JP2007530449A - 小オリゴヌクレオチドに基づく化合物による免疫刺激特性の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2003年12月5日に出願された米国仮出願第60/528,277号の利益を主張し、この仮出願は参照としてその全体が組み込まれる。
本発明は、オリゴヌクレオチドを免疫刺激剤として用いる免疫学および免疫治療の用途に関する。
オリゴヌクレオチドは現代の分子生物学において必須のツールとなっており、診断プローブ法からPCRや遺伝子発現のアンチセンス阻害および免疫治療的用途に至るまでの、広い種類の技法に用いられている。オリゴヌクレオチドのこの広範囲の使用のため、オリゴヌクレオチドを合成する、迅速で安価で効率的な方法に対するさらなる需要が生じている。
これらの報告は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドにより生じる免疫反応を、増強し改変することの必要性が存在することを明白に示している。
本発明は、オリゴヌクレオチド化合物によって引き起こされる免疫反応を増強し改変するための方法を提供する。本発明による方法は、免疫療法用途のために免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増加させることができる。本発明者らは驚くべきことに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、その5’末端を最適に提示するよう修飾することにより、その免疫刺激能力が劇的に増強されることを見出した。かかるオリゴヌクレオチドを、本明細書においては「イムノマー」と呼ぶ。
1つの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマーは、配列番号170で表される配列を含む。
他の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマーは、配列番号171で表される配列を含む。
他の態様において、本発明は、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、該患者にイムノマーを投与することを含む。
他の態様において、本発明は、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者における免疫反応を調節する方法であって、該患者にイムノマーを投与することを含む、前記方法を提供し、ここで免疫反応は、Th1および/またはTh2免疫反応である。
本発明は、免疫療法用途のための免疫刺激剤としての、オリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。本明細書中に引用の発行された特許、特許出願、および参考文献は、その各々が具体的また個別に参照として組み込まれると示された場合同様に、参照としてここに組み込まれる。本明細書に引用された任意の参考文献の任意の教示と本明細書の間に不一致がある場合は、本発明のために後者を優先する。
本発明者らは驚くべきことに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドがその5’末端を最適に提示するよう修飾することが、その免疫刺激能力に劇的に影響することを見出した。かかるオリゴヌクレオチドを、本明細書において「イムノマー」と呼ぶ。
ある態様において、イムノマーは2個または3個以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、(イムノマーの文脈において)これらは同一でも異なっていてもよい。好ましくは、かかる免疫刺激性オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも1つの到達可能5’末端を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはこれらの混合物を含むことができる。本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分またはこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで述べるような非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様においては、修飾ヌクレオシドは2’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは2’−デオキシ−2’−フルオロアラビノシドである。
用語「オリゴヌクレオチド 」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、1種より多いヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの好ましい1例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート部位および、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである(例えばPederson et al.、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号を参照)。
本発明のためには、用語「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、魚類、鳥類または哺乳類などの脊椎動物に投与された場合に免疫反応を引き起こす、上記のオリゴヌクレオチドを指す。本明細書において、用語「哺乳類」は、限定なく、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、家畜、ウシ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。有用な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Agrawal et al.の、1998年11月5日に公開されたWO 98/49288;2001年2月22日に公開されたWO 01/12804、2001年8月2日に公開されたWO 01/55370、2001年4月30日に申請されたPCT/US01/13682;および2001年9月26日に申請されたPCT/US01/30137に記載されている。好ましくは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含む。
Dは、水素結合供与体(hydrogen bond donor)であり;
D’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体(hydrogen bond acceptor)、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され;
A’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択され;
Xは、炭素または窒素であり;および
S’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体に結合するのに好適な他のリンカー部分により誘導体化されている。
ある態様において、(I)の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。天然に存在しない好ましいピリミジン塩基の例は、限定なく、5−ヒドロキシシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−アルキルシトシン、好ましくはN4−エチルシトシンおよび4−チオウラシルを含む。しかし、ある態様において5−ブロモシトシンは特異的に除外される。
Dは、水素結合供与体であり;
D’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選択され;
Aは、水素結合受容体または親水基であり;
Xは、炭素または窒素であり;
各Lは、独立してC、O、NおよびSからなる群から選択され;および、
S’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
好ましい水素結合供与体は、限定なく、−NH−、−NH2、−SHおよび−OHを含む。好ましい水素結合受容体は、限定なく、C=O、C=S、−NO2、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのN1を含む。
ある態様において、(II)の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。天然に存在しない好ましいプリン塩基の例は、限定なく、6−チオグアニンおよび7−デアザグアニンを含む。ある態様において、(II)の糖部分S’は、構造(I)について上記したように、天然に存在する糖部分である。
5’−Nn−N1−Y−Z−N1−Nn−3’ (III)
式中、
Yは、シチジン、2’デオキシチミジン、2’デオキシシチジン、アラビノシチジン、2’−デオキシ−2’−置換アラビノシチジン、2’−デオキシチミジン、2’−O−置換アラビノシチジン、2’−デオキシ−5−ヒドロキシシチジン、2’−デオキシ−N4−アルキル−シチジン、2’−デオキシ−4−チオウリジンまたはその他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり;
N1は、各々の場合に、好ましくは天然に存在するかもしくは合成のヌクレオシド、または免疫刺激性部分であって、これらは、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−L−デオキシリボヌクレオシド、およびホスホジエステルもしくは修飾ヌクレオシド間結合により隣接ヌクレオシドの3’側へ結合されたヌクレオシド、からなる群から選択され、ここで前記修飾ヌクレオシド間結合は、限定することなく、約2オングストローム〜約200オングストロームの長さを有するリンカー、C2〜C18アルキルリンカー、ポリ(エチレングリコール)リンカー、2−アミノブチル−1,3−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、2’−5’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、もしくはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択され;
を含み、
ただし、N1またはNnの少なくとも1つは免疫刺激性部分であり;
ここでnは、0〜30の数であり;および
ここで、3’末端、ヌクレオシド間リンカー、または誘導体化核酸塩基または糖は、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、免疫刺激性であってもなくてもよい、他のオリゴヌクレオチドに結合されている。
本発明による好ましい免疫刺激性部分は、修飾複素環塩基を有するヌクレオシドをさらに含み、これらには、限定なく、5−ヒドロキシシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、N4−アルキルシトシン、好ましくはN4−エチルシトシン、4−チオウラシル、6−チオグアニン、7−デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、C5−プロピニルピリミジン、および限定なく2,6−ジアミノプリンを含むジアミノプリンが含まれる。
さらに他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの付着を許容する官能基を有する有機部分である。かかる付着は、任意の安定な共有結合によるのが好ましい。非限定的例として、リンカーは、図13に示されるように、ヌクレオシドの任意の好適な位置に付着することができる。ある好ましい態様において、リンカーは、3’−ヒドロキシルに付着する。かかる態様において、リンカーは好ましくはヒドロキシル官能基を含み、これは好ましくは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは非ホスフェートに基づく結合によって3’−ヒドロキシルに付着する。
ある態様において、小分子は脂肪族または芳香族炭化水素であり、これらのどちらも、随意的に、オリゴヌクレオチドを結合する直鎖においてまたはそれに付加されて、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素、およびチオ尿素からなる群から選択される1個または2個以上の官能基を含むことができる。小分子は、環式または非環式であることができる。小分子リンカーの例は、限定はされないが、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含む。しかし、非ヌクレオチドリンカーを記述するために、用語「小分子」はヌクレオシドを含むことを意図しない。
本発明によるある非ヌクレオチドリンカーは、図1に模式的に示すように、2個より多いオリゴヌクレオチドの付着を許容する。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合的にそれに付着できる3個のヒドロキシル基を有する。本発明によるあるイムノマーは、従って、非ヌクレオチドリンカーに3’末端で結合する、2個より多いオリゴヌクレオチドを含む。幾つかのかかるイムノマーは、その各々が到達可能5’末端を有する、少なくとも2個の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。
直線合成またはパラレル合成プロトコルによる合成の最後に、イムノマーは好都合に脱保護することができ、これは濃縮アンモニア溶液を用いて、またはもし修飾ヌクレオシドが組み込まれる場合はホスホラミダイト供給者による推奨に従って行う。イムノマー産物は好ましくは、逆相HPLCにより精製され、脱トリチル化され(detritylated)、脱塩されそして透析される。
ドメインA−ドメインB−ドメインC (I)
ドメインBは、ドメインAとCを結合するリンカーであり、3’−‘5’結合、2’−5’結合、3’−3’結合、ホスフェート基、ヌクレオシド、または非ヌクレオシドリンカーであることができ、これは脂肪族、芳香族、アリール、環式、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−もしくはヘキサポリエチレングリコール、または複素環部分であってよい。
式(III)に示された構造は、本明細書において、2つの3’末端の配列が相補的であり、分子間水素結合を許容するために、2つの分子の3’末端がブロックされているため、「末端ディマー(terminal dimmer)」と呼ぶ。さらに、ドメインAおよびA’は同一であってもなくてもよく、ドメインBおよびB’は同一であってもなくてもよく、ドメインCおよびC’は同一であってもなくてもよい。
本発明の幾つかの核酸分子の非限定的例を、表24B−Cおよび25B−Cに示す(下記参照)。
本発明のこの側面による方法は、免疫系のモデル研究に有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物の疾病の予防または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児科および獣医学のワクチン用途に有用である。
本発明のために、用語「アレルギー」は、限定なく、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎(花粉症としても知られる)、アレルギー性結膜炎、じんましん(urticaria)(じんましん(hives)としても知られる)、呼吸器アレルギー、およびラテックス、薬物および虫刺されなどの他の物質へのアレルギー反応、またはアレルギー性鼻炎−副鼻腔炎および中耳炎から一般に生じる問題を含む。用語「気道炎症」とは、限定なく喘息を含む。喘息の具体的な例は、限定なく、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息および夜間喘息を含む。
特定のいかなる学説にも拘束されることを意図するものではないが、細菌への暴露の減少は、先進国における喘息、アトピー性皮膚炎、および鼻炎などのアレルギー性疾患の罹患率、重篤度、および死亡率の増加の、部分的な原因である可能性がある。この仮説は、細菌感染または産物が、実験動物モデルおよび臨床研究におけるアレルギー性疾患の発症を抑制できるとの証拠によって支援される。ある配列コンテクスト(CpG DNA)における、非メチル化CpGジヌクレオチドを含む細菌DNAまたは合成オリゴデオキシヌクレオチドは、固有の免疫反応を強力に刺激し、これによって免疫が得られる。CpG DNAに対する免疫反応には、固有の免疫細胞の活性化、B細胞増殖、Th1サイトカイン分泌の誘導、および免疫グロブリン(Ig)の産生が含まれる。CpG DNAによる免疫細胞の活性化は、分子パターン認識受容体であるトール様受容体9(TLR9)を介して起こる。CpG DNAは、IL−12およびIFN−γの分泌を特徴とする、強いTh1優勢免疫反応を誘導する。イムノマー(IMO)のみ、またはアレルゲン結合体としてのイムノマーは、IL−4、IL−5およびIgEの産生を低下させ、アレルギー性喘息のマウスモデルにおける好酸球を減少させる。IMO化合物はまた、Th2反応をTh1反応に変換することにより、確立されたアトピー性好酸球気道疾病を効率的に逆転させる。
Th2サイトカインがIgEおよびIgG1の産生に向うIgアイソタイプスイッチの引き金となる一方で、Th1サイトカインIFN−γは、Bリンパ球によるIgG2aの産生を誘導する。OVA/ミョウバンおよびIMO化合物を注射されたマウスは、OVA/ミョウバンのみを注射されたマウスに比べて、低いIgEおよびIgG1濃度と高いIgG2a濃度に伴い、低濃度のIL−4、IL−5およびIL−13、および高濃度のIFN−γを産生する。このことは、抗原およびIMO化合物を付与されたマウスにおいて、Th1サイトカイン誘導と、免疫グロブリンアイソタイプスイッチとの間の緊密なリンクの存在を示唆する。
本発明は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび/またはイムノマーを含むキットを提供し、ここで後者は、イムノマーが1つより多い5’末端を有するように一緒に結合された少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで少なくとも1つの前記オリゴヌクレオチドは免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。他の側面において、キットは、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび/または免疫刺激性オリゴヌクレオチド結合体および/またはイムノマーまたはイムノマー結合体、および生理学的に許容し得る担体を含む。キットは一般に、使用のための指示書のセットも含む。
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。
例1:免疫調節性部分を含有するオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、1μmolスケール上でDNA自動合成装置(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)を用いて、図5および図6に概説した直線合成またはパラレル合成方法に従って合成した。
全てのヌクレオシドホスホラミダイトは、31Pおよび1H NMRスペクトルにより特性を明らかにした。修飾ヌクレオシドは、特定部位に通常のカプリングサイクルを用いて組み込んだ。合成の後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相HPLCにより精製して、透析した。ナトリウム塩形態の精製オリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。純度は、CGEおよびMALDI−TOF MSにより試験した。
脾細胞増殖のin vitro解析を、前に記載した標準的方法(例えば、Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182(1996)を参照)を用いて行った。結果を図8Aに示す。これらの結果は、高濃度において、2つの到達可能5’末端を有するイムノマー6が、到達可能5’末端を有さないイムノマー5または1つの到達可能5’末端を有するオリゴヌクレオチド4よりも、多くの脾細胞増殖をもたらすことを示す。イムノマー6はまた、LPS陽性対照よりも多くの脾細胞増殖をもたらす。
in vitroでの結果をin vivoモデルに適用可能かどうかを試験するために、選択したオリゴヌクレオチドをマウスに投与し、免疫刺激活性レベルの指標として脾腫の程度を測定した。5mg/kgの一回量をBALB/cマウス(雌、4〜6週齢、Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT)に腹腔内投与した。オリゴヌクレオチド投与の72時間後にマウスを犠牲にし、脾臓を採取して重量測定した。図8Bに結果を示す。これらの結果は、2つの到達可能5’末端を有するイムノマー6が、オリゴヌクレオチド4またはイムノマー5よりも大幅に高い免疫刺激効果を有することを示す。
脊椎動物細胞における、好ましくはBALB/cマウス脾臓細胞またはヒトPBMCにおける、IL−12およびIL−6の分泌を、サンドイッチELISAで測定した。サイトカイン抗体および標準サイトカインを含む必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAより購入した。ELISAプレート(Costar)は、PBSN緩衝液(PBS/0.05%アジ化ナトリウム、pH9.6)中の5μg/mLの適当な抗体を用いて4℃にて1晩インキュベートし、次にPBS/1%BSAを用いて37℃にて30分間ブロックした。細胞培養上清および標準サイトカインは、PBS/10%FBSで適切に希釈し、前記プレートにトリプリケート(triplicate)で添加し、25℃で2時間インキュベートした。プレートに1μg/mLの適当なビオチン化抗体を加え、25℃で1.5時間インキュベートした。次にプレートをPBS−T緩衝液(PBS/0.05%Tween 20)でよく洗浄し、ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ(Sigma, St. Louis, MO)を加えた後25℃で1.5時間さらにインキュベートした。プレートをSure Blue(登録商標)(Kirkegaard and Perry)発色試薬で発色させ、Stop Solution(Kirkegaard and Perry)を加えて反応を終了させた。色の変化をCeres 900 HDI分光光度計(Bio-Tek Instruments)で測定した。下の表5Aに結果を示す。
オリゴヌクレオチド鎖の長さの効果を検討するため、各鎖に18、14、11および8個のヌクレオチドを含むイムノマーを合成し、BALB/cマウスの脾臓細胞培養物中のサイトカインIL−12およびIL−6の分泌を誘導するそれらの能力を計測することにより、免疫刺激活性を試験した(表6〜8)。この中で、および以下の全ての例において、サイトカインアッセイは、例4で記載されたBALB/c脾臓細胞培養物において実施した。
表9〜11に示すように、免疫刺激活性は、非天然ピリミジンヌクレオシドまたは非天然プリンヌクレオシドを免疫刺激性ジヌクレオチドモチーフに含む種々の長さのイムノマーにおいて維持された。
表9.イムノマー構造および免疫刺激活性
2つのオリゴヌクレオチドを結合するリンカーの長さの効果を試験するため、同じオリゴヌクレオチドを含むがリンカーの異なるイムノマーを合成し、免疫刺激活性を試験した。表12に示す結果は、リンカーの長さがイムノマーの免疫刺激活性に役割を果たすことを示唆する。最大の免疫刺激効果は、C3〜C6−アルキルリンカーまたは分散されたホスフェート電荷(interspersed phosphate charge)を有する脱塩基リンカーにより達成された。
一般に、天然のホスホジエステル骨格を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドより免疫刺激性が低い。この低い免疫刺激活性の程度は、部分的に、実験条件下におけるホスホジエステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解による可能性がある。オリゴヌクレオチドの分解は、第1に、オリゴヌクレオチドを3’末端から消化する3’エキソヌクレアーゼの結果である。この例のイムノマーは遊離の3’末端を含まない。従って、ホスホジエステル骨格を有するイムノマー化合物は、実験条件下において対応するモノマーオリゴヌクレオチドより長い半減期を有するはずであり、従って改善された免疫刺激活性を示す。表13に示す結果はこの効果を示しており、イムノマー84および85は、BALB/cマウスの脾臓細胞培養物においてサイトカイン誘導により決定されたように、免疫刺激活性を示す。
オリゴヌクレオチドを、1μmolスケール上でDNA自動合成装置(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems)を用いて合成した。デオキシヌクレオシドホスホラミダイトは、Applied Biosystem(Foster City, CA)から入手した。7−デアザ−2’−デオキシグアノシンホスホラミダイトはGlen Research(Sterling Virginia)から入手した。1,3−ビス−DMT−グリセロール−CPGは、ChemGenes(Ashland, MA)から入手した。修飾ヌクレオシドは、特定部位に通常のカプリングサイクルを用いてオリゴヌクレオチドに組み込んだ。合成の後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相HPLCにより精製して、透析した。ナトリウム塩形態の精製オリゴヌクレオチドは、使用前に凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドの純度は、CGEおよびMALDI−TOF MS(Bruker Proflex III MALDI-TOF質量分析計)により検査した。
オリゴヌクレオチドは、10%ウシ血清を含むPBS中で、37℃にて4、24、または48時間インキュベートした。無傷のオリゴヌクレオチドを、毛細管ゲル電気泳動により決定した。表14に結果を示す。
表14.10%ウシ血清PBS溶液中でのオリゴヌクレオチドの消化
BALB/cマウス(4〜8週齢)の脾臓細胞を、RPMI完全培地中で培養した。マウスマクロファージ様細胞である、J774(American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、10%(v/v)FCSおよび抗生物質(100IU/mLのペニシリンG/ストレプトマイシン)を付加したダルベッコ修飾イーグル培地中で培養した。他の全ての培養試薬は、Mediatech(Gaithersburg, MD)から購入した。
IL−12およびIL−6のためのELISA。BALB/cマウス脾臓細胞またはJ774細胞を、それぞれ5×106または1×106細胞/mLの密度で24ウェルディッシュにプレートした。TE緩衝液(10mMのトリス−HCl、pH7.5、1mMのEDTA))に溶解したIMO化合物を、最終濃度が0.03、0.1、0.3、1.0、3.0または10.0μg/mLとなるようにマウス脾臓細胞培養物に、そして1.0、3.0または10.0μg/mLとなるようにJ774細胞培養物に添加した。細胞は次に、37℃で24時間インキュベートし、ELISAアッセイ用に上清を収集した。実験は、各IMO化合物に対して各濃度につきトリプリケートで、2回または3回実施した。
結果を表15に示す。
この試験のために以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これら修飾オリゴヌクレオチドの各々は、イムノマーに組み込むことができる。
表17.CpG DNAの置換位置を示す配列
ホスホジエステル結合の、イムノマーが誘導するサイトカイン誘導への効果を試験するために、以下の分子を合成した。
表21.POイムノマー配列および解析データ
bPSおよびPOはそれぞれ、ホスホロチオエートおよびホスホジエステル骨格を表わす。
cMALDI−TOF質量分析により決定した。
短イムノマーのサイトカイン誘導に対する効果を試験するため、以下のイムノマーを用いた。これらの結果は、セグメント当たり5ヌクレオチドの短いイムノマーが、サイトカイン産生を誘導するのに効果的であることを示す。
健康なボランティアから採取した新鮮な血液からのPBMC(CBR Laboratories, Boston, MA)を、フィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)により単離し、B細胞をPBMCから、CD19細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、製造業者の指示に従い正の選択により単離した。
全部で1×105のB細胞/200μlを、0.3、1.0、3.0、または10.0μg/mL濃度のCpG DNAで64時間刺激し、次に0.75μCiの[3H]−チミジンでパルスし、8時間後に収穫した。放射能の取り込みを、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。表23は、最終濃度10.0μg/mLにおける6つのCpG DNAについての、B細胞増殖の平均±SDを示す。
pDCは、ヒトPBMCから、BDCA−4細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用い、製造業者の指示に従って単離した。pDCは、96ウェルプレートに1×106細胞/mL、200μL/ウェルでプレートした。CpG DNAを、最終濃度0.3、1.0、3.0、または10.0μg/mLで細胞培養物に加え、37℃で24時間インキュベートした。上清を次に採取して、IFN−αについてヒトIFN−αELISAキット(PBL)を用いてアッセイした。表24A〜24Cは、1.0および10.0μg/mLの濃度の6つのCpG DNAについて、IFN−αの平均±SDを示す。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を健康なボランティアの末梢血から単離し、例4に記載したようにして調製した。表25A〜25Cは、10.0μg/mLの濃度の5つのIMO化合物についての、IL−6、IL−12およびIL−γの平均±SDを示す。
表25A.ヒトPBMCアッセイ(72時間)におけるイムノマー構造および免疫刺激活性
5〜6週齢の雌のBALB/cマウスは、Taconic Farms(Germantown, NY)から入手し、OVAを含まない食餌で維持した。5匹のマウスのグループを免疫化試験に用いた。IMO化合物(図22)を合成し、精製し、上記のように解析した。
各マウスは、100μlのPBS中の10μgのニワトリオボアルブミン(OVA;グレードV、Sigma, St. Louis, MO)を等容量のミョウバン溶液(Imject-Alum, Pierce, Rockford, IL)と混合して、0日および14日目に皮下(s.c.)注射することにより感作し、40μlのPBS中の20μgのOVAで28、29および30日目に鼻腔内(i.n.)でチャレンジした(図2)。200μlのPBSに溶解したIMO1および2(30または60μg)を、33、37、40および43日目にマウスにs.c.注射した。33日目の最初のIMO化合物注射の2時間後に、麻酔下のマウスからretro-orbital穿刺により血液サンプルを採取し、サイトカインアッセイ用に血清を収穫した。各マウスは、40μlPBS中の10μgOVAにより、44日目にi.n.でチャレンジした。最後のOVAチャレンジの24時間後にマウスを出血させ、肺および脾臓を取り出した。
IL−5、IL−10、IL−12およびIFN−γのレベルは、BD Biosciences(San Diego, CA)からのマウス抗体を用いた酵素免疫測定法(ELISA)により決定した。IL−6およびIL−13レベルは、マウスのDuoSet ELISAキット(R&D System, Minneapolis, MN)にて、製造業者の指示に従って評価した。
45日目に取り出した肺を、中性ホルマリン中に固定し、Mass Histology Service(Warwick, RI)に送付して、処理およびヘマトキシリン&エオジン(HE)染色およびパス(PAS)染色を行った。肺組織切片を光学顕微鏡で観察し、デジタルカメラで撮影した。
統計的解析は、分散分析(ANOVA)を用いて行った。OVA免疫群およびIMO処置群をスチューデントt検定を用いて比較した。結果は平均±SEMで表わした。全ての比較は両側検定で行い、統計的有意性は*p<0.05で示した。
IMO化合物の、マウスにおいてOVA誘導アレルギー炎症を予防する能力について試験した。各マウスは、100μlPBS中の20μgニワトリオボアルブミン(OVA;グレードV、Sigma, St. Louis, MO)を同量のミョウバン溶液(Imject-Alum, Pierce, Rockford, IL)と混合し、0、7および14日目に皮下(s.c.)注射により感作した。マウスのナイーブ群はミョウバン注射のみを受けた。OVA/ミョウバン混合物中に溶解したIMO化合物(10μg)は、0、7および14日目にマウスに投与した。最終免疫化の14日後に、イソフルラン(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)による麻酔下のマウスをretro-orbital穿刺により出血させ、犠牲にして脾臓を取り出した。
IMO化合物の、OVA/ミョウバンを注射されたマウスにおけるTh2優勢免疫反応を変化させる能力を決定するために、IMO化合物をOVA/ミョウバンと共に、0および14日目に注射した。脾臓細胞を28日目にマウスから単離し、OVAと共に72時間インキュベートした(抗原リコール)。OVA/ミョウバンのみを注射されたマウスからの脾臓細胞は、ナイーブマウスよりも高いレベルのTh2関連サイトカイン、例えばIL−4(〜2倍)、IL−5(130倍)、およびIL−13(28倍)を産生した(図23Aおよび図23B参照)。CpG DNAまたはIMO化合物およびOVAを付与されたマウスからの脾臓細胞は、有意に少ないこれらのサイトカイン、特にIL−5およびIL−13を分泌した;IL−5は20%〜97%減少し、IL−13は60%〜95%減少した。これらの結果は、IMO化合物が、Th2関連サイトカイン分泌を抑制する効果を有することを示唆する。
同じ抗原リコール実験において、OVA/ミョウバンおよびIMO化合物を注射されたマウスの脾臓細胞は、ナイーブマウスまたはOVA/ミョウバン注射マウスの細胞より有意に高いレベルのTh1サイトカインIFN−γを産生した(図23Aおよび図23B参照)。OVA/ミョウバンおよび従来のCpG DNA1を注射されたマウスの脾臓細胞は、ナイーブ脾臓細胞が産生したのと同等レベルのIFN−γを産生した。これらの結果は、OVA/ミョウバンを注射されたマウスのIMO化合物による処置は、脾臓細胞が産生するサイトカインに反映されるように、免疫反応をTh2優勢から主にTh1型へと変化させ得ることを示す。
IMO化合物のIgE産生に及ぼす効果を評価するために、OVA特異的および総IgEの血清レベルを、最後のOVA/ミョウバン注射の14日後に試験した。OVA/ミョウバンでの感作は、マウスにおいて高レベルのOVA特異的IgE産生をもたらした;OVA特異的IgEレベルは、IMO化合物をOVA/ミョウバンと共に付与されたマウスにおいて有意に低かった(ナイーブマウスのレベルと同等)(図24Aおよび図24B参照)。血清総IgEレベルも、OVA/ミョウバンとIMO化合物を注射されたマウスにおいて低かった。
IMO化合物のIgG1およびIgG2a産生に及ぼす効果を評価するために、OVA特異的および総IgG1およびIgG2aの血清レベルを試験した。OVA/ミョウバンの注射を受けた動物は、高レベルのOVA特異的IgG1および、少ないレベルのOVA特異的IgG2aを産生した(図24Aおよび図24B参照)。IMO化合物のマウスへの注射は、効果を有さないか、またはOVA/ミョウバン注射のマウスに見出されるレベルより、OVA特異的IgG1のレベルを低下させた。OVA特異的IgG2a抗体レベルは、OVA/ミョウバンのみを付与されたマウスよりも、IMO化合物を付与されたマウスの血清において有意に高かった。これらのIgG1およびIgG2aレベルは、OVA/ミョウバンのみを付与されたマウスに比べて、OVA/ミョウバンと共にIMO化合物を付与されたマウスにおける、より高いOVA特異的IgG2a/IgG1の比率に翻訳された。
同様の結果は、血清総Ig産生についても見出された。OVA/ミョウバンとIMO化合物を付与されたマウスの血清は、OVA/ミョウバンのみを付与されたマウスよりも、より低い総IgG1レベルおよびより高い総IgG2aレベルを有した。
IMO1およびIMO2の治療可能性を、喘息のマウスモデルにおいて試験した。マウスをOVAで感作およびチャレンジし、IMO1およびIMO2を用いて上のプロトコルに記載したように処置した。
IMO1およびIMO2による処置の局所的免疫反応への効果を決定するために、ナイーブマウスおよび、OVA/ミョウバンで感作およびチャレンジし、IMO1およびIMO2による処置有り、無しのマウスの肺の組織学を、IMO1およびIMO2の最終注射の48時間後に試験した。OVAで感作およびチャレンジしたマウスでIMO1およびIMO2の処置無しのものは、ナイーブマウスと比べて重篤な炎症性細胞浸潤および気道上皮過形成を示した(データ示されず)。逆に、IMO1およびIMO2で処置したマウスは、無処置のマウスと比べてより少ない炎症性細胞浸潤およびより少ない気道上皮過形成を有した(データ示されず)。これらの結果は、IMO1およびIMO2の、OVAで感作およびチャレンジしたマウスにおけるOVA誘導の肺の炎症を逆転させる能力を示す。
IMO1およびIMO2の、OVAで感作およびチャレンジしたマウスにおけるTh2優勢免疫反応を逆転させる能力を決定するために、45日目のマウスから脾臓細胞を単離し、これをOVAと共に72時間インキュベートした。脾臓細胞をOVAで再刺激した後、Th2サイトカイン(IL−5およびIL−13)の産生に、処置群の間で大きな違いを観察した。OVAのみを注射したマウスからの脾臓細胞は、高レベルのTh2関連サイトカインを産生した(図25)。IMO1およびIMO2で処置したマウスは、有意に少ないレベルのOVA誘導のTh2サイトカインを産生した(図25)。抗原リコール実験において、ナイーブマウスおよびOVA/ミョウバンで感作およびチャレンジしたマウスからの脾臓細胞の培養物中には、低いレベルのIL−12およびIFN−γのみが誘導された。OVAチャレンジの後にIMO1およびIMO2で処置されたマウスからの脾臓細胞は、有意に高いレベルのIFN−γを産生した(図25)。
IgE産生に及ぼすIMO1およびIMO2の効果を評価するために、OVA特異的および総IgEの血清レベルを試験した。OVAで感作およびチャレンジしたがIMO1およびIMO2で処置していないマウスは、血清に高レベルのOVA特異的IgEを有したが(図26)、一方、IMO1およびIMO2で処置したマウスは、有意に低いレベルのOVA特異的IgEを有した。血清総IgEレベルも、IMO1およびIMO2の処置を受けたマウスにおいて低かった(図26)。
IgG2a産生に及ぼすIMO1およびIMO2の処置の効果を評価するために、OVA特異的および総IgG2aの血清レベルを試験した。IMO1およびIMO2の処置なしで、OVAで感作およびチャレンジしたマウスは、少ないレベルのOVA特異的IgG2aを有した(図26)。OVAで感作およびチャレンジし、IMO1およびIMO2で処置したマウスは、OVA特異的IgG2a抗体レベルの増加を示した(図26)。同様の結果が、血清総Ig産生にも見出された(図26):OVAで感作およびチャレンジし、IMO1およびIMO2で処置したマウスは、IMO1およびIMO2で処置しなかったマウスより高いレベルの総IgG2aを有した。
IMO処置の用量の効果を決定するために、33μgのIMO1またはIMO3を1、2、および3日目にマウスの鼻腔内に処置するか、または100μgのIMO1またはIMO3を一回でマウスの鼻腔内に投与して処置した。マウスは出血させて、最終処置の5時間後に肺を取り出した。100μgの一回量は高レベルの全身的サイトカイン反応を誘導したが、3回の低用量(3×33μg)は、高い局所(BALF)サイトカイン反応を誘導した(図27)。
IMO化合物の低用量の複数回投与が、ナイーブマウスにおける局所的および全身的サイトカインレベルに及ぼす用量依存的効果を決定するために、マウスを2.5μg、10.0μgまたは40.0μgのIMO1で1、2および3日目に鼻腔内処置した。マウスは出血させ、最終処置の5時間後に肺を取り出した。IMO化合物は、局所(BALF)サイトカインレベルを増加させたが、低用量を複数回投与したマウスにおける全身的サイトカインレベルは増加させなかった(図28)。この効果は、用量依存的であった。
マウスを、10mgOVAを0および14日に腹腔内(i.p.)注射して感作し、40μlPBS中の10μgのOVAで28日目に鼻腔内でチャレンジした。脾臓細胞を30日目に採集し、100μg/mOVAで、1μg/ml〜10μg/mlのIMO化合物またはブデソニドの有り、無しにて、72時間インキュベートした。IMO1およびブデソニドの両方は、OVA誘導のTh2サイトカイン(IL−5、ILB)の分泌を抑制した(図29)。しかし、IMO1のみが、強いTh1サイトカインの誘導(IL−12、FN−8)を示した。
前述の発明について明確さと理解のためにある程度詳細に記述したが、この開示を読んだ当業者には、本発明および付属のクレームの真の範囲から乖離することなく、形態および詳細についての種々の改変が可能であることが理解される。
Claims (42)
- 配列番号170で表される配列を含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマー。
- 請求項1に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物。
- 共刺激性分子が、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合している、請求項2に記載の免疫調節性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項2に記載の免疫調節性組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項2に記載の免疫調節性組成物。
- 請求項1に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、および抗原をさらに含む、免疫調節性組成物。
- 抗原が、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択される、請求項6に記載の免疫調節性組成物。
- 抗原がアレルゲンである、請求項6に記載の免疫調節性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項6に記載の免疫調節性組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項6に記載の免疫調節性組成物。
- 配列番号171で表される配列を含む、免疫刺激性オリゴヌクレオチドイムノマー。
- 請求項11に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、並びに、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択される共刺激性分子をさらに含む、免疫調節性組成物。
- 共刺激性分子が、免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーに結合している、請求項12に記載の免疫調節性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項12に記載の免疫調節性組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項12に記載の免疫調節性組成物。
- 請求項11に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドイムノマーを含み、および抗原をさらに含む、免疫調節性組成物。
- 抗原が、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、および脂質からなる群から選択される、請求項16に記載の免疫調節性組成物。
- 抗原がアレルゲンである、請求項16に記載の免疫調節性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項16に記載の免疫調節性組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項16に記載の免疫調節性組成物。
- 気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者を治療的に処置する方法であって、該患者にイムノマーを投与することを含む、前記方法。
- イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含み、および1つより多い5’末端を有しており、ここで少なくとも1個の前記ヌクレオチドは、到達可能5’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、および免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、請求項21に記載の方法。
- 免疫刺激性ジヌクレオチドが、CpG、C*pG、CpG*、およびC*pG*からなる群から選択され、この式中、Cは、シチジンまたは2’−デオキシシチジンであり、C*は、2’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、1−(2’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−オキソ−7−デアザ−8−メチル−プリン、2’−デオキシ−2’− 置換アラビノシチジン、2’−O−置換アラビノシチジン、2’−デオキシ−5−ヒドロキシシチジン、2’−デオキシ−N4−アルキル−シチジン、2’−デオキシ−4−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Gは、グアノシンまたは2’−デオキシグアノシンであり、G*は、2’デオキシ−7−デアザグアノシン、2’−デオキシ−6−チオグアノシン、アラビノグアノシン、2’−デオキシイノシン、2’−デオキシ−2’置換−アラビノグアノシン、2’−O−置換−アラビノグアノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドである、請求項21に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号170で表される配列を含む、請求項21に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号171で表される配列を含む、請求項21に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号172で表される配列を含む、請求項21に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号173で表される配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 疾病または疾患に関連する抗原を投与することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- イムノマーもしくは抗原または両者が、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合している、請求項21に記載の方法。
- アジュバントを投与することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、または喘息を有する患者における免疫反応を調節する方法であって、該患者にイムノマーを投与することを含む、前記方法。
- 免疫反応がTh1免疫反応である、請求項31に記載の方法。
- 免疫反応がTh2免疫反応である、請求項31に記載の方法。
- イムノマーが、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも2個のオリゴヌクレオチドを含み、および1つより多い5’末端を有しており、ここで少なくとも1個の前記ヌクレオチドが、到達可能5’末端を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、および免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、請求項31に記載の方法。
- 免疫刺激性ジヌクレオチドが、CpG、C*pG、CpG*、およびC*pG*からなる群から選択され、この式中、Cは、シチジンまたは2’−デオキシシチジンであり、C*は、2’−デオキシチミジン、アラビノシチジン、1−(2’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)−2−オキソ−7−デアザ−8−メチル−プリン、2’−デオキシ−2’− 置換アラビノシチジン、2’−O−置換アラビノシチジン、2’−デオキシ−5−ヒドロキシシチジン、2’−デオキシ−N4−アルキル−シチジン、2’−デオキシ−4−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Gは、グアノシンまたは2’−デオキシグアノシンであり、G*は、2’デオキシ−7−デアザグアノシン、2’−デオキシ−6−チオグアノシン、アラビノグアノシン、2’−デオキシイノシン、2’−デオキシ−2’置換−アラビノグアノシン、2’−O−置換−アラビノグアノシンである、請求項31に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号170で表される配列を含む、請求項31に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号171で表される配列を含む、請求項31に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号172で表される配列を含む、請求項31に記載の方法。
- イムノマーが、配列番号173で表される配列を含む、請求項31に記載の方法。
- 疾病または疾患に関連する抗原を投与することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- イムノマーもしくは抗原または両者が、免疫原性タンパク質もしくは非免疫原性タンパク質と結合している、請求項31に記載の方法。
- アジュバントを投与することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
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