(the family Hantaviridae)의 단일 가닥 엔벨로프화, 네가티브 센스 RNA 바이러스이다. 이러한 바이러스는 일반적으로 설치류를 감염시키지만 그들에서 질환을 일으키지 않는다. 인간은 설치류의 소변, 타액 또는 대변과의 접촉을 통해 한타바이러스에 감염될 수 있다. 일부 균주는 인간에게 강력하게 치명적인 질환, 예를 들어, 신증후군 동반 한타바이러스 출혈열(hantavirus hemorrhagic fever with renal syndrome; HFRS), 한타바이러스 심폐 증후군(hantavirus cardiopulmonary syndrome; HCPS)으로서 공지되기도 한 한타바이러스 폐 증후군(hantavirus pulmonary syndrome; HPS)을 일으키는 반면, 다른 균주는 공지된 인간 질환과 관련되지 않는다. HPS(HCPS)는 "한타바이러스 입자로 오염된 에어로졸화된 설치류의 배설물(소변 및 대변)의 흡입과 관련된 희귀 호흡기 질병"이다.
한타바이러스의 인간 감염은 거의 전적으로 설치류의 배설물과의 인간 접촉과 관련이 있지만; 2005년 및 2019년에 남아메리카에서 안데스 바이러스의 인간 대 인간 전염이 보고되었다.
한타바이러스는 한국 전쟁 중 초기 발병이 관찰된 한국의 한탄강 지역의 이름을 따서 명명되었다. 이 바이러스는 1976년 이호왕(Ho-Wang Lee)에 의해 단리되었다.
신증후군 동반 출혈열(HFRS)은 한타비리대 과의 한타바이러스 종에 의해 유발되는 임상적으로 유사한 질병의 그룹이다. 한국 출혈열(Korean hemorrhagic fever), 유행성 출혈열(epidemic hemorrhagic fever), 유행성 신증(nephropathia epidemica)으로도 공지되어 있다. HFRS를 일으키는 종은 한탄, 도브라바-베오그라드, 사레마아, 서울 및 푸우말라를 포함한다. 그것은 유럽, 아시아 및 아프리카에서 발견된다. 한타바이러스 유도 출혈열에서 잠복 기간은 증상이 발병되기 전 인간에서 2 내지 4주이다. 그들의 중증도는 바이러스 부하에 달려 있다.
한타바이러스 폐 증후군(HPS)은 북아메리카, 중앙 아메리카 및 남아메리카에서 발견된다. 그것은 종종 치명적인 폐 질환이다. 미국에서, 원인 제제는 사슴 마우스에 의해 운반되는 신 놈브레 바이러스이다. 전구 증상은 발열(fever), 기침(cough), 근육통(muscle pain), 두통(headache) 및 무기력(lethargy)과 같은 독감 유사 증상을 포함한다. 그것은 기계적 호흡 및 강력한 이뇨제의 개입에도 불구하고 종종 치명적인 급속하게 진화하는 폐 부종(pulmonary edema)을 동반하는 갑작스런 호흡 곤란 발병을 특징으로 한다. 사망률은 36%이다.
한타바이러스 폐 증후군은 미국 남서부의 포 코너스 지역에서 1993년 발병 동안 최초로 인식되었다. 그것은 브루스 템페스트 박사(Dr. Bruce Tempest)에 의해 확인되었다. 원래는 '포 코너스병(Four Corners disease)'이라고 불렸지만, "포 코너스"라는 명칭이 지역을 낙인 찍었다는 아메리카 원주민의 불만 이후 명칭이 "신 놈브레 바이러스"로 변경되었다. 그 이후로 미국 전체에서 확인되었다. 집 안팎의 설치류 통제는 주요 예방 전략으로 남아 있다.
한타바이러스는 분야바이러스이다. 분야비랄레스 목은 12개의 과로 나뉜다. 이 목의 모든 구성원과 마찬가지로, 한타바이러스는 3개의 네가티브-센스, 단일 가닥 RNA 세그먼트를 포함하는 게놈을 가지고 있기 때문에, 네가티브 센스 RNA 바이러스로 분류된다. 다른 분야바이러스 과의 구성원은 일반적으로 절지동물 매개 바이러스이지만[11], 한타바이러스는 주로 에어로졸화된 설치류 배설물의 흡입 또는 설치류 물림을 통해 인간에게 전염되는 것으로 생각된다.
분야비랄레스의 다른 구성원과 마찬가지로, 오르토한타바이러스는 S(소), M(중) 및 L(대)로 지정된 3개의 단일 가닥 네가티브-센스 RNA 세그먼트로 구성된 게놈을 갖는 엔벨로프화 바이러스이다. S RNA는 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 인코딩한다. M RNA는 공동번역적으로 절단되어 엔벨로프 당단백질 Gn(이전 G1) 및 Gc(이전 G2)를 산출하는 폴리단백질을 인코딩한다.
L RNA는 바이러스 전사효소/복제효소로서 기능하는 L 단백질을 인코딩한다. 비리온 내에서, 한타바이러스의 게놈 RNA는 N 단백질과 복합체를 형성하여 나선형 뉴클레오캡시드를 형성하는 것으로 생각되며, 이의 RNA 성분은 게놈 세그먼트의 5 ' 말단 서열과 3' 말단 서열 사이의 서열 상보성으로 인해 원형화된다.
다른 분야비랄레스와 마찬가지로, 3개의 세그먼트 각각은 컨센서스 3'-말단 뉴클레오티드 서열(AUCAUCAUC)을 갖고, 이는 5'-말단 서열에 상보적이며, 과 내의 다른 4개의 속과는 다르다. 이들 서열은 바이러스 뉴클레오캡시드(N) 단백질과의 결합에 의해 촉진되는 복제 및 캡시드화에서 역할을 할 것으로 보이는 범핸들 구조를 형성하는 것으로 보인다. 큰 세그먼트의 길이는 6530-6550 뉴클레오티드(nt)이고, 중간 세그먼트의 길이는 3613-3707nt이며, 작은 세그먼트의 길이는 1696-2083nt이다.
이 과의 다른 속과는 달리, 비구조 단백질은 공지되지 않았다. 각 세그먼트의 5' 및 3'에는 짧은 비코딩 서열이 있다: 5' 말단의 모든 서열의 비코딩 세그먼트는 37-51nt이다. 3' 비코딩 영역은 다르다: L 세그먼트 38-43nt; M 세그먼트 168-229nt; 및 S 세그먼트 370-730nt. S 세그먼트의 3' 말단은 속 사이에 보존되어 기능적인 역할을 시사한다.
한타바이러스 비리온의 직경은 약 120~160나노미터(nm)이다. 바이러스 엔벨로프의 지질 이중층은 약 5nm 두께이고, 당 잔기가 부착된 바이러스 표면 단백질이 매립되어 있다. Gn 및 Gc로 공지된 이러한 당단백질은 바이러스 게놈의 M 세그먼트에 의해 인코딩된다. 그들은 서로 결합(이종이량체화)하는 경향이 있으며, 내부 꼬리와 엔벨로프 표면을 넘어 약 6nm까지 연장되는 외부 도메인을 모두 갖는다.
엔벨로프 안에는 뉴클레오캡시드가 있다. 이들은 바이러스 게놈의 3개의 세그먼트와 상호작용하여 나선 구조를 형성하는 뉴클레오캡시드 단백질 N의 많은 카피로 구성된다. 바이러스로 인코딩된 RNA 폴리머라제도 또한 내부에서 발견된다. 질량 기준으로, 비리온은 50% 초과의 단백질, 20 내지 30%의 지질 및 2 내지 7%의 탄수화물이다. 비리온의 밀도는 입방 센티미터당 1.18그램이다. 이러한 특징은 한타비리대 과의 모든 구성원에게 공통적이다.
숙주 세포로의 진입은 비리온의 세포 수용체에의 부착 및 후속적 엔도사이토시스에 의해 발생하는 것으로 생각된다. 뉴클레오캡시드는 비리온과 엔도솜 막의 pH 의존성 융합에 의해 세포질에 도입된다. 뉴클레오캡시드가 세포질로 방출된 후, 복합체는 미세관 관련 이동을 통해 ER-골지 중간체 구획(ERGIC)으로 표적화되어 ERGIC에서 바이러스 팩토리를 형성한다.
이어서, 이러한 팩토리는 바이러스 단백질의 전사 및 후속 번역을 촉진한다. 바이러스 유전자의 전사는 L 단백질과 3개의 뉴클레오캡시드 종의 결합에 의해 개시되어야 한다. 전사효소 및 복제효소 기능 외에도, 바이러스 L 단백질은 또한 바이러스 mRNA의 전사를 개시하는 데 사용되는 캡핑된 프라이머의 생산을 위해 세포 메신저 RNA(mRNA)를 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 것으로 생각된다. 이러한 캡 스내칭의 결과로서, 한타바이러스의 mRNA는 캡핑되고 주형화되지 않은 5' 말단 연장을 함유한다.
G1(또는 Gn) 및 G2(Gc) 당단백질은 헤테로-올리고머를 형성한 다음, 소포체로부터 골지 복합체로 운반되고, 여기서 글리코실화가 완료된다. L 단백질은 포지티브-센스 RNA 중간체를 통한 복제에 의해 초기 게놈을 생성한다. 한타바이러스 비리온은 골지의 막에 매립된 당단백질과 뉴클레오캡시드의 결합에 이어, 골지 시스터네로 싹트기 시작함으로써 조립되는 것으로 생각된다. 이어서, 초기 비리온은 분비 소포에서 원형질막으로 운반되고 엑소사이토시스에 의해 방출된다.
한타바이러스 감염의 병인은 그것을 설명하는 동물 모델이 부족하기 때문에 명확하지 않다(래트 및 마우스는 심각한 질환을 앓을 것으로 보이지 않는다). 신체에서 바이러스 복제의 주요 부위는 공지되지 않았지만, HFRS에서 주요 효과는 혈관에 있는 반면, HPS에서는 대부분의 증상이 폐와 관련이 있다. HFRS에서는, 내피 기능 장애로 인해 혈관 투과성이 증가하고 혈압이 감소되며, 가장 극적인 손상은 신장에서 나타나는 반면, HPS에서는 폐, 비장 및 담낭이 가장 영향을 받는다. HPS의 초기 증상은 독감(근육통, 발열 및 피로)과 유사하게 나타나는 경향이 있고, 일반적으로 노출 후 약 2 내지 3주에 나타난다. 질환의 후기 단계(증상이 시작된 후 약 4 내지 10일 후)에는 호흡 곤란(difficulty breathing), 호흡 곤란(shortness of breath) 및 기침(coughing)이 포함된다.
한타바이러스 출혈열을 유발하는 바이러스는 안데스 바이러스를 제외하고는 사람에서 사람으로 전염되는 것으로 나타나지 않았다. 다른 유형의 한타바이러스의 경우, 에어로졸화된 설치류 배설물 또는 설치류 물림은 유일하게 공지된 인간에의 전염 경로이다. 마르부르크 및 에볼라 출혈열과 같은 유사한 네가티브 가닥 RNA 바이러스는 감염된 혈액 및 체액과의 접촉에 의해 전염될 수 있으며, 아프리카 병원의 의료 종사자에게 확산되는 것으로 공지되어 있지만, 적절한 예방 조치를 한 현대 병원 환경에서는 쉽게 전염되지 않는다. 매개물(감염에 노출된 무생물)을 통한 전염은 출혈성 또는 폐 형태의 한타바이러스 질환에서는 입증되지 않았다.
CDC에 따르면, 한타바이러스 감염에 대한 최선의 예방은 가정, 직장 또는 캠프장에서 설치류와의 접촉을 제거하거나 최소화하는 것이다. 바이러스는 설치류의 타액, 배설물 및 물림에 의해 전염될 수 있기 때문에, 인간이 자주 방문하는 지역에서 래트 및 마우스의 통제는 질환 예방의 핵심이다. 일반적인 예방은 설치류 둥지를 처분하고, 마우스 및 래트가 침입할 수 있는 집의 임의의 균열과 구멍을 봉인하고, 함정을 설치하거나, 독약을 내려 놓거나, 집에서 고양이와 같은 자연 포식자를 사용하여 달성될 수 있다.
한타바이러스가 환경에서 감염성으로 남아 있는 기간은 설치류의 식이, 온도, 습도, 실내 또는 실외와 같은 요인에 따라 달라진다. 바이러스는 정상 실온에서 2 내지 3일 동안 활성으로 잔류하는 것으로 입증되었지만, 직사광선의 자외선은 몇 시간 이내에 그들을 죽인다. 그러나, 불확실한 나이의 설치류 배설물 또는 소변은 항상 감염성으로 처리되어야 한다.
중국과 한국에는 승인된 백신이 있지만, 한타바이러스에 대한 FDA 승인된 시판 백신은 없다. 한타박스(Hantavax)로 공지된 백신은 1990년부터 연구 중이다. 현재, 개발은 임상 3상 시험 단계에 있었다. 이 불활성화 백신은 푸우말라(PUUV) 바이러스와 같은 유럽 한타바이러스에 대해 효과적이지 않은 것으로 여겨진다. 사멸된 바이러스 백신은 높은 봉쇄하에서의 대량 생산과 관련된 위험과 백신의 효율성에 대한 미해결 문제 때문에 추구되지 않고 있다. 많은 실험실이 DNA 벡터 또는 재조합 단백질에 의해 바이러스 항원을 전달하는 백신을 개발해 왔다. WHO가 승인한 백신은 널리 받아들여지지 않았지만, 한국군은 한타바이러스 백신의 최대 소비자 중 하나이며, 공중 보건 센터에 이어 두 번째이다.
리바비린은 HPS와 HFRS의 약물일 수 있지만, 그의 효과는 공지되지 않았지만, 여전히 자발적인 회복은 지원 치료로 가능하다. 한타바이러스 감염이 의심되는 사람은 심각한 호흡 곤란을 동반하는 급성 폐 단계 동안 호흡할 수 있도록 돕기 위해 제공된 산소와 기계적 호흡 지원을 통해 병원에 입원할 수 있다. 한타바이러스의 급성기 동안 면역요법, 인간 중화 항체의 투여는 마우스, 햄스터 및 래트에서만 연구되었다. 통제된 임상 시험에 대한 보고는 없다.
한타바이러스 감염은 호주를 제외한 모든 대륙에서 보고되었다. 신증후군 동반 출혈열에 의해 특히 영향을 받는 지역에는 중국, 한반도, 러시아(한탄, 푸우말라, 및 서울 바이러스), 및 북유럽과 서유럽(푸우말라 및 도브라바 바이러스)이 있다. 한타바이러스 폐 증후군의 발생률이 가장 높은 지역에는 아르헨티나, 칠레, 브라질, 미국, 캐나다 및 파나마가 포함된다.
2010년에, 신증후군 동반 출혈열을 유발하는 새로운 한타바이러스인 상가수 바이러스(Sangassou virus)가 아프리카에서 단리되었다.
중국, 홍콩, 한반도 및 러시아에서, 신증후군 동반 출혈열은 한탄, 푸우말라 및 서울 바이러스에 의해 유발된다.
유럽에서, 2개의 한타바이러스- 푸우말라 및 도브라바-베오그라드 바이러스-가 신증후군 동반 출혈열을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 푸우말라는 전형적으로 발열, 두통, 위장 증상, 신장 기능 장애 및 시력 저하로 나타나는 일반적으로 경미한 질환- 유행성 신증-을 일반적으로 일으킨다. 도브라바 감염은 종종 출혈성 합병증을 동반한다는 점을 제외하고는 유사하다.
푸우말라 바이러스는 설치류 숙주인 뱅크 들쥐(클레트리오노미스 글라레올러 스( Clethrionomys glareolus ))에 의해 운반되며, 지중해 지역을 제외한 대부분의 유럽 전역에 존재한다. 4개의 공지된 도브라바 바이러스 유전자형이 있으며, 각각은 상이한 설치류 종에 의해 운반된다. 유전자형 도브라바는 노란목 마우스(아포 데무스 플라비콜리스 ( Apodemus flavicollis ))에서 발견되고; 유전자형 사레마아(Saaremaa) 및 쿠르키노(Kurkino)는 줄무늬 필드 마우스(아포데무스 아그라리우 스( Apodemus agrarius ))에서 발견되며, 유전자형 소치(Sochi)는 흑해 필드 마우스(아포데무스 폰티쿠스( Apodemus ponticus ))에서 발견된다.
2017년에만, 독일 로베르크 코흐 연구소(RKI)는 한타바이러스 감염에 대한 1,713건의 알림을 받았다.
미국에서, HPS의 경미한 사례에는 신 놈브레 바이러스, 뉴욕 바이러스, 바유 바이러스(Bayou virus), 및 아마도 블랙 크릭 커넬 바이러스(Black Creek Canal virus)가 포함된다. 2017년 1월 현재 36개주에서 1995년 이후 미국에서 누적적으로 728건의 한타바이러스 사례가 보고되었다(미국 이외의 지역에서 노출된 것으로 추정되는 사례는 포함하지 않음). 사례의 96% 이상이 미시시피 강의 서쪽 주에서 발생했다. 보고된 사례 수의 상위 10개 주(원래 노출 상태에 따라 순서가 지정된 계수와 약간 다름)는 뉴멕시코(109), 콜로라도(104), 애리조나(78), 캘리포니아(61), 워싱턴(50), 텍사스(45), 몬타나(43), 유타(38), 아이다호(21) 및 오리건(21)이었고; 보고된 모든 사례의 36%가 사망으로 이어졌다.
멕시코에서는 다음과 같은 설치류가 한타바이러스를 운반하는 것으로 밝혀졌다: 메가돈토미스 토마시 ( Megadontomys thomasi ), 네오토마 픽타(Neotoma picta), 페로미스쿠스 비타에(Peromyscus beatae), 라이트로돈토미스 메갈로티 스( Reithrodontomys megalotis ) 및 라이트로돈토미스 수미크라스티 ( Reithrodontomys sumichrasti ).
캐나다 전역에서 이 질환의 주된 원인인 신 놈브레 바이러스 감염 사슴 마우스가 있지만, 2015년 6월까지, 캐나다 동부에서 한타바이러스 폐 증후군의 문서화된 사례는 단 1건뿐이었으며, 브리티시 컬럼비아, 앨버타, 서스캐처원 및 매니토바에서 대부분의 사례는 서부에 있다. 총 109건의 확인된 사례가 있었고; 감염된 사례의 약 30%가 사망했다. 캐나다에서는 "모든 사례는 농촌 환경에서 발생했으며, 사례의 약 70%는 국내 및 농업 활동과 관련되었다."
최초로 확인된 사망은 2013년 1월 브리티시 컬럼비아 북부에서 발생했고, 또 다른 사망은 2013년 6월 서스캐처원 킨더슬리에서 발생하였다.
남아메리카에서 발견된 HPS의 제제는 대인 관계 형태의 전염을 나타낸 유일한 한타바이러스인 안데스 바이러스(많은 다른 동의어 중에서 오란, 카스텔로 데 손호스- "꿈의 성"의 포르투갈어, 레키구아나스, 쥬키티바, 아라라쿠아라 및 베르메호 바이러스로 칭명되기도 함), 및 이전에 공지된 리오 마모르 바이러스와 매우 가까운 친척인 라구나 네그라 바이러스(Laguna Negra virus)를 포함한다.
한타바이러스를 운반하는 것으로 나타난 설치류는 아브로트릭스 롱기필리스(Abrothrix longipilis) 및 올리고리조미스 롱기카우다투스(Oligoryzomys longicaudatus)를 포함한다.
II. 모노클로날 항체 및 이의 생산
"단리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 (1) 로리 방법(Lowry method)에 의해 결정된 바와 같이 95중량% 초과의 항체, 가장 특히 99중량% 이상으로; (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지; 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적인 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄로 칭명되는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 이종사량체 단위로 구성되며, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J쇄와 함께 2 내지 5개의 기본적인 4쇄 단위를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다. IgG의 경우, 4쇄 단위는 일반적으로 약 150,000달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디이황화 브릿지를 갖는다. 각 H 쇄는 N-말단에 가변 영역(VH)에 이어, 알파 및 감마 쇄 각각에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 뮤 및 아이소타입에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각 L 쇄는 N-말단에 가변 영역(VL)을 갖고, 다른 쪽 말단에는 불변 도메인(CL)이 뒤따른다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 페어링은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조와 특성의 경우, 예를 들어, 문헌(Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6)을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 L 쇄는 불변 도메인(CL)의 아미노산 서열에 기초하여 카파와 람다로 칭명되는 두 가지 명확하게 상이한 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 이들 중쇄의 불변 도메인(CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입에 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 부류의 면역글로불린이 있다. 그들 감마 및 알파 부류는 CH 서열 및 기능의 비교적 미미한 차이에 기초하여 하위부류로 추가로 나뉘며, 인간은 다음 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "가변"은 V 도메인의 특정 세그먼트가 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 스팬 전체에 균일하게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 각각 9 내지 12개아미노산 길이인 "초가변 영역"이라고 칭명되는 극한 가변성의 더 짧은 영역으로 분리된 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라 칭명되는 비교적 불변 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 가변의 영역은 각각 4개의 FR을 포함하고, 주로 베타 시트 구성을 채택하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되어 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 베타 시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄 중 초가변 영역은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합하는 데 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예를 들어, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 항체 의존성 호중구 식 균작용(ADNP), 및 항체 의존성 보체 침착(ADCD)에 항체의 참여를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예: 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링될 때 VL의 내의 거의 약 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH 내의 거의 약 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 카바트 et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 이들 잔기(예: 초티아 넘버링 시스템(Chothia numbering system)에 따라 넘버링될 때 VL 중의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 VH 중의 26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); 및/또는 "초가변 루프"/CDR로부터의 잔기들(예: IMGT 넘버링 시스템에 따라 넘버링될 때 VL 중의 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH 중의 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3); Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000))을 포함한다. 임의로 항체는 AHo에 따라 넘버링되었을 때 다음 지점: VL 중 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) 및 123 (L3), 및 VsubH 중 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) 및 123 (H3) 중 하나 이상에 대칭성 삽입을 갖는다; Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)).
"생식세포계열 핵산 잔기"란 불변 또는 가변 영역을 인코딩하는 생식세포계열 유전자에서 자연적으로 발생하는 핵산 잔기를 의미한다. "생식세포계열 유전자"는 생식 세포(즉, 난자 또는 정자가 될 운명의 세포)에서 발견되는 DNA이다. "생식 세포계열 돌연변이"는 단일 세포기의 생식 세포 또는 접합체에서 발생한 특정 DNA의 유전 가능한 변화를 지칭하며, 자손에게 전달될 때, 이러한 돌연변이는 신체의 모든 세포에 통합된다. 생식세포계열 변이는 단일 신체 세포에서 획득된 체세포 돌연변이와는 대조적이다. 일부 경우에, 가변 영역을 인코딩하는 생식세포계열 DNA 서열 내의 뉴클레오티드가 돌연변이되고(즉, 체세포 돌연변이), 상이한 뉴클레오티드로 대체된다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 그들의 특이성 이외에, 모노클로날 항체는 그들이 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 변형제 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시내용에 유용한 모노클로날 항체는 문헌(참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 또는 항원-특이적 B 세포, 감염 또는 면역화에 반응하는 항원-특이적 형질모세포의 단일 세포 분류, 또는 벌크 분류된 항원-특이적 수집에서 단일 세포로부터 연결된 중쇄 및 경쇄의 포획 후 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포(참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
A. 일반적인 방법
한타바이러스에 결합하는 모노클로날 항체는 다수의 용도를 갖는 것으로 이해될 것이다. 이들은 한타바이러스 감염을 검출 및 진단하는 데 뿐만 아니라 이들을 치료하는 데 사용하기 위한 진단 키트의 생산을 포함한다. 이러한 맥락에서, 이러한 항체를 진단제 또는 치료제에 연결시키거나, 그들을 경쟁 검정에서 포획제 또는 경쟁자로서 사용하거나, 그들을 부착되는 추가 제제 없이 개별적으로 사용할 수 있다. 항체는 이하 추가로 논의된 바와 같이 돌연변이되거나 변형될 수 있다. 항체를 제조하고 특성화하기 위한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다(참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 미국 특허 제4,196,265호).
모노클로날 항체(MAb)를 생성하는 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하는 방법과 동일한 라인에 따라 시작한다. 이 두 가지 방법의 첫 번째 단계는 적절한 숙주의 면역화 또는 이전의 자연 감염 또는 허가된 또는 실험적 백신에 의한 예방접종으로 인해 면역성인 대상체의 확인이다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 면역화용으로 제공된 조성물은 그의 면역원성이 상이할 수 있다. 따라서, 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 담체에 결합시킴으로써 달성될 수 있는 바와 같이, 숙주 면역계를 강화시키는 것이 종종 필요하다. 예시적이고 바람직한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 다른 알부민, 예를 들어, 난백 알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민은 또한 담체로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 담체 단백질에 접합시키는 수단은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 글루타르알데히드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카르보디이미드 및 비스비아조화 벤지딘을 포함한다. 당업계에 또한 익히 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 보조제로서 공지된 면역 반응의 비특이적 자극제를 사용함으로써 향상될 수 있다. 동물에서 예시적이고 바람직한 보조제는 완전 프로인트 보조제(사멸된 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 보조제 및 수산화알루미늄 보조제를 포함하며, 인간에서는 명반, CpG, MFP59 및 면역자극성 분자의 조합("보조제 시스템", 예를 들어, AS01 또는 AS03)을 포함한다. 나노입자 백신, 또는 물리적 전달 시스템(예: 지질 나노입자 또는 금 생물체 비드)에서 DNA 또는 RNA 유전자로서 전달되고 바늘, 유전자 총, 경피 전기 천공 장치로 전달되는 유전자 인코딩된 항원을 포함하는 한타바이러스 특이적 B 세포를 유도하기 위한 추가의 실험 형태의 접종이 가능하다. 항원 유전자는 또한 복제 적격 또는 결함 있는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 또는 알파바이러스 레플리콘, 또는 대안적으로 바이러스-유사 입자에 의해 인코딩되도록 운반될 수 있다.
천연 병원체에 대한 인간 항체의 경우, 적절한 접근법은 병원체에 노출된 대상체, 예를 들어, 질환에 걸린 것으로 진단된 대상체, 또는 병원체에 대한 보호 면역을 생성하기 위해 또는 실험 백신의 안전성 또는 효능을 시험하기 위해 접종받은 대상체를 확인하는 것이다. 순환성 항병원체 항체가 검출될 수 있고, 이어서 항체 양성 대상체로부터 B 세포를 인코딩하거나 생산하는 항체가 수득될 수 있다.
폴리클로날 항체의 생산에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 성질 및 면역화에 사용되는 동물에 따라 달라진다. 면역원을 투여하기 위해 다양한 경로가 사용될 수 있다(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내). 폴리클로날 항체의 생산은 면역화 후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링함으로써 모니터링될 수 있다. 두 번째 부스터 주사도 제공될 수 있다. 적절한 역가가 달성될 때까지 부스팅 및 역가 과정이 반복된다. 목적하는 수준의 면역원성이 수득되면, 면역화된 동물로부터 채혈하고, 혈청을 단리하여 저장할 수 있고/있거나 동물을 사용하여 MAb를 생성할 수 있다.
면역화 후, 항체, 특히 B 림프구(B 세포)를 생성할 가능성이 있는 체세포는 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택된다. 이들 세포는 생검된 비장, 림프절, 편도선 또는 아데노이드, 골수 흡인물 또는 생검, 폐 또는 위장관과 같은 점막 기관으로부터의 조직 생검, 또는 순환성 혈액으로부터 수득될 수 있다. 이어서, 면역화된 동물 또는 면역화된 인간으로부터의 항체 생성 B 림프구는 불멸의 골수종 세포의 세포, 일반적으로 면역화된 동물 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포와 동일한 종 중 하나와 융합된다. 하이브리도마 생성 융합 절차에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비-항체 생성성이며, 높은 융합 효율, 및 이어서 목적하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 지지하는 특정 선택적 배지에서 성장할 수 없게 만드는 효소 결핍을 갖는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 다수의 골수종 세포 중 어느 하나가 사용될 수 있다(참조: Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). HMMA2.5 세포 또는 MFP-2 세포가 이러한 세포의 특히 유용한 예이다.
항체 생성 비장 또는 림프절 세포와 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 일반적으로 체세포와 골수종 세포를 2:1의 비율로 혼합하는 단계를 포함하지만, 비율은 세포막의 융합을 촉진하는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기적)의 존재하에 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, 초기 단계로서 엡스타인 바 바이러스(EBV)에 의한 인간 B 세포의 형질전환은 B 세포의 크기를 증가시키고 비교적 큰 크기의 골수종 세포와의 융합을 향상시킨다. EBV에 의한 형질전환 효율은 형질전환 배지에서 CpG와 Chk2 억제제를 사용함으로써 향상된다. 대안적으로, 인간 B 세포는 추가의 가용성 인자, 예를 들어, IL-21 및 TNF 슈퍼패밀리의 유형 II 구성원인 인간 B 세포 활성화 인자(BAFF)를 함유하는 배지에서 CD40 리간드(CD154)를 발현하는 형질감염된 세포주와의 공동 배양으로 활성화될 수 있다. 센다이 바이러스를 사용하는 융합 방법은 문헌[Kohler and Milstein (1975; 1976)]에 의해 기재되었고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어, 37%(v/v) PEG를 사용하는 방법은 문헌[Gefter et al. (1977)]에 의해 기재된다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용도 적합하며(Goding, pp. 71-74, 1986), 더 나은 효율을 위한 공정이 있다(Yu et al., 2008). 융합 절차는 일반적으로 약 1x10-6 내지 1x10-8의 낮은 주파수에서 생존 가능한 하이브리드를 생성하지만, 최적화된 절차를 사용하여 200 중 1에 가까운 융합 효율을 달성할 수 있다(Yu et al., 2008). 그러나, 융합의 비교적 낮은 효율은, 생존 가능한 융합된 하이브리드가 선택적 배지에서 배양함으로써 모체의 주입된 세포(특히 일반적으로 무기한으로 계속 분열하는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에, 문제를 제기하지 않는다. 선택적 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 데노보 합성(de novo synthesis)을 차단하는 제제를 함유하는 것이다. 예시적이고 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 푸린과 피리미딘 모두의 데노보 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 푸린 합성만 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지에는 뉴클레오티드의 공급원으로서 히포크산틴 및 티미딘이 보충된다(HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 배지에는 히포크산틴이 보충된다. B 세포 공급원이 EBV 형질전환된 인간 B 세포주인 경우, 골수종에 융합되지 않은 EBV 형질전환 주를 제거하기 위하여, 우아바인이 첨가된다.
바람직한 선택 배지는 HAT 또는 우아바인을 포함하는 HAT이다. 뉴클레오티드 구제 경로를 조작할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 구제 경로의 주요 효소, 예를 들어, 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)에 결함이 있고, 그들은 생존할 수 없다. B 세포는 이 경로를 조작할 수 있지만, 배양에서 제한된 수명을 가지며, 일반적으로 약 2주 이내에 사망한다. 따라서, 선택적 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종과 B 세포로부터 형성된 하이브리드이다. 융합에 사용되는 B 세포의 공급원이 EBV-형질전환 B 세포주인 경우, 여기에서와 같이, EBV-형질전환 B 세포는 약물 사멸에 취약하기 때문에, 우아바인이 하이브리드의 약물 선택을 위해 사용될 수 있는 반면, 사용된 골수종 파트너는 우아바인 내성이도록 선택된다.
배양은 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마의 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 마이크로타이터 플레이트에서 단일-클로날 희석에 의해 세포를 배양한 후, 개별 클론 상청액을 (약 2 내지 3주 후에) 목적하는 반응성에 대해 시험함으로써 수행된다. 검정은 방사성면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정 도트 면역결합 검정 등과 같이 민감하고 간단하고 신속해야 한다. 이어서, 선택된 하이브리도마는 순차적으로 희석되거나 유세포 계측 분류에 의해 단일 세포 분류되고 개별 항체 생성 세포주로 클로닝되고, 이어서 이 클론은 무기한으로 번식되어 mAb를 제공할 수 있다. 세포주는 두 가지 기본 방법으로 MAb 생산을 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마의 샘플은 동물(예: 마우스)에 (종종 복강으로) 주사될 수있다. 임의로, 동물은 주사 전에 탄화수소, 특히 오일, 예를 들어, 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)으로 프라이밍된다. 인간 하이브리도마가 이러한 방식으로 사용되는 경우, 종양 거부 반응을 방지하기 위해 SCID 마우스와 같은 면역저하된 마우스에 주사하는 것이 최적이다. 주사된 동물은 융합 세포 하이브리드에 의해 생성된 특정 모노클로날 항체를 분비하는 종양이 발병한다. 이어서, 동물의 체액, 예를 들어, 혈청 또는 복수를 탭핑하여 MAb를 고농도로 제공할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관내에서 배양될 수 있고, 여기서 MAb는 고농도로 쉽게 수득될 수 있는 배양 배지로 자연적으로 분비된다. 대안적으로, 인간 하이브리도마 세포주를 시험관내에서 사용하여 세포 상청액에서 면역글로불린을 생성할 수 있다. 세포주는 고순도의 인간 모노클로날 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화하기 위해 무혈청 배지에서의 성장에 적응될 수 있다.
어느 하나의 수단에 의해 생성된 MAb는, 목적하는 경우, 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들어, FPLC 또는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 본 개시내용의 모노클로날 항체의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 소화를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단에 의해 정제된 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용에 포함된 모노클로날 항체 단편은 자동화 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
또한, 분자 클로닝 접근법을 사용하여 모노클로날 항체를 생성할 수 있다는 것이 고려된다. 관심 항원으로 표지된 단일 B 세포는 상자성 비드 선택 또는 유세포 계측 분류를 사용하여 물리적으로 분류될 수 있고, 이어서 RNA는 RT-PCR에 의해 증폭된 항체 유전자 및 단일 세포로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 항원 특이적 벌크 분류된 세포 집단은 중쇄 및 경쇄 앰플리콘의 물리적 연결, 또는 소포로부터의 중쇄 및 경쇄 유전자의 일반적인 바코딩을 사용하여 단일 세포로부터 회수된 미세소포 및 일치된 중쇄 및 경쇄 가변 유전자로 분리될 수 있다. 단일 세포를 형성하는 일치된 중쇄 및 경쇄 유전자는 RT-PCR 프라이머 및 세포당 하나의 바코드로 전사체를 마킹하기 위한 바코드를 보유하는 세포 침투성 나노입자로 세포를 처리함으로써 항원 특이적 B 세포의 집단으로부터 수득될 수 있다. 항체 가변 유전자는 또한 하이브리도마 라인 및 RT-PCR에 의해 수득된 항체 유전자의 RNA 추출에 의해 단리될 수 있고, 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 대안적으로, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고, 적절한 항체를 발현하는 파지미드는 바이러스 항원을 사용하여 패닝함으로써 선택된다. 종래의 하이브리도마 기술에 비해 이 접근법의 장점은 단일 라운드에서 약 104배 많은 항체가 생성되고 스크리닝될 수 있고, 새로운 특이성이 적절한 항체를 발견할 기회를 추가로 증가시키는 H 및 L 쇄 조합에 의해 생성된다는 것이다.
본 개시내용에 유용한 항체의 생산을 교시하는, 각각 본원에 참고로 포함되는 다른 미국 특허는 조합 접근법을 사용하는 키메라 항체의 생산을 기재하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 제제를 기재하는 미국 특허 제4,816,567호; 및 항체-치료제 접합체를 기재하는 미국 특허 제4,867,973호를 포함한다.
B. 본 개시내용의 항체
본 개시내용에 따른 항체는, 첫 번째 예에서, 그들의 결합 특이성에 의해 정의될 수 있다. 당업자는 당업자에게 익히 공지된 기술을 사용하여 주어진 항체의 결합 특이성/친화도를 평가함으로써 이러한 항체가 본 청구범위의 범위 내에 속하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 주어진 항체가 결합하는 에피토프는 항원 분자(예: 도메인 내의 선형 에피토프) 내에 위치된 3개 이상(예: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20) 아미노산의 단일 연속 서열로 구성될 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 항원 분자(예: 형태 에피토프) 내에 위치된 복수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 구성될 수 있다.
당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여, 항체가 폴리펩티드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지" 여부를 결정할 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들어, 문헌(참조: Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.))에 기재된 것과 같은 일상적인 교차 차단 검정을 포함한다. 교차 차단은 ELISA, 생물층 간섭 측정법, 또는 표면 플라즈몬 공명과 같은 다양한 결합 검정으로 측정될 수 있다. 다른 방법으로는 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248:443-63), 펩티드 절단 분석, 단일 입자 재구성, cryoEM, 또는 단층 촬영을 사용하는 고해상도 전자 현미경 기술, 결정학 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer (2000) Prot. Sci. 9:487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소 표지한 후 항체를 중수소 표지 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 이어서, 단백질/항체 복합체는 물로 옮겨지고, 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환 가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환 가능한 양성자보다 느린 속도로 중 수소 대 수소 역교환을 겪는다. 그 결과, 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있고, 따라서 계면에 포함되지 않는 아미노산과 비교하여 비교적 높은 질량을 나타낼 수 있다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 절단 및 질량 분광법 분석에 제공되어, 항체가 상호작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소 표지된 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 문헌(Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A)을 참조한다. 항체가 한타바이러스를 중화시킬 경우, 항체 탈출 돌연변이체 변이체 유기체는 고농도의 항체의 존재하에 시험관내 또는 동물 모델에서 한타바이러스를 증식시킴으로써 단리될 수 있다. 항체에 의해 표적화된 항원을 인코딩하는 한타바이러스 유전자의 서열 분석은 항체 탈출을 부여하는 돌연변이(들)를 밝혀내고, 에피토프 내의 잔기를 나타내거나 에피토프의 구조에 알로스테릭하게 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
용어 "에피토프"는 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지된 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로의 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 형태로 적어도 3개, 보다 일반적으로는 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항원 구조 기반 항체 프로파일링(ASAP)으로도 공지된 변형 보조 프로파일링(MAP)은 각 항체의 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에의 결합 프로필의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시된 다수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(참조: US 2004/0101920, 본원에 구체적으로 전체가 참고로 포함됨). 각 카테고리는 다른 카테고리로 표현되는 에피토프와는 분명히 다르거나 부분적으로 중첩되는 고유한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술은 유전적으로 동일한 항체의 신속한 여과를 가능하게 하여 특성화가 유전적으로 상이한 항체에 초점을 맞출 수 있도록 한다. 하이브리도마 스크리닝에 적용될 때, MAP는 목적하는 특성을 갖는 mAb를 생성하는 희귀한 하이브리도마 클론의 확인을 용이하게 할 수 있다. MAP를 사용하여 본 개시내용의 항체를 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 그룹으로 분류할 수 있다.
본 개시내용은 동일한 에피토프 또는 에피토프의 일부에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 항체와 표적 또는 이의 단편에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항체를 포함한다. 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 참조 항체와 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건하에서 표적에 결합하도록 한다. 이어서, 표적 분자에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합에 이어 표적 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체가 참조 항체와 상이한 에피토프에 결합한다고 결론지을 수 있다. 한편, 시험 항체가 참조 항체와의 포화 결합 후에 표적 분자에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 참조 항-한타바이러스 항체와의 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 상기의 결합 방법론이 두 배향으로 수행된다: 첫 번째 배향에서, 참조 항체를 포화 조건하에 한타바이러스 항원에 결합시킨 후 한바이러스 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 배향에서, 시험 항체를 포화 조건하에서 한타바이러스 항원 분자에 결합시킨 후 참조 항체의 한타바이러스 분자에 대한 결합을 평가한다. 두 배향에서, 제1 (포화) 항체만이 한타바이러스에 결합할 수 있다면, 시험 항체와 참조 항체가 한타바이러스에 대한 결합에 대해 경쟁한다고 결론이 내려진다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 참조 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없을 수 있지만, 중첩성 또는 인접 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
각각이 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 두 항체는 동일하거나 중첩성 에피토프에 결합한다. 즉, 1배, 5배, 10배, 20배, 또는 100배 초과의 하나의 항체는 경쟁 결합 검정으로 측정된 바와 같이, 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90%, 또는 심지어 99% 억제한다(참조: 예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). 대안적으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 중첩성 에피토프를 갖는다.
이어서, 추가의 일상적인 실험(예: 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 관찰된 시험 항체의 결합의 부족이 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지 또는 입체적 차단 (또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 부족의 원인인지의 여부를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 계측법 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. EM 또는 결정학을 이용한 구조 연구는 또한 결합에 대해 경쟁하는 두 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지 여부를 입증할 수 있다.
또 다른 측면에서, 각각 표 3 및 표 4에 예시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄로부터의 클론-쌍을 이룬 CDR을 갖는 모노클로날 항체가 제공된다. 이러한 항체는 본원에 기재된 방법을 사용하여 실시예 섹션에서 하기 논의된 클론에 의해 생성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 항체는 그들의 가변 서열에 의해 정의될 수 있고, 이는 추가의 "프레임워크" 영역을 포함한다. 이들은 완전 가변 영역을 인코딩하거나 나타내는 표 1 및 2에 제공된다. 또한, 항체 서열은 임의로 이하 보다 상세히 논의된 방법을 사용하여 이들 서열과 다를 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 (a) 가변 영역이 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있고, (b) 핵산이 그로 인해 인코딩된 잔기에 영향을 미치지 않고 상기 제시된 것들과 상이할 수 있고, (c) 핵산이 주어진 백분율, 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성에 의해 상기 제시된 것들과 다를 수 있고, (d) 핵산이 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M의 NaCl에 의해 제공된 것과 같은 저염 및/또는 고온 조건에 의해 예시된 바와 같이 높은 엄격성 조건하에서 하이브리드화하는 능력에 의해 상기 제시된 것들과 다를 수 있고, (e) 아미노산이 주어진 백분율, 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성에 의해 상기 제시된 것들과 다를 수 있고, 또는 (f) 아미노산이 보존적 치환(이하 논의됨)을 허용함으로써 상기 제시된 것들과 상이할 수 있다는 점에서 상기 제시된 것들과 다를 수 있다. 상기 각각은 표 1로 제시된 핵산 서열 및 표 2의 아미노산 서열에 적용된다.
폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열을 비교할 때, 이하 기재된 바와 같이 최대 상응성을 위해 정렬될 때 두 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일하면, 두 서열은 "동일하다"고 한다. 두 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 비교 윈도우에서 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 연속 위치, 일반적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 세그먼트를 지칭하며, 여기서 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, Wis.)의 Lasergene 스위트에서 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 아래 참고문헌에 기재된 여러 정렬 체계를 구현한다: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌(Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482)의 국소 동일성 알고리즘, 문헌(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443)의 동일성 정렬 알고리즘, 문헌(Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)의 유사성 방법의 검색, 이러한 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터화된 구현, 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 특정 예는 각각 문헌(Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402) 및문헌(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들어, 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용되어 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 퍼센트 서열 동일성을 결정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 항체 서열의 재배열된 특성 및 각 유전자의 가변 길이는 단일 항체 서열의 BLAST 검색의 다중 라운드를 필요로 한다. 또한, 다른 유전자의 수동 조립은 어렵고 오류가 발생하기 쉽다. 서열 분석 도구 IgBLAST(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/의 월드 와이드 웹)는 생식세포계열 V, D 및 J 유전자와의 일치, 재배열 접합부의 세부사항, Ig V 도메인 프레임워크 영역의 묘사 및 상보성 결정 영역을 식별한다. IgBLAST는 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 분석할 수 있고, 서열을 뱃치로 처리하고, 생식세포계열 유전자 데이터베이스와 다른 서열 데이터베이스를 동시에 검색하여 아마도 가장 일치하는 생식세포계열 V 유전자를 누락할 가능성을 최소화하도록 할 수 있다.
하나의 예시적 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(일치하는 잔기 쌍의 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기의 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산될 수 있다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 다음과 같은 경우에 중지된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 떨어지고; 누적 점수가 하나 이상의 음수 스코어링 잔류물 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 가고; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드 길이(W) 11, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 정렬, (B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산할 수 있다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 다음과 같은 경우에 중지된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 감소하고; 누적 점수가 하나 이상의 음수 스코어링 잔류물 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 가고; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다.
하나의 접근법에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위해 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 참조 서열의 총 위치의 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
항체를 정의하는 또 다른 방법은 하기 기재된 항체 및 그들의 항원 결합 단편 중 어느 하나의 "유도체"로서이다. 용어 "유도체"는 항원에 면역특이적으로 결합하지만, "부모"(또는 야생형) 분자에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 첨가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 이러한 아미노산 치환 또는 첨가는 천연(즉, DNA-인코딩됨) 또는 비천연 아미노산 잔기를 도입할 수 있다. 용어 "유도체"는, 예를 들어, 향상된 또는 손상된 이펙터 또는 결합 특성을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 등을 형성하도록, 예를 들어, 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 갖는 변이체로서 포함한다. 용어 "유도체"는 비-아미노산 변형, 예를 들어, 글리코실화(예: 변경된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민산 등의 함량을 가짐), 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 연결될 수 있는 등의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변경된 탄수화물 변형은 다음 중 하나 이상을 조절한다: 항체의 가용화, 항체의 아세포 수송 및 분비의 촉진, 항체 조립의 촉진, 형태적 완전성, 및 항체 매개 이펙터 기능. 특정 구현예에서, 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형이 결여된 항체에 비해 항체 매개 이펙터 기능을 향상시킨다. 변경된 항체 매개 이펙터 기능을 유도하는 탄수화물 변형은 당업계에 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Shields, R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001), Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). 탄수화물 함량을 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Wallick, S. C. et al. (1988), J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989), J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995), Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003), Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740).
유도체 항체 또는 항체 단편은 비드-기반 또는 세포 기반 검정에 의해 또는 동물 모델의 생체내 연구에서 측정된 바와 같이 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 항체 의존성 호중구 식균작용(ADNP), 또는 항체 의존성 보체 침착(ADCD) 기능에 바람직한 수준의 활성을 부여하기 위해 조작된 서열 또는 글리코실화 상태로 생성될 수 있다.
유도체 항체 또는 항체 단편은 특정 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 사용하는 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 유도체는 부모 항체와 유사하거나 동일한 기능을 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 항체 유도체는 부모 항체에 비해 변경된 활성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 유도체 항체(또는 이의 단편)는 부모 항체보다 더 강하게 에피토프에 결합하거나 단백질 분해에 더 내성일 수 있다.
C. 항체 서열의 조작
다양한 구현예에서, 개선된 발현, 개선된 교차 반응성 또는 감소된 오프-표적 결합과 같은 다양한 이유로 식별된 항체의 서열을 조작하는 것을 선택할 수 있다. 변형된 항체는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 발현, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현 방법은 이 문서의 다른 곳에서 다루어진다. 다음은 항체 조작을 위한 관련된 목표 기술의 일반적인 논의이다.
하이브리도마를 배양한 다음, 세포를 용해시키고 전체 RNA를 추출할 수 있다. 랜덤 헥사머를 RT와 함께 사용하여 RNA의 cDNA 카피를 생성한 다음, 모든 인간 가변 유전자 서열을 증폭시킬 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 다중 혼합물을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝된 다음, 표준 벡터 프라이머를 사용하여 자동화된 DNA 서열분석에 의해 서열분석될 수 있다. 결합 및 중화 검정은 하이브리도마 상청액으로부터 수집되고 단백질 G 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 정제된 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
재조합 전장 IgG 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 클로닝 벡터로부터 IgG 플라스미드 벡터로 서브클로닝하고, 293(예: 프리스타일(Freestyle)) 세포 또는 CHO 세포로 형질감염시킴으로써 생성될 수 있으며, 항체는 293 또는 CHO 세포 상청액으로부터 수집 및 정제될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포 시스템은 박테리아, 예를 들어, 이. 콜리(E. coli), 곤충 세포(S2, Sf9, Sf29, 하이파이브), 식물 세포(예: 인간 유사 글리칸에 대한 조작이 있거나 없는 담배), 조류, 또는 다양한 비인간 유전자 도입 맥락에서, 예를 들어, 마우스, 래트, 염소 또는 암소를 포함한다.
후속 항체 정제의 목적 및 숙주의 면역화 둘 다를 위해, 항체를 인코딩하는 핵산의 발현이 또한 고려된다. 항체 코딩 서열은 RNA, 예를 들어, 천연 RNA 또는 변형된 RNA일 수 있다. 변형된 RNA는 mRNA에 증가된 안정성 및 낮은 면역원성을 부여하여 치료적으로 중요한 단백질의 발현을 촉진시키는 특정 화학적 변형을 고려한다. 예를 들어, N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ)은 번역 능력면에서 몇몇 다른 뉴클레오사이드 변형 및 그들의 조합을 능가한다. 면역/eIF2α 인산화 의존 번역의 억제를 끄는 것 외에도, 통합된 N1mΨ 뉴클레오티드는 mRNA의 리보솜 일시 정지 및 밀도를 증가시킴으로써 번역 과정의 역학을 극적으로 변경한다. 변형된 mRNA의 리보솜 부하의 증가는 동일한 mRNA에서 리보솜 재활용 또는 데노보 리보솜 동원을 지지함으로써 그들을 개시에 대해 더 관대하게 만든다. 이러한 변형은 RNA로 접종 후 생체내에서 항체 발현을 향상시키는 데 사용될 수 있다. RNA는 천연이든 변형되든지 네이키드 RNA로서 또는 지질 나노입자와 같은 전달 비히클에 전달될 수 있다.
대안적으로, 항체를 인코딩하는 DNA는 동일한 목적으로 사용될 수 있다. DNA는 그것이 설계되는 숙주 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 포함된다. 발현 카세트는 통상적인 플라스미드 또는 미니벡터와 같은 복제 가능한 벡터에 유리하게 포함된다. 벡터는 바이러스 벡터를 포함하고, 예를 들어, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 렌티바이러스가 고려된다. VEE 바이러스 또는 신드비스 바이러스에 기초한 알파바이러스 레플리콘과 같은 항체 유전자를 인코딩하는 레플리콘이 또한 고려된다. 이러한 벡터의 전달은 근육내, 피하, 또는 피내 경로를 통해 바늘에 의해, 또는 생체내 발현이 목적시되는 경우 경피 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
최종 cGMP 제조 공정과 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 공정에서 생성된 항체의 신속한 가용성은 공정 개발 프로그램의 지속 기간을 단축시킬 가능성을 갖는다. Lonza는 CHO 세포에서 소량(최대 50g)의 항체의 신속한 생산을 위해 CDACF 배지에서 성장된 풀링된 형질감염체를 사용하는 일반적인 방법을 개발했다. 진정한 과도 시스템보다 약간 느리지만, 이점은 더 높은 제품 농도와 생산 세포주와 동일한 숙주 및 공정의 사용을 포함한다. 1회용 생물반응기에서 모델 항체를 발현하는 GS-CHO 풀의 성장과 생산성의 예: 유가 방식(fed-batch mode)으로 작동하는 1회용 백 생물반응기 배양(5L 작업 용적)에서 2g/L의 수확 항체 농도는 형질감염 9주 이내에 달성되었다.
항체 분자는, 예를 들어, mAb의 단백질분해 절단에 의해, 또는, 예를 들어, 재조합 수단를 통해 생산 가능한 단일 쇄 면역글로불린에 의해 생성되는 단편(예: F(ab'), F(ab')2)을 포함할 것이다. F(ab') 항체 유도체는 1가인 반면, F(ab')2 항체 유도체는 2가이다. 하나의 구현예에서, 이러한 단편은 서로 또는 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 결합하여 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 중요하게는, 이러한 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환체를 함유할 수 있다.
관련된 구현예에서, 항체는 개시된 항체의 유도체, 예를 들어, 개시된 항체의 서열과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체(예: 키메라 또는 CDR-그래프트 항체)이다. 대안적으로, 항체 분자에 보존적 변화를 도입하는 것과 같은 변형을 만들고 싶을 수 있다. 이러한 변화를 만드는 데 있어, 아미노산의 수치 요법 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적 수치 요법 특성이 생성된 단백질의 2차 구조에 기여한다는 것이 허용되며, 이는 차례로 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 정의한다.
또한, 유사한 아미노산의 치환이 친수성에 기초하여 효과적으로 수행될 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호는 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있음을 명시한다. 미국 특허 제4,554,101호에서 상세화된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌(+3.0), 리신(+3.0) 및 히스티딘(-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트(+3.0±1), 글루타메이트(+3.0±1), 아스파라긴(+0.2) 및 글루타민(+0.2); 친수성 비이온성 아미노산: 세린(+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2) 및 트레오닌(-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인(-1.0) 및 메티오닌(-1.3); 소수성 비방향족 아미노산: 발린(-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5±1), 알라닌(-0.5) 및 글리신(0); 소수성 방향족 아미노산: 트립토판(-3.4), 페닐알라닌(-2.5) 및 티로신(-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것들이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것들이 더욱 더 특히 바람직하다.
상기 개략된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 전술한 다양한 특성을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 하기를 포함한다: 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.
본 개시내용은 또한 아이소타입 변형을 고려한다. 상이한 아이소타입을 갖도록 Fc 영역을 변경함으로써, 상이한 기능성이 달성될 수 있다. 예를 들어, IgG1로 변경하면 항체 의존성 세포 세포독성을 증가시킬 수 있고, 부류 A로 전환하면 조직 분포를 향상시킬 수 있고, 부류 M으로 전환하면 원자가를 향상시킬 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 아미노산 변형을 IL-23p19 결합 분자의 Fc 영역의 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 기능을 변경하는 하나 이상의 추가 아미노산 변형과 조합하는 것이 유용할 수 있다. 특별한 관심있는 결합 폴리펩티드는 C1q에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 기존의 C1q 결합 활성을 가지며 임의로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 갖는 폴리펩티드는 이들 활성 중 하나 또는 둘 모두가 향상되도록 변형될 수 있다. C1q를 변경하고/하거나 그의 보체 의존성 세포독성 기능을 변경하는 아미노산 변형은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO/0042072에 기재되어 있다.
예를 들어, C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형시켜 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 변경된 이펙터 기능을 갖는 항체의 Fc 영역을 설계할 수 있다. "이펙터 기능"은 생물학적 활성을 활성화 또는 감소시키는 역할을 한다(예: 대상체에서). 이펙터 기능의 예에는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구할 수 있고, 다양한 검정(예: Fc 결합 검정, ADCC 검정, CDC 검정 등)을 사용하여 평가될 수 있다.
예를 들어, 개선된 C1q 결합 및 개선된 FcγRIII 결합을 갖는(예: 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성 모두를 가짐) 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 대안적으로, 이펙터 기능이 감소되거나 절제되는 것이 목적시되는 경우, 변이체 Fc 영역은 감소된 CDC 활성 및/또는 감소된 ADCC 활성으로 조작될 수 있다. 다른 구현예에서, 이들 활성 중 하나만이 증가될 수 있고, 임의로 또한 다른 활성이 감소될 수 있다(예를 들어, ADCC 활성이 개선되었지만 CDC 활성이 감소된 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해 및 그 반대의 경우도 마찬가지이다).
FcRn 결합. Fc 돌연변이는 또한 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호작용을 변경하고 그들의 약동학적 특성을 개선하기 위해 도입되고 조작될 수 있다. FcRn에 대한 결합이 개선된 인간 Fc 변이체의 수집이 기재되어 있다(Shields et al., (2001). FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 고분해능 맵핑 및 FcγR에 대한 결합이 개선된 IgG1 변이체의 설계(J. Biol. Chem. 276:6591-6604). 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 및/또는 생체내 거동을 평가하기 위한 스크리닝을 포함하는 기술을 통해 생성될 수 있는 아미노산 변형을 포함하여, 증가된 반감기를 초래할 수 있는 다수의 방법이 공지되어 있다(Kuo and Aveson, (2011)). 된다. 돌연변이 유발에 이어지는 계산 전략은 또한 돌연변이될 아미노산 돌연변이 중 하나를 선택하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질의 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 상기 부모 폴리펩티드와 비교하여 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, Fc 영역에서 아미노산의 넘버링은 카바트에서 EU 인덱스의 넘버링이다. 본 개시내용의 추가의 측면에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
추가로, 다양한 공보는 분자에 FcRn 결합 폴리펩티드를 도입하거나 FcRn 결합 친화도가 유지되지만 다른 Fc 수용체에 대한 친화도는 크게 감소된 항체와 분자를 융합시키거나 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴으로써 반감기가 변경된 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법을 기재하고, 예를 들어, 문헌(Kontermann (2009))을 참조한다.
유도체화된 항체는 포유동물, 특히 인간에서 부모 항체의 반감기(예: 혈청 반감기)를 변경하는 데 사용될 수 있다. 이러한 변경은 15일 초과, 바람직하게는 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과 또는 5개월 초과의 반감기를 초래할 수 있다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 개시내용의 항체 또는 이의 단편의 증가된 반감기는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 보다 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변형(예: 치환, 결실 또는 추가)함으로써 생성될 수 있다.
문헌(참조: Beltramello et al. (2010))은 이전에 뎅기열 바이러스 감염을 향상시키는 경향으로 인해 중화 mAb의 변형을 보고했으며, 여기서 CH2 도메인의 위치 1.3 및 1.2에서 류신 잔기(C-도메인의 IMGT 고유 넘버링에 따라)는 알라닌 잔기로 치환되었다. "LALA" 돌연변이로도 공지된 이 변형은 문헌(Hessell et al. (2007))에 의해 기재된 바와 같이 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa에 대한 항체 결합을 폐지한다. 변이체 및 비변형 재조합 mAb를 4개의 뎅기열 바이러스 혈청형에 의한 감염을 중화 및 증강시키는 능력에 대해 비교하였다. LALA 변이체는 비변형된 mAb와 동일한 중화 활성을 유지하였으나, 증강 활성이 완전히 결여되었다. 따라서, 이러한 특성의 LALA 돌연변이는 현재 개시된 항체의 맥락에서 고려된다.
변경된 글리코실화. 본 개시내용의 특정 구현예는 시알산, 갈락토스, 또는 푸코스를 포함하지 않는 실질적으로 균질한 글리칸을 함유하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이들 둘 다 각각 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 부착될 수 있다. 전술한 실질적으로 균질한 글리칸은 중쇄 불변 영역에 공유 결합될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 구현예는 신규한 Fc 글리코실화 패턴을 갖는 mAb를 포함한다. 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 GNGN 또는 G1/G2 당형에 의해 표현되는 실질적으로 균질한 조성물에 존재한다. Fc 글리코실화는 치료적 mAb의 항바이러스 및 항암 특성에서 중요한 역할을 한다. 본 개시내용은 시험관내 푸코스 부재 항-HIV mAb의 항-렌티바이러스 세포-매개 바이러스 억제의 증가를 보여주는 최근 연구와 일치한다. 코어 푸코스가 결여된 균질한 글리칸을 사용하는 본 개시내용의 이 구현예는 특정 바이러스에 대한 보호가 2배를 초과하는 비율로 증가되었음을 나타내었다. 코어 푸코스의 제거는 자연 킬러(NK) 세포에 의해 매개되는 mAb의 ADCC 활성을 극적으로 향상시키지만, 다형핵 세포(PMN)의 ADCC 활성에 대한 반대 효과를 갖는 것으로 보인다.
GNGN 또는 G1/G2 당형으로 표현되는 실질적으로 균질한 조성물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실질적으로 균질한 GNGN 당형을 포함하지 않고 당형을 함유하는 G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF 또는 GNGNFX를 포함하는 동일한 항체와 비교하여 Fc 감마 RI 및 Fc 감마 RIII에 대해 증가된 결합 친화도를 나타낸다. 본 개시내용의 하나의 구현예에서, 항체는 1×10-8M 이하의 Kd로 Fc 감마 RI로부터, 1×10-7M 이하의 Kd로 Fc 감마 RIII로부터 해리된다.
Fc 영역의 글리코실화는 전형적으로 N-연결형 또는 O-연결형이다. N-연결형은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 하드록시 아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착함을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있다. 아스파라긴 측쇄 펩티드 서열에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이러한 펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다.
글리코실화 패턴은, 예를 들어, 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 결실시키고/시키거나 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 추가함으로써 변경될 수 있다. 항체의 Fc 영역에 글리코실화 부위의 첨가는 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열(N-연결된 글리코실화 부위의 경우)를 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 예시적 글리코실화 변이체는 중쇄의 잔기 Asn297의 아미노산 치환을 갖는다. 변경은 또한 원래 폴리펩티드의 서열(O-연결된 글리코실화 부위의 경우)에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 수행될 수 있다. 추가로, Asn 297을 Ala로 변경하면 글리코실화 부위 중 하나를 제거할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 베타 (1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnT III)을 발현하는 세포에서 발현되어 GnT III이 GlcNAc를 IL-23p19 항체에 첨가하도록 한다. 이러한 방식으로 항체를 생산하는 방법은 WO/9954342, WO/03011878, 특허 공보 20030003097A1, 및 문헌(Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180; February 1999)에 제공된다. 세포주는 클러스터링된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR)과 같은 게놈 편집 기술을 사용하여 글리코실화와 같은 특정 번역 후 변형을 향상 또는 감소 또는 제거하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 기술을 사용하여 재조합 모노클로날 항체를 발현하는 데 사용되는 293 또는 CHO 세포에서 글리코실화 효소를 인코딩하는 유전자를 제거할 수 있다.
모노클로날 항체 단백질 서열 라이어빌리티(liability)의 제거. 인간 B 세포로부터 수득된 항체 가변 유전자 서열을 조작하여 그들의 제조 가능성과 안전성을 향상시킬 수 있다. 잠재적인 단백질 서열 라이어빌리티는 다음을 함유하는 부위와 관련된 서열 모티프를 검색함으로써 식별될 수 있다:
1) 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기,
2) N-연결된 글리코실화,
3) Asn 탈아미드화,
4) Asp 이성체화,
5) SYE 절단,
6) Met 산화,
7) Trp 산화,
8) N-말단 글루타메이트,
9) 인테그린 결합,
10) CD11c/CD18 결합, 또는
11) 단편화.
이러한 모티프는 재조합 항체를 인코딩하는 cDNA의 합성 유전자를 변경함으로써 제거될 수 있다.
치료 항체의 개발 분야에서 단백질 공학의 노력은 특정 서열 또는 잔기가 용해도의 차이와 관련이 있음을 명확하게 보여준다(Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106 (29), 11937-11942, 2009; Voynov et al., Biocon . Chem., 21 (2), 385-392, 2010). 문헌에서의 용해도 변경 돌연변이로부터의 증거는 일부 친수성 잔기, 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 및 세린이 다른 친수성 잔기, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 리신 및 아르기닌보다 단백질 용해도에 훨씬 더 유리하게 기여한다는 것을 나타낸다.
안정성. 항체는 강화된 생물물리학적 특성을 위해 조작될 수 있다. 평균 겉보기 용융 온도를 사용하여 상대적 안정성을 결정하기 위해 상승된 온도를 사용하여 항체를 전개할 수 있다. 시차 주사 열량계(DSC)는 분자의 열용량 Cp(도당 분자의 가온에 필요한 열)를 온도의 함수로 측정한다. DSC를 사용하여 항체의 열 안정성을 연구할 수 있다. mAb의 DSC 데이터는 때때로 mAb 구조 내의 개별 도메인의 전개를 해결하고 써모그램에서 최대 3개의 피크(Fab, CH2 및 CH3 도메인의 전개로부터)를 생성하기 때문에 특히 흥미롭다. 전형적으로, Fab 도메인의 전개는 가장 강한 피크를 생성한다. Fc 부분의 DSC 프로필 및 상대적 안정성은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스에 대한 특징적인 차이를 보여준다(참조: Garber and Demarest, Biochem . Biophys . Res. Commun .　355, 751-757, 2007). 또한, CD 분광계로 수행되는 원형 이색성(CD)을 사용하여 평균 겉보기 용융 온도를 결정할 수 있다. 원자외선 CD 스펙트럼은 0.5nm의 증분으로 200 내지 260nm 범위의 항체에 대해 측정된다. 최종 스펙트럼은 20개 축적의 평균으로 결정될 수 있다. 잔류 타원도 값은 배경 공제 후에 계산될 수 있다. 항체의 열 전개(0.1mg/mL)는 25 내지 95℃에서 235nm에서 1℃/분의 가열 속도로 모니터링할 수 있다. 동적 광산란(DLS)을 사용하여 응집 성향을 평가할 수 있다. DLS는 단백질을 포함한 다양한 입자의 크기를 특성화하는 데 사용된다. 시스템이 크기로 분산되지 않으면, 입자의 평균 유효 직경이 결정될 수 있다. 이 측정은 입자 코어의 크기, 표면 구조의 크기 및 입자 농도에 따라 달라진다. DLS가 본질적으로 입자로 인한 산란 광 강도의 변동을 측정하기 때문에, 입자의 확산 계수가 결정될 수 있다. 상업용 DLA 장비의 DLS 소프트웨어는 상이한 직경의 입자 집단을 나타낸다. 안정성 연구는 DLS를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 샘플의 DLS 측정은 입자의 유체역학적 반경이 증가하는지 여부를 결정함으로써 입자가 시간이 경과함에 따라 또는 온도 변동에 따라 응집되는지 여부를 보여줄 수 있다. 입자가 응집되면, 더 큰 반경을 갖는 더 큰 입자 집단을 볼 수 있다. 온도에 따른 안정성은 현장에서 온도를 조절함으로써 분석될 수 있다. 모세관 전기영동(CE) 기술은 항체 안정성의 특징을 결정하기 위한 입증된 방법론을 포함한다. iCE 접근법을 사용하여 탈아미드화, C-말단 리신, 시알릴화, 산화, 글리코실화 및 단백질의 pI 변화를 초래할 수 있는 단백질에 대한 임의의 다른 변화로 인한 항체 단백질 전하 변이체를 해결할 수 있다. 발현된 항체 단백질 각각은 단백질 단순 모리스 장비를 사용하여 모세관 컬럼(cIEF)에서 높은 처리량의 유리 용액 등전점 포커싱(IEF)에 의해 평가될 수 있다. 전체 컬럼 UV 흡수 검출은 등전점(pI)에서 분자 포커싱의 실시간 모니터링을 위해 30초 마다 수행될 수 있다. 이 접근법은 전통적인 겔 IEF의 고해상도와 컬럼 기반 분리에서 발견되는 정량화 및 자동화의 이점을 결합하면서 동원 단계의 필요성을 제거한다. 이 기술은 발현된 항체의 동일성, 순도 및 불균일성 프로필의 재현 가능한 정량적 분석을 산출한다. 이 결과는 흡광도와 기본 형광 검출 모드 모두와 최저 0.7μg/mL의 검출 감도를 사용하여 항체에 대한 전하 불균일성 및 분자 사이징을 확인한다.
용해도. 항체 서열의 고유 용해도 점수를 결정할 수 있다. 고유 용해도 점수는 CamSol Intrinsic을 사용하여 계산할 수 있다(Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015). scFv와 같은 각 항체 단편의 HCDR3 내의 잔기 95-102(카바트 넘버링)의 아미노산 서열은 용해도 점수를 계산하기 위한 온라인 프로그램을 통해 평가될 수 있다. 실험 기술을 사용하여 용해도를 결정할 수도 있다. 용액이 포화되고 용해도 한계에 도달할 때까지 용액에 동결건조된 단백질의 첨가, 또는 적절한 분자량 컷-오프를 갖는 미세농축기에서 한외 여과에 의한 농축을 포함하는 다양한 기술이 존재한다. 가장 간단한 방법은 황산암모늄을 사용하는 단백질 침전을 포함하는 방법을 사용하여 단백질의 용해도를 측정하는 무정형 침전의 유도이다(Trevino et al., J Mol Biol,　366: 449-460, 2007). 황산암모늄 침전은 상대적 용해도 값에 대한 빠르고 정확한 정보를 제공한다. 황산암모늄 침전은 잘 정의된 수성 및 고체 상을 갖는 침전된 용액을 생성하고 비교적 소량의 단백질을 필요로 한다. 황산암모늄에 의한 무정형 침전의 유도를 사용하여 수행된 용해도 측정도 또한 상이한 pH 값에서 쉽게 수행될 수 있다. 단백질의 용해도는 매우 pH 의존적이고, pH는 용해도에 영향을 미치는 가장 중요한 외인성 요인으로 간주된다.
자가 반응성. 일반적으로, 자가 반응성 클론은 음성 선택에 의해 개체 발생 동안 제거되어야 한다고 생각되지만, 자가 반응성을 갖는 많은 인간 천연 항체가 성인의 성숙 레퍼토리에서 지속되고 자가 반응성이 병원체에 대한 많은 항체의 항바이러스 기능을 향상시킬 수 있음이 명백해졌다. 초기 B 세포 발달 동안 항체의 HCDR3 루프는 종종 양전하가 풍부하고 자가 반응성 패턴을 나타낸다는 것이 주목되었다(Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003). 현미경 검사(접착성 HeLa 또는 HEp-2 상피 세포를 사용) 및 유세포 계측 세포 표면 염색(현탁액 Jurkat T 세포 및 293S 인간 배아 신장 세포를 사용)으로 인간 기원 세포에 대한 결합 수준을 평가함으로써 주어진 항체를 자가 반응성에 대해 시험할 수 있다. 자가 반응성은 또한 조직 어레이에서 조직에 대한 결합 평가를 사용하여 조사될 수 있다.
바람직한 잔기 ("인간 유사성"). 혈액 공여자로부터의 인간 B 세포의 B 세포 레퍼토리 딥 서열분석은 많은 최근 연구에서 광범위하게 수행되고 있다. 인간 항체 레퍼토리의 상당 부분에 대한 서열 정보는 건강한 인간에 공통적인 항체 서열의 특징에 대한 통계적 평가를 용이하게 한다. 인간 재조합 항체 가변 유전자 참조 데이터베이스에서 항체 서열의 특징에 대한 지식으로, 항체 서열의 "인간 유사성"(HL)의 위치 특이적 정도가 추정될 수 있다. HL은 치료용 항체 또는 백신으로서 항체와 같은 임상적 사용에서의 항체의 개발에 유용한 것으로 나타났다. 목표는 항체의 인간 유사성을 증가시켜 항체 약물의 효능을 현저하게 감소시키거나 심각한 건강 영향을 유발할 수 있는 잠재적인 부작용 및 항항체 면역 반응을 감소시키는 것이다. 총 약 4억 개의 서열의 3명의 건강한 인간 혈액 공여자의 조합된 항체 레퍼토리의 항체 특성을 평가할 수 있고, 항체의 초가변 영역에 초점을 맞춘 새로운 "상대적 인간 유사성"(rHL) 점수를 생성하였다. rHL 점수는 인간 서열(양의 점수)과 비인간 서열(음의 점수)을 쉽게 구별할 수 있도록 한다. 항체는 인간 레퍼토리에서 일반적이지 않은 잔기를 제거하도록 조작될 수 있다.
D. 단일 쇄 항체
단일 쇄 가변 단편(scFv)은 짧은(보통 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합이다. 이 키메라 분자는 불변 영역의 제거와 링커 펩티드의 도입에도 불구하고 원래 면역 글로불린의 특이성을 유지한다. 이 변형은 일반적으로 특이성을 변경하지 않고 남긴다. 이들 분자는 항원 결합 도메인을 단일 펩티드로서 발현시키는 것이 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하기 위해 역사적으로 생성되었다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마 또는 B 세포로부터 유래된 서브클론화된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일 쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 결여되고, 따라서 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위(예: 단백질 A/G)가 결여된다. 이러한 단편은, 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에, 종종 단백질 L을 사용하여 정제/고정될 수 있다.
가요성 링커는 일반적으로 나선- 및 회전-촉진성 아미노산 잔기, 예를 들어, 알라닌, 세린 및 글리신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 또한 기능할 수 있다. 문헌(참조: Tang et al. (1996))은 단백질 링커 라이브러리로부터 단일 쇄 항체(scFvs)에 대한 맞춤형 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 유전자가 가변 조성물의 18-아미노산 폴리펩티드를 인코딩하는 세그먼트에 의해 연결된 랜덤 링커 라이브러리가 작제되었다. scFv 레퍼토리(약 5×106개의 상이한 구성원)를 필라멘트 파지 상에 표시하고, 합텐으로 친화도 선택을 실시하였다. 선택된 변이체의 집단은 결합 활성의 유의한 증가를 나타내었지만 상당한 서열 다양성을 유지하였다. 후속적으로 1054개의 개별 변이체를 스크리닝하여 가용성 형태로 효율적으로 생성된 촉매 활성 scFv를 산출하였다. 서열 분석은 VH C 말단 이후 링커 두 잔기에서 보존된 프롤린과 선택된 테더의 유일한 공통 특징으로서 다른 위치에서 아르기닌과 프롤린의 풍부함을 나타냈다.
본 개시내용의 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 J 쇄와 조합하여 다량체의 형성을 허용하는 IgA로부터 유래된 서열을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 구현예에서, 쇄는 2개의 항체의 조합을 허용하는 비오틴/아비딘과 같은 제제로 변형될 수 있다.
별개의 구현예에서, 단일 쇄 항체는 비펩티드 링커 또는 화학적 단위를 사용하여 수용체의 경쇄 및 중쇄를 결합시킴으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별도의 세포에서 생성되고, 정제된 후, 적절한 방식으로 함께 연결될 것이다(즉, 중쇄의 N-말단은 적절한 화학적 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착된다).
가교결합 시약은 2개의 상이한 분자의 작용성 그룹, 예를 들어, 안정화제 및 응고제를 묶는 분자 브릿지를 형성하는 데 사용된다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 이종이량체성 복합체가 생성될 수 있음이 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적으로 연결하기 위해, 불필요한 단독중합체의 형성을 제거하는 헤테로-이작용성 가교결합제가 사용될 수 있다.
예시적인 헤테로-이작용성 가교결합제는 2개의 반응성 그룹을 함유한다: 하나는 1차 아민 그룹(예: N-하이드록시 석신이미드)과 반응하고, 다른 하나는 티올 그룹(예: 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)과 반응한다. 1차 아민 반응성 그룹을 통해, 가교결합제는 하나의 단백질(예: 선택된 항체 또는 단편)의 리신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 그룹을 통해 가교결합제는 이미 제1 단백질에 묶여 다른 단백질(예: 선택제)의 시스테인 잔기(유리 설프하이드릴 그룹)와 반응한다.
혈액에서 합리적인 안정성을 갖는 가교결합제가 사용되는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합하는데 성공적으로 사용될 수 있는 많은 유형의 이황화 결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체적으로 방해된 이황화 결합을 함유하는 링커는 생체내에서 더 큰 안정성을 제공하고 작용 부위에 도달하기 전에 표적 펩티드의 방출을 방지하는 것으로 입증될 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 연결제의 한 그룹이다.
또 다른 가교결합 시약은 SMPT이며, 이는 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체적으로 방해되는" 이황화 결합을 함유하는 이작용성 가교결합제이다. 이황화 결합의 입체적 장애는 조직 및 혈액에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 수행하며, 이로써 부착된 제제의 표적 부위로의 전달 전에 접합체의 분리를 예방하는데 도움이 된다고 생각된다.
SMPT 가교결합 시약은, 다른 많은 공지된 가교결합 시약과 마찬가지로, 작용성 그룹, 예를 들어, 시스테인의 SH 또는 1차 아민(예: 리신의 엡실론 아미노 그룹)을 가교결합하는 능력을 부여한다. 또 다른 가능한 유형의 가교결합제는 절단 가능한 이황화 결합을 함유하는 헤테로-이작용성 광반응성 페닐아지드, 예를 들어, 설포석신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트를 포함한다. N-하이드록시-석신이미딜 그룹은 1급 아미노 그룹과 반응하고, 페닐아지드(광분해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
방해된 가교결합제 이외에, 비방해된 가교결합제도 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 다른 유용한 가교결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교결합제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 다른 구현예는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 리간드와 아민 함유 중합체 및/또는 단백질의 접합체를 생성하는 데, 특히 킬레이트제, 약물, 효소, 검출 가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하는 데 유용한 이작용성 링커를 기재한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건하에서 절단 가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단 가능한 접합체를 개시한다. 이 링커는 관심 제제가 링커에 직접 결합될 수 있고, 절단이 활성제의 방출을 초래한다는 점에서 특히 유용하다. 특정 용도는 단백질, 예를 들어, 항체, 또는 약물에 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴 그룹을 첨가하는 것을 포함한다.
미국 특허 제5,856,456호는 폴리펩티드 성분을 연결하여 융합 단백질, 예를 들어, 단일 쇄 항체를 제조하는 데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 링커는 최대 약 50개 아미노산 길이이며, 프롤린이 이어지는 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 리신)의 적어도 하나의 발생을 함유하며, 더 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역 진단 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시-함유 링커를 개시한다.
E. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 이중특이적 또는 다중특이적이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 단일 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이러한 항체는 제1 항원 결합 부위를 제2 항원의 결합 부위와 결합할 수 있다. 대안적으로, 항병원체 암(arm)은 백혈구 상의 유발 분자, 예를 들어, T 세포 수용체 분자(예: CD3), 또는 IgG의 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 Fc 감마 RIII(CD16)에 결합하여 세포 방어 메카니즘을 감염된 세포에 집중시키고 국소화하도록 하는 암과 결합될 수 있다. 이중특이적 항체를 또한 사용하여 세포독성제를 감염된 세포에 국소화할 수 있다. 이들 항체는 병원체-결합 암과 세포독성제(예: 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위 원소 합텐)에 결합하는 암을 포함한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예: F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. WO96/16673은 이중특이적 항-ErbB2/항-Fc 감마 RIII 항체를 기재하고, 미국 특허 제5,837,234호는 이중특이적 항-ErbB2/항-Fc 감마 RI 항체를 개시한다. 이중특이적 항-ErbB2/Fc 알파 항체는 WO98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시한다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 구색 때문에, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 그 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로, 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차는 WO 93/08289, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 영역을 면역 글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인에 의해서이다. 적어도 하나의 융합체에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 세포로 공동-형질감염된다. 이는 작제에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 목적하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 경우, 구현예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 더 큰 가요성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율로 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 초래하거나, 또는 비율이 목적하는 쇄 조합의 수율에 유의한 영향을 미치지 않는 경우, 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
이 접근법의 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 다른 암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이 비대칭 구조는 불필요한 면역글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이 접근법은 WO94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 대한 추가의 세부사항에 대해, 예를 들어, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예: 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써, 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "공동"이 제2 항체 분자의 계면에서 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 불필요한 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 결합될 수 있고, 다른 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 불필요한 세포로 표적화하기 위해(미국 특허 제4,676,980호) 및 HIV 감염 치료용으로(WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP03089) 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술도 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌(참조: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985))은 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이들 단편은 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에서 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
화학적으로 결합하여 이중특이적 항체를 형성할 수 있는 이. 콜리로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하는 기술이 존재한다. 문헌(참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))은 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각 Fab' 단편은 이. 콜리로부터 개별적으로 분비되고, 시험관내에서 지시된 화학적 커플링을 실시하여 이중특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있었다.
재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술도 또한 기재되어 있다(Merchant et al., Nat. Biotechnol .　16,　677-681　(1998).　doi:10.1038/nbt0798-677pmid:9661204). 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌(참조: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))에 의해 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 메커니즘을 제공했다. 단편은 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 도메인 사이의 페어링을 허용할 수 없는 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루도록 강제되어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략도 보고되었다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
특정 구현예에서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 DOCK-AND-LOCK™(DNL™) 복합체로서 형성될 수 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,521,056호; 제7,527,787호; 제7,534,866호; 제7,550,143호 및 제7,666,400호, 이들 각각의 실시예 섹션은 본원에 참고로 포함된다). 일반적으로, 상기 기술은 cAMP 의존성 단백질 키나제(PKA)의 조절(R) 서브유닛의 이량체화 및 도킹 도메인(DDD) 서열과 임의의 다양한 AKAP 단백질로부터 유래된 앵커 도메인(AD) 서열 사이에서 발생하는 특이적 및 고친화도 결합 상호작용을 이용한다(참조: Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264; Wong and Scott, Nat. Rev. Mol . Cell Biol . 2004; 5: 959). DDD 및 AD 펩티드는 임의의 단백질, 펩티드 또는 기타 분자에 부착될 수 있다. DDD 서열이 자발적으로 이량체화되고 AD 서열에 결합하기 때문에, 상기 기술은 DDD 또는 AD 서열에 부착될 수 있는 임의의 선택된 분자 사이에 복합체의 형성을 허용한다.
둘 이상의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147: 60, 1991; Xu et al., Science , 358(6359):85-90, 2017). 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빠르게 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본 개시내용의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체(예: 4가 항체)일 수 있으며, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 인코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역에 대한 아미노 말단 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다(또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 (및 바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)는 둘 이상의 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있으며, 여기서 VD1은 제1 가변 영역이고, VD2는 제2 가변 영역이며, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개(및 바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
전하 변형은 Fab 분자의 아미노산 치환이 그들의 결합 암(참조: PCT 공보 번호 WO2015/150447, 특히 그 안의 실시예, 그 전체는 본원에 참고로 포함됨) 중 하나(또는 둘 이상의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우, 그 이상)에서 VH/VL 교환을 수반하는 Fab 기반 이중/다중특이적 항원 결합 분자의 생산에서 발생할 수 있는 경쇄와 불일치 중쇄(벤스 존스형 부산물)의 미스페어링의 감소를 초래하는 다중특이적 항체의 맥락에서 특히 유용하다.
따라서, 특정 구현예에서, 치료제에 포함된 항체는
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자,
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고,
여기서, 제1 항원은 활성화 T 세포 항원이고, 제2 항원은 표적 세포 항원이거나, 제1 항원은 표적 세포 항원이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이고,
여기서
i) a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따르는 넘버링)으로 치환되고, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환되고; 또는
ii) b) 하의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산(카바트에 따르는 넘버링)으로 치환되고, b) 하의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환된다.
항체는 i) 및 ii) 하에 언급된 변형 둘 다를 포함하지 않을 수 있다. 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL과 CH1은 서로 대체되지 않는다(즉, 교환되지 않은 채로 남아 있다).
항체의 또 다른 구현예에서, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따르는 넘버링)으로 독립적으로(하나의 바람직한 구현예에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 독립적으로) 치환되고, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E), 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 독립적으로 치환된다.
추가의 구현예에서, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따르는 넘버링)으로 독립적으로 치환되고, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환된다.
특정 구현예에서, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따르는 넘버링)에 의해 독립적으로(하나의 바람직한 구현예에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 독립적으로) 치환되고, 위치 123의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카바트에 따르는 넘버링)에 의해 독립적으로(하나의 바람직한 구현예에서, 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로) 치환되고, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고, 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된다.
보다 특별한 구현예에서, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따르는 넘버링)으로 치환되고, 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)(카바트에 의한 넘버링)으로 치환되고, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환되고, 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환된다.
훨씬 더 특별한 구현예에서, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서, 위치 124의 아미노산은 리신(K)(카바트에 따르는 넘버링)으로 치환되고, 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)(카바트에 따르는 넘버링)으로 치환되고, a) 하의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서, 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환되고, 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)(카바트 EU 인덱스에 따르는 넘버링)으로 치환된다.
F. 키메라 항원 수용체
인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR)로도 공지되어 있음)는 면역 이펙터 세포에 임의의 특이성을 이식하는 조작된 수용체이다. 전형적으로, 이들 수용체는 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포로 이식하는데 사용되며, 그들의 코딩 서열의 전달은 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진된다. 이러한 방식으로, 다수의 표적 특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 이 접근법의 I상 임상 연구는 효능을 보여준다.
이들 분자의 가장 흔한 형태는 CD3-제타 막 관통 및 엔도도메인에 융합된 모노클로날 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 융합체이다. 이러한 분자는 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 제타 신호의 전달을 초래한다. 이러한 작제물의 예는 하이브리도마 14g2a(디시알로강글리오사이드 GD2를 인식함)로부터 유래된 scFv의 융합체인 14g2a-제타이다. T 세포가 이 분자를 발현하면(일반적으로 온코레트로바이러스 벡터 형질도입에 의해 달성됨), 그들은 GD2를 발현하는 표적 세포(예: 신경모세포종 세포)를 인식하고 사멸시킨다. 악성 B 세포를 표적으로 하기 위해, 연구자들은 B-계통 분자 CD19에 특이적인 키메라 면역 수용체를 사용하여 T 세포의 특이성을 재지시했다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 가요성 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이 scFv는 초기 단백질을 소포체 및 후속 표면 발현(이는 절단된다)으로 지시하는 신호 펩티드에 선행된다. 가요성 스페이서는 scFv가 상이한 방향으로 배향하도록 하여 항원 결합을 가능하게 한다. 막관통 도메인은 일반적으로 세포 내로 돌출하여 목적하는 신호를 전달하는 신호전달 엔도도메인의 원래 분자로부터 유래되는 전형적인 소수성 알파 나선이다.
타입 I 단백질은 실제로 그 사이에 있는 막관통 알파 나선에 의해 연결된 2개의 단백질 도메인이다. 막관통 도메인이 통과하는 세포막 지질 이중층은 내부 부분(엔도도메인)을 외부 부분(엑토도메인)으로부터 단리하도록 작용한다. 하나의 단백질로부터 엑토도메인을 다른 단백질의 엔도도메인에 결합하면, 전자의 인식을 후자의 신호에 결합하는 분자를 초래한다는 것은 그다지 놀라운 일이 아니다.
엑토도메인. 신호 펩티드는 초기 단백질을 소포체 내로 지시한다. 이는 수용체가 글리코실화되어 세포막에 고정되는 경우에 필수적이다. 임의의 진핵생물 신호 펩티드 서열은 일반적으로 잘 작동한다. 일반적으로, 아미노 말단의 대부분의 성분에 천연적으로 부착된 신호 펩티드가 사용된다(예를 들어, 배향 경쇄-링커-중쇄를 갖는 scFv에서, 경쇄의 천연 신호가 사용된다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 scFv이다. 그러나, 많은 대안이 있다. 천연 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 항원 인식 도메인이 기재되었으며, 간단한 엑토도메인(예: HIV 감염 세포를 인식하는 CD4 엑토도메인) 및 더 이국적인 인식 성분, 예를 들어, 연결된 사이토카인(이는 사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 유도함)을 갖는다. 실제로, 높은 친화도로 주어진 표적에 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 영역으로 사용될 수 있다.
스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결한다. 항원 결합 도메인이 항원 인식을 용이하게 하기 위해, 상이한 방향으로 배향할 수 있도록 충분히 가요성이어야 한다. 가장 간단한 형태는 IgG1로부터의 힌지 영역이다. 대안은 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 CD3의 일부를 포함한다. 대부분의 scFv 기반 작제물의 경우, IgG1 힌지로 충분하다. 그러나, 최적의 스페이서는 종종 경험적으로 결정되야 한다.
막관통 도메인. 막관통 도메인은 막에 걸쳐 있는 소수성 알파 나선이다. 일반적으로, 엔도도메인의 대부분의 막 근위 성분으로부터의 막관통 도메인이 사용된다. 흥미롭게도, CD3-제타 막관통 도메인을 사용하면 천연 CD3-제타 막관통 하전된 아스파르트산 잔기의 존재에 의존하는 요인인 천연 TCR로의 인공 TCR의 통합을 초래할 수 있다. 상이한 막관통 도메인은 상이한 수용체 안정성을 초래한다. CD28 막관통 도메인은 밝게 발현된 안정한 수용체를 초래한다.
엔도도메인. 이것은 수용체의 "비즈니스-엔드(business-end)"이다. 항원 인식 후, 수용체가 클러스터링되고, 신호가 세포로 전달된다. 가장 일반적으로 사용되는 엔도도메인 성분은 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타이다. 이는 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포로 전달한다. CD3-제타는 완전히 유능한 활성화 신호를 제공하지 않을 수 있으며 추가의 공동자극 신호전달이 필요하다.
"1세대" CAR은 전형적으로 내인성 TCR로부터의 신호의 1차 전달자인 CD3ξ-쇄로부터의 세포내 도메인을 가졌다. "2세대" CAR은 다양한 공동자극성 단백질 수용체(예: CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 꼬리에 추가하여 T 세포에 추가 신호를 제공한다. 전임상 연구는 2세대 CAR 설계가 T 세포의 항종양 활성을 향상시킨다는 것을 나타냈다. 보다 최근의 "3세대" CAR은 다중 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 결합하여 효능을 더욱 증강시킨다.
G. ADC
항체 약물 접합체 또는 ADC는 감염성 질환을 갖는 사람들의 치료를 위한 표적화 요법으로 설계된 매우 강력한 생물약제학적 약물의 새로운 부류이다. ADC는 불안정한 결합을 갖는 안정한 화학적 링커를 통해 생물학적 활성 세포독성/항바이러스 페이로드 또는 약물에 연결된 항체(전체 mAb 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편, 또는 scFv)로 구성된 복잡한 분자이다. 항체 약물 접합체는 생물접합체 및 면역접합체의 예이다.
모노클로날 항체의 독특한 표적화 능력을 세포독성 약물의 암 사멸 능력과 결합함으로써, 항체 약물 접합체는 건강한 조직과 병든 조직 사이의 민감한 차별을 허용한다. 이는 전통적인 전신 접근법과는 대조적으로, 항체 약물 복합체가 감염된 세포를 표적으로 하고 공격하여 건강한 세포가 덜 심하게 영향을 받는다는 것을 의미한다.
ADC 기반 항종양 요법의 개발에서, 항암제(예: 세포 독소 또는 세포독소)가 특정 세포 마커를 특이적으로 표적으로 하는 항체(예: 이상적으로는 감염된 세포 내에서만 또는 세포 상에서만 발견되는 단백질)에 결합된다. 항체는 이러한 단백질을 체내에서 추적하고 암 세포의 표면에 부착한다. 항체와 표적 단백질(항원) 사이의 생화학적 반응은 종양 세포에서 신호를 유발하고, 이 신호는 이어서 세포독소와 함께 항체를 흡수하거나 내재화한다. ADC가 내재화된 후, 세포독성 약물이 방출되어 세포를 죽이거나 바이러스 복제를 손상시킨다. 이 표적화로 인해, 이상적으로 약물은 부작용이 적고 다른 제제보다 더 넓은 치료 창을 제공한다.
항체와 세포독성/항바이러스제 사이의 안정한 연결은 ADC의 중요한 측면이다. 링커는 디설파이드, 히드라존 또는 펩티드(절단 가능함), 또는 티오에테르(절단 불가능함)를 포함하는 화학적 모티프를 기반으로 하며, 표적 세포로 세포독성제의 분포 및 전달을 제어한다. 절단 가능한 및 절단 불가능한 유형의 링커는 전임상 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 브렌툭시맙 베도틴은 인간 특이적 CD30 양성 악성 세포에 강력하고 매우 독성인 항미세관제인 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 합성 항종양제인 MMAE를 전달하는 효소 감수성 절단 가능한 링커를 포함한다. 높은 독성 때문에, 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제하는 MMAE는 단일 제제 화학요법제로서 사용될 수 없다. 그러나, 항-CD30 모노클로날 항체(cAC10, 종양 괴사 인자 또는 TNF 수용체의 세포막 단백질)에 연결된 MMAE의 조합은 세포외 유체에서 안정적이며 카텝신에 의해 절단 가능하고 요법에 안전한 것으로 입증되었다. 다른 승인된 ADC인 트라스투주맙 엠탄신은 메이탄신의 유도체인 미세관 형성 억제제 메르탄신(DM-1)과 안정한 절단 불가능한 링커에 의해 부착된 항체 트라스투주맙(Herceptin®/Genentech/Roche)의 조합이다.
보다 좋고 더 안정한 링커의 가용성은 화학 결합의 기능을 변화시켰다. 절단 가능하거나 절단 불가능한 링커 유형은 세포독성(항암) 약물에 특정 특성을 부여한다. 예를 들어, 절단 불가능한 링커는 약물을 세포 내에 유지시킨다. 그 결과, 전체 항체, 링커 및 세포독성제는 표적 암 세포로 들어가고, 여기서 항체는 아미노산의 수준으로 분해된다. 생성된 복합체- 아미노산, 링커 및 세포독성제-는 이제 활성 약물이 된다. 대조적으로, 절단 가능한 링커는 세포독성제를 방출하는 숙주 세포 내의 효소에 의해 촉매된다.
현재 개발중인 다른 유형의 절단 가능한 링커는 세포독성/항바이러스성 약물과 절단 부위 사이에 여분의 분자를 추가한다. 이 링커 기술을 통해 연구자들은 절단 동역학 변화에 대한 걱정 없이 더 많은 가요성을 갖는 ADC를 생성할 수 있다. 연구자들은 또한 펩티드에서 아미노산을 서열분석하는 방법인 에드만 분해(Edman degradation)에 근거한 새로운 펩티드 절단 방법을 개발하고 있다. ADC 개발의 미래 방향은 또한 안정성 및 치료 지수를 더욱 향상시키기 위한 부위 특이적 접합(TDC), 및 α 방출 면역접합체 및 항체 접합 나노입자의 개발을 포함한다.
H. BiTES
이중특이적 T-세포 인게이저(BiTE)는 항암제로서의 사용에 대해 조사된 인공 이중특이적 모노클로날 항체의 한 부류이다. 그들은 감염된 세포에 대해 숙주의 면역계, 보다 구체적으로 T 세포의 세포독성 활성을 지시한다. BiTE는 Micromet AG의 등록 상표이다.
BiTE는 약 55킬로달톤의 단일 펩티드 쇄 상의 상이한 항체의 2개의 단일 쇄 가변 단편(scFv), 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 하나는 특정 분자를 통해 감염된 세포에 결합한다.
다른 이중특이적 항체와 마찬가지로, 그리고 일반적인 모노클로날 항체와는 달리, BiTE는 T 세포와 표적 세포 사이에 링크를 형성한다. 이는 T 세포가 MHC I 또는 공동자극성 분자의 존재와는 무관하게 퍼포린 및 그랜자임과 같은 단백질을 생산함으로써 감염된 세포에 대해 세포독성/항바이러스 활성을 발휘하도록 한다. 이러한 단백질은 감염된 세포로 들어가 세포의 아폽토시스를 개시한다. 이 작용은 감염된 세포에 대한 T 세포 공격 중에 관찰되는 생리학적 과정을 모방한다.
I. 인트라바디
특정 구현예에서, 항체는 세포의 내부 작용에 적합한 재조합 항체이고- 이러한 항체는 "인트라바디"로 공지되어 있다. 이들 항체는 다양한 메카니즘에 의해, 예를 들어, 세포내 단백질 트래픽킹을 변경하고, 효소 기능을 방해하고, 단백질-단백질 또는 단백질-DNA 상호작용을 차단하여 표적 기능을 방해할 수 있다. 다수의 방식에서, 그들의 구조는 상기 논의된 단일 쇄 및 단일 도메인 항체의 구조를 모방하거나 평행하다. 실제로, 단일 전사체/단일 쇄는 표적 세포에서 세포내 발현을 가능하게 하고, 또한 세포막을 가로지르는 단백질 수송을 더 실현 가능하게 하는 중요한 특징이다. 그러나, 추가의 특징이 필요하다.
인트라바디 치료의 구현에 영향을 미치는 두 가지 주요 문제는 세포/조직 표적화를 포함하는 전달, 및 안정성이다. 전달과 관련하여, 조직 지시된 전달, 세포 유형 특이적 프로모터의 사용, 바이러스 기반 전달 및 세포 투과성/막 전좌 펩티드의 사용과 같은 다양한 접근법이 사용되었다. 안정성과 관련하여, 상기 접근법은 일반적으로 파지 디스플레이를 포함하고, 서열 성숙 또는 컨센서스 서열의 발달을 포함할 수 있는 방법 또는 보다 지시된 변형, 예를 들어, 삽입 안정화 서열(예: Fc 영역, 샤페론 단백질 서열, 류신 지퍼) 및 디설파이드 대체/변형을 포함하는 억지 기법(brute force)에 의해 스크리닝하는 것이다.
인트라바디가 필요로 할 수 있는 추가 특징은 세포내 표적화를 위한 신호이다. 인트라바디(또는 다른 단백질)를 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 ER과 같은 아세포 영역으로 표적화할 수 있는 벡터가 설계되었고, 시판되고 있다(Invitrogen Corp.; Persic et al., 1997).
세포에 들어가는 능력 덕분에, 인트라바디는 다른 유형의 항체가 달성할 수 없는 추가 용도를 갖는다. 본 항체의 경우, 살아있는 세포 내의 MUC1 세포질 도메인과 상호작용하는 능력은 신호전달 기능(다른 분자에 결합) 또는 올리고머 형성과 같은 MUC1 CD와 관련된 기능을 방해할 수 있다. 특히, 이러한 항체는 MUC1 이량체 형성을 억제하는 데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
J. 정제
특정 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하도록 의도되며, 여기서 단백질은 자연적으로 수득 가능한 상태에 비해 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 단백질은 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 단백질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주성분을 형성하는 조성물, 예를 들어, 조성물 내의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 기술은 한 수준에서 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 분획에 대한 세포 환경의 조악한 분획화를 포함한다. 폴리펩티드를 다른 단백질로부터 분리한 후, 관심 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제하여 부분적 또는 완전한 정제(또는 균일성으로의 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점전기영동(isoelectric focusing)이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등에 의한 침전, 또는 열변성에 이어 원심분리; 겔 여과, 역상, 히드록실아파타이트 및 친화도 크로마토그래피; 및 이러한 기술 및 다른 기술의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 항체를 정제함에 있어서, 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태깅된 부분에 결합하는 친화도 컬럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나 특정 단계가 생략될 수 있고, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조에 적합한 방법을 초래하는 것으로 간주된다.
일반적으로, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 이용하여 분획화된다. 대안적으로, 항원을 사용하여 적절한 항체를 동시에 정제하고 선택할 수 있다. 이러한 방법은 종종 지지체, 예를 들어, 컬럼, 필터 또는 비드에 결합된 선택 제제를 이용한다. 항체는 지지체에 결합되고 오염물은 제거되고(예를 들어, 세척되고), 조건(염, 열 등)을 적용함으로써 항체가 방출된다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 이들은, 예를 들어, 활성 분획의 비활성을 결정하거나, SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 그것을 초기 추출물의 비활성과 비교하여 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내는 데 사용되는 실제 단위는 물론 정제를 추적하기 위해 선택된 특정 검정 기술과 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존할 것이다.
폴리펩티드의 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에 따라 때때로 유의하게 변할 수 있는 것으로 공지되어 있다(Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 정제된 또는 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량이 변할 수 있음을 이해할 것이다.
III. 한타바이러스 감염의 능동적/수동적 면역화 및 치료/예방
A. 제형화 및 투여
본 발명은 항한타바이러스 항체 및 이를 생성하기 위한 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편, 또는 펩티드 면역원, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 동물, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정된 약전에 나열되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 무균 액체, 예를 들어, 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는 오일일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우, 물은 특정 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액용으로 사용될 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은, 목적하는 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 의약품 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 제제의 예는 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로, 예방적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을 적절한 양의 담체와 함께 함유하여 환자에게 적절한 투여 형태를 제공할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 하고, 이는 경구, 정맥내, 동맥내, 협측내, 비강내, 분무, 기관지 흡입, 직장내, 질내, 국소적일 수 있거나, 기계적 호흡에 의해 전달될 수 있다.
활성 백신은 또한 개시된 것들과 같은 항체가 한타바이러스 감염의 위험이 있는 대상체에서 생체내 생산되는 경우에 고려된다. 이러한 백신은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고, 예를 들어, 피내, 정맥내, 근육내, 피하, 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 피내 및 근육내 경로에 의한 투여가 고려된다. 백신은 대안적으로 점막에 직접 국소 경로에 의해, 예를 들어, 점비약, 흡입, 분무기에 의해, 또는 직장내 또는 질내 전달을 통해 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산성 염, 및 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 이러한 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카르복실 그룹으로 형성되는 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 이러한 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
인공적으로 획득된 수동적 면역으로 공지된 항체의 수동적 전달은 일반적으로 정맥내 또는 근육내 주사의 사용을 수반할 것이다. 항체의 형태는 정맥내(IVIG) 또는 근육내(IG) 사용을 위한 풀링된 인간 면역글로불린으로서, 면역화된 또는 질환으로부터 회복되는 공여자로부터의 고역가 인간 IVIG 또는 IG로서, 및 모노클로날 항체(MAb)로서 인간 또는 동물의 혈장 또는 혈청일 수 있다. 이러한 면역은 일반적으로 단기간 동안만 지속되며, 특히 비인간 기원의 감마 글로불린으로부터 과민성 반응 및 혈청병의 잠재적인 위험도 또한 존재한다. 그러나, 수동적 면역은 즉각적인 보호를 제공한다. 항체는 주사에 적합한, 즉 무균 및 주사 가능한 담체로 제형화될 것이다.
일반적으로, 본 개시내용의 조성물의 성분은 별도로 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 사셰트와 같은 밀폐형 용기 내의 건조 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 그것은 무균의 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공되어 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 악제학적으로 허용되는 염은 음이온으로 형성된 것들, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
2. ADCC
항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)은 면역 이펙터 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해로 이어지는 면역 메카니즘이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 일반적으로 Fc 영역의 N-말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. "증가된/감소된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 갖는 항체"는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정된 증가된/감소된 ADCC를 갖는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "증가된/감소된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 메카니즘에 의해 표적 세포를 둘러싸는 배지 중의 소정의 항체 농도에서 소정 시간에 용해되는 표적 세포의 수의 증가/감소, 및/또는 ADCC의 메카니즘에 의해 소정 시간에 소정의 수의 표적 세포의 용해를 달성하는데 필요한, 표적 세포를 둘러싸는 배지 중의 항체의 농도의 감소/증가 중 어느 하나로 정의된다. ADCC의 증가/감소는 동일한 표준 생산, 정제, 제형화 및 저장 방법(당업자에게 공지되어 있음)을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 상대적이지만, 그것은 조작되지 않았다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 글리코실화 패턴이 변경되도록(예: 글리코실트랜스퍼라제, GnTIII, 또는 다른 글리코실트랜스퍼라제를 발현하도록) 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 항체에 의해 매개된 ADCC의 증가는 동일한 유형의 비조작 숙주 세포에 의해 생산된 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다.
3. CDC
보체 의존성 세포독성(CDC)은 보체 시스템의 기능이다. 그것은 면역계의 항체 및 세포의 관련 없이 막을 손상시켜 병원체를 사멸시키는 면역계의 과정이다. 세 가지 주요 과정이 있다. 세 가지 모두가 치명적인 콜로이드 삼투압 부종, 즉 CDC를 일으키는 병원체에 하나 이상의 막 공격 복합체(MAC)를 삽입한다. 그것은 항체 또는 항체 단편이 항바이러스 효과를 갖는 메커니즘 중 하나이다.
IV. 항체 접합체
본 개시내용의 항체는 항체 접합체를 형성하기 위해 적어도 하나의 제제에 연결될 수 있다. 진단제 또는 치료제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 모이어티를 연결 또는 공유 결합 또는 복합체화하는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 목적하는 활성, 예를 들어, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비제한적인 예는 독소, 항종양제, 치료 효소, 방사성 핵종, 항바이러스제, 킬레이트제, 사이토카인, 성장 인자, 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화도 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들어, 비오틴을 포함한다.
항체 접합체는 진단제로서 사용하기에 일반적으로 바람직하다. 항체 진단은 일반적으로 두 부류, 다양한 면역검정에서와 같은 시험관내 진단에 사용하기 위한 것들과 일반적으로 "항체 지시된 이미징"으로 공지된 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 것들에 속한다. 항체에 대한 그들의 부착 방법들과 마찬가지로, 많은 적합한 이미징제가 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호 및 제4,472,509호). 사용된 이미징 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광 색소, NMR 검출 가능한 물질 및 X-선 이미징제이다.
상자성 이온의 경우, 예로서, 이온, 예를 들어, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III)을 언급할 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X-선 이미징과 같은 다른 맥락에서 유용한 이온은 란타늄(III), 금(III), 납(II), 특히 비스무트(III)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
치료 및/또는 진단 용도의 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 125I는 종종 특정 구현예에서 사용하기에 바람직하고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 그들의 저에너지 및 장거리 검출에 대한 적합성 때문에 종종 바람직하다. 본 개시내용의 방사성 표지된 모노클로날 항체는 당업계에 익히 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨, 및 화학적 산화제, 예를 들어, 차아염소산나트륨, 또는 효소 산화제, 예를 들어, 락토퍼옥시다제와의 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 본 개시내용에 따른 모노클로날 항체는 리간드 교환 공정에 의해, 예를 들어, 퍼테크네이트를 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 컬럼에서 킬레이트화하고, 항체를 이 컬럼에 적용함으로써 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 직접 표지화 기술은, 예를 들어, 퍼테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충 용액, 및 항체를 배양함으로써 사용될 수 있다. 금속성 이온으로서 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키는데 종종 사용되는 중간 작용성 그룹은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광 표지 중에는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 케스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그래핀, ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드가 있다.
본 개시내용에서 고려되는 추가의 유형의 항체는 주로 시험관내에서 사용하기 위한 것들이며, 여기서 항체는 2차 결합 리간드 및/또는 발색성 기질과의 접촉시 착색 생성물을 생성하는 효소 (효소 태그)에 연결된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다아제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
항체에 대한 분자의 부위-특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 항체와 합텐 기반 친화도 표지의 반응을 포함한다. 본질적으로, 합텐 기반 친화도 표지는 항원 결합 부위에서 아미노산과 반응하여 이 부위를 파괴하고 특정 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는 항체 접합체에 의한 항원 결합의 상실을 초래하기 때문에 유리하지 않을 수 있다.
아지드 그룹을 함유하는 분자는 또한 저강도 자외선에 의해 생성된 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 대한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있다(Potter and Haley, 1983). 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조 세포 추출물에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 확인하기 위한 부위-지시된 포토프로브로서 사용되어 왔다(Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하는데 사용되었고(Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989), 항체 결합제로서 사용될 수 있다.
접합체 모이어티에 대한 항체의 부착 또는 접합을 위한 몇몇 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들어, 유기 킬레이트제, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 착물의 사용을 포함한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 모노클로날 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트와 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응할 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 이미징은 모노클로날 항체를 사용하여 달성되며, 검출 가능한 이미징 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-석신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 구현예에서, 항체 결합 부위를 변경하지 않는 반응 조건을 사용하여, 면역글로불린의 Fc 영역에 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 이 방법론에 따라 생성된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 감도를 나타내는 것으로 개시되어 있다(미국 특허 제5,196,066호, 본원에 참고로 포함됨). 이펙터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역의 탄수화물 잔기에 접합된 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착도 문헌에 개시되어 있다(O'Shannessy et al., 1987). 이 접근법은 현재 임상 평가 중인 진단적 및 치료적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되었다.
V. 면역검출 방법
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 한타바이러스 및 그의 관련 항원을 결합, 정제, 제거, 정량화 및 그렇지 않으면 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 전통적인 의미로 적용될 수 있지만, 또 다른 용도는 백신 및 기타 바이러스 스톡의 품질 관리 및 모니터링에 있을 수 있으며, 본 개시내용에 따른 항체를 사용하여 바이러스 중 항원의 양 또는 완전성(즉, 장기간 안정성)을 평가할 수 있다. 대안적으로, 상기 방법을 사용하여 적절한/목적하는 반응성 프로필에 대한 다양한 항체를 스크리닝할 수 있다.
다른 면역검출 방법은 대상체에서 한타바이러스의 존재를 결정하기 위한 특정 검정을 포함한다. 다양한 검정 포맷이 고려되지만, 특히 타액, 혈액, 혈장, 객담, 정액 또는 소변과 같은 대상체로부터 수득된 유체에서 한타바이러스를 검출하는 데 사용되는 것들이다. 특히, 정액은 한타바이러스를 검출하기 위한 실행 가능한 샘플로서 입증되었다(Purpura et al., 2016; Mansuy et al., 2016; Barzon et al., 2016; Gornet et al., 2016; Duffy et al., 2009; CDC, 2016; Halfon et al., 2010; Elder et al. 2005). 검정은 가정 임신 테스트와 유사한 측방 유동 검정(이하 참조)을 포함하는 비의료(가정) 사용을 위해 유리하게 포맷될 수 있다. 이들 검정은 가족 구성원의 대상체에 의한 사용을 가능하게 하기 위한 적절한 시약 및 지침서를 포함하는 키트의 형태로 패키징될 수 있다.
일부 면역검출 방법에는 몇 가지 예를 들자면, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA), 면역방사측정 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정 및 웨스턴 블롯이 포함된다. 특히, 샘플에서 특정 기생충 에피토프에 지시된 한타바이러스 항체의 검출 및 정량화를 위한 경쟁적 검정도 제공된다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는 과학 문헌, 예를 들어, 문헌(참조: Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987))에 기재되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 한타바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 경우에 따라서는 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에 샘플을 본 개시내용에 따르는 제1 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
이들 방법은 샘플로부터 한타바이러스 또는 관련 항원을 정제하는 방법을 포함한다. 항체는 바람직하게는 고체 지지체에, 예를 들어, 컬럼 매트릭스의 형태로 연결될 것이고, 한타바이러스 또는 항원성 성분을 함유하는 것으로 의심되는 샘플이 고정화된 항체에 적용될 것이다. 불필요한 성분은 컬럼으로부터 세척되어 고정화된 항체에 면역복합체화된 한타바이러스 항원을 남기고, 이어서 컬럼으로부터 유기체 또는 항원을 제거함으로써 수집된다.
면역결합 방법은 샘플에서 한타바이러스 또는 관련 성분의 양을 검출 및 정량화하는 방법, 및 결합 과정 동안 형성된 임의의 면역 복합체의 검출 및 정량화 방법을 포함한다. 여기서, 한타바이러스 또는 그의 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고, 샘플을 한타바이러스 또는 이의 성분에 결합하는 항체와 접촉시킨 후, 특정 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출하고 정량화할 것이다. 항원 검출과 관련하여, 분석된 생물학적 샘플은 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플, 예를 들어, 조직 절편 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 혈액 및 혈청을 포함하는 생물학적 유체, 또는 대변 또는 소변과 같은 분비물일 수 있다.
선택된 생물학적 샘플을 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에서 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 항체 조성물을 샘플에 단순히 첨가하고 혼합물을 항체가 면역 복합체를 형성하기에 충분한 시간, 즉 존재하는 한타바이러스 또는 항원에 결합하기에 충분한 시간 동안 배양하는 문제이다. 이 시간 후, 샘플-항체 조성물, 예를 들어, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은 일반적으로 세척하여 임의의 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하고, 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체만이 검출되도록 허용할 것이다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 다수의 접근법을 적용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 임의의 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그와 같은 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이, 2차 결합 리간드, 예를 들어, 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용을 통해 추가적인 이점을 찾을 수 있다.
검출에 사용되는 항체는 그 자체가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있고, 여기서 이어서 이 표지를 간단히 검출할 것이고, 이에 의해 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양이 결정될 수 있도록 한다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에 결합하게 되는 제1 항체는 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우에, 제2 결합 리간드는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 2차 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이며, 따라서 "2차" 항체로 지칭될 수 있다. 1차 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에서 표지된 2차 결합 리간드, 또는 항체와 접촉된다. 이어서, 2차 면역 복합체를 일반적으로 세척하여 임의의 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거한 다음, 2차 면역 복합체의 나머지 표지를 검출한다.
추가의 방법은 2단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 상기한 바와 같이, 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 항체와 같은 제2 결합 리간드를 사용하여 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 다시 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 효과적인 조건하에 제2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이 시스템은 목적하는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역 검출의 한 가지 방법은 두 개의 상이한 항체를 사용한다. 첫 번째 비오티닐화 항체를 사용하여 표적 항원을 검출한 다음, 두 번째 항체를 사용하여 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출한다. 그 방법에서, 시험되는 샘플은 먼저 제1 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양된다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부는 항원에 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체는 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오티닐화 DNA 및/또는 상보적 비오티닐화 DNA의 연속 용액 중에서 배양에 의해 증폭되고, 각 단계에서 항체/항원 복합체에 추가의 비오틴 부위를 첨가한다. 적절한 수준의 증폭이 달성될 때까지 증폭 단계를 반복하고, 그 시점에서, 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양된다. 이 두 번째 단계의 항체는, 예를 들어, 염색체 기질을 사용하는 조직 효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 효소로 표지된다. 적절한 증폭으로, 거시적으로 가시성인 접합체가 생성될 수 있다.
면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오티닐화 DNA와의 배양까지는 칸토어 방법(Cantor method)과 유사하지만, 스트렙타비딘 및 비오티닐화 DNA 배양의 여러 라운드를 사용하는 대신, DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체를 항체를 방출하는 낮은 pH 또는 높은 염 완충액으로 세척한다. 이어서, 생성된 세척 용액을 사용하여 적절한 대조군을 갖는 적합한 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론적으로, PCR의 거대한 증폭 능력 및 특이성을 이용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.
A. ELISA
면역검정은 가장 간단하고 직접적인 의미에서, 결합 검정이다. 특정의 바람직한 면역검정은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사성면역검정(RIA)이다. 조직 절편을 사용하는 면역조직화학적 검출이 또한 특히 유용하다. 그러나, 검출은 이러한 기술에 제한되지 않고, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등이 또한 사용될 수 있다는 것이 쉽게 이해될 것이다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 본 개시내용의 항체는 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 단백질 친화도를 나타내는 선택된 표면에 고정된다. 이어서, 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 결합 및 세척 후, 결합된 항원이 검출될 수 있다. 검출 가능한 표지에 연결된 또 다른 항한타바이러스 항체를 첨가함으로써 검출이 달성될 수 있다. 이 유형의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항-한타바이러스 항체의 첨가, 이어서 제2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제3 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있고, 제3 항체는 검출가능한 표지에 연결된다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 웰 표면에 고정된 후, 본 개시내용의 항한타바이러스 항체와 접촉된다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 결합 및 세척 후, 결합된 항한타바이러스 항체가 검출된다. 초기 항한타바이러스 항체가 검출 가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체는 직접 검출될 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제1 항한타바이러스 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있고, 제2 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
사용된 포맷에 관계없이, ELISA는 코팅, 배양 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출과 같은 공통된 특정 특징을 갖는다. 이들은 아래에 기재되어 있다.
항원 또는 항체로 플레이트를 코팅함에 있어서, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새 또는 지정된 시간 동안 배양할 것이다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 것이다. 이어서, 웰의 임의의 잔류하는 이용 가능한 표면은 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"된다. 이들은 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액을 포함한다. 코팅은 고정화 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하고, 따라서 표면에 대한 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 아마도 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 더 일반적이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 비반응성 물질로 코팅하여 배경을 감소시키고, 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 고정화 표면을 면역 복합체 (항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서 시험될 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 제3 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
"면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하"란, 조건이 바람직하게는 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)/트윈과 같은 용액으로 항원 및/또는 항체를 희석함을 포함한다는 것을 의미한다. 이러한 추가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소를 돕는 경향이 있다.
"적절한" 조건은 또한 배양이 효과적인 결합을 가능하게 하기에 충분한 온도에서 또는 시간 동안임을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 약 1 내지 2 내지 4시간 정도, 또는 약 4℃ 정도에서 밤새일 수 있다.
ELISA의 모든 배양 단계에 이어, 접촉된 표면을 세척하여 비복합체화된 물질을 제거한다. 바람직한 세척 절차는 PBS/Tween 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척하는 단계를 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이의 특정 면역 복합체의 형성, 및 후속적 세척 후에, 심지어 미량의 면역 복합체의 발생이 결정될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 가능하게 하는 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이는 적절한 발색성 기질과 배양시 발색을 생성하는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들어, 제1 및 제2 면역 복합체를 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제 접합 항체와 추가의 면역 복합체 형성의 발달에 유리한 조건하에서 일정 기간 동안 접촉 또는 배양하는 것을 목적으로 할 것이다(예를 들어, PBS-Tween과 같은 PBS 함유 용액에서 실온에서 2시간 동안 배양).
표지된 항체와의 배양 후, 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 후, 표지의 양은, 예를 들어, 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플, 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS) 또는 효소 표지로서 퍼옥시다아제의 경우 H2O2와 같은 발색성 기질과의 배양에 의해 정량화된다. 이어서, 정량화는, 예를 들어, 가시 스페특럼 분광광도계를 사용하여 생성된 색상의 정도를 측정함으로 달성된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 경쟁적 포맷의 사용을 고려한다. 이는 샘플에서 한타바이러스 항체의 검출에 특히 유용하다. 경쟁 기반 검정에서, 공지되지 않은 양의 분석물 또는 항체는 공지된 양의 표지된 항체 또는 분석물을 대체하는 능력에 의해 결정된다. 따라서, 신호의 정량화 가능한 손실은 샘플에서 공지되지 않은 항체 또는 분석물의 양을 나타낸다.
여기서, 본 발명자는 샘플에서 한타바이러스 항체의 양을 결정하기 위해 표지된 한타바이러스 모노클로날 항체의 사용을 제안한다. 기본적인 포맷은 공지된 양의 한타바이러스 모노클로날 항체(검출 가능한 표지에 연결됨)를 한타바이러스 항원 또는 입자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한타바이러스 항원 또는 유기체는 바람직하게는 지지체에 부착된다. 표지된 모노클로날 항체를 지지체에 결합시킨 후, 샘플을 첨가하고, 샘플 내의 임의의 비표지된 항체가 표지된 모노클로날 항체와 경쟁하고, 따라서 치환될 수 있도록 하는 조건하에서 배양한다. 손실된 표지 또는 남아있는 표지를 측정하여(그리고 부착된 표지의 원래 양에서 그것을 뺌), 지지체에 얼마나 많은 비표지된 항체가 결합되는지, 따라서 샘플에 얼머나 많은 항체가 존재했는지를 결정할 수 있다.
B. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯(대안적으로, 단백질 면역블롯)은 소정의 조직 균질물 또는 추출물 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술이다. 겔 전기영동을 사용하여 폴리펩티드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3-D 구조(천연/비변성 조건)에 의해 천연 또는 변성된 단백질을 분리한다. 이어서, 단백질은 막(전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮겨지고, 여기서 그들은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙(검출)된다.
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양물로부터 채취될 수 있다. 대부분의 경우, 고체 조직은 먼저 블렌더(더 큰 샘플 용적의 경우), 균질화기(더 적은 용적)를 사용하거나 초음파 처리에 의해 기계적으로 분쇄된다. 세포는 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 파괴되어 개방될 수 있다. 그러나, 박테리아, 바이러스 또는 환경 샘플이 단백질의 공급원일 수 있고, 따라서 웨스턴 블롯팅은 세포 연구에만 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 다양한 세제, 염 및 완충액을 사용하여 세포의 용해를 촉진하고 단백질을 가용화할 수 있다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 종종 자체 효소에 의한 샘플의 소화를 방지하기 위해 첨가된다. 조직 제조는 종종 단백질 변성을 피하기 위해 냉온에서 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하, 또는 이들 인자의 조합에 의한 것일 수 있다. 분리의 특성은 샘플의 처리 및 겔의 특성에 따라 달라진다. 이것은 단백질을 결정하는 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플에서 단백질을 2차원으로 확산시키는 2차원(2-D) 젤을 사용할 수도 있다. 단백질은 1차원에서는 등전점(중성 순 전하를 갖는 pH)에 따라 분리되고, 2차원에서는 분자량에 따라 분리된다.
단백질이 항체 검출에 접근할 수 있도록 만들기 위해, 그들은 겔 내에서 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 만들어진 막으로 이동시킨다. 막은 겔 상부에 놓고, 그 위에 여과지의 스택을 놓는다. 전체 스택은 모세관 작용에 의해 종이가 위로 이동하는 완충 용액에 배치하여 그것과 함께 단백질을 가져온다. 단백질을 옮기는 또 다른 방법은 전기블롯팅이라 칭명되고, 전류를 사용하여 단백질을 겔로부터 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막으로 끌어당긴다. 단백질은 겔 내에 있던 조직을 유지하면서 겔 내에서 막으로 이동한다. 이 블로팅 공정의 결과, 단백질은 검출을 위해 얇은 표면층에 노출된다(아래 참조). 두 종류의 막은 비특이적 단백질 결합 특성을 위해 선택된다(즉, 모든 단백질과 동일하게 잘 결합한다). 단백질 결합은 소수성 상호작용 및 막과 단백질 사이의 하전된 상호작용에 기초한다. 니트로셀룰로스 막은 PVDF보다 저렴하지만 훨씬 취성이며 반복된 프로빙을 잘 견디지 못한다. 겔에서 막으로의 단백질 전달의 균일성 및 전반적인 효능은 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 폰소 S 염료로 막을 염색함으로써 확인될 수 있다. 일단 전달되면, 단백질은 표지된 1차 항체 또는 비표지된 1차 항체를 사용하여 검출되고, 이어서 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 표지된 단백질 A 또는 2차 표지된 항체를 사용하는 간접 검출이 이어진다.
C. 측방 유동 검정
측방 유동 면역크로마토그래피 검정으로도 공지된 측방 유동 검정은 전문적이고 비싼 장비를 필요로 하지 않고 샘플(매트릭스)에서 표적 분석물의 존재 (또는 부재)를 검출하도록 의도된 간단한 장치이지만, 판독 장비에 의해 지원되는 많은 실험실 기반 적용이 존재한다. 전형적으로, 이러한 테스트는 가정 테스트, 진료 시점 테스트 또는 실험실 사용을 위해 저자원 의료 진단으로 사용된다. 널리 확산되고 익히 공지된 적용은 가정용 임신 테스트이다.
이 기술은 다공성 종이 또는 소결된 중합체의 조각과 같은 일련의 모세관 상을 기반으로 한다. 이 요소들 각각은 자발적으로 유체(예: 소변)를 수송하는 능력을 갖는다. 첫 번째 요소(샘플 패드)는 스펀지 역할을 하며 과도한 샘플 유체를 보유한다. 일단 침지되면, 유체는 제조업체가 입자의 표면에 고정된 표적 분자(예: 항원) 및 이의 화학적 파트너(예: 항체) 사이의 최적화된 화학 반응을 보장하기 위해 모든 것을 함유하는 염-당 매트릭스 중의 건조된 포맷의 생물활성 입자(아래 참조)인 소위 접착체를 저장한 두 번째 요소(접합체 패드)로 이동한다. 샘플 유체는 염-당 매트릭스를 용해시키는 동안, 그것은 또한 입자를 용해시키고, 하나의 조합된 수송 작용에서, 샘플 및 접합체는 다공성 구조를 통해 유동하면서 혼합한다. 이러한 방식으로, 분석물은 세 번째 모세관 상을 통해 추가로 이동하면서 입자에 결합한다. 이 물질은 제3 분자가 제조업체에 의해 고정된 하나 이상의 영역(종종 스트라이프라고 칭명됨)을 갖는다. 샘플-접합체 혼합물이 이러한 스트라이프에 도달할 때까지, 분석물은 입자에 결합되고, 세 번째 '포획' 분자는 복합체에 결합한다. 잠시 후, 점점 더 많은 유체가 스트라이프를 통과하면, 입자가 축적되고 스트라이프 영역의 색상이 변한다. 전형적으로, 적어도 두 개의 스트라이프가 있다: 하나(대조군)는 임의의 입자를 포획하여 반응 조건과 기술이 잘 작동했음을 보여주고, 두 번째는 특정 포획 분자를 함유하고 분석물 분자가 고정된 입자들만 포획한다. 이러한 반응 영역을 통과한 후, 유체는 단순히 폐기물 용기 역할을 하는 최종 다공성 물질-심지-에 들어간다. 측방 유동 테스트는 경쟁적 또는 샌드위치 검정으로 작동할 수 있다. 측방 유동 검정은 미국 특허 제6,485,982호에 개시되어 있다.
D. 면역조직화학
본 개시내용의 항체는 또한 면역조직화학(IHC)에 의한 연구용으로 제조된 신선한-동결된 및/또는 포르말린 고정된 파라핀-매립 조직 블록 둘 다와 조합하여 사용될 수 있다. 이들 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자의 이전 IHC 연구에 성공적으로 사용되었고, 당업자에게 익히 공지되어 있다(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간략하게, 동결된 절편은 실온에서 50ng의 동결된 "분쇄" 조직을 작은 플라스틱 캡슐 중의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재수화하고; 원심분리에 의해 입자를 펠렛화하고; 그들을 점성의 매립화 배지(OCT)에 재현탁시키고; 캡슐을 역전시키고/시키거나 원심분리에 의해 다시 펠렛화하고; -70℃ 이소펜탄에서 급속 동결시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 조직의 동결된 실린더를 제거하고; 조직 실린더를 냉동 마이크로톰 척 상에 고정시키고/시키거나; 캡슐로부터 25 내지 50개의 연속 절편을 절단함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 전체 동결 조직 샘플이 연속 절편 절단에 사용될 수 있다.
영구 절편은 플라스틱 마이크로퍼지 튜브에 50mg 샘플을 재수화하는 단계; 펠렛화하는 단계; 4시간 고정 동안 10% 포르말린에 재현탁시키는 단계; 세척하고/펠렛화하는 단계; 따뜻한 2.5% 한천에 재현탁시키는 단계; 펠렛화하는 단계; 한천을 경화시키기 위해 빙수로 냉각시키는 단계; 튜브로부터 조직/한천 블록을 제거하는 단계; 블록을 파라핀에 침윤시키고/시키거나 매립하는 단계; 및/또는 최대 50개의 연속 영구 절편을 절단하는 단계를 포함하는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다시, 전체 조직 샘플은 치환될 수 있다.
E. 면역검출 키트
추가의 구현예에서, 본 개시내용은 상기한 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항체는 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원을 검출하는데 사용될 수 있기 때문에, 항체는 키트에 포함될 수 있다. 따라서, 면역검출 키트는 적절한 용기 수단에 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원에 결합하는 제1 항체 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 구현예에서, 한타바이러스 항체는 컬럼 매트릭스 및/또는 마이크로타이터 플레이트의 웰과 같은 고체 지지체에 미리 결합될 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 주어진 항체와 관련되거나 이에 연결된 검출 가능한 표지를 포함하는 것들을 포함하는 다양한 형태 중의 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 관련되거나 이에 부착된 검출 가능한 표지가 또한 고려된다. 예시적인 2차 리간드는 제1 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 2차 항체이다.
본 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은 제1 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 2차 항체를 제2 항체에 대해 결합 친화도를 갖는 제3 항체와 함께 포함하는 2성분 시약을 포함하고, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다. 상기 주시된 바와 같이, 다수의 예시적인 표지가 당업계에 공지되어 있고, 모든 이러한 표지는 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있다.
상기 키트는 검출 검정의 표준 곡선을 제조하는데 사용될 수 있는 바와 같이, 표지되든 비표지되든 한타바이러스 또는 한타바이러스 항원의 적합하게 분액화된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완전히 접합된 형태로, 중간체의 형태로, 또는 키트의 사용자에 의해 접합되는 별개의 모이어티로서 항체-표지 접합체를 함유할 수 있다. 키트의 성분은 수성 배지에 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 항체가 배치될 수 있거나, 또는 바람직하게는 적합하게 분액화될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 항체, 항원, 및 임의의 다른 시약 용기를 상업적 판매를 위해 근접 감금으로 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 유지되는 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
F. 백신 및 항원 품질 관리 검정
본 개시내용은 또한 샘플에서 바이러스 항원의 항원 완전성을 평가하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 항체 단편의 용도를 고려한다. 백신과 같은 생물학적 의약품은 일반적으로 분자적으로 특성화될 수 없다는 점에서 화학 약물과 상이하고; 항체는 상당한 복잡성을 갖는 큰 분자이고 제조에서 제조에 이르기까지 광범위하게 변하는 능력을 갖는다. 그들은 또한 삶의 시작시 어린이를 포함한 건강한 개체에게 투여되며, 따라서 스스로 해를 끼치지 않고 생명을 위협하는 질환을 예방하거나 치료하는 데 효과적임을 가능한 한 최대한으로 보장하기 위해 품질에 중점을 두어야 한다.
백신의 생산 및 분포의 세계화가 증가함에 따라 공중 보건 문제를 보다 잘 관리할 수 있는 새로운 가능성을 열었지만, 다양한 공급원에서 조달된 백신의 동등성과 상호교환 가능성에 대한 의문을 또한 제기했다. 출발 물질의, 생산 및 품질 관리 테스트의 국제 표준화 및 이들 제품이 제조되어 사용되는 방식에 대한 규제 감독에 대한 높은 기대치의 설정은 따라서 지속적인 성공의 초석이 되었다. 그러나, 그것은 끊임없는 변화의 분야로 남아 있으며, 이 분야에서 지속적인 기술 발전은 가장 오래된 공중 보건 위협뿐만 아니라 새로운 것 - 몇 가지 예를 들자면, 말라리아, 유행성 인플루엔자, 및 HIV에 대한 강력한 새로운 무기를 개발할 전망을 제공할 뿐만 아니라 제조업체, 규제 기관 및 광범위한 의료계에 큰 압력을 가하여 제품이 달성 가능한 최고 수준의 품질 표준을 지속적으로 충족한다는 것을 보장한다.
따라서, 임의의 공급원으로부터, 또는 제조 공정 중 임의의 시점에, 항원 또는 백신을 수득할 수 있다. 따라서, 품질 관리 공정은 본원에 개시된 항체 또는 단편의 바이러스 항원에 대한 결합을 확인하는 면역검정을 위한 샘플을 제조하는 것으로 시작할 수 있다. 이러한 면역검정은 본 문서의 다른 곳에 개시되어 있으며, 이들 중 임의의 것을 사용하여 항원의 구조적/항원성 완전성을 평가할 수 있다. 항원적으로 정확하고 온전한 항원의 허용 가능한 양을 함유하는 샘플을 발견하기 위한 표준은 규제 기관에 의해 확립될 수 있다.
항원 완전성이 평가되는 또 다른 중요한 구현예는 저장 수명 및 저장 안정성을 결정하는 것이다. 백신을 포함한 대부분의 의약품은 시간이 경과함에 따라 악화될 수 있다. 따라서, 시간이 경과함에 따라 백신에서와 같이 항원이 분해되거나 불안정되어 더 이상 항원성이 아니고/아니거나 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 생성할 수 있는지 여부를 결정하는 것이 중요하다. 다시, 항원적으로 온전한 항원의 허용 가능한 양을 함유하는 샘플을 발견하기 위한 표준은 규제 기관에 의해 확립될 수 있다.
특정 구현예에서, 바이러스 항원은 하나 이상의 보호 에피토프를 함유할 수 있다. 이러한 경우에, 1개 이상의 항체, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 심지어 그 이상의 항체의 결합을 검토하는 검정을 사용하는 것이 유용한 것으로 입증할 수 있다. 이들 항체는 밀접하게 관련된 에피토프에 결합하여 그들은 인접하거나 심지어 서로 중첩되도록 한다. 한편, 그들은 항원의 상이한 부분으로부터 별개의 에피토프를 나타낼 수 있다. 다중 에피토프의 완전성을 조사함으로써, 항원의 전반적인 완전성, 및 따라서 보호 면역 반응을 생성하는 능력에 대한 보다 완전한 그림이 결정될 수 있다.
본 개시내용에 기재된 항체 및 이의 단편은 또한 보호 한타바이러스 항체의 존재를 검출함으로써 백신 접종 절차의 효능을 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다. 본 개시내용에 기재된 항체, 항체 단편, 또는 이의 변이체 및 유도체는 또한 목적하는 면역원성을 갖는 백신 제조를 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다.
VI. 실시예
하기 실시예는 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 하기 실시예에 개시된 기술은 구현예의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 그의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 개시 내용의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 유사하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1 - 물질 및 방법
세포주. 모든 세포주는 매월 마이코플라스마에 대해 테스트되었고, 모든 샘플은 음성이었다. Expi293F 세포(ATCC, 암컷)는 10% 플루로닉 F-68 및 200mM의 L-글루타민이 보충된 프리스타일 F17 발현 배지(Gibco)에서 125RPM에서 37℃, 8.0% CO2에서 현탁액에서 배양하였다. ExpiCHO 세포(ATCC, 암컷)는 ExpiCHO 발현 배지(Thermo Fisher)에서 125RPM에서 37℃, 8.0% CO2에서 현탁액에서 배양하였다. 엡스타인-바 바이러스를 생산하는 B95.8 세포(ATCC® CRL-1612, 암컷) 및 인간 B 세포 하이브리도마 형성을 위한 융합 파트너로서 사용된 비분비 골수종 HMMA2.5 이종골수종 세포주(Lisa Cavacini에 의해 친절하게 제공됨, 여성 인간 및 암컷 마우스 요소)는 각각 ClonaCell-HY 배지 A에서 8% CO2 중 37℃에서 배양하였다. BHK-21(WI-2) 세포주(Kerafast, 시리아 골든 햄스터, 성별 불특정됨) 및 베로 E6 세포주(ATCC, CCL-81, 아프리카 그린 원숭이, 성별 불특정됨)는 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM에서 8% CO2에서 37℃에서 배양하였다. 인간 1차 제대 정맥 내피 세포(HUVEC, ATCC, 풀링됨, 성별 뱃치-특이적)를 내피 세포 성장 키트-VEGF(ATCC)가 보충된 혈관 기초 배지에서 5% CO2에서 37℃에서 배양하였다. PBMC(백혈구 여과 필터로부터 수득됨, Nashville Red Cross, 수컷)를 조사하고, 10% DMSO를 함유하는 배지 A에 동결보존시켰다.
인간 대상체. SNV 면역 대상체(공여자 ID# 1486)는 2017년 6월 6일에 한타바이러스 감염으로 진단된 유타주 출신의 57세 남성이었다. 말초 혈액은 2018년 6월 20일(감염 후 1년)에 미국에서 이 대상체로부터 수득되었다. SNV 면역 대상체(공여자 ID# 1487)는 2010년 12월에 한타바이러스 감염으로 진단된 캔자스주 출신의 36세 여성이었다. 말초 혈액은 2018년 7월 20일(감염 후 8년)에 미국에서 이 대상체로부터 수득되었다. SNV 면역 대상체(공여자 ID# 1513)는 미지의 날짜에 한타바이러스 감염으로 진단된 텍사스주 출신의 41세 남성이었다. 말초 혈액은 2018년 4월 3일에 미국에서 이 대상체로부터 수득되었다. Vanderbilt University Medical Center Institutional Review Board의 승인을 받은 서면 동의서는 모든 인간 대상체로부터 제공되었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 피콜에서 밀도 구배 원심분리를 사용하여 단리되고 실험에 사용될 때까지 액체 질소에서 동결보존되었다. ANDV 면역 개체(공여자 ID# 1685)의 PBMC는 칠레의 Universidad Del Desarrollo에서 2015년에 수집되었다. 연구는 Universidad Del Desarrollo 및 Vanderbilt University Medical Center의 기관 검토위원회의 승인을 받았다. PBMC는 2015년에 액체 질소 건조 운송업체를 사용하여 Vanderbilt로 옮겼다.
바이러스. 안데스 바이러스 균주 칠레-9717869(칠레 R123) 및 신 놈브레 바이러스 균주 SN77734는 UTMB에서 신흥 바이러스 및 아르보바이러스에 대한 세계 참조 센터로부터 수득되었다.
동물 모델. 8주령의 암컷 골든 시리안 햄스터, 균주 HsdHan®:AURA를 생존 연구에 사용하였다. 모든 동물 실험 및 절차는 국립 보건원(National Institutes of Health)의 실험 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 텍사스 대학 의과 지부(IACUC2004049)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인받았다. 주사는 케타민 하이드로클로라이드 및 크실라진으로 유도되고 유지되는 마취하에 수행되었으며, 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다.
세포-표면 발현된 항원의 생성. 다양한 한타바이러스 종으로부터의 전장 M 세그먼트를 인코딩하는 cDNA를 함유하는 플라스미드(pWRG/SN-M(opt)(Hooper et al., 2013), pWRG/AND-M(opt2)(Hooper et al., 2014a), pWRG/PUU-M(s2)(Brocato et al., 2013), pWRG/DOB-M(opt), pWRG/HTN-M(co)(Hooper et al., 2001a) 및 pWRG/SEO -M(opt2)(Hooper et al., 2001a))(제이 후퍼 박사(Dr. Jay Hooper)에 의해 친절하게 제공됨, 미국 육군 감염병 의학 연구소(USAMRIID))를 사용하여 세포 표면 표시된 한타바이러스 항원을 생성하였다. Expi293F 세포는 10% 플루로닉 F-68 및 200mM L-글루타민을 함유하는 프리스타일(Freestyle) F17 발현 배지(Gibco)에서 배양되었고, 엑스피펙타민(Expifectamine) 293 형질감염 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 플라스미드 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. Expi293F 세포를 형질감염 48시간 후에 수확하고, 유세포 계측 검정에 사용하기 위해 동결보존하였다.
NWH- 반응성 항체의 스크리닝 및 결합. 유세포 계측 검정을 사용하여 NWH 반응성 항체의 결합을 스크리닝하고 정량화하였다. 상기한 바와 같이 전장 M 세그먼트로 형질감염된 Expi293F 세포를 해동하고, 40μm 세포 스트레이너를 통해 변형시키고, FACS 완충액(2% 초저 IgG FBS, 1mM EDTA, D-PBS)에서 50,000 세포/웰로 96-웰 V-바닥 플레이트에 플레이팅했다. 세포를 정제된 mAb 또는 세포 상청액과 함께 4℃에서 1시간 동안 배양하고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, 피코에리트린(PE)(Southern Biotech)에 접합된 염소 항-인간 IgG 항체의 1:1,000 용액으로 4℃에서 30분 동안 염색했다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 5μg/mL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Thermo Fisher)로 4℃에서 5분 동안 염색하였다. PE 및 DAPI 염색은 iQue Screener Plus 유세포 계측기(Intellicyt)로 측정하고 제조업체의 ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 정량화했다. 퍼센트 PE 양성 세포의 값은 2차 항체만으로 염색된 Expi293F 세포의 상대적 형광 강도에 기초하여 게이팅함으로써 결정되었다.
인간 하이브리도마의 단리 및 모노클로날 항체의 정제. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Histopaque(Sigma-Aldrich) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 면역 대상체 혈액 샘플로부터 단리되고, 사용 전까지 액체 질소의 기상에서 동결보존시켰다. PBMC를 해동시키고, 600만 개의 세포를 엡스타인-바 바이러스를 함유하는 4.5mL의 여과된 상청액(배양된 B95.8 세포로부터 수집된 상청액 중)으로 형질전환시키고, 2.5㎍/mL CpG(포스포로티오에이트-변형된 올리고데옥시뉴클레오티드 ZOEZOEZZZZEEEEZOEZZZT(서열번호 453), Invitrogen), 10μM Chk2 억제제(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 C3742), 및 10μg/mL 사이클로스포린 A(Sigma-Aldrich, 카탈로그 번호 C1832)를 함유하는 배지에 플레이팅하고, 384-웰 플레이트에 플레이팅했다. 7일 후, 림프아구성 세포주(LCL)를 96-웰 플레이트에서 조사된 PBMC(백혈구 여과 필터로부터 수득됨, Nashville Red Cross)를 함유하는 피더층 상에서 확장시켰다. LCL 상청액을 수집하고, Expi293F-SNV-M 세포, Expi293F-ANDV-M 세포, 또는 모의 형질감염된 Expi293F 세포를 사용하는 유세포 계측 검정에서 스크리닝하였다. 항인간 IgG 2차 접합 PE 항체(Southern Biotech)를 검출에 사용하였다. NWH 반응성 항체를 분비하는 세포주는 모의 형질감염된 Expi293F 세포에 기초한 게이팅에 의해 확인되었다. 이어서, 항원 반응성 웰 내의 LCL을 전기 융합에 의해 HMMA2.5 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성하고, 100μM 히포크산틴, 0.4μM 아미노프테린, 16μM 티미딘 및 7μg/mL 우아바인을 함유하는 배지에 플레이팅했다. 하이브리도마를 3주 동안 배양한 후, Expi293F-SNV-M 또는 Expi293F-ANDV-M을 사용하는 유세포 계측 결합 검정으로 다시 스크리닝하여 SNV 및 ANDV 반응성 항체를 분비하는 세포를 확인하였다. 양성 웰은 SH800S 세포 분류기(Sony™)에서 384-웰 플레이트로 단일 세포 분류되었다. 이어서, 단일 세포를 3 내지 4주 동안 배양하고, 유세포 계측법에 의해 Expi293F-SNV-M 또는 Expi293F-ANDV-M 세포에 대해 스크리닝하여 양성 클론을 확인하였다. 이어서, Expi293F-SNV-M 또는 Expi293F-ANDV-M 세포와 반응된 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 G-Rex 6-웰 플레이트(Wilson Wolf)로 확장시키고, 하이브리도마 무혈청 배지(Gibco)에서 2 내지 4주 동안 성장시켰다. 상청액을 G-Rex 플레이트로부터 수확하고, 0.45㎛ 공극 크기 필터 플라스크로 여과하였다. 그런 다음, HiTrap MabSelectSure 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 AKTA 순수 단백질 정제 시스템(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 하이브리도마 상청액으로부터 mAb를 친화도 정제하였다.
항체 유전자 서열 분석. RNA는 이전에 기재된 바와 같이 cDNA 말단의 변형된 5' 급속 증폭(5' RACE)에 기초하는 클로닝된 하이브리도마 세포 펠렛으로부터 추출 및 증폭되었다(Turchaninova et al., 2016). 이어서, 준비된 앰플리콘 라이브러리를 Sequel Platform(Pacific Biosciences)을 사용하여 서열분석하였다. 아이소타입 및 서브클래스는 불변 영역의 서열을 통해 결정되었다. 항체 유전자 세그먼트, 상보성 결정 영역(CDR)을 결정하기 위한 서열 분석, 및 생식세포계열로부터의 % 돌연변이는 ImMunoGeneTics(IMGT) V-QUEST 도구를 사용하여 수행되었다(Giudicelli et al., 2011).
의사유사형 VSV의 생성. 모든 의사유사형 바이러스는 플라스미드 pWRG/SN-M(opt), pWRG/AND-M(opt2), pWRG/PUU-M(s2), pWRG/DOB-M(opt), pWRG/HTN-M(co), pWRG/SEO-M(opt2) 및 pCAGGS-G-Kan(Kerafast, 마이클 에이. 휘트 박사(Dr. Michael A. Whitt)에 의해 친절하게 제공됨)을 사용하여 이전에 공개된 프로토콜(Whitt, 2010)에 기초하여 생성되었다. BHK-21(WI-2) 세포를 6-웰 플레이트에 100,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 10μL의 리포펙타민 3000 및 P300 시약(Thermo Fisher) 및 2.5μg의 플라스미드 DNA로 형질감염시키고, 배지를 제거하고 4시간 후에 정상 성장 배지로 교체하였다. 형질감염 48시간 후, 세포를 무혈청 DMEM에서 약 0.02의 다중도로 G*ΔG-GFP rVSV(Kerafast, 마이클 에이. 휘트 박사에 의해 친절하게 제공됨)로 접종하고, 3시간 후에 세포를 PBS로 2회 세척하고, 정상 성장 배지를 세포에 첨가하였다. 세포를 32℃에서 배양하였다. pVSV/ANDV, pVSV/DOBV 또는 pVSV/VSV-G를 함유하는 상청액을 감염 24시간 후 수집하고, pVSV/SNV, pVSV/HTNV, pVSV/SEOV 또는 pVSV/PUUV를 함유하는 상청액을 감염 48시간 후 수집했다. 상청액을 원심분리에 의해 투명하게 하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다.
의사유형 바이러스 중화 검정. 작제물 pVSV/ANDV, pVSV/DOBV, pVSV/SNV, pVSV/HTNV, pVSV/SEOV 및 pVSV/PUUV를 중화 검정에 사용하였다. BHK-21 세포를 96-웰 플레이트에서 5,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 항체를 완전 성장 배지로 단계적으로 희석한 다음, 바이러스와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 항체 및 바이러스를 함유하는 배지를 세포에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하여 바이러스 부착을 가능하게 했다. 그런 다음, 세포를 세척하고 항체 및 바이러스 혼합물을 제거하고 완전 성장 배지로 교체했다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 CTL ImmunoSpot® S6 분석기(CTL)로 영상화하고, GFP 양성 세포를 각 웰에서 계수하였다. 상대적 감염성 퍼센트는 항체를 함유하는 웰 내의 GFP 양성 세포의 수를 나누고, 바이러스만을 포함하는 웰 내의 GFP 양성 세포의 평균 수로 정규화함으로써 계산되었다.
수용체 차단 검정. 가용성 세포외 카드헤린 반복 1(sEC1, GenBank 수탁 번호 NM_002587, 잔기 1-172) 작제물을 합성하고, C-말단 GSG 링커 및 데카히스티딘 태그를 갖는 GenScript에 의해 pCDNA3.1(+) 포유류 세포 발현 벡터로 클로닝했다. sEC1은 ExpiCHO 세포에서 발현되고 AKTA 순수 단백질 정제 시스템(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 HisTrap 엑셀 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 통해 정제되고, 이어서 Alexa Fluor 647(Thermo Fisher)로 표지되었다. 이전에 기재된 바와 같이, 전장 ANDV M 세그먼트를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염된 Expi293F 세포를 10μg/mL의 각 mAb와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 뎅기열 바이러스 엔벨로프 단백질에 지시된 대조군 mAb, DENV 2D22를 음성 대조군으로서 첨가하고, 비표지된 sEC1을 양성 대조군으로서 50μg/mL로 첨가하였다. 표지된 sEC1을 세포 현탁액 및 제1 mAb에 최종 농도 200ng/mL로 직접 첨가하고, 4℃에서 추가 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 유세포 계측 완충액으로 세척하고, 0.5μg/mL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였다. Alexa Fluor 647 및 DAPI 염색은 iQue Screener Plus 유세포 계측기(Intellicyt)로 측정하고, 제조업체의 ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 정량화했다. 항체의 존재하에 결합을 표지된 sEC1만의 최대 결합 신호로 나누어 수용체 차단 %를 결정하였다.
융합 억제 검정. 세포 대 세포 융합 억제 검정은 이전에 공개된 방법으로부터 적응되었다(Willensky et al., 2016). 베로 세포를 96-웰 플레이트(GreinerBio-One)에서 7,500 세포/웰로 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 0.2 μL/웰의 리포펙타민 3000 및 P300 시약(Thermo Fisher) 및 100ng/웰의 플라스미드 pWRG/SN-M(opt) 또는 75ng/웰의 플라스미드 pWRG/AND-M으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 10μg/mL의 각 mAb를 형질감염된 세포에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. mAb를 함유하는 배지를 제거하고, MES 완충 D-MEM(pH 5.5)으로 교체하고, 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 세포를 D-PBS로 2회 세척하고, 배지를 정상 성장 배지(D-MEM, pH 7.4)로 교체하였다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 1μM 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트(Cell Tracker CMFDA, Molecular Probes)를 함유하는 D-MEM에서 37℃에서 추가 1시간 동안 배양하여 세포질을 염색하였다. 이어서, 세포를 실온에서 20분 동안 4%(w/v) 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.1% Triton X-100으로 침투시켰다. 한타바이러스 당단백질을 염색하기 위해, 세포를 SNV-27 및 ANDV-44의 조합(0.1% BSA 중 각각 0.5μg/mL)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고, 진탕시킨 후 PBS-T로 2회 세척했다. 이어서, 세포를 염소 항-인간 IgG Alexa Fluor 568(0.1% BSA 중 1μg/mL)로 45분 동안 배양(진탕)하고, PBS-T로 2회 세척한 후, 0.1μg/mL의 DAPI를 함유하는 D-PBS를 첨가하여 핵을 염색했다. Image Xpress(Molecular Devices) 형광 이미저를 사용하여 웰 채널당 4개의 이미지를 포획했다. 융합 지수는 MetaXpress 소프트웨어(Molecular Devices) 미세핵 적용 모듈을 사용하여 측정되었다. 웰당 4개의 이미지를 사용하여 다핵 세포의 %를 계산한 다음, 평균값을 mAb(최대 다핵 세포 형성을 나타냄)로 처리되지 않은 대조군 웰로 정규화하여 각 mAb에 대한 융합 지수(%)를 계산했다.
경쟁-결합 검정. 이전에 기재된 바와 같이, ANDV 또는 SNV 전장 M 세그먼트로 형질감염된 Expi293F 세포를 10μg/mL의 최초의 비표지된 mAb와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. Alexa Fluor 647(Thermo Fisher)로 표지된 제2 mAb를 세포 현탁액 및 제1 mAb에 최종 농도 0.5μg/mL로 직접 첨가하고, 4℃에서 추가로 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 FACS 완충액으로 세척하고, 0.1μg/mL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였다. Alexa Fluor 647 및 DAPI 염색은 iQue Screener Plus 유세포 계측기(Intellicyt)로 측정하고 제조업체의 ForeCyt 소프트웨어를 사용하여 정량화했다. 제1 항체의 존재하에서의 결합을 표지된 항체만의 최대 결합 신호로 정규화하여 % 경쟁 값을 결정하였다.
시리아 햄스터 안데스 바이러스 챌린지 연구. 동물 챌린지 연구는 Galveston National Laboratory의 ABSL-4 시설에서 수행되었다. 마우스에서 mAb의 시험을 위한 동물 프로토콜은 갤버스턴(UTMB)의 텍사스 대학 의료 분과의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 8주령의 암컷 시리아 골든 햄스터(메소크리세투스 오라투스(Mesocricetus auratus))(Envigo)에 0일째에 근육내(i.m.) 경로로 200 PFU의 안데스 한타바이러스(균주 칠레-9717869)를 접종하였다. 동물(n=6/그룹)은 바이러스 접종 후 3일 및 8일째에 복강내(i.p.) 경로로 5mg/kg의 SNV-24, SNV-30, SNV-53, ANDV-5, ANDV-44, 또는 DENV 2D22(음성 대조군 뎅기열 바이러스 항체)로 처리하고, 질환에 대해 모니터링했다. 챌린지 후 26일 동안 동물의 체중을 매일 측정하고 모니터링하였다. 동물이 증상을 보이면, 하루에 두 번 검사했다. 질환은 다음 파라미터를 사용하여 점수를 매겼다: 호흡 이상, 구부린 자세, 주름진 털, 빠르고 얕은 호흡, 움직임 부족 및 체중 감소.
빈사 상태의 동물은 IACUC 프로토콜에 의해 명시된 바와 같이 안락사시켰다. 연구의 8일째 및 11일째에 채혈하고, 모든 동물은 말기 출혈과 장기 수집(폐 및 간)이 수행되었을 때 감염 32일 후에 안락사시켰다.
진본 SNV 및 진본 ANDV를 사용하는 초점 감소 중화 검정. 초점 기반 중화 검정을 위해, UTMB 아르보바이러스 레퍼런스 컬렉션의 100 PFU의 안데스 바이러스(ANDV) 칠레-9717869(GenBank 참조 # AF291702-04) 또는 신 놈브레(SNV), SN 77734(GenBank 참조 # AF281850-52)를 37℃에서 1시간 동안 3회 100μL의 용적의 다양한 농도의 Mab와 함께 예비배양하고, 96-웰 플레이트에서 베로-E6 세포의 단층에 배치했다. 37℃에서 1시간 동안 바이러스를 흡착시킨 후, 바이러스-항체 혼합물을 10% 태아 소 혈청(Quality Biologicals) 및 0.1% 겐타마이신 설페이트(Mediatech)를 함유하는 최소 필수 배지(MEM) 중 100μL의 0.9% 메틸셀룰로스로 대체한 다음, 37℃에서 배양한다. 플레이트는 생물봉쇄 실험실을 제거한 후 10% 완충 포르말린(Thermo Fisher)으로 고정시켰다. 감염 후 6 내지 7일 또는 10 내지 11일째에, 각각 ANDV 또는 SNV 모노클로날 항체의 혼합물로 단층을 염색함으로써 병소를 시각화하였다. KPL 친화도 정제된 퍼옥시다아제 표지된 염소 항-인간 IgG(SeraCare)를 2차 항체로서 사용하고, AEC 기질 키트(Abcam)를 HRP의 기질로 사용하였다. 병소를 계수하고, 중화 곡선을 모의 중화 바이러스와 비교하여 병소 수 감소 백분율로서 플롯팅했다.
조직 병리학. 부검 동안, 총체적 병변이 관찰되었고, 왼쪽 엽으로부터의 대표적인 폐 조직이 10% 포르말린으로 수집되었다. 4℃에서 24시간 초기 고정 후, 폐 조직을 격리로부터 제거하기 전에 추가 48시간 고정 동안 신선한 10% 포르말린으로 옮겼다. 포르말린 고정 조직은 UTMB 해부학적 병리학 코어에 의한 표준 조직학적 절차에 의해 처리되었다. 약 4㎛ 두께의 절편을 절단하여 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. 폐의 절편을 염증 정도, 염증성 병소의 유형 및 감염되지 않은 동물 또는 대조군 동물의 절편과 병행하여 폐포/폐포 중격/기도/혈관 변화에 대해 조사하였다. 맹검 조직 절편은 기재된 기준을 사용하여 병리학적 병변에 대해 반정량적으로 점수를 매겼다(표 S3).
각 실험의 통계 분석은 방법 및/또는 도면 범례에 기재되어 있다. 모든 통계 분석은 Prism v7(GraphPad) 또는 RStudio v1.3.1073에서 수행되었다.
결합 및 중화 곡선. mAb 결합의 EC50 값은 하부 제약 값이 0인 4-파라미터 용량 반응 비선형 회귀 분석을 사용하는 항체 농도의 로그 변환을 통해 계산되었다. mAb 매개 중화의 IC50 값은 하부 제약 값이 0, 상부 제약 값이 100인 4-파라미터 용량 반응 비선형 회귀 분석을 사용하는 항체 농도의 로그 변환에 의해 계산되었다. IC90 값은 IC50 값과 같은 방법으로 계산되었지만, F 상수는 10으로 설정되었다. EC50, IC50 및 IC90의 값은 2 내지 3개의 독립적인 실험으로부터 생성되었고, 평균값으로 보고되었다.
경쟁-결합 분석. mAb 처리된 샘플의 결합 값을 최대 결합 대조군으로 정규화하여 각 mAb의 잔류 결합 %를 결정하고, 3개의 독립적인 실험으로부터의 값을 평균하였다. 상관 계수는 'rcorr' 함수를 사용한 RStudio 상의 피어슨 방법에 의해 결정되었다. mAb는 "hclust" 방법을 사용하여 상관 계수에 따라 정렬되었다.
시리아 햄스터의 치명적인 챌린지. 연구는 항체 처리 그룹당 6마리의 햄스터로 수행되었다. 생존 곡선은 카플란-마이어 분석을 통해 생성되었고, 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 각 mAb 처리 그룹을 아이소타입 대조군(DENV 2D22)과 비교하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)
실시예 2 - 결과
신세계-반응성 mAb의 단리 및 범위. 본 발명자는 이전에 SNV로 실험실 확인된 증후성 감염으로 고통받고 있던 3명의 달리 건강한 인간 개체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 20개의 SNV 반응성 mAb의 패널을 단리시켰다. 개체 1은 2010년 12월에 감염되었고, 샘플은 2018년 7월에 수집되었고; 개체 2는 2017년 6월에 감염되었고, 샘플은 2018년 6월에 수집되었고; 개체 3은 미지의 날짜에 감염되었고, 샘플은 2018년 4월에 수집되었다. 본 발명자는 또한 이전에 ANDV에 감염된 공여자로부터 16개의 ANDV 반응성 mAb의 패널을 단리시켰다. ANDVimmune 샘플은 칠레에서 수집되었고 연구 전에 익명화되었다. 모든 mAb는 전술한 바와 같이 B 세포 하이브리도마 방법을 통해 생성되었다(Alvarado and Crowe, 2016; Powell et al., 2020a; Smith and Crowe, 2015; Yu et al., 2008). 본 발명자는 Expi293F 세포의 표면에서 발현된 ANDV 또는 SNV 당단백질에 대한 결합을 스크리닝하고, IQue Screener Plus(Intellicyt)에서 유세포 계측법을 통해 NWH 반응성 항체를 검출함으로써 ANDV- 또는 SNV-반응성 mAb를 발현하는 B 세포를 확인했다. 항체 유전자를 인코딩하는 RNA를 역전사하고, 증폭시키고, 클로닝된 하이브리도마 세포주로부터 서열분석하여 각 클론의 항체 가변 유전자를 확인하였다(표 S1 및 S2). IgG2 아이소타입인 SNV-57을 제외하고 대부분의 항체는 IgG1 아이소타입이었다.
NWH- 반응성 mAb의 결합 및 중화 효능. 다음으로, 본 발명자는 NWH 균주에 결합하고 중화하는 NWH 반응성 mAb의 발명자 패널의 능력을 특성화하고자 했다. 이를 위해, 본 발명자는 ANDV 또는 SNV 당단백질로 의사유형화된 VSV(pVSV/ANDV 및 pVSV/SNV)를 사용하거나 BSL3 조건하에 진본 야생형(wt) ANDV 또는 SNV를 사용하여 인간 mAb의 교차 중화 및 결합 활성을 시험하였다(도 1a-b). 대부분의 한타바이러스 종은 CDC 위험 그룹 3의 병원체이며, 이는 진본 바이러스를 조작하기 위한 BSL3 절차를 필요로 한다. BSL2 환경에서 중화 활성에 대한 패널의 구성원을 스크리닝하기 위해, 본 발명자는 VSV에 기초한 충분히 특성화된 바이러스 의사유형화 시스템을 사용하였다(Higa et al., 2012; Ray et al., 2010; Schnell et al., 1996; Whitt, 2010). 이 시스템에서, VSV 당단백질을 인코딩하는 유전자는 바이러스 게놈으로부터 제거되고, 비리온은 NWH 당단백질 Gn 및 Gc로 의사유형화하여 복제-무능 바이러스 입자를 생성한다. 다음으로, pVSV/SNV 또는 pVSV/ANDV에 대한 중화 활성을 나타낸 모든 mAb를 초점 감소 중화 시험(FRNT)으로 SNV 균주 SN77734(wt SNV) 또는 ANDV 균주 칠레-9717869(wt ANDV)의 중화에 대해 시험하였다. MAb는 FRNT 검정에서 상동성 한타바이러스 종의 중화 효능에 기초하여 그룹화되었다(도 1a-b). 그룹 1 mAb는 초강력한 중화 활성(IC50 < 10ng/mL)을 나타냈고, 그룹 2 mAb는 강력한 중화 활성(IC50 10-100ng/mL)을 나타냈으며, 그룹 3 mAb는 중화 활성(IC50 100-10,000ng/mL)을 나타냈고, 그룹 4 mAb는 검출 가능한 중화 활성이 결여되었다.
하나의 SNV 반응성 mAb(SNV-42)만이 초강력한 중화 활성을 가졌고, 하나의 mAb(SNV-53)는 wt SNV에 대해 강력한 중화 활성을 가졌다(도 1a-b). SNV 반응성 패널의 4개의 추가 mAb는 또한 wt SNV를 중화시킨 반면, 나머지 mAb는 검출 가능한 중화 활성을 갖지 않았다. 본 발명자는 또한 ANDV 바이러스로부터 이종성 당단백질에 대한 결합을 시험하였고, SNV 면역 개체로부터 단리된 대부분의 mAb는 또한 ANDV 당단백질에 반응하고 pVSV/ANDV를 중화시켰음을 발견하였다(도 1a, 도 5, 도 6). pVSV/ANDV의 교차 반응성 및 교차 중화를 나타낸 모든 mAb는 FRNT에서 wt ANDV의 중화에 대해 시험되었고, 7개의 SNV 반응성 mAb는 wt ANDV의 중화 활성을 나타내었다. wt 바이러스를 사용한 모든 검정은 베로 세포를 사용하여 시험하였고, pVSV를 사용하는 모든 검정은 BHK-21 세포를 사용하여 시험하였지만, mAb는 또한 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하는 중화 검정에서 유사한 효능을 나타냈다(도 7a-b).
ANDV 면역 개체로부터 단리된 ANDV 반응성 mAb는 SNV 반응성 mAb에서 관찰된 교차 반응성 표현형과는 대조적으로 제한된 교차 중화 활성을 나타내었다(도 1b, 도 5, 도 6). 대부분의 ANDV 반응성 항체는 pVSV/ANDV 및 wt ANDV 검정에서 유사한 중화 활성을 나타내었고, 6개의 mAb는 초강력한 중화 활성을 나타내고, 3개의 mAb는 강력한 중화 활성을 나타내며, 4개의 mAb는 중화 활성을 나타낸다. 시험된 하나의 mAb, ANDV-44만이 wt SNV에 대해 중화 활성을 나타냈다. SNV Gn 및 Gc 단백질에 대한 교차 반응성도 또한 5개의 mAb(ANDV-44, -12, -59, -2 및 -54)로 제한되었다.
본 발명자들은 wt ANDV 및 wt SNV에 대해 중화 활성을 나타낸 mAb에 대해 두 가지 별개의 기능 패턴인 완전 또는 불완전한 중화에 주목하였다(도 1c). 불완전하게 중화하는 mAb는 시험된 최고 농도에서 잔류 바이러스 분획(>10% 상대적 감염성)을 남겼다. 그룹 1 및 2의 3개의 mAb(SNV-42, SNV-53 및 ANDV-44)만이 wt SNV에 대해 완전한 중화 활성을 나타낸(도 1c, 왼쪽 상단) 반면, 그룹 3의 나머지 mAb는 시험된 최고 농도에서 완전한 중화를 나타내지 않았다(도 1c, 왼쪽 하단). 모든 그룹 1 및 2의 ANDV 반응성 mAb 및 SNV-53은 wt ANDV의 완전한 중화를 나타내었다(도 1c, 오른쪽 상단). 그룹 3의 MAb는 시험된 최고 농도에서 wt ANDV에 대한 불완전한 중화를 나타냈다(도 1c, 오른쪽 하단). 요약하면, 대부분의 ANDV 반응성 mAb는 강력하고 종 특이적 중화 활성을 나타내는 반면, SNV 반응성 mAb는 덜 강력한 중화 활성을 입증했지만 범위는 더 넓었다.
NWH- 반응성 mAb의 기계론적 평가. 중화의 기계론적 기초를 결정하기 위해, 본 발명자는 수용체 차단 및 융합 억제를 측정하는 2개의 시험관내 검정에서 활성에 대해 모든 mAb를 시험하였다. 프로토카드헤린-1(PDCH-1)은 NWH의 후보 수용체로서 이전에 확인되었고, 세포외 카드헤린 반복 1(EC-1)은 ANDV 또는 SNV 당단백질과의 직접 결합 상호작용을 나타냈다(Jangra et al., 2018). 따라서, 본 발명자는 가용성 EC1(sEC1) 단백질을 사용하는 경쟁 결합 검정을 통해 NWH 상호작용의 차단에 대해 SNV-반응성 및 ANDV-반응성 mAb를 시험하였다. SNV-반응성 mAb 중 3개(SNV-30, -62, -67)는 부분적 수용체 차단 활성(26 내지 50%의 잔류 결합)을 나타낸 반면, ANDV-반응성 mAb 중 4개(ANDV- 3, -5, -38, -42)는 완전한 수용체 차단(≤25% 잔류 결합)을 나타내었다(도 1a-b). 본 발명자는 ANDV-형질감염된 세포에 대한 sEC1의 결합만을 검출하였고, 따라서 SNV-특이적 mAb(SNV-3 및 SNV-42)는 수용체 차단 활성에 대해 시험되지 않았다.
ANDV 또는 SNV 표면 단백질 Gn/Gc를 발현하는 베로 세포는 낮은 pH(pH 5.5) 배지에 노출될 때 세포-대-세포 융합을 겪는다(Bignon et al., 2019; Guardado-Calvo et al., 2016). 시험관내 바이러스 융합을 시험하기 위하여, 본 발명자는 세포-대-세포 융합을 유도하기 전에 세포에 10㎍/mL의 각 mAb를 첨가함으로써 융합 억제 검정을 수행하였다. 그런 다음, MetaXpress 소프트웨어를 사용하여 다핵 세포의 %를 계수하고, 값을 mAb로 처리되지 않은 대조군 샘플의 값으로 정규화하여 융합 지수(%)를 정량화했다(도 8a-b). 이 검정을 통해, 본 발명자는 pVSV 중화 검정에서 중화 활성을 나타낸 SNV-반응성 mAb 각각이 또한 세포-대-세포 융합의 감소를 나타냈다는 것을 결정했다(도 1a-b). 추가로, 그룹 1 및 2에서 각각의 ANDV-반응성 mAb도 또한 융합 억제 활성을 나타냈다. 따라서, NWH mAb는 시험관내에서 일련의 수용체 차단 및 융합 억제 활성을 나타내었고, 대부분의 중화 항체는 또한 융합을 억제하였다.
중화의 범위 및 다양한 한타바이러스 종에 대한 결합. 많은 항체가 SNV 및 ANDV와 교차 반응했기 때문에, 발명자는 OWH 종에 대한 mAb의 결합 및 중화 활성의 범위를 결정하고자 했다. 반응성과 중화 활성을 시험하기 위해, 본 발명자는 푸우말라(pVSV/PUUV), 도브라바-베오그라드(pVSV/DOBV), 한탄(pVSV/HTNV), 및 서울(pVSV/SEOV) 바이러스로부터 Gn과 Gc를 보유하는 pVSV, 및 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포를 생성하여 PUUV, DOBV, HTNV 및 SEOV로부터의 당단백질을 표면에 표시한다(도 2a, 도 9, 도 10). SNV-반응성 mAb 중 6개는 시험된 4개 종 모두에 대해 반응성을 나타내었고, 4개의 mAb(SNV-24, -53, -57 및 -68)는 시험된 4개의 pVSV 모두의 반응성 및 중화 활성을 나타내었다(도 2c). 흥미롭게도, SNV-24와 SNV-57은 다른 인간 공여자로부터 단리되었고, 동일한 경쇄 가변 유전자 용도를 가졌다(표 S1). SNV-반응성 mAb의 대부분(20개 중 14개)은 PUUV에 대한 반응성을 입증했고, 대부분은 pVSV 중화 검정에서 PUUV의 강력한 중화를 나타내었다(도 2a). 각각의 광범위하게 반응성인 mAb는 또한 포유류 세포 표면 표시된 EEEV E1/E2 또는 RVFV Gn/Gc에 대한 검출 가능한 결합에 대해 시험되었지만, 입증되지 않았고(데이터는 나타내지 않음), 따라서 이들은 광범위하게 반응성인 한타바이러스 mAb이다.
대조적으로, 대부분의 ANDV 반응성 mAb는 OWH 종에 대해 검출 가능한 반응성 또는 중화 활성을 나타내지 않았다(도 2b). 3개의 mAb(ANDV-5, -59 및 -69)만이 PUUV에 대해 반응성을 나타내었지만, 이들 mAb는 pVSV/PUUV에 대한 임의의 검출 가능한 중화 활성을 갖지 않았다. ANDV-44는 HTNV에 대해 검출 가능한 반응성을 나타낸 유일한 mAb이지만, 이 mAb는 pVSV/HTNV에 대해 임의의 검출 가능한 중화 활성을 갖지 않았다. 따라서, ANDV-면역 공여자로부터 단리된 mAb는 주로 ANDV 특이적이었지만, 광범위하게 반응성인 mAb는 이전에 SNV에 감염된 공여자로부터 단리되었다. 이러한 결과는 회수된 SNV 반응성 mAb가 OWH 종에 대해 광범위한 반응성 및 중화 활성을 나타내는 반면, 발명자가 단리한 ANDV-반응성 mAb는 일반적으로 종 특이적임을 입증한다.
경쟁-결합 분석에 기초한 항원 부위의 맵핑. 다음으로, 본 발명자는 NWH 감염 동안 유도된 인간 mAb에 의해 인식되는 주요 항원 부위, 특히 강력하게 중화되는 mAb에 의해 인식되는 Gn 및 Gc 상의 부위의 수를 결정하고자 했다. 결합 패턴을 결정하기 위해, 그는 ANDV 당단백질의 유세포 계측 기반 경쟁 결합 분석을 사용하였다(도 3). 검은색 상자는 동일한 부위에서 결합에 대해 경쟁된 항체의 쌍을 나타내고, 회색 상자는 결합의 중간 경쟁을 나타낸 항체를 나타내고, 흰색 상자는 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하지 않은 항체를 나타낸다. 항체는 다른 mAb와의 경쟁에 기초하여 클러스터링되고, 따라서 함께 비닝된 mAb는 유사한 항원 부위에 결합할 가능성이 있다. 데이터는 2개의 패널 중 mAb가 상이한 경쟁 결합 부위로 분류될 수 있고, 2개의 패널 중 mAb에 의해 표적화된 8개의 상이한 항원 부위가 있었음을 밝혀냈다. SNV-반응성 mAb의 절반 이상이 하나의 주요 그룹(부위 A1로 지정됨)에 존재하였으며, 대부분 광범위하고 강력하게 중화하는 mAb를 반영하는 반면, 비중화성 SNV-반응성 mAb는 별도의 경쟁 그룹(부위 E)에 비닝되었다. 초강력하게 중화하는 ANDV-반응성 mAb는 3개의 별개의 부위(부위 C1, D 및 F)로 비닝되었다. SNV-반응성 및 ANDV-반응성 항체는 전형적으로 별개의 경쟁 결합 그룹으로 비닝되었지만, 두 부위 A 및 C에 대해 중첩이 있었다. 부위 C1은 강력하게 중화성 및 교차 반응성 mAb(SNV-53 및 ANDV-44)를 함유했지만, 부위 C2는 교차 반응성이지만, 약하게 중화성 또는 비중화성 mAb(SNV-21, ANDV-2, ANDV-12)를 함유하였다. 부위 A1과 A2 사이에서도 중첩이 발생하였고, 여기서 비중화성 mAb SNV-50은 약하게 중화하는 교차 반응성 mAb ANDV-59와 경쟁했다. SNV-반응성 수용체 차단 mAb는 서로 경쟁하고(부위 A1), ANDV-반응성 mAb도 또한 서로 경쟁했지만(부위 F), 이들 부위는 중첩되지 않았다. SNV-42 및 SNV-3은 ANDV 당단백질에 대한 검출 가능한 결합을 갖지 않았고, 따라서 ANDV-반응성 mAb에 대해 경쟁하지 않았다. 그러나, SNV-42 및 SNV-3은 다른 SNV-반응성 mAb와 경쟁할 때 별개의 그룹으로 비닝된다(도 11). 경쟁 결합 그룹에 기초하여, 강하게 중화하고 광범위하게 반응성인 mAb는 다수의 에피토프를 표적으로 하고, 인간 B 세포에 의해 인식되는 ANDV 및 SNV에는 2개의 교차 반응성 부위가 존재한다.
시리아 햄스터 감염 모델에서의 치료 효능. 패널의 mAb가 노출 후 설정에서 치료 효능을 나타내었는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 ANDV 병인의 시리아 햄스터 모델에서, 5개의 mAb, SNV-반응성 패널로부터의 3개의 mAb와 ANDV-반응성 패널로부터의 2개의 mAb를 시험하였다. 시리아 햄스터는 한타바이러스 병인의 바람직한 모델이며, ANDV는 면역적격 동물에서 치명적인 호흡 부전을 일으키는 유일한 NWH 종이다(Hooper et al., 2001b). ANDV는 시리아 햄스터에서 치명적이며, 인간 감염 동안 병인의 특징을 모방하는 호흡기 증상을 생성하며, 따라서 노출 후 설정 모델에서 수동적 보호를 시험하기 위한 적절한 모델이다(Hooper et al., 2001b; Wahl-Jensen et al., 2007). 본 발명자는 그들의 시험관내 중화 특성, 경쟁 맵핑 및 범위에 기초하는 동물 보호 연구를 위해 mAb의 서브세트를 선택한다. 그룹 1의 하나의 ANDV 특이적 mAb(ANDV-5) 및 그룹 2의 하나의 교차 중화성 mAb(ANDV-44)는 ANDV-반응성 패널로부터 선택되었다. 그룹 2의 하나의 교차 중화성 mAb(SNV-53), 그룹 3의 하나의 교차 중화성 mAb(SNV-24) 및 그룹 4의 하나의 비중화성 mAb(SNV-30)는 SNV-반응성 패널로부터 선택되었다. 시리아 햄스터(치료 그룹당 n = 6)에 i.m. 경로에 의해 200 PFU의 ANDV를 접종한 후, 감염 후 3일째 및 8일째에 i.p. 경로로 5mg/kg의 rSNV-30, rSNV-24, rSNV-53, rANDV-5, rANDV-44 또는 대조군 항체 DENV 2D22를 받았다. 대조군의 모든 동물은 9일째에 시작하여 호흡기 증상을 나타내기 시작하였고, 모두 감염 후 11일째까지 IACUC 프로토콜에 의해 요구되는 바와 같이 굴복되거나 안락사되었다. SNV-30으로 처리된 동물 중 3마리는 감염 후 10일째까지 굴복되거나 안락사되었고, SNV-24 또는 ANDV-5로 처리된 동물 중 2마리는 11일째까지 안락사되었고, SNV-53으로 처리된 한 마리 동물만이 10일째에 굴복되었다(도 4a). ANDV-44로 처리된 모든 동물은 ANDV 챌린지에 생존하였고, 폐의 다성분 병리의 감소를 나타냈다(도 12). 동물은 증상 발병 후 매우 빠르게 질환에 굴복했기 때문에, 본 발명자는 대조군과 치료 그룹 사이의 유의한 체중 감소를 측정할 수 없었다(도 4b). 그는 빈사상태 동물 또는 연구 종결시 동물들로부터 폐 및 간을 수집하였고, 조직에서 바이러스 역가를 측정했다. 9일에서 11일 사이에 굴복한 대부분의 동물은 폐와 간에 바이러스를 나타냈으나, 연구 종료시까지 생존한 모든 동물은 폐 또는 간에서 검출 가능한 바이러스가 결여되었다(도 4c).
실시예 3 - 논의
여기서, 본 발명자는 이전의 ANDV 또는 SNV 감염으로부터 회복된 개체의 메모리 B 세포로부터 NWH mAb의 단리 및 특성화를 기재한다. SNV-반응성 mAb의 대부분은 다수의 NWH 및 OWH 종과 광범위하게 반응하고 중화되었지만, SNV 생존자로부터의 극소수의 mAb는 wt SNV 또는 wt ANDV에 대한 강력한 중화 활성을 나타냈다. 반대로, 대부분의 ANDV-반응성 mAb는 wt ANDV에 대해 강력한 중화 활성을 나타냈지만, 범위는 제한되었다. 본 발명자는 NWH-반응성 mAb에 대한 인식 부위가 ANDV 당단백질 스파이크 복합체의 적어도 8개의 별도의 항원성 부위에 맵핑되고, 교차 반응성 중화에 대한 취약성의 다중 부위가 Gn 또는 Gc에 존재한다는 것을 입증했다. 시험된 4개의 NWH mAb는 매우 엄격한 치사성 질환 모델에서 ANDV 감염으로부터 시리아 햄스터를 보호했다.
본 발명자는 패널에서 항체의 중화 효능을 시험하기 위해 2개의 상이한 검정을 사용하였다. 본 발명자는 BSL2 조건에서 한타바이러스 당단백질로 의사유형화된 VSV를 사용하고, BSL3 조건에서 wt SNV 또는 wt ANDV를 사용하여 중화 검정을 수행하였다. 이전 연구는 pVSV 한타바이러스 중화 검정이 wt 바이러스를 사용한 FRNT 검정에서 수득된 결과에 필적할 만한 값을 갖는 결과를 제공한다는 결론을 뒷받침한다(Higa et al., 2012; Hooper et al., 2014a; Perley et al., 2020). 발명가가 수득한 중화의 IC50 값은 ANDV-반응성 mAb로 수행된 2개의 검정 사이에서 매우 유사했지만, pVSV 검정에서 중화 활성을 나타낸 SNV-반응성 mAb 중 다수는 wt SNV 또는 wt ANDV를 중화할 수 없었다. SNV-반응성 mAb는 형질감염된 세포 표면에 표시된 균주 SNV CC107로부터의 SNV Gn/Gc 단백질에 대한 결합에 기초하여 단리되었지만, 중화에서 시험된 wt SNV 균주는 SN77734였다. 사소한 서열 변동은 pVSV와 wt SNV 중화 검정 사이의 중화에서 보이는 차이를 설명할 수 있다. 또한, 포유류 세포에서 발현되거나 VSV 입자에 포장된 Gn/Gc 복합체의 조직이 wt SNV 비리온의 표면에 있는 이러한 단백질의 조직과 크게 다를 수 있다.
본 발명자는 wt SNV에 대한 패널 중 대부분의 mAb에 대해 항체 연속 희석으로 불완전한 중화 및 비-S자형 용량 반응 곡선을 관찰하였다. 이 결과는 한타바이러스 비리온이 다양한 범위의 입자 형태를 나타내기 때문에 중화에 사용된 현탁액 중 비리온 입자의 불균일성에서 기인할 수 있다(Parvate et al., 2019). 일부 HIV bnAb는 또한 특징적인 비-S자형 중화 곡선과 불완전한(<100%) 중화 활성을 입증한다(McCoy et al., 2015; Webb et al., 2015). 이 특징은 글리칸 풍부 gp41 막 근위 외부 영역을 표적으로 하는 HIV bnAb의 기능적이고 에피토프 특이적 부류의 특징이고, HIV 균주가 세포 배양에서 생산되는 경우의 글리코실화의 입자 불균질성으로부터 발생할 수 있다. HIV의 경우에서와 같이, 불완전한 중화가 보호 효능에 어떤 영향을 미치는지는 완전히 명확하지 않지만, 중화 항체 활성 기울기 > 1을 갖는 bnAb가 더 큰 치료 가능성을 나타낼 가능성이 있다(Webb et al., 2015). 상이한 에피토프 또는 작용 메커니즘에 기초한 다양한 부류의 한타바이러스 항체는 지금까지 기재되지 않았으며, 불완전하고 비-S자형 중화는 한타바이러스 bnAb의 특징일 수 있다. 최근의 증거는 한타바이러스 당단백질 스파이크 복합체가 "호흡하여" 스파이크의 "개방" 형태가 막 삽입을 위한 융합 루프를 노출시키지만 바이러스 융합을 촉진하는 데 필요한 Gn에 의한 언캡핑을 받지 않는다는 가설을 지지했다 (Bignon et al., 2019; Serris et al., 2020). 스파이크의 이러한 동적 특징은 약하게 중화되는 mAb의 표적인 Gc 상의 유인 에피토프를 노출시킬 수 있다. 이러한 에피토프는 스파이크의 "폐쇄된" 형태로 폐색될 것이고, 개방 또는 폐쇄된 스파이크 상태의 관점에서 입자 불균일성은 본 연구에서 mAb에 의해 입증된 약하거나 불완전한 중화를 설명할 수 있다.
본 발명자는 또한 시험관내 검정을 사용하여 수용체 차단 및 융합 억제 활성에 대해 NWH mAb를 시험하였고, 융합 억제 정도는 SNV-반응성 및 ANDV-반응성 mAb 둘 다에 대한 중화 활성의 효능과 상관관계가 있음을 나타냈다. 하나의 초강력한 중화성 mAb, ANDV-5만이 수용체 결합을 차단하였다. 따라서, PCDH-1 관여의 차단은 강력한 NWH 중화의 본질적인 특징이 아닐 수 있다. 수용체 차단은 많은 바이러스에 대한 중화의 주요 메커니즘이지만, PCDH-1의 차단은 본 발명자가 여기에 기재하는 mAb의 중화 효능을 예측하는 것으로 보이지 않는다. β3 인테그린은 또한 병원성 한타바이러스의 숙주 세포로의 진입을 촉진하는 것으로 나타났으며, mAb는 Gn/Gc와 인테그린 β3 사이의 상호작용을 차단하여 강력한 중화를 달성할 수 있다(Gavrilovskaya et al., 1999; Gavrilovskaya et al., 2010; Gavrilovskaya et al., 1998). 강력하게 중화하는 mAb가 β3 인테그린과 같은 다른 수용체의 관여를 차단하는지 여부 또는 아직 확인되지 않은 다른 수용체 또는 중요한 부착 인자가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 추가 작업이 필요할 수 있다.
특히, 본 발명자는 ANDV-면역 공여자로부터 단리된 mAb와 비교하여 SNV 면역 공여자로부터 단리된 mAb의 결합 및 중화 범위의 비대칭 패턴을 관찰하였다. SNV mAb의 다수는 이종성 한타바이러스 종에 결합하여 중화되었지만, ANDV mAb의 대부분은 ANDV에 특이적이었다. 본 발명자가 단일 회복된 개체로부터 ANDV mAb를 단리시켰기 때문에, 그가 관찰한 ANDV 특이적 반응은 이 특별한 개체 반응의 특징일 수 있다. 그러나, 그는 수득된 mAb의 패널에서 항체 생식계열세포 유전자 사용, 항원성 부위 인식, 범위 및 중화 활성의 다양성을 관찰하였고, 이는 이러한 ANDV 감염 개체의 반응이 종 특이적일 가능성이 있음을 시사한다. HFRS 또는 HCPS 환자의 혈청에서, 이종성 한타바이러스 종에 대한 교차 중화 활성이 관찰되었지만, 한타바이러스 감염에 대한 인간 면역 반응의 교차 반응성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다(Chu et al., 1995). 이전 연구는 SNV M 유전자 세그먼트를 인코딩하는 cDNA에 의한 예방접종은 햄스터를 치명적인 ANDV 챌린지로부터 보호할 수 없었고, 혈청에서 교차 중화상 항체를 유도하지 못했음을 보여주었다(Hooper et al., 2013). DNA 백신 전략은 또한 HFRS 및 HCPS 종으로부터 보호하는 실험 후보 범용 한타바이러스 백신으로서 HTNV/PUUV/ANDV/SNV M 유전자의 조합으로 진행되었지만, 이 접근법은 SEOV 또는 DOBV에 대한 중화 항체를 유도하지 못했다(Hooper et al., 2006; Hooper et al., 2013). Gn 및 Gc를 인코딩하는 전장 M 세그먼트는 NWH 대 OWH 종의 가장 멀리 관련된 구성원 사이에서 단지 약 50%의 아미노산 서열 유사성을 나타낸다(Guardado-Calvo et al., 2016; Li et al., 2016). 따라서, 여기서 단리된 많은 항체가 더 멀리 관련된 한타바이러스 종과 광범위하게 교차 반응했다는 것은 주목할 만하다. 가장 광범위하게 반응성인 mAb가 융합 단백질 Gc에 결합하고, 이는 한타바이러스 계열에 걸쳐 약 60%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다(Guardado-Calvo et al., 2016). Gc는 막의 근위에 위치되고 Gn에 의해 부분적으로 차폐되고, 따라서 특히 고도로 보존된 융합 루프의 영역에서 덜 체액성 면역압하에 있을 수 있다. 문헌(참조: Duehr et al.)에 의한 또 다른 최근 공개된 연구는 또한 PUUV, HTNV 및 ANDV 항원으로 구성되는 후보 백신이 ANDV 항원만을 함유하는 후보 백신보다 더 많은 Gc 반응성 뮤린 항체를 유도한다는 것을 입증했으며, 광범위하게 반응성 체액성 반응에서 Gc에 대한 항체의 중요한 역할을 추가로 시사한다(Duehr et al., 2020). 최근의 연구는 중화 mAb가 Gc의 예비융합 단량체 형태에 결합하는 것을 나타내는 Gc와의 복합체에서 PUUV mAb 4G2의 공동결정 구조를 기재하였으며, 한타바이러스 종의 합리적 백신 설계에서 Gc의 중요성을 추가로 시사한다(Ilona Rissanen, 2020). 여기서, 본 발명자들은 이종성 한타바이러스 챌린지 연구에서 보호를 나타내는 교차 반응성 mAb를 기재한다. 4개의 mAb(SNV-24, -53, -57 및 -68)는 시험된 모든 한타바이러스 종에 대해 중화 활성을 나타내었다. 이러한 bnAb에 의해 표적화된 부위를 정의함으로써, 범용 한타바이러스 백신 개발을 알릴 수 있으며, 이러한 결과는 SNV 기반 면역원이 교차 중화 항체 반응을 유도하는 데 보다 효과적일 수 있음을 시사한다.
본 발명자는 전장 IgG를 사용한 경쟁 결합 검정을 통해 Gn/Gc 스파이크 상의 8개의 별개의 항원 부위에 대한 NWH 반응성 항체의 인식 부위를 맵핑했다. 경쟁 결합 그룹에 의해 형성된 패턴과 교차 중화 효능에 의해 할당된 작용성 그룹을 분석하면, 대부분의 ANDV 및 SNV 반응성 mAb가 별도의 그룹으로 분리되었음을 나타냈다. 그러나, SNV에 교차 반응된 4개의 ANDV-반응성 mAb(ANDV-2, -12, -44 및 -59)는 SNV-반응성 mAb와의 결합에 대해 경쟁하였고, 중첩성 경쟁 결합 그룹으로 클러스터링되어 감염 동안 인간 B 세포에 의해 인식된 NWH 당단백질 스파이크에 교차 반응성 부위가 있음을 나타낸다. 모두 wt SNV 및 ANDV에 대해 강력하고 완전한 중화 활성을 나타낸 2개의 mAb, SNV-53 및 ANDV-44는 당단백질 스파이크 상의 유사한 항원성 부위에 대한 결합에 대해 경쟁하였다. 이러한 발견은 NWH 감염이 NWH 당단백질 상의 교차 중화 부위를 표적화하는 유사한 부류의 강력하게 중화하는 항체를 유도할 수 있음을 보여준다. ANDV 및 SNV 감염 동안 표적화되는 중요한 항원성 부위를 결정하는 것은 합리적인 백신 설계 및 NWH에 대한 효과적인 의료 대책의 개발에 필수적일 수 있다.
이전의 두 연구는 또한 햄스터 챌린지 연구에서 ANDV 중화 mAb의 수동적 전달을 또한 시험하였으며, 각각 덜 염격한 감염 모델에서(발명자가 여기에서 사용된 더 엄격한 i.m. 경로 대신에 비강내로 전달된 200 PFU 사용) 및 실질적으로 더 높은 용량의 항체(25 또는 50mg/kg)에서 100% 보호를 나타냈다(Duehr et al., 2020; Garrido et al., 2018). 대조적으로, 그는 매우 치명적인(200 PFU i.m. 챌린지) 모델에서 저용량 항체 치료(5mg/kg)에서 mAb ANDV-44, ANDV-5, SNV-53 및 SNV-24의 효능을 나타내었고, 한타바이러스 감염을 치료하기 위한 치료 분자로서 이러한 mAb의 임상 사용 가능성을 지지한다. ANDV-44는 이 모델에서 완전한 보호를 나타냈다. 이러한 결과는 본 연구에 기재된 mAb가 이전에 기재된 것보다 더 낮은 용량에서 한타바이러스 감염의 치료적 치료의 유망한 후보임을 시사한다.
COVID-19 전염병에 의해 입증된 바와 같이, 새로 출현하는 감염성 질환은 세계에 심오하게 영향을 미칠 가능성이 있으며, 불균형하게 사회의 가장 취약한 구성원을 표적으로 한다. 특히, 한타바이러스는 저자원 환경에서 설치류에서 인간으로의 동물 유행성 전염으로 인한 사회적 불평등으로 번성한다. 추가로, 기후 변화는 설치류에서 인간 집단으로의 한타바이러스의 파급과 관련이 있으며, 전세계적으로 환경 파괴가 악화됨에 따라 계속 문제가 될 것이다(Prist et al., 2016). 이 연구는 NWH 관련 질환의 치료를 위한 치료 후보를 제시하고 NWH 감염에 대한 B 세포 반응을 특성화하는 추가 연구의 기초를 제공한다.
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본원에 개시되고 청구되는 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조 및 수행될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 본 개시내용의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 조성물 및 방법, 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 둘 다 관련되는 특정 제제가 동일한 또는 유사한 결과가 달성되는 동안 본원에 기재된 제제를 치환할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 유사한 치환체 및 변경은 모두 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 개시내용의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
VII. 참고문헌
하기 참고문헌은, 그들이 본원에 제시된 것들에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부사항을 제공하는 정도로, 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> VANDERBILT UNIVERSITY <120> HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HANTAVIRUS AND METHODS OF USE THEREFOR <130> VBLT.P0300WO <150> US 62/933,755 <151> 2019-11-11 <160> 453 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 gaggtgcaac tgttggagtc tgggggaggc ttgatacagt ccggggggtc gctgagactc 60 tcctgtgttg tctctggaat cgattttagc aactatgcca tgacctgggt ccgccacgct 120 ccagggaagg ggctggagtg gatctcgact attagtggta gtggcgacac cacaaactac 180 gcagactccg cgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggaa cacactgttt 240 gtgcgaatta atagcctgag agccgaggac acggccattt attactgtgc gaaaactatg 300 ggaccagttt ctggccaata tgcttttgat atctggggcc aagggacaaa ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 2 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccaccatc 60 acctgttctg gagataattt ggggaataaa tttgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120 ctgtcccctg 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Ser Arg Asp Ile His Thr Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln His Thr Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Glu Met Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Glu Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Lys 100 105 <210> 79 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 79 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ile Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Leu Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Arg Ala Tyr Ser Ser Gly Trp His Val 100 105 110 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cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 213 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 213 caggtgcagc tggtgcagtc tggaggtgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc aactatggaa tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcctgagtg gatgggatgg atcagcactt tcaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg actatagact catccacgag cacagcctac 240 ctggagctga ggagcctgag atctaacgac acggccgtgt attactgtgc gagacgtccg 300 ccttactatg atagtactgc ttttgatata tggggccaag ggacaatggt catcgtctct 360 tca 363 <210> 214 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 214 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcagcatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatagga agtaatattg taaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc atgggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgttca acatgggatg 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tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc 300 caggggacca aggtggagat caaa 324 <210> 217 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 217 caggtgcagt tgctgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgagggtc 60 tcctgtcagt cttctggaga catctacaac tactatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctg tctatggaag accaaactac 180 gtacagaagt ttaggggcag agtcactttt accgtggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcaccctgag agctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagacacg 300 gcccgctctc attactttgg ctcggggaac gactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca tcgtctcttc a 381 <210> 218 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 218 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gattcaactt tgtggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc tactcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagcggcagt ggatcaggca cagattttac actggaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggcgtg tattactgca tgcaggctct acaatttcct 300 cggacttttg gccaggggac caagctggac atcaaa 336 <210> 219 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 219 caggtgcagc tccaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccatcagc agtggtggtt tttactggag ctggattcgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggtatatgt actacaatgg gaacaccaac 180 tacaatccct ccctcaagag tcgaatcacc atatcaatag acgcgtccaa gaaccagttt 240 tccctgacgg tggattctgt gacccctgcg gacacggccg tgtattattg tgcgagagga 300 ggcttatatg gtcaactcat ccgaggattt ttccacccct ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 220 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 220 cagtctgtgc tgactcagtc accctcagtg tctgggaccc ccgggcagac ggtctccatc 60 tcttgttctg gaagctggtc caacatcgga cggaatcacg tatactggta tcaccaactc 120 ccaggatcgg cccccaaact tctcatctat atgagcagtc agcgaccctt aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccag gtctgacact tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgtg gcatgggatg atagtctgag tggtttctat 300 gtcttcggaa ctgggaccaa ggtcaccgtc cta 333 <210> 221 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 221 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cgcctttagt agttactgga tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtt tgtggccaac ataaagtatg atgcaagtga aaaatactat 180 gtggactccg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acggcaggaa ttcattctat 240 ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attattgtgc ggttccgggc 300 ccgggataca gttttgctta tgactactgg ggtcagggaa cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 222 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 222 gacatccaga tgacccaatc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcgttggc acctatttaa attggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct aatctatgaa gcatctagtt tgcagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtag gctgcaaccc 240 gaagattttg caacttactc ctgtcaacag agtgacattc ccccgtggac gttcggccaa 300 gggactaagg tggagatcaa a 321 <210> 223 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 223 gaagtgaagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cagttttgat gattacgcca tgcactgggt ccggcaacct 120 ctagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga acagcggaaa cacagcctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca acaccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag acctgaagac acggccttgt attactgtgg aaaagatcta 300 ggaggtatag tattggctcc gattgactcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 224 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 224 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc ggtcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gcttttaact atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcttgatt tctgcggtca ataatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctatctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttatttctgc agctcatata cagtcagcta cactctcaca 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 225 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 225 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctcagactc 60 tcctgtgcag tctccggatt caccttcagg aactatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg acggaggtaa caaagattat 180 gcagcctccg tgaagggccg attcaccatc tccagagacg attccaagaa cgccctttat 240 ctgcaaatga acagcctgag acctgaggac acggctgtgt attcctgtgt gaaagatctt 300 gggggagact atcccccgct tgacccacac tactggtact acggtatgga tgtctggggc 360 caagggacca cggtcatcgt ctcctca 387 <210> 226 <211> 329 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 226 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccggacaggg ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga actaagtctg tactctggta ccagcaactc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctgatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccggttct ctggctccaa gtccggcacc tctgcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg agggtgatta ctactgtgcc tcatgggatg tcagcctgag tgtttgggtg 300 ttcggcggac ggaccaagct gaccgtcct 329 <210> 227 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 227 caggtgcacc tggtgcagtc tgggggtgag ctgaggaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agttttgcta ttacgtggct gcgacaggcc 120 cctggacagg ggcttgagtg ggtgggagca tacattcctg tctttggctc agcaatccac 180 ggacagaagg tccacggcag agtcactctt accgcggacg aatccacgac cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt atttctgtgc gagaggaccg 300 acgcagaatt gggaatatag ttattatacc tactttgagt cctggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 228 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 228 caaatcgtgt tgacgcagtc tccaggcacc 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gggccaggga 360 atcccggtca ccgtctcctc a 381 <210> 240 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 240 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagac ggtcaccatc 60 tcctgctctg gcagcagctc caacattcgg cataattttg tttcgtggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cgtcatttat gaaaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctccccat 300 tgggtgttcg gcggagggac caggctgact gtccta 336 <210> 241 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 241 caggtgcatc tgcaggagtc gggcccagga ctagtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggcta ctccatcagc agtggttact gctggggctg gatccggcag 120 accccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctggc atactgggac cacctactac 180 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcactggaca cgtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gttctctgac cgccgcagac acggccgtct attactgtgc gagagcgatc 300 tatgatagta gtggttattc cccgttcagc ggtttagaca tctggggcca agggactaca 360 gtcaccatct cctca 375 <210> 242 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 242 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgttctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccaacaagtc 120 cccggaacag cccccaaact cctcttttat gacaataaca agcgaccctc agggattcct 180 taccgattct ctggctccaa gtctggcacg tccgccaccc tggccatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgaa tctttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 243 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 243 caggtgcatc tgcaggagtc gggcccagga ctagtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggcta ctccatcagc agtggttact gctggggctg gatccggcag 120 accccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctggc atactgggac cacctactac 180 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcactggaca cgtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gttctctgac cgccgcagac acggccgtct attactgtgc gagagcgatc 300 tatgatagta gtggttattc cccgttcagc ggtttagaca tctggggcca agggactaca 360 gtcaccatct cctca 375 <210> 244 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 244 tcctatgagc tgactcagcc acactcagtg tcagtggcca cagcacagat ggccaggatc 60 acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa gctgtgcact ggtaccagca aaagccaggc 120 caggaccctg tgctggtcat ctatagcgat agcaaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaacccagg gaacaccgcc accctaacca tcagcaggat cgaggctggg 240 gatgaggctg actattactg tcaggtgtgg gacagtagta gtgatcatcg ctgggtgttc 300 ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327 <210> 245 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 245 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser 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<213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 419 Cys Gln Ser Ala Asp Arg Leu Gly Thr Tyr Trp Val Phe 1 5 10 <210> 420 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 420 Cys Gln Gln Tyr Lys Ser His Arg Thr Phe 1 5 10 <210> 421 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 421 Cys Ala Arg Met Met Val Gly Glu Gly Thr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 422 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 422 Cys Ala Arg Arg Pro Pro Tyr Tyr Asp Ser Thr Ala Phe Asp Ile Trp 1 5 10 15 <210> 423 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 423 Cys Thr Thr Asp Leu Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Ser Leu Gly Phe 1 5 10 15 Val Tyr Thr Tyr Asn Phe Met Asp Val Trp 20 25 <210> 424 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 424 Cys Ala Arg Asp Thr Ala Arg Ser His 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Phe Glu Ser Trp 20 <210> 430 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 430 Cys Val Arg Ser Pro Asn Leu Gly Leu Met Tyr Gln Gly Met Asp Leu 1 5 10 15 Trp <210> 431 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 431 Cys Ala Arg Asp Arg Ser Ala Thr Gln Asp Ala Phe Asp Ile Trp 1 5 10 15 <210> 432 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 432 Cys Ala Ala Met Gly Ser Gly Trp Trp Tyr Tyr His Tyr Asp Leu Asp 1 5 10 15 Val Trp <210> 433 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 433 Cys Ala Arg Asp Glu Gly Leu His Asn Trp Lys Phe Asn Ala Met Asp 1 5 10 15 Val Trp <210> 434 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 434 Cys Ala Arg Glu Asn Thr Pro Thr Tyr Asn Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr Trp <210> 435 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> 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PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 441 Cys Val Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Phe Tyr Val Phe 1 5 10 <210> 442 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 442 Cys Gln Gln Ser Asp Ile Pro Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 443 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 443 Cys Ser Ser Tyr Thr Val Ser Tyr Thr Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 444 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 444 Cys Ala Ser Trp Asp Val Ser Leu Ser Val Trp Val Phe 1 5 10 <210> 445 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 445 Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Ala Val Thr Phe 1 5 10 <210> 446 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 446 Cys Gln Val Trp Asp Ile Gly Ser Glu His Trp Val Phe 1 5 10 <210> 447 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 447 Cys His Val Trp Asp Ile Ser Ser Asp Leu Pro Val Val Phe 1 5 10 <210> 448 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 448 Cys Ala Ala Trp Val Asp Ser Val Asn Gly Leu Val Val Phe 1 5 10 <210> 449 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 449 Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Pro Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 450 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 450 Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Thr Trp Val Phe 1 5 10 <210> 451 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 451 Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Pro His Trp Val Phe 1 5 10 15 <210> 452 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic antibody sequence <400> 452 Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Leu Trp Val Phe 1 5 10 <210> 453 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence 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Claims (97)

  1. 대상체(subject)에서 한타바이러스 감염(hantavirus infection)을 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체로부터의 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬(clone-paired) 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 샘플 중의 한타바이러스 항원에 결합시킴으로써 상기 샘플에서 한타바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 체액인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샘플이 혈액, 객담, 눈물, 타액, 점액 또는 혈청, 정액, 자궁경부 또는 질 분비물, 양수, 태반 조직, 소변, 삼출물, 삼출액, 조직 긁힘(tissue scraping) 또는 대변인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 ELISA, RIA, 측방 유동 검정(lateral flow assay) 또는 웨스턴 블롯(Western blot)을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계 및 제1 검정과 비교하여 한타바이러스 항원 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해 인코딩(encoding)되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80%, 또는 90% 동일성(identity)을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합(recombinant) scFv (단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 방법.
  13. 한타바이러스에 감염된 대상체를 치료하거나, 한타바이러스에 감염될 위험이 있는 대상체의 감염 가능성을 감소시키는 방법으로서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 것에 대해 95% 동일성을 갖는 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  22. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이적(bispecific) 항체인, 방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 감염 전 또는 감염 후에 투여되는, 방법.
  24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 임신한 여성, 성적으로 활동적인 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성인, 방법.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 전달이 항체 또는 항체 단편 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터(vector)를 사용한 유전자 전달(genetic delivery)을 포함하는, 방법.
  26. 모노클로날 항체(monoclonal antibody)로서, 상기 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 모노클로날 항체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 모노클로날 항체.
  28. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 모노클로날 항체.
  29. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 모노클로날 항체.
  30. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  31. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 모노클로날 항체.
  33. 제26항 내지 제31항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체이거나, 이중특이적 항체인, 모노클로날 항체.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 모노클로날 항체.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디(intrabody)인, 모노클로날 항체.
  36. 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하이브리도마 또는 조작된 세포로서, 상기 항체 또는 항체 단편이 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  38. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  39. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  40. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  41. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  42. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이적 항체인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  45. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디인, 하이브리도마 또는 조작된 세포.
  47. 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 백신 제형(vaccine formulation).
  48. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 백신 제형.
  49. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 백신 제형.
  50. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 백신 제형.
  51. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 백신 제형.
  52. 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 백신 제형.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편 중 적어도 하나가 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 백신 제형.
  54. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중 적어도 하나가 키메라 항체이거나 이중특이적 항체인, 백신 제형.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중 적어도 하나가 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 백신 제형.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나가 세포 침투성 펩티드를 추가로 포함하고/하거나 인트라바디인, 백신 제형.
  57. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따르는 제1 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 백신 제형.
  58. 제57항에 있어서, 상기 발현 벡터(들)가 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 VEE 벡터(들)인, 백신 제형.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 바늘 주사, 제트 주사, 또는 전기천공에 의한 전달용으로 제형화된, 백신 제형.
  60. 제57항에 있어서, 제2 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항의 별개의 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함하는, 백신 제형.
  61. 한타바이러스에 감염되었거나 감염될 위험이 있는 임신 대상체의 태반 및/또는 태아의 건강을 보호하는 방법으로서, 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 바와 같은 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 것들에 대해 95% 동일성을 갖는 클론-쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  64. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 1로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  67. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 방법.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG, 또는 FcR 상호작용의 변경(제거 또는 강화), 반감기의 증가 및/또는 치료 효능의 증가를 위해 돌연변이된 Fc 부분, 예를 들어, LALA, N297, GASD/ALIE, YTE 또는 LS 돌연변이, 또는 글리칸의 효소적 또는 화학적 첨가 또는 제거 또는 정의된 글리코실화 패턴으로 조작된 세포주에서의 발현과 같은, FcR 상호작용을 변경(제거 또는 강화)하도록 변경된 글리칸을 포함하는, 재조합 IgG 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  70. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이중특이적 항체인, 방법.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 감염 전 또는 감염 후에 투여되는, 방법.
  72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 임신한 여성, 성적으로 활동적인 여성, 또는 불임 치료를 받고 있는 여성인, 방법.
  73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 전달이 항체 또는 항체 단편 투여, 또는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 RNA 또는 DNA 서열 또는 벡터를 사용한 유전자 전달을 포함하는, 방법.
  74. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 미처리 대조군과 비교하여 태반의 크기를 증가시키는, 방법.
  75. 제61항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 미처리 대조군과 비교하여 태아의 바이러스 부하(viral load) 및/또는 병리를 감소시키는, 방법.
  76. 한타바이러스 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제1 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 항원에 대한 상기 제1 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성, 정확한 형태 및/또는 정확한 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 샘플이 재조합적으로 생산된 항원을 포함하는, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 샘플이 백신 제형 또는 백신 생산 뱃치(batch)를 포함하는, 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭 측정법을 사용하는 바이오센서, 또는 유세포 계측 염색(flow cytometric staining)을 포함하는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  81. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  82. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  83. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  84. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  85. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  86. 제76항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 방법.
  87. 제76항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하기 위해 단계 (a) 및 (b)를 두 번째로 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  88. 제76항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 상기 항원을 포함하는 샘플을 각각 표 3 및 4로부터의 클론-쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 제2 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (d) 상기 항원에 대한 상기 제2 항체 또는 항체 단편의 검출 가능한 결합에 의해 상기 항원의 항원 완전성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 가변 서열에 대해 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 1에 제시된 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  92. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 따르는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  94. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 항체 단편이 표 2로부터의 클론-쌍을 이룬 서열에 대해 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는, 방법.
  95. 제89항에 있어서, 상기 제2 항체 단편이 재조합 scFv(단일 쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편인, 방법.
  96. 제89항에 있어서, 시간이 경과함에 따라 항원의 항원 안정성을 결정하기 위해 단계 (c) 및 (d)를 두 번째로 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  97. 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 이를 생산하는 하이브리도마 또는 조작된 세포로서, 상기 항체가 한타바이러스 바이러스 융합 단백질(Gc)에 결합하고, 신 놈브레(Sin Nombre) 바이러스(SNV), 안데스(Andes) 바이러스(ANDV), 푸우 말라(Puumala) 바이러스(PUUV), 한탄(Hantaan) 바이러스(HNTV), 서울(Seoul) 바이러스(SEOV) 및 도브라바(Dobrava) 바이러스(DOB) 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 모두를 중화시키는, 인간 모노클로날 항체 또는 항체 단편, 또는 이를 생산하는 하이브리도마 또는 조작된 세포.
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