CN117120087A - 茄尼醇疫苗助剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本公开描述了茄尼醇作为疫苗组合物中的助剂的用途以及相关的预防和治疗方法。茄尼醇可用于替换疫苗组合物中的角鲨烯，其具有类似或优异的免疫刺激效应。在室温下为固体的茄尼醇可通过在水性溶液中加热至其熔融温度以上以形成分散体而被配制用于疫苗组合物中。

Description

茄尼醇疫苗助剂及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2020年12月23日的名称为“茄尼醇疫苗助剂及其制备方法(Solanesol Vaccine Adjuvants and Methods of Preparing Same)”的美国临时申请63/130,366号的优先权，该美国临时申请的公开内容全文以引用方式并入本文。

联邦研发资助声明

本发明是在国家过敏和感染性疾病研究所授予的合同R01AU35673号下受政府支持完成的。政府在本发明中拥有某些权利。

技术领域

本公开整体涉及药物和疫苗制剂领域。更具体地，本公开描述了茄尼醇作为疫苗组合物中的助剂的用途以及相关的预防和治疗方法。

背景技术

免疫的目的是在最小限度副作用的情况下生成针对靶抗原的特异性和强效的免疫应答。然而，一些疫苗需要助剂来增强对靶抗原的免疫应答的强度和持续时间。助剂有助于刺激基于抗体和效应T细胞功能的保护性免疫力。大多数(如果不是全部的话)助剂通过接合先天免疫系统的组分来增强T和B细胞应答。助剂也可以使赋予免疫力所必要的抗原剂量最小化。铝盐是用作助剂的第一物质中的一些第一物质。当前，角鲨烯乳剂是最广泛采用的疫苗助剂制剂之一。

角鲨烯是天然存在的低聚异戊二烯(即，异戊二烯的超低分子量聚合物)，其在室温为液体。角鲨烯主要来源于鲨鱼肝脏，这一来源存在可持续性问题。尽管角鲨烯也可从植物源获得，但提取更具挑战性。全球大流行可能产生对快速制造数十亿疫苗剂量的需要。不能获得足够量的助剂(诸如角鲨烯)会制约疫苗生产能力。

可用作助剂的新化合物(特别是可从可持续的基于植物的源获得的具有强效免疫刺激特性的化合物)是疫苗开发所需要的。相对于这些和其他考虑作出以下公开。

发明内容

本公开描述了茄尼醇作为免疫刺激组合物(诸如水包油型疫苗)中的助剂的用途。本公开还提供了一种用于生成包含茄尼醇的药物组合物(诸如疫苗组合物)的方法。

茄尼醇为可从植物源获得的具有九个异戊二烯单元的长链聚类异戊二烯醇化合物，其先前尚未用作疫苗助剂。与疫苗中常用的其他可代谢油(诸如角鲨烯)不同，茄尼醇在室温为固体。因此，用于角鲨烯和其他油的配制技术不易于适应与茄尼醇一起使用。

本申请的发明人已经发现，通过熔融茄尼醇并生成乳液，同时将药物组合物保持处于升高的温度，可以将茄尼醇放入该组合物中。出人意料地，发现以这种方式用茄尼醇产生的疫苗诱导与使用角鲨烯作为可代谢油的疫苗类似的应答。另外发现该疫苗与使用角鲨烯的疫苗相比具有类似的稳定性。

包含茄尼醇作为助剂的免疫刺激组合物也可包含表面活性剂、张度剂(tonicityagent)和抗氧化剂中的一者或多者。疫苗组合物另外包含抗原。抗原可以为任何抗原化合物，诸如多肽、编码多肽的核酸或病原体。表面活性剂可以为亲水性表面活性剂、疏水性表面活性剂或两者。在具体实施中，亲水性表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(普朗尼克F68)。在具体实施中，疏水性表面活性剂为l,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DMPC)、或聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(泊洛沙姆188)。抗氧化剂可以为α-生育酚(维生素E)。张度剂可以为甘油。

包含茄尼醇的免疫刺激组合物可以通过以下来产生：在加热至茄尼醇的熔点以上的缓冲水性溶液中将固体茄尼醇熔融。缓冲水性溶液可以为可包含甘油和表面活性剂的磷酸盐缓冲剂。将固体茄尼醇添加到缓冲水性溶液并使其溶解。这产生了包含液体茄尼醇的油相。也可以将一种或多种表面活性剂添加到缓冲水性溶液。通过均化已加热的溶液来形成分散体。可以将分散体微流化，同时保持温度高于茄尼醇的熔点。可以将分散的茄尼醇的粒度减小至约100nm或更小，同时保持温度高于茄尼醇的熔点。可以将抗氧化剂添加到分散体的油相。

应当理解，本文所述的各种具体实施的特性中的一个、一些或所有特性可以被组合以形成符合本公开的其他具体实施。在参考以下详细描述和附图后，本公开的这些和其他方面将变得显而易见。本文公开的所有参考文献都据此全文以引用方式并入，好像各自单独并入那样。

附图说明

图1示出了在与处于四种不同油浓度中的一种油浓度的三种不同疫苗组合物中的一者一起孵育之后的活的PBMC的百分比。条高度为来自3个不同样品的值的平均值。PBMC跨所有疫苗制剂和油浓度都保持活力。

图2示出了对响应于用疫苗组合物刺激的MCP-1表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似浓度的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图3示出了对响应于用疫苗组合物刺激的Mip-1β表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似浓度的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图4示出了对响应于用疫苗组合物刺激的IL-8表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似量的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图5示出了对响应于用疫苗组合物刺激的IL-6表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似量的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图6示出了通过总血清IgG测量的对rH5疫苗的抗体应答。用使用助剂鲨鱼角鲨烯SE或茄尼醇SE的疫苗制剂进行免疫产生显著更高水平的针对抗原rH5的抗体。在鲨鱼角鲨烯SE或茄尼醇SE的使用之间没有显著的差异。

图7示出了通过血清IgG1测量的对rH5疫苗的抗体应答。IgG1为中和性抗体并且优先地通过Th2型免疫应答来诱导。

图8示出了通过血清IgG2c测量的对rH5疫苗的抗体应答。IgG2c为优先地通过Th1型免疫应答来诱导的中和性和调理性抗体。

图9示出了通过酶联免疫斑点测定法的来自骨髓IgG浆母细胞的rH5特异性抗体应答。使用助剂鲨鱼角鲨烯SE或茄尼醇SE产生比对照物或葡萄籽SE显著更高计数的骨髓浆母细胞。结果被示出为检测到的细胞的数量(Log 10)，其中每个点表示单个动物，并且条表示均值。

图10示出了用马红细胞(RBC)测量针对H5N1的功能性抗体的血凝抑制(HAI)测定法的几何平均滴度(GMT)。虚线指示病毒滴定测定法的检测极限(LOD)。鲨鱼角鲨烯SE和茄尼醇SE两者均表现出了比对照物或用葡萄籽SE配制的疫苗组合物显著更高的滴度。

图11示出了对IFNg具有特异性的抗体分泌细胞(ASC)的数量。与对照物或葡萄籽SE相比，助剂鲨鱼角鲨烯SE和茄尼醇SE两者均显示出了显著更高水平的产生IFN-γ的细胞。

图12示出了对IL-5具有特异性的ASC。跨各种助剂制剂未观察到显著的差异。

图13示出了用茄尼醇(批号QH592)作为助剂的疫苗组合物在5℃储存期间的油浓度。虚线指示理论目标浓度。参考上述标准曲线确定了浓度。

图14A和图14B示出了在5℃分别储存1个月和12个月之后，用茄尼醇作为助剂的疫苗组合物的洗脱的色谱图。

图15示出了所有浓度的用鲨鱼角鲨烯(批号QH597)作为助剂的疫苗组合物在5℃储存期间的油浓度。

图16A和图16B示出了在5℃分别储存1个月和12个月之后，用茄尼醇作为助剂的疫苗组合物的洗脱的色谱图。

图17示出了在5℃储存的疫苗组合物的乳液粒度稳定性，其中误差条表示来自每种乳液的一个批次的三个单独等分试样的标准尺寸偏差。

具体实施方式

茄尼醇为由具有45个碳原子的九个异戊二烯单元组成的非环状萜烯醇。纯茄尼醇在室温为不溶于水的蜡质白色固体。茄尼醇提取自植物，特别是烟草叶，但也存在于其他茄科作物，包括马铃薯、番茄、茄子和胡椒。茄尼醇在制药工业中用作用于泛醌药物(诸如辅酶Q10和维生素K2)的合成的中间体。茄尼醇具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗癌、抗炎和抗溃疡活性。茄尼醇衍生物胶束已经用于疏水性药物的递送。茄尼醇的结构如下所示。

当然，应当理解，免疫刺激组合物可以在一种或多种抗原的存在下用于引发抗原特异性免疫应答。另选地，免疫刺激组合物可以在不存在抗原时用于引发非特异性免疫应答。

一般技术

除非另外指明，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学、重组DNA、生物化学和化学的常规技术。文献中全面解释了此类技术。参见，例如，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，第2版，Sambrook等人编辑，

冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)：(1989)；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编辑，1984)；MuUis等人，美国专利4,683,195号；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，1984)；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；论著《酶学方法》(Methods in Enzymology)(学术出版社股份有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约(N.Y.))；以及Ausubel等人，《最新分子生物学实验方法汇编》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Maryland)(1989)。

定义

除非另外指明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都具有其在本领域公认的含义。

在本说明书中，除非另外指明，否则术语“约”和“基本上由...组成”意指所指示的范围、值或结构的±20％。

另选方案(例如，“或”)的使用应被理解为意指另选方案中的一者、两者或其任何组合。

如本文所用，术语“包括”、“具有”和“包含”同义地使用，所述术语及其变体旨在被解释为非限制性的。

如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。

“个体”或“受试者”是任何哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类、农场动物、运动动物、宠物(诸如猫、狗、马)和啮齿动物。

维生素E是指生育酚(TCP)和三烯生育酚两者，并且可以为天然存在的或合成的。

环境温度为介于15℃与25℃之间。

如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以为例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应来掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在的话，可在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。

分散体

分散体为在其中一种材料的分布颗粒分散在另一种材料的连续相中的体系。分散体不显示任何结构；即，假设分散在液体或固体基质(“分散体介质”)中的颗粒(或在乳液的情况下：液滴)是统计分布的。分散为这样的过程，通过该过程(在固体分散在液体中的情况下)团聚颗粒彼此分离，并且生成在液体分散体介质的内表面与分散颗粒的表面之间的新界面。当讨论固体颗粒在液体介质中的悬浮液时，ζ电势最常用于对分散程度进行定量，其中具有ζ电势的高绝对值的悬浮液被认为是良好分散的。溶液描述了均匀的混合物，其中在溶液被静置达延长的时间段的情况下分散的颗粒将不会沉降。

水相

组合物的水相通常是缓冲盐溶液(例如，盐水)或水。缓冲盐溶液可以为包含盐(例如，NaCl)的水性溶液、缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液)，并且还可包含例如渗透度调节剂(例如，糖)、聚合物、表面活性剂或它们的组合。如果乳液被配制用于肠胃外施用，则优选组成最终缓冲溶液，使得张度(即，渗透度)与正常生理流体基本相同，以防止不期望的施用后结果，诸如组合物的施用后溶胀或快速吸收。还优选缓冲水相以保持与正常生理状况相当的pH。另外，在某些情况下，可能期望将pH保持在特定水平以确保组合物的某些组分的稳定性。例如，可能期望制备等渗(即，与身体和血液的正常细胞相同的可渗透溶质(例如，盐)浓度)和等渗压的组合物。为了控制张度，组合物可包含生理盐，诸如钠盐。在一些方面，例如可使用约0.9％(w/v)的氯化钠(NaCl)(生理盐水)。可存在的其他盐包括例如氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。非离子等张剂也可用于控制张度。被分类为醛醣的单糖诸如葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖以及被分类为酮醣的单糖诸如果糖、山梨糖和木酮糖可在本公开中用作非离子等张剂。也可使用二糖诸如蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖。此外，醛糖醇(无环多羟基醇，也称为糖醇)诸如甘油、甘露醇、木糖醇和山梨糖醇为可用于本公开中的非离子等张剂。非离子张度调节剂可根据所用试剂的不同以例如约0.1％至约10％或约1％至约10％的浓度存在。

可缓冲该水相。本文可使用任何生理上可接受的缓冲液，诸如水、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液等。水性组分的pH将优选地介于4.0至8.0之间或为约4.5至约6.8。在一个具体实施中，水相为无RNA酶水或DEPC处理水或使用该无RNA酶水或DEPC处理水制备的缓冲液。在一些情况下，缓冲液中的高盐可能干扰带负电的分子与乳液颗粒的复合，因此要避免高盐。在其他情况下，可包含缓冲液中的一定量的盐。

在一个具体实施中，缓冲液为pH介于约5.0与8.0之间的10mM柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸钠)。在另一具体实施中，水相为无RNA酶水或DEPC处理水，或者缓冲液使用无RNA酶水或DEPC处理水来制备。在其他具体实施中，本公开的组合物不包含柠檬酸盐缓冲液。

该水相还可包含附加组分，诸如改变水相的同渗容摩的分子或在复合后稳定带负电的分子的分子。优选地，该水相的同渗容摩使用非离子等张剂调节，该非离子等张剂诸如为糖(例如，海藻糖、蔗糖、右旋糖、果糖、还原帕拉金糖等)、糖醇(诸如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、甘油等)或它们的组合。如果需要，可使用非离子聚合物(例如，聚(烷基二醇)诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚丁二醇)或非离子表面活性剂。

表面活性剂

表面活性剂或表面活化剂为降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力的化合物。表面活性剂为两亲性的，意味着它们包含亲水性(喜水性)头部基团和疏水性(憎水性或喜油性)尾部基团。表面活性剂吸附在油与水之间的界面处，从而降低表面张力。乳化剂为稳定乳液的表面活性剂。乳化剂包覆乳液内的液滴并防止它们聚集在一起或聚结。

在一些具体实施中，本公开的组合物包含表面活性剂。表面活性剂可以为亲水性表面活性剂。亲水性表面活性剂可具有约10至30、10至15、10至20、10至25、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的HLB值。在一些具体实施中，亲水性表面活性剂为普朗尼克F68(HLB 29)。表面活性剂可以为疏水性表面活性剂。疏水性表面活性剂可具有约1至6、2至5、1至4、3至6、1、2、3、4、5或6的HLB值。在一些具体实施中，疏水性表面活性剂为磷脂。本公开的组合物可包含疏水性表面活性剂和亲水性表面活性剂两者。

存在多种为生物应用专门设计并且常用于生物应用的表面活性剂。可用于实施本公开的表面活性剂包括：普朗尼克F68、吐温80、聚山梨酸酯80(CAPMUL POE低PV表面活性剂，威斯康星州简斯维尔市ABITEC公司(ABITEC Corp.,Janesville,Wis.))、聚乙烯66012-羟基硬脂酸酯(SOLUTOL HS15，伊利诺伊州芝加哥巴斯夫公司(BASF Corp.,Chicago,111))、泊洛沙姆188(PLURONIC Q F68嵌段共聚物，伊利诺伊州芝加哥巴斯夫公司)、胆酸钠、丙三基脱氧胆酸盐和磷脂酰胆碱。其他合适的表面活性剂包括：鞘脂(诸如鞘磷脂和鞘氨醇)和磷脂(诸如磷脂酰胆碱、l,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺、L-a-磷脂酰乙醇胺和l,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC))或它们的混合物。DPPC可用于人类。在一些具体实施中，表面活性剂为DMPC、DOPC和/或POPC(包括合成的DMPC、DOPC和POPC)。可使用Brij表面活性剂。(Maria E.N.P.Ribeiro，Carolina L.de Moura，MarianoG.S.Vieira，Nilce V.Gramosa，Chiraphon Chaibundit，Marcos C.de Mattos，DavidAttwood，Stephen G.Yeates，S.Keith Nixon，Nagila M.P.S.Ricardo，《Brij表面活性剂的增溶能力》(Solubilisation capacity of Brij surfactants)，《国际药剂学杂志》(International Journal of Pharmaceutics)，第436卷，第1-2期，2012，第631-635页，ISSN 0378-5173，doi.org/10.1016/j.ijpharm.2012.07.032。)可使用一种或多种表面活性剂。

合适的表面活性剂的附加示例描述于WO2005009462A2中。

在一些具体实施中，表面活性剂以约100:1(油:表面活性剂)的比率存在。在一些具体实施中，表面活性剂以约0.018％w/v的浓度存在。在一些具体实施中，表面活性剂以约0.0001％w/v、约0.0005％w/v、约0.001％w/v、约0.005％w/v、约0.01％w/v、约0.011％w/v、约0.012％w/v、约0.013％w/v、约0.014％w/v、约0.015％w/v、约0.016％w/v、约0.017％w/v、约0.018％w/v、约0.019％w/v、约0.02％w/v、约0.03％w/v、约0.04％w/v、约0.05％w/v、约0.06％w/v、约0.07％w/v、约0.08％w/v、约0.09％w/v、约0.1％w/v、约0.2％w/v、约0.3％w/v、约0.4％w/v、约0.5％w/v、约0.6％w/v、约0.7％w/v、约0.8％w/v、约0.9％w/v或约1％w/v的浓度存在。本文所述的百分比和比率是指在冻干之前的水包油型乳液制剂中或在重构后的水包油型乳液中的比率和百分比。

亲水-亲脂平衡(HLB)

乳液的亲水-亲脂平衡(HLB)允许估计表面活性剂的亲水或亲脂力。两亲性分子的HLB通常计算如下：HLB＝(20X亲水性部分的重量)/(两亲性分子的重量)。确定乳液的HLB的方法在本领域中是已知的。参见，例如，万维网网址firp.ula.ve/archivos/historicos/76_Book_HLB_ICI.pdf和网址chemistscomer.com/hlb-the-easiest-way-to-create-an-emulsion/。

HLB可具有范围为从0(对于最亲脂的分子)到20(对于最亲水的分子)的值。根据表面活性剂的化学组成(特别是例如添加乙氧基基团或烯烃氧化物)，这种估计可改变并且HLB值的域可增加(例如，LUTROL 具有为29的HLB)。在表面活性剂的混合物的情况下，混合物的HLB为每种表面活性剂通过其重量比平衡的HLB的总和：HLB＝(HLB表面活性剂X×重量表面活性剂X)+(HLB表面活性剂Y×重量表面活性剂Y)/(重量表面活性剂X+重量表面活性剂Y)。

可选择特定的表面活性剂以及亲水性表面活性剂与疏水性表面活性剂的比率以实现总HLB值。乳液可具有从约9到约12、从约9.5到约11.5以及从约10到约11.5的最终HLB。在一些具体实施中，乳液的HLB为从约10.5到约11.0。在一些具体实施中，水包油型乳液的疏水:亲脂平衡(HLB)大于约9、或大于约10或介于约9至12之间。

张度剂

在具体实施中，疫苗组合物可包含张度剂。张度剂起到使得溶液在渗透性特征方面类似于生理流体的作用。张度剂的示例包括右旋糖、甘露醇、氯化钠、氯化钾和甘油。用张度剂配制的疫苗组合物将具有与人血基本相同的渗透压。等渗或生理制剂通常具有从约275mOsm至325mOsm的渗透压。微低渗压为250mOsm至270mOsm，并且微高渗压为330mOsm至350mOsm。渗透压可例如使用蒸汽压或凝固点降低型渗压计来测量。通常，在本领域中被称为“张度调节剂”或张度剂的特定赋形剂用于控制药物制剂的张度。盐(NaCl、KC1、MgCl₂、CaCl₂等)表示常常用作张度调节剂。此外，赋形剂(诸如但不限于蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸等)可用作张度调节剂。在本文所述的具体实施中的任一者中，张度剂可以为例如多元醇，诸如甘露醇或甘油。可被添加到本公开以使免疫刺激组合物等渗的药剂包含右旋糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇、PEG 300、PEG 400和聚乙二醇。

抗氧化剂

在具体实施中，免疫刺激组合物包含抗氧化剂。可用于本公开的乳液中的例示性抗氧化剂包括但不限于α-生育酚(维生素E)、亚硫酸氢钠和抗坏血酸。

稳定性

本文提供的疫苗组合物的稳定性在储存之后借助于一种或多种测定法(例如，生物物理学和生物化学测定法)来评估。稳定性可通过测量储存期间粒度的改变来评估。粒度稳定性可通过测量储存前后的平均粒度来评价。疫苗组合物可在约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃储存。

例如，动态光散射(DLS)可用于评价乳液粒度。在一些具体实施中，将其与储存之前的乳液粒度进行比较。在一些具体实施中，不将乳液粒度与储存之前的粒度进行比较。在本文的一些具体实施中，通过测量疫苗组合物的Z-平均直径(Z-avg)来确定粒度。在特定具体实施中，当粒度的Z-平均直径从初始尺寸增加小于20％时，指示稳定的组合物。

在一些具体实施中，动态光散射(DLS)可用于评价Pdl。在一些具体实施中，将其与储存之前的疫苗组合物的PDI进行比较。

在一个实施方案中，在储存之后评价ζ电势。例如，动态光散射(DLS)可用于评价ζ电势。在一些具体实施中，将其与储存之前的ζ电势进行比较。

治疗剂

在一些具体实施中，组合物可用于治疗目的。因此，在一些具体实施中，所描述的组合物包含用于治疗疾病、病症或疾患的生物活性剂。

在一些具体实施中，药剂可用于治疗或预防过敏、癌症、感染性疾病、自身免疫或成瘾。在一些具体实施中，试剂可用于刺激、增强和/或调节免疫应答。

在所公开的具体实施的一些方面，组合物包含癌抗原或编码癌抗原的核酸。在一些具体实施中，包含癌抗原的疫苗组合物将可用于对抗以肿瘤相关抗原表达(诸如HER-2/neu表达)或者其他癌症特异性或癌症相关抗原为特征的任何癌症。

根据本公开的某些具体实施的组合物和方法也可用于预防或治疗自体免疫性疾病，其包括以下疾病、病症或疾患：其中宿主或受试者的免疫系统不利地介导针对“自身组织”、细胞、生物分子(例如，肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、含蛋白脂质、脂质、糖脂、核酸(诸如RNA和DNA)、低聚糖、多糖、蛋白聚糖、糖胺聚糖等以及受试者细胞和组织的其他分子组分)或表位(例如，特异性免疫学限定的识别结构，诸如通过抗体可变区互补性决定区(CDR)或通过T细胞受体CDR识别的那些)的免疫应答。

本公开的组合物可包含与呼吸系统疾病(诸如由细菌感染(例如，肺炎球菌)引起或加剧的那些)相关联的抗原，以用于预防和治疗病症(诸如慢性阻塞性肺病(COPD))。

在一些具体实施中，本公开的组合物用于促进或增强受试者中的免疫应答。在一些此类具体实施中，生物活性剂为助剂。非限制性助剂包括：TLR激动剂(包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9激动剂)、Rig-I激动剂、皂草苷、碳水化合物、碳水化合物聚合物、缀合的碳水化合物、全病毒颗粒、病毒样颗粒、病毒片段和细胞片段。此类助剂的示例包括但不限于：双链RNA、RIBOXXOL、聚(I:C)和

在一些方面，本公开的组合物可用于增强或引发宿主、患者中或细胞培养物中的免疫应答。如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物。患者可患有感染性疾病、癌症(诸如乳腺癌)或自身免疫疾病，或者可以为正常(即，没有可检测到的疾病和/或感染)。细胞培养物为包含免疫活性细胞或分离的免疫系统细胞(包括但不限于T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突细胞)的任何制备物。此类细胞可通过本领域的普通技术人员众所周知的多种技术中的任一种(例如，Ficoll-泛影钠密度离心)来分离。细胞可(但不必)已从患有癌症的患者中被分离出来，并可在治疗之后被重新引入到患者中。

免疫应答通常可被认为例如在分子和细胞水平上通过宿主的免疫系统的细胞和组织来区分自身和非自身结构，但本公开不应限于此。例如，免疫应答也可包括由自身分子、细胞或组织的免疫识别引起的免疫系统状态改变，如可伴随任何数量的正常状况(诸如免疫系统组分的典型调节)，或如可存在于病理状况(诸如在自体免疫和退行性疾病中观察到的不适当的自体免疫应答)中。又如，除通过特定免疫系统活性的上调进行诱导之外(诸如抗体和/或细胞因子产生，或细胞介导的免疫力的活化)，免疫应答也可包括对可检测到的免疫力的抑制、衰减或任何其他下调，其可以为所选择的抗原、抗原施用途径、特异性耐受诱导或其他因素的结果。

对通过本公开的疫苗进行的免疫应答的诱导的确定可通过本领域的普通技术人员将很快熟悉的多种众所周知的免疫测定法中的任一者来建立。此类测定法包括但不必限于如下的体内或体外确定：可溶性抗体；可溶性介质诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介质；如由免疫系统的细胞的改变的功能或结构特性例如细胞增殖、改变的运动性、特化活性的诱导诸如特异性基因表达或溶细胞行为确定的细胞激活状态；免疫系统的细胞发生的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)开始。用于执行这些和类似测定法的规程是广为人知的并且可见于例如Lefkovits(《免疫学方法手册：全面的技术资料集》(Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques)，1998；还可参见《免疫学实验室指南》(Current Protocols in Immunology)；还可参见例如Weir，《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，1986，布莱克威尔科学出版社(Blackwell Scientific)，马萨诸塞州波士顿(Boston,MA)；Mishell和Shigii(编辑)，《细胞免疫学方法精选》(Selected Methods in Cellular Immunology)，1979，弗里曼出版社(Freeman Publishing)，加利福尼亚州旧金山(San Francisco,CA)；Green和Reed，1998，《科学》(Science)281:1309以及其中引用的参考文献)。

可例如通过使用诸如放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、平衡透析或固相免疫印迹(包括蛋白质印迹)的体外方法，测定来自用根据本公开的疫苗处理的宿主的样品(例如，包含免疫球蛋白的样品，诸如血清、血浆或血液)来实现对抗原特异性抗体产生的检测。在一些具体实施中，ELISA测定法还可包括用对抗原具有特异性的固相单克隆抗体进行对靶抗原的抗原捕获固定，例如，以增强该测定法的敏感性。可溶性介质(例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺素等)的精细加工也可例如使用易于从商业来源获得的方法、装置和试剂(例如，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)；还可参见《安迪生物科技公司2006年产品目录》(R&D Systems 2006Catalog)，明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技公司(R&D Systems,Minneapolis,MN))通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)容易地确定。

疫苗组合物

在一些具体实施中，疫苗组合物或疫苗制剂用于引发或增强宿主中对抗原的免疫反应性或免疫应答。在某些具体实施中，本文所述的组合物(例如，疫苗组合物)包含能够引发针对人或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原组合物。

因此本公开提供了用于改变(即，例如相对于如本领域技术人员将熟悉的适当对照，以统计上显著的方式增加或降低)能够产生免疫应答的宿主中的免疫应答的组合物。如将为本领域的普通技术人员所知的，免疫应答可以为宿主的免疫状态的任何主动改变，这可包括参与宿主免疫状态的维持和/或调节的一个或多个组织、器官、细胞或分子的结构或功能的任何改变。通常，免疫应答可由多种熟知参数中的任何参数来检测，包括但不限于如下的体内或体外确定：可溶性免疫球蛋白或抗体；可溶性介质诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介质；如通过免疫系统的细胞的改变的功能或结构特性(例如细胞增殖、改变的运动性、特化活性的诱导，诸如特异性基因表达或溶细胞行为)确定的细胞活化状态改变；免疫系统的细胞发生的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)开始；或任何其他可检测免疫应答的存在的标准。

本公开的组合物对免疫应答的诱导的确定可通过本领域普通技术人员将很快熟悉的多种熟知的免疫测定法中的任一种来建立。此类测定法包括但不必限于如下的体内或体外确定：可溶性抗体；可溶性介质诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介质；如通过免疫系统的细胞的改变的功能或结构特性(例如细胞增殖、改变的运动性、特化活性的诱导，诸如特异性基因表达或溶细胞行为)确定的细胞活化状态改变；免疫系统的细胞发生的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)开始。用于执行这些和类似测定法的规程是广为人知的并且可见于例如Lefkovits(《免疫学方法手册：全面的技术资料集》(ImmunologyMethods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques)，1998；还可参见《免疫学实验室指南》(Current Protocols in Immunology)；还可参见例如Weir，《实验免疫学手册》(Handbook ofExperimental Immunology)，1986，布莱克威尔科学出版社(BlackwellScientific)，马萨诸塞州波士顿(Boston,MA)；Mishell和Shigii(编辑)，《细胞免疫学方法精选》(Selected Methods in Cellular Immunology)，1979，弗里曼出版社(FreemanPublishing)，加利福尼亚州旧金山(San Francisco,CA)；Green和Reed，1998，《科学》(Science)281:1309以及其中引用的参考文献)。

抗原反应性T细胞增殖的检测可通过多种已知的技术实现。例如，T细胞增殖可通过测量DNA合成的速率来检测，并且抗原特异性可通过控制候选抗原反应性T细胞暴露于的刺激物(诸如，例如，特定期望抗原或对照抗原脉冲的抗原递呈细胞)来确定。已被刺激增殖的T细胞表现出增加的DNA合成速率。测量DNA合成速率的典型方式是，例如，通过用氚化胸腺嘧啶对T细胞培养物进行脉冲标记，该氚化胸腺嘧啶是掺入新合成的DNA中的核苷前体。掺入的氚化胸腺嘧啶的量可使用液体闪烁谱仪来确定。检测T细胞增殖的其他方式包括测量白介素-2(IL-2)产生的增加、Ca²⁺流或染料摄取，诸如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑。另选地，可测量淋巴因子(诸如干扰素-γ)的合成，或可定量可对特定抗原作出应答的T细胞的相对数量。

可例如通过使用诸如放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、平衡透析或固相免疫印迹(包括蛋白质印迹)的体外方法，测定来自用根据本公开的疫苗处理的宿主的样品(例如，包含免疫球蛋白的样品，诸如血清、血浆或血液)来实现对抗原特异性抗体产生的检测。在具体实施中，ELISA测定法还可包括用靶抗原特异性的固相单克隆抗体进行该抗原的抗原捕获固定，例如，以增强该测定法的敏感性。可溶性介质(例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺素等)的精细加工也可例如使用易于从商业来源获得的方法、装置和试剂(例如，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)；还可参见《安迪生物科技公司2006年产品目录》(R&D Systems 2006Catalog)，明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物科技公司(R&D Systems,Minneapolis,MN))通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)容易地确定。

许多其他免疫学参数可使用本领域中熟知的常规测定法来监测。这些测定法可包括例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)测定法、继发性体外抗体应答、使用已确立的标志物抗原系统进行各种外周血细胞或淋巴样单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光测定分析、免疫组织化学或其他相关测定法。这些和其他测定法可见于例如Rose等人(编辑)，《临床实验室免疫学手册》(Manual of Clinical Laboratory Immunology)，第5版，1997，美国微生物学会(American Society of Microbiology)，华盛顿特区(Washington,DC)。

因此，设想了本文所提供的组合物将能够在宿主中引发或增强至少一种免疫应答，所述至少一种免疫应答选自Th1型T淋巴细胞应答、TH2型T淋巴细胞应答、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、抗体应答、细胞因子应答、淋巴因子应答、趋化因子应答以及炎症应答。在某些具体实施中，免疫应答可包括下述中的至少一种：一种或多种细胞因子的产生，其中细胞因子选自干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；一种或多种白介素的产生，其中白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18和IL-23；—种或多种趋化因子的产生，其中趋化因子选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL2、CCL4、CCL5、CXCL1和CXCL5；以及选自记忆性T细胞应答、记忆性B细胞应答、效应T细胞应答、细胞毒性T细胞应答和效应B细胞应答的淋巴细胞应答。

药物组合物

本文提供了包含如本文所述的分散体或乳液或纳米结构脂质载体的药物组合物。在一些具体实施中，组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。例示性载体在所采用的剂量和浓度下对接受者将是无毒的。用于治疗用途的“药学上可接受的载体”在药学领域中是众所周知的，并且描述于例如《雷明顿药物科学》(Remingtons PharmaceuticalSciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)(A.R.Gennaro编辑，1985)中。例如，可使用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至矫味剂。例如，可添加苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。同上1449。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。同上。

在本文提供的一些具体实施中，本文提供的药物组合物能够通过0.45微米过滤器过滤。在一些具体实施中，药物组合物能够通过0.20微米过滤器过滤。在一些具体实施中，药物组合物能够通过0.22微米过滤器过滤。

“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的盐，其来源于此类化合物与有机或无机酸(酸加成盐)或者有机或无机碱(碱加成盐)的组合。本公开的组合物可以游离碱或盐的形式使用，其中这两种形式都被认为在本公开的范围内。

药物组合物可以是允许将该组合物施用给患者的任何形式。例如，组合物可以呈固体、液体或气体(气溶胶)的形式。典型的施用途径包括但不限于口服、局部、肠胃外(例如，舌下或向颊地)、舌下、直肠、阴道和鼻内(例如，作为喷雾)。如本文所用的术语肠胃外包括离子电渗(例如，U.S.7,033,598；7,018,345；6,970,739)、超声促渗(例如，U.S.4,780,212；4,767,402；4,948,587；5,618,275；5,656,016；5,722,397；6,322,532；6,018,678)、热(例如，U.S.5,885,211；6,685,699)、无源透皮(例如，U.S.3,598,122；3,598,123；4,286,592；4,314,557；4,379,454；4,568,343；5,464,387；英国专利说明书2232892号；U.S.6,871,477；6,974,588；6,676,961)、微针(例如，U.S.6,908,453；5,457,041；5,591,139；6,033,928)施用以及皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、海绵窦内、鞘内、耳道内、尿道内、肿瘤内注射或输注技术。在具体实施方案中，通过选自离子电渗、微空化、超声促渗或微针的技术在真皮内施用如本文所述的组合物(包括疫苗和药物组合物)。

药物组合物被配制成使得允许其中所含的活性成分在将组合物施用于患者时是生物可利用的。将要施用给患者的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以为单剂量单位，并且气溶胶形式的本公开的一种或多种化合物的容器可容纳多个剂量单位。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现或至少部分地实现期望效果(例如，足以生成期望免疫应答)的量。按“有效方案”施用有效量的组合物。术语“有效方案”是指足以实现期望效果的被施用的组合物的量与给药频率的组合。

可改变实际剂量水平，以便获得有效地实现对于特定患者、组合物和施用模式而言期望的应答而对患者没有毒性的量。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，外加所采用的特定组合物、接受治疗的受试者的年龄、性别、体重、病症、总体健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。

在本文提供的治疗具体实施中，施用约1μg/kg至约10mg/kg剂量的治疗性药物组合物。对于本领域技术人员将显而易见的是，施用的次数和频率将取决于受试者的应答。

在本文提供的基于疫苗的具体实施中，每次施用将施用约1μg至100μg的抗原或0.1μg至10mg的编码抗原的核酸，本发明的制剂允许复制子RNA的从约0.1ug、约1ug、约5μg或约10μg至约500μg的人剂量。本发明的制剂允许约5μg至约20μg复制子RNA的人剂量。

对于本领域的技术人员将显而易见的是，施用的次数和频率将取决于受试者的应答，制剂允许在少至一次免疫接种之后具有治疗功效。

对于口服施用，可存在赋形剂和/或粘结剂。示例为蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。可存在着色剂和/或调味剂。可采用包衣壳。

组合物可以呈液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个示例，该液体可用于口服施用或用于通过注射递送。当旨在用于口服施用时，组合物可含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂中的一者或多者。在旨在通过注射来施用的组合物中，可包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一者或多者。

不论呈溶液、悬浮液还是其他类似形式的形式，如本文所用的液体药物组合物可包含以下载体或赋形剂中的一者或多者：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液、生理盐水、林格液、等渗氯化钠、固定油(诸如角鲨烯、角鲨烷、矿物油、二缩甘露醇单油酸酯、胆固醇和/或可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张度的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可被封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。可注射的药物组合物优选为无菌的。

药物组合物可呈冻干饼状物的形式。在一些具体实施中，本文所指的饼状物为由冻干过程产生的多孔和海绵状结构样材料；或者饼状物为在冷冻干燥过程之后剩余的固体内容物。在一些具体实施中，饼状物的外观可被描述为海绵状饼状物、可爱饼状物和优雅饼状物。在一些具体实施中，如果冻干后没有形成饼状物，则所得组合物可被表征为透明膜、薄膜、厚白色膜或固化的气泡。期望的饼状物是指以下饼状物：在2℃至8℃或以上或在约8℃的典型冷链储存在上述温度暴露、储存或保持饼状物之后，该饼状物显示出冻干疫苗制剂的期望特征。(“用于小分子冻干的赋形剂(Excipients used in lyophilization ofsmall molecules)”Ankit Bahetia，Lokesh Kumarb，Arvind K.Bansal，《赋形剂与食品化学杂志》(J.Excipients and Food Chem.)1(1)2010；41-54。)

当冻干时，药物组合物可包含一种或多种冻干赋形剂。如本文所用，冻干赋形剂可指除药理学活性药物之外的物质，其被包括在冻干过程中以有助于合适的饼状物结构的形成或配制。冻干赋形剂可包括膨松剂、缓冲剂或增溶剂。

在一些具体实施中，使用VirTis(Gardiner，NY)Advantage 2.0EL-85台式冷冻干燥机来执行冻干。冷冻干燥配方可使用热处理计划表，包括从4℃到-40℃的10小时冷冻步骤和在-15℃的退火步骤。初级干燥阶段(处于100mTorr)可从-40℃到25℃持续18.3小时。最后，可在25℃采用处于50mTorr的次级干燥阶段达9小时。

抗原

在一些具体实施中，本公开的制剂还将包含一种或多种抗原。

在一些具体实施中，抗原为流感相关抗原。在一些具体实施中，抗原为引起流感的抗原。在一些具体实施中，抗原来自引起流感的病毒。在一个实施方案中，抗原包括H5N1。在一个实施方案中，抗原包括H5N1。

用于在本文所述的疫苗组合物和采用GLA的方法的某些具体实施中使用的抗原可以为期望针对其引发或增强受试者中的免疫反应性的任何靶表位、分子(包括生物分子)、分子复合物(包括包含生物分子的分子复合物)、亚细胞组装、细胞或组织。通常，术语抗原将是指感兴趣的多肽抗原。然而，如本文所用，抗原也可指编码感兴趣的多肽抗原的重组构建体(例如，表达构建体)。在某些具体实施中，抗原可以为以下、或可来源于以下、或可与以下产生免疫学交叉反应：感染性病原体和/或与感染、癌症、自身免疫疾病、过敏、哮喘或其中刺激抗原特异性免疫应答将是期望的或有益的任何其他病症相关联的表位、生物分子、细胞或组织。

某些具体实施，本公开的疫苗制剂包含能够引发针对人或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原组合物，该抗原或抗原组合物可包括来源于病毒的组合物，诸如来自HIV-1(诸如tat、nef、gpl20或gpl60)、人疱疹病毒(诸如gD或其衍生物)或即刻早期蛋白(诸如来自HSV1或HSV2的ICP27)、细胞巨化病毒((尤其是人)(诸如gB或其衍生物)、轮状病毒(包括减毒活病毒)、爱泼斯坦巴尔病毒(诸如gp350或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(诸如gpl、II和IE63)，或来自肝炎病毒，诸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或来自其他病毒病原体，诸如副粘病毒：呼吸道合胞病毒(诸如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒(例如HPV6、11、16、18等)、黄病毒(例如，黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)、流感病毒(在卵或MDCK细胞中生长的完整活或灭活病毒、裂解流感病毒，或完整流感病毒体(如Gluck，《疫苗》(Vaccine)，1992，10，915-920所描述的)或其纯化或重组蛋白，诸如HA、NP、NA或M蛋白，或它们的组合)。

在某些具体实施中，本公开的疫苗制剂含有针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的抗原。在一些具体实施中，有效载荷为对严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)具有特异性的多肽抗原。SARS-CoV-2包括主要结构蛋白刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)。在一些具体实施中，有效载荷选自由以下项组成的组：SARS-CoV-2S、E、M和N蛋白及其片段。

在某些其他具体实施中，本公开的疫苗制剂包含能够引发针对人或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原组合物，该抗原或抗原组合物可包括来源于一种或多种细菌病原体的组合物，诸如奈瑟氏球菌属，包括淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(例如荚膜多糖及其缀合物、转铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；酿脓链球菌(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌、变异链球菌：杜克雷嗜血杆菌；莫拉氏菌属，包括卡他莫拉菌，也称为卡他布兰汉菌(例如高和低分子量粘附素和侵袭素)；博代氏杆菌属，包括百日咳杆菌(例如百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、丝状红血球凝集素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳杆菌和支气管腐败杆菌；分枝杆菌属，包括肺结核分枝杆菌(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、类结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌；军团杆菌属，包括嗜肺军团杆菌；埃希氏菌属，包括肠毒性大肠杆菌(例如定殖因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒素或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、致肠病大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素或其衍生物)；弧菌属，包括霍乱弧菌(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺菌属，包括宋内志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌；耶尔森氏鼠疫杆菌属，包括小肠结肠炎耶尔森氏鼠疫杆菌(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏鼠疫杆菌、假结核病耶尔森氏鼠疫杆菌；弯曲杆菌属，包括空肠弯曲杆菌(例如毒素、粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌；沙门氏菌属，包括伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌；李斯特氏菌属，包括单核细胞增多性李斯特菌；螺杆菌属，包括幽门螺旋杆菌(例如尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌属，包括铜绿假单胞菌；葡萄球菌属，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；肠球菌属，包括粪肠球菌、屎肠球菌；破伤风梭菌属，包括破伤风梭菌(例如破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(例如肉毒梭菌毒素及其衍生物)、艰难梭菌(例如破伤风梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢杆菌属，包括炭疽芽孢杆菌(例如肉毒梭菌毒素及其衍生物)；棒状杆菌属，包括白喉棒状杆菌(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属，包括伯氏疏螺旋体(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋体(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.afzelii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安德森疏螺旋体(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏疏螺旋体；埃立克体属，包括马埃立克体以及人粒细胞埃立克体的药剂；立克次体属，包括立氏立克次体；衣原体属，包括沙眼衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体；钩端螺旋体，包括问号钩端螺旋体；密螺旋体，包括苍白密螺旋体(例如稀有的外膜蛋白)、齿垢密螺旋体、猪痢疾密螺旋体；或其他细菌病原体。

在某些其他具体实施中，本公开的疫苗制剂包含能够引发针对人或其他哺乳动物病原体的免疫应答的抗原或抗原组合物，该抗原或抗原组合物可包括来源于一种或多种寄生生物的组合物(参见，例如，John，D.T.和Petri，W.A.，《马克尔和沃格的医学寄生虫学》(Markell and Voge’s Medical Parasitology)-^版，2006，WB Saunders，费城(Philadelphia)；Bowman，D.D.，《乔治的兽医寄生虫学》(Georgis’Parasitology forVeterinarians)-第8版，2002，WB Saunders，费城)，诸如疟原虫属，包括恶性疟原虫；弓形虫属，包括鼠弓形虫(例如SAG2、SAG3、Tg34)；内阿米巴属，包括溶组织内阿米巴；巴贝虫属，包括田鼠巴贝虫；锥体虫属，包括克氏锥体虫；贾第鞭毛虫属，包括兰伯氏贾第鞭毛虫；利什曼虫属，包括主要利什曼虫；肺囊虫属，包括卡氏肺囊虫；毛滴虫属，包括阴道毛滴虫；或来自能够感染哺乳动物的蠕虫，诸如：(i)线虫感染(包括但不限于蠕形住肠线虫、似蚓蛔线虫、毛首鞭虫、美洲板口线虫、十二指肠钩虫、班氏吴策线虫、马来丝虫、旋盘尾丝虫、麦地那龙线虫、旋毛线虫和粪类圆线虫)；(ii)吸虫感染(包括但不限于曼氏血吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫、湄公血吸虫、华支睾吸虫、并殖吸虫属、肝片吸虫、大拟片吸虫、巨片吸虫)；以及(iii)绦虫感染(包括但不限于牛肉绦虫和猪肉绦虫)。因此，某些具体实施可设想疫苗组合物，其包含来源于血吸虫属(曼氏血吸虫、埃及血吸虫和/或日本血吸虫)或来源于酵母(诸如假丝酵母属，包括白色念珠菌；隐球菌属，包括新型隐球菌)的抗原。

根据如本文所公开的某些其他具体实施，疫苗组合物和相关制剂以及使用方法可包括来源于癌细胞的抗原，如可用于癌症的免疫疗法治疗。例如，助剂制剂可用于肿瘤排斥抗原，诸如用于前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑素瘤癌的那些，癌或癌细胞来源的抗原包括MAGE 1,3和MAGE 4或其他MAGE抗原，诸如公开于WO99/40188中的那些、PRAME、BAGE、Lage(也称为NY Eos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996《当前免疫学观点》(Current Opinions in Immunology)8，第628-636页；Van den Eynde等人，《国际临床与实验室研究杂志》(International Journal ofClinical Laboratory Research)(1997和1998)；Correale等人(1997)，《国家癌症研究所杂志》(Journal of the National Cancer Institute)89，第293页。癌抗原的这些非限制性示例在宽泛范围的肿瘤类型中表达，诸如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。参见，例如，美国专利6,544,518号。

适合与根据某些目前公开的具体实施的疫苗组合物一起使用的其他肿瘤特异性抗原包括但不限于肿瘤特异性或肿瘤相关的神经节苷脂，诸如GM₂和GM₃或其与载体蛋白的缀合物；或者在用于引发或增强抗癌免疫应答的疫苗组合物中使用的抗原可以为自身肽激素，诸如全长促性腺激素释放激素(GnRH，WO 95/20600)，其是一种短的10个氨基酸长的肽，可用于治疗许多癌症。在另一个实施方案中，使用前列腺抗原，诸如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(例如，《美国国家科学院学报》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)95(4)1735-17401998)、PSMA或在一个实施方案中被称为前列腺酶的抗原。(例如，Nelson等人，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1999)96:3114-3119；Ferguson等人《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1999.96，3114-3119；WO 98/12302；美国专利5,955,306号；WO 98/20117；美国专利5,840,871号和5,786,148号；WO 00/04149。其他前列腺特异性抗原从WO 98/137418和WO/004149是已知的。另一种为STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)。

可用于本公开的上下文中的其他肿瘤相关抗原包括：Plu-1(《生物化学杂志》JBiol.Chem 21(22)15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomonetal Bioessays199，21:61-70，美国专利5,654,140号)和Criptin(美国专利5,981,215号)。

另外，与癌症疗法中的疫苗特别相关的抗原也包括酪氨酸酶和存活蛋白。

在其他具体实施中，用于本公开的组合物中的一种或多种抗原包括与呼吸系统疾病(诸如由细菌感染(例如，肺炎球菌)引起或加剧的那些)相关联的抗原，用于预防和治疗病症(诸如慢性阻塞性肺病(COPD))。COPD在生理学上被定义为在慢性支气管炎和/或肺气肿患者中存在不可逆的或部分可逆的气道阻塞(《美国呼吸和重症护理医学杂志》(AmJRespir Crit Care Med.)1995年11月；152(5Pt 2):S77-121)。COPD的加剧通常由细菌(例如，肺炎球菌)感染引起(《临床微生物学评论》(Clin Microbiol Rev.)2001年4月；14(2):336-63)。

核酸

本公开的疫苗制剂的某些具体实施包括编码抗原的核酸分子(例如，DNA或RNA)。合适的抗原包括但不限于细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生生物抗原、植物抗原、癌抗原或它们的组合。抗原可被包括在以下中或源自以下：例如，过敏、癌症、感染性疾病或自身免疫疾病。核酸分子包括但不限于寡核苷酸、脱氧核糖核苷酸、质粒DNA、环状DNA、线性DNA、单链DNA、修饰的DNA、反义DNA、核糖核苷酸、mRNA、化学修饰的RNA、非编码RNA、miRNA、siRNA、tRNA、核糖体RNA、RNA核酶、复制子RNA、RNA适体、DNA适体、双链RNA、碱基取代的RNA和包含肌苷的RNA。

在具体实施中，生物活性剂为RNA分子。RNA分子可编码各种类型的蛋白质，包括但不限于抗原、抗体、毒素、生长因子、细胞因子和激素。本文所用的RNA分子还可表示非编码RNA，包括但不限于siRNA、miRNA、CRISPR引导RNA、核糖酶RNA、发夹、RNA适体、RNA激动剂和免疫调节RNA。有利地，自我复制RNA分子使用细胞的翻译机制来生成显著增加的编码的基因产物，诸如蛋白质或抗原，其可在细胞中聚积或从细胞分泌。

在一些具体实施中，生物活性剂为自我复制RNA分子。自我复制RNA分子在本领域中是众所周知的，并且可通过使用来源于病毒(例如，甲病毒属、黄病毒属、小核糖核酸病毒)的复制元件并用编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列取代结构病毒蛋白来产生。自我复制RNA分子通常为(+)-链分子，其可在递送到细胞后被直接翻译，并且这种翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，该酶然后从递送的RNA产生反义和有义转录物。因此，递送的RNA导致多个子RNA的产生。这些子RNA以及共线性亚基因组转录物可被自身翻译以提供编码的抗原的原位表达，或者可被转录以提供与递送的RNA具有相同意义的另外的转录物，其被翻译以提供抗原的原位表达。该转录序列的总体结果为引入的复制子RNA数量的扩增，并且从而编码的抗原变成为细胞的主要多肽产物。

有利地，自我复制RNA分子利用细胞的翻译机制来生成显著增加的编码的基因产物，诸如蛋白质或抗原，其可在细胞中积累或从细胞分泌。自我复制RNA分子可例如通过RNA复制和扩增以及翻译的产物来刺激toll样受体(TLR)3、7和8以及非TLR路径(例如，RIG-I、MD-5)，这可诱导转染的细胞的凋亡。

在其中生物活性剂为DNA分子的具体实施中，DNA分子可编码各种类型的蛋白质，包括但不限于抗原、抗体、毒素、生长因子、细胞因子和激素。DNA可包括但不限于质粒DNA、环状DNA、线性DNA、单链DNA、修饰的DNA、反义DNA和适体DNA。

助剂

在一些具体实施中，在本文所述的组合物中使用的助剂(例如，热稳定冻干疫苗)为免疫刺激助剂。免疫刺激助剂可以为直接作用于免疫系统的助剂，诸如，例如，细胞因子、TLR配体或微生物毒素。在本文的一些具体实施中，助剂为细胞因子助剂。在本文所述的组合物中，一种或多种细胞因子可适合单独作为助剂或者与一种或多种附加助剂相组合。合适的细胞因子包括干扰素(IFN)、白介素(IL)、趋化因子、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些具体实施中，干扰素为I型IFN、II型IFN或III型IFN。在一些具体实施中，干扰素为IFN-α、IFN-β、IFN-γ或IFN-λ以及这些当中的亚型(例如，IFN-λ、IPN-λ2和IPN-λ3)。在一些具体实施中，细胞因子为白介素。可在本文所述的组合物中用作助剂的白介素的非限制性示例包括：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35和IL-36。在一些具体实施中，细胞因子为趋化因子。在一些具体实施中，趋化因子为CC趋化因子、CXC趋化因子、C趋化因子或CX3C趋化因子。可用作本文所述组合物中的助剂的CC趋化因子的非限制性示例包括：CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28。可用于本文所述组合物中的CXC趋化因子的非限制性示例包括：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17。在一些具体实施中，细胞因子为集落刺激因子。在一些具体实施中，集落刺激因子为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。在一些具体实施中，细胞因子为肿瘤坏死因子。可用作本文所述组合物中的助剂的肿瘤坏死因子家族蛋白的非限制性示例包括TNF-α和4-1BBL。

在一些具体实施中，免疫刺激性助剂为Toll样受体(TLR)配体(例如，TLR激动剂)。在本文所述的组合物中，一种或多种TLR配体可适合单独作为助剂或者与一种或多种附加助剂相组合。TLR包括先天免疫系统的细胞表面跨膜受体，其赋予宿主细胞对多种保守的微生物分子结构的早期识别能力，该微生物分子结构诸如可存在于大量感染性病原体中或大量感染性病原体上(例如，Armant等人，2002《基因组生物学》(Genome Biol.)3(8):综述3011.1-3011.6；Fearon等人，1996《科学》(Science)272:50；Medzhitov等人，1997《当前免疫学观点》(Curr.Opin.Immunol.)9:4；Luster 2002《当前免疫学观点》(Curr.Opin.Immunol.)14:129；Lien等人，2003《自然免疫学》(Nat.Immunol.)4:1162；Medzhitov，2001《自然综述免疫学》(Nat.Rev.Immunol.)1:135；Takeda等人，2003《免疫学年度评论》(Ann Rev Immunol.)21:335；Takeda等人，2005《国际免疫学》(Int.Immunol.)17:1；Kaisho等人，2004《微生物感染》(Microbes Infect.)6:1388；Datta等人，2003《免疫学杂志》(J.Immunol.)170:4102)。

诱导TLR介导的信号转导以增强经由先天免疫系统的免疫应答的发起可通过与细胞表面TLR接合的TLR激动剂(例如，TLR配体)来实现。例如，脂多糖(LPS)可以为通过TLR2或TLR4的TLR激动剂(Tsan等人，2004《白细胞生物学杂志》(J.Leuk.Biol.)76:514；Tsan等人，2004《美国生理学细胞生理学杂志》(Am.J.Physiol.Cell Phsiol.)286:C739；Lin等人，2005Shock 24:206)；聚(肌苷-胞苷)(polykC)可以为通过TLR3的TLR激动剂(Salem等人，2006《疫苗》(Vaccine)24:5119)；CpG序列(包含未甲基化的胞嘧啶-鸟苷或“CpG”二核苷酸基序的寡脱氧核苷酸，例如，CpG 7909，Cooper等人，2005AIDS19:1473；CpG 10101Bayes等人，《寻找Exp临床药物方法》(Methods Find Exp Clin Pharmacol)27:193；Vollmer等人《关于生物疗法的专家意见》(Expert Opinion on Biological Therapy)5:673；Vollmer等人，2004《抗微生物药剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)48:2314；Deng等人，2004《免疫学杂志》(J.Immunol.)173:5148)可以为通过TLR9的TLR激动剂(Andaloussi等人，2006Glia 54:526；Chen等人，2006《免疫学杂志》(J.Immunol.)177:2373)；肽聚糖可以为TLR2和/或TLR6激动剂(SoboU等人，2006《生殖生物学》(Biol.Reprod.)75:131；Nakao等人，2005《免疫学杂志》(J.Immunol.)174:1566)；3M003(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-6,7,8,9-四氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇水合物，分子量318Da，来自明尼苏达州圣保罗的3M医药(3M Pharmaceuticals,St.Paul,MN)，其为相关化合物3M001和3M002的来源；Gorden等人，2005《免疫学杂志》(J.Immunol.)174:1259)可以为TLR7激动剂(Johansen2005《临床和实验过敏》(Clin.Exp.Allerg.)35:1591)和/或TLR8激动剂(Johansen 2005)；鞭毛蛋白可以为TLR5激动剂(Feuillet等人，2006《美国国家科学院学报》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)103:12487)；抑制蛋白可以为TLR11激动剂(Hedhli等人，2009，《疫苗》(Vaccine)，27(16):2274-87)；脂肽可以为TLR1、TLR2和/或TLR6激动剂(Gao等人，2013，《疫苗》(Vaccine)，31(26):2796-803)；并且丙型肝炎抗原可通过TLR7和/或TLR9用作TLR激动剂(Lee等人，2006《美国国家科学院学报》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)103:1828；Horsmans等人，2005《肝脏学》(Hepatol.)42:724)。其他TLR激动剂是已知的(例如，Schirmbeck等人，2003《免疫学杂志》(J.Immunol.)171:5198)并可根据当前描述的具体实施中的某些具体实施来使用。

例如，并且作为背景(参见，例如，美国专利6,544,518号)，已知含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激寡核苷酸当通过全身和粘膜途径被施用时作为助剂(WO96/02555，EP 468520，Davis等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，1998.160(2):870-876；McCluskie和Davis，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，1998，161(9):4463-6)。CpG为DNA中存在的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。Krieg，《自然》(Nature)374，第546页1995阐明了CG基序在免疫刺激中的主要作用。详细分析已表明，CG基序必须在特定序列背景中，并且此类序列在细菌DNA中是常见的，但在脊椎动物DNA中是罕见的。免疫刺激序列通常为：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG基序未被甲基化，但已知其他未甲基化的CpG序列是免疫刺激性的，并且可用于本公开的某些具体实施中。CpG当配制成疫苗时可在游离溶液中与游离抗原一起被施用(WO 96/02555；McCluskie和Davis，同上)，或与抗原共价缀合(PCT公开WO 98/16247号)，或用载体诸如氢氧化铝配制(例如，Davis等人，同上，Brazolot-Millan等人，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，1998，95(26)，15553-8)。

试剂盒

在某些具体实施中还设想包含本文所述的免疫刺激组合物的试剂盒，其可在一个或多个容器中提供。在一个具体实施中，组合物的所有组分一起存在于单个容器中，但可能的具体实施并非旨在如此受限，并且还设想两个或更多个容器，其中例如免疫助剂组合物与抗原组分分开并且不与抗原组分接触。向受试者施用如本文所述并且包含抗原和助剂组合物两者以及任选地其他本文所述组分的疫苗组合物是有益的。

本公开的试剂盒还可包含如本文所述的使用说明或用于混合小瓶中所含的材料的说明。在一些具体实施中，小瓶中的材料为干燥的或冻干的。在一些具体实施中，小瓶中的材料为液体。

根据此类试剂盒具体实施的容器可以是任何合适的容器、器皿、小瓶、安瓿、管、杯、盒、瓶、细颈瓶、广口瓶、平皿、单孔或多孔设备的孔、贮存器、罐等或者其中可放置、储存和/或运输本文所公开的组合物并且可进入其中取出内容物的其他装置。通常，此类容器可由与预期用途相容且可易于实现从中回收所含的内容物的材料制成。此类容器的非限制性示例包括玻璃和/或塑料密封的或可再密封的管和安瓿，包括具有橡胶隔片或与使用针和注射器抽取内容物相容的其他密封装置的那些。此类容器可例如由玻璃或化学相容的塑料或树脂制成，该玻璃或化学相容的塑料或树脂可由材料制成或可涂覆有材料，该材料允许从容器中有效回收材料和/或保护材料免受例如降解条件(诸如紫外光或温度极限)的影响或免于引入不期望的污染物(包括微生物污染物)。容器优选地为无菌的或可灭菌的，并且由将与任何载体、赋形剂、溶剂、溶媒等(诸如可用于悬浮或溶解本文所述的疫苗组合物和/或免疫助剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等)相容的材料制成。

产生免疫应答的方法

本文提供了在受试者中生成免疫应答的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述组合物的步骤，其中生物活性剂为蛋白抗原或编码蛋白抗原的核酸分子。在一些具体实施中，生物活性剂为编码蛋白抗原的RNA(例如，mRNA)或DNA分子。在一些具体实施中，提供了促进或增强免疫应答的方法，其中生物活性剂为助剂。

治疗有效量的组合物的典型施用途径包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、口颊、直肠、阴道、静脉内、真皮内、透皮、鼻内、粘膜内或皮下。在一些具体实施中，组合物的施用在肌内、眼、肠胃外或肺进行。

在一些具体实施中，本文所公开的组合物为疫苗组合物并且用作疫苗。本文所述的组合物可用于在受试者中产生免疫应答(包括非特异性应答和抗原特异性应答)。在一些具体实施中，免疫应答包括全身性免疫应答。在一些具体实施中，免疫应答包括粘膜免疫应答。免疫应答的产生包括刺激免疫应答、加强免疫应答或增强免疫应答。

本文所述的组合物可用于增强针对病毒的保护性免疫力。本文所述的组合物可用于增强针对一种或多种细菌病原体的保护性免疫力。本文所述的组合物可用于增强针对一种或多种寄生生物的保护性免疫力。

用于确定本公开的组合物是否能够有效地递送抗原和/或在受试者中具有期望的效果的方法是本领域中已知的并且未在本文中详细描述。在一个方面，可通过在血液样品中或从粘膜部位监测施用前后的抗原特异性抗体(例如，系统性IgM、IgG(IgG1、IgG2a或IgA)水平来确定针对抗原的免疫应答。还可在施用后通过评估抗原刺激后的T和B细胞功能来监测细胞免疫应答。

评估本文所公开的组合物或疫苗(其中核酸分子(例如，RNA)编码蛋白质抗原)的免疫原性的另一种方式是表达重组蛋白质抗原以通过免疫印迹和/或微阵列来筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质与患者样品之间的阳性反应指示患者已对所考虑的蛋白质产生免疫应答。该方法还可用于鉴定免疫显性抗原和/或蛋白质抗原内的表位。

还可通过用感兴趣的病原体感染激发适当的动物模型来在体内确定组合物的功效。

在本文所提供的具体实施中，受试者是哺乳动物(例如，包括农场动物(奶牛、猪、山羊、马等)、宠物(猫、狗等)和啮齿动物(大鼠、小鼠等)或人类的动物)。在一个实施方案中，受试者为人。在另一个实施方案中，受试者为非人哺乳动物。在另一个实施方案中，非人哺乳动物为狗、奶牛或马。

制备包含茄尼醇的组合物的方法

通过将可代谢油茄尼醇与一种或多种表面活性剂组合来产生稳定乳液(SE)。如本文所提供的，一种制备水性茄尼醇分散体的方法包括：(a)将茄尼醇添加到被加热至茄尼醇的熔点以上的缓冲水性溶液中；(b)使缓冲水性溶液和茄尼醇均化以形成水性茄尼醇分散体；以及(c)将粒度减小至约100nm或更小，同时保持温度高于茄尼醇的熔点。缓冲水性溶液可通过将一种或多种表面活性剂和/或张度剂溶解于水性缓冲液中来制备。可缓冲该水相。本文可使用任何生理上可接受的缓冲液，诸如水、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液等。水性组分的pH可介于4.0至8.0之间或为从约4.5到约6.8。在另一个具体实施中，水相为无RNA酶水或DEPC处理水或使用该无RNA酶水或DEPC处理水制备的缓冲液。

固体茄尼醇在加热的缓冲液中熔融形成水性茄尼醇分散体。使熔融的茄尼醇和缓冲液均化。可通过各种乳化方法均化，包括但不限于高剪切乳化和微流化。可将抗氧化剂添加到水性茄尼醇分散体。

例如，包括使混合物一次、两次或更多次通过注射器针头的方法将适用于均化小体积的液体。同样地，微流化器(MHOS微流体机，最多50道(pass)，在6巴的最大压力输入(约850巴的输出压力)达2分钟的时间段)中的乳化过程可被适配为产生更小或更大体积的分散体。这种适配可通过常规实验来实现，该常规实验包括测量所得分散体直至获得具有所需直径的油滴的制剂。一旦冷却至低于茄尼醇的熔点(其为约33℃)，则分散在缓冲液中的液体油固化并形成固体脂质纳米颗粒。

固体脂质纳米颗粒(SLN)或脂质纳米颗粒(LNP)为由脂质构成的纳米颗粒。固体脂质纳米颗粒通常为具有介于10纳米与1000纳米之间的平均直径的球形。固体脂质纳米颗粒具有可增溶亲脂性分子的固体脂质核基质。脂质核通过表面活性剂(乳化剂)被稳定。不同的配制程序包括高剪切均化和超声、溶剂乳化/蒸发或微乳化。使用超声处理可获得在30nm至180nm范围内的尺寸分布。

在一些具体实施中，包含茄尼醇的组合物可以为纳米结构的脂质载体(NLC)。本领域技术人员将理解，NLC由NLC颗粒组成。NLC描述于Beloqui等人，《纳米医学》(Nanomedicine)NBM 2016；12:143-161中。在低于茄尼醇的熔融温度的温度，本公开的NLC颗粒可包含：(a)包含液相脂质和固体茄尼醇的油核、(b)阳离子脂质、(c)疏水性表面活性剂和(d)亲水性表面活性剂，组合物可以为稳定的并能够将生物活性剂递送到细胞。生物活性剂的递送可例如用于生成免疫应答和/或用于治疗受试者的疾病和健康状况。

可在将茄尼醇和水性缓冲液混合时或紧接在施用于受试者之前(例如，床边)将抗原添加到水性茄尼醇分散体。

可将水性茄尼醇分散体干燥。可将抗原添加到干燥的组合物。

以下申请以引用方式并入：WO2010141861、WO2013119856、WO2008124647、WO2014042780、WO2009012166、WO2009143006、WO2010003085、WO2012064659、WO2008153541、WO2014160985、WO2014160987、WO2015103167、WO2014197629、WO2017200852、WO2017210364、WO2017200957、WO2017205225、WO2018053294、WO2018232257、WO2019051149和WO2018226949。

实施例

A.制剂

在(Milli-Q)去离子水中，用23mg/mL甘油、2.7mg/mL磷酸一铵、0.17mg/mL磷酸氢二铵和0.36mg/mL普朗尼克F68制备水性缓冲液。对于100mL批次的茄尼醇-SE，将96mL的缓冲液添加到250mL烧杯并在热板上在磁力搅拌下加热至45℃至50℃。将760mg DMPC、3.6g茄尼醇和0.022mL维生素E添加到缓冲液并使其溶解。然后将粗乳液用Silverson L4RT均化器以7000rpm至8000rpm均化达8分钟至10分钟。然后使用M-110P型号微流化器和用于40℃温度控制的外部循环水浴，在30,000psi将均化的乳液微流化达10道。在微流化之后，将乳液通过0.2μm注射器过滤器过滤并等分成1.2mL等分试样以供储存。

B.体外研究

用三种可代谢油中的一种配制助剂4％乳液：葡萄籽SE(批号QH598)、茄尼醇SE(批号QH592)或鲨鱼角鲨烯SE(批号QH597)。

a.PBMC测定法

从三个供体收集成人外周血。使用Ficoll密度梯度从血液中分离PBMC。将分离的PBMC重悬浮至5×10⁵个活细胞/mL。将200μl的PMBC与50μl的前述稀释的疫苗组合物中的一者混合。疫苗组合物包含在RPMI 1640和10％胎牛血清(FBS)中的1:1稀释至0.4％、0.2％、0.1％或0.05％油的可代谢油。将PBMC在37℃、5％ CO₂下孵育达18小时至24小时。在孵育之后，使用Guava仪器(Guava Technologies，加利福尼亚州海沃德)使用制造商的试剂、方案和软件通过流式细胞术来对细胞进行计数。

图1示出了在与处于四种不同油浓度中的一种油浓度的三种不同疫苗组合物中的一者一起孵育之后的活的PBMC的百分比。条高度为来自3个不同样品的值的平均值。PBMC跨所有疫苗制剂和油浓度都保持活力。

b.全血测定法(WBA)

通过WBA来确定先天免疫刺激。WBA提供了更好的生理环境，其可提供对血清生物标志物、生物特征谱的更广泛评估。

用从3名男性和3名女性供体收集的静脉未稀释肝素化全血来执行WBA。在收集的2小时内，将200μl的血液以1:1稀释并与50μl的三种制剂中的一种混合。以在冲洗级盐水中0.4％、0.2％、0.1％和0.05％油的四种不同稀释液来制备每种制剂。在混合之后，将血液在37℃、5％ CO₂下孵育达18小时至24小时。在孵育之后，收集血浆并在-20℃储存。根据制造商的说明使用特异性夹心ELISA测定法试剂盒(对于细胞因子，eBiosciences，加利福尼亚州圣地亚哥，并且对于趋化因子，Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)测定血浆的可溶性人细胞因子IL-8和IL-6以及趋化因子MCP-1和Mip-1β。

与角鲨烯乳液相比，茄尼醇制剂(批号QH592)对人全血显示出相当的或增加的体外先天刺激活性。

图2示出了对响应于用疫苗组合物刺激的MCP-1表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似浓度的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图3示出了对响应于用疫苗组合物刺激的Mip-1β表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似浓度的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图4示出了对响应于用疫苗组合物刺激的IL-8表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似量的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

图5示出了对响应于用疫苗组合物刺激的IL-6表达水平进行比较的ELISA数据。用处于0.4％油或0.2％油的茄尼醇配制的疫苗组合物产生了比具有类似量的鲨鱼角鲨烯的疫苗组合物高得多的表达水平。

C.小鼠体内研究

C57BL/6小鼠(4只雄性和4只雌性JAX#000664)以三周间隔(即，在第0天和第21天)用与指示的助剂的2％乳液混合的0.01μg的灭活重组流感HA H5N1蛋白“rH5”(A/越南/1194/2004)进行肌内免疫。助剂为葡萄籽SE(批号QH598)、茄尼醇SE(批号QH592)或鲨鱼角鲨烯SE(批号QH597)。也使用了在无助剂的情况下配制的对照物。在第21天(促进免疫之前)对小鼠采血并收集血清。在第42天收获小鼠。在第42天收集血清、骨髓和脾。

通过测量特异性抗体、针对HA的功能性抗体和浆母细胞的产生，将包含茄尼醇SE的疫苗组合物的助剂活性与包含葡萄籽油SE和鲨鱼角鲨烯SE的疫苗组合物进行比较。评估诱导抗体和T细胞应答的助剂活性。与鲨鱼角鲨烯SE相比，茄尼醇制剂可显著增强H5特异性和功能性抗体滴度两者。

a.评价助剂活性的免疫学测定法

i.ELISA端值滴度

通过抗体捕获ELISA来确定抗原特异性IgG、IgG1和IgG2c终点滴度。ELISA滴度用于对rH5特异性抗体进行定量。在第42天收集血浆。数据示出为每只动物的单独的点，其中条的高度表示均值，并指示SEM。通过单向ANOVA来确定显著性(ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。

图6示出了通过总血清IgG测量的对rH5疫苗的抗体应答。使用助剂鲨鱼角鲨烯SE或茄尼醇SE用疫苗制剂免疫产生了显著更高水平的针对抗原rH5的抗体。在鲨鱼角鲨烯SE或茄尼醇SE的使用之间没有显著的差异。

图7示出了通过血清IgG1测量的对rH5疫苗的抗体应答。IgG1为中和性抗体并且优先地通过Th2型免疫应答来诱导。

图8示出了通过血清IgG2c测量的对rH5疫苗的抗体应答。IgG2c为由Th 1型免疫应答优先诱导的中和和调理抗体。

ii.骨髓酶联免疫斑点测定法

在用rH5免疫之后，使用骨髓酶联免疫斑点测定法来确定疫苗特异性长寿命抗体分泌细胞(ASC)的诱导。稳健的抗体应答还反映在分泌H5特异性IgG的浆母细胞的升高的水平。

图9示出了通过酶联免疫斑点测定法的来自骨髓IgG浆母细胞的rH5特异性抗体应答。使用助剂鲨鱼角鲨烯SE或茄尼醇SE产生比对照物或葡萄籽SE显著更高计数的骨髓浆母细胞。结果被示出为检测到的细胞的数量(Log 10)，其中每个点表示单个动物，并且条表示均值。

iii.血凝抑制(HAI)

也根据公开的方法通过血凝抑制测定法(HAI)来检查病毒中和抗体的血清水平。血凝抑制(HI)测定法为对流感疫苗功效的有意义的预测指示标识，其中大于40的滴度被认为足以提供保护。需要HAI抗体来更有效地限制病毒复制和扩散。预先存在的IgG抗体可通过在感染之后与CD8记忆或效应T细胞协作以诱导稳健的T细胞应答来降低疾病严重性。高HAI滴度对于预防严重症状是理想的，功能性抗体在感染后仍可被快速诱导并以低预激发HAI滴度赋予适度保护。即使在不存在HAI抗体的情况下，疫苗也可诱导足以延缓病情进展的病毒特异性IgG和T细胞免疫的水平。Wong，SS.，Duan，S.，DeBeauchamp，J.等人，《免疫与使用水包油助剂的雪貂模型中的禽流感H5N1疫苗的保护作用相关联》(The immunecorrelates of protection for an avian influenza H5N1 vaccine in the ferretmodel using oil-in-water adjuvants)，《科学报告》(Sci Rep)7，44727(2017).https://doi.org/10.1038/srep44727

HAI滴度测量针对血凝素(HA)的功能性抗体。H5N1灭活病毒将结合火鸡/马红细胞以形成包被孔-血凝的晶格。与HA结合的抗体将阻断晶格形成，因此RBC形成团块-血凝抑制。使用洗过的1％马红细胞(RBC)来测定所有细胞。用在第42天收集的血清来执行HAI。

图10示出了用马红细胞(RBC)测量针对H5N1的功能性抗体的血凝抑制(HAI)测定法的几何平均滴度(GMT)。虚线指示病毒滴定测定法的检测极限(LOD)。鲨鱼角鲨烯SE和茄尼醇SE两者均表现出了比对照物或用葡萄籽SE配制的疫苗组合物显著更高的滴度。

iv.脾细胞酶联免疫斑点测定法

为了检查由助剂诱导的H5N1特异性T细胞记忆，在初级促进免疫之后3周收获脾细胞，并分析用H5 HA刺激时其分泌IFN-γ的脾细胞。通过酶联免疫斑点测定法(IL-5，IFNg)来研究细胞免疫应答。

图11示出了对IFNg具有特异性的抗体分泌细胞(ASC)的数量。与对照物或葡萄籽SE相比，助剂鲨鱼角鲨烯SE和茄尼醇SE两者均显示出显著更高水平的产生IFN-γ的细胞。

图12示出了对IL-5具有特异性的ASC。跨各种助剂制剂未观察到显著的差异。

D.稳定性

将用茄尼醇SE配制的疫苗组合物的生理化学稳定性与用鲨鱼角鲨烯SE配制的疫苗组合物的稳定性进行比较。茄尼醇制剂显示出与鲨鱼角鲨烯乳液相当的物理化学稳定性。

a.HPLC稳定性

使用HPLC方法，通过在320nm处的UV吸收检测来确定可代谢油的浓度。先前描述了HPLC方法(Misquith A，Fung M，Dowling Q M，Guderian J A，Vedvick T S，Fox C B.《TLR4激动剂活性的体外评价：制剂效果》(In vitro evaluation of TLR4 agonist activity:formulation effects)，《胶体和表面B：生物界面》(Coll Surf B:Biointerfaces)，2014；113:312-9)。通过在储存1个月、3个月、7个月和12个月之后测量可代谢油的浓度来确定稳定性。

以0.5mg/mL制备油标准品。将油标准品溶解于氯仿中，并将1mL等分试样置于HPLC小瓶中。使用Genevac EZ-2离心蒸发器(纽约州斯通里奇(Stone Ridge,N.Y.))蒸发氯仿。然后将样品在-20℃储存。通过在GLA-C中重构油标准品并注入5μL、10μL、20μL、30μL和40μL体积以产生五点曲线来产生标准曲线。

流动相A(75:15:10[v:v:v]甲醇:氯仿:水，含有20mM乙酸铵和1％乙酸)。流动相B(1:1[v:v]甲醇:氯仿，含有20mM乙酸铵和1％乙酸)。GLA-C：将样品在含有20mM乙酸铵和1％乙酸的2:1[v:v]甲醇:氯仿中稀释。

将疫苗组合物在GLA-C稀释液中1:50稀释。将15μL的稀释的疫苗组合物加载到柱上。一式三份地执行测量，其中每个时间点有三个单独的样品。使用以下梯度条件来执行HPLC：0分钟-10％ B、5分钟-10％ B、13分钟-100％ B、18分钟-10％ B和23分钟-10％ B。

一般来讲，油组分在约12分钟至15分钟时洗脱。DMPC在约8分钟时洗脱。所有其他制剂组分在约2.5分钟时洗脱。

图13示出了用茄尼醇(批号QH592)作为助剂的疫苗组合物在5℃储存期间的油浓度。虚线指示理论目标浓度。参考上述标准曲线确定了浓度。

图14A和图14B示出了在5℃分别储存1个月和12个月之后，用茄尼醇作为助剂的疫苗组合物的洗脱的色谱图。

图15示出了所有浓度的用鲨鱼角鲨烯(批号QH597)作为助剂的疫苗组合物在5℃储存期间的油浓度。

图16A和图16B分别示出了在5℃储存1个月和12个月之后，用茄尼醇作为助剂的疫苗组合物的洗脱的色谱图。

b.粒度稳定性

粒度不稳定性被任意限定为从初始尺寸生长>50％。在冷藏温度下，对于所测试的疫苗组合物中的任一者，非常小的尺寸生长是明显的。简言之，通过在水中1:100倍稀释每种乳液的等分试样并通过动态光散射(Malvern Zetasizer APS)测量散射强度-偏置尺寸平均值(Z-avg)，在指示的时间点确定粒度。

图17示出了在5℃储存的疫苗组合物的乳液粒度稳定性，其中误差条表示来自每种乳液的一个批次的三个单独等分试样的标准尺寸偏差。

结论

尽管已用特征和/或方法动作专用的语言描述了本主题，但是应当理解，所附权利要求书中定义的主题不必限于上述具体特征或动作。相反，这些具体特征和动作是作为实现权利要求的示例性形式而公开的。

本文描述了某些具体实施，包括本发明人已知的用于执行本发明的最佳模式。当然，在阅读前述描述后，有关这些所描述的具体实施的变型形式对于本领域普通技术人员将变得显而易见。技术人员将知道如何在适当的情况下采用此类变型形式，并且本文所公开的具体实施可以以不同于具体描述的方式来实践。因此，所附权利要求书中叙述的主题的所有修改形式和等同物均包括在本公开的范围内。此外，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变型形式中的任何组合。

Claims (49)

1.一种免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物包含足以刺激受试者的免疫系统的量的茄尼醇。

2.根据权利要求1所述的免疫刺激组合物，其中所述茄尼醇在茄尼醇的熔点以下呈固体脂质纳米颗粒的形式，并且在所述茄尼醇的熔点以上呈乳液的形式。

3.根据权利要求2所述的免疫刺激组合物，其中所述茄尼醇的熔点为约33℃至35℃。

4.根据权利要求1所述的免疫刺激组合物，其中所述组合物在约5℃之间的温度下稳定达至少12个月。

5.根据权利要求1所述的免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物进一步包含至少一种表面活性剂。

6.根据权利要求5所述的免疫刺激组合物，其中所述至少一种表面活性剂包括亲水性表面活性剂。

7.根据权利要求6所述的免疫刺激组合物，其中所述亲水性表面活性剂具有约10至30的HLB值。

8.根据权利要求6所述的免疫刺激组合物，其中所述亲水性表面活性剂包含以下中的至少一者：吐温、吐温80、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酸酯80)、Brij表面活性剂、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(普朗尼克F68)、聚乙烯660 12-羟基硬脂酸酯、胆酸钠、丙三基脱氧胆酸盐、Prij表面活性剂、或聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(泊洛沙姆188)。

9.根据权利要求5所述的免疫刺激组合物，其中所述至少一种表面活性剂包括疏水性表面活性剂。

10.根据权利要求9所述的免疫刺激组合物，其中所述疏水性表面活性剂具有约1至6的HLB值。

11.根据权利要求9所述的免疫刺激组合物，其中所述疏水性表面活性剂包含以下中的至少一者：磷脂、司盘、脱水山梨醇酯三油酸酯(司盘85)、脱水山梨糖醇酯、磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、l,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DMPC)、l,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、DLPC、DPPC、DSPC或卵磷脂。

12.根据权利要求5所述的免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物进一步包含疏水性表面活性剂和亲水性表面活性剂。

13.根据权利要求12所述的免疫刺激组合物，其中所述疏水性表面活性剂包含磷脂，并且所述亲水性表面活性剂包含聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(泊洛沙姆188)。

14.根据权利要求1所述的免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物进一步包含张度剂。

15.根据权利要求14所述的免疫刺激组合物，其中所述张度剂为盐水、甘油、糖或糖醇。

16.根据权利要求1所述的免疫刺激组合物，所述免疫刺激组合物进一步包含抗氧化剂。

17.根据权利要求16所述的免疫刺激组合物，其中所述抗氧化剂为α-生育酚(维生素E)。

18.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含抗原和根据权利要求1至17中任一项所述的免疫刺激组合物，相比由所述免疫刺激组合物在没有助剂的情况下诱导的免疫应答，所述免疫刺激组合物以足以诱导对所述抗原的更大免疫应答的量存在。

19.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述抗原为多肽、编码多肽的核酸或病原体。

20.根据权利要求18所述的疫苗组合物，其中所述抗原为H5N1。

21.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至17中任一项所述的免疫刺激组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

22.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

23.一种单个小瓶，所述单个小瓶包含根据权利要求1至17中任一项所述的免疫刺激组合物，其中所述免疫刺激组合物被容纳在所述小瓶中。

24.一种单个小瓶，所述单个小瓶包含根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物被容纳在所述小瓶中。

25.一种单个小瓶，所述单个小瓶包含根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述药物组合物被容纳在所述小瓶中。

26.一种用于刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至17中任一项所述的免疫刺激组合物。

27.一种用于刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗组合物。

28.一种用于刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求21所述的药物组合物

29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述免疫应答为非特异性免疫应答。

30.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中刺激免疫应答包括引发或增强所述受试者中的抗原特异性免疫应答。

31.一种用于生成水性茄尼醇分散体的方法，所述方法包括：

a.将茄尼醇添加到被加热至茄尼醇的熔点以上的缓冲水性溶液中；

b.使所述缓冲水性溶液和所述茄尼醇均化以形成所述水性茄尼醇分散体；以及

c.将粒度减小至约100nm或更小，同时保持温度高于所述茄尼醇的熔点。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述缓冲水性溶液包含表面活性剂。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述表面活性剂包括亲水性表面活性剂。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述亲水性表面活性剂具有约10至30的HLB值。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述亲水性表面活性剂包含以下中的至少一者：吐温、吐温80、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酸酯80)、Brij表面活性剂、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(普朗尼克F68)、聚乙烯660 12-羟基硬脂酸酯、胆酸钠、丙三基脱氧胆酸盐、Prij表面活性剂、或聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(泊洛沙姆188)。

36.根据权利要求32所述的方法，其中所述表面活性剂包括疏水性表面活性剂。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疏水性表面活性剂包含磷脂，并且所述亲水性表面活性剂包含聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚物(泊洛沙姆188)。

38.根据权利要求31所述的方法，其中所述缓冲水性溶液包含张度剂。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述张度剂包含所述张度剂为盐水、甘油、糖或糖醇。

40.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括添加抗氧化剂。

41.根据权利要求40所述的方法，其中将所述抗氧化剂添加到包含所述茄尼醇的油相。

42.根据权利要求40至41所述的方法，其中所述抗氧化剂为α-生育酚(维生素E)。

43.根据权利要求31所述的方法，其中将所述缓冲水性溶液加热至约45℃至约50℃。

44.根据权利要求31所述的方法，其中减小所述粒度在约40℃执行。

45.根据权利要求31所述的方法，其中减小所述粒度通过微流化、高压均化、剪切力或超声均化来执行。

46.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括将所述水性茄尼醇分散体冷却至所述茄尼醇的熔点以下。

47.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括使所述水性茄尼醇分散体经过0.2μm过滤器。

48.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括将抗原添加到所述水性茄尼醇分散体。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗原为多肽、编码多肽的核酸或病原体。