CN108472309A - 用于水痘带状疱疹病毒（vzv）的核酸疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开的方面涉及核酸疫苗。所述疫苗包括至少一种具有编码至少一种水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原的开放阅读框架的RNA多核苷酸。还描述了用于制备和使用所述疫苗的方法。

Description

用于水痘带状疱疹病毒(VZV)的核酸疫苗
相关申请
本申请依据35 U.S.C.§ 119(e)要求2015年10月22日提交的美国临时申请No.62/245,234、2015年10月28日提交的美国临时申请No.62/247,697、2016年5月12日提交的美国临时申请No.62/335348和2015年10月22日提交的美国临时申请62/245,031的权益，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文中。
发明背景
水痘是一种由水痘带状疱疹病毒(VZV)引起的急性传染病。水痘带状疱疹病毒是已知会传染人类和脊椎动物的八种疱疹病毒之一。VZV还称为鸡痘病毒(chickenpoxvirus)、水痘病毒(varicella virus)、带状疱疹病毒和第3型人类疱疹病毒(HHV-3)。VZV只影响人类，而且通常在儿童、青少年和年轻人中引起鸡痘，并且在成年人中(儿童中极少)引起带状疱疹(缠腰龙)。导致水痘的原发性VZV感染会导致并发症，包括病毒性或继发性细菌性肺炎。即使当水痘的临床症状已经消退，VZV在感染者的神经系统中仍蛰伏在三叉神经和背根神经节中(病毒潜伏期)。在约10至20％的病例中，VZV在生命后期再活化，从感觉神经节传播返回到皮肤，产生一种称为缠腰龙或带状疱疹的疾病(皮疹)。VZV还会导致从无菌性脑膜炎到脑炎的多种神经病况。VZV感染的其它严重并发症包括疱疹后神经痛、莫拉雷脑膜炎(Mollaret′s meningitis)、多发性带状疱疹、血小板减少症、心肌炎、关节炎和导致中风的脑动脉炎症、脊髓炎、眼部疱疹或无疹性带状疱疹。在极少情形下，VZV影响膝状神经节，产生伴随面神经特定分枝的病变。症状可包括舌头和耳朵上令人感到疼痛的水疱以及单侧面神经无力和听力丧失。
1995年以来，水痘病例已下降97％，主要是由于疫苗接种。然而，仅在美国每年估计仍有500,000至1百万带状疱疹(缠腰龙)事件发生。带状疱疹的终生罹病风险据估计为至少32％，以年龄增长和细胞免疫抑制为最重要的风险因素。实际上，据估计，50％活到85岁的人都会出现带状疱疹。
活的减毒VZV Oka菌株疫苗在美国以商标名称(Merck)可得并出售。类似但不同的VZV疫苗在全球范围内都以(GlaxoSmithKline)出售。自从1995年获得批准以来，在澳大利亚、美国和几个其它国家已将其加入至推荐用于儿童的疫苗接种方案中。2007年，免疫接种咨询委员会(Advisory Committee on Immunization Practices，ACIP)推荐在入学之前使用第二剂疫苗以确保维持高水平的水痘免疫性。在2001至2005年，在水痘疫苗接种高覆盖的学校报道有爆发现象，表明即使在大多数儿童已进行疫苗接种而且疫苗如预期发挥作用的情况下，通过单剂量的疫苗接种策略仍无法防止水痘爆发。因此，双剂量疫苗接种成为所采用的方案；然而，即使使用双剂量疫苗，仍报道有突破性水痘发生。此外，水痘疫苗接种已引起关注，疫苗引发的免疫性可能并非终身的，可能致使成年人易患更严重的疾病，因为来自其儿童时期免疫的免疫性已经消逝。
2005年，FDA批准合并的活的减毒组合麻疹-流行性腮腺炎-风疹-水痘(MMRV)疫苗PROQUADTM(Merck)用于12个月至12岁的人。尽管MMRV中的减毒麻疹、流行性腮腺炎和风疹疫苗病毒与MMR疫苗中的那些相同而且具有相同的效价，但MMRV疫苗中的Oka/Merck VZV的效价高于单抗原水痘疫苗中的效价。
2006年，美国食品与药品管理局(the United States Food and DrugAdministration)批准(Merck)用于预防60岁或60岁以上人的缠腰龙(带状疱疹)(目前50至59岁获得批准)。含有用于水痘和MMRV疫苗中的相同Oka/Merck水痘带状疱疹病毒，但其效价比在这两种疫苗中存在的效价高得多(高出＞10倍的病毒剂量)，因为设计了浓缩的配制物用于在对VZV的免疫性随着年龄增长而消逝的老年人体内引发免疫反应。
尽管水痘疫苗在健康个体中已显示安全，但仍有证据表明由疫苗所赋予的对VZV感染的免疫性随时间而消逝，使得接受疫苗接种的个体易受缠腰龙(一种更严重的病况)的侵害。另外，已报道个体已因水痘疫苗接种而发生鸡痘或缠腰龙。疫苗可能在神经节中建立潜伏感染，接着可再活化而导致带状疱疹。
此外，活的减毒病毒不适合所有受试者，包括孕妇和患有中度或严重急性疾病的人。而且，水痘不适合或未经批准用于免疫功能不足的患者，包括由于白血病、淋巴瘤、全身恶性肿瘤、免疫缺陷病或免疫抑制疗法而存在免疫抑制的人。同样，因感染人类免疫缺陷病毒(HIV)而存在中度或严重细胞免疫缺陷的人(包括经诊断患有后天性免疫缺陷症候群(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的那些人)不应接受水痘疫苗。因此，尽管在免疫功能不足的个体中存在与带状疱疹相关的发病率和死亡率高风险，但这种人群不符合用活的减毒疫苗(诸如)进行疫苗接种的条件。
美国每年有一百万例带状疱疹。美国每年直接用于带状疱疹的医药成本估计花费10亿美元，而且用于带状疱疹的治疗常常无效或不可用。
脱氧核糖核酸(DNA)疫苗接种是一种用于刺激对外来抗原(诸如VZV抗原)的体液和细胞免疫反应的技术。向活的宿主体内直接注入基因工程DNA(例如，裸质粒DNA)导致小量宿主细胞直接产生抗原，从而导致保护性的免疫反应。然而，利用此技术产生潜在问题，包括可能发生插入诱变，这可能导致致癌基因活化或对肿瘤抑制基因的抑制作用。
发明概要
本文提供一种基于以下知识构建的核糖核酸(RNA)疫苗，即RNA(例如，信使RNA(mRNA))可以安全地引导身体的细胞机制产生几乎任何所关注的蛋白，从天然蛋白到抗体以及在细胞内外可具有治疗活性的其它完全新颖的蛋白构筑体。本公开的水痘带状疱疹病毒(VZV)RNA疫苗可用于引发针对VZV的平衡免疫反应，包含细胞和体液免疫性，而不存在与减毒病毒疫苗接种相关的诸多风险。
RNA(例如，mRNA)疫苗根据感染的盛行率或未满足的医学需要的程度或水平而可用在各种情境中。RNA(例如，mRNA)疫苗可用于治疗和/或预防各种基因型、菌株和分离株的VZV。RNA(例如，mRNA)疫苗的优越性在于其与市售的抗病毒治疗处理相比产生大得多的抗体效价，而且更早地产生反应。尽管不希望受理论约束，但相信如同mRNA多核苷酸，RNA疫苗经过更优地设计从而在RNA疫苗指派天然细胞机制时通过转译产生适当的蛋白构型。与离体制造并且可触发不利细胞反应的传统疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更自然的方式提供给细胞系统。
在表1至9中提供本公开所涵盖的各种VZV氨基酸序列。如本文提供的RNA(例如，mRNA)疫苗可包括至少一种编码表1中提供的至少一种VZV糖蛋白的RNA多核苷酸，或其片段、同源物(例如，具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性)或变异体或衍生物。
本公开的一些实施方案提供VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架的核糖核酸(RNA)多核苷酸。本公开的一些实施方案提供VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码两种或两种以上VZV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架的RNA多核苷酸。本公开的一些实施方案提供VZV疫苗，所述VZV疫苗包括两种或两种以上具有编码两种或两种以上VZV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV糖蛋白。例如，VZV糖蛋白可以是VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN或gM或其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZVgE多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gI多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gB多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gH多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gK多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gL多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gC多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gN多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gM多肽。在一些实施方案中，VZV糖蛋白由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸序列来编码。
在一些实施方案中，VZV糖蛋白是变异体gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZVgE多肽是缺少锚结构域(ER保留结构域)的截短多肽。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含VZV gE多肽的氨基酸1至561(或由其组成或基本上由其组成)。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至561(或由其组成或基本上由其组成)。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸1至573(或由其组成或基本上由其组成)。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至573(或由其组成或基本上由其组成)。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为缺少羧基末端尾结构域的截短多肽。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含VZV gE多肽的氨基酸1至573(或由其组成或基本上由其组成)。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：34的氨基酸1至573(或由其组成或基本上由其组成)。
在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽在一个或多个与ER保留相关的基序中具有至少一种突变，其中一个或多个基序中的突变导致VZV gE多肽在ER和/或高基氏体中的保留减少。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽在一个或多个与将gE靶向高基氏体或反式高基氏体网络(TGN)相关的基序中具有至少一种突变，其中一个或多个基序中的突变导致靶向或定位到高基氏体或TGN的VZV gE多肽减少。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽在一个或多个与VZV gE的内化作用或gE的胞吞作用相关的基序中具有至少一种突变，其中一个或多个基序中的突变导致VZV gE多肽的胞吞作用减少。在一些实施方案中，变异体VZVgE多肽在一个或多个磷酸化酸性基序(诸如SSTT(SEQ ID NO：122))中具有至少一种突变。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是具有Y582G突变的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是具有Y569A突变的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是具有Y582G突变和Y569A突变的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是包含VZV gE的氨基酸1至573并且具有Y569A突变的抗原性片段。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是包含SEQ ID NO：38的抗原性片段。
在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是具有Igκ序列的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为SEQ ID NO：14。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是具有取代SESTDT(SEQ ID NO：59)的A-E-A-A-D-A序列(SEQ ID NO：58)的全长VZV gE多肽。这是以富含Ala的序列取代富含Ser/Thr的“SSTT”(SEQ ID NO：122)酸性簇。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为SEQ ID NO：26。在其中VZV gE多肽具有A-E-A-A-D-A序列(SEQID NO：58)的一些实施方案中，变异体VZV gE多肽在一个或多个与ER/高基氏体保留、TGN定位或胞吞作用相关的基序中也具有至少一种突变(例如，具有Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变和Y569A突变两者)和/或在一个或多个磷酸化酸性基序(诸如SSTT(SEQ ID NO：122)基序)中具有至少一种突变。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为SEQ ID NO：30的氨基酸序列或包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为在C末端具有有助于多肽分泌或其定位到细胞膜的另一序列的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为在C末端具有Igκ序列的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，VZV gE多肽在C末端具有有助于分泌的另一序列(例如，在C末端具有Igκ序列)，并且在一个或多个与ER保留、TGN定位或胞吞作用相关的基序中具有至少一种突变(例如，具有Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变和Y569A突变两者)和/或在一个或多个磷酸化酸性基序(诸如SSTT(SEQ ID NO：122)基序)中具有至少一种突变。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是缺少锚结构域(ER保留结构域)且在C末端具有有助于多肽分泌的另一序列(例如，在C末端具有Igκ序列)的截短多肽。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含氨基酸1至561并且在C末端具有Igκ序列。在一些实施方案中，变异体多肽为SEQ ID NO：22。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽为缺少羧基末端尾结构域并且在C末端具有有助于多肽分泌的另一序列(例如，在C末端具有Igκ序列)的截短多肽。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含氨基酸1至573并且在C末端具有Igκ序列。
在一些实施方案中，抗原性多肽包含两种或两种以上糖蛋白。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白由单一RNA多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白由两种或两种以上RNA多核苷酸编码，例如每种糖蛋白由单独的RNA多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gE与gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位中至少一者的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gI与gE、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位中至少一者的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gE、gI与gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位中至少一者的任意组合。
在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gI。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gB。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gB。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gB。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gH。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gH。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gH。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gK。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gK。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gK。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gL。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gL。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gL。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gC。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gC。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gC。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gN。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gN。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gN。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gM。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gI和gM。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE、gI和gM。
在一些实施方案中，疫苗包含任意两种或两种以上VZV糖蛋白(例如，前述段落以及实施例和图式中公开的任意变异体VZV gE)，并且VZV gE是变异体gE，诸如本文公开的任意变异体VZV gE糖蛋白，例如，前述段落以及实施例和图式中公开的任意变异体VZV gE。
在一些实施方案中，VZV疫苗包括两种或两种以上RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有编码两种或两种以上VZV抗原性多肽或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架(由单一RNA多核苷酸编码或由两种或两种以上RNA多核苷酸编码，例如每种糖蛋白由单独的RNA多核苷酸编码)，且所述两种或两种以上VZV糖蛋白是变异体gE(例如，本文在前述段落中公开的任意变异体gE多肽)和选自gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的VZV糖蛋白。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是变异体gE(例如，本文在前述段落中公开的任意变异体gE多肽)和gI。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且变异体VZV gE多肽是缺少锚结构域(ER保留结构域)的截短多肽(例如，包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至561的截短VZV gE多肽)。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且变异体VZV gE多肽是缺少羧基末端尾结构域的截短多肽(例如，包含SEQID NO：18的氨基酸1至573的截短VZV gE多肽)。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且变异体VZV gE多肽在一个或多个与ER保留、TGN定位和/或胞吞作用相关的基序中具有至少一种突变(例如，变异体VZV gE具有Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变与Y569A突变两者)和/或在一个或多个磷酸化酸性基序(诸如SSTT(SEQ ID NO：122)基序)中具有至少一种突变。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且变异体VZV gE多肽是包含VZV gE的氨基酸1至573且具有Y569A突变的抗原性片段。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且变异体VZV gE多肽是具有A-E-A-A-D-A(SEQ ID NO：58)序列的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且VZV gE多肽具有A-E-A-A-D-A(SEQ ID NO：58)序列和Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变与Y569A突变两者。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且VZV gE多肽是在C末端具有有助于多肽分泌的另一序列(例如，Igκ序列)的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且VZV gE多肽是具有Igκ序列和Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变与Y569A突变两者的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，糖蛋白是VZV gI和变异体VZV gE，且VZV gE多肽是缺少锚结构域(ER保留结构域)且具有Igκ序列的截短VZV gE多肽。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是包含氨基酸1至561或氨基酸1至573且在C末端具有Igκ序列的截短多肽。
在任意上述实施方案中，VZV疫苗还可包含活的减毒VZV、整体未活化的VZV或VZV病毒样粒子(VLP)。在一些实施方案中，活的减毒VZV、整体未活化的VZV或VZV VLP选自或来源于以下菌株和基因型：VZV E1菌株、基因型E1_32_5、E1_KeI、E1_杜马斯、E1_俄罗斯1999、E1_SD、E1_MSP、E1_36、E1_49、E1_BC、E1_NH29；VZV E2菌株、基因型E2_03-500、E2_2、E2_11、E2_HJO；VZV J菌株、基因型pOka；VZV M1菌株、基因型M1_CA123；VZV M2菌株、基因型M2_8和M2_DR；和VZV M4菌株、西班牙基因型4242、法国基因型4415和意大利基因型4053。
本公开涵盖包含编码VZV的其它病毒性蛋白组分(例如，被膜蛋白)的RNA多核苷酸的替代性RNA疫苗。因此，本公开的一些实施方案提供VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV被膜蛋白或其抗原性片段或表位的开放阅读框架的核糖核酸(RNA)多核苷酸。本公开的一些实施方案提供VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV被膜蛋白或其免疫原性片段或表位和至少一种VZV糖蛋白或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架的RNA多核苷酸。本公开的一些实施方案提供VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV被膜蛋白或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架的RNA多核苷酸和至少一种具有编码至少一种VZV糖蛋白或其免疫原性片段或表位的开放阅读框架的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RNA疫苗包含RNA(例如，mRNA)多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种VZV被膜蛋白以及一种或多种选自VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽的VZV糖蛋白或其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，VZV糖蛋白是VZV gE多肽或其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，VZV糖蛋白是VZV gI多肽或其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，VZV糖蛋白是变异体VZV gE多肽，诸如本文公开的任意变异体VZV gE多肽。在一些实施方案中，VZV糖蛋白是VZV gE糖蛋白和VZV gI糖蛋白或其免疫原性片段或表位。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：41以及与选自SEQ ID NO：1至8和41的核酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)一致性的同源物的核酸序列来编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：41以及与选自SEQ ID NO：1至8和41的核酸序列具有至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.8％或99.9％)一致性的同源物的核酸序列来编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由至少一种选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：41以及与选自SEQ IDNO：1至8和41的核酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％)一致性的同源物的核酸序列片段(例如，具有抗原性序列或至少一个表位的片段)来编码。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：41的核酸序列的至少一个表位来编码。
在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：1编码的gE多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：2编码的gI多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：3编码的截短gE多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：5编码的截短gE多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：6编码的具有Y569A突变的截短gE多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：7编码的具有AEAADA序列SEQ ID NO：58的gE多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：8编码的具有Y582G突变和AEAADA序列(SEQ IDNO：58)的gE多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸是由SEQ ID NO：41编码的gE多肽。
在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少90％一致性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少95％的一致性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少96％的一致性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55的氨基酸序列具有至少97％的一致性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少98％的一致性的抗原性多肽。在一些实施方案中，至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少99％的一致性的抗原性多肽。
在一些实施方案中，编码VZV多肽的开放阅读是经过密码子优化的。在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55中任一者的抗原性蛋白，而且其中RNA多核苷酸是经过密码子优化的的mRNA。在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：92至108中任一者标识的mRNA序列。在一些实施方案中，所述由SEQ ID NO：92至108中任一者标识的mRNA序列经过密码子优化来编码与由SEQ ID NO：92至108中任一者编码的抗原性VZV多肽具有同样免疫原性或更具免疫原性的抗原性VZV多肽。
在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：10的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有小于80％的一致性。在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码SEQ ID NO：10的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有大于80％的一致性，但不包括野生型mRNA序列。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：42的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有小于80％的一致性。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：42的抗原性蛋白，其中RNA多核苷酸与野生型mRNA序列具有大于80％的一致性，但不包括野生型mRNA序列。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：14的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有小于80％的一致性。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：14的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有大于80％的一致性，但不包括野生型mRNA序列。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：26的抗原性蛋白，其中RNA多核苷酸与野生型mRNA序列具有小于80％的一致性。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：26的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有大于80％的一致性，但不包括野生型mRNA序列。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码SEQ ID NO：30的抗原性蛋白，其中RNA多核苷酸与野生型mRNA序列具有小于80％的一致性。在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码SEQ ID NO：30的抗原性蛋白，其中RNA(例如，mRNA)多核苷酸与野生型mRNA序列具有大于80％的一致性，但不包括野生型mRNA序列。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸由选自SEQ ID NO：1至8和SEQ ID NO 41中任一者的序列编码，并且包括至少一种化学改性。
在一些实施方案中，VZV疫苗是多价的。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含来源于VZV E1菌株的多核苷酸序列，包括例如基因型E1_32_5、E1_KeI、E1_杜马斯、E1_俄罗斯1999、E1_SD、E1_MSP、E1_36、E1_49、E1_BC和E1_NH29中的任一个或多个。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸包含来源于VZV E2菌株的多核苷酸序列，包括例如基因型E2_03-500、E2_2、E2_11和E2_HJO中的任一个或多个。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸包含来源于VZV J菌株的多核苷酸序列，包括例如基因型pOka。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸包含来源于VZV M1菌株的多核苷酸序列，包括例如基因型M1_CA123。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸包含来源于VZV M2菌株的多核苷酸序列，包括例如基因型M2_8和M2_DR。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)多核苷酸包含来源于VZVM4菌株的多核苷酸序列，包括例如西班牙基因型4242、法国基因型4415和意大利基因型4053中的任一个或多个。
本发明的一些实施方案提供一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架以及至少一个5′端帽的核糖核酸(RNA)多核苷酸。在一些实施方案中，5′端帽是7mG(5′)ppp(5′)NImpNp。本发明的一些实施方案提供一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，其中所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸具有至少一种化学改性。在一些实施方案中，所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸还包含第二种化学改性。在一些实施方案中，具有至少一种化学改性的所述至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸具有5′端帽。在一些实施方案中，所述至少一种化学改性选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸的每个(100％)尿苷都包含化学改性，诸如N1-甲基假尿苷改性或N1-乙基假尿苷改性。
本发明的一些实施方案提供一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架的核糖核酸(RNA)多核苷酸，其中所述开放阅读框架中至少80％(例如，85％、90％、95％、98％、99％、100％)的尿嘧啶具有化学改性，可选的是其中所述疫苗在脂质纳米粒子中配制。在一些实施方案中，所述开放阅读框架中100％的尿嘧啶具有化学改性。在一些实施方案中，化学改性位于尿嘧啶的第5位。在一些实施方案中，化学改性是N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，所述开放阅读框架中100％的尿嘧啶被改性为包括N1-甲基假尿苷。
本发明的一些实施方案提供一种在阳离子脂质纳米粒子内配制的VZV疫苗。在一些实施方案中，阳离子脂质纳米粒子包含阳离子脂质、PEG改性的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质，并且非阳离子脂质是中性脂质，并且固醇是胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自由以下各项组成的组：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一-12，15-二烯-1-胺(L608)和N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七-8-胺(L530)。
在一些实施方案中，脂质是
在一些实施方案中，脂质是
在一些实施方案中，阳离子脂质纳米粒子具有约20至60％的阳离子脂质、约5至25％的非阳离子脂质、约25至55％的固醇以及约0.5至15％的经PEG改性的脂质的摩尔比。在一些实施方案中，纳米粒子具有小于0.4的多分散性值。在一些实施方案中，纳米粒子在中性pH值下具有净中性电荷值。在一些实施方案中，纳米粒子具有50至200nm的平均直径。
本发明的一些实施方案提供在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用可有效产生抗原特异性免疫反应的量的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应包含T细胞反应或B细胞反应。在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应包含T细胞反应和B细胞反应。在一些实施方案中，一种产生抗原特异性免疫反应的方法包括单次施用疫苗。在一些实施方案中，一种方法还包括向受试者施用补强剂量的疫苗。在一些实施方案中，通过皮内或肌肉内注射向受试者施用疫苗。
本文还提供用于在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法中的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗，所述方法包括向所述受试者施用可有效产生抗原特异性免疫反应的量的疫苗。
本文还提供VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的用途，所述疫苗用于制造用以在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法中的药物，所述方法包括向所述受试者施用可有效产生抗原特异性免疫反应的量的疫苗。
本发明的一些方面提供预防或治疗VZV感染的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗是以在受试者体内有效产生抗原特异性免疫反应的量来配制的。
本发明的一些实施方案提供在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用在受试者体内有效产生抗原特异性免疫反应的量的如本文提供的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗。
在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少1log。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了1至3log。
在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少2倍。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少5倍。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少10倍。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了2至10倍。
在一些实施方案中，对照值是在未施用VZV疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照值是在施用了活的减毒或不活化VZV疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照值是在施用了重组或纯化VZV蛋白疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照值是在施用了VZV病毒样粒子(VLP)疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少2倍的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗、活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少4倍的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗、活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少10倍的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗、活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少100倍的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗、活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少1000倍的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗、活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低2倍至1000倍的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗、活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，有效量是25μg至1000μg或50μg至1000μg或25至200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是50μg、100μg、200μg、400μg、800μg或1000μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是50μg至400μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg或400μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用25μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用50μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用100μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用200μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向受试者施用400μg的剂量。在一些实施方案中，有效量是总计两次向所述受试者施用500μg的剂量。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于60％。
可以使用标准分析(参见例如Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)来评估疫苗功效。例如，可以通过双盲随机化临床控制试验来测量疫苗功效。疫苗功效可表达为未经疫苗接种(ARU)与经疫苗接种(ARV)研究组之间的疾病侵袭率(AR)的成比例减小，并且可以利用下式，由疫苗接种组之间的疾病相对风险(RR)来计算：
功效＝(ARU-ARV)/ARU×100；和
功效＝(1-RR)×100。
同样，可以使用标准分析(参见例如Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)来评估疫苗有效性。疫苗有效性是对疫苗(已证明具有高疫苗功效)如何减少群体疾病的评估。此测量可评估在天然场地条件下而非在受控临床试验中的净利益平衡和疫苗接种程序(不仅疫苗本身)的不利作用。疫苗有效性与疫苗功效(效能)成正比，但也受群体中的目标组受免疫的程度以及影响住院治疗、动态访问或成本的“现实”结果的其它非疫苗相关因素的影响。例如，可以使用可追溯的病例对照分析，其中对一组受感染病例中的疫苗接种率和适当的对照值进行比较。疫苗有效性可以表达为比率差异，利用优势比(OR)来发展感染，而不管是否疫苗接种：
有效性＝(1-OR)×100。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于65％。在一些实施方案中，疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于70％。在一些实施方案中，疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于75％。在一些实施方案中，疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于80％。在一些实施方案中，疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于85％。在一些实施方案中，疫苗针对VZV的功效(或有效性)大于90％。
在一些实施方案中，疫苗使受试者对VZV免疫持续达1年(例如，对于单一VZV季节)。在一些实施方案中，疫苗使受试者对VZV免疫持续长达2年。在一些实施方案中，疫苗使受试者对VZV免疫持续2年以上。在一些实施方案中，疫苗使受试者对VZV免疫持续3年以上。在一些实施方案中，疫苗使受试者对VZV免疫持续4年以上。在一些实施方案中，疫苗使受试者对VZV免疫持续5至10年。
在一些实施方案中，施用过VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者年龄在约12个月与约10岁(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10岁)之间。在一些实施方案中，施用过VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者年龄在约12个月与约15个月(例如，约12、12.5、13、13.5、14、14.5或15个月)之间。在一些实施方案中，施用过VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者年龄在约4岁与约6岁(例如，约4、4.5、5、5.6或6岁)之间。
在一些实施方案中，受试者是年龄在约20岁与约50岁(例如，约20、25、30、35、40、45或50岁)之间的年轻人。
在一些实施方案中，受试者是约60岁、约70岁或更老(例如，约60、65、70、75、80、85或90岁)的老年受试者。
在一些实施方案中，受试者暴露于VZV、受VZV感染或存在受VZV感染的风险。
在一些实施方案中，受试者免疫功能不足(具有受损的免疫系统，例如患有免疫病症或自体免疫病症)。
本发明的一些方面提供水痘带状疱疹病毒(VZV)RNA(例如，mRNA)疫苗，所述疫苗含有与VZV抗原性多肽连接的信号肽。因此，在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗含有至少一种具有编码与VZV抗原性肽连接的信号肽的开放阅读框架的核糖核酸(RNA)多核苷酸。本文还提供编码本文公开的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的核酸。
本发明的其它方面提供含有与VZV抗原性多肽连接的信号肽的水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗。在一些实施方案中，VZV抗原性多肽是VZV糖蛋白。在一些实施方案中，VZV糖蛋白选自VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM。在一些实施方案中，VZV糖蛋白是VZV gE或变异体VZV gE多肽。
在一些实施方案中，信号肽是IgE信号肽。在一些实施方案中，信号肽是IgE HC(Ig重链ε-1)信号肽。在一些实施方案中，信号肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：56)。在一些实施方案中，信号肽是IgGκ信号肽。在一些实施方案中，信号肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：57)。在一些实施方案中，信号肽选自：日本脑炎PRM信号序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：109)、VSVg蛋白信号序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：110)以及日本脑炎JEV信号序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQID NO：111)。
本文还提供编码本文公开的VZV疫苗的核酸。所述VZV疫苗包括至少一种具有编码与VZV抗原性多肽连接的信号肽的开放阅读框架的核糖核酸(RNA)(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，VZV抗原性肽是VZV糖蛋白。在一些实施方案中，VZV糖蛋白选自VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM。在一些实施方案中，VZV抗原性肽是VZV gE或gE多肽的变异体。
在一些实施方案中，有效量的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，单一剂量的VZV疫苗)导致针对VZV的血清中和抗体相对于对照值而言增加2倍至200倍(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200倍)。在一些实施方案中，单一剂量的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗导致针对VZV的血清中和抗体相对于对照值而言增加约5倍、50倍或150倍。在一些实施方案中，单一剂量的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗导致针对VZV的血清中和抗体相对于对照值而言增加约2倍至10倍或约40至60倍。
在一些实施方案中，在与鞭毛蛋白佐剂组合时，尤其当一种或多种编码抗原的mRNA与编码鞭毛蛋白的mRNA组合时，RNA疫苗RNA(例如，mRNA)的功效可显著增强。
与鞭毛蛋白佐剂(例如，由mRNA编码的鞭毛蛋白佐剂)组合的RNA(例如，mRNA)疫苗的优越特性在于它与市售的疫苗配制物相比产生大得多的抗体效价并且更早地产生反应。尽管不希望受理论约束，但相信RNA疫苗，例如如同mRNA多核苷酸，通过更优的设计从而在RNA(例如，mRNA)疫苗指派天然细胞机制时经过转译而产生适当的蛋白构型(对于抗原和佐剂而言)。与离体制造并且可触发不利细胞反应的传统疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更自然的方式提供给细胞系统。
本发明的一些实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，所述疫苗包括至少一种具有编码至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能够引发对抗原性多肽的免疫反应的免疫原性片段)的开放阅读框架的RNA(例如，mRNA)多核苷酸以及至少一种具有编码鞭毛蛋白佐剂的开放阅读框架的RNA(例如，mRNA多核苷酸)。
在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽(例如，经过编码的鞭毛蛋白多肽)是鞭毛蛋白。在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽(例如，经过编码的鞭毛蛋白多肽)是免疫原性鞭毛蛋白片段。在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽和至少一种抗原性多肽由单一RNA(例如，mRNA)多核苷酸编码。在其它实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽和至少一种抗原性多肽各自由不同的RNA多核苷酸编码。
在一些实施方案中，至少一种鞭毛蛋白多肽与具有SEQ ID NO：115至117中任一者的序列的鞭毛蛋白多肽具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的一致性。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗是经过化学改性的。在其它实施方案中，核酸疫苗是未改性的。
其它方面提供对受试者进行疫苗接种的组合物以及方法，包括向所述受试者施用包含一种或多种具有编码第一抗原性VZV多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定元件，而且其中佐剂不与疫苗共同配制或共同施药。
在其它方面，本发明是一种对受试者进行疫苗接种的组合物以及方法，包括向所述受试者施用包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中向受试者施用10μg/kg与400μg/kg之间剂量的核酸疫苗。在一些实施方案中，RNA多核苷酸的剂量是每次给药1-5μg、5-10μg、10-15μg、15-20μg、10-25μg、20-25μg、20-50μg、30-50μg、40-50μg、40-60μg、60-80μg、60-100μg、50-100μg、80-120μg、40-120μg、40-150μg、50-150μg、50-200μg、80-200μg、100-200μg、120-250μg、150-250μg、180-280μg、200-300μg、50-300μg、80-300μg、100-300μg、40-300μg、50-350μg、100-350μg、200-350μg、300-350μg、320-400μg、40-380μg、40-100μg、100-400μg、200-400μg或300-400μg。在一些实施方案中，通过皮内或肌肉内注射向受试者施用核酸疫苗。在一些实施方案中，在第0天向受试者施用核酸疫苗。在一些实施方案中，在第21天向受试者施用第二剂量的核酸疫苗。
在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括25微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括100微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括50微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括75微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括150微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括400微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，在施用给受试者的核酸疫苗中包括200微克剂量的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，RNA多核苷酸在局部淋巴结中比在远端淋巴结中积聚高出100倍的水平。在其它实施方案中，核酸疫苗是经过化学改性的，而在其它实施方案中，核酸疫苗是未改性的。
本发明的方面提供一种包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中所述RNA多核苷酸不包括稳定元件，以及药学上可接受的载剂或赋形剂，其中疫苗中不包括佐剂。在一些实施方案中，稳定元件是组蛋白茎环。在一些实施方案中，稳定元件是相对于野生型序列而言GC含量增加的核酸序列。
本发明的方面提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中配制物中存在RNA多核苷酸用于体内施药给宿主，这赋予了可接受百分比的人类受试者优于第一抗原的血清保护标准的抗体效价。在一些实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的抗体效价是中和抗体效价。在一些实施方案中，中和抗体效价大于蛋白疫苗。在其它实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价大于佐剂蛋白疫苗。又在其它实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价是1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000或2,000-2,500。中和效价典型地表达为实现血小板数量减少50％所需的最高血清稀释度。
还提供包含一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，其中配制物中存在RNA多核苷酸用于体内施药给宿主，从而引发了比由具有稳定元件或用佐剂配制并且编码第一抗原性多肽的mRNA疫苗引发的抗体效价持续更久的高抗体效价。在一些实施方案中，RNA多核苷酸配制成在单次施药一周内产生中和抗体。在一些实施方案中，佐剂选自阳离子肽以及免疫刺激性核酸。在一些实施方案中，阳离子肽是鱼精蛋白。
各方面提供包含一种或多种具有包含至少一种化学改性或可选地不含化学改性的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框架编码第一抗原性多肽，其中配制物中存在RNA多核苷酸用于体内施药给宿主，使得宿主体内的抗原表达水平显著超过由具有稳定元件或用佐剂配制并且编码第一抗原性多肽的mRNA疫苗产生的抗原表达水平。
其它方面提供包含一种或多种具有包含至少一种化学改性或可选地不含化学改性的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框架编码第一抗原性多肽，其中所述疫苗具有比未改性mRNA疫苗产生等同的抗体效价少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，存在25-100微克剂量的RNA多核苷酸。
本发明的方面还提供一单位的使用疫苗，所述疫苗包含10ug与400ug之间的一种或多种具有包含至少一种化学改性或可选地不含化学改性的开放阅读框架的RNA多核苷酸，所述开放阅读框架编码第一抗原性多肽，以及药学上可接受的载剂或赋形剂，所述疫苗配制成用于传递给人类受试者。在一些实施方案中，疫苗还包含阳离子脂质纳米粒子。
本发明的方面提供在个体或个体群体中产生、维持或恢复对VZV菌株的抗原性记忆的方法，所述方法包括对所述个体或群体施用抗原性记忆补强核酸疫苗，所述核酸疫苗包含(a)至少一种RNA多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一种化学改性或可选地不含化学改性以及两个或两个以上密码子优化的开放阅读框架，所述开放阅读框架编码一组参考抗原性多肽，以及(b)可选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，通过选自肌肉内施药、皮内施药以及皮下施药组成的群的途径向个体施用疫苗。在一些实施方案中，施药步骤包括使受试者的肌肉组织与适合注射组合物的装置接触。在一些实施方案中，施药步骤包括使受试者的肌肉组织与适合注射组合物的装置接触以及电穿孔。
本发明的方面提供对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向受试者施用25ug/kg与400ug/kg之间单次剂量的核酸疫苗，所述核酸疫苗包含对受试者进行疫苗接种有效量的一种或多种具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
其它方面提供包含一种或多种具有包含至少一种化学改性的开放阅读框架的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框架编码第一抗原性多肽，其中所述疫苗具有比未改性的mRNA疫苗产生等同的抗体效价少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，存在25至100微克剂量的RNA多核苷酸。
其它方面提供包含具有包含未改性核苷酸(未改性的)的开放阅读框架的LNP配制的RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述开放阅读框架编码第一抗原性多肽，其中所述疫苗具有比未在LNP中配制的未改性mRNA疫苗产生等同的抗体效价少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，存在25至100微克剂量的RNA多核苷酸。
实施例中呈现的数据表明使用本发明的配制物显著增强的免疫反应。数据表明了本发明的化学改性和未改性RNA疫苗两者的有效性。令人惊讶的是，与现有技术中报道的优选使用在载剂中配制的未化学改性的mRNA来生产疫苗相反，本发明中发现经过化学改性的mRNA-LNP疫苗比未改性的mRNA需要低得多的有效mRNA剂量，也就是说比在除LNP以外的载剂中配制的未改性的mRNA少十倍。本发明的化学改性和未改性RNA疫苗两者都产生比在不同的脂质载剂中配制的mRNA疫苗更好的免疫反应。
在其它方面，本发明涵盖一种治疗60岁或60岁以上老年受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用对所述受试者进行免疫接种有效量的核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
在其它方面，本发明涵盖一种治疗17岁或17岁以下年轻受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用对所述受试者进行免疫接种有效量的核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
在其它方面，本发明涵盖一种治疗成人受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用对所述受试者进行免疫接种有效量的核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
所述RNA多核苷酸是SEQ ID NO：1至8以及41之一，并且包括至少一种化学改性。在其它实施方案中，RNA多核苷酸是SEQ ID NO：1至8以及41之一，并且不包括任何核苷酸改性，或未改性。又在其它实施方案中，所述至少一种RNA多核苷酸编码SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42以及45至55中任一者的抗原性蛋白，并且包括至少一种化学改性。在其它实施方案中，所述RNA多核苷酸编码EQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42以及45至55中任一者的抗原性蛋白，并且不包括任何核苷酸改性，或未改性。
在优选的方面，本发明的疫苗(例如，LNP囊封的mRNA疫苗)在受疫苗接种受试者的血液或血清中产生预防和/或治疗有效水平、浓度和/或效价的抗原特异性抗体。如本文中定义，术语抗体效价指的是受试者(例如，人类受试者)体内产生的抗原特异性抗体的量。在示范性实施方案中，抗体效价表述为仍产生积极结果的最大稀释度(连续稀释)的倒数。在示范性实施方案中，通过酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)来确定或测量抗体效价。在示范性实施方案中，通过中和分析，例如通过微量中和分析来确定或测量抗体效价。在某些方面，抗体效价测量值表述为比率，诸如1∶40、1∶100等。
在本发明的示范性实施方案中，有效疫苗产生大于1∶40、大于1∶100、大于1∶400、大于1∶1000、大于1∶2000、大于1∶3000、大于1∶4000、大于1∶500、大于1∶6000、大于1∶7500、大于1∶10000的抗体效价。在示范性实施方案中，在疫苗接种10天后、疫苗接种20天后、疫苗接种30天后、疫苗接种40天后或疫苗接种50天或50天以上后产生或实现抗体效价。在示范性实施方案中，在向受试者施用单次剂量的疫苗后产生或实现效价。在其它实施方案中，在多次给药后，例如在第一次和第二次给药(例如，补强剂量)后产生或实现效价。
在本发明的示范性方面，抗原特异性抗体是以μg/ml为单位来测量或以IU/L(每升的国际单位)或mIU/ml(每毫升的毫国际单位)为单位来测量的。在本发明的示范性实施方案中，有效疫苗产生＞0.5μg/ml、＞0.1μg/ml、＞0.2μg/ml、＞0.35μg/ml、＞0.5μg/ml、＞1μg/ml、＞2μg/ml、＞5μg/ml或＞10μg/ml。在本发明的示范性实施方案中，有效疫苗产生＞10mIU/ml、＞20mIU/ml、＞50mIU/ml、＞100mIU/ml、＞200mIU/ml、＞500mIU/ml或＞1000mIU/ml。在示范性实施方案中，在疫苗接种10天后、疫苗接种20天后、疫苗接种30天后、疫苗接种40天后或疫苗接种50天或50天以上后产生或实现抗体水平或浓度。在示范性实施方案中，在向受试者施用单次剂量的疫苗后产生或实现所述水平或浓度。在其它实施方案中，在多次给药后，例如在第一次和第二次给药(例如，补强剂量)后产生或实现所述水平或浓度。在示范性实施方案中，通过酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)来确定或测量抗体水平或浓度。在示范性实施方案中，通过中和分析，例如通过微量中和分析来确定或测量抗体水平或浓度。
本发明的每种限制都可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预期本发明中涉及任一种要素或要素组合的每种限制都可以包括在本发明的每一个方面中。本发明并非将应用局限在下文描述中所述或图式中所说明的构筑细节和组件配置。本发明存在其它实施方案并且能够以各种方式来实践或进行。
附图简单说明
附图并非打算按比例绘制。图式中，各图中说明的每个相同或接近相同的组件由相似的数字来表示。为清楚的目的，并非在每幅图式中都对每个组件进行标记。在图式中：
图1是描绘推荐的水痘带状疱疹病毒路径的示意图。
图2是编码VZV gE(菌株Oka)的构筑体的示意图。
图3描绘用由MC3配制的编码VZV gE抗原的mRNA对BALB/C小鼠进行免疫的研究设计和注射方案。
图4是展示各种变异体VZV gE抗原的示意图。所述图式从上到下分别描绘SEQ IDNO：120、132和58。
图5是展示ELISA分析结果的图表，所述图表展示与疫苗相比，用各种VZV gE mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV gE IgG水平。
图6是展示ELISA分析结果的图表，所述图表表明与疫苗相比，用各种VZV gE mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV gE IgG水平。
图7是展示ELISA分析结果的图表，所述图表表明与疫苗相比，用各种VZV gE mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV gE IgG水平。
图8A和8B展示用抗体染色来展示高基氏体的人类黑素瘤(MeWo)细胞的共焦显微法。
图9A-9C展示用针对VZV gE的抗体染色来展示VZV gE表达和运输的MeWo细胞的共焦显微法。图9C中描绘的序列AEAADA是SEQ ID NO：58。
图10A和10B是描绘各种VZV野生型基因型的示意图。
图11A和11B是展示ELISA分析结果的图表，所述图表展示与疫苗相比，用VZV gE变异体mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV gE IgG水平。整个图11A和11B中描绘的序列AEAADA是SEQ ID NO：58。
图12A和12B是展示ELISA分析结果的图表，所述图表展示与疫苗相比，用VZV gE变异体mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV gE IgG水平。整个图12A和12B中描绘的序列AEAADA是SEQ ID NO：58。
图13是展示ELISA分析结果的图表，测量用VZV gE变异体mRNA疫苗进行免疫的小鼠血清中的抗体效价。在小鼠体内由VZV gE变异体mRNA引发的抗-VZV gE反应大于引发的反应。用于GE-删除_来自_574-Y569A的gE变异体mRNA引发比大1log的免疫反应。整个图13中描绘的序列AEAADA是SEQ ID NO：58。
图14A是展示ELISA分析结果的图表，所述图表展示在初始暴露于疫苗(第1至5组)或VZV-gE-del_574_Y569A(第6组)后，用VZV gE变异体mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV gE IgG水平。整个图14A中描绘的序列AEAADA是SEQ ID NO：58。图14B是展示EC50的测定值的图表。
图15A和15B是展示对在初始暴露于疫苗(第1至5组)或VZV-gE-del_574_Y569A(第6组)后，用VZV gE变异体mRNA进行疫苗接种的小鼠T细胞分析结果的图表。整个图15A和15B中描绘的序列AEAADA是SEQ ID NO：58。
图16A和16B是展示ELISA分析结果的图表，所述图表展示在初始暴露于VZV-gE-del_574_Y569A或ZOSTAVAX后，用VZV-gE-del_574_Y569A或进行疫苗接种的恒河猴(rhesus monkey)血清中的抗-VZV gE IgG水平。图16C是展示EC50和EC10测定值的图表。图16D、16E和16F是展示在初始暴露于VZV-gE-del_574_Y569A或ZOST后，用VZV-gE-del_574_Y569A或进行疫苗接种的恒河猴T细胞分析结果的图表。
具体实施方式
本发明的实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，所述疫苗包括至少一种编码水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。水痘带状疱疹病毒(VZV)存在至少五个分支。第1分支和第3分支包括欧洲/北美菌株；第2分支包括亚洲菌株，尤其来自日本；并且第5分支似乎来自印度。第4分支包括来自欧洲的一些菌株，但其地理来源需要进一步澄清。VZV基因体序列的系统发生分析将野生型菌株解析为9种基因型(E1、E2、J、M1、M2、M3、M4、VIII和IX)。对来自18个欧洲国家的342个临床水痘和带状疱疹样本的序列分析标识以下VZV基因型分布：E1，221(65％)；E2，87(25％)；M1，20(6％)；M2，3(1％)；M4和11(3％)。未观察到M3或J菌株。在来自澳大利亚和新西兰的165个临床水痘和带状疱疹分离株中，127个东部澳大利亚分离株中的67个为E1、30个为E2、16个为J、10个为M1且4个为M2；38个新西兰分离株中的25个为E1、8个为E2且5个为M1。
VZV是以直径约为200nm的球形多层结构形式存在的α疱疹病毒。病毒基因体被覆盖有非晶形层被膜蛋白的蛋白衣壳结构包围。所述两种结构被脂质包膜包围，所述脂质包膜散布有呈现于病毒粒子外部的各自长度约为8nm的病毒糖蛋白，并且包围由162个排列成二十面体形式的六倍体和五倍体衣壳体组成的100nm核鞘。由病毒编码蛋白和酶组成的被膜位于核鞘与病毒包膜之间的空间。病毒包膜由宿主细胞膜获得并且含有病毒编码的糖蛋白。
VZV基因体是具有至少70个开放阅读框架的124,884个碱基对的单一线性双倍体DNA分子。基因体视S区段的取向而具有2种主要异构体，P(原型)和IS(反转S)，它们以相等的频率存在，总频率为90至95％。L区段也可以反转，总计产生四种线性异构体(IL和ILS)。
VZV与单纯疱疹病毒(HSV)密切相关，享有大量基因体同源性。VZV基因体是人类疱疹病毒中最小的并且编码至少71种复制早前开放阅读框架(分别为ORF64至62)的另外三个开放阅读框架(ORF69至ORF71)的独特蛋白(ORF0至ORF68)。仅一部分编码蛋白形成病毒粒子的结构。那些蛋白是九种糖蛋白：ORF5(gK)、ORF9A(gN)、ORF14(gC)、ORF31(gB)、ORF37(gH)、ORF50(gM)、ORF60(gL)、ORF67(gI)和ORF68(gE)。已知包膜糖蛋白(gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL、gN和gM)与HSV中的那些蛋白相对应；但是没有HSV gD的等效物。VZV也无法产生在确定HSV潜伏期(单纯疱疹病毒)中起重要作用的LAT(潜伏期相关转录物)。编码糖蛋白gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM在病毒复制周期的不同步骤中起作用。在感染细胞中以及在成熟病毒粒子中发现最多的糖蛋白是糖蛋白E(gE、ORF 68)，它是病毒粒子包膜的主要组分并且为病毒复制所必需。糖蛋白I(gI，ORG 67)与gE在感染细胞中形成复合物，这有利于糖蛋白的胞吞作用并且将其引导至反式高基氏体网络(TGN)，在此获得最终的病毒包膜。在TGN中需要糖蛋白I(gI)进行VZV包膜并且在VZV复制期间进行有效膜融合。发现VZV gE和gI在感染宿主细胞表面上复合在一起。作为第二普遍的糖蛋白并且认为在病毒入口中发挥作用的糖蛋白B(ORF 31)与中和抗体结合。认为糖蛋白H具有融合功能，促使病毒在细胞和细胞之间传播。gE、gB和gH的抗体在天然感染之后而且在疫苗接种后普遍存在，并且已证实在体外中和病毒活性。
本发明的实施方案提供RNA(例如，mRNA)疫苗，所述疫苗包括至少一种编码至少一种VZV抗原性多肽的多核苷酸。本文提供的VZV RNA疫苗可用于引发平衡免疫反应，包含细胞和体液免疫性，而不存在与DNA疫苗和活的减毒疫苗相关的多种风险。本文公开的各种RNA(例如，mRNA)疫苗在BALB/C小鼠体内产生免疫反应，在实施例部分详细论述其结果。特定而言，具有编码各种VZV抗原中的一种或多种的开放阅读框架的RNA(例如，mRNA)多核苷酸疫苗相对于传统VZV疫苗(例如，减毒VZV病毒)产生显著的免疫反应。本文公开的编码VZVgE或变异体VZV gE的VZV RNA(例如，mRNA)多核苷酸疫苗在通过肌肉内(IM)或皮内(ID)施药时，在两次施药后展现显著的免疫反应。VZV糖蛋白和被膜蛋白已证实具有抗原性。本发明中涵盖VZV糖蛋白、其片段以及其表位。
国际申请No.PCT/US2015/02740的整个内容以引用的方式并入本文中。
已发现，本文所述的mRNA疫苗在几个方面优于目前的疫苗。首先，脂质纳米粒子(LNP)传递优于其它配制物，包括文献中所述的鱼精蛋白基本方法，而且不需要其它佐剂。使用LNP使得可以有效地传递经过化学改性或未改性的mRNA疫苗。另外，本文中已表明，经过改性以及未改性的LNP配制的mRNA疫苗在显著程度上优于传统的疫苗。在一些实施方案中，本发明的mRNA疫苗优于传统疫苗至少10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1,000倍。
尽管已努力尝试生产功能性RNA疫苗，包括mRNA疫苗以及自复制RNA疫苗，但这些RNA疫苗的治疗功效尚未完全确定。相当令人吃惊的是，发明人根据本发明的方面发现一类用于体内传递mRNA疫苗的配制物，所述配制物产生显著增强的，而且在许多方面协同的免疫反应，包括增强抗原产生以及增强产生具有中和能力的功能性抗体。与其它类别的基于脂质的配制物中使用的mRNA剂量相比，即使在施用显著更低剂量的mRNA时，仍可以实现这些结果。本发明的配制物已展示显著出乎意料的体内免疫反应，足以确定功能性mRNA疫苗作为预防剂以及治疗剂的功效。另外，自复制RNA疫苗依赖于病毒复制途径来向细胞中传递足够的RNA来产生免疫原性反应。本发明的配制物不需要病毒复制即可产生足够的蛋白而导致强烈的免疫反应。因此，本发明的mRNA并非自复制RNA，而且不包括病毒复制必需的组分。
本发明在一些方面涉及到令人惊讶的发现，即脂质纳米粒子(LNP)配制物显著增强mRNA疫苗的有效性，包括化学改性和未改性的mRNA疫苗。使用几种不同的抗原体内检验在LNP中配制的mRNA疫苗的功效。本文呈现的结果表明在LNP中配制的mRNA疫苗优于其它市售疫苗的出乎意料的优越功效。
除了提供增强的免疫反应以外，本发明的配制物以比试验的其它疫苗更低剂量的抗原产生更加快速的免疫反应。本发明的mRNA-LNP配制物也产生比在不同载剂中配制的疫苗在定量以及定性上都更佳的免疫反应。
本文中所述的数据表明，本发明的配制物比现有的VZV抗原疫苗产生显著出乎意料的改良，包括与VARIVAX和ZOSTAVAX相比，通过在LNP中配制的mRNA化学改性以及未改性VZV疫苗产生显著更高水平的IgG。经过化学改性的LNP mRNA疫苗比试验的未改性或市售疫苗显著更快速地开始产生IgG。
另外，即使当mRNA的剂量低于其它疫苗时，本发明的mRNA-LNP配制物仍优于其它疫苗。数据表明，在两次10μg剂量后以及在两次2μg剂量后，所有gE变异体LNP mRNA疫苗都诱发比强烈得多的免疫反应。当血清稀释100倍以上时，经过VZV gE LNP mRNA进行疫苗接种的小鼠血清中的抗体效价高于经过进行疫苗接种的小鼠血清中的抗体效价，表明VZV gE LNP mRNA疫苗在小鼠体内诱发比强得多的免疫反应。
小鼠中的结果与在非人类的灵长动物体内观察到的免疫原性相一致。用经过化学改性的VZV LNP mRNA疫苗或对恒河猴进行预致敏。mRNA疫苗提供比更高的抗-gE效价，并且与组不同，产生合理频率的产生IFNγ的CD4 T-细胞、IL-2或TNFα细胞。数据也表明，在Zostavax暴露后给予一剂mRNA疫苗接种与给予两剂mRNA疫苗接种等效地诱发相当的T细胞反应。
本文所述研究中使用的一些LNP先前已用来在各种动物模型以及人类体内传递siRNA。鉴于结合LNP配制物的siRNA传递所进行的观察，LNP适用于疫苗的事实相当令人惊讶。观察到，治疗性地传递在LNP中配制的siRNA导致与短暂IgM反应相关的不利发炎反应，通常导致抗原产量减少以及免疫反应受损。与由siRNA观察到的结果相反，本发明的LNP-mRNA配制物在本文中证实产生增强的IgG水平，足以用于预防和治疗方法，而非短暂的IgM反应。
核酸/多核苷酸
如本文提供的水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗包含至少一种(一种或多种)具有编码至少一种VZV抗原性多肽的开放阅读框架的核糖核酸(RNA，例如mRNA)多核苷酸。术语“核酸”以其最广泛的含义包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。所述聚合物称为多核苷酸。
在一些实施方案中，VZV疫苗的至少一种RNA多核苷酸由选自以下的至少一个核酸序列编码：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：41。
在一些实施方案中，VZV疫苗的至少一种RNA(例如，mRNA)多核苷酸由选自以下的至少一个核酸序列片段(例如，具有抗原性序列或至少一个表位的片段)编码：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8和SEQ ID NO：41。
核酸(也称为多核苷酸)可以是或者可包括例如核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖组态的LNA、具有α-L-核糖组态的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能基的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能基的2′-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)或其嵌合体或组合。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸充当信使RNA(mRNA)。“信使RNA”(mRNA)指的是编码(至少一种)多肽(天然产生、非天然产生或改性的氨基酸聚合物)并且可通过转译以体外、体内、就地或离体产生经过编码的多肽的任何多核苷酸。本领域技术人员将了解，除另外说明以外，本申请中所述的多核苷酸序列将在代表性DNA序列中列举“T”，但其中所述序列表示RNA(例如，mRNA)，“T”将被“U”取代。因此，由特定序列识别号码标识的DNA编码的任何RNA多核苷酸也可包含由所述DNA编码的相应RNA(例如，mRNA)序列，其中所述DNA序列的每个“T”被“U”取代。
mRNA分子的基本组分通常包括至少一个编码区、5′非转译区(UTR)、3′UTR、5′端帽和聚腺苷酸尾(聚-A尾)。本发明的多核苷酸可充当mRNA，但在其功能性和/或结构设计特征方面区别于野生型mRNA，所述特征用以使用基于核酸的处理来克服有效多肽表达的现有问题。
在一些实施方案中，VZV疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码2至10种、2至9种、2至8种、2至7种、2至6种、2至5种、2至4种、2至3种、3至10种、3至9种、3至8种、3至7种、3至6种、3至5种、3至4种、4至10种、4至9种、4至8种、4至7种、4至6种、4至5种、5至10种、5至9种、5至8种、5至7种、5至6种、6至10种、6至9种、6至8种、6至7种、7至10种、7至9种、7至8种、8至10种、8至9种或9至10种抗原性多肽。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码至少10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种抗原性多肽。在一些实施方案中，VZV疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码至少100种抗原性多肽或至少200种抗原性多肽。在一些实施方案中，VZV疫苗的RNA多核苷酸(例如，mRNA)编码1至10种、5至15种、10至20种、15至25种、20至30种、25至35种、30至40种、35至45种、40至50种、1至50种、1至100种、2至50种或2至100种抗原性多肽。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸(例如，mRNA)经过密码子优化。密码子优化方法在本领域中已知并且可如本文提供来使用。例如，序列SEQ ID NO：11、15、19、23、27、31、35、39、62、66、70、74、78、82、86、90中的任一个或多个或SEQ ID NO：92至108中的任一个或多个序列可经过密码子优化。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配标靶与宿主有机体中的密码子频率来确保适当摺叠；使GC含量出现偏差来增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可损害基因构造或表达的串联重复密码子或碱基运行最小化；定制转录和转译控制区；插入或去除蛋白运输序列；去除/添加编码蛋白中的转译后改性位点(例如，糖苷化位点)；添加、去除或取代蛋白结构域；插入或删除限制位点；改性核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节转译速率以使得蛋白的各种结构域可适当摺叠；或减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。密码子优化工具、算法和服务在本领域中已知-非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专利方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法来优化开放阅读框架(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化序列(例如，SEQ ID NO：92至108的密码子优化序列)与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有小于95％的序列一致性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有小于90％的序列一致性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有小于85％的序列一致性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有小于80％的序列一致性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有小于75％的序列一致性。
在一些实施方案中，密码子优化序列与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有65％与85％之间(例如，约67％与约85％之间或约67％与约80％之间)的序列一致性。在一些实施方案中，密码子优化序列与天然产生或野生型序列(例如，编码所关注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)的天然产生或野生型mRNA序列)享有65％与75％之间或约80％的序列一致性。
在一些实施方案中，密码子优化序列(例如，SEQ ID NO：92至108的密码子优化序列)编码与由SEQ ID NO：92至108的(非密码子优化)序列编码的抗原性多肽具有同样免疫原性或更具免疫原性(例如，多出至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)的抗原性多肽。
在一些实施方案中，VZV疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有至少一种改性、至少一个5′端帽，且所述VZV疫苗配制在脂质纳米粒子内。在体外转录反应期间，可根据制造商的方案使用以下化学RNA端帽类似物产生5′-鸟苷端帽结构来同时完成对多核苷酸的5′-封端：3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G[ARCA端帽]；G(5′)ppp(5′)A；G(5′)ppp(5′)G；m7G(5′)ppp(5′)A；m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。改性RNA的5′-封端可在转录后使用牛痘病毒封端酶来完成以产生“端帽0”结构：m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。端帽1结构可使用牛痘病毒封端酶和2′-O甲基-转移酶产生，从而产生：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基。端帽2结构可由端帽1结构产生，接着使用2′-O甲基-转移酶对5′-倒数第三个核苷酸进行2′-O-甲基化。端帽3结构可由端帽2结构产生，接着使用2′-O甲基-转移酶对5′-倒数第四个核苷酸进行2′-O-甲基化。酶可来源于重组来源。
在转染至哺乳动物细胞中时，改性mRNA具有12至18小时之间或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可以是其中G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的量增加的RNA在功能方面可以比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。举例来说，WO02/098443公开了一种医药组合物，所述医药组合物含有在转译区通过序列改性来稳定化的mRNA。由于遗传密码退化，改性通过用促进更大RNA稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子取代现有密码子来起作用。所述方法局限于RNA的编码区。
抗原/抗原性多肽
在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV糖蛋白。例如，VZV糖蛋白可以是VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN或gM或其免疫原性片段或表位。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZVgE多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gI多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gB多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gH多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gK多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gL多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gC多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gN多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV gM多肽。
在一些实施方案中，抗原性多肽包含两种或两种以上糖蛋白。所述两种或两种以上糖蛋白可以由单一RNA多核苷酸来编码或者可以由两种或两种以上RNA多核苷酸来编码，例如每种糖蛋白由单独的RNA多核苷酸来编码。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gE与选自gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的糖蛋白的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gI与选自gE、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的糖蛋白的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上糖蛋白可以是VZV gE、gI与选自gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM多肽或其免疫原性片段或表位的糖蛋白的任意组合。在一些实施方案中，所述两种或两种以上VZV糖蛋白是gE和gI。本发明涵盖包含编码VZV的其它病毒蛋白组分(例如，被膜蛋白)的RNA多核苷酸的替代RNA疫苗。因此，本发明的一些实施方案提供VZV疫苗，所述疫苗包括至少一种具有编码至少一种VZV被膜蛋白或其抗原性片段或表位的开放阅读框架的核糖核酸(RNA)多核苷酸。在一些实施方案中，抗原性多肽是VZV被膜蛋白或其抗原性片段或表位。在其它实施方案中，VZV疫苗的抗原性片段可以是至少一种VZV被膜多肽和至少一种VZV糖蛋白多肽，例如选自gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM的任何VZV糖蛋白。
本发明包括变异体VZV抗原性多肽。在一些实施方案中，变异体VZV抗原性多肽是变异体VZV gE多肽。变异体VZV gE多肽经过设计来避免多肽的ER/高基氏体保留，导致抗原的表面表达增加。在一些实施方案中，变异体gE多肽经过截短来去除多肽的ER保留部分或细胞质尾端部分。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽经过突变来减少VZV多肽定位到ER/高基氏体/TGN。所述改性抑制了ER捕获并因此加快了运输到细胞膜。
因此，在一些实施方案中，VZV糖蛋白是变异体gE多肽。VZV gE在其C末端具有用于TGN的标靶序列并且在受感染而且经过gE转染的细胞中从ER运输到TGN。TGN中的大多数gE似乎通过胞吞作用来从浆膜撷取并且从胞内体传递到TGN，接着再循环到浆膜。gE与其它与产生完整包膜VZV病毒粒子相关的VZV蛋白(例如，被膜蛋白)一起积聚在TGN中。因此，使得TGN定位和胞吞作用减少的突变有助于将gE运输到细胞膜。
变异体VZV gE多肽可以是缺少锚结构域(ER保留结构域)的任何截短多肽。例如，变异体VZV gE多肽可以是至少包含氨基酸1至124，例如包括氨基酸1至124、1至140、1至160、1至200、1至250、1至300、1至350、1至360、1至400、1至450、1至500、1至511、1至550和1至561的截短VZV gE多肽以及具有所引用大小范围内的片段大小的多肽片段。在一个实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至561。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是缺少羧基末端尾结构域的截短多肽。因此，在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至573。
在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽在一个或多个与ER保留相关的基序中具有至少一种突变，其中一个或多个基序中的突变导致VZV gE多肽在ER和/或高基氏体中的保留减少。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽在一个或多个磷酸化酸性基序中具有至少一种突变。例如，变异体VZV gE多肽可以是具有Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变与Y569A突变两者的全长VZV gE多肽。或者，变异体VZV gE多肽可以是抗原性片段，其包含例如VZVgE的氨基酸1至573并且具有Y569A突变。或者，变异体VZV gE多肽可以是在酸性磷酸化基序(诸如，SST基序)中具有突变的抗原性片段。例如，变异体VZV gE多肽可以是具有AEAADA序列(SEQ ID NO：58)的抗原性片段。
在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是在C末端具有有助于多肽分泌的另一序列的全长VZV gE多肽。例如，变异体VZV gE多肽可以是在C末端具有Igκ序列的全长VZV gE多肽。在一些实施方案中，VZV gE多肽在C末端具有有助于分泌的另一序列(I.，在C末端具有Igκ序列)并且变异体VZV gE多肽在一个或多个与ER保留、TGN定位和/或胞吞作用相关的基序中具有至少一种突变(例如，Y582G突变、Y569A突变或Y582G突变与Y569A突变两者)和/或在一个或多个磷酸化酸性基序中具有至少一种突变。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是缺少锚结构域(ER保留结构域)的截短多肽并且在C末端具有有助于多肽分泌的另一序列，例如在C末端具有Igκ序列。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至561并且在C末端具有Igκ序列。在一些实施方案中，变异体VZV gE多肽是缺少羧基末端尾结构域并且在C末端具有有助于多肽分泌的另一序列(例如，在C末端具有Igκ序列)的截短多肽。在一些实施方案中，截短VZV gE多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至573并且在C末端具有Igκ序列。
在一些实施方案中，VZV抗原性多肽长于25个氨基酸且短于50个氨基酸。因此，多肽包括基因产物、天然产生的多肽、合成多肽、同源物、异种同源物、同种同源物、片段和以上各物的其它等效物、变异体和类似物。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。多肽也可包含单链或多链多肽，诸如抗体或胰岛素，并且可以缔合或连接。最常见地，在多链多肽中可见二硫键联。术语多肽也可以适用于氨基酸聚合物，其中至少一个氨基酸残基是相应天然产生的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变异体”指的是其氨基酸序列区别于天然或参考序列的分子。氨基酸序列变异体与天然或参考序列相比可在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。变异体通常与天然或参考序列具有至少50％的一致性。在一些实施方案中，变异体与天然或参考序列享有至少80％或至少90％的一致性。
在一些实施方案中，提供“变异体模拟物”。如本文所用，“变异体模拟物”含有至少一个将模拟活化序列的氨基酸。例如，麸氨酸可以充当偶磷基-苏氨酸和/或偶磷基-丝氨酸的模拟物。或者，变异体模拟物可以导致去活化或者导致含有模拟物的不活化产物。例如，苯丙氨酸可以充当酪氨酸的不活化取代，或者丙氨酸可以充当丝氨酸的不活化取代。
“异种同源物”指的是通过物种形成从共同祖先基因进化的不同物种的基因。异种同源物在进化过程中通常保持相同的功能。标识异种同源物对于可靠预测新测序基因体中的基因功能而言是重要的。
“类似物”打算包括因一种或多种氨基酸改变而不同的多肽变异体，例如仍保留母体或起始多肽的一种或多种特性的对氨基酸残基的取代、添加或删除。
“同种同源物”是通过在基因体内复制而相关的基因(或蛋白)。异种同源物在进化过程中保留相同的功能，而同种同源物进化出新的功能，即使所述新功能与初始功能相关。
本发明提供若干种类型的组合物，所述组合物基于多核苷酸或多肽，包括变异体和衍生物。所述变异体和衍生物包括例如取代、插入、删除和共价变异体和衍生物。术语“衍生物”与术语“变异体”同义使用，但通常指的是相对于参考分子或起始分子而言以任何方式改性和/或改变的分子。
因此，本发明的范畴内包括编码相对于参考序列而言含有取代、插入和/或添加、删除和共价改性的肽或多肽(具体来说是本文公开的多肽序列)的多核苷酸。例如，可向肽序列(例如，N末端或C末端)添加序列标签或氨基酸，诸如一个或多个赖氨酸。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽的溶解性或使得可进行生物素标记。或者，位于肽或蛋白的氨基酸序列的羧基和氨基末端区的氨基酸残基可以可选地被删除来提供截短序列。或者，某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可根据序列的用途删除，例如表达作为具有可溶性或连接至固体支撑物的较大序列的部分的序列。在替代性实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、连接子、多聚结构域(诸如，摺叠区)等等的序列可以由实现相同或类似功能的替代序列来取代。所述序列可易于由本领域技术人员识别。还应该了解，本文提供的一些序列含有序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)，其例如可在用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前被删除。
提到多肽时的“取代变异体”是在天然或起始序列中去除至少一个氨基酸残基并且在其相同位置处插入不同氨基酸的那些取代变异体。取代可以是单次的，其中分子中只有一个氨基酸被取代，或者取代可以是多次的，其中同一分子中两个或两个以上氨基酸被取代。
如本文所用，术语“保守性氨基酸取代”指的是以具有类似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代序列中正常存在的氨基酸。保守性取代的实例包括以非极性(疏水性)残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)取代另一非极性残基。同样，保守性取代的实例包括用一种极性(亲水性)残基取代另一残基，诸如精氨酸与赖氨酸之间、麸酰氨酸与天冬酰氨酸之间和甘氨酸与丝氨酸之间。另外，保守性取代的其它实例是用诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的碱性残基取代另一者，或用诸如天冬氨酸或麸氨酸的一种酸性残基取代另一种酸性残基。非保守性取代的实例包括用诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸的非极性(疏水性)氨基酸残基取代诸如半胱氨酸、麸酰氨酸、麸氨酸或赖氨酸的极性(亲水性)残基和/或用极性残基取代非极性残基。
提到多肽或多核苷酸时的“特征”分别定义为分子的基于不同氨基酸序列或基于核苷酸的组分。由多核苷酸编码的多肽特征包括表面表达、局部构型形状、摺叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任意组合。
如本文所用，当提到多肽时，术语“结构域”指的是具有一种或多种可标识的结构或功能性特征或特性(例如，结合能力，充当蛋白与蛋白相互作用的位点)的多肽基序。
如本文所用，当提到多肽时，术语“位点”在涉及基于氨基酸的实施方案时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。如本文所用，当提到多核苷酸时，术语“位点”在涉及基于核苷酸的实施方案时与“核苷酸”同义使用。位点表示在基于多肽或多核苷酸的分子中可进行改性、操作、变化、衍生或改变的肽或多肽或多核苷酸中的位置。
如本文所用，当提到多肽或多核苷酸时，术语“末端(termini或terminus)”分别指的是多肽或多核苷酸的端点。所述端点不仅局限于多肽或多核苷酸的第一个或最后一个位点，而且可包括末端区域中的其它氨基酸或核苷酸。基于多肽的分子的特征在于具有N末端(由具有游离氨基(NH2)的氨基酸封端)和C末端(由具有游离羧基(COOH)的氨基酸封端)。蛋白在某些情形下由通过双硫键或通过非共价力(多聚体、寡聚物)结合在一起的多个多肽链组成。所述蛋白具有多个N末端和C末端。或者，可选地，多肽的末端可以进行改性以便可以由基于非多肽的部分开始或结束，诸如有机结合物。
如本领域技术人员所公认的，蛋白片段、功能性蛋白结构域和同源蛋白也被认为在所关注的多肽的范畴内。举例来说，本文提供长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或大于100个氨基酸的参考蛋白的任何蛋白片段(意思是比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基但其它方面都相同的多肽序列)。在另一个实施例中，根据本发明可以使用与本文所述任何序列40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％一致的包括20、30、40、50或100个氨基酸延伸段的任何蛋白。在一些实施方案中，多肽包括如本文提供或参考的任何序列中所示的2、3、4、5、6、7、8、9、10或10种以上突变。在一些实施方案中，蛋白片段长于25个氨基酸且短于50个氨基酸。
本发明的多肽或多核苷酸分子与参考分子(例如，参考多肽或参考多核苷酸)，例如与本领域中所述的分子(例如，工程化或经设计的分子或野生型分子)可享有一定程度的序列类似性或一致性。如本领域中已知，术语“一致性”指的是如通过对比序列所确定，两个或两个以上多肽或多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，一致性的意思也在于如由两个或两个以上氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数所确定的其间的序列相关程度。一致性测量两个或两个以上序列中具有由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)提出的空隙比对(如果存在任何)的较小者之间的一致匹配百分比。相关肽的一致性可易于由已知方法来计算。“一致性％”在应用于多肽或多核苷酸序列时定义为在比对序列且引入空隙(如果必要)来实现最大一致性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基一致的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中熟知。应了解，一致性取决于一致性百分比的计算，但由于计算中引入空隙和处罚，因此它们的值可能不同。通常，如本文所述且本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定，特定多核苷酸或多肽变异体与所述特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列一致性。用于比对的所述工具包括BLAST试剂盒的那些工具(Stephen F.Altschul，等人(1997)，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：anew generation of protein database search programs”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一种流行的局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。一种基于动态程序化的通用全局比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)“Ageneral method applicable tothe search for similarities in the amino acid sequences of two proteins”J.Mol.Biol.48：443-453)。最近研发出了一种快速优化全局序列比对算法(Fast OptimalGlobal Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)，据称它比其它优化全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生对核苷酸和蛋白序列的全局比对。本文中描述其它工具，尤其在下文“一致性”的定义中。
如本文所用，术语“同源性”指的是聚合分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。享有由比对匹配残基所确定的临限水平类似性或一致性的聚合分子(例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子)称为同源的。同源性是描述分子间关系的定量术语，并且可以基于对类似性或一致性的定量。类似性或一致性是定义两个比较序列间的序列匹配程度的定量术语。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致或类似，就认为它们是彼此“同源”的。术语“同源”必然指的是至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的对比。如果两个多核苷酸序列编码的多肽中至少20个氨基酸的至少一个延伸段至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％一致，就认为所述的两个多核苷酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列由其编码至少4至5个独特规定氨基酸的延伸段的能力来特征化。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列来说，由其编码至少4至5个独特规定氨基酸的延伸段的能力来确定同源性。如果两种蛋白中至少20个氨基酸的至少一个延伸段至少50％、60％、70％、80％或90％一致，就认为所述两种蛋白序列是同源的。
同源性暗示对比的序列在从共同来源进化时出现分歧。术语“同源物”指的是与来源于共同祖先序列的第二氨基酸序列或核酸序列相关的第一氨基酸序列或核酸序列(例如，基因(DNA或RNA)或蛋白序列)。术语“同源物”可适用于通过物种形成事件而分离的基因和/或蛋白之间的关系或适用于通过遗传复制事件而分离的基因和/或蛋白之间的关系。
多蛋白和多组分疫苗
本发明涵盖包含各自编码单一抗原性多肽的多个RNA(例如，mRNA)多核苷酸的VZV疫苗以及包含编码一种以上抗原性多肽(例如，融合多肽)的单一RNA多核苷酸的VZV疫苗。因此应了解，包含具有编码第一VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA(例如，mRNA)多核苷酸和具有编码第二VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸(例如，mRNA)的疫苗组合物涵盖(a)包含编码第一VZV抗原性多肽的第一RNA多核苷酸和编码第二VZV抗原性多肽的第二RNA多核苷酸的疫苗，和(b)包含编码第一和第二VZV抗原性多肽(例如，融合多肽)的单一RNA多核苷酸的疫苗。在一些实施方案中，本发明的VZV RNA疫苗包含2种至10种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)或10种以上具有开放阅读框架的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸各自编码不同的VZV抗原性多肽(或编码2种至10种或10种以上不同VZV抗原性多肽的单一RNA多核苷酸)。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗包含具有编码VZV gE蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gI蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gB蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gH蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gK蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gL蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gC蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸、具有编码VZV gN蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸和具有编码VZV gM蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗包含具有编码VZV gE的开放阅读框架的RNA多核苷酸和具有编码VZV gI蛋白的开放阅读框架的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗包含具有编码VZV gE蛋白或gE变异体的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸编码与信号肽(例如，SEQ ID NO：56、57、109、110或111)融合的VZV抗原性多肽。信号肽可在抗原性多肽的N末端或C末端融合。
信号肽
在一些实施方案中，由VZV多核苷酸编码的抗原性多肽包含信号肽。在N末端包含蛋白的15至60个氨基酸的信号肽通常需要通过分泌途径跨膜移位，并且因此普遍地控制真核细胞和原核细胞中的大多数蛋白进入分泌途径。信号肽通常包括三个区域：具有不同长度的N末端区域，通常包含带正电荷的氨基酸；疏水性区域；以及短羧基末端肽区域。在真核细胞中，初生前驱体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体导向粗糙内质网(ER)膜并且开始通过其传输生长的肽链。然而，信号肽不负责成熟蛋白的最终目标。序列中不含其它地址标签的分泌型蛋白默认被分泌到外部环境。信号肽通过内质网(ER)保留信号肽酶从前驱体蛋白裂解或者保持不裂解并充当膜锚。近年来，关于信号肽已演变出一种更先进的观点，表明某些信号肽的功能和免疫优势比先前预期的更多样得多。
信号肽通常用于促使将新合成的蛋白靶向内质网(ER)来进行加工。ER加工产生成熟的包膜蛋白，其中信号肽通常由宿主细胞的信号肽酶裂解。信号肽也可以促使将蛋白靶向细胞膜。本发明的VZV疫苗可包含例如编码人工信号肽的RNA多核苷酸，其中信号肽编码序列可操作性地连接至VZV抗原性多肽的编码序列并与其同框。因此，在一些实施方案中，本发明的VZV疫苗产生包含与信号肽融合的VZV抗原性多肽的抗原性多肽。在一些实施方案中，信号肽与VZV抗原性多肽的N末端融合。在一些实施方案中，信号肽与VZV抗原性多肽的C末端融合。
在一些实施方案中，与VZV抗原性多肽融合的信号肽为人工信号肽。在一些实施方案中，与由VZV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的VZV抗原性多肽融合的人工信号肽由免疫球蛋白获得，例如IgE信号肽或IgG信号肽。在一些实施方案中，与由VZV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的VZV抗原性多肽融合的信号肽是具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：56)的Ig重链ε-1信号肽(IgE HC SP)。在一些实施方案中，与由VZV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的VZV抗原性多肽融合的信号肽是具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：57)的IgGk链V-III区HAH信号肽(IgGk SP)。在一些实施方案中，由VZV RNA(例如，mRNA)疫苗编码的VZV抗原性多肽具有与SEQ ID NO：56、57、109、110和111中任一者的信号肽融合的10、14、18、22、26、30、34、38、42和45至55之一所述的氨基酸序列。本文公开的实施例不打算限制并且根据本发明可使用本领域中已知促使将蛋白靶向ER以供加工和/或促使将蛋白靶向细胞膜的任何信号肽。
信号肽可具有15至60个氨基酸的长度。例如，信号肽可具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽可具有20至60、25至60、30至60、35至60、40至60、45至60、50至60、55至60、15至55、20至55、25至55、30至55、35至55、40至55、45至55、50至55、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、15至45、20至45、25至45、30至45、35至45、40至45、15至40、20至40、25至40、30至40、35至40、15至35、20至35、25至35、30至35、15至30、20至30、25至30、15至25、20至25或15至20个氨基酸的长度。
信号肽通常在ER加工期间在裂解接合处由初生多肽裂解。由本发明的VZV RNA疫苗产生的成熟VZV抗原性多肽通常不包含信号肽。
化学改性
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种呼吸道细胞融合性病毒(VZV)抗原性多肽的开放阅读框架，其中所述RNA包含至少一种化学改性。
术语“化学改性”和“经过化学改性的”指的是关于腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞嘧啶核苷(C)核糖核苷或脱氧核糖核苷对其位置、图案、百分比或群体中的至少一者的改性。通常，所述术语并非指的是对天然产生的5′-末端mRNA端帽部分的核糖核苷酸改性。
多核苷酸的改性包括(不限于)本文所述的那些改性并且包括(但明确地不限于)包含化学改性的那些改性。多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)可包含天然产生、非天然产生的改性或多核苷酸可包含天然产生与非天然产生改性的组合。多核苷酸可包括例如对糖、核碱基或核苷间键联(例如，对连接的磷酸酯、对磷酸二酯键或对磷酸二酯主链)的任何适用的改性。
关于多肽，术语“改性”指的是相对于典型集合20个氨基酸而言的改性。如本文提供的多肽如果含有氨基酸取代、插入或取代与插入的组合，那么也认为它是“经过改性的”。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含多种(一种以上)不同改性。在一些实施方案中，特定区域的多核苷酸含有一种、两种或两种以上(可选地不同的)核苷或核苷酸改性。在一些实施方案中，引入细胞或有机体中的经过改性的RNA多核苷酸(例如，改性的mRNA多核苷酸)在细胞或有机体中相对于未改性的多核苷酸而言分别展现出降解减少。在一些实施方案中，引入细胞或有机体中的改性的RNA多核苷酸(例如，改性的mRNA多核苷酸)在细胞或有机体中可分别展现出免疫原性减小(例如，固有的反应减少)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含在多核苷酸合成期间或在多核苷酸合成后引入的非天然改性的核苷酸来实现所需的功能或特性。改性可呈现于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。改性可以通过化学合成或通过聚合酶在链的末端或链的任意其它处引入。多核苷酸的任何区域都可以进行化学改性。
本发明提供多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的改性核苷和核苷酸。“核苷”指的是与有机碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称为“核碱基”)组合的含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。“核苷酸”指的是核苷，包括磷酸酯基团。改性的核苷酸可以通过诸如化学、酶促或重组的任何适用方法来合成，从而包括一种或多种改性或非天然的核苷。多核苷酸可包含键联核苷的一个或多个区域。所述区域可具有可变的主链键联。所述键联可以是标准的磷酸二酯键，在这种情形下多核苷酸将包含核苷酸区域。
经过改性的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且涵盖在核苷酸和/或经过改性的核苷酸之间形成的碱基对，包含非标准或经过改性的碱基，其中氢键供体与氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间氢键结，诸如在具有至少一种化学改性的那些多核苷酸中。所述非标准碱基配对的一种实例是经过改性的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或连接子的任意组合都可以并入本发明的多核苷酸中。
适用于本发明的组合物、疫苗、方法和合成方法中的多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)改性(包括(但不限于)化学改性)包括(但不限于)以下：2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷；2-甲硫基-N6-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甘氨酸基氨基甲酰基腺苷；N6-异戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；1，2′-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷；2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；2′-O-甲基腺苷；2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；异戊烯基腺苷；N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷；N6，2′-O-二甲基腺苷；N6，2′-O-二甲基腺苷；N6，N6，2′-O-三甲基腺苷；N6，N6-二甲基腺苷；N6-乙酰基腺苷；N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷；N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷；7-去氮杂-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6，N6(二甲基)腺嘌呤；N6-顺-羟基-异戊烯基-腺苷；α-硫基-腺苷；2(氨基)腺嘌呤；2(氨基丙基)腺嘌呤；2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(氨基烷基)腺嘌呤；2-(氨基丙基)腺嘌呤；2-(卤基)腺嘌呤；2-(卤基)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2′-氨基-2′-脱氧基-ATP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-ATP；2′-脱氧基-2′-a-氨基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(去氮杂)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(氨基)腺嘌呤；8(硫烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(氨基)腺嘌呤；8-(卤基)腺嘌呤；8-(羟基)腺嘌呤；8-(硫烷基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-叠氮基-腺苷；氮杂腺嘌呤；去氮杂腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(异戊基)腺嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-去氮杂腺苷TP；2′氟-N6-Bz-脱氧基腺苷TP；2′-OMe-2-氨基-ATP；2′O-甲基-N6-Bz-脱氧基腺苷TP；2′-a-乙炔基腺苷TP；2-氨基腺嘌呤；2-氨基腺苷TP；2-氨基-ATP；2′-a-三氟甲基腺苷TP；2-叠氮基腺苷TP；2′-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2′-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟腺苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基腺苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巯基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲硫基-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-去氮杂-3-溴腺苷TP；3-去氮杂-3-氯腺苷TP；3-去氮杂-3-氟腺苷TP；3-去氮杂-3-碘腺苷TP；3-去氮杂腺苷TP；4′-叠氮基腺苷TP；4′-碳环腺苷TP；4′-乙炔基腺苷TP；5′-高-腺苷TP；8-氮杂-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-去氮杂腺苷TP；2-氨基嘌呤；7-去氮杂-2，6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基嘌呤；2-硫基胞嘧啶核苷；3-甲基胞嘧啶核苷；5-甲酰基胞嘧啶核苷；5-羟甲基胞嘧啶核苷；5-甲基胞嘧啶核苷；N4-乙酰基胞嘧啶核苷；2′-O-甲基胞嘧啶核苷；2′-O-甲基胞嘧啶核苷；5，2′-O-二甲基胞嘧啶核苷；5-甲酰基-2′-O-甲基胞嘧啶核苷；立西啶(Lysidine)；N4，2′-O-二甲基胞嘧啶核苷；N4-乙酰基-2′-O-甲基胞嘧啶核苷；N4-甲基胞嘧啶核苷；N4，N4-二甲基-2′-OMe-胞嘧啶核苷TP；4-甲基胞嘧啶核苷；5-氮杂-胞嘧啶核苷；假-异-胞嘧啶核苷；吡咯并-胞嘧啶核苷；α-硫基-胞嘧啶核苷；2-(硫基)胞嘧啶；2′-氨基-2′-脱氧基-CTP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-CTP；2′-脱氧基-2′-a-氨基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基胞嘧啶核苷TP；3(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶；3-(甲基)胞嘧啶核苷；4，2′-O-二甲基胞嘧啶核苷；5(卤基)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(卤基)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞嘧啶核苷；5-碘-胞嘧啶核苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮基)胞嘧啶；6-氮杂-胞嘧啶核苷；氮杂胞嘧啶；去氮杂胞嘧啶；N4(乙酰基)胞嘧啶；1-甲基-1-去氮杂-假异胞嘧啶核苷；1-甲基-假异胞嘧啶核苷；2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶核苷；2-甲氧基-胞嘧啶核苷；2-硫基-5-甲基-胞嘧啶核苷；4-甲氧基-1-甲基-假异胞嘧啶核苷；4-甲氧基-假异胞嘧啶核苷；4-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假异胞嘧啶核苷；4-硫基-1-甲基-假异胞嘧啶核苷；4-硫基-假异胞嘧啶核苷；5-氮杂-泽布拉林(zebularine)；5-甲基-泽布拉林；吡咯并-假异胞嘧啶核苷；泽布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞嘧啶核苷TP；2，2′-脱水-胞嘧啶核苷TP盐酸盐；2′氟-N4-Bz-胞嘧啶核苷TP；2′氟-N4-乙酰基-胞嘧啶核苷TP；2′-O-甲基-N4-乙酰基-胞嘧啶核苷TP；2′O-甲基-N4-Bz-胞嘧啶核苷TP；2′-a-乙炔基胞嘧啶核苷TP；2′-a-三氟甲基胞嘧啶核苷TP；2′-b-乙炔基胞嘧啶核苷TP；2′-b-三氟甲基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基胞嘧啶核苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基胞嘧啶核苷TP；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞嘧啶核苷TP；3′-乙炔基胞嘧啶核苷TP；4′-叠氮基胞嘧啶核苷TP；4′-碳环胞嘧啶核苷TP；4′-乙炔基胞嘧啶核苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-胞嘧啶核苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫基胞嘧啶核苷TP；5-(4-氨基-苯基)-2-硫基胞嘧啶核苷TP；5-氨基烯丙基-CTP；5-氰基胞嘧啶核苷TP；5-乙炔基氮杂-胞嘧啶核苷TP；5-乙炔基胞嘧啶核苷TP；5′-高-胞嘧啶核苷TP；5-甲氧基胞嘧啶核苷TP；5-三氟甲基-胞嘧啶核苷TP；N4-氨基-胞嘧啶核苷TP；N4-苄酰基-胞嘧啶核苷TP；假异胞嘧啶核苷；7-甲基鸟苷；N2，2′-O-二甲基鸟苷；N2-甲基鸟苷；怀俄苷(Wyosine)；1，2′-O-二甲基鸟苷；1-甲基鸟苷；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；2′-O-甲基鸟苷；2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)；7-氨基甲基-7-去氮杂鸟苷；7-氰基-7-去氮杂鸟苷；古嘌苷(Archaeosine)；甲基怀俄苷；N2，7-二甲基鸟苷；N2，N2，2′-O-三甲基鸟苷；N2，N2，7-三甲基鸟苷；N2，N2-二甲基鸟苷；N2，7，2′-O-三甲基鸟苷；6-硫基-鸟苷；7-去氮杂-鸟苷；8-侧氧基-鸟苷；N1-甲基-鸟苷；α-硫基-鸟苷；2(丙基)鸟嘌呤；2-(烷基)鸟嘌呤；2′-氨基-2′-脱氧基-GTP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-GTP；2′-脱氧基-2′-a-氨基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基鸟苷TP；6(甲基)鸟嘌呤；6-(烷基)鸟嘌呤；6-(甲基)鸟嘌呤；6-甲基-鸟苷；7(烷基)鸟嘌呤；7(去氮杂)鸟嘌呤；7(甲基)鸟嘌呤；7-(烷基)鸟嘌呤；7-(去氮杂)鸟嘌呤；7-(甲基)鸟嘌呤；8(烷基)鸟嘌呤；8(炔基)鸟嘌呤；8(卤基)鸟嘌呤；8(硫烷基)鸟嘌呤；8-(烯基)鸟嘌呤；8-(烷基)鸟嘌呤；8-(炔基)鸟嘌呤；8-(氨基)鸟嘌呤；8-(卤基)鸟嘌呤；8-(羟基)鸟嘌呤；8-(硫烷基)鸟嘌呤；8-(硫醇)鸟嘌呤；氮杂鸟嘌呤；去氮杂鸟嘌呤；N(甲基)鸟嘌呤；N-(甲基)鸟嘌呤；1-甲基-6-硫基-鸟苷；6-甲氧基-鸟苷；6-硫基-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷；6-硫基-7-去氮杂-鸟苷；6-硫基-7-甲基-鸟苷；7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷；7-甲基-8-侧氧基-鸟苷；N2，N2-二-甲基-6-硫基-鸟苷；N2-甲基-6-硫基-鸟苷；1-Me-GTP；2′氟-N2-异丁基-鸟苷TP；2′O-甲基-N2-异丁基-鸟苷TP；2′-a-乙炔基鸟苷TP；2′-a-三氟甲基鸟苷TP；2′-b-乙炔基鸟苷TP；2′-b-三氟甲基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基鸟苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基鸟苷TP；4′-叠氮基鸟苷TP；4′-碳环鸟苷TP；4′-乙炔基鸟苷TP；5′-高-鸟苷TP；8-溴-鸟苷TP；9-去氮杂鸟苷TP；N2-异丁基-鸟苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1，2′-O-二甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2′-O-甲基肌苷；环氧基Q核苷(Epoxyqueuosine)；半乳糖基-Q核苷；甘露糖基Q核苷；Q核苷；烯丙基氨基-胸苷；氮杂胸苷；去氮杂胸苷；脱氧-胸苷；2′-O-甲基尿苷；2-硫尿苷；3-甲基尿苷；5-羧基甲基尿苷；5-羟基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氢尿苷；假尿苷；(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-氨基-5-羧基丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-乙基-假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2′-O-甲基假尿苷；2′-O-甲基尿苷；2-硫基-2′-O-甲基尿苷；3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷；3，2′-O-二甲基尿苷；3-甲基-假-尿苷TP；4-硫尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷；5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯；5，2′-O-二甲基尿苷；5，6-二氢-尿苷；5-氨基甲基-2-硫尿苷；5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷；5-羧基羟甲基尿苷；5-羧基羟甲基尿苷甲酯；5-羧基甲氨基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-羧基甲氨基甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲氨基甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲氨基甲基尿苷；5-羧基甲氨基甲基尿苷；5-氨基甲酰基甲基尿苷TP；5-甲氧羰基甲基-2′-O-甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲基尿苷；5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫尿苷；5-甲氨基甲基-2-硒基尿苷；5-甲氨基甲基-2-硫尿苷；5-甲氨基甲基尿苷；5-甲基二氢尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲酯-尿苷TP；N1-甲基-假-尿嘧啶；N1-乙基-假-尿嘧啶；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；3-(3-氨基-3-羧基丙基)-尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基尿苷TP；5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫基-尿苷；1(氨基烷氨基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(氨基烷氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫基)假尿嘧啶；1(氨基烷氨基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(氨基烷氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫基)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1经取代的2(硫基)-假尿嘧啶；1经取代的2，4-(二硫基)假尿嘧啶；1经取代的4(硫基)假尿嘧啶；1经取代的假尿嘧啶；1-(氨基烷氨基-羰基乙烯基)-2-(硫基)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；2(硫基)假尿嘧啶；2′脱氧基尿苷；2′氟尿苷；2-(硫基)尿嘧啶；2，4-(二硫基)假尿嘧啶；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-鸟苷；2′-氨基-2′-脱氧基-UTP；2′-叠氮基-2′-脱氧基-UTP；2′-叠氮基-脱氧基尿苷TP；2′-O-甲基假尿苷；2′脱氧基尿苷；2′氟尿苷；2′-脱氧基-2′-a-氨基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-a-叠氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶；4(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)尿嘧啶；4-硫基尿嘧啶；5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-氨基丙基)尿嘧啶；5(氨基烷基)尿嘧啶；5(二甲氨基烷基)尿嘧啶；5(胍基烷基)尿嘧啶；5(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5(甲基)2，4(二硫基)尿嘧啶；5(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5(甲氨基甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5(甲氨基甲基)-2，4(二硫基)尿嘧啶；5(甲氨基甲基)-4(硫基)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-氨基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-2，4(二硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基氨基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷氨基烷基)尿嘧啶；5-(二甲氨基烷基)尿嘧啶；5-(胍基烷基)尿嘧啶；5-(卤基)尿嘧啶；5-(I，3-二唑-I-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)2，4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-2，4(二硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲氨基甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5-(甲氨基甲基)-2，4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲氨基甲基)-4-(硫基)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-氨基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮基)尿嘧啶；6-(偶氮基)尿嘧啶；6-氮杂-尿苷；烯丙基氨基-尿嘧啶；氮杂尿嘧啶；去氮杂尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫基-假-UTP；1-羧基甲基-假尿苷；1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫基-假尿苷；2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷；2-硫基-1-甲基-假尿苷；2-硫基-5-氮杂-尿苷；2-硫基-二氢假尿苷；2-硫基-二氢尿苷；2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫基-1-甲基-假尿苷；4-硫基-假尿苷；5-氮杂-尿苷；二氢假尿苷；(±)1-(2-羟丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羟丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羟丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2，2，3，3，3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2，2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2，4，6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2，4，6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2，4，6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-氨基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-氨基-乙基)假-UTP；1-(2-羟基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3，4-双-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3，4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-氨基-3-羧基丙基)假-UTP；1-(3-氨基-丙基)假-UTP；1-(3-环丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-氨基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苄基)假-UTP；1-(4-氨基-丁基)假-UTP；1-(4-氨基-苯基)假-UTP；1-(4-叠氮基苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺酰基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苄基)假-UTP；1-(4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-苄基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫基甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-氨基-戊基)假-UTP；1-(6-氨基-己基)假-UTP；1，6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙酰基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)-乙氧基]-丙酰基}假尿苷TP；1-乙酰基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-氨基甲基-假-UTP；1-苄酰基假尿苷TP；1-苄氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-环丁基甲基-假-UTP；1-环丁基-假-UTP；1-环庚基甲基-假-UTP；1-环庚基-假-UTP；1-环己基甲基-假-UTP；1-环己基-假-UTP；1-环辛基甲基-假-UTP；1-环辛基-假-UTP；1-环戊基甲基-假-UTP；1-环戊基-假-UTP；1-环丙基甲基-假-UTP；1-环丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羟甲基假尿苷TP；1-异-丙基-假-UTP；1-Me-2-硫基-假-UTP；1-Me-4-硫基-假-UTP；1-Me-α-硫基-假-UTP；1-甲磺酰基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2，2，2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-吗啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫基吗啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(经取代的苯基)假-UTP；1-甲基-6-氨基-假-UTP；1-甲基-6-叠氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲氨基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲酰基-假-UTP；1-甲基-6-羟基氨基-假-UTP；1-甲基-6-羟基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-异-丙基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲氨基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-第三丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-吗啉基甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-三甲基乙酰基假尿苷TP；1-丙炔基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-对甲苯基-假-UTP；1-第三丁基-假-UTP；1-硫基甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫基吗啉基甲基假尿苷TP；1-三氟乙酰基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2，2′-脱水-尿苷TP；2′-溴-脱氧基尿苷TP；2′-F-5-甲基-2′-脱氧基-UTP；2′-OMe-5-Me-UTP；2′-OMe-假-UTP；2′-a-乙炔基尿苷TP；2′-a-三氟甲基尿苷TP；2′-b-乙炔基尿苷TP；2′-b-三氟甲基尿苷TP；2′-脱氧基-2′，2′-二氟尿苷TP；2′-脱氧基-2′-a-巯基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-a-硫基甲氧基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氨基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-叠氮基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-溴尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氯尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-氟尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-碘尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-巯基尿苷TP；2′-脱氧基-2′-b-硫基甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫基-尿苷；2-甲氧基尿苷；2′-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4′-叠氮基尿苷TP；4′-碳环尿苷TP；4′-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲氨基尿苷TP；5′-高-尿苷TP；5-碘-2′-氟-脱氧基尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘甲基-6-氘尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基阿糖尿苷TP；6-(2，2，2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-吗啉基)-假-UTP；6-(4-硫基吗啉基)-假-UTP；6-(经取代的苯基)-假-UTP；6-氨基-假-UTP；6-叠氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲氨基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-羧酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲酰基-假-UTP；6-羟基氨基-假-UTP；6-羟基-假-UTP；6-碘-假-UTP；6-异-丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲氨基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-第三丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫基-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-对苯甲酸；假-UTP-N1-对苯甲酸；怀丁苷(Wybutosine)；羟基怀丁苷；异怀俄苷；过氧基怀丁苷；未完全改性的羟基怀丁苷；4-去甲基怀俄苷；2，6-(二氨基)嘌呤；1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡恶嗪-1-基；1，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡噻嗪-I-基；1，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡恶嗪-1-基；1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘；2(氨基)嘌呤；2，4，5-(三甲基)苯基；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-胞嘧啶核苷；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-腺嘌呤；2′甲基、2′氨基、2′叠氮基、2′氟-尿苷；2′-氨基-2′-脱氧基核糖；2-氨基-6-氯-嘌呤；2-氮杂-肌苷基；2′-叠氮基-2′-脱氧基核糖；2′氟-2′-脱氧基核糖；经2′-氟-改性的碱基；2′-O-甲基-核糖；2-侧氧基-7-氨基吡啶并嘧啶-3-基；2-侧氧基-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮；3-(甲基)异喹诺酮；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4，6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5经取代的嘧啶；5-(甲基)异喹诺酮；5-硝基吲哚；6-(氮杂)嘧啶；6-(偶氮基)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-I-基；7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡恶嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡恶嗪-1-基；7-(氨基烷基羟基)-I，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡噻嗪-I-基；7-(氨基烷基羟基)-I，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡恶嗪-I-基；7-(氮杂)吲哚基；7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡恶嗪I-基；7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-I-基；7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡恶嗪-1-基；7-(胍基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡恶嗪-1-基；7-(胍基烷基-羟基)-I，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡噻嗪-I-基；7-(胍基烷基羟基)-I，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡恶嗪-I-基；7-(丙炔基)异喹诺酮；7-(丙炔基)异喹诺酮；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；7-去氮杂-肌苷基；7-经取代的1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡恶嗪-1-基；7-经取代的1，3-(二氮杂)-2-(侧氧基)-啡恶嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；氨基吲哚基；蒽基；双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；双-邻位取代6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黄嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；异喹诺酮；异鸟苷；N2-经取代的嘌呤；N6-甲基-2-氨基-嘌呤；N6-经取代的嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；努布拉林(Nubularine)；O6-经取代的嘌呤；O-烷基化衍生物；邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；邻位取代6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代间型霉素(Oxoformycin)TP；对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；对位取代6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；并五苯基；苯蒽基；苯基；丙炔基-7-(氮杂)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基；2-侧氧基-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；芪基；经取代的1，2，4-三唑；并四苯基；杀结核菌素(Tubercidine)；黄嘌呤；黄嘌呤核苷-5′-TP；2-硫基-泽布拉林；5-氮杂-2-硫基-泽布拉林；7-去氮杂-2-氨基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-氨基-核糖苷-TP；间型霉素A TP；间型霉素B TP；吡咯核苷(Pyrrolosine)TP；2′-OH-阿糖-腺苷TP；2′-OH-阿糖-胞嘧啶核苷TP；2′-OH-阿糖-尿苷TP；2′-OH-阿糖-鸟苷TP；5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷TP；和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)腺苷TP。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述改性的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中改性的核碱基选自由以下各项组成的组：假尿苷(ψ)、2-硫尿苷(s2U)、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2′-O-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、α-硫基-鸟苷、α-硫基-腺苷、5-氰基尿苷、4′-硫基尿苷7-去氮杂-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)和2，6-二氨基嘌呤(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-去氮杂-鸟苷、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-侧氧基-鸟苷、7-甲基-8-侧氧基-鸟苷、2，8-二甲基腺苷、2-香叶基硫尿苷、2-立西啶、2-硒基尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)-5，6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷、3-甲基假尿苷、5-(羧基羟甲基)-2′-O-甲基尿苷甲酯，5-氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-氨基甲基-2-硒基尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-羧基甲氨基甲基-2-硒基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-羟基胞嘧啶核苷、5-甲氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、7-氨基羧基丙基-去甲基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷、7-氨基羧基丙基怀俄苷甲酯、8-甲基腺苷、N4，N4-二甲基胞嘧啶核苷、N6-甲酰基腺苷、N6-羟甲基腺苷、艾格买替丁(agmatidine)、环状N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、麸氨酰基-Q核苷、甲基化未完全改性的羟基怀丁苷、N4，N4，2′-O-三甲基胞嘧啶核苷、香叶基化5-甲氨基甲基-2-硫尿苷、香叶基化5-羧基甲氨基甲基-2-硫尿苷、Q碱基、preQ0碱基、preQ1碱基和其中两种或两种以上的组合。在一些实施方案中，所述至少一种化学改性的核苷选自由以下各项组成的组：假尿苷、1-甲基-假尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷以及其组合。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA聚核糖核苷酸，诸如mRNA聚核糖核苷酸)包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述改性的核碱基的组合。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述改性的核碱基的组合。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)中改性的核碱基选自由以下各项组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫基-鸟苷和α-硫基-腺苷。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸包括至少两种(例如，2种、3种、4种或4种以上)前述改性的核碱基的组合，包括(但不限于)化学改性。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2-硫尿苷(s2U)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2-硫尿苷和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含2′-O-甲基尿苷和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，诸如mRNA)包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)进行均匀改性(例如，完全改性、整个序列中进行改性)来用于特定改性。例如，多核苷酸可用1-甲基-假尿苷进行均匀改性，意思是mRNA序列中的所有尿苷残基被1-甲基-假尿苷取代。类似地，多核苷酸可以通过用诸如上文所述的任何改性残基取代而被均匀地改性为序列中存在的任意类型的核苷残基。
具有改性胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞嘧啶核苷(ac4C)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、5-卤基-胞嘧啶核苷(例如，5-碘-胞嘧啶核苷)、5-羟甲基-胞嘧啶核苷(hm5C)、1-甲基-假异胞嘧啶核苷、2-硫基-胞嘧啶核苷(s2C)以及2-硫基-5-甲基-胞嘧啶核苷。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的尿苷。具有改性的尿苷的例示性核碱基和核苷包括1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基尿苷、2-硫基尿苷、5-氰基尿苷、2′-O-甲基尿苷和4′-硫基尿苷。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的腺嘌呤。具有改性的腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括7-去氮杂-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)和N6-甲基-腺苷(m6A)。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的鸟嘌呤。具有改性的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-去氮杂-鸟苷、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-侧氧基-鸟苷和7-甲基-8-侧氧基-鸟苷。
本发明的多核苷酸可沿整个分子长度部分或完全改性。例如，一种或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任一种或多种或所有A、G、U、C)在本发明的多核苷酸中或在其给定的预定序列区中都可以进行均匀改性(例如，在包括或排除聚腺苷酸尾的mRNA中)。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸(或其给定序列区)中的所有核苷酸X都是改性的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
多核苷酸可含有约1％至约100％改性的核苷酸(关于总体核苷酸含量而言或关于一种或多种类型的核苷酸而言，即A、G、U或C中的任一个或多个)或任何介于中间的百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。将了解，任何剩余的百分比都由未改性的A、G、U或C的百分比来解释。
多核苷酸可含有最小1％且最大100％改性的核苷酸或任何介于中间的百分比，诸如至少5％改性的核苷酸、至少10％改性的核苷酸、至少25％改性的核苷酸、至少50％改性的核苷酸、至少80％改性的核苷酸或至少90％改性的核苷酸。例如，多核苷酸可含有改性的嘧啶，诸如改性的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由改性的尿嘧啶(例如，5-经取代的尿嘧啶)取代。改性的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物取代，或可由多种具有不同结构(例如，2种、3种、4种或4种以上独特结构)的化合物取代。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由改性的胞嘧啶(例如，5-经取代的胞嘧啶)取代。改性的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物取代，或可由多种具有不同结构(例如，2种、3种、4种或4种以上独特结构)的化合物取代。
因此，在一些实施方案中，RNA疫苗包含5′UTR元件、可选的是经过密码子优化的开放阅读框架和3′UTR元件、聚(腺苷酸)序列和/或多腺苷酸化信号，其中RNA未经过化学改性。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的尿嘧啶。具有改性的尿嘧啶的例示性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-尿苷(s2U)、4-硫基-尿苷(s4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫基-尿苷(nm5s2U)、5-甲氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲氨基甲基-2-硫基-尿苷(mnm5s2U)、5-甲氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨基甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲氨基甲基-2-硫基-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫基-尿苷(inm5s2U)、α-硫基-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)，且5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫基-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的胞嘧啶。具有改性的胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞嘧啶核苷、6-氮杂-胞嘧啶核苷、假异胞嘧啶核苷、3-甲基-胞嘧啶核苷(m3C)、N4-乙酰基-胞嘧啶核苷(ac4C)、5-甲酰基-胞嘧啶核苷(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶核苷(m4C)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5C)、5-卤基-胞嘧啶核苷(例如，5-碘-胞嘧啶核苷)、5-羟甲基-胞嘧啶核苷(hm5C)、1-甲基-假异胞嘧啶核苷、吡咯并-胞嘧啶核苷、吡咯并-假异胞嘧啶核苷、2-硫基-胞嘧啶核苷(s2C)、2-硫基-5-甲基-胞嘧啶核苷、4-硫基-假异胞嘧啶核苷、4-硫基-1-甲基-假异胞嘧啶核苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假异胞嘧啶核苷、1-甲基-1-去氮杂-假异胞嘧啶核苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫基-泽布拉林、2-硫基-泽布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶核苷、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶核苷、4-甲氧基-假异胞嘧啶核苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞嘧啶核苷、立西啶(k2C)、α-硫基-胞嘧啶核苷、2′-O-甲基-胞嘧啶核苷(Cm)、5，2′-O-二甲基-胞嘧啶核苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2′-O-甲基-胞嘧啶核苷(ac4Cm)、N4，2′-O-二甲基-胞嘧啶核苷(m4Cm)、5-甲酰基-2′-O-甲基-胞嘧啶核苷(f5Cm)、N4，N4，2′-O-三甲基-胞嘧啶核苷(m4 2Cm)、1-硫基-胞嘧啶核苷、2′-F-阿糖-胞嘧啶核苷、2′-F-胞嘧啶核苷和2′-OH-阿糖-胞嘧啶核苷。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的腺嘌呤。具有改性的腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-2，6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘氨酸基氨基甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6，N6-二甲基-腺苷(m6 2A)、N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫基-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N6，2′-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6，N6，2′-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1，2′-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫基-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2′-F-阿糖-腺苷、2′-F-腺苷、2′-OH-阿糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，改性的核碱基是改性的鸟嘌呤。具有改性的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧基怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、未完全改性的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-去氮杂-鸟苷、Q核苷(Q)、环氧基Q核苷(oQ)、半乳糖基-Q核苷(gaIQ)、甘露糖基-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫基-鸟苷、6-硫基-7-去氮杂-鸟苷、6-硫基-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫基-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2，N2-二甲基-鸟苷(m2 2G)、N2，7-二甲基-鸟苷(m2，7G)、N2，N2，7-二甲基-鸟苷(m2，2，7G)、8-侧氧基-鸟苷、7-甲基-8-侧氧基-鸟苷、1-甲基-6-硫基-鸟苷、N2-甲基-6-硫基-鸟苷、N2，N2-二甲基-6-硫基-鸟苷、α-硫基-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2，N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2 2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2，7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m2，7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1，2′-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫基-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2′-F-阿糖-鸟苷和2′-F-鸟苷。
RNA(例如，mRNA)的体外转录
本发明的VZV疫苗包含至少一种RNA多核苷酸，诸如mRNA(例如，改性的mRNA)。例如，mRNA由模板DNA经体外转录，称为“体外转录模板”。在一些实施方案中，至少一种RNA多核苷酸具有至少一种化学改性。所述至少一种化学改性可包括本文所述的任何改性，但显然不限于此。
RNA的体外转录在本领域中已知并且在国际公布WO/2014/152027中已有描述，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。例如，在一些实施方案中，在体外转录反应中使用未经扩增的线性化DNA模板产生RNA转录物来产生RNA转录物。在一些实施方案中，RNA转录物通过酶促封端来封端。在一些实施方案中，通过例如使用寡dT受质的色谱方法来纯化RNA转录物。一些实施方案排除使用DNase。在一些实施方案中，通过使用所述化学的T7噬菌体RNA聚合酶和核苷酸三磷酸的酶促体外转录反应，由编码所关注基因的未经扩增的线性DNA模板来合成RNA转录物。在本发明的方法中可使用任意数量的RNA聚合酶或变异体。聚合酶可选自(但不限于)噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变聚合酶，诸如(但不限于)能够合并改性的核酸和/或改性的核苷酸(包括经过化学改性的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。
在一些实施方案中，使用未经扩增的线性化质粒DNA作为用于体外转录的模板DNA。在一些实施方案中，模板DNA是分离的DNA。在一些实施方案中，模板DNA为cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过逆转录RNA多核苷酸(例如(但不限于)VZV RNA，例如VZV mRNA)来形成。在一些实施方案中，细胞(例如，细菌细胞，例如大肠杆菌，例如DH-1细胞)由质粒DNA模板转染。在一些实施方案中，培养转染细胞来复制质粒DNA，接着进行分离且纯化。在一些实施方案中，DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于所关注基因的5′处并与所关注基因可操作性连接的T7启动子。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5′非转译(UTR)区、含有开放阅读框架且编码3′UTR和聚腺苷酸尾。体外转录模板的具体核酸序列组成和长度将取决于由模板编码的mRNA。
“5′非转译区”(UTR)指的是直接位于起始密码子(即，由核糖体转译的mRNA转录物的第一密码子)上游(即，5′)的不编码多肽的mRNA区域。
“3′非转译区”(UTR)指的是直接位于终止密码子(即，表示转译终止的mRNA转录物的密码子)下游(即，3′)的不编码多肽的mRNA区域。
“开放阅读框架”是由起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束的DNA连续延伸段并且编码多肽。
“聚腺苷酸尾”是位于含有多个连续单磷酸腺苷的3′UTR下游，例如直接位于其下游(即3′)的mRNA区域。聚腺苷酸尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，聚腺苷酸尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，聚腺苷酸尾含有50至250个单磷酸腺苷。在一种相关生物的情境中(例如，在细胞中、体内)，聚(腺苷酸)尾用来保护mRNA以免酶促降解，例如在细胞质中，并且有助于转录终止和/或由核输出mRNA并转译。
在一些实施方案中，多核苷酸包括200至3,000个核苷酸。例如，多核苷酸可包括200至500个、200至1000个、200至1500个、200至3000个、500至1000个、500至1500个、500至2000个、500至3000个、1000至1500个、1000至2000个、1000至3000个、1500至3000个或2000至3000个核苷酸)。
治疗方法
本文提供用于在人类和其它哺乳动物体内预防和/或治疗VZV的组合物(例如，医药组合物)、方法、试剂盒和试剂。VZV RNA疫苗可用作治疗剂或预防剂。所述VZV RNA疫苗可用在药物中来预防和/或治疗传染病。在例示性方面中，本发明的VZV RNA疫苗用于对水痘和带状疱疹提供预防性保护作用。水痘是由VZV引起的急性传染病。导致鸡痘(水痘)的原发性水痘带状疱疹病毒感染会导致并发症，包括病毒或继发性细菌性肺炎。甚至当鸡痘的临床症状已经消退时，VZV在感染者的神经系统中在三叉神经和背根神经节中仍保持蛰伏并且在生命后期可再活化，从感觉神经节传播返回至皮肤，在此产生称为带状疱疹的疾病(皮疹)，而且也会导致从无菌性脑膜炎至脑炎变化的多种神经病况。本发明的VZV疫苗可用于预防和/或治疗原发性感染(鸡痘)而且也使病毒感染再活化(带状疱疹)，并且尤其可适用于预防和/或治疗免疫功能不足且年老的患者从而预防或减小带状疱疹的严重性和/或持续时间。
在施用本发明的VZV RNA疫苗后可达成对VZV的预防性保护作用。疫苗可施用一次、两次、三次、四次或四次以上，但可能施用一次疫苗(可选地紧接单次补强剂)即足够。尽管较不有利，但可能向受感染受试者施用疫苗来达成治疗性反应。给药可能需要相应调整。
本发明的方面中提供一种在受试者体内引发针对VZV的免疫反应的方法。所述方法涵盖向受试者施用VZV RNA疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架的RNA(例如，mRNA)多核苷酸，由此在受试者体内引发对VZV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加。“抗-抗原性多肽抗体”是特异性地结合抗原性多肽的血清抗体。
预防有效剂量是以临床上可接受的水平预防病毒感染的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是疫苗的包装插页中所列的剂量。如本文所用，传统疫苗指的是除本发明的mRNA疫苗以外的疫苗。举例来说，传统疫苗包括(但不限于)活微生物疫苗、死微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗等。在例示性实施方案中，传统疫苗是已实现注册审批和/或已由国家药品监督管理机构(例如，美国食品与药品管理局(theFood and Drug Administration，FDA)或欧洲药品管理局(the European MedicinesAgency，EMA))注册的疫苗。
本发明的方面中提供一种在受试者体内引发针对VZV的免疫反应的方法。所述方法涵盖向受试者施用VZV RNA疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架的RNA多核苷酸，由此在受试者体内引发对VZV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中所述受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加。“抗-抗原性多肽抗体”是特异性结合抗原性多肽的血清抗体。
预防有效剂量是以临床上可接受的水平预防病毒感染的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是疫苗的包装插页中所列的剂量。如本文所用，传统疫苗指的是除本发明的mRNA疫苗以外的疫苗。举例来说，传统疫苗包括(但不限于)活微生物疫苗、死微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗等。
在一些实施方案中，受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加1log至10log。
在一些实施方案中，受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加1log。
在一些实施方案中，受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加2log。
在一些实施方案中，受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加3log。
在一些实施方案中，受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加5log。
在一些实施方案中，受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价在疫苗接种后相对于经预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的抗-抗原性多肽抗体效价而言增加10log。
本发明的其它方面中提供一种在受试者体内引发针对VZV的免疫反应的方法。所述方法涵盖向受试者施用VZV RNA疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架的RNA多核苷酸，由此在受试者体内引发对VZV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中受试者体内的免疫反应等同于在以相对于RNA疫苗而言2倍至100倍剂量水平的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言两倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言三倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言4倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言5倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言10倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言50倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言100倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言10倍至1000倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等同于在经传统疫苗以相对于VZVRNA疫苗而言100倍至1000倍的剂量水平进行疫苗接种的受试者体内的免疫反应。
在其它实施方案中，通过测定受试者体内的[蛋白]抗体效价来评估免疫反应。
在其它方面中，本发明是一种通过向受试者施用VZV RNA疫苗而在受试者体内引起针对VZV的免疫反应的方法，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框架的RNA多核苷酸，由此在受试者体内引发对VZV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特异性的免疫反应，其中受试者体内的免疫反应相对于在以预防有效剂量的针对VZV的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内所引发的免疫反应而言早引发2天至10周。在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应是在用相对于RNA疫苗而言2倍至100倍剂量水平的预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早2天引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早3天引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早1周引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早2周引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早3周引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早5周引发。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于在用预防有效剂量的传统疫苗进行疫苗接种的受试者体内引发的免疫反应而言早10周引发。
本文还提供一种通过向受试者施用具有编码第一抗原性多肽的开放阅读框架的VZV RNA疫苗而在受试者体内引发针对VZV的免疫反应的方法，其中RNA多核苷酸不包括稳定元件，而且其中佐剂不与疫苗共同配制或共同施药。
广谱VZV疫苗
预期可存在人具有感染一种以上VZV菌株的风险的情形。RNA(例如，mRNA)治疗性疫苗由于多种因素而尤其符合组合疫苗接种方法，所述因素包括(但不限于)制造速度、快速调整疫苗来适应感知地理威胁的能力等等。此外，由于疫苗利用人体来产生抗原性蛋白，因此所述疫苗符合生产更大、更复杂的抗原性蛋白，从而允许在人类受试者体内适当摺叠、表面表达、抗原呈现等。为针对一种以上VZV菌株进行保护，可施用组合疫苗，所述组合疫苗包括编码第一VZV的至少一种抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)的RNA以及进一步包括编码第二VZV的至少一种抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)的RNA。RNA(mRNA)可例如在单一脂质纳米粒子(LNP)中共同配制，或者可以共同施药为目的在单独的LNP中进行配制。
鞭毛蛋白佐剂
鞭毛蛋白是约500个氨基酸的单体蛋白，其聚合形成与细菌运动相关的鞭毛。鞭毛蛋白由各种鞭毛形细菌(例如，鼠伤寒沙氏杆菌(Salmonella typhimurium))以及非鞭毛形细菌(诸如大肠杆菌(Escherichia coli))来表达。由Toll样受体5(TLR5)以及Nod样受体(NLR)Ipaf和Naip5来调节先天免疫系统细胞(树突状细胞、巨噬细胞等)对鞭毛蛋白的感测。已证实TLR和NLR在活化先天免疫反应和适应性免疫反应中具有重要作用。因此，鞭毛蛋白在疫苗中提供佐剂效应。
编码已知鞭毛蛋白多肽的核苷酸和氨基酸序列在NCBI GenBank数据库中公开可得。尤其已知来自鼠伤寒沙氏杆菌(S.Typhimurium)、幽门螺旋杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.Cholera)、粘质沙雷氏菌(S.marcesens)、痢疾志贺氏杆菌(S.flexneri)、梅毒螺旋菌(T.Pallidum)、嗜肺性退伍军人杆菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋体菌(B.burgdorferei)、难治梭状芽孢杆菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌农杆菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、克氏巴尔通体菌(B.clarridgeiae)、奇异变型杆菌(P.Mirabilis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilus)、李斯特单胞菌(L.monocytogenes)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)的鞭毛蛋白序列。
如本文所用的鞭毛蛋白多肽指的是全长鞭毛蛋白、其免疫原性片段以及与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50％序列一致性的肽。例示性鞭毛蛋白包括来自伤寒杆菌(Salmonella typhi)(UniPro输入号：Q56086)、鼠伤寒沙氏杆菌(A0A0C9DG09)、肠炎沙氏杆菌(Salmonella enteritidis)(A0A0C9BAB7)和猪瘟沙氏杆菌(Salmonella choleraesuis)(Q6V2X8)和SEQ ID NO：115-117的鞭毛蛋白。在一些实施方案中，鞭毛蛋白多肽与鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的序列一致性。
在一些实施方案中，鞭毛蛋白多肽是免疫原性片段。免疫原性片段是引起免疫反应的鞭毛蛋白部分。在一些实施方案中，免疫反应是TLR5免疫反应。免疫原性片段的一种实例是其中所有或一部分铰链区已删除或由其它氨基酸取代的鞭毛蛋白。例如，抗原性多肽可插入铰链区中。铰链区是鞭毛蛋白的高变区。鞭毛蛋白的铰链区也称为“D3结构域或D3区”、“推进结构域或推进区”、“高变结构域或高变区”和“可变结构域或可变区”。如本文所用，“至少一部分铰链区”指的是鞭毛蛋白铰链区的任何部分或整个铰链区。在其它实施方案中，鞭毛蛋白的免疫原性片段是鞭毛蛋白的20、25、30、35或40个氨基酸C末端片段。
鞭毛蛋白单体由结构域D0至D3形成。形成主干的D0和D1由串联的长α螺旋体组成并且在不同的细菌间高度保守。D1结构域包括多个适用于TLR5活化的氨基酸延伸段。整个D1结构域或结构域中的一个或多个活化区是鞭毛蛋白的免疫原性片段。D1结构域中的免疫原性区实例包括残基88至114和残基411至431(在鼠伤寒沙氏杆菌FliC鞭毛蛋白中)。在88至100区中的13个氨基酸内，在沙氏杆菌鞭毛蛋白与仍保持TLR5活化的其它鞭毛蛋白之间至少允许6次取代。因此，鞭毛蛋白的免疫原性片段包括活化TLR5并且含有与FliC的88至100中的沙氏杆菌序列(LQRVRELAVQSAN；SEQ ID NO：118)具有53％或更大一致性的13个氨基酸基序的鞭毛蛋白样序列。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括编码鞭毛蛋白与一种或多种抗原性多肽的融合蛋白的RNA。如本文所用的“融合蛋白”指的是构筑体的两种组分的连接。在一些实施方案中，抗原性多肽的羧基末端与鞭毛蛋白多肽的氨基末端融合或连接。在其它实施方案中，抗原性多肽的氨基末端与鞭毛蛋白多肽的羧基末端融合或连接。融合蛋白可包括例如与一种、两种、三种、四种、五种、六种或六种以上抗原性多肽连接的一种、两种、三种、四种、五种、六种或六种以上鞭毛蛋白多肽。当两种或两种以上鞭毛蛋白多肽和/或两种或两种以上抗原性多肽连接时，所述构筑体可称为“多聚体”。
融合蛋白的每种组分可直接彼此连接或可通过连接子连接。举例来说，连接子可以是氨基酸连接子。由RNA(例如，mRNA)疫苗编码连接融合蛋白的组分的氨基酸连接子可包括例如选自由以下各项组成的组的至少一个成员：赖氨酸残基、麸氨酸残基、丝氨酸残基和精氨酸残基。在一些实施方案中，连接子长度为1至30、1至25、1至25、5至10、5、15或5至20个氨基酸。
在其它实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括至少两种独立的RNA多核苷酸，一种编码一种或多种抗原性多肽且另一种编码鞭毛蛋白多肽。所述至少两种RNA多核苷酸可在诸如脂质纳米粒子的载剂中共同配制。
治疗性和预防性组合物
本文提供用于例如在人类和其它哺乳动物中预防、治疗或诊断VZV的组合物(例如，医药组合物)、方法、试剂盒和试剂。VZV RNA(例如，mRNA)疫苗可用作治疗剂或预防剂。所述疫苗可用在药物中来预防和/或治疗传染病。在一些实施方案中，可预期本发明的VZV疫苗用于启动免疫效应细胞，例如用于离体活化外周血液单核细胞(PBMC)，接着注入(再注入)受试者体内。
在例示性实施方案中，可将如本文所述含有RNA多核苷酸的VZV疫苗施用于受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人类受试者)，并且RNA多核苷酸经体内转译而产生抗原性多肽。
VZV RNA疫苗可经过引发以用于在细胞、组织或有机体中转译多肽(例如，抗原或免疫原)。在例示性实施方案中，所述转译在体内发生，但可预期离体、在培养物中或在体外发生所述转译的实施方案。在例示性实施方案中，使细胞、组织或有机体与有效量的含有VZV RNA疫苗的组合物相接触，所述疫苗含有具有至少一个编码抗原性多肽的可转译区的多核苷酸。
“有效量”的VZV RNA疫苗至少部分地基于标靶组织、标靶细胞类型、施药方式、多核苷酸的物理特征(例如，改性核苷的大小和程度)和VZV RNA疫苗的其它组分和其它决定因素来提供。一般而言，有效量的VZV RNA疫苗组合物提供随细胞中的抗原产量而变化的引发或补强免疫反应。一般而言，有效量的含有具有至少一种化学改性的RNA多核苷酸的VZVRNA疫苗优选地比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未改性多核苷酸的组合物更为有效。抗原产量增加可以通过细胞转染增加(经RNA疫苗转染的细胞的百分比)、自多核苷酸的蛋白转译增加、核酸降解减少(例如，由自改性的多核苷酸进行蛋白转译的持续时间增加证实)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应改变而得以证实。
术语“医药组合物”指的是活性剂与使组合物尤其适合体内或离体诊断或治疗用途的惰性或活性载剂的组合。“药学上可接受的载剂”在施用于受试者或在受试者上施用后不引起不利的生理学效应。就与活性成分相容并且能够使其稳定的意义而言，医药组合物中的载剂必须是“可接受的”。可使用一种或多种增溶剂作为用于传递活性剂的医药载剂。药学上可接受的载剂的实例包括(但不限于)生物相容性媒剂、佐剂、添加剂和稀释剂从使组合物呈一定剂型可用。其它载剂的实例包括胶状二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。其它合适的医药载剂和稀释剂以及供其使用的医药辅料在Remington′sPharmaceutical Sciences中描述。
在一些实施方案中，根据本发明的RNA疫苗(包括多核苷酸和其编码多肽)可用于治疗或预防VZV。
VZV RNA疫苗可作为主动免疫流程的部分预防性或治疗性地施用于健康受试者或在症状发作后在培育期或主动感染期的感染早期施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的本发明的RNA疫苗的量可以是对于免疫预防而言有效的量。
VZV RNA(例如，mRNA)疫苗可与其它预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是佐剂或补强剂。如本文所用，在提到预防性组合物(诸如疫苗)时，术语“补强剂”指的是额外施用的预防性(疫苗)组合物。补强剂(或补强疫苗)可在早期施用预防性组合物之后给予。初始施用预防性组合物与补强剂之间的施药时间可以是(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在例示性实施方案中，初始施用预防性组合物与补强剂之间的施药时间可以是(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方案中，类似于本领域中已知的施用不活化疫苗，VZV RNA疫苗可通过肌肉内、鼻内或皮内施用。
VZV RNA疫苗根据感染的盛行率或未满足医学需要的程度或水平而可用于各种情境中。作为一种非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防各种传染病。RNA疫苗的优越特性在于它与市售的抗病毒药相比产生大得多的抗体效价，而且比市售的抗病毒药更早地产生反应。
本文提供医药组合物，所述医药组合物包括VZV RNA疫苗和可选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的RNA疫苗组合物和/或复合物。
VZV RNA(例如，mRNA)疫苗可单独或与一种或多种其它组分结合进行配制或施用。举例来说，VZV RNA疫苗(疫苗组合物)可包含其它组分，包括(但不限于)佐剂。
在一些实施方案中，VZV RNA疫苗不包括佐剂(不含佐剂)。
VZV RNA(例如，mRNA)疫苗可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合进行配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种其它活性物质，诸如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可以是无菌的、不含热原或无菌且不含热原。医药剂(诸如疫苗组合物)的配制和/或制造中的一般考虑因素可参见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams&Wilkins，2005(其以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，VZV RNA疫苗施用于人类、人类患者或受试者。为本发明的目的，词组“活性成分”通常指的是RNA疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码抗原性多肽的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。
本文所述的疫苗组合物的配制物可以通过已知或后来在药理学技术中研发的任何方法来制备。一般而言，所述制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如，mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合，且接着如果必要和/或需要，将产物分份、成形和/或封装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本发明，医药组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量将根据接受治疗受试者的特性、体型和/或病况并且进一步根据将施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％与100％之间，例如0.5与50％之间、1至30％之间、5至80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
VZV RNA疫苗可使用一种或多种赋形剂来配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自储存配制物)；(4)改变生物分布(例如，靶向特异性组织或细胞类型)；(5)增加编码蛋白的体内转译；和/或(6)改变编码蛋白(抗原)的体内释放概况。除了传统赋形剂(诸如任何以及所有溶剂、分散液培养基、稀释剂或其它液体媒剂)以外，分散液或悬浮液助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、赋形剂可包括(不限于)类脂质、脂质粒、脂质纳米粒子、聚合物、脂质粒复合物、核壳纳米粒子、肽、蛋白、由VZV RNA疫苗转染的细胞(例如，用于移植到受试者体内)、玻尿酸酶、纳米粒子模拟物以及其组合。
稳定化元件
已发现天然产生的真核mRNA分子除了诸如5′-端帽结构或3′-聚(腺苷酸)尾的其它结构特征以外还含有稳定化元件，包括(但不限于)位于其5′-末端的非转译区(UTR)(5′UTR)和/或位于其3′-末端的非转译区(UTR)(3′UTR)。5′UTR与3′UTR两者通常都由基因组DNA转录并且是未成熟mRNA的元件。通常在mRNA加工期间向转录(未成熟)mRNA中增加成熟mRNA的特征性结构特征，诸如5′-端帽和3′-聚(腺苷酸)尾。3′-聚(腺苷酸)尾通常是增加到转录mRNA的3′-末端的腺嘌呤核苷酸的延伸段。3′-聚(腺苷酸)尾可包含多达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3′-聚(腺苷酸)尾的长度可以是对于个别mRNA的稳定性而言必需的元件。
在一些实施方案中，RNA疫苗可包括一种或多种稳定化元件。稳定化元件例如可包括组蛋白茎环。已识别出茎环结合蛋白(SLBP)，它是一种32kDa的蛋白。它与位于核和细胞质中的组蛋白信使的3′-末端的组蛋白茎环相关。它的表达水平由细胞周期来调节；在S阶段期间达到峰值，此时也评估组蛋白mRNA水平。已证实由U7 snRNP对组蛋白pre-mRNA的3′-末端进行有效加工必需蛋白。SLBP在加工后继续与茎环结合，且接着刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中转译成组蛋白。SLBP的RNA结合域在后生动物和原生动物中是保守的；它与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点相对于茎环而言包括至少三个核苷酸5′和两个核苷酸3′。
在一些实施方案中，RNA疫苗包括一个编码区、至少一个组蛋白茎环和可选的一个聚(腺苷酸)序列或多腺苷酸化信号。聚(腺苷酸)序列或多腺苷酸化信号通常应增强编码蛋白的表达水平。在一些实施方案中，编码蛋白并非组蛋白、报道体蛋白(例如，荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标记或选择蛋白(例如，α-血球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，聚(腺苷酸)序列或多腺苷酸化信号与至少一种组蛋白茎环的组合尽管实际上代表替代机制，但仍协同作用来增加蛋白表达超越由任一个别元件所观测的水平。已发现，聚(腺苷酸)与至少一种组蛋白茎环的组合的协同效应并不取决于元件的顺序或聚(腺苷酸)序列的长度。
在一些实施方案中，RNA疫苗不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括天然产生茎环的约15至20个核苷酸3′的富含嘌呤的多核苷酸延伸段，代表U7snRNA的结合位点，其在将组蛋白pre-mRNA加工为成熟组蛋白mRNA中有所涉及。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。
在一些实施方案中，RNA疫苗可含有或可不含增强子和/或启动子序列，其可以是改性或未改性的或可以是活化或未活化的。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常来源于组蛋白基因，并且包括由间隔基分开、由短序列组成的两个相邻的部分或完全相反的互补序列的分子内碱基配对，所述分子内碱基配对形成所述结构的环。非配对环区域通常无法与茎环元件的任一者碱基配对。这更常发生在RNA中，因为它是多种RNA二级结构的重要组分，但也可以存在于单股DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于错配或凸起的长度、数量以及配对区域的碱基组成。在一些实施方案中，可产生不稳定的碱基配对(非Watson-Crick碱基配对)。在一些实施方案中，至少一种组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在其它实施方案中，RNA疫苗可去除一个或多个富含AU的序列。所述序列(有时称为AURES)是在3′UTR中发现的去稳定化序列。AURES可从RNA疫苗中去除。或者，AURES可保留在RNA疫苗中。
纳米粒子配制物
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗在纳米粒子中配制。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗在脂质纳米粒子中配制。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗在脂质-聚阳离子复合物(称为阳离子脂质纳米粒子)中配制。可以通过本领域中已知的方法和/或如美国公布No.20120178702中所述的方法来实现脂质纳米粒子的形成，所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，聚阳离子可包括阳离子肽或多肽，诸如(但不限于)聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸和国际公布No.WO2012013326或美国公布No.US20130142818中所述的阳离子肽；所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗在包括非阳离子脂质，诸如(但不限于)胆固醇或二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)的脂质纳米粒子中配制。
脂质纳米粒子配制物可受(但不限于)阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质的饱和程度、聚乙二醇化的性质、所有组分的比率和生物物理学参数(诸如，尺寸)的影响。在Semple等人(Nature Biotech.2010 28：172-176；以全文引用的方式并入本文中)的一种实例中，脂质纳米粒子配制物可由57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰基磷脂酰基胆碱、34.3％胆固醇和1.4％PEG-c-DMA组成。另外举例来说，改变阳离子脂质的组成证实可更有效地将siRNA传递到各种抗原呈现细胞(Basha等人Mol Ther.2011 19：2186-2200；以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物可包含35％至45％的阳离子脂质、40％至50％的阳离子脂质、50％至60％的阳离子脂质和/或55％至65％的阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米粒子中的脂质与RNA(例如，mRNA)的比率可以是5∶1至20∶1、10∶1至25∶1、15∶1至30∶1和/或至少30∶1。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物中PEG的比率可增加或减少，和/或PEG脂质的碳链长度可改变为C14至C18以改变脂质纳米粒子配制物的药物动力学和/或生物分布。作为一种非限制性的实例，与阳离子脂质、DSPC和胆固醇相比，脂质纳米粒子配制物可含有0.5％至3.0％、1.0％至3.5％、1.5％至4.0％、2.0％至4.5％、2.5％至5.0％和/或3.0％至6.0％的脂质摩尔比的PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)(本文中也称为PEG-DOMG)。在一些实施方案中，PEG-c-DOMG可由PEG脂质替代，诸如(但不限于)PEG-DSG(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油)和/或PEG-DPG(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)。阳离子脂质可选自本领域中已知的任何脂质，诸如(但不限于)DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗配制物是包含至少一种脂质的纳米粒子。脂质可选自(但不限于)DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一-12，15-二烯-1-胺(L608)、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七-8-胺(L530)、聚乙二醇化脂质和氨基醇脂质。
在一些实施方案中，脂质为
在一些实施方案中，脂质为
在一些实施方案中，脂质可以是阳离子脂质，诸如(但不限于)DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA和氨基醇脂质。氨基醇阳离子脂质可以是美国专利公布No.US20130150625中所述和/或由其中所述的方法制得的脂质，所述专利公布以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，阳离子脂质可以是2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，2Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物1)；2-氨基-3-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物2)；2-氨基-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛基氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中的化合物3)；和2-(二甲氨基)-3-[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z，12Z)-十八-9，12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中的化合物4)；或其任何药学上可接受的盐或立体异构物。
脂质纳米粒子配制物通常包含脂质，具体来说是可电离的阳离子脂质，例如2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)或9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，并且还包含中性脂质、固醇和能够减少粒子聚集的分子，例如PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基本上由以下各项组成：(i)至少一种选自由以下各物组成的群的脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)；(ii)选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，其摩尔比为20至60％的阳离子脂质：5至25％的中性脂质：25至55％的固醇；0.5至15％的PEG-脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括25％至75％的选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)，例如基于摩尔浓度计35至65％、45至65％、60％、57.5％、50％或40％。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括0.5％至15％的中性脂质，例如基于摩尔浓度计3至12％、5至10％或15％、10％或7.5％。中性脂质的实例包括(不限于)DSPC、POPC、DPPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，配制物基于摩尔浓度计包括5％至50％的固醇(例如，基于摩尔浓度计15％至45％、20％至40％、40％、38.5％、35％或31％)。固醇的一种非限制性实例是胆固醇。在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括0.5％至20％的PEG或经PEG改性的脂质(例如，基于摩尔浓度计0.5％至10％、0.5％至5％、1.5％、0.5％、1.5％、3.5％或5％)。在一些实施方案中，PEG或经PEG改性的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。在一些实施方案中，PEG或经PEG改性的脂质包含平均分子量小于2,000，例如约1,500Da、约1,000Da或约500Da的PEG分子。经PEG改性的脂质的非限制性实例包括PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DMG)(本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(在Reyes等人，J.Controlled Release，107，276至287(2005)中进一步论述，其内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括25％至75％的选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、0.5至15％的中性脂质、5至50％的固醇和0.5至20％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括35％至65％的选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、3至12％的中性脂质、15至45％的固醇和0.5至10％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括45至65％选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、5至10％的中性脂质、25-40％的固醇和0.5至10％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括60％选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、7.5％的中性脂质、31％的固醇和1.5％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括50％选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、10％的中性脂质、38.5％的固醇和1.5％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括50％选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、10％的中性脂质、35％的固醇、4.5％或5％的PEG或经PEG改性的脂质和0.5％的标靶脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括40％选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、15％的中性脂质、40％的固醇和5％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括57.2％选自由以下各物组成的群的阳离子脂质：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、7.1％的中性脂质、34.3％的固醇和1.4％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基于摩尔浓度计包括57.5％的阳离子脂质(选自PEG脂质，其为PEG-cDMA，PEG-cDMA在Reyes等人(J.Controlled Release，107，276-287(2005))中进一步论述，其内容以全文引用的方式并入本文中)、7.5％的中性脂质、31.5％的固醇和3.5％的PEG或经PEG改性的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基本上由摩尔比为20％至70％阳离子脂质：5％至45％中性脂质：20％至55％胆固醇：0.5％至15％经PEG改性的脂质的脂质混合物组成。在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物基本上由摩尔比为20％至60％阳离子脂质：5％至25％中性脂质：25％至55％胆固醇：0.5％至15％经PEG改性的脂质的脂质混合物组成。
在一些实施方案中，脂质的摩尔比为50/10/38.5/1.5(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DPPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DSG)、50/10/35/5(阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol％阳离子脂质/中性脂质，例如DSPC/Chol/经PEG改性的脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。
脂质纳米粒子组合物及其制备方法的非限制性实例例如在Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等人(2012)，Angew.Chem.Int.编，51：8529-8533；和Maier等人(2013)Molecular Therapy 21，1570-1578(其各自的内容以全文引用的方式并入本文中)中描述。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物可包含阳离子脂质、PEG脂质和结构脂质并且可选地包含非阳离子脂质。作为一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可包含40％至60％的阳离子脂质、5％至15％的非阳离子脂质、1％至2％的PEG脂质以及30％至50％的结构脂质。作为另一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可包含50％的阳离子脂质、10％的非阳离子脂质、1.5％的PEG脂质和38.5％的结构脂质。作为又一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可包含55％的阳离子脂质、10％的非阳离子脂质、2.5％的PEG脂质和32.5％的结构脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可以是本文所述的任何阳离子脂质，诸如(但不限于)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子配制物可以是4组分脂质纳米粒子。脂质纳米粒子可包含阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG脂质以及结构脂质。作为一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可包含40％至60％的阳离子脂质、5％至15％的非阳离子脂质、1％至2％的PEG脂质以及30％至50％的结构脂质。作为另一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可包含50％的阳离子脂质、10％的非阳离子脂质、1.5％的PEG脂质和38.5％的结构脂质。作为又一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可包含55％的阳离子脂质、10％的非阳离子脂质、2.5％的PEG脂质和32.5％的结构脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可以是本文所述的任何阳离子脂质，诸如(但不限于)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA和L319。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米粒子配制物可包含阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG脂质以及结构脂质。作为一种非限制性的实例，脂质纳米粒子包含50％的阳离子脂质DLin-KC2-DMA、10％的非阳离子脂质DSPC、1.5％的PEG脂质PEG-DOMG和38.5％的结构脂质胆固醇。作为一种非限制性的实例，脂质纳米粒子包含50％的阳离子脂质DLin-MC3-DMA、10％的非阳离子脂质DSPC、1.5％的PEG脂质PEG-DOMG和38.5％的结构脂质胆固醇。作为一种非限制性的实例，脂质纳米粒子包含50％的阳离子脂质DLin-MC3-DMA、10％的非阳离子脂质DSPC、1.5％的PEG脂质PEG-DMG和38.5％的结构脂质胆固醇。作为又一种非限制性的实例，脂质纳米粒子包含55％的阳离子脂质L319、10％的非阳离子脂质DSPC、2.5％的PEG脂质PEG-DMG和32.5％的结构脂质胆固醇。
疫苗组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量可根据接受治疗受试者的特性、体型和/或病况并且进一步根据将施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含0.1％与99％(w/w)之间的活性成分。举例来说，组合物可包含0.1％与100％之间，例如0.5％与50％之间、1％至30％之间、5％至80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，RNA疫苗组合物可包含配制在包含MC3、胆固醇、DSPC以及PEG2000-DMG的脂质纳米粒子中的本文所述的多核苷酸、缓冲液柠檬酸三钠、蔗糖以及注射用水。作为一种非限制性的实例，组合物包含：2.0mg/mL的药物物质(例如，编码VZV的多核苷酸)、21.8mg/mL的MC3、10.1mg/mL的胆固醇、5.4mg/mL的DSPC、2.7mg/mL的PEG2000-DMG、5.16mg/mL的柠檬酸三钠、71mg/mL的蔗糖和1.0mL的注射用水。
在一些实施方案中，纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)具有10至500nm、20至400nm、30至300nm、40至200nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米粒子(例如，脂质纳米粒子)具有50至150nm、50至200nm、80至100nm或80至200nm的平均直径。
脂质粒、脂质体复合物和脂质纳米粒子
在一些实施方案中，RNA疫苗医药组合物可在脂质粒中配制，所述脂质粒诸如(但不限于)DiLa2脂质粒(Marina Biotech，Bothell，WA)、(Marina Biotech，Bothell，WA)、基于中性DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱)的脂质粒(例如，siRNA传递用于卵巢癌(Landen等人Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)；其以全文引用的方式并入本文中)和涂有玻尿酸的脂质粒(Quiet Therapeutics，Israel)。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在如美国公布No.US2012060293中所述的冻干凝胶相脂质粒组合物中配制，所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可包含磷酸酯结合物。磷酸酯结合物可增加体内循环次数和/或增加纳米粒子的定靶传递。用于本发明的磷酸酯结合物可由国际公布No.WO2013033438或美国公布No.US20130196948中所述的方法制得，所述公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，磷酸酯结合物可包括国际公布No.WO2013033438中所述任一式的化合物，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可包含聚合物结合物。聚合物结合物可以是水溶性结合物。聚合物结合物可具有如美国公布No.20130059360中所述的结构，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些方面中，可使用美国公布No.20130072709中所述的方法和/或嵌段聚合试剂来制备与本发明的多核苷酸的聚合物结合物，所述公布以全文引用的方式并入本文中。在其它方面中，聚合物结合物可具有包含环部分的侧位侧基，诸如(但不限于)美国公布No.US20130196948中所述的聚合物结合物，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可包含结合物来增强本发明的纳米粒子在受试者体内的传递。结合物还可以抑制纳米粒子在受试者体内的吞噬细胞清除率。在一些方面中，结合物可以是由人类膜蛋白CD47设计的“自身”肽(例如，Rodriguez等人(Science 2013，339，971-975)所述的“自身”粒子，其以全文引用的方式并入本文中)。如Rodriguez等人证实，自身肽展示巨噬细胞调节纳米粒子的清除，这增强了纳米粒子的传递。在其它方面中，结合物可以是膜蛋白CD47(例如，参见Rodriguez等人Science 2013，339，971-975，其以全文引用的方式并入本文中)。Rodriguez等人证实，类似于“自身”肽，CD47与杂乱肽和PEG涂覆纳米粒子相比可增加受试者体内的循环粒子比。
在一些实施方案中，本发明的RNA疫苗在包含结合物的纳米粒子中配制以增强本发明的纳米粒子在受试者体内的传递。结合物可以是CD47膜，或结合物可来源于CD47膜蛋白，诸如前文所述的“自身”肽。在其它实施方案中，纳米粒子可包含PEG和CD47结合物或其衍生物。又在其它实施方案中，纳米粒子可包含上文所述的“自身”肽和膜蛋白CD47。
在一些实施方案中，如本文关于传递本发明的RNA疫苗所述，“自身”肽和/或CD47蛋白可与病毒样粒子或假病毒粒子结合。
在其它实施方案中，RNA疫苗医药组合物包含本发明的多核苷酸以及可具有可降解键的结合物。结合物的非限制性实例包括包含可电离氢原子的芳族部分、间隔基部分和水溶性聚合物。作为一种非限制性的实例，包含具有可降解键的结合物的医药组合物以及用于传递所述医药组合物的方法在美国公布No.US20130184443中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可以是包含碳水化合物载剂和RNA疫苗的碳水化合物纳米粒子。作为一种非限制性的实例，碳水化合物载剂可包括(但不限于)由酸酐改性的植物糖原或肝糖型物质、植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、由酸酐改性的植物糖原β-糊精。(参见例如国际公布No.WO2012109121，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。
本发明的纳米粒子配制物可涂覆表面活性剂或聚合物来改善粒子的传递。在一些实施方案中，纳米粒子可涂覆亲水性涂料，诸如(但不限于)PEG涂料和/或具有中性表面电荷的涂料。亲水性涂料可有助于传递具有较大有效负载的纳米粒子，诸如(但不限于)中枢神经系统内的RNA疫苗。作为一种非限制性的实例，包含亲水性涂料的纳米粒子和制造所述纳米粒子的方法在美国公布No.US20130183244中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可以是亲水性聚合物粒子。亲水性聚合物粒子以及制造亲水性聚合物粒子的方法的非限制性实例在美国公布No.US20130210991中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在其它实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可以是疏水性聚合物粒子。
可以通过以称为快速消除的脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解阳离子脂质替代阳离子脂质来改善脂质纳米粒子配制物。可电离阳离子脂质(诸如(但不限于)DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA)已证实随着时间流逝在血浆和组织中积聚，并且可能是毒性的潜在来源。在大鼠体内，快速消除脂质的快速代谢可使脂质纳米粒子的耐受性和治疗指数改善1mg/kg剂量至10mg/kg剂量的数量级。包涵酶促降解酯键可以改善阳离子组分的降解和代谢概况，同时仍维持reLNP配制物的活性。酯键在内部可位于脂质链内，或者在外部可位于脂质链的末端。内部酯键可取代脂质链中的任何碳。
在一些实施方案中，内部酯键可位于饱和碳的任一侧。
在一些实施方案中，可以通过传递脂质纳米粒子引发免疫反应，所述脂质纳米粒子可包括纳米物种、聚合物和免疫原。(美国公布No.20120189700和国际公布No.WO2012099805，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。
聚合物可囊封纳米物种或部分囊封纳米物种。免疫原可以是本文所述的重组蛋白、改性的RNA和/或多核苷酸。在一些实施方案中，脂质纳米粒子可进行配制用于诸如(但不限于)针对病原体的疫苗中。
脂质纳米粒子可进行工程化来改变粒子的表面特性从而使脂质纳米粒子可渗透粘膜障壁。粘液位于诸如(但不限于)口腔(例如，口腔和食管膜和扁桃体组织)、眼睛、胃肠(例如，胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻、呼吸道(例如，鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖器(例如，阴道、子宫颈和尿道膜)的粘膜组织上。对于较高药物囊封效率和能够提供多种药物的持续传递而言，优选的大于10至200nm的纳米粒子被认为太大而无法快速扩散穿过粘膜障壁。粘液持续分泌、流出、丢弃或消化以及再循环，使得大部分截留粒子可在数秒或几小时内从粘膜组织去除。由低分子量聚乙二醇(PEG)密集涂覆的大聚合纳米粒子(直径为200nm至500nm)仅比相同粒子在水中扩散低4至6倍地扩散穿过粘液(Lai等人PNAS 2007 104(5)：1482至487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2)：158至171；其各自以全文引用的方式并入本文中)。纳米粒子的传输可使用渗透速率和/或荧光显微技术来确定，包括(但不限于)光漂白后荧光恢复(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)和高分辨率多粒子追踪(high resolution multiple particle tracking，MPT)。作为一种非限制性的实例，可渗透粘膜障壁的组合物可如美国专利No.8,241,670或国际公布No.WO2013110028中所述来制备，所述专利和公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
通过工程化来渗透粘液的脂质纳米粒子可包含聚合材料(例如，聚合核)和/或聚合物-维生素结合物和/或三嵌段共聚物。聚合材料可包括(但不限于)聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。聚合材料可以是生物可降解和/或生物相容的。生物相容性聚合物的非限制性实例在国际公布No.WO2013116804中描述，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。聚合材料可另外进行辐射。作为一种非限制性的实例，聚合材料可进行γ辐射(参见例如国际公布No.WO201282165，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。具体聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PEO-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PPO-共-D，L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、羟丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-麸氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯(诸如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷二醇(诸如聚(乙二醇)(PEG))、聚伸烷基氧化物(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(诸如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(诸如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯卤化物(诸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素(诸如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯))和其共聚物和混合物、聚二氧环己酮和其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚反丁烯二酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、PEG-PLGA-PEG和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可由共聚物涂覆或与共聚物缔合，所述共聚物诸如(但不限于)嵌段共聚物(诸如国际公布No.WO2013012476中所述的分枝聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)和(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如美国公布20120121718、美国公布20100003337和美国专利No.8,263,665，所述公布和专利各自以全文引用的方式并入本文中)。共聚物可以是通常视为安全(GRAS)的聚合物并且脂质纳米粒子的形成可通过无新的化学实体产生的方式。例如，脂质纳米粒子可包含涂覆PLGA纳米粒子的泊洛沙姆，但不形成仍能快速渗透人类粘液的新的化学实体(Yang等人Angew.Chem.Int.编2011 50：25972600；其内容以全文引用的方式并入本文中)。一种用于产生可渗透人类粘液的纳米粒子的非限制性可扩展方法由Xu等人描述(参见例如JControl Release 2013，170(2)：279-86，其内容以全文引用的方式并入本文中)。
聚合物-维生素结合物的维生素可以是维生素E。结合物的维生素部分可由其它合适组分取代，所述组分诸如(但不限于)维生素A、维生素E、其它维生素、胆固醇、疏水性部分或其它表面活性剂的疏水性组分(例如，固醇链、脂肪酸、烃链和氧化烯链)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗医药组合物可在脂质粒中配制，所述脂质粒诸如(但不限于)DiLa2脂质粒(Marina Biotech，Bothell，WA)、(Marina Biotech，Bothell，WA)、基于中性DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱)的脂质粒(例如，siRNA传递用于卵巢癌(Landen等人Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713，其以全文引用的方式并入本文中))和涂有玻尿酸的脂质粒(Quiet Therapeutics，Israel)。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在如美国公布No.US2012060293中所述的冻干凝胶相脂质粒组合物中配制，所述美国公布以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可包含磷酸酯结合物。磷酸酯结合物可增加体内循环次数和/或增加纳米粒子的定靶传递。用于本发明的磷酸酯结合物可由国际公布No.WO2013033438或美国公布No.20130196948中所述的方法制得，所述公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，磷酸酯结合物可包括国际公布No.WO2013033438中所述任一式的化合物，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可包含聚合物结合物。聚合物结合物可以是水溶性结合物。聚合物结合物可具有如美国申请No.20130059360中所述的结构，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些方面中，可使用美国专利申请No.20130072709中所述的方法和/或嵌段聚合试剂来制备本发明的多核苷酸的聚合物结合物，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。在其它方面中，聚合物结合物可具有包含环部分的侧位侧基，诸如(但不限于)美国公布No.US20130196948中所述的聚合物结合物，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可包含结合物来增强本发明的纳米粒子在受试者体内的传递。结合物还可以抑制纳米粒子在受试者体内的吞噬细胞清除率。在一些方面中，结合物可以是由人类膜蛋白CD47设计的“自身”肽(例如，Rodriguez等人(Science 2013，339，971-975)所述的“自身”粒子，其以全文引用的方式并入本文中)。如Rodriguez等人证实，自身肽展示巨噬细胞调节纳米粒子的清除，增强了纳米粒子的传递。在其它方面中，结合物可以是膜蛋白CD47(例如，参见Rodriguez等人Science 2013，339，971-975，其以全文引用的方式并入本文中)。Rodriguez等人证实，类似于“自身”肽，CD47与杂乱肽和PEG涂覆纳米粒子相比可增加受试者体内的循环粒子比。
在一些实施方案中，本发明的RNA疫苗在包含结合物的纳米粒子中配制以增强本发明的纳米粒子在受试者体内的传递。结合物可以是CD47膜，或结合物可来源于CD47膜蛋白，诸如前文所述的“自身”肽。在其它方面中，纳米粒子可包含PEG和CD47结合物或其衍生物。又在其它方面中，纳米粒子可包含上文所述的“自身”肽和膜蛋白CD47。
在其它方面中，如本文关于传递本发明的RNA疫苗所述，“自身”肽和/或CD47蛋白可与病毒样粒子或假病毒粒子结合。
在其它实施方案中，RNA疫苗医药组合物包含本发明的多核苷酸以及可具有可降解键的结合物。结合物的非限制性实例包括包含可电离氢原子的芳族部分、间隔基部分和水溶性聚合物。作为一种非限制性的实例，包含具有可降解键的结合物的医药组合物以及用于传递所述医药组合物的方法在美国公布No.US20130184443中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
纳米粒子配制物可以是包含碳水化合物载剂和RNA(例如，mRNA)疫苗的碳水化合物纳米粒子。作为一种非限制性的实例，碳水化合物载剂可包括(但不限于)由酸酐改性的植物糖原或肝糖型物质、植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、由酸酐改性的植物糖原β-糊精。(参见例如国际公布No.WO2012109121；所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。
本发明的纳米粒子配制物可涂覆表面活性剂或聚合物来改善粒子的传递。在一些实施方案中，纳米粒子可涂覆亲水性涂料，诸如(但不限于)PEG涂料和/或具有中性表面电荷的涂料。亲水性涂料可有助于传递具有较大有效负载的纳米粒子，诸如(但不限于)中枢神经系统内的RNA疫苗。作为一种非限制性的实例，包含亲水性涂料的纳米粒子以及制造所述纳米粒子的方法在美国公布No.US20130183244中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可以是亲水性聚合物粒子。亲水性聚合物粒子的非限制性实例以及制造亲水性聚合物粒子的方法在美国公布No.US20130210991中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在其它实施方案中，本发明的脂质纳米粒子可以是疏水性聚合物粒子。
可以通过以称为快速消除的脂质纳米粒子(reLNP)的生物可降解阳离子脂质替代阳离子脂质来改善脂质纳米粒子配制物。可电离阳离子脂质(诸如(但不限于)DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA)已证实随着时间流逝在血浆和组织中积聚，并且可能是毒性的潜在来源。在大鼠体内，快速消除脂质的快速代谢可使脂质纳米粒子的耐受性和治疗指数改善1mg/kg剂量至10mg/kg剂量的数量级。包涵酶促降解酯键可改善阳离子组分的降解和代谢概况，同时仍维持reLNP配制物的活性。酯键在内部可位于脂质链内，或在外部可位于脂质链的末端。内部酯键可取代脂质链中的任何碳。
在一些实施方案中，内部酯键可位于饱和碳的任一侧。
在一些实施方案中，可以通过传递脂质纳米粒子引发免疫反应，所述脂质纳米粒子可包括纳米物种、聚合物和免疫原(美国公布No.20120189700和国际公布No.WO2012099805，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。
聚合物可囊封纳米物种或部分囊封纳米物种。免疫原可以是本文所述的重组蛋白、改性的RNA和/或多核苷酸。在一些实施方案中，脂质纳米粒子可进行配制用于诸如(但不限于)针对病原体的疫苗中。
脂质纳米粒子可进行工程化来改变粒子的表面特性以使得脂质纳米粒子可渗透粘膜障壁。粘液位于诸如(但不限于)口腔(例如，口腔和食管膜和扁桃体组织)、眼睛、胃肠(例如，胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻、呼吸道(例如，鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖器(例如，阴道、子宫颈和尿道膜)的粘膜组织上。对于较高药物囊封效率和能够提供多种药物的持续传递而言优选的大于10至200nm的纳米粒子被认为太大而无法快速扩散穿过粘膜障壁。粘液持续分泌、流出、丢弃或消化和再循环，使得大部分截留粒子可在数秒或几小时内从粘膜组织去除。通过低分子量聚乙二醇(PEG)密集涂覆的大聚合纳米粒子(直径为200nm至500nm)只比相同粒子在水中扩散低4至6倍地扩散穿过粘液(Lai等人PNAS2007 104(5)：1482至487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2)：158-171；其各自以全文引用的方式并入本文中)。纳米粒子的传输可使用渗透速率和/或荧光显微技术来确定，包括(但不限于)光漂白后荧光恢复(FRAP)和高分辨率多粒子追踪(MPT)。作为一种非限制性的实例，可渗透粘膜障壁的组合物可如美国专利No.8,241,670或国际公布No.WO2013110028中所述来制备，所述专利和国际公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
通过工程化来渗透粘液的脂质纳米粒子可包含聚合材料(即，聚合核)和/或聚合物-维生素结合物和/或三嵌段共聚物。聚合材料可包括(但不限于)聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。聚合材料可以是生物可降解和/或生物相容的。生物相容性聚合物的非限制性实例在国际公布No.WO2013116804中描述，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。聚合材料可另外进行辐射。作为一种非限制性的实例，聚合材料可进行γ辐射(参见例如国际公布No.WO201282165，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。具体聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PEO-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PPO-共-D，L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、羟丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-麸氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯(诸如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷二醇(诸如聚(乙二醇)(PEG))、聚伸烷基氧化物(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(诸如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(诸如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯卤化物(诸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素(诸如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯))以及其共聚物和混合物、聚二氧环己酮以及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚反丁烯二酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、PEG-PLGA-PEG和三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可用共聚物涂覆或与共聚物缔合，所述共聚物诸如(但不限于)嵌段共聚物(诸如国际公布No.WO2013012476中所述的分枝聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)和(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如美国公布20120121718和美国公布20100003337和美国专利No.8,263,665，所述公布和专利各自以全文引用的方式并入本文中)。共聚物可以是通常视为安全(GRAS)的聚合物并且脂质纳米粒子的形成可通过无新的化学实体产生的方式。例如，脂质纳米粒子可包含涂覆PLGA纳米粒子的泊洛沙姆，但不形成仍能够快速渗透人类粘液的新的化学实体(Yang等人Angew.Chem.Int.编.2011 50：25972600；其内容以全文引用的方式并入本文中)。一种用于产生可渗透人类粘液的纳米粒子的非限制性可扩展方法由Xu等人描述(参见例如JControl Release 2013，170(2)：279-86，其内容以全文引用的方式并入本文中)。
聚合物-维生素结合物的维生素可以是维生素E。结合物的维生素部分可由其它合适组分取代，所述组分诸如(但不限于)维生素A、维生素E、其它维生素、胆固醇、疏水性部分或其它表面活性剂的疏水性组分(例如，固醇链、脂肪酸、烃链和氧化烯链)。
进行工程化来渗透粘液的脂质纳米粒子可包括表面改变剂，诸如(但不限于)多核苷酸、阴离子蛋白(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂，诸如二甲基双十八烷基-溴化铵)、糖类或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液分解剂(例如，N-乙酰基半胱氨酸、艾、凤梨酶、木瓜酶、大青属、乙酰基半胱氨酸、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocistein)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、莱托斯坦(Ietosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺素β4阿法链道酶(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))和各种DNA酶，包括rhDNA酶。表面改变剂可嵌埋或陷入粒子表面中或安置(例如，通过涂覆、吸收、共价键联或其它方法)在脂质纳米粒子的表面上(参见例如美国公布20100215580和美国公布20080166414和US20130164343，所述公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，粘液渗透脂质纳米粒子可包含至少一种本文所述的多核苷酸。多核苷酸可囊封于脂质纳米粒子中和/或安置在粒子表面上。多核苷酸可与脂质纳米粒子共价偶合。粘液渗透脂质纳米粒子的配制物可包含多个纳米粒子。另外，配制物可含有可与粘液相互作用并改变周围粘液的结构和/或粘附特性的粒子来减小可增加粘液渗透脂质纳米粒子传递到粘膜组织的粘膜粘附。
在其它实施方案中，粘液渗透脂质纳米粒子可以是包含粘膜渗透增强涂料的低渗压配制物。配制物对于其所传递的上皮细胞可具有低渗压。
低渗压配制物的非限制性实例可见于国际公布No.WO2013110028中，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，为增强通过粘膜障壁的传递，RNA疫苗配制物可包含低渗压溶液或者可以是低渗压溶液。发现低渗压溶液可增加粘膜惰性粒子(诸如(但不限于)粘液渗透粒子)能够到达阴道上皮表面的速率(参见例如Ensign等人Biomaterials 2013，34(28)：6922-9，其内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，RNA疫苗被配制成脂质体复合物(lipoplex)，诸如(不限于)来自Silence Therapeutics(London，United Kingdom)的ATUPLEXTM系统、DACC系统、DBTC系统和其它siRNA-脂质体复合技术，来自(Cambridge，MA)的STEMFECTTM以及基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白定靶和非定靶传递核酸(Aleku等人Cancer Res.2008 68：9788-9798；Strumberg等人Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50：76-78；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Kaufmann等人Microvasc Res 2010 80：286-293；Weide等人J Immunother.2009 32：498-507；Weide等人J Immunother.2008 31：180-188；Pascolo，Expert Opin.Biol.Ther.4：1285-1294；Fotin-Mleczek等人，2011J.Immunother.34：1-15；Song等人，Nature Biotechnol.2005，23：709-717；Peer等人，ProcNatl Acad Sci USA.2007 6；104：4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19：125-132；其各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，也可以构建所述配制物或改变其组成以使其被动地或主动地通过体内导向不同的细胞类型，包括(但不限于)肝细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、抗原呈现细胞和白血球(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；Song等人，NatBiotechnol.2005 23：709-717；Judge等人，J Clin Invest.2009 119：661-673；Kaufmann等人，Microvasc Res 2010 80：286-293；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.201023：334-344；Basha等人，Mol.Ther.2011 19：2186-2200；Fenske和Cullis，Expert OpinDrug Deliv.2008 5：25-44；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer和Lieberman，Gene Ther.2011 18：1127-1133；其各自以全文引用的方式并入本文中)。将配制物被动靶向肝细胞的一种实例包括基于DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA的脂质纳米粒子配制物，其已证实结合至脂蛋白元E并促使所述配制物通过体内结合且吸收到肝细胞中(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；其以全文引用的方式并入本文中)。如(但不限于)叶酸盐、转铁蛋白、N-乙酰基半乳胺糖(GaINAc)和抗体靶向方法所例示，也可以通过在其表面上表达不同的配位体来选择性地靶向配制物(Kolhatkar等人，Curr Drug DiscovTechnol.2011 8：197-206；Musacchio和Torchilin，Front Biosci.2011 16：1388-1412；Yu等人，Mol Membr Biol.2010 27：286-298；Patil等人，Crit Rev Ther Drug CarrierSyst.2008 25：1-61；Benoit等人，Biomacromolecules.2011 12：2708-2714；Zhao等人，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：309-319；Akinc等人，Mol Ther.2010 18：1357-1364；Srinivasan等人，Methods Mol Biol.2012 820：105-116；Ben-Arie等人，Methods MolBiol.2012 757：497-507；Peer 2010 J Control Release.20：63-68；Peer等人，Proc NatlAcad Sci U S A.2007 104：4095-4100；Kim等人，Methods Mol Biol.2011 721：339-353；Subramanya等人，Mol Ther.2010 18：2028-2037；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer和Lieberman，Gene Ther.2011 18：1127-1133；其各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗被配制成固体脂质纳米粒子。固体脂质纳米粒子(SLN)可以是平均直径在至1000nm之间的球形。SLN具有可溶解亲脂性分子的固体脂质核基质并且可以由表面活性剂和/或乳化剂稳定。在其它实施方案中，脂质纳米粒子可以是自组装的脂质-聚合物纳米粒子(参见Zhang等人，ACS Nano，2008，2(8)，第1696至1702页；其内容以全文引用的方式并入本文中)。作为一种非限制性的实例，SLN可以是国际公布No.WO2013105101中所述的SLN，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。作为另一种非限制性的实例，SLN可由国际公布No.WO2013105101中所述的方法或制程来制备，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
脂质粒、脂质体复合物或脂质纳米粒子可用于改善多核苷酸定向蛋白生产的功效，因为所述配制物能够增加RNA疫苗的细胞转染；和/或增加编码蛋白的转译。一种此实例包涵使用脂质囊封以便可有效地全身传递复合物质粒DNA(Heyes等人，Mol Ther.2007 15：713-720；其以全文引用的方式并入本文中)。脂质粒、脂质体复合物或脂质纳米粒子也可以用于增加多核苷酸的稳定性。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可进行配制用于受控释放和/或靶向传递。如本文所用，“受控释放”指的是符合特定释放模式来实现治疗结果的医药组合物或化合物释放概况。在一些实施方案中，RNA疫苗可囊封在本文所述和/或本领域中已知的用于受控释放和/或靶向传递的传递剂中。如本文所用，术语“囊封”意思是围绕、包围或包装。在与本发明化合物的配制物相关时，囊封可以是实质上、完全或部分的。术语“实质上囊封”意思是至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本发明的医药组合物或化合物可由传递剂围绕、包围或包装。“部分囊封”意思是小于10％、10％、20％、30％、40％、50％或50％以下的本发明的医药组合物或化合物可由传递剂围绕、包围或包装。有利的是，囊封可以通过使用荧光和/或电子纤维照片测量本发明的医药组合物或化合物的泄露或活性来确定。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的本发明的医药组合物或化合物囊封在传递剂中。
在一些实施方案中，受控释放配制物可包括(但不限于)三嵌段共聚物。作为一种非限制性的实例，配制物可包括两种不同类型的三嵌段共聚物(国际公布No.WO2012131104和No.WO2012131106；所述国际公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在其它实施方案中，RNA疫苗可囊封在脂质纳米粒子或快速消除的脂质纳米粒子中并且脂质纳米粒子或快速消除的脂质纳米粒子接着可囊封在本文所述和/或本领域中已知的聚合物、水凝胶和/或手术密封剂中。作为一种非限制性的实例，聚合物、水凝胶或手术密封剂可以是PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics，Inc.Alachua，FL)、(Halozyme Therapeutics，San Diego CA)、手术密封剂(诸如纤维蛋白原聚合物(Ethicon Inc.Cornelia，GA))、(Baxter International，Inc Deerfield，IL)、基于PEG的密封剂和(Baxter International，IncDeerfield，IL)。
在其它实施方案中，脂质纳米粒子可囊封在本领域中已知的在注射到受试者体内时可形成凝胶的任何聚合物。作为另一种非限制性的实例，脂质纳米粒子可囊封在可生物降解的聚合物基质中。
在一些实施方案中，用于受控释放和/或靶向传递的RNA疫苗配制物也可以包括至少一种受控释放涂层。受控释放涂层包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、EUDRAGITEUDRAGIT和纤维素衍生物，诸如乙基纤维素水性分散液和
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗受控释放和/或靶向传递配制物可包含至少一种可含有聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括(但不限于)聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)以及其组合。在其它实施方案中，可降解聚酯可包括PEG共轭来形成聚乙二醇化聚合物。
在一些实施方案中，包含至少一种多核苷酸的RNA疫苗受控释放和/或靶向传递配制物可包含至少一种如美国专利No.8,404,222中所述的PEG和/或PEG相关聚合物衍生物，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
在其它实施方案中，包含至少一种多核苷酸的RNA疫苗受控释放传递配制物可以是美国公布No.20130130348中所述的受控释放聚合物系统，所述公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封在治疗性纳米粒子中，在本文中称为“治疗性纳米粒子RNA疫苗”。治疗性纳米粒子可由本文所述并且在本领域中已知的方法来配制，本领域诸如(但不限于)国际公布No.WO2010005740、No.WO2010030763、No.WO2010005721、No.WO2010005723、No.WO2012054923、美国公布No.US20110262491、No.US20100104645、No.US20100087337、No.US20100068285、No.US20110274759、No.US20100068286、No.US20120288541、No.US20130123351和No.US20130230567和美国专利No.8,206,747、No.8,293,276、No.8,318,208和No.8,318,211，所述公布和专利各自的内容以全文引用的方式并入本文中。在其它实施方案中，治疗性聚合物纳米粒子可由美国公布No.US20120140790中所述的方法来标识，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子RNA疫苗可配制成用于持续释放。如本文所用，“持续释放”指的是在规定时间段内符合一定释放速率的医药组合物或化合物。所述时间段可包括(但不限于)数小时、数天、数周、数月和数年。作为一种非限制性的实例，持续释放纳米粒子可包含聚合物和治疗剂，诸如(但不限于)本发明的多核苷酸(参见国际公布第2010075072和美国公布No.US20100216804、No.US20110217377和No.US20120201859，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一种非限制性实例中，持续释放配制物可包含允许持续生物可用性的药剂，诸如(但不限于)晶体、大分子凝胶和/或微粒悬浮液(参见美国公布No.US20130150295，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子RNA疫苗可配制成具有标靶特异性。作为一种非限制性的实例，治疗性纳米粒子可包括皮质类固醇(参见国际公布No.WO2011084518，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。作为一种非限制性的实例，治疗性纳米粒子可在国际公布No.WO2008121949、No.WO2010005726、No.WO2010005725、No.WO2011084521和美国公布No.US20100069426、No.US20120004293和No.US20100104655中所述的纳米粒子中配制，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可包含聚合基质。作为一种非限制性的实例，纳米粒子可包含两种或两种以上聚合物，诸如(但不限于)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、多元羟基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子包含二嵌段共聚物。在一些实施方案中，二嵌段共聚物可包括与诸如(但不限于)以下的聚合物组合的PEG：聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、多元羟基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或其组合。又在其它实施方案中，二嵌段共聚物可以是诸如国际公布No.WO2013120052中所述的那些高-X二嵌段共聚物，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
作为一种非限制性的实例，治疗性纳米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公布No.US20120004293和美国专利No.8,236,330，所述公布和专利各自以全文引用的方式并入本文中)。在另一种非限制性实例中，治疗性纳米粒子是包含PEG与PLA或PEG与PLGA的二嵌段共聚物的隐形纳米粒子(参见美国专利No.8,246,968和国际公布No.WO2012166923，所述专利和国际公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中)。又在另一种非限制性实例中，治疗性纳米粒子是如美国公布No.20130172406中所述的隐形纳米粒子或标靶特异性隐形纳米粒子，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含多嵌段共聚物(参见例如美国专利No.8,263,665和No.8,287,910和美国公布No.20130195987，所述专利和公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中)。
又在另一种非限制性实例中，脂质纳米粒子包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG(参见例如，热敏性水凝胶(PEG-PLGA-PEG)，它在Lee等人“Thermosensitive Hydrogel as aTGF-β1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.”PharmaceuticalResearch，2003 20(12)：1995-2000中用作TGF-β1基因传递媒剂；并且在Li等人“Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive BiodegradableHydrogel”Pharmaceutical Research 2003 20(6)：884-888中用作受控基因传递系统；以及Chang等人，“Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymerenhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.”J ControlledRelease.2007 118：245-253；其各自以全文引用的方式并入本文中)。本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物的脂质纳米粒子中配制。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物可包括在包含非聚合微胞和嵌段共聚物的聚离子复合物中。(参见例如美国公布No.20120076836，所述公布以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种丙烯酸系聚合物。丙烯酸系聚合物包括(但不限于)丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸与甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙氧基甲基丙烯酸乙酯、氰基甲基丙烯酸乙酯、氨基甲基丙烯酸烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯以及其组合。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种聚(乙烯基酯)聚合物。聚(乙烯基酯)聚合物可以是共聚物，诸如无规共聚物。作为一种非限制性的实例，无规共聚物可具有诸如国际公布第WO2013032829或美国公布No.20130121954中所述的那些结构，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些方面中，聚(乙烯基酯)聚合物可与本文所述的多核苷酸结合。在其它方面中，可用于本发明中的聚(乙烯基酯)聚合物可以是所述的那些。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种二嵌段共聚物。二嵌段共聚物可以是(但不限于)聚(乳酸)-聚(乙二醇)共聚物(参见例如国际公布No.WO2013044219；所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。作为一种非限制性的实例，治疗性纳米粒子可用于治疗癌症(参见国际公布No.WO2013044219，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种本文中所述和/或本领域中已知的阳离子聚合物。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种含胺聚合物，诸如(但不限于)聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰氨基胺)树枝状聚合物、聚(β-氨基酯)(参见例如美国专利No.8,287,849，所述专利以全文引用的方式并入本文中)以及其组合。在其它实施方案中，本文所述的纳米粒子可包含胺阳离子脂质，诸如国际公布No.WO2013059496中所述的那些，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些方面中，阳离子脂质可具有氨基-胺或氨基-酰胺部分。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可包含至少一种可降解聚酯，其可含有聚阳离子侧链。可降解聚酯包括(但不限于)聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)以及其组合。在其它实施方案中，可降解聚酯可包括PEG共轭物以形成聚乙二醇化聚合物。
在其它实施方案中，治疗性纳米粒子可包括至少一种标靶配位体的共轭物。标靶配位体可以是本领域中已知的任何配位体，诸如(但不限于)单株抗体(Kirpotin等人，Cancer Res.2006 66：6732-6740，其以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子可在水溶液中配制，其可用于标靶癌症(参见国际公布No.WO2011084513和美国公布No.20110294717，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，治疗性纳米粒子RNA疫苗，例如包含至少一种RNA疫苗的治疗性纳米粒子可使用Podobinski等人在美国专利No.8,404,799中所述的方法来配制，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封在合成性纳米载剂中、连接到合成性纳米载剂和/或与合成性纳米载剂缔合。合成性纳米载剂包括(但不限于)国际公布No.WO2010005740、No.WO2012149454和No.WO2013019669，以及美国公布No.US20110262491、No.US20100104645、No.US20100087337和No.US20120244222中所述的那些合成性纳米载剂，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。合成性纳米载剂可使用本领域中已知和/或本文所述的方法来配制。作为一种非限制性的实例，合成性纳米载剂可由国际公布No.WO2010005740、No.WO2010030763和No.WO201213501，以及美国公布No.US20110262491、No.US20100104645、No.US20100087337和No.US2012024422中所述的方法来配制，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。在其它实施方案中，合成性纳米载剂配制物可由国际公布No.WO2011072218和美国专利No.8,211,473中所述的方法来冻干，所述国际公布和专利各自的内容以全文引用的方式并入本文中。又在其它实施方案中，包括(但不限于)合成性纳米载剂的本发明的配制物可由美国公布No.20130230568中所述的方法来冻干或复水，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可含有反应性基团来释放本文所述的多核苷酸(参见国际公布No.WO20120952552和美国公布No.US20120171229，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可含有免疫刺激剂来增强来自传递合成性纳米载剂的免疫反应。作为一种非限制性的实例，合成性纳米载剂可包含可增强免疫系统的基于Th1的反应的Th1免疫刺激剂(参见国际公布No.WO2010123569和美国公布No.20110223201，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可配制成用来靶向释放。在一些实施方案中，合成性纳米载剂进行配制从而在规定的pH下和/或在所需的时间间隔后释放多核苷酸。作为一种非限制性的实例，合成性纳米粒子可配制成在24小时后和/或在4.5的pH下释放RNA疫苗(参见国际公布No.WO2010138193和No.WO2010138194和美国公布No.US20110020388和No.US20110027217，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可配制成用来受控和/或持续释放本文所述的多核苷酸。作为一种非限制性的实例，用于持续释放的合成性纳米载剂可由本领域中已知、本文所述和/或如国际公布No.WO2010138192和美国公布No.20100303850中所述的方法来配制，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，RNA疫苗可配制成用来受控和/或持续释放，其中所述配制物包含至少一种聚合物，所述聚合物为结晶侧链(CYSC)聚合物。CYSC聚合物在美国专利No.8,399,007中描述，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可配制成用作疫苗。在一些实施方案中，合成性纳米载剂可囊封至少一种编码至少一种抗原的多核苷酸。作为一种非限制性的实例，合成性纳米载剂可包括至少一种抗原以及用于疫苗剂型的赋形剂(参见国际公布No.WO2011150264和美国公布No.20110293723，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。作为另一种非限制性的实例，疫苗剂型可包括至少两种具有相同或不同抗原和赋形剂的合成性纳米载剂(参见国际公布No.WO2011150249和美国公布No.20110293701，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中)。疫苗剂型可由本文所述、本领域中已知和/或国际公布No.WO2011150258和美国公布No.US20120027806中所述的方法来选择，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可包含至少一种编码至少一种佐剂的多核苷酸。作为非限制性实例，佐剂可包含二甲基双十八烷基溴化铵、二甲基双十八烷基氯化铵、二甲基双十八烷基磷酸铵或二甲基双十八烷基乙酸铵(DDA)和分枝杆菌属的总脂质萃取物的非极性部分或所述非极性部分的部分(参见例如美国专利No.8,241,610；所述专利以全文引用的方式并入本文中)。在其它实施方案中，合成性纳米载剂可包含至少一种多核苷酸和佐剂。作为一种非限制性的实例，包含佐剂的合成性纳米载剂可由国际公布No.WO2011150240和美国公布No.US20110293700中所述的方法来配制，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可囊封至少一种编码来自病毒的肽、片段或区域的多核苷酸。作为一种非限制性的实例，合成性纳米载剂可包括(但不限于)国际公布No.WO2012024621、No.WO201202629、No.WO2012024632和美国公布No.US20120064110、No.US20120058153和No.US20120058154中所述的纳米载剂，所述公布各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，合成性纳米载剂可与能够触发体液性和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的多核苷酸偶合(参见例如国际公布No.WO2013019669，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，RNA疫苗可囊封在两性离子脂质中、连接到两性离子脂质和/或与两性离子脂质缔合。两性离子脂质的非限制性实例以及使用两性离子脂质的方法在美国公布No.20130216607中描述，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些方面中，两性离子脂质可用在本文所述的脂质粒和脂质纳米粒子中。
在一些实施方案中，如美国公布No.20130197100中所述，RNA疫苗可在胶体纳米载剂中配制，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，纳米粒子可进行优化以用于口服。纳米粒子可包含至少一种阳离子生物聚合物，诸如(但不限于)几丁聚糖或其衍生物。作为一种非限制性的实例，纳米粒子可由美国公布No.20120282343中所述的方法来配制；所述公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，LNP包含脂质KL52(美国申请公布No.2012/0295832中公开的氨基-脂质，所述申请公布全文明确以引用的方式并入本文中)。可以通过并入所述脂质来改善LNP施药的活性和/或安全性(如通过检查ALT/AST、白血球计数和细胞介素引发中的一种或多种来测量)。包含KL52的LNP可以通过静脉内施用和/或通过一次或多次给药来施用。在一些实施方案中，施用包含KL52的LNP与包含MC3的LNP相比导致相等或改善的mRNA和/或蛋白表达。
在一些实施方案中，RNA疫苗可以使用较小的LNP来传递。所述粒子可包含低于0.1μm直至100nm的直径，诸如(但不限于)小于0.1μm、小于1.0μm、小于5μm、小于10μm、小于15μm、小于20μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于125μm、小于150μm、小于175μm、小于200μm、小于225μm、小于250μm、小于275μm、小于300μm、小于325μm、小于350μm、小于375μm、小于400μm、小于425μm、小于450μm、小于475μm、小于500μm、小于525μm、小于550μm、小于575μm、小于600μm、小于625μm、小于650μm、小于675μm、小于700μm、小于725μm、小于750μm、小于775μm、小于800μm、小于825μm、小于850μm、小于875μm、小于900μm、小于925μm、小于950μm或小于975μm。
在其它实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗可以使用较小的LNP来传递，所述较小的LNP可包含约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nm、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm的直径。
在一些实施方案中，使用包含微流体混合器的方法来合成所述LNP。例示性微流体混合器可包括(但不限于)狭缝数位间微混合器，包括(但不限于)Microinnova(Allerheiligen bei Wildon，Austria)制造的那些微混合器和/或交错人字形微混合器(SHM)(Zhigaltsev，I.V.等人，Bottom-up design and synthesis of limit size lipidnanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecondmicrofluidic mixing have been published(Langmuir.2012.28：3633-40；Belliveau，N.M.等人，Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipidnanoparticles for in vivo delivery of siRNA.Molecular Therapy-NucleicAcids.2012.1：e37；Chen，D.等人，Rapid discovery of potent siRNA-containing lipidnanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.J Am ChemSoc.2012.134(16)：6948-51；其各自以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，产生包含SHM的LNP的方法还包括将至少两种输入流混合，其中通过微结构引发的混沌对流(microstructure-induced chaotic advection，MICA)来进行混合。根据此方法，流体流流经以人字形图案形式存在的通道，导致旋转流动并使流体在彼此周围摺叠。这种方法也可包含供流体混合的表面，其中所述表面在流体循环期间改变方向。使用SHM产生LNP的方法包括美国申请公布No.2004/0262223和No.2012/0276209中公开的那些方法，所述申请公布各自以全文引用的方式明确并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的RNA疫苗可在使用微混合器产生的脂质纳米粒子中配制，所述微混合器诸如(但不限于)狭缝数位间微结构混合器(SIMM-V2)或标准狭缝数位间微混合器(SSIMM)或来自Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH，Mainz Germany的履带装置(Caterpillar，CPMM)或冲击-喷射(Impinging-jet，IJMM)。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微流体技术产生的脂质纳米粒子中配制(参见Whitesides，George M.The Origins and the Future ofMicrofluidics.Nature，2006 442：368-373；和Abraham等人Chaotic Mixer forMicrochannels.Science，2002 295：647-651；其各自以全文引用的方式并入本文中)。作为一种非限制性的实例，受控微流体配制物包括一种被动方法用于以低雷诺数(Reynoldsnumber)在微通道中混合稳压驱动流的流动(参见例如Abraham等人Chaotic Mixer forMicrochannels.Science，2002 295：647-651；其以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微混合器芯片产生的脂质纳米粒子中配制，诸如(但不限于)来自Harvard Apparatus(Holliston，MA)或Dolomite Microfluidics(Royston，UK)的那些。微混合器芯片可用于通过分流和重组机制快速混合两种或两种以上流体流。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可配制成使用国际公布No.WO2013063468或美国专利No.8,440,614中所述的药物囊封微球体来传递，所述国际公布和专利各自以全文引用的方式并入本文中。微球体可包含如国际公布No.WO2013063468中所述的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。在其它方面中，氨基酸、肽、多肽、脂质(APPL)适用于将本发明的RNA疫苗传递到细胞中(参见国际公布No.WO2013063468，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在脂质纳米粒子中配制，所述脂质纳米粒子具有约10至约100nm的直径，诸如(但不限于)约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70nm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm约50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可具有约10至500nm的直径。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子可具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。
在一些方面中，脂质纳米粒子可以是国际公布No.WO2013059922中所述的极限尺寸脂质纳米粒子，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。极限尺寸脂质纳米粒子可包含围绕含水核或疏水核的脂质双层；其中脂质双层可包含磷脂，诸如(但不限于)二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂、C8-C20脂肪酸二酰基磷脂酰胆碱和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。在其它方面中，极限尺寸脂质纳米粒子可包含聚乙二醇-脂质，诸如(但不限于)DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG和DSPE-PEG。
在一些实施方案中，可使用国际公布No.WO2013063530中所述的传递方法使RNA疫苗在特定位置处传递、定位和/或集中于特定位置，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，可在向受试者传递RNA疫苗之前、与此同时或在此之后向受试者施用空的聚合粒子。空的聚合粒子一旦与受试者接触，就会经历体积变化，并且安置、嵌埋、固定或截留于受试者体内的特定位置处。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在活性物质释放系统中配制(参见例如美国公布No.US20130102545，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。活性物质释放系统可包含1)与催化活性核酸杂合的寡核苷酸抑制剂链粘结的至少一种纳米粒子以及2)与治疗活性物质(例如，本文所述的多核苷酸)粘结的至少一种受质分子粘结的化合物，其中通过催化活性核酸裂解受质分子来释放治疗活性物质。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在纳米粒子中配制，所述纳米粒子包括包含非细胞物质的内部核和包含细胞膜的外表面。细胞膜可来源于细胞或来源于病毒的膜。作为一种非限制性的实例，纳米粒子可由国际公布No.WO2013052167中所述的方法来制备，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。作为另一种非限制性的实例，国际公布No.WO2013052167中所述的纳米粒子可用于传递本文所述的RNA疫苗，所述公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，RNA疫苗可在由多孔纳米粒子支撑的脂质双层(原始细胞)中配制。原始细胞在国际公布No.WO2013056132中描述，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本文所述的RNA疫苗可在如美国专利No.8,420,123和No.8,518,963和欧洲专利No.EP2073848B1中所述的聚合纳米粒子中配制或由其中所述的方法来制备，所述专利各自的内容以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，聚合纳米粒子可具有高玻璃转变温度，诸如美国专利No.8,518,963中所述的纳米粒子或由其中所述的方法制备的纳米粒子，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。作为另一种非限制性的实例，用于口服和非经肠配制物的聚合物纳米粒子可由欧洲专利No.EP2073848B1中所述的方法来制备，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
在其它实施方案中，本文所述的RNA(例如，mRNA)疫苗可在用于成像的纳米粒子中配制。纳米粒子可以是诸如美国公布No.20130129636中所述的那些脂质粒纳米粒子，所述公布以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性的实例，脂质粒可包含2-{4，7-双-羧基甲基-10-[(N，N-二硬脂酰基酰氨基甲基-N′-酰氨基-甲基]-1，4，7，10-四-氮杂环十二-1-基}-乙酸钆(III)和中性完全饱和磷脂组分(参见例如美国公布No.US20130129636，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，可用于本发明的纳米粒子由美国专利申请No.20130130348中所述的方法形成，所述专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
本发明的纳米粒子还可以包括营养素，诸如(但不限于)其缺少可导致贫血至神经管缺损的健康危害的那些营养素(参见例如国际专利公布No.WO2013072929中所述的纳米粒子，所述专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。作为一种非限制性的实例，营养素可以是亚铁盐、铁盐或铁元素形式的铁、碘、叶酸、维生素或微量营养素。
在一些实施方案中，本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在可膨胀纳米粒子中配制。可膨胀纳米粒子可以是(但不限于)美国专利No.8,440,231中所述的那些纳米粒子，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。作为一种非限制性实施方案，可膨胀纳米粒子可用于将本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗传递到肺系统(参见例如美国专利No.8,440,231，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中)。
本发明的RNA(例如，mRNA)疫苗可在诸如(但不限于)美国专利No.8,449,916中所述的那些聚酸酐纳米粒子中配制，所述专利的内容以全文引用的方式并入本文中。本发明的纳米粒子和微米粒子可进行几何学工程化来调节巨噬细胞和/或免疫反应。在一些方面中，经过几何学工程化的粒子可具有不同的形状、大小和/或表面电荷来合并本发明的多核苷酸，从而用于靶向传递，诸如(但不限于)肺传递(参见例如国际公布No.WO2013082111，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。几何学工程化粒子可具有的其它物理特征包括(但不限于)可改变与细胞和组织的相互作用的开窗术、角度臂、非对称性和表面粗糙度、电荷。作为一种非限制性的实例，本发明的纳米粒子可由国际公布No.WO2013082111中所述的方法来制备，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可以是诸如(但不限于)国际公布No.WO2013090601中所述的那些水溶性纳米粒子，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。纳米粒子可以是具有致密和两性离子配位体的无机纳米粒子来展示良好的水溶解性。纳米粒子也可以具有小流体动力学直径(HD)、关于时间、pH和盐度的稳定性以及低水平的非特异性蛋白结合。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子可由美国公布No.US20130172406中所述的方法研发，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明的纳米粒子是诸如(但不限于)美国公布No.20130172406中所述的那些隐形纳米粒子或标靶特异性隐形纳米粒子，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。本发明的纳米粒子可由美国公布No.20130172406中所述的方法来制备，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在其它实施方案中，隐形或标靶特异性隐形纳米粒子可包含聚合基质。聚合基质可包含两种或两种以上聚合物，诸如(但不限于)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、多元羟基酸、聚反丁烯二酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷氮烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酸酐、聚醚、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其组合。
在一些实施方案中，纳米粒子可以是具有高密度核酸层的纳米粒子-核酸混合结构。作为一种非限制性的实例，纳米粒子-核酸混合结构可由美国公布No.20130171646中所述的方法来制备，所述公布的内容以全文引用的方式并入本文中。纳米粒子可包含核酸，诸如(但不限于)本文所述和/或本领域中已知的多核苷酸。
本发明的至少一种纳米粒子可嵌埋在核纳米结构中或用低密度多孔3-D结构或能够在纳米结构内或表面上携带或缔合至少一种有效负载的涂料涂覆。包含至少一种纳米粒子的纳米结构的非限制性实例在国际公布No.WO2013123523中描述，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
疫苗施用模式
VZV RNA(例如，mRNA)疫苗可以通过产生治疗有效结果的任何途径来施用。所述途径包括(但不限于)皮内、肌肉内、鼻内和/或皮下施药。本发明提供包括向有此需要的受试者施用RNA疫苗的方法。所需确切量将根据受试者的物种、年龄和一般病况、疾病的严重性、特定组合物、其施药模式、其活性模式等等而在受试者之间变化。VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物通常配制成单位剂型以便于施药以及剂量的均一性。然而应了解，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物的每日总用量可由主治医师在合理医学判断的范畴内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当成像剂量水平将取决于各种因素，包括受治疗的病症和病症的严重性；所采用具体化合物的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施药时间、施药途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用具体化合物组合或同步使用的药物和医学技术中熟知的类似因素。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可以按足以每天按受试者体重计传递0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg的剂量水平每天、每周、每月等施用一次或多次来获得所需的治疗、诊断、预防或成像作用(例如参见国际公布No.WO2013078199中所述的单位剂量范围，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中)。所需剂量可按每天三次、每天两次、每天一次、每个一天、每三天、每周、每两周、每三周、每四周、每2个月、每三个月、每6个月等来传递。在某些实施方案中，所需剂量可使用多次施药来传递(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或十四次以上施药)。当采用多次施药时，可使用诸如本文所述的那些分开给药方案。在例示性实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可按足以传递0.0005mg/kg至0.01mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约0.0075mg/kg，例如约0.0005mg/kg、约0.001mg/kg、约0.002mg/kg、约0.003mg/kg、约0.004mg/kg或约0.005mg/kg的剂量水平来施用。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可按足以传递0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg的剂量水平施用一次或两次(或两次以上)。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可按0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg的总剂量或按足以传递0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg的总剂量的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。本发明涵盖更高和更低的施药剂量和频率。例如，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可施用三次或四次。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗组合物可按0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg的总剂量或按足以传递0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg的总剂量的剂量水平施用两次(例如，第0天和第7天、第0天和第14天、第0天和第21天、第0天和第28天、第0天和第60天、第0天和第90天、第0天和第120天、第0天和第150天、第0天和第180天、第0天和3个月后、第0天和6个月后、第0天和9个月后、第0天和12个月后、第0天和18个月后、第0天和2年后、第0天和5年后或第0天和10年后)。
在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗是以10μg/kg与400μg/kg之间的核酸疫苗单次剂量向受试者施用对受试者进行有效疫苗接种的量。在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的RNA疫苗是以10μg与400μg之间的核酸疫苗单次剂量向受试者施用对受试者进行有效疫苗接种的量。在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗是以25至1000μg之间的单次剂量向受试者施用(例如，单次剂量的编码VZV抗原的mRNA)。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗是以25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg的单次剂量向受试者施用。例如，VZV RNA疫苗可以按25至100、25至500、50至100、50至500、50至1000、100至500、100至1000、250至500、250至1000或500至1000μg的单次剂量向受试者施用。在一些实施方案中，用于对受试者进行疫苗接种的方法中的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗是按两次剂量向受试者施用，两次剂量的组合等同于25至1000μg的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗。
本文所述的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗医药组合物可配制成本文所述的剂型，诸如鼻内、气管内或可进行注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌肉内、皮内、心脏内、腹膜内和皮下)。
VZV RNA疫苗配制物以及使用方法
本发明的一些方面提供VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的配制物，其中VZV RNA疫苗按有效量配制以在受试者体内产生抗原特异性免疫反应(例如，产生对抗-VZV抗原性多肽具有特异性的抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫反应的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的剂量。本文还提供在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法。
在一些实施方案中，通过测量在施用了如本文提供的VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价来特征化抗原特异性免疫反应。抗体效价是对受试者体内的抗体量的测量，所述抗体例如对特定抗原(例如，抗-VZV抗原性多肽)或抗原的表位具有特异性的抗体。抗体效价通常表述为提供一种积极结果的最大稀释度的倒数。酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)是例如用于确定抗体效价的常用分析。
在一些实施方案中，使用抗体效价来评估受试者是否感染或确定是否需要免疫。在一些实施方案中，使用抗体效价来确定自体免疫反应的强度、确定是否需要补强剂免疫、确定先前的疫苗是否有效以及识别任何最近或先前的感染。根据本发明，可使用抗体效价来确定由VZV RNA(例如，mRNA)疫苗在受试者体内引发的免疫反应的强度。
在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少1log。例如，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3log。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了1、1.5、2、2.5或3log。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了1至3log。例如，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言可增加1至1.5、1至2、1至2.5、1至3、1.5至2、1.5至2.5、1.5至3、2至2.5、2至3或2.5至3log。
在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少2倍。例如，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言可增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了2至10倍。例如，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言可增加2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9或9至10倍。
在一些实施方案中，对照值是在未施用VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照值是在施用了活的减毒VZV疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。减毒疫苗是通过减小活疫苗(活的)的毒性所产生的疫苗。减毒病毒以使其相对于活的未改性病毒而言无害或毒性较小的方式进行改变。在一些实施方案中，对照值是在施用了不活化VZV疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照值是在施用了重组或纯化VZV蛋白疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如，细菌或酵母)中产生或由大量病原有机体纯化的蛋白抗原。在一些实施方案中，对照值是在施用了VZV病毒样粒子(VLP)疫苗(例如，含有病毒衣壳蛋白，但缺少病毒基因体，且因此无法复制/产生后代病毒的粒子)的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，对照物是包含融合前或融合后F蛋白或包含两者的组合的VLP VZV疫苗。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是与重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量相比减低的剂量。如本文提供的“医疗常规”指的是医学或心理学治疗准则，并且可以是一般性或具体的。“医疗常规”基于在对给定病况的治疗中涉及的医学专业之间的科学证据和协作来规定适当治疗。它是医师/临床医师对于特定类型的患者、疾病或临床情形应遵循的诊断和治疗过程。如本文提供的“医疗常规剂量”指的是医师/临床医师或其它医学专业人员将施用给受试者来治疗或预防VZV或VZV相关病况，同时遵循用于治疗或预防VZV或VZV相关病况的医疗常规准则的重组或纯化VZV蛋白疫苗或活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的剂量。
在一些实施方案中，在施用了有效量的VZV RNA疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗或活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是等同于比重组或纯化VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少2倍的剂量。例如，VZV RNA疫苗的有效量可以是等同于比重组或纯化VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的剂量。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗的有效量是等同于比重组或纯化VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少100倍、至少500倍或至少1000倍的剂量。在一些实施方案中，VZV RNA疫苗的有效量是等同于比重组或纯化VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、250、500或1000倍的剂量。在一些实施方案中，在施用了有效量的VZV RNA疫苗的受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或蛋白VZV蛋白疫苗或活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是等同于比重组或纯化VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低2倍至1000倍(例如，2倍至100倍、10倍至1000倍)的剂量，其中在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗或活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是等同于比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低2至1000、2至900、2至800、2至700、2至600、2至500、2至400、2至300、2至200、2至100、2至90、2至80、2至70、2至60、2至50、2至40、2至30、2至20、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至1000、3至900、3至800、3至700、3至600、3至500、3至400、3至3至00、3至200、3至100、3至90、3至80、3至70、3至60、3至50、3至40、3至30、3至20、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至1000、4至900、4至800、4至700、4至600、4至500、4至400、4至300、4至200、4至100、4至90、4至80、4至70、4至60、4至50、4至40、4至30、4至20、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、4至4、5至1000、5至900、5至800、5至700、5至600、5至500、5至400、5至300、5至200、5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至20、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至1000、6至900、6至800、6至700、6至600、6至500、6至400、6至300、6至200、6至100、6至90、6至80、6至70、6至60、6至50、6至40、6至30、6至20、6至10、6至9、6至8、6至7、7至1000、7至900、7至800、7至700、7至600、7至500、7至400、7至300、7至200、7至100、7至90、7至80、7至70、7至60、7至50、7至40、7至30、7至20、7至10、7至9、7至8、8至1000、8至900、8至800、8至700、8至600、8至500、8至400、8至300、8至200、8至100、8至90、8至80、8至70、8至60、8至50、8至40、8至30、8至20、8至10、8至9、9至1000、9至900、9至800、9至700、9至600、9至500、9至400、9至300、9至200、9至100、9至90、9至80、9至70、9至60、9至50、9至40、9至30、9至20、9至10、10至1000、10至900、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、10至20、20至1000、20至900、20至800、20至700、20至600、20至500、20至400、20至300、20至200、20至100、20至90、20至80、20至70、20至60、20至50、20至40、20至30、30至1000、30至900、30至800、30至700、30至600、30至500、30至400、30至300、30至200、30至100、30至90、30至80、30至70、30至60、30至50、30至40、40至1000、40至900、40至800、40至700、40至600、40至500、40至400、40至300、40至200、40至100、40至90、40至80、40至70、40至60、40至50、50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、50至90、50至80、50至70、50至60、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、60至90、60至80、60至70、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、70至90、70至80、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、80至90、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、90至100、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、100至500、100至400、100至300、100至200、200至1000、200至900、200至800、200至700、200至600、200至500、200至400、200至300、300至1000、300至900、300至800、300至700、300至600、300至500、300至400、400至1000、400至900、400至800、400至700、400至600、400至500、500至1000、500至900、500至800、500至700、500至600、600至1000、600至900、600至800、600至700、700至1000、700至900、700至800、800至1000、800至900或900至1000倍的剂量。在一些实施方案中，诸如以上实施方案，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗或活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。在一些实施方案中，有效量是等同于(或等同于至少)比重组VZV蛋白疫苗的医疗常规剂量减低2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、1280、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、4360、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、5760、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820-、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000倍的剂量。在一些实施方案中，诸如以上实施方案，在受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价等同于在施用了医疗常规剂量的重组或纯化VZV蛋白疫苗或活的减毒或不活化VZV疫苗或VZV VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-VZV抗原性多肽抗体效价。
在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是50至1000μg的总剂量。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、50至90、50至80、50至70、50至60、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、60至90、60至80、60至70、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、70至90、70至80、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、80至90、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、90至100、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、100至500、100至400、100至300、100至200、200至1000、200至900、200至800、200至700、200至600、200至500、200至400、200至300、300至1000、300至900、300至800、300至700、300至600、300至500、300至400、400至1000、400至900、400至800、400至700、400至600、400至500、500至1000、500至900、500至800、500至700、500至600、600至1000、600至900、600至900、600至700、700至1000、700至900、700至800、800至1000、800至900或900至1000μg的总剂量。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是25至500μg的剂量，总计向受试者施用两次。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是25至500、25至400、25至300、25至200、25至100、25至50、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、100至500、100至400、100至300、100至200、150至500、150至400、150至300、150至200、200至500、200至400、200至300、250至500、250至400、250至300、300至500、300至400、350至500、350至400、400至500或450至500μg的剂量，总计向受试者施用两次。在一些实施方案中，VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的有效量是25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg的总剂量，总计向所述受试者施用两次。
其它实施方案
1.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽、编码至少一种VZV抗原性多肽的开放阅读框架以及3′聚腺苷酸尾。
2.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：11标识的序列编码。
3.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：92标识的序列。
4.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：10标识的序列。
5.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：15标识的序列编码。
6.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：93标识的序列。
7.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：14标识的序列。
8.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：19标识的序列编码。
9.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：94标识的序列。
10.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：18标识的序列。
11.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：23标识的序列编码。
12.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：95标识的序列。
13.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：22标识的序列。
14.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：27标识的序列编码。
15.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：96标识的序列。
16.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：26标识的序列。
17.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：31标识的序列编码。
18.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：97标识的序列。
19.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：30标识的序列。
20.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：35标识的序列编码。
21.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：98标识的序列。
22.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：34标识的序列。
23.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：39标识的序列编码。
24.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：99标识的序列。
25.段落1的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
26.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：62标识的序列编码。
27.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：101标识的序列。
28.段落26或27的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
29.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：66标识的序列编码。
30.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：102标识的序列。
31.段落30或31的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
32.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：70标识的序列编码。
33.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：103标识的序列。
34.段落32或33的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
35.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：74标识的序列编码。
36.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：104标识的序列。
37.段落35或36的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
38.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：78标识的序列编码。
39.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：105标识的序列。
40.段落38或39的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
41.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：82标识的序列编码。
42.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：106标识的序列。
43.段落41或42的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
44.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：86标识的序列编码。
45.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：107或134标识的序列。
46.段落44或45的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
47.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由SEQ ID NO：90标识的序列编码。
48.段落1的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：108标识的序列。
49.段落47或48的疫苗，其中所述至少一种抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
50.段落1至49中任一项所述的疫苗，其中所述5′端帽是7mG(5′)ppp(5′)NImpNp或包含7mG(5′)ppp(5′)NImpNp。
51.段落1至50中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框架中100％的尿嘧啶被改性而在所述尿嘧啶的第5位包括N1-甲基假尿苷。
52.段落1至51中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗被配制在包含以下各物的脂质纳米粒子中：DLin-MC3-DMA；胆固醇；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DSPC)；以及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
53.段落52的疫苗，其中所述脂质纳米粒子还包含柠檬酸三钠缓冲液、蔗糖以及水。
54.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：92标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：92标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
55.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：93标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：93标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
56.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：94标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：94标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
57.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：95标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：95标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
58.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：96标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：96标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
59.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：97标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：97标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
60.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：98标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：98标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
61.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：99标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：99标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
62.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：101标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：101标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
63.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：102标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：102标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
64.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：103标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：103标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
65.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：104标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：104标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
66.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：105标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：105标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
67.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：106标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：106标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
68.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：107或134标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：107或134标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
69.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述mRNA多核苷酸具有5′端帽7mG(5′)ppp(5′)NImpNp、由SEQ ID NO：108标识的序列以及3′聚腺苷酸尾，其中由SEQ ID NO：108标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
70.权利要求第54至69中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗被配制在包含DLin-MC3-DMA、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷胆碱(DSPC)和聚乙二醇(PEG)2000-DMG的脂质纳米粒子中。
本发明在其申请案中不限于下文描述中所述或图式中说明的构筑详情和组分配置。本发明可以具有其它实施方案并且能够以各种方式来实践或进行。又，本文所用的词组和术语是为了描述的目的，而且不应理解为限制。本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涵盖”以及其变化形式打算涵盖下文所列的项目和其等效物以及其它项目。
实例
实例1：制造多核苷酸
根据本发明，可利用标题为“Manufacturing Methods for Production of RNATranscripts”的国际公布WO2014/152027中教导的方法来实现制造多核苷酸和或其部分或区域，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
纯化方法可包括国际公布WO2014/152030和国际公布WO2014/152031中教导的那些方法，所述国际公布各自以全文引用的方式并入本文中。
多核苷酸的检测和特征化方法可如国际公布WO2014/144039中的教导来进行，所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
特征化本发明的多核苷酸可使用多核苷酸定位、逆转录酶测序、电荷分布分析、检测RNA杂质或两种或两种以上方法的任意组合来实现。“特征化”包括测定RNA转录序列、测定RNA转录物的纯度或测定RNA转录物的电荷异质性。所述方法例如在国际公布WO2014/144711和国际公布WO2014/144767中教导，所述国际公布各自的内容以全文引用的方式并入本文中。
实施例2：嵌合多核苷酸合成
根据本发明，嵌合多核苷酸的两个区域或部分可使用三磷酸酯化学物连接或接合。100个或100个以下核苷酸的第一区域或部分例如由5′单磷酸酯和末端3′desOH或阻断OH化学合成。如果所述区域长于80个核苷酸，就可以合成为用于接合的两股。
如果第一区域或部分通过使用体外转录(IVT)而合成为非定位改性的区域或部分，那么接着可以由3′末端的后续封端来转化5′单磷酸酯。
单磷酸酯保护基可选自本领域中已知的那些单磷酸酯保护基中的任一者。
嵌合多核苷酸的第二区域或部分可使用化学合成或IVT方法来合成。IVT方法可包括可利用具有改性端帽的引子的RNA聚合酶。或者，可化学合成具有多达130个核苷酸的端帽并与IVT区域或部分偶合。
对于接合方法而言，由DNA T4接合酶接合，接着由DNA酶处理应易于避免串接。
整个嵌合多核苷酸无需由磷酸酯-糖骨架来制造。如果所述区域或部分中的一种编码多肽，那么所述区域或部分可包含磷酸酯-糖骨架。
接着使用任何已知的键击化学、邻位键击化学、溶联(solulink)或本领域技术人员已知的其它生物结合化学方法来进行接合。
合成途径
使用一系列起始区段来制备嵌合多核苷酸。所述区段包括：
(a)封端并且受保护的5′区段，其包含正常3′OH(SEG.1)
(b)5′三磷酸酯区段，所述区段可包括多肽的编码区和正常3′OH(SEG.2)
(c)用于包含虫草素或无3′OH(SEG.3)的嵌合多核苷酸3′末端(例如，尾部)的5′单磷酸酯区段。
在合成(化学或IVT)之后，用虫草素处理区段3(SEG.3)并且接着用焦磷酸酶处理来产生5′单磷酸酯。
接着可使用RNA接合酶使区段2(SEG.2)接合到SEG.3。接合的多核苷酸接着进行纯化并用焦磷酸酶处理来裂解二磷酸酯。接着可以纯化经过处理的SEG.2-SEG.3构筑体并使SEG.1接合到5′末端。可进行嵌合多核苷酸的进一步纯化步骤。
当嵌合多核苷酸编码多肽时，接合或连接区段可表示为：5′UTR(SEG.1)、开放阅读框架或ORF(SEG.2)以及3′UTR+聚腺苷酸(SEG.3)。
每个步骤的产率可高达90至95％。
实施例3：用于cDNA生产的PCR
使用Kapa Biosystems(Woburn，MA)的2×KAPA HIFITMHotStart ReadyMix进行用于制备cDNA的PCR程序。此系统包括2×KAPA ReadyMix 12.5μl；正向引子(10μM)0.75μl；反向引子(10μM)0.75μl；模板cDNA 100ng；以及稀释到25.0μl的dH2O。反应条件可以是在95℃下持续5分钟。反应可进行25个在98℃下持续20秒、接着在58℃下持续15秒、接着在72℃下持续45秒、接着在72℃下持续5分钟、接着在4℃下至结束的循环。
根据制造商的说明，使用Invitrogen的PURELINKTMPCR微试剂盒(Carlsbad，CA)清理反应(至多5μg)。较大的反应可能需要使用具有较大容量的产品来清理。清理之后，使用NANODROPTM对cDNA定量并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析来确认cDNA是预期的大小。接着可提交cDNA来进行测序分析，然后继续进行体外转录反应。
实施例4：体外转录(IVT)
体外转录反应产生RNA多核苷酸。所述多核苷酸可包含本发明的多核苷酸的区域或部分，包括化学改性的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。化学改性的RNA多核苷酸可以是经过均匀改性的多核苷酸。体外转录反应利用核苷酸三磷酸酯(NTP)的定制混合物。NTP可包含化学改性的NTP，或天然与化学改性NTP的混合物，或天然NTP。
一种典型的体外转录反应包括以下：
1)模板cDNA 1.0μg
2)10×转录缓冲液 2.0μl
(400mM Tris-HCl pH 8.0、190mMMgCl2、50mM DTT、10mM亚精胺)
3)定制NTP(各25mM) 0.2μl
4)RNA酶抑制剂 20U
5)T7RNA聚合酶 3000U
6)dH2O 至多20.0μl.和
7)在37℃下培育3小时到5小时。
粗的IVT混合物可以在4℃下储存过夜以供第二天清理。接着使用1U的无RNA酶的DNA酶来消化初始模板。在37℃下培育15分钟后，根据制造商的说明使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)来纯化mRNA。此试剂盒可纯化多达500μg RNA。清理之后，使用NANODROPTM对RNA多核苷酸进行定量，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析来确认RNA多核苷酸是适当的大小而且RNA未发生降解。
实施例5：酶促封端
如下对RNA多核苷酸进行封端，其中所述混合物包括：60μg至180μg的IVT RNA以及多达72μl的dH2O。将混合物在65℃下培育5分钟使RNA变性，接着即刻转移到冰中。
实验方案则包涵：将10×封端缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、60mM KCl、12.5mMMgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷酰基甲硫氨酸(2.5μl)；RNA酶抑制剂(100U)；2′-O-甲基转移酶(400U)；牛痘封端酶(鸟苷酰基转移酶)(40U)；dH2O(多达28μl)混合；并且对于60μg RNA而言在37℃下培育30分钟或对于180μg RNA而言在37℃下培育持续达2小时。
接着可根据制造商的说明，使用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)来纯化RNA多核苷酸。清理之后，可使用NANODROPTM(ThermoFisher，Waltham，MA)对RNA定量并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析来确认RNA多核苷酸是适当的大小而且RNA未发生降解。也可以通过运行逆相转录PCR来对RNA多核苷酸产物进行测序以产生用于测序的cDNA。
实施例6：聚腺苷酸加尾反应
在cDNA中无聚-T时，在清理最终产物之前必须进行聚腺苷酸加尾反应。这是通过将封端IVT RNA(100μl)；RNA酶抑制剂(20U)；10×加尾缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)；20mM ATP(6.0μl)；聚腺苷酸聚合酶(20U)；多达123.5μl的dH2O混合并在37℃下培育30min来进行。如果聚腺苷酸尾已在转录物中，就可以跳过加尾反应并且直接用Ambion的MEGACLEARTM试剂盒(Austin，TX)(多达500μg)清理。聚腺苷酸聚合酶可以是在酵母中表达的重组酶。
应了解，聚腺苷酸加尾反应的持续性或完整性并非总是产生确切尺寸的聚腺苷酸尾。因此，约40至200个核苷酸，例如约40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150-165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165个的聚腺苷酸尾在本发明的范畴中。
实施例7：封端分析
蛋白表达分析
本文中教导的含有任意端帽、编码多肽的多核苷酸(例如，mRNA)可在相同浓度下转染到细胞中。可在转染后6、12、24和/或36小时通过ELISA来分析分泌到培养基中的蛋白的量。向培养基中分泌较高水平蛋白的合成性多核苷酸对应于具有较高转译感受态端帽结构的合成性多核苷酸。
纯度分析合成
可使用变性琼脂糖-尿素凝胶电泳或HPLC分析来比较本文中教导的含有任意端帽、编码多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸的纯度。通过电泳而且具有单一合并波段的RNA多核苷酸对应于与具有多个波段或拖尾波段的多核苷酸相比具有较高纯度的产物。具有单一HPLC峰的化学改性RNA多核苷酸也对应于较高纯度的产物。具有较高效率的封端反应提供更纯的多核苷酸群体。
细胞介素分析
本文中教导的含有任意端帽、编码多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸可在多种浓度下转染到细胞中。可在转染后6、12、24和/或36小时通过ELISA来分析分泌到培养基中的促炎性细胞介素(诸如TNF-α和IFN-β)的量。导致向培养基中分泌较高水平促炎性细胞介素的RNA多核苷酸对应于含有免疫活性端帽结构的多核苷酸。
封端反应效率
在核酸酶处理后，通过LC-MS分析本文中教导的含有任意端帽、编码多肽的RNA(例如，mRNA)多核苷酸的封端反应效率。核酸酶处理封端多核苷酸产生由LC-MS可检测的游离核苷酸与封端5′-5-三磷酸酯端帽结构的混合物。LC-MS光谱上封端产物的量可表述为来自反应的总多核苷酸的百分比，并且对应于封端反应效率。通过LC-MS，具有较高封端反应效率的端帽结构具有较高的封端产物量。
实施例8：改性的RNA或RT PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
根据制造商实验方案，可将个别的RNA多核苷酸(200-400ng，体积为20μl)或逆转录PCR产物(200至400ng)负载在非变性1.2％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上的孔中并运行12到15分钟。
实施例9：NANODROPTM改性的RNA定量和UV光谱资料
TE缓冲液(1μl)中化学改性的RNA多核苷酸用于NANODROPTMUV吸光度读数来定量来自化学合成或体外转录反应的每种多核苷酸的产率。
实施例10：使用利匹哆异德(Lipidoid)配制改性的mRNA
在添加到细胞中之前，通过将多核苷酸和利匹哆异德以固定的比率混合，可配制RNA(例如，mRNA)多核苷酸来进行体外实验。体内配制物可能需要添加其它的成分来促使在整个受试者体内循环。为测试所述利匹哆异德形成适合体内运作的粒子的能力，可使用用于siRNA-利匹哆异德配制物的标准配制方法作为起始点。形成粒子之后，添加多核苷酸并使其与复合物整合。使用标准染料排除分析测定囊封效率。
实施例11：编码用于VZV疫苗的gE RNA多核苷酸的例示性核酸
以下序列是可用于编码用于VZV疫苗的VZV RNA多核苷酸gE的例示性序列。VZV疫苗可包含例如至少一种由至少一种以下序列或以下序列的至少一个片段编码的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，mRNA还包含5′端帽，例如本文公开的任意端帽，例如具有序列m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基的端帽。在一些实施方案中，mRNA不具有端帽序列。在一些实施方案中，mRNA具有至少一种化学改性，例如本文公开的任意化学改性，例如N1-甲基假尿苷改性或N1-乙基假尿苷改性。在其它实施方案中，mRNA不具有化学改性。
本文所述的每个序列都涵盖化学改性序列或不包括改性核苷酸的未改性序列。
VZV gE-全长Oka菌株：
VZV gE-全长Oka菌株(mRNA)：
实施例12：编码用于VZV疫苗的gI RNA多核苷酸的例示性核酸
以下序列是可用于编码用于VZV RNA(例如，mRNA)疫苗的VZV RNA多核苷酸gI的例示性序列。gI多肽与感染细胞中的gE形成复合物，这促使了糖蛋白的胞吞作用，并将其导向反式高基氏体网络(TGN)，在此获得最终的病毒包膜。VZV疫苗可包含例如至少一种由至少一种以下序列或以下序列的至少一个片段编码的RNA(例如，mRNA)多核苷酸。在一些实施方案中，mRNA还包含5′端帽，例如本文公开的任意端帽，例如具有序列m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基的端帽。在其它实施方案中，mRNA不具有端帽序列。在一些实施方案中，mRNA具有至少一种化学改性，例如本文公开的任意化学改性，例如N1-甲基假尿苷改性或N1-乙基假尿苷改性。在其它实施方案中，mRNA不具有化学改性。
VZV-GI-全长(Oka菌株)：
VZV-GI-全长(Oka菌株)(mRNA)：
实施例13：用于VZV疫苗中的编码具有不同C末端序列的变异体gE抗原的mRNA
将VZV在反式高基氏体网络中包膜。糖蛋白I(gI)与感染细胞中的gE形成复合物，这促使了糖蛋白的胞吞作用并且将其导向反式高基氏体网络(TGN)，在此获得最终的病毒包膜。设计编码具有不同C末端变异体序列的gE抗原的mRNA来避免gE截获于ER/高基氏体/TGN中，导致增加gE抗原定位于浆膜中并改善免疫刺激能力。图4中展示gE抗原的示意图。
工程化若干种不同gE变异体mRNA序列(Oka菌株)：
(1)编码具有删除C末端区域(SEQ ID NO：17至20)的末端62个氨基酸的截短多肽的gE变异体mRNA。所得多肽减少定位到反式高基氏体网络中，而且胞吞作用减少。
(2)编码具有删除C末端区域的末端62个氨基酸的截短多肽而且也经Igκ取代信号肽的gE变异体mRNA，这产生了分泌形式的截短gE多肽(SEQ ID NO：21至24)。所得多肽减少定位到反式高基氏体网络中，而且胞吞作用减少。
(3)编码具有删除C末端区域(SEQ ID NO：33至36)的末端50个氨基酸的截短多肽的gE变异体mRNA。所得多肽减少定位到反式高基氏体网络中，而且胞吞作用减少。
(4)编码具有删除C末端区域的末端50个氨基酸的截短多肽而且也具有点突变Y569A(SEQ ID NO：37至40)的gE变异体mRNA。“AYRV”基序(SEQ ID NO：119)是将gE多肽靶向反式高基氏体网络中的运输基序。因此，使AARV序列SEQ ID NO：120突变为AYRV SEQ IDNO：119导致gE多肽减少定位到反式高基氏体网络中。
(5)编码具有AEAADA(SEQ ID NO：58)序列(SEQ ID NO：25至28)的全长gE多肽的gE变异体mRNA。A-E-A-A-D-A(SEQ ID NO：58)序列取代SESTDT(SEQ ID NO：59)。这是以富含Ala的序列取代富含Ser/Thr“SSTT”(SEQ ID NO：122)的酸性簇。这使得CKII磷酸化减少，这又导致gE多肽减少定位到反式高基氏体网络中。
(6)编码具有AEAADA(SEQ ID NO：58)序列的全长gE多肽而且也具有点突变Y582G(SEQ ID NO：29-32)的gE变异体mRNA。“YAGL”(SEQ ID NO：121)基序是增强gE多肽定位到反式高基氏体网络中的胞吞作用基序。因此，使GAGL序列(SEQ ID NO：132)突变为YAGL(SEQID NO：121)导致所得多肽的胞吞作用减少。
所述变异体各自具有减少编码gE蛋白定位到反式高基氏体网络中并且增强运输到浆膜的改性。表1概述编码具有不同C末端序列的变异体gE抗原的mRNA。在一些实施方案中，变异体mRNA还包含5′端帽，例如本文公开的任意端帽，例如具有序列m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基的端帽。在一些实施方案中，变异体mRNA不具有5′端帽。在一些实施方案中，变异体mRNA具有至少一种化学改性，例如本文公开的任意化学改性，例如N1-甲基假尿苷改性或N1-乙基假尿苷改性。在一些实施方案中，mRNA不具有化学改性。下表中提供编码mRNA变异体的序列。
表1：mRNA构筑体
VZV-GE-删除-562
VZV-GE-删除-562(mRNA)
VZV-GE-删除-562-Igκ
VZV-GE-删除-562-Igκ(mRNA)
VZV-GE-删除-574
VZV-GE-删除-574(mRNA)
VZV-GE-删除-574-Y569A
VZV-GE-删除-574-Y569A(mRNA)
VZV-gE-全长-AEAADA(SEQ ID NO：58)
VZV-gE-全长-AEAADA(SEQ ID NO：58)(mRNA)
VZV-GE-完整-AEAADA(SEQ ID NO：58)-Y582G
VZV-GE-完整-AEAADA(SEQ ID NO：58)-Y582G(mRNA)
VZV_gE_Oka_hIgκ
VZV_gE_Oka_hIgκ(mRNA)
表2.变异体VZV gE构筑体的序列
G*表示5′端帽，例如7mG(5′)ppp(5′)NImpNp
实施例14：Vero和Mewo细胞中的变异体gE抗原分布
在Vero细胞和Mewo细胞中研究具有不同C末端变异体的VZV gE抗原的表达和运输。
Vero细胞是用于细胞培养物中的细胞谱系。‘Vero’谱系由从非洲绿猴提取的肾上皮细胞分离。MeWo细胞是易受VZV感染影响的人类恶性黑素瘤细胞。Vero细胞或Mewo细胞由下文表3中所示的构筑体转染。转染细胞由用于gE和用于高基氏体标记GM 130以及高基氏体蛋白的抗体染色。使用共焦显微法来观察染色细胞。关于构筑体的结果描述在表3中(“细胞定位”行)。图9提供一种例示性实验，展示以下转染构筑体的结果：(1)编码在C末端删除62个氨基酸的VZV gE多肽(由SEQ ID NO：3编码)的VZV gE mRNA；(2)编码具有AEAADA序列(SEQ ID NO：58)的VZV gE多肽(由SEQ ID NO：7编码)的全长VZV gE mRNA；或(3)PBS(作为阴性对照物)。使用抗-gE抗体，图9展示截短VZV gE多肽(具有62个氨基酸C末端删除)定位在核周位置和细胞器。具有AEAADA序列(SEQ ID NO：58)的全长VZV gE多肽定位在高基氏体和核周位置。重要的是，若干种构筑体，例如gE-截短-删除_来自_574_Y569A、具有AEAADA(SEQ ID NO：58)的全长gE、具有AEAADA(SEQ ID NO：58)和Y582C突变的全长gE、gE-截短-删除_来自_574以及gE-截短-删除_来自具有Y569A突变的574各自编码定位在细胞膜的多肽，表明所述多肽可具有增强的抗原性。
表3.变异体VZV gE多肽的细胞运输结果概述
实施例15：用MC3配制的编码VZV gE抗原的mRNA对BALB/C小鼠进行免疫
进行一种免疫研究来初始评估用MC3-配制的编码VZV抗原的mRNA作为疫苗候选物在BALB/C小鼠体内通过肌肉内或皮内施药后实现免疫的效应。
候选疫苗如下：
(1)用MC3配制的VZVgE-hIg κ mRNA，其具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基、N1-甲基假尿苷化学改性以及另一个hIg κ序列。
(2)用MC3配制的VZV gE mRNA，其具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性。
(3)用MC3配制的VZVgE mRNA，其具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基而且无化学改性。
所有VZV gE mRNA都是菌株Oka。
对BALB/C小鼠通过肌肉内或皮内给予单次10μg剂量或两次10μg剂量(在第28天)的用MC3配制的VZV gE mRNA(上文所述的疫苗(1)、(2)或(3))。G5指的是具有N1-甲基假尿苷化学改性的mRNA。G0指的是未进行改性的mRNA。端帽1指的是5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基。每个处理组都含有八只小鼠。阳性对照物为疫苗且阴性对照物为PBS。
获取血液样品来确定血清蛋白和抗体的存在/水平。进行西方墨点法来检测六小时时的VZV-gE蛋白表达，并进行ELISA来检测小鼠IgG。图2中展示编码VZV gE(菌株Oka)的构筑体的示意图。图3和表3中展示研究设计和注射方案的示意图。表4展示用于收集不同样品的各个时间点。收集血液进行血清蛋白和抗体测定，同时对于第1至4组、第13组和第14组而言在第0天给药后6小时研究VZV蛋白表达，则对于第2组、第4组和第14组而言在第28天给药后6小时研究VZV蛋白表达。在第-3天、第14天、第27天、第42天和第56天进行抗体检测分析。
表4：注射方案
表5：样品收集方案
实施例16：免疫原性研究-ELISA
设计此研究来测试候选VZV疫苗在BALB/C小鼠中的免疫原性，所述候选VZV疫苗包含编码来自VZV的糖蛋白gE的mRNA多核苷酸。在固定间隔下以各种VZV mRNA疫苗配制物对小鼠进行免疫，并且在每次免疫后收集血清。在实施例15的表2中提供免疫方案。在实施例15的表4中描述血清收集方案。
酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)
使用标准方法，通过酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)来测定针对VZV糖蛋白E的血清抗体效价。在一种研究中，在抽血前并且在通过肌肉内两次给药10μg的以下各物被疫苗接种的小鼠中，在疫苗接种后第14天和第42天收集的血清中测量抗-VZV gE小鼠IgG的量：(1)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE-hIgκ(表2和3中的1号)；(2)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基并且无化学改性的VZV-gE(表2和3中的6号)；(3)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE(表2和3中的10号)；(4)疫苗(阳性对照物)；或(5)PBS(阴性对照物)。
图5至7展示所有测试的mRNA编码VZV-gE疫苗相对于目前的疫苗而言都具有极强的免疫反应。图5展示在第14天，在用疫苗候选物(1)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE-hIgκ进行疫苗接种的小鼠血清中，抗-VZV-gE IgG的效价为约10μg/mL，而且在用疫苗候选物(3)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE进行疫苗接种的小鼠血清中，抗-VZV-gEIgG的效价为约50μg/mL。用进行疫苗接种的小鼠血清中的抗-VZV-gE IgG水平在第14天时不可检测。在第42天，在用疫苗候选物(1)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE-hIgκ或疫苗候选物(3)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE进行疫苗接种的小鼠血清中存在的抗-VZV-gE IgG的量与在用进行疫苗接种的小鼠血清中存在的抗-VZV-gE IgG的量相比几乎大出1000倍。在用疫苗候选物(2)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基并且无化学改性的VZV-gE进行疫苗接种的小鼠血清中存在的抗-VZV gE IgG的量与在用进行疫苗接种的小鼠血清中存在的抗-VZV-gE IgG的量相比几乎大出100倍。这项研究表明每种测试的VZV gE mRNA疫苗都是比目前的VZV疫苗更具免疫原性的疫苗。
实施例17：免疫原性研究-ELISA
设计此研究来测试候选VZV疫苗在BALB/C小鼠中的免疫原性，所述候选VZV疫苗包含编码来自VZV的糖蛋白gE的mRNA多核苷酸。在固定间隔下用各种VZV mRNA疫苗配制物对小鼠进行免疫，并且在每次免疫后收集血清。在实施例15的表4中提供免疫方案。在实施例15的表5中描述血清收集方案。
使用标准方法，通过酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)来测定针对VZV糖蛋白E的血清抗体效价。在第二种扩展研究中，连续稀释血清样品以使信号在使用ELISA可检测的范畴内。在通过肌肉内两次给药10μg的以下各物进行疫苗接种的小鼠中，在疫苗接种后第42天收集的血清中测量抗-VZV gE小鼠IgG的量：(1)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE-hIgκ(表2和3中的1号)；(2)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基而且无化学改性的VZV-gE(表2和3中的6号)；(3)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE(表2和3中的10号)；(4)疫苗(阳性对照物)；或(5)PBS(阴性对照物)。在10倍连续稀释液中测量抗-VZV-gE小鼠IgG的浓度。
图6展示在用疫苗候选物(1)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE-hIgκ进行疫苗接种的小鼠中可见最强的免疫反应。在用疫苗候选物(3)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性的VZV-gE进行疫苗接种的小鼠中可见第二最强的反应。在用疫苗候选物(2)具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基而且无化学改性的VZV-gE进行疫苗接种的小鼠中可见第三最强的反应。所有三种VZV gE mRNA疫苗都产生比疫苗显著更大的免疫反应。
图7展示在疫苗接种后第3天、第14天和第42天时，在用疫苗(1)至(4)和(5)阴性对照物进行疫苗接种的小鼠中存在的抗-VZV-gE小鼠IgG的量。
实施例18：免疫原性研究
设计此研究来测试候选VZV疫苗在BALB/C小鼠中的免疫原性，所述候选VZV疫苗包含编码来自VZV的变异体糖蛋白gE的mRNA多核苷酸。在固定间隔下用各种VZV mRNA疫苗配制物对小鼠进行免疫，并且在每次免疫后在指定时间点收集血清。在下文表6中提供免疫方案。在下文表7中描述血清收集方案。
在通过肌肉内两次给药10μg或2μg的指定构筑体进行疫苗接种的小鼠中，在疫苗接种后测量在表7中指示的时间收集的血清中的抗-VZV gE小鼠IgG的量。使用的所有mRNA都具有5′端帽：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基以及N1-甲基假尿苷化学改性。用作阳性对照物并且用19400 pfu SC的两次临床剂量通过肌肉内注射到小鼠体内。PBS用作阴性对照物。
通过酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)来测定在用表6中所示的VZV gE变异体mRNA疫苗进行免疫的小鼠中针对VZV gE变异体多肽的抗体效价。为进行ELISA，对培养盘的孔涂覆PBS中的VZV gE抗原(Abcam：ab43050)。将100μl浓度为1、2或4μg/ml的VZV gE抗原用于在4℃下涂覆过夜。接着用300μl的PBST(具有0.05％吐温(tween)的PBS)将孔洗涤3次。将涂有VZV gE的孔在室温下以200μl在PBS中含有1％Blotto的阻断缓冲液阻断30分钟。将含有抗-VZV gE抗体的小鼠血清按1∶2000稀释，而且接着使用PBST进行1∶3连续稀释。将稀释过的血清添加到涂有VZV gE的孔中并在室温下培育1小时。将二级抗体，与辣根过氧化物酶(HRP，Abcam：ab6728)结合的兔抗小鼠在PBST中按1∶1000稀释并将100μl含有二级抗体的溶液添加到孔中而且在室温下培育45分钟。向孔中添加100μl的HRP受质KPL TMB并在室温下培育3分钟，然后添加100μl终止溶液(2M H2SO4)来终止HRP反应。在A450下测量由HRP受质产生的信号。结果展示于图11A、11B、12A、12B、13和表8和9中。
图11A展示所有gE变异体在两次10μg给药后引发比强得多的免疫反应。图11B展示所有gE变异体在两次2μg给药后引发比强得多的免疫反应。在两种剂量下，gE变异体GE-del_574_Y569A和GE-del-562-IgκSP都引发最强的免疫反应，而且在用这种gE变异体进行免疫的小鼠血清中测量的抗体效价比在用进行免疫的小鼠血清中测量的抗体效价大出10倍以上，表明GE-del_574_Y569A和GE-del_562-IgκSPmRNA都是针对VZV的优秀疫苗候选物。
图12A展示由用10μg表6中所述的VZV gE mRNA变异体免疫两次的小鼠收集的滴定血清中的抗体量。图12B展示由用2μg表6中所述的VZV gE mRNA变异体免疫两次的小鼠收集的滴定血清中的抗体量。当血清稀释100倍以上时，用VZV gE变异体进行疫苗接种的小鼠血清中的抗体效价高于用进行疫苗接种的小鼠血清中的抗体效价，表明VZV gEmRNA变异体比在小鼠中引发强得多的免疫反应。测试的所有VZV gE mRNA变异体在小鼠中引发免疫反应方面展示相当的能力。
图13是表明与相比，由VZV gE变异体mRNA疫苗引发的抗-VZV gE免疫反应的图表。VZV gE变异体GE-删除_来自_574-Y569A在小鼠中引发比大出约1log的免疫反应。
表9概述在由以各自10μg或2μg的VZV gE mRNA两次免疫的小鼠收集的血清中的倒数IgG效价(IC50)。GE-删除_来自_574-Y569A在10μg或2μg剂量下都引发强免疫反应。使用几何平均效价(GMT)来指示VZV gE变异体mRNA疫苗的免疫原性潜能。GE_删除_来自_574-Y569A展示最高GMT值，表明其在引发针对VZV gE的免疫反应中最为有效。
表6：注射方案
表7：样品收集方案
表8.不同VZV构筑体的IC50概述
倒数IgG效价(IC50)
名称 10ug 2ug
GE-完整_AEAADA 5741 6378
GE-完整_AEAADA_&_Y582G 10306 3556
GE-del-562 11672 6445
GE-del-562-IaκSP 16490 7939
GE-del_574 9031 4082
GE-del_574_Y569A 1170404 7291
GE-Oka_hIgκ 11708 6448
GE-Oka_hIgκ 7045 3672
GE-完整_AEAADA_GI-完整 4457 8242
GE-del_574_Y569A NA
PBS NA NA
Zostavax 860 860
分析对照物 培养盘1 培养盘2 ％CV 标准值 平均值 CV
VZV_gE_Oka_hIgκ 12803 11078 7.22 862.5 11940.5 0.07
表9.通过ELISA测量的倒数抗-gE IgG效价(IC50)
实施例19：VZV体外中和分析
进行VZV体外中和分析来评估抗-VZV gE抗体在中和VZV方面的功效。通过收集经VZV gE变异体mRNA疫苗进行疫苗接种的小鼠的血清来获得抗-VZV gE抗体。如表6中所述，以10μg或2μg剂量的VZV gE变异体mRNA疫苗对小鼠进行疫苗接种且在第2次免疫后2周收集血清。
为进行分析，将小鼠血清以1∶5稀释且接着经受1∶2连续稀释。将VZV病毒添加至血清中且允许在室温下继续中和1小时。将ARPE-19细胞在一天前接种于96孔中且将病毒/血清混合物以每孔50至100pfu添加至ARPE-19细胞中。次日，将ARPE-19细胞固定且进行VZV特异性染色。扫描并分析培养盘。VZV体外中和分析的结果概述于表10中。表10中的值为展示VZV病毒斑块覆盖的孔面积减少50％的血清稀释。未观测到斑块数量减少。如表10中所示，来自经GE-删除_来自_574-Y569A变异体mRNA疫苗免疫的小鼠的血清的一份复本能够以1∶80稀释度减少VZV病毒斑块所覆盖的孔面积。
表10.体外中和分析
实施例20：小鼠中的免疫原性
带状疱疹(HZ)或缠腰龙(shingles)是一种具有水疱疹特征的衰竭性疾病，最常见的并发症为疱疹后神经痛(PHN)。PHN为在清理皮肤爆发后产生的持续且严重的疼痛，且可能持续数年，由此导致受影响受试者的高发病率。HZ由来自感觉神经节的潜伏水痘-带状疱疹病毒(VZV)的再活化而引起。在原发性VZV感染(鸡痘)期间产生的免疫反应已证实防止潜伏VZV再活化。然而，HZ的发病率与年龄增长密切相关。若干项研究已证实，T细胞调节的免疫反应随年龄增加且在免疫抑制期间减少，导致VZV再活化。尽管如此，抗-VZV抗体的水平随年龄增长保持相对稳定，表明体液免疫反应可能不足以预防HZ。若干项研究已报道由支配记忆反应的CD4+T细胞引发VZV特异性CD4+和CD8+T细胞。
经批准的疫苗Zostavax在50至60岁成年人中展示约60％至70％的功效且随年龄而降低。近来，亚单位佐剂疫苗(Shingrix：gE蛋白+ASO1B)展示在50岁以上成年人的所有年龄群中都具有约90％的功效。然而，此疫苗在10％的疫苗接种受试者体内展示3级严重AE。Shingrix在对Zostavax两次给药后展示约对数倍更优的T和B细胞反应。在本发明的研究中，研究以gE构筑体进行mRNA免疫在小鼠和NHP中的免疫原性。
本研究定义为用于测试候选VZV疫苗在BALB/C小鼠中的免疫原性，所述候选VZV疫苗包含编码来自VZV的糖蛋白gE的mRNA多核苷酸。以如下文表11中所述的各种VZV mRNA疫苗配制物对小鼠进行免疫。以对第1至5组进行预致敏来模拟原发性水痘暴露且以mRNA构筑体VZV-gE-del_574_Y569A对第6组进行预致敏。如表11中所示，在第28天对所有组(第1至6组)进行补强。在第-3天、第21天、第38天和第42天对动物抽血。在第38天和第42天收集血液和脾脏用于血清学和T细胞分析。如图14A中所示，所有组都对mRNA疫苗接种产生相当的抗-gE抗体反应，其中动物接收mRNA用于预致敏且补强(第6组)趋势更高。如图15A中所示，所有组都展示CD4 T-细胞反应，其中mRNA预致敏和补强(第6组)趋于更高的反应。如图15B中所示，注意到可变的CD8 T-细胞反应，其中mRNA预致敏和补强(第6组)展示最高的CD8 T细胞频率。
表11：注射方案
实施例21：非人类灵长类动物中的免疫原性
基于实施例20中的资料，进一步评估mRNA构筑体VZV-gE-del_574_Y569A在非人类灵长类动物中的免疫原性。如下文表12中所述，将三组恒河猴以mRNA(VZV-gE-del_574_Y569A)或预致敏且补强。在第0天、第14天、第28天和第42天对动物抽血以进行血清学和T细胞分析。在第0天、第28天和第42天进行T细胞分析。如图16A和16B中所示，mRNA预致敏和补强(第1组)产生最高的抗-gE效价，其后为预致敏、mRNA补强(第2组)。后一组(第2组)的抗-gE效价则比预致敏、补强(第3组)要好约10倍。如图16C和16D中所示，在预致敏、补强组(第3组)中未检测到产生IFNγ、IL-2或TNFα的CD4-T细胞。相反，如图16C和16D中所示，在mRNA预致敏、mRNA补强组(第1组)和预致敏、mRNA补强组(第2组)中检测到合理频率的产生IFNγ、IL-2或TNFα的CD4-T细胞且在统计学上无分别。这些资料表明在Zostavax暴露后进行一剂量的mRNA疫苗接种在引发相当的T细胞反应方面等同于两剂量的mRNA疫苗接种。
表12：注射方案
表13.水痘带状疱疹病毒氨基酸序列
表14.VZV多肽序列
表15.鞭毛蛋白核酸序列
表16.鞭毛蛋白氨基酸序列
等效形式
本领域技术人员将意识到，或使用不超出常规的实验即能够确认本文所述本发明的特定实施方案的多种等效形式。所述等效形式意欲由以下权利要求书所涵盖。
本文公开的所有参考文献，包括专利文件，都以全文引用的方式并入。

Claims (112)

1.一种水痘带状疱疹病毒(VZV)疫苗，所述疫苗包含至少一种具有编码至少一种VZV抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
2.如权利要求1所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸具有编码两种或两种以上VZV抗原性多肽的开放阅读框架。
3.如权利要求1或2所述的VZV疫苗，其中所述至少一种VZV抗原性多肽是VZV糖蛋白或其抗原性片段或表位。
4.如权利要求1或2所述的VZV疫苗，其中所述至少一种VZV抗原性多肽是VZV被膜蛋白或其抗原性片段或表位。
5.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述VZV糖蛋白是选自VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN以及gM。
6.如权利要求5所述的VZV疫苗，其中所述VZV糖蛋白是VZV gE。
7.如权利要求5所述的VZV疫苗，其中所述VZV糖蛋白是VZV gI。
8.如权利要求6所述的VZV疫苗，其中所述VZV糖蛋白是变异体VZV gE多肽。
9.如权利要求8所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽是缺少锚结构域(ER保留结构域)的截短多肽。
10.如权利要求8所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽是缺少羧基末端尾结构域的截短多肽。
11.如权利要求9所述的VZV疫苗，其中所述VZV抗原性片段是包含SEQ ID NO：10的氨基酸1至561的截短VZV gE多肽。
12.如权利要求10所述的VZV疫苗，其中所述VZV抗原性片段是包含SEQ ID NO：18的氨基酸1至573的VZV gE变异体多肽。
13.如权利要求8所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽在与ER保留、胞吞作用和/或定位于高基氏体或反式高基氏体网络相关的至少一个基序中具有至少一种突变。
14.如权利要求13所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽在至少一个磷酸化酸性基序中具有至少一种突变。
15.如权利要求13所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽相对于SEQ ID NO：10具有Y582G突变。
16.如权利要求13所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽相对于SEQ ID NO：10具有Y569A突变。
17.如权利要求13所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZV gE多肽相对于SEQ ID NO：10具有Y582G突变和Y569A突变。
18.如权利要求12所述的VZV疫苗，其中所述VZV抗原性片段相对于SEQ ID NO：10具有Y569A突变。
19.如权利要求6或如权利要求13至17中任一项所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZVgE多肽具有A-E-A-A-D-A序列(SEQ ID NO：58)。
20.如权利要求6或如权利要求13至17中任一项所述的VZV疫苗，其中所述变异体VZVgE多肽在C末端具有Igκ序列。
21.如权利要求11或12所述的VZV疫苗，其中所述VZV gE抗原性片段在C末端具有Igκ序列。
22.如权利要求5所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码VZV gE和gI抗原性多肽。
23.如权利要求6或如权利要求8至21中任一项所述的VZV疫苗，其中所述疫苗包含至少一种具有编码gI抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
24.如权利要求6或如权利要求8至21中任一项所述的VZV疫苗，其中所述疫苗包含至少一种具有编码选自VZV gB、gH、gK、gL、gC、gN以及gM的抗原性多肽的开放阅读框架的RNA多核苷酸。
25.如权利要求4所述的VZV疫苗，其中至少一种RNA多核苷酸具有编码选自VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN以及gM的VZV抗原性多肽的开放阅读框架。
26.如权利要求5至25中任一项所述的VZV疫苗，所述疫苗还包含活的减毒VZV、整体未活化的VZV或VZV VLP。
27.如权利要求1至3中任一项所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由选自SEQ ID NO：1至8、37、39、41、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88或90的至少一个核酸序列、至少一个核酸序列片段或至少一个核酸序列表位来编码，或其中所述至少一种RNA多核苷酸由选自SEQ ID NO：6、37、39、84或86的至少一个核酸序列、至少一个核酸序列片段或至少一个核酸序列的表位序列来编码。
28.如权利要求1至3中任一项所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸包含选自SEQ ID NO：92至108以及123至131的序列。
29.如权利要求1至3中任一项所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸包含选自SEQ ID NO：92至108以及123至131的至少一个核酸序列片段或至少一个mRNA序列的表位。
30.如权利要求6所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由SEQ ID NO：1编码。
31.如权利要求7所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由SEQ ID NO：2编码。
32.如权利要求11所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由SEQ ID NO：3编码。
33.如权利要求12所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由SEQ ID NO：5编码。
34.如权利要求18所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由SEQ ID NO：6、37、39、84或86编码。
35.如权利要求19所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸由SEQ ID NO：7编码。
36.如权利要求19所述的VZV疫苗，其中所述RNA多核苷酸由SEQ ID NO：8编码。
37.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、26、30、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少90％一致性的抗原性多肽。
38.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、26、30、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少95％一致性的抗原性多肽。
39.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、26、30、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少96％一致性的抗原性多肽。
40.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、26、30、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少97％一致性的抗原性多肽。
41.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、26、30、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少98％一致性的抗原性多肽。
42.如权利要求3所述的VZV疫苗，其中所述至少一种RNA多核苷酸编码与SEQ ID NO：10、14、26、30、38、42和45至55中任一者的氨基酸序列具有至少99％一致性的抗原性多肽。
43.如权利要求1至42中任一项所述的VZV疫苗，其中编码所述多核苷酸的所述开放阅读是经过密码子优化的。
44.如权利要求1至43中任一项所述的VZV疫苗，其中所述疫苗是多价的。
45.如权利要求1至43中任一项所述的VZV疫苗，其中所述RNA多核苷酸包含至少一种化学改性。
46.如权利要求45所述的VZV疫苗，所述疫苗还包含第二种化学改性。
47.如权利要求45或权利要求46所述的VZV疫苗，其中所述化学改性选自由以下各项组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。
48.如权利要求45所述的VZV疫苗，其中所述开放阅读框架中80％的尿嘧啶具有化学改性。
49.如权利要求48所述的VZV疫苗，其中所述开放阅读框架中100％的尿嘧啶具有化学改性。
50.如权利要求45至49中任一项所述的VZV疫苗，其中所述化学改性位于所述尿嘧啶的第5位。
51.如权利要求50所述的VZV疫苗，其中所述化学改性是N1-甲基假尿苷。
52.如权利要求1至51中任一项所述的VZV疫苗，其中所述疫苗配制在阳离子脂质纳米粒子中。
53.如权利要求52所述的VZV疫苗，其中所述阳离子脂质纳米粒子包含阳离子脂质、PEG改性的脂质、固醇和非阳离子脂质。
54.如权利要求53所述的VZV疫苗，其中所述阳离子脂质是可电离的阳离子脂质并且所述非阳离子脂质是中性脂质，并且所述固醇是胆固醇。
55.如权利要求52所述的VZV疫苗，其中所述阳离子脂质选自由以下各项组成的组：2，2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油基-甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和9-((4-(二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)。
56.如权利要求54所述的VZV疫苗，其中所述阳离子脂质纳米粒子具有约20％至60％的阳离子脂质、约5％至25％的非阳离子脂质、约25％至55％的固醇以及约0.5％至15％PEG改性脂质的摩尔比。
57.如权利要求52所述的VZV疫苗，其中所述纳米粒子具有小于0.4的多分散性值。
58.如权利要求52所述的VZV疫苗，其中所述纳米粒子在中性pH值下具有净中性电荷。
59.如权利要求52所述的VZV疫苗，其中所述纳米粒子具有50至200nm的平均直径。
60.如权利要求1至59中任一项所述的VZV疫苗，所述疫苗用于在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法中，所述方法包括向所述受试者施用可有效产生抗原特异性免疫反应的量的所述疫苗。
61.一种如权利要求1至59中任一项所述的VZV疫苗的用途，所述疫苗用于制造用以在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法中的药物，所述方法包括向所述受试者施用可有效产生抗原特异性免疫反应的量的所述疫苗。
62.一种预防或治疗VZV感染的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求1至59中任一项所述的疫苗。
63.一种在受试者体内引发抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用可在所述受试者体内有效产生抗原特异性免疫反应的量的如权利要求1至59中任一项所述的疫苗。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述抗原特异性免疫反应包含T细胞反应或B细胞反应。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中向所述受试者施用单一剂量的所述疫苗。
66.如权利要求63或64所述的方法，其中向所述受试者施用第一剂量和第二(补强)剂量的所述疫苗。
67.如权利要求63至66中任一项所述的方法，其中通过皮内注射或肌肉内注射向所述受试者施用所述疫苗。
68.如权利要求63至67中任一项所述的方法，其中在所述受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了至少1log。
69.如权利要求63至68中任一项所述的方法，其中在所述受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加了1至3log。
70.如权利要求63至69中任一项所述的方法，其中在所述受试者体内产生的所述抗-抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加至少2倍。
71.如权利要求63至70中任一项所述的方法，其中在所述受试者体内产生的所述抗-抗原性多肽抗体效价相对于对照值而言增加2至10倍。
72.如权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述对照值是在未施用针对所述病毒的疫苗的受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
73.如权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述对照值是在施用了针对所述病毒的活的减毒疫苗或不活化疫苗的受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
74.如权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述对照值是在施用了针对所述病毒的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
75.如权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述对照值是在施用了针对所述病毒的VLP疫苗的受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
76.如权利要求63至75中任一项所述的方法，其中所述有效量是等同于针对所述病毒的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的医疗常规剂量减低至少2倍的剂量，而且其中在所述受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价等同于在分别施用了所述医疗常规剂量的针对所述病毒的重组蛋白疫苗或纯化蛋白疫苗的对照受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
77.如权利要求63至75中任一项所述的方法，其中所述有效量是等同于针对所述病毒的活的减毒疫苗或不活化疫苗的医疗常规剂量减低至少2倍的剂量，而且其中在所述受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价等同于在分别施用了所述医疗常规剂量的针对所述病毒的活的减毒疫苗或不活化疫苗的对照受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
78.如权利要求63至75中任一项所述的方法，其中所述有效量是等同于针对所述病毒的VLP疫苗的医疗常规剂量减低至少2倍的剂量，而且其中在所述受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价等同于在施用了所述医疗常规剂量的针对所述病毒的VLP疫苗的对照受试者体内产生的抗-抗原性多肽抗体效价。
79.如权利要求63至78中任一项所述的方法，其中所述有效量是50μg至1000μg的总剂量。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述有效量是总计两次向所述受试者施用的25μg、100μg、400μg或500μg的剂量。
81.如权利要求63至80中任一项所述的方法，其中所述疫苗针对所述病毒的功效大于65％。
82.如权利要求63至81中任一项所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对所述病毒免疫持续长达2年。
83.如权利要求63至81中任一项所述的方法，其中所述疫苗使所述受试者对所述病毒免疫持续2年以上。
84.如权利要求63至83中任一项所述的方法，其中所述受试者年龄是约1岁至约10岁。
85.如权利要求63至84中任一项所述的方法，其中所述受试者已暴露于所述病毒，其中所述受试者感染所述病毒，或其中所述受试者存在受所述病毒感染的风险。
86.如权利要求63至85中任一项所述的方法，其中所述受试者免疫功能不足。
87.一种工程化核酸，所述工程化核酸编码如权利要求1至59中任一项所述的疫苗的至少一种RNA多核苷酸。
88.一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有(i)5′端帽、(ii)编码至少一种VZV抗原性多肽的开放阅读框架，以及(iii)3′聚腺苷酸尾(polyA tail)。
89.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：6标识的序列的序列编码。
90.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：37标识的序列的序列编码。
91.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：39标识的序列的序列编码。
92.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：84标识的序列的序列编码。
93.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸由包含由SEQ ID NO：86标识的序列的序列编码。
94.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：128标识的序列。
95.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：99或133标识的序列。
96.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种mRNA多核苷酸包含由SEQ ID NO：107或134标识的序列。
97.如权利要求88所述的疫苗，其中所述至少一种VZV抗原性多肽包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
98.如权利要求88至97中任一项所述的疫苗，其中所述5′端帽是7mG(5′)ppp(5′)N1mpNp或包含7mG(5′)ppp(5′)N1mpNp。
99.如权利要求88至98中任一项所述的疫苗，其中所述开放阅读框架中100％的尿嘧啶被改性而在所述尿嘧啶的第5位包括N1-甲基假尿苷。
100.如权利要求88至99中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗被配制在脂质纳米粒子中。
101.如权利要求100所述的疫苗，其中所述疫苗还包含柠檬酸三钠缓冲剂、蔗糖以及水。
102.一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包含至少一种包含由SEQ ID NO：99标识的核酸序列的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸具有(i)5′端帽、(ii)编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架以及(iii)3′聚腺苷酸尾，其中所述5′端帽是7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
103.如权利要求102所述的VZV疫苗，其中所述由SEQ ID NO：99标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
104.一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包含至少一种包含由SEQ ID NO：133标识的核酸序列的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸具有(i)5′端帽、(ii)编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架以及(iii)3′聚腺苷酸尾，其中所述5′端帽是7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
105.如权利要求104所述的VZV疫苗，其中所述由SEQ ID NO：133标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
106.一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包含至少一种包含由SEQ ID NO：107标识的核酸序列的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸具有(i)5′端帽、(ii)编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架以及(iii)3′聚腺苷酸尾，其中所述5′端帽是7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
107.如权利要求106所述的VZV疫苗，其中所述由SEQ ID NO：107标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性而在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
108.一种VZV疫苗，所述VZV疫苗包含至少一种包含由SEQ ID NO：134标识的核酸序列的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸具有(i)5′端帽、(ii)编码VZV抗原性多肽的开放阅读框架以及(iii)3′聚腺苷酸尾，其中所述5′端帽为7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。
109.如权利要求108所述的VZV疫苗，其中所述由SEQ ID NO：134标识的序列的尿嘧啶核苷酸被改性成在所述尿嘧啶核苷酸的第5位包括N1-甲基假尿苷。
110.一种用于对受试者进行疫苗接种的医药组合物，所述医药组合物包含有效剂量的编码水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原的mRNA，其中所述有效剂量足以产生如在施药1到72小时后在受试者的血清中测量的可检测水平的抗原。
111.如权利要求110所述的组合物，其中所述抗原的截断指数是1到2。
112.一种用于对受试者进行疫苗接种的医药组合物，所述医药组合物包含有效剂量的编码水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原的mRNA，
其中所述有效剂量足以产生如在施药1到72小时后在受试者的血清中测量的由中和抗体针对所述抗原所产生的1,000-10,000中和效价。
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