CN106999568A - 登革病毒疫苗组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含第一登革疫苗和第二登革疫苗的登革病毒疫苗组合物，其中所述第一登革疫苗包含至少一种活减毒登革病毒或活减毒嵌合登革病毒，且所述第二登革疫苗是重组登革亚单位疫苗、DNA疫苗、缀合物疫苗或灭活登革疫苗；其中所述活减毒登革病毒或活减毒嵌合登革病毒的基因组包含3'非翻译区的TL2茎‑环结构的30个核苷酸缺失。本发明的登革病毒疫苗组合物可以进一步包含一种或多种佐剂。在本发明的优选实施方案中，所述第一登革疫苗和第二登革疫苗是四价的。本发明还涉及使用本发明的登革病毒疫苗组合物来治疗或预防登革感染或预防、改善或延迟其临床表现的发作或进展的方法。

Description

登革病毒疫苗组合物及其使用方法
发明领域
本发明涉及在引发针对登革病毒感染的免疫应答的组合物，其可用于预防和/或治疗对象中的登革病毒感染，和/或其临床表现。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月22日提交的美国临时申请号62/095,331的权益，该申请以其整体通过引用并入本文。
对电子提交的序列表的引用
本申请的序列表作为ASCII格式的序列表，经由EFS-Web电子提交，其文件名为“23913WOPCTSEQ.TXT”，创建日期为2015年11月23日，并且大小为17.5 KB。EFS-Web提交的该序列表是说明书的一部分，且以其整体通过引用并入本文。
发明背景
黄病毒科包括原型黄热病毒(YF)、四种血清型的登革病毒(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)、日本脑炎病毒(JE)、蜱传脑炎病毒(TBE)、西尼罗病毒(WN)、圣路易斯脑炎病毒(SLE)和约70种其他引起疾病的病毒。黄病毒是含有单一正链RNA基因组的小的包膜病毒。十种基因产物由单一开放阅读框编码且翻译为以如下顺序组织的多蛋白：衣壳(C)，“膜前体”(preMembrane，prM，其在病毒粒子从细胞释放前才被加工成“膜”(M))，“包膜”(E)，随后为非结构(NS)蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5 (综述于Chambers, T. J. 等人,Annual Rev Microbiol (1990) 44:649-688; Henchal, E. A.和Putnak, J. R., Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396)。然后，通过由宿主以及病毒编码的蛋白酶介导的精确加工事件产生各个黄病毒蛋白。
黄病毒的包膜源自宿主细胞膜且含有病毒编码的膜锚定的膜(M)和包膜(E)糖蛋白。E糖蛋白是最大的病毒结构蛋白且含有负责细胞表面附着和内体-内融合(intra-endosomal fusion)活性的功能结构域。其也是宿主免疫系统的主要目标，诱导病毒中和抗体的产生，这与保护性免疫相关。
登革病毒通过伊蚊属的蚊子：主要是埃及伊蚊(A. aegypti)和白纹伊蚊(A. albopictus)传播给人。登革病毒的感染导致各种临床表现，范围为从不明显的或轻度的发热疾病，经典型登革热(DF)，到登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)。登革热特征在于高烧、头痛、关节和肌肉疼痛、皮疹、淋巴结病和白细胞减少(Gibbons, R. V. 和 D. W.Vaughn, British Medical Journal (2002) 324:1563-1566)。DHF/DSS是更常见于儿童中的更严重的感染形式，标志为血管通透性和/或严重出血表现，范围为从存在瘀点和瘀斑至自发性严重出血和深度休克。在没有诊断和及时医疗干预的情况下，如果不治疗，DHF/DSS的突然发病和快速进展可以是致命的。
在全球发病率和死亡率的方面，登革病毒是最显著的一组的节肢动物传播病毒，估计每年发生一亿例登革感染，包括至少3600万例登革热和250,000至500,000例DHF/DSS(Gubler, D. J., Clin. Microbiol. Rev. (1998) 11:480-496; Gibbons, 同上)。随着全球人口的增加，人口的城市化(特别是在整个热带地区)，和持续蚊子控制措施的缺乏，登革病的蚊子载体已经将它们的分布扩散遍及热带、亚热带和一些温带地区，给超过一半世界人口带来了登革感染的风险。现代飞机旅行和人类迁徙已经促进了登革血清型的全球分布，使得多种登革血清型现在在许多地区是地方性流行的。在过去20或更多年，已存在登革流行频率和DHF/DSS发病率的增加。例如，在东南亚，DHF/DSS是儿童中住院和死亡的主要因素(Gubler, 同上; Gibbons和Vaughn, 同上)。
迄今为止，黄病毒疫苗的开发成败参半(mixed success)。为了产生保护免于由黄病毒引起的疾病的候选疫苗，已经实施了4种基本方法：活减毒病毒、灭活的完整病毒、重组亚单位蛋白和基于DNA的疫苗。用于黄热病毒的活减毒疫苗已经使用了数十年，并且更近地，用于日本脑炎的活减毒疫苗已在世界多国得到注册。对于TBE和JE病毒，已经证明了灭活的完整病毒疫苗的使用，并且几种注册产品是可用的。Heinz 等人 Flavivirus andflavivirus vaccines. Vaccine 30: 4301-06 (2012)。
尽管上文着重介绍的YF、JE、和TBE疫苗取得了成功，但使用活减毒病毒和灭活的病毒方法来开发登革病毒的疫苗已经遇到了显著挑战。存在四种血清型的登革病毒(DENV1、DENV2、DENV3和DENV4)且发现各血清型的毒株传播遍及整个世界的登革流行地区。自然感染为感染的血清型赋予持久的免疫力，但对非其他登革血清型则没有。当一种血清型的登革病毒感染继之以另一种血清型的第二次感染时，在第二次登革感染后最经常发生更严重形式的疾病(DHF/DSS)。已经假设DHF和DSS与第二次登革感染的更频繁关联是由于一种病毒类型感染诱导的非中和抗体增强第二种登革病毒类型的感染性(抗体依赖性增强- ADE)。
迄今为止，临床测试的大多数疫苗是活减毒疫苗。非复制型疫苗候选物的使用也在探索中。例如，Ivy等人(美国专利6,432,411)公开了包含DEN1-4 80% E (对应于DENV-2包膜多肽的氨基酸1-395的DEN1-4的肽区域)蛋白的四价亚单位疫苗。Ivy等人(同上)还报道了包含DENV 1-4 80% E和ISCOMATRIX®佐剂的组合物。Coller等人(WO 2012/154202)公开了包含DEN 1-4的DEN1-4 80% E的四价制剂。灭活的病毒也可以用作潜在的疫苗候选物或用作有效疫苗的组分(Putnak等人 Vaccine 23: 4442–4452 (2005), US 6190859, US6254873和Sterner等人 WO 2007/002470)。国际专利申请号PCT/US14/042625 (WO/2014/204892)中公开了包含活减毒登革病毒疫苗和非复制型登革疫苗的组合物。
然而，尽管先前作出努力来开发登革疫苗，但迄今没有目前注册的登革疫苗。因此，仍然需要可以诱导针对登革感染和/或登革相关疾病的保护性免疫应答的稳定、安全且有效的疫苗。
发明概述
本发明涉及登革病毒疫苗组合物，其包含药学上有效量的(a) 包含至少一种活减毒登革病毒(LAV)或至少一种活减毒嵌合黄病毒(LACV)的活减毒登革疫苗，其中LAV和LACV包含病毒基因组，其含有对应于3'非翻译(UTR)区域的TL-2茎-环结构的约30个核苷酸的缺失；这降低病毒的复制能力，和(b) 非复制型登革疫苗。发现非复制型登革疫苗与活减毒疫苗在相同的组合物中的存在不显著影响活病毒活力，从而允许活的和非复制型疫苗在相同制剂(“共同制剂” )中施用。
在一些实施方案中，非复制型登革疫苗选自重组登革亚单位疫苗、DNA疫苗、缀合物疫苗或灭活登革疫苗。在进一步实施方案中，非复制型登革疫苗是重组登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。在本发明的一些实施方案中，非复制型登革疫苗是重组登革亚单位疫苗，其包含至少一种登革包膜(E)蛋白或其片段。在本发明的优选实施方案中，重组登革亚单位疫苗是四价的，且包含截短的登革E蛋白，其各自由登革病毒(“DENV”，或者“DEN”)血清型1(又名DENV 1)、DENV 2、DENV 3和DENV 4的野生型E的从其N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80％组成。
在本发明的额外实施方案中，活减毒登革疫苗是四价LAV或“LATV”(即包含来自DENV 1-4的活减毒登革病毒，或如本文所定义的来自DENV 1-4的活减毒嵌合黄病毒，或其组合，其中LAV或LACV中的至少一种是Δ30LAV或Δ30LACV)。在本发明的额外实施方案中，活减毒登革疫苗是四价的且包含至少一种嵌合黄病毒；其中所述嵌合黄病毒包含病毒基因组，其含有编码单一登革病毒血清型的prM和E蛋白的核苷酸序列和编码不同黄病毒的衣壳和非结构蛋白的核苷酸序列，其中所述嵌合黄病毒被减毒。在本发明的一些实施方案中，嵌合黄病毒的衣壳和非结构蛋白来自与prM和E蛋白不同的登革血清型。
在本发明的一个优选实施方案中，活减毒登革疫苗是包含DEN1Δ30病毒、DEN2/4Δ30病毒(DEN4骨架上的DEN2 Δ30LACV)、DEN3Δ30病毒和DEN4Δ30病毒的活减毒四价疫苗。参见图1。
本发明还涉及包含活减毒登革疫苗、重组登革亚单位疫苗和佐剂的登革病毒疫苗组合物，其中活减毒登革疫苗包含至少一种Δ30LAV或Δ30LACV。在本文所述的一些实施方案中，所述佐剂是铝盐佐剂。在替代实施方案中，所述佐剂是基于皂苷的佐剂或toll样受体激动剂佐剂。
本发明的其他方面包括预防登革感染或预防或改善其症状的方法，其包括向有此需要的患者施用药学有效量的本发明的登革病毒疫苗组合物。在本发明的该方面的额外实施方案中，所述组合物以引发/加强的方案施用，其中将第一剂量的组合物施用于有此需要的患者，允许过去预定量的时间，且向患者施用第二剂量的组合物。可以在各剂量之间已经过去预定量的时间之后任选地向患者施用额外剂量。
在额外实施方案中，本发明涉及诱导针对登革感染的免疫应答、从而降低登革感染的可能性的方法，其包括以下步骤：
(a) 混合第一登革疫苗和第二登革疫苗以形成登革病毒疫苗组合物，
其中所述第一登革疫苗是包含登革血清型1-4的活减毒病毒(LAV)或具有针对登革血清型1-4的免疫原性的活减毒嵌合黄病毒(LACV)或其组合的活减毒四价登革疫苗；其中至少一种LAV或LACV是Δ30LAV或Δ30LACV；
其中所述第二登革疫苗是重组四价登革亚单位疫苗或灭活的四价登革疫苗；且其中所述重组四价登革亚单位疫苗包含登革血清型1-4的登革包膜(E)蛋白或其片段；
(b) 在混合之后将步骤(a)的登革病毒疫苗组合物施用于其中待诱导针对登革病的免疫应答的患者，从而降低登革感染的可能性。在本发明的方法的一些实施方案中，免疫应答预防登革感染或预防或改善其症状。在本发明的额外实施方案中，在允许过去预定量的时间之后，向患者施用第二剂量的组合物。组合物的第二剂量的第一登革疫苗和第二登革疫苗可以配制于单一小瓶或两个分开的小瓶中，且在施用于患者之前混合在一起。
本发明还涉及本发明的登革病毒疫苗组合物用于治疗或预防与登革感染相关的疾病(诸如登革热、DSS或DHF)的用途。
如说明书通篇和所附权利要求中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的指代，除非上下文另有清楚指出的。
除非上下文明确指明所示可能性之一，提及“或”表明任一或两种可能性。在一些情况下，“和/或”用于突出任一或两种可能性。
如说明书通篇和所附权利要求中所使用，适用以下定义和缩写：
本文中也称为“LAV”的术语“活减毒病毒”意指活减毒登革病毒，其中与野生型登革病毒相比，病毒引起疾病的能力降低。
术语“活减毒嵌合病毒”(或者“活减毒嵌合黄病毒”)或“LACV”是指活减毒嵌合病毒，其中病毒基因组包含第一黄病毒的骨架(包括C、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5基因)和第二黄病毒的前膜(prM)和包膜(E)基因，其中第二黄病毒选自DENV1、DENV2、DENV3或DENV4。第一黄病毒可以是不同的登革血清型或另一黄病毒，诸如黄热病毒。
术语“Δ30 LAV”是指活减毒DEN1、DEN2、DEN3或DEN4病毒，其中LAV包含病毒基因组，其含有对应于从约nt 143至约nt 172的3'非翻译(UTR)区域的TL2茎-环结构的约30个核苷酸(nt)的缺失，这降低病毒的复制能力(参见WO 03/092592)。
术语“Δ30 LACV”是指来自DENV 1-4的活减毒嵌合黄病毒(LACV)，其中LACV包含病毒基因组，其含有对应于从约nt 143至约nt 172的3'UTR区域的TL2茎-环结构的约30 nt的缺失，这降低病毒的复制能力(参见WO 03/092592)。
术语“Δ30/Δ31 LAV”是指活减毒DEN1、DEN2、DEN3或DEN4病毒，其中病毒基因组包含3'UTR的TL2茎-环结构的约30 nt的缺失，并且进一步包含3'UTR的约31 nt的单独、不连续的上游缺失，其去除直到且包括TL-3同源结构的序列，使得缺失延伸远至登革3'UTR的TL-3同源结构的5'边界。参见Whitehead等人, 美国专利号8,337,860。在本发明的优选实施方案中，DEN3 LAV包含Δ30/Δ31突变。
术语“Δ30/Δ31 LACV”是指如上所述的活减毒嵌合DEN1、DEN2、DEN3或DEN4病毒，其中嵌合病毒的病毒基因组包含3'UTR的TL2茎-环结构的30 nt缺失，并且进一步包含使TL-3结构缺失的3'UTR的单独、不连续的上游31 nt缺失，如上所述。
术语“LATV”或“活减毒四价病毒”或“LATV疫苗”是指包含有效量的DEN1 LAV或LACV、DEN2 LAV或LACV、DEN3 LAV或LACV，和DEN4 LAV或LACV的疫苗，其中登革LAV或LACV中的至少一种包含3'UTR中的TL-2结构的Δ30突变，如上文和WO 03/092592中所述。在一些优选实施方案中，LATV包含以下特征：(1) rDEN1Δ30，其为DENV1 LAV，其中DENV1病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30 nt缺失；(2) rDEN2/4Δ30，其为在DENV4骨架上包含DENV2 prM和E基因的DENV2 LACV，其中DEN4骨架包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30-nt缺失；(3) rDEN3Δ30/Δ31，其为DENV3 LAV，其中DENV3病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30 nt缺失和对应于3'UTR的TL-3结构的单独、不连续的上游31 nt缺失；和(4) rDEN4Δ30，其为DENV4 LAV，其中DENV4病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30 nt缺失(参见图1)。
“非复制型疫苗”是指用于预防或治疗登革病毒感染或其临床症状的登革病毒疫苗，其选自重组亚单位疫苗、灭活疫苗、缀合物疫苗或DNA疫苗。
“灭活疫苗”是指包含有效量的杀灭的或无活性的完整登革病毒和药学上可接受的载体的疫苗，其中所述病毒通过任何方式(包括用化学品、热或辐射)灭活。灭活疫苗在灭活之后具有低残余感染性，例如灭活之后的<5噬斑形成单位(PFU)/mL。在优选的实施方案中，在灭活之后存在非常少量的残余感染性，例如<4 PFU/mL、<3 PFU/mL、或<2 PFU/mL、<1PFU/mL、<0.5 PFU/mL、或<0.1 PFU/mL。特定疫苗的PFU可以，例如，通过使用噬斑测定、免疫染色测定或本领域中已知用于检测病毒感染性的其他方法来测定。
“缀合物疫苗”是指包含共价连接至载体蛋白的登革抗原的疫苗。
“DNA疫苗”是包含编码登革蛋白抗原(包括登革蛋白、登革蛋白片段和登革融合蛋白及其变体)的核苷酸序列的疫苗。DNA疫苗包含质粒(例如DNA或病毒质粒)，其含有可操作连接至启动子的编码目的抗原的核苷酸序列。
“亚单位疫苗”是指包括一种或多种登革抗原成分(但不是完整登革病毒)，诸如登革免疫原性表位、登革蛋白、登革抗原融合蛋白(包括不同登革血清型抗原的融合体)或登革蛋白片段的疫苗。如本文所使用的亚单位疫苗可以是单价的(包含单一登革抗原)或多价的(包含多于一种抗原组分)。在优选的实施方案中，所述亚单位疫苗是四价的。
术语“共同制剂引发-加强”是指这样的治疗方案，其包括(1)向有此需要的患者施用登革病毒疫苗组合物，其中所述组合物包含(a) 至少一种活减毒登革病毒(LAV)或活减毒嵌合黄病毒(LACV)，其中LAV或LACV包含在病毒基因组的3'非翻译区域中的Δ30突变，且其中LACV的病毒基因组包含单一登革病毒血清型的prM和E基因以及不同黄病毒的C和非结构基因，(b) 非复制型登革疫苗，和(c) 药学上可接受的载体；(2) 等待经过预定量的时间；和(3) 向患者施用如上所述的第二登革病毒疫苗组合物。在一些实施方案中，非复制型登革疫苗是亚单位疫苗或灭活疫苗。第二登革病毒疫苗组合物可以与第一登革病毒疫苗组合物相同或不同，只要其包含根据本发明的活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗。本发明的组合物中使用的登革病毒疫苗可用于在人患者中诱导针对同源登革病毒的病毒中和抗体应答。
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防止措施。“需要”治疗的个体或患者包括已经具有登革感染的那些，无论是否表现任何临床症状，以及处于登革感染的风险中的那些。用本发明的登革疫苗组合物或共同制剂治疗患者包括以下的一种或多种：在患者中诱导/增加针对登革病的免疫应答，诱导针对一种或多种登革病毒的病毒中和抗体应答，在已经被登革感染的患者中预防、改善、消除或降低登革病的临床表现的可能性，预防或降低发生登革热、DHF、或DSS和/或与登革感染相关的其他疾病或并发症的可能性，降低登革感染和/或与登革相关的其他疾病或并发症的临床症状的严重性或持续时间，和预防或降低登革感染的可能性。
术语“药学有效量”或“有效量”意指将足够的疫苗组合物引入患者以产生期望效果，包括，但不限于：在患者中诱导/增加针对登革病的免疫应答，在患者中诱导/增加针对登革病的病毒中和抗体应答，预防或降低登革感染的可能性，预防或降低登革反复感染的可能性，在已经感染登革病的患者中预防、改善或消除登革感染的临床表现，预防登革热、DHF和/或DSS，或降低与登革相关的疾病的严重性或持续时间。本领域技术人员认识到该水平可以变化。
术语“免疫应答”是指细胞介导的(T-细胞)免疫应答和/或抗体(B细胞)应答。
术语“患者”是指待接受本文所述的登革疫苗组合物/共同制剂的能够被登革病毒(例如DEN1、DEN2、DEN3或DEN4)感染的哺乳动物，包括具有免疫活性的和免疫低下的个体。在优选实施方案中，所述患者是人。如本文所定义，“患者”包括已经感染登革病的那些，无论是通过自然感染或接种，或者可能随后暴露的那些。
“MAA”是指Merck铝佐剂。MAA是无定形羟基磷酸铝硫酸盐佐剂。
“ISCOM样佐剂”是包含免疫刺激复合物(ISCOM)(其由皂苷、胆固醇和磷脂构成，它们一起形成特征性的笼状颗粒)的佐剂，其具有促成其功能的独特球形、笼状结构(对于综述，参见Barr和Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996))。该术语既包括ISCOM™佐剂(其用抗原产生并且在ISCOM™颗粒内包含抗原)，还包括ISCOM™基质佐剂(其是在没有抗原的情况下产生的中空的ISCOM型佐剂)。在本文提供的组合物和方法的优选实施方案中，ISCOM型佐剂是ISCOM™基质颗粒佐剂，如ISCOMATRIX™，其在没有抗原的情况下制造(ISCOM™和ISCOMATRIX™是澳大利亚帕克维尔CSL Limited的注册商标)。
名称“rDEN1Δ30-1545”是指重组登革1病毒，其中病毒基因组包含(1) 3'UTR的TL2茎-环结构的30 nt缺失和(2)在核苷酸位置1545的取代，其在病毒适应于在Vero细胞中生长之后发生。
名称“rDEN2/4 Δ 30(ME)-1495,7163”是指重组嵌合登革2/4病毒，其中病毒基因组包含：(1)登革4骨架(C、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5基因)，其包含(i)3'UTR的TL2茎-环结构的30 nt缺失和(ii)在核苷酸位置1495和7163的取代，其在病毒适应于在Vero细胞中生长之后发生，和(2)登革2 prM和E基因。
名称“rDEN3Δ30/31-7164”是指重组登革3病毒，其中病毒基因组包含：(1) 3'UTR的TL2茎-环结构的30 nt缺失，(2)Δ30突变上游的3'UTR中的单独的31 nt缺失，其缺失TL-3结构，和(3)在核苷酸位置7164的取代，其在病毒适应于在Vero细胞中生长之后发生。
名称“rDEN4Δ 30-7132,7163,8308”是指重组登革4病毒，其中病毒基因组包含：(1) 3'UTR的TL2茎-环结构的30 nt缺失和(2)在核苷酸位置7132、7163和8308的取代，其在病毒适应于在Vero细胞中生长之后发生。
“V180”是指由来自4种登革病毒血清型(DENV1、DENV2、DENV3和DENV4)的每一种的截短的包膜糖蛋白(DEN-80E)构成的四价亚单位疫苗，其中所述E蛋白各自构成从野生型E的N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80％，使得所述E蛋白当在宿主细胞中重组表达时可分泌至生长培养基中。参见Coller等人 WO 2012/154202。
以下缩写在本文中使用，且具有以下含义：C是登革衣壳基因，DEN(或DENV)是登革病毒，DF是登革热，DHF是登革出血热，DSS是登革休克综合征，h是小时，GMT是几何平均滴度，IM是肌内，IMX是Iscomatrix™，JE是日本脑炎，LAV是活减毒病毒，MAA是Merck铝佐剂，MAPA是Merck磷酸铝佐剂，NS (用于NS1-NS5中)是非结构的，nt是核苷酸，PFU是噬斑形成单位，prM是登革前膜基因，SC是皮下，TBE是蜱传脑炎，UTR是非翻译区域，WN (或WNV)是西尼罗病毒，YF (或YFV)是黄热病毒，且wt是野生型。
附图简述
图1提供了实施例1-3中使用的Δ30 LATV (Δ30四价活减毒登革病毒疫苗)的组成的示意图。
图2显示了混合所示佐剂和亚单位登革抗原对上文和实施例1中所述的Δ30 LATV中的登革病毒1型(图中的“rDEN1Δ30”柱)、登革病毒2型(“rDEN2/4Δ30”柱)、登革病毒3型(“rDEN3Δ30”柱)和登革病毒4型(“rDEN4Δ30”柱)的病毒活力的影响。如实施例2中所述使用Vero细胞上的体外噬斑测定法，测定病毒活力(报告为以PFU/ml计的病毒滴度)。显示了与在4℃下储存24小时之后的相同混合物相比，每种样品的初始时间点(0小时)的值。
图3提供了在第4周(剂量1后4周，参见实施例3)，在恒河猴中诱导的登革血清型中和抗体滴度(LiCor50 GMT)。研究中使用的免疫时间表和制剂显示于表2中。使用如实施例3中所述的基于LiCor的微量中和测定法，测定免疫滴度。
图4提供了在第20周(剂量2后4周，参见实施例3)，在其数据提供于图3中的相同恒河猴中诱导的登革血清型中和抗体滴度(LiCor50 GMT)。
图5提供了对于实施例3中描述的所有组的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的纵向几何平均中和滴度。
图6提供了在第4周(剂量1后4周，参见实施例4)，在恒河猴中诱导的登革血清型中和抗体滴度(LiCor50 GMT)。研究中使用的免疫时间表和制剂显示于表3中。使用如实施例3中所述的基于LiCor的微量中和测定法，测定免疫滴度。
图7提供了在第28周(剂量2后4周，参见实施例4)，在其数据提供于图6中的相同恒河猴中诱导的登革血清型中和抗体滴度(LiCor50 GMT)。
图8提供了对于实施例4中描述的所有组的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的纵向几何平均中和滴度。
发明详述
本发明涉及登革病毒疫苗组合物，其包含药学上有效量的(a) 包含至少一种活减毒登革病毒(LAV)或至少一种活减毒嵌合黄病毒(LACV)的活减毒登革疫苗，其中LAV和LACV包含病毒基因组，其含有对应于3'非翻译(UTR)区域的TL-2茎-环结构的约30个核苷酸的缺失，这降低病毒的复制能力，且其中LACV的病毒基因组包含编码单一登革病毒血清型的prM和E蛋白的核苷酸序列和编码不同黄病毒的C和非结构蛋白的核苷酸序列；和(b) 非复制型登革疫苗，任选地还包含佐剂。将LAV或LACV和第二疫苗配制于相同的小瓶或分开的小瓶中且在施用于对象之前混合在一起。在本发明的实施方案中，将根据本发明的组合物在引发-加强治疗方案中两次或更多次施用于患者。
包括在一个时间点施用活减毒疫苗、随后在2周至2年后施用非复制型登革疫苗的常规的异源引发-加强方案是可以使用的一种替代方法，但该方法可引起应当在系列中首先施用何种疫苗(活减毒疫苗或非复制型疫苗)的混淆。以适当顺序施用活减毒疫苗和非复制型疫苗是重要的，因为反转顺序(首先亚单位或灭活疫苗，随后为活减毒疫苗)可导致劣等免疫应答，如果人们变得自然感染，则所述劣等免疫应答可增加对其患更严重的登革病的风险。因此，将活减毒疫苗和非复制型疫苗共施用于患者简化了完整治疗方案的施用。据认为，(1)活减毒疫苗和(2)非复制型疫苗的共同制剂，当在引发-加强方案中施用时，疫苗将引起强烈的免疫应答，其在引发时主要由活疫苗驱动且在加强时主要由非复制型疫苗驱动。
在本发明之前，据认为，亚单位抗原或灭活疫苗和/或佐剂在包含活减毒病毒的登革疫苗组合物中的存在具有灭活活减毒病毒、导致病毒滴度降低的潜力。Minke等人(Vaccine 29 (2011) 4608-4612和Veterinary Immunol.and Immunopathol. 111 (2006)47-57)以及Guthrie等人(Vaccine 27 (2009) 4434-4438)报道了配制于卡波姆佐剂中的表达衍生自WNV的prM/E基因的修饰的活重组金丝雀痘病毒。然而，该疫苗组合物不含分离的病毒亚单位抗原。
已经测试了在引发-加强策略中使用不同的登革病毒疫苗。Simmons等人(Virology 396 280-288 (2010)；美国专利号8,440,202和美国专利号8,241638)通过用灭活疫苗或基于DNA的疫苗的形式的非复制型疫苗引发动物、随后用四价活减毒疫苗加强，在恒河猴中测试登革病的引发加强方法。Kanakatte等人(WO 2008127307)也描述了针对登革病的异源引发加强方案，其使用包含DNA表达系统、腺病毒表达载体或委内瑞拉马脑炎病毒复制子系统的引发免疫原和包含四价活减毒疫苗的加强免疫原的。在该方法中，在施用引发免疫原的两周和2个月之间施用加强免疫原。
Guy等人(WO 2008/047023)报道了在患者中诱导针对DEN1-4的保护的方法，其包括：施用(a)第一系列的(i)一剂量的第一血清型的疫苗登革病毒和一剂量的第二血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一剂量的第三血清型的疫苗登革病毒和一剂量的第四血清型的疫苗登革病毒的施用，和(b)第二系列的剂量(i)和(ii)的施用，其中剂量(i)和(ii)在分离的解剖部位同时施用，并且其中第二系列在第一系列之后至少30天至至多12个月执行。因此，针对登革病的引发/加强方法的先前报道集中于使用LAV作为加强免疫原，且要求在施用引发组合物和施用LAV之间经过数周至数个月的一段时间。
我们在本文中已经显示，令人惊讶地，剂量1后四周用本发明的组合物(共同制剂)(Δ30 LATV + V180)免疫的恒河猴中测量的几何平均中和滴度与当单独给予Δ30 LATV疫苗时诱导的那些相当(参见实施例3)。这表明Δ30 LATV疫苗与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®佐剂的共同制剂不负面影响对第一剂量的活减毒病毒疫苗的响应。
本文中进一步显示，与单独的Δ30 LATV疫苗相比，常规的引发加强(Δ30 LATV引发，随后为V180加强)和共同制剂引发加强方法(Δ30 LATV + V180共同制剂引发，随后为Δ30 LATV + V180共同制剂加强)诱导针对所有四种DENV类型的更好的中和滴度。与接受常规的引发-加强方案的组中诱导的中和应答相比，在加强剂量后四周时的共同制剂组中的中和应答是等效的，如果不是更好的话。这表明，Δ30 LATV疫苗与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®佐剂的共同制剂不负面影响对所述亚单位加强的应答。
因此，异源引发/加强方法的益处可以通过如下实现：(a)将第一登革疫苗组合物施用于有此需要的患者，所述组合物包含：(1)活减毒登革疫苗，其中活减毒登革疫苗包含至少一种包含病毒基因组的LAV或LACV，其中所述病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL-2茎-环结构的约30个核苷酸的缺失，和(2)非复制型登革疫苗；(b)允许经过预定量的时间；和(3)将第二登革病毒疫苗组合物施用于患者。在本发明的一些实施方案中，非复制型疫苗选自亚单位登革疫苗和灭活登革疫苗。在该实施方案中，将本发明的登革疫苗组合物作为引发和加强组合物施用于患者。在本发明的实施方案中，第一登革疫苗组合物和第二登革疫苗组合物是相同的。在替代实施方案中，第一登革疫苗组合物和第二登革疫苗组合物是不同的。
因此，本发明涉及预防或降低登革感染的可能性，或预防、治疗或改善其临床表现的方法，所述方法包括：
(a) 将第一登革病毒疫苗组合物施用于有此需要的患者，
(b) 在步骤(a)之后等待经过预定量的时间；和
(c) 向患者施用第二登革病毒疫苗组合物，
其中第一和第二登革病毒疫苗组合物包含：
(i)包含至少一种活减毒登革病毒(LAV)或活减毒嵌合黄病毒(LACV)的活减毒登革疫苗，其中所述LACV包含单一登革病毒血清型的prM和E基因以及不同黄病毒的骨架；且其中所述LAV或LACV包含病毒基因组，其含有3'UTR中的TL-2茎-环结构的30个核苷酸缺失；和
(ii)非复制型登革疫苗。
在上述方法的一些实施方案中，非复制型疫苗是登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。
在本发明的优选实施方案中，活减毒和非复制型登革疫苗是四价的(即包含DEN1、DEN2、DEN3和DEN4组分或诱导针对DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的免疫应答)。
在共同制剂引发-加强方法的一些实施方案中，步骤(c)的第二登革病毒疫苗组合物与步骤(a)的第一登革病毒疫苗组合物是相同的。在替代实施方案中，步骤(c)的组合物与步骤(a)的组合物不是相同的。在额外实施方案中，所述方法包括重复步骤(b)和(c)一次或多次。在一些实施方案中，将步骤(a)和/或步骤(c)的第一疫苗和第二登革疫苗配制于分开的小瓶中且在施用之前混合在一起。认为在引发/加强方案中使用本发明的组合物将引起强烈的免疫应答，其在引发(第一剂量)时主要由活减毒疫苗驱动且在加强(第二剂量)时主要由非复制型疫苗(例如亚单位或灭活疫苗)驱动。
因此，本发明涉及包含有效量的活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗以及药学上可接受的载体的登革病毒疫苗组合物，其中所述活减毒登革疫苗包含至少一种活减毒登革病毒(LAV)或至少一种活减毒嵌合黄病毒(LACV)，其中所述LAV或LACV包含病毒基因组，其含有3'UTR中的TL-2茎-环结构的30个核苷酸缺失。在本发明的一些实施方案中，本发明的登革病毒疫苗组合物的非复制型登革疫苗选自重组登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。
为了制备本发明的药物或无菌登革病毒疫苗组合物，将如本文所述的活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗与药学上可接受的载体或赋形剂混合。或者，活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗在混合前包含药学上可接受的载体，且当混合疫苗时不需要额外载体。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences 和 U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)。药学上可接受的载体包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗和吸收延迟剂等。所述载体可以适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”是指这样的物质，如上所述，其与适合于施用于人的本发明活性成分(例如完整灭活的病毒、活减毒病毒、活减毒嵌合病毒、病毒蛋白、包含编码登革抗原蛋白的核苷酸序列的质粒或登革抗原缀合物)混合。在本发明的实施方案中，药学上可接受的载体不以相同形式存在于自然界中，例如该物质是人造的，因为其不存在于自然界中或该物质的纯度和/或无菌度(sterility)与相应的天然物质是不相同的。例如，注射用无菌水，其为注射用蒸馏水的无菌、不含细菌、无溶质制剂，不以相同形式存在于自然界中，且被认为是药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种本文公开的活性成分(例如，四价LAV)和注射用无菌水。在进一步实施方案中，药学上可接受的载体可以是水的另一种形式，其适用于药物或生物制剂，且与自然界中存在的水不相同，其包括纯化水、注射用水、无菌纯化水和抑菌性注射用水。
药物组合物在制备和储存条件下通常应当是无菌和稳定的。可以通过以例如冻干粉末、浆料、水溶液、悬浮液、微乳液、分散体、脂质体或适合于疫苗配制和施用的其他有序结构的形式，与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman, 等人(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams和Wilkins, New York,NY; Avis,等人(编) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications,Marcel Dekker, NY; Lieberman, 等人 (编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, 等人(编) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner和Kotkoskie (2000)Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY)。
本发明的登革病毒疫苗共同制剂可以进一步包含额外组分，包括但不限于如下面讨论的佐剂、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、盐、抗微生物防腐剂、表面活性剂、张力调节剂、螯合剂、葡聚糖、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖T40、二乙醇胺、胍、氯化钙、柠檬酸钠、白蛋白、明胶、聚乙二醇(PEG)、脂质和肝素。本领域技术人员能够容易地确定期望的登革病毒疫苗组合物或共同制剂中应当包括哪些额外的赋形剂，这取决于其在制剂中的功能，以及预计的施用模式，剂量，和其他因素，诸如组合物的预期的储存时间和温度。本领域技术人员认识到额外的赋形剂的量可以变化，并且可以容易地确定对于施用于人安全且对于期望的功能有效的适当量。
活减毒登革病毒疫苗
如上所示，本发明的登革病毒疫苗组合物包含活减毒登革疫苗，其包含选自登革病毒1型(DEN1)、登革病毒2型(DEN2)、登革病毒3型(DEN3)和登革病毒4型(DEN4)的至少一种LAV，或LACV，其中LAV或LACV包含含有3'UTR中的TL-2 Δ30修饰的病毒基因组，且其中LAV或LACV：诱导针对登革病的免疫应答，诱导针对登革病的病毒中和抗体应答，保护免于感染或降低感染的可能性或降低其临床表现的严重度或持续时间。在本发明的实施方案中，活减毒登革疫苗是单价、二价、三价或四价的，即分别诱导针对DEN血清型1-4中的一种、两种、三种或四种或保护免于DEN血清型1-4中的一种、两种、三种或四种的免疫应答。在本发明的优选实施方案中，活减毒登革疫苗是四价的，即诱导针对DEN血清型1-4或保护免于DEN血清型1-4的免疫应答，并且包含DEN1、DEN2、DEN3和DEN4组分，其中每种组分是LAV或LACV。
在本发明的一些实施方案中，本发明的LATV的每一种LAV或LACV组分包含活减毒病毒，其独立地是减毒嵌合黄病毒或减毒登革病毒，其包含在病毒基因组的3'UTR中的TL-2Δ30修饰。登革病毒的减毒通过TL-2 Δ30修饰实现。然而，在疫苗的一种或多种组分中也可以包括额外的减毒突变，包括但不限于：在位置1495、1545、7132、7163、7164和8308的突变。减毒突变可以通过不同的技术来实现，包括本领域中已知的方法，诸如通过组织培养物上的连续传代或通过更多定义的遗传操作。可用于减毒登革病毒和嵌合登革病毒的突变是本领域中已知的。参见，例如，WO 02/095075、WO 2006/44857、美国专利号7,189,403、美国专利号8,337,860、WO 2003/103571、WO 2000/014245和WO 2008/022196。已知的减毒登革毒株也可以用于本文组合物中，诸如W O 06/134433、WO 2006/134443、WO 2007/141259、WO96/40933、WO 2000/057907、WO 2000/057908、WO 2000/057909、WO 2000/057910和WO2007/015783中描述的毒株。
本发明的组合物的优选实施方案包含四价活减毒登革疫苗(LATV)。此四价活减毒疫苗可以包含四种减毒登革病毒(LAV)、三种LAV和一种减毒嵌合黄病毒毒株(LACV)、两种登革LAV和两种LACV、一种登革LAV和三种LACV，或四种LACV。
在优选实施方案中，LATV包括以下特征：(1) rDEN1Δ30，其为DENV1 LAV，其中DENV1病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30 nt缺失；(2) rDEN2/4Δ30，其为在DENV4骨架上包含DENV2 prM和E基因的DENV2 LACV，其中DEN4骨架包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30-nt缺失；(3) rDEN3 Δ30/Δ31，其为DENV3 LAV，其中DENV3病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30 nt缺失和对应于3' UTR的TL-3结构的单独、不连续的上游31 nt缺失；和(4) rDEN4Δ30，其为DENV4 LAV，其中DENV4病毒基因组包含对应于3'UTR中的TL2茎-环结构的30 nt缺失。
在本发明的包含嵌合黄病毒的实施方案中，各嵌合黄病毒包含病毒基因组，其包含编码单一登革病毒血清型的prM和E蛋白的核苷酸序列和编码不同黄病毒的衣壳和非结构蛋白(即“骨架”)的核苷酸序列，其中各嵌合黄病毒是减毒的。用于构建重组活减毒黄病毒毒株的方法可以包括使用已知减毒毒株作为基础，其中所述方法包括用来自相关目的病毒的适当基因(prM和E)取代基础病毒的等同基因。例如，该方法已用于WNV，其中所述嵌合病毒是类型间嵌合的，基于包含WNV的prM和E基因的减毒DEN-4毒株(Bray, M.等人, J. Virol. (1996) 70:4162-4166; Chen, W., 等人, J. Virol. (1995) 69:5186-5190;Bray, M.和Lai, C.-J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346; Lai,C. J.等人, Clin. Diagn. Virol. (1998) 10:173-179)。
另一种方法是使用YF 17D减毒黄热病毒株作为基础来开发重组嵌合疫苗，其先前用于JE病毒、DEN病毒和WN 病毒。可以通过将编码来自任何黄热病毒株(例如，YFV 17D)的prM和E蛋白的基因替换为登革血清型的那些而构建包含黄热病骨架的嵌合黄热病疫苗。DNA克隆之后，转录RNA且转染入Vero细胞，以获得具有YFV 17D复制机器和相关登革病毒的外壳(external coat)的嵌合病毒。参见Guirakhoo等人, Journal of Virology, 74(12):5477–5485 (2000); Guy等人, Vaccine 28: 632–649 (2010); Monath T.P. Adv Virus Res (2003) 61:469-509; Monath等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694;和WO 98/37911。因此，在本发明的一些实施方案中，活减毒登革疫苗包含(1)至少一种包含单一登革血清型的prM和E蛋白和黄热病骨架的嵌合黄病毒和(2)至少一种包含病毒基因组的LAV或LACV，所述病毒基因组包含3'UTR的TL-2茎-环结构的30-核苷酸缺失。
可用于本发明的组合物中的嵌合活减毒黄病毒也可以包含登革嵌合病毒，其中病毒基因组包含单一登革病毒血清型的prM和E基因和不同的登革病毒血清型的衣壳和非结构基因。在其中嵌合病毒包含来自第二登革血清型的骨架的实施方案中，登革骨架包含对应于TL-2茎-环结构的3'UTR的约30个核苷酸的缺失，并且可以任选地包含额外的减毒突变。通过将TL-2茎-环结构的30-核苷酸缺失引入减毒登革骨架或野生型登革病毒骨架，任何减毒登革病毒或野生型登革病毒都可以用作嵌合病毒的骨架。可以通过连续传代、通过引入定义的基因突变或通过使用已知的减毒登革毒株来实现登革病毒骨架的减毒。登革嵌合疫苗描述于，例如，Whitehead等人WO 03/092592中。在本发明的一些实施方案中，活减毒疫苗包含嵌合黄病毒，其中衣壳和非结构蛋白来自与prM和E蛋白不同的登革血清型。
本发明的登革病毒疫苗组合物包含有效量的活减毒病毒疫苗。在本发明的一些实施方案中，活减毒登革疫苗的效价是10至约1x107噬斑形成单位(PFU)。在替代实施方案中，活减毒登革疫苗的效价是约1x102至约1x106 PFU。在其他实施方案中，活减毒登革疫苗的效价是约1x103至约1x105 PFU。
登革亚单位疫苗
在本发明的一些实施方案中，所述组合物包含重组登革亚单位疫苗，其包含一种或多种登革抗原蛋白。在本发明的该方面的优选实施方案中，所述重组登革亚单位疫苗包含一种或多种登革蛋白、融合蛋白或其一种或多种片段。在进一步优选的实施方案中，重组登革亚单位疫苗包含登革包膜或E蛋白、或其片段。
在进一步优选的实施方案中，重组登革亚单位疫苗是四价的，即靶向针对所有四种登革血清型的免疫应答。重组登革亚单位疫苗可以包含四种重组登革蛋白或少于四种重组登革蛋白，例如重组DEN1蛋白、重组DEN2蛋白和重组DEN3/4融合蛋白。在一些实施方案中，重组登革亚单位疫苗包含DEN1-4的登革病毒包膜糖蛋白或其片段(例如DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E或DEN4-80EZip)，其使用重组表达系统产生和分泌。所述亚单位疫苗可以任选地包含佐剂，如下面更充分描述。
在本发明的该方面的一些实施方案中，所述重组登革亚单位疫苗包含一种或多种纯化的登革病毒包膜(“E”)蛋白、药学上可接受的赋形剂，其中所述E蛋白各自构成野生型E的从其N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80%，使得所述E蛋白当在宿主细胞中重组表达时可被分泌到生长培养基中，且其中所述组合物在人对象中诱导中和抗体的产生。在本发明的一些实施方案中，所述重组登革亚单位疫苗进一步包含有效量的佐剂。在本发明的一些实施方案中，DEN-4 E蛋白是二聚的(“DEN4-80EZip”)，如描述于US 6,749,857和WO2012/154202中。
在本发明的该方面的一些实施方案中，上述组合物中的E蛋白在昆虫宿主细胞中重组产生和表达。在进一步优选的实施方案中，E蛋白在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) Schneider 2 (S2)宿主细胞中重组产生和表达。
本发明的重组登革病毒E蛋白可以借助使用果蝇Schneider 2 (S2)细胞的细胞培养表达系统产生。该系统已经表明产生维持天然样结构的重组登革包膜蛋白(Cuzzubbo 等人, Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2001) 8:1150-55; Modis 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (2003) 100:6986-91; Modis 等人, Nature (2004) 427:313-9; Zhang 等人, Structure (2004)12(9):1607-18)。也已经显示该表达系统表达来自其他黄病毒诸如西尼罗病毒、日本脑炎病毒、丙型肝炎病毒和蜱传脑炎病毒的其他重组包膜蛋白。重组登革包膜蛋白可以在C-末端截短，剩下80%的天然包膜蛋白(“80E”)。因此80E被定义为E蛋白的从其N-末端的氨基酸1开始的约前80%的连续氨基酸。
如上所述，本发明的该方面的一些实施方案包含截短的80E蛋白，其由野生型E的从其N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80％组成。本发明的一些实施方案中使用的E蛋白缺失该蛋白的膜锚定部分(E的羧基末端的约最后10％)。换言之，本发明的具体实施方案中使用的截短80E蛋白由E的从其N-末端的氨基酸1开始的多达前90%的连续氨基酸组成，因此允许其被分泌至细胞外培养基，以便于回收。截短可以进一步缺失连接80E部分与膜锚定部分的E蛋白的“茎”部分；茎部分不含显著的抗原表位且因此不包括在优选的抗原DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E、DEN4-80E或DEN4-80EZip中。可克隆和分泌超过90%，但少于100%的E蛋白，即该蛋白可为90%+的长度，羧基端截短的，并且可以包括跨膜结构域的部分，只要截短的E蛋白可分泌。“可分泌”意指能够被分泌，且通常从表达系统中的转化细胞分泌。因此，本领域技术人员将意识到，可用于本发明的组合物和方法中的登革E蛋白可以与本文例举的80％不同，只要该蛋白是可分泌的。在本发明的各方面的优选实施方案中，DEN E蛋白为约80％的长度，从包膜蛋白的N-末端氨基酸开始且在第393至第401氨基酸的范围内的氨基酸结束，例如，为从登革病毒2型的氨基酸1至氨基酸395。在本发明的各方面的替代实施方案中，登革E蛋白可以是E的其N-末端的氨基酸1开始的连续氨基酸的约75％、约85％、约90％、约95％、或约98％。在本发明的各方面的示例性实施方案中，DEN E蛋白是E蛋白的其N-末端的氨基酸1开始的连续氨基酸的约80％；诸如如SEQ ID NO:1中所述的DEN1-80E，如SEQ ID NO:2中所述的DEN2-80E，如SEQ ID NO:3中所述的DEN3-80E和如SEQ ID NO:4中所述的DEN4-80E。
分泌的E蛋白可以进一步含有促进二聚化的结构域，诸如在DEN4-80EZip蛋白中，使得进一步增强重组蛋白的免疫原性。示例性DEN4-80EZip蛋白包含如SEQ ID NO:5中所述的氨基酸序列。在本发明的该方面的一些实施方案中，所述组合物中包括的DEN1、DEN2和DEN3 80E抗原是单体的，且DEN4 80E抗原是二聚的。
在本发明的该方面的替代实施方案中，所述组合物中的DEN1-80E、DEN2-80E、DEN3-80E和DEN4-80E蛋白是单体的。在此类实施方案中，DEN4成分存在的量是DEN1、DEN2、和DEN3蛋白的个别量的约1.5至约3倍，优选DEN1、DEN2、和DEN3成分(蛋白)的量的约2倍。在本发明的该方面的优选实施方案中，所述组合物中的DEN1:DEN2:DEN3:DEN4抗原的比率是约1:1:1:2。
在本发明的包含登革E蛋白的实施方案中，所述组合物中的各E蛋白的量是约0.5μg至约500 μg。在替代实施方案中，各E蛋白的量是约0.5 µg至约450 µg、0.5 µg至约400 µg、0.5 µg至约350 µg、0.5 µg至约300 µg、0.5 µg至约250 µg、0.5 µg至约200 µg、0.5 µg至约150 µg、0.5 µg至约100 µg、0.5 µg至约50 µg、5.0 µg至约500 µg、5.0 µg至约450 µg、5.0 µg至约400 µg、5.0 µg至约350 µg、5.0 µg至约300 µg、5.0 µg至约250 µg、5.0 µg至约200 µg、5.0 µg至约150 µg、5.0 µg至约100 µg、5.0 µg至约50 µg、10 µg至约500 µg、10 µg至约450 µg、10 µg至约400 µg、10 µg至约350 µg、10 µg至约300 µg、10 µg至约250µg、10 µg至约200 µg、10 µg至约150 µg、10 µg至约100 µg、10 µg至约50 µg、25 µg至约500 µg、25 µg至约450 µg、25 µg至约400 µg、25 µg至约350 µg、25 µg至约300 µg、25 µg至约250 µg、25 µg至约200 µg、25 µg至约150 µg、25 µg至约100 µg或25 µg至约50 µg。在进一步优选的实施方案中，所述组合物中的各E蛋白的量是约1.0 μg至约100 μg。在又进一步实施方案中，所述组合物中的各E蛋白的量选自约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500 µg。
灭活登革疫苗
作为本发明的登革疫苗共同制剂中的登革亚单位疫苗的替代方案，也可以使用完整灭活登革疫苗或灭活登革嵌合疫苗。本文共同制剂的灭活登革疫苗包含一种或多种完整灭活的登革病毒和/或一种或多种灭活的登革嵌合病毒。在本发明的该方面的一些实施方案中，灭活登革疫苗是四价的，且包含完整灭活的DEN1、DEN2、DEN3和DEN4。在替代实施方案中，所述灭活疫苗包含四种灭活的嵌合登革病毒。在又其他实施方案中，所述灭活疫苗是四价的，并且包含一种或多种完整灭活的登革病毒和一种或多种灭活的登革嵌合病毒，例如灭活的完整DEN1病毒、灭活的完整DEN2病毒、灭活的DEN3嵌合病毒和灭活的DEN4嵌合病毒。本领域技术人员意识到，灭活的完整或嵌合的DEN病毒的任何组合可以用于本发明的四价组合物和方法中，只要所述疫苗组合物靶向所有四种登革血清型。
可用于本发明的组合物和方法中的灭活的登革疫苗描述于Putnak等人Vaccine23:4442-4452 (2005)、US 6190859、US 6254873和Sterner等人WO 2007/002470。或者，可以通过本领域中已知的方法，例如，用化学品、热或辐射来灭活登革病毒毒株和嵌合登革毒株/嵌合黄病毒毒株，以用于本发明的组合物和方法中。
佐剂
已经广泛地研究了疫苗与可增强针对目的抗原的免疫应答的化合物(称为佐剂)的共同施用。除了增强针对目的抗原得免疫应答以外，一些佐剂可以用于降低引发期望的免疫应答所必需的抗原的量，或降低临床方案中诱导持久的免疫应答且提供免于疾病的保护所需要的注射次数。
为此，本发明的登革病毒疫苗共同制剂可以采用佐剂。本文描述的共同制剂的佐剂可以是如上所述行使期望功能且不灭活或显著影响组合物的LAV或LACV的滴度的任何佐剂。
超过60年前，确定基于铝的化合物具有佐剂活性(综述参见Lindblad, E.B.Immunol. and Cell Biol. 82: 497-505 (2004); Baylor 等人 Vaccine 20: S18-S23(2002))。当以适当剂量使用时，通常认为铝佐剂是安全的。在全世界内，监管机构已经批准了许多铝佐剂用于施用于人。
因此，基于铝的化合物诸如氢氧化铝(Al(OH)3)、羟基磷酸铝(AlPO4)、无定形羟基磷酸铝硫酸盐(AAHS)或所谓的“明矾”(KAl(SO4)·12H2O) (参见Klein 等人, Analysis ofaluminum hydroxyphosphate vaccine adjuvants by Al MAS NMR., J. Pharm. Sci. 89(3): 311-21 (2000))，可以与本文提供的组合物组合。在本文提供的本发明的示例性实施方案中，铝佐剂是羟基磷酸铝或AAHS，或者称为“MAA”。在替代实施方案中，所述铝佐剂是磷酸铝佐剂，本文中称为“MAPA”。在其他实施方案中，所述佐剂是氢氧化铝。
本领域技术人员将能够确定铝佐剂的最佳剂量，所述最佳剂量既安全又有效增加针对靶向的登革病毒的免疫应答。对于铝的安全性概况以及FDA批准的疫苗中包括的铝的量的讨论，参见Baylor 等人, Vaccine 20: S18-S23 (2002)。通常，铝佐剂的有效且安全剂量在50 µg至1.25 mg元素铝/剂量(100 µg/mL至2.5 mg/mL浓度)而变化。
因此，本发明的具体实施方案包括包含活减毒登革病毒疫苗和非复制型疫苗的组合物，如本文中任何实施方案所述，并且进一步包含铝佐剂。在一些实施方案中，所述非复制型疫苗选自重组登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。在本发明的实施方案中，所述登革组合物包含含有约50 μg至约1.25 mg元素铝/剂量疫苗的佐剂。在其他实施方案中，铝佐剂/剂量疫苗组合物包含范围为以下量的元素铝：约100 µg至约1.0 mg、约100 µg至约900 µg、约100 µg 至约850 µg、约100 µg 至约800 µg、约100 µg至约700 µg、约100 µg至约600 µg、约100 µg 至约500 µg、约100 µg至约400 µg、约100 µg至约300 µg、约100至约250 µg、约200 µg至约1.25 mg、约200 µg至约1.0 mg、约200 µg至约900 µg、约200 µg 至约850 µg、约200 µg 至约800 µg、约200 µg至约700 µg、约200 µg至约600 µg、约200 µg 至约500µg、约200 µg至约400 µg、约200 µg至约300 µg、约300 µg至约1.25 mg、约300 µg至约1.0mg、约300 µg至约900 µg、约300 µg 至约850 µg、约300 µg 至约800 µg、约300 µg至约700µg、约300 µg至约600 µg、约300 µg至约500 µg、约300 µg至约400 µg、约400 µg至约1.25mg、约400 µg至约1.0 mg、约400 µg至约900 µg、约400 µg至约850 µg、约400 µg至约800 µg、约400 µg至约700 µg、约400 µg至约600 µg、约400 µg至约500 µg、约500 µg至约1.25mg、约500 µg至约1.0 mg、约500 µg至约900 µg、约500 µg至约850 µg、约500 µg至约800 µg、约500 µg至约700 µg、约500 µg至约600 µg、约600 µg至约1.25 mg、约600 µg至约1.0mg、约600 µg至约900 µg、约600 µg至约850 µg、约600 µg至约800 µg或约600 µg至约700µg。
可以与本发明的登革病毒疫苗组合物结合使用的其他佐剂包括包括但不限于含有CpG寡核苷酸，或作用于toll样受体诸如TLR 4和TLR9的其他分子的佐剂(关于综述，参见Daubenberger, C.A., Curr. Opin. Mol. Ther. 9(1):45-52 (2007); Duthie等人,Immunological Reviews 239(1): 178-196 (2011); Hedayat 等人, Medicinal Research Reviews 32(2): 294-325 (2012))，所述分子包括脂多糖、单磷酰脂质A和氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。可用于本发明的组合物中的额外佐剂包括免疫刺激性寡核苷酸(IMO；参见例如U.S. 7,713,535和U.S. 7,470,674)；T-辅助表位、脂质A及其衍生物或变体、脂质体、磷酸钙、细胞因子(例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) IL-2、IFN-α、Flt-3L)、CD40、CD28、CD70、IL-12、热休克蛋白(HSP) 90、CD134 (OX40)、CD137、CoVaccineHT、非离子型嵌段共聚物、不完全弗氏佐剂、趋化因子、霍乱毒素；大肠杆菌不耐热肠毒素；百日咳毒素；胞壁酰二肽、胞壁酰二肽类似物、MF59，SAF、免疫刺激复合物、生物可降解的微球体、聚磷腈；合成多核苷酸。
用于与本文描述的组合物一起使用的额外佐剂是以ISCOM (“免疫刺激复合物”，关于综述参见Barr和Mitchell, Immunology and Cell Biology 74: 8-25 (1996);以及Skene和Sutton, Methods 40: 53-59 (2006))的特征形式，含有单独或与胆固醇和磷脂组合的皂苷(例如QS21)的佐剂。此类佐剂在本文中称为“基于皂苷的佐剂”。在本文提供的组合物和方法的具体实施方案中，突变毒素和/或毒素蛋白与ISCOM型佐剂或“ISCOM”组合，所述“ISCOM”是ISCOM基质颗粒佐剂，诸如在没有抗原的情况下制造的ISCOMATRIX™(ISCOM™和ISCOMATRIX™是澳大利亚帕克维尔CSL Limited的注册商标)。
使用方法
本发明的实施方案还包括一种或多种本文所述的登革疫苗共同制剂，其(i)用于以下,(ii)用作用于以下的药物或组合物，或(iii)用于制备用于以下的药物：(a)治疗(例如，人体)；(b)药物；(c)抑制登革病毒复制，包括DEN1、DEN2、DEN3和/或DEN4；(d)诱导针对DEN1、DEN2、DEN3和/或DEN4中的一种或多种的免疫应答或保护性免疫应答；(e)诱导针对一种或多种登革类型的病毒中和抗体应答；(f)治疗或预防登革病毒的感染；(g)预防登革病毒感染的复发；(h)降低与登革病毒感染相关的病理症状的进展、发作或严重性和/或降低登革病毒感染的可能性或，(i)治疗、预防或延迟登革相关疾病的发作、严重性或进展，所述登革相关疾病包括但不限于：登革热、登革出血热、登革休克综合征。在这些用途中，登革疫苗组合物可以任选地与一种或多种佐剂(例如，本文所述的MAA、磷酸铝、氢氧化铝诸如Alhydrogel®、或其他铝盐佐剂、基于皂苷的佐剂诸如ISCOMATRIX™ (CSL, Ltd.)、TLR激动剂、或脂质纳米颗粒)组合应用。
因此，本发明提供了用于预防和/或治疗性治疗登革病毒感染或登革相关疾病的方法，其包括向需要治疗的患者施用一种或多种本发明的共同制剂。
“患者”(或者在本文中称为“对象”)是指能够被登革病毒(诸如DEN1、DEN2、DEN3或DEN4)感染的哺乳动物。在优选实施方案中，患者是人。可以预防性或治疗性治疗患者。预防性治疗提供了足够的保护性免疫，以降低登革感染或其效果(例如，登革热)的可能性或严重度。可以进行治疗性治疗，以降低登革感染或其临床效果的严重度或预防其复发。
预防性治疗可以使用本发明的登革病毒疫苗组合物来进行，如本文所述。本发明的共同制剂可以施用于一般群体或处于增加的登革感染风险的那些人，例如住在或将旅行至伊蚊属蚊子流行的世界地区的那些人。
“需要治疗”的那些包括已经具有登革感染(例如，被DEN1、DEN2、DEN3或DEN4中的一种或多种感染)的那些，以及倾向于具有任何感染的那些或期望感染可能性降低的任何人。
本发明的登革病毒疫苗组合物可以使用本领域众所周知的技术配制且施用于患者。通常的药物施用的指导提供于例如Vaccines 编辑 Plotkin和Orenstein, W.B.Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences第20版, 编辑Gennaro, Mack Publishing, 2000；和Modern Pharmaceutics第20版，编辑Banker和Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990。
因此，本发明提供了用于在患者中诱导针对登革感染的保护性免疫应答的方法，其包括向患者施用免疫有效量的本文所述的任何登革病毒疫苗组合物的步骤。
本发明还提供了用于治疗登革感染或用于治疗与登革感染相关的任何病理状态的方法，此类治疗包括预防感染，和降低临床症状的严重度，延缓或预防疾病的进展，和/或降低感染或其临床症状的可能性；所述方法包括向患者施用免疫有效量的任何本文所述的疫苗组合物的步骤。
本发明的额外实施方案包括在引发/加强方案中向患者施用两种或更多种本发明的组合物。因此，本发明涉及预防或降低有此需要的患者中的登革感染的可能性的方法，其包括以下步骤：
(a) 向所述患者施用本发明的第一登革病毒疫苗组合物；
(b) 步骤(a)之后等待过去预定量的时间；
(c) 向所述患者施用本发明的第二登革病毒疫苗组合物；和(d) 任选地重复步骤(b)和(c)；
由此在所述患者中预防登革感染或降低被登革感染的可能性。
在上述方法的实施方案中，本发明的登革病毒疫苗组合物呈液体的形式(即活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗一起配制为相同的小瓶或容器中的液体)。在替代实施方案中，冻干所述登革病毒疫苗组合物(即活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗一起配制且冻干于相同的小瓶或其他容器中)，且在施用于患者之前用无菌稀释剂重构。在额外实施方案中，活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗提供于分开的小瓶或容器中，且在施用于患者之前由临床医生混合在一起。在此类实施方案中，活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗可以(1)两者均呈液体形式，(2)两者均冻干，或(3)一种疫苗呈液体形式且一种疫苗被冻干。当一种疫苗呈液体形式且一种疫苗被冻干时，所述冻干疫苗可以用液体疫苗重构以形成本发明的登革病毒疫苗组合物，或者冻干疫苗可以用无菌稀释剂重构且然后与液体疫苗混合以形成本发明的登革病毒疫苗组合物。
第一剂量的本发明的登革病毒疫苗组合物和第二剂量的本发明的登革病毒疫苗组合物或其后任何剂量之间的时间量是约2周至约2年。在本发明的优选的实施方案中，在多次施用之间允许经过2个月至12个月的时间。在本发明的该方面的替代实施方案中，疫苗组合物的各剂量的各施用之间的时间量独立地选自2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月和24个月。
在本发明的一些实施方案中，所述第一和第二登革病毒疫苗组合物是相同的。在替代实施方案中，所述第一和第二登革病毒疫苗组合物不是相同的。
本发明的登革病毒疫苗组合物可以通过不同的途径施用。在本发明的优选的实施方案中，本发明的组合物胃肠外施用，即通过皮内、皮下或肌内注射。皮下和肌内施用可以使用，例如，针或喷射注射器来进行。
本文所述的组合物可以以与剂量制剂相容的方式且以免疫有效的量进行施用，以治疗和/或降低登革感染的可能性。在本发明的上下文中，施用于患者的剂量应足以随着时间在患者中实现有利应答，诸如登革病毒水平的降低，或降低被登革感染的可能性。待施用的登革病毒疫苗的量可以取决于待治疗的对象，包括其年龄、性别、重量和总体健康情况。在这方面，需要施用的疫苗的精确量将取决于从业者的判断。在待针对登革感染的治疗或预防中施用的疫苗的有效量的确定中，医师可以评估循环血浆水平、疾病进展和抗登革抗体的产生。在任何情况下，本发明的免疫原性组合物的合适剂量可以由本领域技术人员容易地决定。
合适的给药方案优选考虑本领域众所周知的因素进行确定，包括患者的年龄、重量、性别和医学状况；施用途径；期望的效应；和采用的具体组合物。给药的时机取决于本领域众所周知的因素且范围可以为2周至24个月。在最初施用之后，可以施用一个或多个额外剂量，以维持和/或加强抗体滴度。
本发明还涉及用于预防登革病毒感染或预防或改善其症状的方法，其包括以下步骤：(a)将活减毒登革疫苗和非复制型登革疫苗混合以形成登革病毒疫苗组合物，其中所述第一疫苗包含至少一种登革热LAV或LACV，其中所述LAV或LACV包含对应于3'UTR的TL-2茎-环结构的约30个核苷酸的缺失；和(b)向登革感染或其症状待预防或改善的患者施用一剂量的步骤(a)的登革病毒疫苗组合物。在该方法中，所述登革病毒疫苗组合物在混合之后其保持稳定的时间段内(例如24小时内)施用于患者。在本发明的该方面的一些实施方案中，所述非复制型登革疫苗是重组登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。
本发明的该方面的进一步实施方案包括(c)在施用所述登革病毒疫苗组合物之后允许过去预定量的时间，和(d)施用第二剂量的本发明的组合物。在所述实施方案中，步骤(c)和(d)可以任选地重复一次或多次。
在上述方法中，所述第一登革疫苗是优选四价的，且包含DEN1、DEN2、DEN3和DEN 4组分，其中各组分包含活减毒登革病毒或活减毒嵌合黄病毒，如本文所述。在示例性实施方案中，所述活减毒登革疫苗包含四种嵌合黄病毒；其中各嵌合黄病毒包含单一登革病毒血清型的prM和E蛋白和不同的黄病毒的衣壳和非结构蛋白，其中各嵌合黄病毒是减毒的。在某些实施方案中，四种嵌合黄病毒的衣壳和非结构蛋白来自黄热病毒。在替代实施方案中，四种嵌合黄病毒各自的衣壳和非结构蛋白来自与prM和E蛋白不同的登革血清型。
在本发明的该方面的一些实施方案中，所述第二登革疫苗是四价重组登革亚单位疫苗，其包含来自DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的登革E蛋白或其片段。本文描述了可用于本发明的该方法中的亚单位疫苗。在优选实施方案中，所述E蛋白各自构成DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的野生型E的从其N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80％。
在上述方法的某些实施方案中，所述活减毒登革疫苗是冻干的，且所述重组亚单位疫苗在混合之前是液体。在一些实施方案中，步骤(a)的混合包括用液体疫苗重构冻干疫苗。在替代实施方案中，所述冻干疫苗用无菌稀释剂重构，然后与步骤(a)中的液体疫苗混合。
本文提及的所有出版物都通过引用并入，其目的为描述且公开可以与本发明结合使用的方法和材料。
已经参考附图描述了本发明的不同实施方案，应当理解的是，本发明不限于那些精确实施方案，并且在不背离如随附权利要求定义的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中实现各种变化和修改。
实施例1
用于测试活减毒登革病毒在佐剂和/或登革抗原(四价DEN-80E)存在的情况下的相容性/稳定性的制剂的制备。
进行研究以评估重组Δ30活减毒病毒(rDEN1-4)当与四价DEN-80E (1-4)亚单位疫苗(V180) (单独或与MAA或ISCOMATRIX® (IMX)组合)组合共同配制时的相容性/稳定性。
所有制剂都使用无菌技术在生物安全柜中制备。用于测试的样品用期望佐剂、一种或多种登革抗原或佐剂/一种或多种抗原组合配制于Dulbecco氏PBS中，且置于用FLUROTEC® (West Pharmaceutical Services, Inc., Exton, PA)塞子密封的2 ml无菌ISO小瓶中。本研究中测试的佐剂/抗原样品如下：(1) 单独的PBS；(2)四价DEN-80E (DEN1-80E + DEN2-80E + DEN3-80E + DEN4-80E)；(3)四价DEN-80E + MAA；(4)四价DEN-80E +3xMAA和(5)四价DEN-80E + ISCOMATRIX™佐剂(IMX)。如下所述，将佐剂/抗原样品与活减毒登革病毒以1:1比率现场混合。所述样品在与Δ30活减毒登革病毒(如实施例2中所述)现场混合之前和之后的剂量和浓度显示于表1中。
表1. 四价测试样品的浓度
。
所有制剂在与LAV现场混合之前储存在2-8℃。
实施例2
具有Δ30登革活减毒病毒的共同制剂在佐剂和/或登革热抗原(四价DEN-80E)存在的情况下的相容性/稳定性测试
将实施例1中制备的抗原/佐剂样品与Δ30活减毒登革病毒现场混合，且如下所述使用Vero细胞上的体外噬斑测定，测试病毒活力。这些研究中使用的活减毒登革病毒是(rDEN1- rDEN1Δ30-1545；rDEN2 – rDEN2/4 Δ30(ME)-1495,7163；rDEN3 – rDEN3Δ30/31-7164；和rDEN4 – rDEN4 Δ30-7132,7163,8308)。在与Δ30 LAV现场混合之后，登革抗原和佐剂的浓度提供于表1中。
用4 x 105个Vero细胞/孔接种二十四孔板。Vero细胞的传代水平为P144。为了稀释病毒样品用于噬斑测定(T=0小时时间点)，在22℃水浴中解冻每一种的∆30 LAV's(rDEN1- 4)各1 mL的等分试样。在2%培养基199中进行病毒的稀释以产生具有2 x 105PFU/mL的病毒滴度的稀释储液。将来自该稀释储液的0.5 mL病毒等分至新鲜管中，且与0.5mL实施例1中描述的佐剂/抗原制剂之一混合以得到1:1稀释。获得的总体积为1 mL，其中0.5mL用于T=0小时噬斑测定，且0.5 mL储存于4℃，用于T=24时间点噬斑测定。
使用2%培养基199在96孔板中制备1:1 ∆30LAV:佐剂/抗原样品的进一步稀释液以得到各测试样品的1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:100,000 和1:1,000,000稀释。为了进行该测定，Vero细胞单层用PBS洗涤，且将75μl各稀释的样品(一式两份)添加至平板的各孔。使病毒接种物散布至孔中的细胞上，且将平板置于培养箱中。每10-15分钟摇动平板，持续1小时，以均匀散布接种物。吸附1小时之后，通过将1 ml培养基中的1%甲基纤维素添加至各孔而覆盖细胞，且在37℃和5% CO2下孵育。
孵育6天之后，从每个孔吸出甲基纤维素覆盖物，并将细胞单层进行使用泛-黄病毒单克隆抗体4G2的免疫染色(Henchal等人. Dengue virus-specific and flavivirusgroup determinants identified with monoclonal antibodies by indirectimmunofluorescence. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 31(4):830–836 (1982))。在免疫染色程序后，通过计数在适当病毒稀释度的噬斑数目来测定病毒滴度。
24小时之后，重复上述程序以测定储存之后各样品的病毒滴度。如上所述制备样品。结果表明，测试的佐剂、单独的亚单位抗原或佐剂/抗原制剂对T=0的Δ30 LAV的病毒滴度都不具有任何影响(参见图2)。该结果进一步表明，甚至在4℃孵育24小时之后，与单独的亚单位抗原以及与佐剂在一起的Δ30 LAV是稳定的。
实施例3
在恒河猴(Macaca mulatta)中评估登革引发 – 加强接种策略
恒河猴中进行的该非GLP研究的目标是评估共同制剂引发–加强接种策略且将其与常规的引发加强策略进行比较。对于该研究，使用不同的方案施用两种疫苗候选物，四价重组登革亚单位疫苗候选物(V180)和Δ30四价登革活减毒疫苗(Δ30 LAV)。四价V180候选物包含来自4种登革病毒血清型(登革病毒(DENV)1、DENV2、DENV3和DENV4)的每一种的截短的包膜糖蛋白(DEN-80E)。Δ30四价LAV包含登革类型1-4的活减毒登革病毒((rDEN1 - rDEN1Δ30-1545; rDEN2 – rDEN2/4 Δ30(ME)-1495,7163; rDEN3 – rDEN3Δ30/31-7164; 和rDEN4 – rDEN4 Δ 30-7132,7163,8308)。
在本研究中利用任一性别(n=4/组)、称重超过3 kg且通过ELISA为黄病毒(DENV1、2、3和4，和西尼罗河病毒)抗体阴性的健康成体、印度恒河猴。如表2中所述施用疫苗。对于该研究，第1组在0和16周时皮下(SC)接受Δ30 LAV疫苗。第2组接受常规的引发加强，其中在0周时给予Δ30 LAV疫苗，随后在16周时给予使用Alhydrogel® (BrenntagBiosector, Frederikssund, DK)配制的V180。第3组在0和16周时接受Δ30 LAV疫苗和V180/Alhydrogel®的共同制剂(共同制剂引发加强)。以0.5mL/剂量施用所有疫苗。接种之后，每天观察动物在接种部位的任何变化或可能指示对疫苗的不良反应的活动或摄食习惯的其他变化。
表2. 恒河猴免疫原性研究中使用的时间表和制剂
。
使用基于LiCor的微量中和测定每4周测定病毒中和活性，直至研究第20周。对于LiCor测定，将Vero细胞以1.5x104个细胞/孔接种于平底96孔组织培养板中的100 μl 10%培养基199中，过夜。在分开的96孔板中，以1:10开始，一式两份2倍连续稀释血清样品，进行8次稀释。对于没有达到终点滴定的样品，以较高稀释度开始，重新测试样品。将血清与等体积的稀释至50 pfu/孔的病毒一起孵育。在2%培养基199中进行所有测定稀释。将混合物在37℃ + 5% CO2孵育1小时。中和之后，将整个混合物添加至铺板的Vero细胞上，且在37℃ +5% CO2孵育4天。去除培养基之后，将细胞用PBS中的3.7％甲醛固定30分钟。将板用200 μl0.1% Titon X-100/PBS洗涤2次，每次5分钟。将板用50μl 2.8 μg/ml的4G2抗体染色。然后以7.5 μg/ml添加生物素化的马抗小鼠IgG，随后添加IRDye® 800CW链霉抗生物素蛋白(1:1000)和DRAQ5荧光探针(1:10,000)的混合物。将板保持在黑暗中，用于该最后显色。将抗体和试剂稀释于补充0.2% Tween-20的Odyssey封闭缓冲液中。在抗体更换之间，将板用0.1%Tween-20/PBS洗涤3次。孵育步骤在室温进行1小时。使用BioTek® EL406洗板器系统(Winooski, VT)将洗涤和分配步骤自动化。将板风干且用红外Odyssey® Sa成像系统(Li-Cor Biosciences)扫描。将原始数据输入Excel处理工作表。取一式两份孔平均值，且将血清终点中和滴度定义为当与各测定板上包括的病毒对照相比时使800nm/700nm荧光积分强度比率减少≥50％的最高血清稀释度的倒数。使用Prism® (GraphPad Software, Inc.)绘制结果。以1:10稀释度开始，设置所有样品。如果样品在该稀释度不能中和，则分配1:5的滴度。
对于第4周(剂量1后4周)的所有组的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的几何平均中和滴度概述于图3中。在该时间点，在所有免疫的动物(除了第2组中没有对DENV 4响应的一个动物)中检测到病毒中和抗体应答。来自第4周的关键结论是：
• 在剂量1后四周时的共同制剂组(第3组)中测量的中和应答，与当单独给予Δ30LATV疫苗时诱导的中和应答(第1和2组)相当。这表明Δ30 LATV疫苗与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®佐剂的共同制剂没有负面影响对第一剂量的活减毒病毒疫苗的响应。
对于第20周(剂量2后4周)的所有组的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的几何平均中和滴度概述于图4中。在该时间点，在所有免疫的动物中检测到病毒中和抗体应答。来自第20周结果的关键结论是：
• 与Δ30 LATV疫苗(第1组)相比，常规的引发加强(第2组)和共同制剂引发加强方法(第3组)都诱导了对所有四种DENV类型的更好的中和滴度。取决于DENV类型，滴度范围为1.7至6.7倍更高。
• 与接受常规的引发-加强方案的组中诱导的中和应答相比，在剂量2后四周时的共同制剂组(第3组)中测量的中和应答是等效的，如果不是更好的话。这表明，Δ30 LATV疫苗与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®佐剂的共同制剂没有负面影响对亚单位加强的应答。
所有组的对DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的纵向几何平均中和滴度显示于图5中。总而言之，数据表明，共同制剂引发加强方案引起与常规的引发加强方法相当的应答且所述应答优于作为同源疫苗给予的Δ30 LATV。
实施例4
在恒河猴中评估登革引发 – 加强剂量依赖性接种策略
恒河猴中进行的该非GLP研究的目标是评估使用亚单位疫苗和登革活减毒疫苗的不同共同制剂剂量的共同制剂引发–加强接种策略。对于该研究，使用实施例3中描述的两种疫苗候选物。
在本研究中利用任一性别(n=5/组)、称重超过4 kg且通过ELISA为黄病毒(DENV1、2、3和4，和西尼罗河病毒)抗体阴性的健康成体、印度恒河猴。如表3中所述施用疫苗。对于该研究，第1组在0和24周时皮下(SC)接受Δ30 LAV疫苗(10e5 pfu各LAV)。第2组在0和24周时接受Δ30 LAV疫苗(10e5 pfu各LAV)和V180 (10、10、10、20 μg各80E) /Alhydrogel®(Brenntag Biosector, Frederikssund, DK)的共同制剂(共同制剂引发加强)。第3组在0和24周时接受Δ30 LAV疫苗(10e5 pfu各LAV)和V180 (3、3、3、6 μg各80E) /Alhydrogel®的共同制剂(共同制剂引发加强)。第4组在0和24周时接受Δ30 LAV疫苗(10e3 pfu各LAV)和V180 (10、10、10、20 μg各80E) /Alhydrogel®的共同制剂(共同制剂引发加强)。以0.5mL/剂量施用所有疫苗。接种之后，每天观察动物在接种部位的任何变化或可能指示对疫苗的不良反应的活动或摄食习惯的其他变化。
表3. 恒河猴免疫原性研究中使用的时间表和制剂
。
使用如上面实施例3中所述的基于LiCor的微量中和测定每4周测定病毒中和活性，直至研究第28周。
对于第4周(剂量1后4周)的所有组的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的几何平均中和滴度概述于图6中。在该时间点，在所有免疫的动物(除了没有对DENV 1响应的第1组中的一个动物和第4组中的一个动物)中检测到病毒中和抗体应答。来自第4周结果的关键结论是：
• 在剂量1后四周时的共同制剂组(第2、3和4组)中测量的中和应答，与当单独给予Δ30 LATV疫苗时诱导的中和应答(第1组)相当。这表明Δ30 LATV疫苗与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®佐剂的共同制剂没有负面影响对第一剂量的活减毒病毒疫苗的响应。
• 接受高剂量(10e5 pfu各病毒)的Δ30 LATV(第2组)或低剂量(10e3 pfu各病毒)的Δ30 LATV(第4组)的共同制剂组中的中和响应是相当的。这表明，与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®的共同制剂没有负面影响较低剂量的Δ30 LATV疫苗。
对于第28周(剂量2后4周)的所有组的DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的几何平均中和滴度概述于图7中。在该时间点，在所有免疫的动物中检测到病毒中和抗体应答。来自第28周结果的关键结论是：
• 所有共同制剂组(第2、3和4组)在剂量2后4周时都展示出LiCor中和滴度的强烈加强，其优于仅Δ30 LATV组(第2组)中观察到的那些。这表明，Δ30 LATV疫苗与V180亚单位疫苗和Alhydrogel®佐剂的共同制剂没有负面影响对亚单位加强的应答。
• 含有低剂量V180的共同制剂(第3组)以及含有高剂量V180的共同制剂(第2组)都有加强。
• 含有低剂量(10e3 pfu各病毒)的Δ30 LATV的共同制剂(第4组)以及含有高剂量(10e5 pfu各病毒)的Δ30 LATV的共同制剂(第2组)都有加强。
所有组的对DENV1、DENV2、DENV3和DENV4的纵向几何平均中和滴度显示于图8中。总而言之，数据表明，共同制剂引发加强方案引起与常规的引发加强方法相当的应答且所述应答优于作为同源疫苗给予的Δ30 LATV。
序列表
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<211> 395
<212> PRT
<213> 登革1
<400> 1
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DEN4-80EZip
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435 440 445
Cys Gly Gly
450

Claims (41)

1.登革病毒疫苗组合物，其包含药学上有效量的：
(a) 包含至少一种活减毒登革病毒(LAV)或至少一种活减毒嵌合黄病毒(LACV)的活减毒登革疫苗，其中所述LAV和所述LACV包含病毒基因组，其含有对应于3'非翻译(UTR)区域的TL-2茎-环结构的约30个核苷酸的缺失；和
(b) 非复制型登革疫苗。
2.权利要求1的组合物，其中所述非复制型登革疫苗是重组登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。
3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述非复制型登革疫苗是四价登革亚单位疫苗，其包含来自登革病毒1型(DEN1)、登革病毒2型(DEN2)、登革病毒3型(DEN3)和登革病毒4型(DEN4)的登革E蛋白或其片段。
4.权利要求3的组合物，其中所述E蛋白各自构成DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的野生型E的从其N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80％。
5.权利要求3或权利要求4的组合物，其进一步包含佐剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述佐剂是铝盐佐剂。
7.权利要求6的组合物，其中所述组合物中的元素铝的量为约50μg至约1.25mg。
8.权利要求7的组合物，其中所述组合物中的元素铝的量为约200μg至约850μg。
9.权利要求5的组合物，其中所述佐剂是基于皂苷的佐剂。
10.权利要求3-8中任一项的组合物，其中所述组合物中的每一种E蛋白的量为约0.5μg至约500μg。
11.权利要求10的组合物，其中所述组合物中的每一种E蛋白的量为约1.0 μg至约100μg。
12.权利要求11的组合物，其中DEN4 E蛋白的量是DEN1、DEN2和DEN3 E蛋白的量的约1.5至约2.5倍。
13.权利要求10-12中任一项的组合物，其中每一种E蛋白在昆虫宿主细胞中重组产生且表达。
14.权利要求1-13中任一项的组合物，其中所述活减毒登革疫苗是四价的。
15.权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述活减毒登革疫苗包含一种具有针对登革2型的免疫原性的LACV和三种具有针对登革1、3和4型的免疫原性的LAV。
16.权利要求15的组合物，其中所述LACV的病毒基因组包含登革血清型2的前膜(prM)和包膜(E)基因和不同登革血清型的衣壳和非结构基因。
17.权利要求16的组合物，其中所述不同登革血清型是登革血清型4。
18.权利要求1-17中任一项的组合物，其中所述活减毒登革疫苗包含具有对登革血清型3的免疫原性的LAV，其中所述LAV的病毒基因组还在所述Δ30缺失的上游含有对应于3'UTR的TL-3结构的核苷酸的缺失。
19.权利要求14-18中任一项的组合物，其中所述活减毒登革疫苗的效价是10至约1x107噬斑形成单位(PFU)。
20.权利要求19的组合物，其中所述活减毒登革疫苗的效价是约1x103至约1x105 PFU。
21.在有此需要的患者中诱导针对登革病的免疫应答的方法，其包括向所述患者施用有效量的权利要求1-20中任一项的登革病毒疫苗组合物。
22.在有此需要的患者中降低登革感染的可能性、或预防或改善其症状的方法，其包括向所述患者施用有效量的权利要求1-20中任一项的登革病毒疫苗组合物。
23.降低登革感染的可能性、或预防或改善其症状的方法，其包括以下步骤：
(a) 混合第一和第二登革疫苗以形成登革病毒疫苗组合物，其中所述第一登革疫苗是包含至少一种活减毒登革病毒(LAV)或至少一种活减毒嵌合黄病毒(LACV)的活减毒登革疫苗，其中所述LAV和所述LACV包含病毒基因组，其含有对应于3'非翻译(UTR)区域的TL-2茎-环结构的约30个核苷酸的缺失；且其中所述第二登革疫苗是非复制型登革疫苗；和
(b) 向有此需要的患者施用步骤(a)的登革病毒疫苗组合物。
24.权利要求23的方法，其中所述非复制型登革疫苗是重组登革亚单位疫苗或灭活登革疫苗。
25.权利要求23或权利要求24的方法，其中所述第一登革疫苗是四价的，且包含具有针对登革血清型1 (DEN1)的免疫原性的组分、具有针对登革血清型2 (DEN2)的免疫原性的组分、具有针对登革血清型3 (DEN3)的免疫原性的组分和具有针对登革血清型4 (DEN4)的免疫原性的组分，其中每一种组分包含活减毒登革病毒或活减毒嵌合黄病毒。
26.权利要求24或25的方法，其中所述第二登革疫苗是四价重组登革亚单位疫苗，其包含来自DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的登革E蛋白或其片段。
27.权利要求26的方法，其中所述活减毒登革疫苗是冻干的，且所述重组亚单位疫苗在混合之前是液体。
28.权利要求27的方法，其中步骤(a)的混合包括用所述液体疫苗重构所述冻干疫苗。
29.权利要求27的方法，其中在步骤(a)中与所述液体疫苗混合之前，使用无菌稀释剂重构所述冻干疫苗。
30.权利要求26的方法，其中所述活减毒疫苗和所述重组亚单位疫苗两者在混合之前均呈液体形式。
31.权利要求26-30中任一项的方法，其中所述E蛋白各自构成DEN1、DEN2、DEN3 和DEN4的野生型E的从其N-末端的氨基酸残基1开始的长度的约80％。
32.权利要求23的方法，其中所述活减毒登革疫苗包含一种具有针对登革血清型2的免疫原性的LACV和三种具有针对登革血清型1、登革血清型3和登革血清型4的免疫原性的LAV；其中所述LACV包含病毒基因组，其包含登革血清型2的前膜和包膜基因以及登革血清型4的非结构和衣壳基因。
33.权利要求32的方法，其中具有针对DEN3的免疫原性的LAV含有病毒基因组，其在所述Δ30缺失的上游进一步包含对应于3'UTR的TL-3结构的核苷酸的缺失。
34.降低有此需要的患者中的登革感染的可能性的方法，其包括以下步骤：
(a) 向所述患者施用根据权利要求1-20中任一项的第一登革病毒疫苗组合物；
(b) 步骤(a)之后等待过去预定量的时间；
(c) 向所述患者施用根据权利要求1-20中任一项的第二登革病毒疫苗组合物；由此降低所述患者被登革感染的可能性。
35.权利要求34的方法，其中所述第一登革病毒疫苗组合物和所述第二登革病毒疫苗组合物是相同的。
36.权利要求34或35的方法，其中步骤(b)中的时间量为2个月至2年。
37.权利要求34-36中任一项的方法，其进一步包括重复步骤(b)和(c)一次或多次。
38.权利要求34-36中任一项的方法，其中所述第一登革病毒疫苗组合物和所述第二登革病毒疫苗组合物通过肌内或皮下注射来施用。
39.权利要求1-20中任一项的登革病毒疫苗组合物用于治疗或预防与登革感染相关的疾病的用途。
40.权利要求1-20中任一项的登革病毒疫苗组合物用于在患者中诱导针对登革病毒的免疫应答的用途。
41.根据权利要求1-20中任一项的登革病毒疫苗组合物，其用于治疗或预防与登革感染相关的疾病。
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