CN116355917B - 一种水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗及其应用 - Google Patents
一种水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种水痘‑带状疱疹病毒mRNA疫苗及其应用，通过对mRNA核酸序列中的CDS序列进行点突变和密码子优化，再选择合适的启动子、5’‑UTR、3’‑UTR和3’‑端PolyA组合成完整的编码水痘‑带状疱疹病毒的mRNA核酸，并改进mRNA疫苗的试剂配方，提高LNP载药量，最终获得能呈现强烈且稳定的免疫效果，大幅提升动物体内的抗体滴度，并且不影响动物正常生长的水痘‑带状疱疹病毒mRNA疫苗，还可显著降低疫苗成本，临床应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其应用。
背景技术
带状疱疹是由水痘-带状疱疹病毒引起的急性感染性皮肤病。水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)初次感染引起水痘，愈合后残留的病毒潜伏于脊神经后跟及颅神经的神经节中，当VZV特异性的细胞免疫下降时，病毒重新复活发生带状疱疹；在所有神经系统的疾病中，其发病率最高。带状疱疹的发生风险随年龄增长而增加，高龄之所以成为带状疱疹重要的危险因素，可能是因为随着年龄增长，免疫逐步减弱，VZV特异性细胞免疫(CMI)反应的成分减少所致。带状疱疹患者常伴有较多并发症，如带状疱疹后神经痛(PHN)、带状疱疹眼病(HZO)、Ramsay Hunt综合征，以及其他并发症包括运动神经损伤和其他神经系统并发症如脑膜炎等。据估计，大约三分之一的人在一生中会患带状疱疹，带状疱疹的发病高风险人群为老年人或免疫功能低下者。我国每年有近300万人受带状疱疹影响，50岁及以上人群每年新发带状疱疹病例约156万例。当前，我国正处于老龄化发展阶段，带状疱疹易感人群数量逐年上升，加速研制安全有效的带状疱疹疫苗，将为全面推进中国健康老龄化发展发挥作用。
疫苗接种是预防和控制带状疱疹及其并发症最有效的手段。目前批准上市的疫苗有两种，分别是带状疱疹减毒活疫苗和重组带状疱疹佐剂亚单位疫苗。此外，还有一种带状疱疹灭活疫苗处于临床研究阶段。
2006年，美国FDA批准首个带状疱疹减毒活疫苗(Oka/Merck strain，Merck&Co)上市，该疫苗是由Merck公司开发的，基于其已上市的水痘减毒活疫苗(Varivax，Oka/Merck)，经浓缩制备，病毒含量是水痘减毒活疫苗的14倍，但是该疫苗预防带状疱疹的效力仅为60％-70％。Merck公司开发的带状疱疹减毒活疫苗抗原用量大、生产成本高，免疫原性较差，诱导细胞免疫效果差，疫苗保护效力会随着年龄的增长而逐渐降低，并且由于其为减毒活疫苗，限制了其在免疫抑制人群、活动性肺结核患者、孕妇等人群的中使用。因此，2020年7月起，该疫苗已不再使用。
2017年，重组带状疱疹佐剂亚单位疫苗(Shingrix，GSK)FDA批准上市用于50岁以上人群预防带状疱疹和愈后神经痛，该疫苗由重组VZV糖蛋白E和T细胞加强佐剂AS01B组成，针对带状疱疹的总体疫苗效力为97.2％。AS01B佐剂包含两种免疫刺激剂MPLA(3-O-desacyl-4’-monophosphoryl 1ipid A)和QS-21：MPLA可激活天然免疫系统，刺激细胞因子的分泌和协同刺激分子的表达；QS-21是一种皂素，可促进抗原特异性抗体反应。但QS-21具有溶血性，需要配合胆固醇和脂质体形式使用以消除副作用。佐剂间接提示该脂质体系统应用于疫苗时稳定性有待进一步提高。此外，采用CHO细胞系生产糖蛋白E，具有成本高，发酵、纯化工艺复杂、糖基化产物不稳定、质量控制难度大等缺点。
尽管带状疱疹疫苗在全球范围内大多数国家被推广应用，遗憾的是，目前中国仍无带状疱疹疫苗上市。
疫苗诱导机体产生体液免疫应答即VZV特异性抗体的能力，是疫苗有效性的一个保障。抗体水平的增长倍数与疫苗的保护性效力密切相关；同时，带状疱疹的发生也与体内VZV特异性细胞介导免疫(Cell-mediated immunity，CMI)的下降有着重要的关联。由脂质纳米粒(LNPs)包裹的体外转录的mRNAs组成的核酸疫苗不仅可有效引发特异性的体液免疫，还激发CD4+T细胞免疫反应。通过LNP递送mRNA抗原可提高对疫苗的免疫应答，LNP可以保护mRNA不受酶降解，并促进靶细胞对mRNA的有效摄取和细胞内释放。
因此，尽快研制带状疱疹mRNA疫苗，进一步增强细胞免疫应答作用，提高疫苗的有效性，降低成本，是亟需解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种新型的水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗，通过对mRNA核酸序列中的CDS序列进行点突变和密码子优化，再选择合适的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合成完整的编码水痘-带状疱疹病毒的mRNA核酸，并改进mRNA疫苗的试剂配方，提高LNP载药量，最终获得能呈现强烈且稳定的免疫效果，大幅提升动物体内的抗体滴度，并且不影响动物正常生长的水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗，还可显著降低疫苗成本，临床应用前景广阔。
一方面，本发明提供了一种编码水痘-带状疱疹病毒的核酸，具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7任一项所示的序列，或与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7任一项具有80％以上同源性的序列，或与SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.7任一项所示的序列中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的序列，或与SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.7任一项部分互补或完全互补的序列，或对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7任一项所示的序列进行核苷酸修饰的序列。
本发明提供的编码水痘-带状疱疹病毒的核酸，包括编码水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE的核酸，所述核酸为mRNA，用于制备mRNA疫苗。
不同的物种，不同的细胞，选择的候选mRNA序列是不同的，这是因为不同的物种，不同的细胞在编码同一种氨基酸时，选择的同义密码子是不同的(也就是密码子使用频率不同)，具有各自的偏向性，此种现象称为密码子偏向性。故为了能够在疫苗后续的使用物种比如人或非人灵长类或啮齿类中能够利用其密码子的偏好性稳定且高表达蛋白，必须对gE蛋白翻译区进行密码子优化，才能用于制备mRNA疫苗。
制备水痘-带状疱疹病毒的mRNA疫苗，主要是对gE蛋白翻译区的进行点突变和密码子优化，获得CDS序列，其中的点突变采用的是研究团队在前期研究过程中采用的点突变方式：使gE的第569位序列发生Y到A的突变，且第593位序列发生S到A的突变，且第595位序列发生S到A的突变，且第596位序列发生T到A的突变，且第598位序列发生T到A的突变；密码子优化包括：针对在小鼠及人体或非人灵长类内表达时的密码子偏好性进行调整、针对在小鼠及人体内表达时的密码子偏好性进行调整，优化并添加个别的稀有密码子和多个终止密码子，得到大量的核苷酸序列；再经过平均GC含量的微调，优化避开因构建质粒时需要的其他酶切位点序列，优化个别连续的短重复碱基结构，优化个别的可能存在co-loop缺陷的二级结构，获得核苷酸序列，使其能顺利在小鼠及人体或非人灵长类内表达，再经筛选获得核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.7所示的7条mRNA核苷酸。
在一些方式中，本发明提供的编码水痘-带状疱疹病毒的核酸，是对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE双突变株(包括Y569A，S593A，S595A，T596A，T598A)，其序列如SEQ IDNo.15所示)进行密码子优化，其中密码子优化包括：针对在小鼠及人体内表达时的密码子偏好性进行调整、常用密码子的使用频率进行调整得到大量的核苷酸序列；再根据适配质粒构建载体的酶切位点、GC含量、密码子适应指数、稀有密码子使用频率、二级结构等进行筛选，获得核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.7所示的7条CDS序列。
进一步地，还包括启动子、5’-UTR、3’-UTR或3’-端PolyA中的至少一种或多种。
本发明提供的mRNA还包括启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA等非编码区的序列，非编码区序列的选择也会影响mRNA结构的稳定性，以及影响生物体内的目标蛋白翻译效率，因此针对每一个CDS序列，还需选择合适的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA。
在一些方式中，本发明采用T7启动子。
在一些方式中，T7启动子优选采用AG结尾的T7Promoter，有助于提高mRNA结构的稳定性：TAATACGACTCACTATAAG。
在一些方式中，CDS序列还包括Kozak序列。
在一些方式中，Kozak序列分别采用GGCTAGCGCCGCCACC或GCCACC或GCCGCCACC。
在一些方式中，5’UTR序列分别采用GAGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC 或GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCC 或GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCC 或GAGACCCAAGCTGGCTAGCGGGAGAAAGCTTACC 或CTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGG 或TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA或GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA。
在一些方式中，3’UTR序列分别采用CTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCCTGGAGCTAGC或GCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA或TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC或GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGC或GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC或
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTGAGGGTCTAGAACTAGTGTCGACGC或TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA。
进一步地，所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7任一项所示的序列与启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的序列分别如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.14所示。
CDS序列为SEQ ID NO.1时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.8；CDS序列为SEQ ID NO.2时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.9；CDS序列为SEQ ID NO.3时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.10；CDS序列为SEQ IDNO.4时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ IDNO.11；CDS序列为SEQ ID NO.5时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.12；CDS序列为SEQ ID NO.6时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.13；CDS序列为SEQ ID NO.7时，与优选的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.14。
进一步地，所述编码水痘-带状疱疹病毒的核酸优选具有如SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示的序列。
研究证明，含有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列的mRNA疫苗，能在动物体内产生更高更稳定的抗体滴度。
进一步地，具有如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的序列。
CDS序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5时，与启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合后的mRNA序列为SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12。
另一方面，本发明提供了一种核酸-脂质复合物，包括如上所述的核酸和递送核酸的脂质体。
进一步地，所述递送核酸的脂质体包括缓冲液和脂质溶液；所述缓冲液与如上所述的核酸共同组成水相溶液，缓冲液pH为4～6；所述脂质溶液用于包裹水相溶液。
进一步地，所述缓冲液中包括冰乙酸、三水乙酸钠和DEPC水；所述脂质溶液中的脂质含量为10～20mg/mL，所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
在一些方式中，缓冲液中还包括氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，pH为5.5。
在一些方式中，所述脂质溶液中的脂质含量为10～20mg/mL，所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
在一些方式中，所述SM-102：胆固醇：DSPC：DMG-PEG2000的质量比为141.36:59.26:31.44:14.97。
现有的mRNA疫苗试剂的载药量较低，在生物体内要达到治疗效果所需要的用量较大，存在试剂用量大给患者带来潜在的毒副作用增加的危害隐患。因此需要开发载药量更高、用量和毒副作用更低、免疫效果更好的，既可以预防也可以起到治疗作用的mRNA疫苗试剂。本发明所述载药量是指单位体积的药物试剂中mRNA的含量。
比如，现有水痘-带状疱疹mRNA试剂配方的载药量较低，导致同等剂量时所需的给药试剂体积偏大，同时由于载药量低，使较多的大分子辅料带入体内，副作用风险高。
本发明通过改进水痘-带状疱疹mRNA疫苗试剂的缓冲液配方和pH，使试剂配方中的mRNA载药量显著提升，同等辅料物质的量下，提高单位体积mRNA载药量，可以有效减少同等剂量下的给药制剂体积，从而获得更加显著的免疫治疗效果，同时相应地减少了进入体内的大分子辅料等的量，在一定程度上降低辅料可能带来的副反应，如有效减少PEG等成分在其他脏器或组织等中的免疫刺激作用。
在一些方式中，本发明经研究证明，相比于现有的含有三甲胺、盐酸三乙胺等成分的水相溶液配方，采用本发明提供的含有氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐的水相溶液配方能显著提升注射试剂的载药量，同时该试剂具有非常好的稳定性，可长期保存，其中的mRNA含量等药物成分含量稳定，有良好的临床应用条件。
另外，本发明发现，维持水相溶液合适的pH值，也能显著提升用于微针皮内注射的mRNA疫苗的载药量，若将pH调至4～6等偏酸性范围内，能使脂质体中负载的mRNA含量显著提升，并在特定pH条件下，即pH5.5时达到最优。其原因可能是，在制备时，在偏酸环境可以使得可电离阳离子脂质带正电荷，同等条件下可以吸附更多核酸分子(如mRNA等，本身带负电荷)，且这种最优是在水相制备溶液为pH5.5时体现，相比于pH7.4或pH4等条件下的缓冲液，pH5.5时可以更加有效荷载核酸分子，达成相对稳定的可用制剂，因此载药量更高。
在一些方式中，所述缓冲液中的氨基丁三醇：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐：冰乙酸：三水乙酸钠：DEPC水的质量比为99.2:377.6:13.76:64:40。本发明提供的水相溶液配方必须严格按照特定比例配置，才能维持在较高的载药量。
在一些方式中，所述脂质溶液中的脂质含量为10～20mg/mL，所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
本发明经大量研究证明，通过调控试剂中的脂质含量，也可显著提高脂质体的载药量。所述脂质包括胆固醇、可电离阳离子脂质、磷脂和PEG化脂质，是一种复合脂质体；提高脂质含量，是指同时提高胆固醇、可电离阳离子脂质、磷脂和PEG化脂质四种成分的含量，使脂质溶液中的脂质含量从最初的7.72mg/mL提高到10～20mg/mL，最优选为15.44mg/mL，可使脂质制剂体系的载药量由29.39μg/mL左右至少提高到157.75μg/mL左右。
在一些方式中，所述可电离阳离子脂质为SM-102(十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯))；磷脂为DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)；PEG化脂质为DMG-PEG(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000)，其PEG分子量范围可为1000～5000Da；可电离阳离子脂质：胆固醇：磷脂：PEG化脂质的质量比为(9～10)：(3～4)：(2～3)：1。
在一些方式中，所述PEG化脂质为DMG-PEG2000；所述SM-102：胆固醇：DSPC：DMG-PEG2000的质量比为141.36:59.26:31.44:14.97。
本发明提供的核酸-脂质复合物通过微流控纳米药物制备系统制得。
再一方面，本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗，所述疫苗包括如上所述的核酸，或包括如上所述的核酸-脂质复合物。
再一方面，本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗在提高动物体内产生的水痘-带状疱疹病毒抗体滴度的用途，所述疫苗包括如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的序列，或包括如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的序列。
再一方面，本发明提供了一种脂质体在制备高载药量的水痘-带状疱疹病毒疫苗的用途，所述脂质体包括缓冲液和脂质溶液；所述缓冲液与如上所述的mRNA共同组成水相溶液，缓冲液pH为4～6；所述脂质溶液用于包裹水相溶液；其中，缓冲液中包括氨基丁三醇和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐；所述脂质溶液中的脂质含量为10～20mg/mL，所述脂质包括可电离阳离子脂质、胆固醇、磷脂和PEG化脂质。
本发明具有以下有益效果：
(1)通过对mRNA核酸序列中的CDS序列进行点突变和密码子优化，再选择合适的启动子、5’-UTR、3’-UTR和3’-端PolyA组合成完整的编码水痘-带状疱疹病毒的mRNA核酸，共计筛选获得7组全新的编码水痘-带状疱疹病毒的mRNA核酸；
(2)改进了LNP的试剂配方，提高LNP载药量；
(3)采用编码水痘-带状疱疹病毒的mRNA核酸，与LNP组合，制备得到mRNA疫苗，最终获得能呈现强烈且稳定的免疫效果，大幅提升动物体内的抗体滴度，并且不影响动物正常生长；
(4)降低疫苗成本，临床应用前景广阔。
详细说明
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：生物化学与分子生物学词典(Dictionary of Biochemistryand Molecular Biology)，(第2版)J.Stenesh(编著)，Wiley-Interscience(1989)；微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第3版)，P.Singleton和D.Sainsbury(编著)，Wiley-Interscience(2007)；钱伯斯科技词典(Chambers Dictionary of Science and Technology)(第2版)，P.Walker(编著)，Chambers(2007)；遗传学词汇(Glossary of Genetics)(第5版)，R.Rieger等(编著)，Springer-Verlag(1991)；以及哈珀柯林斯生物学词典(The HarperCollins Dictionaryof Biology)，W.G.Hale和J.P.Margham，(编著)，HarperCollins(1991)。
尽管与本文所描述的类似或等效的任何方法和组合物可用于本发明的实践或检验，但本文描述了优选的方法和组合物。出于本发明的目的，下面为了清楚和便于参考起见对以下术语加以定义：根据长期以来的专利法惯例，当在本申请包括权利要求书中使用不带数量指示的指称物时，表示“一或多”。术语“约”和“近似”用于本文中时是可互换的，并且一般应理解为是指一个给定数字周围的数字范围，以及所叙述的数字范围内的所有数字。此外，本文中的所有数值范围应理解为包括该范围内的各个整数。
mRNA
mRNA可以包括至少两种核苷酸。核苷酸可以是天然存在的核苷酸或修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约5种核苷酸至约5,000种核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至少约5种核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至多约5,000种核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约5种核苷酸至约20种核苷酸、约5种核苷酸至约40种核苷酸、约5种核苷酸至约60种核苷酸、约5种核苷酸至约80种核苷酸、约5种核苷酸至约100种核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约5种核苷酸、约20种核苷酸、约40种核苷酸、约60种核苷酸、约80种核苷酸、约100种核苷酸、约200种核苷酸、约500种核苷酸、约1,000种核苷酸、约2000种核苷酸或约5000种核苷酸。
mRNA可以包括至少一种本申请所述的修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约1种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至少约1种修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至多约100种修饰核苷酸。
mRNA可以包括至少0.1％的修饰核苷酸。修饰核苷酸的分数可以计算为：修饰核苷酸的数量/核苷酸的总数*100％。在一些实施例中，RNA分子包括约0.1％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至少约0.1％的修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至多约100％修饰核苷酸。
经过修饰的核苷酸
在一些方式中，所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸选择如下一种或者几种核苷酸：2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷、N-1-甲基-假尿苷、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷；甲基化碱基；插入碱基；2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖；硫代磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键。以及PCT/CN2020/074825，PCT/CN2020/106696中所描述的改性核苷酸进行修饰。
mRNA疫苗
mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体，直接进行翻译，形成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答，达到预防免疫的作用，是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗后的第三代疫苗，具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、易规模化扩大等特点。mRNA疫苗的基本原理是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内，在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护。
由于mRNA自身的稳定性差、易被组织内的核酸酶降解、进入细胞的效率较低、翻译效率较低等问题，这些缺陷限制了mRNA疫苗的应用，不同的递送载体对mRNA疫苗的稳定性和翻译效率也起到非常关键的作用，递送载体可分为病毒载体和非病毒载体(包括脂质体、非脂质体、病毒、纳米颗粒等)。因此需要进行相关的改进措施，以下是mRNA制备的药理学改进策略：1、合成帽类似物或使用加帽酶通过与真核翻译起始因子4E(EIF4E)结合来稳定mRNA并增加蛋白翻译；2、调节5′-非翻译区(UTR)和3′-UTR中的元件来稳定mRNA并增加蛋白翻译；3、添加Poly(A)尾可使mRNA稳定并增加蛋白质翻译；4、修饰核苷来减少先天免疫激活并增加翻译；5、使用RNase III处理和快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化可降低免疫激活并增加翻译；6、优化序列或密码子来增加翻译；7、翻译起始因子和其他方法的共同递送来改变翻译和免疫原性。本发明主要通过采用突变序列，优化密码子，并调整启动子、5′-UTR、3′-UTR和Poly(A)尾，从而获得能产生更高免疫活性的水痘-带状疱疹mRNA疫苗。
CDS序列
CDS(Coding sequence)是指成熟mRNA中可以被翻译为蛋白质的编码序列区域，自起始密码子开始至终止密码子结束。CDS必定是一个ORF(开放读码框)，但也可能包括很多ORF。反之，每个ORF不一定都是CDS。该区域由外显子组成，编码蛋白质的部分，边界范围从靠近5′末端的起始密码子开始，到靠近3′末端的终止密码子为止。mRNA的编码区范围位于5′非翻译区和部分同样为外显子的3′非翻译区之间。
合成后处理
合成后可加入5'帽和/或3'尾。帽的存在可以提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性。“尾”的存在可以用于保护mRNA免于核酸外切酶降解和/或调节蛋白质表达水平。
可以如下添加5'帽：第一，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基，留下两个末端磷酸基；然后通过鸟苷酰转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)加入到末端磷酸基中，产生5,5,5三磷酸键；然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A，G(5')ppp(5')A 和G(5')ppp(5')G。更多帽结构在已公布的美国申请No.US 2016/0032356中进行了描述，阿什奎尔海克(Ashiqul Haque)等，“化学修饰的hCFTRmRNA在囊性纤维化小鼠模型中恢复肺功能”(ChemicallymodifiedhCFTR mRNAsrecuperate lung function in a mouse model of cysticfibrosis)，科学报告(Scientific Reports)(2018)8：16776，以及科尔(Kore)等，“5'-端帽类似物的最新进展：合成和生物分支”(Recent Developments in 5’-Terminal Cap Analogs：SynthesisandBiological Ramifications)有机化学迷你读物(Mini-Reviews in Organic Chemistry)2008，5，179-192，其通过引用并入本申请。
尾结构可以包括聚(A)和/或聚(C)尾。mRNA的3'末端(例如，3'末端的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种核苷酸)上的聚-A尾可以包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的腺苷核苷酸。mRNA的3'末端(例如，3'末端的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100种核苷酸)上的聚-A尾可以包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％胞嘧啶核苷酸。
如本申请所述，添加5'帽和/或3'尾可以有助于检测体外合成期间产生的无效转录物，因为没有加帽和/或加尾，那些过早中止的mRNA转录物的大小可能太小而无法被检测到。因此，在一些实施例中，在测试mRNA纯度(例如，mRNA中存在的无效转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾加入合成的mRNA中。在一些实施例中，在如本申请所述纯化mRNA之前，将5'帽和/或3'尾加入到合成的mRNA中。在其他实施例中，在如本申请所述纯化mRNA后，将5'帽和/或3'尾加入到合成的mRNA中。
除了以上方法外，加帽或者加尾的步骤是在从DNA体外转录为RNA的转录过程总完成的，这些方法都是本领域一般技术人员可以自由选择。
根据本发明合成的mRNA可以不需进一步纯化而使用。特别地，可以使用根据本发明合成的mRNA而无需去除短聚物的步骤。在一些实施例中，根据本发明合成的mRNA进一步纯化。根据本发明可以使用各种方法纯化合成的mRNA。例如，可以使用离心、过滤和/或色谱方法进行mRNA的纯化。在一些实施例中，合成的mRNA通过乙醇沉淀或过滤或色谱法、或凝胶纯化或任何其它合适的方法纯化。在一些实施例中，通过HPLC纯化mRNA。在一些实施例中，在标准酚：氯仿：异戊醇溶液中提取mRNA，这是本领域技术人员所熟知的。在一些实施例中，使用切向流过滤纯化mRNA。合适的纯化方法包括在US 2016/0040154、US 2015/0376220、于2018年2月27日提交的PCT申请PCT/US18/19954，名称为“用于纯化信使RNA的方法”以及于2018年2月27日提交的题为“纯化信使RNA的方法”的PCT申请PCT/US18/19978中所描述的方法，所有这些都通过引用并入本申请并且可以用于实施本发明。
在一些实施例中，mRNA在加帽和封尾之前被纯化。在一些实施例中，加帽和封尾之后纯化mRNA。在一些实施例中，加帽和封尾之前和之后均纯化mRNA。在一些实施例中，通过离心在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。在一些实施例中，通过过滤在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。在一些实施例中，通过切向流过滤(TFF)或通过色谱法在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。
在一些方式中，加尾是伴随转录同时完成的，因此，也可以在加尾和加帽步骤完成后对核酸进行纯化，纯化的方法如前述的方法。所以，在一些方式中，纯化步骤应该都是在封尾之后。当然,mRNA也可以在加帽之前被纯化。当然也可以在转录之后就进行纯化。可以使用本领域可用的任何方法来检测和定量mRNA的全长或无效转录物。在一些实施例中，使用印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染色、光谱、紫外(UV)或UPLC或其组合检测合成的mRNA分子。本领域已知的其他检测方法包括在本发明中。在一些实施例中，使用UV吸收光谱法通过毛细管电泳分离来检测合成的mRNA分子。在一些实施例中，在凝胶电泳之前，mRNA被乙二醛染料变性。在一些实施例中，合成的mRNA在加帽或封尾前表征。在一些实施例中，合成的mRNA在加帽和封尾后表征。
在一些实施例中，根据本发明制备的mRNA基本上没有短聚物或无效转录物。特别地，通过毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳，根据本发明制备的mRNA包括不可检测水平的短聚物或无效转录物。如本文所用，术语“短聚物”或“无效转录物”是指任何小于全长的转录物。在一些实施例中，“短聚物”或“无效转录物”的长度小于100核苷酸、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20或者长度小于10核苷酸。在一些实施例中，添加5'-帽和/或3'-聚A尾后检测或量化短聚物。
UTR序列
3’-非翻译区(3’-UTR)：通常，术语“3’-UTR”是指人工核酸分子的一部分，其位于可读框的3’(即“下游”)，并且其不翻译为蛋白。通常，3’-UTR是mRNA的蛋白编码区(可读框(ORF)或编码序列(CDS))和聚腺苷酸序列之间的mRNA的一部分。在本发明的情况中，术语3’-UTR还可以包含这样的元件，其不在模板中编码，RNA由其转录，但在成熟过程中在转录后添加，例如聚腺苷酸序列。mRNA的3’-UTR不翻译为氨基酸序列。3′UTR序列通常由在基因表达过程中被转录为各自的mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为包含任选内含子的成熟前mRNA。成熟前mRNA随后在成熟过程中进一步被加工为成熟mRNA。该成熟过程包含以下步骤：5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内，3′-UTR对应于位于蛋白编码区终止密码子，优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端和mRNA的聚腺苷酸序列之间。术语“对应于”意为3′-UTR序列可以是如用于限定3′-UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内，术语“基因的3′-UTR”，为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′-UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′-UTR”包括3′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链二者以及成熟和未成熟的二者)。优选3′UTR具有多于20，30，40或50个核苷酸的长度。3′-非翻译区(3′UTR)：3′UTR典型地是mRNA的一部分，其位于mRNA的蛋白编码区(即可读框)和多聚腺苷酸序列之间。mRNA的3′UTR不翻译为氨基酸序列。在本发明范围内，3′UTR对应于位于蛋白编码区终止密码子的3′端，优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端，并且向多聚腺苷酸序列的5′侧，优选向紧接多聚腺苷酸序列的5′侧的核苷酸延伸的成熟mRNA序列。术语“对应于”意为3′UTR序列可以是如用于限定3′UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内，术语“基因的3′UTR”，如“白蛋白基因的3′UTR”，为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′UTR”包括3′UTR的DNA序列和RNA序列。
5’-非翻译区(5’-UTR)：通常，术语“5’-UTR”是指人工核酸分子的一部分，其位于可读框的5’(即“上游”)，并且其不翻译为蛋白。5’-UTR通常理解为信使RNA(mRNA)的特定区段，所述信使RNA位于mRNA的可读框的5’。通常，5’-UTR在转录起始位点起始并且在可读框的起始密码子之前的一个核苷酸处终止。优选地，所述5’UTR具有多于20，30，40或50个核苷酸的长度。5’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调控元件。所述调控元件可以是例如核糖体结合位点。5’-UTR可以被转录后修饰，例如通过加入5’-帽修饰。mRNA的5’-UTR不翻译为氨基酸序列。5’-UTR序列通常由基因表达过程中转录为各个mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为成熟前mRNA，其包含任选的内含子。成熟前mRNA然后在成熟过程中进一步加工为成熟mRNA。该成熟过程包括以下步骤：5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内，5′-UTR对应于位于起始密码子和例如5’-帽之间的成熟mRNA序列。优选地，5′-UTR对应于从位于5′帽的3′侧的核苷酸，更优选从紧邻5′帽的3′侧核苷酸，向位于蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸，优选向紧接蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸延伸的序列。紧接成熟mRNA 5′帽的3′侧的核苷酸典型地对应于转录起始位点。术语“对应于”意为5′-UTR序列可以是如用于限定5′-UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或与此RNA序列对应的DNA序列。在本发明范围内，术语“基因的5′-UTR”，是对应于源自该基因的成熟mRNA的5′-UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的5′-UTR”包括5′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链以及成熟和未成熟的二者)。
作为mRNA稳定化的备选方案，已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特征稳定化元件。例如，它们可以包含在其5＇末端(5＇-UTR)和/或在其3＇末端(3＇-UTR)的所谓非翻译区(UTR)以及其它结构特征，如5＇帽结构或3＇-聚腺苷酸尾。5＇-UTR和3＇-UTR二者都典型地从基因组DNA转录并且因此是成熟前(premature)mRNA元件。在mRNA加工过程中，成熟mRNA的特有结构特征，如5＇帽和3＇-聚腺苷酸尾(也称为多聚腺苷酸尾或聚腺苷酸序列)通常被添加于转录的(成熟前)mRNA。
3＇-聚腺苷酸尾典型地是添加在转录的mRNA的3＇末端的一段单调腺苷核苷酸序列。其可以包含至多约400个腺苷核苷酸。发现此种3＇-聚腺苷酸尾的长度对于个体mRNA的稳定性是可能的关键要素。此外，已显示α-球蛋白mRNA的3＇UTR可能是对于公知的α-球蛋白mRNA稳定性的重要因素(Rodgers等人，Regulatedα-globin mRNA decay is acytoplasmic eventproceeding through 3＇-to-5＇exosome-dependent decapping，RNA，8，第1526-1537页，2002)。α-球蛋白mRNA的3＇UTR明显参与特定核蛋白-复合物(α-复合物)的形成，其存在与mRNA体外稳定性相关(Wang等人，An mRNA stability complexfunctions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro，Molecularand Cellular biology，第19卷，第7期，1999年7月，第4552-4560页)。对于核糖体蛋白mRNA中的UTR已经进一步表明有趣的调节功能：在核糖体蛋白mRNA的5’-UTR控制生长相关的mRNA翻译的同时，该调节的严格性由核糖体蛋白mRNA中的各个3’-UTR赋予(Ledda等人，Effect of the 3’-UTR length on the translationalregulation of 5’-terminaloligopyrimidine mRNAs，Gene，第344卷，2005，p.213-220)。该机制促进核糖体蛋白的特异表达，所述核糖体蛋白通常以恒定的方式转录从而一些核糖体蛋白mRNA如核糖体蛋白S9或核糖体蛋白L32称为看家基因(Janovick-Guretzky等人，Housekeeping Gene Expressionin Bovine Liver is Affected by PhysiologicalState，Feed Intake，and DietaryTreatment，J.Dairy Sci.，Vol.90，2007，p.2246-2252)。核糖体蛋白的生长相关的表达模式因此主要是由于对翻译水平的调节。
术语“3’-UTR元件”是指包含源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列或由源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“3’-UTR元件”优选是指人工核酸序列，如人工mRNA的3’-UTR包含的核酸序列。因此，在本发明的意义中，优选地，3’-UTR元件可以由mRNA，优选人工mRNA的3’-UTR包含，或3’-UTR元件可以由各自的转录模板的3’-UTR包含。优选地，3’-UTR元件是对应于mRNA的3’-UTR，优选人工mRNA，如通过转录基因改造的载体构建体获得的mRNA的3’-UTR的核酸序列。优选地，本发明的意义中的3’-UTR元件作为3’-UTR行使功能或编码执行3’-UTR的功能的核苷酸序列。
因此，术语“5’-UTR元件”是指包含源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列或由源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“5’-UTR元件”优选是指人工核酸序列，如人工mRNA的5’-UTR包含的核酸序列。因此，在本发明的意义中，优选地，5’-UTR元件可以由mRNA，优选人工mRNA的5’-UTR包含，或5’-UTR元件可以由各自的转录模板的5’-UTR包含。优选地，5’-UTR元件是对应于mRNA的5’-UTR，优选人工mRNA，如通过转录基因改造的载体构建体获得的mRNA的5’-UTR的核酸序列。优选地，本发明的意义中的5’-UTR元件作为5’-UTR行使功能或编码执行5’-UTR的功能的核苷酸序列。
根据本发明的人工核酸分子中的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产。因此，根据本发明的人工核酸分子可以尤其包含一下一种或者几种功能的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件：增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，或增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地，根据本发明的人工核酸分子包含延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地，根据本发明的人工核酸分子包含至少一个3’-UTR元件和至少一个5’-UTR元件，即延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个3’-UTR元件和延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个5’-UTR元件。“延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产”通常是指与从缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR(如天然与ORF组合存在的3’-UTR和/或5’-UTR)的各个参比核酸产生的蛋白的量相比，从具有各个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的根据本发明的人工核酸分子产生的蛋白的量。尤其是，与缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长从根据本发明的人工核酸分子，例如从根据本发明的mRNA的蛋白生产。尤其是，与缺少3’-和/或5’-UTR或包含参比3’-和/或5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件增加从根据本发明的人工核酸分子，例如从根据本发明的mRNA的蛋白生产，尤其是蛋白表达和/或总蛋白生产。优选地，与缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-UTR和/或5’-UTR的各个核酸的翻译效率相比，根据本发明的人工核酸分子的所述至少一个3’-UTR元件和/或所述至少一个5’-UTR元件不消极影响核酸的翻译效率。甚至更优选地，与其天然情况下各个ORF编码的蛋白的翻译效率相比，翻译效率由3’-UTR和/或5’-UTR增强。本文中使用的术语“各个核酸分子”或“参比核酸分子”意为-除不同3’-UTR和/或5’-UTR之外-参比核酸分子是与包含3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的本发明的人工核酸分子相当的，优选相同的。
递送载体
可使用任何方法配制和递送根据本发明合成的mRNA用于体内生产蛋白质，例如抗体，或者抗原，或者抗体片段或者抗原片段等。在一些实施例中，将mRNA封装到转移载体中，例如纳米颗粒。除此之外，这种包封的一个目的通常是保护核酸免受可能含有降解核酸和/或引起核酸快速排泄的系统或受体的酶或化学物质的环境的影响，并促进细胞摄取和相应序列的表达。因此在一些实施例中，合适的递送载体能增强其中包括mRNA的稳定性和/或促进mRNA递送至靶细胞或组织。在一些实施例中，纳米颗粒可以是基于脂质的纳米颗粒，例如包括脂质体或基于聚合物的纳米颗粒。在一些实施例中，用于递送载体的纳米颗粒可具有约1～1000nm之间的颗粒直径。纳米颗粒可包括至少0.001μg、0.01μg、0.1μg、1μg、10μg、100μg、1mg、10mg、100mg、1g或更多mRNA。
当然，这种纳米粒子也可以是核壳类结构的颗粒，如果核酸与聚合物混合形成了核，然后再在核结构外包裹脂质体，也可以通过本发明的混合器来完成。可以先通过混合器让核酸和聚合物形成微粒结构，然后在通过混合器让微粒与脂质成分形成微粒结构。这种所谓的核壳结构，例如专利申请号201880001680.5中所有核的材料以及壳的材料都可以用本发明的混合器来形成，该专利的所有组成核的材料和形成壳的材料都是本发明的一个具体实施方式。
在一些实施例中，转运载体是脂质体囊泡、或促进核酸转移至靶细胞和组织的其他手段。合适的转运载体可以包括但不限于脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树枝状聚合物、淀粉基递送系统、胶束、乳剂、囊泡、质粒、病毒、钙磷酸基核苷酸、适体、肽和其他载体标签。还考虑使用生物离子胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装体作为合适的转移载体。(Hum.Gene Ther.2008September；19(9):887-95)。
脂质纳米颗粒可以包括一种或以上阳离子脂质、一种或以上非阳离子脂质、一种或以上基于甾醇的脂质、和/或一种或以上PEG-改性脂质。脂质体可包括三种或更多种不同的脂质组分，脂质的一种不同组分是基于甾醇的阳离子脂质。在一些实施例中，基于甾醇的阳离子脂质是咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(参见WO2011/068810，其通过引用并入本申请)。在一些实施例中，基于甾醇的阳离子脂质可构成脂质纳米颗粒(例如，脂质体)中总脂质的不超过70％(例如，不超过65％和60％)。合适的脂质的实例可包括，例如，磷脂酰化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。
阳离子脂质的非限制性实例可包括(但不限于)C12-200、MC3、DLinDMA、DLin-MC3-DMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(咪唑基)、HGT5000、HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、SM-102、ALC-0315和HGT4003等，或其组合。
非阳离子脂质的非限制性实例可以包括(但不限于)神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰基甘油钠盐(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、鞘磷脂、或其组合。
在一些实施例中，PEG改性脂质可以是PEG长度可以是1000～5000Da的聚(乙烯)二醇链，其共价连接到具有C6-C20长度的烷基链的脂质上。PEG改性脂质的非限制性实例可包括(但不限于)DMG-PEG1000、DMG-PEG1300、DMG-PEG1500、DMG-PEG1800、DMG-PEG2000、DMG-PEG2200、DMG-PEG2500、DMG-PEG2700、DMG-PEG3000、DMG-PEG3200、DMG-PEG3500、DMG-PEG3700、DMG-PEG4000、DMG-PEG4200、DMG-PEG4500、DMG-PEG4700、DMG-PEG5000、ALC-0159、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG和DSPE-PEG、或其组合。
还考虑使用聚合物作为转移载体，无论是单独使用还是与其他转移载体组合使用。合适的聚合物可包括，例如，聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精和聚乙烯亚胺。基于聚合物的纳米颗粒可包括聚乙烯亚胺(PEI)，例如支化的PEI。
载体的核壳结构也是另外一种具体的实施方式。在一些方式中，所述的疫苗试剂包括前述的核酸，该核酸可以翻译，表达冠状病毒的抗原或者抗原片段，这样的核酸被包含在多个多聚复合物或蛋白质核粒子内，并且其中所述多个多聚复合物或蛋白质核粒子本身被囊封在第一生物相容性脂质双层壳中。在一些方式中，所述多聚复合物或蛋白质核粒子含有至少第一带正电荷的聚合物或蛋白质。其中所述第一生物相容性脂质双层壳促进一种或多种哺乳动物抗原呈递细胞对所述多个多聚复合物或蛋白质核粒子的巨胞饮作用。在一些方式中，该疫苗试剂还包含囊封在所述生物相容性脂质双层内的选自CpG、聚(I:C)、明矾及其任何组合的佐剂。在一些方式中，疫苗试剂还包括含囊封在所述生物相容性脂质双层之间的空间内的免疫调节化合物，例如IL-12p70蛋白质、FLT3配体、或吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂。在一些方式中，其中所述吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂是GDC-0919、INCB24360或其组合。在一些方式中，其中所述带正电荷的聚合物或蛋白质包含鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚(β-氨基酯)或其任何组合。在一些方式中，所述生物相容性脂质双层包含以下的一种或多种：1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)；及其组合。在一些方式中，所述生物相容性脂质双层包含：(a)约30％至约70％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)；(b)约70％至约30％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；或(c)约0.5％至约5％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)。在一些方式中，所述生物相容性脂质双层包含：(a)约45％至约55％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)；(b)约55％至约45％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；和(c)约1％至约2％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。本文引用的参考文献不被认为是要求保护的发明的现有技术。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
附图说明
图1为实施例1中的ZS304 mRNA琼脂糖凝胶电泳图；
图2为实施例1中的ZS304-mRNA-1的毛细管电泳图谱；
图3为实施例1中的ZS304-mRNA-2的毛细管电泳图谱；
图4为实施例1中的ZS304-mRNA-3的毛细管电泳图谱；
图5为实施例1中的ZS304-mRNA-4的毛细管电泳图谱；
图6为实施例1中的ZS304-mRNA-5的毛细管电泳图谱；
图7为实施例1中的ZS304-mRNA-6的毛细管电泳图谱；
图8为实施例1中的ZS304-mRNA-7的毛细管电泳图谱；
图9为实施例2中Ribogreen试剂盒进行包封率的测量过程中96孔黑板进行样品添加方式示意图；
图10为实施例3中ZS304-mRNA-LNP给药取样动物实验方案流程示意图；
图11为实施例3中Anti gE抗体滴度检测结果示意图；
图12为实施例3中Anti gE抗体滴度检测结果(改变纵坐标)示意图；
图13为实施例3中给药期间小鼠体重变化示意图；
图14为实施例4中小鼠模型上的长时间Anti gE抗体滴度的检测结果示意图；
图15为实施例4中长时间给药期间小鼠体重变化示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
以下实施例中采用的实验试剂、耗材及实验仪器如下：
1、实验试剂及耗材：
无水乙醇(Sigma-Aldrich，REF：E7023-500ML)、Ribogreen试剂盒(Invitrogen，REF：R11490)、胆固醇(Sigma-Aldrich，REF：C8667-5G)、DSPC(SINOPEG，ltem No：06030001100)、阳离子磷脂SM-102(SINOPEG，ltem No：06040008800)、mPEG-DMG-2K(SINOPEG，ltem No：06020112402)、DEPC水(Invitrogen，REF:750023)、三水乙酸钠(Sigma-Aldrich，REF：32318-500G-R)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Roche，REF：10812846001)、氨基丁三醇(Sigma-Aldrich，REF：T6687-100G)、冰乙酸(MACKLIN，REF：A801295-500ml)、超滤离心管50mL 10K(Millipore，REF：UFC901096)、ZS304-mRNA-1(阿法纳生物，Lot：mRNA-304-220630)、ZS304-mRNA-3(阿法纳生物，Lot：mRNA-304-220803)、ZS304-mRNA-4(阿法纳生物，Lot：mRNA-304-220803)、ZS304-mRNA-5(阿法纳生物，Lot：mRNA-304-220811)、ZS304-mRNA-6(阿法纳生物，Lot：mRNA-304-220803)、ZS304-mRNA-7(阿法纳生物，Lot：mRNA-304-220803)、D-PBS(BBI，H422FD0153)、EveryBlot Blocking Buffer(BIO-RAD)、20×CoatingBuffer(BBI，)、TMB单组分显色液(Solarbio，20211103)、Stop Solution(Biolegend，B308260)、VZV-gE protein(Acro，GLE-V52H3)、Goat Anti-Mouse IgG H&L HRP(1:5000)(abcam，ab205719)、Anti-VZV gE Protein Antibody(abcam，Ab272686)。
2、实验仪器：
微流控纳米药物制备系统(迈安纳，型号：INano L)、高速冷冻离心机(ThermoScientific，型号：Sorvall ST 16R)、酶标仪(Molecular Device，型号：Spectramax ID3)、激光粒度仪(马尔文，型号：zetasizer pro)、精密天平(Sartorius，型号：SQP Quintix124-1CN)、PH计(METTLER TOLEDO，型号：S210)、1ml注射器(康得莱，0.45*16mm RWLB)。
实施例1水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗的序列设计、制备与检测
一、水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗的序列设计
水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗的序列设计采用优化的mRNA代码序列，加强mRNA的稳定性与蛋白表达效能。设计水痘-带状疱疹病毒gE蛋白双突变株蛋白氨基酸(包括Y569A，S593A，S595A，T596A，T598A)，据报道这些突变形成的gE突变体能够在体内诱导更强的抗体滴度，其序列如SEQ ID No.15所示，其mRNA的CDS由优化的密码子构成，决定了水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE的氨基酸序列。
对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白gE双突变株进行密码子优化，其中密码子优化包括：针对在小鼠及人体内表达时的密码子偏好性进行调整、常用密码子的使用频率进行调整，获得了189条核苷酸序列；再根据适配质粒构建载体的酶切位点、GC含量、密码子适应指数、稀有密码子使用频率、二级结构等进行筛选获得核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.7所示的7条CDS序列。
准备包含了T7启动子，Kozak序列、5’UTR、3’UTR、PolyA尾的有效模板序列，针对SEQ IDNo.1～SEQ ID No.7所示的7条CDS序列，分别组合上最合适的T7启动子，Kozak序列、5’UTR、3’UTR、PolyA尾，其组合方式如表1所示。
表1、CDS序列的组合方式
根据表1设计优化得到的水痘-带状疱疹病毒gE双突变株mRNA疫苗活性成分分别为ZS304-mRNA-1(SEQ ID No.8)、ZS304-mRNA-2(SEQ ID No.9)、ZS304-mRNA-3(SEQ IDNo.10)、ZS304-mRNA-4(SEQ ID No.11)、ZS304-mRNA-5(SEQ ID No.12)、ZS304-mRNA-6(SEQID No.13)、ZS304-mRNA-7(SEQ ID No.14)。
二、水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗的体外合成
将设计的水痘-带状疱疹病毒gE双突变株mRNA疫苗序列进行DNA模板合成，并进行质粒的放大生产和一代测序，上述步骤由第三方基因合成公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)完成，并对最终质粒产物进行检验，内容包括：序列，外观和性状，酶切鉴定，紫外光谱检测，浓度检测，残留RNA检测，基因组DNA检测，超螺旋度检测，内毒素检测和生物负载检测。
在合成过程中，ZS304-mRNA-1、ZS304-mRNA-3、ZS304-mRNA-4、ZS304-mRNA-5、ZS304-mRNA-6和ZS304-mRNA-7共6条序列顺利被合成，而ZS304-mRNA-2可能由于序列设计差异化的问题，在质粒抽提过程中抽提难度大且测序后有序列缺失和突变情况，导致迟迟未能进行mRNA IVT，后期花费了大量时间优化了质粒抽提条件，成功制备得到了ZS304-mRNA-2的质粒并进行了mRNA IVT，但因为其花费的时间过长，后续的成药性也会成为问题，故在第一阶段先筛除掉ZS304-mRNA-2，在接下来的实施例中都采用ZS304-mRNA-1、ZS304-mRNA-3、ZS304-mRNA-4、ZS304-mRNA-5、ZS304-mRNA-6和ZS304-mRNA-7共6条序列进行实验。
三、使用超微量分光光度计检测合成的ZS304系列mRNA的浓度
本实施例使用了Nanodrop One超微量分光光度计作为主要检测仪器，对获得的6条mRNA疫苗活性成分序列进行检测，检测的具体实施步骤如下：
1.将仪器的电源线插好，打开电源开关，等待仪器软件初始化和氘灯的升温稳定；
2.仪器开机完成初始化后，在主界面上选择“核算定量”，并继续选择该菜单下的“RNA”功能；
3.测试前先使用超纯水对基座进行清洁：用移液器吸取2ul蒸馏水加到检测基座上，将样品臂放下，浸泡2分钟，最后用无尘纸将检测基座擦拭干净；
4.调零：清洁基座后，在下探头上加2ul的1mM柠檬酸钠(pH6.4±0.2)(REGALXT0649-500)，放下探头，点击“Blank”键进行调零；
5.调零完毕后，使用无尘纸将探头上的样品擦拭干净，并加入2ul ZS304系列mRNA样品，点击“Measure”键，获取各项检测结果，每一个样品都逐一进行检测和记录；
6.最后检测完毕后，按照步骤3的操作，再次清洗仪器并结束实验。检测结果见表2。
表2：mRNA鉴定信息
| Molecule NO. | Conc.(ng/uL) | A260/A280 | A260/A230 | CE Purity Test |
| ZS304-mRNA-1 | 1516.6 | 1.93 | 2.07 | 97％ |
| ZS304-mRNA-3 | 1280 | 1.92 | 2.13 | 98％ |
| ZS304-mRNA-4 | 1488.8 | 1.93 | 2.11 | 95％ |
| ZS304-mRNA-5 | 1867.4 | 1.94 | 2.11 | 96％ |
| ZS304-mRNA-6 | 1246.9 | 1.92 | 2.13 | 98％ |
| ZS304-mRNA-7 | 1282.4 | 1.93 | 2.15 | 97％ |
由表2可以看出，获得的六条mRNA序列的浓度、纯度稍有区别，其中ZS304-mRNA-5的浓度最高，ZS304-mRNA-3和ZS304-mRNA-6的纯度最高。
四、使用琼脂糖凝胶电泳对ZS304系列mRNA进行检测
本实施例中，使用琼脂糖凝胶电泳法对制备后且定量的mRNA质量进行检测。检测的具体实施步骤如下：
1.接通凝胶成像仪(Tanon 4600SF)电源，打开凝胶成像仪及其电脑软件，预冷镜头；
2.根据ZS304系列mRNA的定量结果，吸取1ug总量的mRNA产物；
3.配置TAE(Sangon Biotech B548101-0500)溶液5000ml备用，配置0.9％高熔点琼脂糖凝胶(ThermoFisher Invitrogen 16500-100)，使用微波炉(Midea M1-L213BWrite)的加热功能将琼脂糖凝胶液充分溶解，并在稍微冷却后，加入到9孔齿数制胶模具中；
4.配置样品，使用核酸样品上样缓冲液(Beijing TIANGEN RT201-02)与ZS304系列mRNA样品混合，制成7个对应样品；
5.拔掉电泳齿梳，将已经凝固的琼脂糖凝胶从胶槽中取出，带模具一起，胶孔朝负极方向，置入电泳槽中。并在电泳槽中加入适量的TAE溶液，直至足够浸没过凝胶；
6.使用20ul移液器，在第一个凝胶孔中，缓慢加入核酸样品凝胶标准品(Tanon5000DNA Marker)；
7.使用20ul移液器，吸取15ul待测ZS340系列mRNA对应样品，缓慢加入到凝胶孔中；
8.合上电泳槽上盖，使对应的正负电极接通，并连接到电泳仪电源；
9.调节电泳仪电源(Tanon EPS600)为恒压模式，设定电泳参数为180V，25min，点击“Run/Stop”键，开始电泳；
10.等待电泳电源因倒数计时而自动停止后，打开电泳槽盖，带模具一起捞出凝胶；
11.将凝胶从模具中取下，并放置到凝胶成像仪底部的石英载物台上；
12.使用凝胶成像仪软件，在UV254nm波长光下，曝光并拍摄凝胶。
需要说明的是，在本实施例中，使用的核酸样品上样缓冲液中，已经预混了凝胶红色核酸染料(Tanon GelRed)，因此，在电泳完成后，可直接使用凝胶成像仪，在紫外光激发下，获取凝胶成像结果。检测结果见附图1，其中1号样品为核酸样品凝胶标准品，2～8号样品为ZS304系列mRNA对应样品。本实施例的实施结果证明，该批ZS304系列新鲜制备的mRNA产品的质量符合实验要求。
五、使用毛细管电泳对ZS304系列mRNA进行检测
本实施例中，使用毛细管电泳法来检测ZS304系列mRNA的完整度情况，以期反映出其mRNA的质量。检测的具体实施步骤如下：
检测结果见图2～图8，其中图2为ZS304-mRNA-1的毛细管电泳图谱；图3为ZS304-mRNA-2的毛细管电泳图谱；图4为ZS304-mRNA-3的毛细管电泳图谱；图5为ZS304-mRNA-4的毛细管电泳图谱；图6为ZS304-mRNA-5的毛细管电泳图谱；图7为ZS304-mRNA-6的毛细管电泳图谱；图8为ZS304-mRNA-7的毛细管电泳图谱。由图2～图8可以看出该批ZS304系列mRNA产品的CE结果均高于90％，故质量符合实验要求。
实施例2水痘-带状疱疹ZS304-mRNA LNP疫苗的制备及不同缓冲液pH时的表征
本实施例提供的水痘-带状疱疹ZS304-mRNA LNP疫苗的制备方法包括如下步骤：
1、水相溶液和脂质溶液的配制
配置水相溶液及脂质混合溶液，详细配置方案见表3：
表3、水相溶液的配制
按照表4精密称取以上成分并经DEPC水充分溶解后4℃保存备用。配置完成的水相缓冲盐溶液pH7.4，采用冰乙酸调节pH至5.5或4即得。
表4、脂质溶液的配制
按照上表配置脂质母液于四个储样小瓶中，充分溶解后-20℃储存，实验当天室温解冻后超声。高浓度脂质母液各取0.6mL，混合均匀后制得最终处方脂质有机溶液(脂质总浓度为15.44mg/mL)。
针对每条ZS304-mRNA均需用pH5.5的水相buffer稀释到200μg/mL(其中ZS304-mRNA-1另外增加一份用pH4的水相buffer稀释到200μg/mL)，并各需至少0.9mL。详细配置方案如表5。
表5、配置方案
2、LNP的制备
按照水相mRNA溶液：有机相脂质溶液＝3：1的比例，12mL/min的流速，1.2mL的总体积，通过微流控纳米药物制备系统分别制备各种ZS304-mRNA-LNP和Blank LNP，初始废液0.3mL，终端废液0.05mL。此外，ZS304-mRNA-1分别在pH4的水相溶液条件下按照总体积0.8mL，制备一份LNP。
制备得到的ZS304-mRNA-LNP和Blank LNP立即用1X的水相buffer 20倍稀释再补加10倍体积稀释，通过超滤离心管进行离心浓缩(离心条件2500g，4℃，10min)，弃掉超滤离心管下部溶液，直至超滤管上部体积接近初始mRNA-LNP体积，即为最终制剂。
3、Size和zeta电位的测量
ZS304-mRNA-LNP和Blank LNP各取50uL通过粒度仪测量粒径，进一步利用Stockes-Einstein方程得到样品的粒度分布结果，即流体力学直径DH及其分布，颗粒分布信息经系统计算得为PDI，回收后取80uL稀释10倍测量zeta电位。
4、测量包封率
通过Ribogreen试剂盒进行包封率的测量，具体方法如下：
(1)取样品和Ribogreen试剂盒放置在超净台上平衡至室温；
(2)1X TE buffer和Triton buffer之前制备好储存于4℃冰箱；
(3)取96孔黑板，在第一排分别加入15uL ZS304-mRNA-LNP，以及一孔PBS，并补加1X TE buffer至总体积250uL；
(4)按照如图9所示在96孔黑板进行样品添加，其中B、C排中为50uL 1X TE buffer加上50uL A排样品稀释液。D、E排为50uL Triton buffer加上50uL A排样品稀释液。
(5)按照表6配置标曲溶液，并分别加入到96孔黑板中：
表6、标曲溶液的配制
(6)避光静置5min，所有样品孔加入荧光显色液后，至酶标仪上进行荧光检测。根据计算得到包封率结果。
随后按照包封率的计算公式(包载的药物与投入总药物的比值)进行计算得到包封率数据。而包载的mRNA量由于涉及到包封率测量时的稀释，所以要乘回相应的稀释倍数。
再根据未包载药物(ZS304-mRNA)量和药物(ZS304-mRNA)总量，计算载药量，载药量＝(总药物量-(未被有效包封)游离药物量)/体积。
5、实验结果及分析
检测结果如表7所示。
表7、ZS304-mRNA-LNP性能检测结果
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所有mRNA LNP均澄清透明，并带有乳光。各项表征均合格，交由细胞评价部进行后续体内实验。此外，由表7可以看出，采用pH4的mRNA水相溶液制备的少量mRNA LNP表明，在pH4的水相溶液下，制备的mRNA LNP的包封效果较差。
同时本实施例还验证了pH在未用冰醋酸调整前，即pH7.4的情况下制备ZS304-mRNA-1-LNP，其包封效果比pH4的情况更差，载药量更低。
采用不同pH的缓冲液制备得到的ZS304-mRNA-1-LNP粒度结果差别较大，载药量完全不同；pH为4.0时包封率和pH5.5时，不仅包封率差别大，而且测得pH5.5下总mRNA载药量明显更高(141.72μg/mL)，也就是说单位体积的LNP中含有更多的mRNA，而且稳定性也非常好。可见维持水相溶液合适的pH值，也能显著提升新型水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗的载药量，尤其是pH5.5时达到最优。其原因可能是，在制备LNP时，在偏酸环境可以使得可电离阳离子脂质带正电荷，同等条件下可以吸附更多核酸分子(如mRNA等，本身带负电荷)，且这种最优是在水相溶液为pH5.5时体现，相比于pH7.4或pH4等条件下的缓冲液，pH5.5时可以更加有效荷载核酸分子，达成相对稳定的可用制剂，因此载药量更高，用量更少，毒副作用更小，免疫效果更好。
进一步，本实施例还验证了脂质混合溶液在低脂质含量情况下制备ZS304-mRNA-1-LNP，比如表8所示的低脂质含量配方情况。
表8、低脂质含量的试剂配方
制备得到的不同脂质含量的ZS304-mRNA-1-LNP的分别检测粒度、PDI、电位、包封率、载药量，考察不同脂质含量对制备ZS304-mRNA-1-LNP的影响。结果证明，低脂质含量的情况下，载药量降低50％。可见当提高脂质溶液中的脂质含量时，能显著提升ZS304-mRNA-1-LNP的载药量，从而使水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗中的辅料用量更少，毒副作用更小，仅需更少的剂量就能达到更好的免疫效果，同时稳定性也更好。
实施例3ZS304-mRNA-1-LNP在Balb/c小鼠模型上的研究
本实施例采用Balb/c小鼠，级别为SPF级，6-8周龄，雌性，数量为21只，根据体重将小鼠随机分成七组，每组3只小鼠，按照表9所示的实验方案，于Day1开始给药；每周监测体重两次。在给药后Day7，Day14，Day21，Day28眼眶采血。
表9、实验方案
血清采集过程为：根据实验设计，所有组别的小鼠按照耳标顺序选取每次每组3只小鼠分别在4个时间点进行血清的采集，每只小鼠的血样均采集。5个时间点分别是：第一次给药后7天，第一次给药后14天，第二次给药之后7天以及第二次给药之后14天(流程如图10所示)。通过眼眶收集血液样本，室温静置1小时后，3000rpm离心20min收集血清样品，收集的血清-80℃保存用于后续检测。采血体积100μL左右。血清前处理：金属浴56℃，30分钟。每次采血后进行血清中的进行Anti gE抗体滴度检测。
Anti gE抗体滴度检测(ELISA)方法：1、工作液准备：a、包被液：原液是20x的，用无菌去离子水稀释到1x的；b、包被蛋白：将VZV-gE protein按0.4μg/mL稀释到包被液里；c、稀释二抗：按1:5000稀释到1x样品稀释液中；d、血清稀释液：配制2％BSA；e、洗涤液：0.05％PBST，吸250μL吐温20，加到1XPBS(500mL)中，形成1xPBST。2、实验步骤：a、包被VZV-gE蛋白，100uL每孔，混匀封板，4度冰箱过夜；b、洗板3次，1XPBST；c、封板室温封闭1小时，200uL每孔；d、准备要检测的血清(提前预处理56℃，30min)；e、洗板，1次，1XPBST；f、准备一块稀释板，将血清按1:100进行稀释，作为第一个点，后续2倍稀释，一共做8个点：第一排孔加入297μL 2％BSA，第二排到第八排均加入120ul 2％BSA；把血清样品3μL，加入第一排孔，混匀；转移第一排孔的120μL，到第二排孔，反复吹打混匀，再转移其中的120uL，到第三个孔，以此类推到第八个孔，最后使用排枪吸100μL至检测板内。标准品按五倍稀释，第一个点浓度为0.2mg/mL，后续按五倍稀释，吸100μL放在第一列孔里；g、混匀，封板，室温2小时(或4度冰箱过夜)；h、准备二抗：Goat Anti-Mouse IgG H&L HRP(1:5000)；i、洗板3次，1XPBST；J、加入二抗，100μL每孔；K、混匀，封板，室温1小时；l、洗板6次，1XPBST；m、混匀，封板，室温30分钟；n、加入TMB显色，100μL每孔；o、室温孵育4分钟；p、加入终止液，100μL每孔；q、读板OD450。
动物安乐标准:(1)严重脱水；(2)持续稀便；(3)活动迟缓(不能进食或饮水)；(4)弓背，侧卧；(5)活动减少，出现肌肉萎缩症状；(6)呼吸困难；(7)进程性体温降低；(8)瘫痪，痉挛；(9)持续流血；(10)由于严重的腹水或腹围增大导致动物不能够正常行动。
小鼠异常观察说明:给药免疫后，每周常规监测药物对动物正常行为的影响。具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。
小鼠实验机构为国际实验动物评估和认可管理委员会(AAALAC International)认证的机构，并且动物实验设施经委托方或公司内部动物管理委员会批准。实验过程中，动物福利和实验操作均符合AAALAC的要求。
Anti gE抗体滴度检测结果见图11、12和表10。
表10、Anti gE抗体滴度检测结果
同时对小鼠的体重进行了检测，检测结果见图13和表11。
表11、小鼠体重检测结果
由图11、12可以看出，通过第一次免疫之后Day7、Day14的抗体滴度检测结果可看出，编码gE的六条mRNA均呈现出强烈的免疫反应，其中ZS304-mRNA-4与ZS304-mRNA-5效果最为突出，在Day14时，抗体滴度均达到约5.5*105。
尤其是图12可以更清楚地看出，Day21、Day28后，ZS304-mRNA-5效果较ZS304-mRNA-4更为突出，在Day21时，ZS304-mRNA-4抗体滴度达到1.8*106，ZS304-mRNA-5抗体滴度达到2.8*106；在Day28时，ZS304-mRNA-4抗体滴度达到2.2*106，ZS304-mRNA-5抗体滴度达到4.2*106。
另外从小鼠体重检测结果(图13、表11)可以看出，G4(ZS304-mRNA-4)的体重增长较为缓慢，而其他各组动物体重数据均处于正常生长范围。
因此通过筛选结果，挑选ZS304-mRNA-4或5为候选序列，其中G5(ZS304-mRNA-5)为最优选，抗体滴度最高，而且能使小鼠正常生长。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
实施例4ZS304-mRNA-1-LNP在Balb/c小鼠模型上的长时间抗体滴度的检测研究
对实施例3中的实验动物，进行超过28天的时间点采血，来进行Anti gE抗体滴度检测，每两周或更长检测一次，并进行称重，实验方法均与实施例3相同，不再赘述，结果见图14和表12。
表12、长时间Anti gE抗体滴度检测结果
/>
由图14和表12可以看出，通过两次免疫之后在Day44的抗体滴度达到峰值滴度强度为5*106，而后有一个下降，之后在Day98内处于平稳状态，平均值约为1*106，其中ZS304-mRNA-5的效果仍强于其他组。同时，由图15可看出各组动物体重处于稳定增长阶段，间接反映动物耐受性良好。
序列表
SEQ ID NO.1
ZS304-mRNA-1的CDS：
ATGGGCACCGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTCGGCATCATCACCGGCACCCT
GAGAATCACCAACCCCGTGAGAGCTAGCGTGCTCCGGTACGACGACTTCCATATCGACGAGGACA
AGCTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCCTACTACCACAGCGACCACGCCGAGAGCAGCTGGGT
GAACAGAGGCGAGAGCAGCAGAAAGGCCTACGACCACAACAGCCCCTACATCTGGCCTAGAAAC
GACTACGACGGCTTCCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAAGGCAGAGGCA
TCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCCACACAGATGAGCGCCCAAGAGGACCTGGGCGACGA
CACCGGCATCCACGTGATCCCCACCCTGAACGGCGACGACAGACACAAGATCGTGAACGTGGATC
AGAGACAGTACGGCGACGTGTTCAAGGGCGACCTGAACCCCAAGCCCCAAGGGCAGAGACTGAT
CGAGGTGAGCGTGGAGGAGAACCACCCCTTCACCCTGAGAGCCCCCATTCAGAGAATCTACGGCG
TGAGATACACCGAAACCTGGAGCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGCACCGGCGACGCCGCCCCCGCC
ATTCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTGCTTCCAAGACGTGGTCGTGGACGTGGACTGCGC
CGAGAACACCAAGGAGGATCAGCTGGCCGAGATCAGCTACAGATTCCAAGGCAAGAAGGAGGCC
GATCAGCCCTGGATCGTGGTGAACACAAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAGCTGGACCCCCCCGA
GATCGAGCCCGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGAACCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGA
ACATGAGAGGCAGCGACGGCACAAGCACCTACGCCACCTTCCTGGTGACCTGGAAGGGCGACGA
GAAGACAAGAAACCCCACCCCCGCCGTGACCCCTCAGCCTAGAGGGGCCGAGTTCCACATGTGG
AACTACCACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACCTTCAGCCTGGCCATGCACCTGCAGTACAA
GATCCACGAGGCCCCCTTCGACCTGCTCCTGGAGTGGCTGTACGTGCCCATCGACCCCACCTGTCA
GCCCATGAGACTGTACAGCACCTGCCTGTACCACCCCAACGCCCCTCAATGCCTGAGCCACATGA
ACAGCGGCTGCACCTTCACAAGCCCCCACCTGGCTCAGAGAGTGGCTAGCACCGTGTATCAGAAC
TGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAGCCTAGCTTCGG
CCTGATCCTGCACGACGGCGGCACAACCCTCAAGTTCGTGGACACCCCCGAGAGCCTGAGCGGCC
TGTACGTGTTCGTGGTGTACTTCAACGGCCACGTGGAGGCCGTGGCCTACACCGTGGTGAGCACC
GTGGACCACTTCGTGAATGCCATCGAGGAAAGAGGGTTCCCTCCTACCGCTGGGCAGCCTCCCGC
CACCACCAAGCCCAAGGAGATTACCCCCGTGAACCCTGGCACATCCCCCCTGCTGAGATACGCTG
CCTGGACCGGCGGCCTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGATCTGCACCGCCA
AGAGAATGAGAGTGAAGGCCGCTAGAGTGGACAAGAGCCCCTACAATCAGAGCATGTACTACGCC
GGGCTGCCCGTCGACGACTTCGAGGATGCCGAGGCCGCCGACGCCGAGGAAGAGTTCGGGAACG
CCATTGGCGGCAGCCATGGCGGCAGCAGCTACACCGTGTATATCGACAAGACAAGATGATGASEQ IDNO.2
ZS304-mRNA-2的CDS：
ATGGGCACAGTGAACAAGCCCGTGGTCGGCGTCCTGATGGGCTTTGGAATTATCACCGGCACTCTG
AGAATCACAAACCCGGTGCGGGCCAGCGTGCTCAGATACGACGACTTCCACATCGATGAGGACAA
ACTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCTTACTACCATTCTGATCACGCCGAAAGCTCCTGGGTGA
ACAGAGGAGAGTCTTCTAGAAAGGCATATGACCACAATTCACCCTACATTTGGCCTAGAAACGACT
ACGACGGGTTCCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGAAGAGGTATCGA
CAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCAACCCAGATGAGCGCCCAGGAGGATCTGGGAGATGACACC
GGCATCCACGTGATCCCTACCCTGAACGGCGACGATAGACACAAGATCGTGAATGTGGACCAACG
GCAGTATGGCGACGTGTTTAAGGGCGATCTGAACCCCAAGCCTCAAGGACAGAGACTGATCGAGG
TGTCCGTGGAAGAAAACCACCCTTTCACCCTTAGAGCCCCTATCCAGAGAATCTACGGCGTGCGCT
ACACGGAAACCTGGAGCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGTACCGGAGATGCCGCCCCTGCCATCCAA
CACATCTGCCTGAAGCACACCACATGCTTCCAGGACGTGGTTGTGGACGTTGACTGCGCCGAGAA
CACCAAAGAAGATCAGCTGGCCGAGATCTCTTACAGATTCCAGGGCAAGAAAGAGGCCGACCAG
CCCTGGATCGTGGTCAATACCAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAACTGGACCCCCCCGAGATCGA
GCCAGGCGTGCTCAAAGTGCTGCGGACCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGC
GGGGATCCGACGGCACCAGCACATACGCCACATTCCTGGTGACCTGGAAGGGCGACGAGAAAAC
CAGAAACCCTACACCCGCTGTTACCCCACAACCTCGGGGCGCCGAGTTCCACATGTGGAATTACC
ACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACATTTAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTATAAGATCCACG
AGGCCCCTTTCGATCTGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGACCCTACATGCCAGCCAATGA
GGCTGTACAGCACCTGTCTGTACCACCCTAACGCCCCTCAGTGCCTGAGCCATATGAACAGCGGTT
GTACATTTACCAGCCCCCATCTGGCTCAGCGGGTGGCCAGCACCGTGTACCAGAACTGCGAGCAC
GCTGACAACTACACAGCCTACTGTCTGGGCATTTCTCACATGGAACCTTCCTTCGGCCTCATCCTG
CACGACGGCGGAACAACACTGAAGTTCGTGGATACACCTGAAAGCCTGTCTGGCCTGTATGTGTT
CGTGGTGTACTTCAACGGCCACGTCGAGGCCGTGGCTTACACCGTGGTGAGCACGGTCGACCACT
TCGTGAACGCCATCGAGGAACGGGGATTCCCCCCCACCGCCGGCCAGCCACCTGCCACCACCAAG
CCCAAGGAAATCACCCCTGTGAATCCTGGCACCTCCCCTCTCCTGAGATACGCCGCCTGGACCGGC
GGTTTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTCATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAGCGGATGCGG
GTGAAGGCCGCTAGAGTGGATAAGAGCCCCTACAACCAGAGCATGTATTACGCCGGCCTGCCTGT
GGACGACTTCGAGGATGCCGAAGCCGCTGATGCCGAGGAGGAATTTGGCAACGCTATCGGCGGCA
GCCACGGCGGCTCTAGCTACACCGTGTACATCGACAAGACAAGATGATAATAGSEQ ID NO.3
ZS304-mRNA-3的CDS：
ATGGGCACAGTGAACAAGCCCGTGGTCGGCGTCCTGATGGGCTTTGGAATTATCACCGGCACTCTGAGAATCACAAACCC
GGTGCGGGCCAGCGTGCTCAGATACGACGACTTCCACATCGATGAGGACAAACTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCTT
ACTACCATTCTGATCACGCCGAAAGCTCCTGGGTGAACAGAGGAGAGTCTTCTAGAAAGGCATATGACCACAATTCACCCT
ACATTTGGCCTAGAAACGACTACGACGGGTTCCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGAAGAGG
TATCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCAACCCAGATGAGCGCCCAGGAGGATCTGGGAGATGACACCGGCATCCAC
GTGATCCCTACCCTGAACGGCGACGATAGACACAAGATCGTGAATGTGGACCAACGGCAGTATGGCGACGTGTTTAAGGG
CGATCTGAACCCCAAGCCTCAAGGACAGAGACTGATCGAGGTGTCCGTGGAAGAAAACCACCCTTTCACCCTTAGAGCCC
CTATCCAGAGAATCTACGGCGTGCGCTACACGGAAACCTGGAGCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGTACCGGAGATGCCGCCC
CTGCCATCCAACACATCTGCCTGAAGCACACCACATGCTTCCAGGACGTGGTTGTGGACGTTGACTGCGCCGAGAACACC
AAAGAAGATCAGCTGGCCGAGATCTCTTACAGATTCCAGGGCAAGAAAGAGGCCGACCAGCCCTGGATCGTGGTCAATAC
CAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAACTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCAGGCGTGCTCAAAGTGCTGCGGACCGAGAAG
CAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGGGGATCCGACGGCACCAGCACATACGCCACATTCCTGGTGACCTGGAA
GGGCGACGAGAAAACCAGAAACCCTACACCCGCTGTTACCCCACAACCTCGGGGCGCCGAGTTCCACATGTGGAATTACC
ACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACATTTAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCCCCTTTCGATC
TGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGACCCTACATGCCAGCCAATGAGGCTGTACAGCACCTGTCTGTACCACCCTAA
CGCCCCTCAGTGCCTGAGCCATATGAACAGCGGTTGTACATTTACCAGCCCCCATCTGGCTCAGCGGGTGGCCAGCACCGT
GTACCAGAACTGCGAGCACGCTGACAACTACACAGCCTACTGTCTGGGCATTTCTCACATGGAACCTTCCTTCGGCCTCATC
CTGCACGACGGCGGAACAACACTGAAGTTCGTGGATACACCTGAAAGCCTGTCTGGCCTGTATGTGTTCGTGGTGTACTTC
AACGGCCACGTCGAGGCCGTGGCTTACACCGTGGTGAGCACGGTCGACCACTTCGTGAACGCCATCGAGGAACGGGGAT
TCCCCCCCACCGCCGGCCAGCCACCTGCCACCACCAAGCCCAAGGAAATCACCCCTGTGAATCCTGGCACCTCCCCTCTCC
TGAGATACGCCGCCTGGACCGGCGGTTTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTCATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAG
CGGATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGATAAGAGCCCCTACAACCAGAGCATGTATTACGCCGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGATGCCGAAGCCGCTGATGCCGAGGAGGAATTTGGCAACGCTATCGGCGGCAGCCACGGCGGCTCTAGCTAC
ACCGTGTACATCGACAAGACAAGATGATGA
SEQ ID NO.4
ZS304-mRNA-4的CDS：
ATGGGCACAGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTCCTGATGGGCTTCGGAATTATCACAGGCACACTGCGGATCACCAACCC
CGTGCGGGCCAGCGTGCTGAGATACGACGACTTCCACATCGACGAGGATAAGCTGGATACCAACAGCGTGTACGAGCCTT
ATTACCATAGCGACCACGCCGAAAGCAGCTGGGTCAACAGAGGCGAAAGCTCTAGAAAGGCCTACGACCACAACTCCCCT
TACATCTGGCCTAGGAACGACTACGACGGGTTTCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAATCAGGGCAGAG
GAATCGATAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCTACCCAGATGTCAGCCCAGGAGGACCTGGGCGATGATACCGGCATTCAC
GTGATCCCCACACTGAACGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGATCAGAGACAGTACGGCGATGTGTTCAAGGG
CGACCTTAATCCCAAGCCTCAAGGCCAGAGACTGATCGAGGTGTCCGTGGAAGAAAACCACCCCTTTACACTGAGAGCCC
CCATCCAGCGGATCTACGGCGTGCGGTACACTGAAACCTGGTCCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGCACCGGAGACGCCGCTC
CTGCTATCCAACACATCTGTTTGAAGCACACCACCTGTTTTCAGGACGTGGTGGTGGACGTGGATTGCGCCGAGAATACCA
AGGAGGACCAGCTGGCCGAAATCAGCTACAGATTCCAGGGCAAAAAGGAAGCCGATCAGCCCTGGATCGTGGTCAATAC
CAGCACCCTGTTCGATGAGCTGGAGCTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCTGGCGTTCTGAAAGTGCTGAGAACCGAGAAA
CAGTACCTGGGCGTTTACATCTGGAACATGCGGGGCTCTGACGGCACCAGCACATACGCCACCTTCCTGGTGACCTGGAA
GGGCGACGAGAAGACCAGAAACCCCACCCCTGCCGTTACCCCACAGCCACGCGGTGCCGAGTTCCACATGTGGAATTATC
ACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACATTTAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAGGCTCCTTTCGACC
TGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGATCCTACCTGTCAGCCAATGCGGCTGTACAGCACCTGTTTATATCACCCTAAC
GCCCCACAGTGCCTCAGCCACATGAACAGCGGGTGCACATTTACATCCCCTCACCTGGCACAGCGGGTGGCCTCTACAGTG
TATCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCTTACTGCCTGGGAATCTCTCATATGGAACCCAGCTTCGGCCTGATCC
TGCACGACGGCGGAACAACACTGAAGTTCGTGGACACCCCTGAGTCTCTGAGCGGCCTGTACGTGTTCGTGGTGTACTTC
AACGGCCACGTCGAAGCCGTGGCCTACACGGTGGTGTCCACAGTGGACCATTTCGTGAACGCCATCGAGGAAAGAGGCT
TCCCTCCTACCGCCGGACAACCTCCTGCTACCACCAAACCAAAAGAGATCACCCCGGTGAATCCTGGAACAAGCCCTCTGC
TCAGGTACGCCGCCTGGACCGGCGGCCTGGCTGCTGTGGTTCTGCTGTGCCTGGTCATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAGC
GGATGAGAGTGAAGGCCGCCCGGGTGGACAAGAGCCCCTACAACCAGAGCATGTACTACGCCGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGACGCTGAAGAGGAATTTGGCAACGCCATCGGCGGCTCTCACGGAGGAAGCAGCTA
CACCGTGTATATCGACAAGACAAGATGA
SEQ ID NO.5
ZS304-mRNA-5的CDS：
ATGGGCACCGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTCCTGATGGGCTTCGGCATCATTACAGGCACCCTCAGAATCACCAACCC
TGTTAGAGCCTCTGTGCTGAGATACGATGATTTCCACATCGACGAGGACAAGCTGGACACAAACAGTGTGTACGAGCCCTA
CTACCATAGCGACCACGCCGAGAGCAGCTGGGTGAATAGAGGCGAGAGCTCTAGAAAGGCCTATGACCACAACTCTCCTT
ACATCTGGCCCAGAAACGACTACGACGGCTTTCTGGAAAACGCTCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGCAGAGG
AATCGACAGCGGAGAAAGACTGATGCAACCTACACAGATGAGCGCCCAGGAGGACCTGGGCGATGACACAGGCATCCAC
GTTATTCCTACCCTGAACGGTGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGCGCCAGTACGGCGACGTGTTCAAGGG
CGACCTGAATCCAAAGCCACAAGGCCAGAGACTGATCGAGGTGTCTGTGGAGGAAAACCACCCCTTCACCCTGCGGGCC
CCTATTCAGCGGATCTACGGCGTGAGATACACAGAGACATGGTCCTTCCTGCCATCCCTGACCTGTACCGGCGACGCCGCT
CCTGCCATTCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACATGCTTTCAGGACGTGGTGGTGGACGTGGACTGCGCCGAGAACAC
AAAGGAAGATCAACTGGCTGAGATCTCCTACCGGTTCCAGGGGAAGAAAGAAGCCGACCAGCCCTGGATCGTTGTCAAC
ACCAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAACTGGATCCTCCTGAGATCGAGCCGGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGAACCGAGA
AGCAGTACCTGGGGGTGTACATCTGGAATATGAGGGGCTCCGACGGCACAAGCACATACGCCACATTTCTGGTGACCTGG
AAGGGCGATGAGAAGACCCGGAACCCTACCCCTGCTGTGACACCTCAGCCTAGAGGCGCCGAGTTCCACATGTGGAACTA
CCATTCTCACGTGTTCAGCGTGGGAGATACCTTTAGCCTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAAGCCCCTTTCGAC
CTGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCCATCGACCCTACATGCCAGCCAATGCGGCTGTACAGCACCTGCCTGTACCACCCTA
ACGCTCCACAGTGCCTGAGCCACATGAACTCTGGCTGTACCTTCACCTCCCCTCATCTGGCCCAGCGGGTGGCCAGCACCG
TGTACCAGAACTGTGAACACGCTGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAACCCAGCTTTGGACTGA
TCCTGCACGACGGCGGAACCACCCTGAAATTCGTCGATACACCTGAGAGCCTGTCTGGACTTTATGTGTTCGTGGTGTACTT
CAATGGCCACGTGGAAGCCGTGGCCTACACCGTGGTGTCCACCGTGGATCACTTCGTGAACGCTATCGAGGAGAGAGGCT
TCCCCCCCACCGCCGGCCAGCCTCCCGCCACCACCAAACCTAAAGAGATCACCCCTGTAAACCCTGGCACCAGCCCTCTGC
TGCGGTACGCCGCTTGGACAGGAGGCCTGGCCGCAGTGGTCCTGCTTTGTCTGGTGATCTTCCTGATCTGCACGGCCAAG
CGGATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGACAAAAGCCCATATAACCAGAGCATGTACTACGCCGGACTGCCCGTGGATGA
CTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGATGCCGAAGAGGAATTCGGCAATGCCATCGGCGGCAGCCACGGAGGCAGCAGCTA
CACAGTGTACATCGATAAGACCAGATGATGA
SEQ ID NO.6
ZS304-mRNA-6的CDS：
ATGGGAACCGTGAACAAGCCTGTGGTGGGAGTGCTGATGGGCTTCGGAATCATCACCGGCACCCTGAGAATCACCAACCC
GGTGCGGGCCTCTGTGCTGCGGTACGACGACTTCCACATCGATGAGGATAAGCTGGATACAAACAGCGTGTACGAGCCCT
ACTACCACAGCGACCACGCCGAGTCCAGCTGGGTGAACAGAGGCGAGAGCTCTAGAAAGGCCTACGATCATAATTCTCCT
TACATCTGGCCTCGGAACGACTACGATGGCTTCCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTCTACAATCAGGGAAGAGG
CATCGACAGCGGAGAAAGACTGATGCAGCCTACACAGATGAGCGCCCAGGAGGACCTGGGCGATGACACAGGCATCCAT
GTGATCCCTACCCTGAATGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGAGACAATACGGCGACGTGTTTAAGGG
CGATCTGAACCCTAAGCCTCAGGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCCGTCGAGGAAAACCACCCCTTCACACTGAGAGCCC
CTATCCAGAGGATCTACGGCGTTAGATACACCGAGACATGGTCCTTCTTGCCTAGCCTGACCTGTACCGGAGATGCCGCCCC
TGCCATCCAACACATTTGCCTGAAGCACACAACCTGCTTCCAGGACGTGGTGGTCGATGTGGATTGCGCCGAGAATACCAA
GGAGGACCAACTGGCTGAAATTTCTTACCGATTTCAGGGCAAAAAGGAAGCTGATCAGCCTTGGATCGTGGTTAATACAA
GCACACTGTTCGACGAGCTGGAACTGGACCCTCCAGAGATCGAGCCTGGCGTGCTGAAAGTGCTGCGGACCGAGAAACA
GTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGGGGCTCTGATGGCACCAGCACCTACGCGACATTTCTGGTGACCTGGAAGG
GCGACGAGAAGACCAGAAACCCCACCCCTGCCGTGACTCCTCAGCCTAGAGGCGCCGAATTCCACATGTGGAACTACCAC
AGCCATGTGTTCAGCGTGGGCGACACCTTTTCACTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCGCCATTTGACCTG
CTGCTTGAATGGCTGTACGTGCCCATCGACCCCACATGCCAGCCCATGAGACTGTACAGCACCTGTCTGTATCACCCTAACG
CCCCCCAGTGCCTCAGCCACATGAACAGCGGTTGTACATTCACCAGCCCCCACCTGGCTCAGCGGGTGGCCAGCACCGTG
TACCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCCTATTGCCTGGGCATCTCTCACATGGAACCTTCTTTCGGCCTGATCC
TGCACGACGGCGGCACAACCCTGAAGTTCGTGGACACACCTGAGTCTCTGAGCGGACTGTACGTGTTCGTGGTCTACTTC
AACGGCCACGTGGAAGCCGTGGCCTATACCGTGGTCAGCACCGTGGACCACTTCGTGAACGCCATCGAAGAAAGAGGCT
TTCCTCCAACCGCCGGCCAGCCTCCTGCTACCACCAAACCTAAGGAAATCACACCAGTGAATCCCGGCACCTCCCCCCTGC
TCCGCTACGCTGCCTGGACCGGCGGACTGGCCGCTGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAGC
GGATGCGGGTGAAGGCTGCCAGAGTGGACAAAAGCCCCTACAACCAGAGCATGTACTACGCAGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGATGCCGAGGAAGAGTTCGGCAACGCCATCGGCGGCAGCCACGGAGGCAGCAGCTA
TACAGTGTACATCGACAAGACAAGATGATGA
SEQ ID NO.7
ZS304-mRNA-7的CDS：
ATGGGCACTGTGAACAAGCCTGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTCGGCATCATCACAGGAACACTGCGGATCACCAACCC
CGTTAGAGCCAGCGTGCTGAGATATGACGACTTCCACATCGACGAGGACAAGCTGGATACAAACTCCGTGTACGAACCTTA
CTACCACTCCGACCACGCGGAGAGCAGCTGGGTGAACAGAGGAGAGTCTTCTAGAAAGGCCTACGACCATAATTCACCAT
ACATTTGGCCCAGGAACGACTACGACGGCTTTCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTATAATCAAGGAAGAGG
CATCGACAGCGGCGAGCGGCTGATGCAGCCCACCCAGATGAGCGCCCAAGAGGACCTGGGCGACGATACCGGCATCCAC
GTGATCCCCACCCTGAACGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGAGGCAGTACGGCGACGTGTTCAAGG
GAGATCTGAATCCCAAGCCCCAGGGCCAGCGGCTTATCGAAGTGTCCGTGGAAGAGAACCACCCTTTCACCCTGCGGGCC
CCTATCCAGAGAATCTACGGGGTTAGATACACCGAGACATGGAGCTTTCTGCCTAGCCTGACCTGTACAGGCGACGCCGCT
CCTGCCATCCAACACATCTGCCTGAAACACACCACCTGCTTCCAGGACGTGGTCGTCGATGTGGACTGCGCCGAGAATACC
AAGGAAGATCAGCTGGCCGAAATCAGCTACAGATTCCAAGGCAAGAAAGAGGCTGACCAGCCTTGGATCGTGGTGAACA
CCTCTACACTGTTCGATGAGCTGGAACTGGACCCTCCTGAGATCGAGCCTGGGGTGCTGAAGGTGCTGCGGACCGAAAA
GCAGTACCTGGGCGTGTATATCTGGAACATGAGAGGCAGCGACGGCACAAGCACCTACGCCACATTTCTGGTCACCTGGA
AGGGCGACGAGAAGACAAGAAACCCCACACCAGCCGTGACCCCTCAGCCGCGGGGAGCCGAGTTCCACATGTGGAATTA
CCACAGCCACGTGTTTAGCGTGGGCGACACCTTCAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAAGCCCCATTCGA
CCTGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGATCCTACCTGTCAGCCTATGCGGCTGTACTCCACCTGCCTCTACCACCCCA
ACGCCCCTCAGTGTTTGTCTCACATGAACTCTGGCTGCACCTTCACCAGCCCTCACCTGGCCCAGAGAGTGGCCAGCACAG
TTTACCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAACCCAGCTTCGGCCTGA
TCCTTCATGATGGAGGCACAACCCTGAAGTTCGTCGACACCCCCGAGAGCCTGAGCGGCCTGTACGTGTTCGTGGTGTACT
TTAACGGCCACGTGGAAGCAGTGGCTTATACCGTGGTTTCTACAGTGGACCACTTCGTGAATGCTATTGAGGAAAGAGGAT
TTCCTCCAACCGCTGGCCAGCCACCAGCTACCACAAAACCTAAGGAAATCACCCCTGTCAACCCTGGCACCTCCCCCCTGC
TGCGATACGCCGCCTGGACAGGCGGCCTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGATCTGTACCGCCAAG
AGAATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGATAAAAGCCCTTACAACCAGAGCATGTACTACGCCGGACTGCCCGTGGATGA
TTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGATGCCGAGGAAGAGTTCGGCAACGCCATAGGAGGCAGCCATGGCGGCTCTAGCTAC
ACAGTATATATCGACAAAACCAGATGATGA
SEQ ID NO.8
ZS304-mRNA-1：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:
GAGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC
CDS:
ATGGGCACCGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTCGGCATCATCACCGGCACCCTGAGAATCACCAACCC
CGTGAGAGCTAGCGTGCTCCGGTACGACGACTTCCATATCGACGAGGACAAGCTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCCT
ACTACCACAGCGACCACGCCGAGAGCAGCTGGGTGAACAGAGGCGAGAGCAGCAGAAAGGCCTACGACCACAACAGCC
CCTACATCTGGCCTAGAAACGACTACGACGGCTTCCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAAGGCAGA
GGCATCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCCACACAGATGAGCGCCCAAGAGGACCTGGGCGACGACACCGGCATC
CACGTGATCCCCACCCTGAACGGCGACGACAGACACAAGATCGTGAACGTGGATCAGAGACAGTACGGCGACGTGTTCA
AGGGCGACCTGAACCCCAAGCCCCAAGGGCAGAGACTGATCGAGGTGAGCGTGGAGGAGAACCACCCCTTCACCCTGA
GAGCCCCCATTCAGAGAATCTACGGCGTGAGATACACCGAAACCTGGAGCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGCACCGGCGAC
GCCGCCCCCGCCATTCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACCTGCTTCCAAGACGTGGTCGTGGACGTGGACTGCGCCGA
GAACACCAAGGAGGATCAGCTGGCCGAGATCAGCTACAGATTCCAAGGCAAGAAGGAGGCCGATCAGCCCTGGATCGTG
GTGAACACAAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAGCTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCCGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGAA
CCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGAGAGGCAGCGACGGCACAAGCACCTACGCCACCTTCCTGGT
GACCTGGAAGGGCGACGAGAAGACAAGAAACCCCACCCCCGCCGTGACCCCTCAGCCTAGAGGGGCCGAGTTCCACAT
GTGGAACTACCACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACCTTCAGCCTGGCCATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAGG
CCCCCTTCGACCTGCTCCTGGAGTGGCTGTACGTGCCCATCGACCCCACCTGTCAGCCCATGAGACTGTACAGCACCTGCCT
GTACCACCCCAACGCCCCTCAATGCCTGAGCCACATGAACAGCGGCTGCACCTTCACAAGCCCCCACCTGGCTCAGAGAG
TGGCTAGCACCGTGTATCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAGCCTA
GCTTCGGCCTGATCCTGCACGACGGCGGCACAACCCTCAAGTTCGTGGACACCCCCGAGAGCCTGAGCGGCCTGTACGTG
TTCGTGGTGTACTTCAACGGCCACGTGGAGGCCGTGGCCTACACCGTGGTGAGCACCGTGGACCACTTCGTGAATGCCAT
CGAGGAAAGAGGGTTCCCTCCTACCGCTGGGCAGCCTCCCGCCACCACCAAGCCCAAGGAGATTACCCCCGTGAACCCTG
GCACATCCCCCCTGCTGAGATACGCTGCCTGGACCGGCGGCCTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGA
TCTGCACCGCCAAGAGAATGAGAGTGAAGGCCGCTAGAGTGGACAAGAGCCCCTACAATCAGAGCATGTACTACGCCGG
GCTGCCCGTCGACGACTTCGAGGATGCCGAGGCCGCCGACGCCGAGGAAGAGTTCGGGAACGCCATTGGCGGCAGCCA
TGGCGGCAGCAGCTACACCGTGTATATCGACAAGACAAGATGATGA3’UTR:CTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCCTGGAGCTAGC
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO.9
ZS304-mRNA-2：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC
CDS:
ATGGGCACAGTGAACAAGCCCGTGGTCGGCGTCCTGATGGGCTTTGGAATTATCACCGGCACTCTGAGAATCACAAACCC
GGTGCGGGCCAGCGTGCTCAGATACGACGACTTCCACATCGATGAGGACAAACTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCTT
ACTACCATTCTGATCACGCCGAAAGCTCCTGGGTGAACAGAGGAGAGTCTTCTAGAAAGGCATATGACCACAATTCACCCT
ACATTTGGCCTAGAAACGACTACGACGGGTTCCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGAAGAGG
TATCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCAACCCAGATGAGCGCCCAGGAGGATCTGGGAGATGACACCGGCATCCAC
GTGATCCCTACCCTGAACGGCGACGATAGACACAAGATCGTGAATGTGGACCAACGGCAGTATGGCGACGTGTTTAAGGG
CGATCTGAACCCCAAGCCTCAAGGACAGAGACTGATCGAGGTGTCCGTGGAAGAAAACCACCCTTTCACCCTTAGAGCCC
CTATCCAGAGAATCTACGGCGTGCGCTACACGGAAACCTGGAGCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGTACCGGAGATGCCGCCC
CTGCCATCCAACACATCTGCCTGAAGCACACCACATGCTTCCAGGACGTGGTTGTGGACGTTGACTGCGCCGAGAACACC
AAAGAAGATCAGCTGGCCGAGATCTCTTACAGATTCCAGGGCAAGAAAGAGGCCGACCAGCCCTGGATCGTGGTCAATAC
CAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAACTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCAGGCGTGCTCAAAGTGCTGCGGACCGAGAAG
CAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGGGGATCCGACGGCACCAGCACATACGCCACATTCCTGGTGACCTGGAA
GGGCGACGAGAAAACCAGAAACCCTACACCCGCTGTTACCCCACAACCTCGGGGCGCCGAGTTCCACATGTGGAATTACC
ACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACATTTAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCCCCTTTCGATC
TGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGACCCTACATGCCAGCCAATGAGGCTGTACAGCACCTGTCTGTACCACCCTAA
CGCCCCTCAGTGCCTGAGCCATATGAACAGCGGTTGTACATTTACCAGCCCCCATCTGGCTCAGCGGGTGGCCAGCACCGT
GTACCAGAACTGCGAGCACGCTGACAACTACACAGCCTACTGTCTGGGCATTTCTCACATGGAACCTTCCTTCGGCCTCATC
CTGCACGACGGCGGAACAACACTGAAGTTCGTGGATACACCTGAAAGCCTGTCTGGCCTGTATGTGTTCGTGGTGTACTTC
AACGGCCACGTCGAGGCCGTGGCTTACACCGTGGTGAGCACGGTCGACCACTTCGTGAACGCCATCGAGGAACGGGGAT
TCCCCCCCACCGCCGGCCAGCCACCTGCCACCACCAAGCCCAAGGAAATCACCCCTGTGAATCCTGGCACCTCCCCTCTCC
TGAGATACGCCGCCTGGACCGGCGGTTTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTCATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAG
CGGATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGATAAGAGCCCCTACAACCAGAGCATGTATTACGCCGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGATGCCGAAGCCGCTGATGCCGAGGAGGAATTTGGCAACGCTATCGGCGGCAGCCACGGCGGCTCTAGCTAC
ACCGTGTACATCGACAAGACAAGATGATAATAG3’UTR:
GCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTG
GTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO.10
ZS304-mRNA-3：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC
CDS:
ATGGGCACAGTGAACAAGCCCGTGGTCGGCGTCCTGATGGGCTTTGGAATTATCACCGGCACTCTGAGAATCACAAACCC
GGTGCGGGCCAGCGTGCTCAGATACGACGACTTCCACATCGATGAGGACAAACTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCTT
ACTACCATTCTGATCACGCCGAAAGCTCCTGGGTGAACAGAGGAGAGTCTTCTAGAAAGGCATATGACCACAATTCACCCT
ACATTTGGCCTAGAAACGACTACGACGGGTTCCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGAAGAGG
TATCGACAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCAACCCAGATGAGCGCCCAGGAGGATCTGGGAGATGACACCGGCATCCAC
GTGATCCCTACCCTGAACGGCGACGATAGACACAAGATCGTGAATGTGGACCAACGGCAGTATGGCGACGTGTTTAAGGG
CGATCTGAACCCCAAGCCTCAAGGACAGAGACTGATCGAGGTGTCCGTGGAAGAAAACCACCCTTTCACCCTTAGAGCCC
CTATCCAGAGAATCTACGGCGTGCGCTACACGGAAACCTGGAGCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGTACCGGAGATGCCGCCC
CTGCCATCCAACACATCTGCCTGAAGCACACCACATGCTTCCAGGACGTGGTTGTGGACGTTGACTGCGCCGAGAACACC
AAAGAAGATCAGCTGGCCGAGATCTCTTACAGATTCCAGGGCAAGAAAGAGGCCGACCAGCCCTGGATCGTGGTCAATAC
CAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAACTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCAGGCGTGCTCAAAGTGCTGCGGACCGAGAAG
CAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGGGGATCCGACGGCACCAGCACATACGCCACATTCCTGGTGACCTGGAA
GGGCGACGAGAAAACCAGAAACCCTACACCCGCTGTTACCCCACAACCTCGGGGCGCCGAGTTCCACATGTGGAATTACC
ACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACATTTAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCCCCTTTCGATC
TGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGACCCTACATGCCAGCCAATGAGGCTGTACAGCACCTGTCTGTACCACCCTAA
CGCCCCTCAGTGCCTGAGCCATATGAACAGCGGTTGTACATTTACCAGCCCCCATCTGGCTCAGCGGGTGGCCAGCACCGT
GTACCAGAACTGCGAGCACGCTGACAACTACACAGCCTACTGTCTGGGCATTTCTCACATGGAACCTTCCTTCGGCCTCATC
CTGCACGACGGCGGAACAACACTGAAGTTCGTGGATACACCTGAAAGCCTGTCTGGCCTGTATGTGTTCGTGGTGTACTTC
AACGGCCACGTCGAGGCCGTGGCTTACACCGTGGTGAGCACGGTCGACCACTTCGTGAACGCCATCGAGGAACGGGGAT
TCCCCCCCACCGCCGGCCAGCCACCTGCCACCACCAAGCCCAAGGAAATCACCCCTGTGAATCCTGGCACCTCCCCTCTCC
TGAGATACGCCGCCTGGACCGGCGGTTTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTCATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAG
CGGATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGATAAGAGCCCCTACAACCAGAGCATGTATTACGCCGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGATGCCGAAGCCGCTGATGCCGAGGAGGAATTTGGCAACGCTATCGGCGGCAGCCACGGCGGCTCTAGCTAC
ACCGTGTACATCGACAAGACAAGATGATGA3’UTR:
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGT
ACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO.11
ZS304-mRNA-4：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:
GAGACCCAAGCTGGCTAGCGGGAGAAAGCTTACCGGCTAGCGCCGCCACC
CDS:
ATGGGCACAGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTCCTGATGGGCTTCGGAATTATCACAGGCACACTGCGGATCACCAACCC
CGTGCGGGCCAGCGTGCTGAGATACGACGACTTCCACATCGACGAGGATAAGCTGGATACCAACAGCGTGTACGAGCCTT
ATTACCATAGCGACCACGCCGAAAGCAGCTGGGTCAACAGAGGCGAAAGCTCTAGAAAGGCCTACGACCACAACTCCCCT
TACATCTGGCCTAGGAACGACTACGACGGGTTTCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAATCAGGGCAGAG
GAATCGATAGCGGCGAGAGACTGATGCAGCCTACCCAGATGTCAGCCCAGGAGGACCTGGGCGATGATACCGGCATTCAC
GTGATCCCCACACTGAACGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGATCAGAGACAGTACGGCGATGTGTTCAAGGG
CGACCTTAATCCCAAGCCTCAAGGCCAGAGACTGATCGAGGTGTCCGTGGAAGAAAACCACCCCTTTACACTGAGAGCCC
CCATCCAGCGGATCTACGGCGTGCGGTACACTGAAACCTGGTCCTTCCTGCCTAGCCTGACCTGCACCGGAGACGCCGCTC
CTGCTATCCAACACATCTGTTTGAAGCACACCACCTGTTTTCAGGACGTGGTGGTGGACGTGGATTGCGCCGAGAATACCA
AGGAGGACCAGCTGGCCGAAATCAGCTACAGATTCCAGGGCAAAAAGGAAGCCGATCAGCCCTGGATCGTGGTCAATAC
CAGCACCCTGTTCGATGAGCTGGAGCTGGACCCCCCCGAGATCGAGCCTGGCGTTCTGAAAGTGCTGAGAACCGAGAAA
CAGTACCTGGGCGTTTACATCTGGAACATGCGGGGCTCTGACGGCACCAGCACATACGCCACCTTCCTGGTGACCTGGAA
GGGCGACGAGAAGACCAGAAACCCCACCCCTGCCGTTACCCCACAGCCACGCGGTGCCGAGTTCCACATGTGGAATTATC
ACAGCCACGTGTTCAGCGTGGGCGACACATTTAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAGGCTCCTTTCGACC
TGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGATCCTACCTGTCAGCCAATGCGGCTGTACAGCACCTGTTTATATCACCCTAAC
GCCCCACAGTGCCTCAGCCACATGAACAGCGGGTGCACATTTACATCCCCTCACCTGGCACAGCGGGTGGCCTCTACAGTG
TATCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCTTACTGCCTGGGAATCTCTCATATGGAACCCAGCTTCGGCCTGATCC
TGCACGACGGCGGAACAACACTGAAGTTCGTGGACACCCCTGAGTCTCTGAGCGGCCTGTACGTGTTCGTGGTGTACTTC
AACGGCCACGTCGAAGCCGTGGCCTACACGGTGGTGTCCACAGTGGACCATTTCGTGAACGCCATCGAGGAAAGAGGCT
TCCCTCCTACCGCCGGACAACCTCCTGCTACCACCAAACCAAAAGAGATCACCCCGGTGAATCCTGGAACAAGCCCTCTGC
TCAGGTACGCCGCCTGGACCGGCGGCCTGGCTGCTGTGGTTCTGCTGTGCCTGGTCATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAGC
GGATGAGAGTGAAGGCCGCCCGGGTGGACAAGAGCCCCTACAACCAGAGCATGTACTACGCCGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGACGCTGAAGAGGAATTTGGCAACGCCATCGGCGGCTCTCACGGAGGAAGCAGCTA
CACCGTGTATATCGACAAGACAAGATGA3’UTR:
GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTG
GTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGC
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO.12
ZS304-mRNA-5：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:
CTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGGCCGCCACC
CDS:
ATGGGCACCGTGAACAAGCCCGTGGTGGGCGTCCTGATGGGCTTCGGCATCATTACAGGCACCCTCAGAATCACCAACCC
TGTTAGAGCCTCTGTGCTGAGATACGATGATTTCCACATCGACGAGGACAAGCTGGACACAAACAGTGTGTACGAGCCCTA
CTACCATAGCGACCACGCCGAGAGCAGCTGGGTGAATAGAGGCGAGAGCTCTAGAAAGGCCTATGACCACAACTCTCCTT
ACATCTGGCCCAGAAACGACTACGACGGCTTTCTGGAAAACGCTCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGCAGAGG
AATCGACAGCGGAGAAAGACTGATGCAACCTACACAGATGAGCGCCCAGGAGGACCTGGGCGATGACACAGGCATCCAC
GTTATTCCTACCCTGAACGGTGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGCGCCAGTACGGCGACGTGTTCAAGGG
CGACCTGAATCCAAAGCCACAAGGCCAGAGACTGATCGAGGTGTCTGTGGAGGAAAACCACCCCTTCACCCTGCGGGCC
CCTATTCAGCGGATCTACGGCGTGAGATACACAGAGACATGGTCCTTCCTGCCATCCCTGACCTGTACCGGCGACGCCGCT
CCTGCCATTCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACATGCTTTCAGGACGTGGTGGTGGACGTGGACTGCGCCGAGAACAC
AAAGGAAGATCAACTGGCTGAGATCTCCTACCGGTTCCAGGGGAAGAAAGAAGCCGACCAGCCCTGGATCGTTGTCAAC
ACCAGCACCCTGTTCGACGAGCTGGAACTGGATCCTCCTGAGATCGAGCCGGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGAACCGAGA
AGCAGTACCTGGGGGTGTACATCTGGAATATGAGGGGCTCCGACGGCACAAGCACATACGCCACATTTCTGGTGACCTGG
AAGGGCGATGAGAAGACCCGGAACCCTACCCCTGCTGTGACACCTCAGCCTAGAGGCGCCGAGTTCCACATGTGGAACTA
CCATTCTCACGTGTTCAGCGTGGGAGATACCTTTAGCCTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAAGCCCCTTTCGAC
CTGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCCATCGACCCTACATGCCAGCCAATGCGGCTGTACAGCACCTGCCTGTACCACCCTA
ACGCTCCACAGTGCCTGAGCCACATGAACTCTGGCTGTACCTTCACCTCCCCTCATCTGGCCCAGCGGGTGGCCAGCACCG
TGTACCAGAACTGTGAACACGCTGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAACCCAGCTTTGGACTGA
TCCTGCACGACGGCGGAACCACCCTGAAATTCGTCGATACACCTGAGAGCCTGTCTGGACTTTATGTGTTCGTGGTGTACTT
CAATGGCCACGTGGAAGCCGTGGCCTACACCGTGGTGTCCACCGTGGATCACTTCGTGAACGCTATCGAGGAGAGAGGCT
TCCCCCCCACCGCCGGCCAGCCTCCCGCCACCACCAAACCTAAAGAGATCACCCCTGTAAACCCTGGCACCAGCCCTCTGC
TGCGGTACGCCGCTTGGACAGGAGGCCTGGCCGCAGTGGTCCTGCTTTGTCTGGTGATCTTCCTGATCTGCACGGCCAAG
CGGATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGACAAAAGCCCATATAACCAGAGCATGTACTACGCCGGACTGCCCGTGGATGA
CTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGATGCCGAAGAGGAATTCGGCAATGCCATCGGCGGCAGCCACGGAGGCAGCAGCTA
CACAGTGTACATCGATAAGACCAGATGATGA3’UTR:
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGG
GCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO.13
ZS304-mRNA-6：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:
TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGC
CACC
CDS:
ATGGGAACCGTGAACAAGCCTGTGGTGGGAGTGCTGATGGGCTTCGGAATCATCACCGGCACCCTGAGAATCACCAACCC
GGTGCGGGCCTCTGTGCTGCGGTACGACGACTTCCACATCGATGAGGATAAGCTGGATACAAACAGCGTGTACGAGCCCT
ACTACCACAGCGACCACGCCGAGTCCAGCTGGGTGAACAGAGGCGAGAGCTCTAGAAAGGCCTACGATCATAATTCTCCT
TACATCTGGCCTCGGAACGACTACGATGGCTTCCTGGAAAACGCCCACGAGCACCACGGCGTCTACAATCAGGGAAGAGG
CATCGACAGCGGAGAAAGACTGATGCAGCCTACACAGATGAGCGCCCAGGAGGACCTGGGCGATGACACAGGCATCCAT
GTGATCCCTACCCTGAATGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGAGACAATACGGCGACGTGTTTAAGGG
CGATCTGAACCCTAAGCCTCAGGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCCGTCGAGGAAAACCACCCCTTCACACTGAGAGCCC
CTATCCAGAGGATCTACGGCGTTAGATACACCGAGACATGGTCCTTCTTGCCTAGCCTGACCTGTACCGGAGATGCCGCCCC
TGCCATCCAACACATTTGCCTGAAGCACACAACCTGCTTCCAGGACGTGGTGGTCGATGTGGATTGCGCCGAGAATACCAA
GGAGGACCAACTGGCTGAAATTTCTTACCGATTTCAGGGCAAAAAGGAAGCTGATCAGCCTTGGATCGTGGTTAATACAA
GCACACTGTTCGACGAGCTGGAACTGGACCCTCCAGAGATCGAGCCTGGCGTGCTGAAAGTGCTGCGGACCGAGAAACA
GTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGCGGGGCTCTGATGGCACCAGCACCTACGCGACATTTCTGGTGACCTGGAAGG
GCGACGAGAAGACCAGAAACCCCACCCCTGCCGTGACTCCTCAGCCTAGAGGCGCCGAATTCCACATGTGGAACTACCAC
AGCCATGTGTTCAGCGTGGGCGACACCTTTTCACTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATCCACGAGGCGCCATTTGACCTG
CTGCTTGAATGGCTGTACGTGCCCATCGACCCCACATGCCAGCCCATGAGACTGTACAGCACCTGTCTGTATCACCCTAACG
CCCCCCAGTGCCTCAGCCACATGAACAGCGGTTGTACATTCACCAGCCCCCACCTGGCTCAGCGGGTGGCCAGCACCGTG
TACCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCCTATTGCCTGGGCATCTCTCACATGGAACCTTCTTTCGGCCTGATCC
TGCACGACGGCGGCACAACCCTGAAGTTCGTGGACACACCTGAGTCTCTGAGCGGACTGTACGTGTTCGTGGTCTACTTC
AACGGCCACGTGGAAGCCGTGGCCTATACCGTGGTCAGCACCGTGGACCACTTCGTGAACGCCATCGAAGAAAGAGGCT
TTCCTCCAACCGCCGGCCAGCCTCCTGCTACCACCAAACCTAAGGAAATCACACCAGTGAATCCCGGCACCTCCCCCCTGC
TCCGCTACGCTGCCTGGACCGGCGGACTGGCCGCTGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGATCTGCACAGCCAAGC
GGATGCGGGTGAAGGCTGCCAGAGTGGACAAAAGCCCCTACAACCAGAGCATGTACTACGCAGGCCTGCCTGTGGACGA
CTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGATGCCGAGGAAGAGTTCGGCAACGCCATCGGCGGCAGCCACGGAGGCAGCAGCTA
TACAGTGTACATCGACAAGACAAGATGATGA3’UTR:
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCT
GAGTAGGAAGTGAGGGTCTAGAACTAGTGTCGACGC
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO.14
ZS304-mRNA-7：
T7 Promoter:
TAATACGACTCACTATAAG5’UTR:GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC
CDS:
ATGGGCACTGTGAACAAGCCTGTGGTGGGCGTGCTGATGGGCTTCGGCATCATCACAGGAACACTGCGGATCACCAACCC
CGTTAGAGCCAGCGTGCTGAGATATGACGACTTCCACATCGACGAGGACAAGCTGGATACAAACTCCGTGTACGAACCTTA
CTACCACTCCGACCACGCGGAGAGCAGCTGGGTGAACAGAGGAGAGTCTTCTAGAAAGGCCTACGACCATAATTCACCAT
ACATTTGGCCCAGGAACGACTACGACGGCTTTCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTATAATCAAGGAAGAGG
CATCGACAGCGGCGAGCGGCTGATGCAGCCCACCCAGATGAGCGCCCAAGAGGACCTGGGCGACGATACCGGCATCCAC
GTGATCCCCACCCTGAACGGCGATGATAGACACAAGATCGTGAACGTGGACCAGAGGCAGTACGGCGACGTGTTCAAGG
GAGATCTGAATCCCAAGCCCCAGGGCCAGCGGCTTATCGAAGTGTCCGTGGAAGAGAACCACCCTTTCACCCTGCGGGCC
CCTATCCAGAGAATCTACGGGGTTAGATACACCGAGACATGGAGCTTTCTGCCTAGCCTGACCTGTACAGGCGACGCCGCT
CCTGCCATCCAACACATCTGCCTGAAACACACCACCTGCTTCCAGGACGTGGTCGTCGATGTGGACTGCGCCGAGAATACC
AAGGAAGATCAGCTGGCCGAAATCAGCTACAGATTCCAAGGCAAGAAAGAGGCTGACCAGCCTTGGATCGTGGTGAACA
CCTCTACACTGTTCGATGAGCTGGAACTGGACCCTCCTGAGATCGAGCCTGGGGTGCTGAAGGTGCTGCGGACCGAAAA
GCAGTACCTGGGCGTGTATATCTGGAACATGAGAGGCAGCGACGGCACAAGCACCTACGCCACATTTCTGGTCACCTGGA
AGGGCGACGAGAAGACAAGAAACCCCACACCAGCCGTGACCCCTCAGCCGCGGGGAGCCGAGTTCCACATGTGGAATTA
CCACAGCCACGTGTTTAGCGTGGGCGACACCTTCAGCCTGGCTATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAAGCCCCATTCGA
CCTGCTGCTGGAATGGCTGTACGTGCCTATCGATCCTACCTGTCAGCCTATGCGGCTGTACTCCACCTGCCTCTACCACCCCA
ACGCCCCTCAGTGTTTGTCTCACATGAACTCTGGCTGCACCTTCACCAGCCCTCACCTGGCCCAGAGAGTGGCCAGCACAG
TTTACCAGAACTGCGAGCACGCCGACAACTACACCGCCTACTGCCTGGGCATCAGCCACATGGAACCCAGCTTCGGCCTGA
TCCTTCATGATGGAGGCACAACCCTGAAGTTCGTCGACACCCCCGAGAGCCTGAGCGGCCTGTACGTGTTCGTGGTGTACT
TTAACGGCCACGTGGAAGCAGTGGCTTATACCGTGGTTTCTACAGTGGACCACTTCGTGAATGCTATTGAGGAAAGAGGAT
TTCCTCCAACCGCTGGCCAGCCACCAGCTACCACAAAACCTAAGGAAATCACCCCTGTCAACCCTGGCACCTCCCCCCTGC
TGCGATACGCCGCCTGGACAGGCGGCCTGGCCGCCGTGGTGCTGCTGTGCCTGGTGATCTTCCTGATCTGTACCGCCAAG
AGAATGCGGGTGAAGGCCGCTAGAGTGGATAAAAGCCCTTACAACCAGAGCATGTACTACGCCGGACTGCCCGTGGATGA
TTTCGAGGACGCCGAGGCCGCCGATGCCGAGGAAGAGTTCGGCAACGCCATAGGAGGCAGCCATGGCGGCTCTAGCTAC
ACAGTATATATCGACAAAACCAGATGATGA3’UTR:
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGT
ACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA
PolyA Tail:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Claims (2)
1.一种核酸-脂质复合物，其特征在于，由编码核酸和递送核酸的脂质体组成，所述编码核酸的序列如SEQ ID NO.12所示；所述递送核酸的脂质体由缓冲液和脂质溶液组成；所述缓冲液与编码核酸共同组成水相溶液，缓冲液pH为5.5；脂质溶液用于包裹水相溶液；所述缓冲液由氨基丁三醇、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、冰乙酸、三水乙酸钠和DEPC水组成；所述脂质溶液中的脂质含量为10~20mg/mL，所述脂质由SM-102、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000组成；
所述核酸-脂质复合物的制备方法包括如下步骤：
（1）水相溶液和脂质溶液的配制
水相溶液的配制：精密称取氨基丁三醇99.20mg、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐377.60mg、冰乙酸13.76mg及三水乙酸钠64.00mg，并经DEPC水160mL溶解，用冰乙酸调节pH至5.5；编码核酸用缓冲液稀释到200μg/mL；
脂质溶液的配制：称取SM-102 141.36mg，无水乙醇加入量4mL，配制SM-102脂质母液；称取胆固醇59.26mg，无水乙醇加入量4mL，配制胆固醇脂质母液；称取DSPC 31.44mg，无水乙醇加入量4mL，配制DSPC脂质母液；称取DMG-PEG14.97mg，无水乙醇加入量4mL，配制DMG-PEG脂质母液；四种脂质母液各取0.6mL混合均匀；
（2）mRNA-LNP的制备：
a、按照水相mRNA溶液：有机相脂质溶液=3：1的比例，12mL/min的流速，1.2mL的总体积，通过微流控纳米药物制备系统制备初始mRNA-LNP；初始废液0.3mL，终端废液0.05mL；
b、制备得到的mRNA-LNP立即用1X的缓冲液20倍稀释再补加10倍体积稀释，通过超滤离心管进行离心浓缩，离心条件2500g，4℃，10min弃掉超滤离心管下部溶液，直至超滤管上部体积接近初始mRNA-LNP体积，即为核酸-脂质复合物。
2.如权利要求1所述的核酸-脂质复合物在制备水痘-带状疱疹病毒疫苗中的应用，所述水痘-带状疱疹病毒疫苗可显著提高小鼠体内产生的水痘-带状疱疹病毒抗体滴度。
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- 2023-02-15 CN CN202310117947.XA patent/CN116355917B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Effects of Varicella-Zoster Virus Glycoprotein E Carboxyl-Terminal Mutation on mRNA Vaccine Efficacy;Cao H 等;《Vaccines (Basel)》;第9卷(第12期);摘要、材料和方法部分 * |
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