ES2558106T3 - Formación de complejos de ácidos nucleicos con componentes catiónicos disulfuro-reticulados para la transfección e inmunoestimulación - Google Patents

Formación de complejos de ácidos nucleicos con componentes catiónicos disulfuro-reticulados para la transfección e inmunoestimulación Download PDF

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Abstract

Complejodecargaportadorpolimérico que comprende: a) comounportador,unportadorpoliméricoformadopor componentes catiónicos reticulados con disulfuro, donde los componentes catiónicos reticulados con disulfuro son péptidos catiónicos, teniendo los pépridos catiónicos una longitu de 10-100 residuos aminoácidos, donde los enlaces disulfuro están formados por residuos cisteína contenidos en los péptidos catiónicos, que están situados proximales a los extermos terminales de los péptidos catiónicos, y b) comounacarga,almenosunamoléculadeARN monohebra, para su uso en un método para inmunoestumlar inespecíficamente la respuesta inmune de un paciente que lo necesite o para uso en un método para un tratamiento adyuvante de un paciente que lo necesite.

Description

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El complejo de carga portador polimérico de la invención como se define arriba comprende como un componente un portador polimérico formado por componentes catiónicos reticulados por disulfuro. El término “componente catiónico” se refiere típicamente aunamoléculacargada,cargada positivamente (catión) a un valor de pH de aproximadamente 1 a 9, de preferencia a un valor de pH de o por debajo de 9, o por debajo de 8, o por debajo de 7, muy preferiblemente a valores de pH fisiológicos, por ejemplo, alrededor de 7,3 a 7,4. En consecuencia, un péptido, proteína o polímero catiónico de acuerdo con la presente invención se carga positivamente bajo condiciones fisiológicas, particularmente bajo condicionessalinas fisiológicasdelacélulainvivo.Ladefiniciónde “catiónico”tambiénsepuede referir a componentes “policatiónicos”.
En este contexto, los componentes catiónicos que forman la base del portador polimérico del complejo de carga portador polimérico delainvenciónpor reticulacióndedisulfuroson péptidos catiónicos tal como se definen en la reivindicación 1. Otros componenetes peptídicos adicionales pueden seleccionarse de entre cualquier péptido, proteína o polímerocatiónicoo policatiónico adecuado para este propósito, en particular cualquier péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico capaz de formar un complejo con un ácido nucleico como se define de acuerdo con la presenteinvención, y por ello preferentemente condensar el ácido nucleico. El péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico es preferentemente una molécula lineal, sin embargo, también pueden emplearse péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos ramificados.
Cada proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico del portadorpoliméricocontienealmenosunaporción-SH,muy preferiblemente al menos un residuo cisteína o cualquier grupo químico adicional que tenga una porción-SHcapazdeformarunenlacedisulfuro después delacondensaciónconalmenosunaproteína, péptidoopolímerocatiónicoopolicatiónicoadicionalcomocomponentecatiónico del portador polimérico aquí mencionado.
Cada proteína, péptido o polímero catiónico, policatiónico o cualquier componente adicional del portador polimérico preferentemente se enlaza a sus componentes adyacentes (proteínas, péptido, polímeros catiónicos u otros componentes) por una reticulación disulfuro. De preferencia, la reticulación por disulfuro es un enlace disulfuro (reversible) (-S-S-) entre al menos una proteína,péptidoopolímero catiónico o policatiónico y al menos una proteína, péptido o polímero catiónicoopolicatiónicoadicionaluotrocomponentedelportador polimérico. La reticulación por disulfuro se forma típicamente por condensación de porciones -SH de los componentes del portador polimérico, particularmente de los componentes catiónicos. Esta porción -SH puede ser partedelaestructuradelaproteína,péptidoopolímerocatiónicoopolicatiónico o cualquiercomponenteadicionaldelportadorpolimérico antes delareticulación por disulfuro o se puede añadir antes delamisma mediante una modificación como la definida abajo. En este contexto, los azufres adyacentes a un componente del portadorpolimérico,necesariosparaproporcionarunenlacedisulfuro,puedenserprovistosporelpropiocomponente, porejemplo,poruna porción -SH como la definida aquí o se pueden proporcionar modificando el componente en consecuencia para tener una porción -SH.Estas porcionesSHsonproporcionadastípicamenteporcadaunodeloscomponentes,por ejemplo,medainteunacisteínaocualquieraminoácido(modificado)adicional o compuesto del componente que tenga una porción -SH.En caso de que el componente catiónico ocualquiercomponenteadicionaldel portador polimérico sea un péptido o proteína, se prefiere que la porción -SH sea provista por al menos un residuo cisteína. Alternativamente, el componente del portador polimérico puede modificarse correspondientemente con una porción -SH, de preferencia mediante una reacción química con un compuesto que porte una porción -SH, de manera que cada uno de los componentes del portador polimérico porta al menos una de estas porciones -SH. Estecompuestoqueportaunaporción-SHpuedeser,porejemplo,una cisteína (adicional) o cualquier aminoácido (modificado) adicional o compuesto del componente del portador polimérico que porte una porción -SH. Este compuesto puede ser también cualquier compuesto o porción no amino que contenga
o permita introducir una porción -SH en el componentecomo el definido aquí. Estos compuestos no amino pueden unirse al componente del portador polimérico deacuerdoconlapresenteinvención por reacciones químicas o de unión de compuestos, por ejemplo por la unión de un ácido3-tiopropiónicoo2iminotiolano(reactivodeTraut), porformacióndeamida(porejemplo,ácidoscarboxílicos,ácidossulfónicos, aminas, etc.), por adición de Michael (por ejemplo, porciones de maleinimida,carbonilosα,βinsaturados,etc.),porquímicasimplificada (por ejemplo, azidas o alquinos), por metátesis de alqueno/alquinos (por ejemplo, alquenos o alquinos), formación de imina o hidrazona (aldehídos o cetonas,hidrazinas,hidroxilaminas,aminas),reaccionesdeformacióndecomplejos (avidina, biotina, proteína G) ocomponentesquepermitan reacciones de sustitución tipo Sn (por ejemplo, haloalcanos, tioles, alcoholes, aminas, hidrazinas,hidrazidas,ésteresdeácidosulfónico,sales de oxifosfonio) u otras porciones químicas que pueden utilizarse en la unióndecomponentesadicionales.Enalgunoscasos,laporción–SHpuede estar enmascarada por grupos protectores durante la unión química al componente. Estos gruposprotectoresseconocenenlatécnicaypueden eliminarse después del acoplamiento químico.En cada caso, la porción-SH,porejemplodeunacisteínaode cualquieraminoácidoocompuesto (modificado) adicional, puede estar presente en los extremos terminales o internamente en cualquier posición del componente del portador polimérico. Como se define aquí, cada uno de los componentes del portador polimérico tiene típicamente al menos una porción -SH, pero también puede contenerdos, tres, cuatro, cinco o incluso
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másporciones-SH.Ademásdelaunión de componentes catiónicos, se puede usar una porción -SH para unir componentes adicionales del portador polimérico como el definido aquí, particularmente un componente aminoácido, por ejemplo epítopos de antígeno,antígenos,anticuerpos,péptidospenetradoresdecélulas(porejemplo, TAT), ligandos, etc.
Como se definióarriba,elportadorpoliméricodelamolécula de carga portadora polimérica de la invención está formado por componentes catiónicos (o policatiónicos) reticulados por disulfuro de acuerdo con la reivindicación 1.
De acuerdocon la invención, el portador polimérico del complejo de carga portador comprende al menos un portador polimérico que está formado por componentes catiónicos reticulados por disulfuro, donde los componentes catiónicosdel rfeticulado con disulfuro son péptidos catiónicos, teniendo estos péptidos catiónicos una longitud de 3 a 100 aminoácidos, preferentementede 10 a 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; o de 15 a 25 aminoácidos. Además,el portador polimérico pude incluir además al menos un caompinente catiónico (o policatiónico) seleccionado de entre péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos. Estos péptidosoproteínascatiónicosopolicatiónicospreferentemente tienen una longitud de 3 a 300 aminoácidos, preferentemente de uan longitud de aproximadamente 3 a 50 aminoácidos, en especial de una longitud de aproximadamente 3 a 25 aminoácidos, esto es una longitud de aproximadamente 3 a 10; 5 a 20; 5 a 15; 8 a 15, 16 o 17; 10 a 15, 16, 17, 18, 19, o 20; o 15 a 25 aminoácidos. Alternativa o adcionalmente, estos péptidos
o proteínas catiónicos o policatiónicos pueden tener unpesomolecular deaproximadamente 0,01 kDa aalrededor de100 kDa, incluyendo unpeso molecular de aproximadamente0,5 kDaa alrededorde 100 kDa, de preferencia de aproximadamente 10 kDa a alrededor de 50 kDa, aúnmáspreferiblementedealrededorde10kDaaaproximadamente30 kDa.
Las propiedades catiónicas del péptido o proteína catiónico o policatiónico o del portador polimérico completo, si el portador poliméricoestá compuesto completamente por péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos, se pueden determinar según su contenido de aminoácidos catiónicos. Preferentemente, el contenido de aminoácidos catiónicos en el péptido o proteína catiónico o policatiónico y/o en el portador polimérico es almenos un 10%,20%o30%,depreferenciaalmenosun 40%,muypreferiblementealmenosun 50%,60%o70%,perotambiénpreferiblemente al menos un 80%, 90%, o incluso un 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
o 100%, más preferiblemente al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%
o 100%, o puede estar en el intervalo de aproximadamente10%a90%,muypreferiblementeenelintervalodealrededor de 15% a75%, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 20% a 50%, por ejemplo, 20, 30, 40 ó 50%, o en un intervalo formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba, siempreycuandoelcontenidodetodoslosaminoácidos,porejemploaminoácidos catiónicos, lipófilos, hidrófilos,aromáticosyotros aminoácidos,enel péptido o proteína catiónico o policatiónico, o en el portador polimérico completo si el portador polimérico estácompuestocompletamentede péptidos o proteínas catiónicos o policatiónicos, sea del 100%.
En este contexto, preferentemente los aminoácidos catiónicos son los aminoácidos naturales Arg (Arginina), Lys (lisina), His (histidina) y Orn (Ornitina). Sin embargo, enunsentidomásampliocualquieraminoácido (no natural) queporteunacargacatiónicasobresucadenalateraltambién sepuedecontemplarparallevaracabolainvención.Sin embargo, son preferentes aquellos aminoácidos catiónicos cuyas cadenas laterales están cargadas positivamente encondiciones de pH fisiológicas. Enuna realización especialmente preferente, estos aminoácidos son Arg, Lys y Orn.
Preferentemente, estospéptidosoproteínascatiónicoso policatiónicosdelportadorpolimérico,quecomprendenoestánmodificadosadicionalmente para comprenderalmenos una porción -SH, se seleccionan de, sin limitarse a, péptidos o proteínas catiónicos tales como protamina,nucleolina,esperminaoespermidina,oligo-opoli-L-lisina (PLL), polipéptidos básicos, oligo o poli-arginina, péptidos penetradores de células (CPPs), CPPs quiméricos tales como Transportan, o péptidos MPG,péptidos deuniónaVIH,Tat,VIH-1Tat (VIH),péptidosderivadosde Tat, miembros de la familia de la penetratina, por ejemplo penetratina, péptidos derivados de antenapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, etc., CCPs derivados de antimicrobianos, por ejemplo Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, MAP, KALA, PpTG20, Loligomere, FGF, Lactoferrina, histonas, péptidos derivados de VP22 o análogos, HSV, VP22 (herpes simple), MAP, KALA o dominiosdetransduccióndeproteínasPTDs,PpT620,péptidosricosenprolina,péptidosricosenarginina,péptidosric osenlisina,Pep-1,L-oligómeros, péptidos de calcitonina, etc.
Alternativa o adicionalmente,estospéptidosoproteínas catiónicos o policatiónicos del portador polimérico, que comprenden o están modificados adicionalmente para comprender al menos una porción -SH, seseleccionan de, sin limitarse a, los siguientes péptidos catiónicos con la siguiente fórmula suma (I):
{(Arg)l ;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x};
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Deacuerdoconotra realización no reivindicada,los péptidos o proteínas catiónicos opolicatiónicosdelportadorpolimérico, que tienen la fórmula suma empírica (I) mostrada arriba y que comprendenoestánmodificadosademásparacomprenderalmenosunaporción -SH, pueden seleccionarse, sin
5 limitarse a, del grupo consistente en las fórmulas genéricas Arg7 (también llamada R7), Arg9(también llamada R9), Arg12(también llamada R12).
De acuerdo con otra realización no reivindicada, el péptido o proteína catiónico o policatiónico del portador polimérico, cuando se define de acuerdo con la fórmula {(Arg)l ;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (fórmula(I))mostradaarribayquecomprendeoestámodificada ademásparacomprenderalmenosunaporción
10 SH,puedenseleccionarse,sinlimitarse a, de la subfórmula (Ia):
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donde(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)oyxsoncomosedefinen aquí, Xaa’ es cualquier aminoácidoseleccionadodeentre aminoácidos nativos (es decir, naturales) o nonativosexceptoArg,Lys,His,Orno Cys e y es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21-30,31-40,41-50,51-60,61
15 70,71-80 y 81-90, siempre que el contenido total de Arg (Arginina), Lys (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) represente al menos el 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido.
Esta realización no reivindicada se puedeaplicarasituacionesenlasqueel péptidooproteínacatiónicoopolicatiónicodelportadorpolimérico,porejemplocuandosedefinedeacuerdoconlafórm ulaempírica (Arg)l ;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x(fórmula (I)) como se muestra arriba, comprende o ha sido
20 modificado con al menos una cisteína como porciónSHenelsignificadoanterior,demaneraqueelpéptidocatiónicoopolicatiónico como componente catiónico porte almenosunacisteína que es capaz de formar un enlace disulfuro con otros componentes del portador polimérico.
De acuerdo con otra realización preferida particular, el péptidoo proteína catiónico o policatiónico
25 delportadorpolimérico tal como se deine en la reivindicación 1 puede seleccionarse, sin limitarse a, de la subfórmula (Ib):
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donde la fórmula empírica {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (fórmula (I)) es como se define aquí y forma un núcleo de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la fórmula (I) (semiempírica) y donde Cys1yCys2soncisteínasproximales a,oterminalesa (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x. Ejemplos ilustrativos pueden comprender cualquiera de las secuencias anteriores flanqueadas por dos Cys y las siguientes secuencias:
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Esta modalidad puede aplicarseasituacionesdondeel péptido o proteína catiónico o policatiónico del portador polimérico, por ejemplo cuando está definidodeacuerdoconlafórmulaempírica (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x(fórmula(I))mostradaarribaha sido modificado con al menos dos cisteínas como porciones -SH en elsignificado anterior,de manera queelpéptidocatiónico opolicatiónico del complejo decargaportadorpoliméricodelainvencióncomo componente catiónico porta al menos dos cisteínas (terminales) que soncapacesdeformarunenlacedisulfuroconotroscomponentesdel portador polimérico.
De acuerdo con una segunda alternativa,almenosun componente catiónico (o policatiónico) del portador polimérico se puede seleccionar de por ejemplo cualquier polímero catiónico o policatiónico (no peptídico)adecuadoenestecontexto,siempreycuandoestepolímerocatiónicoopolicatiónico(nopeptídico)tengaoe stémodificadopara tener al menos una porción-SHqueproporcioneunenlacede unión disulfuro al polímero catiónico o policatiónico con otro componente del portador polimérico como el definido aquí. Así, igual que comose ha definido aquí, el portador polimérico puede comprender los mismoso diferentes polímeros catiónicos o policatiónicos.
En el caso específico de queelcomponentecatiónicodel portador polimérico comprenda un polímero catiónico
o policatiónico (no peptídico),laspropiedadescatiónicasdelpolímerocatiónicoopolicatiónico (no peptídico) pueden determinarse según su contenido en cargas catiónicas cuando se compara con las cargas totales de los componentesdelpolímerocatiónico.Preferentemente,elcontenidode cargascatiónicasdelpolímerocatiónicoaunpH(fisiológico)comoel definido aquí es dealmenosel 10%,20%o30%,depreferenciaalmenos el 40%, muy preferiblemente al menos el 50%, 60% o 70%, pero también preferentemente al menos el 80%, 90% o incluso 95%, 96%, 97%, 98%,99%o 100%, muy preferiblemente al menos el 30%, 40%, 50%, 60%,70%,80%, 90%,95%,96%,97%,98%,99%o100%, opuedeestarenun rangodeaproximadamente el 10% al 90%, muy preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 30% a 100%, incluso preferiblemente en el intervalo de alrededor de 50% a 100%, por ejemplo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, o en un rango formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba,siemprequeelcontenidodetodaslascargas,porejemplocargas positivas y negativas, a un pH (fisiológico) como el definido aquí del polímero catiónico completo sea del 100%.
Preferentemente, el componente catiónico (no peptídico) del portador polimérico representa un polímero catiónico o policatiónico, típicamentecon unpesomoleculardealrededorde0,1ó0,5kDaaaproximadamente 100 kDa, preferentemente de alrededor de 1 kDa a aproximadamente 75 kDa, muy preferiblemente de alrededor de 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, todavía más preferiblementedealrededorde5 kDa aaproximadamente30 kDa,oun pesomoleculardeaproximadamente 10 kDa aaproximadamente50kDa,aúnmáspreferiblementedealrededor de 10 kDa a aproximadamente 30 kDa. Además, el polímero catiónico o policatiónico (no peptídico) típicamente tiene al menos una porción
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componente del mismo, por ejemplo por medio de cadenas laterales, porciones SH o por medio de porciones adicionales como las aquí definidas, donde elcomponenteaminoácido(AA)preferentemente semodifiqueen consecuencia.
Deacuerdoconunaalternativaadicionaly particularmente preferida,elcomponenteaminoácido(AA)sepuedeusarparamodificarelportadorpolimérico, en particular elcontenidodecomponentes catiónicos del portador polimérico definido arriba.
En este contexto es preferente que el contenido de componentes catiónicosenelportadorpoliméricoseadealmenosel 10%,20%o30%,preferiblemente al menos el 40%,muypreferiblementealmenosel 50%,60%o 70%, pero también preferentemente al menos el 80%, 90%, o incluso el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, más preferiblemente al menosel 30%,40%,50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, o puede estar en elintervalodealrededorde30%a100%,muypreferiblementeenelintervalo de aproximadamente 50% a 100%, todavía más preferiblemente en el intervalo de alrededor de 70% a 100%, por ejemplo, 70, 80, 90 ó 100%, o en un intervalo formado por cualesquiera dos de los valores mencionados arriba, siempre y cuando el contenido de todos los componentes en el portador polimérico sea del 100%.
En el contexto de la presente invención, el componente aminoácido (AA) se puede seleccionar de las siguientes alternativas.
De acuerdo con una primera alternativa, el componente aminoácido (AA) puede ser un componente aminoácido (AA) aromático. La incorporación de aminoácidos o secuencias aromáticos como componenteaminoácido (AA) aromático en el portador polimérico de la presente invención hace posibleunaunióndiferente(segunda)delportador polimérico al ácido nucleico debido a interacciones de los aminoácidos aromáticos con las bases de la carga de ácido nucleico, en contraste con launión de los mismos por secuencias cargadas catiónicas de la molécula portadora polimérica al esqueleto fosfato. Esta interacción puede ocurrir, por ejemplo, por intercalaciones o por unión a ranuras menores o mayores.Estetipodeinteracciónnoespropensaala descompactaciónpor los socios de formación de complejos aniónicos (por ejemplo, heparina, ácidos hialurónicos), los cuales se encuentranprincipalmenteenlamatriz extracelular in vivo, y también es menos susceptible a los efectos de salificación.
Para ello, los aminoácidos del componente aminoácido (AA)aromáticopuedenseleccionarseyaseadelosmismosodiferentesaminoácidos aromáticos, por ejemplo seleccionadosdeTrp,TyroPhe. Alternativamente, los aminoácidos (o el componente aminoácido aromático completo (AA)) se puede seleccionar de las siguientes combinaciones de péptidos Trp-Tyr, Tyr-Trp, Trp-Trp,Tyr-Tyr,Trp-Tyr-Trp,Tyr-Trp-Tyr,Trp-Trp-Trp,Tyr-Tyr-Tyr,Trp-Tyr-Trp-Tyr,Tyr-Trp-Tyr-Trp, Trp-Trp-Trp-Trp, Phe-Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe, Phe-Tyr-Phe, Tyr-Phe-Tyr, Phe-Phe-Phe, Phe-Tyr-Phe-Tyr,Tyr-Phe-Tyr-Phe,Phe-Phe-Phe-Phe, Phe-Trp, Trp-Phe, Phe-Phe, Phe-Trp-Phe, Trp-Phe-Trp, Phe-Trp-Phe-Trp, Trp-Phe-Trp-Phe, o Tyr-Tyr-Tyr-Tyr, etc. (SEQ ID NOs: 15-42). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8,9,10,12,13,14,15otodavíamásveces.Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí como sea adecuado.
Además, el componente aminoácido (AA) aromático puede contener o puede estar flanqueado por una porción que contenga -SH que permita introducir este componente por un enlacedisulfuro como parteadicional delportadorpoliméricodefinidoarriba,por ejemplo como un enlazador. Esta porción que contiene -SH puede ser cualquier porción como la definida aquí adecuada para acoplar un componente como el aquí definido o uncomponenteadicional como el aquí definido. Como ejemplo, esta porción que contieneSHpuedeserunacisteína.Después,elcomponenteaminoácido (AA) aromático se puede seleccionarporejemplode combinaciones de péptidos Cys-Tyr-Cys, Cys-Trp-Cys, Cys-Trp-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Trp-Cys, Cys-Trp-Trp-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Trp-Tyr-Trp-Cys, Cys-Tyr-Trp-Tyr-Cys, Cys-Trp-Trp-Trp-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Trp-Tyr-Trp-Tyr-Cys,Cys-Tyr-Trp-Tyr-Trp-Cys,Cys-Trp-Trp-Trp-Trp-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Phe-Cys, Cys-Phe-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Phe-Cys, Cys-Phe-Phe-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Phe-Tyr-Phe-Cys, Cys-Tyr-Phe-Tyr-Cys, Cys-Phe-Phe-Phe-Cys, Cys-Tyr-Tyr-Tyr-Cys, Cys-Phe-Tyr-Phe-Tyr-Cys, Cys-Tyr-Phe-Tyr-Phe-Cyso Cys-Phe-Phe-Phe-Phe-Cys,Cys-Phe-Trp-Cys,Cys-Trp-Phe-Cys,Cys-Phe-Phe-Cys,Cys-Phe-Trp-Phe-Cys,Cys-Trp-Phe-Trp-Cys,Cys-Phe-Trp-Phe-Trp-Cys,Cys-Trp-Phe-Trp-Phe-Cys, etc. Cada Cys arriba tambiénsepuedereemplazarpor cualquier péptido o compuesto químico modificado que porte una porción -SHlibrecomose defineaquí.(SEQIDNOS:43-75).Estascombinaciones de péptidos pueden estar repetidas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además,elcomponenteaminoácido(AA)aromáticopuedecontener o representar al menos una prolina, la cual puede servir comoun rompedor de estructura de secuencias más largas de Trp, Tyr y Phe en el componente aminoácido (AA) aromático, preferentemente dos, tres o más prolinas.
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Deacuerdoconunasegundaalternativa,elcomponenteaminoácido (AA) puede ser un componente aminoácido (AA) hidrófilo (y preferentemente polar no cargado). La incorporacióndeaminoácidos hidrófilos (y preferentemente polares no cargados) o secuencias como componente aminoácido (AA) hidrófilo (ypreferentementepolarno cargado)enelportadorpoliméricodelapresenteinvenciónhaceposibleuna unión más flexible a la carga de ácido nucleico. Esto lleva a una compactación más efectiva de la carga de ácido nucleico y, por consiguiente, a una mejor protección contra las nucleasas y la descompactación no deseada. Permite también la provisión de un portador polimérico (largo) con una carga catiónica reducida sobre el portador completo y, en este contexto, que se ajuste más a las propiedades de unión si se desea o es necesario.
Para este propósito, los aminoácidos del componente aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) pueden seleccionarseyaseadelosmismosodiferentesaminoácidoshidrófilos(y de preferencia polares no cargados), seleccionados por ejemplo de Thr, Ser, Asn o Gln. Alternativamente, los aminoácidos (o elcomponenteaminoácido (AA) hidrófilo completo (y de preferencia polar no cargado) se puedenseleccionardelassiguientescombinacionesdepéptidosSer-Thr, Thr-Ser, Ser-Ser, Thr-Thr, Ser-Thr-Ser, Thr-Ser-Thr, Ser-Ser-Ser, Thr-Thr-Thr, Ser-Thr-Ser-Thr, Thr-Ser-Thr-Ser, Ser-Ser-Ser-Ser, Thr-Thr-Thr-Thr, Gln-Asn, Asn-Gln, Gln-Gln, Asn-Asn, Gln-Asn-Gln, Asn-Gln-Asn, Gln-Gln-Gln, Asn-Asn-Asn, Gln-Asn-Gln-Asn, Asn-Gln-Asn-Gln, Gln-Gln-Gln-Gln,Asn-Asn-Asn-Asn,Ser-Asn,Asn-Ser,Ser-Ser,Asn-Asn,Ser-Asn-Ser,Asn-Ser-Asn, Ser-Ser-Ser,Asn-Asn-Asn,Ser-Asn-Ser-Asn,Asn-Ser-Asn-Ser, Ser-Ser-Ser-Ser o Asn-Asn-Asn-Asn, etc. (SEQ ID NOs: 76-111). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado) puede contener o puede estar bloqueado por una porción que contenga -SH, la cual permite introducir este componentepor un enlace disulfuro como una parte adicional de la fórmula genérica(I)arriba,porejemplo,comounenlazador.Estaporciónquecontiene -SH puede ser cualquier porción como la aquí definida adecuada para acoplar un componente como el aquí definido a un componente adicional comoeldefinido aquí. Comoejemplo, estaporciónquecontieneSHpuedeserunacisteína.Después,porejemplo el componente aminoácido (AA) hidrófilo (ydepreferencia polar no cargado) puede seleccionarse de, por ejemplo, combinaciones de péptidos Cys-Thr-Cys, Cys-Ser-Cys, Cys-Ser-Thr-Cys, Cys-Thr-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Cys,Cys-Thr-Thr-Cys,Cys-Ser-Thr-Ser-Cys,Cys-Thr-Ser-Thr-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Cys, Cys-Thr-Thr-Thr-Cys, Cys-Ser-Thr-Ser-Thr-Cys, Cys-Thr-Ser-Thr-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Ser-Cys, Cys-Thr-Thr-Thr-Thr-Cys, Cys-Asn-Cys, Cys-Gln-Cys, Cys-Gln-Asn-Cys, Cys-Asn-Gln-Cys, Cys-Gln-Gln-Cys, Cys-Asn-Asn-Cys, Cys-Gln-Asn-Gln-Cys, Cys-Asn-Gln-Asn-Cys,Cys-Gln-Gln-Gln-Cys,Cys-Asn-Asn-Asn-Cys,Cys-Gln-Asn-Gln-Asn-Cys, Cys-Asn-Gln-Asn-Gln-Cys, Cys-Gln-Gln-Gln-Gln-Cys, Cys-Asn-Asn-Asn-Asn-Cys, Cys-Asn-Cys, Cys-Ser-Cys, Cys-Ser-Asn-Cys, Cys-Asn-Ser-Cys, Cys-Ser-Ser-Cys, Cys-Asn-Asn-Cys, Cys-Ser-Asn-Ser-Cys, Cys-Asn-Ser-Asn-Cys, Cys-Ser-Ser-Ser-Cys, Cys-Asn-Asn-Asn-Cys, Cys-Ser-Asn-Ser-Asn-Cys,Cys-Asn-Ser-Asn-Ser-Cys,Cys-Ser-Ser-Ser-Ser-CysoCys-Asn-Asn-Asn-Asn-Cys, etc.CadaCysarribatambiénsepuede reemplazar por cualquier péptido o compuesto químico modificadoque porte una porción -SH libre como ladefinidaaquí(SEQIDNOs:112-153).Estas combinaciones
de
péptidos pueden repetirse, por ejemplo 1, 2,
3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,14,15otodavíamásvecombinar entre sí según sea adecuado.
ces.Estascombina ciones de péptidos también se p ueden
Además,elcomponenteaminoácido(AA)hidrófilo(yde preferencia polar no cargado) puede contener al menos una prolina, la cualpuede servir como un rompedor deestructuradesecuenciasmáslargasde Ser, Thr y Asn en el componente aminoácido (AA) hidrófilo (y de preferencia polar no cargado), de preferencia dos, tres o más prolinas.
Deacuerdoconunaterceraalternativa,elcomponenteaminoácido(AA)puedeseruncomponenteaminoácido(AA)lip ófilo. La incorporación deaminoácidoslipófilososecuenciascomocomponente aminoácido (AA) lipófilo en el portador poliméricodelapresente invención hace posible una compactación más fuerte de la carga de ácido nucleico y/o el portador polimérico y su carga de ácido nucleico cuando seforma un complejo.Esto se debe en particular a interacciones de una o más hebras de polímero del portador polimérico, particularmente de secciones lipófilas del componente aminoácido (AA) lipófilo y la carga de ácido nucleico. Esta interacción preferentemente añadirá estabilidad adicionalalcomplejoentreelportadorpoliméricoysucargadeácidonucleico. Esta estabilización se puede compararenciertaformaconuna especie de reticulación no covalente entre diferentes hebras de polímero. Especialmente en un ambiente acuoso esta interacción es típicamente fuerte y proporciona un efecto significativo.
Paraello,losaminoácidosdelcomponenteaminoácido (AA) lipófilo pueden seleccionarse ya sea de los mismos
o diferentes aminoácidos lipófilos, porejemplo,seleccionadosdeLeu,Val, Ile, Ala, Met. Alternativamente, el aminoácido AA (o el componente aminoácido (AA) lipófilo completo) pueden seleccionarse de las siguientes combinaciones de péptidos Leu-Val, Val-Leu, Leu-Leu, Val-Val,Leu-Val-Leu, Val-Leu-Val, Leu-Leu-Leu, Val-Val-Val, Leu-Val-Leu-Val, Val-Leu-Val-Leu, Leu-Leu-Leu-Leu, Val-Val-Val-Val, Ile-Ala, Ala-Ile, Ile-Ile, Ala-Ala,
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Ile-Ala-Ile, Ala-Ile-Ala, Ile-Ile-Ile, Ala-Ala-Ala, Ile-Ala-Ile-Ala, Ala-Ile-Ala-Ile, Ile-Ile-Ile-Ile, Ala-Ala-Ala-Ala, Met-Ala, Ala-Met, Met-Met, Ala-Ala, Met-Ala-Met, Ala-Met-Ala, Met-Met-Met, Ala-Ala-Ala,Met-Ala-Met-Ala, Ala-Met-Ala-Met o Met-Met-Met-Met, etc (SEQ ID NOs:154-188).Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ejemplo 1, 2, 3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,14,15,otodavíamásveces.Estascombinaciones de péptidostambién se pueden combinarentresísegúnsea adecuado.
Además, el componente aminoácido (AA) lipófilo puede contener o puede estar flanqueado por una porción que contenga -SH, la cual permitaintroducirestecomponenteporunenlacedisulfurocomo una parte adicionaldelportadorpoliméricoanterior,porejemplo como un enlazador. Esta porción que contiene -SH puede ser cualquier porción como lasaquí definidas adecuada para acoplar un componente como el definido aquí a un componente adicional como el definido. Comoejemplo,estaporciónquecontieneSHpuedeserunacisteína.Luego, por ejemplo, el componente aminoácido (AA) lipófilo puede seleccionarse de por ejemplo las combinaciones de péptidosCys-Val-Cys, Cys-Leu-Cys, Cys-Leu-Val-Cys, Cys-Val-Leu-Cys, Cys-Leu-Leu-Cys, Cys-Val-Val-Cys,Cys-Leu-Val-Leu-Cys,Cys-Val-Leu-Val-Cys,Cys-Leu-Leu-Leu-Cys, Cys-Val-Val-Val-Cys, Cys-Leu-Val-Leu-Val-Cys, Cys-Val-Leu-Val-Leu-Cys, Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys, Cys-Val-Val-Val-Val-Cys, Cys-Ala-Cys, Cys-Ile-Cys, Cys-Ile-Ala-Cys, Cys-Ala-Ile-Cys, Cys-Ile-Ile-Cys, Cys-Ala-Ala-Cys,Cys-Ile-Ala-Ile-Cys,Cys-Ala-Ile-Ala-Cys,Cys-Ile-Ile-Ile-Cys, Cys-Ala-Ala-Ala-Cys, Cys-Ile-Ala-Ile-Ala-Cys, Cys-Ala-Ile-Ala-Ile-Cys, Cys-Ile-Ile-Ile-Ile-Cys oCys-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys,Cys-Met-Cys, Cys-Met-Ala-Cys, Cys-Ala-Met-Cys, Cys-Met-Met-Cys, Cys-Ala-Ala-Cys, Cys-Met-Ala-Met-Cys, Cys-Ala-Met-Ala-Cys, Cys-Met-Met-Met-Cys, Cys-Ala-Ala-Ala-Cys,Cys-Met-Ala-Met-Ala-Cys,Cys-Ala-Met-Ala-Met-Cys,Cys-Met-Met-Met-MetCysoCys-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys,etc.Cada Cys arriba también se puede reemplazar por cualquier péptido o compuesto químico modificado que porte una porción -SH libre como la definida aquí (SEQ ID NOs: 189 229).Estascombinacionesdepéptidospueden repetirse, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 o todavíamás veces. Estascombinacionesdepéptidostambiénsepuedencombinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente aminoácido (AA) lipófilo puede contener al menos una prolina, que puede servir como un rompedor de estructuradesecuenciasmáslargasdeLeu,Val,Ile,AlayMetenel componenteaminoácido(AA)lipófilo,depreferenciados,tresomás prolinas.
Finalmente,deacuerdocon una cuartaalternativa,elcomponenteaminoácido(AA)puedeseruncomponenteaminoácido(AA) básico débil. La incorporación de aminoácidos básicos débiles o secuencias como componente aminoácido (AA)básicodébilenel portador polimérico de la presente invención puede servir como una esponja deprotonesyfacilitarelescapeendosómico(llamadotambiénliberaciónendosómica) (efecto de esponja de protones). La incorporación de este componente aminoácido (AA) básico débil incrementa preferentemente la eficiencia de transfección.
Paraestepropósito,losaminoácidosdelcomponenteaminoácido (AA) básico débil pueden seleccionarse ya sea de los mismos odiferentes aminoácidos débiles, por ejemplo seleccionados de histidina o aspartato (ácido aspártico). Alternativamente, los aminoácidos básicos débiles (o el componente aminoácido (AA) básico débil completo) pueden seleccionarse de las siguientes combinaciones de péptidosAsp-His,His-Asp, Asp-Asp, His-His, Asp-His-Asp, His-Asp-His, Asp-Asp-Asp, His-His-His, Asp-His-Asp-His, His-Asp-His-Asp, Asp-Asp-Asp-Asp o His-His-His-His, etc (SEQ ID NOs: 230-241). Estas combinaciones de péptidos pueden repetirse, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 o todavía más veces. Estas combinaciones de péptidos tambiénsepuedencombinar entre sí según sea adecuado.
Además, el componente aminoácido (AA) básico débil puede contener o puede estar flanqueado por una porción que contenga -SH, la cual permita introducir este componente por un enlacedisulfuro comounaparteadicionaldelafórmulagenérica(I)arriba,porejemplocomo un enlazador. Esta porción que contiene -SH puede ser cualquier porción como la definida en la presente acoplada para acoplar un componente como el definido aquí a un componente adicional como el indicado.Como ejemplo, esta porción que contiene– SH puede ser unacisteína.Después,porejemplo,elcomponenteaminoácido ( AA) básico débil puede seleccionarse de, por ejemplo, las combinaciones de péptidos Cys-His-Cys, Cys-Asp-Cys, Cys-Asp-His-Cys, Cys-His-Asp-Cys, Cys-Asp-Asp-Cys, Cys-His-His-Cys, Cys-Asp-His-Asp-Cys,Cys-His-Asp-His-Cys,Cys-Asp-Asp-Asp-Cys,Cys-His-His-His-Cys,Cys-Asp-His-Asp-His-Cys, Cys-His-Asp-His-Asp-Cys,Cys-Asp-Asp-Asp-Asp-Cys o Cys-His-His-His-His-Cys, etc. Cada Cys arribatambiénse puede reemplazar por cualquier péptidoocompuestoquímicomodificado que porte una porción -SH libre como la aquí definida (SEQ ID NOs:242-255).Estascombinacionesdepéptidospuedenrepetirse,porejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 ó incluso aún más veces. Estas combinaciones de péptidos también se pueden combinar entre sí según sea adecuado.
Además,elcomponenteaminoácido(AA)débilpuedeconteneralmenosunaprolina,quepuedeservircomounromped ordeestructura de secuencias máslargasdehistidinaoaspartato(ácido aspártico) en el componente aminoácido (AA) básico débil, de preferencia dos, tres o más prolinas.
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De acuerdo con una quinta alternativa, el componente aminoácido (AA) puede ser un péptido de señalouna secuenciadeseñal,una señal o secuencia de localización, una señal de localización nuclear o una secuencia(NLS),unanticuerpo,unpéptidodepenetracióncelular(porejemploTAT),etc.Depreferencia,estecompon enteaminoácido(AA) se une al portador polimérico o a otro componente del portador polimérico por medio de un enlace disulfuro (reversible). En estecontexto,el péptido de señal o la secuencia de señal, una señal o secuencia de ubicación, unaseñalosecuenciadeubicaciónnuclear(NLS),unanticuerpo,unpéptido de penetración celular (por ejemplo TAT), etc. comprende además al menos una porción -SH. En este contexto, una señal o secuencia de ubicación o una señal o secuencia deubicaciónnuclear(NLS)sepuede usar para dirigir el complejo de carga portador polimérico de la invención a célulasdianaespecíficas(porejemplohepatocitosocélulaspresentadorasdeantígenos)ypreferentemente permiteunatranslocalización del portador polimérico a unadiana específica, por ejemplo, dentro de la célula, dentro del núcleo, dentrodelcompartimientoendosómico, secuencias para la matriz mitocondrial, secuencias de localización para la membranaplasmática,secuenciasdelocalizaciónparaelaparatodeGolgi,el núcleo, el citoplasma y el citoesqueleto, etc. Este péptido señal, una señal o secuencia de localización o una señal de localizaciónnuclearse puede usar para el transporte de cualquieradelosácidosnucleicos definidos aquí, de preferencia un ARN o un ADN, muy preferiblemente unARNsh o un ADNp, por ejemplo dentro del núcleo. Sin limitarse a, este péptido de señal, una señal osecuenciadeubicaciónouna señal de ubicación nuclear puede comprender, por ejemplo, secuencias de localizaciónparaelretículoendoplásmico.Lasseñalesosecuenciasdelocalización particulares o señales de localización nucleares pueden incluir, por ejemplo, KDEL (SEQ ID NO: 256), DDEL (SEQ IDNO:257),DEEL (SEQ ID NO: 258), QEDL (SEQ ID NO: 259), RDEL (SEQ ID NO: 260), y GQNLSTSN (SEQ ID NO: 261), secuencias de localización nuclear, incluyendoPKKKRKV(SEQIDNO:262),PQKKIKS(SEQIDNO:263),QPKKP(SEQIDNO:264),RKKR (SEQIDNO:265),RKKRRQRRRAHQ (SEQ ID NO: 266), RQARRNRRRRWRERQR (SEQ ID NO: 267), MPLTRRRPAASQALAPPTP (SEQ ID NO: 268), GAALTILV (SEQ ID NO: 269) y GAALTLLG (SEQ ID NO: 270), secuencias de localización para el compartimientoendosómico,incluyendoMDDQRDLISNNEQLP(SEQIDNO:271),secuenciasdelocalizaciónparal amatrizmitocondrial, incluyendoMLFNLRXXLNNAAFRHGHNFMVRNFRCGQPLX(SEQID NO: 272), secuencias de localización para la membrana plasmática GCVCSSNP (SEQ ID NO: 273),GQTVTTPL(SEQIDNO:274), GQELSQHE(SEQIDNO:275),GNSPSYNP(SEQIDNO:276),GVSGSKGQ(SEQIDNO:277),GQTITTPL(SEQIDN O:278), GQTLTTPL (SEQ ID NO: 279), GQIFSRSA (SEQ ID NO: 280), GQIHGLSP (SEQ ID NO: 281), GARASVLS (SEQ ID NO: 282) y GCTLSAEE (SEQ ID NO:283),secuenciasdelocalizaciónparaelretículoendoplásmicoyelnúcleo, incluyendo GAQVSSQK (SEQIDNO:284)yGAQLSRNT(SEQ ID NO: 285), secuencias de localización para el aparato de Golgi, el núcleo, el citoplasma y el citoesqueleto, incluyendo GNAAAAKK (SEQ IDNO: 286),secuenciasdelocalizaciónparaelcitoplasmaycitoesqueleto,incluyendo GNEASYPL (SEQ ID NO: 287), secuencias de localización para la membrana plasmática y citoesqueleto, incluyendoGSSKSKPK(SEQID NO: 288), etc. Ejemplos de secuencias de péptidos de señal secretora como los definidos aquí incluyen, sin estar limitarse a, secuencias de señal de moléculas MHC clásicas o no clásicas (por ejemplo, secuencias señal de moléculas MHC I y II, por ejemplo de la molécula MHC clase I HLA-A*0201), secuencias de señaldecitoquinasoinmunoglobulinascomo las definidas aquí, secuencias de señal de la cadena invariante de inmunoglobulinas o anticuerpos como las definidas aquí, secuencias de señaldeLamp1,Tapasina,Erp57,Calreticulina,Calnexina,yproteínasasociadas a membrana adicionales o de proteínas asociadas al retículo endoplásmico (ER) o al compartimiento endosómico-lisosómico. De manera particularmente preferente, se pueden usar de acuerdo con la presente invención las secuencias de señal de lamoléculaMHC clase I HLA-A*0201. Estecomponenteadicionalpuedeunirse,porejemplo,aunpolímerocatiónico
o a cualquier otro componente del portador polimérico comoel definido aquí. De preferencia este péptido de señal, señal o secuencia de ubicación o señal osecuenciadeubicaciónnuclear(NLS)seuneal portador polimérico o a otro componente del portador polimérico por unenlacedisulfuro(reversible). Paraello,elcomponente (AA)comprendeademásalmenosunaporción-SH comola aquí definida. La unión a cualquiera de los componentes del portador polimérico, también puede producirse empleando un enlace ácido lábil, preferentemente vía una cadena lateral de cualquiera de los componentes del portador polimérico que permita desprender o liberar el componente adicional a valores de pH más bajos, por ejemplo a valores de pH fisiológicos como los definidos aquí.
Además,deacuerdoconotraalternativa,elcomponenteaminoácido (AA) puede ser un péptido o proteína funcional, quepuede modular la funcionalidad del portador polimérico en consecuencia. Estos péptidos o proteínas funcionales como componente aminoácido (AA) comprenden preferentemente cualesquiera péptidos o proteínas como los aquí definidos,porejemplocomolosdefinidosabajocomoproteínas terapéuticamente activas. De acuerdo con una alternativa, estos péptidos o proteínas funcionales adicionales pueden comprender los llamados péptidos de penetración celular (CPPs) o péptidos catiónicos de transporte. Se prefieren particularmente los CPPs que incluyen un cambiodeconformaciónmediadoporpHenelendosomayllevanaunaliberación mejorada del portador polimérico (en complejo con un ácido nucleico) del endosoma por inserción en la capalipídicadelliposoma. Estos péptidos de penetración celular (CPPs) o péptidos catiónicos de transporte pueden incluir, sin limitarse a,
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protamina, nucleolina, espermina o espermidina, oligo-o poli-L-lisina (PLL), polipéptidos básicos, oligo o poliarginina, péptidos de penetración celular (CPPs), CPPs quiméricos, tales como Transportan, opéptidosMPG, péptidos de unión a VIH, Tat, VIH-1 Tat (VIH), péptidos derivados de Tat,miembros de la familia de la penetratina, por ejemplo Penetratina, péptidos derivados de Antenapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, etc., CPPs derivados de antimicrobianos, por ejemplo Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, MAP,KALA,PpTG20,Loligomere,FGF,Lactoferrina,histonas,péptidosderivados de VP22 o análogos, HSV, VP22 (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTDs), PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, Pep-1, L-oligómeros, péptidos de calcitonina, etc. Este componenteaminoácido (AA) también se puede unir a cualquier componente del portador poliméricocomoeldefinidoaquí.Preferentemente seunealportadorpoliméricooa otro componente del portador polimérico porunenlacedisulfuro (reversible). Para ello, el componente aminoácido (AA) comprende preferentemente al menos una porción -SH como ladefinidaaquí.Launiónacualquieradeloscomponentesdelportadorpolimérico también se puede lograrusandounaporciónSHounenlace ácido lábil, de preferencia vía una cadena lateral de cualquiera de loscomponentesdelportadorpoliméricoquepermitadesprenderoliberarel componente adicional a valores de pH más bajos, por ejemplo a valores de pH fisiológicos como los definidos en la presente.
Deacuerdoconunaúltimaalternativa,elcomponente aminoácido (AA) puede ser cualquier péptido o proteína que pueda realizar una función favorable en la célula. Son particularmente preferentes péptidos o proteínas seleccionados de péptidos o proteínas terapéuticamente activos, de antígenos, por ejemplo antígenos de tumor, antígenos patógenos (antígenos animales, antígenos virales, antígenos protozoarios, antígenos bacterianos,antígenosalérgicos),antígenosautoinmunesoantígenosadicionales, de alérgenos, de anticuerpos, de proteínas o péptidos inmunoestimuladores, de receptores de células T específicas de antígenos o de cualquier otra proteína o péptido adecuado para una aplicación (terapéutica) específica como la definida abajo para codificar ácidos nucleicos.Son particularmente preferentes los epítopos de péptidos a partir deantígenos como los definidos aquí.
El portador polimérico puede comprender al menos uno de los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentesadicionales, porejemplo(AA),pudiendo cualquiera de las alternativas anteriores puede combinarse entre sí, y se pueden formarpolimerizando éstos enunareaccióndecondensación de polimerización por medio de sus porciones -SH.
Deacuerdoconotroaspecto,elportadorpolimérico del complejodecargaportadorpoliméricodelainvenciónosus componentesindividuales, por ejemplo los péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, por ejemplo (AA),sepuedemodificaraún másconunligando,preferentemente uncarbohidrato,ern especialunazúcar,todavíamáspreferiblemente con manosa. Preferentemente, este ligando se une al portador polimérico o a un componente del portador polimérico por un enlace disulfuro (reversible) oporadicióndeMichael.En caso de que el ligando seunaporunenlacedisulfuro,elligando comprendeademásalmenosunaporción-SH.Estosligandossepuedenusar para dirigir el complejo de carga portador polimérico de la invención a células diana específicas (porejemplohepatocitosocélulas presentadoras de antígeno). En este contexto,es particularmente preferente la manosa como ligando en caso de que las células dendríticas sean la diana, especialmente para propósitos de vacunación o adyuvantes.
De acuerdo con un aspecto más de la invención, el complejo de carga portador polimérico de la invención puede comprendercomponentes (AA) como los definidos arriba que no comprendan porciones -SH. Estos componentes (AA) pueden añadirse antes o durante la reacciónde formación de complejos de la al menos una molécula de ácido nucleico. Se estamanera,loscomponentes(AA)sonincorporados(no covalentemente) en el complejo de carga portador poliméricodela invención sin la inclusión de los componentes (AA) en el propio portador polimérico por polimerización (covalente).
De acuerdo con una realización específica, el complejo de carga portador polimérico de la invencióncompletopuedeformarseapartirde una condensación de polimerización (de al menos uno) de los péptidos, proteínasopolímeroscatiónicosopolicatiónicosmencionadosarribaocomponentes adicionales, por ejemplo (AA), por medio de sus porciones -SH en una primeraetapayformandocomplejodelácidonucleicocon el portador polimérico en una segunda etapa. El portador polimérico puede contener entonces un númerodealmenosunootodavíamásdelos péptidos,proteínasopolímeroscatiónicosopolicatiónicosocomponentesadicionales, por ejemplo (AA) definidos arriba, preferentemente el número determinado por el intervalo anterior.
De acuerdo con una realización específica alternativa, el complejo de carga portador polimérico de la invención se forma porlacondensacióndepolimerizacióndealmenosunodelospéptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba o componentes adicionales, porejemplolos (AA)mencionadosarriba,por medio de sus porciones -SH simultáneamente para formar complejosdecarga de ácido nucleico en ell portador polimérico (preparado in situ). Asimismo, el portador polimérico también puede
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entonces contener aquí unnúmero de al menos uno o todavía más de los mismos odiferentesdelos péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos mencionados arriba ocomponentesadicionales,porejemplode los (AA)mencionadosarriba, preferentemente el número determinado por el intervalo anterior.
El complejo de carga portador polimérico de la invención comprende además como carga al menos un ácido nucleico (molécula). En el contexto de la presente invención, esta molécula deácidonucleico puede ser cualquier ácido nucleico adecuado, seleccionado, por ejemplo, decualquier ADN (deunasolahebraodedoblehebra),depreferencia,sin estar limitarse a, por ejemplo ADNgenómico,moléculasde ADN de una sola hebra, moléculas de ADN de doble hebra, ADN de codificación, cebadores de ADN, sondas de ADN, ADN inmunoestimulador, oligodesoxirribonucleótidos (cortos de un oligonucleótido de ADN (corto)),o se puede seleccionar, por ejemplo, de cualquier PNA (ácidonucleico péptido) o puede seleccionarse, por ejemplo, de cualquier ADN (hebra individual o doble hebra), preferentemente, sin limitarse a, oligorribonucleótidos (corto) de un oligonucleótido de ARN (corto)),un ARNdecodificación,unARNmensajero(ARNm),unARNinmunoestimulador, un ARN de interferencia pequeño (ARNsi), un ARN antisentido, un micro ARN, un ARN nuclear pequeño (ARNsn), un ARN de pasador pequeño (sh) o ribointerruptores, ribozimas o aptámeros, etc. La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invencióntambiénpuedeserunARNribosómico(ARNr),unARNdetransferencia (ARNt), un ARN mensajero (ARNm) o un ARN viral (ARNv). De preferencia, la moléculadeácidonucleicodelcomplejodecarga portador polimérico de la invención es un ARN. Muy preferiblemente, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de lainvención es un ARN de hebra individual (lineal), aún más preferiblemente un ARNm o un ARN inmunoestimulador. En el contexto de la presente invención, un ARNm es típicamente un ARN que está compuesto de varios elementosestructurales,porejemplo unaestructura5’-CAPopcional,unaregión 5’-UTR opcional, un sitio de unión ribosómico haciael extremo 5’ seguido por una región de codificación, una región 3’-UTR opcional, que puede ser seguida por una cola poli-A (y/o una cola poli-C). Un ARNm puede ocurrir como un ARN mono-, dioincluso multicistrónico, es decir, un ARN que porte las secuencias de codificaciónde uno, dos o más proteínas o péptidos. Estas secuencias de codificación en ARNm di-o incluso multicistrónico pueden estar separadas por al menos una secuencia IRES, por ejemplo como la definida aquí.
Además,elácidonucleicodelcomplejodecargaportador poliméricodelainvenciónpuedeserunácidonucleico(molécula)deuna sola o de doble hebra (que también se puede considerarcomounácido nucleico (molécula) debido a asociación no covalentededosácidos nucleicos (moléculas) de hebra individual) o un ácido nucleico parcialmente de doble hebra o parcialmente de una sola hebra, que al menos parcialmentesonauto-complementarios(ambosdeellosparcialmentemoléculas de ácido nucleico parcialmente de doble hebra o parcialmente de una sola hebra se forman típicamente por una molécula de ácido nucleico de hebra individual más larga y más corta o por dos moléculas de ácido nucleicodeunasolahebra,quetienencasilamismalongitud,donde una molécula de ácido nucleico de una sola hebra es en parte complementaria a la otra molécula de ácido nucleico de unasolahebray ambas forman entonces una molécula deácidonucleicodedoblehebraen estaregión,esdecir,unácidonucleico(molécula)parcialmentededoblehebra o parcialmente de una sola hebra. Preferiblemente, el ácido nucleico (molécula) puede ser una molécula de ácidonucleicodeunasolahebra. Más aún, el ácido nucleico (molécula) puede ser una molécula de ácido nucleico circular o lineal, de preferencia una molécula de ácido nucleico lineal.
De acuerdo con una alternativa,lamoléculadeácidonucleico del complejo de carga portador polimérico de la invenciónpuedeserun ácido nucleico de codificación, por ejemplo un ADN o ARN. Este ADN o ARN de codificación puede ser cualquier ADN oARNcomoeldefinido aquí.Preferiblemente, este ADN o ARN de codificación puede ser un ADNo ARN de una sola o de doble hebra, muy preferiblemente un ADN o ARN de una sola hebra y/o ADN o ARN circular o lineal, muy preferiblemente un ADN o ARN lineal. De manera aún más preferible, el ADN o ARN de codificación puede ser un ADN o ARN de una sola hebra (lineal). Más preferiblemente,lamoléculadeácidonucleicodeacuerdoconlapresenteinvenciónpuedeserunARNmensajero(AR Nm)(deunasolahebra) (lineal). Este ARNm se puede presentar como un ARN mono-, di-o incluso multicistrónico, es decir, un ARN que porte las secuencias de codificación de una, dos o más proteínas o péptidos.Estas secuencias de codificación enARNm di-o incluso multicistrónico pueden estar separadas por al menos una secuencia IRES, por ejemplo, como la aquí definida.
Ácidos nucleicos de codificación:
La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede codificar para una proteína o un péptido, que se puedeseleccionar,sinestarlimitarse a,porejemplo, proteínas o péptidos terapéuticamente activos, incluyendo proteínas adyuvantes,deantígenos,porejemplo,antígenostumorales,antígenospatógenos (por ejemplo, seleccionado de antígenos animales, deantígenos virales, de antígenos de protozoarios, de antígenos bacterianos), antígenos alergénicos, antígenos autoinmunesoantígenosadicionales,dealérgenos, de anticuerpos, de proteínas o péptidos inmunoestimuladores, de receptores de células T específicas de antígenos, o de cualquier otra proteína o péptidoadecuado para una aplicación (terapéutica) específica, donde el ácido nucleico de
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codificaciónpuedesertransportadoenunacélula,untejidoo un organismo y la proteína puede expresarse subsecuentemente en esta célula, tejido u organismo.
a) Proteínas terapéuticamente activas
En el contexto de la presenteinvención,lasproteínaso péptidos terapéuticamente activos pueden codificarse por la molécula de ácidonucleicodelcomplejodecargaportadorpoliméricodelainvencióndefinido aquí. Las proteínas terapéuticamente activas se definen aquí como proteínas que tienen un efecto en lasanación, de preferencia profilácticamente o para tratar terapéuticamente una enfermedad, de preferenciacomoladefinidaaquí,osonproteínasdelascualesunindividuo tiene necesidad. Éstas pueden seleccionarse de cualquier proteína recombinante o aislada que se presente naturalmente o que se diseña sintéticamente conocida por una persona experta en la técnica anterior. Sin estar restringidas a lasmismas,lasproteínasterapéuticamenteactivas puedencomprenderproteínascapacesdeestimularoinhibirlatransducción de señales en la célula, por ejemplocitoquinas, linfocinas, monocinas, factores decrecimiento,receptores,moléculasdetransducción de señales, factores de transcripción, etc.; anticoagulantes; antitrombinas; proteínas antialérgicas; factores apoptóticos o proteínas relacionadas con la apoptosis, enzimas terapéuticas activas y cualquier proteína relacionada concualquier enfermedad adquirida o hereditaria.
Una proteína terapéuticamente activa que se puede codificar por la molécula de ácido nucleico del complejo decargaportador polimérico de la invención definido aquí también puede ser una proteína adyuvante.Enestecontexto,unaproteínaadyuvantesedebeentenderprefrentemente como cualquierproteínacapazdeprovocaruna respuesta inmune innata como la aquí definida. Preferiblemente, esta respuesta inmune innata comprende la activación de un receptor de reconocimiento de patrón, tal como por ejemplo un receptor seleccionado dela familia del receptor tipo Toll (TLR), incluyendo por ejemplo un receptor tipo Toll seleccionado de TLR1 a TLR10 humanos o de receptores tipo Toll de murino TLR1 a TLR13. Muy preferiblemente, la proteína adyuvante se seleccionadeproteínasadyuvanteshumanasodeproteínasadyuvantespatógenas seleccionadas del grupo consistente en, sin limitarse a, proteínas bacterianas, proteínas de protozoarios, proteínas virales o proteínas fúngicas, proteínas animales, en particular proteínas adyuvantes bacterianas. Además, pueden usarse también ácidos nucleicos que codifican para proteínas humanas implicadas en efectos adyuvantes (por ejemplo, ligandosde receptores de reconocimiento de patrones, receptores de reconocimiento de patrones, proteínas de las vías de transducción de señales, factores de transcripción ocitoquinas).
b) Antígenos
La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definido aquí puedealternativamentecodificar para un antígeno. De acuerdo con lapresenteinvención,eltérmino “antígeno” se refiere a una sustancia que es reconocida por el sistema inmunológico yes capaz dedesencadenar una respuesta inmune específicade antígeno, por ejemplo, por la formación de anticuerpos o células T específicas de antígenos como parte de una respuesta inmune adaptiva. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmune adaptiva es la activacióndelascélulasTespecíficasdeantígenosnaivesporcélulaspresentadoras de antígenos. Esto se produce en los tejidos linfoides y órganos a través de los cuales las células T naives están pasando constantemente. Los tres tipos de células que pueden servir como células presentadoras de antígenos son células dendríticas, macrófagos y células B. Cada una de estascélulastieneunafuncióndistintaparaprovocar respuestas inmunes. Lascélulasdendríticastisularesabsorbenantígenos por fagocitosis y macropinocitosis y son estimuladas por infección para migrar al tejido linfoide local, donde se diferencian encélulas dendríticas maduras.Los macrófagos ingieren antígenos en partículas talescomo bacterias y soninducidosporagentesinfecciososaexpresar moléculas MHC clase II. La capacidad única de las células B para unirse e internalizar antígenos de proteínas solubles por medio de sus receptores puede ser importante para inducir células T. Al presentar el antígeno sobre moléculasMHCselogralaactivacióndecélulasTqueinducesuproliferación y diferenciación en células T efectoras de brazos.La función más importante de las células T efectoras es la eliminación de células infectadas por células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos por células TH1, que juntos constituyen la inmunidad mediada por células, y la activacióndecélulasBporcélulastantoTH2comoTH1paraproducirdiferentes clases deanticuerpos,conduciendoasílarespuestainmune humoral. Las células T reconocen un antígeno por sus receptores de células T que no reconocen y se unen al antígeno directamente, pero en su lugar reconocenfragmentosdepéptidoscortos,porejemplo,deantígenosde proteínas de patógenos que se unen a moléculas MHC sobre las superficies de otras células.
Lascélulas T entran dentrodedosclasesprincipalesquetienendiferentes funciones efectoras. Lasdosclasessedistinguenporlaexpresión de las proteínas de superficie celular CD4 y CD8.Estos dos tipos de células T difieren en la clase de molécula MHC que reconocen. Hay dos clases de moléculas MHC moléculas MHC clase I y MHC clase II -que difieren ensuestructura ypatrónde expresión entejidos del cuerpo. Las células T CD4+se unen a una molécula MHC clase II y las células T
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omo“antígenos tumorales”; sin embargo, no son antígenos en el estricto significado de una sustancia inductora de una respuesta inmune. La clase de antígenos tumorales pueden dividirse más en antígenos específicos de tumor (TSAs) y antígenos asociadoscontumor(TAAs).LosTSAssólopuedenserpresentadosporcélulas tumorales y nunca por células “sanas” normales. Son típicamente resultado de una mutación específica detumor.LosTAAs,más comunes, se presentan normalmente por células tanto tumorales como salas. Estos antígenos son reconocidos y la célula presentadora de antígenospuedeserdestruidaporcélulasTcitotóxicas.Además,losantígenos tumorales también se puedenpresentarsobrelasuperficiedel tumor en forma de, por ejemplo, un receptor mutado. En este caso, pueden ser reconocidos por anticuerpos. Los antígenos tumorales particularmente preferentes se seleccionan del grupo consistente en 5T4, 707-AP, 9D7, AFP,AlbZIPHPG1,alfa-5-beta-1-integrina,alfa-5-beta-6integrina,alfa-actinin-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemato, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-catenina/m, BING-4,BRCA1/,BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CASP8/m,catepsinaB,catepsinaL,CD19,CD20,CD22,CD25,CDE30,CD33,CD4,CD52,CD55,CD56,CD80,CDC27/m, CDK4/m,CDKN2A/m,CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, proteína similar a coactosina, collage XXIII, COX-2, CT-9/ BRD6, Cten, ciclina B1, cicina D1, cip-B, CYPB1,DAM-10,DAM-6,DEK-CAN,EFTUD2/m,EGFR,ELF2/m,EMMPRIN, EpCam,EphA2,EphA3,ErbB3,ETV6-AML1,EZH2,FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLAA11/m, HLA-A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP702M, HST-2, hTERT, iCE,IGF-1R,IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmadura, kalikreína-2, kalikreína-4, Ki 67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m,LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9,MAGE-A10,MAGE-A12,MAGE-B1,MAGE-B2,MAGE-B3,MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamaglobina A, MART-1/melan-A, MART-2, MART-2/m, proteína de matriz 22, MC1R, M-CSF,ME1/m,mesotelina,MG50/PXDN,MMP11,MN/CAIX-antígeno,MRP-3, MUC-1,MUC-2,MUM-1/ m,MUM2/m,MUM-3/ m,miosinaclase I/m, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, Neo-PAP/ m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B,OA1,OFAiLRP,OGT,OGT/m,OS-9,OS-9/m,osteocalcina,osteopontina, p15, p190 menor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-cinase, Pin-1, Pml/PARalfa, POTE, PRAME,PRDX5/ m,prosteína,proteinasa-3,PSA, PSCA, PSGR, PSM,PSMA, PTPRK/m, RAGE1,RBAF600/m,RHAMM/CD168, RU1, RU2,S-100,SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF beta, TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8,tirocinasa,UPA,VEGF,VEGFR-2/FLK-1,andWT1.Estosantígenos tumorales preferentemente pueden seleccionarse del grupo consistente en MAGE-A1(porejemplo,MAGE-A1deacuerdoconelnúmero de registro M77481), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6 (por ejemplo, MAGE-A6 de acuerdo con el número de registro NM_005363), MAGE-C1, MAGE-C2,melan-A( porejemplo,melanAdeacuerdoconelnúmeroderegistroNM_005511),GP100(porejemplo,GP100deacuerdoconel número de registro M77348), tirocinasa (por ejemplo, tirocinasa de acuerdo con el númeroderegistroNM_000372),survivina(porejemplo,survivina de acuerdo con el número de registro AF077350), CEA (por ejemplo, CEA de acuerdo con el número de registro NM_004363), Her-2/ neu (por ejemplo,Her-2/ neudeacuerdoconelnúmeroderegistroM11730),WT1(por ejemplo, WT1 de acuerdo con el número de registro NM_000378), PRAME (por ejemplo, PRAME de acuerdo con el número de registro NM_006115), EGFRI(receptordefactordecrecimientoepidérmico1)(porejemplo,EGFRI (receptor de factor de crecimiento epidérmico 1) de acuerdo con el número de registro AF288738), MUC1, mucina-1 (por ejemplo, mucina-1 de acuerdo con el número de registro NM_002456), SEC61G ( por ejemplo, SEC61GdeacuerdoconelnúmeroderegistroNM_014302),hTERT(porejemplo,hTERTnúmeroderegistroNM_198 253),5T4(porejemplo,5T4 de acuerdo con el número de registro NM_006670), NY-Eso-1 (por ejemplo, NY-Eso1 de acuerdo con el número de registro NM_001327), TRP-2 (por ejemplo, TRP-2 de acuerdo con el número de registro NM_001922), STEAP, PCA, PSA, PSMA, etc.
De acuerdo con otra alternativa, una clase más de antígenos codificados por la molécula deácidonucleicodelcomplejodecarga portador polimérico de la invención aquí definido comprende antígenos alergénicos. Estos antígenos alergénicos pueden seleccionarse de antígenosderivadosdediferentesfuentes,porejemplodeanimales,plantas, hongos, bacterias, etc. Los alérgenos en este contexto incluyen por ejemplo céspedes, pólenes, mohos, fármacos o numerosos activadores ambientales, etc. Los antígenos alergénicos pertenecen típicamentea diferentes clases de compuestos, tales como ácidos nucleicos y sus fragmentos,proteínasopéptidosysusfragmentos,carbohidratos,polisacáridos, azúcares, lípidos, fosfolípidos, etc.De particular interés en el contexto de la presente invención son los antígenos que pueden ser codificados por la molécula deácidonucleicodelcomplejodecarga portadorpoliméricodelainvención,esdecir,antígenosdeproteínasopéptidos y sus fragmentos o epítopos, o ácidos nucleicos y sus fragmentos, particularmente ácidos nucleicos y sus fragmentos, que codifican para estos antígenos de proteínas o péptidos y sus fragmentos o epítopos.
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c) Anticuerpos
De acuerdo con una alternativa más,lamoléculadeácido nucleico del complejo de cargaportadorpoliméricodelainvención aquí definido puedecodificarparaunanticuerpoounfragmento de anticuerpo.De acuerdo con la presente invención, este anticuerpo puedeseleccionarse de cualquier anticuerpo, por ejemplo cualquier anticuerpo producido recombinantemente odeorigennatural,conocidoenlatécnica, en particular anticuerpos adecuados para propósitos terapéuticos, de diagnóstico o científicos, o anticuerpos que hayan sido identificados en relaciónconenfermedadescancerosasespecíficas.Aquí,eltérmino“anticuerpo” se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales y policlonales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y bloqueadores o neutralizantes) y especies de anticuerpos con la especificidad poliepitópica. De acuerdo con la invención, el término “anticuerpo”comprendetípicamentecualquieranticuerpoconocidoenlatécnica (por ejemplo anticuerpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tales como anticuerpos de origennatural,anticuerposgeneradosporinmunizaciónen un organismo anfitrión, anticuerpos que fueron aislados e identificadosa partirdeanticuerposdeorigennaturaloanticuerposgeneradosporinmunización en un organismoanfitriónyproducidosrecombinantemente por métodos biomoleculares conocidos en la técnica, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos,intracuerpos,esdecir,anticuerposexpresadosencélulasyubicados opcionalmente encompartimientoscelularesespecíficos,y fragmentos y variantes de los anticuerpos mencionados arriba. En general, un anticuerpo consiste en una cadena ligera y una cadena pesada, ambas con dominios variables y constantes. La cadena ligera consiste en un dominiovariableN-terminal,VL,yundominioconstanteCterminal,CL. Por el contrario, la cadena pesada del anticuerpo IgG, por ejemplo, comprende un dominio variable N-terminal, VH, y tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3.
Enelcontextodelapresenteinvención,losanticuerpos codificadosporlamoléculadeácidonucleicodelcomplejodecargaportador polimérico de la invención aquí definido pueden comprender preferentemente anticuerpos de longitud completa, es decir anticuerpos compuestos de las cadenas pesada completa y ligera completa, como se describió arriba. Sin embargo,derivadosdeanticuerpostales comofragmentos,variantesoaductosdeanticuerpostambiénpuedensercodificadosporlamoléculadeácidonucleico delcomplejodecarga portador polimérico de la invención aquí definido.Preferentemente, los fragmentos de anticuerpo se seleccionan de fragmentos Fab, Fab’,F(ab’)2,Fc,Facb,pFc’,FdyFvdelosanticuerpos(delongitudcompleta) mencionados arriba. En general, los fragmentos de anticuerpo se conocen en la técnica. Por ejemplo, un fragmento Fab (“fragmento, unión a antígeno”) está compuesto de un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera.Los dos dominios variables se unen alepítopo sobre antígenos específicos.Lasdoscadenasestánconectadaspor un enlace disulfuro. Un fragmento scFv (“fragmento variable de cadena individual”), por ejemplo, consiste típicamente en los dominios variables delascadenas ligeraypesada.Losdominiosestánenlazadospor un enlace artificial, en general un enlace de polipéptido tal como un péptidocompuesto de 15-25 residuos de glicina, prolina y/o serina.
En el presente contexto, es preferible que las cadenas diferentes del anticuerpo o fragmento de anticuerpo sean codificadas por una molécula de ácidonucleicomulticistrónica.Alternativamente,lasdiferentescepas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo son codificadas por varios ácidosnucleicos (secuencias) monocistrónicos.
ARNsi:
Deacuerdoconunaalternativamás,lamoléculadeácido nucleico del complejo de carga portadorpoliméricodelainvención aquí definido puede estar en formadeARNds,depreferencia ARNsi. Un ARNds o un ARNsies de interés particularmente en relación con el fenómeno de interferencia de ARN. La técnicainvitrode interferencia de ARN (ARNi) se basa en moléculas de ARN de doble hebra(ARNds) que desencadenan la supresión específica de secuencia de la expresión génica (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9:746-750; Sharp (2001) Genes Dev. 5:485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251). En la transfeccióndecélulasdemamíferoconARNdslargo,laactivaciónde la proteína cinasa R y RNasaL ocasiona efectos no específicos, por ejemplo una respuesta a interferón (Stark y col.(1998)Annu.Rev. Biochem. 67: 227-264; He y Katze (2002) Viral Immunol.15:95-119). Estos efectos no específicos se evitan cuando se usa elllamadoARNsi (ARN de interferencia pequeño) más corto, por ejemplo de 21 a 23 meros,porque los efectos no específicos no son desencadenados por un ARNsi más corto que 30 pb (Elbashir y col. (2001) Nature 411:494-498).
La molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención aquí definido puedeentoncesserun ADNdedoblehebra(ARNds)quetengaunalongitudde17a29,depreferencia de 19 a 25 y preferiblemente sea al menos 90%, muy preferiblemente 95% y especialmente 100%(delosnucleótidosdeun ARNds) complementaria a una sección de la molécula de ácido nucleico de una proteína o antígeno
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(terapéuticamente relevante) descrita anteriormente aquí(comoingredienteactivo)odecualquierproteínaadicionalcomo la descrita aquí, ya sea una sección de codificación o no codificación, de preferencia unaseccióndecodificación.Estamoléculadeácido nucleico (parte de) puede ser llamada aquí una “secuencia diana” y puede ser cualquier molécula de ácido nucleico como la definida aquí, depreferencia un ADN genómico, un ADNc, un ARN, por ejemplo, un ARNm, etc., 90% complementario significa que con una longitud de ARNds descrito aquí de, por ejemplo, 20 nucleótidos, el ARNds contiene no más de 2 nucleótidosquenomuestracomplementariedadconlaseccióncorrespondiente de la secuenciadiana.LasecuenciadelARNdedoble hebra usado de acuerdo con la invención es, sin embargo, de preferencia completamente complementaria en su estructura general con una sección de la secuencia diana. En este contexto, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede ser un ARNds de estructura general 5’-(N17-29)-3’, de preferencia de estructura general 5’-(N19-25)-3’, muypreferiblementedela estructura general 5’-(N19-24)-3’, o aún más preferiblemente de la estructura general 5’-(N21-23)-3’, donde para cada estructura general cada N es un nucleótido (de preferencia diferente) de una sección de la secuencia dianba, de preferencia se selecciona de un número continuo de 17 a 29 nucleótidos de una sección de la secuencia diana, y está presente en la estructura general 5’-(N17-29)-3’ en su orden natural. En principio, todas las secciones de una longitud de 17 a 29,depreferenciade19a25 pares de bases presentes en la secuencia diana pueden servir paraprepararunARNdscomoeldefinidoaquí.Igualmente,las moléculas de ARNds usadas como molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención también se puedendirigir contrasecuenciasdenucleótidosdeunaproteínaoantígeno(terapéuticamente relevante) descrito anteriormente en la presente (como ingrediente activo) que no descanse en laregióndecodificación,en particular en la región de no codificación 5’ de la secuencia diana, por ejemplo entonces contra regiones de no codificación de la secuencia diana que tengan una funciónreguladora.Lasecuenciaobjetivodel ARNds usado como una moléculade ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención puede, por tanto, descansar enla región traducida y no traducida de la secuencia objetivo y/o en la región de los elementos de control de una proteína o antígeno descrito anteriormenteaquí. LasecuenciaobjetivoparaunARNdsusadacomolamoléculade ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención también puede descansar en la región de superposición de una secuencia no traducida y traducida; en particular,lasecuenciaobjetivopuede comprenderalmenosunnucleótidohaciaelextremo5’deltripletedeinicio de la región de codificación, por ejemplo, de un ADN genómico, un ADNc, un ARN o un ARNm, etc.
Ácidos nucleicos inmunoestimuladores:
a) Ácidos nucleicos inmunoestimuladores CpG:
De acuerdo con otra alternativa, la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador polimérico de la invención definidoaquí puedeestarenformadeunácidonucleicoCpG(inmunoestimulador),enparticular CpG-ARN o CpG-ADN, que induzca de preferencia una respuesta inmune innata. Un CpG-ARN oCpG-ADNusadodeacuerdoconla invención puede ser un CpG-ADN de hebra individual (ssCpG-ADN),un CpGADNdedoblehebra(ADNds),unCpG-ARNdehebraindividual(ssCpG-ARN)ounCpG-ARNdedoblehebra(dsCpGARN).Elácido nucleico CpG usado de acuerdo con la invención está depreferenciaen forma deCpGARN,muypreferiblementeenformadeCpG-ARNdehebra individual (ssCpG-ARN). Tambiénde preferencia,estos ácidos nucleicos CpGtienenunalongitudcomoladescritaarriba.Preferiblementelosmotivos CpG son no metilados.
b) ARN inmunoestimulador (ARNsi):
Igualmente, deacuerdoconunaalternativamás,lamoléculade ácidonucleico(inmunoestimuladora)delcomplejodecargaportadorpolimérico de la invención puede estar en forma de un ARN inmunoestimulador (ARNsi), que provoque de preferencia una respuesta inmune innata. Este ARN inmunoestimulador puede ser cualquier ARN (doble hebra o hebra individual), por ejemplo un ARNdecodificación, comoeldefinidoaquí.Depreferencia,elARNinmunoestimulador puede ser un ARN de hebra individual, doble hebra o parcialmente doble hebra, muypreferiblementeunARNdehebra individual, y/o un ARN circular o lineal, muy preferiblemente un ARN lineal.Más preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARNde hebra individual (lineal). Todavía más preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN de no codificación (largo) (lineal) de una sola hebra)). En este contexto, se prefiereparticularmentequeel ARNsiporteuntrifosfatoensuextremo5’queeselcasoparaelARNtranscrito in vitro. Un ARN inmunoestimulador también se puede presentar como un oligonucleótido de ARN corto como el definido aquí. Un ARN inmunoestimulador según se usa en la presente puede seleccionarse además de cualquier clase de moléculas de ARN encontradas en la naturaleza o que sepreparensintéticamente,yquepuedainducirunarespuestainmuneinnata y pueda soportar una respuesta inmune adaptiva inducida por un antígeno. En este contexto, una respuesta inmune puedepresentarsede varias maneras. Un factor sustancial para una respuesta inmune (adaptiva) adecuada es la estimulación de diferentessub-poblacionesdecélulasT. Los linfocitos T se dividen típicamente en dos sub-poblaciones, las célulasT auxiliares 1 (Th1) y las células Tauxiliares2(Th2),conlascualesel sistema inmunológico es capaz de
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CpG 2216: oligonucleótido CpG (SEQ ID NO: 387)
Rico en GU corto: oligonucleótido de ARN rico en GU (SEQ ID NO: 369).
2. Preparación de s ecuencias de ácido nucleico:
Para los presentes ejemplos se prepararon secuencias de ácido nucleico como se
5 indicóenelejemplo1yseusaronparalaformaciónde loscomplejosdecargaportadorespoliméricospolimerizadosdelainvención o para complejos de carga portadores no polimerizados para comparación. Estos complejos de cargaportadorespoliméricosseusaron para transacción in vitro e in vivo, para inmunoestimulación in vitro y para caracterizaciones de partículas.
De acuerdo con una primera preparación, se prepararon las secuencias de ADN que codifican para las
10 secuencias de ADN R1180, R722 y R491. Las secuencias de las moléculas de ARN correspondientes se muestran en el listado de secuencias (SEQ ID NOS: 384, 385 y 386).
Las secuencias ricas en GU cortas y losoligonucleótidosCpG 2216 se prepararonmediantesíntesisenfasesólidaautomáticamediante química de fosforamidita. Lassecuencias se muestran en el listado de secuencias (SEQ ID NOS: 387 y 369).
15 2. Transcripción in vitro:
Los plásmidosdeADNrespectivospreparadosdeacuerdocon el ejemplo 2 para R1180, R722 y R91 fueron transcritos in vitro usando T7-polimerasa(T7OptiARNmkit,CureVac,Tübingen,Alemania)siguiendolasinstruccionesdelfabricante.PosteriormenteelARNmsep urificóusando PureMessenger®(CureVac, Tübingen, Alemania).
20 3. Síntesis de complejos de carga portadores poliméricos
Las secuencias de ácido nucleico definidas arriba en el ejemplo1semezclaronconloscomponentescatiónicoscomolosdefinidosenelejemplo1.Portanto,lacantidadindicad adesecuenciadeácido nucleico se mezcló con el componente catiónico respectivo en relaciones de masa como se indican, formando así un complejo. Siseusaban
25 componentescatiónicosdepolimerizacióndeacuerdoconlapresenteinvención, la polimerización de los componentes catiónicos tuvo lugar simultáneamente la complejación de la carga de ácido nucleico. Posteriormente la solución resultante se ajustó con agua a un volumen final de50µlyseincubódurante30minutosatemperaturaambiente.Las diferentes relaciones componente catiónico/ácido nucleico usadas en los experimentos se muestran en la tabla 1.
30 Tabla 1
Muestra(péptido catiónico/ ácido nucleico)
Relación en masa RelaciónN/P Relaciónmol ar
CR12C/R1180
1:2 0.9 44:1
CR12C/R1180
2:1 3.6 185:1
R12/R1180
1:2 0.7 48:1
R12/R1180
2:1 2.5 146:1
CR9C/R1180
2:1 0.9 55:1
R9/R1180
2:1 1.1 65:1
CR7C
1:2 0.8 70:1
R7
1:2 1.0 85:1
CR12C/CpG
1:2,5 4.9 8:1
CR12C/R491
1:2 0.9 150:1
CR12C/ricoenGUcorto
1:2,5 4.9 8:1
CR12C/R722
5:1 9.6 444:1
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CR12C/R722
4:1 7.6 355:1
CR12C/R722
3:1 5.7 266:1
CR12C/R722
2:1 3.8 177:1
CR12C/R722
1:1 1.9 88:1
CR12C/R722
1:2 0.9 44:1
CR12C/R722
1:3 0.6 29:1
CR12C/R722
1:4 0.5 22:1
CR12C/R722
1:5 0.4 17:1
Relación N/P = Es una medida de la carga iónica del componente catiónico del portador polimérico o del portador polimérico como tal. En caso de que las propiedades catiónicas del componente catiónico se proporcionen por átomos de nitrógeno, la relación N/P es la relación entre átomos de nitrógeno básicos y residuos fosfato, considerando que los átomos de nitrógeno confieren a cargas positivas y fosfato del esqueleto de fosfato del ácido nucleico confiere a la carga negativa. N/P se calcula de preferencia por la siguiente fórmula: N/ P = pmol [ARN]* relación*catiónico AS/µg ARN*3*1000 Como ejemplo se aplicó el ARN R722 de acuerdo con SEQ ID NO: 385, con un peso molecular de 186 kDa. Por tanto 1 µg de ARN R722 confiere a 5,38 pmol de ARN.
4. Transfección de células HepG2 y B16F10:
Se prepararon complejos de carga portadores poliméricos que contenían 5 µg de ARN que codificaba para luciferasa (R1180)comose indica en el ejemplo 3. Células HepG2 o B16F10 (150x103/pocillo) fueron 5 sembradas 1 día antes de la transfección en placas de microtitulación de 24pocillos llevando a una confluencia del 70% cuando se llevó a cabo la transfección. Para la transfección, 50 µl delasolucióndecomplejode carga portador polimérico se mezclaron con 250 µl de medio libre de suero y se añadieron a las células (concentración final de ARN: 13 µg/ ml).Antesde la adición de la solución de transfección libre de suero las células fueron lavadas suavemente y cuidadosamente 2 veces con 1 ml de 10 Optimen (Invitrogen) por pocillo.Luego, se añadió la solución de transfección (300µlporpocillo)alascélulasylascélulasseincubarondurante4horasa 37ºC. Posteriormente se añadieron 100 µl de medio RPMI (Camprex)que contenía 10% de FCS por pocillo y las célulasseincubarondurante20 horas más a 37ºC. La solución de transfección fue succionada 24 horas después de la transfección y las células se lisaron en 300 µl de regulador de pHdelisis(25mMdeTris-PO4,2mMdeEDTA,10%deglicerol,1%deTriton
15 X100,2mMdeDTT).Lossobrenadantesfueronluegomezclados tampón de luciferina (25 mM de glicilglicina, 15 mMde MgSO4 , 5 mM de ATP, 62.5 µM de luciferina) y se detectó la luminiscencia usando un luminómetro (Lumat LB 9507 (Berthold Technologies,Bad Wildbad, Alemania).
5. Expresión de luciferasa in vivo:
Complejos de carga portadores poliméricos que contenían 5 µg de
20 ARNmquecodificabaparaluciferasa(R1180)fueronpreparadoscomo seindicóenelejemplo3.Posteriormentelasoluciónresultanteseajustócon una solución de lactato de Ringer hastaunvolumenfinalde100µlyse incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente,produciendouna solución con una concentración de 0,1 g/l de complejos de carga portadores poliméricos.Seadministraronintradérmicamente100µldeestasolución(en la espalda) de ratones BALB/ c de
25 7semanasdeedad.Despuésde24 horas los ratones fueron sacrificados y las muestras (piel de laespalda) fueron recuperadas, congeladas a -78ºC y lisadas durante 3 minutos a velocidadcompletaenunlisadordetejido(Qiagen,Hilden,Alemania).Posteriormente se añadieron 600 µl de tampónde lisis y las soluciones resultantes sesometieronotros6minutosavelocidadcompleta en el lisador de tejidos. Después de 10 minutos de centrifugación a 13.500 rpm a 4ºC los sobrenadantes
30 semezclaronconreguladordepHde luciferina (25 mMde glicilglicina, 15 mM deMgSO4, 5 mMde ATP,
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