KR101138131B1 - 작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극특성의 조절 - Google Patents

작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극특성의 조절 Download PDF

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Abstract

전술한 발명이 명료함과 이해를 목적으로 어느 정도 상세하게 설명되긴 하였 지만, 본 분야의 기술자에게는 본 명세서를 숙지함에 따라 본 발명의 범주 및 첨부되는 특허청구범위를 벗어남이 없이 외형 및 상세한 부분에 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 분명할 것이다.

Description

작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극 특성의 조절{MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES BY SMALL OLIGONUCLEOTIDE-BASED COMPOUNDS}
본 발명은 면역학 및 면역자극제로서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 면역요법 적용에 관한 것이다.
관련 분야의 요약
올리고뉴클레오티드는 진단용 프로빙 방법으로부터 PCR에서 유전자 발현의 안티센스 억제 및 면역요법 적용에 이르기까지 광범위한 기술에 사용되는, 현대 분자 생물학에서는 없어서는 안되는 도구가 되어 왔다. 올리고뉴클레오티드의 이러한 광범위한 사용은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 신속하고 효과적이면서도 저렴한 방법에 대한 요구가 증가하는 추세를 낳았다.
안티센스 및 진단적 적용을 위한 올리고뉴클레오티드의 합성은 현재 일상적으로 이루어질 수 있다. 참조, 예: [(Methods in Molecular Biology , Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp.165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); 및 Uhlmann and3 Peyman, supra; Agrawal and lyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995); 및 Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)]. 초기의 합성 방법은 포스포디에스테르 및 포스포트리에스테르 화학을 포함하였다. 예컨대, 코라나 등은 올리고뉴클레오티드 합성에 대한 포스포디에스테르 화학을 개시하였다(Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209 (1972)). 리스는 문헌에서 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 포스포트리에스테르 화학을 개시하였다(Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978)). 이들 초기 방법은 합성에 대한 보다 효율적인 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트 방법에 대한 길을 대대적으로 열어주었다. 예를 들어 뷰케이지와 카루테르는 폴리뉴클레오티드 합성에서 데옥시리보누클레오시드 포스포라미다이트를 사용하는 것에 대해 개시하였다(Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)). 아그라월과 잠멕닉은 미국 특허 제 5,149,798호(1992)에서 H-포스포네이트 방법에 의한 올리고뉴클레오티드의 최적화된 합성을 개시하였다. 이들 현대적인 방법 둘 모두는 다양한 변형된 뉴클레오티드간 결합을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 사용되었다. 아그라월과 굿차일드는 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 메틸포스포네이트의 합성을 문헌에서 교시하였다(Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987)). 커널리 등은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트의 합성을 개시하였다(Connolly et al., Biochem. 23:3443 (1984)). 제이거 등은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 합성을 개시하였다(Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988)). 아그라월 등은 H-포스포네이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트의 합성을 개시하였다 (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7079-7083 (1988)).
보다 최근에 이르러, 여러 연구자들에 의해 면역요법 분야에서 면역자극제로서의 올리고뉴클레오티드의 사용의 타당성이 입증되었다. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 면역 자극을 유도할 수 있다는 관찰은 이러한 부수 효과를 치료적 도구로서 개발하는 데에 있어서 관심을 불러 일으켰다. 이런 노력들은 디뉴클레오티드 천연 CpG를 함유하고 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 초점이 모아졌다. 구라모토 등은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 앞뒤역순상동서열(palindrome)을 함유하고 있는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도하고 천연 킬러 활성을 향상시킬 수 있다고 교시하고 있다(Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)). 크리그 등은 포스포로티오에이트 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 면역자극성이라는 것을 개시하였다(Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)). 리앙 등은 그러한 올리고뉴클레오티드가 인간 B 세포를 활성화시킨다고 설명하였다(Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)). 몰도베뉴 등은 CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 향상시킨다고 교시하였다(Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)). 맥클러스키와 데이비스는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 효능있는 애쥬번트로서 작용하여 B형 간염 표면 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다고 교시하였다(McCluskie and Davis, J. Immunol. 161: 4463-4466 (1998)).
CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 다른 변형도 면역 반응의 조절제로서 작용하는 이들의 능력에 또한 영향을 줄 수 있다(참조: Zhao et al., Biochem . Pharmacol . (1996) 51:173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic acid Drug Dev . (l997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg . Med . Chem . Lett . (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med . Chem . Lett . (2000) 10:1051-1054; Yu et al., Bioorg . Med . Chem. Lett . (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg . Med . Chem . Lett . (2001) 11:2263-2267; 및 Kandimalla et al., Bioorg . Med . Chem . (2001) 9:807-813).
CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 조절할 수 있는 하나의 반응은 천식이다. 알레르기성 천식 반응은 2형 T-헬퍼(Th2) 림프구의 활성화에 의해 특징화된다. Th2 림프구에 의해 유도된 반응은 천식에서 알레르기성 염증의 발병 및 전파에서 중요한 역할을 한다. Th2 사이토카인 IL-5는 호산구의 생성 및 생존을 증가시켜 기도 호산구증가증을 증가시킨다. 다른 Th2 사이토카인(IL-4, IL-9, 및 IL-13)은 또한 알레르겐-특이적 IgE 생산, 비만세포 증식, 내피세포 부착 분자 발현, 및 기도 과민반응을 유도하여 알레르기성 염증에서 중요한 역할을 한다. 코르티코스테로이드는 현재 알레르기성 천식을 위해 유일하고 광범위하게 사용되는 치료제이다. 스테로이드 치료법은 염증 증상을 최소화하는데는 효능이 있지만 질환을 치유하지는 못한다. 연속 요법이 알레르기성 천식 진행을 저지시키기 위해 요구된다.
이들 보고는 면역자극성 올리고뉴클레오티드에 의해 유발된 면역 반응을 향 상시키고 변형시킬 필요성이 있음을 명백히 보여준다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 올리고뉴클레오티드 화합물에 의해 유발된 면역 반응을 향상시키고 변형시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역요법 적용을 위한 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 면역자극 효과를 증가시킬 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 면역자극 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 최적으로 제공하는 변형이 그 올리고뉴클레오티드의 면역자극 능력을 극적으로 향상시킨다는 것을 발견하였다. 그러한 올리고뉴클레오티드를 본원에서는 '이뮤노머(immunomer)'로 언급한다.
그러므로, 제 1 측면으로, 본 발명은 3' 말단, 뉴클레오티드간 결합부, 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결되어 있는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하되, 상기 올리고뉴클레오티드중 적어도 하나는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머를 제공한다.
한 실시태양에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머는 SEQ ID NO 170의 서열을 포함한다.
제 2 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO 170의 서열을 포함하는 면역조절 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 추가로, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 전사활성화(trans-activating) 인자, 펩티드, 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 보조자극 분자를 포함하는 면역조절 조성물을 제공한다. 본 발명의 본 측면에서, 보조자극 분자는 임의로 면역조절 올리고뉴클레오티드 이뮤노머에 컨쥬게이션되고, 면역조절 조성물은 추가로 애쥬번트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 임의로 포함한다.
제 3 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO 170의 서열을 포함하는 면역조절 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 추가로, 펩티드, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택되는 항원, 또는 알레르겐인 항원을 포함하는 면역조절 조성물을 제공한다. 본 발명의 본 측면에서, 면역조절 조성물은 추가로 애쥬번트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 임의로 포함한다.
또다른 실시태양에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머는 SEQ ID NO 171의 서열을 포함한다.
제 4 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO 171의 서열을 포함하는 면역조절 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 추가로, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 전사활성화 인자, 펩티드, 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 보조자극 분자를 포함하는 면역조절 조성물을 제공한다. 본 발명의 본 측면에서, 보조자극 분자는 임의로 면역조절 올리고뉴클레오티드 이뮤노머에 컨쥬게이션되고, 면역조절 조성물은 추가로 애쥬번트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 임의로 포함한다.
제 5 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO 171의 서열을 포함하는 면역조절 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 추가로, 펩티드, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택되는 항원, 또는 알레르겐인 항원을 포함하는 면역조절 조성물을 제공한다. 본 발명의 본 측면에서, 면역조절 조성물은 추가로 애쥬번트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 임의로 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 이뮤노머를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 기도 염증, 염증 질환, 알레르기, 또는 천식에 걸린 환자를 치료학적으로 처리하는 방법을 제공한다.
제 6 측면으로, 본 발명은 이뮤노머가 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결되며 하나 이상의 5' 말단을 갖는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드중 적어도 하나는 접근가능한 5' 말단을 갖는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이며 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는, 환자를 치료학적으로 처리하는 방법을 제공한다. 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG, C*pG, CpG*,및 C*pG*로 구성된 군으로부터 선택되되, 여기에서, C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*는 2'-데옥시티미딘. 아라비노시티딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 다른 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*는 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 2'-데옥시-2'치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신이다.
제 7 측면으로, 본 발명은 이뮤노머가 SEQ ID NO 170의 서열, 또는 SEQ ID NO 171의 서열, 또는 SEQ ID NO 172의 서열, 또는 SEQ ID NO 173의 서열을 포함하는, 환자를 치료학적으로 처리하는 방법을 제공한다.
제 8 측면으로, 본 발명은 이뮤노머 또는 항원, 또는 둘 모두가 면역원성 단백질 또는 비-면역원성 단백질에 연결되어 있는, 상기 질환 또는 질병과 관련된 항원을 투여하는 것을 추가로 포함하고/거나 애쥬번트를 투여하는 것을 추가로 포함하여, 환자를 치료학적으로 처리하는 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 이뮤노머를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 기도 염증, 염증 질환, 알레르기, 또는 천식에 걸린 환자에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 면역 반응이 Th1 및/또는 Th2 면역 반응인 방법을 제공한다.
제 9 측면으로, 본 발명은 이뮤노머가 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결되며 하나 이상의 5' 말단을 갖는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드중 적어도 하나는 접근가능한 5' 말단을 갖는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이며 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는, 환자에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG, C*pG, CpG*,및 C*pG*로 구성된 군으로부터 선택되되, 여기에서, C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*는 2'-데옥시티미딘. 아라비노시티딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 다른 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*는 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 2'-데옥시-2'치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신이다.
제 10 측면으로, 본 발명은 이뮤노머가 SEQ ID NO 170의 서열, 또는 SEQ ID NO 171의 서열, 또는 SEQ ID NO 172의 서열, 또는 SEQ ID NO 173의 서열을 포함하는, 환자에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.
제 11 측면으로, 본 발명은 이뮤노머 또는 항원, 또는 둘 모두가 면역원성 단백질 또는 비-면역원성 단백질에 연결되어 있는, 상기 질환 또는 질병과 관련된 항원을 투여하는 것을 추가로 포함하고/거나 애쥬번트를 투여하는 것을 추가로 포함하여, 환자를 치료학적으로 처리하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 대표적인 이뮤노머의 개략적인 도면이다.
도 2는 본 발명의 여러가지 대표적인 이뮤노머를 도시한다.
도 3은 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성에 적절한 대표적인 작은 분자 링커의 군을 도시한다.
도 4는 본 발명의 이뮤노머의 병렬 합성에 적절한 대표적인 작은 분자 링커의 군을 도시한다.
도 5는 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성에 대한 합성 반응식이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 6은 본 발명의 이뮤노머의 병렬 합성에 대한 합성 반응식이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸.
도 7A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서의 이뮤노머 1-3에 의한 IL- 12의 유도를 그래프로 도시한다. 이들 데이타는 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 2가 모노머 올리고 1보다 더 강한 IL-12의 유도 인자라는 것과, 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 3이 올리고 1과 비교하여 면역 자극을 생성하는데 동일하거나 더 약한 능력을 가지고 있음을 시사한다.
도 7B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서의 이뮤노머 1-3에 의한 IL-6의 유도(각각 상부에서 바닥까지)를 그래프로 도시한다. 이들 데이타는 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 2가 모노머 올리고 1보다 더 강한 IL-6의 유도 인자라는 것과, 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 3이 올리고 1과 비교하여 면역 자극을 유도하는데 동일하거나 더 약한 능력을 가지고 있음을 시사한다.
도 7C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서의 이뮤노머 1-3에 의한 IL-10의 유도 (각각 상부에서 바닥까지)를 그래프로 도시한다.
도 8A는 각각 접근불가능한 5'-말단과 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 상이한 농도의 이뮤노머 5와 6에 의한, 세포 배양액중에서의 BALB/c 마우스 비장 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 8B는 CpG 모티프의 5'-플랭킹(flanking) 서열에서 면역원성 화학적 변형이 일어난 이뮤노머 4-6에 의한 BALB/c 마우스 비장 비대를 그래프로 도시한다. 다시 말하면, 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머(6)는 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 5 및 모노머 올리고 4와 비교할 때 비장 비대를 증가시키는 능력이 보다 크다.
도 9A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-12의 유도를 그래프로 도시한다.
도 9B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-6의 유도를 그래프로 도시한다.
도 9C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-10의 유도를 그래프로 도시한다.
도 10A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 이뮤노머 14, 15 및 16에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 10B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 이뮤노머 14 및 16에 의한 IL-12에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 10C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 이뮤노머 14 및 16에 의한 IL-6에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 11A는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 11B는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 IL-12에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 11C는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 상이한 농도의 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 IL-6에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다.
도 12는 올리고뉴클레오티드 4 및 이뮤노머 14, 23 및 24를 사용한 BALB/c 마우스 비장 비대를 그래프로 도시한다.
도 13은 비-뉴클레오티드 결합이 뉴클레오시드에, 뉴클레오염기에서, 3' 위치에서, 또는 2' 위치에서 부착될 수 있음을 보여주는, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드의 개략도이다.
도 14는 실시예 13에서 사용된 화학적 치환을 도시한다.
도 15는 실시예 13의 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어진 사이토카인 프로필을 도시한다.
도 16은 아미노 링커와 비교하여 글리세롤 링커에 대한 상대적인 사이토카인 유도를 도시한다.
도 17은 다양한 링커 및 링커 조합물에 대한 상대적인 사이토카인 유도를 도시한다.
도 18A-E는 다양한 PS 및 PO 이뮤노머와 올리고뉴클레오티드에 대한 상대적인 뉴클레아제 내성을 도시한다.
도 19는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 사이토카인 유도를 도시한다.
도 20은 C3H/Hej 마우스 비장 세포 배양액중에서 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 사이토카인 유도를 도시한다.
도 21은 고농도의 이뮤노머에서 C3H/Hej 마우스 비장 세포 배양액중에서의 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 사이토카인 유도를 도시한다.
도 22는 이뮤노머(IMO)의 서열 및 화학적 변형을 나타낸다.
도 23A 및 23B는 비장 세포 배양액에서 사이토카인 반응에 의해 입증되는 마우스에서 OVA-유도된 Th2 면역 반응의 IMO 저해를 나타낸다.
도 24A 및 24B는 혈청 항체 반응에 의해 입증되는 바와 같은, 마우스에서 OVA-유도된 Th2 면역 반응의 IMO 저해를 나타낸다.
도 25는 마우스의 확립된 OVA-유도된 알레르기성 천식에 대한 IMO 1 및 2의 용량-의존적 효과를 나타낸다. 사이토카인 분비는 OVA-회상(recall) 반응으로 비장 세포 배양액에서 일어난다. IMO 1 및 2 둘 모두는 용량-의존적 방식으로 IL-5 분비를 현저하게 저해시켰다. IL-13은 IMO 화합물 둘 모두에 의해 현저하게 저해되었다. IMO 화합물 둘 모두는 용량-의존적 IFN-g 분비를 유도하였다.
도 26은 혈청 항원-특이적 항체 및 전체 항체를 나타낸다. IMO 1 및 2는 OVA-특이적 IgE의 용량-의존적 감소 및 OVA-특이적 IgG2a의 증가를 일으켰다.
도 27은 실험을 받은 적이 없는(나이브(naive)) 마우스에서 국소 및 전신 사이토카인 수준에 대한 단일 고용량 대 다회 저용량의 IMO 화합물의 효과를 나타낸다. 단일 용량 100mg은 고수준의 전신 사이토카인 반응을 유도하였다. 대조적으로, 3회의 저용량(3x33mg)은 높은 국소 (BALF) 사이토카인 반응을 유도하였다.
도 28은 나이브 마우스에서 국소 및 전신 사이토카인 수준에 대한 IMO 화합물의 저용량 다회 투여의 용량-의존적 효과를 나타낸다. IMO 1은 소량으로 여러번 투여되었을 때, 마우스에서 국소 (BALF) 사이토카인 수준을 증가시켰지만, 전신 사 이토카인 수준은 증가시키지 않았다. 이러한 효과는 용량-의존적이다.
도 29는 시험관내에서 IMO 및 코르티코스테로이드의 효과를 비교한다. IMO 1 및 부데소나이드 둘 모두는 OVA-유도된 Th2 사이토카인 분비를 억제시켰다. 그러나, IMO 1만이 강력한 Th1 사이토카인 유도를 나타내었다.
바람직한 실시태양의 상세한 설명
본 발명은 면역요법 적용을 위한 면역자극제로서 올리고뉴클레오티드의 치료학적 용도에 관한 것이다. 본원에서 인용되는 공개 특허, 특허 출원 및 참고문헌들은 본원에 참고로 삽입된다. 본원에서 인용된 참고문헌이 교시하는 것과 본 발명의 상세한 설명이 일치하지 않는 경우, 본 발명의 목적상, 본 발명의 상세한 설명이 우선한다.
본 발명은 면역요법 적용, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 성인 및 소아 및 수의학 분야에서의 암, 자가면역 질환, 천식, 호흡기 알레르기, 음식 알레르기, 및 세균, 기생충, 및 바이러스 감염의 치료에 사용되는 면역자극성 화합물에 의해 유발된 면역 반응을 향상시키고 조절하는 방법을 제공한다. 알레르기성 천식이 본 발명의 방법 및 화합물에 의한 치료에 특히 바람직한 질환이다. 따라서, 본 발명은 또한 면역요법을 위한 최적 수준의 면역자극 효과를 갖는 화합물 및 상기 화합물을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 이뮤노머는 DNA 백신, 항체, 알레르겐, 화학요법제, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 배합되는 애쥬번트로서 유용하다.
본 발명자들은 놀랍게도 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 최적으 로 제공하는 변형이 그 올리고뉴클레오티드의 면역자극 능력에 극적으로 영향을 준다는 것을 발견하였다. 그러한 올리고뉴클레오티드를 본원에서는 "이뮤노머"로 언급한다.
제 1 측면으로, 본 발명은 3' 말단, 또는 뉴클레오시드간 결합부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오티드중 적어도 하나는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "접근가능한 5' 말단"은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 이뮤노머를 인지하고 그에 결합하여 면역계를 자극하는 인자들이 그에 접근하도록 하기에 충분히 이용가능하다는 것을 의미한다. 접근가능한 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드에서, 말단 당의 5' OH 위치는 2개 이상의 뉴클레오시드 잔기에 공유결합되지 않는다. 임의로, 5' OH는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 부분, 방향족 또는 지방족 링커, 콜레스테롤, 또는 접근성을 방해하지 않는 또 다른 물질에 연결될 수 있다.
본 발명의 목적상, "이뮤노머"는 3' 말단, 뉴클레오시드간 결합부, 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 직접 또는 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오티드(이뮤노머와 관련하여)중 하나 이상이 면역자극성 올리고뉴클레오티드이며 접근가능한 5' 말단을 갖는 임의의 화합물을 의미하고, 이 화합물은 척추동물에 투여될 때 면역 반응을 유도한다. 몇몇 실시태양에서, 척추동물은 인간을 포함하는 포유 동물이 다.
몇몇 실시태양에서, 이뮤노머는 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드(이뮤노머와 관련하여)를 포함한다. 바람직하게는, 각각의 그러한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 접근가능한 5' 말단을 갖는다.
특정 실시태양에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드(들) 이외에, 이뮤노머는 또한 유전자에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "상보적인"은 올리고뉴클레오티드가 생리적 조건하에서 유전자의 영역에 하이브리드화하는 것을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 유전자의 발현을 하향조절한다. 그러한 하향조절성 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 올리고뉴클레오티드, 작은 억제성 RNA 및 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용되는 용어 "유전자를 하향조절한다"는 것은 유전자의 전사 또는 유전자 산물의 번역을 저해하는 것을 의미한다. 그러므로, 본 발명의 이러한 실시태양에 따른 이뮤노머는 면역계를 자극하면서도 하나 이상의 특정 질환 표적을 표적화하는데 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 이뮤노머는 리보자임 또는 유인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "리보자임"은 촉매적 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 바람직하게는 리보자임은 특정 핵산 표적에 결합하여 그 표적을 절단한다. 본원에서 사용되는 용어 "유인 올리고뉴클레오티드"는 서열-특이적 인 방식으로 전사 인자에 결합하여 전사 활성을 정지시키는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 바람직하게는 리보자임 또는 유인 올리고뉴클레오티드는 제한없이, 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 포함하는 2차 구조를 나타낸다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 폴리(I)-폴리(dC)를 포함한다. 특정 실시태양에서는 적어도 하나의 Nn 세트가 3 내지 10개의 dG 및/또는 G 또는 2'-치환된 리보 또는 아라비노 G로 된 스트링(string)을 포함한다.
본 발명의 목적상, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 다수의 연결된 뉴클레오시드 단위로부터 형성된 폴리뉴클레오시드를 말한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는 기존의 핵산 공급원으로부터 얻어질 수 있지만, 바람직하게는 합성 방법에 의해 제조된다. 바람직한 실시태양에서 각 뉴클레오시드 단위는 헤테로사이클릭 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로스, 아라비노스, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노스, 2'-O-치환된 아라비노스 또는 헥소스 당 기를 포함한다. 뉴클레오시드 잔기는 공지된 수많은 뉴클레오시드간 결합중 어느 하나에 의해 상호간에 결합될 수 있다. 그러한 뉴클레오시드간 결합으로는 제한없이 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 다리결합된 포스포라미데이트, 다리결합된 메틸렌 포스포네이트, 다리결합된 포스포로티오에이트, 및 설폰 뉴클레오시드간 결합을 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체특이적 뉴클레오시드간 결합(예를 들어, (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 결합)을 갖는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "디뉴클레오티드"는 결합이 포스페이트기를 포함하고 있는 결합이든 또는 그렇지 않든 간에 그러한 임의의 뉴클레오시드간 결합을 갖는 폴리뉴클레오시드 및 디뉴클레오시드를 포함하는 것으로 명백하게 의도된다. 특정 바람직한 실시태양에서 이들 뉴클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 결합, 또는 이들의 조합일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 3 내지 약 35개의 뉴클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30개의 뉴클레오시드 잔기, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 20개의 뉴클레오시드 잔기를 갖는다. 몇몇 실시태양에서 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 18개, 또는 약 5 내지 약 14개의 뉴클레오시드 잔기를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 정확한 수가 결정적이지 않다는 의미를 함축한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오시드 잔기의 수는 중요하지 않으며, 1개 또는 2개의 뉴클레오시드 잔기를 덜 갖거나, 1개 내지 수개의 추가의 뉴클레오시드 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드도 상기 기술된 각 실시태양의 각각의 동등물로서 주시된다. 몇몇 실시태양에서는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 11개의 뉴클레오티드를 갖는다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 제한없이, 단백질 기, 친유성 기, 인터칼 레이팅 제제, 디아민, 폴산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하는 추가의 치환체를 갖는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 임의의 다른 뉴클레오염기 함유 중합체를 포함하며, 이들로는 제한없이 펩티드 핵산(PNA), 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산(PHONA), 고정된(locked) 핵산(LNA), 모르폴리노-백본 올리고뉴클레오티드, 및 알킬 링커 또는 아미노 링커가 있는 백본 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "2차 구조"는 분자내 및 분자간 수소 결합을 의미한다. 분자내 수소 결합을 통해 스템-루프 구조가 형성된다. 분자간 수소 결합을 통해 이중 핵산 분자가 형성된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 변형된 헤테로사이클릭 염기, 변형된 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함하는 뉴클레오시드이다. 몇몇 실시태양에서, 변형된 뉴클레오시드는 본원에서 설명되는 바와 같이 비-천연 피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오시드이다. 몇몇 실시태양에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-치환된 리보뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노시드이다.
본 발명의 목적상, 용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드"는 펜토스 부분의 2' 위치에 있는 하이드록실기가 치환되어 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드를 생성하게 되는 리보뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게 그러한 치환은 1-6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하고 있는 저급 알킬기, 또는 6-10개의 탄소 원자를 갖는 아릴기로 이루어지며, 그러한 알킬, 또는 아릴기는 치환되지 않을 수 있거나, 예를 들어, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시, 또는 아미노기로 치환될 수 있다. 그러한 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드의 예로는 제한 없이, 2'-O-메틸리보뉴클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸리보뉴클레오시드를 포함한다.
용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드"는 또한 2'-하이드록실기가 1-6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하고 있는 저급 알킬기, 또는 아미노 또는 할로기로 대체된 리보뉴클레오시드를 포함한다. 그러한 2'-치환된 리보뉴클레오시드의 예로는 제한 없이, 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 및 2'-프로파길 리보뉴클레오시드를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 하이브리드 및 키메라 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "키메라 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 그러한 키메라 올리고뉴클레오티드의 바람직한 일례는 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 또는 포스포로디티오에이트 영역 및 비-이온성 결합, 예를 들어, 알킬포스포네이트 또는 알킬포스포노티오에이트 결합을 포함하는 키메라 올리고뉴클레오티드이다(참조: Pederson et al., 미국 특허 제 5,635,377호 및 제 5,366,878호).
"하이브리드 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 그러한 하이브리드 올리고뉴클레오티드의 바람직한 한 가지 예는 리보뉴클레오티드 또는 2'-치환된 리보뉴클레오티드 영역, 및 데옥시 리보뉴클레오티드 영역을 포함한다(참조: Metelev 및 Agrawal, 미국 특허 제 5,652,355호, 제 6,683,167호, 제 6,346,614호 및 제 6,143,881호).
본 발명의 목적상, 용어 "면역자극성 올리고뉴클레오티드"는 척추동물, 예를 들어, 어류, 가금류, 또는 포유 동물에 투여되었을 때 면역 반응을 유도하는 상기 기술한 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 말한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유 동물"은 제한 없이, 래트, 마우스, 개, 고양이, 말, 소, 젖소, 돼지, 토끼, 인간 이외의 영장류, 및 인간을 포함한다. 유용한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 문헌에 설명되어 있다(Agrawal et al., WO 98/49288, 1998.11.5. 공개; WO 01/12804, 2001.2.22. 공개; WO 01/55370, 2001.8.2. 공개; PCT/USO1/13682, 2001.4.30. 출원; 및 PCT/USO1/30137, 2001.9.26. 출원). 바람직하게는, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 식 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하되, 여기에서 Pyr은 천연 또는 합성 피리미딘 뉴클레오시드이고 Pur은 천연 또는 합성 퓨린 뉴클레오시드이다. 본원에서 사용되는 용어 "피리미딘 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 염기 성분이 피리미딘 염기인 뉴클레오시드를 말한다. 유사하게, 용어 "퓨린 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 염기 성분이 퓨린 염기인 뉴클레오시드를 말한다. 본 발명의 목적상, "합성" 피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오시드는 비-천연 피리미딘 또는 퓨린 염기, 비-천연 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 피리미딘 뉴클레오시드는 하기 구조식(I)을 갖는다:
Figure 112006048749664-pct00001
상기 식에서,
D는 수소 결합 도너(donor)이고;
D'은 수소, 수소 결합 도너, 수소 결합 억셉터(acceptor), 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 구성된 군으로부터 선택되며;
A는 수소 결합 억셉터 또는 친수성 기이고;
A'는 수소 결합 억셉터, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 탄소 또는 질소이고;
S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다.
바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 또 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기에 적절한 다른 링커 부분에 의해 유도체화된다.
바람직한 수소 결합 도너로는 제한 없이, -NH-, -NH2 , -SH 및 -OH를 포함한다. 바람직한 수소 결합 억셉터로는 제한 없이, C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예를 들어, 시토신의 N3을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, (I)의 염기 부분은 비-천연 피리미딘 염기이다. 바람직한 비-천연 피리미딘 염기의 예로는, 제한 없이, 5-하이드록시시토신, 5-하이드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 및 4-티오우라실을 포함한다. 그러나, 몇몇 실시태양에서는 5-브로모시토신이 특별히 배제된다.
몇몇 실시태양에서, (I)의 당 부분 S'는 비-천연 당 부분이다. 본 발명의 목적상, "천연 당 부분"은 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하는 당 부분, 예를 들어, 리보스 및 2'-데옥시리보스이고, "비-천연 당 부분"은 핵산의 일부로서 천연적으로 존재하지 않지만 올리고뉴클레오티드의 백본에 사용될 수 있는 임의의 당, 예를 들어, 헥소스이다. 아라비노스와 아라비노스 유도체가 바람직한 당 부분의 예이다.
본 발명에 따른 바람직한 퓨린 뉴클레오시드 유사체는 하기 구조식(II)를 갖는다:
Figure 112006048749664-pct00002
상기 식에서,
D는 수소 결합 도너이고;
D'은 수소, 수소 결합 도너, 및 친수성 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 수소 결합 억셉터 또는 친수성 기이고;
X는 탄소 또는 질소이며;
각각의 L은 독립적으로 C, O, N, 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고;
S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다.
바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 또 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기에 적절한 다른 링커 부분에 의해 유도체화된다.
바람직한 수소 결합 도너로는 제한 없이, -NH-, -NH2 , -SH 및 -OH가 있다. 바람직한 수소 결합 억셉터로는 제한 없이, C=O, C=S, -NO2 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예를 들어, 구아닌의 N1을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, (II)의 염기 부분은 비-천연 퓨린 염기이다. 바람직한 비-천연 퓨린 염기의 예로는 제한 없이, 6-티오구아닌 및 7-데아자구아닌이 있다. 몇몇 실시태양에서, (II)의 당 부분 S'은 상기 구조식 (I)에 대하여 설명된 것과 같이 천연 당 부분이다.
바람직한 실시태양에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG, C*pG, CpG*, 및 C*pG*로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 다른 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드 또는 드물게 발생되는 피리미딘 뉴클레오시드이며, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 다른 비-천연 퓨린 뉴클레오시드 또는 드물게 발생되는 퓨린 뉴클레오시드이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오시드간 결합이다. 특정 바람직한 실시태양에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 디뉴클레오티드의 한 쪽 또는 양쪽에 면역자극성 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식(III)의 면역자극성 도메인을 포함한다:
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' ( III )
상기 식에서,
Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 다른 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고;
Z는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이며, G*는 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 다른 비-천연 퓨 린 뉴클레오시드이고;
N1은 각각의 경우에 바람직하게는 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성(abasic) 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 결합에 의해 3'측상의 인접 뉴클레오시드에 연결된 뉴클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드간 결합은, 제한없이, 약 2옹스트롬 내지 약 200 옹스트롬의 길이를 갖는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 결합, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합로 구성된 군으로부터 선택되고;
Nn은 각각의 경우에 바람직하게는 천연 뉴클레오시드, 또는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 결합에 의해 3'측상의 인접 뉴클레오시드에 연결된 뉴클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오티드간 결합은 바람직하게는 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 결합, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합로 구성된 군으로부터 선택되고;
단, N1 또는 Nn 중 적어도 하나는 면역자극성 부분이고;
n은 0 내지 30의 수이고;
3' 말단, 뉴클레오시드간 링커, 또는 유도체화된 뉴클레오염기 또는 당은 면역자극성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 또다른 올리고뉴클레오티드에 직접 연결되거나 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된다.
몇몇 바람직한 실시태양에서, YZ는 아라비노시티딘 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘 및 아라비노구아노신 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신이다. 바람직한 면역자극성 부분은 제한 없이, 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르 프로드럭, 설폰, 설폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, N-메틸하이드록실아민, 카보네이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노포스포네이트, 포스포라미데이트, 특히 일차 아미노-포스포라미데이트, N3 포스포라미데이트 및 N5 포스포라미데이트, 및 입체 특이적 결합(예를 들어, (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 결합)을 포함하는 포스페이트 백본의 변형을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 또한 당 변형, 예를 들어, 제한 없이, 2'-치환된 펜토스 당, 제한하는 것은 아니지만, 2'-O-메틸리보스, 2'-O-메톡시에틸리보스, 2'-O-프로파길리보스, 및 2'-데옥시-2'-플루오로리보스; 3'-치환된 펜토스 당, 제한하는 것은 아니지만, 3'-O-메틸 리보스; 1',2'-디데옥시리보스; 아라비노스; 치환된 아라비노스 당, 제한하는 것은 아니지만, 1'-메틸아라비노스, 3'-하이드록시메틸아라비노스, 4'-하이드록시메틸아라비노스, 및 2'-치환된 아라비노스 당; 헥소스 당, 제한하는 것은 아니지만, 1,5-안히드로헥시톨; 및 알파-아노머를 갖는 뉴클레오시드를 포함한다. 변형된 당이 3'-데옥시리보뉴클레오시드 또는 3'-O-치환된 리보뉴클레오시드인 실시태양에서 면역자극성 부분은 2'-5' 뉴클레오시드간 결합에 의하여 인접한 뉴클레오시드에 부착된다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 추가로 다른 탄수화물 백본 변형 및 대체를 지닌 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 포스페이트 기를 갖는 펩티드 핵산(PHONA), 고정된 핵산(LNA), 모르폴리노 백본 올리고뉴클레오티드, 및 약 2옹스트롬 내지 약 200옹스트롬의 길이를 갖는 백본 링커 부분, 제한하는 것은 아니지만, 알킬 링커 또는 아미노 링커를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 알킬 링커는 분지형 또는 비분지형의 치환된 또는 치환되지 않은, 그리고 키랄적으로 순수한 또는 라세미 혼합물일 수 있다. 가장 바람직한 것은 그러한 알킬 링커가 약 2 내지 약 18개의 탄소 원자를 갖는 것이다. 어느 바람직한 실시태양에서, 그러한 알킬 링커는 약 3 내지 약 9개의 탄소 원자를 갖는다. 어느 알킬 링커들은 하이드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오에테르로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 몇몇 작용기화된 알킬 링커는 식 -O-(CH2 -CH2 -O-)n(n=1-9)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커이다. 몇몇 다른 작용기화된 알킬 링커는 펩티드 또는 아미노산이다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 추가로 DNA 이소폼, 예를 들어 제한없이 β-L-데옥시리보뉴클레오시드 및 α-데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 3' 변형을 포함하며, 추가로 비-천연 뉴클레오시드간 결합 위치, 예를 들어, 제한 없이, 2'-5', 2'-2', 3'-3' 및 5'-5' 결합을 갖는 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 변형된 헤테로사이클릭 염기, 예를 들어 제한 없이, 5-하이드록시시토신, 5-하이드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 4-티오우라실, 6-티오구아닌, 7-데아자구아닌, 이노신, 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘, 및 디아미노퓨린, 예를 들어 제한 없이, 2,6-디아미노퓨린을 갖는 뉴클레오시드를 추가로 포함한다.
제한하는 것은 아니지만, 구체적인 예시로서, 예를 들어, 구조식(III)의 면역자극성 도메인에서 위치 N1 또는 Nn에 있는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합이 약 2 옹스트롬 내지 약 200 옹스트롬의 길이를 갖는 링커인 면역자극성 부분이고, 위치 X1에 있는 C2-C18 알킬 링커가 면역자극성 부분이며, 위치 X1에 있는 β-L-데옥시리보뉴클레오시드가 면역자극성 부분이다. 하기 표 1에는 면역자극성 부분의 대표적인 위치와 구조가 제시되어 있다. 특정 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 링커에 대한 언급은 그 위치에 있는 뉴클레오시드 잔기가 그것의 3'-하이드록실에서 표시된 링커로 치환되고, 그로써 그 뉴클레오시드 잔기와 3'측상의 인접한 뉴클레오시드 사이에 변형된 뉴클레오시드간 결합이 생성되었음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 특정 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 변형된 뉴클레오시드간 결합에 대한 언급은 그 위치에 있는 뉴클레오시드 잔기가 열거된 결합에 의하여 3' 측상에서 인접한 뉴클레오시드에 결합되는 것을 의미한다.
표 1
위치 전형적인 면역자극성 부분
N1 천연 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, β-L-데옥시리보뉴클레오시드 C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 결합, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커(아미노 링커), 2'-5'뉴클레오시드간 결합, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합
Nn 천연 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 2'-5' 뉴클레오시드간 결합, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합, 단, N1과 N2는 둘 모두 비염기성 결합이 될 수 없다
표 2는 업스트림 강화 도메인을 갖는 면역자극성 올리고뉴클레오티드내의 면역자극성 부분의 대표적인 위치 및 구조를 제시한다. 본원에서 사용되는 용어 "스페이서(spacer) 9"는 식 -O-(CH2-CH2-O)n-(여기서, n=3)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다. 용어 "스페이서 18"은 식 -O-(CH2-CH2-O)n-(여기서, n=6)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "C2-C18 알킬 링커"는 식 -O-(CH2)q-(여기에서, q는 정수 2 내지 18이다)의 링커를 나타낸다. 따라서, 용어 "C3-링커" 및 "C3-알킬 링커"는 식 -O-(CH2)3-O-의 링커를 의미한다. 스페이서 9, 스페이서 18, 및 C2-C18 알킬 링커의 각각에 대하여, 링커는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 결합에 의하여 인접한 뉴클레오시드에 결합된다.
표 2
위치 전형적인 면역자극성 부분
5'N2 천연 뉴클레오시드, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
5'N1 천연 뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜), 비염기성 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
3'N1 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 2'-O-메틸리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18
3'N2 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 3'-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-프로파길리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합
3'N3 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합, 2'-5'뉴클레오시드간 결합, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N3 + 3'N4 2'-O-메톡시에틸-리보뉴클레오시드, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합, d(G)n, 폴리I-폴리dC
3'N5 + 3'N6 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC
5'N1 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, d(G)n, 폴리I-폴리dC
하기 표 3은 다운스트림 강화 도메인을 갖는 면역자극성 올리고뉴클레오티드내의 면역자극성 부분의 대표적인 위치 및 구조를 제시한다.
표 3
위치 전형적인 면역자극성 부분
5'N2 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합
5'N1 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합
3'N1 1',2'-디데옥시리보스, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합, 2'-O-메틸
3'N2 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 결합, 2'-O-메틸
3'N3 3'-데옥시리보뉴클레오시드, 3'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 2'-O-프로파길-리보뉴클레오시드
3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드
본 발명에 따른 이뮤노머는 3' 말단 또는 뉴클레오시드간 결합부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 목적상, "비-뉴클레오티드 링커"는 공유 또는 비-공유 결합에 의해 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있는 임의의 부분이다. 바람직하게는, 그러한 링커는 약 2옹스트롬 내지 약 200옹스트롬의 길이를 갖는다. 바람직한 링커의 여러 예를 하기에 나타낸다. 비-공유 결합으로는, 제한하는 것은 아니지만, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, π-스택킹(stacking) 상호작용, 및 수소 결합이 있다. 용어 "비-뉴클레오티드 링커"는 2개의 뉴클레오시드의 3'-하이드록실기를 직접적으로 연결시키는 상기 기술한 바와 같은 뉴클레오시드간 결합, 예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 작용기를 의미하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 목적상, 상기 직접적인 3'-3' 결합은 "뉴클레오티드 결합"으로서 간주된다.
몇몇 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 링커는 금 입자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 금속이다. 다른 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 링커는 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드이다.
다른 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드에 대한 부착을 가능하게 하는 작용기를 갖는 유기 부분이다. 그러한 부착은 바람직하게는 임의의 안정한 공유 결합에 의한 것이다. 비-제한적인 예로서, 링커는 도 13에서 도시된 바와 같이 뉴클레오시드상의 임의의 적합한 위치에 부착될 수 있다. 어떤 바람직힌 실시태양에서 링커는 3'-하이드록실에 부착된다. 그러한 실시태양에서 링커는 바람직하게는 하이드록실 작용기를 포함하는데, 그것은 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 비-포스페이트-기초 결합에 의하여 3'-하이드록실에 부착된다.
몇몇 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 링커는 생체분자, 예를 들어 제한없이, 폴리펩티드, 항체, 지질, 항원, 알레르겐, 및 올리고사카라이드이다. 다른 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 링커는 작은 분자이다. 본 발명의 목적상, 작은 분자는 1,000Da 미만의 분자량을 갖는 유기 부분이다. 몇몇 실시태양에서, 작은 분자의 분자량은 750Da 미만이다.
몇몇 실시태양에서, 작은 분자는 지방족 또는 방향족 탄화수소이며, 둘 중 어느 하나는 임의로 올리고뉴클레오티드를 연결하는 선형 쇄에서 또는 여기에 매달린 형태로 하이드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오우레아로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 작은 분자는 사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있다. 작은 분자 링커의 예로는, 제한하는 것은 아니지만, 아미노산, 탄수화물, 사이클로덱스트린, 아다만탄, 콜레스테롤, 합텐 및 항생제가 있다. 그러나, 비-뉴클레오티드 링커를 설명하기 위한 목적상, "작은 분자"는 뉴클레오시드를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 작은 분자 링커는 글리세롤 또는 식 HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH의 글리세롤 동족체이며, 여기서 o와 p는 독립적으로 정수 1 내지 약 6, 정수 1 내지 약 4, 또는 정수 1 내지 약 3이다. 다른 실시태양에서, 작은 분자 링커는 1,3-디아미노-2-하이드록시프로판의 유도체이다. 그러한 일부 유도체는 식 HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH을 갖고, 여기서 m은 정수 0 내지 약 10, 0 내지 약 6, 2 내지 약 6, 또는 2 내지 약 4이다.
본 발명에 따른 일부 비-뉴클레오티드 링커는 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드의 부착을 가능하게 한다. 예를 들어, 작은 분자 링커인 글리세롤은 3개의 하이드록실기를 갖는데, 여기에 올리고뉴클레오티드가 공유적으로 부착될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 몇몇 이뮤노머는 3' 말단에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 일부 이뮤노머는 2개 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 각각의 올리고뉴클레오티드는 접근가능한 5' 말단을 갖는다.
본 발명의 이뮤노머는 도 5 및 6에 개략적으로 도시되고, 또한 실시예에서도 설명되는 바와 같이 자동 합성기 및 포스포라미다이트 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 이뮤노머는 선형 합성 방법에 의하여 합성된다(도 5 참조). 본원에서 사용되는 용어 "선형 합성"이란 이뮤노머의 한쪽 말단에서 출발하여 다른 쪽 말단으로 선형으로 진행되는 합성을 말한다. 선형 합성은 동일하거나 동일하지 않은 (길이, 염기 조성 및/또는 포함된 화학적 변형의 관점에서) 모노머 단위가 이뮤노머내로 통합되는 것을 가능하게 한다.
또 다른 합성 방식은 "병렬 합성"으로, 이 방식에서는 중심 링커 부분으로부터 바깥쪽으로 합성이 진행된다(도 6 참조). 고체 지지체 부착된 링커가 미국 특허 제 5,912,332호에서 설명되는 바와 같이 병렬 합성에 대해 사용될 수 있다. 또한, 보편적인 고체 지지체, 예를 들어, 포스페이트가 부착되고 기공 조절되는 유리 지지체가 사용될 수 있다.
이뮤노머의 병렬 합성은 선형 합성에 비해 수개의 장점을 가지고 있다: (1) 병렬 합성은 동일한 모노머 단위의 통합을 가능하게 하고; (2) 선형 합성과는 달리 2개의 (또는 모든) 모노머 단위가 동시에 합성되고, 이로써 합성 단계의 수 및 합성에 필요한 시간이 모노머 단위에 대한 것과 동일하며; (3) 합성 단계의 감소로 최종 이뮤노머 산물의 순도 및 수율을 개선시킨다.
선형 합성 또는 병렬 합성 프로토콜에 의한 합성의 종료시에, 변형된 뉴클레오시드가 통합되어 있는 경우, 이뮤노머는 진한 암모니아 용액으로 또는 포스포라미다이트 공급자에 의해 권고받은 바와 같이 용이하게 탈보호될 수 있다. 생성된 이뮤노머는 바람직하게는 역상 HPLC에 의해 정제되고, 탈트리틸화되고, 탈염되고 투석된다.
하기 표 4A 및 4B는 본 발명에 따른 대표적인 이뮤노머를 제시한다. 추가의 이뮤노머는 하기 실시예에서 설명된다.
표 4. 이뮤노머 서열의 예
Figure 112006048749664-pct00003
Figure 112006048749664-pct00004
표 4B
Figure 112006048749664-pct00005
또다른 측면에서 본 발명은 2차 구조를 갖고, 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 면역자극성 핵산을 제공한다. 본 측면에서, 면역자극성 핵산은 구체적으로 하기 식(I)의 구조를 포함한다.
도메인 A-도메인 B-도메인 C (I)
도메인의 길이는 약 2개 내지 약 12개 뉴클레오티드일 수 있다. 도메인 A는 CpG, YpG, YpR, CpR, R*pG 및 R*pR(여기에서, C는 시티딘 또는 2'데옥시시티딘이고, G는 구아노신 또는 2' 데옥시구아노신이고, Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 2'디데옥시-5-할로시토신, 2'디데옥시-5-니트로시토신, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 다른 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, R*는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린이고; R은 구아노신 또는 2'데옥시구아노신, 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'치환 된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 다른 비-천연 퓨린 뉴클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오시드간 결합이다)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 디뉴클레오티드를 함유하거나, 함유하지 않는 앞뒤역순상동서열 또는 자가-상보적 도메인을 갖거나, 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5' 또는 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA일 수 있다. 특정의 바람직한 실시태양에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다.
특정 실시태양에서, 도메인 A는 도메인 A 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 위치하는 CpG, YpG, YpR, CpR, R*pG 및 R*pR로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 디뉴클레오티드를 가질 것이다.
도메인 B는 3'-'5'결합, 2'-5'결합, 3'-3'결합, 포스페이트기, 뉴클레오시드, 또는 지방족, 방향족, 아릴, 사이클릭, 키랄, 아키랄, 펩티드, 탄수화물, 지질, 지방산, 모노- 트리- 또는 헥사폴리에틸렌 글리콜, 또는 헤테로사이클릭 부분일 수 있는 비-뉴클레오시드 링커일 수 있는, 도메인 A 및 C를 연결시키는 링커이다.
도메인 C는 CpG, YpG, YpR, CpR, R*pG 및 R*pR(여기에서, C는 시티딘 또는 2'데옥시시티딘이고, G는 구아노신 또는 2' 데옥시구아노신이고, Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 2'디데옥시-5-할로시토신, 2'디데옥시-5-니트로시토신, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5- 하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 다른 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드 (여기서, R*는 1-(2'-데옥시-β-D-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린이고; R은 구아노신 또는 2'데옥시구아노신, 2'데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'치환된 아라비노구아노신, 2'-O-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 다른 비-천연 퓨린 뉴클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오시드간 결합이다)로 구성된 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드를 갖거나 갖지 않을 수 있는, 앞뒤역순상동서열 또는 자가-상보적 서열을 갖거나, 갖지 않는 5'-3' 또는 3'-5', 2'-5' DNA, RNA, RNA-DNA, DNA-RNA, 폴리I-폴리C일 수 있다. 특정의 바람직한 실시태양에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 바람직하게 "이뮤노머"로서 언급되는, 도메인 A 및 도메인 C의 올리고뉴클레오티드를 연결시키는 비-뉴클레오티드 링커이다. 특정의 바람직한 실시태양에서, 영역 C는 디뉴클레오티드 CpG, YpG, YpR, CpR, R*pG 또는 R*pR을 갖지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 식(I)에 포함된 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 12 내지 약 50개 뉴클레오티드이다. 특정 실시태양에서, 식(I)에 포함된 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 12 내지 약 26개 뉴클레오티드이다.
비제한적인 예에 의해 본 측면의 특정 실시태양에서, 면역자극성 핵산은 구체적으로 하기 식(II)의 구조를 가질 것이다.
Figure 112006048749664-pct00006
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 분자내 스템-루프 형태로 분자의 3' 말단에 2차 구조 요소가 존재한다.
비제한적인 예에 의해 본 측면의 특정 실시태양에서, 면역자극성 핵산은 구체적으로 하기 식(III)의 구조를 가질 것이다.
Figure 112006048749664-pct00007
2개의 분자의 3' 말단은 분자간 수소 결합을 허용하도록 2개의 3' 말단 서열이 상보적이기 때문에 2개 분자의 3' 말단이 차단되는 바, 식(III)으로 도시된 구조는 "말단 다이머"로 언급된다. 추가로, 도메인 A 및 A'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고, 도메인 B 및 B'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있고, 도메인 C 및 C'는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
비제한적인 예에 의해 본 측면의 특정 실시태양에서, 면역자극성 핵산은 구체적으로 식(IV)의 구조를 가질 것이다.
Figure 112006048749664-pct00008
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 도시된 분자의 3' 말단은 2차 구조를 갖는데, 이는 3' 말단의 상보적 서열이 이러한 영역에 수소 결합되기 때문이다. 특정 실시태양에서, 리간드와 같은 분자는 3'-말단에 부착되어 세포 흡수를 촉진시키거나 분자의 안정성을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 몇몇 핵산 분자의 비제한적 예는 표 24B-C 및 25B-C(하기 참조)에 제시한다.
제 2 측면으로 본 발명은 상기 기술한 바와 같은 이뮤노머와, 접근가능한 5' 말단 외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션된 항원을 포함하고 있는 이뮤노머 컨쥬게이트를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된 항원을 포함한다. 일부 다른 실시태양에서는 항원은 3' 말단 이외의 위치에서 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된다. 몇몇 실시태양에서, 항원은 백신 효과를 발생시킨다.
항원은 바람직하게는 병원체와 관련된 항원, 암과 관련된 항원, 자가면역 질환과 관련된 항원, 및 다른 질환, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 수의학적 또는 가금류 질병과 관련된 항원으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 항원은 알레르겐이다. 본 발명의 목적상, "～과 관련된"은 항원이 병원체, 암, 자가 면역 질병, 음식 알레르기, 피부 알레르기, 호흡기 알레르기, 천식 또는 다른 질병이 존재하는 경우에 존재하지만, 병원체, 암, 자가면역 질환, 음식 알레르기, 피부 알레르기, 호흡기 알레르기, 또는 질병이 없는 경우, 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재함을 의미한다.
이뮤노머는 항원에 공유적으로 결합되거나, 항원과 작동가능하게 결합된다. 본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 결합된다"는 것은 이뮤노머와 항원 둘 모두의 활성이 유지되는 임의의 결합을 의미한다. 그러한 작동가능한 결합의 비제한적인 예는 동일한 리포솜 또는 다른 그러한 전달 비히클 또는 시약의 일부가 됨을 포함한다. 이뮤노머가 항원에 공유적으로 결합되는 실시태양에서 그러한 공유 결합은 바람직하게는 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 접근가능한 5' 말단 이외의 이뮤노머상의 임의의 위치에 존재한다. 예를 들어, 항원은 뉴클레오시드간 결합에 부착될 수 있거나 비-뉴클레오티드 링커에 부착될 수 있다. 또한, 항원은 그 자체가 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다.
제 3 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트와 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "생리적으로 허용되는"은 이뮤노머의 효력을 방해하지 않고 세포, 세포 배양액, 조직, 또는 생물체와 같은 생물학적 시스템과 양립할 수 있는 물질을 말한다. 바람직하게는 생물학적 시스템은 살아있는 생물체, 예를 들어, 척추동물이다.
본원에서 사용되는 용어 "담체"는 어떠한 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 또는 약제학적 제형에 사용되는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포함한다. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특성은 특정적용에 대한 투여 경로에 따라 좌우되는 것으로 이해되어야 한다. 이들 물질을 함 유하고 있는 약제학적으로 허용되는 제형의 제법은 문헌에 기술되어 있다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed., A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990).
제 4 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 척추동물에 투여하는 것을 포함하여, 척추동물에서 면역 반응을 유발시키기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 척추동물은 포유 동물이다. 본 발명의목적상, 용어 "포유 동물"은 인간을 포함하는 것으로 명백하게 의도된다. 바람직한 실시태양에서 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 면역자극이 필요한 척추동물에 투여된다.
본 발명의 상기 측면에 따른 방법에서 이뮤노머는 어느 적절한 경로, 예를 들어 제한 없이, 비경구, 경구, 설하, 경피, 국소, 비내, 근내, 복강내, 피하, 피내, 에어로졸, 눈안, 기관지내, 직장내, 질내, 유전자 총(gene gun)에 의해, 피부 패치 또는 점안액으로, 또는 구강세척액 형태로 투여될 수 있다. 이뮤노머의 치료적 조성물의 투여는 질병의 증상 또는 대용 마커를 감소시키는 데에 효과적인 용량으로 및 기간동안 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여될 때 치료적 조성물은 바람직하게는 약 0.0001μM 내지 약 10μM의 이뮤노머 혈중 수준을 수득하기에 충분한 용량으로 투여된다. 국소 투여를 위해서는 이것보다 훨씬 더 낮은 농도가 효과적일 것이며, 훨씬 더 높은 농도도 허용될 수 있다. 바람직하게는 이뮤노머의 전체 용량 범위는 환자당 약 0.001mg 내지 약 200mg/kg 체중/일일 것이다. 치료학적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 치료 조성물을 개체에게 단일 치료 에피소드로서 동시에, 또는 순차적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 이뮤노머는 면역 반응의 특이성 또는 크기를 향상시키기 위해 백신, 항체, 세포독성 제제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 유전자 요법 벡터, DNA 백신 및/또는 애쥬번트와 함께 투여된다. 이들 실시태양에서, 본 발명의 이뮤노머는 애쥬번트로서 다양하게 작용할 수 있고/있거나 직접적인 면역자극 효과를 발생시킬 수 있다.
이뮤노머 또는 백신, 또는 둘 모두는 면역원성 단백질, 예를 들어, 키호울 림펫 헤모시아닌(KLH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 또는 임의의 다른 면역원성 담체 단백질 또는 비면역원성 담체 단백질에 임의로 결합될 수 있다. 임의의 애쥬번트, 예를 들어 제한 없이, 프로인트 완전 애쥬번트, 프로인트 불완전 애쥬번트, KLH, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 명반, 및 사포닌, 예를 들어, QS-21, 이미퀴모드, R848, 또는 이들의 조합물이 과잉으로 사용될 수 있다.
톨-양 수용체(Toll-like receptor, TLR)는 감염 센서로서 작용하고 선천성 및 적응성 면역 반응의 활성화를 유도한다. TLR는 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)이라 명명되는 광범위하게 다양한 리간드를 인식한다. 보존된 병원체-관련 분자 생성물을 인식할 때, TLR는 그의 세포내 시그날링 도메인, 톨/인터루킨-1 수용체(TIR) 도메인, 및 다운스트림 어댑터 단백질 MyD88을 통해 숙주 방어 반응을 활성화시킨다. 수지상 세포 및 마크로파지는 정상적으로 이들이 또한 생성시키는 톨-양 수용체(TLR) 리간드 및 사이토카인(예를 들어, 인터루킨-1β, IL-6 및 종양 괴사 인자, TNF)에 반응하고; 자연 살상(NK) 세포 및 T 세포는 또한 향염증성 회로에 관여한다. 세균성 화합물에 의한 TLR 자극 후, 선천성 면역 세포는 일련의 사이토카인을 방출한다. TLR 리간드의 몇몇 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 지단백질; 펩티도글리칸, 지모산(TLR2), 이중가닥 RNA, 폴리I:폴리C(TLR3), 리포폴리사카라이드, 열 쇼크 단백질, 탁솔(TLR4), 플라젤린(TLR5), 및 이미다조퀴놀린-R848, 레스퀴모드, 이미퀴모드; ssRNA (TLR7/8)을 포함한다.
본 발명의 상기 측면의 목적상, 용어 "~와 함께"는 동일한 환자의 동일한 질병을 치료하는 과정중에 있는 것을 의미하고, 이뮤노머 및/또는 백신 및/또는 애쥬번트를 어떠한 순서로든, 예를 들어 동시에 투여하는 것뿐 아니라 일시적으로 여러날 간격을 두고 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 그러한 병용 처리는 또한 이뮤노머, 및/또는 독립적으로 백신, 및/또는 독립적으로 애쥬번트의 단일 투여 그 이상을 포함할 수 있다. 이뮤노머 및/또는 백신 및/또는 애쥬번트의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 면역계의 모델 연구에 유용하다. 이 방법은 또한 인간 또는 동물 질병의 예방 또는 치료적 처리에도 유용하다. 예를 들 면 본 발명의 방법은 가금류 및 수의학적 백신 분야에 유용하다.
제 5 측면으로, 본 발명은 환자에게 본 발명의 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하여 질병 또는 질환에 걸린 환자를 치료학적으로 처리하는 방법을 제공한다. 다양한 실시태양에서 처리하고자 하는 질병 또는 질환은 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증성 질병, 알레르기, 천식 또는 병원체에 의해 유발되는 질병이다. 병원체는 세균, 기생충, 진균, 바이러스, 비로이드, 및 프리온을 포함한다. 투여는 본 발명의 제 4 측면에서 설명된 것과 같이 수행된다.
본 발명의 목적상, 용어 "알레르기"는 제한 없이, 음식 알레르기, 아토피 피부염, 알레르기성 비염(건초열로서도 공지됨), 알레르기성 결막염, 두드러기(발진으로도 공지됨), 호흡기성 알레르기 및 라텍스, 약물 및 벌레 쏘임과 같은 다른 물질에 대한 알레르기성 반응 또는 알레르기성 비염-동염 및 중이염으로부터 통상 유발되는 문제들을 포함한다. 용어 "기도 염증"은 제한 없이, 천식을 포함한다. 천식의 특정 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 알레르기성 천식, 비-알레르기성 천식, 운동-유도성 천식, 직업 천식, 및 야간 천식을 포함한다.
알레르기성 천식은 알레르기와 관련된 기도 폐색을 특징으로 하고 알레르겐이로 불리는 물질에 의해 유발된다. 알레르기성 천식의 자극원은 제한하는 것을 아니지만, 부유 화분, 곰팡이, 동물의 비듬, 집먼지 진드기 및 바퀴벌레 낙모를 포함한다. 비-알레르기성 천식은 바이러스 감염, 특정 약물 또는 대기중에서 발견되는 자극원에 의해 유발되고, 이는 코 및 기도를 악화시킨다. 비-알레르기성 천식의 자극원은 제한하는 것을 아니지만, 부유 입자(예: 석탄, 분필 가루), 대기 오염원(예: 담배 연기, 목재 연기), 강한 냄새 또는 스프레이(예: 향수, 가내 클렌저, 요리 연기, 페인트 또는 니스), 바이러스 감염(예: 감기, 바이러스 폐렴, 동염, 코폴립), 아스피린-민감성, 및 위식도역류병(GERD)을 포함한다. 운동-유도성 천식(EIA)은 왕성한 신체 활동에 의해 유발된다. EIA의 증상은 대다수의 천식 환자에서 다양한 정도로 발생하고 운동하는 동안 차고 건조한 공기의 흡입에 의한 결과로서 유발되는 것으로 여겨진다. EIA의 자극원은 제한하는 것은 아니지만, 운동시 부유 화분의 흡입, 운동시 대기 오염원의 흡입, 바이러스 기도 감염을 갖는 경우의 운동 및 차고 건조한 공기내에서의 운동을 포함한다. 직업 천식은 작업장에서 발견되는 자극원 및 다른 잠재적 유해 물질의 흡입과 직접적으로 관련된다. 직업 천식의 자극원은 제한하는 것은 아니지만, 퓸(fume), 화학물질, 기체, 수지, 금속, 먼지, 증기 및 살충제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "자가면역 질환'은 "자기" 단백질이 면역계에 의해 공격을 받는 질병을 나타낸다. 그러한 용어는 자가면역 천식을 포함한다.
특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 선진국에서는 세균에 대한 노출 감소가 부분적으로는 천식, 아토피성 피부염, 및 비염과 같은 알레르기성 질환에 기인하는 발병률, 중증도 및 사망률 증가의 원인이 될 수 있다. 상기 가설은 실험상의 동물 모델 및 임상적 연구에서 세균 감염 또는 산물이 알레르기성 질환의 발생을 저해할 수 있다는 증거에 의해 입증된다. 특정 서열과 관련하여(CpG DNA) 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 세균 DNA는 선천성 면역 반응을 효능있게 자극하고 이로써 후천성 면역을 자극한다. CpG DNA에 대한 면역 반응은 선천성 면역 세포 활성화, B 세포 증식, Th1 사이토카인 분비 유도, 및 이뮤노글로블린(Ig) 생산을 포함한다. CpG DNA에 의한 면역 세포 활성화는 분자 패턴 인식 수용체인 톨-양 수용체 9(TLR9)를 통해 발생한다. CpG DNA는 IL-12 및 IFN-γ의 분비를 특징으로 하는 강력한 Th1-우세 면역 반응을 유도한다. 이뮤노머(IMO)는 단독으로 또는 알레르겐 컨쥬게이트로서 IL-4, IL-5, 및 IgE의 생산을 감소시키고 알레르기성 천식에 걸린 마우스 모델에서 호산구증가증을 저하시킨다. IMO 화합물은 Th2 반응을 Th1 반응으로 전환시킴으로써 확립된 아토피성 호산구 기도 질환을 또한 효과적으로 역전시킨다.
다양한 마우스 및 래트 모델에서 Th2-우세 면역 반응 확립시키기 위해 명반과 함께 OVA를 통상적으로 사용한다. Th2 면역 반응은 IL-4, IL-5, 및 IL-13 생산 증가, 전체 및 항원-특이적 IgE, IgG1 혈청 수준 증가 및 저수준의 IgG2a를 포함한다. IMO 화합물은 마우스에서 확립된 Th2-우세 면역 반응을 저지하고 역전시킨다. 마우스에 OVA/명반과 함께 IMO 화합물을 공투여하여 IL-4, IL-5, 및 IL-13 생산을 감소시키고 항원 재자극되는 비장-배양액에서 IFN-γ 생산을 유도한다. 추가로, IMO 화합물은 이러한 마우스에서 항원-특이적 및 전체 IgE를 저해하고 IgG2a 생산을 향상시킨다.
OVA/명반 및 IMO 화합물의 주사는 저수준의 Th2-관련 사이토카인, IgE 및 IgG1, 및 고수준의 Th1-관련 사이토카인 및 IgG2a을 특징으로 하는, 마우스에서 림프구 항원-회상(antigen-recall) 반응(Th1-형)을 유도한다. IMO 화합물과 다른 종류의 항원, 예로서, S. 마소니(S. masoni) 에그 및 달걀 리소자임을 공투여할 경우 시험관내 및 생체내 연구에서 Th2-반응을 Th1-우세 반응으로 역전시켰다. 본원에 기술된 바와 같이, IMO 화합물은 Th2 면역 반응의 발생을 효과적으로 저지시키고 강력한 Th1 반응을 허여한다.
Th2 사이토카인은 IgE 및 IgG1을 생산하는 쪽으로 Ig 이소타입 전환을 유발하는 반면, Th1 사이토카인 IFN-γ은 B-림프구에 의한 IgG2a의 생산을 유도한다. OVA/명반 및 IMO 화합물이 주사된 마우스는 저수준의 IL-4, IL-5, 및 IL-13, 및 고수준의 IFN-γ을 생산하고, 이는 OVA/명반만이 단독으로 주사된 마우스보다 낮은 수준의 IgE 및 IgG1, 및 높은 수준의 IgG2a를 수반한다. 이는 항원 및 IMO 화합물을 투여받은 마우스에서 이뮤노글로블린 이소타입 전환과 Th1-사이토카인 유도 사이에 밀접한 관련성이 존재한다는 것을 시사한다.
혈청 항원-특이적 및 전체 IgE 수준은 OVA/명반만을 단독으로 투여받은 마우스에서보다 OVA/명반 및 IMO 화합물을 투여받은 마우스에서 현저히 낮다. 반대로, OVA-특이적 IgG1 수준은 미미하게 변하고 전체 IgG1 수준은 OVA/명반만이 단독으로 주사된 마우스와 비교하여 단지 미세하게 감소한다(데이타로 나타내지 않음). 상이한 반응이 IgE 및 IgG1 부류 전환의 조절에 관여하는 상이한 메카니즘으로부터 초래될 수 있지만, 이소타입 둘 모두는 IL-4 및 IL-13에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, IL-6은 IL-4의 존재하에 B 림프구가 IgG1을 합성하도록 촉진시킨다.
본 발명에 따른 방법중 어느 것에 있어서, 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 이뮤노머의 면역자극성 효과를 감소시키지 않으며 질환 또는 이상의 치료에 유용한 임의의 다른 제제와 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 상기 측면의 목적상, 용어 "~와 함께"는 동일한 환자의 동일한 질병을 치료하는 과정중에 있는 것을 의미하고, 이뮤노머 및 임의의 제제를 어떠한 순서로든, 예를 들어 동시에 투여하는 것 뿐 아니라 일시적으로 여러날 간격을 두고 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 그러한 병용 처리는 또한 이뮤노머, 및 독립적으로 상기 제제의 단일 투여 그 이상을 포함할 수 있다. 이뮤노머 및 제제의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 임의의 방법에서, 질병 또는 질환을 치료하기 위해 유용한 제제는 제한하는 것은 아니지만, 항원, 알레르겐, 또는 보조자극 분자, 예로서, 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 전사활성화 인자, 펩티드 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함한다. 추가로, 상기 제제는 항원 또는 알레르겐을 엔코딩하는 DNA 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명은 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및/또는 이뮤노머를 포함하는 키트로서, 이뮤노머가 하나 이상의 접근가능한 5' 말단을 갖도록 함께 연결된 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드중 적어도 하나는 면역자극성 올리고뉴클레오티드인 키트를 제공한다. 또다른 측면에서, 키트는 본 발명에 따른 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및/또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트 및/또는 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 키트는 또한 일반적으로 한 세트의 사용 설명서를 포함할 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 실시태양을 추가로 예시하도록 의도되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 면역조절 부분을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성
도 5 및 6에서 약술된 바와 같은 선형 합성 또는 병렬 합성 방법에 따라 자동 DNA 합성기(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 1μmol 규모로 합성하였다.
데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(Foster City, CA)으로부터 입수하였다. 1',2'-디데옥시리보스 포스포라미다이트, 프로필-1-포스포라미다이트, 2-데옥시우리딘 포스포라미다이트, 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸)펜틸아미딜]-2-프로파놀 포스포라미다이트 및 메틸 포스포라미다이트는 글렌 리서치(Glen Research)(Sterling, VA)로부터 입수하였다. β-L-2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트, α-2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트, 모노-DMT-글리세롤 포스포라미다이트 및 디-DMT-글리세롤 포스포라미다이트는 켐진스(ChemGenes)(Ashland,MA)으로부터 입수하였다. (4-아미노부틸)-1,3-프로판디올 포스포라미다이트는 클론테크(Clontech)(Palo Alto, CA)로부터 입수하였다. 아라비노시티딘 포스포라미다이트, 아라비노구아노신, 아라비노티미딘 및 아라비노우리딘은 릴라이어블 파마슈티칼(Reliable Pharmaceutical)(St. Louis, MO)로부터 입수하였다. 아라비노구아노신 포스포라미다이트, 아라비노티미딘 포스포라미다이트 및 아라비노우리딘 포스포라미다이트는 하이브리돈, 인크.(Cambridge, MA)(Noronha et al. (2000) Biochem., 39: 7050-7062)에서 합성하였다.
모든 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 31P 및 1H NMR 스펙트럼으로 특징화하였다. 정규 커플링 사이클을 사용하여 변형된 뉴클레오시드를 특정 부위에 혼입시켰다. 합성한 후, 올리고뉴클레오티드를 진한 수산화암모늄을 사용하여 탈보호하고 역상 HPLC, 이어서 투석에 의해 정제하였다. 나트륨 염 형태로서 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용 전에 동결건조시켰다. CGE 및 MALDI-TOF MS에 의해 순도를 시험하였다.
실시예 2: 비장 세포 증식 분석
앞서 기술된 바와 같은 표준 방법(참조, 예: Zhao et al., Biochem Pharma 51: 173-182 (1996))을 사용하여 비장세포 증식에 대한 시험관내 분석을 수행하였다. 결과를 도 8A에 나타낸다. 이 결과를 통해 고농도에서 2개의 접근가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 6은 접근가능한 5' 말단을 갖지 않는 이뮤노머 5 또는 하나의 접근가능한 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드 4보다 높은 비장세포 증식을 일으킨다는 것이 입증되었다. 이뮤노머 6은 또한 LPS 양성 대조군보다 높은 비장세포 증식을 유발한다.
실시예 3 : 생체내 비장 비대 어세이(Assay)
생체내 모델에 대한 시험관내 결과의 적용성을 시험하기 위하여, 선별된 올리고뉴클레오티드를 마우스에게 투여하고 면역자극 활성 수준의 지표로서 비장 비대 정도를 측정하였다. 5mg/kg의 단일 용량을 BALB/c 마우스(암컷, 4-6주령, Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT)에 복강내 투여하였다. 올리고뉴클레오티드 투여 후 72시간째 마우스를 희생시키고, 비장을 수거하고 질량을 측정하였다. 결과를 도 8B에 나타낸다. 이 결과를 통해 2개의 접근가능한 5' 말단을 갖는 이뮤노머 6이 올리고뉴클레오티드 4 또는 이뮤노머 5보다 훨씬 큰 면역자극 효과를 갖는다는 것이 입증되었다.
실시예 4: 사이토카인 분석
척추 동물 세포, 바람직하게 BALB/c 마우스 비장 세포 또는 인간 PBMC에서 IL-12 및 IL-6의 분비를 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 사이토카인 항체 및 사이토카인 표준물을 포함하는, 필요한 시약을 파밍겐(PharMingen)(San Diego, CA)으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트(Costar)를 4℃에서 밤새도록 PBSN 완충액(PBS/0.05% 소듐 아지드, pH 9.6)중 5㎍/mL의 적절한 항체와 함께 인큐베이션시킨 후 37℃에서 30분동안 PBS/1% BSA로 차단하였다. 세포 배양 상층액 및 사이토카인 표준물을 PBS/10% FBS로 적절하게 희석시키고, 3중으로 플레이트에 가하고 25℃에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 플레이트에 1㎍/mL의 적절한 바이오티닐화된 항체를 깔고 25℃에서 1.5시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 PBS-T 완충액(PBS/0.05% Tween 20)으로 철저하게 세척하고 스트렙타비딘 컨쥬게이션된 퍼옥시다제(Sigma, St. Louis, MO)를 가한 후 추가로 25℃에서 1.5시간동안 인큐베이션시켰다. 슈어 블루(Sure BlueTM)(Kirkegaard and Perry) 발색 시약을 사용하여 플레이트를 전개시키고 스톱 솔루션(Stop SolutionTM)(Kirkegaard and Perry)을 가하여 반응을 종결시켰다. Ceres 900 HDI 분광광도계(Bio-Tek Instruments)상에서 색 변화를 측정하였다. 결과를 하기 표 5A에 나타낸다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리기(Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)에 의해 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 분리하였다. 요약하면, 원추형 원심분리기중에서 Histopaque-1077(동부피)상에 헤파린처리된 혈액을 적층시키고 실온에서 30분동안 400 x g에서 원심분리하였다. 단핵 세포를 함유하는 연막(buffy coat)를 주의하여 제거하고 10분동안 250 x g에서 원심분리에 의해 등장성 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 세척하였다. 이어서, 생성된 세포 펠릿을 L-글루타민(MediaTech, Inc., Herndon, VA)을 함유하고 10% 열 비활성화된 FCS 및 페니실린-스트렙토마이신(1OOU/ml)으로 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재하에 상이한 기간동안 세포를 24 웰 플레이트에서 1 X 106 세포/ml/웰로 배양하였다. 인큐베이션 기간 종료시, 상층액을 수거하고 샌드위치 ELISA에 의해 IL-6(BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10(BD Pharmingen), IL-12(BioSource International, Camarillo, CA), IFN-α(BioSource International) 및 -γ(BD Pharmingen) 및 TNF-α(BD Pharmingen)을 포함하는 다양한 사이토카인에 대하여 어세이할 때까지 -70℃에서 냉동 보관하였다. 결과를 하기 표 5 및 5A에 나타낸다.
모든 경우에 있어서, 세포 배양 상층액중 IL-12 및 IL-6의 수준을 각각 IL-12 및 IL-6에 대해 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 산출하였다. 세포 배양 상층액중 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α의 수준은 각각 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α에 대한 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 산출하였다.
표 5. 이뮤노머 구조 및 인간 PBMC 배양액중 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00009
표 5A. 이뮤노머 구조 및 BALB /c 마우스 비장 세포 배양액중 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00010
정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 이탤릭체는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
Figure 112006048749664-pct00011
또한, 도 7A-C에 나타낸 결과를 통해 2개의 접근가능한 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드 2는 낮은 농도에서 각각 1개의 접근가능한 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드 1 또는 접근가능한 5' 말단을 갖지 않는 올리고뉴클레오티드 3보다 IL-12 및 IL-6은 증가시키고 IL-10은 증가시키지 않는다는 것이 입증되었다.
실시예 5: 이뮤노머의 면역자극 활성에 대한 사슬 길이의 효과
올리고뉴클레오티드 사슬 길이의 효과를 연구하기 위하여 각 사슬에 18, 14, 11, 및 8개의 뉴클레오티드를 함유하는 이뮤노머를 합성하고 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 사이토카인 IL-12 및 IL-6의 분비를 유도하는 능력에 의해 측정하여 면역자극활성에 대하여 시험하였다(표 6-8). 본 실시예 및 이하 모든 실시예에서 사이토카인 어세이는 실시예 4에 기술된 바와 같이 BALB/c 비장 세포 배양액에서 수행하였다.
표 6. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00012
표 7. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00013
표 8. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00014
본 결과는 올리고뉴클레오티드 사슬 길이가 18-량체로부터 7-량체로 감소됨에 따라 이뮤노머의 면역자극 활성은 증가하였음을 제시한다. 6-량체 또는 5-량체 만큼 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬 길이를 갖는 이뮤노머는 단일 5' 말단을 갖는 18-량체 올리고뉴클레오티드의 것에 필적하는 면역자극 활성을 나타내었다. 그러나, 6-량체 또는 5-량체 만큼 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬 길이를 갖는 이뮤노머는 링커 길이가 약 2 옹스트롬 내지 약 200 옹스트롬일 때 면역자극 활성을 증가시켰다.
실시예 6: 비-천연 피리미딘 또는 비-천연 퓨린 뉴클레오시드를 함유하는 이뮤노머의 면역자극 활성
표 9-11에 나타낸 바와 같이, 면역자극 활성은 면역자극성 디뉴클레오티드 모티프에서 비-천연 피리미딘 또는 비-천연 퓨린 뉴클레오시드를 갖는 다양한 길이의 이뮤노머에 대하여 유지되었다.
표 9. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00015
표 10. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00016
표 11. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00017
실시예 7: 면역자극 활성에 대한 링커의 효과
2개의 올리고뉴클레오티드를 연결시키는 링커의 길이의 효과를 조사하기 위하여 올리고뉴클레오티드는 동일하지만 링커는 상이한 것을 함유하는 이뮤노머를 합성하고 면역자극 활성에 대하여 시험하였다. 표 12에 나타낸 결과는 링커 길이가 이뮤노머의 면역자극 활성에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 최상의 면역자극 효과는 산재된 포스페이트 전하를 갖는 비염기성 링커 또는 C3- 내지 C6-알킬 링커를 사용하는 경우에 달성되었다.
표 12. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00018
실시예 8: 면역자극 활성에 대한 올리고뉴클레오티드 백본 의 효과
일반적으로, 천연 포스포디에스테르 백본을 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 동일한 길이의 올리고뉴클레오티드보다 면역자극성이 작았다. 상기와 같이 낮은 면역자극 활성도는 부분적으로 실험 조건하에 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 빠른 분해에 기인할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 분해는 주로 올리고뉴클레오티드를 3' 말단으로부터 분해시키는 3'-엑소뉴클레아제의 결과이다. 본 실시예의 이뮤노머는 유리 3' 말단을 포함하지 않는다. 따라서, 실험 조건하에서 포스포디에스테르 백본을 갖는 이뮤노머는 상응하는 모노머 올리고뉴클레오티드보다 긴 반감기를 가져야 하고, 따라서, 개선된 면역자극 활성을 나타내어야 한다. 표 13에 제시한 결과는 상기 효과를 입증하는데, 이뮤노머 84 및 85는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 사이토카인 유도에 의해 측정되는 바와 같이 면역자극 활성을 나타낸다.
표 13. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00019
실시예 9: 이뮤노머 73-92의 합성
자동 DNA 합성기(Expedite 8909 PerSeptive Biosystems)를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 1μmol 규모로 합성하였다. 데옥시뉴클레오시드 포스포라미다이트를 어플라이드 바이오시스템즈(Foster City, CA)로부터 입수하였다. 7-데아자-2'-데옥시구아노신 포스포라미다이트를 글렌 리서치(Glen Research)(Sterling Virginia)로부터 입수하였다. 1,3-비스-DMT-글리세롤-CPG를 켐진스(Ashland, MA)로부터 입수하였다. 정규 커플링 사이클을 사용하여 변형된 뉴클레오시드를 특정 부위에 혼입시켰다. 합성한 후, 올리고뉴클레오티드를 진한 수산화암모늄을 사용하여 탈보호하고 역상 HPLC, 이어서 투석에 의해 정제하였다. 나트륨 염 형태로서 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용 전에 동결건조시켰다. CGE 및 MALDI-TOF MS(Bruker Proflex III MALDI-TOF 질량 분광계)에 의해 올리고뉴클레오티드의 순도를 조사하였다.
실시예 10: 이뮤노머 안정성
올리고뉴클레오티드를 37℃에서 4, 24 또는 48시간동안 10% 우혈청을 함유하는 PBS에서 인큐베이션시켰다. 온전한(intact) 올리고뉴클레오티드를 모세관 겔 전기영동에 의해 측정하였다. 결과를 표 14에 나타낸다.
표 14. 10 % 우혈청 PBS 용액중 올리고뉴클레오티드의 분해
Figure 112006048749664-pct00020
실시예 11: 면역자극 활성에 대한 접근가능한 5' 말단의 효과
BALB/c 마우스(4-8주) 비장 세포를 RPMI 완전 배지에서 배양하였다. 뮤린 마크로파지-양 세포인 J774(American Type Culture Collection,Rockville, MD)를 10%(v/v) FCS 및 항생제(100IU/mL의 페니실린 G/스트렙토마이신)으로 보충된 둘베코스 변형된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다. 다른 모든 배양 시약은 메디아테크(Mediatech)(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다.
IL-12 및 IL-6에 대한 ELISA. BALB/c 마우스 비장 또는 J774 세포를 각각 5X106 또는 1x106세포/mL의 밀도로 24-웰 디쉬에 플레이팅시켰다. TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA)에 용해된 IMO 화합물을, 최종 농도가 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 또는 10.0㎍/mL가 되도록 마우스 비장 세포 배양액에 가하고, 최종 농도가 1.0, 3.0, 또는 10.0㎍/mL가 되도록 J774 세포 배양액에 가하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시키고 상층액을 ELISA 어세이를 위해 수거하였다. 각 농도에서 3중으로, 각 IMO 화합물에 대하여 2 또는 3회에 걸쳐 본 실험을 실시하였다.
IL-12 및 IL-6의 분비를 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 사이토카인 항체 및 사이토카인 표준물을 포함하는, 필요한 시약을 파밍겐으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트(Costar)를 4℃에서 밤새도록 PBSN 완충액(PBS/0.05% 소듐 아지드, pH 9.6)중 5㎍/mL로 적절한 항체와 함께 인큐베이션시킨 후 37℃에서 30분동안 PBS/1% BSA로 차단하였다. 세포 배양 상층액 및 사이토카인 표준물을 PBS/1% BSA로 적절하게 희석시키고 3중으로 플레이트에 가하고 25℃에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 1㎍/mL의 적절한 바이오티닐화된 항체와 인큐베이션시키고, 25℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS/0.05% Tween 20으로 철저하게 세척한 후 스트렙타비딘 컨쥬게이션된 퍼옥시다제(Sigma)를 가한 후 추가로 25℃에서 1.5시간동안 인큐베이션시켰다. 슈어 블루TM(Kirkegaard and Perry) 발색 시약을 사용하여 플레이트를 전개시키고 스톱 솔루션TM(Kirkegaard and Perry)을 가하여 반응을 종결시켰다. Ceres 900 HDI 분광광도계(Bio-Tek Instruments)상에 450 nm에서 색 변화를 측정하였다. 세포 배양 상층액중 IL-12 및 IL-6의 수준을 각각 IL-12 및 IL-6에 대해 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 산출하였다.
결과를 표 15에 나타낸다.
표 15: 본 연구에서 사용된 포스포로티오에이트 CpG DNA 서열 및 변형 a
Figure 112006048749664-pct00021
차트 1
Figure 112006048749664-pct00022
표 16. BALB /c 마우스 비장 세포 배양액중 CpG DNA - 컨쥬게이트에 의한 IL -12 및 IL -6 분비의 유도
Figure 112006048749664-pct00023
이들 결과를 함께 고려하면, CpG DNA의 접근가능한 5'-말단은 그것의 최적 면역자극 활성에 필요하며, 더 작은 기, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 모노뉴클레오티드, 또는 디뉴클레오티드는 면역자극 경로에 관여하는 수용체 또는 인자들에 대한 CpG DNA의 5'-말단의 접근가능성을 효과적으로 차단하지 못하는 것으로 나타난다. 그러나, CpG DNA의 5'-말단에서 플루오레세인 또는 더 큰 분자같이 큰 분자의 컨쥬게이션은 면역자극 활성을 제거할 수 있다. 이들 결과는 CpG DNA-항원/백신/모뉴클로날 항체(mAb) 컨쥬게이트의 면역자극 활성을 연구하는 데 직접적인 영향을 준다. CpG DNA의 5'-말단에서의 백신 또는 mAb와 같은 큰 분자의 컨쥬게이션은 CpG DNA의 부최적 면역자극 활성을 유도할 수 있다. CpG DNA의 3'-말단에서의 작용성 리간드의 컨쥬게이션은 증가된 뉴클레아제 안정성에 기여할 뿐 아니라 생체내에서 CpG DNA의 증가된 면역자극 효능에도 기여한다.
실시예 12: 사이토카인 분비에 대한 링커의 효과
본 연구를 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이러한 변형된 올리고뉴클레오티드 각각을 이뮤노머로 혼입시킬 수 있다.
표 17. 치환 위치를 나타내는 CpG DNA 의 서열
Figure 112006048749664-pct00024
Figure 112006048749664-pct00025
면역자극 활성의 증강을 위한 최적의 링커 크기를 평가하기 위하여, 본 발명자는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 변형된 CpG DNA에 의해 유도된 IL-12 및 IL-6 분비를 측정하였다. 모든 CpG DNA는 농도-의존적 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하였다. 도 15는 모 CpG DNA와 비교되는 CpG 디뉴클레오티드의 5'-플랭킹 서열중 5번째 뉴클레오티드 위치에 링커를 갖는, 1㎍/mL 농도의 선별된 CpG DNA, 116, 119, 126, 130, 및 134로 수득된 데이타를 나타낸다. C2-(1), C3-(2), 및 C4-링커(3)을 포함하는 CpG DNA는 모 CpG DNA 4의 것과 유사한 IL-12 생산 분비를 유도하였다. 5'-플랭킹 서열에서 CpG 디뉴클레오티드로부터 5번째 뉴클레오티드 위치에 C6 및 C9-링커(4 및 5)를 함유하는 CpG DNA는 모 CpG DNA보다 더 낮은 수준의 IL-12 분비를 유도하였고(도 15), 이는 C4-링커보다 긴 링커의 치환이 IL-12를 낮은 수준으로 유도한다는 것을 시사한다. 링커를 갖는 5개의 CpG DNA 모두는 모 CpG DNA보다 2 내지 3배 높은 IL-6 분비를 유도하였다. 이들 CpG DNA에서 링커의 존재는 링커를 갖지 않는 CpG DNA와 비교하여 IL-6의 유도에 대하여 현저한 효과를 나타내었다. 그러나, 본 발명자는 IL-6 분비에 대한 길이-의존적 링커의 효과를 관찰하지 못했다.
에틸렌글리콜-링커를 함유하는 CpG DNA의 면역자극 활성에 대한 효과를 조사하기 위하여 본 발명자는 트리에틸렌글리콜-링커(6)가 각각 CpG 디뉴클레오티드의 5'-플랭킹 서열에서 5번째 뉴클레오티드 위치에, 3'-플랭킹 서열에서 4번째 뉴클레오티드 위치에 혼입되어 있는 CpG DNA 137 및 138을 합성하였다. 유사하게, CpG DNA 139 및 140은 각각 CpG 디뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-플랭킹 서열에 헥사에틸렌글리콜-링커(7)를 함유하였다. BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 모든 4개의 변형된 CpG DNA(137-140)를 모 CpG DNA 4와 비교하여 사이토카인 유도(IL-12, IL-6, 및 IL-10)에 대하여 시험하였다. 모든 CpG DNA는 시험된 농도 범위에 (0.03-10.0㎍/mL)에 대하여 농도-의존적 사이토카인 생산을 유도하였다 (데이타로 나타내지 않음). 0.3㎍/mL 농도의 CpG DNA 137-140에서 유도된 사이토카인의 수준을 표 18에 나타낸다. 5'-플랭킹 서열에 에틸렌글리콜-링커를 갖는 CpG DNA 137 및 139는 모 CpG DNA 4보다 높은 수준의 IL-12(2106±143 및 2066±153pg/mL) 및 IL-6(2362±166 및 2507±66pg/mL) 분비를 유도하였다(표 18). 동일 농도에서, 137 및 139는 모 CpG DNA보다 약간 낮은 수준으로 IL-10 분비를 유도하였다(표 18). 3'-플랭킹 서열에 보다 짧은 에틸렌글리콜-링커(6)을 갖는 CpG DNA 138은 모 CpG DNA과 유사한 IL-12 분비를 유도하였지만, IL-6 및 IL-10은 현저히 낮은 수준으로 유도하였다(표 18). 보다 긴 에틸렌글리콜-링커(7)를 갖는 CpG DNA 140은 모 CpG DNA와 비교하여 시험된 모든 3개의 사이토카인을 현저히 낮은 수준으로 유도하였다 (표 18).
트리에틸렌글리콜-링커(6)는 C9-링커(5)와 유사한 사슬 길이를 갖지만, 비장 세포 배양액에서 사이토카인 분비의 유도에 의해 측정하여 트리에틸렌글리콜-링커를 함유하는 CpG DNA는 C9-링커를 포함하는 CpG DNA보다 우수한 면역자극 활성을 가졌다. 이 결과는 보다 긴 알킬-링커(4 및 5)를 함유하는 CpG DNA를 사용하여 관찰되는 낮은 면역자극 활성이 링커의 길이 증가와는 무관하고 링커의 소수성 특징과 관련성을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 상기 관찰을 통해 본 발명자는 면역자극 활성에 대한 친수성 작용기를 함유하는 분지형 알킬-링커의 치환을 연구하게 되었다.
표 18. BALB /c 마우스 비장 세포 배양액에서 에틸렌글리콜-링커를 함유하는 CpG DNA 에 의해 유도된 사이토카인 분비
Figure 112006048749664-pct00026
분지형 알킬-링커를 함유하는 CpG DNA의 면역자극 활성에 대한 효과를 시험하기 위하여, 하이드록실(8) 또는 아민(9) 작용기를 함유하는 2개의 분지형 알킬-링커를 모 CpG DNA 4에 혼입시키고 생성된 변형된 CpG DNA의 면역자극 활성에 대한 효과(150-154, 표 19)를 조사하였다. BALB/c 마우스 비장 세포 배양액(증식) 및 생체내(비장 비대)에서 상이한 뉴클레오티드 위치에 아미노-링커 9를 함유하는 CpG DNA 150-154를 사용하여 수득한 데이타를 표 19에 나타낸다.
표 19. BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 아미노부티릴 프로판디올-링커를 함유하는 CpG DNA에 의해 유도된 비장 세포 증식 및 BALB/c 마우스의 비장 비대
Figure 112006048749664-pct00027
모 CpG DNA 4는 0.1㎍/mL의 농도에서 3.7±0.8의 증식 지수를 나타내었다. 동일 농도에서, 상이한 위치에 아미노-링커 9를 함유하는 변형된 CpG DNA 151-154는 모 CpG DNA보다 높은 비장 세포 증식을 유발하였다(표 19). 다른 링커를 사용하여 관찰된 바와 같이, 치환이 CpG 디뉴클레오티드에 인접하여 위치하는 경우(150), 모 CpG DNA와 비교하여 보다 낮은 증식 지수가 주목되었고(표 19), 추가로, 이는 CpG 디뉴클레오티드에 인접한 링커 치환의 배치가 면역자극 활성에 대하여 유해한 효과를 갖는다는 것을 확인시켜 주었다. 일반적으로, 5'-플랭킹 서열에서 2'-데옥시리보뉴클레오시드에 대한 아미노-링커의 치환(151 및 152)은 3'-플랭킹 서열에 치환을 갖는 것(153 및 154)에서 발견되는 것보다 더욱 높은 비장 세포 증식을 유발하였다. 비장 비대 어세이에서 유사한 결과가 관찰되었고(표 19), 이는 비장 세포 배양액에서 관찰된 결과를 확인시켜 주었다. 글리세롤-링커(8)를 함유하는 변형된 CpG DNA는 아미노-링커(9)를 함유하는 변형된 CpG DNA를 사용하여 관찰된 것과 유사하거나 그보다 약간 높은 면역자극 활성을 나타내었다(데이타로 나타내지 않음).
링커 8 및 9를 함유하는 CpG DNA의 면역자극성 효과를 비교하기 위하여, 본 본 발명자는 5'-플랭킹 서열에 치환을 갖는 CpG DNA 145 및 152를 선택하고 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 사이토카인 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하는 능력에 대하여 분석하였다. CpG DNA 145 및 152 둘 모두는 농도-의존적 사이토카인 분비를 유도하였다. 도 4는 마우스 비장 세포 배양액에서 모 CpG DNA 4와 비교되는 0.3㎍/mL 농도의 145 및 152에 의해 유도된 IL-12 및 IL-6의 수준을 나타낸다. CpG DNA는 둘 모두 모 CpG DNA 4보다 더욱 높은 수준의 IL-12 및 IL-6을 유도하였다. 글리세롤-링커(8)을 함유하는 CpG DNA는 아미노-링커(9)를 함유하는 CpG DNA보다 약간 높은 수준의 사이토카인(특히, IL-12)를 유도하였다(도 16). 이 결과는 친수성 기를 함유하는 링커가 CpG DNA의 면역자극 활성에 대하여 더욱 유리하다는 것을 추가적으로 확인시켜 준다.
본 발명자는 CpG DNA에서 다중 링커 치환의 2가지 상이한 일면을 조사하였다. 하나의 실험 세트에서, 본 발명자는 뉴클레오티드 서열의 길이를 13-량체로 유지시키고 5'-말단에 1 내지 5개의 C3-링커(2) 치환을 혼입시켰다(120-124). 이러한 변형된 CpG DNA를 통해 본 발명자는 가용성 문제를 일으키지 않고 링커 길이 증가에 따른 효과를 연구할 수 있었다. 두번째 실험 세트에서, 본 발명자는 면역자극 활성에 대한 임의의 추가적인 효과가 존재하는지를 연구하기 위하여 CpG 디뉴클레오티드의 5'-플랭킹 서열 중의 인접 위치에 2개의 동일한 링커 치환(3, 4, 또는 5)을 혼입시켰다.
변형된 CpG DNA는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 모 CpG DNA 4와 비교하여 사이토카인 생산을 유도하는 능력에 대하여 연구되었다. 모든 CpG DNA는 농도-의존적 사이토카인 생산을 유도하였다. 1.0㎍/mL 농도의 CpG DNA로 수득된 데이타를 표 20에 나타낸다. 이 어세이에서, 1㎍/mL의 농도에서 모 CpG DNA 4는 967±28pg/mL의 IL-12, 1593±94pg/mL의 IL-6, 및 14±6pgmL의 IL-10 분비를 유도하였다. 표 20에 제시된 데이타는 링커 치환 갯수가 감소함에 따라 IL-12 유도가 감소되었음을 제시한다. 그러나, CpG DNA 123 및 124에 의한 낮은 수준의 IL-12 분비 유도는 더욱 짧은 길이의 CpG DNA의 결과일 수 있다. 15-뉴클레오티드보다 짧은 비변형된 CpG DNA를 사용한 본 연구는 미미한 면역자극 활성을 나타내었다(데이타로 나타내지 않음). 링커 치환의 길이나 수가 IL-6 분비에 덜 효과를 미치는 것은 아니다. 링커 치환으로 IL-10 분비가 증가되지만, 이들 CpG DNA에 의한 전체적인 IL-10 분비는 최소였다.
CpG 디뉴클레오티드의 5'-플랭킹 서열 중의 4번째 및 5번째 위치에 2개의 링커 치환을 함유하고 있는 CpG DNA(링커 3-127; 링커 4-131; 링커 5-135) 및 상응하는 5'-절단 변형체 128, 132, 및 136 각각을 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액에서 사이토카인 분비를 유도하는 능력에 대하여 시험하였다. 1.0㎍/mL 농도에서 분비된 IL-12 및 IL-6의 수준을 도 17에 나타낸다. 도 17에 제시한 결과는 면역자극 활성이 혼입된 링커의 성질에 의존한다는 것을 시사한다. C4-링커 3으로 4번째 및 5번째 뉴클레오시드를 치환한 것(CpG DNA 127)은 모 CpG DNA 4와 비교하여 사이토카인 분비에 대하여 미미한 효과를 나타내었고, 이는 상기 위치의 뉴클레오염기 및 당 고리가 수용체 인지 및/또는 결합에 불필요함을 시사한다. 링커 치환외의 뉴클레오티드 결실(CpG DNA 128)은 CpG DNA 4 및 127을 사용하여 관찰된 것보다 높은 IL-12 및 IL-6 분비를 유발하였다. 예측된 바와 같이, 2개의 C6-링커(4) 치환은 모 CpG DNA 4에 의해 유도된 것보다 낮게 IL-12를 분비하고, 모 CpG DNA 4에 의한 것과 유사하게 IL-6을 분비시켰다. 5'-절단 CpG DNA 132는 CpG DNA 131보다 높게 사이토카인 분비를 유도하였다. 2개의 C9-링커(5)를 갖는 CpG DNA 135 및 136은 미미한 사이토카인 분비를 유도하였고, 이는 상기 기술된 바와 같이 동일한 링커를 함유하고 있는 단일-치환된 CpG DNA로 얻어진 결과를 확인해준다.
실시예 13: 사이토카인 유도에 대한 포스포디에스테르 결합의 효과
이뮤노머-유도된 사이토카인 유도에 대한 포스포디에스테르 결합의 효과를 시험하기 위하여 하기 분자를 합성하였다.
표 21 PO - 이뮤노머 서열 및 분석 데이타
Figure 112006048749664-pct00028
PS-CpG DNA 4(표 21)는 대조군으로서 PO-CpG DNA 155이 사용된 경우 마우스에서 면역 반응을 유도하는 것으로 관찰되었다(데이타로 나타내지 않음). PO-이뮤노머 156 및 157은 각각 글리세릴 링커 X에 의해 3'-말단을 통해 연결된 2개의 동일한 모 CpG DNA 155의 절단된 카피를 포함한다(표21). 156 및 157은 각각 14개의 염기의 동일한 올리고뉴클레오티드 세그먼트를 함유하는 반면, 157의 5'-말단은 2개의 C3-링커 Y의 부가에 의해 변형되어 있다(표 21). 모든 올리고뉴클레오티드 4, 155-157은 마우스의 면역계를 활성화시킨다고 공지되어 있는 'GACGTT' 헥사머 모티프를 함유한다.
10% 우태아 혈청 (FBS)(열로 인해 비활성화되지 않았음)을 함유하는 세포 배양액중 CpG DNA 4, 155-157을 37℃에서 4, 24, 및 48시간동안 인큐베이션시켜 뉴클레아제에 대한 PO-이뮤노머의 안정성을 평가하였다. 이어서, 반응 혼합물에 남아있는 온전한 CpG DNA를 CGE에 의해 측정하였다. 도 18A-D은 24시간동안 10% FBS에서 인큐베이션된 CpG DNA 4, 155-157의 뉴클레아제 분해 프로파일을 나타낸다. 각 시점에 남아있는 전장 CpG DNA의 양을 도 18E에 나타낸다. 예측한 바와 같이, 모 PS-CpG DNA 4는 혈청 뉴클레아제에 대하여 가장 큰 내성을 나타내었다. 48 시간 인큐베이션시킨 후, 약 55%의 18-량체 4가 분해되지 않은 채로 남아있었다. 대조적으로, 전장 PO-이뮤노머 155는 단지 약 5%만이 동일한 실험 조건하에서 약 4 시간 후에 남아 있었고, 이것은 포스포디에스테르 결합을 함유하고 있는 DNA가 빠르게 분해된다는 것을 확인해준다. 예상했던 바와 같이 PO-이뮤노머 156과 157은 둘 다 혈청 뉴클레아제에 대해 155보다는 더 내성이었다. 4시간 후에 155의 약 5%와 비교하여 156과 157는 각각 약 62% 및 73%가 온전하게 남아 있었다(도 18 E). 48시간 후에는, 156과 157의 약 23% 및 37%가 분해되지 않은 채로 남아 있었다. 이들 연구 결과는 3'-3'-결합된 PO-이뮤노머가 혈청 뉴클레아제에 대해 더 안정함을 보여줄 뿐 아니라, 5'-말단에서의 화학적 변형이 추가로 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
CpG DNA의 면역자극 활성을 BALB/c 및 C3H/HeJ 마우스 비장 세포 배양액중에서 분비된 사이토카인 IL-12 및 IL-6의 수준을 측정함으로써 연구하였다. 모든 CpG DNA는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 농도-의존적 사이토카인 분비를 유도하였다(도 19). PS-CpG DNA 4는 3㎍/ml에서 각각 2656±256 및 12234±1180 pg/ml의 IL-12 및 IL-6을 유도하였다. 모 PO-CpG DNA 155는 10㎍/ml 농도에서를 제외하면 백그라운드 이상으로 사이토카인 수준을 상승시키지 못하였다. 이 관찰은 뉴클레아제 안정성 어세이 결과와 일치한다. 대조적으로 PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 IL-12 및 IL-6 두 가지 모두의 분비를 유도하였다.
도 19에 도시된 결과는 PS- 및 PO-CpG DNA의 사이토카인 유도 프로필의 분명한 차이를 보여준다. PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IL-12를 유도하였다(도 19A). 대조적으로 3㎍/ml 이하의 농도에서는 무시해도 좋을 정도의 양으로 IL-6을 생성하였다(도 19B). 가장 높은 농도(10㎍/ml)에서 조차도 PO-이뮤노머 156은 PS-CpG DNA 4보다 상당히 덜 IL-6을 유도하였다. PO-이뮤노머 157의 5'-말단에 있는 C3 링커의 존재는 156과 비교하여 약간 더 높은 수준의 IL-6 분비를 초래하였다. 그러나 중요한 것은 PO-이뮤노머 157에 의해 생성된 IL-6의 수준은 PS CpG DNA 4에 의해 유도된 IL-6의 수준 보다 훨신 더 낮다는 사실이다. 도 19A의 삽입도는 3㎍/ml 농도에서 분비된 IL-6에 대한 IL-12의 비율을 나타낸다. IL-12 분비를 증가시키는 것 외에 PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도하였다(데이타로 나타내지 않음).
BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 PO- 및 PS-CpG DNA에 의해 유도된 상이한 사이토카인 프로필로 인해, 본 발명자들은 C3H/HeJ 마우스 비장 세포 배양액 (LPS 저-반응성 스트레인)중에서 CpG DNA에 의한 사이토카인 유도 패턴을 연구하게 되었다. 이 어세이에서 시험된 3개의 모든 CpG DNA는 농도-의존적 사이토카인 분비를 유도하였다(도 20A 및 B). BALB/c 마우스 비장 세포 배양액중에서 PO-CpG DNA 155가 사이토카인 분비를 유도하지 못하였기 때문에 그것은 C3H/HeJ 비장 세포 배양액 중에서는 더 이상 시험하지 않았다. PO-이뮤노머 156 및 157은 둘 다 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 IL-12 생성을 유도하였다(도 20A). 그러나 3㎍/ml 이하의 농도에서는 어느 것도 IL-6 생성을 유도하지 못하였다. 가장 높은 시험 농도(10㎍/ml)에서는 두 가지 모두 PS-CpG DNA 4보다 상당히 더 적은 양으로 IL-6을 유도하였다(도 20B). 분비된 IL-6에 대한 IL-12의 비를 계산하여 PS 및 PO CpG DNA의 사이토카인 분비 프로필을 구별하였다(도 20A 삽입도). 또한, C3H/HeJ 비장 세포 배양액 결과는 CpG DNA로 관찰된 반응이 LPS 오염에 의한 것이 아님을 시사한다.
PS-CpG DNA는 생체내에서 강력한 항종양 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. PO-CpG DNA가 더 큰 뉴클레아제 안정성을 나타내고 시험관내 어세이에서 더 높은 수준의 IL-12 및 IFN-γ 분비를 유도하였기 때문에 본 발명자들은 PO-이뮤노머의 이런 바람직한 성질이 생체내에서 항종양 활성을 개선시키는지를 밝혀내는 데 관심을 모았다. 본 발명자들은 PO-이뮤노머 157을, 야생형 p53을 발현하는 MCF-7 유방암 세포 또는 돌연변이된 p53을 발현하는 DU-145 전립선암 세포의 종양 이종이식편을 내포하고 있는 누드 마우스에 0.5mg/kg의 용량으로 격일로 피하 투여하였다. PO-이뮤노머 157은 식염수 대조표준과 비교하여 15일째 MCF-7 종양 성장을 57% 억제하였다(도 21A). 그것은 또한 34일째에 DU-145 종양 성장을 52% 억제하였다(도 21B). 이들 항종양 연구는 제안된 디자인의 PO-이뮤노머가 생체내에서 강력한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 14: 짧은 이뮤노머
사이토카인 유도에 대한 짧은 이뮤노머의 효과를 시험하기 위하여 하기 이뮤노머를 사용하였다. 본 결과는 세그먼트(segment)당 5개 뉴클레오티드만큼 짧은 이뮤노머가 사이토카인 생산을 유도하는데 효과적이라는 나타낸다.
표 22. 이뮤노머 구조 및 BABL /C 마우스 비장 세포 배양액에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00029
Figure 112006048749664-pct00030
실시예 15: 인간 B 세포 및 형질세포양 수지상 세포( pDC )의 분리
건강한 지원자의 혈액으로부터 새로 채혈된 것으로부터의 PBMC(CBR Laboratories, Boston, MA)를 Ficoll 밀도 구배 원심분리법(Histopaque-1077, Sigma)에 의해 분리하고 B 세포를 CD19 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 양성 선별에 의해 PBMC로부터 분리하였다.
실시예 16 : B 세포 증식 어세이
64시간동안 전체 1 X 105 B세포/200㎕를 0.3, 1.0, 3.0, 또는 10.0㎍/mL 농도의 CpG DNA로 자극한 후, 0.75μCi의 [3H]-티미딘으로 펄싱하고 8시간 후 수거하였다. 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사능 혼입을 측정하였다. 표 23은 최종 농도 10.0㎍/mL에서 6개의 CpG DNA에 대한 B 세포 증식의 평균±SD를 나타낸다.
표 23. 이뮤노머 구조 및 인간 B-세포 증식 어세이(72시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00031
정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 밑줄은 2'-OMe 리보뉴클레오티드를 나타내고; 이탤릭체는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다.
실시예 17 : 인간 pDC 배양액 및 IFN -α ELISA .
pDC는 BDCA-4 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 인간 PBMC로부터 분리하였다. pDC를 1x106 세포/mL, 200㎕/웰을 사용하여 96-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. CpG DNA를 최종 농도 0.3,1.0, 3.0, 또는 10.0㎕/mL로 세포 배양액에 가하고 37℃에서 24시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 상층액을 수거하고 인간 IFN-α ELISA 키트(PBL)를 사용하여 IFN-α에 대하여 어세이하였다. 표 24A-24C에는 농도 1.0 및 10.0㎍/mL에서 6개의 CpG DNA에 대한 IFN-α의 평균±SD를 나타낸다.
표 24A. 이뮤노머 구조 및 인간 수지상 세포 어세이(72시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00032
표 24B. 이뮤노머 구조 및 인간 수지상 세포 어세이(24시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00033
표 24C. 이뮤노머 구조 및 인간 수지상 세포 어세이(24시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00034
실시예 18
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 분리하고 상기 실시예 4에서 논의된 바와 같이 준비하였다. 표 25A-25C에는 농도 10.0㎍/mL에서 5개의 IMO 화합물에 대한 IL-6, IL-12 및 IL-γ의 평균±SD를 나타낸다.
표 25A. 이뮤노머 구조 및 인간 PBMC 어세이(72시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00035
표 25B. 이뮤노머 구조 및 인간 PBMC 어세이(24시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00036
표 25C. 이뮤노머 구조 및 인간 PBMC 어세이(24시간)에서 면역자극 활성
Figure 112006048749664-pct00037
오로지 표 23, 24A-24C 및 25A-25C를 위해: 정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고; 밑줄체는 2'-OMe 리보뉴클레오티드를 나타내고; 이탤릭체는 포스포디에스테르 결합을 나타내고, R, R1, X 및 X1은 하기와 같이 정의된다:
Figure 112006048749664-pct00038
실시예 19: 비장 세포 연구
5-6주령된 암컷 BALB/c 마우스를 타코닉 팜스(Taconic Farms)(Germantown, NY)으로부터 입수하고 무 OVA(OVA-free) 섭식으로 유지시켰다. 5마리의 마우스 그룹을 면역화 연구에서 사용하였다. 상기 기술된 바와 같이, IMO 화합물(도 22)를 합성하고, 정제하고, 분석하였다.
0일 및 14일째 동부피의 명반 용액(Imject-Alum, Pierce, Rockford, IL)과 혼합된 100㎕ PBS중 10㎍ 닭 오발부민(OVA; V 등급, Sigma, St. Louis, MO)을 피하(s.c.) 주사하여 각 마우스를 감작시키고, 28일, 29일 및 30일째 40㎕ PBS중 20㎍ OVA를 비강내(i.n.)로 2차투여(challenge)하였다(도 2). 33일, 37일, 40일 및 43일째에 200㎕ PBS중에 용해된 IMO 1 및 2(30 또는 60㎍)를 마우스에 s.c. 주사하였다. 33일째에 IMO 화합물을 1차 주사한 후 2시간째 안와후방 천자에 의해 마취하에 마우스로부터 혈액 샘플을 채혈하고 혈청을 사이토카인 어세이를 위해 수거하였다. 44일째에 40㎕ PBS중 10㎍OVA를 i.n.으로 2차투여하였다. 마우스를 방혈시키고 폐 및 비장을 마지막 OVA 2차투여 후 24시간째 분리하였다.
차가운 RPMI 1640 배지(Sigma)에서 단일 비장-세포 현탁액을 제조하고 10% FCS(HyClone, Logan,UT) 및 100㎍/mL 페니실린 및 100U/ml 스트렙토마이신(HyClone)를 함유하는 RPMI 1640 배지중에서 5 x 106 세포/ml으로 각 실험 그룹에 대하여 풀링시켰다. 비장 세포(0.2ml/웰)를 5% C02 분위기하에 37℃에서 100㎍/mL OVA의 존재하에 96-웰 평편-바닥 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에서 인큐베이션시켰다. 72시간동안 인큐베이션시킨 후, 배양 상층액을 사이토카인 어세이를 위해 수거하였다.
BD 바이오사이언스(BD Biosciences)(San Diego, CA)로부터의 마우스 항체로 효소면역측정법(ELISA)에 의해 IL-5, IL-10, IL-12, 및 IFN-γ의 수준을 측정하였다. IL-6 및 IL-13 수준은 마우스 DuoSet ELISA 키트(R & D System, Minneapolis, MN)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 평가하였다.
OVA-특이적 및 전체 IgE 및 IgG2a의 수준은 ELISA에 의해 마우스 혈청에서 평가하였다. OVA-특이적 Ig 검출을 위해, 96-웰 ELISA 플레이트(Immulon 2; Dynatech, Chantilly, VA)를 PBS(pH 9.6) 중의 10㎍/mL OVA로 코팅하였다. 전체 Ig 검출을 위해 플레이트를 1㎍/mL 항-마우스 IgE(클론 R35-72) 및 1㎍/mL 항-마우스 IgG2a(클론 R11-89)로 코팅하였다. 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 1시간동안 실온에서 1% BSA/PBS(pH 7.4)로 차단시켰다. 연속 혈청 희석액(IgE에 대해 1:10, IgG2a에 대해 1:100)을 플레이트에 가하고 2시간동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고 100㎕/웰의 바이오티닐화된 항-마우스 IgE(클론 R35-116)를 0.25㎍/mL으로, 또는 IgG2a(클론 R19-15)을 0.25㎍/mL으로 플레이트에 첨가하고 2시간동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 항체 모두를 BD 바이오사이언스로부터 입수하였다. 플레이트를 세척하고 100㎕/웰의 0.25㎍/mL의 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Sigma)를 가하고 1시간동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 100㎕/웰의 TMB 서브스트레이트 솔루션(Substrate Solution)(KPL, Gaithersburg, MD) 이어서, 100㎕/웰의 스톱 솔루션(KPL)에서 어세이를 전개시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski,VT)를 사용하여 A450(OD450과 동일)을 측정하고, KC 주니어 소프트웨어(KC Junior software)(High Point, NC)를 사용하여 데이타를 분석하였다(도 24 참조)
실시예 20: 폐 조직학
45일째에 분리한 폐를 중성 포르말린중에 고정시키고 프로세싱 및 헤마톡실린 & 에오신(HE) 및 과요오드산 Schiff(PAS) 염색을 위해 매스 히스톨로지 서비스(Mass Histology Service)(Warwick, RI)로 보냈다. 폐 조직 절편을 광학 현미경하에 관찰하고 디지털 카메라를 사용하여 촬영하였다.
분산분석법(ANOVA)를 사용하여 통계학적 분석을 실시하였다. OVA-면역화된 그룹 및 IMO-처리된 그룹을 스튜던트 t-테스트를 사용하여 비교하였다. 결과는 평균±SEM으로서 표현하였다. 모든 비교값은 양측검정하고(two tailed) 통계학적 유의수준은 * p < 0.05로 나타내었다.
실시예 21: 예방 모델에서의 연구
마우스에서 OVA-유도된 알레르기성 염증을 예방하는 IMO 화합물의 능력을 연구하였다. 0일, 7일, 및 14일째 동부피의 명반 용액(Imject-Alum, Pierce, Rockford, IL)과 혼합된 100㎕ PBS중의 20㎍ 닭 오발부민(OVA; V 등급, Sigma, St. Louis, MO)의 피하(s.c.) 주사에 의해 각 마우스를 감작시켰다. 나이브 마우스 그룹에 명반만을 주사하였다. 0일, 7일 및 14일째에 OVA/명반 혼합물에 용해된 IMO 화합물(10㎍)을 마우스에 투여하였다. 최종 면역화후 14일째, 마우스를 아이소플루란(Abbot Laboratories, North Chicago, IL)에 의한 마취하에 안와후방의 천자에 의해 출혈시킨 후, 희생시켜 비장을 분리하였다.
실시예 22: 항원-특이적 회상 면역 반응에서 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL 12 및 IL-13의 저해에 대한 IMO 화합물의 효과
OVA/명반이 주사된 마우스에서 Th2-우세 면역 반응을 변경시키는 IMO 화합물의 능력을 측정하기 위하여 0일 및 14일째에 OVA/명반과 함께 IMO 화합물을 주사하였다. 28일째 비장 세포를 마우스로부터 분리하고 72시간동안 OVA와 인큐베이션시켰다(항원 회상). OVA/명반이 주사된 마우스로부터의 비장 세포는 나이브 마우스보다 고수준의 Th2-관련 사이토카인, 예로서, IL-4(~2배), IL-5(130배), 및 IL-13(28배)을 생산하였다(도 23A 및 23B 참조). CpG DNA 또는 IMO 화합물 및 OVA을 투여받은 마우스로부터의 비장 세포는 이들 사이토카인, 특히, IL-5 및 IL-13을 현저히 더 소량으로 분비하였고; IL-5는 20% 내지 97% 감소되었고 IL-13은 60% 내지 95% 감소되었다. 이 결과는 IMO 화합물이 Th2-관련 사이토카인 분비에 대하여 저해 효과를 갖는다는 것을 시사한다.
실시예 23 : 항원-특이적 회상 면역 반응에서 IFN-γ 생산에 대한 IMO 화합물의 효과
동일한 항원-회상 실험에서, OVA/명반 및 IMO 화합물이 주사된 마우스로부터의 비장 세포는 나이브 마우스 또는 OVA/명반-주사된 마우스로부터의 세포보다 현저하게 높은 수준의 Th1 사이토카인 IFN-γ을 생산하였다(도 23A 및 도 23B 참조). OVA/명반 및 통상의 CpG DNA 1이 주사된 마우스로부터의 비장 세포는 나이브 비장 세포에 의해 생산된 것에 필적하는 수준의 IFN-γ을 생산하였다. 이 결과는 비장 세포에 의해 생산되는 사이토카인에 의해 반영되는 바와 같이, IMO 화합물로 OVA/명반-주사된 마우스를 처리하여 Th2-우세 타입을 주로 Th1 타입으로 변화시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 24 : OVA -특이적 및 전체 IgE 생산에 대한 IMO 화합물의 효과
IgE 생산에 대한 IMO 화합물의 효과를 평가하기 위하여 마지막 OVA/명반 주사 후 14일째의 OVA-특이적 및 전체 IgE의 혈청 수준을 조사하였다. OVA/명반으로 감작시켜 마우스에서 고수준의 OVA-특이적 IgE이 생산되었고; OVA-특이적 IgE 수준은 OVA/명반과 함께 IMO 화합물을 투여받은 마우스에서 현저히 낮았다(나이브 마우스에서 관찰되는 것에 필적함)(참조, 도 24A 및 24B). 전체 혈청 IgE 수준은 또한 OVA/명반 및 IMO 화합물이 주사된 마우스에서 낮았다.
실시예 25: OVA -특이적 및 전체 IgG1 및 IgG2a 생산에 대한 IMO 화합물의 효과
IgG1 및 IgG2a 생산에 대한 IMO 화합물의 효과를 평가하기 위하여 OVA-특이적 및 전체 IgG1 및 IgG2a의 혈청 수준을 조사하였다. OVA/명반이 주사된 동물은 고수준의 OVA-특이적 IgG1 및 미미한 수준의 OVA-특이적 IgG2a(도 24A 및 24B 참조)을 생산하였다. IMO 화합물을 마우스에 주사하는 것은 OVA/명반-주사된 마우스에서 관찰되는 수준과 비교하여 효과가 전혀 없거나 OVA-특이적 IgG1의 수준을 저하시켰다. OVA-특이적 IgG2a 항체 수준은 OVA/명반만을 투여받은 마우스보다 IMO 화합물을 투여받은 마우스의 혈청에서 현저히 높았다. 이들 IgG1 및 IgG2a의 수준은 OVA/명반만이 투여된 마우스에 비해 OVA/명반 + IMO 화합물이 주사된 마우스에서 보다 높은 비의 OVA-특이적 IgG2a/IgG1로서 해석되었다.
유사한 결과가 혈청 전체 Ig 생산에 대해서 관찰되었다. OVA/명반 및 IMO 화합물이 주사된 마우스로부터의 혈청은 OVA/명반만을 투여받은 마우스에서보다 낮은 수준의 전체 IgG1 및 높은 수준의 전체 IgG2a를 가졌다.
실시예 26: 치료학적 모델에서의 연구
천식에 걸린 마우스 모델에서 IMO 1 및 2의 치료학적 효능을 시험하였다. 상기 프로토콜에 기술된 바와 같이 마우스를 OVA로 감작시키고 2차투여하고 IMO 1 및 2로 처리하였다.
국소 면역 반응에 대한 IMO 1 및 2 처리의 효과를 측정하기 위하여, IMO 1 및 2 처리를 받거나 받지 않은 나이브 마우스 및 OVA/명반-감작되고-2차투여된 마우스의 폐의 조직 구조를 IMO 1 및 2의 마지막 주사 후 48시간째에 조사하였다. IMO 1 및 2로 처리받지 않은 OVA-감작 및 2차투여된 마우스는 나이브 마우스와 비교하여 중증 염증 세포 침윤 및 기도 상피 증식을 보였다 (데이타로 나타내지 않음). 대조적으로, IMO 1 및 2-처리된 마우스는 비처리된 마우스 보다 적은 염증 세포 침윤 및 적은 기도 증식을 보였다 (데이타로 나타내지 않음). 이 결과를 통해 OVA로 감작되고 2차투여된 마우스에서 OVA-유도된 폐 염증을 역전시키는 IMO 1 및 2의 능력이 입증되었다.
실시예 27: 항원-특이적 회상 면역 반응에서 Th2 및 Th1 사이토카인에 대한 IMO 1 및 2 처리의 효과
OVA로 감작되고 2차투여된 마우스에서 Th2-우세 면역 반응을 역전시키는 IMO 1 및 2의 능력을 측정하기 위하여 본 발명자는 45일째에 마우스로부터 비장 세포를 분리하고 72시간동안 OVA와 함께 인큐베이션시켰다. 비장 세포를 OVA로 재자극시킨 후, 본 발명자는 처리군중에서 Th2 사이토카인(IL-5, 및 IL-13)의 생산에서 현저한 차이를 관찰하였다. OVA만이 주사된 마우스로부터의 비장 세포는 고수준의 Th2-관련 사이토카인을 생산하였다(도 25). IMO 1 및 2로 처리받은 마우스는 OVA-유도된 Th2 사이토카인을 현저히 덜 생산하였다(도 25). 항원-회상 실험에서, 나이브 및 OVA/명반-감작되고-2차투여된 마우스로부터의 비장 세포 배양액에서는 오직 저수준의 IL-12 및 IFN-γ만이 유도되었다. OVA 2차투여후 IMO 1 및 2로 처리된 마우스로부터의 비장 세포는 현저한 고수준의 IFN-γ를 생산하였다(도 25).
실시예 28: OVA-감작되고 2차투여된 마우스에서 OVA-특이적 및 전체 혈청 IgE 생산에 대한 IMO 1 및 2 처리의 효과
IgE 생산에 대한 IMO 1 및 2의 효과를 평가하기 위하여 본 발명자는 OVA-특이적 및 전체 IgE의 혈청 수준을 조사하였다. OVA로 감작되고 2차투여되었지만, IMO 1 및 2로는 처리되지 않은 마우스는 혈청내 고수준의 OVA-특이적 IgE를 갖는 반면(도 26), IMO 1 및 2로 처리받은 마우스는 현저히 낮은 수준의 OVA-특이적 IgE를 가졌다. IMO 1 및 2를 투여받은 마우스에서는 전체 혈청 IgE 수준 또한 낮았다(도 26).
실시예 29: OVA/명반-감작되고 2차투여된 마우스에서 OVA-특이적 및 전체 IgG2a 생산에 대한 IMO 1 및 2 처리의 효과
IgG2a 생산에 대한 IMO 1 및 2 처리의 효과를 평가하기 위하여 본 발명자는 OVA-특이적 및 전체 IgG2a의 혈청 수준을 조사하였다. IMO 1 및 2 처리가 없는 경우, OVA로 감작되고 2차투여된 마우스는 미미한 수준의 OVA-특이적 IgG2a를 가졌다(도 26). IMO 1 및 2로 처리된 OVA-감작되고 2차투여된 마우스에서는 OVA-특이적 IgG2a 항체 수준이 증가되었다(도 26). 혈청 전체 Ig 생산에 대하여 유사한 결과가 관찰되었는데(도 26): OVA로 감작되고 2차투여되고 IMO 1 및 2로 처리받은 마우스는 IMO 1 및 2 처리받지 못한 마우스보다 높은 수준의 전체 IgG2a를 가졌다.
실시예 30: 나이브 마우스에서 국소 및 전신 Th1 사이토카인에 대한 단일 고용량 대 다회 저용량의 IMO 화합물의 효과
IMO 처리에 대한 용량의 효과를 측정하기 위하여 1일, 2일 및 3일째에 마우스를 33㎍의 IMO 1 또는 3으로 비내 처리하거나 100㎍의 IMO 1 또는 3으로 1회 비내 투여하여 처리하였다. 마우스를 출혈시키고 마지막 처리 후 5시간째에 폐를 분리하였다. 100㎍의 단일 용량은 고수준의 전신 사이토카인 반응을 유도하였지만, 3가지의 저용량(3x33㎍)은 보다 높은 국소(BALF) 사이토카인 반응을 유도하였다(도 27).
나이브 마우스에서 국소 및 전신 사이토카인 수준에 대한 IMO 화합물의 저용량의 다회 투여의 용량-의존적 효과를 측정하기 위하여, 1일, 2일 및 3일째에 마우스를 2.5㎍, 10.0㎍ 또는 40.0㎍의 IMO 1로 비내 처리하였다. 마우스를 출혈시키고 마지막 처리 후 5시간째에 폐를 분리하였다. 저용량으로 다회 투여되었을 때 IMO 화합물은 마우스에서 국소(BALF) 사이토카인 수준을 증가시켰지만 전신 사이토카인은 증가시키지 못했다(도 28). 이러한 효과는 용량-의존적이다.
실시예 31: 시험관내에서의 IMO 화합물 및 코르티코스테로이드의 효과 비교
사후(pm) 0일째 및 14일째에 10mg의 OVA를 복강내(i.p.) 주사하여 마우스를 감작시키고 28일째에 40μ PBS중의 10㎍의 OVA로 비내 2차투여하였다. 30일째에 비장 세포를 수거하고 72시간 동안 1㎍/ml 내지 10㎍/ml IMO 화합물 또는 부데소나이드의 존재 또는 부재하에서 100㎍/m의 OVA와 함께 인큐베이션시켰다. IMO 1 및 부데소나이드 둘 모두는 OVA 유도된 Th2 사이토카인 분비(IL-5, ILB)를 억제시켰다(도 29). 그러나, 단지 IMO 1만이 강력한 Th1 사이토카인 유도를 나타내었다(IL-12, FN-8).
SEQUENCE LISTING <110> HYBRIDON, INC. <120> MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES BY SMALL OLIGONUCLEOTIDE-BASED COMPOUNDS <130> HYB-026PCT <140> PCT/US04/016298 <141> 2004-05-24 <150> 60/528,277 <151> 2003-12-08 <160> 93 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gagaacgctc gacctt 16 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ctatctgacg ttctctgt 18 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 tgacgttctc tgt 13 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (9) <223> 50HdC <400> 4 ctatctgang ttctctgt 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description 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Synthetic oligonucleotide <400> 36 ctttcgttct ct 12 <210> 37 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 50HdC <400> 37 tctttngttc t 11 <210> 38 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7) <223> 7-deaza-dG <400> 38 tctttcnttc t 11 <210> 39 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 50HdC <400> 39 tctgtngttc t 11 <210> 40 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (6) <223> 50HdC <400> 40 tctgangttc t 11 <210> 41 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ccatgacgtt cctgatg 17 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 tccatgacgt tcctgatg 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ccatgacgtt cctgatgc 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 cctactagcg ttctcatc 18 <210> 50 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gcgttctcat c 11 <210> 51 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 tagcgttctc atc 13 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Claims (42)

  1. 구조식 5'-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5'를 지닌 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머로서, 상기 구조식에서 R이 아라비노구아노신이고, X가 글리세롤 링커인 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머.
  2. 제 1항에 따른 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 백신, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, DNA 백신 또는 애쥬번트를 추가로 포함하는, TLR9(Toll-like receptor 9)-매개 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 조성물.
  3. 제 1항에 따른 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 전사활성화(trans-activating) 인자, 펩티드 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 보조자극 분자를 추가로 포함하는, TLR9-매개 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 보조자극 분자가 상기 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머에 컨쥬게이션된, 조성물.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는, 조성물.
  6. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  7. 제 1항에 따른 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머를 포함하고; 항원을 추가로 포함하는, TLR9-매개 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 항원이 펩티드, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드 및 지질로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 항원이 알레르겐인, 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제 1항에 따른 이뮤노머를 포함하는, 암, 자가면역 질환, 기도 염증, 염증 질환, 알레르기, 천식, 및 세균, 기생충 또는 바이러스 감염에 의해 유발되는 질병으로 구성된 군에서 선택된 질병 또는 질환에 걸린 환자를 치료하기 위한 치료용 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 백신, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, DNA 백신, 애쥬번트, 또는 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 전사활성화 인자, 펩티드 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 보조자극 분자를 추가로 포함하는 치료용 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 질병 또는 질환과 관련된 항원을 추가로 포함하는 치료용 조성물.
  15. 삭제
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  17. 삭제
  18. 삭제
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  20. 제 1항에 따른 면역자극성 올리고뉴클레오티드 이뮤노머 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, TLR9-매개 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 조성물.
  21. 제 1항에 따른 이뮤노머를 포함하는, 척추동물에서 TLR9-매개 면역 반응을 유도 또는 증강시키기 위한 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 백신, 항체, 세포독성제, 알레르겐, 항생제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, DNA 백신, 애쥬번트, 또는 사이토카인, 케모카인, 단백질 리간드, 전사활성화 인자, 펩티드 및 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 보조자극 분자를 추가로 포함하는 조성물.
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