CN102202689A

CN102202689A - 疫苗

Info

Publication number: CN102202689A
Application number: CN2009801437446A
Authority: CN
Inventors: R·L·比曼斯; A·埃罗亚哈比
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2009-08-26
Publication date: 2011-09-28
Also published as: MX2011002267A; EP2328613A1; WO2010023216A1; BRPI0916884A2; ZA201101481B; KR20110050531A; JP5769624B2; AU2009286769A1; EA201100268A1; JP2015163617A; JP2012500827A; IL211233A0; CA2734950A1; US20110159081A1; US8846080B2

Abstract

本发明提供了包含至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述抗原和抗原递送颗粒通过中间连接物连接。

Description

疫苗

技术领域

本发明涉及包含通过中间连接物与抗原连接的颗粒抗原递送系统的疫苗和免疫原性组合物。

背景技术

一直需要具有改进的免疫原性的新的组合物或疫苗。作为一种策略，佐剂已经被用于尝试改善针对任意给定抗原产生的免疫应答。

WO05/014110公开了组合物，其包含：a)脂质体；b)至少一种A-型CpG，其中所述A-型CpG与所述脂质体结合或由所述脂质体封装。Shahum&Thérin[Immunology(1988)65：315-317]公开了包含牛血清白蛋白的组合物，所述牛血清白蛋白是游离的，或封装在脂质体中，或通过异双官能试剂N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)与脂质体表面共价连接。通过这种经典的缀合方法，抗原在配制的早期与脂质体直接且共价地连接。该连接不是可逆的，除非发生酶促或化学降解。另一方面，封装方法具有发生抗原变性和/或降解的风险。

替代性的方法包括，通过静电相互作用使抗原与离子性带电荷的脂质体结合。HSV抗原gB与阳离子性脂DOTAP配合并成功用于在接种的小鼠中诱发免疫应答，尤其是CTL应答(Walker等人.1992-PNAS，89：7915-7918)。组合了阳离子性脂DC-chol的HBsAg产生了改进的和平衡的免疫力，其能够克服小鼠对乙肝疫苗的无响应性(Brunel等人.1999.Vaccine 17：2192-2203)。

仍然需要提供合适的免疫应答的改进的疫苗和免疫原性组合物。

发明内容

本发明人证明，包含颗粒抗原递送系统和抗原(其中所述抗原和颗粒通过中间连接物连接)的疫苗或免疫原性组合物诱导免疫应答，该免疫应答相对于其中颗粒和抗原不通过中间连接物连接的组合物而言是改进的免疫应答。特别地，本发明的免疫原性组合物诱导改进的CD8+T-细胞免疫应答。

本发明的具体实施方式提供了包含至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述抗原和抗原递送颗粒通过中间连接物连接。

特别地，在本发明的一个实施方式中提供了免疫原性组合物，其中连接物包含至少2个彼此互补的组件，其中连接物组件之一与抗原递送颗粒连接，互补性连接物组件与抗原连接；抗原递送颗粒与抗原继而通过与它们连接的互补性组件的杂交和/或结合(joining)而连接。

在本发明的一个实施方式中，连接物由互补性单链寡核苷酸构成。寡核苷酸介导的连接允许以可通过改变寡核苷酸的长度和序列而调节的强度进行的可逆连接。这继而允许抗原在被细胞摄取之后被释放。此外，抗原通过一定长度的连接物位于抗原递送颗粒的表面处，这使其能够被B-细胞识别。

本发明还允许“两瓶概念”，其中颗粒抗原递送系统和抗原可以在包装和运输中保持分离，例如，其中，可以在适当的时间点(可以是在临给药前)将它们组合。本发明还允许可以与任何感兴趣的抗原组合的一般性颗粒抗原递送系统的概念。此外，通过使用与颗粒抗原递送系统连接的不同寡聚体(oligo)，人们可以将不同的抗原(如果需要，按不同的比例)连接至同一颗粒。

因此，在本发明的第一方面，提供了包含通过中间连接物连接的抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物。

在本发明的一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与颗粒连接，另一互补性连接物组件与抗原连接。

在本发明的另一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与颗粒连接，另一互补性连接物组件与抗原连接，并且其中所述2个互补性连接物组件是杂交的。

在本发明的一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。

在本发明的另一个方面，提供了疫苗或免疫原性组合物在制备用于预防感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述疫苗或免疫原性组合物包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。

在本发明的另一个方面，提供了本文描述的疫苗或免疫原性组合物在制备用于预防和/或治疗感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途。

在另一个方面，提供了如本文定义的疫苗或免疫原性组合物的方法或用途，其用于提供保护以抵抗由病原体引起的感染或疾病，所述病原体是所述免疫原性组合物中的抗原所源自的病原体的变体。

在另一个实施方式中，提供了如本文定义的疫苗或免疫原性组合物的方法或用途，其用于提供保护以抵抗由包含抗原的病原体引起的感染或疾病，所述抗原是所述免疫原性组合物中的抗原的变体。

在本发明的另一个实施方式中，提供了如本文定义的免疫原性组合物的方法或用途，其用于产生抗原特异性CD8+T-细胞免疫应答，所述方法或用途包括向患者给予本发明的免疫原性组合物。

在本发明的另一个方面，提供了如本文定义的疫苗或免疫原性组合物的方法或用途，其用于治疗哺乳动物中的疾病。

在本发明的另一个方面，提供了试剂盒，其包含i)与寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒；和ii)与互补于i)中的寡核苷酸的寡核苷酸连接的至少一种抗原。

附图说明

图1：不同的洗脱级份的SDS-PAGE/考马斯分析。

图2：不同的洗脱级份的SDS-PAG/BET分析。

图3A和3B：杂交反应混合物超离心之后的沉淀和上清液的SDS-PAGE分析。

图4：研究设计。

图5：产生细胞因子的CD8+T-细胞比例(CD8+群体内的百分比)。

图6：产生细胞因子的CD4+T-细胞比例(CD4+群体内的百分比)。

图7：体内检测的细胞介导的细胞毒性。

图8：抗-p27抗体效价(总IgG-汇集的血清)。

具体实施方式

在本文中，本发明人使用的术语“包含/包括(comprising)”、“包含/包括(comprise)”和“包含/包括(comprises)”意在任选在各种情况下分别与术语“由......组成(consisting of)”、“由......组成(consist of)”和“由......组成(consists of)”替换。

本文中的涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方式也适用于涉及本发明的“免疫原性组合物”的实施方式，反之亦然。

本发明人证明，相对于其中的抗原递送颗粒和抗原不通过中间连接物连接的组合物而言，如本文描述的本发明的疫苗或免疫原性组合物引发改进的免疫应答。“改进的免疫应答”的意思是以下列一种或多种方式改变免疫应答：效应细胞(例如，CD8+和/或CD4+T-细胞、B-细胞)的数目增加；一种或多种效应细胞类型的有效性提高；一种或多种细胞类型产生的一种或多种细胞因子增加；以及产生的一种或多种细胞因子占总细胞因子谱的比例增加。特别地，本发明的免疫原性组合物诱导改进的CD8+T-细胞免疫应答。改进的CD8+T-细胞应答对于预防和/或治疗某些疾病具有重要意义，所述疾病为：其中靶细胞可能被细胞内细菌或病毒例如HIV感染，或者靶细胞可能是肿瘤细胞。

因此，在本发明的第一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物。

使用具有互补性组件的中间连接物的进一步有益之处在于，不同大小的颗粒/抗原可以容易地分别与不同抗原/抗原递送颗粒结合。这相对于直接共价键合是进一步的优势。

特别地，提供了免疫原性组合物，其中连接物包含至少2个彼此互补的组件，其中连接物组件之一与抗原递送颗粒连接，互补性连接物组件与抗原连接；抗原递送颗粒与抗原继而通过与它们连接的互补性组件的杂交和/或结合而连接。

因此，在本发明的一个具体方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。

在本发明的一个具体方面，本发明的免疫原性组合物包含免疫原性组合物，后者包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸，其中第一寡核苷酸与所述抗原递送颗粒连接，并且与第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸与抗原连接。

在本发明的另一方面，提供了免疫原性组合物，其包含通过一对或多对互补性寡核苷酸与一种或多种抗原连接的至少一种抗原递送颗粒。在另一个实施方式中，免疫原性组合物包含与一种或多种抗原连接的至少一种抗原递送颗粒；所述抗原可以是全都相同的，或者一种或多种抗原可以是不同的。在本发明的另一个实施方式中，提供了包含抗原递送颗粒成分的免疫原性组合物，其中一种或多种抗原递送颗粒是不同的。在本发明的另一个实施方式中，提供了免疫原性组合物，其包含一种或多种不同的抗原递送颗粒以及一种或多种不同的抗原。

颗粒抗原递送系统

颗粒递送系统是本领域熟知的(参见例如Singh和O’Hagan 2002Pharmaceutical Research 19(6)：715-727)，并且包括：水包油乳液、微粒(参见O’Hagen&Singh 2003 Expert Rev.Vaccines 2(2)：269-283)、免疫刺激复合物(ISCOM)、蛋白酶体、油滴和脂质体。如本文使用的术语“抗原递送颗粒”是指颗粒抗原递送系统的单个颗粒，其包括但不限于，水包油乳液的油滴、单一的微粒或纳米颗粒、单一的蛋白酶体、单一的油滴、单一的脂质体、胶束、蛋白酶体或单一的ISCOM。

脂质体

本发明的一个具体实施方式涉及包含脂质体制剂的免疫原性组合物，所述脂质体制剂通过中间连接物与抗原连接。

在本发明的一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种脂质体和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与所述脂质体连接，并且另一个互补性连接物组件与抗原连接。

在本发明的另一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种脂质体和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与所述脂质体连接，并且另一个互补性连接物组件与抗原连接，并且其中2个互补性连接物组件是杂交的。

在本发明的具体实施方式中，中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。

术语“脂质体”一般是指单层或多层(尤其是2，3，4，5，6，7，8，9或10层，这取决于形成的脂膜的数目)的包含水性内部的脂结构。脂质体和脂质体制剂是本领域熟知的。能够形成脂质体的脂类包括所有的具有脂或脂样特性的物质。可以构成脂质体中的脂的脂类可以选自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦脂、甘油膦酰脂、硫酯、鞘脂、磷脂、isoprenolide、甾类、硬脂、甾醇、archeolipid、合成的阳离子性脂和含脂的碳水化合物。

在一个实施方式中，脂质体包含磷脂。合适的磷脂包括(但不限于)：磷酸胆碱(PC)，其为合成磷脂酰胆碱的中间体；天然磷脂衍生物：卵磷酸胆碱、卵磷酸胆碱、大豆磷酸胆碱、氢化的大豆磷酸胆碱、作为天然磷脂的鞘磷脂；和合成的磷脂衍生物：磷酸胆碱(二癸酰-L-α-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰磷脂酰胆碱[DOPC]、1-棕榈酰，2-油酰磷脂酰胆碱[POPC]、二反油酰磷脂酰胆碱[DEPC])、磷酸甘油(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])，磷脂酸(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE 1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸丝氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端激活的磷脂)。在一个实施方式中，脂质体包含1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸乙醇胺。在一个实施方式中，使用高度纯化的磷脂酰胆碱，其可以选自磷脂酰胆碱(卵)、氢化磷脂酰胆碱(卵)、磷脂酰胆碱(大豆)、氢化磷脂酰胆碱(大豆)。在另一个实施方式中，脂质体包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物。

脂质体的尺寸可以为30nm至数微米，这取决于磷脂组成和用于制备脂质体的方法。在本发明的具体实施方式中，脂质体的尺寸为50nm至500nm的范围，在进一步的实施方式中为50nm至200nm。动态激光散射是用于测定脂质体尺寸的方法，其是本领域技术人员熟知的。

在本发明的进一步的实施方式中，本发明的脂质体与不止一个寡核苷酸连接，例如1至10,000个，1至15,000个，1至25,000个，1至50,000个，1至90,000个，1至100,000个，或更多的寡核苷酸。与抗原连接的寡核苷酸可以是全部相同的，或者一个或多个可以是不同的。

在进一步的实施方式中，本发明的脂质体还包含甾醇。合适的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个具体的实施方式中，脂质体包含胆固醇作为甾醇。这些甾醇是本领域熟知的，例如胆固醇公开于Merck索引，第11版，第341页，其是发现于动物脂肪中的天然存在的甾醇。

本发明的免疫原性组合物可以包含不止一种脂质体。脂质体的组成可以是不同的，因此，在本发明的一个实施方式中，提供了包含一种或多种不同脂质体的免疫原性组合物。脂质体的不同可以在于：它们包含不同的元件或由不同元件组成，包含另外的元件，缺少某些元件，或者构成脂质体的一种或多种元件的比例是不同的。脂质体的不同可以在于其组成，即在于其所源自的磷脂。在进一步的实施方式中，脂质体的不同可以在于存在于脂质体中的甾醇的量，例如，在一个实施方式中，免疫原性组合物包含一定比例的含有甾醇的脂质体和一定比例的不含甾醇的脂质体，或者脂质体可以具有不同量的甾醇。在进一步的实施方式中，免疫原性组合物可以包含含有不同免疫刺激剂的脂质体；例如，在一个实施方式中，免疫原性组合物可以包含一定比例的含有免疫刺激剂(例如皂苷和/或TLR配体)的脂质体和不含另外的免疫刺激剂的脂质体。在进一步的实施方式中，提供了包含连接了不同寡核苷酸的脂质体的免疫原性组合物。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含一定比例的与特定寡核苷酸或寡核苷酸组连接的脂质体，而其余的脂质体可以包含替代性寡核苷酸或寡核苷酸组。免疫原性组合物可以包含任意数目的不同类型的脂质体，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多不同的脂质体。当然，一些脂质体可以不与一种或多种寡核苷酸连接，而其它脂质体与一个或多个不同类型的寡核苷酸连接。

水包油乳液

在本发明的一个实施方式中，提供了本发明的免疫原性组合物，其包含通过中间连接物连接的至少一种抗原和水包油乳液中的至少一种油滴。

在本发明的一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原和水包油乳液中的至少一种油滴的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与所述油滴连接，另一个互补性连接物组件与抗原连接。

在本发明的另一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原和水包油乳液中的至少一种油滴的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与所述油滴连接，另一个互补性连接物组件与抗原连接，并且其中所述2个互补性连接物组件是杂交的。

在本发明的一个具体实施方式中，中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。

本发明的水包油乳液包含可代谢的油和乳化剂。为了使任意水包油组合物适合向人类给予，乳液系统的油相必须包含可代谢的油。术语“可代谢的油”的含义是本领域熟知的。“可代谢的”可以定义为“能够通过代谢被转化”(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。油可以是任意植物油、鱼油、动物油或合成油，其对于受体是无毒的并且能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是本发明的一部分，其可以包括商业上可获得的油，例如NEOBEE

等。

特别适宜的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯)是一种非饱和油，其大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中，是用于本发明的特别优选的油。角鲨烯是胆固醇的生物合成中的中间体，从这个意义上来讲，其为可代谢的油(Merck索引，第10版，条目号8619)。在本发明的进一步的实施方式中，可代谢油以组合物总体积的0.5％至10％(v/v)的量存在于免疫原性组合物中。

水包油乳液进一步包含乳化剂。适宜地，所述乳化剂可以是聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。另外，所述乳化剂适宜地以组合物总体积的0.125％至4％(v/v)的量存在于疫苗或免疫原性组合物中。

本发明的水包油乳液任选包含母育酚。母育酚是本领域熟知的，描述于EP0382271。适宜的母育酚可以是α-生育酚或其衍生物，例如α-生育酚琥珀酸酯(也称为维生素E琥珀酸酯)。所述母育酚适宜地以免疫原性组合物总体积的0.25％至10％(v/v)的量存在于佐剂组合物中。

制备水包油乳液的方法是本领域技术人员熟知的。通常而言，所述方法包括将油相(任选包含母育酚)与表面活性剂例如PBS/TWEEN80^TM溶液混合，然后使用匀浆器进行匀浆；对本领域技术人员显而易见的是，包括使混合物两次通过注射器针头的方法将适合于将小体积的液体匀浆。同样地，本领域技术人员可以改造微射流(microfluidizer)(M110S Microfluidics仪器，最大通过50次，在最大输入压力为6bar(输出压力是大约850bar)时持续2分钟)中的乳化方法来产生较小或较大体积的乳液。该改造可以通过常规实验实现：包括测定得到的乳液，直至达到具有需要的直径的油滴的制备物。

在水包油乳液中，油和乳化剂应该处于水性载体中。所述水性载体可以是例如磷酸盐缓冲的盐水。

特别地，本发明的水包油乳液系统具有亚微米范围的小尺寸油滴。适宜的油滴尺寸可以是120至750nm的范围，更特别的尺寸是120至600nm的直径。更特别地，水包油乳液包含这样的油滴，根据强度其至少70％具有小于500nm的直径，更特别的根据强度至少80％具有小于300nm的直径，更特别的根据强度至少90％具有120至200nm范围的直径。

根据本发明，油滴尺寸即直径是根据强度给出的。有数种根据强度测定油滴直径尺寸的方法。强度是通过使用尺寸测量仪测定的，适宜地通过动态光散射测定，例如Malvern Zetasizer 4000或优选Malvern Zetasizer 3000HS。第一个可能方式是通过动态光散射(PCS-光子关联光谱法)测定z均径ZAD；该方法另外给出多分散指数(PDI)，根据累积量算法计算ZAD和PDI。这些数值不需要知晓颗粒折射率。第二种方式是通过另一种算法(Contin或NNLS或自动化的″Malvern″算法(由尺寸测量仪提供的缺省算法))测定全部的粒径分布，从而计算油滴的直径。多数情况下，由于复合组合物的颗粒折射率是未知的，所以仅考虑强度分布，如果需要的话，还考虑从该分布产生的强度均值。

本发明的免疫原性组合物可以包含不止一种类型的油滴。水包油乳液中的油滴可以具有不同组成，因此在本发明的一个实施方式中，提供了包含一种或多种不同油滴的免疫原性组合物。油滴的不同可以在于：它们包含不同的元件或由不同元件组成，包含另外的元件，缺少某些元件，或者构成油滴的一种或多种元件的比例是不同的。油滴的不同可以在于其组成，即在于其所源自的脂。在进一步的实施方式中，提供了包含连接了不同寡核苷酸的油滴的免疫原性组合物。例如，本发明的免疫原性组合物可以包含一定比例的与特定寡核苷酸或寡核苷酸组连接的油滴，而其余的脂质体可以包含替代性寡核苷酸或寡核苷酸组。免疫原性组合物可以包含任意数目的不同类型的油滴，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多不同的油滴。

ISCOM

在本发明的一个实施方式中，提供了本发明的免疫原性组合物，其包含通过中间连接物连接的至少一种ISCOM和至少一种抗原。

在本发明的一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种ISCOM和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与所述ISCOM连接，另一个互补性连接物组件与抗原连接。

在本发明的另一个方面，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种ISCOM和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中连接物组件之一与所述ISCOM连接，另一个互补性连接物组件与抗原连接，并且其中所述2个互补性连接物组件是杂交的。

ISCOM是本领域熟知的(参见Kersten&Crommelin[1995]Biochimica et Biophysica Acta 1241：117-138)。ISCOM包含皂苷、胆固醇和磷脂，并且形成开口箱子样结构，通常尺寸是40nm。ISCOM形成于皂苷、胆固醇和其它磷脂的相互作用。制备ISCOM的典型反应混合物是5mg/ml皂苷和各1mg/ml的胆固醇和磷脂。

适合用于本发明的ISCOM中的磷脂包括但不限于：磷酸胆碱(二癸酰-L-α-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰磷脂酰胆碱[DOPC]、1-棕榈酰，2-油酰磷脂酰胆碱[POPC]、二反油酰磷脂酰胆碱[DEPC])、磷酸甘油(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])，磷脂酸(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE 1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸丝氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂(mPEG-磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端激活的磷脂)。在本发明的一个实施方式中，ISCOM包含1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸乙醇胺。在进一步的实施方式中，使用高度纯化的磷脂酰胆碱，其可以选自磷脂酰胆碱(卵)、氢化磷脂酰胆碱(卵)、磷脂酰胆碱(大豆)、氢化磷脂酰胆碱(大豆)。在另一个实施方式中，ISCOM包含磷脂酰乙醇胺[POPE]或其衍生物。

多种皂苷适合用于本发明的ISCOM之中。在本领域中已经深入研究了各个皂苷的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，见上文)。例如，Quil A(源自南美洲树木皂树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其组分描述于US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；和EP 0 362 279 B1。

包含Quil A的组分的ISCOM已经用于生产疫苗(Morein，B.，EP 0 109942 B1)。已经报道这些结构具有佐剂活性(EP 0 109 942 B1；WO 96/11711)。

QuilA的组分、QuilA的衍生物和/或其组合是用于本发明的ISCOM中的适宜的皂苷制备物。溶血性皂苷QS21和QS17(Quil A的经HPLC纯化的组分)被描述为强有力的佐剂，其产生方法公开于美国专利No.5,057,540和EP 0 362 279 B1中。这些文献中还描述了QS7(Quil-A的非溶血性组分)的用途，其作为全身性疫苗的强有力的佐剂。QS21的用途进一步描述于Kensil等人(1991.J.Immunology vol 146，431-437)。QS21与聚山梨醇酯或环糊精的组合也是已知的(WO 99/10008)。包含QuilA的组分例如QS21和QS7的颗粒佐剂系统描述于WO 96/33739和WO 96/11711，这些文献并入本文。其它的特定的QuilA组分(称为QH-A、QH-B、QH-C以及被称为QH-703的QH-A与QH-C的混合物)公开于WO1996011711中的ISCOM的表格中，其并入本文。

微粒

在本发明的一个实施方式中，提供了本发明的免疫原性组合物，其包含通过中间连接物连接的至少一种微粒和至少一种抗原。

微粒、包含微粒的组合物和制备微粒的方法是本领域熟知的(参见Singh等人[2007 Expert Rev.Vaccines 6(5)：797-808]和WO/1998/033487)。如本文使用的术语“微粒”是指直径为大约1000nm至大约150μm的颗粒，其源自具有多种分子量的聚合材料，在共聚物例如PLG的情况下，所述聚合材料具有多种丙交酯∶乙交酯的比例。特别地，微粒的直径允许非肠道给药，不阻塞针头和毛细管。微粒也被称作微球。微粒尺寸可以通过本领域熟知的技术容易地测定，例如光子相关光谱法、激光衍射法和/或扫描电镜。

用于本文的微粒将由可灭菌的、无毒的和生物可降解的材料制备。此类材料包括但不限于，聚(a-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐。

特别地，本发明的微粒源自聚(u-羟基酸)，特别地，源自聚(丙交酯)(″PLAII″)或D，L-丙交酯与乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(″PLGII″或″PLGAII″)，或D，L-丙交酯与己内酯的共聚物。

用于制备本发明的微粒的生物可降解聚合物可以容易地从商业途径获得，例如从Boehringer Ingelheim，Germany and Birmingham Polymers，Inc.，Birmingham，AL获得。例如，用于形成本文的微粒的有用的聚合物包括那些源自下列的聚合物：聚羟基丁酸；聚己内酯；聚原酸酯；聚酐；以及聚(a-羟基酸)，例如聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)(二者在本文中都称作″PLAII″)、聚(羟基丁酸酯)、D，L-丙交酯与乙交酯的共聚物(例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(在本文中称作″PLG″或″PLGA″))或D，L-丙交酯与己内酯的共聚物。特别的聚合物是PLA和PLG聚合物。可以获得多种分子量的这些聚合物，针对给定抗原的合适的分子量由本领域技术人员容易地确定。因此，例如对于PLA，合适的分子量将是大约2000至5000的量级。对于PLG，合适的分子量一般是大约10,000至大约200,000的范围，特别是大约15,000至大约150,000，更特别是大约50,000至大约100,000。如果使用例如PLG的共聚物形成微粒，可以使用多种丙交酯∶乙交酯比例。

具有不同的丙交酯∶乙交酯比例的微粒的混合物可用于制剂中以便达到针对给定抗原的需要的释放动力学，并提供初级和次级免疫应答。本发明的微粒的降解速率也可以由例如聚合物分子量和聚合物结晶度的因素控制。具有不同的丙交酯∶乙交酯比例和分子量的PLG共聚物可以容易地通过商业途径从多个来源获得，包括Boehringer Ingelheim，Germany and Birmingham Polymers，Inc.，Birmingham，AL。也可以使用本领域熟知的技术例如Tabata等人，J.Biomed.Mater.Res.(1988)22：837-858中描述的技术通过乳酸组分的简单聚缩合来合成这些聚合物。

纳米颗粒

在本发明的一个实施方式中，提供了本发明的免疫原性组合物，其包含通过中间连接物连接的至少一种纳米颗粒和至少一种抗原。

纳米颗粒是本领域熟知的。包含纳米颗粒的组合物和纳米颗粒的制备公开于WO/2008/051245和Singh等人(2007 Expert Rev.Vaccines 6(5)：797-808)，通过引用并入本文。

如本文使用的术语“纳米颗粒”是指源自聚合材料的直径小于1000nm的颗粒。纳米颗粒具有与微粒(见上文)相同/相似的组成，其区别仅在于它们的尺寸。纳米颗粒也称作纳米球。本发明的组合物中的纳米颗粒通常具有这样的尺寸分布：其中Z均值和/或D(v，0.5)值小于250nm，更通常小于150nm，并且其中Z均值和/或D(v，0.9)小于350nm，更通常小于200nm。

可以使用本领域可获得的方法测定(测量)粒径。例如，可以使用光子相关光谱法、动态光散射或准弹性光散射测定粒径。这些方法基于粒径与获自布朗运动测量值的颗粒扩散特性的相关性。布朗运动是由于环绕颗粒的溶剂分子的碰撞造成的颗粒的随机运动。颗粒越大，布朗运动越缓慢。速度是通过平动扩散系数(D)定义的。测量值是指颗粒在液体内如何移动(水力直径)。获得的直径是与颗粒具有相同的平动扩散系数的颗粒的直径。还可以使用静态光散射测定粒径，该静态光散射测定溶液中的颗粒单次散射的光的强度。静态光散射测定的是作为散射角和溶质浓度的函数的光强度。穿过光源例如激光束的颗粒以一定角度使光散射，该角度与它们的尺寸成反比。大颗粒以低散射角和高强度产生衍射式样，而小颗粒产生宽角度的低强度信号。如果作为角度的函数测定从样品散射的光的强度，则可以计算粒径分布。将角度的信息与散射模型(例如Mie理论)进行比较，以计算尺寸分布。

一般地，在室温测定粒径，其包括多次分析待测样品(例如对同一样品至少3次重复测定)，以产生颗粒直径的平均值。

对于光子相关光谱法，通常从累积量(单模态)分析计算Z均值(也称作累积量均值或水力直径)。对于静态光散射测定(同样对于在一些实施方式中的光子相关光谱法)，可以测定基于体积的尺寸参数。

例如，D(v，0.5)(其中v表示体积)是这样的尺寸参数，其值定义为所测定的组合物中的50％的颗粒(基于体积)具有小于D(v，0.5)值的尺寸并且组合物中50％的颗粒具有大于D(v，0.5)值的尺寸的点。类似地，D(v，0.9)是这样的尺寸参数，其值定义为组合物中的90％的颗粒(基于体积)具有小于D(v，0.9)值的尺寸并且组合物中10％的颗粒具有大于D(v，0.9)值的尺寸的点。

寡核苷酸

在本发明的进一步的实施方式中，提供了包含通过中间连接物连接的如本文描述的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的组合物，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。

术语“寡核苷酸”是本领域熟知的。术语“寡核苷酸”在本文中用于指任意单链寡核苷酸序列。寡核苷酸可以是RNA或DNA寡核苷酸，或者寡核苷酸可以是肽核酸，或者在替代性实施方式中，寡核苷酸可以形成三链DNA螺旋。因此，根据本发明的“寡核苷酸”是指能够与互补性核酸杂交的单链寡核苷酸序列。寡核苷酸的设计(长度和具体序列)将取决于抗原递送颗粒和/或抗原的性质，以及使用该寡核苷酸的条件(例如温度和离子强度)。寡核苷酸的设计可以取决于所连接的抗原递送颗粒或抗原的类型。寡核苷酸的长度可以决定连接的特异性和强度，并且可以根据抗原与脂质体表面之间的需要的长度而变化。寡核苷酸的序列可以根据寡核苷酸的需要的免疫刺激效应而变化。寡核苷酸可以是任意长度，仅受到其杂交能力和/或可以合成它的容易性的限制。在一个实施方式中，寡核苷酸长度是8至250个碱基(例如10至200、12至75、13至50、10至45、14至40)，特别地，寡核苷酸长度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40个碱基。

互补性寡核苷酸对可以是任何序列，只要其适合于彼此结合并能够连接至脂质体和/或抗原。在一个实施方式中，第一寡核苷酸序列的序列是SEQ ID NO：1至6的任意项的序列，或者可以是包含或包含于SEQ ID NO：1至6的序列的10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个碱基。寡核苷酸对的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸互补。当需要时，可以对寡核苷酸的长度和/或序列进行微小改变，以维持任意给定情况下所需的特异性和灵敏性。本文所列的寡核苷酸可以在例如任一方向延伸1至40或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸。术语“免疫刺激性寡核苷酸”在本文中用于指能够激活免疫系统的成分的寡核苷酸。在本发明的一个实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含一个或多个未甲基化的胞苷-鸟苷(CpG)基序。在进一步的实施方式中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含一个或多个未甲基化的胸苷-鸟苷(TG)基序，或者可以富含T。“富含T”的意思是，寡核苷酸的核苷酸组成包含超过50％、60％、70％或80％的胸苷。在本发明的一个实施方式中，寡核苷酸不是免疫刺激性寡核苷酸，并且不包含未甲基化的CpG基序。在进一步的实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸不富含T和/或不包含未甲基化的TG基序。

可以对寡核苷酸进行修饰以改善体外和/或体内稳定性。例如，在本发明的一个实施方式中，对寡核苷酸进行修饰以包含硫代磷酸酯骨架，即核苷酸间的键合。对寡核苷酸的其它合适的修饰(包括二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和甲基膦酸酯修饰)以及替代性的核苷酸间的键合是本领域技术人员熟知的，且涵盖在本发明内。

在进一步的实施方式中，可以对寡核苷酸进行修饰以使其能够与抗原递送颗粒和/或抗原缀合。修饰寡核苷酸的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方式中，提供了经修饰以包含游离的巯基(SH)的寡核苷酸。在具体的实施方式中，提供了在其3’末端包含游离巯基的寡核苷酸。“游离巯基”的意思是该基团能够进行化学缀合。

在本发明的一个实施方式中，提供了本发明的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物的抗原递送颗粒与一种或多种寡核苷酸连接。单一抗原递送颗粒上的寡核苷酸可以是全部相同的，或者可替代地，一种或多种不同的寡核苷酸可以与单一抗原递送颗粒连接。免疫原性组合物中的寡核苷酸可以是全部相同的，或者在进一步的实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含一种或多种不同的寡核苷酸。

在本发明的进一步的实施方式中，提供了包含2个或更多个抗原递送颗粒的免疫原性组合物，其中一定比例的递送颗粒与一种类型的寡核苷酸连接，并且其中一定比例与一种或多种不同的寡核苷酸连接。

在本发明的进一步的实施方式中，提供了包含与一种或多种不同寡核苷酸连接的抗原的免疫原性组合物，即本发明的抗原可以与任意数目的不同寡核苷酸连接，例如1、2、3、4、5、6或更多个不同寡核苷酸序列。在本发明的进一步的实施方式中，提供了包含2个或更多个不同抗原的免疫原性组合物，其中一个抗原与一种类型的寡核苷酸连接，并且其中一种或多种不同抗原与一种或多种不同寡核苷酸连接。

在进一步的实施方式中，提供了免疫原性组合物，其中抗原与一种或多种不同寡核苷酸序列连接。这句话意思是单一抗原分子可以与一种或多种不同序列的寡核苷酸连接，但是，在本发明的替代性实施方式中，抗原群体中的彼此相同的抗原与不同寡核苷酸连接。

缀合

本发明的一个实施方式涉及免疫原性组合物，其中抗原递送颗粒通过中间连接物与抗原连接。在具体的实施方式中，所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。所述寡核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任意方法与抗原和/或脂质体连接。

在本发明的具体实施方式中，提供了如本文描述的本发明的免疫原性组合物，其中寡核苷酸通过化学缀合与至少一种抗原递送颗粒连接，并且其中与所述的与至少一种抗原递送颗粒连接的寡核苷酸互补的寡核苷酸通过化学缀合与至少一种抗原连接。

抗原可以具有通过化学缀合而连接的一种或多种例如1至10，1至15，1至25，1至50，1至200，2至100，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多寡核苷酸。寡核苷酸可以通过本领域技术人员熟知的化学方法与抗原缀合。

在一个实施方式中，抗原通过双官能连接物(例如S-GMBS[N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)硫代琥珀酰亚胺酯])与寡核苷酸缀合，以向蛋白中导入马来酰亚胺基团，继而具有另外的巯基的寡核苷酸与所述马来酰亚胺缀合。用于添加马来酰亚胺基团的其它合适试剂可以选自：N-[α-马来酰亚胺乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯(AMAS)、N-[β-马来酰亚胺丙氧基]琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-[ε-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯](LC-SMCC)、琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基酯(SMCC)、马来酰亚胺(聚氧化乙烯)_{2，4，6，8或12}N-羟基琥珀酰亚胺酯(SM(PEG)_2， _{4，，6，8或12)}、琥珀酰亚氨基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚氨基6-[β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N--[ε-马来酰亚胺己酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基硫代-琥珀酰亚胺酯(Sulfo-MBS)、硫代琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代-琥珀酰亚胺酯(Sulfo-GMBS)和硫代琥珀酰亚氨基4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯(Sulfo-SMPB)(Pierce；Bioconjugate techniques Greg T.Hermanson Academic Press 1996)。

在其中“蛋白包含一个或多个游离巯基”的其它实施方式中，在马来酰亚胺激活之前，使用例如N-乙基马来酰亚胺封闭游离巯基。

本领域技术人员可以获得多种另外的化学方法，因此在一个实施方式中，包含游离巯基的抗原可以被修饰，以便在使用例如N-琥珀酰亚氨基3-[2-吡啶基硫]丙酸酯(SPDP)的试剂进行DTT处理之后将游离氨基转化为巯基。其它试剂可以选自：琥珀酰亚氨基6-[3-(2-吡啶基硫]丙酰胺基]己酸酯LC-SPDP，4-琥珀酰亚氨氧基羰基-甲基-α-[2-吡啶基二硫]甲苯(SMPT)、LC-SMPT、硫代琥珀酰亚氨基3-[2-吡啶基硫]丙酸酯(Sulfo-SPDP)、硫代琥珀酰亚氨氧基羰基-甲基-α-[2-吡啶基二硫]甲苯Sufo-SMPT、硫代琥珀酰亚氨基6-甲基-α-[2-吡啶基二硫]甲苯酰胺己酸酯Sulfo-LC-SMPT、硫代琥珀酰亚氨基6-[3’-2-吡啶基硫]丙酰胺基]己酸酯(Sulfo-LC-SDPD)和N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯：

寡核苷酸-SH+抗原-SH→寡核苷酸-S-S-抗原

在替代性实施方式中，可以使用双马来酰亚胺试剂例如BM[PEO]_2或3或DTME对包含巯基的抗原进行修饰，产生适合与巯基(thiol)修饰的寡核苷酸缀合的马来酰亚胺激活的抗原：

Ag-SH+双马来酰亚胺试剂→马来酰亚胺激活的抗原+寡核苷酸-SH

在替代性实施方式中，可以通过与例如SBAP、NHS-BA、SIA、SIAB和硫代-SIAB的试剂反应而获得卤代乙酰基抗原。然后，得到的卤代乙酰基抗原可以与巯基修饰的寡核苷酸缀合：

寡核苷酸-SH+抗原-Br→寡核苷酸-S-抗原+HBr

脂质体可以与一个或多个例如1至100,000个寡核苷酸连接，这取决于脂质体的尺寸和其它限制，例如脂质体表面处的寡核苷酸的空间位阻。可以使用本领域技术人员熟知的化学方法使寡核苷酸与脂质体缀合。脂质体缀合物及衍生物的制备是熟知的(参见Bioconjugate techniques.G T.Hermanson：preparation of liposome conjugates and derivatives，第528-569页(1996))。可以使用异双官能交联剂激活包含磷脂酰乙醇胺基团的脂质体以添加马来酰亚胺、碘代乙酰基或吡啶基二硫化物基团。

寡核苷酸可以与脂质体的任一成分连接，例如与磷脂连接。在一个实施方式中，脂质体包含马来酰亚胺修饰的磷脂。在一个实施方式中，脂质体包含POPE-MAL(N-(3-马来酰亚胺基-1-氧代丙基)L-α-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油烯基[NOF American corporation]，其中可以缀合例如巯基修饰的寡核苷酸。

可以将脂质体配制为包含0.5％至50％(摩尔)的百分比的修饰的磷脂。特别地，修饰的磷脂的百分比是1％至20％，更特别是1％至10％。与寡核苷酸共价连接的修饰的磷脂的分数将取决于实验条件和反应产率。

寡核苷酸可以与ISCOM的任一成分连接，例如与磷脂连接。在一个实施方式中，ISCOM包含马来酰亚胺修饰的磷脂。在一个实施方式中，ISCOM包含POPE-MAL，例如巯基修饰的寡核苷酸可以与其缀合。

ISCOM可以配制为包含修饰的磷脂。与寡核苷酸共价连接的修饰的磷脂的分数取决于实验条件和反应产率。在进一步的实施方式中，本发明的ISCOM包含修饰的胆固醇。

寡核苷酸可以与水包油乳液中的油滴缀合。本发明的水包油乳液的油滴可以包含能够与一个或多个寡核苷酸缀合的修饰的表面活性剂。在一个实施方式中，提供了包含修饰的表面活性剂的本发明的油滴，其中所述表面活性剂是如本文定义的修饰的磷脂。在本发明的具体实施方式中，修饰的磷脂占表面活性剂总体积的大约0.1％至10％(v/v)。

寡核苷酸可以与微粒和/或纳米颗粒缀合。本发明的微粒/纳米颗粒可以包含能够与一个或多个寡核苷酸缀合的修饰的磷脂。在一个实施方式中，提供了包含如本文定义的修饰的磷脂的本发明的微粒/纳米颗粒。

在本发明的一个实施方式中，提供了制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使第一寡核苷酸与抗原缀合；

b.使与步骤a中的寡核苷酸互补的第二寡核苷酸与抗原递送颗粒缀合；

c.在允许寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和抗原递送颗粒。

在进一步的实施方式中，提供了制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使用合适的试剂封闭抗原中的任何游离巯基；

b.向所述抗原中加入马来酰亚胺基团；

c.使第一巯基激活的寡核苷酸与所述抗原缀合；

d.使与步骤c中的寡核苷酸互补的第二巯基寡核苷酸与包含马来酰亚胺激活的磷脂的脂质体缀合；

e.在允许所述寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和脂质体。

a.使用合适的试剂封闭抗原中的任何游离巯基；

b.向所述抗原中加入马来酰亚胺基团；

c.使第一巯基激活的寡核苷酸与所述抗原缀合；

d.使与步骤c中的寡核苷酸互补的第二巯基寡核苷酸与包含马来酰亚胺激活的磷脂的ISCOM缀合；

e.在允许所述寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和ISCOM。

a.使用合适的试剂封闭抗原中的任何游离巯基；

b.向所述抗原中加入马来酰亚胺基团；

c.使第一巯基激活的寡核苷酸与所述抗原缀合；

d.使与步骤c中的寡核苷酸互补的第二巯基寡核苷酸与包含马来酰亚胺激活的磷脂的油滴缀合；

e.在允许所述寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和油滴。

a.使用合适的试剂封闭抗原中的任何游离巯基；

b.向所述抗原中加入马来酰亚胺基团；

c.使第一巯基激活的寡核苷酸与所述抗原缀合；

d.使与步骤c中的寡核苷酸互补的第二巯基寡核苷酸与包含马来酰亚胺激活的磷脂的微粒和/或纳米颗粒缀合；

e.在允许所述寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和微粒和/或纳米颗粒。

在本发明的具体实施方式中，提供了制备如本文描述的免疫原性组合物的方法，其中以大约为6的双官能连接物/抗原的摩尔比来进行步骤b。

抗原

本发明的疫苗或免疫原性组合物将包含能够引发针对人或动物病原体和/或在人或动物中引起疾病发生的物质的免疫应答的抗原。在本发明的进一步的实施方式中，本发明的疫苗或免疫原性组合物将包含能够引发针对人或动物中的肿瘤和/或肿瘤抗原或瘤的免疫应答的抗原。

术语“抗原”是本领域技术人员熟知的。抗原可以是能够在人或动物中引起免疫应答的蛋白、多糖、肽、核酸、蛋白-多糖缀合物、分子或半抗原。抗原可以源自病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌，与病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌同源，或是合成的以模拟来自病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌的分子。在本发明的替代性实施方式中，抗原源自肿瘤细胞或瘤，与肿瘤细胞或瘤同源，或是合成的以模拟来自肿瘤细胞或瘤的分子。在本发明的进一步的实施方式中，抗原源自参与过敏症、阿尔茨海默病、动脉硬化症、肥胖和尼古丁依赖症的物质，与参与过敏症、阿尔茨海默病、动脉硬化症、肥胖和尼古丁依赖症的物质同源，或是合成的以模拟来自参与过敏症、阿尔茨海默病、动脉硬化症、肥胖和尼古丁依赖症的物质的分子。

在本发明的一个实施方式中，提供了包含一种或多种抗原递送颗粒的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒通过中间连接物与一种或多种抗原连接。在本发明的进一步的实施方式中，提供了包含一种或多种抗原递送颗粒的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒通过连接物与一种或多种抗原连接，并且其中所述连接物包含至少一对互补性寡核苷酸。本发明的抗原递送颗粒与任意数目的抗原连接，例如1至200,000个抗原分子；这取决于特定的抗原递送颗粒。抗原可以是全都相同的，或者在替代性实施方式中，可以有一种或多种不同抗原，因此本发明的抗原递送颗粒可以与任意数目的不同抗原连接，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60或更多个不同抗原。

在本发明的进一步的实施方式中，抗原与不止一个寡核苷酸连接，例如1至200，2至100，1至50，1至25，1至15，1至10，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个寡核苷酸。与抗原连接的寡核苷酸可以是全都相同的，或者可替代地，一种或多种寡核苷酸可以是彼此不同的。

本发明的免疫原性组合物包含与连接物组件连接的抗原递送颗粒和与互补性连接物组件连接的抗原。适宜地，至少30％或更多的抗原分子与组合物中的抗原递送颗粒连接。在本发明的进一步的实施方式中，至少大约40％或更多的抗原分子与抗原递送颗粒连接。在本发明的进一步的实施方式中，多数抗原与抗原递送颗粒连接，也就是说，组合物中的超过50％的抗原分子与抗原递送颗粒连接。在本发明的进一步的实施方式中，组合物中的基本上所有的抗原分子与组合物的抗原递送颗粒连接。“基本上所有”的意思是，至少60％、70％、80％、90％、95％或更多的抗原分子与抗原递送颗粒连接。在本发明的一个实施方式中，存在于本发明的免疫原性组合物中的所有(大约100％)的抗原与组合物中的抗原递送颗粒连接。可以通过本领域技术人员已知的多种方法从组合物中除掉任何多余的未结合的抗原分子，例如，可以将免疫原性组合物离心，其中与抗原递送颗粒连接的抗原被沉淀，而未与脂质体连接的抗原保留在上清液中。

试剂盒

本发明的一个优势在于，连接至抗原的寡核苷酸可以与连接至互补性寡核苷酸的抗原递送颗粒容易地连接。在本发明的范围内包括包含与互补性连接物组件连接的抗原递送颗粒和抗原的试剂盒。在具体的实施方式中，提供了包含与互补性寡核苷酸连接的抗原递送颗粒和抗原的试剂盒。本发明的试剂盒中的与互补性寡核苷酸缀合的抗原递送颗粒和抗原可以彼此杂交，或者可以是分开的，因此需要在向宿主给药之前进行杂交。

在本发明的一些方面，提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒。在本发明的进一步的方面，提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原。

在本发明的一个实施方式中，提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒；和ii)与一种或多种与i)中的寡核苷酸互补的寡核苷酸连接的至少一种抗原。在本发明的进一步的实施方式中，提供了试剂盒，其包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒；和ii)与一种或多种与i)中的寡核苷酸互补的寡核苷酸连接的2个或更多个不同抗原。在本发明的进一步的实施方式中，提供了试剂盒，其包含i)与寡核苷酸连接的一种或多种抗原递送颗粒；ii)与i)中的寡核苷酸或不同的寡核苷酸连接的一种或多种不同类型的抗原递送颗粒；和iii)与一种或多种与i)和/或ii)中的寡核苷酸互补的寡核苷酸连接的一种或多种抗原；以及任选的iv)与互补于i)和/或ii)的寡核苷酸的寡核苷酸连接的一种或多种不同抗原。

在本发明的一个实施方式中，提供了试剂盒，其中至少一种抗原递送颗粒通过经互补性寡核苷酸的杂交与至少一种抗原连接，或者，至少一种抗原通过经互补性寡核苷酸的杂交与至少一种抗原递送颗粒连接。

在本发明的替代性实施方式中，提供了试剂盒，其中抗原递送颗粒和抗原装在不同的瓶中，因此不通过互补性寡核苷酸杂交，从而它们可以在给药前的适当时间点进行杂交。

试剂盒可以包含任意数目的不同类型的抗原递送颗粒，例如1至100个不同类型的抗原递送颗粒。在一个实施方式中，一种类型的抗原递送颗粒与相同的寡核苷酸连接，在替代性实施方式中，每个不同类型的抗原递送颗粒可以与不同的寡核苷酸连接。在本发明的进一步的实施方式中可以包含任意数目的不同抗原，例如1至100个不同抗原。试剂盒中的抗原适宜地与互补于连接至试剂盒中的至少一组脂质体的寡核苷酸的寡核苷酸连接。

在进一步的实施方式中，提供了试剂盒，其包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒；和ii)与互补于该寡核苷酸的一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原；和iii)另外的免疫刺激剂。

免疫刺激剂

在本发明的进一步的实施方式中，提供了基本上如本文描述的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含至少一种免疫刺激剂或免疫刺激剂的组合。

在本发明的一个实施方式中，提供了包含通过中间连接物连接的至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原的免疫原性组合物，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸，所述免疫原性组合物进一步包含一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂可以在脂质体内(在脂双层中或封装在内部水相中)、ISCOM中或液滴中，与水溶液中的抗原递送颗粒混合；或者在进一步的实施方式中，组合物的成分可以吸附至另外的免疫刺激剂。

任选的免疫刺激剂选自：皂苷、脂A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、金属盐、toll样受体激动剂或其组合。在具体的实施方式中，免疫刺激剂/佐剂是Toll样受体激动剂，特别是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂，或皂苷。具体的组合包括皂苷(尤其是QS21)佐剂和/或Toll样受体4激动剂(例如3D-MPL)或Toll样受体9激动剂(例如含有CpG免疫刺激性寡核苷酸)。其它组合包括皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4激动剂，例如皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4配体例如3D-MPL或烷基氨基葡糖苷磷酸酯。

在一个实施方式中，免疫刺激剂是Toll样受体(TLR)4配体，尤其是激动剂，例如脂A衍生物，特别是单磷酰脂A，或者更特别是3脱酰单磷酰脂A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以名称MPL销售，在文献中被称作MPL或3D-MPL。参见，例如美国专利No.4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进CD4+T细胞应答，具有IFN-g(Th1)表型。可以根据GB 2 220 211 A中公开的方法制备3D-MPL。在化学上，其为具有3、4、5或6条酰基化链的3-脱酰单磷酰脂A的混合物。在具体的实施方式中，小颗粒3D-MPL用于本发明的组合物中。小颗粒3D-MPL具有这样的粒径：其可以通过0.22μm的滤器进行无菌过滤。此类制备物描述于WO 94/21292。

免疫原性组合物还可以包含是脂多糖的免疫刺激剂，适宜地是脂A的非毒性衍生物，特别是单磷酰脂A或更特别是3-脱酰单磷酰脂A(3D-MPL)。在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物包含3D-MPL。

脂A的合成衍生物是已知的，被认为是TLR 4激动剂，包括但不限于：

OM174(2-脱氧-6-邻-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰氧基四-癸酰基氨基]-4-邻-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基二氢磷酸酯)，(WO 95/14026)

OM 294 DP(3S，9R)-3--[(R)-十二酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸烷-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)

其它的可以使用的TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，例如公开于WO9850399或US6303347中的那些(也公开了制备AGP的方法)，或公开于US6764840中的AGP的药学上可接受的盐。一些AGP是TLR4激动剂，一些是TLR4拮抗剂。二者都被认为可以用作免疫刺激剂。

其它合适的能够通过TLR-4引起信号传导应答的TLR-4配体(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)是例如，来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，尤其是LPS的非毒性衍生物(例如3D-MPL)。其它合适的TLR激动剂有：热休克蛋白(HSP)10，60，65，70，75或90；表面活性剂蛋白A、乙酰透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防卫素-2、胞壁酰二肽(MDP)或呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一个实施方式中，TLR激动剂是HSP 60，70或90。

Toll样受体(TLR)是I型跨膜受体，在昆虫和人类中是进化上保守的。目前发现了10种TLR(TLR 1至10)(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。TLR家族的成员具有相似的细胞外和细胞内结构域；已经表明它们的细胞外结构域具有富含亮氨酸的重复序列，并且它们的细胞内结构域与白细胞介素-1受体(IL-1R)的细胞内区域是类似的。TLR细胞在免疫细胞和其它细胞(包括血管上皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肠上皮细胞)之间有差别地表达。TLR的细胞内结构域可以与接头蛋白Myd88(其在其细胞质区域内也具有IL-1R结构域)相互作用，引起细胞因子的NF-KB激活；这种Myd88途径是TLR激活影响细胞因子释放的一种方式。TLR主要在例如抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞等)的细胞类型中表达。

通过TLR刺激引起的树突细胞的激活导致树突细胞的成熟和炎性细胞因子例如IL-12的产生。目前进行的研究已经表明：TLR识别不同类型的激动剂，虽然一些激动剂对于数个TLR而言是共同的。TLR激动剂主要源自细菌或病毒，并且包括例如鞭毛蛋白或细菌脂多糖(LPS)的分子。

“TLR激动剂”意指能够通过TLR信号传导途径引起信号传导应答的成分，其可以作为直接的配体，或者通过产生内源或外源配体而间接进行(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。

在另一个实施方式中，TLR分子的其它的天然或合成的激动剂用作任选的免疫刺激剂。这些可以包括但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。

在本发明的一个实施方式中，使用能够通过TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂选自：三酰化脂肽(LP)；酚可溶性调控蛋白；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)LP；S-(2，3-双(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸化物(Pam3Cys)LP(其模拟细菌脂蛋白的酰基化氨基末端)以及来自伯疏氏螺旋体(Borrelia burgdorfei)的OspA LP。

在替代性的实施方式中，使用能够通过TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂是下列一项或多项：脂蛋白，肽聚糖，来自结核分枝杆菌、伯疏氏螺旋体、梅毒螺旋体(T.pallidum)的细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的物种的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟菌属孔蛋白(Neisseria porin)、细菌菌毛、耶尔森氏菌属(Yersinia)毒力因子、CMV病毒体、麻疹血凝素和来自酵母的酵母聚糖。

在替代性的实施方式中，使用能够通过TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)，或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly IC)，这是一种与病毒感染相关的分子核酸式样。

在替代性的实施方式中，使用能够通过TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。

在替代性的实施方式中，使用能够通过TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、二酰化的LP和酚可溶性调控蛋白。另外的TLR6激动剂描述于WO2003043572。

在替代性的实施方式中，使用能够通过TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(其为位置N7和C8的鸟苷类似物)或咪唑喹啉化合物，或其衍生物。在一个实施方式中，TLR激动剂是咪喹莫特。另外的TLR7激动剂描述于WO02085905。

在替代性的实施方式中，使用能够通过TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂(Sabroe等人，JI 2003 1630-5页)。适宜地，能够通过TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉化合物，例如雷西莫特(R848)；雷西莫特也能够被TLR-7识别。其它的可用的TLR-8激动剂包括描述于WO2004071459中的那些。

也可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它Toll样受体(TLR)9激动剂(除了用于杂交中的那些以外)。用于本发明的疫苗或免疫原性组合物的特定寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，特别是含有由至少3个、甚至更特别是至少6个或更多个核苷酸间隔开的2个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后跟鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在具体的实施方式中，寡核苷酸中的核苷酸间是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，虽然本发明范围内也包括磷酸二酯和其它核苷酸间键合。本发明范围内还包括具有混合的核苷酸间键合的寡核苷酸。制备硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。

用于本发明的具体寡核苷酸的实例具有以下序列。在本发明的具体实施方式中，序列包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键合。

(SEQ ID NO 1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)

(SEQ ID NO 2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)

(SEQ ID NO 3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

(SEQ ID NO 4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)

(SEQ ID NO 5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)

(SEQ ID NO 6)：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)

替代性的CpG寡核苷酸可以包含以上序列，其中它们具有无关紧要的缺失或添加。用于本发明的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法合成(例如参见EP 468520)。可以使用自动化合成仪方便地合成此类寡核苷酸。

因此，在另一个实施方式中，本发明的组合物还包含选自下列的免疫刺激剂：TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或其组合。

在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物还包含皂苷。用于本发明的特别适宜的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是分离自南美洲树木皂树的皂苷制备物，其首先由Dalsgaard等人在1974年描述(“Saponin adjuvants”，Archiv.für die gesamte Virusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，243-254页)为具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了Quil A的纯化的片段，其保持佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0 362 278)，所述片段例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)。QS-21是源自皂树的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答，是本发明上下文中的优选皂苷。

本发明的免疫原性组合物中的皂苷佐剂特别是Quil A的免疫学活性组分，例如QS-7或QS-21，适宜地是QS-21。在一个实施方式中，本发明的组合物包含基本上纯的形式的免疫学活性皂苷组分。特别地，本发明的组合物包含基本上纯的形式的QS21，也就是说，QS21是至少75％、80％、85％、90％纯的，例如至少95％纯的，或至少98％纯的。

在具体的实施方式中，在其低反应原性(reactogenic)组合物中提供QS21，其中以外源甾醇例如胆固醇猝灭QS21。存在数种特定形式的低反应原性组合物，其中以外源胆固醇猝灭QS21。在一个实施方式中，本发明的包含皂苷的脂质体适宜地包含中性脂，例如磷脂酰胆碱，其适宜地在室温下是非结晶形式，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱。脂质体还可以包含带电荷的脂，对于由饱和脂构成的脂质体，其增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下带电荷的脂的量适宜地是1％至20％w/w，特别是5％至10％。甾醇与磷脂的比例是1％至50％(mol/mol)，适宜地是20％至25％。

当与不含甾醇的组合物比较时，本发明的包含QS21和甾醇(尤其是胆固醇)的免疫原性组合物显示出降低的反应原性，而保持了佐剂效应。可以根据WO 96/33739中公开的方法进行反应原性研究。根据本发明的甾醇意指外源甾醇，即对于从中制备抗原性制备物的生物体而言不是内源的甾醇，而是向抗原制备物中添加的或者在配制时随后添加的甾醇。

当活性皂苷组分是QS21时，QS21∶甾醇的比例通常是1∶100至1∶1(w/w)的量级，适宜地是1∶10至1∶1(w/w)，优选是1∶5至1∶1(w/w)。适宜地，存在多余的甾醇，QS21∶甾醇的比例是至少1∶2(w/w)。在一个实施方式中，QS21∶甾醇的比例是1∶5(w/w)。甾醇适宜地是胆固醇。

其它有用的皂苷源自植物欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)或Gyophilla struthium。在文献中描述的其它皂苷包括七叶树皂角素(Escin)，其描述于Merck索引(第12版，条目号3737)，其是存在于七叶树(horse chestnut tree，拉丁名Aesculus hippocastanum)的种子中的皂苷混合物。描述了通过色谱法和纯化(Fiedler，Arzneimittel-Forsch.4，213(1953))以及通过离子交换树脂(Erbring等人.，US 3,238,190)进行的其分离。已经纯化了七叶树皂角素的组分并显示其具有生物学活性(Yoshikawa M等人(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996 Aug；44(8)：1454-1464))。还已经描述了与例如制备ISCOM相关的来自Gypsophilla struthium的皂苷(R.Vochten等人，1968，J.Pharm.Belg.，42，213-226)。

特别地，组合物可以包含两种或更多种如上所列举的免疫刺激剂。在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含脂多糖和免疫学活性的皂苷二者。在本发明的进一步的实施方式中，脂多糖被掺入本发明的脂质体中。在本发明的具体实施方式中，脂多糖是3D-MPL，并且免疫学活性的皂苷是QS21，被掺入到本发明的脂质体中。

接种

包含本发明的免疫原性组合物的疫苗制备物可通过经由全身性或粘膜途径给予所述疫苗而用于保护或治疗易于被感染的哺乳动物。这些给药可以包括：通过肌肉内、腹膜内、真皮内或皮下途径注射；或通过粘膜给药至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。虽然本发明的疫苗可以以单剂给药，但其成分也可以在同一时间或不同时间联合共同给药。此外，本发明的疫苗可以通过IM给药用于初免给药，并且通过IN用于加强给药。

疫苗中的蛋白抗原含量通常是1-500μg范围，优选是5-350μg，最通常是5-300μg范围。初次接种之后，受试者可以接受间隔足够的一个或多个加强免疫。

疫苗制备物的一般性描述见Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach”(eds Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)。

脂质体内的封装描述于Fullerton的美国专利4,235,877。

每个疫苗剂量中的每个抗原的量选择为诱导免疫保护性应答而没有常见疫苗中的显著性不利副作用的量。此量将根据所用的具体免疫原以及如何呈现它而变化。

在进一步的实施方式中，提供了通过给予基本上如本文描述的组合物来治疗易患疾病或患有疾病的个体的方法。

还提供了预防个体患上疾病的方法，所述疾病选自：感染性细菌和病毒疾病，寄生虫疾病(特别是细胞内病原性疾病)，增殖性疾病，例如前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或黑素瘤；非癌症慢性病症、过敏症，所述方法包括向所述个体给予基本上如本文描述的组合物。

在进一步的实施方式中，提供了用于病况或疾病的预防性治疗或治疗的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含复合物形式的至少一种脂质体和至少一种抗原，其中所述抗原和所述脂质体通过中间连接物连接。

在进一步的实施方式中，提供了疫苗在制备用于病况或疾病的预防性治疗或治疗的药物中的用途，其中所述疫苗包含基本上如本文描述的组合物。

通过参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

I-通过中间连接物与抗原连接的脂质体制剂

I.1.p27抗原与GpC-SH单链ODN(脱氧寡核苷酸)的缀合

方法

I.1.1.使用N-乙基马来酰亚胺(NEM)封闭抗原的-SH官能团

p27抗原含有内在的能够与马来酰亚胺反应的-SH。为了避免此SH与马来酰亚胺的预成熟反应，通过化学方式将其封闭。

N-乙基马来酰亚胺

为此，将P27(SIV)与25倍摩尔过量的N-乙基马来酰亚胺(Sigma，MW125.12)在室温搅拌温育1小时。使用pH 6.8的100mM磷酸盐作为洗脱缓冲液在PD10柱(Amersham)上除掉多余的反应剂。收集1ml的级份并通过在280nm的吸收值进行监视。汇集那些包含NEM修饰的p27的级份并通过Lowry(蛋白含量)法进行分析。通过Ellman氏剂量估计反应的效力。

收集并汇集包含纯化的抗原的级份2-4。

在汇集的级份中进行直接Ellman测定以验证所有的SH官能团都被封闭。

I.1.2.p27的激活

将8.7ml浓度为～1.1mg/ml的SH-封闭的p27(NEM修饰的p27)与(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代-琥珀酰亚胺酯，Pierce)按照等于6的S-GMBS/p27摩尔比温育1小时(RT，磁力搅拌)。使用pH 6.8的100mM磷酸盐作为洗脱缓冲液，使用PD10柱(Amersham)除掉副产物和多余的反应剂。收集1ml的级份并通过在280nm的吸收值进行监视。汇集包含马来酰亚胺激活的p27的级份。通过Lowry法估计蛋白含量。通过间接Ellman氏剂量估计p27上的马来酰亚胺官能团的数目(检测到2.4个马来酰亚胺官能团)。S-GMBSN-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯)是双官能试剂，其在一侧包含琥珀酰亚胺官能团，在另一侧包含马来酰亚胺。琥珀酰亚胺与-NH官能团反应(例如与蛋白的碱性氨基酸反应)；马来酰亚胺与巯基(-SH)反应。

使用Lowry测定法对汇集物中的p27进行的定量揭示其为1.33mg/ml(对于5.6ml的总体积)。使用间接Ellman测定以验证激活率。数据显示：S-GMBS/p27为6的比例导致平均激活2个官能团/蛋白。凝胶电泳显示该比例产生相对匀质的激活的p27群体。使用较高的比例(7.5和15)导致较高分子量条带的模糊图谱，这说明可能发生了数个蛋白的交联(数据未显示)。因此，选择摩尔比为6进行进一步的实验。

I.1.3.p27抗原与GpC-SH ODN的缀合

将马来酰亚胺激活的p27与3.6倍摩尔过量的GpC-SH(获自Eurogentec，通过与马来酰亚胺官能团的数目比较，是1.5倍摩尔过量的；与SEQ ID NO：4所示序列互补的序列的磷酸二酯寡核苷酸，在3’末端具有巯基)在pH为6.8的磷酸盐缓冲液中温育。在室温温育1小时之后，加入半胱氨酸(Merck，4mg/ml)以猝灭反应，即使用过量的半胱氨酸中和未反应的马来酰亚胺官能团。通过以2mM磷酸盐缓冲液150mM NaCl pH 6.8透析来除掉过量的GpC。但是，通过SDS-PAGE进行的分析表明：由于游离蛋白和游离GpC仍然存在于缀合物中，所以通过凝胶过滤(Superdex 75)对其进行纯化。以2mM磷酸盐150mM NaCl pH 6.8进行洗脱。收集1ml的级份并通过在260和280nm的吸收值进行监视。汇集那些仅包含缀合物的级份。

图1(考马斯兰染色)显示：级份21-23包含p27-GpC缀合物，级份24、25包含未缀合的p27与p27-GpC缀合物的混合物，而其它级份仅包含未缀合的p27。图2(溴化乙锭或BET染色)显示：游离的GpC出现在级份24-29。

然后使用Superdex 75柱对级份24-26进行第二次纯化步骤。然后汇集仅包含缀合物的级份，并与级份21-23混合。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析最终的汇集物。在凝胶上观察到42kDa的条带，这表明平均有2个GpC寡聚体连接到每个p27蛋白上。

缀合物储存在-20℃直至使用。

I.2.脂质体与互补性CpG-SH寡聚体的缀合

为了将CpG-SH寡聚体(如SEQ ID NO：4所示序列的磷酸二酯CpG，在3’末端具有巯基)共价连接至脂质体的表面，制备了掺入了POPE-MAL脂衍生物(在其极性头部连接了马来酰亚胺官能团的POPE)的修饰的脂质体。以下描述了所使用的方法(脂膜水合)。

将DOPC(8.7mg)、胆固醇(2.5mg)、3D-MPL(0.5mg)和POPE-MAL[N-(3-马来酰亚胺-1-氧代丙基)L-α-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油烯基，NOF American corporation](1.3mg，代表～10％摩尔DOPC)溶解于2ml氯仿中。随后在氮流中蒸掉氯仿，并在真空下干燥3小时。向干燥脂膜中加入1ml 10mM PO4-150mM NaCl，pH 7.2，其含有7.5mg CpG-SH(代表相对于POPE-MAL而言1.5倍摩尔过量的CpG-SH)。

然后将由此形成的脂膜在水合介质中漩涡直至脂膜完全重悬。水合介质中存在的CpG-SH允许在相当不稳定的马来酰亚胺官能团降解之前在SH与马来酰亚胺之间发生反应。使用探针超声仪(50W)将溶液超声2分钟以获得SUV(单个单层囊泡，single unilamellar vesicle)，然后在磁力搅拌下在40℃温育1小时。

在温育的最后，通过超离心(200,000g，1h，4℃)将掺入了CpG的脂质体从游离的CpG-SH中纯化出来。除掉上清液(含有游离的CpG)，将沉淀(含有脂质体-CpG)重悬于100μl缓冲液。

作为最后一个步骤，使用半胱氨酸(25倍摩尔过量)在室温将脂质体表面处的未反应的马来酰亚胺官能团猝灭30分钟。再次沉淀脂质体以除掉多余的半胱氨酸并重悬于100μl缓冲液。

通过3％的琼脂糖凝胶电泳分析来自两个超离心的沉淀和上清液，并以溴化乙锭染色以检测CpG的存在(数据未显示)。

I.3.脂质体与p27的杂交

为了使缀合了GpC的p27结合至脂质体表面，通常按照如下所述进行杂交步骤。为此，将1.5ml脂质体-CpG缀合物(15mg/ml DOPC)和3mlp27-GpC缀合物(0.5mg/ml p27)在pH 7.4的PBS缓冲液中混合，并在37℃温育30分钟。作为对照(以确保p27-GpC通过DNA杂交在脂质体-CpG上特异性结合)，p27-GpC平行地与在其表面处不含CpG寡聚体的脂质体温育。

然后将测试和对照超离心以允许分离p27结合的脂质体(沉淀)和游离的p27-GpC(上清液)。然后通过SDS-PAGE和考马斯染色分析沉淀和上清液。图3A和3B中显示了两个代表性实验的数据。在测试的情况下，大部分p27在沉淀中被检出，而在对照中则没有；这表明脂质体表面处存在的CpG寡聚体允许p27与脂质体的有效结合。

在杂交之后向免疫原性组合物中加入QS21，达到100μg的浓度。该制剂被称作“P27--GpCCpG--ASA^*”，如表1和随附方框中所解释。

注意：对于免疫实验，注射由杂交形成的混合物，不除掉未结合的p27-GpC。

通过寡核苷酸连接物与抗原连接的脂质体的体内测试

材料和方法

试剂和培养基

如下总结和描述的制剂用于接种6-8周龄的C57BL/B6(H2Kb)雌鼠(10只/组)。小鼠接受间隔14天的两次注射，在第4、5和6周期间采血(关于实际的采血日，见图4)。以即配制剂肌肉内接种小鼠(注射进入左侧腓肠肌，最终体积为50μl)。使用编码SIV-p27蛋白的重组腺病毒进行异源初免-加强，佐剂p27用作对对照组，以5x10⁸VP的剂量注射腺病毒。研究设计显示于图4。

体内测定的制剂的总结

下表(表1)总结了所有的测试制剂，包括对照制剂。本发明的组合物以高亮标出。

表1：测试制剂的总结

为了清楚说明所用的佐剂抗原结合策略，尤其是对照组的设计，以下提供了图例以使技术人员容易地确定每个制剂的成分并将文中的描述与附图相联系。图例解释了表1(上文)、文中和附图中提及的制剂。

II-1.1对照制剂的制备

II-1.1.1含有ASA的制剂

将脂(例如来自卵黄的或合成的磷脂酰胆碱)、胆固醇和3D-MPL在有机溶剂中的混合物在真空下干燥(或者可替代地，在惰性气流中干燥)。然后加入水溶液(例如磷酸盐缓冲的盐水)，搅拌管直至液体成悬浮液。然后将该悬浮液进行微射流处理直至脂质体尺寸减小至大约100nm，然后通过0.2μm滤器进行无菌过滤。通常而言，胆固醇∶磷脂酰胆碱的比例是1∶4(w/w)，加入水溶液以使胆固醇的最终浓度是5至50mg/ml。脂质体具有确定的尺寸：100nm，其被称作SUV(小的单层囊泡)。将水溶液中的QS21加入至SUV。PBS组成为：Na₂HPO₄：8.1mM；KH₂PO₄：1.47mM；KCl：2.7mM；NaCl：137mM pH 7.4。该混合物被称作ASA。将ASA在存在p27抗原的情况下稀释，从而p27、3 D-MPL和QS21的终浓度都是100μg/ml。该制剂被称作“p27+ASA”。

II-1.1.2.p27与含有DOTAP的脂质体的结合或与PEI(聚乙烯亚胺)聚合物的结合

为了制备含有DOTAP的脂质体，将DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基])-N，N，N-三甲胺甲基硫酸酯)和DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)按照1/1的摩尔比在氯仿中混合，将溶剂在氮气流中蒸发掉以获得脂膜。将膜用含有50mM Hepes和6％蔗糖的缓冲液(pH 7.4)水合，以使DOTAP终浓度达到20mg/ml。将获得的囊泡依次挤压通过400nm和100nm的聚碳酸酯膜。

为了制备p27/DOTAP-DOPE复合物，将2ml p27(浓度为200μg/ml)与2ml DOTAP/DOPE脂质体(DOTAP浓度为4mg/ml)混合，将混合物在室温温育30分钟。该混合物的缓冲液组成是：Hepes：5mM；蔗糖：9％；pH7.4。为了估计结合效力，通过在200,000g超离心使脂质体沉淀，使用改良的Lowry程序测定沉淀和上清液中的p27。该实验中的结合率经估计为大约60％-70％的p27与脂质体结合。该制剂被称作“p27-+DOTAP”。

将PEI(MW＝750KD)溶解于pH 6.8的50mM Hepes+6％蔗糖。为了制备p27/PEI复合物，将2ml p27(在pH 6.8的50mM Hepes，6％蔗糖中，浓度为200μg/ml)与2ml PEI(在pH 6.8的50mM Hepes，6％蔗糖中，浓度为4mg/ml)混合，将混合物在室温温育30分钟。该制剂被称作“p27-+PEI”。

在向小鼠给药前将ASA佐剂与这两种制剂混合，从而ASA浓度等于用于其它组的浓度。

II-1.2器官收集

II-1.2.1PBL分离

从后眼窝静脉采血(50μl/小鼠，10只小鼠/组)并直接稀释于RPMI+肝素(LEO)培养基。通过lymphoprep梯度(CEDERLANE)分离PBL。然后清洗细胞，计数，最后以特别稀释度重悬于特别缓冲液中(见下文)。

II-1.2.2脾细胞分离

简而言之，通过破碎脾脏提取总细胞，然后将细胞重悬于大体积的RPMI(5个脾脏使用35ml)。通过lymphoprep梯度(CEDERLANE)分离脾细胞。然后清洗淋巴细胞，计数，最后以特别稀释度重悬于特别缓冲液中，以进一步用作CMC测定中的靶细胞。

II-1.2.3淋巴结细胞分离

简而言之，通过破碎引流淋巴结提取总细胞。将这些细胞小心地清洗两次，计数，最后以特别稀释度重悬于特别缓冲液中，以进一步用作CMC测定中的靶细胞。

II-1.3免疫学测定

II-1.3.1细胞内细胞因子染色(ICS)

在如上所述获取的血液样品中进行ICS。该测定包括两个步骤：离体刺激和染色。在完全培养基中进行离体淋巴细胞的刺激，所述完全培养基是RPMI 1640(Biowitaker)，补充了5％FCS(Harlan，Holland)，各1μg/ml的抗小鼠抗体CD49d和CD28(BD，Biosciences)，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，10μg/ml链霉素硫酸盐，10单位/ml青霉素G钠(Gibco)，10μg/ml链霉素50μM B-ME巯基乙醇和100倍稀释的非必需氨基酸，所有这些添加物都来自Gibco Life technologies。肽刺激全部在37℃，5％CO₂中进行。

步骤1：离体刺激(SIV-p27模型)

对于离体刺激，将5x10⁵至10x10⁵个PBL重悬于完全培养基中，该培养基补充了59种15-mer的SIV-p27肽(每种重叠11个氨基酸并包含购自Neosystem的不同的MHC I类限制性肽和MHC II类限制性肽)的汇集物，每种肽以1μg/ml的浓度存在。2小时后，加入1μg/ml Brefeldin-A(BD，Biosciences)，静置16小时，总共经过18小时后收集细胞。

步骤2：染色

刺激之后直接将PBL染色。简而言之，将细胞清洗一次，然后以抗小鼠抗体(全部购自BD，Biosciences)染色；所有后续步骤都在冰上进行。首先将细胞在50μl CD16/32溶液(1/50f.c.，FACS缓冲液)中温育10分钟。加入50μl T细胞表面标志物混合物(1/100CD8a perCp，1/100CD4 APC Cy7)并将细胞温育20分钟，然后清洗。将细胞在200μl的perm/fix溶液(BD，Biosciences)中固定并透化，在perm/wash缓冲液(BD，Biosciences)中清洗一次，然后在4℃以抗IFNg-APC、抗-TNFa-PE和抗IL2-FITC染色2小时或过夜。使用带有CELLQuest^TM软件的FACS Calibur^TM分析数据，每个测试获取对活的CD8设门中的15000个事件。

II-1.3.2体内检测细胞介导的细胞毒活性(体内CMC)

为了在体内测评抗原特异性细胞毒性，向免疫和对照小鼠注射抗原特异性和非特异性靶标的混合物(比例1/1)。向同系脾细胞和淋巴结细胞中载入或不载入1μg/ml的59种15-mer的肽的汇集物(包含完整SIV-p27蛋白)，然后分别以低剂量和高剂量的CFSE标记它们。对于差别化标记，使用浓度为0.2μM或2.5μM的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Molecular Probes-Palmoski等人；2002，J.Immunol.168，4391-4398)。以1/1的比例汇集两种类型的靶标并以10⁸个靶标/毫升的浓度重悬。在第2次注射之后21天，向每只小鼠尾静脉中注射200μl靶标混合物。通过在靶标注射后24小时处死的动物中采集的血液(颈静脉)中进行的FACS^R分析来测定细胞毒性。根据以下公式计算相对于抗原阴性对照的p27特异性靶细胞的裂解平均百分率：

注射前靶细胞＝体内注射之前，通过FACS获得的肽脉冲的靶标(preinj.+)与非脉冲的(preinj.-)靶标的混合物。

校正的靶标(+)＝体内注射之后，通过FACS获得的肽脉冲的靶标的数目，校正是为了将注射前混合物中preinj+细胞的数目考虑在内(见上文)。

II-1.3.3抗原特异性抗体效价：特异性IgG的(汇集的)血清分析(ELISA)

在第二次注射之后2周进行血清学分析。通过后眼窝穿孔从小鼠中采血(10只/组)。

使用的平板是96孔板(NUNC，免疫吸附平板)，其包被根据抗原模型而各异。

对于SIV-p27模型：通过ELISA测定抗-SIV-p27总IgG。在4℃以抗原包被96孔板过夜(每孔中100μl SIV-p27溶液，在PBS中5μg/ml)。按照以下进行显示步骤：将平板在清洗缓冲液(PBS/0.1％Tween 20(Merck))中清洗，在37℃以200μl饱和缓冲液(PBS/0.1％Tween 20/1％BSA)饱和1小时。除掉饱和缓冲液，并加入100μl稀释的小鼠血清，在37℃再温育60分钟。清洗3次之后，以100μl生物素化的抗小鼠总IgG(在饱和缓冲液中稀释1000倍)，将平板在37℃温育1小时。温育之后，再次按照上文描述清洗96孔板。每孔加入100μl链霉亲和素过氧化物酶溶液(Amersham)(在饱和缓冲液中稀释1000倍)。最后的清洗是在清洗缓冲液中的5步清洗。最后，每孔加入100μl OPDA(37.5μl ml Citrate de Na-0.05％吐温-pH4.5+15mg OPDA+37.5μl现配现加的H₂O₂)，将平板在黑暗中在室温放置20分钟。每孔加入100μl of H₂SO₄ 2N以终止反应。使用来自BIORAD的Elisa酶标仪在490/630nm的波长读取吸收值。使用Softmax-pro软件计算结果。

II-2结果

II-2.1离体检测产生细胞因子的T-细胞(ICS)

图5显示了在第二次注射后7天，对于不同小组检测到的产生细胞因子的CD8+T-细胞的比例。

初级CD8应答极低(数据未显示)。图8中显示的次级应答是初级应答的显然加强的结果。第二次注射后7天，对于接受包含游离p27和ASA(P27+ASA)的制剂的小鼠而言，CD8的比例是极低的。当p27通过DNA杂交与脂质体表面结合时(P27--GpCCpG-ASA^*)，CD8应答相对于P27+ASA明显升高，这表明p27与脂质体的结合对于CD8+T-细胞应答具有明显的加强效应。对照制剂如下(其中抗原/脂质体不可能通过寡聚体杂交而结合)：包含含有POPE-MAL的脂质体但不含结合的CpG的制剂(p27+ASA^*)，或包含与CpG结合的脂质体但是是未修饰的p27的制剂(p27+ASA^*--CpG)，或者包含与p27缀合的GpC但是具有在其表面处不含CpG的脂质体的制剂(p27--GpC+ASA^*)。所有这些对照制剂都诱导极低的CD8应答(＜0.5％)。这表明CD8应答的改进明显需要p27通过杂交与脂质体结合，其既不是由于抗原和/或脂质体的化学修饰，也不是仅仅由于存在与脂质体结合的修饰的CpG。综上，总体的数据显示：可以通过经互补性寡核苷酸的杂交使抗原与包含免疫刺激剂MPL和QS21的脂质体结合，由此达到改进的CD8应答。以包含阳离子脂((p27-+DOTAP)与ASA)或阳离子聚合物((p27-+PEI)与ASA)的制剂注射的小鼠均未诱导可检测比例的p27特异性CD8+T-细胞。后面的数据表明：抗原通过离子相互作用与颗粒系统例如DOTAP脂质体或PEI聚合物的结合不足以诱导CD8，因此说明：当抗原通过寡核苷酸杂交与ASA结合时所观察到的改进的CD8应答不是简单地由抗原的颗粒化引起的。

图6显示了在第二次注射后7天，对于不同小组检测到的产生细胞因子的CD4+T-细胞比例。如对于CD8应答所观测到的那样，初级CD4应答极低(数据未显示)。图9中显示的应答是免疫应答的显然加强的结果。在第二次注射后7天，数据清晰地表明抗原通过杂交与脂质体的结合对于CD4应答也具有阳性效应(比较p27+ASA与P27--GpCCpG-ASA^*)。如同对于CD8应答一样，对照制剂显示：CD4应答的增强不是由于蛋白的修饰(p27-GpC+ASA^*)，也不是仅仅由于脂质体的修饰(P27+ASA^*)，也不是仅由于存在与脂质体结合的CpG(P27+ASA^*-CpG)。以含有阳离子脂((p27-+DOTAP)与ASA)或阳离子聚合物((p27-+PEI)与ASA)的制剂注射的小鼠均没有诱导可检测比例的p27特异性CD4+T-细胞。

II-2.2体内检测的细胞毒性活性(CMC)

图7显示了在第二次注射后21天在体内检测的细胞毒性活性。在注射靶细胞后24小时分析PBL(详见材料和方法)。制剂(其中p27通过DNA杂交与脂质体表面结合)(P27--GpCCpG-ASA^*)相对于包含游离的p27和ASA的制剂(p27+ASA)诱导了更高的细胞毒性活性。对照组(p27-GpC+ASA^*、P27+ASA^*、P27+ASA^*-CpG)都没有诱导如P27--GpCCpG-ASA^*制剂所诱导的高水平的细胞毒性。以含有与阳离子脂((p27-+DOTAP)与ASA)或阳离子聚合物((p27-+PEI)与ASA)结合的抗原的制剂注射的小鼠均没有诱导可检测的体内细胞毒性活性。

II-2.3抗原特异性抗体效价：特异性IgG的(汇集的)血清分析(ELISA)

图8显示了在第二次注射后14天收集的单一血清中检测的抗-p27 IgG效价。在抗原通过DNA杂交与脂质体结合后，p27特异性抗体效价升高。在此，包含修饰的p27和ASA的制剂(P27-GpC+ASA^*)能够改进抗体应答。以包含阳离子脂((p27-+DOTAP)与ASA)或阳离子聚合物((p27-+PEI)与ASA)的制剂注射的组均没有诱导比在接受p27+ASA的小鼠中观察到的更高的抗体效价。

还测试了包含缺少CpG基序的寡核苷酸(SEQ ID NO：7GGTGTGTGCATTGCTTGGTGGTGG及其互补序列)的免疫原性组合物。对于证实存在杂交的样品，有趋势显示相对于非杂交对照的增加的免疫应答，虽然该趋势不是统计上显著的。

Claims

1.一种免疫原性组合物，其包含至少一种抗原递送颗粒和至少一种抗原，其中所述抗原和抗原递送颗粒通过中间连接物连接。

2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒选自：脂质体、ISCOM、水包油乳液中的油滴、微粒、纳米颗粒或油滴。

3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是脂质体。

4.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是ISCOM。

5.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是水包油乳液中的油滴。

6.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是微粒。

7.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是纳米颗粒。

8.权利要求1至7任一项的免疫原性组合物，其中所述连接物包含至少2个彼此互补的组件，并且其中第一连接物组件与所述抗原递送颗粒连接，与所述第一连接物组件互补的第二连接物组件与抗原连接。

9.权利要求1至8任一项的免疫原性组合物，其中所述2个互补性连接物组件结合在一起和/或是杂交的。

10.权利要求1至9任一项的免疫原性组合物，其中所述中间连接物包含至少一对互补性寡核苷酸序列。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中第一寡核苷酸与所述抗原递送颗粒连接，与所述第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸与抗原连接。

12.权利要求10的免疫原性组合物，其中一种或多种抗原与一种或多种抗原递送颗粒通过互补性寡核苷酸的杂交而连接。

13.权利要求10至12任一项的免疫原性组合物，其中所述寡核苷酸选自：DNA、RNA和PNA。

14.权利要求10至13任一项的免疫原性组合物，其中所述寡核苷酸是DNA。

15.权利要求14的免疫原性组合物，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯骨架。

16.权利要求14或15的免疫原性组合物，其中所述寡核苷酸中的至少一种包含一个或多个CpG基序。

17.权利要求14或15的免疫原性组合物，其中至少一种所述寡核苷酸不包含一个或多个CpG基序。

18.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述包含一个或多个CpG基序的寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的序列(ODN 2006)。

19.权利要求10至18任一项的免疫原性组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸被修饰以促进所述寡核苷酸与抗原递送颗粒和/或抗原的缀合。

20.权利要求10至19任一项的免疫原性组合物，其中通过添加巯基(SH)来修饰所述一种或多种寡核苷酸。

21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述巯基与所述寡核苷酸的3’末端缀合。

22.权利要求10至21任一项的免疫原性组合物，其中至少一种抗原递送颗粒通过化学缀合与第一寡核苷酸连接。

23.权利要求22的免疫原性组合物，其中至少一种抗原通过化学缀合与互补于所述第一寡核苷酸的第二寡核苷酸连接。

24.权利要求23的免疫原性组合物，其中至少一种抗原通过基于马来酰亚胺的化学缀合与所述寡核苷酸中的至少一种连接。

25.前述权利要求任意项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含免疫刺激剂。

26.权利要求25的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是脂质体并且其中至少一种脂质体包含一种或多种免疫刺激剂。

27.权利要求25或26的免疫原性组合物，其中所述免疫刺激剂选自：皂苷；Toll样受体4(TLR4)配体；Toll样受体7和/或8(TLR7/8)配体；Toll样受体9(TLR9)配体；或其任意组合。

28.权利要求26或27的免疫原性组合物，其中所述脂质体包含皂苷和/或TLR4配体。

29.权利要求27或28的免疫原性组合物，其中所述皂苷是Quil A的衍生物。

30.权利要求29的免疫原性组合物，其中所述Quil A衍生物是QS21。

31.权利要求27或28的免疫原性组合物，其中所述TLR4配体是单磷酰脂A。

32.前述权利要求任意项的免疫原性组合物，其中所述抗原递送颗粒是脂质体，并且其中至少一种脂质体包含甾醇。

33.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述甾醇是胆固醇。

34.前述权利要求任意项的免疫原性组合物，其包含一种或多种不同抗原。

35.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使第一寡核苷酸与抗原缀合；

c.在允许所述寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和抗原递送颗粒。

36.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使用合适的试剂封闭抗原中的任何游离巯基；

b.向所述抗原中加入马来酰亚胺基团；

c.使第一巯基激活的寡核苷酸与所述抗原缀合；

e.在允许寡核苷酸杂交的条件下混合所述抗原和脂质体。

37.用于医药的前述权利要求任意项的免疫原性组合物。

38.用于预防和/或治疗易患或患有疾病的人的前述权利要求任意项的免疫原性组合物。

39.前述权利要求任意项的免疫原性组合物在制备用于预防和/或治疗易患或患有疾病的人的药物中的用途。

40.易患或患有疾病的个体的治疗，所述治疗通过给予前述权利要求任意项要求保护的免疫原性组合物进行。

41.一种试剂盒，其包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒。

42.一种试剂盒，其包含i)与一种或多种寡核苷酸连接的至少一种抗原。

43.一种试剂盒，其包含i)与寡核苷酸连接的至少一种抗原递送颗粒；和ii)与互补于i)中的寡核苷酸的寡核苷酸连接的至少一种抗原。

44.权利要求41至43任一项的试剂盒，其包含一种或多种不同类型的抗原递送颗粒。

45.权利要求41至44任一项的试剂盒，其包含一种或多种不同抗原。

46.权利要求41至45任一项的试剂盒，其包含一种或多种不同寡核苷酸。

47.权利要求41至46的试剂盒，其还包含一种或多种免疫刺激剂。

48.权利要求43至47任一项的试剂盒，其中所述至少一种抗原递送颗粒与至少一种抗原通过经所述互补性寡核苷酸的杂交而连接，或者所述至少一种抗原与至少一种抗原递送颗粒通过经所述互补性寡核苷酸的杂交而连接。

49.权利要求41至47任一项的试剂盒，其中所述一种或多种抗原递送颗粒和一种或多种抗原不通过互补性寡核苷酸杂交。