CN113372453A

CN113372453A - 一种融合蛋白及猪流行性腹泻病毒s1蛋白重组亚单位疫苗

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Publication number: CN113372453A
Application number: CN202110659863.XA
Authority: CN
Inventors: 余兴龙; 丁彦彬; 赵墩; 喻晓航; 罗烨; 罗灵芝; 郑金; 刘江鹰
Original assignee: Hunan Wubang Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Wubang Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113372453B

Abstract

一种融合蛋白，包含猪流行性腹泻病毒S1蛋白和具有佐剂效应的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellum，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。以该融合蛋白配合商品化佐剂制备的猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组亚单位疫苗，经过肌肉注射和滴鼻免疫动物后，发现本发明的S1‑Flagellum疫苗不仅可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫，同时又能够在黏膜分泌物中产生高水平的抗原特异性sIgA，为一种既能产生针对PEDV的细胞和体液免疫保护，同时又能产生黏膜免疫保护的S1重组亚单位疫苗，可用于PEDV的防控和净化。

Description

一种融合蛋白及猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组亚单位疫苗

技术领域

本发明属于兽用疫苗和兽用生物制品领域，涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒S1蛋白和沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellum的融合蛋白，同时涉及包含该融合蛋白的猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组亚单位疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以高接触性、仔猪高死亡率的重要传染性疾病，该病的主要特征是感染侵袭新生仔猪消化系统，死亡率可达70％以上，自2013年首次爆发以后，对整个全球的养猪业造成巨大经济损失。目前，我国主要通过对母猪进行产前接种PEDV弱毒疫苗和灭活疫苗进行防控，国内商品化的PEDV活疫苗和灭活苗，主要以CV777等毒株进行制备，临床反映仍存在免疫保护效果不完全、散毒、毒株重组突变的问题。近年来，PED在全中国范围内仍不断爆发，开发一种安全、有效的新型疫苗用于PEDV的免疫防控尤为迫切。

基因工程亚单位疫苗具有安全、有效、便于操作的优点，被认为是最具有应用前景的疫苗类型，猪流行性腹泻病毒(PEDV)的Spike蛋白(纤突蛋白)作为PEDV亚单位疫苗的靶标抗原已经被广泛研究。研究已经证实，Spike蛋白为糖基化蛋白，分为S1和S2两个结构域，S1区域分布丰富的中和抗体表位，其是PEDV亚单位疫苗开发的理想目标蛋白。其次，针对于PEDV的S1蛋白作为亚单位疫苗研究在国内外已经有所进展，但目前国内仍无针对PEDV的商品化亚单位疫苗。

天然免疫通过特殊的模式识别受体(PRRS)检测病原体相关分子模式(PAMPs)来识别病原体的入侵，TOLL样受体(TLRs)样受体在天然免疫的激活和病原体的识别中起着重要的作用，其中TLR5受体与其配体细菌鞭毛蛋白Flagellum相结合，可以激活适应性免疫应答。呼吸道、胃肠道疾病和生殖道等的上皮细胞分布有大量的TLR5，当鞭毛蛋白与抗原混合后经鼻内给药，在黏膜分泌物和血清中产生高水平的抗原特异性sIgA。此外，TLR5与鞭毛蛋白的结合通过刺激淋巴结巨噬细胞产生浆细胞生长因子而直接促进浆细胞分化，诱导Th2应答提高体液免疫应答和特异性IgG抗体水平。所以，鞭毛蛋白可作为一种有效的粘膜佐剂，主要通过与抗原直接混合或与抗原融合表达的方式用于增强抗原免疫力，鞭毛蛋白是疫苗配方中一种很好的佐剂，已经被广泛使用。

发明内容

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种融合蛋白，同时提供一种含有该融合蛋白的猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组亚单位疫苗，以用于PEDV的免疫防控。

为达上述目的，本发明提供的融合蛋白，包含猪流行性腹泻病毒S1蛋白和具有佐剂效应的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellum，Flagellum蛋白的D3区以破伤风毒素的(P2)T细胞表位QYIKANSKFIGITEL进行替换，S1蛋白与Flagellum蛋白之间使用刚性Linker(EAAAK)连接，尾端添加6×HIS标签，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明同时提供一种核酸分子，编码上述融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种疫苗，含有上述的融合蛋白；该疫苗还含有GEL01佐剂，融合蛋白与GEL01佐剂的体积比为4：1；该疫苗的浓度为200μg/mL。

研究表明，肠道中分泌性sIgA抗体水平及血液中IgG抗体水平，对于PEDV的保护至关重要。所以本发明以PEDV的S1蛋白和沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellum)为基础，使用哺乳动物细胞CHO表达出S1和Flagellum的融合蛋白S1-Flagellum，配合商品化佐剂进行乳化，经过肌肉注射和滴鼻免疫动物后，发现本发明的S1-Flagellum疫苗不仅可以产生特异性的细胞免疫和体液免疫，同时又能够在黏膜分泌物中产生高水平的抗原特异性sIgA，本疫苗为一种既能产生针对PEDV的细胞和体液免疫保护，同时又能产生黏膜免疫保护的S1重组亚单位疫苗，可用于PEDV的防控和净化，具有良好的应用前景。

如此，本发明的有益效果如下：

1.本发明借助真核表达系统，以融合表达的形式表达出S1-Flagellum蛋白，属于首次发明。

2.动物免疫及攻毒保护实验说明，本S1-Flagellum疫苗不仅可以产生细胞免疫、体液免疫，同时可以产生黏膜免疫用于阻断PEDV的口鼻接触传播。

3.本发明的S1-Flagellum疫苗为亚单位疫苗，可以用于PEDV的净化工作，具有较高的推广和应用价值。

附图说明

图1是S1-Flagellum基因片段的PCR扩增结果图，

其中，M:DNA分子mark；泳道1，2：S1-Flagellum PCR扩增产物。

图2是S1-Flagellum基因克隆转化子鉴定结果图，

其中，M:DNA分子mark；泳道1，2，3，4：pKS001-S1-Flagellum转化子。

图3是稳定细胞株表达上清中S1-Flagellum蛋白的WB鉴定结果图，

其中，泳道1：正常CHO-K1Q细胞的表达上清；泳道2：纯化的CHO-K1Q-S1-Flagellum细胞株(3H4单克隆细胞株)表达上清；M:彩虹180蛋白mark。

图4是CHO-K1Q-S1-Flagellum细胞株(3H4单克隆细胞株)表达上清纯化结果图，

其中，泳道1，2，3：3H4细胞株表达上清纯化的S1-Flagellum蛋白；M:彩虹180蛋白mark。

图5是西班牙Ingenasa试剂盒检测血清中S1抗体水平图。

图6是间接ELISA检测口腔分泌液中的sIgA抗体水平图。

图7是流式细胞仪检测外周血中CD3⁺/CD4⁺及CD3⁺/CD8⁺T细胞的比例图。

图8是使用ELISA试剂盒检测外周血中IL-4及IFN-γ的表达水平图。

图9是使用PEDV毒株进行攻毒后仔猪死亡情况图。

具体实施方式

实施例1 表达载体构建及蛋白制备

本发明以PEDV毒株(GenBank accession:JQ517274.1)的S1蛋白基因及肠炎鼠伤寒沙门氏菌株(Enterica serovar Typhimurium strain)(GenBank accession:CP007581.1)的鞭毛蛋白Flagellum基因为基础，设计S1与Flagellum蛋白的融合表达序列S1-Flagellum，其中Flagellum蛋白的D3区以破伤风毒素的(P2)T细胞表位QYIKANSKFIGITEL进行替换，S1与Flagellum之间使用刚性Linker(EAAAK)连接，融合蛋白的尾端添加6×HIS标签，最终的基因序列送南京金斯瑞生物公司进行密码子优化合成。

设计PCR扩增引物，以合成的S1-Flagellum基因片段(序列如SEQ ID NO.2所示，共3630bp)作为模板，扩增出S1-Flagellum重组基因，通过基因克隆将S1-Flagellum基因克隆至哺乳动物细胞表达载体pKS001的HindⅢ和EcoRⅠ中，构建出重组表达载体pKS001-S1-Flagellum，提取无内毒素的重组表达载体pKS001-S1-Flagellum，借助电穿孔转染设备，将pKS001-S1-Flagellum质粒转染至哺乳动物细胞CHO-K1Q(

CHO-K1Q)中，构建稳定表达S1-Flagellum蛋白的CHO-K1Q稳定细胞株，发酵所构建的CHO-K1Q细胞株，表达纯化获得S1-Flagellum蛋白，用于后期疫苗的制备和使用。

1.重组表达载体pKS001-S1-Flagellum的构建

1.1PCR扩增及基因片段的酶切

设计引物S1-Flagellum-FP和S1-Flagellum-RP，引物序列如下：

S1-Flagellum-FP：5'-AAGCTTGCCACCATGCAGGACGTGACCAG-3'，如SEQ ID NO.3所示；

S1-Flagellum-RP：5'-GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3'，如SEQ ID NO.4所示。

以上述合成的S1-Flagellum基因(SEQ ID NO.1)作为模板进行PCR扩增，扩增出S1-Flagellum重组基因，扩增的基因片段长度为3630bp，结果见图1，回收PCR扩增片段。

使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对回收的S1-Flagellum基因片段于37℃酶切3h，酶切体系(240μL)：S1-Flagellum基因片段120μL、HindⅢ6μL、EcoRⅠ6μL、10×Kbuffer24μL，水补充至240μL。酶切后回收目的片段。

1.2重组质粒的克隆转化

复苏培养转化有pKS001质粒的DH5α重组克隆菌，使用LB培养基培养100mL菌液，37℃180rpm条件下培养12h后使用质粒提取试剂盒提取pKS001。使用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶对提取的pKS001质粒于37℃酶切3h，酶切体系(120μL)：pKS001质粒60μL、HindⅢ3μL、EcoRⅠ3μL、10×Kbuffer12μL、水42μL。将酶切前、酶切后的pKS001分别进行核酸电泳，确定pKS001被切开，回收酶切后载体片段。使用DNA T4连接酶将S1-Flagellum基因片段与酶切后的pKS001载体于22℃连接30min，连接体系为：pKS001载体2μL、S1-Flagellum的PCR片段6μL、T4连接酶10μL、Ligase buffer2μL。取S1-Flagellum与pKS001的连接产物10μL，轻轻加入放置在冰盒上的100μL TOP10感受态中，轻轻吹打混匀，将该混合物置于冰上30min。42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3～5min。加入500μL不含抗生素的LB培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h。将菌液5000rpm离心1min以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约50-100μL的培养液，重悬菌体，然后全部均匀涂布到含氨苄抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。

挑取pKS001-S1-Flagellum转化平板上的克隆菌落作为模板，以S1-Flagellum-FP和S1-Flagellum-RP为鉴定引物，进行PCR扩增，将PCR产物进行核酸电泳，具体如图2所示，条带大小与预期相符合，表明pKS001-S1-Flagellum克隆菌克隆成功。

1.3重组质粒的抽提

1)使用LB培养基，接种pKS001-S1-Flagellum重组克隆菌200mL，培养37℃，180rpm，培养12h后，5000rpm 5min离心收集细菌，使用北京天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)进行质粒的抽提。

2)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3)取200mL过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm离心3min收集细菌，尽量吸除上清。尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL溶液P1(已加入RNase A)，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

4)向离心管中加入8mL溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。

5)向离心管中加入8mL溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm离心10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL的管中。

6)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)。

7)室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。

8)向吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9)重复操作步骤8。

10)向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液。

11)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

12)将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2mL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm离心2min。将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存。

1.4对构建质粒进行基因测序

使用NdeI对抽提的重组质粒进行单酶切，使用切胶回收试剂盒，并切胶回收较小片段。以pKS001-fp:5'-AGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTT-3'(SEQ ID NO.5)和pKS001-rp:5'-GCCGCCAGACATGATAAGATACATTG-3'(SEQ ID NO.6)为测序引物，将回收的基因片段，寄送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，验证克隆序列正确性。测序报告结果显示，所构建的pKS001-S1-Flagellum基因正确无误，基因克隆成功。

2.重组蛋白表达鉴定及蛋白的CHO稳定细胞系构建与筛选

所用试剂和仪器：CHO-K1Q细胞，MSX(24mM)，

CD04培养基，200mM(L-谷胺酰胺)，BTX-ECM830电转仪，标准4mm电转杯，QuaMono^TM CHO cloning培养基A，QuaMono^TMCHO cloning培养基B,

CHO Feed02 Supplement补料，50mL康宁离心管，96孔细胞培养板(康宁)，24孔细胞培养板(康宁)，T25细胞培养瓶(康宁)，125mL细胞摇瓶(康宁)，离心机，细胞计数板，pKS001-S1-Flagellum质粒，细胞培养箱(37℃，5％CO₂)，CO₂细胞培养摇床(37℃，5％CO₂)。

2.1细胞复苏及传代

使用预热的CD04培养基(添加4mM的L-谷胺酰胺)复苏1支CHO-K1Q细胞，细胞复苏至125mL细胞摇瓶，培养体积为25mL，50mm振幅CO₂摇床，37℃，5％CO₂，100rpm条件下进行培养。待培养至2-5天，选择处于对数生长中期时(细胞密度约为2～3×10⁶cells/mL)CHO-K1Q细胞进行传代，传代密度为5×10⁵cells/mL，放置50mm振幅CO₂摇床，37℃，5％CO₂，100rpm条件下继续进行培养。开展电转实验前，按照以上方法对细胞进行连续3次传代。

2.2细胞转染

选择对数生长期CHO-K1Q细胞，密度达到2～3×10⁶cells/mL时，180g/min离心5min收集细胞。使用新鲜的CD04培养基(添加4mM的L-谷胺酰胺)重悬CHO-K1Q细胞，调整细胞密度为5×10⁶cells/mL。取50μgDNA的pKS001-S1-Flagellum质粒到4mm电转杯中，然后加入800μL密度为5×10⁶cells/mL的CHO-K1Q细胞。使用4mm电转杯进行电转实验(电转参数：电压280V，脉冲1次、时长3ms，脉冲间隔时长5s)。电转后静置电转杯5min，然后将细胞转移至T25细胞培养瓶之中，并添加5mL的CD04培养基(添加4mM的L-谷胺酰胺)，轻轻吹打混匀，置入恒温箱中培养。

2.3初步MSX加压及筛选

静置培养以上转染细胞24h后，将T25细胞培养瓶之中的细胞转移至50mL离心管，180g/min，5min离心收集细胞，弃掉上清，使用CD04培养基(含有25μM，MSX)重选细胞，按照1～2×10⁴cells/孔，200μL/孔体积，进行96孔板铺板。待细胞长至每孔的四分之一时，使用ELISA方法检测表达量，挑选高表达孔内细胞，转移富集到新的96孔板上继续培养。挑选高表达细胞池，进行放大培养(从24孔板至摇瓶逐步放大)。通过比较细胞生长，表达水平，倍增时间，情况筛选得到最优细胞池。

2.4单克隆挑选及增殖

1)使用CD04培养基(含有25μM，MSX)对筛选的最优表达细胞池进行传代和培养，培养细胞池密度至2～3×10⁶cells/mL，而且细胞活率大于95％。

2)将适量的细胞培养物置于24孔板中，使用CD04培养基，将细胞密度进行倍比稀释至200cells/mL。

3)使用QuaMono^TM CHO cloning培养基(按照CHO cloning Medium A:CHO cloningMedium B＝100：1比例进行配制)，倍比稀释至4cells/mL，视铺板效率决定细胞悬液总体积，使用移液器吸取上述细胞液，按照120μL/孔，0.5个细胞/孔的标准。每个克隆铺板不少于20块；

4)使用96孔高通量扫描显微镜，对所有的克隆孔，进行逐一扫描拍照，使用电脑筛选单克隆孔进行标记。

5)置入恒温培养箱静置培养，第0天、第1天、第2天、第3天、第7天对单克隆细胞孔，进行扫描观察，拍照记录细胞生长情况。

6)第7天时，按照100μL/孔标准，添加CHO cloning Medium C(2周后，单克隆细胞的汇合度可以达到1/2-1/3)。

7)一般为铺板后的14-15天后，待细胞长至每孔的四分之一时，挑选细胞生长状态良好、生长旺盛的细胞孔，转移到新的96孔板。

8)3天后，使用ELISA方法检测表达上清，根据检测结果，挑选适量高表达的细胞池，进行悬浮培养放大，冻存后作为构建的稳转细胞种子，其中单克隆3C1株、4F2株、3H4株具有高表达水平，且3H4株的表达量最高。

3.使用摇瓶进行稳定细胞株Fed-batch发酵表达

使用125mL的细胞摇瓶接种构建的CHO-K1Q稳定细胞株3H4，逐渐放大至500mL的摇瓶中进行培养，培养基选择CD04培养基。使用

CHO Feed02 Supplement补料进行补加营养，进行发酵培养，同时按照6g/L的标准补充葡萄糖。第0天开始取样，绘制细胞生长曲线，第3天开始留样，进行后续统一产量检测，第14天时，细胞活率低于60％时收获。

4.表达上清的Western-boling鉴定

细胞株3H4悬浮发酵第4天，收集了1mL上清液，同时以正常培养的CHO-K1Q细胞培养上清CD04培养基液作为对照。取上清样品，各加入20μL的loadingbuffer和60μL的转染上清，煮沸5min，在提前制备12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶内上样，彩虹蛋白mark加入5μL，转染上清样品每孔加入10μL，120v电泳80min。将MilliporePVDF(0.45μm)膜进行用甲醇浸泡1.5min预处理，后放置到转膜液浸泡5min。按照电压600v，电流300mA，时间为60min的条件转膜。使用1％明胶含量的PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)在4℃静止封闭过夜。使用封闭液稀释His-tag单克隆抗体(MAb)至终浓度0.1μg/mL，将PVDF膜，置于使用封闭液稀释好的一抗中，在37℃摇床上孵育1.5h，转速60rpm。使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)洗涤PVDF膜3次，每次洗涤10min。封闭液稀释HRP羊抗鼠二抗IgG至0.05μg/mL，将PVDF膜置于使用封闭液稀释的二抗中，37℃孵育1h。使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20)洗涤PVDF膜3次，每次洗涤10min。使用ECL溶液(Millipore)并将曝光液均匀滴加在PVDF膜上，借助成像系统(Bio-Rad)收集信号，并使用Image Lab软件4.0.1分析Western-boling结果，具体结果见图3，被曝光的S1-Flagellum蛋白条带，与预期的170kDa大小完全相符合。

5.表达上清的纯化

收集细胞株3H4的培养混合物上清，低温高速离心8000rpm，5min，弃掉沉淀中的细胞，以11000rpm 4℃再次离心10min后收集上清。将以上收集上清培养物，使用0.45μm的滤膜过滤以后，使用5mL的TED-6FF-Ni纯化柱进行纯化，流速为3mL/min。使用Tris缓冲液(pH8.0,50mM Tris-HCl，0.2M Nacl)进行洗涤，每个样品按照3mL/min流速，洗涤10min，待基线拉平以后，使用500mM咪唑溶液(pH8.0，50mM Tris-HCl，0.2M Nacl，500mM Imidazole)进行梯度洗脱，待OD280出峰以后，按照0.8mL/管的标准收集纯化样品。对洗脱的样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果显示能够纯化获得纯度较高的S1-Flagellum蛋白，与预期的170kDa大小完全相符合，结合参见图4。

实施例2 疫苗制备

将S1-Flagellum蛋白使用0.22μm滤膜进行除菌过滤，使用无菌PBS缓冲液稀释至400μg/mL的浓度，使用无菌PBS缓冲液稀释GEL01佐剂(Seppic)至40％浓度，使用搅拌子磁力搅拌佐剂相，不断边搅拌边滴等体积的抗原相，最终以佐剂与抗原按照1:4比例混合搅拌均匀，制备得到S1-Flagellum亚单位疫苗(200μg/mL)，然后进行分装并4℃冷藏备用。

实施例3 疫苗免疫实验

选择PEDV抗原抗体均为阴性的怀孕母猪10头，随机分为2组：S1-Flagellum疫苗免疫组(简称S1-Flagellum组)和PBS免疫对照组(简称PBS组)，S1-Flagellum组的母猪颈部肌肉注射2mL的本发明的S1-Flagellum疫苗，同时使用本发明的S1-Flagellum疫苗进行2mL的滴鼻免疫，PBS组的母猪进行颈部肌肉注射和鼻腔滴鼻2mLPBS。每间隔21天进行一次免疫(肌肉注射和滴鼻免疫)，共免疫2次，免疫后第14天、21天、42天、35天、42天、56天，对母猪进行耳缘静脉采血，离心收集血清，同时使用咀嚼棉绳采集口腔分泌液。

免疫后的第56天，对每个组的母猪进行外周血采集，并进行抗凝血处理，便于后续流式细胞仪检测淋巴细胞(CD3⁺/CD4⁺),(CD3⁺/CD8⁺)T淋巴细胞以及血浆中IL-4及IFN-γ表达水平的检测。

3.1免疫后特异性IgG和sIgA抗体的检测

3.1.1免疫后特异性IgG检测

免疫后第0天、21天、35天、42天、56天，对所有母猪进行耳缘静脉采血，220×g离心5min，离心收集血清。使用西班牙Ingenasa试剂盒检测试剂盒说明书，检测免疫后第0天、21天、35天、42天、56天的IgG抗体水平，统计S1-Flagellum组和PBS组的抗体情况。结果表明，对照PBS组猪只的S1抗体为阴性，S1-Flagellum组的S1抗体阻断逐渐上升，免疫后56天平均S/P值可以达到2.5，具体见图5，本发明的S1-Flagellum疫苗能产生高水平的血清IgG抗体，表明本发明的S1-Flagellum疫苗具有较好的免疫原性。

3.1.2免疫后特异性sIgA检测

免疫后第0天、21天、35天、42天、56天，时使用咀嚼棉绳采集口前分泌的唾液，使用10kda超滤管，5000×g离心10min，浓缩至1mL。使用碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)将S1-Flagellum蛋白稀释至3μg/mL，按照每孔添加100μL的标准，包被蛋白至96孔酶标板(Corning Costar)，并在4℃条件下包被24h。使用PBS(pH7.4，0.1％Tween 20，1％BSA)封闭包被板，37℃封闭60min，封闭后拍干备用。向每个孔中添加100μL浓缩后肺泡灌洗液，并抗原板在37℃下，孵育30min。使用PBST(pH7.4，0.1％Tween 20)洗涤4次后，加入HRP偶联的山羊抗猪IgA(1：20,000)并在37℃下孵育30min。使用PBST(pH7.4，0.1％Tween 20)洗涤4次后，将50μL TMB底物,37℃下孵育15min。每孔添加到50μL终止溶液中，测定OD450，当OD450值大于0.25判定为抗体阳性，当OD450值小于或等于0.25判定为抗体阴性。

结果见图6，结果表明，S1-Flagellum疫苗滴鼻免疫后，口腔黏膜中能够产生较高水平的特异性sIgA抗体，随着免疫时间的推迟，特异性sIgA抗体呈现逐渐上升趋势，而PBS组没有产生相应的特异性sIgA抗体，说明通过滴鼻免疫，本发明的S1-Flagellum疫苗能产生高水平的sIgA抗体，该疫苗具有良好的黏膜免疫效果。

3.2免疫后CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺T细胞的检测

为了确定免疫后CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞的比率，免疫后的第42天，对每个组的母猪进行外周血采集，并进行抗凝血处理，并使用淋巴细胞分离培养基分离淋巴细胞分离外周血淋巴细胞。将淋巴细胞悬浮液用Zombie NIR^TM荧光染料，PE抗兔CD8a，PerCP/Cyanine5.5抗兔CD4⁺(BioLegend)PE抗兔CD3(BioLegend)，进行染色孵育。孵育后，使用BDFACSCalibur荧光激活细胞分选仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)分析结果。

分析结果如图7所示，相比PBS组，S1-Flagellum组能够产生高平的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T，且S1-Flagellum组产生的CD3⁺CD4⁺比例水平明显高于CD3⁺CD8⁺T比例，说明本发明的S1-Flagellum疫苗能产生显著的细胞免疫应答。

3.3免疫后IL-4及IFN-γ表达水平的检测

为了确定免疫后外周血中IL-4及IFN-γ表达水平，免疫后56天，对每个组的母猪进行外周血采集，并进行抗凝血处理，220g/min，离心5min，收集血浆上清。使用双抗体夹心原理的商品化ELISA试剂盒检测血浆中的IL-4及IFN-γ表达水平的检测。统计检测结果，具体如图8所示，相比PBS组，S1-Flagellum组能够产生明显的IL-4(Th2细胞分泌，刺激产生体液免疫)及IFN-γ(Th1细胞分泌，刺激产生细胞免疫)，说明本发明的S1-Flagellum疫苗能同时产生更强的细胞免疫和体液免疫。

3.4S1-Flagellum疫苗免疫保护实验

S1-Flagellum组和PBS组的免疫后60天，待10头母猪产仔后，充分让仔猪吃够初乳，从S1-Flagellum组和PBS组的母猪所产仔猪中分别随机选择5头4日龄的仔猪，分别标记为S1-FlagellumⅡ组和PBSⅡ组。使用实验室保存分离的PEDV病毒(GenBank accession:JQ517274.1)，按照500TCID50，1mL/头的攻毒剂量，对所有仔猪进行攻毒。攻毒后7天内，统计S1-FlagellumⅡ组和PBSⅡ组仔猪的死亡率，评估本发明的S1-Flagellum亚单位疫苗的免疫保护效果，结合参见图9，结果显示PBSⅡ组的5头仔猪全部死亡，S1-FlagellumⅡ组的5头仔猪全部存活，说明本发明的S1-Flagellum亚单位疫苗免疫母猪后，对所产仔猪产生了100％保护率，所以本S1-Flagellum亚单位疫苗对PEDV具有很好的免疫保护效果，具有广阔的应用前景。

以上实验结果显示，本发明的S1-Flagellum疫苗，不仅可以产生细胞免疫、体液免疫，同时可以产生黏膜免疫，S1-Flagellum疫苗产生高水平的特异性血清IgG抗体水平，而且能够产生黏膜免疫分泌高水平的特异性sIgA抗体，使用S1-Flagellum疫苗免疫母猪后，对母猪所产仔猪进行攻毒，本S1-Flagellum疫苗对仔猪的保护率为100％，所以本S1-Flagellum疫苗是一种防控PEDV的良好亚单位疫苗，能用于PEDV的净化工作，具有较高的应用价值。

序列表

<110> 湖南兀邦生物科技有限公司

湖南农业大学

<120> 一种融合蛋白及猪流行性腹泻病毒S1蛋白重组亚单位疫苗

<130> 0008

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1210

<212> PRT

<213> 合成()

<400> 1

Met Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg Arg Phe

1 5 10 15

Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly Gly

20 25 30

Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys

35 40 45

Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Val Ser

50 55 60

His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro

65 70 75 80

Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly

85 90 95

Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser Ile

100 105 110

Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn

115 120 125

Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser Val

130 135 140

Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp Lys

145 150 155 160

Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Lys

165 170 175

Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro Thr

180 185 190

Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser Tyr

195 200 205

Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala

210 215 220

Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp

225 230 235 240

Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val Ser

245 250 255

Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr

260 265 270

Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly Val Cys

275 280 285

Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile

290 295 300

Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr

305 310 315 320

Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp Pro

325 330 335

His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val Pro Tyr

340 345 350

Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe

355 360 365

Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr

370 375 380

Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu

385 390 395 400

Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val

405 410 415

Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile

420 425 430

Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro

435 440 445

Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly

450 455 460

Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile

465 470 475 480

Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile

485 490 495

Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala

500 505 510

Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg

515 520 525

Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr

530 535 540

Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val

545 550 555 560

Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu

565 570 575

Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser

580 585 590

Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu

595 600 605

Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe

610 615 620

Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly

625 630 635 640

Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr

645 650 655

Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser

660 665 670

Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala

675 680 685

Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser

690 695 700

Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn

705 710 715 720

Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly

725 730 735

Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Ser Gly Gln

740 745 750

Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn

755 760 765

Phe Ser Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu

770 775 780

Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly

785 790 795 800

Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys

805 810 815

Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile

820 825 830

Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile

835 840 845

Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln

850 855 860

Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln

865 870 875 880

Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu

885 890 895

Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu

900 905 910

Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu

915 920 925

Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu

930 935 940

Asp Thr Leu Asn Val Gln Gln Lys Tyr Lys Val Ser Asp Thr Ala Ala

945 950 955 960

Thr Val Thr Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

965 970 975

Thr Glu Leu Leu Pro Ala Thr Ala Thr Glu Asp Val Lys Asn Val Gln

980 985 990

Val Ala Asn Ala Asp Leu Thr Glu Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ala Ala

995 1000 1005

Gly Val Thr Gly Thr Ala Ser Val Val Lys Met Ser Tyr Thr Asp Asn

1010 1015 1020

Asn Gly Lys Thr Ile Asp Gly Gly Leu Ala Val Lys Val Gly Asp Asp

1025 1030 1035 1040

Tyr Tyr Ser Ala Thr Gln Asn Lys Asp Gly Ser Ile Ser Ile Asn Thr

1045 1050 1055

Thr Lys Tyr Thr Ala Asp Asp Gly Thr Ser Lys Thr Ala Leu Asn Lys

1060 1065 1070

Leu Gly Gly Ala Asp Gly Lys Thr Glu Val Val Ser Ile Gly Gly Lys

1075 1080 1085

Thr Tyr Ala Ala Ser Lys Ala Glu Gly His Asn Phe Lys Ala Gln Pro

1090 1095 1100

Asp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys

1105 1110 1115 1120

Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly

1125 1130 1135

Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr

1140 1145 1150

Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr

1155 1160 1165

Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala

1170 1175 1180

Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Leu Arg His His His His His His

1205 1210

<210> 2

<211> 3630

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 2

atgcaggacg tgaccaggtg cagcgccaac accaacttca ggaggttctt cagcaagttc 60

aacgtgcagg cccctgccgt ggtggtgctg ggcggctacc tgcctatcgg cgagaaccag 120

ggcgtgaaca gcacctggta ctgcgccggc cagcacccta ccgccagcgg cgtgcacggc 180

atcttcgtga gccacatcag gggcggccac ggcttcgaga tcggcatcag ccaggagcct 240

ttcgacccta gcggctacca gctgtacctg cacaaggcca ccaacggcaa caccaacgcc 300

accgccaggc tgaggatctg ccagttccct agcatcaaga ccctgggccc taccgccaac 360

aacgacgtga ccaccggcag gaactgcctg ttcaacaagg ccatccctgc ccacatgagc 420

gagcacagcg tggtgggcat cacctgggac aacgacaggg tgaccgtgtt cagcgacaag 480

atctactact tctacttcaa gaacgactgg agcagggtgg ccaccaagtg ctacaacagc 540

ggcggctgcg ccatgcagta cgtgtacgag cctacctact acatgctgaa cgtgaccagc 600

gccggcgagg acggcatcag ctaccagcct tgcaccgcca actgcatcgg ctacgccgcc 660

aacgtgttcg ccaccgagcc taacggccac atccctgagg gcttcagctt caacaactgg 720

ttcctgctga gcaacgacag caccctggtg cacggcaagg tggtgagcaa ccagcctctg 780

ctggtgaact gcctgctggc catccctaag atctacggcc tgggccagtt cttcagcttc 840

aaccagacca tcgacggcgt gtgcaacggc gccgccgtgc agagggcccc tgaggccctg 900

aggttcaaca tcaacgacac cagcgtgatc ctggccgagg gcagcatcgt gctgcacacc 960

gccctgggca ccaacttcag cttcgtgtgc agcaacagca gcgaccctca cctggccacc 1020

ttcgccatcc ctctgggcgc cacccaggtg ccttactact gcttcctgaa ggtggacacc 1080

tacaacagca ccgtgtacaa gttcctggcc gtgctgcctc ctaccgtgag ggagatcgtg 1140

atcaccaagt acggcgacgt gtacgtgaac ggcttcggct acctgcacct gggcctgctg 1200

gacgccgtga ccatcaactt caccggccac ggcaccgacg acgacgtgag cggcttctgg 1260

accatcgcca gcaccaactt cgtggacgcc ctgatcgagg tgcagggcac cgccatccag 1320

aggatcctgt actgcgacga ccctgtgagc cagctgaagt gcagccaggt ggccttcgac 1380

ctggacgacg gcttctaccc tatcagcagc aggaacctgc tgagccacga gcagcctatc 1440

agcttcgtga ccctgcctag cttcaacgac cacagcttcg tgaacatcac cgtgagcgcc 1500

agcttcggcg gccacagcgg cgccaacctg atcgccagcg acaccaccat caacggcttc 1560

agcagcttct gcgtggacac caggcagttc accatcagcc tgttctacaa cgtgaccaac 1620

agctacggct acgtgagcaa gagccaggac agcaactgcc ctttcaccct gcagagcgtg 1680

aacgactacc tgagcttcag caagttctgc gtgagcacca gcctgctggc cagcgcctgc 1740

accatcgacc tgttcggcta ccctgagttc ggcagcggcg tgaagttcac cagcctgtac 1800

ttccagttca ccaagggcga gctgatcacc ggcaccccta agcctctgga gggcgtgacc 1860

gacgtgagct tcatgaccct ggacgtgtgc accgagtaca ccatctacgg cttcaagggc 1920

gagggcatca tcaccctgac caacagcagc ttcctggccg gcgtgtacta caccagcgac 1980

agcggccagc tgctggcctt caagaacgtg accagcggcg ccgtgtacag cgtgacccct 2040

tgcagcttca gcgagcaggc cgcctacgtg gacgacgaca tcgtgggcgt gatcagcagc 2100

ctgagcagca gcaccttcaa cagcaccagg gagctgcctg gcttcttcta ccacagcaac 2160

gacggcagca actgcaccga gcctgtgctg gtgtacagca acatcggcgt gtgcaagagc 2220

ggcagcatcg gctacgtgcc tagccagagc ggccaggtga agatcgcccc taccgtgacc 2280

ggcaacatca gcatccctac caacttcagc gaggccgccg ccaaggccca ggtgatcaac 2340

accaacagcc tgagcctgct gacccagaac aacctgaaca agagccagag cgccctgggc 2400

accgccatcg agaggctgag cagcggcctg aggatcaaca gcgccaagga cgacgccgcc 2460

ggccaggcca tcgccaacag gttcaccgcc aacatcaagg gcctgaccca ggccagcagg 2520

aacgccaacg acggcatcag catcgcccag accaccgagg gcgccctgaa cgagatcaac 2580

aacaacctgc agagggtgag ggagctggcc gtgcagagcg ccaacagcac caacagccag 2640

agcgacctgg acagcatcca ggccgagatc acccagaggc tgaacgagat cgacagggtg 2700

agcggccaga cccagttcaa cggcgtgaag gtgctggccc aggacaacac cctgaccatc 2760

caggtgggcg ccaacgacgg cgagaccatc gacatcgacc tgaagcagat caacagccag 2820

accctgggcc tggacaccct gaacgtgcag cagaagtaca aggtgagcga caccgccgcc 2880

accgtgaccg gccagtacat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagctgctg 2940

cctgccaccg ccaccgagga cgtgaagaac gtgcaggtgg ccaacgccga cctgaccgag 3000

gccaaggccg ccctgaccgc cgccggcgtg accggcaccg ccagcgtggt gaagatgagc 3060

tacaccgaca acaacggcaa gaccatcgac ggcggcctgg ccgtgaaggt gggcgacgac 3120

tactacagcg ccacccagaa caaggacggc agcatcagca tcaacaccac caagtacacc 3180

gccgacgacg gcaccagcaa gaccgccctg aacaagctgg gcggcgccga cggcaagacc 3240

gaggtggtga gcatcggcgg caagacctac gccgccagca aggccgaggg ccacaacttc 3300

aaggcccagc ctgacctggc cgaggccgcc gccaccacca ccgagaaccc tctgcagaag 3360

atcgacgccg ccctggccca ggtggacacc ctgaggagcg acctgggcgc cgtgcagaac 3420

aggttcaaca gcgccatcac caacctgggc aacaccgtga acaacctgac cagcgccagg 3480

agcaggatcg aggacagcga ctacgccacc gaggtgagca acatgagcag ggcccagatc 3540

ctgcagcagg ccggcaccag cgtgctggcc caggccaacc aggtgcctca gaacgtgctg 3600

agcctgctga ggcaccacca ccaccaccac 3630

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 3

aagcttgcca ccatgcagga cgtgaccag 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 4

gaattcttag tggtggtggt ggtggtgc 28

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 5

agactgttcc tttccatggg tctt 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成()

<400> 6

gccgccagac atgataagat acattg 26

Claims

1.一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种核酸分子，编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种疫苗，含有权利要求1所述的融合蛋白。

5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还含有GEL01佐剂。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中融合蛋白与GEL01佐剂的体积比为4:1。

7.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的浓度为200μg/mL。

8.权利要求1所述的融合蛋白在制备预防猪流行性腹泻药物中的应用。