JP7195147B2 - Ｐｅｇ化リポソームおよび使用方法 - Google Patents

Ｐｅｇ化リポソームおよび使用方法 Download PDF

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ホーベン，ニール ヴァン
アビヤンカー，マユレッシュ，エム．
ペトリ，ウイリアム，エイ．，ジュニア．
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アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体で本明細書に援用される、２０１６年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／３３７，３２８号の利益を主張する。
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、米国保健福祉省の事前準備対応次官補局（the Office of the Assistant Secretary for Preparedness and Response (ASPR)）内の生物医学先端研究開発局（the Biomedical Advanced Research and Development Authority ）（ＢＡＲＤＡ）によって与えられた契約第ＨＨＳＯ１００２０１００００３９Ｃ号の下、ならびに、保健福祉省の国立衛生研究所内の国立アレルギー・感染症研究所によって与えられた助成金第５Ｒ２１ＡＩ１０９１１８号および契約第ＨＨＳＮ２７２２００８０００４５Ｃ号の下で、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
リポソームベースの送達系は、薬剤および造影剤などの生体分子用に開発されてきた。このようなリポソームは、免疫系への提示の改善、生体分子の放出制御、ならびに疎水性および親水性の生体分子両方の製剤化を可能にする万能性をもたらす循環持続性の長期化などの利点を与える。リポソームの循環半減期を長くするためには、血清タンパク質および食細胞との相互作用を含む正常なクリアランス機構からリポソームを遮蔽することが必要である。リポソームのＰＥＧ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有するリポソーム）を含む、免疫系からのリポソームの遮蔽を改善するための多数のアプローチが開発されてきた。ＰＥＧおよびマクロファージからリポソームを遮蔽するように設計された他のコポリマーを含有するリポソームは、当技術分野では「ステルスリポソーム」と呼ばれてきた。遮蔽特性に加えて、ＰＥＧ化は、長期保存時のリポソームの融合を排除ではなく抑制することによって、リポソーム製剤の安定性に影響を及ぼし得る。このような融合を回避するために、ＰＥＧコロナは、リポソーム表面を立体的に遮蔽するのに十分な厚さの層を与えるべきである。
ＰＥＧ分子量は、効果的な表面遮蔽の重要な決定因子であると従来考えられてきた。低分子量のＰＥＧで被覆されたＰＥＧ化リポソームは、遮蔽に効果がなかった。例えば、７５０ダルトンのＰＥＧを有するＰＥＧ化リポソームを非ＰＥＧ化リポソームと比較した場合、相違はなかった（Mori et al., FEBS Lett, 1991）。血液循環の長期化および食細胞による取り込みの低下は、ＰＥＧ分子量が５０００ダルトンを超えるまで増加した場合にのみ観察された。
リポソームはまた、サブユニットタンパク質ワクチンおよびアジュバントの送達についても評価されてきた。リポソーム組成を調整して所望の脂質濃度、電荷、サイズ、ならびに抗原およびアジュバントの分配または標的化を達成することができるので、リポソームは魅力的なワクチン送達ビヒクルである。アニオン性、カチオン性、および中性のリポソームを含む多くのリポソームベースの系が評価されているが、全てのリポソームが同等に作られるわけではない。多くのカチオン性脂質リポソーム製剤は毒性がある。多くの中性リポソームは生体外では不安定であり、経時的にサイズが大きくなるか、または製造直後に崩壊するかのいずれかである。アニオン性リポソームは、種々の抗原を送達し、細胞膜と融合するアニオン性リポソームの能力に影響を与える電荷制限を有する。他のリポソームは、免疫系自体に影響を及ぼし得る合成脂質またはブロックコポリマーを含有する。コレステロールベースのリポソーム製剤は、コレステロールがヒト細胞膜の天然成分であり、ＤＯＴＡＰおよびＤＯＰＣなどの他の共脂質（co-lipid）と組み合わせた場合、約０．３の望ましい多分散指数を有する約１００～２００ｎｍの安定なカチオン性ナノ粒子を形成するという点で理想的である。ワクチン製剤としての使用のためのリポソーム製剤を改良するために、ＰＥＧ化戦略を含む様々な戦略が採用されてきた。今日まで、既知のリポソームの安定性および毒性に関連する問題を克服し、かつ、免疫応答の質を効果的に改善することができる明白な製剤は開発されていない（Carstens et al.Vaccine 29, 2011; Kaur et al.Journal of Controlled Release, 2012; Schwendener, Ther Adv Vaccines, 2014; Nag and Awasthi, Pharmaceutics, 2013; Vartak and Sucheck, Vaccines, 2016; Fan et al., Journal of Controlled Release, 2015; Schmidt et al., Pharmaceutics, 2016に概説されている)。
したがって、安定であり、製造可能であり、脂質ベースの抗原およびアジュバントと適合性であり、サイズが小さい、ワクチン、治療薬、および診断薬用のＰＥＧ化リポソームを開発する必要がある。ワクチンの分野では、このようなリポソームを、免疫応答を増強することができるアジュバントと共に提供する必要性が特に存在し、インフルエンザ、腸疾患（アメーバ症など）、結核、ＨＩＶ、癌、および肝炎などのワクチン接種は、このようなリポソームの開発の利益を享受し得る。本明細書において、このようなリポソームに関連する組成物および方法が提供される。
特許出願および特許公報を含む本明細書に挙げられている全ての参考文献は、あたかも個々の参考文献が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されているかのように、参照によりその全体で本明細書に援用される。
本発明は、ＰＥＧ化リポソーム、ＰＥＧ化リポソームを含んでなる製剤および組成物、ならびにＰＥＧ化リポソームを製造および使用する方法を提供する。ＰＥＧ化リポソームは、ワクチン、治療薬、および診断薬に有用である。
ＰＥＧ化リポソームは、少なくともコレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質であって、前記ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧ成分の平均分子量が約５０００ダルトン以下である、前記ＰＥＧ化脂質を含んでなる。ＰＥＧ化リポソームは安定であり、免疫応答の発生のための薬剤の送達が可能である。ＰＥＧ化脂質が約５０００ダルトン以下であるリポソームのＰＥＧ化は、リポソームの安定性を可能にし、免疫応答の発生のために免疫細胞への送達を可能にする。本明細書で提供されているように、組成物中に存在するＰＥＧ化リポソームのサイズは、約１ｎｍ～約４５０ｎｍの範囲であり、サイズは、温度が変化しても、時間が経過しても、安定を保つ。ＰＥＧ化リポソームは安定であり、ほとんどもしくは全く凝集を示さないか、または凝集の減少を示し、バイアル瓶に入れる前の最終滅菌工程に適している。本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、ＴＬＲアゴニストおよび／または薬剤、例えば、ワクチン、治療、もしくは診断用途用の薬剤をさらに含んでなり得る。免疫応答を刺激するためのＰＥＧ化リポソームの製造および使用に関連する組成物および方法も提供される。
一態様において、（ａ）コレステロール、（ｂ）非ＰＥＧ化中性脂質、および（ｃ）ＰＥＧ化脂質であって、前記ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が約５０００ダルトン以下である、前記ＰＥＧ化脂質、を含んでなるリポソームがここで提供される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量は、約７５０ダルトン～約５０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量は、約２０００ダルトン以下である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量は、約７５０ダルトンである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、中性脂質を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、Ｃ１４アルキル鎖、Ｃ１６アルキル鎖、またはＣ１８アルキル鎖を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、またはＤＭＰＥである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＳＰＥである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＰＰＥである。いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質は、Ｃ１４アルキル鎖、Ｃ１６アルキル鎖、またはＣ１８アルキル鎖を含んでなる。いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、またはＤＭＰＥである。いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質はＤＰＰＣである。いくつかの実施形態において、リポソームは安定である。いくつかの実施形態において、リポソームは、約２℃～約８℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。いくつかの実施形態において、リポソームは、約２５℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。いくつかの実施形態において、リポソームは、約３７℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。いくつかの実施形態において、リポソームの多分散指数は、約０．３以下で維持される。いくつかの実施形態において、リポソームのサイズは４５０ｎｍ未満または約４５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、リポソームのサイズは４５０未満または約４５０ｎｍで維持される。いくつかの実施形態において、リポソームのサイズは約５０ｎｍ～約３００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、リポソームの多分散指数は０．３未満または約０．３である。いくつかの実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）は、約１ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の範囲である。いくつかの実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の範囲である。いくつかの実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の範囲である。いくつかの実施形態において、リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約５０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、リポソーム中の非ＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約４５ｍｏｌ％～約９８ｍｏｌ％の範囲である。いくつかの実施形態において、リポソーム中の非ＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約４５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、約９．８：５．７：０．８である。いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、約１８：５．５：３である。いくつかの実施形態において、リポソームは、１つ以上のＴＬＲアゴニストをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４、ＳＬＡ、ＧＬＡ、３Ｄ－ＭＰＬ、Ｒ８３７、またはＲ８４８を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは疎水性尾部を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７アゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ８アゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、イミダゾキノリンまたはイミダゾキノリン含有化合物を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは３Ｍ－０５２を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストはＲ８４８を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ４アゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは３Ｄ－ＭＰＬを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストはＧＬＡを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは式（Ｖ）の合成ＧＬＡを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは式（ＶＩ）の合成ＧＬＡを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式：
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 の合成ＧＬＡまたは薬剤的に許容できるその塩を含んでなる。いくつかの実施形態において、リポソームは、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態において、リポソームは、ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２を含んでなる。いくつかの実施形態において、リポソームは、１つ以上の薬剤をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、または生物を含んでなる。いくつかの実施形態において、薬剤は抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はアメーバ症関連抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はＬｅｃＡを含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はインフルエンザ関連抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＨ５Ｎ１を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原は結核関連抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＩＤ９１を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＩＤ９３を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＢＣＧ由来抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原は肝炎ウイルス関連抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＢ型肝炎抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＣ型肝炎抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原はＨＩＶ関連抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、抗原は癌関連抗原を含んでなる。
関連する態様では、本明細書で提供されるリポソームのいずれか１つを含んでなる組成物がここで提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤を含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物はワクチンである。いくつかの実施形態において、組成物は治療薬である。いくつかの実施形態において、組成物は診断薬である。
別の態様において、対象において免疫応答を刺激する方法であって、本明細書に記載のリポソームのいずれか、または本明細書に記載のリポソームを含んでなる組成物のいずれかを前記対象に投与し、それによって前記対象において免疫応答を刺激することを含んでなる、前記方法が本明細書で提供される。別の態様において、対象においてＴｈ１応答を誘発する方法であって、本明細書に記載のリポソームのいずれか、または本明細書に記載のリポソームを含んでなる組成物のいずれかを前記対象に投与し、それによって前記対象においてＴｈ１応答を誘発することを含んでなる、前記方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、免疫応答は非特異的免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫応答は抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫応答は全身免疫応答を含んでなる。いくつかの実施形態において、免疫応答は粘膜免疫応答を含んでなる。いくつかの実施形態において、粘膜免疫応答は、腸管、糞便、または膣粘膜免疫応答を含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、癌の治療または予防のために使用される。いくつかの実施形態において、組成物はワクチンとして使用される。いくつかの実施形態において、組成物は、インフルエンザ原因ウイルスに対する防御免疫を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、組成物は、アメーバ症原因生物に対する防御免疫を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、組成物は、赤痢アメーバに対する防御免疫を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、組成物は、インフルエンザに対する防御免疫を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、組成物は、アメーバ症に対する防御免疫を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、組成物の投与経路は、経口、局所、非経口、舌下、口腔内、直腸内、膣内、静脈内、皮内、経皮、鼻腔内、粘膜内、または皮下である。いくつかの実施形態において、投与経路は鼻腔内である。
別の態様において、対象において全身免疫応答および粘膜免疫応答を刺激する方法であって、本明細書で提供されるリポソームのいずれか１つ、または本明細書で提供されるリポソームを含んでなる組成物のいずれか１つを前記対象に鼻腔内投与することを含んでなる、前記方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなるリポソームを投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、方法は、ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２を含んでなるリポソームを投与することを含んでなる。いくつかの実施形態において、粘膜免疫応答は、腸管、糞便、または膣粘膜免疫応答を含んでなる。いくつかの実施形態において、粘膜免疫応答は、鼻腔に対して遠位である。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、リポソームまたは組成物は、レチノイン酸コアジュバント（co-adjuvant）と共に投与され得る。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、リポソームまたは組成物は、ヒトに投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、リポソームまたは組成物は、ヒト以外の哺乳類に投与される。いくつかの実施形態において、ヒト以外の哺乳類は、イヌ、ウシ、またはウマである。
別の態様では、本明細書で提供されるＰＥＧ化リポソームのいずれか１つを製造する方法であって、（ａ）非ＰＥＧ化中性脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロールを有機溶媒中で混合することと、（ｂ）有機溶媒を蒸発させて脂質膜を得ることと、（ｃ）緩衝液中で脂質膜を再水和させることと、（ｄ）工程（ｃ）の再水和生成物を超音波処理、顕微溶液化、または押出することとを含んでなる前記方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、ＴＬＲアゴニストの混合をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、有機溶媒はクロロホルムである。いくつかの実施形態において、工程（ｃ）の再水和生成物を超音波処理し、次いで顕微溶液化する。いくつかの実施形態において、方法は、薬剤をＰＥＧ化リポソームに混合することをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、薬剤は抗原を含んでなる。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると、明らかになるであろう。さらに、本発明の特定の態様をより詳細に記載する様々な参考文献が本明細書に記載されており、それゆえ、それらはその全体で参照により援用される。
図１Ａ～１Ｄは、様々な製剤の物理的特徴および安定性の特徴を示す。
図１Ａは５℃での経時的な粒径を示す。 図１Ｂは５℃での経時的な多分散指数を示す。 図１Ｃは３７℃での経時的な粒径を示す。 図１Ｄは３７℃での経時的な多分散指数を示す。
図２はＥＬＩＳＡによって測定した、様々な製剤のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答を示す。この図は、対応するアジュバントと混合されたＬｅｃＡ抗原の様々な製剤によるマウスの免疫化後の血漿ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価の比較を示す。
図３Ａ～ＤはＬｅｃＡ特異的サイトカイン応答を示す。
図４Ａ～Ｂはプレチャレンジ粘膜ＩｇＡ応答および付着阻害能を示す。ＧＬＡ ３Ｍ－０５２リポソームアジュバント添加ＬｅｃＡで、混合鼻腔内（０週目および４週目）ならびに皮下（２週目）レジメンを用いてマウスを免疫した。示された群のマウスは、オールトランスレチノイン酸（ＲＡ）１５０ｍｇの毎週の腹腔内注射を受けた。糞便サンプルを、３回目の免疫化の３週間後に採取した。図４Ａでは、糞便上清を１２０倍に希釈し、ＥＬＩＳＡによってプレチャレンジ抗レクチンＩｇＡ力価を測定した。図４Ｂでは、糞便ＩｇＡが哺乳類細胞への栄養体の付着を阻害する能力を、記載の付着阻害アッセイを用いてインビトロで測定した。
図５Ａ～Ｂは腸アメーバ症のマウスモデルを用いたワクチン媒介性防御を示す。ＧＬＡ ３Ｍ－０５２リポソームアジュバントは、盲腸チャレンジ試験において中等度の防御を与えた。異種性レジメンを使用して免疫したマウスを、最後の免疫化の４週間後に赤痢アメーバ（E. histolytica）で盲腸内にチャレンジした。チャレンジの１週間後にマウスを安楽死させ、ＥＬＩＳＡを用いて抗原負荷（図５Ａ）について、滅菌免疫の尺度として培養による生アメーバ（図５Ｂ）について、盲腸内容物を分析した。チャレンジされた総数からの感染マウスの数を各列の上部に示す。２つの独立しているが同一の試験からのデータをプールした。
図６は示された製剤に対する血漿ＩｇＧ応答を示す。
図７は示された製剤に対する糞便ＩｇＡ応答を示す。この図は、ＰＥＧ長の増加が粘膜ＩｇＡ応答を増強することを示す。
図８Ａ～Ｂは免疫に対する送達経路の効果を示し、ＩＮ（鼻腔内）だけのレジメンは、最も高いＩｇＧ２ａおよびＩｇＡ力価をもたらす。リポソーム＋アジュバントは、ロバストな粘膜および全身のＴｈ１免疫応答、腸抗ＬｅｃＡ ＩｇＡを生じた（図８Ｂ）。 同上。
図９Ａ～Ｂは免疫に対する送達経路の効果を示す。ＩＮだけのレジメンは、他のレジメンと比較して同等またはそれ以上のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７力価を生じた。リポソーム＋アジュバントは、ロバストな粘膜および全身のＴｈ１免疫応答、ＩＦＮ－γ（図９Ａ）、およびＩＬ１７（図９Ｂ）を生じた。 同上。
図１０Ａ～Ｂは３Ｍ－０５２の代表的製剤の５℃で６ヶ月間の（ａ）粒径および（ｂ）サイズ多分散指数を示す。エラーバーは、各時点での単一製剤バッチからの３つの別々の粒径アッセイの標準偏差を表す。これらのバッチについて３Ｍ－０５２含有量は測定しなかったが、同じプロセスを使用して製造した後続のバッチに基づいて０．０４ｍｇ／ｍｌであると推定された。
図１１Ａ～Ｈは３Ｍ－０５２で免疫したマウスが、Ｈ５Ｎ１チャレンジ後の生存の増強を示すことを示す。示されているアジュバントと組み合わせて、ｒＨＡタンパク質（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）で動物を１回免疫した。免疫化の２１日後、動物を１０６ＰＦＵのＡ／ＶＮ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１、Ｃｌａｄｅ１）でチャレンジした。生存（図１１Ａ）および体重減少（図１１Ｂ、１１Ｃ）について動物を毎日モニタリングした。チャレンジ後３日（図１１Ｄ）および７日（図１１Ｅ）に、マウスを安楽死させ、プラークアッセイによって肺ウイルス力価を測定した。さらに、チャレンジ後７日に、無傷肺を固質化の尺度として秤量し（１１Ｆ）、肉眼的病変の出現についてスコアをつけた（図１１Ｇ）。有意性を、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ Ｌｏｇ－Ｒａｎｋ Ｔｅｓｔ（Ａ）により、または一元配置ＡＮＯＶＡにより求めた（図１１Ｄ～１１Ｇ）（＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１１Ｈは、肺ウイルス力価を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１２Ａ～Ｄは製剤化３Ｍ－０５２アジュバントで免疫したマウスにおけるＣＤ４ Ｔ細胞応答を示す。示されているアジュバントと組み合わせて、ｒＨＡタンパク質（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）で動物を１回免疫した。免疫化の７日後、安楽死させたマウス（ｎ＝５／群）由来の脾細胞をｒＨＡで刺激した後のサイトカイン刺激について分析した。ＩＦＮγ（Ｉ）、ＴＮＦα（Ｔ）、およびＩＬ－２（２）のサイトカイン分泌パターンを測定して、Ｔｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の誘発を調べた。多機能性ｔ細胞の相対パーセンテージも測定した。群間の有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）によって求めた。
図１３Ａ～Ｈは単回免疫化後の同種性Ｈ５Ｎ１チャレンジからのフェレットの防御を示す。雄のケナガイタチフェレット（Fitch ferret）を、製剤化３Ｍ－０５２アジュバントと組み合わせたスプリットＨ５Ｎ１ワクチン（Ｈ５Ｎ１、Sanofi Pasteur）で１回免疫し、１０６ＰＦＵのＡ／ＶＮ／１２０３で免疫した２１日後にチャレンジした。生存（図Ａ、Ｅ）、体重減少（図Ｂ、Ｆ）、および臨床スコア（図Ｃ、Ｇ）について、動物を最大１４日間モニタリングした。さらに、ウイルス力価を評価するために鼻洗浄液を採取した（図Ｄ、Ｈ）。３Ｍ－０５２－ＳＥおよび３Ｍ－０５２－リポソームアジュバント製剤はいずれも、鼻洗浄液からのより迅速なウイルス排除、体重減少および臨床スコアの低下、ならびに１００％生存を特徴とする、このモデルにおける強力なシングル・ショット防御を示す。
図１４Ａ～Ｆは製剤化３Ｍ－０５２アジュバントによるウイルス中和力価の誘発を示す。雄のケナガイタチフェレット（Fitch ferret）を、製剤化３Ｍ－０５２アジュバントと組み合わせたスプリットＨ５Ｎ１ワクチン（ＳＰ－Ｈ５、Sanofi Pasteur）で１回免疫した。免疫化の２１日後、全動物から血液を採取し、レトロウイルス偽型中和アッセイを用いてウイルス中和抗体についてアッセイした。アジュバント製剤中に３Ｍ－０５２が含まれていることは、同種ｃｌａｄｅ１ウイルス（図Ａ、Ｄ）とｃｌａｄｅ２ウイルス株（図Ｂ、Ｅ）およびｃｌａｄｅ２．２株（図Ｃ、Ｆ）との両方に対する中和力価の有意な（一元配置ＡＮＯＶＡ）増加をもたらした。 図１５Ａ～Ｂは単回免疫化後の異種性Ｈ５Ｎ１チャレンジからのフェレットの防御を示す。雄のケナガイタチフェレット（Fitch ferret）を、製剤化３Ｍ－０５２アジュバントと組み合わせたスプリットＨ５Ｎ１ワクチン（Ｈ５Ｎ１、Sanofi Pasteur）で１回免疫し、１０６ＰＦＵのＡ／Ｗｈｏｏｐｅｒ Ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／０５で免疫した２１日後にチャレンジした。鼻洗浄液を採取してウイルス力価を評価した。３Ｍ－０５２－ＳＥアジュバントは、ウイルスのより迅速な排除を誘発し、５日目には検出不可能な力価を示した。３Ｍ－０５２－リポソームアジュバント製剤は、３日目まで力価を示し、５日目までに排除を示す。
発明の詳細な説明
本出願は、とりわけ、ＰＥＧ化リポソーム製剤、ＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物、ならびにＰＥＧ化リポソームを製造および使用する方法に関する。本発明者らは、不溶性のトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを製剤化する一方、様々なＴＬＲリガンドおよび／または抗原を組み込む際に安定性を維持しながら驚くほど万能性であり、抗原と混合した場合に免疫応答を増強するのに有効であるリポソーム製剤を開発した。本発明者らは、様々な異なる抗原をこれらのリポソームと混合すると、哺乳動物に投与することができる抗原－リポソーム製剤が得られることを見出した。リポソーム製剤は、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量は、約５０００ダルトン以下、好ましくは約７５０～約５０００ダルトン、または７５０～約２０００ダルトンである。ＰＥＧ化脂質の使用は安定性を与え、免疫応答の送達および発生／刺激／改変を可能にする。いくつかの好ましい実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質はＤＰＰＣであり、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ化ＤＳＰＥまたはＤＰＰＥである。いくつかの特に好ましい実施形態において、リポソームは、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび必要に応じて抗原をさらに含んでなる。
本明細書に記載のＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物（ワクチン組成物、医薬組成物など）もまた提供される。当該組成物は、対象において免疫応答を発生／刺激／改変するのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、１つ以上の抗原および／またはＴＬＲアゴニストをさらに含んでなる。
本発明者らはまた、不溶性のトール様受容体３Ｍ－０５２のスクアレンベースの水中油型エマルションを製剤化する場合、ＤＭＰＣの代わりに卵ホスファチジルコリンまたはＰＯＰＣを用いて製造したエマルションが、加工後のトール様受容体のより高い回収率をもたらすことも見出した。さらに、トール様受容体と卵ホスファチジルコリンまたはＰＯＰＣとをクロロホルム中で混合する初期混合工程を追加することにより、トール様受容体の回収率がさらに増加した。本出願はまた、とりわけ、スクアレン、不飽和ホスファチジルコリン、およびトール様受容体（例えば、不溶性のトール様受容体）を含んでなるスクアレンベースの水中油型エマルション、ならびにトール様受容体と不飽和ホスファチジルコリンとをクロロホルム中で混合することにより当該エマルションを製造する方法に関する。
Ｉ．定義
以下の用語は、別段の定めがない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、その技術分野で認識されている意味を有する。
本明細書において、用語「約」および「から本質的になる」は、別段の定めがない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「含む」、「有する」、および「含んでなる」は、同義語として使用されており、これらの用語およびその変形は非限定的なものと解釈されるべきであることが意図されている。
本明細書で使用される場合と、添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を意味しない限り、複数の言及を含む。
本明細書で使用される用語「高分子」は、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、および生物起源または合成起源のポリヌクレオチドによって例示されるが、これらに限定されない大分子を指す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって分断されていてもよい。当該用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体、および当該技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。
用語「単離」は、分子がその天然の環境から取り出されたことを意味する。
「精製」は、分子がその天然の環境に存在するよりも、ならびに／または実験室条件下で最初に合成および／もしくは増幅されたときよりも、より純粋な形態で分子が存在するように、分子の純度が高められたことを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するものではない。
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでなり得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、通常、必然的ではないが、長さが約２００ヌクレオチド未満である、短く、通常一本鎖であり、通常合成のポリヌクレオチドを概して指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドに同等かつ完全に適用可能である。
「個体」または「対象」は、任意の哺乳類である。哺乳類には、ヒト、霊長類、家畜、狩猟動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、およびげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。
「アルキル」は、直鎖状または分岐状の飽和炭化水素である。例えば、アルキル基は、１～３０個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１～Ｃ３０）アルキル）または１～２０個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１～Ｃ２０アルキル）または１～１０個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル）または１～８個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１～Ｃ８）アルキル）または１～６個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１～Ｃ６）アルキル）または１～４個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル）を有することができる。当該用語には、例として、直鎖状および分岐状のヒドロカルビル基、例えば、メチル（ＣＨ３－）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２－）、ｎ－プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ－）、ｎ－ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２－）、ｓｅｃ－ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ－）、ｔ－ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ－）、ｎ－ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、ネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２－）、およびｎ－ヘキシル（ＣＨ３（ＣＨ２）５－）が含まれる。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は基－ＯＨを指す。
「アルコキシ」は、基－Ｏ－アルキルを指し、ここで、アルキルは、本明細書で定義される通りである。アルコキシには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｎ－ペントキシなどが含まれる。
「カルボキシルエステル」または「カルボキシエステル」は、基－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキルおよび－Ｃ（Ｏ）Ｏ－置換アルキルを指し、ここで、アルキルおよび置換アルキルは、本明細書で定義されるとおりである。
本発明の実施は、別段の定めがない限り、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、組み換えＤＮＡ、生化学、および化学の従来技術を用いる。このような技術は文献で充分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Pat.No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「水に不溶性」とは、化合物が水と混合された場合に、例えば、室温で、例えば約２５℃～５０℃の間で水と混合した場合に、溶解しない、または無視できるレベルまで溶解する化合物を指す。
ＩＩ．ＰＥＧ化リポソーム
本開示は、少なくともコレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなるＰＥＧ化リポソームであって、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧ成分の平均分子量が約５０００ダルトン以下である、前記ＰＥＧ化リポソームを提供する。本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、薬剤、例えば、ワクチン、治療、または診断用途用の薬剤をさらに含んでなり得る。本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、例えば上記のワクチン、治療、または診断用途用の、ＴＬＲアゴニストをさらに含んでなり得る。ＰＥＧ化リポソームの各個々の成分の説明およびＰＥＧ化リポソームの特徴を以下に記載する。
Ａ．ＰＥＧ化脂質
本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、ＰＥＧ化脂質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合した脂質）であって、前記ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が、約５０００ダルトン以下である、前記ＰＥＧ化脂質を含んでなる。中性の非ＰＥＧ化脂質およびコレステロールと組み合わせたＰＥＧと結合したこのような脂質の使用は、ＰＥＧ化脂質を含有しない他の中性のリポソームに対して安定性を付与することが認められた。このようなＰＥＧ化脂質の使用は、ＰＥＧ化リポソーム構造の長期安定性を可能にし、免疫応答の効果的な刺激を可能にする。
ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの特徴
本明細書で企図される実施形態において、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量は、約５０００ダルトン以下である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量は、約２０００ダルトン以下である。特定の実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は、約７５０ダルトン～約５０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は、約７５０ダルトン～約２０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は約７５０～１０００、７５０～１５００、７５０～２０００、７５０～２５００、７５０～３０００、７５０～３５００、７５０～４０００、７５０～４５００、または７５０～５０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は約４５００～５０００、４０００～５０００、３５００～５０００、３０００～５０００、２５００～５０００、２０００～５０００、１５００～５０００、１０００～５０００、または７５０～５０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は、約５００～１０００、５００～７５０、または７５０～１０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は、約１５００～２５００、１５００～２０００、または２０００～２５００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧの平均分子量は、約４５００～５５００、４５００～５０００、または２０００～５０００ダルトンの範囲である。
一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ７５０を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ１０００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ１５００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ２０００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ２５００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ３０００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ３５００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ４０００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ４５００を含んでなる。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質はＰＥＧ５０００を含んでなる。
ＰＥＧ化脂質中の脂質の特徴
本明細書では、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、コレステロールおよび非ＰＥＧ化中性脂質成分と会合して安定なリポソーム構造を形成することができる（リン脂質を含む）脂質を含んでなり得ることが企図されている。
表１は、本発明に使用するためにＰＥＧに結合することができる例示的な脂質の非限定的なリストを提供する。
表１：例示的な脂質
Figure 0007195147000002
Figure 0007195147000003
特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、リン脂質または四級アンモニウム塩脂質である。特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ホスファチジルコリンまたはホスホグリセリドであるリン脂質である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、以下の部分：
Figure 0007195147000004
 のいずれかを含んでなり、式中、Ｘ－はアルカリ金属対イオンであり、Ｙ＋はハロゲン化物対イオンである。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、Ｃ１０～２０アルキル鎖を含んでなる。特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、Ｃ１２～１８アルキル鎖を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、Ｃ１４アルキル鎖、Ｃ１６アルキル鎖、またはＣ１８アルキル鎖を含んでなる。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、アニオン性である。特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、カチオン性である。特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、全体的に中性に帯電している。特定の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、双性イオンである。
特定の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、またはＤＭＰＥである。一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＳＰＥである。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＰＰＥである。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分は、ＤＭＰＥである。
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、ＰＥＧ化脂質の脂質成分はＤＬＰＥであることができる。
特定の実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）は、約１ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の範囲である。特定の実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）は、約１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、１６ｍｏｌ％、１７ｍｏｌ％、１８ｍｏｌ％、１９ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、２１ｍｏｌ％、２２ｍｏｌ％、２３ｍｏｌ％、２４ｍｏｌ％、または約２５ｍｏｌ％である。例示的な実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％である。別の例示的な実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約１０ｍｏｌ％である。別の例示的な実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約１５ｍｏｌ％である。別の例示的な実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約２０ｍｏｌ％である。別の例示的な実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％は、約２５ｍｏｌ％である。
例示的なＰＥＧ化脂質
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ１５００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２５００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３５００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ４０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ４５００、またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ１５００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２５００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ３０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ３５００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ４０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ４５００、またはＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ７５０、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ１０００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ１５００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２５００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ３０００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ３５００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ４０００、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ４５００、またはＤＭＰＥ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ７５０、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ１０００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ１５００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ２５００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ３０００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ３５００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ４０００、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ４５００、またはＤＰＰＣ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ７５０、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ１０００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ１５００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ２０００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ２５００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ３０００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ３５００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ４０００、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ４５００、またはＤＯＰＣ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ７５０、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ１０００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ１５００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ２０００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ２５００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ３０００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ３５００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ４０００、ＤＬＰＣ－ＰＥＧ４５００、またはＤＬＰＣ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ７５０、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ１０００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ１５００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ２５００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ３０００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ３５００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ４０００、ＤＭＰＣ－ＰＥＧ４５００、またはＤＭＰＣ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ７５０、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ１０００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ１５００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ２０００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ２５００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ３０００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ３５００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ４０００、ＰＯＰＣ－ＰＥＧ４５００、またはＰＯＰＣ－ＰＥＧ５０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ７５０、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ１０００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ１５００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ２５００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ３０００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ３５００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ４０００、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ４５００、またはＤＳＰＣ－ＰＥＧ５０００である。
Ｂ．非ＰＥＧ化中性脂質
本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、非ＰＥＧ化中性脂質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合していない中性脂質）も含んでなる。本明細書では、リポソームの非ＰＥＧ化中性脂質成分は、全体的な中性電荷を有するか、または双性イオン性であり、ＰＥＧ化脂質成分と会合して安定なリポソーム構造を形成することができる（中性リン脂質を含む）中性脂質を含んでなることが企図されている。
本明細書で提供されるように、非ＰＥＧ化中性脂質は、全体的に中性に帯電している。特定の実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質は双性イオンである。ＰＥＧ化リポソームの中性非ＰＥＧ化脂質成分は、いくつかのバリエーションでは、ＰＥＧ化リポソームを全体的に中性に帯電させることができる。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームの非ＰＥＧ化中性脂質成分は、Ｃ１０～２０アルキル鎖を含んでなる。特定の実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質成分は、Ｃ１２～１８アルキル鎖を含んでなる。いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質成分は、Ｃ１４アルキル鎖、Ｃ１６アルキル鎖、またはＣ１８アルキル鎖を含んでなる。
いくつかの実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、またはＤＭＰＥである。
特定の実施形態において、リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）は、約４５ｍｏｌ％～約９８ｍｏｌ％の範囲である。特定の実施形態において、リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）は、約４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６５ｍｏｌ％、７０ｍｏｌ％、７５ｍｏｌ％、８０ｍｏｌ％、８５ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、９５ｍｏｌ％、または約９８ｍｏｌ％である。例示的な実施形態において、リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質のｍｏｌ％は、約４５ｍｏｌ％である。
例示的な実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質対ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、９．８：０．８である。例示的な実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質対ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、１８：３である。
例示的な実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ対ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００の脂質モル比は、９．８：０．８である。例示的な実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ対ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０の脂質モル比は、９．８：０．８である。例示的な実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ対ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０の脂質モル比は、１８：３である。
Ｃ．コレステロール
本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、（コレステロール含有化合物を含む）コレステロールを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約１ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約５０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約４５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約４０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約３５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約２５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約２０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約１５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約１０ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％は、約５ｍｏｌ％である。
特定の実施形態において、コレステロール対非ＰＥＧ化中性脂質対ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、約５．７：９．８：０．８である。特定の実施形態において、コレステロール対非ＰＥＧ化中性脂質対ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、約５．５：１８：３である。
特定の実施形態において、コレステロール対非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ対ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００の脂質モル比は、約５．７：９．８：０．８である。特定の実施形態において、コレステロール対非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ対ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０の脂質モル比は、約５．７：９．８：０．８である。特定の実施形態において、コレステロール対非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ対ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０の脂質モル比は、約５．５：１８：３である。
Ｄ．ＴＬＲアゴニスト
本明細書で記載されている場合、本明細書に記載のＰＥＧ化リポソームは、１つ以上のトール様受容体アゴニスト（ＴＬＲアゴニスト）を含んでなり得る。トール様受容体（ＴＬＲ）は、多数の感染性病原体の中または上に存在し得るような種々の保存された微生物分子構造に対して宿主細胞に早期認識能力を与える先天性免疫系の細胞表面膜貫通受容体を含む。先天性免疫系による免疫応答の開始を促進するＴＬＲ媒介シグナル伝達の誘発は、細胞表面ＴＬＲに結合するＴＬＲアゴニストによって達成され得る。例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４を介するＴＬＲアゴニストであり得（Tsan et al., 2004 J. Leuk.Biol.76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol.Cell Phsiol.286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206）、ポリ（イノシン－シチジン）（ｐｏｌｙｌ：Ｃ）は、ＴＬＲ３を介するＴＬＲアゴニストであり得（Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119）、ＣｐＧ配列（非メチル化シトシン－グアノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチドまたは「ＣｐＧ」ジヌクレオチドモチーフ、例えば、ＣｐＧ７９０９，Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473；ＣｐＧ１０１０１ Bayes et al.Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al.Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob.Agents Chemother.48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol.173:5148）は、ＴＬＲ９を介するＴＬＲアゴニストであり得（Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol.177:2373）、ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ６アゴニストであり得（Soboll et al., 2006 Biol.Reprod.75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol.174:1566）、３Ｍ００３（ミネソタ州セントポールの3M Pharmaceuticalsからの４－アミノ－２－（エトキシメチル）－α，α－ジメチル－６，７，８，９－テトラヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール水和物，Ｍｏｌ．Ｗｔ．３１８ Ｄａは、関連化合物３Ｍ００１および３Ｍ００２の供給源でもある；Gorden et al., 2005 J. Immunol.174:1259）は、ＴＬＲ７アゴニスト（Johansen 2005 Clin.Exp.Allerg.35:1591）および／またはＴＬＲ８アゴニスト（Johansen 2005）であり得、フラゲリンは、ＴＬＲ５アゴニストであり得（Feuillet et al., 2006 Proc.Nat. Acad.Sci.USA 103:12487）、Ｃ型肝炎抗原は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ９を介するＴＬＲアゴニストとして作用し得る（Lee et al., 2006 Proc.Nat. Acad.Sci.USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol.42:724）。他のＴＬＲアゴニストが公知であり（例えば、Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol.171:5198）、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態に従って使用され得る。
様々な実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、それらの組み合わせであり得る。
ＴＬＲ７／８アゴニスト
本明細書に記載の組成物に使用することができるＴＬＲ７／８アゴニストが、本明細書において提供される。本明細書で使用される場合、「ＴＬＲ７／８アゴニスト」は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、または両方とのその相互作用を介してその生物活性に影響を与えるアゴニストを指す。このような生物活性には、先天性免疫系を介した免疫応答を促進するＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８媒介シグナル伝達の誘発が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、ＴＬＲは、イミダゾキノリン、イミダゾキノリン含有化合物、またはイミダゾキノリンアミン誘導体であるが（例えば、米国特許第４，６８９，３３８号（Gerster）参照）、他の化合物クラスも公知である（例えば、米国特許第５，４４６，１５３号（Lindstrom et al.）；米国特許第６，１９４，４２５号（Gerster et al.）；および米国特許第６，１１０，９２９号（Gerster et al.）；ならびに国際公開番号ＷＯ２００５／０７９１９５（Hays et al.）参照）。
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物に使用されるＴＬＲ７／８アゴニストは、イミダゾキノリン誘導体、例えば、その内容が参照によりその全体で本明細書に援用されるShi et al.（ACS Med.Chem.Lett., 2012, 3(6), pp.501-504）に記載されているものを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ７／８は、イミダゾキノリンまたはイミダゾキノリン含有化合物を含んでなる。いくつかの実施形態において、イミダゾキノリンは免疫応答変更因子である（ＩＭＱまたはＲ８３７と呼ばれる）イミキモドである。いくつかの実施形態において、イミダゾキノリンは、免疫応答変更因子として作用する薬剤であるレシキモド（Ｒ８４８）である（Tomai MA, Miller RL, Lipson KE, Kieper WC, Zarraga IE, Vasilakos JP (October 2007）."Resiquimod and other immune response modifiers as vaccine adjuvants".Expert Review of Vaccines 6 (5): 835-47.）。特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストはＣＬ０７５である。
例えば、特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、式（Ｉ）の以下の構造の化合物
Figure 0007195147000005
 または薬剤的に許容できるその塩であり、式中、
Ｒ１１は、水素およびＣ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｃ１～６アルキルは、ハロ、ヒドロキシル、およびＣ１～６アルコキシからなる群から選択される１以上の基で置換されていてもよく、
Ｒ１２は、水素およびカルボキシルエステルからなる群から選択され、
Ｒ１３は、水素およびＣ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｃ１～６アルキルは、ハロ、ヒドロキシル、およびＣ１～６アルコキシからなる群から選択される１以上の基で置換されていてもよい。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１１は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、Ｃ１～６アルコキシで置換されているＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３である。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１２は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１２はカルボキシルエステルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ３である。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１３はＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３はＣ２～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）２である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、ハロ、ヒドロキシル、またはＣ１～６アルコキシで置換されているＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、ヒドロキシルで置換されているＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、ヒドロキシルで置換されているＣ２～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、－ＣＨ２－Ｃ（ＣＨ３）２ＯＨである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、式（ＩＩ）の以下の構造の化合物
Figure 0007195147000006
 または薬剤的に許容できるその塩であり、式中、
Ｒ１１は、水素およびＣ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｃ１～６アルキルは、ハロ、ヒドロキシル、およびＣ１～６アルコキシからなる群から選択される１以上の基で置換されていてもよく、
Ｒ１２は、水素およびカルボキシルエステルからなる群から選択され、
Ｒ１３ａは、水素およびヒドロキシルからなる群から選択される。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１１は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、Ｃ１～６アルコキシで置換されているＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１２は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１２はカルボキシルエステルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ３である。
式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１３ａはヒドロキシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３ａは水素である。
特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、式（ＩＩＩ）の以下の構造の化合物
Figure 0007195147000007
 または薬剤的に許容できるその塩であり、式中、
Ｒ１１は、水素およびＣ１～６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｃ１～６アルキルは、ハロ、ヒドロキシル、およびＣ１～６アルコキシからなる群から選択される１以上の基で置換されていてもよく、
Ｒ１２は、水素およびカルボキシルエステルからなる群から選択され、
Ｒ１３ｂは、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１～６アルコキシ、およびアシルアミノからなる群から選択される１以上の基で置換されていてもよいＣ１～６アルキルである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１１は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、Ｃ１～６アルコキシで置換されているＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１２は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１２はカルボキシルエステルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ３である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１３ｂは、アシルアミノで置換されているＣ２～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３ｂは－（ＣＨ２）４－アシルアミノである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１～２５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１５～２５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１５～２０アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１７アルキルである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、式（ＩＶ）の以下の構造の化合物
Figure 0007195147000008
 または薬剤的に許容できるその塩であり、式中、
Ｒ１０は、水素およびＣ１～６アルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１ｂは、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１～６アルコキシ、およびアシルアミノからなる群から選択される１以上の基で置換されていてもよいＣ１～６アルキルである。
式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１０は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１０はＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１０は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１０はｎ－ブチルである。
式（ＩＶ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１１ｂは、アシルアミノで置換されているＣ２～４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１ｂは－（ＣＨ２）４－アシルアミノである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１～２５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１５～２５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１５～２０アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１ｂは－（ＣＨ２）４－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ１７アルキルである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、以下の構造のいずれかの化合物またはその薬剤的に許容できる塩である。
Figure 0007195147000009
Figure 0007195147000010
特定の実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、以下の構造の化合物またはその薬剤的に許容できる塩である。
Figure 0007195147000011
特定の例示的な実施形態において、本明細書の組成物に使用されるＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｎ－（４－｛［４－アミノ－２－ブチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］オキシ｝ブチル）オクタデカンアミド）、米国特許第９，２４２，９８０号に記載されている３Ｍ－０５２を含んでなる。
ＴＬＲ４アゴニスト
本明細書に記載の組成物に使用することができるＴＬＲ４アゴニストが、本明細書において提供される。特定の実施形態において、本明細書の組成物に使用されるＴＬＲ４アゴニストは、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、例えば、その内容が参照によりその全体で本明細書に援用される、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２１０１７号、第ＵＳ２００９／０４５０３３号、第ＵＳ２０１０／０３７４６６号、および第ＵＳ２０１０／０３１０６０２号に記載されているものを含んでなる。
例えば、特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（Ｖ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント
Figure 0007195147000012
 または薬剤的に許容できるその塩であり、式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、同じかまたは異なり、独立して、－Ｏ－、－ＮＨ－、または－（ＣＨ２）－であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同じかまたは異なり、独立して、存在しないか、または－Ｃ（＝Ｏ）－であり、
Ｙ１は酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同じかまたは異なり、独立して、－ＯＨ、－ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、－ＯＨまたは－ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、同じかまたは異なり、独立して、Ｃ８～１３アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は、同じかまたは異なり、独立して、Ｃ６～１１アルキルである。
合成ＧＬＡ構造のいくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ８アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
例えば、特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＶＩ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000013
特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ１２～Ｃ２０アルキルである。
別の特定の実施形態において、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ１３アルキルである上記の式を有する。
別の特定の実施形態において、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ８アルキルである上記の式を有する。
別の特定の実施形態において、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ９～Ｃ２０アルキルである上記の式を有する。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＶＩＩ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000014
上記ＧＬＡ構造の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９～Ｃ２０アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＶＩＩＩ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000015
上記ＧＬＡ構造の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９～Ｃ２０アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＸ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000016
上記ＧＬＡ構造の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９～Ｃ２０アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000017
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000018
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
Figure 0007195147000019
別の実施形態において、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）は、本明細書に記載の組成物に組み込まれる。ＡＬＤは、分子がより少ない、または異なるリピドＡの副作用を呈するように変更または構築されているリピドＡ様分子である。これらの副作用には、発熱原性、局所シュワルツマン反応性、およびニワトリ胚５０％致死量アッセイ（ＣＥＬＤ５０）で評価される毒性が含まれる。本開示に係る有用なＡＬＤには、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）が含まれる。ＭＰＬおよび３Ｄ－ＭＰＬは公知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。例えば、モノホスホリルリピドＡおよびその製造を開示している米国特許第４，４３６，７２７号を参照されたい。米国特許第４，９１２，０９４号および再審査証明書Ｂ１米国特許第４，９１２，０９４号は、３－脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびその製造方法を具体化している。また、例えば、ＧＢ２２２０２１１およびＷＯ９２／１１６５５６を参照されたい。３デ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡは、ＧＢ２２２０２１１（Ribi）から公知である。これは、化学的には、３デ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５、または６アシル化鎖との混合物であり、Ribi Immunochem Montanaによって製造されている。３デ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡのある種の形態が国際特許出願ＷＯ９２／１１６５５６に開示されている。ＭＰＬおよび３Ｄ－ＭＰＬに関するこれらの特許のそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
上記のＴＬＲ４アゴニスト化合物において、全電荷は分子中の官能基に従って決定することができる。例えば、リン酸基は、リン酸基のイオン化状態に応じて、負に帯電していること、または中性であることができる。
例示的なＴＬＲアゴニスト実施形態
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＰＥＧ化リポソームの脂質二重層と会合する。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＰＥＧ化リポソームに封入される。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、非ＰＥＧ化リポソームの構造を破壊するものである。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは疎水性尾部を含んでなる。いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストの疎水性尾部は、ＰＥＧ化リポソームの脂質二重層と会合する。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４、ＳＬＡ、ＧＬＡ、ＭＰＬ，３Ｄ－ＭＰＬ、Ｒ８４８、Ｒ８３７、またはそれらの組み合わせを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ４アゴニストを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ７アゴニストを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはＴＬＲ８アゴニストを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストはイミダゾキノリンを含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは３Ｍ－０５２を含んでなる。
いくつかの実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストの組み合わせを含んでなる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３Ｍ－０５２およびＧＬＡを含んでなる。
Ｅ．薬剤
本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、生物、ゲノム、またはウイルスであることができる、１種以上の薬剤をさらに含んでなり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、２種以上の薬剤を含んでなる。
いくつかの実施形態において、薬剤は、ＰＥＧ化リポソームと会合する。いくつかの実施形態において、薬剤は、リガンド交換によって、および／または静電的（電荷に基づく）相互作用によってＰＥＧ化リポソームと会合する。
特定の実施形態では、薬剤は、ＰＥＧ化リポソームの約０．０１～１重量％であり得る。
ポリペプチド
いくつかの実施形態において、薬剤はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは全長タンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは融合タンパク質である。いくつかの特定の実施形態において、融合タンパク質は、個体への投与の際に免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態において、以下にさらに説明するように、ポリペプチドは抗原である。
抗原
一実施形態において、薬剤は抗原を含んでなる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド抗原は、アレルギー、癌、または感染症に関与するか、または由来する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、ワクチン接種用途に有用であり、ワクチン製剤（ワクチン組成物）として提供される。
抗原は、対象において免疫反応の誘発または増強が望まれる、標的エピトープ、（生体分子を含む）分子、（生体分子を含む分子複合体を含む）分子複合体、細胞内集合体、細胞、または組織であり得る。しばしば、抗原という用語は、目的のポリペプチド抗原を指す。しかしながら、本明細書中で使用される場合、抗原は、目的のポリペプチド抗原をコードする組み換えコンストラクト（例えば、発現コンストラクト）を指す場合もある。特定の実施形態において、抗原は、感染症、癌、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、または抗原特異的免疫応答の刺激が望ましいか、または有益である他の状態に関連する感染性病原体および／もしくはエピトープ、生体分子、細胞、または組織であり得るか、またはこれらに由来し得るか、またはこれらと免疫学的に交差反応性であり得る。
特定の実施形態は、細菌、ウイルス、または真菌などの１以上の感染性病原体、例えば、結核菌もしくは癩菌もしくは別のマイコバクテリアなどのアクチノバクテリア；サルモネラ属、ナイセリア属、ボレリア属、クラミジア属、もしくはボルデテラ属のメンバーなどの細菌；単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびサイトメガロウイルスなどのウイルス；ＨＩＶ－１もしくはＨＩＶ－２などのＨＩＶ；アスペルギルス、ブラストミセス、コクシジオイデス、およびニューモシスチスなどの真菌もしくはＣ． ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ． ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ． ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ． ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃ． ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＣ． ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓなどのカンジダ種を含む酵母；原生動物などの寄生生物、例えばＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ． ｖｉｖａｘ、Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰ． ｏｖａｌｅを含むプラスモディウム種；または別の寄生生物、例えばアカントアメーバ、赤痢アメーバ、住血線虫、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、クリプトスポリジウム、鉤虫、赤痢アメーバ、大腸アメーバ、エントアメーバ・ディスパー、ハルトマンアメーバ、ポレックアメーバ、バンクロフト糸状虫、ジアルジア、およびリーシュマニアのうちの１以上、に由来する抗原を企図する。特定の実施形態において、抗原は、結核、インフルエンザ、アメーバ症、ＨＩＶ、肝炎、またはリーシュマニア症に関与する抗原由来であり得るか、またはこれらに関連し得る。
いくつかの実施形態において、抗原はアメーバ症関連抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はアメーバ症原因抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はアメーバ症原因生物由来である。いくつかの実施形態において、抗原は赤痢アメーバ由来である。一実施形態において、抗原はＬｅｃＡを含んでなる。一実施形態において、抗原はＬｅｃＡである。
いくつかの実施形態において、抗原はインフルエンザ関連抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はインフルエンザ原因抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はインフルエンザ原因ウイルス由来である。一実施形態において、抗原はＨ５Ｎ１を含んでなる。一実施形態において、抗原はＨ５Ｎ１を含んでなる。
例えば、特定の実施形態において、抗原は、ボレリア属種由来であり、抗原は、核酸、病原体由来抗原または抗原調製物、組み換え産生されたタンパク質またはペプチド、およびキメラ融合タンパク質を含み得る。一つのこのような抗原はＯｓｐＡである。ＯｓｐＡは、宿主細胞におけるその生合成のために脂質化形態の完全成熟タンパク質（Ｌｉｐｏ－ＯｓｐＡ）であり得るか、あるいは非脂質化誘導体であり得る。このような非脂質化誘導体には、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ１）の最初の８１個のＮ末端アミノ酸を有する非脂質化ＮＳ１－ＯｓｐＡ融合タンパク質、および完全なＯｓｐＡタンパク質、ならびに３つのさらなるＮ末端アミノ酸を有するＯｓｐＡの非脂質化形態である別のＭＤＰ－ＯｓｐＡが含まれる。
特定の実施形態において、抗原は、ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０、もしくはｇｐ１６０）、ヒトヘルペスウイルス、例えば、ｇＤもしくはその誘導体、もしくは最初期タンパク質、例えば、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、サイトメガロウイルス（（（特にヒト）（例えば、ｇＢもしくはその誘導体）、ロタウイルス（弱毒生ウイルスを含む）、エプスタイン・バーウイルス（例えば、ｇｐ３５０もしくはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩＩ、およびＩＥ６３）、または肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原もしくはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルス、または他のウイルス病原体、例えばパラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質もしくはそれらの誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６，１１，１６，１８など）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、またはインフルエンザウイルス（卵もしくはＭＤＣＫ細胞中で増殖させた全生もしくは不活性化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス、もしくは（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載の）全インフルエンザビロソーム、もしくはそれらの精製もしくは組み換えタンパク質、例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、もしくはＭタンパク質、もしくはそれらの組み合わせ）由来である。
特定の他の実施形態において、抗原は、１以上の細菌性病原体、例えば、淋菌ならびに髄膜炎菌（例えば、莢膜多糖およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含むナイセリア属種；化膿レンサ球菌（例えば、Ｍタンパク質もしくはその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、Ｂ群溶血性レンサ球菌（S. agalactiae）、ミュータンス菌：軟性下疳菌；カタル球菌（Branhamella catarrhalis）としても知られているモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）を含むモラクセラ属種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ）（例えば、高分子量および低分子量アドヘシンおよびインベジン）；百日咳菌（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素もしくはその誘導体、繊維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、フィムブリエ）、パラ百日咳菌、および気管支敗血症菌を含むボルデテラ属種；結核菌（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、－Ｂ、もしくは－Ｃ）、ウシ型結核菌（M. bovis）、癩菌、Ｍ．アビウム（M. avium）、ヨーネ菌（M. paratuberculosis）、Ｍ．スメグマチス（M. smegmatis）を含むマイコバクテリウム属種；在郷軍人病菌を含むレジオネラ属種；腸内毒素性（enterotoxic）大腸菌（例えば、定着因子、易熱性毒素もしくはその誘導体、耐熱性毒素もしくはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸内病原性大腸菌（例えば、志賀毒素様毒素もしくはその誘導体）を含むエシェリキア属種；コレラ菌（例えば、コレラ毒素もしくはその誘導体）を含むビブリオ属種；赤痢菌、志賀赤痢菌、Ｓ．フレックスネリ（S. flexnerii）を含むシゲラ属種；エンテロコリチカ菌（Y. enterocolitica）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、ペスト菌、偽結核菌を含むエルシニア属種；ジェジュニ菌（C. jejuni）（例えば、毒素、アドヘシン、およびインベジン）ならびにＣ.コリ（C. coli）を含むカンピロバクター属種；チフス菌、パラチフス菌、Ｓ．コレレスイス（S. choleraesuis）、Ｓ．エンテリティディス（S. enteritidis）を含むサルモネラ属種; Ｌ．モノサイトジェネス（L. monocytogenes）を含むリステリア属種；ピロリ菌（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むヘリコバクター属種；緑膿菌を含むシュードモナス属種; 黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌を含むスタフィロコッカス属種;フェカリス菌（E. faecalis）、フェシウム菌（E. faecium）を含むエンテロコッカス属種；破傷風菌（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、ボツリヌス菌（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、ディフィシル菌（C. difficile）（例えば、クロストリジウム毒素ＡもしくはＢおよびその誘導体）を含むクロストリジウム属種；炭疽菌（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むバチルス属種；ジフテリア菌（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）を含むコリネバクテリウム属種；ライム病ボレリア（B. Burgdorferi）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ガリニ（ B. garinii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アフゼリ（B. Afzelii ）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アンダーソニー（B. Andersonii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ヘルムスイ（B. hermsii）を含むボレリア属種；Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒト顆粒球エーリキア症の薬剤を含むエーリキア属種；リケッチア（R. Rickettsii）を含むリケッチア属種; Ｃ．トラコマチス（C. trachomatis）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、肺炎球菌（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジアを含むクラミジア属種；Ｌ．インターロガンス（L. interrogans）を含むレプトスピラ属種; 梅毒トレポネマ（例えば、希少な外膜タンパク質）、Ｔ．デンティコラ（T. denticola）、Ｔ．ヒオディセンテリエ（T.hyodysenteriae）を含むトレポネマ属種；または他の細菌性病原体由来である。
特定の他の実施形態において、抗原は、１以上の寄生生物（例えば、John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia参照）、例えば、熱帯熱原虫を含むプラスモディウム属種;Ｔ．ゴンディ（T. gondii）（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ属種；赤痢アメーバを含むエントアメーバ属種; Ｂ．マイクロッティ（B. microti）を含むバベシア属種；クルーズトリパノソーマを含むトリパノソーマ属種；ランブル鞭毛虫を含むジアルジア属種；Ｌ．マニア（ L. major）を含むリーシュマニア属種；Ｐ．カリニ（P. carinii）を含むニューモシスチス属種；腟トリコモナスを含むトリコモナス属種；または哺乳類に感染することができる蠕虫、例えば：（ｉ）線虫感染症（例えば、限定はされないが、蟯虫、回虫、鞭虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、回旋糸状虫、メジナ虫、旋毛虫、および糞線虫）；（ｉｉ）吸虫感染症（例えば、限定はされないが、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、メコン住血吸虫、肝吸虫、肺吸虫属、肝蛭、巨大肝吸虫（Fasciola magna）、 巨大肝蛭（Fasciola gigantica））；ならびに（ｉｉｉ）条虫感染症（例えば、限定はされないが、無鉤条虫および有鉤条虫）由来である。特定の実施形態において、抗原は、住血吸虫属種、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、および／もしくは日本住血吸虫由来であるか、または酵母、例えば、カンジダ属種、例えば、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ；クリプトコッカス属種、例えば、Ｃ．ネオフォルマンス（C. neoformans）由来である。
他の特異的抗原は、結核菌、例えばＴｈ Ｒａ１２、Ｔｂ Ｈ９、Ｔｂ Ｒａ３５、Ｔｂ３８－１、Ｅｒｄ １４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２、およびｈＴＣＣ１（ＷＯ ９９／５１７４８）由来である。結核菌のタンパク質には、２、３、もしくは４以上またはそれ以上の結核菌のポリペプチドが融合してより大きなタンパク質になっている融合タンパク質およびその変異体も含まれる。特定の融合体には、Ｒａ１２－ＴｂＨ９－Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４－ＤＰＶ－ＭＴＩ、ＤＰＶ－ＭＴＩ－ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４ＤＰＶ－ＭＴＩ－ＭＳＬ－ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４－ＤＰＶ－ＭＴＩ－ＭＳＬ、ＤＰＶ－ＭＴＩ－ＭＳＬ－ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９－ＤＰＶ－ＭＴＩが含まれる（ＷＯ ９９１５１７４８）。使用され得る他の抗原には、抗原、抗原の組合せ、ならびにＵＳ ２０１０／０１２９３９１およびＷＯ ２００８／１２４６４７に記載の融合タンパク質が含まれる。一つの例示的な実施形態において、融合タンパク質はＩＤ９３である。一つの例示的な実施形態において、融合タンパク質はＩＤ９１である。
他の特異的抗原はクラミジア由来であり、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（ＷＯ ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ ３６６４１２）、および推定膜タンパク質（Ｐｍｐ）が含まれる。他のクラミジア抗原は、ＷＯ ９９１２８４７５に記載されている群から選択することができる。特定の抗原は、ストレプトコッカス属種、例えば肺炎球菌（例えば、莢膜多糖およびそのコンジュゲート、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）およびタンパク質抗原ニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、ならびにそれらの変異解毒誘導体（ＷＯ ９０／０６９５１；ＷＯ ９９／０３８８４）由来であり得る。他の細菌ワクチンは、インフルエンザ菌タイプＢ（例えばＰＲＰおよびそのコンジュゲート）、分類不能型インフルエンザ菌、例えばＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（米国特許第５，８４３，４６４号）、またはそれらの複数コピー変異型もしくは融合タンパク質を含むヘモフィルス属種由来の抗原を含んでなる。
他の特異的抗原は、Ｂ型肝炎由来で生じる。Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は、当該分野で周知であり、とりわけ、欧州特許出願ＥＰ－Ａ４１４３７４；ＥＰ－Ａ－０３０４５７８、およびＥＰ １９８４７４に記載されているＰｒｅＳ１、Ｐａｒｓ２Ｓ抗原の誘導体が含まれる。一態様において、抗原は、特にＣＨＯ細胞で発現される場合、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０である。他の実施形態において、抗原はｇＤ２ｔである。
他の実施形態において、抗原は、性器疣贅の原因と考えられるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１など）、および子宮頸癌の原因となるＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）に由来する。特定の抗原には、Ｌ１粒子またはカプソメア、ならびにＨＰＶ６およびＨＰＶ１１タンパク質Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２から選択される１以上の抗原を含んでなる融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質のある種の形態には、ＷＯ ９６／２６２７７に開示されているＬ２Ｅ７、およびＧＢ ９７１７９５３．５（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５）に開示されているタンパク質Ｄ（１／３）－Ｅ７が含まれる。さらなる可能な抗原には、ＨＰＶ １６または１８抗原が含まれる。例えば、Ｌ１もしくはＬ２抗原モノマー、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）として一緒に提示されるＬ１もしくはＬ２抗原、もしくはＶＬＰもしくはカプソメア構造で単独で提示されるＬ１単独タンパク質である。このような抗原、ウイルス様粒子、およびカプソメアは、それ自体公知である。例えば、ＷＯ９４／００１５２、ＷＯ９４／２０１３７、ＷＯ９４／０５７９２、およびＷＯ９３／０２１８４を参照されたい。
他の実施形態において、抗原は融合タンパク質である。融合タンパク質は、単独で、または例えばＥ７、Ｅ２、もしくはＦ５などの融合タンパク質として含まれていてもよく、特定の実施形態は、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を含んでなるＶＬＰを含む（ＷＯ ９６／１１２７２）。特定のＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６由来のタンパク質Ｄ－Ｅ６もしくはＥ７融合体を形成するためのタンパク質Ｄ担体と融合した初期タンパク質Ｅ６もしくはＦ７、もしくはそれらの組み合わせ、またはＥ６もしくはＥ７とＬ２との組み合わせを含んでなる（ＷＯ ９６／２６２７７）。あるいは、ＨＰＶ１６または１８初期タンパク質Ｅ６およびＥ７は、単一の分子、例えば、タンパク質Ｄ－Ｅ６／Ｅ７融合体で提示され得る。組成物は、例えばタンパク質Ｄ－Ｅ６もしくはタンパク質Ｄ－Ｅ７融合タンパク質またはタンパク質Ｄ Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の形態の、初期ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のいずれかまたは両方を、必要に応じて含み得る。組成物は、他のＨＰＶ株由来の抗原、例えばＨＰＶ３１または３３株由来の抗原をさらに含んでなり得る。
抗原はまた、マラリアを引き起こす寄生生物に由来し得る。例えば、熱帯熱原虫由来の抗原には、ＲＴＳ，Ｓ、およびＴＲＡＰが含まれる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４つのアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結された熱帯熱原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的に全てのＣ末端部分を含んでなるハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第９１２４３９０．７号からの優先権を主張するＷＯ ９３／１０１５２として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号に開示されている。酵母で発現されると、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として産生され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と同時発現されると、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を産生する。
ＴＲＡＰ抗原は、ＷＯ ９０／０１４９６として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号に記載されている。本発明の実施形態は、抗原調製物がＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含んでなるマラリアワクチンである。多段階マラリアワクチンの成分の有力候補である他のプラスモディウム抗原は、熱帯熱原虫ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、およびプラスモディウム属種のそれらの類似体である。
一実施形態において、抗原は、癌の免疫療法に有用であり得るように、癌細胞に由来する。例えば、抗原は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、または黒色腫癌などの腫瘍拒絶抗原であり得る。例示的な癌または癌細胞由来抗原には、ＭＡＧＥ１、３、およびＭＡＧＥ４、またはＷＯ９９／４０１８８に開示されているものなどの他のＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、（ＮＹ Ｅｏｓ １としても知られている）Ｌａｇｅ、ＳＡＧＥ、およびＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）、またはＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al.(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p.293）が含まれる。癌抗原のこれらの非限定的な例は、黒色腫、肺癌、肉腫、および膀胱癌などの広範囲の腫瘍型で発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照されたい。
他の腫瘍特異的抗原には、ＧＭ２およびＧＭ３などの腫瘍特異的もしくは腫瘍関連ガングリオシドもしくはキャリアタンパク質とのそれらのコンジュゲート；または、多くの癌の治療に有用な、短い１０アミノ酸長のペプチドである、全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、ＷＯ ９５／２０６００）などの自己ペプチドホルモンが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、前立腺抗原、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（例えば、 Proc.Nat. Acad.Sci.USA 95(4) 1735-17401998）、ＰＳＭＡ、または一実施形態においてはプロステート（Prostase）として知られる抗原（例えば、Nelson, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999.96, 3114-3119；ＷＯ ９８／１２３０２；米国特許第５，９５５，３０６号；ＷＯ ９８／２０１１７；米国特許第５，８４０，８７１号および第５，７８６，１４８号；ＷＯ ００／０４１４９）を使用する。他の前立腺特異的抗原は、ＷＯ ９８／１３７４１８およびＷＯ／００４１４９から公知である。もう一つはＳＴＥＡＰ（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）である。
本発明において有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ－１（J Biol.Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、ＨＡＳＨ－１、ＨａｓＨ－２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70、米国特許第５，６５４，１４０号）、およびＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号）が含まれる。さらに、癌の治療におけるワクチンに特に適している抗原は、チロシナーゼおよびサバイビンも含んでなる。
他の実施形態において、本発明の組成物に使用される薬剤には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの状態の予防および治療のための、細菌感染（例えば、肺炎球菌）によって引き起こされるかまたは増悪する疾患などの呼吸器疾患に関連する抗原が含まれる。ＣＯＰＤは、慢性気管支炎および／または肺気腫を有する患者における不可逆的またはある程度可逆的な気道閉塞の存在によって生理学的に定義される（Am J Respir Crit Care Med.1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121）。ＣＯＰＤの増悪は、しばしば、細菌（例えば、肺炎球菌）感染によって引き起こされる（Clin Microbiol Rev.2001 Apr;14(2):336-63）。
ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、薬剤はポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、およびオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはコードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、レプリコンＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗原であるか、または抗原を含んでなるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、ＬｅｃＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、Ｈ５Ｎ１である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、ＩＤ９３である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはレプリコンである。いくつかの実施形態において、レプリコンは、主にそれ自身の制御下で複製することができるプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスである。いくつかの実施形態において、レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、レプリコンは、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態において、レプリコンはＲＮＡウイルスに由来する。
アジュバント
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは、アジュバントをさらに含んでなるか、またはコアジュバント（co-adjuvant）と同時投与され得る。いくつかの実施形態において、アジュバントは、レチノイン酸（ＲＡ）、ＡＳ－２、モノホスホリルリピドＡ、３－デ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ、ＩＦＡ、ＱＳ２１、ＣＷＳ、ＴＯＭ、ＡＧＰ、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、Ｌｅｉｆ、サポニン、サポニン模倣物、生物由来および合成のリピドＡ、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン、ＧＬＡ、ＳＬＡ、Ｓｔｉｎｇｉｎ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
生物
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは生物を含んでなる。例えば、赤痢アメーバ、インフルエンザ原因ウイルス、または結核（ＴＢ）を引き起こす結核菌である。現在、生きた細菌によるワクチン接種は、結核に対する防御免疫を誘発するための最も効率的な方法である。この目的のために使用される最も一般的なマイコバクテリウムは、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）の非病原性株であるカルメット・ゲラン杆菌（ＢＣＧ）である。したがって、いくつかの実施形態において、組成物はＰＥＧ化リポソームおよびマイコバクテリウムを含んでなる。
いくつかの実施形態において、薬剤はウイルスまたはウイルスゲノムである。したがって、これらの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ウイルスまたはウイルスゲノムを含んでなる。
Ｆ．例示的なＰＥＧ化リポソーム
特定の実施形態において、本発明のＰＥＧ化リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、約９．８：５．７：０．８である。
特定の実施形態において、本発明のＰＥＧ化リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比は、約１８：５．５：３である。
特定の実施形態において、本発明のＰＥＧ化リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０の脂質モル比は、約９．８：５．７：０．８である。
特定の実施形態において、本発明のＰＥＧ化リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００の脂質モル比は、約９．８：５．７：０．８である。
特定の実施形態において、本発明のＰＥＧ化リポソーム中の非ＰＥＧ化中性脂質ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ化脂質ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０の脂質モル比は、約１８：５．５：３である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＬｅｃＡ抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＬｅｃＡ抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、Ｈ５Ｎ１抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、Ｈ５Ｎ１抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＩＤ９３抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＩＤ９３抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＩＤ９１抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＩＤ９１抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３Ｍ－０５２、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３Ｍ－０５２、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３Ｍ－０５２およびＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、ならびにＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３Ｍ－０５２およびＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、ならびにＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＬｅｃＡ抗原、３Ｍ－０５２およびＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、ならびにＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、ＬｅｃＡ抗原、３Ｍ－０５２およびＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、ならびにＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、Ｈ５Ｎ１抗原、３Ｍ－０５２およびＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、ならびにＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、Ｈ５Ｎ１抗原、３Ｍ－０５２およびＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、ならびにＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、結核関連抗原、ＨＩＶ関連抗原、癌関連抗原、アメーバ症関連抗原、インフルエンザ関連抗原、または肝炎関連抗原、ＴＬＲアゴニスト、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、結核関連抗原、ＨＩＶ関連抗原、癌関連抗原、アメーバ症関連抗原、インフルエンザ関連抗原、または肝炎関連抗原、ＴＬＲアゴニスト、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、結核関連抗原、ＨＩＶ関連抗原、癌関連抗原、アメーバ症関連抗原、インフルエンザ関連抗原、または肝炎関連抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、結核関連抗原、ＨＩＶ関連抗原、癌関連抗原、アメーバ症関連抗原、インフルエンザ関連抗原、または肝炎関連抗原、ＧＬＡ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、結核関連抗原、ＨＩＶ関連抗原、癌関連抗原、アメーバ症関連抗原、インフルエンザ関連抗原、または肝炎関連抗原、３Ｍ－０５２、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ２０００である。
特定の実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、結核関連抗原、ＨＩＶ関連抗原、癌関連抗原、アメーバ症関連抗原、インフルエンザ関連抗原、または肝炎関連抗原、３Ｍ－０５２、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなり、ＰＥＧ成分はＰＥＧ７５０である。
ＩＩＩ．ＰＥＧ化リポソームの生理化学的特性
Ａ．サイズ
本明細書で提供されるように、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約１ｎｍ～４５０ｎｍの範囲であり、ＰＥＧ化ナノリポソームであると考えることができる。このようなナノリポソームは、製造に適しており、濾過滅菌可能である。さらに、生体内で、薬剤（例えば、抗原および／またはアジュバント）を含んでなるこのようなナノリポソームの送達は、典型的には、デポー効果の発生を示さないか、または低減する。さらに、薬剤（例えば、抗原および／またはアジュバント）を含んでなるこのようなナノリポソームの生体内送達は、流入領域リンパ節への送達を可能にし、抗原提示細胞への提示を可能にし、有効なＴｈ１系免疫応答の発生を可能にする。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは、Ｘ線およびレーザー回折、動的光散乱（ＤＬＳ）、ＣｒｙｏＥＭ、またはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅを含むがこれらに限定されない、当該分野における公知の技術によって評価することができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズはＺ平均直径を指す。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約５０ｎｍ～７５ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約５０ｎｍ～１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約５０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約５０ｎｍ～２００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約５０ｎｍ～３００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約２０ｎｍ～１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約２０ｎｍ～５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約１０ｎｍ～２００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約１０ｎｍ～１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは約１０ｎｍ～５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは、約１ｎｍである、約５ｎｍである、約１０ｎｍである、約１５ｎｍである、約２０ｎｍである、約２５ｎｍである、約３０ｎｍである、約３５ｎｍである、約４０ｎｍである、約４５ｎｍである、約５０ｎｍである、約５５ｎｍである、約６０ｎｍである、約６５ｎｍである、約７０ｎｍである、約７５ｎｍである、約８０ｎｍである、約８５ｎｍである、約９０ｎｍである、約９５ｎｍである、約１００ｎｍである、約１０５ｎｍである、約１１０ｎｍである、約１１５ｎｍである、約１２０ｎｍである、約１２５ｎｍである、約１３０ｎｍである、約１３５ｎｍである、約１４０ｎｍである、約１４５ｎｍである、約１５０ｎｍである、約１５５ｎｍである、約１６０ｎｍである、約１６５ｎｍである、約１７０ｎｍである、約１７５ｎｍである、約１８０ｎｍである、約１８５ｎｍである、約１９０ｎｍである、約１９５ｎｍである、または約２００ｎｍである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズは、約１ｎｍ以下、約５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約１５ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、約２５ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約３５ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約４５ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約５５ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約６５ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約７５ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約９５ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約１０５ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１１５ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１２５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１３５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１４５ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１５５ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１６５ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１７５ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１８５ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１９５ｎｍ以下、または約１９９ｎｍ以下である。
本明細書で提供されているように、好ましい実施形態では、ＰＥＧ化リポソームは、少なくとも０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、０．４５ミクロンより小さいフィルターを通して濾過することができる。例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、０．２０または０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。
Ｂ．安定性
本明細書において提供されるＰＥＧ化リポソームは安定であり、使い易さ、製造性、輸送性、および保存を可能にする。本発明者らは、リポソームのＰＥＧ化がリポソームの安定性に寄与することを発見した。サイズを含むがこれに限定されないＰＥＧ化リポソームの生理化学的特性は、経時的に、様々な温度で、および様々な条件下で維持される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化脂質の非存在下でのリポソームと比較した場合、ＰＥＧ化リポソームは凝集の減少を示すか、または全く凝集を示さない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームまたはＰＥＧ化リポソームからなる組成物は、凝集しないか、ほとんどもしくは全く凝集を示さないか、凝集の減少を示すか、または初期サイズと比較して経時的に平均サイズの全体的な増加を示さない。
ＰＥＧ化リポソームの安定性は、当業者に周知の技術によって測定することができる。いくつかの実施形態において、安定性を視覚的に観察する。目視検査は、粒子、凝結物、または凝集物の検査を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのサイズによって安定性を測定し、必要に応じて、経時的な、または様々な温度での、または特定の条件下でのサイズの変化として表す。いくつかの実施形態において、組成物中のＰＥＧ化リポソームの凝集％を評価することによって安定性を求める。いくつかの実施形態において、安定性を、特定のサイズのフィルター、例えば０．２０、０．２２、または０．４５ミクロンのフィルターを通過するＰＥＧ化リポソームの能力によって評価する。いくつかの実施形態において、ｐＨによって安定性を求める。いくつかの実施形態において、安定性を、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）技術を用いて、多分散指数（ＰｄＩ）の測定によって求める。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームのＺ平均直径は、アッセイされた期間にわたって５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、１％未満増加する。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、０～８℃で安定である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約２℃～約８℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約４℃～約８℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約４℃～約８℃の温度で６ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約４℃～約８℃の温度で１年以上の間安定である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、８～２０℃で安定である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、８～２０℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約８℃～約２０℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約８℃～約２０℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約８℃～約２０℃の温度で６ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約８℃～約２０℃の温度で１年以上の間安定である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、２０～３０℃で安定である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、２５℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約２５℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約２５℃の温度で６ヶ月以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約２５℃の温度で１年以上の間安定である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３０～４０℃で安定である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、約３７℃の温度で１ヶ月以上の間安定である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、４０～６２℃で安定である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、４０～６２℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、安定である。
一つの例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、４～８℃で１年以上の間安定である。別の例示的な実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、２５℃で１年以上の間安定である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、１～５回の凍結融解後に安定である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームは、１、２、３、４、または５回の凍結融解後に安定である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームの多分散指数は、約０．３以下で維持される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームの多分散指数は、約０．２５以下で維持される。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームの多分散指数は、約０．２以下で維持される。
ＩＶ．ＰＥＧ化リポソーム製造方法
本明細書で提供されるように、ＰＥＧ化リポソーム製造方法は、（ａ）非ＰＥＧ化中性脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロールを有機溶媒中で混合することと、（ｂ）有機溶媒を蒸発させて脂質膜を得ることと、（ｃ）緩衝液中で脂質膜を再水和させることと、（ｄ）工程（ｃ）の再水和生成物に高エネルギー入力源（例えば、超音波処理、顕微溶液化、押出）を適用することとを含んでなる。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、顕微溶液化を含んでなる。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、超音波処理を含んでなる。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、押出を含んでなる。いくつかの実施形態において、有機溶媒は、クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール／水の混合物である。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、ＴＬＲアゴニストと他の成分との混合をさらに含んでなる。
例示的な実施形態において、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０を、有機溶媒（クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール／水の混合物）中で様々な量の３Ｍ－０５２と混合する。次いで有機溶媒を蒸発させる。得られた脂質膜を緩衝液中で再水和させ、製剤が半透明で、大きな目に見える粒子がなくなるまで超音波処理する。より大きなバッチ（１００ｍＬ）のＰＥＧ化リポソームは、上記のようではあるが、超音波処理時間を短時間にし、その後の高せん断ホモジナイズにより製造することができる。
いくつかの実施形態において、得られたＰＥＧ化リポソームを薬剤（例えば、抗原）と混合する。
Ｖ．ＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物
本明細書に記載のＰＥＧ化リポソームを含んでなる製剤、組成物、および医薬組成物が、本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物は、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含んでなる。
本明細書に記載の組成物は、ワクチン接種、治療、または診断目的のために対象に投与することができる。
医薬組成物は、通常、本明細書に記載の組成物を含んでなり、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて、抗原、追加のアゴニスト、または組み換え発現コンストラクトから選択される本明細書で提供される１以上の成分をさらに含んでなり得る。
本明細書において提供される実施形態において、医薬組成物は、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、０．２０ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。
一実施形態において、本発明は、ＴＬＲ７／８アゴニストまたはＴＬＲ４アゴニストを含んでなるＰＥＧ化リポソームを含んでなる医薬組成物に関する。当該組成物は、本明細書に記載のＴＬＲ７／８アゴニストまたはＴＬＲ４アゴニストが組成物中に製剤化され、組成物が、他の抗原を実質的に欠き、生物による感染などの疾患または他の状態の診断、治療、または予防の目的のために、免疫応答、例えば、非特異的免疫応答または抗原特異的免疫応答を刺激するために対象に組成物を投与する「単独療法」に使用することができる。
他の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の組成物および抗原の両方を含んでなるワクチン組成物であり、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて、本明細書で提供される１以上の成分をさらに含んでなり得る。例示的な担体は、通常、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。
本明細書において提供される治療的実施形態において、約１μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの投与量の治療用医薬組成物を投与する。投与の回数および頻度が対象の応答に依存することは、当業者には明らかであろう。
本明細書において提供されるワクチンをベースとする実施形態において、投与あたり約１μｇ～２５μｇの薬剤（例えば、アジュバントまたは抗原）を投与する。投与の回数および頻度が対象の応答に依存することは、当業者には明らかであろう。
治療用途用の「薬剤的に許容できる担体」は、製薬分野において周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A.R. Gennaro edit.1985）に記載されている。例えば、生理的ｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水を使用し得る。防腐剤と、安定剤と、染料と、矯味剤も、医薬組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として添加し得る。１４４９でＩｄ。また、抗酸化剤および懸濁化剤を使用し得る。Ｉｄ。
「薬剤的に許容できる塩」は、本発明の化合物と有機もしくは無機酸（酸付加塩）または有機もしくは無機塩基（塩基付加塩）との組み合わせに由来する本発明の化合物の塩を指す。本発明の組成物は、遊離塩基または塩のいずれかの形態で使用され得、両方の形態が本発明の範囲内にあると見なされる。
医薬組成物は、組成物を患者に投与することを可能にする任意の形態であり得る。例えば、組成物は、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であり得る。典型的な投与経路には、経口、局所、非経口、舌下、口腔内、直腸内、膣内、静脈内、皮内、経皮、鼻腔内、粘膜内、または皮下が含まれるが、これらに限定はされない。本明細書で使用される用語、非経口には、イオントフォレーシス（例えば、Ｕ．Ｓ．７，０３３，５９８；７，０１８，３４５；６，９７０，７３９）、ソノフォレーシス （sonophoretic）（例えば、Ｕ．Ｓ．４，７８０，２１２；４，７６７，４０２；４，９４８，５８７；５，６１８，２７５；５，６５６，０１６；５，７２２，３９７；６，３２２，５３２；６，０１８，６７８）、サーマル（例えば、Ｕ．Ｓ． ５，８８５，２１１；６，６８５，６９９）、受動的経皮（例えば、Ｕ．Ｓ．３，５９８，１２２；３，５９８，１２３；４，２８６，５９２；４，３１４，５５７；４，３７９，４５４；４，５６８，３４３；５，４６４，３８７；英国特許明細書第２２３２８９２号；Ｕ．Ｓ．６，８７１，４７７；６，９７４，５８８；６，６７６，９６１）、顕微針（例えば、Ｕ．Ｓ．６，９０８，４５３；５，４５７，０４１；５，５９１，１３９；６，０３３，９２８）投与技術と、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、陰茎海綿体、くも膜下腔内、道内（intrameatal）、尿道内注射もしくは注入技術とが含まれる。特定の実施形態において、（ワクチンおよび医薬組成物を含む）本明細書に記載の組成物を、イオントフォレーシス、マイクロキャビテーション、ソノフォレーシス、または顕微針から選択される技術によって皮内に投与する。
医薬組成物が対象に投与されると、医薬組成物に含有されている活性成分が生体利用可能になるように、医薬組成物を製剤化することができる。対象に投与される組成物は、１以上の投与単位の形態をとり、例えば、錠剤が単一の投与単位であり得、エアロゾル形態の本発明の１以上の化合物の容器が複数の投与単位を保持し得る。
経口投与では、賦形剤および／または結合剤が存在し得る。例は、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびエチルセルロースである。着色剤および／または矯味剤が存在し得る。コーティングシェル（coating shell）を使用し得る。
組成物は、液体、例えばエリキシル、シロップ、溶液、エマルション、または懸濁液の形態であり得る。液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与が意図されている場合、組成物は、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および香味増強剤のうちの１以上を含有することができる。注射によって投与されることが意図されている組成物中に、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、および等張剤のうちの１以上が含まれ得る。
溶液、懸濁液、または他の同様の形態の形態である、本明細書で使用される液体医薬組成物は、以下の担体または賦形剤のうちの１以上を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、固定油、例えばスクアレン、スクアラン、鉱油、マンニドモノオレエート、コレステロール、および／または溶媒もしくは懸濁媒体として働き得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。
別の実施形態において、本発明の組成物は、エアロゾル化され得る様式で製剤化される。
また、アルミニウム塩、油中水型エマルション、生物分解性油状ビヒクル、水中油型エマルション、生物分解性マイクロカプセル、およびリポソームを含むがこれらに限定されない送達ビヒクルなどの他の成分を医薬組成物に含めることが望ましい場合もある。このようなビヒクルに用いるための追加の免疫調節性物質（コアジュバント（co-adjuvant））の例は、上記にも記載されており、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニン－Ｄ－イソグルタミン（ＭＤＰ）、グルカン、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマインターフェロン、およびＩＬ－１２が含まれ得る。
当業者に公知の任意の好適な担体が本発明の医薬組成物に使用され得るが、担体の種類は、投与様式および持続放出が望まれるかどうかに依存して変わる。皮下注射などの非経口投与では、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含んでなることができる。経口投与では、上記担体または固体担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムのうちのいずれかを使用し得る。生物分解性微細球（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））もまた、本発明の医薬組成物用担体として使用し得る。好適な生物分解性微細球は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。これに関して、微細球は、約２５ミクロンよりも大きいことが好ましい。
医薬組成物は、緩衝剤などの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤も含有し得る。中性緩衝食塩水または非特異的血清アルブミン（albumiskilln）と混合した生理食塩水は、例示的な適当な希釈剤である。例えば、製品は、希釈剤として適当な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得る。
医薬組成物は、局所投与を目的とし得、この場合、担体は、溶液、エマルション、軟膏、またはゲル基剤を適宜含んでなり得る。例えば、基剤は、以下：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜ろう、鉱油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定剤のうちの１以上を含んでなり得る。増粘剤が局所投与用医薬組成物中に存在し得る。経皮投与が意図されている場合、組成物は、経皮パッチまたはイオントフォレーシス装置を含み得る。局所製剤は、約０．１～約１０％ｗ／ｖ（単位体積あたり重量）の濃度の抗原（例えば、ＧＬＡ抗原ワクチン組成物）またはＧＬＡ（例えば、免疫アジュバント組成物；ＧＬＡは、アラバマ州アラバスターのAvanti Polar Lipids, Inc.から入手可能である；例えば、製品番号６９９８００）を含有し得る。
組成物は、例えば直腸内で融解して薬剤を放出することができる坐剤の形態での、直腸投与を目的とし得る。直腸投与用組成物は、好適な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有し得る。このような基剤には、ラノリン、カカオバター、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法において、医薬組成物／アジュバントを、挿入剤（insert）、ビーズ、徐放性製剤、パッチ、または速放性製剤の使用により投与し得る。
ＶＩ．ＰＥＧ化リポソーム使用方法
ＰＥＧ化リポソームのいずれか１つ、または本明細書で提供されるＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物を投与することを含んでなる、対象において免疫応答を刺激する方法が、本明細書で提供される。ＰＥＧ化リポソームおよび組成物は、ワクチン接種、治療、および診断向けの用途を見出す。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、癌の治療または予防のために使用される。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＰＥＧ化リポソームを含んでなる医薬組成物は、ワクチン組成物であり、ワクチンとして使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、対象における免疫応答（非特異的応答および抗原特異的応答を含む）を刺激するために使用される。いくつかの実施形態において、免疫応答は全身免疫応答を含んでなる。いくつかの実施形態において、免疫応答は粘膜免疫応答を含んでなる。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、インフルエンザ原因ウイルスに対する防御免疫を増強するために使用される。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、アメーバ症原因生物に対する防御免疫を増強するために使用される。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、赤痢アメーバに対する防御免疫を増強するために使用される。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、インフルエンザに対する防御免疫を増強するために使用される。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、アメーバ症に対する防御免疫を増強するために使用される。
一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、本明細書で提供されるＰＥＧ化リポソーム組成物のいずれか１つを鼻腔内投与することを含んでなる、対象において（ＩｇＧ免疫応答を特徴とする）全身免疫応答および（ＩｇＡ免疫応答を特徴とする）粘膜免疫応答の両方を刺激することのために使用される。一実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなるＰＥＧ化リポソームを鼻腔内投与することを含んでなる、対象において全身免疫応答および粘膜免疫応答の両方を刺激することのために使用される。関連の
実施形態において、ＰＥＧ化リポソーム組成物は、ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２を含んでなるＰＥＧ化リポソームを鼻腔内投与することを含んでなる、対象において全身免疫応答および粘膜免疫応答の両方を刺激することのために使用される。驚くべきことに、本発明者らは、ＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物の鼻腔内投与が、（鼻腔内で）局所粘膜応答を生じさせること、全身免疫応答を生じさせること、および遠位粘膜応答（例えば、糞便、腸管、および／または膣粘膜応答）を生じさせることができることを発見した。
本明細書で提供される実施形態において、対象は、哺乳類（例えば、家畜（ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、ペット（ネコ、イヌなど）、およびげっ歯類（ラット、マウスなど）を含む動物、またはヒト）である。一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象はヒト以外の哺乳類である。別の実施形態において、ヒト以外の哺乳類は、イヌ、ウシ、またはウマである。
ＶＩＩ．キットおよび製品
また、特定の実施形態において、１つ以上の容器で提供され得る、本明細書に記載のＰＥＧ化リポソームおよび組成物を含んでなるキットが企図されている。一実施形態において、組成物の全ての成分が単一の容器に一緒に存在するが、本発明の実施形態は、これに限定されることを意図されておらず、例えば免疫アジュバント組成物が抗原成分から分離しており、抗原成分と接触していない２つ以上の容器も企図する。非限定的な理論として、いくつかの場合において、免疫アジュバント組成物としてのＰＥＧ化リポソーム組成物の投与のみが有益に行われ得、一方、他の場合には、当該投与は、抗原の投与と時間的および／または空間的に（例えば、異なる解剖学的部位で）有益に分離され得、さらに他の場合において、本明細書に記載されており、かつ、抗原およびアジュバント組成物の両方と、必要に応じて他の本明細書に記載の成分も含有する、ワクチン組成物の対象への投与が、有益に実施される。
いくつかの実施形態において、キットの１つのバイアルは、ＰＥＧ化リポソームを含んでなる組成物を含んでなり、キットの第２のバイアルは薬剤を含む。いくつかの実施形態において、キットは、任意の薬剤を含む第３のバイアルを含んでなる。
本発明のキットは、本明細書に記載の使用のための説明書またはバイアルに含まれる物質を混合するための説明書をさらに含んでなり得る。いくつかの実施形態において、バイアル中の物質は乾燥または凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、バイアル中の物質は液体である。
このようなキットの実施形態に係る容器は、任意の好適な入れ物、容器、バイアル、アンプル、チューブ、カップ、ボックス、ボトル、フラスコ、ジャー、皿、単一ウェルまたはマルチウェル装置のウェル、リザーバ、タンク、もしくは同種のもの、または本明細書に開示された組成物が置かれ、貯蔵され、および／もしくは運搬され、そしてアクセスされて内容物が除去され得る他の装置であり得る。典型的には、このような容器は、目的の用途に適合し、かつ含まれる内容物の回収が容易に達成され得る材料製であり得る。このような容器の非限定的な例には、針および注射器を使用して内容物を引き出すことに適合するゴム隔膜または他のシール手段を有するものを含む、ガラスおよび／もしくはプラスチックでシールされた、または再シール可能なチューブおよびアンプルが含まれる。このような容器は、例えば、容器から材料を効率的に回収することを可能にし、かつ／または、例えば紫外線もしくは極端な温度などの分解条件から、もしくは微生物夾雑物を含む望ましくない夾雑物の混入から物質を保護する材料で作られているか、または被覆されていてもよい、ガラスまたは化学的に適合するプラスチックもしくは樹脂でつくられていることがあり得る。容器は、好ましくは、無菌または滅菌可能であり、本明細書に記載のワクチン組成物および／または免疫アジュバント組成物および／または抗原および／または組み換え発現コンストラクトなどを懸濁または溶解させるために使用され得るものなどの任意の担体、賦形剤、溶媒、ビヒクル、または同種のものと適合する材料製である。
ＶＩＩＩ．例示的な実施形態
第１の実施形態において、本発明は、とりわけ、コレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質を含んでなるリポソームであって、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が約５０００ダルトン以下である、前記リポソームに関する。
本発明はまた、第２の実施形態において、ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が約７５０ダルトン～約５０００ダルトンの範囲である、第１の実施形態のリポソーム；ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が約２０００ダルトン以下である、第１の実施形態のリポソーム；またはＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が約７５０ダルトンである、第１の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第３の実施形態において、ＰＥＧ化脂質の脂質成分が中性脂質を含んでなるか；ＰＥＧ化脂質の脂質成分がＣ１４アルキル鎖、Ｃ１６アルキル鎖、もしくはＣ１８アルキル鎖を含んでなるか；ＰＥＧ化脂質の脂質成分が、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、もしくはＤＭＰＥであるか；ＰＥＧ化脂質の脂質成分がＤＳＰＥであるか；またはＰＥＧ化脂質の脂質成分がＤＰＰＥである、第１または第２の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第４の実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質がＣ１４アルキル鎖、Ｃ１６アルキル鎖、もしくはＣ１８アルキル鎖を含んでなるか；非ＰＥＧ化中性脂質が、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、もしくはＤＭＰＥであるか；または非ＰＥＧ化中性脂質がＤＰＰＣである、第１、第２、または第３の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第５の実施形態において、リポソームが安定であるか；リポソームが、約２℃～約８℃の温度で１ヶ月以上の間安定であるか；リポソームが、約２５℃の温度で１ヶ月以上の間安定であるか；またはリポソームが、約３７℃の温度で１ヶ月以上の間安定である、第１、第２、第３、または第４の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第６の実施形態において、リポソームの多分散指数が約０．３以下で維持される、第１、第２、第３、第４、または第５の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第７の実施形態において、リポソームのサイズが４５０ｎｍ未満もしくは約４５０ｎｍであるか；リポソームのサイズが４５０ｎｍ未満もしくは約４５０ｎｍで維持されるか；リポソームのサイズが約５０ｎｍ～約３００ｎｍの範囲である、第１、第２、第３、第４、第５、または第６の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第８の実施形態において、リポソーム中のＰＥＧ化脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）が、約１ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の範囲であるか；リポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％が、約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の範囲であるか；またはリポソーム中のＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％が約５ｍｏｌ％である、第１、第２、第３、第４、第５、第６、または第７の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第９の実施形態において、リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％が約１ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の範囲であるか；またはリポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％が約５０ｍｏｌ％である、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第１０の実施形態において、リポソーム中の非ＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％が約４５ｍｏｌ％～約９８ｍｏｌ％の範囲であるか、またはリポソーム中の非ＰＥＧ化脂質のｍｏｌ％が約４５ｍｏｌ％である、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、または第９の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第１１の実施形態において、非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比が約９．８：５．７：０．８であるか、または非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比が約１８：５．５：３である、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第１２の実施形態において、リポソームが、１つ以上のＴＬＲアゴニストをさらに含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、もしくはＴＬＲ９アゴニストを含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ４、ＳＬＡ、ＧＬＡ、３Ｄ－ＭＰＬ、Ｒ８３７、もしくはＲ８４８を含んでなるか；リポソームが、疎水性尾部を有するＴＬＲアゴニストを含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ７アゴニストを含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ８アゴニストを含んでなるか；リポソームが、イミダゾキノリンもしくはイミダゾキノリン含有化合物を含んでなるＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなるか；リポソームが、３Ｍ－０５２を含んでなるか；リポソームが、Ｒ８４８を含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ４アゴニストを含んでなるか；リポソームが、３Ｄ－ＭＰＬを含んでなるか；リポソームが、ＧＬＡを含んでなるか；リポソームが、本明細書で提供される式（Ｖ）の合成ＧＬＡもしくはその薬剤的に許容できる塩と、式（Ｖ）の対応する実施形態のいずれかもしくはその薬剤的に許容できる塩とを含んでなるか；リポソームが、本明細書で提供される式（ＶＩ）の合成ＧＬＡもしくはその薬剤的に許容できる塩と、式（ＶＩ）の対応する実施形態のいずれかもしくはその薬剤的に許容できる塩とを含んでなるか；またはリポソームが、式：
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 の合成ＧＬＡもしくはその薬剤的に許容できる塩を含んでなるか；リポソームが、ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストを含んでなるか；リポソームが、本明細書に記載のＴＬＲ４もしくはＴＬＲ７／８アゴニストのいずれか一つを含んでなるか；またはリポソームが、ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２を含んでなる、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、または第１１の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第１３の実施形態において、リポソームが、１以上の薬剤を含んでなるか；リポソームが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、または生物を含んでなる１以上の薬剤を含んでなるか；リポソームが、抗原を含んでなる１以上の薬剤を含んでなるか；リポソームが、抗原を含んでなる１以上の薬剤を含んでなり、抗原が、アメーバ症関連抗原、ＬｅｃＡ、インフルエンザ関連抗原、Ｈ５Ｎ１、結核関連抗原、ＩＤ９１、ＩＤ９３、ＢＣＧ由来抗原、肝炎ウイルス関連抗原、Ｂ型肝炎抗原、Ｃ型肝炎抗原、ＨＩＶ関連抗原、または癌関連抗原を含んでなる、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、または第１２の実施形態のリポソームのいずれかを提供する。
本発明は、第１４の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、もしくは第１３の実施形態のリポソームのいずれかを含んでなる組成物、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、もしくは第１３の実施形態のリポソームのいずれかと、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、もしくは希釈剤とを含んでなる組成物を提供する。組成物は、例えば、ワクチン、治療薬、または診断薬であることができる。
本発明は、第１５の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、または第１４の実施形態のいずれか一つのリポソームまたは組成物を対象に投与し、それにより対象において免疫応答を刺激することを含んでなる、対象において免疫応答を刺激する方法を提供する。免疫応答は、例えば、非特異的免疫応答；抗原特異的免疫応答；全身免疫応答；粘膜免疫応答；または腸管、糞便、もしくは膣粘膜免疫応答であることができる。組成物は、例えば、癌の治療もしくは予防のため；ワクチンとして；インフルエンザ原因ウイルスに対して防御免疫を増強するため；アメーバ症原因生物に対する防御免疫を増強するため；赤痢アメーバに対する防御免疫を増強するため；インフルエンザに対する防御免疫を増強するため；またはアメーバ症に対する防御免疫を増強するために、使用することができる。組成物の投与経路は、経口、局所、非経口、舌下、口腔内、直腸内、膣内、静脈内、皮内、経皮、鼻腔内、粘膜内、または皮下であることができる。リポソームまたは組成物は、レチノイン酸コアジュバント（co-adjuvant）と共に投与することができる。対象は、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類であることができる。
本発明は、第１６の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、または第１４の実施形態のいずれか一つのリポソームまたは組成物を対象に投与し、それにより対象においてＴｈ１応答を誘発することを含んでなる、対象においてＴｈ１応答を誘発する方法を提供する。免疫応答は、例えば、非特異的免疫応答、抗原特異的免疫応答、全身免疫応答、粘膜免疫応答、または腸管、糞便、もしくは膣粘膜免疫応答であることができる。組成物は、例えば、癌の治療もしくは予防のため、ワクチンとして；インフルエンザ原因ウイルスに対して防御免疫を増強するため；アメーバ症原因生物に対する防御免疫を増強するため；赤痢アメーバに対する防御免疫を増強するため；インフルエンザに対する防御免疫を増強するため；またはアメーバ症に対する防御免疫を増強するために、使用することができる。組成物の投与経路は、経口、局所、非経口、舌下、口腔内、直腸内、膣内、静脈内、皮内、経皮、鼻腔内、粘膜内、または皮下であることができる。リポソームまたは組成物は、レチノイン酸コアジュバント（co-adjuvant）と共に投与することができる。対象は、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類であることができる。
本発明は、第１７の実施形態において、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、または第１４の実施形態のいずれか一つのリポソームまたは組成物を対象に鼻腔内投与することを含んでなる、対象において全身免疫応答および粘膜免疫応答を刺激する方法を提供する。粘膜免疫応答は、例えば、腸、糞便、または膣粘膜免疫応答を含んでなることができる。粘膜免疫応答は、例えば、鼻腔に対して遠位であることができる。リポソームまたは組成物は、レチノイン酸コアジュバント（co-adjuvant）と共に投与することができる。対象は、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類であることができる。
本発明は、第１８の実施形態において、ａ）非ＰＥＧ化中性脂質、ＰＥＧ化脂質、およびコレステロールを有機溶媒中で混合することと、ｂ）有機溶媒を蒸発させて脂質膜を得ることと、ｃ）緩衝液中で脂質膜を再水和させることと、工程ｃ）の再水和生成物を超音波処理、顕微溶液化、または押出することとを含んでなる、本明細書に記載のＰＥＧ化リポソームのいずれかを製造する方法を提供する。ステップａ）は、ＴＬＲアゴニストを混合する工程をさらに含んでなることができる。有機溶媒は、例えば、クロロホルムであることができる。工程（ｃ）の再水和生成物を、例えば、超音波処理し、次いで顕微溶液化することができる。方法は、薬剤をＰＥＧ化リポソームに混合することをさらに含んでなることができる。薬剤は、本明細書に記載の薬剤のいずれか一つであることができる。
本発明は、第１９の実施形態において、ＴＬＲアゴニスト、スクアレン、および不飽和ホスファチジルコリンを含んでなるスクアレンベースの水中油型エマルションを提供する。当該実施形態において、飽和リン脂質、例えばＤＭＰＣと比較して、不飽和ホスファチジルコリンを用いて製造したエマルションは、ＴＬＲアゴニストの回収率が高くなり、すなわち同じ初期濃度のＴＬＲアゴニストで開始した場合の最終製剤中のＴＬＲアゴニストの濃度が高くなった。
本発明は、第２０の実施形態において、スクアレンが約３０～約４０ｍｇ／ｍｌの濃度であり、不飽和ホスファチジルコリンが約５～約１０ｍｇ／ｍｌの濃度である、ＴＬＲアゴニスト、スクアレン、および不飽和ホスファチジルコリンを含んでなるスクアレンベースの水中油型エマルションを提供する。
本発明は、第２１の実施形態において、ＴＬＲアゴニスト、典型的には、ＴＬＲアゴニストを含んでなる水に不溶性（水中で無視できる溶解性）であるＴＬＲアゴニスト、スクアレン、および不飽和ホスファチジルコリン（例えば、卵ホスファチジルコリン）を含む製剤化のために最適化されたスクアレンベースの水中油型エマルションであって、スクアレンが約３４ｍｇ／ｍｌの濃度であり、不飽和ホスファチジルコリンが約７～８ｍｇ／ｍｌまたは約７．６ｍｇ／ｍｌの濃度である、前記スクアレンベースの水中油型エマルションを提供する。
本発明は、第２２の実施形態において、共乳化剤（co-emulsifying agent）、等張化剤、および緩衝剤をさらに含んでいてもよい、第１９、第２０、または第２１の実施形態のいずれか一つのエマルションを提供する。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、共乳化剤（co-emulsifying agent）は、例えば、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性直鎖状トリブロックコポリマーであることができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、等張化剤は、例えば、マンニトールまたはグリセロールなどのポリオールであることができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、緩衝剤は、例えば、リン酸緩衝剤、例えばリン酸アンモニウム緩衝液などであることができる。共乳化剤（co-emulsifying agent）は、エマルション中に存在する場合、好ましくは０．１～約２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．３６ｍｇ／ｍｌの濃度でエマルション中に存在する。等張化剤は、エマルション中に存在する場合、組成物が約２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２７０～３１５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有するようにするのに充分な量で存在する。
本発明は、第２３の実施形態において、ＴＬＲアゴニストが（ａ）合成物であり、（ｂ）水に不溶性であり、（ｃ）イミダゾキノリンもしくはイミダゾキノリン含有化合物であり、（ｄ）疎水性尾部を有し、（ｅ）３Ｍ－０５２、またはそれらの任意の組み合わせである、第１９、第２０、第２１、または第２２の実施形態のエマルションのいずれか一つを提供する。エマルションは、１以上の薬剤をさらに含んでなることができ、前記１以上の薬剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、または生物であることができる。例示的な薬剤には、例えば、アメーバ症関連抗原、ＬｅｃＡ、インフルエンザ関連抗原、Ｈ５Ｎ１、結核関連抗原、ＩＤ９１、ＩＤ９３、ＢＣＧ由来抗原、肝炎ウイルス関連抗原、Ｂ型肝炎抗原、Ｃ型肝炎抗原、ＨＩＶ関連抗原、または癌関連抗原が含まれる。
本発明は、第２４の実施形態において、ＴＬＲアゴニストと不飽和ホスファチジルコリンとを有機溶媒中で混合することを含んでなる、第１９、第２０、第２１、第２２、および第２３の実施形態のエマルションの製造方法を提供する。ＴＬＲアゴニストおよび不飽和ホスファチジルコリンの両方を可溶化することができる有機溶媒が使用に適しており、例えば、エタノール、ＤＭＦ、およびクロロホルムが挙げられる。当該方法は、（ａ）蒸発を含む任意の適当な方法によってクロロホルムを除去して脂質膜を得る工程、（ｂ）乾燥脂質膜にスクアレンを添加する工程、および（ｃ）例えば（例えば、６０℃の水浴中で）超音波処理、または顕微溶液化、または単純な攪拌により得られた混合物を混合する工程をさらに含んでなることができる。
本発明は、第２５の実施形態において、第１９、第２０、第２１、第２２、および第２３の実施形態のエマルションのいずれか一つおよび薬剤的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明は、第２６の実施形態において、第１９、第２０、第２１、第２２、および第２３の実施形態のエマルションのいずれか一つまたは第２５の実施形態の医薬組成物を対象に投与することを含んでなる、対象において免疫応答を刺激する方法を提供する。免疫応答は、例えば、Ｔｈ１免疫応答；非特異的免疫応答、抗原特異的免疫応答、全身免疫応答、粘膜免疫応答、または腸管、糞便、もしくは膣粘膜免疫応答であることができる。エマルションまたは組成物は、例えば、癌の治療もしくは予防のため、ワクチンとして；インフルエンザ原因ウイルスに対して防御免疫を増強するため；アメーバ症原因生物に対する防御免疫を増強するため；赤痢アメーバに対する防御免疫を増強するため；インフルエンザに対する防御免疫を増強するため；またはアメーバ症に対する防御免疫を増強するために、使用することができる。組成物の投与経路は、経口、局所、非経口、舌下、口腔内、直腸内、膣内、静脈内、皮内、経皮、鼻腔内、粘膜内、または皮下であることができる。リポソームまたは組成物は、レチノイン酸コアジュバント（co-adjuvant）と共に投与することができる。対象は、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類であることができる。
以下の実施例は、例示のために提供されるものであって、限定のために提供されるものではない。
実施例１：アメーバ症ワクチン用ＴＬＲリガンド含有リポソームの製剤化および試験
材料および方法
アジュバント、ＬｅｃＡ抗原を含む製剤
全てのアジュバントは、伝染病研究所（ワシントン州シアトルのＩＤＲＩ）で調製し、注射直前に抗原と混合するために２Ｘまたは５Ｘ濃縮製剤として与えた。
ＬｅｃＡ抗原を、TECHLAB（バージニア州ブラックスバーグ）によって、記載されているように製造した（Barroso L, Abhyankar M, Noor Z, Read K, Pedersen K, White R, et al.Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine.Vaccine.2014;32(10):1218-）。グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７５０］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０）、および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）を、Corden Pharma（スイスのリースタル）またはAvanti Polar Lipids（アラバマ州アラバスター）から入手した。３Ｍ－０５２は、3M Drug Delivery Systems（ミネソタ州セントポール）から無料提供された。コレステロールおよび緩衝塩は、J.T.Baker（カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入した。実施例で使用するＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ１３アルキルである式（ＶＩ）の構造を有する。
ＰＥＧ化リポソーム製剤は、クロロホルム中でＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０、またはＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ならびに３Ｍ－０５２および／またはＧＬＡを混合することによって製造した。脂質モル比は、９．８：５．７：０．８（ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ化脂質）であった。次いで、製剤から有機溶媒をロータリーエバポレーターを用いて１２時間以上蒸発させた。脂質薄膜を２５ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ約５．７）中で再水和させ、Crest Powersonic CP230D（ニュージャージー州トレントン）水浴中で約６０℃で最大３０分間超音波処理した。次いで、製剤を１０℃に設定した再循環水冷器で５～６回、１０，０００～３０，０００ｐｓｉで顕微溶液化した。リポソームを０．８／０．２μｍ二重膜ポリエーテルスルホンフィルターで濾過し、５℃、周囲温度、３７℃、または６０℃で保存した。顕微溶液化の代替は超音波処理である
基本的に記載されているように(Fox et al.Vaccine 2013, 31:5848) 、３０，０００ｐｓｉで顕微溶液化（M110P, Microfluidics Corp）により水中スクアレン型エマルションを調製した。ミョウバン吸着製剤は、ＧＬＡのＰＥＧ化脂質ベースの懸濁液の水性脂質成分またはＣｐＧ １８２６の水溶液をAlhydrogel（登録商標）（Brenntag Biosector）に混合することによって、以前に記載されているように( Fox et al.J Pharm Sci 2012, 101:4357 and Fox et al.）調製した。
物理化学的安定性測定
エマルションおよびリポソームの粒径は、水中で１：１００に希釈した後の動的光散乱によって測定した。抗原－アジュバント混合物の短時間（≦２４時間）の物理化学的適合性は、混合直後と、混合物を５℃および周囲温度で保存して混合後４時間および２４時間とに、粒径、外観、および抗原の一次構造をモニタリングすることによって評価した。抗原を最初に生理食塩水中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、続いてリポソームアジュバント製剤と１：１容量で混合した。３つのキュベットの代わりに１つのキュベットを準備したことを除いて、上記のように粒径を測定した。５０μＬのサンプルを５０μＬの４倍還元サンプル緩衝液および１００μＬの２０％ＳＤＳと混合することにより、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。サンプルを９０℃で５分間加熱し、－２０℃で保存した後、９０℃で１分間再加熱し、トリス－グリシンランニングバッファーを含むポリアクリルアミドゲルに１８０Ｖで６５ｍロードし、続いてクーマシーブルーで染色した。
ＨＰＬＣ法を用いて、３Ｍ－０５２の濃度を３２０ｎｍでのＵＶ吸光度の検出によって測定し、ＧＬＡの濃度を帯電エアロゾル検出によって測定した。ＨＰＬＣ法は以前に記載されている（Misquith A, Fung M, Dowling QM, Guderian JA, Vedvick TS, Fox CB.In vitro evaluation of TLR4 agonist activity: formulation effects.Coll Surf B: Biointerfaces.2014; 1 13 :312-9）。測定値が目標濃度の±２０％以内であれば、アジュバント濃度を規定内と見なした。リポソーム粒径およびサイズ多分散性を、Malvern Instruments（イギリスのウスターシャー州）Zetasizer Nano-Sまたは-ZSを用いて評価した。１．５ｍｌポリスチレン使い捨てキュベット中で超純（１８．２ＭΩ）水で製剤を１００倍希釈した。各製剤について、３つの別々のキュベットを準備した。次いで、各キュベットにつき全てのサイズ測定を３回行った。まれに、塵粒により明らかな測定偏差が生じ、このような場合、疑わしいキュベットからの測定値はセットから捨てる。ＴＬＲリガンド濃度、粒径、および外観を指示どおりに定期的にモニタリングした。
免疫化
４～６週齢のＣＢＡ／Ｊ雄マウスをJackson Labsから購入した。非タグ化ＬｅｃＡ抗原をTechLab Inc.（バージニア州ブラックスバーグ）で精製し、マウスあたり免疫化につき５μｇの抗原を使用した。全てのマウス研究を、ＩＡＣＵＣの規制に厳密に従って実施した。頚部領域の皮下免疫化では、ＬｅｃＡをそれぞれのアジュバント（表１）と混合し、体積を注射用生理食塩水で１００μｌにした。鼻腔内免疫化を麻酔下で実施し、典型的には、鼻孔あたり１０μｌの抗原－アジュバント混合物を使用した。全てのレジメンについて連続した免疫化の間に、２週間の間隔を維持した。オールトランスレチノイン酸（ＲＡ）の毎週の投与を伴う実験では、各マウスは、５０μｌの最終体積のＤＭＳＯに溶解した１５０μｇのオールトランスレチノイン酸（Sigma）を腹腔内に受けた。ＲＡストックは－８０℃で保存し、光から保護した。全てのアジュバントを４℃で保存し、製剤を免疫化の直前に無菌的に調製した。
免疫原性の測定
ウェルあたり０．５μｇのレクチンでコーティングした９６ウェルプレートを用いてＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定した。血漿サンプルを適当に希釈し、抗原特異的ＩｇＧ亜型を、１：１０，０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ検出抗体（Southern Biotechnology）を用いて測定した。糞便の上清を記載されているように調製した（Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al）。Protection against intestinal amebiasis by a recombinant vaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon.Infect Immun.2009 Sep;77(9):3909-18）。簡単にいえば、新たに採取した糞便サンプルを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含有するＰＢＳ中に再懸濁し（便１ｍｇあたり５μｌ希釈液）、５分間激しく混合した。不溶性物質を、３０００ｒｐｍおよび１２，０００ｒｐｍで２つの連続回転によって除去し、上清を－２０℃で保存した。適当に希釈した糞便の上清をＥＬＩＳＡに使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＡを１：５０００希釈で二次抗体として使用した。標準曲線を用いて抗体単位を求めた。
細胞外サイトカインの測定では、脾細胞を５０μｇ／ｍｌのＬｅｃＡで７２時間再刺激し、上清をLuminexビーズ（BioRad）を用いるマルチサスペンションアレイシステム（multiplex suspension array system）により分析した（Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al.Protection against intestinal amebiasis by a recombinant vaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon.Infect Immun.2009 Sep;77(9):3909-18）。サンプルを製造者の指示に従って希釈せずに試験し、上清１ミリリットルあたりのピコグラムで測定した。
培養条件およびチャレンジ実験
マウスの盲腸を連続して通過させた、元々ＨＭ１に由来する栄養体：ＩＭＳＳ（ATCC）を、チャレンジ実験に使用した。２％Diamondビタミン、１３％熱不活性化ウシ血清（Gemini Labs）、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンプラス１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したトリプシン－酵母抽出物－鉄（ＴＹＩ－Ｓ－３３）培地中で栄養体を維持した（Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC.A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.Trans R Soc Trop Med Hyg.1978;72(4):431-2）。免疫化群および対照群からのマウスに、最後の追加免疫の４週間後、１５０μｌの培地中２００万個の栄養体を開腹後盲腸内に（intracecaily）チャレンジした（Houpt E, Barroso L, Lockhart L, Wright R, Cramer C, Lyerly D, et al.Prevention of intestinal amebiasis by vaccination with the Entamoeba histolytica Gal/GaiNac lectin.Vaccine.2004 Jan 26;22(5-6):611-7）。チャレンジの１週間後にマウスを安楽死させた。盲腸を１ｍｌ ＰＢＳですすぎ、３００μｌの盲腸洗浄液をＴＹＩ－Ｓ－３３ブロス中で最高５日間培養し、２００μｌを抗原負荷ＥＬＢＡに使用した。ワクチン有効性は１００×（１－（感染したワクチン接種したマウスの％）／（感染したニセマウス（sham mice）の％）として計算した（Guo X, Barroso L, Becker SM, Lyerly DM, Vedvick TS, Reed SG, et al.Protection against intestinal amebiasis by a recombinant vaccine is transferable by T cells and mediated by gamma interferon.Infect Immun.2009 Sep,77(9):39Q9-18; Soong CJ, Kain KC, Abd-Aila M, Jackson TF, Ravdin JI.A recombinant cysteine-rich section of the Entamoeba histolytica galactose-inhibitable lectin is efficacious as a subunit vaccine in the gerbii model of amebic liver abscess.J Infect Dis.1995 Mar; 171(3):645-51）。糞便抗原検出
盲腸内容物中の糞便抗原を、E. his IIELISAキット（バージニア州ブラックスバーグのTechLab Inc.）を用いて検出した。陰性対照よりも≧０，０５の４５０ｎｍでの光学密度を陽性と見なした。精製したＬｅｃＡを用いて標準曲線を作成した。
付着アッセイ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をα－ＭＥＭ培地で増殖させ、赤痢アメーバ栄養体を上記のように増殖させた。赤痢アメーバ栄養体を対照群または免疫化群からの糞便上清の１０倍希釈物で氷上で１時間プレインキュベートした。次いで、栄養体およびＣＨＯ細胞を１：２０の比で混合し、丸底ポリスチレンチューブ中で氷上で９０分間インキュベーションを続けた。顕微鏡での計数の直前に、チューブを短時間ボルテックスし、細胞を血球計数器で計数した。付着は、３個以上の付着性ＣＨＯ細胞を有する栄養体の数として測定し、ロゼット形成の％として報告した。各サンプルを３回試験し、最小１００個のアメーバを計数した（Barroso L, Abhyankar M, Noor Z, Read K, Pedersen K, White R, et al.Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine.Vaccine.2014 Feb 26;32(10): 1218-24; Ravdin JI, Guerrant RL.Role of adherence in cytopathogenic mechanisms of Entamoeba histolytica.Study with mammalian tissue culture cells and human erythrocytes.J Clin Invest.1981 Nov;68(5): 1305-13）。
統計分析
全ての分析は、Graph Pad Prismソフトウェアを用いて行った。チャレンジ試験からの感染マウスおよび非感染マウスの割合をフィッシャーの正確検定を用いて分析した。抗原負荷、抗体力価、および付着阻害の差異をマン・ホイットニー検定を用いて分析した。
結果
生理化学的安定性
リポソームの安定性は、動的光散乱（粒径およびサイズ多分散性）、外観、ならびにＨＰＬＣ（ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２濃度）によってモニタリングした。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むリポソームの多分散性値は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０を含むリポソームの多分散性値よりも有意に高かったが、粒径およびサイズ多分散性値は、５℃で１２ヶ月にわたってほとんどまたは全く変化を示さなかった（図１Ａ）。リポソームの外観は、常に半透明で均一であり、経時的に変化しなかった。３７℃で保存した場合、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むリポソームは、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０を含むリポソームと比較して、粒径およびサイズ多分散性のより大きな経時的な変化を示した（図１Ｃ～１Ｄ）。ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２の濃度は、５℃で保存したサンプルで１２ヶ月にわたって変化しなかった。３７℃では、ＧＬＡ喪失率は３Ｍ－０５２の喪失率よりも高く、＞４０％のＧＬＡ喪失は６ヶ月後であったが、３Ｍ－０５２では検出可能な喪失は生じなかった。
混合後のアジュバントとＬｅｃＡ抗原の短期間（≦２４時間）の適合性を評価するために、ストック抗原を生理食塩水で希釈し、次にアジュバントと１：１の体積比で混合し、下記の生体内免疫試験のための計画された混合手順を模倣した。製剤は、抗原と混合する前後で、半透明で均一な外観を有していた。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むリポソームは、より短いＰＥＧ長（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０）を含むリポソームと比較して、わずかに高いサイズ増加傾向を示したが、全体的に見て、５℃または周囲温度で保存した場合、抗原と混合した後２４時間にわたって、粒径の変化は、ほとんどなかったか（＜１５％）、または全くなかった。全体的に見て、ＧＬＡ、３Ｍ－０５２、または両方のアゴニストの存在は、粒径適合性の結果に影響を与えないようであった。同様に、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ７５０を含むリポソームと比較して、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を含むリポソームでは多分散性がより高かったが、サイズ多分散性値はほとんど変化しなかった。抗原－アジュバント混合物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、リポソーム組成にかかわらず、任意の時点または２４時間にわたる保存条件で抗原一次構造の変化を示さず、予想されるＭＷ近くに均一な単一バンドがあった。まとめると、これらのデータは、抗原－アジュバント混合物が、５℃または周囲温度で少なくとも２４時間まで、許容可能な短期間の適合性を示したことを示す。
免疫原性の評価およびリポソーム製剤の選択
赤痢アメーバ組み換えアドヘシンＬｅｃＡを免疫原として使用して、バランスのとれた免疫応答を生じ得るアジュバントをスクリーニングした。合成ＴＬＲアゴニストを含むアジュバントを表２に示すように調製し、抗原特異的体液性応答を生じさせるそれらの能力を評価した。
表２：ＴＬＲアゴニストを含むアジュバント
Figure 0007195147000021
これらのアジュバントの各々は、薬剤的に許容できる成分からなり、臨床試験に適し得る。エマルションおよびリポソーム製剤は、組成および処理方法に依存して、６５～１３０ｎｍの平均粒径を示したが、ミョウバン含有製剤は微粒子を含んでいた。アジュバントを精製した非タグ化ＬｅｃＡタンパク質と混合することによって９種の製剤を調製し、マウスを皮下で免疫した。１群あたり５匹のマウスを、対応するアジュバントと混合したＬｅｃＡ抗原で２週間間隔で３回皮下で免疫した。最後の免疫化の１週間後に採取した血漿サンプルを２５６，０００倍希釈し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生について分析した。ＧＬＡ ３Ｍ－０５２－リポソームアジュバント添加ＬｅｃＡによって誘発された＊ＩｇＧ２ａレベルは、ＥＭ０１４（ＧＬＡ－ＣｐＧ－ＳＥ）および３Ｍ－０５２－エマルションを除く他の全ての群と比較して統計学的に有意であった。血漿ＩｇＧサブクラスの力価をＥＬＩＳＡによって測定した（図２）。図２は、（ＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳと表される）ＧＬＡ（ＴＬＲ－４アゴニスト）および３Ｍ－０５２（ＴＬＲ－７／８アゴニスト）の混合物を含有するリポソーム製剤が、バランスのとれたＩｇＧ応答を示し、さらなる研究のために選択されたことを示す。
次に、細胞性免疫応答を示す抗原特異的サイトカイン産生を誘発するＧＬＡ－３Ｍ－０５２－ＬＳの能力を調べた。脾細胞をインビトロでＬｅｃＡで再刺激し、培養上清を分析した。ＬｅｃＡを含むアジュバント添加ＧＬＡ ３Ｍ－０５２リポソームは、マウスモデルにおいて防御のマーカーである強いＩＦＮ－γ応答およびＩＬ－１７応答を誘発した（図３Ａ～３Ｄ）。具体的には、マウスを３回目の免疫化の１週間後に安楽死させ、脾臓細胞をＬｅｃＡで７２時間再刺激した。細胞外ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２、およびＩＬ－４の産生は、Luminexにより培養上清中で検出し、ｐｇ／ｍｌとして表した。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．００１。
さらに、ＧＬＡ ３Ｍ－０５２リポソームアジュバント添加ＬｅｃＡ群由来のＰＢＭＣのみが、中等度であるが統計学的に有意な細胞内ＩＦＮ－γ染色を示した。
コアジュバント（co-adjuvant）としてのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）の適合性も試験した。各群のマウスは、ＲＡの週１回の注射を受けた。ＲＡ補助レジメンは、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７のレベルをさらに増加させた（同様に図３Ａ～３Ｄ）。（アジュバント＋ＬｅｃＡ）群および（アジュバント＋ＬｅｃＡ＋ＲＡ）群の両方が同等のＩＬ－２応答を生じ、一方、ＲＡ補助レジメンはＩＬ－４応答をわずかに高くした。
リポソームをベースとするワクチンもまた粘膜免疫化に適しているので、抗原特異的腸ＩｇＡ応答を生成するその能力を試験するために、混合粘膜／非経口免疫レジメンを次の実験に使用した。
粘膜ＩｇＡ応答およびその付着阻害能
マウスは、鼻腔内免疫化で初回刺激を受け、続いて皮下および鼻腔内で追加免疫された。ＲＡ補助群のマウスは、ＲＡの週１回の注射を受けた。図４Ａに示すように、アジュバント添加ＬｅｃＡは、抗原特異的であるロバストな粘膜ＩｇＡ応答を生じた。ＲＡが含まれていることは、ＩｇＡ力価の増加に貢献した。赤痢アメーバ栄養体の標的細胞への付着は、感染の始まりにおける初期段階であり、重要な段階である。
粘膜ＩｇＡが実際に防御的であるかどうかを評価するために、インビトロでＣＨＯ細胞への寄生生物の付着をブロックするその能力を試験した。免疫されたマウスからの糞便上清との栄養体のプレインキュベーションは、栄養体の付着能を有意に低下させた（図４Ｂ）。（アジュバント＋ＬｅｃＡ）または（アジュバント＋ＬｅｃＡ＋ＲＡ）レジメンからの糞便懸濁液は、同等な付着阻害能力を示した。したがって、アジュバント添加ＬｅｃＡは、インビトロで防御的である高い力価の腸ＩｇＡ応答を誘発した。
相乗的ＴＬＲアゴニストを含有するナノリポソーム製剤は、腸内寄生生物チャレンジに対する防御能を有する
腸アメーバ症のマウスモデルを用いて、赤痢アメーバチャレンジに対して防御するＧＬＡ ３Ｍ－０５２リポソームアジュバントの能力を試験した。対照群および実験免疫化群からのマウスに、赤痢アメーバの毒性株を盲腸内でチャレンジし、抗原負荷（図５Ａ）および生存寄生生物の存在（図５Ｂ）を評価するためにチャレンジの１週間後に盲腸を採取した。アジュバント添加ＬｅｃＡは、対照マウスと比較して抗原負荷を有意に減少させ、この減少はコアジュバント（co-adjuvant）としてのＲＡの使用でさらに顕著であった。現在のレジメンでのアジュバントは、中等度の３４％の有効性を示した。しかし、レジメンにＲＡが含まれていることは、有効性を６９．２％に実質的に改善した（表３）。ワクチン有効性を計算するために使用した式は以下であった。
有効性＝１００×（１－（感染したワクチン接種したマウスの％）／（感染を有するニセマウス（sham mice）の％）
アジュバント＋ＬｅｃＡ群の有効性＝１００×（１－４６／６９．２）＝１００×（１－０．６６）＝３４％
表３：ワクチン有効性
Figure 0007195147000022
これらのデータは、合成相乗的ＴＬＲアゴニストの混合物を含有するナノリポソーム製剤が、抗原特異的防御応答を生じる能力を有し、微量栄養素補助免疫化と適合性であることを支持する。
ＰＥＧ長の効果
図６～７は、ＰＥＧ７５０と比較してより高い応答がＰＥＧ２０００製剤で観察されたことを示す。図６は、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２ ＰＥＧ２０００＋ＬｅｃＡ群のバランスのとれたＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１力価を示し、また、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２ ＰＥＧ７５０＋ＬｅｃＡ群と比較して、この群についてより高い力価があったことを示す。図７において、糞便粘膜ＩｇＡ応答に対するＰＥＧ長の効果を調べた。図７は、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２ ＰＥＧ２０００＋ＬｅｃＡ群の糞便ＩｇＡ応答が、ＧＬＡ－３Ｍ－０５２ ＰＥＧ７５０＋ＬｅｃＡ群よりも大きかったことを示す。したがって、リポソーム中のＰＥＧ長の増加は、粘膜ＩｇＡ応答を増強した。
送達経路の効果
免疫化のための送達経路が免疫応答に影響を及ぼすかどうかを調べた。図８Ａ～Ｂは、免疫化に対する送達経路の効果を示し、ＩＮ（鼻腔内）だけのレジメンは、最も高いＩｇＧ２ａおよびＩｇＡ力価をもたらす。リポソーム＋アジュバントは、ロバストな粘膜および全身のＴｈ１免疫応答、腸抗ＬｅｃＡ ＩｇＡを生じた（図１６Ｂ）。
図９Ａ～図９Ｂは、送達経路をさらに示す。鼻腔内だけのレジメンは、他のレジメンと比較して同等またはそれ以上のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７を生じた。ＬｅｃＡ＋リポソーム＋アジュバントの粘膜のみのレジメンは、ロバストな粘膜および全身のＴｈ１免疫応答、ＩＦＮ－γを産生した（９Ａ－Ｂ、表４）。鼻腔内送達がＩｇＡ（全身応答）応答を生じることは予想されなかった。これは、ＬｅｃＡを含むリポソーム中に製剤化したＧＬＡおよび３Ｍ－０５２の粘膜送達が全身免疫を生じさせたことを示す。これらの結果は、組成物の非粘膜投与がＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比によって証明される、ロバストな全身免疫応答を生じることを実証する。驚くべきことに、組成物を粘膜表面に鼻腔内投与すると、鼻孔内の粘膜応答だけでなく、遠位の腸（糞便）粘膜応答も局所的に生じる。
表４：ＬｅｃＡ＋リポソーム＋アジュバントの鼻腔内のみのレジメンは、ロバストな粘膜および全身のＴｈ１免疫応答を生じた
Figure 0007195147000023
結果の議論
本研究の重要な成果は、全身免疫応答および粘膜免疫応答を誘発することができる、合成ＴＬＲアゴニストを含有するナノリポソームアジュバントの同定であった。ＴＬＲ４（ＧＬＡ）およびＴＬＲ７／８（３Ｍ－０５２）アゴニストを含むリポソームベースのアジュバント系は、バランスのとれた体液性応答および強力なサイトカイン応答を生じた。ＧＬＡは、様々な第１相および第２相の臨床試験に用いられる脂質ベースのプラットフォームで製剤化される合成ＴＬＲ４リガンドである。３Ｍ－０５２は、先進的な前臨床開発における合成ＴＬＲ７／８リガンドである（Fox et al.Immunopotentiators in Modern Vaccines, 2nd ed, in press; Smirnov et al.Vaccine 2011, 29:5434; Zhao et al.J Immunother Cancer 2014, 2:12; Singh et al.J Immunol 2014, 193:4722）。ＧＬＡおよび３Ｍ－０５２のリポソーム製剤は、混合粘膜／非経口免疫化レジメンに適しており、強い粘膜ＩｇＡ応答も誘発した。赤痢アメーバでチャレンジした免疫化マウスは、抗原負荷の実質的な低下を示した。ＧＬＡ ３Ｍ－０５２ナノリポソーム製剤は、コアジュバント（co-adjuvant）としてのオールトランスレチノイン酸の使用に適合し、このようなレジメンは、防御の有効性および粘膜ＩｇＡレベルをさらに増加させた。
実施例２：インフルエンザワクチン用３Ｍ－０５２アジュバントの製剤化および試験
材料および方法
材料の製剤化および製造
３Ｍ－０５２は、3M Companyによって社内で合成された。Ｒ８４８は、3Mによって供給されたか、またはAxxora Life Sciences Inc. （カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。合成１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ラク－グリセロール）（ＤＰＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７５０］（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０）、および卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）をAvanti Polar Lipids Inc（アラバマ州アラバスター）またはLipoid LLC（ニュージャージー州ニューアーク）から購入した。スクアレンをSigma（ミズーリ州セントルイス）から入手した。コレステロール、第一リン酸アンモニウム、および第二リン酸アンモニウムをJ.T.Baker（カリフォルニア州サンフランシスコ）から購入した。ポロキサマー１８８およびグリセロールをSpectrum Chemical（カリフォルニア州ガーデナ）から購入した。ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水１×（ＰＢＳ）をInvitrogen（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。
ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０を、有機溶媒（クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール／水混合物）中で様々な量の３Ｍ－０５２と混合することによって、小バッチ（≦２０ｍＬ）のＰＥＧ化リポソーム製剤を製造した。次に、Genevac EZ-2を用いて有機溶媒を蒸発させた。脂質膜をＰＢＳ（ｐＨ７．２）または２５ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．７）に再水和させ、Crest powersonic CP230D（ニュージャージー州トレントン）超音波処理水浴中で約６０℃で約２～３時間、または製剤が半透明で、大きな目に見える粒子がなくなるまで、超音波処理した。中性リポソーム（ＤＯＰＣ、コレステロール）、アニオン性リポソーム（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＰＰＧ）、およびカチオン性リポソーム（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＰＴＡＰ）についても同様の手順に従った。リポソーム成分の重量比は以下の通りであった：ＰＥＧ化（１８：５．５：３，ＤＰＰＣ：ｃｈｏｉ：ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０），中性（２０：５，ＤＯＰＣ：ｃｈｏｌ），アニオン性（１８：５：２，ＤＰＰＣ：ｃｈｏｌ：ＤＰＰＧ），カチオン性（１８：５：２，ＤＰＰＣ：ｃｈｏｌ：ＤＰＴＡＰ）。より大きなバッチ（１００ｍＬ）のＰＥＧ化リポソームは、上記のようではあるが、超音波処理時間を短時間にし、続いて３０，０００ｐｓｉで１２回連続通過の高せん断ホモジナイズ（Microfluidizer Ml 10P）で製造した。
Ｒ８４８を含有するリポソームは、リポソームを最初に７５ｍＭ硫酸アンモニウム溶液で水和させたことを除いて、上記のように濃縮ＰＥＧ化リポソーム組成物を製造することによって調製した。６０℃約１時間の超音波処理後、ＰＤ－１０カラム（GE Healthcare）を用いて、リポソームの外部緩衝液を０．９％生理食塩水に交換した。リポソームは、この時点で外部緩衝液中に生理食塩水を含み、内部に硫酸アンモニウムを含み、当該リポソームを、Ｒ８４８を含有する生理食塩水と混合し、６０℃で１時間インキュベートした。最後に、リポソームを別のＰＤ－１０カラムに通して、カプセル化されていないＲ８４８を除去した。
水中油型安定エマルション（ＳＥ）は、ＤＭＰＣまたは卵ＰＣを含むクロロホルムに３Ｍ－０５２を溶解することによって製造した。次にロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去した。次いで、乾燥した脂質膜にスクアレンを添加し、ガラス容器を６０℃の超音波処理水浴中に約１時間置いた。この混合物を油相と呼ぶ。あるいは、３Ｍ－０５２を（卵ＰＣまたはクロロホルムを含まない）スクアレンおよびＤＭＰＣに直接分散させることによって油相を調製した。次いで、２５ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液、０．０３７％（ｗ／ｗ）ポロキサマー１８８、および１．８％（ｖ／ｖ）グリセロール（等張剤）、４％ｖ／ｖスクアレン、７．６ｍｇ／ｍｌ ＤＭＰＣまたは卵ＰＣ、および様々な量の３Ｍ－０５２の最終濃度を得るために、水相を油相に添加した。いくつかのエマルションは０．０２％ｖ／ｖのα－トコフェロールも含有していた。混合物を６０℃の水浴中でさらに１０～１５分間超音波処理することにより、粗製エマルションを作製した。高せん断ホモジナイザー（Microfluidizer M110P）を介して３０，０００ｐｓｉでの約１２回連続通過で粗製エマルションを処理することにより、最終エマルションを調製した。
上記のように濃縮エマルションを製造し、乾燥粉末Ｒ８４８またはリン酸アンモニウム緩衝液中のＲ８４８の溶液と混合することにより、Ｒ８４８を用いてエマルションを調製した。下記のインビボ実験の前に、エマルションおよびリポソームを０．２μｍ膜を通して濾過した。
製剤キャラクタリゼーション
３Ｍ－０５２およびＲ８４８の濃度は、最初にキュベット中で９８％エタノール／２％ＨＣｌ溶液に各製剤を２０倍に希釈することによって評価した。サンプルを約３２２ｎｍの吸光度についてHitachi U-3900H分光器（日本の東京）で分析した。粒径を、Malvern Instruments（イギリスのウスターシャー州）Zetasizer Nano-S、-ZS、または-APSを用いて評価した。１．５ｍｌポリスチレン使い捨てキュベット中で超純水に製剤を１００倍希釈した。各製剤について、３つの別々のキュベットを準備した。次いで、各キュベットにつき全てのサイズ測定を３回行った。ゼータ電位はMalvern Zetasizer Nano-ZSを用いて測定した。各製剤について、５０μｌを使い捨てキャピラリーセル（Malvern Instruments, DTS1070）で９５０μｌの超純水と混合した。各調製したサンプル（製剤あたり１つのサンプル）から９回の測定値を収集した。
ウイルスストックおよびワクチン
本研究で使用したワクチン抗原は、全てＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（ＶＮ１２０３）インフルエンザウイルス由来であった。マウス免疫原性およびチャレンジ研究に用いた組み換えＨＡタンパク質（ｒＨＡ）は、Protein Sciences Corpから入手した。フェレット免疫化およびチャレンジ研究では、臨床グレードのスプリットＶＮ１２０３ワクチンをSanofi Pasteurから入手した。
示されている通りにＨ５Ｎ１株を１０日齢の孵化鶏卵に接種することにより、マウスおよびフェレットチャレンジ研究のためのウイルスストックを得た。清澄化した尿膜腔液を濾過し、使用するまで－８０℃で保存した。ウイルス力価は、標準的なアッセイを使用した記載の通りのＭＤＣＫ細胞（ATCC #CCL-34）上のプラークアッセイによって求めた。
フェレット全血刺激アッセイ
雄のケナガイタチフェレット（Fitch ferret）から採取した全血を採取し、イミキモド（ＴＬＲ７）、ＴＬＲ７／８アゴニストＣＬ０５７（Invivogen）、および合成ＴＬＲ４アゴニストＧＬＡを含むＴＬＲアゴニスト化合物と共にインキュベートした。インキュベーション後、ＲＮＡ全血抽出キット（Qiagen）を用いて、刺激した対照および生理食塩水対照の両方からＲＮＡを回収した。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＩＬ－１β、およびＩＬ－８についてのＲＮＡのレベルを、リアルタイムＰＣＲによって測定した。発現レベルの変化は、生理食塩水で刺激した血液サンプルに対するＲＮＡレベルの倍数変化としてグラフ化した。
マウスのチャレンジ研究
マウスチャレンジ研究では、６～８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群を、示されているようにアジュバントと組み合わされた組み換えＨ５Ｎ１ ＨＡタンパク質（ＶＮ１２０３株，Protein Sciences Corp.）で免疫した。全ての免疫化は、両肢間で均等な総容量１００μＬのスプリットでの筋肉内経路によるものであった。免疫化の２１日後、１×１０６ＰＦＵのＡ／ＶＮ／１２０３／０５（Ｈ５Ｎ１ Ｃｌａｄｅ １）をマウスにチャレンジした。チャレンジ後１日目から、全ての動物を体重減少についてモニタリングし、重症感染症の徴候を観察した。０日目の体重の＞２５％を失ったことが分かった動物は、安楽死させた。
フェレットのチャレンジ研究
全ての免疫化およびチャレンジ研究のために、雄のケナガイタチフェレット（Fitch ferret）（Mustela putoris fero, Triple F Farms, Sayre PA）を使用した。フェレットの免疫化は、四頭筋に２５０μＬを注射することにより行った。全ての動物は、全米パンデミック備蓄（national pandemic stockpile）から供給された０．５μｇのスプリットＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ Ｈ５Ｎ１ワクチン（Sanofi Pasteur）を受けた。抗体力価を測定するための血清サンプルを、免疫化の２１日後に採取した。
チャレンジは、１×１０５～５×１０５ＰＦＵのウイルスを５０μＬ（２５μＬ／ｎａｒｅ）の容量で肺に滴下することによって開始した。感染後、動物を観察し、毎日秤量してウイルス誘発罹患をモニタリングした。チャレンジ前の体重の２５％を失っている動物は、全て安楽死させた。
プラークアッセイ
ウイルス力価は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞におけるプラークアッセイによって得られた。簡単に述べると、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中１×１０６細胞／ウェルで、６ウェルディッシュに、アッセイ開始の２４時間前に、細胞を播種した。アッセイ開始時に、コンフルエントなＭＤＣＫ単層をＤＭＥＭで３回洗浄してＦＢＳを除去した。連続希釈した鼻洗浄液サンプルを１００μＬ容量で単層に加え、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、１×Ｌ－１５培地（Lonza）中の０．８％アガロース（SeaKem）２ｍＬで単層を覆った。４８～７２時間のインキュベーション後、クリスタルバイオレット（BD）染色後にプラークを定量した。
赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ
赤血球凝集素阻害アッセイは、ＷＨＯプロトコルに従って実施した。（５２）ホルマリン不活性化Ｈ５Ｎ１抗原は、国立生物学的製剤研究所（National Institute for Biological Standards and Control）（ＮＩＢＳＣ）から入手した。全ての細胞を、洗浄した１％ウマ赤血球（ＲＢＣ）（Lampire）を用いてアッセイした。
マイクロ中和アッセイ
中和抗体力価は、偽型レンチウイルス粒子を用いて測定した。簡単に述べると、Ｈ５Ｎ１およびＨＡを発現するプラスミドならびに３つのレンチウイルスパッケージングプラスミド；ウイルス粒子にパッケージングされ、ＣＭＶ直前のプロモーターの制御下でルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするｐＤＲ８．７４（５５）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、およびＨＲ’－ＣＭＶ－Ｌｕｃを２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることによって、偽型粒子を得る。ダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中５×１０３個のＭＤＣＫ細胞／ウェルで２４時間前に播種した黒色平底９６ウェルプレート（Corning）でウイルスストックの力価を測定した。ウイルス力価測定の前に、細胞を２００μＬのＤＭＥＭで３回洗浄してＤＭＥＭを除去し、連続希釈したウイルスストックで覆った。導入遺伝子の発現を可能にするための７２時間のインキュベーション後、形質導入細胞中のルシフェラーゼのレベルを、BrightGloルシフェラーゼ（Promega）を用いて製造業者の指示に従って測定した。
中和分析のために、連続希釈した免疫後血清を１×１０４の相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を含む希釈ウイルスストックと１：１の比で混合した。ウイルス血清混合物を３７℃で１時間インキュベートし、上記のように洗浄したＭＤＣＫ細胞を含むプレートに添加した。全ての形質導入細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルの評価後、中和力価を測定した。ＩＣ９０抗体力価は、ベクター形質導入対照細胞と比較してルシフェラーゼレベルを１０倍低下させることが観察された血清の最大希釈として定義される。
ＨＡアレイ
インフルエンザＨＡタンパク質を含むＨＡアレイは、これまでに記載されている（５６）。本研究で使用したアレイは、第２世代であり、様々なインフルエンザ株（Sinobiological）由来の２７８のＨＡタンパク質を含む。ワクチン接種後の免疫分析のために、アレイを最初にＰＢＳ＋１％ウシ胎仔血清＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０でブロックし、Protein Array Wash Buffer（ArrayIt）で３回洗浄し、３００μＬの１：１００希釈の免疫後マウス血清で振とうしながら１時間インキュベートした。一次インキュベーション後、アレイを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ＩｇＧ２ｃ（Jackson Immunoresearch, Part #: 115-495-208）およびＩｇＧ１（Life Technologies, Part#: A21123）のフルオロフォア結合二次抗体と１：２０００希釈でインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーション後、アレイをRinse Buffer（Arrayit）ですすぎ、Molecular Dynamics 400Bアレイスキャナーを用いて分析した。取得後の分析は、Tableauデータ分析ソフトウェアを使用して行った。
ＥＬＩＳＡ
免疫化の７日後および２１日後に、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ｃのＨＡ特異的エンドポイント力価を測定した。高結合ポリスチレン３８４ウェルプレートを、室温で２．５時間、０．１Ｍ重炭酸塩コーティング緩衝液中の組み換えＶＮ１２０３ ＨＡ（Protein Sciences Corp.）（２μｇ／ｍｌ）でコーティングした。室温で０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡで２時間ブロッキングインキュベーションを行う前後に、プレートを０．１％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。マウス血清を、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０＋０．１％ＢＳＡ中で、Nanonscreen NSX-1536を用いて連続希釈し、４℃で一晩インキュベートし、５回洗浄した。プレートを、抗マウスＩｇＧＴ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２ｃ－ＨＲＰ（Southern Biotechnologies）で振とう機上で１時間インキュベートした。５回の洗浄後、SureBlueテトラメチルベンジジン基質（Kirkegaard & Perry Laboratories）を用いてNanoscreenロボット上にプレートを展開した。Multipette Sagianロボットを用いて、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で酵素反応を停止させた。Synergy ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Biotek）およびGen5ソフトウェアを用いて４５０～５７０ｎｍでプレートを読み取った。
細胞内サイトカイン染色
ワクチン特異的Ｔ細胞応答を定量するために、脾細胞をワクチン接種後群あたり５匹のマウスから単離した。赤血球をRed Blood Cell Lysis Buffer（eBioscience）を用いて溶解し、ｃＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＢＳ，１％ペニシリン／ストレプトマイシン；０．１％２－メルカプトエタノール）に再懸濁した。細胞を９６ウェルプレートに１０７細胞／ウェルで播種し、３７℃で培地またはｒＨＡ抗原（１０μｇ／ｍＬ）で２時間刺激した。１：５０GolgiPlug（BD Biosciences）を添加し、細胞を３７℃でさらに８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＤ４（クローンＲＭ４－５）、ＣＤ８（クローン５３－６．７）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７）、およびＢ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）（BioLegendおよびeBioscience）に対する１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中の蛍光色素標識抗体で、抗ＣＤ１６／３２（クローン９３）の存在下で、室温で暗所で１５分間、細胞表面を染色した。細胞を固定し、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）を用いて暗所で室温で３０分間透過処理した。細胞を
Perm/Wash（BD Biosciences）で洗浄し、以下のような細胞内サイトカインを検出するために、蛍光色素標識抗体で染色した：ＩＦＮ－γ（クローンＸＭＧ－１．２）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、ＴＮＦ（ＭＰ６－ＸＴ２２）、ＩＬ－５（クローン：ＴＲＦＫ５）、およびＩＬ－１０（クローン：ＪＥＳ５－１６Ｅ３）（BioLegendおよびeBioscience）。染色を暗所で室温で１５分間実施した。細胞を洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、３０～４０μｍのＰＰ／ＰＥ ９６フィルタープレート（Pall Corp）を用いて濾過した。４つのレーザーLSR Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences）で最大１０６のイベントを収集した。データをFlowJo（Treestar）で分析した。
結果
アニオン性、カチオン性、またはＰＥＧ化リン脂質で修飾されたＤＰＰＣベースのリポソーム、および中性ＤＯＰＣベースのリポソームは、薄膜技術およびその後の超音波処理によって製造した。リポソームは、種々のリポソーム組成物との非適合性の傾向を強調するために、１ｍｇ／ｍｌの高濃度３Ｍ－０５２で製造した。各リポソームについて２つの別々のバッチの後、ＰＥＧ化リポソームおよびＤＯＰＣリポソームは、超音波処理後、半透明の外観ならびに最小の粒径および多分散性を示した（表５）。
表５：３Ｍ－０５２のリポソームおよびエマルション製剤の製剤特性
Figure 0007195147000024
さらなる安定性およびインビボ評価のためにＰＥＧ化リポソームを選択した。ＰＥＧ化リポソームは負に荷電しており（表６）、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ７５０のアニオン性リン酸基に起因する可能性が最も高い。
表６：３Ｍ－０５２を含有する代表的なリポソームおよびエマルション製剤のゼータ電位
Figure 0007195147000025
リポソームは、５℃で６ヶ月以上の間、粒径の変化をほとんどまたは全く示さなかった（図１０Ａ～１０Ｂ）。概して、製造中の３Ｍ－０５２の喪失は、はっきりとは分からなかった。
３Ｍ－０５２のスクアレンベースの水中油型エマルション（ＳＥ）製剤を顕微溶液化により製造し、多分散性が低く、長期間の粒径の安定性を有する＜１００ｎｍサイズの液滴が得られた（図１０Ａ～１０Ｂ）。エマルションゼータ電位値はわずかに負であった（表６）。驚くべきことに、ＤＰＭＣの代わりに卵ＰＣを用いて製造したエマルションは、処理後３Ｍ－０５２のより高い回収率をもたらした。さらに、クロロホルム中で３Ｍ－０５２を卵ＰＣと混合する初期混合工程を加えることにより、乾燥粉末をクロロホルムを含まないスクアレン／卵ＰＣに超音波処理するのに比べて、３Ｍ－０５２の回収率がさらに増加した。したがって、エマルション組成および処理手順の変化は、最終製剤中の３Ｍ－０５２取り込みに有意な効果を有していた。以下の表７を参照されたい。
表７ エマルション製造後の３Ｍ－０５２の回収率
Figure 0007195147000026
Ｈ５Ｎ１ ＨＡと組み合わせた製剤化３Ｍ－０５２は、単回免疫化後の致命的なＨ５Ｎ１チャレンジからマウス防御する
３Ｍ－０５２アジュバント製剤の安定性の実証（図１０ＡおよびＢ）に続いて、ＨＡ特異的ワクチン応答を増強するこのＴＬＲアゴニストの能力を調べた。ＰＥＧ化リポソーム中またはスクアレン水中油型エマルション（ＳＥ）中のいずれかで製剤化した３Ｍ－０５２を、組み換えインフルエンザＨＡ Ｈ５Ｎ１タンパク質（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株［ＶＮ１２０３］，Protein Sciences Corp.，コネチカット州メリデン）と混合し、筋肉内経路を介してＣ５７Ｂｌ／６マウスの群（Ｎ＝２０／群）を免疫化するために使用した。単回免疫化の２１日後、全てのマウスに１０００ ＬＤ５０のＶＮ１２０３を鼻腔内にチャレンジした。１０匹の動物を１４日間追跡し、体重減少および死亡率によって測定したウイルス誘発性罹患率を求めた。リポソームアジュバント製剤では、３Ｍ－０５２はウイルス誘発性罹患を予防し、ｒＨ５またはリポソームと組み合わせたｒＨ５単独を受けた動物の５０％が生き残ったのに比べて、ｒＨ５＋３Ｍ－０５２－リポソームを受けた動物の１００％が生き残った（図１１Ａ）。ｒＨ５＋３Ｍ－０５２－リポソームで免疫したマウスは、体重減少を示さなかったが、リポソーム有りまたは無しでｒＨ５を受けた動物は、チャレンジ後１１日間で体重を減少させた（図１１Ｂ）。エマルションベースの製剤を受けた動物は、インフルエンザアジュバントとしてのエマルションの既知の有効性と一致して、３Ｍ－０５２有りまたは無しの両方で一貫した生存率を示した（図１１Ａ）。しかしながら、ＴＬＲ７／８アゴニストと組み合わせたエマルションを受けた動物は、ｒＨ５＋ＳＥを受けた動物と比較して、急性感染期間にわたり体重減少の低下を示した（図１１Ｃ）。
動物を生存についてモニタリングすることに加えて、チャレンジ後４日目および７日目に５匹の動物／群を安楽死させて、肺におけるインフルエンザ誘発性症状を測定／観察し、肺ウイルス力価を求めた。チャレンジ後４日目では、ｒＨ５＋３Ｍ－０５２アジュバント製剤で免疫した動物は、非免疫化対照と比較して肺ウイルス力価を有意に低下させた。ｒＨ５＋３Ｍ－０５２－リポソームで免疫した動物は、この時点で検出可能なウイルス力価を有していなかった（図１１Ｄ）。７日目では、３Ｍ－０５２ベースのアジュバント製剤を受けた動物は、ｒＨ５単独と比較してウイルス力価が最小であった。リポソームおよびＳＥベースの製剤の両方について、３Ｍ－０５２の添加は、ＴＬＲなしの同じ製剤と比較して、力価の有意な低下をもたらした（図１１Ｅ）。ウイルス力価の低下に加えて、ｒＨ５＋３Ｍ－０５２アジュバント製剤で免疫化した動物は、肺重量の有意な低下を示し（図１１Ｆ）、肺病理スコアを低下させた（図１１Ｇ）。まとめると、これらの結果は、致死的トリインフルエンザチャレンジの臨床的続発症からもマウスを防御する３Ｍ－０５２の能力を実証している。図１１Ｈは、肺ウイルス力価を示す。
３Ｍ－０５２アジュバント製剤は、マウスにおけるＴｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞応答を誘発する
３Ｍ－０５２含有アジュバント製剤について防御の相関を調べるために、アジュバントと組み合わせたｒＨ５による免疫後に誘発されたＣＤ４ Ｔ細胞応答を調べた。単回免疫化の後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞からのサイトカイン産生を調べた。Ｔｈ１サイトカイン陽性細胞（ＩＦＮγ／ＴＮＦα／ＩＬ－２）のレベルは、３Ｍ－０５２アジュバント製剤で免疫した動物で、低レベルであるが検出可能であることを実証することができた（図１２Ａ～Ｃ）。標準Ｔｈ１ ＣＤ＋ Ｔ細胞は、動物で防御的であることが示された全てのアジュバント製剤で観察することができた。以前の研究と一致して、これらのデータは、低レベルの抗原によるワクチン接種後のマウスにおいてＴｈ１偏性細胞応答を誘発する３Ｍ－０５２の能力を実証している。
３Ｍ－０５２アジュバント製剤は、Ｈ５Ｎ１ ＨＡに対して拡大した交差亜型抗体応答を誘発する
製剤化３Ｍ－０５２アジュバントによる免疫化後のＴｈ１ ＣＤ４ Ｔ細胞（ＩＦＮγ＋ＴＮＴａ＋ＩＬ－２＋）の誘発が観察された（図１２）。第２世代の高密度ＨＡタンパク質アレイを使用して、Ｃｌａｄｅ１ ｒＨ５抗原によって誘発された抗体応答を広げる３Ｍ－０５２の能力を調べた。本研究で使用するＨＡアレイは、ＨＡ亜型１～１６からの１つ以上の代表を含む、２７８個の個々のＨＡタンパク質を含む。様々な亜型由来のＨＡタンパク質に結合するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体の両方の能力を調べた。アジュバントの添加は、追加免疫後に誘発された抗体のレベルを増加させた。ＳＥおよびリポソームアジュバントは、Ｈ５亜型タンパク質への結合の増加を示し、ＩｇＧ１応答が優勢であった。いずれかの製剤に３Ｍ－０５２を添加することにより、抗体応答の有意な拡大がもたらされ、広範なＨＡ亜型に結合し、交差反応性ＩｇＧ２ｃ抗体の誘発ももたらされた。（データは示さず）
アレイ上のＨ５株の試験は、３Ｍ－０５２製剤による免疫化後の交差クレード結合応答を明らかに実証した。３Ｍ－０５２－リポソームおよび３Ｍ－０５２－ＳＥで免疫した動物の両方が、複数のＨ５Ｎ１ウイルスクレードからのタンパク質に結合したＩｇＧ２ｃ抗体のレベルの増加を示した。対照的に、ＩｇＧ１レベルは３Ｍ－０５２の存在に依存しなかった。ＨＡアレイからの知見を検証するために、ＶＮ１２０３ ＨＡをコーティング抗原として用いたＥＬＩＳＡによる免疫後マウス血清中の抗体エンドポイント力価を測定した。血清ＥＬＩＳＡによって観察された結果は、ＨＡアレイで観察された結果を反映していた。（データは示さず）
ＴＬＲ７／８アゴニストは、フェレット全血において受容体およびサイトカインｍＲＮＡを増強する
イミダゾキノリンがフェレットで同族ＴＬＲ受容体を刺激することができることを確認するために、全血刺激アッセイを実施した。雄のイタチフェレット（Fitch ferret）からの全血を採取し、イミダゾキノリンまたは合成ＴＬＲ４アゴニストグルココラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）で刺激した。サイトカインおよびＴＬＲ受容体ｍＲＮＡの両方を刺激するアゴニスト分子の能力を、リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。１００μＭのＲ８４８（他の種では公知のＴＬＲ７／８アゴニスト，3M）および１００μＭのＣＬ０７５（他の種では公知のＴＬＲ８アゴニスト，Invivogen）の両方での全血の刺激は、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－８、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８ ｍＲＮＡの有意な増加をもたらした。この結果は、イミダゾキノリンがフェレット受容体を刺激する能力を実証し、フェレットが、インフルエンザ疾患のこのモデルにおいて役割を果たし得る、活性ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方を有することを示唆している。
製剤化３Ｍ－０５２アジュバントは、（Ｈ５Ｎ１抗原との併用で）単回免疫化後のフェレットにおいてＨ５Ｎ１チャレンジに対する防御を増強する
マウスで有望な結果が得られ、イミダゾキノリンがフェレットＴＬＲを刺激し得ることが確認されたため、３Ｍ－０５２含有アジュバントが単回免疫後の致命的なＨ５Ｎ１チャレンジからフェレットを防御する能力を調べた。これらの研究のために、３Ｍ－０５２有りおよび無しの中性リポソームおよびＳＥアジュバントを、ＶＮ１２０３由来のＨ５Ｎ１スプリットウイルスワクチン（Sanofi）（ＳＰ－Ｈ５）と併用した。この抗原は、現在米国の全米パンデミック備蓄（national pandemic stockpile）に含まれており、以前の研究で臨床的に試験されているため、選択した。簡単に述べると、Ｈ５Ｎ１抗原単独を用いた用量設定試験の後（データは示さず）、示されたアジュバントと混合した０．５μｇのＳＰ－Ｈ５で、筋肉内経路により、４～６匹のフェレットの群を免疫した（図１３）。免疫後２１日目に、フェレットに１０６ＰＦＵのＡ／ＶＮ／１２０３／０４を鼻腔内でチャレンジし、体重減少、臨床スコア、および生存について１４日間追跡した。さらに、チャレンジ後１日目から始めて１日おきに、鼻洗浄液を採取した。１つの研究において、３Ｍ－０５２／ＳＥは、ＳＰ－Ｈ５＋ＳＥで免疫した動物と比較して、チャレンジから動物を完全に防御した（図１３Ａ）。３Ｍ－０５２／ＳＥは、ＳＥ単独と比較してウイルス誘発性罹患率も低下させ、ＳＰ－Ｈ５＋３Ｍ－０５２／ＳＥで免疫した動物は、チャレンジ後に体重減少がなく（図１３Ｂ）、感染を通して最小の臨床スコアしか有しなかった（図１３Ｃ）。同様の結果が、リポソームアジュバント製剤で動物を免疫した後の第２の実験で観察された。３Ｍ－０５２－リポソームは１００％の動物をチャレンジから防御した（図１３Ｅ）。ＳＥベースの製剤と同様に、ＳＰ－Ｈ５＋３Ｍ－０５２リポソームで免疫した動物は体重減少がなく（図１３Ｆ）、臨床スコアが無視できる程度であった（図１３Ｇ）。恐らく最も重要なことに、肺ウイルス力価の試験は、ＳＥおよびリポソーム製剤の両方において、３Ｍ－０５２が鼻洗浄液においてウイルス出芽を減少させることができることを示している。３Ｍ－０５２／ＳＥ（図１３Ｄ）または３Ｍ－０５２／リポソーム（図１３Ｈ）で免疫した動物は、他のアジュバントまたは対照動物と比較して、チャレンジの３日後にすぐに有意な減少を示した。両方の場合において、３Ｍ－０５２アジュバントを受けた全ての動物において、５日目までにウイルスが検出できないレベルまで除去された。
３Ｍ－０５２アジュバント製剤は、フェレットにおいて交差クレード中和抗体応答を誘発する
マウスで観察された広範なＨＡ特異的抗体応答およびフェレットでの相同ウイルスに対して我々が観察したロバストな防御に基づいて、ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングするＨ５Ｎ１ ＨＡ偽型レンチウイルスベクターを用いる様々なアジュバント製剤による免疫化後に誘発された中和抗体力価を直接調べた。簡単に述べると、連続希釈した血清サンプルを、Ｈ５Ｎ１ ＨＡおよびＮＡタンパク質を表面に含むレンチウイルス粒子と共にインキュベートした。血清－ウイルス混合物を、ＭＤＣＫ細胞のコンフルエントな単層上でインキュベートした。ウイルスにパッケージされたルシフェラーゼ導入遺伝子の発現を可能にするインキュベーション後、ルシフェラーゼ遺伝子発現の定量によって血清サンプルの中和能を測定した。これらの研究で観察された生存率の増加と一致して、３Ｍ－０５２／ＳＥおよび３Ｍ－０５２／リポソームアジュバントは、単回注射後２１日目の血清中のＩＣ９０中和力価を増加させた（図１４Ａ、Ｄ）。さらに、両方の製剤は、Ｃｌａｄｅ ２ウイルスに対する中和力価を有意に増加させ、Ａ／Ｉｎｄｏ／５／０５ ［Ｃｌａｄｅ ２．１］およびＡ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／０５［Ｃｌａｄｅ ２．２］に対するＩＣ９０力価の増加が観察された（図１４Ｂ～Ｆ）。この知見は、変異したインフルエンザ株に対する広範な機能的中和抗体力価を誘発する製剤化３Ｍ－０５２の能力と一致する。
３Ｍ－０５２－ＳＥは交差クレード防御応答を誘発する
ＶＮ１２０３抗原による免疫化後のＡ／Ｗｈｏｏｐｅｒ ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／２４４／０５に対して観察された中和力価を考慮して、ＶＮ１２０３抗原によるワクチン接種後の肺におけるウイルス複製を減少させる製剤化３Ｍ－０５２の能力を調べた。以前の研究と同様に、フェレットを、製剤化３Ｍ－０５２と組み合わせたＳＰ－Ｈ５で１回免疫し、２１日後に５×１０５ＰＦＵのウイルスでチャレンジした。３Ｍ－０５２／リポソームを受けた動物は、経時的なウイルス出芽の中程度の減少を示し、３Ｍ－０５２／リポソームを受けた動物は、チャレンジ後５日目に検出可能なウイルスを有しておらず、一方、リポソームまたは抗原のみを受けた他の動物は、
この時点で検出可能なウイルスを有していた（図１５Ｂ）。対照的に、３Ｍ－０５２－ＳＥを受けた動物は、チャレンジの３日後から検出可能なプラークを有さず、迅速にウイルスを除去したが、ＳＰ－Ｈ５＋ＳＥを受けた動物は、５日目まで検出可能なウイルス力価を示した（図１５Ａ）。
結果の議論
ここで示した結果は、動物を製剤化ＴＬＲ７／８アゴニスト３Ｍ－０５２で免疫した場合、Ｈ５Ｎ１ウイルスによる高用量（１０００ ＬＤ５０）チャレンジ後のマウスおよびフェレットにおける防御を示す。３Ｍ－０５２はいずれの製剤にも配合され、これらの製剤は長期間安定である。３Ｍ－０５２の新規ＰＥＧ化リポソーム製剤は、低用量（１００ｎｇ）の組み換えＨＡベースの抗原と組み合わせた場合、生存率を高め、肺ウイルス力価を低下させることが観察された。さらに、３Ｍ－０５２およびＤＭＰＣまたは卵ＰＣをスクアレン水中油型エマルションに組み込む製剤を試験し、ｒＨＡと組み合わせたこの製剤で、生存率の上昇および肺力価の低下が示された。３Ｍ－０５２で免疫した動物におけるＴｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の誘発が観察された。Ｔｈ１ ＣＤ４＋ Ｔ細胞誘発と一致して、３Ｍ－０５２免疫動物におけるＩｇＧ２ｃ抗体の増加が観察された。相同性および異種性ウイルス株の両方に対する防御を誘発する３Ｍ－０５２含有アジュバント製剤の能力、ならびに製剤化３Ｍ－０５２アジュバントの長期間の安定性は、これらの製剤が備蓄に適していることを示す。さらに、これらのアジュバントと現在全米の備蓄に含まれているプレパンデミックワクチン抗原との適合性が実証されており、混合ワクチンは、系統が一致した分離株および変異した分離株の両方からフェレットを防御することができることが示されている。
実施例３：ＰＥＧ化リポソーム万能性
ＰＥＧ化リポソーム製剤の万能性を試験するために、追加の脂質をコレステロール、非ＰＥＧ化中性脂質、およびＰＥＧ化脂質の基本製剤に添加した。１以上の追加の中性脂質および１以上の追加のカチオン性脂質の添加は、得られたリポソーム製剤の安定性または有効性に悪影響を及ぼさなかった（データは示さず）。

Claims (11)

  1. （ａ）コレステロール、
    （ｂ）非ＰＥＧ化中性脂質、
    （ｃ）ＰＥＧ化脂質であって、前記ＰＥＧ化脂質中のＰＥＧの平均分子量が約２０００ダルトンであり、前記非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比が、約９．８：５．７：０．８又は約１８：５．５：３である前記ＰＥＧ化脂質、並びに
    （ｄ）少なくとも１種のＴＬＲ４アゴニスト及び少なくとも１種のＴＬＲ７／８アゴニストであって、前記少なくとも１種のＴＬＲ４アゴニストがＧＬＡであり、前記少なくとも１種のＴＬＲ７／８アゴニストが３Ｍ－０５２である少なくとも１種のＴＬＲ４アゴニスト及び少なくとも１種のＴＬＲ７／８アゴニスト
    を含んでなるリポソームを含む、粘膜免疫応答誘発剤。
  2. 前記ＰＥＧ化脂質の脂質成分が中性脂質を含んでなる、請求項１に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  3. 前記ＰＥＧ化脂質の脂質成分が、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、又はＤＭＰＥである、請求項１又は２に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  4. 前記非ＰＥＧ化中性脂質が、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＥ、又はＤＭＰＥである、請求項１～３の何れか一項に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  5. a) 前記リポソームが、約２℃～約８℃の温度で１ヶ月以上の間安定である、及び／又は
    b) 前記リポソームの多分散指数が約０．３以下で維持される、及び／又は
    c) 前記リポソームのサイズが４５０ｎｍ未満又は約４５０ｎｍである、
    請求項１～４の何れか一項に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  6. 前記リポソーム中の前記ＰＥＧ化脂質のモルパーセンテージ（ｍｏｌ％）が約１ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％の範囲であり、前記リポソーム中のコレステロールのｍｏｌ％が約１ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の範囲であり、前記リポソーム中の非ＰＥＧ化脂質のモル％が約４５ｍｏｌ％～約９８ｍｏｌ％の範囲である、請求項１～５の何れか一項に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  7. 非ＰＥＧ化中性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の脂質モル比が約９．８：５．７：０．８又は約１８：５．５：３である、請求項１～６の何れか一項に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  8. 前記ＧＬＡが式：
    Figure 0007195147000027
     の合成ＧＬＡもしくは薬剤的に許容できるその塩、又は式（ＶＩ）：
    Figure 0007195147000028
     の合成ＧＬＡもしくは薬剤的に許容できるその塩を含んでなり、
    Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６が、Ｃ１１～Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２及びＲ４がＣ１２～Ｃ２０アルキルであり、好ましくは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ６がＣ１１アルキルであり、Ｒ２及びＲ４がＣ１３アルキルである、
    請求項１に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  9. さらに抗原を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  10. 前記抗原が、Ｈ５Ｎ１又はＬｅｃＡを含む、請求項９記載の粘膜免疫応答誘発剤。
  11. 請求項１～１３の何れか一項に記載の粘膜免疫応答誘発剤の製造方法であって、
    （ａ）前記非ＰＥＧ化中性脂質、前記ＰＥＧ化脂質、及び前記コレステロールを有機溶媒中で混合することと、
    （ｂ）前記有機溶媒を蒸発させて脂質膜を得ることと、
    （ｃ）緩衝液中で前記脂質膜を再水和させることと、
    （ｄ）工程（ｃ）の再水和生成物を超音波処理、顕微溶液化、又は押出することと、
    を含んでなる前記方法。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018073676B1 (pt) 2016-05-16 2023-10-03 University Of Virginia Patent Foundation Lipossomas peguilados e métodos de uso
CN107998070A (zh) * 2017-12-12 2018-05-08 南京中医药大学 一种复合磷脂传递体及其在制备经皮给药制剂中的应用
EP3886901A1 (en) * 2018-11-29 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
KR20210105879A (ko) * 2018-12-17 2021-08-27 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 리포좀을 포함하는 제형물
CN110151702A (zh) * 2019-06-24 2019-08-23 昆明医科大学 聚乙二醇修饰流感疫苗脂质体及其制备方法
US11679163B2 (en) 2019-09-20 2023-06-20 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for delivery of RNA
KR102328531B1 (ko) * 2020-01-23 2021-11-17 서울대학교산학협력단 체내 면역 세포 표적 황화수소 공여체 담지 리포좀을 포함하는 면역질환 치료 또는 예방용 약학 조성물
GB2605538A (en) 2020-03-23 2022-10-05 Hdt Bio Corp Compositions and methods for delivery of RNA
CN117120087A (zh) 2020-12-23 2023-11-24 高级健康研究所 茄尼醇疫苗助剂及其制备方法
WO2022183120A1 (en) * 2021-02-26 2022-09-01 University Of Virginia Patent Foundation Development of covid-19 vaccine using a dual tlr ligand liposome adjuvant
WO2022192674A1 (en) * 2021-03-11 2022-09-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeted therapeutic lipid nanoparticles and methods of use
CN115737800B (zh) * 2023-01-09 2023-05-23 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种复合脂质体佐剂及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013536803A (ja) 2010-08-31 2013-09-26 ノバルティス アーゲー 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム
JP2015512950A (ja) 2012-04-12 2015-04-30 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 異なる医薬品の制御送達のためのビヒクル
WO2015123496A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
WO2015136479A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Liposomal compositions for mucosal delivery

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US4286592A (en) 1980-02-04 1981-09-01 Alza Corporation Therapeutic system for administering drugs to the skin
US4314557A (en) 1980-05-19 1982-02-09 Alza Corporation Dissolution controlled active agent dispenser
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
IL73534A (en) 1983-11-18 1990-12-23 Riker Laboratories Inc 1h-imidazo(4,5-c)quinoline-4-amines,their preparation and pharmaceutical compositions containing certain such compounds
US4568343A (en) 1984-10-09 1986-02-04 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US4948587A (en) 1986-07-08 1990-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transbuccal drug delivery
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
US4780212A (en) 1987-07-31 1988-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enchancement of membrane permeability
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB2232892B (en) 1988-02-23 1991-07-24 John Mark Tucker Occlusive body for administering a physiologically active substance
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
EP0449856B1 (en) 1988-12-16 2001-09-12 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
ES2109921T3 (es) 1989-07-25 1998-02-01 Smithkline Beecham Biolog Nuevos antigenos y procedimientos para su preparacion.
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
GB9106048D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
DE122007000084I1 (de) 1991-07-19 2008-03-27 Univ Queensland St Lucia Impfstoff gegen Humanes Papillomavirus (Typ 18)
US5464387A (en) 1991-07-24 1995-11-07 Alza Corporation Transdermal delivery device
WO1993010152A1 (en) 1991-11-16 1993-05-27 Smithkline Beecham Biologicals S.A. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
ATE380871T1 (de) 1992-06-25 2007-12-15 Univ Georgetown Papillomavirus vakzine
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
DE122011100018I1 (de) 1993-03-09 2011-11-17 Univ Rochester Herstellung von menschlichem Papilloma-Virus-Capsid-Protein und virusahnlichen Teilchen.
DE69425661T2 (de) 1993-07-15 2001-04-19 Minnesota Mining & Mfg IMIDAZO [4,5-c]PYRIDIN-4-AMINE
DE69434767T2 (de) 1993-11-02 2006-11-09 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma Halbleiterbauelement mit Aggregat von Mikro-Nadeln aus Halbleitermaterial
US5458140A (en) 1993-11-15 1995-10-17 Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers
US5885211A (en) 1993-11-15 1999-03-23 Spectrix, Inc. Microporation of human skin for monitoring the concentration of an analyte
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5591139A (en) 1994-06-06 1997-01-07 The Regents Of The University Of California IC-processed microneedles
WO1996011272A2 (de) 1994-10-07 1996-04-18 Medigene Gesellschaft Für Molekularbiologische Diagnostik, Theraphie Und Technologie Mbh Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
JP3958360B2 (ja) 1995-02-24 2007-08-15 キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US5618275A (en) 1995-10-27 1997-04-08 Sonex International Corporation Ultrasonic method and apparatus for cosmetic and dermatological applications
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US7033598B2 (en) 1996-11-19 2006-04-25 Intrabrain International N.V. Methods and apparatus for enhanced and controlled delivery of a biologically active agent into the central nervous system of a mammal
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
CO4870792A1 (es) 1997-02-25 1999-12-27 Corixa Corp Compuestos y conjunto de medios de diagnostico para detectar y vigilar la progresion de cancer de prostata
US6764686B2 (en) 1997-07-21 2004-07-20 Baxter International Inc. Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
EP1032676A2 (en) 1997-11-28 2000-09-06 Genset $i(CHLAMYDIA TRACHOMATIS) GENOMIC SEQUENCE AND POLYPEPTIDES, FRAGMENTS THEREOF AND USES THEREOF, IN PARTICULAR FOR THE DIAGNOSIS, PREVENTION AND TREATMENT OF INFECTION
UA67760C2 (uk) 1997-12-11 2004-07-15 Міннесота Майнінг Енд Мануфакчурінг Компані Імідазонафтиридин та тетрагідроімідазонафтиридин, фармацевтична композиція, спосіб індукування біосинтезу цитокінів та спосіб лікування вірусної інфекції, проміжні сполуки
ES2255248T3 (es) 1998-02-05 2006-06-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Derivados de antigenos asociados a tumor de la familia mage, y secuencias de acidos nucleicos que los codifican, usados para la preparacion de proteinas de fusion y de composiciones para vacunas.
CA2326598C (en) 1998-04-07 2014-06-10 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
GB2336310B (en) 1998-04-14 2003-09-10 Stowic Resources Ltd Method of manufacturing transdermal patches
JP2002511266A (ja) 1998-04-15 2002-04-16 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 腫瘍関連核酸及びその使用
US6322532B1 (en) 1998-06-24 2001-11-27 3M Innovative Properties Company Sonophoresis method and apparatus
TW200532020A (en) 1998-07-14 2005-10-01 Corixa Corp Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer
US6110929A (en) 1998-07-28 2000-08-29 3M Innovative Properties Company Oxazolo, thiazolo and selenazolo [4,5-c]-quinolin-4-amines and analogs thereof
IL145982A0 (en) 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6685699B1 (en) 1999-06-09 2004-02-03 Spectrx, Inc. Self-removing energy absorbing structure for thermal tissue ablation
JP4162813B2 (ja) 1999-10-28 2008-10-08 久光製薬株式会社 イオントフォレーシス装置
US6974588B1 (en) 1999-12-07 2005-12-13 Elan Pharma International Limited Transdermal patch for delivering volatile liquid drugs
US6908453B2 (en) 2002-01-15 2005-06-21 3M Innovative Properties Company Microneedle devices and methods of manufacture
US6676961B1 (en) 2002-03-06 2004-01-13 Automated Carrier Technologies, Inc. Transdermal patch assembly
US7018345B2 (en) 2002-12-06 2006-03-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Iontophoresis system
WO2005079195A2 (en) 2003-10-03 2005-09-01 3M Innovative Properties Company Pyrazolopyridines and analogs thereof
DE102005032175A1 (de) 2005-07-09 2007-01-18 Krones Ag Behälter-Behandlungsmaschine und Verfahren zum Laden und Entladen einer Behälter-Behandlungsmaschine
ATE383895T1 (de) 2005-07-19 2008-02-15 Holzapfel Gmbh & Co Kg Geb Auftriebshilfe
WO2007117680A2 (en) * 2006-04-06 2007-10-18 The Johns Hopkins University Methods and compositions for treating bacterial infection
AU2007354917B2 (en) * 2006-09-26 2013-06-06 Access To Advanced Health Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
ES2552471T3 (es) * 2007-02-07 2015-11-30 The Regents Of The University Of California Conjugados de agonistas de TLR sintéticos y usos de los mismos
CN101687027B (zh) 2007-04-04 2015-01-28 传染性疾病研究院 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物
US8793881B2 (en) 2008-08-15 2014-08-05 Stanley Black & Decker, Inc. Utility knife with blade lock
CN102202689A (zh) * 2008-08-28 2011-09-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗
US9265821B2 (en) * 2009-02-17 2016-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant
CA2764374C (en) 2009-06-05 2019-11-19 Infectious Disease Research Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants
WO2010143971A2 (en) * 2009-06-08 2010-12-16 Epitarget As Lipophilic drug carrier
TWI397428B (zh) 2009-12-29 2013-06-01 Ind Tech Res Inst 標的第四介白素受體之傳輸系統
MX359517B (es) 2010-08-17 2018-10-01 3M Innovative Properties Company Star Composiciones, formulaciones y metodos de compuestos lipidicos modificadores de respuestas inmunitaria.
SG11201401177WA (en) * 2011-10-06 2014-04-28 Immunovaccine Technologies Inc Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
BR112014010291A2 (pt) 2011-10-31 2017-04-18 Mallinckrodt Llc composições de lipossoma combinacionais para terapia de câncer
WO2013086526A1 (en) * 2011-12-09 2013-06-13 The Regents Of The University Of California Liposomal drug encapsulation
TR201908003T4 (tr) 2012-02-07 2019-06-21 Infectious Disease Res Inst TLR4 agonistleri içeren gelişmiş adjuvan formülasyonları ve bunların kullanım metotları.
EP2869838B1 (en) * 2012-07-05 2020-09-02 Children's Medical Center Corporation The bacterial biofilm matrix as a platform for protein delivery
MX2015012199A (es) * 2013-03-13 2015-11-30 Mallinckrodt Llc Composiciones de cisplatino liposomal para la terapia contra el cancer.
CN105534908B (zh) * 2016-01-15 2018-12-14 徐州医学院 一种包载核酸药物的具缺氧响应能力和放疗增敏功能脂质体
BR112018073676B1 (pt) 2016-05-16 2023-10-03 University Of Virginia Patent Foundation Lipossomas peguilados e métodos de uso

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013536803A (ja) 2010-08-31 2013-09-26 ノバルティス アーゲー 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム
JP2015512950A (ja) 2012-04-12 2015-04-30 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 異なる医薬品の制御送達のためのビヒクル
WO2015123496A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
WO2015136479A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Liposomal compositions for mucosal delivery

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KHANTASUP KANNIKA，TARGETED SMALL INTERFERING RNA-IMMUNOLIPOSOMES AS A PROMISING THERAPEUTIC AGENT AGAINST 以下備考，ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY，2014年05月，VOL:58, NR:5，PAGE(S):2816 - 2824，http://dx.doi.org/10.1128/AAC.02768-13，HIGHLY PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA A (H5N1) VIRUS INFECTION
Vaccine，Vol.29，2011年，pp.5434-5442

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