JP2023116608A - 水痘帯状疱疹ウイルス(vzv)のための核酸ワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】本開示の態様は、核酸ワクチンに関する。【解決手段】ワクチンは、少なくとも1つの水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む。当該ワクチンを調製するための方法及び使用するための方法も記載される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2015年10月22日に出願された米国特許仮出願第62/245,234号、2015年10月28日に出願された米国特許仮出願第62/247,697号、2016年5月12日に出願された米国特許仮出願第62/335348号及び2015年10月22日に出願された米国特許仮出願第62/245,031号の利益を主張するものであり、各出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2015年10月22日に出願された米国特許仮出願第62/245,234号、2015年10月28日に出願された米国特許仮出願第62/247,697号、2016年5月12日に出願された米国特許仮出願第62/335348号及び2015年10月22日に出願された米国特許仮出願第62/245,031号の利益を主張するものであり、各出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
水痘は、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)によって引き起こされる急性感染症である。水痘帯状疱疹ウイルスは、ヒト及び脊椎動物に感染することが知られている8種のヘルペスウイルスのうちの1つである。VZVは、水疱瘡ウイルス、水痘ウイルス、帯状疱疹ウイルス及びヒトヘルペスウイルス3型(HHV-3)としても知られている。VZVは、ヒトにのみ作用し、一般に、小児、十代及び若年成人に水疱瘡を引き起こし、成人に帯状ヘルペス(帯状疱疹)を引き起こす(小児は稀)。水疱瘡(水痘)をもたらすVZVの一次感染は、ウイルス性肺炎または二次性細菌性肺炎を含む合併症に至る場合もある。水疱瘡の臨床症状が解消された場合でも、VZVは、感染者の三叉神経及び脊髄後根神経節の神経系に潜伏し続ける(ウイルス潜伏期)。症例の約10~20%において、VZVは、後年に活性化し、知覚神経節から皮膚に戻り、そこで帯状疱疹または帯状ヘルペスとして知られる疾患(発疹)を引き起こす。VZVはまた、無菌性髄膜炎から脳炎に至るまでのいくつかの神経学的病態を引き起こすことがある。VZV感染の他の深刻な合併症には、帯状疱疹後神経痛、モラレ髄膜炎、多発性帯状疱疹、血小板減少症、心筋炎、関節炎、及び脳卒中の原因となる脳内の動脈炎症、脊髄炎、眼部帯状疱疹、または無疱疹帯状疱疹が含まれる。稀な例では、VZVは、膝神経節に作用し、顔面神経の特定の枝に続く病変をもたらす。症状には、舌及び耳の痛みを伴う水疱と、顔面片側の筋力低下及び難聴とが含まれ得る。
水痘症例は、主にワクチン接種により、1995年以降97%減少している。しかしながら、推定500,000~100万件の帯状ヘルペス(帯状疱疹)の発症が米国内だけで毎年生じている。帯状ヘルペスの生涯リスクは、少なくとも32%と推定され、加齢及び細胞性免疫抑制が最も重要な危険因子である。実際に、85歳まで生存する人の50%が帯状ヘルペスを発症すると推定されている。
弱毒化生VZV Oka株ワクチンが利用可能であり、VARIVAX(登録商標)(Merck)の商品名で米国において上市されている。類似のものであるが同一ではないVZVワクチンがVARILRIX(登録商標)(GlaxoSmithKline)として世界的に上市されている。1995年に承認されて以降、オーストラリア、米国及び他の数ヶ国において、小児の推奨予防接種スケジュールに加えられている。2007年に、予防接種諮問委員会(ACIP)は、高度の水痘免疫を確実に維持するために、就学前における2回目のワクチン投与を推奨した。2001~2005年、水痘予防接種率の高い学校でアウトブレイクが報告され、大部分の子供が予防接種を受け、予防接種が期待とおりに実施された環境であっても、1回のワクチン投与方針では、水痘のアウトブレイクを防止できなかったことが示された。その結果、2回の予防接種が採用されたプロトコールであるが、ワクチンを2回投与してもブレークスルー水痘の発症が報告されている。更に、水痘の予防接種は、ワクチンによって誘導される免疫が生涯にわたるものではないことがあり、成人では、小児期の予防接種による免疫が弱まるにつれ、より重症な疾患に罹りやすくなる可能性があるという懸念が生じている。
2005年、FDAは、12ヶ月~12歳の人々の使用に対して、混合した弱毒化生風疹・ムンプス・風疹・水痘(MMRV)混合ワクチンPROQUAD(商標)(Merck)を承認した。MMRV中の弱毒化した風疹、ムンプス及び風疹ワクチンウイルスは、MMRワクチンのウイルスと同じであり、同等の力価であるが、Oka/Merck VZVの力価は、MMRVワクチンのほうが単一抗原水痘ワクチンよりも高い。
2006年、米国食品医薬品局は、60歳以上の人々における帯状疱疹(帯状ヘルペス)の予防に対して、ZOSTAVAX(登録商標)(Merck)を承認した(現在では50~59歳に承認されている)。ZOSTAVAX(登録商標)は、水痘ワクチン及びMMRVワクチンで使用されているものと同じOka/Merck水痘帯状疱疹ウイルスを含有するが、加齢に伴ってVZVに対する免疫が弱まっている高齢者において免疫応答を誘発するように濃縮製剤が設計されているため、水痘ワクチン及びMMRVワクチンの両ワクチン中に存在するものよりも力価がかなり高い(10倍を超えるウイルス量)。
水痘ワクチンは、健康な個体で安全であることが示されているが、ワクチンによって付与されたVZV感染に対する免疫が時間の経過とともに弱まることにより、予防接種を受けた個体は、より重症な状態の帯状疱疹に罹りやすくなるという証拠が存在する。加えて、個体が水痘予防接種から水疱瘡または帯状疱疹を発症したという報告もされている。ワクチンは、神経節での潜伏感染を確立し得、その後、再活性化して帯状ヘルペスを引き起こすことがある。
更に、弱毒化生ウイルスは、妊娠した女性及び中等度または重度の急性疾患の人を含む全ての対象に適しているわけではない。また、水痘は、白血病、リンパ腫、全身性悪性腫瘍、免疫不全疾患または免疫抑制療法により免疫抑制状態である人を含む、免疫不全状態の患者には適しておらず、承認もされていない。同様に、後天性免疫不全症候群(AIDS)と診断された人を含む、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の感染から生じる中等度または重度の細胞性免疫不全症の人も水痘ワクチンを受けるべきではない。したがって、免疫不全状態の個体において、帯状ヘルペスに関連した罹患率及び死亡率は高リスクであるが、この集団は、ZOSTAVAX(登録商標)などの弱毒化生ワクチンによる予防接種に適格ではない。
米国では、毎年100万症例の帯状ヘルペスが生じている。米国では、帯状ヘルペスの直接医療費に対して推定10億ドルが毎年費やされており、帯状ヘルペスの治療は必ずしも効果的または利用可能ではない。
デオキシリボ核酸(DNA)ワクチン接種は、VZV抗原などの外来抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を刺激するために使用される1つの技術である。遺伝子操作されたDNA(例えば、ネイキッドプラスミドDNA)を生きている宿主に直接注入すると、宿主細胞うちの少数が抗原を直接産生し、その結果、防御免疫応答が生じる。しかしながら、この技術では、癌遺伝子の活性化または癌抑制遺伝子の抑制を引き起こし得る挿入突然変異誘発の可能性を含む、潜在的な問題が生じる。
RNA(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))が、身体の細胞機構に安全に向かい、天然タンパク質から抗体及び細胞の内外で治療活性を有し得る他の完全に新しいタンパク質構築物までに及ぶ、目的とするほぼあらゆるタンパク質を生成することができるという知見に基づいた、リボ核酸(RNA)ワクチンが本明細書で提供される。本開示の水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)RNAワクチンは、弱毒化ウイルスワクチン接種に関連するリスクの多くを伴うことなく、VZVに対する細胞性免疫と体液性免疫の両方を含むバランスの取れた免疫応答を誘導するために使用することができる。
RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、感染症の罹患率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な環境で利用することができる。RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、様々な遺伝子型、菌株及び分離株のVZVを治療及び/または予防するために利用することができる。RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、一般に利用可能な抗ウイルス治療法と比べて、抗体力価がより大きく、より早い応答をもたらす点で、優れた特性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAワクチンは、RNAワクチンが天然の細胞機構を利用することから、翻訳の際に適切なタンパク質コンフォメーションを生じるように良好に設計されると考えられる。ex vivoで製造され、望ましくない細胞性応答を惹起し得る従来型ワクチンとは異なり、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、より自然な方法で、細胞系にもたらされる。
本開示に包含される様々なVZVアミノ酸配列を表1~9に記載する。本明細書で提供されるRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、表1に記載されるVZV糖タンパク質またはその断片、ホモログ(例えば、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する)もしくはバリアントもしくは誘導体のうちの少なくとも1つをコードする少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含み得る。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、2つ以上のVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、2つ以上のVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する2つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV糖タンパク質である。例えば、VZV糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gNもしくはgMまたはその免疫原性断片もしくはエピトープであり得る。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gIポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gBポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gHポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gKポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gLポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gCポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gNポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gMポリペプチドである。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、配列番号1または配列番号2の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、バリアントgEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠く切断型ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、VZV gEポリペプチドのアミノ酸1~561を含む(またはこれらのアミノ酸からなるか、これらのアミノ酸から本質的になる)。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1~561を含む(またはこれらのアミノ酸からなるか、これらのアミノ酸から本質的になる)。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号18のアミノ酸1~573を含む(またはこれらのアミノ酸からなるか、これらのアミノ酸から本質的になる)。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1~573を含む(またはこれらのアミノ酸からなるか、これらのアミノ酸から本質的になる)。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、カルボキシ末端のテールドメインを欠く切断型ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、VZV gEポリペプチドのアミノ酸1~573を含む(またはこれらのアミノ酸からなるか、これらのアミノ酸から本質的になる)。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号34のアミノ酸1~573を含む(またはこれらのアミノ酸からなるか、これらのアミノ酸から本質的になる)。
いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、ER保持に関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し、この1つ以上のモチーフ中の変異(複数可)は、VZV gEポリペプチドのER及び/またはゴルジ体における保持を減少させる。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、gEのゴルジ体またはトランスゴルジ網(TGN)への標的化に関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し、この1つ以上のモチーフ中の変異(複数可)は、VZV gEポリペプチドのゴルジ体またはTGNへの標的化または局在化を減少させる。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、VZV gEの内在化またはgEのエンドサイトーシスに関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し、この1つ以上のモチーフ中の変異(複数可)は、VZV gEポリペプチドのエンドサイトーシスを減少させる。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、SSTT(配列番号122)などの1つ以上のリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、Y582G変異を有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、Y569A変異を有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、Y582G変異及びY569A変異を有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、VZV gEのアミノ酸1~573を含み、かつY569A変異を有する抗原性断片である。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、配列番号38を含む抗原性断片である。
いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、Igκ配列を有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、配列番号14である。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、SESTDT(配列番号59)を置き換えるA-E-A-A-D-A配列(配列番号58)を有する完全長VZV gEポリペプチドである。これは、Ser/Thrに富む「SSTT」(配列番号122)酸性クラスターをAlaに富む配列に置き換えるものである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、配列番号26である。VZV gEポリペプチドがA-E-A-A-D-A配列(配列番号58)を有するいくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドはまた、ER/ゴルジ体保持、TGN局在化もしくはエンドサイトーシスに関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し(例えば、Y582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方を有する)、かつ/またはSSTT(配列番号122)モチーフなどの1つ以上のリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、配列番号30のアミノ酸配列であるか、当該配列を含む。
いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、ポリペプチドの分泌または細胞膜へのその局在化を促進する付加配列をC末端に有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、Igκ配列をC末端に有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、VZV gEポリペプチドは、分泌を促進する付加配列をC末端に有し(例えば、Igκ配列をC末端に有する)、かつER保持、TGN局在化もしくはエンドサイトーシスに関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し(例えば、Y582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方を有する)、かつ/またはSSTT(配列番号122)モチーフなどの1つ以上のリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠き、かつポリペプチドの分泌を促進する付加配列をC末端に有する(例えば、Igκ配列をC末端に有する)、切断型ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、アミノ酸1~561を含み、Igκ配列をC末端に有する。いくつかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、配列番号22である。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、カルボキシ末端のテールドメインを欠き、かつポリペプチドの分泌を促進する付加配列をC末端に有する(例えば、Igκ配列をC末端に有する)、切断型ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、アミノ酸1~573を含み、Igκ配列をC末端に有する。
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、2つ以上の糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、単一のRNAポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、2つ以上のRNAポリヌクレオチドによってコードされ、例えば、各糖タンパク質は、個別のRNAポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMのポリペプチドまたはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gEと、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープのうちの少なくとも1つとの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gIと、gE、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープのうちの少なくとも1つとの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gEと、gIと、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープのうちの少なくとも1つとの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgIである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgBである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgBである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgBである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgHである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgHである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgHである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgKである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgKである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgKである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgLである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgLである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgLである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgCである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgCである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgCである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgNである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgNである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgNである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgMである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gI及びgMである。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE、gI及びgMである。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、任意の2つ以上のVZV糖タンパク質(例えば、前述の段落ならびに実施例及び図面で開示されるバリアントVZV gEのうちのいずれか)を含み、VZV gEは、本明細書で開示されるバリアントVZV gE糖タンパク質のうちのいずれか、例えば、前述の段落ならびに及び実施例及び図面で開示されるバリアントVZV gEのうちのいずれかなどのバリアントgEである。
いくつかの実施形態において、VZVワクチンは、2つ以上のVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する2つ以上のRNAポリヌクレオチドを含み(単一のRNAポリヌクレオチドによってコードされるか、2つ以上のRNAポリヌクレオチドによってコードされる(例えば、各糖タンパク質は個別のRNAポリヌクレオチドによってコードされる))、2つ以上のVZV糖タンパク質は、バリアントgE(例えば、本明細書中の前述の段落で開示されるバリアントgEポリペプチドのうちのいずれか)と、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMのポリペプチドまたはその免疫原性断片もしくはエピトープから選択されるVZV糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、バリアントgE(例えば、明細書中の前述の段落で開示されるバリアントgEポリペプチドのうちのいずれか)と、gIである。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、バリアントVZV gEポリペプチドは、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠く切断型ポリペプチド(例えば、配列番号10のアミノ酸1~561を含む切断型VZV gEポリペプチド)である。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、バリアントVZV gEポリペプチドは、カルボキシ末端のテールドメインを欠く切断型ポリペプチド(例えば、配列番号18のアミノ酸1~573を含む切断型VZV gEポリペプチド)である。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、バリアントVZV gEポリペプチドは、ER保持、TGN局在化及び/もしくはエンドサイトーシスに関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し(例えば、バリアントVZV gEは、Y582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方を有する)、かつ/またはSSTT(配列番号122)モチーフなどの1つ以上のリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、バリアントVZV gEポリペプチドは、VZV gEのアミノ酸1~573を含み、かつY569A変異を有する抗原性断片である。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、バリアントVZV gEポリペプチドは、A-E-A-A-D-A(配列番号58)配列を有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、VZV gEポリペプチドは、A-E-A-A-D-A(配列番号58)配列及びY582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方を有する。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、VZV gEポリペプチドは、ポリペプチドの分泌を促進する付加配列(例えば、Igκ配列)をC末端に有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、VZV gEポリペプチドは、Igκ配列及びY582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方を有する完全長VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、VZV gIとバリアントVZV gEであり、VZV gEポリペプチドは、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠き、かつIgκ配列を有する切断型VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、アミノ酸1~561またはアミノ酸1~573を含み、かつIgκ配列をC末端に有する切断型ポリペプチドである。
上述の実施形態のいずれにおいても、VZVワクチンは、弱毒化生VZV、完全不活化VZVまたはVZVウイルス様粒子(VLP)を更に含み得る。いくつかの実施形態において、弱毒化生VZV、完全不活化VZVまたはVZV VLPは、次の菌株及び遺伝子型から選択されるか、これらに由来する:VZV E1株、遺伝子型E1_32_5、E1_Kel、E1_Dumas、E1_Russia1999、E1_SD、E1_MSP、E1_36、E1_49、E1_BC、E1_NH29;VZV E2株、遺伝子型E2_03-500、E2_2、E2_11、E2_HJO;VZV J株、遺伝子型pOka;VZV M1株、遺伝子型M1_CA123;VZV M2株、遺伝子型M2_8及びM2_DR;ならびにVZV M4株、遺伝子型Spain4242、France4415及びItaly4053。
VZVの他のウイルスタンパク質成分(例えば、テグメントタンパク質)をコードするRNAポリヌクレオチドを含む、別のRNAワクチンも本開示に包含される。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZVテグメントタンパク質またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZVテグメントタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープと、少なくとも1つのVZV糖タンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープとをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZVテグメントタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドと、少なくとも1つのVZV糖タンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドとを含む、VZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、1つ以上のVZVテグメントタンパク質と、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMポリペプチドまたはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープから選択される1つ以上のVZV糖タンパク質とをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチド(複数可)を含む。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、VZV gEポリペプチドまたはその疫原性断片もしくはエピトープである。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、VZV gIポリペプチドまたはその疫原性断片もしくはエピトープである。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、本明細書で開示されるバリアントVZV gEポリペプチドのうちのいずれかなどのバリアントVZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、VZV gE糖タンパク質及びVZV gI糖タンパク質またはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープである。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号41ならびに配列番号1~8及び41から選択される核酸配列と少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、98%、99%)の同一性を有するホモログから選択される少なくとも1つの核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号41ならびに配列番号1~8及び41から選択される核酸配列と少なくとも90%(例えば、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.8%または99.9%)の同一性を有するホモログから選択される少なくとも1つの核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号41ならびに配列番号1~8及び41から選択される核酸配列と少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、98%、99%)の同一性を有するホモログから選択される核酸配列の少なくとも1つの断片(例えば、抗原性配列または少なくとも1つのエピトープを有する断片)によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号41から選択される核酸配列の少なくとも1つのエピトープによってコードされる。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号1によってコードされるgEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号2によってコードされるgIポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号3によってコードされる切断型gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号5によってコードされる切断型gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号6によってコードされる、Y569A変異を有する切断型gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号7によってコードされる、配列番号58のAEAADA配列を有するgEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号8によってコードされる、Y582G変異及びAEAADA配列(配列番号58)を有するgEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号41によってコードされるgEポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも96%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のアミノ酸配列に対して少なくとも97%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも98%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも99%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、VZVポリペプチドがコードされるオープンリーディングフレームは、コドン最適化される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかの抗原性タンパク質をコードし、当該RNAポリヌクレオチドは、コドン最適化されたmRNAである。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号92~108のうちのいずれか1つによって特定されるmRNA配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号92~108のうちのいずれか1つによって特定されるmRNA配列は、配列番号92~108のうちのいずれか1つによってコードされる抗原性VZVポリペプチドと同程度の免疫原性であるか、それよりも免疫原性が高い抗原性VZVポリペプチドをコードするようにコドン最適化される。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号10の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号10の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%を超える同一性を有するが、野生型mRNA配列を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号42の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号42の抗原性タンパク質をコードし、当該RNAポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%を超える同一性を有するが、野生型mRNA配列を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号14の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号14の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%を超える同一性を有するが、野生型mRNA配列を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号26の抗原性タンパク質をコードし、当該RNAポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号26の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%を超える同一性を有するが、野生型mRNA配列を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号30の抗原性タンパク質をコードし、当該RNAポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号30の抗原性タンパク質をコードし、当該RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、野生型mRNA配列に対して80%を超える同一性を有するが、野生型mRNA配列を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号1~8及び配列番号41のうちのいずれかから選択される配列によってコードされ、少なくとも1つの化学修飾を含む。
いくつかの実施形態において、VZVワクチンは、多価である。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子型E1_32_5、E1_Kel、E1_Dumas、E1_Russia1999、E1_SD、E1_MSP、E1_36、E1_49、E1_BC及びE1_NH29のうちのいずれか1つ以上を含む、VZV E1株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子型E2_03-500、E2_2、E2_11及びE2_HJOのうちのいずれか1つ以上を含む、VZV E2株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子型pOkaを含む、VZV J株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子型M1_CA123を含む、VZV M1株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子型M2_8及びM2_DRを含む、VZV M2株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子型Spain4242、France4415及びItaly4053のうちのいずれか1つ以上を含む、VZV M4株に由来するポリヌクレオチド配列を含む。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレーム及び少なくとも1つの5’末端キャップを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、5’末端キャップは、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpである。本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾を有する、VZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、第2の化学修飾を更に含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの化学修飾を有する少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、5’末端キャップを有する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの化学修飾は、プソイドウリジン、N1-メチルプソイドウリジン、N1-エチルプソイドウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、5-メトキシウリジン及び2’-O-メチルウリジンから選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドのウリジンの全て(100%)がN1-メチルプソイドウリジン修飾またはN1-エチルプソイドウリジン修飾などの化学修飾を含む。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含むVZVワクチンであって、当該オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、98%、99%、100%)は化学修飾を有し、任意選択により、当該ワクチンは脂質ナノ粒子内に製剤化される、VZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中のウラシルの100%が化学修飾を有する。いくつかの実施形態において、化学修飾は、ウラシルの5位にある。いくつかの実施形態において、化学修飾は、N1-メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中のウラシルの100%がN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾される。
本開示のいくつかの実施形態は、カチオン性脂質ナノ粒子内に製剤化されたVZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、PEG修飾脂質と、ステロールと、非カチオン性脂質とを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質はイオン性カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、ジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)、(12Z,15Z)-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミン(L608)及びN,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘプタデカン-8-アミン(L530)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、脂質は、
である。
いくつかの実施形態において、脂質は、
である。
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質約20~60%、非カチオン性脂質約5~25%、ステロール約25~55%及びPEG修飾脂質約0.5~15%のモル比を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、0.4未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、中性のpH値で中性の正味電荷を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、50~200nmの平均直径を有する。
本開示のいくつかの実施形態は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量でVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンを対象に投与することを含む、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答は、T細胞の応答またはB細胞の応答を含む。いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答は、T細胞の応答及びB細胞の応答を含む。いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答をもたらす方法は、ワクチンの単回投与を伴う。いくつかの実施形態において、方法は、ブースター用量のワクチンを対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される。
また、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するためのVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンが本明細書で提供され、この方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量でワクチンを対象に投与することを含む。
更に、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するための薬剤の製造におけるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの使用が本明細書で提供され、この方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量でワクチンを対象に投与することを含む。
本開示のいくつかの態様は、本開示のVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンを対象に投与することを含む、VZV感染を予防または治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で製剤化される。
本開示のいくつかの実施形態は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で本明細書に記載されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも1log増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、1~3log増加する。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも2倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも5倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも10倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、2~10倍増加する。
いくつかの実施形態において、対照は、VZVワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、弱毒化生VZVワクチンまたは不活化VZVワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、VZVウイルス様粒子(VLP)ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/2に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/4に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/10に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/100に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/1000に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を1/2~1/1000に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、25μg~1000μg、または50μg~1000μg、または25~200μgの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、50μg、100μg、200μg、400μg、800μgまたは1000μgの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、200μgの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、50μg~400μgの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μgまたは400μgの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、25μgの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、50μgの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、100μgの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、200μgの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、400μgの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、500μgの用量である。
いくつかの実施形態において、VZVに対するVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効性(または有効率)は、60%超である。
ワクチン有効性は、標準的な分析を使用して評価することができる(例えば、Weinberg et al.,J Infect Dis.2010 Jun 1;201(11):1607-10参照)。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検無作為化比較臨床試験によって決定することができる。ワクチン有効性は、非接種者(ARU)と接種者(ARV)の試験コホート間の罹患率(AR)の比例的低下で表すことができ、次式を使用して、接種者群における疾患の相対危険度(RR)から算出することができる。
有効性=(ARU-ARV)/ARU×100、及び
有効性=(1-RR)×100
有効性=(ARU-ARV)/ARU×100、及び
有効性=(1-RR)×100
同様に、ワクチン有効率は、標準的な分析を使用して評価することができる(例えば、Weinberg et al.,J Infect Dis.2010 Jun 1;201(11):1607-10参照)。ワクチン有効率は、ワクチン(ワクチンの有効性の高さが既に証明されている場合もある)が集団においてどの程度疾患を低下させるかの評価である。この尺度は、ワクチン自体だけではなく、予防接種プログラムの利点と有害作用の正味のバランスを比較臨床試験よりも自然な条件下で評価することができる。ワクチン有効率は、ワクチン有効性(効力)に比例するが、集団中の標的群がどの程度良好に免疫化されているかということに影響され、また、入院、外来診察または費用の「実際の」結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子にも影響される。例えば、一連の感染症例と適切な対照との間の接種率を比較する、後ろ向き症例対照分析を使用することができる。ワクチン有効率は、ワクチン接種を受けたにもかかわらず感染症を発症したオッズ比(OR)を使用した率差として表すことができる。
有効率=(1-OR)×100
有効率=(1-OR)×100
いくつかの実施形態において、VZVに対するVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効性(または有効率)は、65%超である。いくつかの実施形態において、VZVに対するワクチンの有効性(または有効率)は、70%超である。いくつかの実施形態において、VZVに対するワクチンの有効性(または有効率)は、75%超である。いくつかの実施形態において、VZVに対するワクチンの有効性(または有効率)は、80%超である。いくつかの実施形態において、VZVに対するワクチンの有効性(または有効率)は、85%超である。いくつかの実施形態において、VZVに対するワクチンの有効性(または有効率)は、90%超である。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、1年まで(例えば、1回のVZVシーズンの間)、対象をVZVに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、最大2年間、対象をVZVに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、2年を超える間、対象をVZVに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、3年を超える間、対象をVZVに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、4年を超える間、対象をVZVに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、5~10年間、対象をVZVに対して免疫にする。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの投与を受ける対象は、約12ヶ月~約10歳の間の年齢(例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10歳)である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの投与を受ける対象は、約12ヶ月~約15ヶ月の間の年齢(例えば、約12、12.5、13、13.5、14、14.5または15ヶ月)である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの投与を受ける対象は、約4歳~約6歳の間の年齢(例えば、約4、4.5、5、5.6または6歳)である。
いくつかの実施形態において、対象は、約20歳~約50歳の間の年齢(例えば、約20、25、30、35、40、45または50歳)の若年成人である。
いくつかの実施形態において、対象は、約60歳、約70歳またはそれ以上の年齢(例えば、約60、65、70、75、80、85または90歳)の高齢者対象である。
いくつかの実施形態において、対象は、VZVに曝露したことがあり、VZVに感染しており、またはVZVによる感染のリスクがある。
いくつかの実施形態において、対象は、免疫不全状態である(免疫系の障害、例えば、免疫系疾患または自己免疫疾患がある)。
本開示のいくつかの態様は、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドを含有するVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、VZV抗原性ペプチドに連結されたシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含有する。また、本明細書で開示されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンをコードする核酸も本明細書で提供される。
本開示の他の態様は、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドを含有するVZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、VZV抗原性ポリペプチドは、VZV糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMから選択される。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、VZV gEまたはバリアントVZV gEポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、IgEシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、IgE HC(Ig重鎖ε-1)シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列MDWTWILFLVAAATRVHS(配列番号56)を有する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、IgGκシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号57)を有する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、日本脳炎PRMシグナル配列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS、配列番号109)、VSVgタンパク質シグナル配列(MKCLLYLAFLFIGVNCA、配列番号110)及び日本脳炎JEVシグナル配列(MWLVSLAIVTACAGA、配列番号111)から選択される。
更に、本明細書で開示されるVZVワクチンをコードする核酸も本明細書で提供される。そのようなVZVワクチンは、VZV抗原性ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、VZV抗原性ペプチドは、VZV糖タンパク質である。いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMから選択される。いくつかの実施形態において、VZV抗原性ペプチドは、VZV gEまたはgEポリペプチドのバリアントである。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量(例えば、VZVワクチンの単回用量)は、対照と比較して、2倍~200倍(例えば、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190または200倍)のVZVに対する血清中和抗体の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの単回用量は、対照と比較して、約5倍、50倍または150倍のVZVに対する血清中和抗体の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの単回用量は、対照と比較して、約2倍~10倍または約40~60倍のVZVに対する血清中和抗体の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンRNA(例えば、mRNA)の有効性は、フラジェリンアジュバントと組み合わされたとき、特に、1つ以上の抗原をコードするmRNAが、フラジェリンをコードするmRNAと組み合わされたとき、著しく向上し得る。
フラジェリンアジュバント(例えば、mRNAコード化フラジェリンアジュバント)と組み合わされたRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、市販のワクチン製剤と比べて、抗体力価がより大きく、より早い応答をもたらし得る点で、優れた特性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、RNAワクチン、例えば、mRNAポリヌクレオチドなどは、RNA(例えば、mRNA)ワクチンが天然の細胞機構を利用することから、翻訳の際に抗原及びアジュバントの両方にとって適切なタンパク質コンフォメーションを生じるように良好に設計されると考えられる。ex vivoで製造され、望ましくない細胞性応答を惹起し得る従来型ワクチンとは異なり、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、より自然な方法で、細胞系にもたらされる。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片(例えば、抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片)をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドと、フラジェリンアジュバントをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNA(例えば、mRNAポリヌクレオチド)とを含む、RNA(例えば、mRNA)ワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラジェリンポリペプチド(例えば、コードされたフラジェリンポリペプチド)は、フラジェリンタンパク質である。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラジェリンポリペプチド(例えば、コードされたフラジェリンポリペプチド)は、免疫原性フラジェリン断片である。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラジェリンポリペプチド及び少なくとも1つの抗原性ポリペプチドは、単一のRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドによってコードされる。他の実施形態において、少なくとも1つのフラジェリンポリペプチド及び少なくとも1つの抗原性ポリペプチドは、異なるRNAポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのフラジェリンポリペプチドは、配列番号115~117のうちのいずれかの配列を有するフラジェリンポリペプチドに対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸ワクチンは、化学修飾されている。他の実施形態において、核酸ワクチンは、修飾されていない。
更に他の態様は、第1の抗原性VZVポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、当該RNAポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、ワクチンにアジュバントが共配合または共投与されない、対象にワクチン接種を行うための組成物及びその方法を提供する。
他の態様において、本発明は、第1のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、10μg/kg~400μg/kgの用量の核酸ワクチンが対象に投与される、対象にワクチン接種を行うための組成物及びその方法である。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドの用量は、1~5μg、5~10μg、10~15μg、15~20μg、10~25μg、20~25μg、20~50μg、30~50μg、40~50μg、40~60μg、60~80μg、60~100μg、50~100μg、80~120μg、40~120μg、40~150μg、50~150μg、50~200μg、80~200μg、100~200μg、120~250μg、150~250μg、180~280μg、200~300μg、50~300μg、80~300μg、100~300μg、40~300μg、50~350μg、100~350μg、200~350μg、300~350μg、320~400μg、40~380μg、40~100μg、100~400μg、200~400μgまたは300~400μg/用量である。いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、0日目に対象に投与される。いくつかの実施形態において、第2の用量の核酸ワクチンが21日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、25μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、100μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、50μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、75μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、150μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、400μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、200μgの用量のRNAポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節において、100倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態において、核酸ワクチンは、化学修飾されており、他の実施形態において、核酸ワクチンは、化学修飾されていない。
本発明の態様は、第1の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、当該RNAポリヌクレオチドは、安定化要素及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含まず、アジュバントがワクチン中に含まれない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、安定化要素は、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態において、安定化要素は、野生型配列と比較してGC含量の多い核酸配列である。
本発明の態様は、第1の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、当該RNAポリヌクレオチドは、ヒト対象に許容されるパーセンテージで第1の抗原に対する抗体保有基準を上回る抗体力価を付与する、宿主へのin vivo投与用の製剤中に存在する、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のmRNAワクチンによって産生される抗体の力価は、中和抗体の力価である。いくつかの実施形態において、中和抗体の力価は、タンパク質ワクチンよりも大きい。他の実施形態において、本発明のmRNAワクチンによって産生される中和抗体の力価は、アジュバント添加タンパク質ワクチンよりも大きい。更に他の実施形態において、本発明のmRNAワクチンによって産生される中和抗体の力価は、1,000~10,000、1,200~10,000、1,400~10,000、1,500~10,000、1,000~5,000、1,000~4,000、1,800~10,000、2000~10,000、2,000~5,000、2,000~3,000、2,000~4,000、3,000~5,000、3,000~4,000または2,000~2,500である。中和力価は、典型的に、プラーク数の50%減少を達成するのに必要な最大血清希釈として表される。
また、第1の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、当該RNAポリヌクレオチドは、安定化要素を有するか、アジュバントとともに製剤化された第1の抗原性ポリペプチドをコードするmRNAワクチンによって誘発される抗体力価よりも長く持続する高い抗体力価を誘発する、宿主へのin vivo投与用の製剤中に存在する、核酸ワクチンが提供される。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、単回投与後1週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。いくつかの実施形態において、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫活性化核酸から選択される。いくつかの実施形態において、カチオン性ペプチドは、プロタミンである。
いくつかの態様は、少なくとも1つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第1の抗原性ポリペプチドをコードする、1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンであって、当該RNAポリヌクレオチドは、宿主の抗原発現レベルが、安定化要素を有するか、アジュバントとともに製剤化された第1の抗原性ポリペプチドをコードするmRNAワクチンによってもたらされる抗原発現レベルを著しく超えるように、宿主へのin vivo投与用の製剤中に存在する、核酸ワクチンを提供する。
他の態様は、少なくとも1つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第1の抗原性ポリペプチドをコードする、1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンであって、非修飾型mRNAワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なRNAポリヌクレオチドよりも、RNAポリヌクレオチドが少なくとも1/10少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、25~100μgの用量で存在する。
本発明の態様はまた、少なくとも1つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第1の抗原性ポリペプチドをコードする、1つ以上のRNAポリヌクレオチド10μg~400μgと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ヒト対象への送達用に製剤化された、使用単位のワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子を更に含む。
本発明の態様は、個体または個体集団においてVZV株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法を提供し、この方法は、当該個体または集団に抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含み、当該核酸ワクチンは、(a)少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドであって、少なくとも1つの化学修飾を含むか、任意選択により化学修飾を含まず、かつ2つ以上のコドン最適化オープンリーディングフレームを含み、当該オープンリーディングフレームは、一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドと、(b)任意選択により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して個体に投与される。いくつかの実施形態において、投与ステップは、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを触させることを含む。いくつかの実施形態において、投与ステップは、エレクトロポレーションと組み合わせて、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを接触させることを含む。
本発明の態様は、対象にワクチン接種を行う方法を提供し、この方法は、有効量で第1の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの25μg/kg~400μg/kgの単回用量を対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む。
他の態様は、少なくとも1つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第1の抗原性ポリペプチドをコードする、1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンであって、非修飾型mRNAワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なRNAポリヌクレオチドよりも、RNAポリヌクレオチドが少なくとも1/10少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、25~100μgの用量で存在する。
他の態様は、修飾ヌクレオチドを含まない(非修飾)オープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第1の抗原性ポリペプチドをコードする、LNP製剤化RNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、LNPで製剤化されていない非修飾型mRNAワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なRNAポリヌクレオチドよりも、RNAポリヌクレオチドが少なくとも1/10少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、25~100μgの用量で存在する。
実施例で示されるデータは、本発明の製剤を使用すると、免疫応答が著しく向上することを示している。データにより、本開示の化学修飾型RNAワクチンと非修飾型RNAワクチンの両方の有効性が実証された。驚くべきことに、ワクチンの製造には化学修飾されていないmRNAを使用して担体中に製剤化することが好ましいという先行技術の方向とは対照的に、化学修飾されたmRNA-LNPワクチンは、必要とされる有効mRNA用量が非修飾型mRNAよりもかなり低く、すなわち、LNP以外の担体中に製剤化された非修飾型mRNAよりも1/10少ないことが本明細書において発見された。本発明のRNAワクチンは化学修飾型及び非修飾型のどちらも、異なる脂質担体中に製剤化されたmRNAワクチンよりも良好な免疫応答をもたらす。
他の態様において、本発明は、VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、年齢が60歳以上の高齢者対象を治療する方法を包含する。
他の態様において、本発明は、VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、年齢が17歳以下の若年者対象を治療する方法を包含する。
他の態様において、本発明は、VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つ以上のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、成年対象を治療する方法を包含する。
RNAポリヌクレオチドは、配列番号1~8及び41のうちの1つであり、少なくとも1つの化学修飾を含む。他の実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、配列番号1~8及び41のうちの1つであり、いかなるヌクレオチド修飾も含まないか、非修飾である。更に他の実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかの抗原性タンパク質をコードし、少なくとも1つの化学修飾を含む。他の実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、配列番号10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちのいずれかの抗原性タンパク質をコードし、いかなるヌクレオチド修飾も含まないか、非修飾である。
好ましい態様において、本発明のワクチン(例えば、LNP封入化mRNAワクチン)は、ワクチン接種された対象の血中または血清中の抗原特異的抗体の予防上及び/または治療上有効なレベル、濃度及び/または力価をもたらす。本明細書で定義されるように、抗体力価という用語は、対象、例えば、ヒト対象において産生される抗原特異的抗体の量を指す。例示的な実施形態において、抗体力価は、陽性結果をなおももたらす最大希釈(連続希釈)の逆数で表される。例示的な実施形態において、抗体力価は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって決定または測定される。例示的な実施形態において、抗体力価は、中和アッセイ、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。ある特定の態様において、抗体力価の測定値は、1:40、1:100などの比で表される。
本発明の例示的な実施形態において、有効なワクチンは、1:40超、1:100超、1:400超、1:1000超、1:2000超、1:3000超、1:4000超、1:500超、1:6000超、1:7500超、1:10000超の抗体力価をもたらす。例示的な実施形態において、この抗体力価は、ワクチン接種から10日後、ワクチン接種から20日後、ワクチン接種から30日後、ワクチン接種から40日後、またはワクチン接種から50日後以降までに、もたらされるか、達成される。例示的な実施形態において、力価は、単回用量のワクチンを対象に投与した後にもたらされるか、達成される。他の実施形態において、力価は、複数回投与後、例えば、第1の用量及び第2の用量(例えば、ブースター用量)後にもたらされるか、達成される。
本発明の例示的な態様において、抗原特異的抗体は、μg/ml単位で測定されるか、IU/L(国際単位/リットル)またはmIU/ml(ミリ国際単位/ml)単位で測定される。本発明の例示的な実施形態において、有効なワクチンは、>0.5μg/ml、>0.1μg/ml、>0.2μg/ml、>0.35μg/ml、>0.5μg/ml、>1μg/ml、>2μg/ml、>5μg/mlまたは>10μg/mlをもたらす。本発明の例示的な実施形態において、有効なワクチンは、>10mIU/ml、>20mIU/ml、>50mIU/ml、>100mIU/ml、>200mIU/ml、>500mIU/mlまたは>1000mIU/mlをもたらす。例示的な実施形態において、この抗体のレベルまたは濃度は、ワクチン接種から10日後、ワクチン接種から20日後、ワクチン接種から30日後、ワクチン接種から40日後、またはワクチン接種から50日後以上までに、もたらされるか、達成される。例示的な実施形態において、レベルまたは濃度は、単回用量のワクチンを対象に投与した後にもたらされるか、達成される。他の実施形態において、レベルまたは濃度は、複数回投与後、例えば、第1の用量及び第2の用量(例えば、ブースター用量)後にもたらされるか、達成される。例示的な実施形態において、抗体のレベルまたは濃度は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって決定または測定される。例示的な実施形態において、抗体のレベルまたは濃度は、中和アッセイ、例えば、マイクロ中和アッセイによって決定または測定される。
本発明の限定のそれぞれは、本発明の種々の実施形態を包含し得る。したがって、任意の1つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の限定のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得ることが想定される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載され、または図面に示される構築物の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践または実行することができる。
添付の図面は、縮尺とおりに描くことを意図していない。図面中、各種の図に示される同一の構成要素またはほぼ同一の構成要素はそれぞれ同様の数字で表される。明瞭さのため、各図面中、全ての構成要素に名称を付けていない場合がある。
本開示の実施形態は、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原をコードする少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含むRNA(例えば、mRNA)ワクチンを提供する。水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)には、少なくとも5つのクレードがある。クレード1及び3には、欧州/北米株が含まれ、クレード2には、特に日本からのアジア株が含まれ、クレード5は、インドを中心にしているようである。クレード4には、欧州からの複数の株が含まれるが、その地理的起源については更に明確化する必要がある。VZVゲノム配列の系統解析により、野生型株は、9つの遺伝子型(E1、E2、J、M1、M2、M3、M4、VIII及びIX)に分けられている。欧州18ヶ国からの水痘及び帯状疱疹の臨床試料342個を配列解析したところ、次のVZV遺伝子型分布であることが特定された:E1 221(65%)、E2 87(25%)、M1 20(6%)、M2 3(1%)、M4 11(3%)。M3またはJの株は観察されなかった。オーストラリア及びニュージーランドからの水痘及び帯状疱疹の臨床分離株165個のうち、127個のオーストラリア東部分離株では、67個がE1、30個がE2、16個がJ、10個がM1、4個がM2であり、38個のニュージーランド分離株では、25個がE1、8個がE2、5個がM1であった。
VZVは、アルファヘルペスウイルスであり、直径およそ200nmの球状多層構造として存在する。ウイルスゲノムは、テグメントタンパク質の無定形層に覆われたカプシドタンパク質構造によって取り囲まれている。これらの2つの構造は、ビリオンの外側に提示されるそれぞれ長さ約8nmの複数のウイルス糖タンパク質が点在する脂質エンベロープによって取り囲まれ、脂質エンベロープは、正二十面体様に配置された162個の六量体及び五量体のカプソメアからなる100nmのヌクレオカプシドを内包している。ウイルスにコードされたタンパク質及び酵素からなるテグメントは、ヌクレオカプシドとウイルスエンベロープとの間の空間に位置する。ウイルスエンベロープは、宿主細胞膜から取得され、ウイルスにコードされた糖タンパク質を含有する。
VZVゲノムは、少なくとも70個のオープンリーディングフレームを有する、塩基対124,884の単一の線状2本鎖DNA分子である。ゲノムは、Sセグメントの向きに応じて、P(基本型)とIS(逆方向S)の2つの主な異性体を有し、合計頻度が90~95%になる等しい頻度で存在する。Lセグメントも逆向きになり得るため、合計で4つの線状異性体(IL及びILS)が生じる。
VZVは、単純ヘルペスウイルス(HSV)と密接な関係にあり、かなりの相同性を共有している。VZVゲノムは、ヒトヘルペスウイルスの中で最も小さく、前のオープンリーディングフレーム(ORF64~62)を繰り返すオープンリーディングフレーム(それぞれORF69~ORF71)を更に3つ有する、少なくとも71個の特有のタンパク質(ORF0~ORF68)をコードする。コードされたタンパク質の一部のみがウイルス粒子の構造を形成する。これらのタンパク質には、9つの糖タンパク質がある:ORF5(gK)、ORF9A(gN)、ORF14(gC)、ORF31(gB)、ORF37(gH)、ORF50(gM)、ORF60(gL)、ORF67(gI)及びORF68(gE)。既知のエンベロープ糖タンパク質(gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL、gN及びgM)は、HSVのエンベロープ糖タンパク質に対応するが、HSV gDに対応するものはない。VZVはまた、HSV潜伏(単純ヘルペスウイルス)を確立する際に重要な役割を果たすLAT(潜伏関連転写産物)を産生しない。コードされた糖タンパク質であるgE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMは、ウイルス複製サイクルの異なる段階で機能する。感染細胞中及び成熟ビリオン中に存在する最も豊富な糖タンパク質は、糖タンパク質E(gE、ORF68)である。これは、ビリオンエンベロープの主要構成要素であり、ウイルス複製に必須である。糖タンパク質I(gI、ORG67)は、感染細胞中でgEと複合体を形成する。この複合体は、両糖タンパク質のエンドサイトーシスを促進し、最終的なウイルスエンベロープを獲得する場であるトランスゴルジ網(TGN)に両糖タンパク質を誘導する。糖タンパク質I(gI)は、VZVエンベロープメント及びVZV複製中の効率的な膜融合のために、TGN内で必要とされる。VZV gE及びgIは、感染した宿主細胞表面上で複合体化することが確認されている。2番目に多いタンパク質であり、ウイルス侵入に関与すると考えられている糖タンパク質B(ORF31)は、中和抗体に結合する。糖タンパク質Hは、ウイルスの細胞間拡散を促進する融合機能を有すると考えられている。自然感染後及び予防接種後にはgE、gB及びgHに対する抗体が多くなり、in vitroでウイルス活性を中和することが示されている。
本開示の実施形態は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むRNA(例えば、mRNA)ワクチンを提供する。本明細書で提供されるVZV RNAワクチンは、DNAワクチン及び弱毒化生ワクチンに関連するリスクの多くを伴うことなく、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含むバランスの取れた免疫応答を誘導するために使用することができる。本明細書で開示される様々なRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、BALB/Cマウスにおいて免疫応答をもたらしており、その結果については、実施例の項で詳細に考察する。具体的には、種々のVZV抗原のうちの1つ以上をコードするオープンリーディングフレームを有するRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドワクチンは、従来型VZVワクチン(例えば、弱毒化VZVウイルス)と比較して、著しい免疫応答をもたらした。本明細書で開示されるVZV gEまたはバリアントVZV gEのいずれかをコードするVZV RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドワクチンは、筋肉内(IM)投与または皮内(ID)投与したとき、2回の投与後に著しい免疫応答を示した。VZV糖タンパク質及びテグメントタンパク質は、抗原性であることがわかっている。VZV糖タンパク質、その断片及びそのエピトープは、本開示に包含される。
国際出願第PCT/US2015/02740号の内容全体を参照により本明細書に援用する。
本明細書に記載されるmRNAワクチンは、現行ワクチンよりもいくつかの点で優れることが見出された。第1に、脂質ナノ粒子(LNP)送達は、文献に記載されているプロタミン系手段を含む他の製剤よりも優れ、追加のアジュバントを必要としない。LNPの使用により、化学修飾型または非修飾型mRNAワクチンの有効的な送達が可能になる。更に、LNP製剤化mRNAワクチンは、修飾型と非修飾型のどちらも、従来型ワクチンよりも著しく優れていることが本明細書で示された。いくつかの実施形態において、本発明のmRNAワクチンは、従来型ワクチンよりも少なくとも10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍または1,000倍優れている。
mRNAワクチン及び自己複製RNAワクチンを含む機能性RNAワクチンは、その作製が試みられてきたが、これらのRNAワクチンの治療有効性は、まだ完全に確立されていない。実に驚くべきことに、本発明者らは、本発明の態様に従って、抗原生成及び中和能力を有する機能性抗体産生の増大を含む、著しく増強され、また多くの点で相乗的である免疫応答をもたらす、mRNAワクチンのin vivo送達のための製剤クラスを見出した。これらの結果は、他の種類の脂質系製剤で使用されるmRNAの用量と比較して極めて低用量のmRNAが投与された場合でも、達成することができる。本発明の製剤は、機能性mRNAワクチンの予防薬及び治療薬としての有効性を確立するのに十分な予想外に著しいin vivo免疫応答を示した。更に、自己複製RNAワクチンは、免疫原性応答をもたらすのに十分なRNAを細胞に送達するのに、ウイルス複製経路に依存している。本発明の製剤は、強い免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を産生するのにウイルス複製を必要としない。したがって、本発明のmRNAは、自己複製RNAではなく、ウイルス複製に必要な構成要素を含まない。
本発明は、いくつかの態様において、脂質ナノ粒子(LNP)製剤が、化学修飾型及び非修飾型mRNAワクチンを含むmRNAワクチンの有効性を著しく増強するという驚くべき発見に関係する。LNP製剤化mRNAワクチンの有効性について、いくつかの異なる抗原を使用してin vivoで試験した。本明細書に示される結果は、他の市販のワクチンよりも予想外に優れたLNP製剤化mRNAワクチンの有効性を示している。
増強された免疫応答をもたらすことに加えて、本発明の製剤は、試験した他のワクチンよりも少ない用量で、より迅速な免疫応答をもたらす。本発明のmRNA-LNP製剤はまた、異なる担体で製剤化されたワクチンに比べて、定量的及び定性的に良好な免疫応答をもたらす。
本明細書に記載されるデータは、本発明の製剤が、既存のVZV抗原ワクチンを超える予想外の著しい改善をもたらしたことを示しており、これには、LNP中に製剤化されたmRNA化学修飾型及び非修飾型VZVワクチンによるIgG産生のレベルのほうがVARIVAX及びZOSTAVAXと比較して著しく高いということが含まれる。IgGの産生開始は、試験した非修飾型ワクチンまたは市販のワクチンよりも化学修飾型LNP mRNAワクチンのほうが著しく早かった。
更に、本発明のmRNA-LNP製剤は、mRNAの用量が他のワクチンより低い場合であっても、他のワクチンよりも優れている。データは、全てのgEバリアントLNP mRNAワクチンが、2回の10μg投与後及び2回の2μg投与後に、ZOSTAVAX(登録商標)よりも非常に強い免疫応答を誘導したことを示している。血清を100倍超で希釈した場合、抗体力価は、ZOSTAVAX(登録商標)接種マウスの血清よりもVZV gE LNP mRNA接種マウスの血清のほうが高く、VZV gE LNP mRNAワクチンが、マウスにおいて、ZOSTAVAX(登録商標)よりも非常に強い免疫応答を誘導したことを示唆している。
マウスにおける結果は、非ヒト霊長類で観察された免疫原性と一致した。アカゲザルに化学修飾型VZV LNP mRNAワクチンまたはZOSTAVAX(登録商標)を初回投与した。mRNAワクチンは、ZOSTAVAX(登録商標)よりも高い抗gE力価を示し、ZOSTAVAX(登録商標)群とは異なり、IFNγ、IL-2またはTNFα細胞を産生するCD4 T細胞が妥当な頻度で産生された。データはまた、Zostavax曝露後のmRNAワクチン単回投与が、類似のT細胞応答を誘導することにおいて、mRNAワクチンの2回投与と同等であることを示した。
本明細書に記載される試験で使用したLNPのいくつかは、siRNAを送達するために種々の動物モデル及びヒトにおいて以前から使用されているものである。LNP製剤のsiRNA送達に関してなされた観察を考慮すると、LNPがワクチンに有用であるという事実は、実に驚くべきことである。LNP製剤化siRNAの治療的送達は、一過性IgM応答に関連する望ましくない炎症応答の原因となり、典型的に、抗原生成の低減及び免疫応答の低下につながることが観察されている。siRNAについて観察された知見とは対照的に、本発明のLNP-mRNA製剤は、一過性のIgM応答ではなく、予防法及び治療法に十分なIgGレベルの増大をもたらすことが本明細書で示される。
核酸/ポリヌクレオチド
本明細書で提供される水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチンは、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つの(1つ以上の)リボ核酸(RNA、例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味で、ヌクレオチドの重合体を含む任意の化合物及び/または物質を含む。これらの重合体は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。
本明細書で提供される水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチンは、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つの(1つ以上の)リボ核酸(RNA、例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味で、ヌクレオチドの重合体を含む任意の化合物及び/または物質を含む。これらの重合体は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。
いくつかの実施形態において、VZVワクチンの少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号41から選択される少なくとも1つの核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、VZVワクチンの少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8及び配列番号41から選択される核酸配列の少なくとも1つの断片(例えば、抗原性配列または少なくとも1つのエピトープを有する断片)によってコードされる。
核酸(ポリヌクレオチドともいう)は、例えば、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、例えば、β-D-リボ配置を有するLNA、α-L-リボ配置を有するα-LNA(LNAのジアステレオマー)、2’-アミノ官能基を有する2’-アミノ-LNA、及び2’-アミノ官能基を有する2’-アミノ-α-LNAを含む)、エチレン核酸(ENA)、シクロヘキセニル核酸(CeNA)もしくはこれらのキメラもしくは組み合わせであってよく、またはこれらを含み得る。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA(mRNA)として機能する。「メッセンジャーRNA」(mRNA)は、(少なくとも1つの)ポリペプチド(天然、非天然または修飾されたアミノ酸重合体)をコードする任意のポリヌクレオチドであって、これが翻訳されて、in vitro、in vivo、in situまたはex vivoで、コードされているポリペプチドを生成できる任意のポリヌクレオチドを指す。当業者であれば、別途記載される場合を除き、本出願に記載されるポリヌクレオチド配列は、DNA配列を表す場合には「T」を用い、配列がRNA(例えば、mRNA)を表す場合には、「T」は「U」に置き換えられることを理解するであろう。したがって、特定の配列識別番号によって識別されるDNAによってコードされるRNAポリヌクレオチドはいずれも、DNAによってコードされた対応するRNA(例えば、mRNA)配列を含み得、当該RNA配列は、DNA配列の各「T」が「U」に置き換えられているものである。
mRNA分子の基本構成要素は、典型的に、少なくとも1つのコーディング領域、5’非翻訳領域(UTR)、3’UTR、5’キャップ及びポリAテールを含む。本開示のポリヌクレオチドは、mRNAとして機能し得るが、その設計上の機能的及び/または構造的特徴から野生型mRNAとは区別することができ、この特徴は、核酸治療法を用いた有効的なポリペプチド発現に関する既存の課題を解決するのに役立つ。
いくつかの実施形態において、VZVワクチンのRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9または9~10個の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンのRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100個の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、VZVワクチンのRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、少なくとも100個の抗原性ポリペプチドまたは少なくとも200個の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、VZVワクチンのRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、1~10、5~15、10~20、15~25、20~30、25~35、30~40、35~45、40~50、1~50、1~100、2~50または2~100個の抗原性ポリペプチドをコードする。
本開示のポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、いくつかの実施形態において、コドン最適化される。コドン最適化法は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載のとおりに使用することができる。例えば、配列番号11、15、19、23、27、31、35、39、62、66、70、74、78、82、86、90の配列のうちのいずれか1つ以上または配列番号92~108の配列のうちのいずれか1つ以上がコドン最適化され得る。コドン最適化を用いると、いくつかの実施形態において、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確保すること、GC含量に偏りをもたせてmRNAの安定性を向上させ、もしくは二次構造を低減させること、遺伝子構築物もしくは発現を損なう可能性のあるタンデム反復コドンもしくは塩基ラン(base run)を最小にすること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードタンパク質に翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフルすること、制限部位を挿入もしくは欠失すること、リボソーム結合部位及びmRNA分解部位を改変すること、翻訳率を調整してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除することができる。コドン最適化のツール、アルゴリズム及びサービスは、当該技術分野において知られており、非限定的な例には、GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)によるサービス及び/または独自の方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、最適化アルゴリズムを使用してオープンリーディングフレーム(ORF)配列が最適化される。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列(例えば、配列番号92~108のコドン最適化配列)は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して95%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して90%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して85%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して80%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して75%未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して65%~85%(例えば、約67%~約85%または約67%~約80%)の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列(例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド)をコードする天然または野生型mRNA配列)に対して65%~75%または約80%の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列(例えば、配列番号92~108のコドン最適化配列)は、配列番号92~108の(非コドン最適化)配列によってコードされる抗原性ポリペプチドと同程度の免疫原性であるか、それよりも免疫原性が高い(例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも100%、または少なくとも200%高い)抗原性ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、VZVワクチンは、少なくとも1つの修飾を有する少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも1つの5’末端キャップを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含み、かつ脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの5’キャッピングは、以下の化学的RNAキャップアナログを製造元のプロトコールに従って使用して5’-グアノシンキャップ構造を生じさせることで、in vitro転写反応中に同時に達成することができる:3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G[ARCAキャップ];G(5’)ppp(5’)A;G(5’)ppp(5’)G;m7G(5’)ppp(5’)A;m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs(Ipswich,MA))。修飾RNAの5’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs(Ipswich,MA))を生じさせることによって転写後に達成され得る。キャップ1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素と2’-Oメチルトランスフェラーゼの両方を使用してm7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを生じさせることで生成することができる。キャップ2構造は、キャップ1構造から、2’-Oメチルトランスフェラーゼを使用して3番目の5’-ヌクレオチドを2’-O-メチル化することによって生成することができる。キャップ3構造は、キャップ2構造から、2’-Oメチルトランスフェラーゼを使用して4番目の5’-ヌクレオチドを2’-O-メチル化することによって生成することができる。酵素は、組み換え供給源に由来してもよい。
修飾mRNAは、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合、12~18時間または18時間超、例えば、24、36、48、60、72もしくは72時間超の安定性を有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化RNAは、G/Cレベルを増加させたものであり得る。核酸分子(例えば、mRNA)のG/C含量は、RNAの安定性に影響し得る。グアニン(G)及び/またはシトシン(C)の残基量を増加させたRNAは、アデニン(A)及びチミン(T)またはウラシル(U)のヌクレオチドを多量に含有するRNAよりも機能的に安定であり得る。一例として、WO02/098443は、翻訳領域における配列改変によって安定化されたmRNAを含有する医薬組成物を開示している。遺伝コードの縮重により、この改変は、既存のコドンを、結果として得られるアミノ酸を変更することなく、より大きなRNA安定性を助長するコドンに置き換えることによってなされる。このアプローチは、RNAのコーディング領域に限定される。
抗原/抗原性ポリペプチド
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV糖タンパク質である。例えば、VZV糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gNもしくはgMまたはその免疫原性断片もしくはエピトープであり得る。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gIポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gBポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gHポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gKポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gLポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gCポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gNポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gMポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV糖タンパク質である。例えば、VZV糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gNもしくはgMまたはその免疫原性断片もしくはエピトープであり得る。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gEポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gIポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gBポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gHポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gKポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gLポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gCポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gNポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZV gMポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、2つ以上の糖タンパク質を含む。2つ以上の糖タンパク質は、単一のRNAポリヌクレオチドによってコードされてもよいし、2つ以上のRNAポリヌクレオチドによってコードされてもよい(例えば、各糖タンパク質は、個別のRNAポリヌクレオチドによってコードされる)。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMのポリペプチドまたはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gEと、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMポリペプチドまたはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープから選択される糖タンパク質との任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gIと、gE、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMポリペプチドまたはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープから選択される糖タンパク質との任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上の糖タンパク質は、VZV gEと、gIと、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMポリペプチドまたはこれらの免疫原性断片もしくはエピトープから選択される糖タンパク質との任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、2つ以上のVZV糖タンパク質は、gE及びgIである。VZVの他のウイルスタンパク質成分(例えば、テグメントタンパク質)をコードするRNAポリヌクレオチドを含む、別のRNAワクチンも本開示に包含される。したがって、本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも1つのVZVテグメントタンパク質またはその抗原性断片もしくはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む、VZVワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、VZVテグメントタンパク質またはその抗原性断片もしくはエピトープである。他の実施形態において、VZVワクチンの抗原性断片(複数可)は、少なくとも1つのVZVテグメントポリペプチドと、少なくとも1つのVZV糖タンパク質ポリペプチド、例えば、gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMから選択される任意のVZV糖タンパク質であり得る。
本開示は、バリアントVZV抗原性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、バリアントVZV抗原性ポリペプチドは、バリアントVZV gEポリペプチドである。バリアントVZV gEポリペプチドは、ポリペプチドのER/ゴルジ体保持を回避し、抗原の表面発現の増加をもたらすように設計される。いくつかの実施形態において、バリアントgEポリペプチドは、ポリペプチドのER保持部分または細胞質尾部を取り除くように切断される。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、VZVポリペプチドのER/ゴルジ体/TGNへの局在化を低減するように変異される。そのような変更は、ER捕捉を阻害するものであり、これにより、細胞膜への輸送を促進する。
したがって、いくつかの実施形態において、VZV糖タンパク質は、バリアントgEポリペプチドである。VZV gEは、そのC末端にTGNに対する標的化配列を有し、感染細胞及びgEトランスフェクト細胞においてERからTGNへ輸送される。TGN中のほとんどのgEは、形質膜からのエンドサイトーシスによって回収され、エンドソームによってTGNに送達され、続いて形質膜にリサイクルされるようである。gEは、完全にエンベロープされたVZVビリオンの生成に関連する他のVZVタンパク質(例えば、テグメントタンパク質)とともにTGN中に蓄積される。したがって、TGN局在化及びエンドサイトーシスを低減する変異は、gEの細胞膜への輸送を促進する。
バリアントVZV gEポリペプチドは、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠く任意の切断型ポリペプチドであり得る。例えば、バリアントVZV gEポリペプチドは、少なくともアミノ酸1~124(例えば、アミノ酸1~124、1~140、1~160、1~200、1~250、1~300、1~350、1~360、1~400、1~450、1~500、1~511、1~550及び1~561を含む)及び列挙されたサイズ範囲内の断片サイズを有するポリペプチド断片を含む、切断型VZV gEポリペプチドであり得る。一実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1~561を含む。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、カルボキシ末端のテールドメインを欠く切断型ポリペプチドである。したがって、いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1~573を含む。
いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、ER保持に関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異を有し、この1つ以上のモチーフ中の変異(複数可)は、VZV gEポリペプチドのER及び/またはゴルジ体における保持を減少させる。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、1つ以上のリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する。例えば、バリアントVZV gEポリペプチドは、Y582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方を有する完全長VZV gEポリペプチドであり得る。あるいは、バリアントVZV gEポリペプチドは、例えば、VZV gEのアミノ酸1~573を含み、かつY569A変異を有する抗原性断片であり得る。あるいは、バリアントVZV gEポリペプチドは、SSTモチーフなどの酸性リン酸化モチーフ中に変異を有する抗原性断片であり得る。例えば、バリアントVZV gEポリペプチドは、AEAADA配列(配列番号58)を有する抗原性断片であり得る。
いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、ポリペプチドの分泌を促進する付加配列をC末端に有する完全長VZV gEポリペプチドである。例えば、バリアントVZV gEポリペプチドは、Igκ配列をC末端に有する完全長VZV gEポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、VZV gEポリペプチドは、分泌を促進する付加配列をC末端に有し(Igκ配列をC末端に有する)、バリアントVZV gEポリペプチドは、ER保持、TGN局在化及び/もしくはエンドサイトーシスに関連する1つ以上のモチーフ中に少なくとも1つの変異(例えば、Y582G変異、Y569A変異またはY582G変異とY569A変異の両方)を有し、かつ/または1つ以上のリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠き、かつポリペプチドの分泌を促進する付加配列をC末端に有する(例えば、Igκ配列をC末端に有する)、切断型ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1~561を含み、Igκ配列をC末端に有する。いくつかの実施形態において、バリアントVZV gEポリペプチドは、カルボキシ末端のテールドメインを欠き、かつポリペプチドの分泌を促進する付加配列をC末端に有する(例えば、Igκ配列をC末端に有する)、切断型ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、切断型VZV gEポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸1~573を含み、Igκ配列をC末端に有する。
いくつかの実施形態において、VZV抗原性ポリペプチドは、25アミノ酸よりも長く、50アミノ酸よりも短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前述の他の等価物、バリアント及びアナログが含まれる。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、二量体、三量体または四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖ポリペプチドまたは抗体もしくはインスリンなどの多鎖ポリペプチドを含み得、会合または連結され得る。多鎖ポリペプチドには、最も一般的に、ジスルフィド結合が認められる。ポリペプチドという用語はまた、少なくとも1つのアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学的アナログになっているアミノ酸高分子に対しても適用され得る。
「ポリペプチドバリアント」という用語は、そのアミノ酸配列が天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失及び/または挿入を有し得る。通常、バリアントは、天然配列または参照配列に対して少なくとも50%の同一性を有する。いくつかの実施形態において、バリアントは、天然配列または参照配列と少なくとも80%または少なくとも90%の同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、「バリアント模倣体」が提供される。本明細書で使用されるとき、「バリアント模倣体」は、活性化配列を模倣し得る少なくとも1つのアミノ酸を含有する。例えば、グルタミン酸は、リン酸化スレオニン及び/またはリン酸化セリンの模倣体として作用し得る。あるいは、バリアント模倣体は、失活化をもたらすか、模倣体を含有する不活性化産物をもたらすことができる。例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として作用し、アラニンは、セリンの不活性化置換として作用することができる。
「オルソログ」は、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの特定は、新たに配列決定されるゲノムの遺伝子機能の信頼性の高い予測に重要である。
「アナログ」は、1つ以上のアミノ酸の変更、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失による違いはあるが、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの特性のうちの1つ以上を引き続き保持している、ポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
「パラログ」は、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子(またはタンパク質)である。オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持しているが、パラログは、元の機能に関連しているとしても、新しい機能を進化させている。
本開示は、バリアント及び誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをベースにしたいくつかの種類の組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入欠失及び共有結合によるバリアント及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義的に使用されるが、一般的に、参照分子または出発分子と比較して、任意の方法で修飾及び/または変更されている分子を指す。
したがって、参照配列、特に本明細書で開示されるポリペプチド配列に対して置換、挿入及び/または付加、欠失ならびに共有結合による修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたは1つ以上のリジンなどのアミノ酸をペプチド配列に(例えば、N末端またはC末端に)付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製または位置決定のために使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性を増大させ、またはビオチニル化を可能にするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択的に欠失させて、切断型配列を提供してもよい。あるいは、その配列の用途、例えば、可溶性であり、または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部として配列を発現させるなどに応じて、特定のアミノ酸(例えば、C末端残基またはN末端残基)を欠失させてもよい。代替的な実施形態において、シグナル配列、終結配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体形成ドメイン(例えば、foldon領域など)及び同等物のための配列(またはこれらをコードする配列)を、同一または類似の機能を達成する代替配列と置換してもよい。そのような配列は、当業者には容易に特定可能である。本明細書で提供される配列のいくつかは、例えば、RNA(例えば、mRNA)ワクチンの調製直前に削除され得る配列タグまたは末端ペプチド配列を(例えば、N末端またはC末端に)含有することも理解されたい。
ポリペプチドに関する「置換バリアント」は、天然配列または出発配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基が削除され、その代わりに同じ位置に別のアミノ酸が挿入されたものである。置換は、分子中のアミノ酸が1つのみ置換された単一の置換であってもよいし、同一分子中の2つ以上のアミノ酸が置換された複数の置換であってもよい。
本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷または極性を有する別のアミノ酸で置き換える置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性(疎水性)残基を別の非極性残基にする置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例には、ある極性(親水性)残基を別の極性残基にする置換、例えば、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、及びグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基を別の塩基性残基にする置換、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などのある酸性残基を別の酸性残基にする置換も保存的置換の更なる例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニンもしくはメチオニンなどの非極性(疎水性)アミノ酸残基をシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンなどの極性(親水性)残基にする置換、及び/または極性残基を非極性残基にする置換が挙げられる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「特徴」は、分子のうち、明確に異なる、アミノ酸配列ベースの構成要素またはヌクレオチドベースの構成要素としてそれぞれ定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面発現、局所的高次構造形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「ドメイン」という用語は、1つ以上の特定可能な構造的または機能的特徴または特性(例えば、結合能力、タンパク質-タンパク質相互作用の部位としての機能)を有するポリペプチドモチーフを指す。
ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「部位」という用語は、それがアミノ酸に基づく実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「部位」という用語は、それがヌクレオチドに基づく実施形態に関する場合、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。部位は、ポリペプチドベースの分子またはポリヌクレオチドベースの分子内のうちで修飾、操作、改変、誘導体化または変更され得るペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチド内の位置を表す。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書で使用されるとき、「末端」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの端部をそれぞれ指す。かかる端部は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初の部位または最後の部位のみに限定されるものではなく、末端領域に付加されたアミノ酸またはヌクレオチドを含み得る。ポリペプチドベースの分子は、N末端(遊離アミノ基(NH2)を有するアミノ酸で終わる)と、C末端(遊離カルボキシル基(COOH)を有するアミノ酸で終わる)の両方を有することを特徴とし得る。タンパク質は、場合によって、ジスルフィド結合または非共有結合性の力によって一緒になった複数のポリペプチド鎖から構成される(多量体、オリゴマー)。これらのタンパク質は、複数のN末端及びC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、状況に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で開始または終結するように修飾されてもよい。
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン及び相同タンパク質もまた、目的のポリペプチドの範囲内であるとみなされる。例えば、参照タンパク質の10、20、30、40、50、60、70、80、90、100または100超のアミノ酸長の任意のタンパク質断片(すなわち、参照ポリペプチド配列よりも少なくとも1アミノ酸残基分短いがそれ以外では同一であるポリペプチド配列)が本明細書で提供される。別の例において、本明細書に記載される配列のうちのいずれかに対して、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%同一である20、30、40、50または100アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載または参照される配列のうちのいずれも、示されるように、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質断片は、25アミノ酸よりも長く、50アミノ酸よりも短い。
本開示のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子は、参照分子(例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド)、例えば、当該技術分野に記載の分子(例えば、操作または設計された分子または野生型分子)とある程度の配列類似性または配列同一性を共有し得る。「同一性」という用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される2つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係性を指す。当該技術分野において、同一性はまた、2つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間のマッチ数によって決定される配列間の配列関係性の度合いを意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム(例えば、「アルゴリズム」)によって処理されたギャップアライメント(存在する場合)を有する2つ以上の配列のうちより小さい配列間での同一マッチ率を評価する。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に算出することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」は、配列をアライメントし、必要に応じて、最大同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、第2の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一であるアミノ酸または核酸の候補配列中の残基(アミノ酸残基または核酸残基)のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野においてよく知られている。同一性は、同一性パーセントの算出に依存するが、算出に導入されるギャップ及びペナルティーによって値が異なり得ることは理解される。一般に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に知られている配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定したとき、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列に対して、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが、100%未満の配列の同一性を有する。そのようなアライメントツールには、BLASTスイートのものが含まれる(Stephen F.Altschul,et al.,(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。別の多く用いられるローカルアライメント手法は、Smith-Watermanアルゴリズムに基づくものである(Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.” J.Mol.Biol.147:195-197)。動的計画法に基づいた一般的なグローバルアライメント手法は、Needleman-Wunschアルゴリズムである(Needleman,S.B.&Wunsch,C.D.(1970)“A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J.Mol.Biol.48:443-453.)。より最近では、Needleman-Wunschアルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント法よりも高速にヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するといわれるFast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(FOGSAA)が開発されている。他のツールについては、本明細書において、具体的には、以下の「同一性」の定義において記載される。
本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、高分子、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)間及び/またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。マッチする残基のアライメントによって決定された類似性または同一性の閾値レベルを共有する高分子(例えば、核酸分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)及び/またはポリペプチド分子)は、相同と呼ばれる。相同性は、分子間の関係を記述する定性的用語であり、定量的な類似性または同一性に基づき得る。類似性または同一性は、2つの比較配列間の配列マッチの程度を定義する定量的用語である。いくつかの実施形態において、高分子は、その配列が少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%同一または類似であれば、互いに「相同」であるとみなされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)間の比較を指す。2つのポリヌクレオチド配列は、当該配列がコードするポリペプチドが、少なくとも20アミノ酸の少なくとも1つのストレッチについて、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%または更には99%であれば、相同であるとみなされる。いくつかの実施形態において、相同なポリヌクレオチド配列は、一意に指定された少なくとも4~5アミノ酸のストレッチをコードする能力を特徴とする。60ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、一意に指定された少なくとも4~5アミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。2つのタンパク質配列は、当該タンパク質が、少なくとも20アミノ酸の少なくとも1つのストレッチについて、少なくとも50%、60%、70%、80%または90%同一であれば、相同であるとみなされる。
相同性は、比較される配列が進化上共通の起源から分化したことを示唆する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列に由来することにより第2のアミノ酸配列または核酸配列に関連する第1のアミノ酸配列または核酸配列(例えば、遺伝子(DNAまたはRNA)またはタンパク質配列)を指す。「ホモログ」という用語は、種分化の事象によって分離した遺伝子間及び/もしくはタンパク質間の関係、または遺伝子重複の事象によって分離した遺伝子間及び/もしくはタンパク質間の関係に適用され得る。
多タンパク質及び多成分ワクチン
本開示は、単一の抗原性ポリペプチドをそれぞれコードする複数のRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含むVZVワクチン、及び1つを超える抗原性ポリペプチドを(例えば、融合ポリペプチドとして)コードする単一のRNAポリヌクレオチドを含むVZVワクチンを包含する。したがって、第1のVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドと、第2のVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNA)とを含むワクチン組成物は、(a)第1のVZV抗原性ポリペプチドをコードする第1のRNAポリヌクレオチドと、第2のVZV抗原性ポリペプチドをコードする第2のRNAポリヌクレオチドとを含むワクチン、ならびに(b)第1及び第2のVZV抗原性ポリペプチドを(例えば、融合ポリペプチドとして)コードする単一のRNAポリヌクレオチドを含むワクチンを包含することを理解されたい。本開示のVZV RNAワクチンは、いくつかの実施形態において、それぞれが異なるVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する2~10個(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10個)またはそれ以上のRNAポリヌクレオチド(または2~10個もしくはそれ以上の異なるVZV抗原性ポリペプチドをコードする単一のRNAポリヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、VZV gEタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gIタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gBタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gHタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gKタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gCタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gNタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、及びVZV gMタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、VZV gEをコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドと、VZV gIタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、VZV gEタンパク質またはgEバリアントをコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドを含む。
本開示は、単一の抗原性ポリペプチドをそれぞれコードする複数のRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含むVZVワクチン、及び1つを超える抗原性ポリペプチドを(例えば、融合ポリペプチドとして)コードする単一のRNAポリヌクレオチドを含むVZVワクチンを包含する。したがって、第1のVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドと、第2のVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNA)とを含むワクチン組成物は、(a)第1のVZV抗原性ポリペプチドをコードする第1のRNAポリヌクレオチドと、第2のVZV抗原性ポリペプチドをコードする第2のRNAポリヌクレオチドとを含むワクチン、ならびに(b)第1及び第2のVZV抗原性ポリペプチドを(例えば、融合ポリペプチドとして)コードする単一のRNAポリヌクレオチドを含むワクチンを包含することを理解されたい。本開示のVZV RNAワクチンは、いくつかの実施形態において、それぞれが異なるVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する2~10個(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10個)またはそれ以上のRNAポリヌクレオチド(または2~10個もしくはそれ以上の異なるVZV抗原性ポリペプチドをコードする単一のRNAポリヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、VZV gEタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gIタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gBタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gHタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gKタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gCタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、VZV gNタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチド、及びVZV gMタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、VZV gEをコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドと、VZV gIタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、VZV gEタンパク質またはgEバリアントをコードするオープンリーディングフレームを有するRNAポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、RNAポリヌクレオチドは、シグナルペプチド(例えば、配列番号56、57、109、110または111)に融合したVZV抗原性ポリペプチドをコードする。シグナルペプチドは、抗原性ポリペプチドのN末端またはC末端に融合され得る。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態において、VZVポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、N末端の15~60アミノ酸タンパク質を含み、典型的に、分泌経路において膜を通過する移行に必要であり、したがって、真核生物及び原核生物の両生物において、大部分のタンパク質が分泌経路へ入ることを普遍的に制御している。シグナルペプチドは、一般に、長さの異なるN末端領域(通常、正に荷電したアミノ酸を含む)と、疎水性領域と、短いカルボキシ末端ペプチド領域の3つの領域からなる。真核生物において、新生前駆タンパク質(プレタンパク質)のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体(ER)膜に向かわせ、膜を通過して伸長するペプチド鎖の輸送を開始する。しかしながら、シグナルペプチドは、成熟タンパク質の最終目的地に関与しない。配列中に更なるアドレスタグを欠いている分泌タンパク質は、普通は外部環境に分泌される。シグナルペプチドは、小胞体(ER)に存在するシグナルペプチダーゼによって前駆タンパク質から切断されるか、切断されないまま膜アンカーとして機能する。近年、シグナルペプチドのより進んだ見解が導き出されており、ある特定のシグナルペプチドの機能及び免疫優性は、これまで予想されていたよりも極めて多岐にわたることが示されている。
いくつかの実施形態において、VZVポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、N末端の15~60アミノ酸タンパク質を含み、典型的に、分泌経路において膜を通過する移行に必要であり、したがって、真核生物及び原核生物の両生物において、大部分のタンパク質が分泌経路へ入ることを普遍的に制御している。シグナルペプチドは、一般に、長さの異なるN末端領域(通常、正に荷電したアミノ酸を含む)と、疎水性領域と、短いカルボキシ末端ペプチド領域の3つの領域からなる。真核生物において、新生前駆タンパク質(プレタンパク質)のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体(ER)膜に向かわせ、膜を通過して伸長するペプチド鎖の輸送を開始する。しかしながら、シグナルペプチドは、成熟タンパク質の最終目的地に関与しない。配列中に更なるアドレスタグを欠いている分泌タンパク質は、普通は外部環境に分泌される。シグナルペプチドは、小胞体(ER)に存在するシグナルペプチダーゼによって前駆タンパク質から切断されるか、切断されないまま膜アンカーとして機能する。近年、シグナルペプチドのより進んだ見解が導き出されており、ある特定のシグナルペプチドの機能及び免疫優性は、これまで予想されていたよりも極めて多岐にわたることが示されている。
シグナルペプチドは、典型的に、プロセシングのために、新規合成タンパク質の小胞体(ER)への標的化を促進するように機能する。ERプロセシングにより成熟エンベロープタンパク質が生成され、そこでシグナルペプチドは、典型的に、宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化を促進し得る。本開示のVZVワクチンは、例えば、人工シグナルペプチドをコードするRNAポリヌクレオチドを含み得、シグナルペプチドをコードする配列は、VZV抗原性ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結され、当該配列とインフレームである。したがって、本開示のVZVワクチンは、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドに融合されたVZV抗原性ポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、VZV抗原性ポリペプチドのN末端に融合される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、VZV抗原性ポリペプチドのC末端に融合される。
いくつかの実施形態において、VZV抗原性ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、人工シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンによってコードされるVZV抗原性ポリペプチドに融合される人工シグナルペプチドは、免疫グロブリンタンパク質、例えば、IgEシグナルペプチドまたはIgGシグナルペプチドから得られる。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンによってコードされるVZV抗原性ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、MDWTWILFLVAAATRVHS(配列番号56)の配列を有するIg重鎖ε-1シグナルペプチド(IgE HC SP)である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンによってコードされるVZV抗原性ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(配列番号57)の配列を有するIgGk鎖V-III領域のHAHシグナルペプチド(IgGkSP)である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンによってコードされるVZV抗原性ポリペプチドは、配列番号56、57、109、110及び111のうちのいずれかのシグナルペプチドに融合された10、14、18、22、26、30、34、38、42及び45~55のうちの1つに記載されるアミノ酸配列を有する。本明細書で開示される例は、限定を意図するものではなく、プロセシングのためのタンパク質のERへの標的化及び/またはタンパク質の細胞膜への標的化を促進することが当該技術分野において知られているあらゆるシグナルペプチドを本開示に従って使用することができる。
シグナルペプチドは、15~60アミノ酸長を有し得る。例えば、シグナルペプチドは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59または60アミノ酸長を有し得る。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、20~60、25~60、30~60、35~60、40~60、45~60、50~60、55~60、15~55、20~55、25~55、30~55、35~55、40~55、45~55、50~55、15~50、20~50、25~50、30~50、35~50、40~50、45~50、15~45、20~45、25~45、30~45、35~45、40~45、15~40、20~40、25~40、30~40、35~40、15~35、20~35、25~35、30~35、15~30、20~30、25~30、15~25、20~25または15~20アミノ酸長を有し得る。
シグナルペプチドは、典型的に、ERプロセシング中に切断部位で新生ポリペプチドから切断される。本開示のVZV RNAワクチンによって産生される成熟VZV抗原性ポリペプチドは、典型的に、シグナルペプチドを含まない。
化学修飾
本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、いくつかの実施形態において、少なくとも1つの呼吸器合胞体ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含み、当該RNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。
本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、いくつかの実施形態において、少なくとも1つの呼吸器合胞体ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含み、当該RNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。
「化学修飾」及び「化学修飾された(化学修飾型)」という用語は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、ウリジン(U)、チミジン(T)またはシチジン(C)のリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに対する、その位置、パターン、パーセントまたは集団のうちの少なくとも1つにおける修飾を指す。一般に、これらの用語は、天然に存在する5’末端のmRNAキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すものではない。
ポリヌクレオチドの修飾には、限定するものではないが、本明細書に記載されるものが含まれ、化学修飾を含む修飾が含まれるが、これらに明示的に限定されるものではない。ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、天然、非天然である修飾を含み得、またはポリヌクレオチドは、天然及び非天然修飾の組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、任意の有用な修飾を含み得、例えば、糖、核酸塩基またはヌクレオシド間結合(例えば、リン酸、ホスホジエステル連結またはホスホジエステル主鎖への結合)の修飾を含み得る。
ポリペプチドに関して、「修飾」という用語は、標準形の20アミノ酸セットに対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドは、アミノ酸の置換、挿入または置換と挿入の組み合わせを含有する場合も、「修飾された」とみなされる。
ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、いくつかの実施形態において、種々の(1つを超える)異なる修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの特定領域は、1つ、2つまたはそれ以上の(任意選択により異なる)ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの実施形態において、修飾型RNAポリヌクレオチド(例えば、修飾型mRNAポリヌクレオチド)は、細胞または生物に導入されると、非修飾型ポリヌクレオチドと比べて、細胞または生物のそれぞれにおいて低減された分解を示す。いくつかの実施形態において、修飾型RNAポリヌクレオチド(例えば、修飾型mRNAポリヌクレオチド)は、細胞または生物に導入されると、細胞または生物のそれぞれにおいて低減された免疫原性(例えば、低減された先天性応答)を示し得る。
ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、いくつかの実施形態において、所望の機能または特性を達成するために、ポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然修飾型ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在してもよい。修飾は、化学合成またはポリメラーゼ酵素を用いて、鎖の末端または鎖の他の場所に導入することができる。ポリヌクレオチドのいずれの領域も化学修飾され得る。
本開示は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子(例えば、ペントースまたはリボース)またはその誘導体を、有機塩基(例えば、プリンまたはピリミジン)またはその誘導体(本明細書において「核酸塩基」ともいう)との組み合わせで含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、任意の有用な方法によって、例えば、化学的、酵素的または組み換え的に、1つ以上の修飾されたヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを含むように合成することができる。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの1つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は、様々な主鎖結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むことになる。
修飾されたヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン-チミン、アデノシン-ウラシルまたはグアノシン-シトシンの塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び/または非標準的塩基もしくは修飾された塩基を含む修飾ヌクレオチドの間で形成される塩基対も包含され、ここで、水素結合ドナーと水素結合アクセプターの配置は、非標準的塩基と標準的塩基との間、または2つの相補的な非標準的塩基構造(例えば、少なくとも1つの化学修飾を有するポリヌクレオチドにおけるものなど)との間の水素結合を可能にするものである。そのような非標準的塩基対合の一例は、修飾されたヌクレオチドのイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基/糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。
化学修飾を含むがこれらに限定されない、本開示の組成物、ワクチン、方法及び合成手順に有用なポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)の修飾は、限定するものではないが、次のものが含まれる:2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、1,2’-O-ジメチルアデノシン、1-メチルアデノシン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸)、2-メチルアデノシン、2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸)、イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6,2’-O-ジメチルアデノシン、N6,2’-O-ジメチルアデノシン、N6,N6,2’-O-トリメチルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、N6-アセチルアデノシン、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、7-デアザ-アデノシン、N1-メチル-アデノシン、N6,N6(ジメチル)アデニン、N6-シス-ヒドロキシ-イソペンテニル-アデノシン、α-チオ-アデノシン、2(アミノ)アデニン、2(アミノプロピル)アデニン、2(メチルチオ)N6(イソペンテニル)アデニン、2-(アルキル)アデニン、2-(アミノアルキル)アデニン、2-(アミノプロピル)アデニン、2-(ハロ)アデニン、2-(ハロ)アデニン、2-(プロピル)アデニン、2’-アミノ-2’-デオキシ-ATP、2’-アジド-2’-デオキシ-ATP、2’-デオキシ-2’-a-アミノアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドアデノシンTP、6(アルキル)アデニン、6(メチル)アデニン、6-(アルキル)アデニン、6-(メチル)アデニン、7(デアザ)アデニン、8(アルケニル)アデニン、8(アルキニル)アデニン、8(アミノ)アデニン、8(チオアルキル)アデニン、8-(アルケニル)アデニン、8-(アルキル)アデニン、8-(アルキニル)アデニン、8-(アミノ)アデニン、8-(ハロ)アデニン、8-(ヒドロキシル)アデニン、8-(チオアルキル)アデニン、8-(チオール)アデニン、8-アジド-アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、N6(メチル)アデニン、N6-(イソペンチル)アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデノシン、7-メチルアデニン、1-デアザアデノシンTP、2’フルオロ-N6-Bz-デオキシアデノシンTP、2’-OMe-2-アミノ-ATP、2’O-メチル-N6-Bz-デオキシアデノシンTP、2’-a-エチニルアデノシンTP、2-アミノアデニン、2-アミノアデノシンTP、2-アミノ-ATP、2’-a-トリフルオロメチルアデノシンTP、2-アジドアデノシンTP、2’-b-エチニルアデノシンTP、2-ブロモアデノシンTP、2’-b-トリフルオロメチルアデノシンTP、2-クロロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシアデノシンTP、2-フルオロアデノシンTP、2-ヨードアデノシンTP、2-メルカプトアデノシンTP、2-メトキシ-アデニン、2-メチルチオ-アデニン、2-トリフルオロメチルアデノシンTP、3-デアザ-3-ブロモアデノシンTP、3-デアザ-3-クロロアデノシンTP、3-デアザ-3-フルオロアデノシンTP、3-デアザ-3-ヨードアデノシンTP、3-デアザアデノシンTP、4’-アジドアデノシンTP、4’-炭素環式アデノシンTP、4’-エチニルアデノシンTP、5’-ホモ-アデノシンTP、8-アザ-ATP、8-ブロモ-アデノシンTP、8-トリフルオロメチルアデノシンTP、9-デアザアデノシンTP、2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、2-チオシチジン、3-メチルシチジン、5-ホルミルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、5-メチルシチジン、N4-アセチルシチジン、2’-O-メチルシチジン、2’-O-メチルシチジン、5,2’-O-ジメチルシチジン、5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン、リシジン、N4,2’-O-ジメチルシチジン、N4-アセチル-2’-O-メチルシチジン、N4-メチルシチジン、N4,N4-ジメチル-2’-OMe-シチジンTP、4-メチルシチジン、5-アザ-シチジン、プソイド-イソ-シチジン、ピロロ-シチジン、α-チオ-シチジン、2-(チオ)シトシン、2’-アミノ-2’-デオキシ-CTP、2’-アジド-2’-デオキシ-CTP、2’-デオキシ-2’-a-アミノシチジンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドシチジンTP、3(デアザ)5(アザ)シトシン、3(メチル)シトシン、3-(アルキル)シトシン、3-(デアザ)5(アザ)シトシン、3-(メチル)シチジン、4,2’-O-ジメチルシチジン、5(ハロ)シトシン、5(メチル)シトシン、5(プロピニル)シトシン、5(トリフルオロメチル)シトシン、5-(アルキル)シトシン、5-(アルキニル)シトシン、5-(ハロ)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(トリフルオロメチル)シトシン、5-ブロモ-シチジン、5-ヨード-シチジン、5-プロピニルシトシン、6-(アゾ)シトシン、6-アザ-シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、N4(アセチル)シトシン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-プソイドイソシチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、2-メトキシ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、ピロロ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)シチジンTP、2,2’-無水-シチジンTP塩酸塩、2’フルオロ-N4-Bz-シチジンTP、2’フルオロ-N4-アセチル-シチジンTP、2’-O-メチル-N4-アセチル-シチジンTP、2’O-メチル-N4-Bz-シチジンTP、2’-a-エチニルシチジンTP、2’-a-トリフルオロメチルシチジンTP、2’-b-エチニルシチジンTP、2’-b-トリフルオロメチルシチジンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロシチジンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトシチジンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシシチジンTP、2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)シチジンTP、3’-エチニルシチジンTP、4’-アジドシチジンTP、4’-炭素環式シチジンTP、4’-エチニルシチジンTP、5-(1-プロピニル)アラ-シチジンTP、5-(2-クロロ-フェニル)-2-チオシチジンTP、5-(4-アミノ-フェニル)-2-チオシチジンTP、5-アミノアリル-CTP、5-シアノシチジンTP、5-エチニルアラ-シチジンTP、5-エチニルシチジンTP、5’-ホモ-シチジンTP、5-メトキシシチジンTP、5-トリフルオロメチル-シチジンTP、N4-アミノ-シチジンTP、N4-ベンゾイル-シチジンTP、プソイドイソシチジン、7-メチルグアノシン、N2,2’-O-ジメチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、ワイオシン、1,2’-O-ジメチルグアノシン、1-メチルグアノシン、2’-O-メチルグアノシン、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸)、2’-O-メチルグアノシン、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸)、7-アミノメチル-7-デアザグアノシン、7-シアノ-7-デアザグアノシン、アルカエオシン、メチルワイオシン、N2,7-ジメチルグアノシン、N2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン、N2,N2,7-トリメチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、N2,7,2’-O-トリメチルグアノシン、6-チオ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、N1-メチル-グアノシン、α-チオ-グアノシン、2(プロピル)グアニン、2-(アルキル)グアニン、2’-アミノ-2’-デオキシ-GTP、2’-アジド-2’-デオキシ-GTP、2’-デオキシ-2’-a-アミノグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドグアノシンTP、6(メチル)グアニン、6-(アルキル)グアニン、6-(メチル)グアニン、6-メチル-グアノシン、7(アルキル)グアニン、7(デアザ)グアニン、7(メチル)グアニン、7-(アルキル)グアニン、7-(デアザ)グアニン、7-(メチル)グアニン、8(アルキル)グアニン、8(アルキニル)グアニン、8(ハロ)グアニン、8(チオアルキル)グアニン、8-(アルケニル)グアニン、8-(アルキル)グアニン、8-(アルキニル)グアニン、8-(アミノ)グアニン、8-(ハロ)グアニン、8-(ヒドロキシル)グアニン、8-(チオアルキル)グアニン、8-(チオール)グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、N(メチル)グアニン、N-(メチル)グアニン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、6-メトキシ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、1-Me-GTP、2’フルオロ-N2-イソブチル-グアノシンTP、2’O-メチル-N2-イソブチル-グアノシンTP、2’-a-エチニルグアノシンTP、2’-a-トリフルオロメチルグアノシンTP、2’-b-エチニルグアノシンTP、2’-b-トリフルオロメチルグアノシンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオログアノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロログアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオログアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-
b-チオメトキシグアノシンTP、4’-アジドグアノシンTP、4’-炭素環式グアノシンTP、4’-エチニルグアノシンTP、5’-ホモ-グアノシンTP、8-ブロモ-グアノシンTP、9-デアザグアノシンTP、N2-イソブチル-グアノシンTP、1-メチルイノシン、イノシン、1,2’-O-ジメチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、7-メチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、エポキシクエオシン、ガラクトシル-クエオシン、マンノシルクエオシン、クエオシン、アリルアミノ-チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ-チミジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチルウリジン、5-ヒドロキシウリジン、5-メチルウリジン、5-タウリノメチル-2-チオウリジン、5-タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、1-メチル-3-(3-アミノ-5-カルボキシプロピル)プソイドウリジン、1-メチルプソイドウリジン、1-エチル-プソイドウリジン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオ-2’-O-メチルウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、3,2’-O-ジメチルウリジン、3-メチル-プソイド-ウリジンTP、4-チオウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル、5,2’-O-ジメチルウリジン、5,6-ジヒドロ-ウリジン、5-アミノメチル-2-チオウリジン、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジンTP、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メチルウリジン,)、5-メトキシウリジン、5-メチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メチルジヒドロウリジン、5-オキシ酢酸-ウリジンTP、5-オキシ酢酸-メチルエステル-ウリジンTP、N1-メチル-プソイド-ウラシル、N1-エチル-プソイド-ウラシル、ウリジン5-オキシ酢酸、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチルウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)ウリジンTP、5-プロピニルウラシル、α-チオ-ウリジン、1(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチルエニル)-2(チオ)-プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル)-2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル)-4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル)-プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-2(チオ)-プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-プソイドウラシル、1置換2(チオ)-プソイドウラシル、1置換2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1置換4(チオ)プソイドウラシル、1置換プソイドウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチルエニル)-2-(チオ)-プソイドウラシル、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジンTP、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイド-UTP、1-メチル-プソイド-UTP、1-エチル-プソイド-UTP、2(チオ)プソイドウラシル、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2-(チオ)ウラシル、2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-グアノシン、2’-アミノ-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-デオキシウリジンTP、2’-O-メチルプソイドウリジン、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2’-デオキシ-2’-a-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドウリジンTP、2-メチルプソイドウリジン、3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、4(チオ)プソイドウラシル、4-(チオ)プソイドウラシル、4-(チオ)ウラシル、4-チオウラシル、5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5(2-アミノプロピル)ウラシル、5(アミノアルキル)ウラシル、5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5(メチル)2(チオ)ウラシル、5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチル)4(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(トリフルオロメチル)ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)-2,4(ジチオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)-4(チオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)プソイドウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(l,3-ジアゾール-l-アルキル)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(メチル)2(チオ)ウラシル、5-(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチル)4(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-2,4(ジチオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-4(チオ)プソイドウラシル、5-(メチル)プソイドウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、5-アミノアリル-ウリジン、5-ブロモ-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-ウラシル、6(アゾ)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、6-アザ-ウリジン、アリルアミノ-ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、N3(メチル)ウラシル、プソイド-UTP-1-2-エタン酸、プソイドウラシル、4-チオ-プソイド-UTP、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、1-プロピニル-ウリジン、1-タウリノメチル-1-メチル-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、2-メトキシ-4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、(±)1-(2-ヒドロキシプロピル)プソイドウリジンTP、(2R)-1-(2-ヒドロキシプロピル)プソイドウリジンTP、(2S)-1-(2-ヒドロキシプロピル)プソイドウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-プソイド-UTP、1-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)プソイドウリジンTP、1-(2,2-ジエトキシエチル)プソイドウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチル-ベンジル)プソイド-UTP、1-(2,4,6-トリメチル-フェニル)プソイド-UTP、1-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)プソイド-UTP、1-(2-アミノ-エチル)プソイド-UTP、1-(2-ヒドロキシエチル)プソイドウリジンTP、1-(2-Mエトキシエチル)プソイドウリジンTP、1-(3,4-ビス-トリフルオロメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(3,4-ジメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイド-UTP、1-(3-アミノ-プロピル)プソイド-UTP、1-(3-シクロプロピル-プロパ-2-イニル)プソイドウリジンTP、1-(4-アミノ-4-カルボキシブチル)プソイド-UTP、1-(4-アミノ-ベンジル)プソイド-UTP、1-(4-アミノ-ブチル)プソイド-UTP、1-(4-アミノ-フェニル)プソイド-UTP、1-(4-アジドベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-ブロモベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-クロロベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-フルオロベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-ヨードベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メタンスルホニルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メトキシ-ベンジル)プソイド-UTP、1-(4-メトキシ-フェニル)プソイド-UTP、1-(4-メチルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メチル-ベンジル)プソイド-UTP、1-(4-ニトロベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-ニトロ-ベンジル)プソイド-UTP、1(4-ニトロ-フェニル)プソイド-UTP、1-(4-チオメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-トリフルオロメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-トリフルオロメチルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(5-アミノ-ペンチル)プソイド-UTP、1-(6-アミノ-ヘキシル)プソイド-UTP、1,6-ジメチル-プソイド-UTP、1-[3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニル]プソイドウリジンTP、1-{3-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-プロピオニル}プソイドウリジンTP、1-アセチルプソイドウリジンTP、1-アルキル-6-(1-プロピニル)-プソイド-UTP、1-アルキル-6-(2-プロピニル)-プソイド-UTP、1-アルキル-6-アリル-プソイド-UTP、1-アルキル-6-エチニル-プソイド-UTP、1-アルキル-6-ホモアリル-プソイド-UTP、1-アルキル-6-ビニル-プソイド-UTP、1-アリルプソイドウリジンTP、1-アミノメチル-プソイド-UTP、1-ベンゾイルプソイドウリジンTP、1-ベンジルオキシメチルプソイドウリジンTP、1-ベンジル-プソイド-UTP、1-ビオチニル-
PEG2-プソイドウリジンTP、1-ビオチニルプソイドウリジンTP、1-ブチル-プソイド-UTP、1-シアノメチルプソイドウリジンTP、1-シクロブチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロブチル-プソイド-UTP、1-シクロヘプチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロヘプチル-プソイド-UTP、1-シクロヘキシルメチル-プソイド-UTP、1-シクロヘキシル-プソイド-UTP、1-シクロオクチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロオクチル-プソイド-UTP、1-シクロペンチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロペンチル-プソイド-UTP、1-シクロプロピルメチル-プソイド-UTP、1-シクロプロピル-プソイド-UTP、1-エチル-プソイド-UTP、1-ヘキシル-プソイド-UTP、1-ホモアリルプソイドウリジンTP、1-ヒドロキシメチルプソイドウリジンTP、1-イソ-プロピル-プソイド-UTP、1-Me-2-チオ-プソイド-UTP、1-Me-4-チオ-プソイド-UTP、1-Me-アルファ-チオ-プソイド-UTP、1-メタンスルホニルメチルプソイドウリジンTP、1-メトキシメチルプソイドウリジンTP、1-メチル-6-(2,2,2-トリフルオロエチル)プソイド-UTP、1-メチル-6-(4-モルホリノ)-プソイド-UTP、1-メチル-6-(4-チオモルホリノ)-プソイド-UTP、1-メチル-6-(置換フェニル)プソイド-UTP、1-メチル-6-アミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-アジド-プソイド-UTP、1-メチル-6-ブロモ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ブチル-プソイド-UTP、1-メチル-6-クロロ-プソイド-UTP、1-メチル-6-シアノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ジメチルアミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-エトキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-エチルカルボキシレート-プソイド-UTP、1-メチル-6-エチル-プソイド-UTP、1-メチル-6-フルオロ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ホルミル-プソイド-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシアミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ヨード-プソイド-UTP、1-メチル-6-イソ-プロピル-プソイド-UTP、1-メチル-6-メトキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-メチルアミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-フェニル-プソイド-UTP、1-メチル-6-プロピル-プソイド-UTP、1-メチル-6-tert-ブチル-プソイド-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメトキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメチル-プソイド-UTP、1-モルホリノメチルプソイドウリジンTP、1-ペンチル-プソイド-UTP、1-フェニル-プソイド-UTP、1-ピバロイルプソイドウリジンTP、1-プロパルギルプソイドウリジンTP、1-プロピル-プソイド-UTP、1-プロピニル-プソイドウリジン、1-p-トリル-プソイド-UTP、1-tert-ブチル-プソイド-UTP、1-チオメトキシメチルプソイドウリジンTP、1-チオモルホリノメチルプソイドウリジンTP、1-トリフルオロアセチルプソイドウリジンTP、1-トリフルオロメチル-プソイド-UTP、1-ビニルプソイドウリジンTP、2,2’-無水-ウリジンTP、2’-ブロモ-デオキシウリジンTP、2’-F-5-メチル-2’-デオキシ-UTP、2’-OMe-5-Me-UTP、2’-OMe-プソイド-UTP、2’-a-エチニルウリジンTP、2’-a-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-b-エチニルウリジンTP、2’-b-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシウリジンTP、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、2-メトキシウリジン、2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)ウリジンTP、3-アルキル-プソイド-UTP、4’-アジドウリジンTP、4’-炭素環式ウリジンTP、4’-エチニルウリジンTP、5-(1-プロピニル)アラ-ウリジンTP、5-(2-フラニル)ウリジンTP、5-シアノウリジンTP、5-ジメチルアミノウリジンTP、5’-ホモ-ウリジンTP、5-ヨード-2’-フルオロ-デオキシウリジンTP、5-フェニルエチニルウリジンTP、5-トリ重水素メチル-6-重水素ウリジンTP、5-トリフルオロメチル-ウリジンTP、5-ビニルアラウリジンTP、6-(2,2,2-トリフルオロエチル)-プソイド-UTP、6-(4-モルホリノ)-プソイド-UTP、6-(4-チオモルホリノ)-プソイド-UTP、6-(置換フェニル)-プソイド-UTP、6-アミノ-プソイド-UTP、6-アジド-プソイド-UTP、6-ブロモ-プソイド-UTP、6-ブチル-プソイド-UTP、6-クロロ-プソイド-UTP、6-シアノ-プソイド-UTP、6-ジメチルアミノ-プソイド-UTP、6-エトキシ-プソイド-UTP、6-エチルカルボキシレート-プソイド-UTP、6-エチル-プソイド-UTP、6-フルオロ-プソイド-UTP、6-ホルミル-プソイド-UTP、6-ヒドロキシアミノ-プソイド-UTP、6-ヒドロキシ-プソイド-UTP、6-ヨード-プソイド-UTP、6-イソ-プロピル-プソイド-UTP、6-メトキシ-プソイド-UTP、6-メチルアミノ-プソイド-UTP、6-メチル-プソイド-UTP、6-フェニル-プソイド-UTP、6-フェニル-プソイド-UTP、6-プロピル-プソイド-UTP、6-tert-ブチル-プソイド-UTP、6-トリフルオロメトキシ-プソイド-UTP、6-トリフルオロメチル-プソイド-UTP、アルファ-チオ-プソイド-UTP、プソイドウリジン1-(4-メチルベンゼンスルホン酸)TP、プソイドウリジン1-(4-メチル安息香酸)TP、プソイドウリジンTP1-[3-(2-エトキシ)]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-(2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-{2(2-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-メチルホスホン酸、プソイドウリジンTP1-メチルホスホン酸ジエチルエステル、プソイド-UTP-N1-3-プロピオン酸、プソイド-UTP-N1-4-ブタン酸、プソイド-UTP-N1-5-ペンタン酸、プソイド-UTP-N1-6-ヘキサン酸、プソイド-UTP-N1-7-ヘプタン酸、プソイド-UTP-N1-メチル-p-安息香酸、プソイド-UTP-N1-p-安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、低修飾(undermodified)ヒドロキシワイブトシン、4-デメチルワイオシン、2,6-(ジアミノ)プリン、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル:1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-l-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、2(アミノ)プリン、2,4,5-(トリメチル)フェニル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-シチジン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-アデニン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-ウリジン、2’-アミノ-2’-デオキシリボース、2-アミノ-6-クロロ-プリン、2-アザ-イノシニル、2’-アジド-2’-デオキシリボース、2’フルオロ-2’-デオキシリボース、2’-フルオロ-修飾塩基、2’-O-メチル-リボース、2-オキソ-7-アミノピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル、2-ピリジノン、3ニトロピロール、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、3-(メチル)イソカルボスチリリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、5ニトロインドール、5置換ピリミジン、5-(メチル)イソカルボスチリリル、5-ニトロインドール、6-(アザ)ピリミジン、6-(アゾ)チミン、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、6-クロロ-プリン、6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アザ)インドリル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、7-デアザ-イノシニル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリリル、イソグアニシン、N2-置換プリン、N6-メチル-2-アミノ-プリン、N6-置換プリン、N-アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン、O6-置換プリン、O-アルキル化誘導体、オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オキソホルミシンTP、パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ペンタセニル、フェナントラセニル、フェニル
、プロピニル-7-(アザ)インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン-3-イル、ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル、ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル、置換1,2,4-トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン、キサンチン、キサントシン-5’-TP、2-チオ-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、2-アミノ-リボシド-TP、ホルマイシンATP、ホルマイシンBTP、ピロロシンTP、2’-OH-アラ-アデノシンTP、2’-OH-アラ-シチジンTP、2’-OH-アラ-ウリジンTP、2’-OH-アラ-グアノシンTP、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジンTP、及びN6-(19-アミノ-ペンタオキサノンアデシル)アデノシンTP。
b-チオメトキシグアノシンTP、4’-アジドグアノシンTP、4’-炭素環式グアノシンTP、4’-エチニルグアノシンTP、5’-ホモ-グアノシンTP、8-ブロモ-グアノシンTP、9-デアザグアノシンTP、N2-イソブチル-グアノシンTP、1-メチルイノシン、イノシン、1,2’-O-ジメチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、7-メチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、エポキシクエオシン、ガラクトシル-クエオシン、マンノシルクエオシン、クエオシン、アリルアミノ-チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ-チミジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチルウリジン、5-ヒドロキシウリジン、5-メチルウリジン、5-タウリノメチル-2-チオウリジン、5-タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、1-メチル-3-(3-アミノ-5-カルボキシプロピル)プソイドウリジン、1-メチルプソイドウリジン、1-エチル-プソイドウリジン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオ-2’-O-メチルウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、3,2’-O-ジメチルウリジン、3-メチル-プソイド-ウリジンTP、4-チオウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル、5,2’-O-ジメチルウリジン、5,6-ジヒドロ-ウリジン、5-アミノメチル-2-チオウリジン、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジンTP、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メチルウリジン,)、5-メトキシウリジン、5-メチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メチルジヒドロウリジン、5-オキシ酢酸-ウリジンTP、5-オキシ酢酸-メチルエステル-ウリジンTP、N1-メチル-プソイド-ウラシル、N1-エチル-プソイド-ウラシル、ウリジン5-オキシ酢酸、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチルウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)ウリジンTP、5-プロピニルウラシル、α-チオ-ウリジン、1(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチルエニル)-2(チオ)-プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル)-2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル)-4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル)-プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-2(チオ)-プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチルエニル)-プソイドウラシル、1置換2(チオ)-プソイドウラシル、1置換2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1置換4(チオ)プソイドウラシル、1置換プソイドウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチルエニル)-2-(チオ)-プソイドウラシル、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジンTP、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイド-UTP、1-メチル-プソイド-UTP、1-エチル-プソイド-UTP、2(チオ)プソイドウラシル、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2-(チオ)ウラシル、2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-グアノシン、2’-アミノ-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-デオキシウリジンTP、2’-O-メチルプソイドウリジン、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2’-デオキシ-2’-a-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドウリジンTP、2-メチルプソイドウリジン、3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、4(チオ)プソイドウラシル、4-(チオ)プソイドウラシル、4-(チオ)ウラシル、4-チオウラシル、5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5(2-アミノプロピル)ウラシル、5(アミノアルキル)ウラシル、5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5(メチル)2(チオ)ウラシル、5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチル)4(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(トリフルオロメチル)ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)-2,4(ジチオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)-4(チオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)プソイドウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(l,3-ジアゾール-l-アルキル)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(メチル)2(チオ)ウラシル、5-(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチル)4(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-2,4(ジチオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-4(チオ)プソイドウラシル、5-(メチル)プソイドウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、5-アミノアリル-ウリジン、5-ブロモ-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-ウラシル、6(アゾ)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、6-アザ-ウリジン、アリルアミノ-ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、N3(メチル)ウラシル、プソイド-UTP-1-2-エタン酸、プソイドウラシル、4-チオ-プソイド-UTP、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、1-プロピニル-ウリジン、1-タウリノメチル-1-メチル-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、2-メトキシ-4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、(±)1-(2-ヒドロキシプロピル)プソイドウリジンTP、(2R)-1-(2-ヒドロキシプロピル)プソイドウリジンTP、(2S)-1-(2-ヒドロキシプロピル)プソイドウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-プソイド-UTP、1-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)プソイドウリジンTP、1-(2,2-ジエトキシエチル)プソイドウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチル-ベンジル)プソイド-UTP、1-(2,4,6-トリメチル-フェニル)プソイド-UTP、1-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)プソイド-UTP、1-(2-アミノ-エチル)プソイド-UTP、1-(2-ヒドロキシエチル)プソイドウリジンTP、1-(2-Mエトキシエチル)プソイドウリジンTP、1-(3,4-ビス-トリフルオロメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(3,4-ジメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイド-UTP、1-(3-アミノ-プロピル)プソイド-UTP、1-(3-シクロプロピル-プロパ-2-イニル)プソイドウリジンTP、1-(4-アミノ-4-カルボキシブチル)プソイド-UTP、1-(4-アミノ-ベンジル)プソイド-UTP、1-(4-アミノ-ブチル)プソイド-UTP、1-(4-アミノ-フェニル)プソイド-UTP、1-(4-アジドベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-ブロモベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-クロロベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-フルオロベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-ヨードベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メタンスルホニルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メトキシ-ベンジル)プソイド-UTP、1-(4-メトキシ-フェニル)プソイド-UTP、1-(4-メチルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-メチル-ベンジル)プソイド-UTP、1-(4-ニトロベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-ニトロ-ベンジル)プソイド-UTP、1(4-ニトロ-フェニル)プソイド-UTP、1-(4-チオメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-トリフルオロメトキシベンジル)プソイドウリジンTP、1-(4-トリフルオロメチルベンジル)プソイドウリジンTP、1-(5-アミノ-ペンチル)プソイド-UTP、1-(6-アミノ-ヘキシル)プソイド-UTP、1,6-ジメチル-プソイド-UTP、1-[3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニル]プソイドウリジンTP、1-{3-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-プロピオニル}プソイドウリジンTP、1-アセチルプソイドウリジンTP、1-アルキル-6-(1-プロピニル)-プソイド-UTP、1-アルキル-6-(2-プロピニル)-プソイド-UTP、1-アルキル-6-アリル-プソイド-UTP、1-アルキル-6-エチニル-プソイド-UTP、1-アルキル-6-ホモアリル-プソイド-UTP、1-アルキル-6-ビニル-プソイド-UTP、1-アリルプソイドウリジンTP、1-アミノメチル-プソイド-UTP、1-ベンゾイルプソイドウリジンTP、1-ベンジルオキシメチルプソイドウリジンTP、1-ベンジル-プソイド-UTP、1-ビオチニル-
PEG2-プソイドウリジンTP、1-ビオチニルプソイドウリジンTP、1-ブチル-プソイド-UTP、1-シアノメチルプソイドウリジンTP、1-シクロブチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロブチル-プソイド-UTP、1-シクロヘプチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロヘプチル-プソイド-UTP、1-シクロヘキシルメチル-プソイド-UTP、1-シクロヘキシル-プソイド-UTP、1-シクロオクチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロオクチル-プソイド-UTP、1-シクロペンチルメチル-プソイド-UTP、1-シクロペンチル-プソイド-UTP、1-シクロプロピルメチル-プソイド-UTP、1-シクロプロピル-プソイド-UTP、1-エチル-プソイド-UTP、1-ヘキシル-プソイド-UTP、1-ホモアリルプソイドウリジンTP、1-ヒドロキシメチルプソイドウリジンTP、1-イソ-プロピル-プソイド-UTP、1-Me-2-チオ-プソイド-UTP、1-Me-4-チオ-プソイド-UTP、1-Me-アルファ-チオ-プソイド-UTP、1-メタンスルホニルメチルプソイドウリジンTP、1-メトキシメチルプソイドウリジンTP、1-メチル-6-(2,2,2-トリフルオロエチル)プソイド-UTP、1-メチル-6-(4-モルホリノ)-プソイド-UTP、1-メチル-6-(4-チオモルホリノ)-プソイド-UTP、1-メチル-6-(置換フェニル)プソイド-UTP、1-メチル-6-アミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-アジド-プソイド-UTP、1-メチル-6-ブロモ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ブチル-プソイド-UTP、1-メチル-6-クロロ-プソイド-UTP、1-メチル-6-シアノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ジメチルアミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-エトキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-エチルカルボキシレート-プソイド-UTP、1-メチル-6-エチル-プソイド-UTP、1-メチル-6-フルオロ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ホルミル-プソイド-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシアミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-ヨード-プソイド-UTP、1-メチル-6-イソ-プロピル-プソイド-UTP、1-メチル-6-メトキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-メチルアミノ-プソイド-UTP、1-メチル-6-フェニル-プソイド-UTP、1-メチル-6-プロピル-プソイド-UTP、1-メチル-6-tert-ブチル-プソイド-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメトキシ-プソイド-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメチル-プソイド-UTP、1-モルホリノメチルプソイドウリジンTP、1-ペンチル-プソイド-UTP、1-フェニル-プソイド-UTP、1-ピバロイルプソイドウリジンTP、1-プロパルギルプソイドウリジンTP、1-プロピル-プソイド-UTP、1-プロピニル-プソイドウリジン、1-p-トリル-プソイド-UTP、1-tert-ブチル-プソイド-UTP、1-チオメトキシメチルプソイドウリジンTP、1-チオモルホリノメチルプソイドウリジンTP、1-トリフルオロアセチルプソイドウリジンTP、1-トリフルオロメチル-プソイド-UTP、1-ビニルプソイドウリジンTP、2,2’-無水-ウリジンTP、2’-ブロモ-デオキシウリジンTP、2’-F-5-メチル-2’-デオキシ-UTP、2’-OMe-5-Me-UTP、2’-OMe-プソイド-UTP、2’-a-エチニルウリジンTP、2’-a-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-b-エチニルウリジンTP、2’-b-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシウリジンTP、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、2-メトキシウリジン、2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)ウリジンTP、3-アルキル-プソイド-UTP、4’-アジドウリジンTP、4’-炭素環式ウリジンTP、4’-エチニルウリジンTP、5-(1-プロピニル)アラ-ウリジンTP、5-(2-フラニル)ウリジンTP、5-シアノウリジンTP、5-ジメチルアミノウリジンTP、5’-ホモ-ウリジンTP、5-ヨード-2’-フルオロ-デオキシウリジンTP、5-フェニルエチニルウリジンTP、5-トリ重水素メチル-6-重水素ウリジンTP、5-トリフルオロメチル-ウリジンTP、5-ビニルアラウリジンTP、6-(2,2,2-トリフルオロエチル)-プソイド-UTP、6-(4-モルホリノ)-プソイド-UTP、6-(4-チオモルホリノ)-プソイド-UTP、6-(置換フェニル)-プソイド-UTP、6-アミノ-プソイド-UTP、6-アジド-プソイド-UTP、6-ブロモ-プソイド-UTP、6-ブチル-プソイド-UTP、6-クロロ-プソイド-UTP、6-シアノ-プソイド-UTP、6-ジメチルアミノ-プソイド-UTP、6-エトキシ-プソイド-UTP、6-エチルカルボキシレート-プソイド-UTP、6-エチル-プソイド-UTP、6-フルオロ-プソイド-UTP、6-ホルミル-プソイド-UTP、6-ヒドロキシアミノ-プソイド-UTP、6-ヒドロキシ-プソイド-UTP、6-ヨード-プソイド-UTP、6-イソ-プロピル-プソイド-UTP、6-メトキシ-プソイド-UTP、6-メチルアミノ-プソイド-UTP、6-メチル-プソイド-UTP、6-フェニル-プソイド-UTP、6-フェニル-プソイド-UTP、6-プロピル-プソイド-UTP、6-tert-ブチル-プソイド-UTP、6-トリフルオロメトキシ-プソイド-UTP、6-トリフルオロメチル-プソイド-UTP、アルファ-チオ-プソイド-UTP、プソイドウリジン1-(4-メチルベンゼンスルホン酸)TP、プソイドウリジン1-(4-メチル安息香酸)TP、プソイドウリジンTP1-[3-(2-エトキシ)]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-(2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-{2(2-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-[3-{2-(2-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、プソイドウリジンTP1-メチルホスホン酸、プソイドウリジンTP1-メチルホスホン酸ジエチルエステル、プソイド-UTP-N1-3-プロピオン酸、プソイド-UTP-N1-4-ブタン酸、プソイド-UTP-N1-5-ペンタン酸、プソイド-UTP-N1-6-ヘキサン酸、プソイド-UTP-N1-7-ヘプタン酸、プソイド-UTP-N1-メチル-p-安息香酸、プソイド-UTP-N1-p-安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、低修飾(undermodified)ヒドロキシワイブトシン、4-デメチルワイオシン、2,6-(ジアミノ)プリン、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル:1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-l-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、2(アミノ)プリン、2,4,5-(トリメチル)フェニル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-シチジン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-アデニン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-ウリジン、2’-アミノ-2’-デオキシリボース、2-アミノ-6-クロロ-プリン、2-アザ-イノシニル、2’-アジド-2’-デオキシリボース、2’フルオロ-2’-デオキシリボース、2’-フルオロ-修飾塩基、2’-O-メチル-リボース、2-オキソ-7-アミノピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル、2-ピリジノン、3ニトロピロール、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、3-(メチル)イソカルボスチリリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、5ニトロインドール、5置換ピリミジン、5-(メチル)イソカルボスチリリル、5-ニトロインドール、6-(アザ)ピリミジン、6-(アゾ)チミン、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、6-クロロ-プリン、6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アザ)インドリル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、7-デアザ-イノシニル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリリル、イソグアニシン、N2-置換プリン、N6-メチル-2-アミノ-プリン、N6-置換プリン、N-アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン、O6-置換プリン、O-アルキル化誘導体、オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オキソホルミシンTP、パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ペンタセニル、フェナントラセニル、フェニル
、プロピニル-7-(アザ)インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン-3-イル、ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル、ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル、置換1,2,4-トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン、キサンチン、キサントシン-5’-TP、2-チオ-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、2-アミノ-リボシド-TP、ホルマイシンATP、ホルマイシンBTP、ピロロシンTP、2’-OH-アラ-アデノシンTP、2’-OH-アラ-シチジンTP、2’-OH-アラ-ウリジンTP、2’-OH-アラ-グアノシンTP、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジンTP、及びN6-(19-アミノ-ペンタオキサノンアデシル)アデノシンTP。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)中の修飾核酸塩基は、プソイドウリジン(ψ)、2-チオウリジン(s2U)、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、2’-O-メチルウリジン、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)、1-エチル-プソイドウリジン(e1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、α-チオ-グアノシン、α-チオ-アデノシン、5-シアノウリジン、4’-チオウリジン7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)及び2,6-ジアミノプリン、(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアノシン、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、7-メチル-グアノシン(m7G)、1-メチル-グアノシン(m1G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、2,8-ジメチルアデノシン、2-ゲラニルチオウリジン、2-リシジン、2-セレノウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-5,6-ジヒドロウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジン、3-メチルプソイドウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)-2’-O-メチルウリジンメチルエステル、5-アミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、5-アミノメチル-2-セレノウリジン、5-アミノメチルウリジン、5-カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、5-カルバモイルメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-シアノメチルウリジン、5-ヒドロキシシチジン、5-メチルアミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、7-アミノカルボキシプロピル-デメチルワイオシン、7-アミノカルボキシプロピルワイオシン、7-アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、8-メチルアデノシン、N4,N4-ジメチルシチジン、N6-ホルミルアデノシン、N6-ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル-クエオシン、メチル化低修飾ヒドロキシワイブトシン、N4,N4,2’-O-トリメチルシチジン、ゲラニル化5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、ゲラニル化5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、Q塩基、preQ0塩基、preQ1塩基、ならびにこれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン、1-メチル-プソイドウリジン、1-エチル-プソイドウリジン、5-メチルシトシン、5-メトキシウリジン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAポリリボヌクレオチドなどのRNAポリリボヌクレオチド)は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)中の修飾核酸塩基は、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)、1-エチル-プソイドウリジン(e1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、プソイドウリジン(ψ)、α-チオ-グアノシン及びα-チオ-アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、化学修飾を含むがこれらに限定されない、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2、3、4つまたはそれ以上)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、プソイドウリジン(ψ)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、1-エチル-プソイドウリジン(e1ψ)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、1-エチル-プソイドウリジン(e1ψ)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、2-チオウリジン(s2U)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、2-チオウリジン及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、メトキシ-ウリジン(mo5U)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、2’-O-メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、2’-O-メチルウリジン及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、N6-メチル-アデノシン(m6A)を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド(例えば、mRNAなどのRNA)は、N6-メチル-アデノシン(m6A)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、特定の修飾に対して均一に修飾される(例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドは、1-メチル-プソイドウリジンで均一に修飾され得、すなわち、mRNA配列中の全てのウリジン残基が1-メチル-プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、配列中に存在するあらゆる種類のヌクレオシド残基が上記のものなどの修飾残基で置き換えられることによって、均一に修飾され得る。
修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、N4-アセチル-シチジン(ac4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)及び2-チオ-5-メチル-シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)、1-エチル-プソイドウリジン(e1ψ)、5-メトキシウリジン、2-チオウリジン、5-シアノウリジン、2’-O-メチルウリジン及び4’-チオウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)及びN6-メチル-アデノシン(m6A)が挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアノシン、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、7-メチル-グアノシン(m7G)、1-メチル-グアノシン(m1G)、8-オキソ-グアノシン及び7-メチル-8-オキソ-グアノシンが挙げられる。
本開示のポリヌクレオチドは、分子の全長にわたって部分的にまたは完全に修飾され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはその所定の配列領域(例えば、ポリAテールを含む、または含まないmRNA)中の1つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド(例えば、プリンもしくはピリミジン、またはA、G、U、Cのいずれか1つ以上もしくは全て)が均一に修飾され得る。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド(またはその所与の配列領域)中の全てのヌクレオチドXが、修飾ヌクレオチドであり、ここで、Xは、ヌクレオチドA、G、U、Cのうちのいずれか1つ、または組み合わせA+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+CもしくはA+G+Cのうちのいずれか1つである。
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを約1%~約100%(全体的なヌクレオチド含有量に対して、またはヌクレオチドの1つ以上の種類(すなわち、A、G、UまたはCのうちのいずれか1つ以上)に対して)、またはその間の任意のパーセンテージ(例えば、1%~20%、1%~25%、1%~50%、1%~60%、1%~70%、1%~80%、1%~90%、1%~95%、10%~20%、10%~25%、10%~50%、10%~60%、10%~70%、10%~80%、10%~90%、10%~95%、10%~100%、20%~25%、20%~50%、20%~60%、20%~70%、20%~80%、20%~90%、20%~95%、20%~100%、50%~60%、50%~70%、50%~80%、50%~90%、50%~95%、50%~100%、70%~80%、70%~90%、70%~95%、70%~100%、80%~90%、80%~95%、80%~100%、90%~95%、90%~100%及び95%~100%)含有し得る。任意の残りのパーセンテージは、非修飾のA、G、UまたはCの存在によって占められることは理解されるであろう。
ポリヌクレオチドは、最小1%及び最大100%の修飾ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも5%の修飾ヌクレオチド、少なくとも10%の修飾ヌクレオチド、少なくとも25%の修飾ヌクレオチド、少なくとも50%の修飾ヌクレオチド、少なくとも80%の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも90%の修飾ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾ウラシルまたは修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%または100%が、修飾ウラシル(例えば、5-置換ウラシル)によって置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の特有な構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造(例えば、2、3、4つまたはそれ以上の特有な構造)を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%または100%が、修飾シトシン(例えば、5-置換シトシン)によって置き換えられる。修飾シトシンは、単一の特有な構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造(例えば、2、3、4つまたはそれ以上の特有な構造)を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。
したがって、いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、5’UTRエレメント、任意選択によりコドン最適化オープンリーディングフレームならびに3’UTRエレメント、ポリ(A)配列及び/またはポリアデニル化シグナルを含み、当該RNAは、化学修飾されていない。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、6-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ウリジン(s2U)、4-チオ-ウリジン(s4U)、4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、5-ヒドロキシ-ウリジン(ho5U)、5-アミノアリル-ウリジン、5-ハロ-ウリジン(例えば、5-ヨード-ウリジンまたは5-ブロモ-ウリジン)、3-メチル-ウリジン(m3U)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5-カルボキシメチル-ウリジン(cm5U)、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジン(chm5U)、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-ウリジン(mcm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオ-ウリジン(mcm5s2U)、5-アミノメチル-2-チオ-ウリジン(nm5s2U)、5-メチルアミノメチル-ウリジン(mnm5U)、5-メチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(mnm5s2U)、5-メチルアミノメチル-2-セレノ-ウリジン(mnm5se2U)、5-カルバモイルメチル-ウリジン(ncm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウリジン(cmnm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(cmnm5s2U)、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-ウリジン(τm5U)、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン(τm5s2U)、1-タウリノメチル-4-チオ-プソイドウリジン、5-メチル-ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する)、1-メチル-プソイドウリジン(m1ψ)、1-エチル-プソイドウリジン(e1ψ)、5-メチル-2-チオ-ウリジン(m5s2U)、1-メチル-4-チオ-プソイドウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、3-メチル-プソイドウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、5-メチル-ジヒドロウリジン(m5D)、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシ-ウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、N1-メチル-プソイドウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3ψ)、5-(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2-チオ-ウリジン(inm5s2U)、α-チオ-ウリジン、2’-O-メチル-ウリジン(Um)、5,2’-O-ジメチル-ウリジン(m5Um)、2’-O-メチル-プソイドウリジン(ψm)、2-チオ-2’-O-メチル-ウリジン(s2Um)、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(mcm5Um)、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(ncm5Um)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチル-ウリジン(cmnm5Um)、3,2’-O-ジメチル-ウリジン(m3Um)、及び5-(イソペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチル-ウリジン(inm5Um)、1-チオ-ウリジン、デオキシチミジン、2’-F-アラ-ウリジン、2’-F-ウリジン、2’-OH-アラ-ウリジン、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジン及び5-[3-(1-E-プロペニルアミノ)]ウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、5-アザ-シチジン、6-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン(m3C)、N4-アセチル-シチジン(ac4C)、5-ホルミル-シチジン(f5C)、N4-メチル-シチジン(m4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、α-チオ-シチジン、2’-O-メチル-シチジン(Cm)、5,2’-O-ジメチル-シチジン(m5Cm)、N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン(ac4Cm)、N4,2’-O-ジメチル-シチジン(m4Cm)、5-ホルミル-2’-O-メチル-シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’-O-トリメチル-シチジン(m4
2Cm)、1-チオ-シチジン、2’-F-アラ-シチジン、2’-F-シチジン及び2’-OH-アラ-シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、2-アミノ-プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-ハロ-プリン(例えば、2-アミノ-6-クロロ-プリン)、6-ハロ-プリン(例えば、6-クロロ-プリン)、2-アミノ-6-メチル-プリン、8-アジド-アデノシン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)、2-メチルチオ-N6-メチル-アデノシン(ms2m6A)、N6-イソペンテニル-アデノシン(i6A)、2-メチルチオ-N6-イソペンテニル-アデノシン(ms2i6A)、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6-グリシニルカルバモイル-アデノシン(g6A)、N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(t6A)、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(m6t6A)、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(ms2g6A)、N6,N6-ジメチル-アデノシン(m6
2A)、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(hn6A)、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(ms2hn6A)、N6-アセチル-アデノシン(ac6A)、7-メチル-アデニン、2-メチルチオ-アデニン、2-メトキシ-アデニン、α-チオ-アデノシン、2’-O-メチル-アデノシン(Am)、N6,2’-O-ジメチル-アデノシン(m6Am)、N6,N6,2’-O-トリメチル-アデノシン(m6
2Am)、1,2’-O-ジメチル-アデノシン(m1Am)、2’-O-リボシルアデノシン(リン酸)(Ar(p))、2-アミノ-N6-メチル-プリン、1-チオ-アデノシン、8-アジド-アデノシン、2’-F-アラ-アデノシン、2’-F-アデノシン、2’-OH-アラ-アデノシン及びN6-(19-アミノ-ペンタオキサノンアデシル)-アデノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4-デメチル-ワイオシン(imG-14)、イソワイオシン(imG2)、ワイブトシン(yW)、ペルオキシワイブトシン(o2yW)、ヒドロキシワイブトシン(OhyW)、低修飾ヒドロキシワイブトシン(OhyW*)、7-デアザ-グアノシン、クエオシン(Q)、エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル-クエオシン(galQ)、マンノシル-クエオシン(manQ)、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン(m7G)、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチル-イノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチル-グアノシン(m1G)、N2-メチル-グアノシン(m2G)、N2,N2-ジメチル-グアノシン(m2
2G)、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,7G)、N2,N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,2,7G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、α-チオ-グアノシン、2’-O-メチル-グアノシン(Gm)、N2-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2Gm)、N2,N2-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2
2Gm)、1-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m1Gm)、N2,7-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2,7Gm)、2’-O-メチル-イノシン(Im)、1,2’-O-ジメチル-イノシン(m1Im)、2’-O-リボシルグアノシン(リン酸)(Gr(p))、1-チオ-グアノシン、O6-メチル-グアノシン、2’-F-アラ-グアノシン、及び2’-F-グアノシンが挙げられる。
RNA(例えば、mRNA)のin vitro転写
本開示のVZVワクチンは、mRNA(例えば、修飾されたmRNA)などの少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む。mRNAは、例えば、「in vitro転写鋳型」と呼ばれる鋳型DNAからin vitroで転写される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾を有する。少なくとも1つの化学修飾には、明示的に限定されるものではないが、本明細書に記載の任意の修飾が含まれ得る。
本開示のVZVワクチンは、mRNA(例えば、修飾されたmRNA)などの少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む。mRNAは、例えば、「in vitro転写鋳型」と呼ばれる鋳型DNAからin vitroで転写される。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾を有する。少なくとも1つの化学修飾には、明示的に限定されるものではないが、本明細書に記載の任意の修飾が含まれ得る。
RNAのin vitro転写は、当該技術分野において知られており、国際公開第WO/2014/152027号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている。例えば、いくつかの実施形態において、RNA転写産物は、RNA転写産物を生成するためのin vitro転写反応において、増幅されていない線状DNA鋳型を使用して生成される。いくつかの実施形態において、RNA転写産物は、酵素的キャッピングによりキャッピングされる。いくつかの実施形態において、RNA転写産物は、クロマトグラフ法により、例えば、オリゴdT基質を使用して精製される。いくつかの実施形態は、DNaseの使用を除外する。いくつかの実施形態において、RNA転写産物は、T7ファージRNAポリメラーゼ及び所望の化学物質のヌクレオチド三リン酸を利用する酵素的in vitro転写反応により、目的遺伝子をコードする増幅されていない線状DNA鋳型から合成される。任意数のRNAポリメラーゼまたはバリアントを本発明の方法で使用することができる。ポリメラーゼは、ファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNaポリメラーゼ及び/または変異ポリメラーゼ(例えば、限定するものではないが、化学修飾された核酸及び/またはヌクレオチドを含む修飾核酸及び/または修飾ヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼ)から選択され得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、増幅されていない線状化プラスミドDNAをin vitro転写の鋳型DNAとして利用する。いくつかの実施形態において、鋳型DNAは、単離されたDNAである。いくつかの実施形態において、鋳型DNAは、cDNAである。いくつかの実施形態において、cDNAは、RNAポリヌクレオチド、例えば、限定するものではないが、VZV RNA、例えば、VZV mRNAの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、細菌細胞、例えば、E.coliであり、例えば、DH-1細胞にプラスミドDNA鋳型をトランスフェクトする。いくつかの実施形態において、トランスフェクトした細胞を培養してプラスミドDNAを複製し、その後、プラスミドDNAを単離及び精製する。いくつかの実施形態において、DNA鋳型は、5’側に位置し、目的遺伝子に作動可能に連結されたRNAポリメラーゼプロモーター、例えば、T7プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、in vitro転写鋳型は、5’非翻訳(UTR)領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、3’UTR及びポリAテールをコードする。in vitro転写鋳型の特定の核酸配列の組成及び長さは、鋳型によってコードされるmRNAに依存する。
「5’非翻訳領域」(UTR)は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン(すなわち、リボソームによって翻訳されるmRNA転写産物の最初のコドン)から直接上流(すなわち、5’側)にあるmRNAの領域を指す。
「3’非翻訳領域」(UTR)は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン(すなわち、翻訳の終結を伝達するmRNA転写産物のコドン)から直接下流(すなわち、3’側)にあるmRNAの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン(例えば、メチオニン(ATG))で始まり、終止コドン(例えば、TAA、TAGまたはTGA)で終わり、かつポリペプチドをコードするDNAの連続ストレッチである。
「ポリAテール」は、多数の連続したアデノシン一リン酸を含有する、3’UTRから下流、例えば、直接下流(すなわち、3’側)にあるmRNAの領域である。ポリAテールは、10~300個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリAテールは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290または300個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリAテールは、50~250個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的環境内(例えば、細胞内、in vivo)において、ポリ(A)テールは、例えば、細胞質内での酵素分解からmRNAを保護するように機能し、また転写終結ならびに/または核からのmRNAの輸送及び翻訳を助ける。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、200~3,000個のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、200~500、200~1000、200~1500、200~3000、500~1000、500~1500、500~2000、500~3000、1000~1500、1000~2000、1000~3000、1500~3000または2000~3000個のヌクレオチドを含み得る。
治療方法
ヒト及び他の動物におけるVZVの予防及び/または治療のための組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。VZV RNAワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。これは、感染症の予防及び/または治療のための薬剤として使用することができる。例示的な態様において、本発明のVZV RNAワクチンは、水痘及び帯状ヘルペスからの予防的保護を提供するために使用される。水痘は、VZVによって引き起こされる急性感染症である。水疱瘡(水痘)をもたらす水痘帯状疱疹ウイルスの一次感染は、ウイルス性肺炎または二次性細菌性肺炎を含む合併症に至る場合もある。水疱瘡の臨床症状が解消された場合でも、VZVは、感染者の三叉神経及び脊髄後根神経節の神経系に潜伏し続け、後年に活性化し、知覚神経節から皮膚に戻り、そこで帯状疱疹または帯状ヘルペスとして知られる疾患(発疹)を引き起こすことがあり、また、無菌性髄膜炎から脳炎に至るまでのいくつかの神経学的病態を引き起こすことがある。本開示のVZVワクチンは、一次感染(水疱瘡)と再活性化したウイルス感染(帯状疱疹または帯状ヘルペス)の両方を予防及び/または治療するために使用することができ、免疫不全状態及び高齢の患者に対する、帯状ヘルペスを予防し、またはその重症度及び/もしくは期間を軽減するための予防及び/または治療に特に有用であり得る。
ヒト及び他の動物におけるVZVの予防及び/または治療のための組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。VZV RNAワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。これは、感染症の予防及び/または治療のための薬剤として使用することができる。例示的な態様において、本発明のVZV RNAワクチンは、水痘及び帯状ヘルペスからの予防的保護を提供するために使用される。水痘は、VZVによって引き起こされる急性感染症である。水疱瘡(水痘)をもたらす水痘帯状疱疹ウイルスの一次感染は、ウイルス性肺炎または二次性細菌性肺炎を含む合併症に至る場合もある。水疱瘡の臨床症状が解消された場合でも、VZVは、感染者の三叉神経及び脊髄後根神経節の神経系に潜伏し続け、後年に活性化し、知覚神経節から皮膚に戻り、そこで帯状疱疹または帯状ヘルペスとして知られる疾患(発疹)を引き起こすことがあり、また、無菌性髄膜炎から脳炎に至るまでのいくつかの神経学的病態を引き起こすことがある。本開示のVZVワクチンは、一次感染(水疱瘡)と再活性化したウイルス感染(帯状疱疹または帯状ヘルペス)の両方を予防及び/または治療するために使用することができ、免疫不全状態及び高齢の患者に対する、帯状ヘルペスを予防し、またはその重症度及び/もしくは期間を軽減するための予防及び/または治療に特に有用であり得る。
VZVからの予防的保護は、本開示のVZV RNAワクチンの投与後に達成され得る。ワクチンは、1回、2回、3回、4回またはそれ以上投与することができるが、ワクチンを1回投与すれば十分であり得る(その後、任意選択により1回のブースターを行う)。あまり望ましくはないが、感染個体にワクチンを投与して治療応答を達成することが可能である。用量は適宜調整する必要があり得る。
本開示の態様において、VZVに対する対象の免疫応答を誘発する方法が提供される。方法は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含むVZV RNAワクチンを対象に投与することを伴い、これにより、当該対象において、VZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して増加する。「抗抗原性ポリペプチド抗体」は、抗原性ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防上有効な用量は、臨床的に許容されるレベルでウイルスの感染を防ぐ治療上有効な用量である。いくつかの実施形態において、治療上有効な用量は、ワクチンの添付文書に列挙される用量である。従来型ワクチンは、本明細書で使用されるとき、本開示のmRNAワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンには、生きた微生物のワクチン、死滅した微生物のワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、DNAワクチン、VLPワクチンなどが含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、従来型ワクチンは、規制当局の承認を受け、かつ/または国内医薬品規制機関、例えば、米国食品医薬品局(FDA)もしくは欧州医薬品庁(EMA)によって登録されたワクチンである。
本発明の態様において、VZVに対する対象の免疫応答を誘発する方法が提供される。方法は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含むVZV RNAワクチンを対象に投与することを伴い、これにより、当該対象において、VZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して増加する。「抗抗原性ポリペプチド抗体」は、抗原性ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防上有効な用量は、臨床的に許容されるレベルでウイルスの感染を防ぐ治療上有効な用量である。いくつかの実施形態において、治療上有効な用量は、ワクチンの添付文書に列挙される用量である。従来型ワクチンは、本明細書で使用されるとき、本発明のmRNAワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンには、生きた微生物のワクチン、死滅した微生物のワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、DNAワクチンなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、1log~10log増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、1log増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、2log増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、3log増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、5log増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、10log増加する。
本発明の他の態様において、VZVに対する対象の免疫応答を誘発する方法が提供される。方法は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含むVZV RNAワクチンを対象に投与することを伴い、これにより、当該対象において、VZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象における免疫応答は、VZVに対する従来型ワクチンをRNAワクチンに対して2倍~100倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して2倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して3倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して4倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して5倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して10倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して50倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して100倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して10~1000倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをVZV RNAワクチンに対して100~1000倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
他の実施形態において、免疫応答は、対象における[タンパク質]抗体力価を決定することによって評価される。
他の態様において、本発明は、少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含むVZV RNAワクチンを対象に投与することによって、当該対象において、VZVに対する免疫応答を誘発する方法であり、これにより、当該対象において、VZV抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象における免疫応答は、VZVに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象において誘発される免疫応答と比較して2日~10週間早く誘導される。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、RNAワクチンに対して2倍~100倍の用量である予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、2日早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、3日早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、1週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、2週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、3週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、5週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、10週間早く誘導される。
第1の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するVZV RNAワクチンを対象に投与することによって、VZVに対する対象の免疫応答を誘発する方法であって、当該RNAポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、ワクチンにアジュバントが共配合または共投与されない。
広域スペクトルVZVワクチン
2種以上のVZV株に感染するリスクのある状況が想定される。RNA(例えば、mRNA)治療用ワクチンは、限定するものではないが、製造スピード、認められた地理的脅威に適合するようにワクチンを迅速に調整できる能力などを含むいくつかの因子により、混合ワクチン手法に特に適している。更に、当該ワクチンは、人体を利用して抗原性タンパク質を産生するので、より大きくより複雑な抗原性タンパク質の産生に適しており、これにより、ヒト対象における適切な折り畳み、表面発現、抗原提示などが可能となる。2種以上のVZV株から保護するために、第1のVZVの少なくとも1つの抗原性ポリペプチドタンパク質(またはその抗原性部分)をコードするRNAを含み、第2のVZVの少なくとも1つの抗原性ポリペプチドタンパク質(またはその抗原性部分)をコードするRNAを更に含む、混合ワクチンを投与することができる。RNA(mRNA)は、例えば、単一の脂質ナノ粒子(LNP)中に一緒に製剤化されてもよいし、共投与が予定されている別々のLNP中に製剤化されてもよい。
2種以上のVZV株に感染するリスクのある状況が想定される。RNA(例えば、mRNA)治療用ワクチンは、限定するものではないが、製造スピード、認められた地理的脅威に適合するようにワクチンを迅速に調整できる能力などを含むいくつかの因子により、混合ワクチン手法に特に適している。更に、当該ワクチンは、人体を利用して抗原性タンパク質を産生するので、より大きくより複雑な抗原性タンパク質の産生に適しており、これにより、ヒト対象における適切な折り畳み、表面発現、抗原提示などが可能となる。2種以上のVZV株から保護するために、第1のVZVの少なくとも1つの抗原性ポリペプチドタンパク質(またはその抗原性部分)をコードするRNAを含み、第2のVZVの少なくとも1つの抗原性ポリペプチドタンパク質(またはその抗原性部分)をコードするRNAを更に含む、混合ワクチンを投与することができる。RNA(mRNA)は、例えば、単一の脂質ナノ粒子(LNP)中に一緒に製剤化されてもよいし、共投与が予定されている別々のLNP中に製剤化されてもよい。
フラジェリンアジュバント
フラジェリンは、約500アミノ酸の単量体タンパク質であり、重合することにより、細菌の動きに関与する鞭毛を形成する。フラジェリンは、種々の有鞭毛型細菌(例えばSalmonella typhimurium)及び無鞭毛型細菌(Escherichia coliなど)によって発現されている。自然免疫系細胞(樹状細胞、マクロファージなど)によるフラジェリンの感知は、Toll様受容体5(TLR5)ならびにNod様受容体(NLR)Ipaf及びNaip5によって媒介される。TLR及びNLRは、自然免疫応答及び適応免疫応答を活性化する役割を担うことが特定されている。したがって、フラジェリンは、ワクチンにおいて、アジュバント効果をもたらす。
フラジェリンは、約500アミノ酸の単量体タンパク質であり、重合することにより、細菌の動きに関与する鞭毛を形成する。フラジェリンは、種々の有鞭毛型細菌(例えばSalmonella typhimurium)及び無鞭毛型細菌(Escherichia coliなど)によって発現されている。自然免疫系細胞(樹状細胞、マクロファージなど)によるフラジェリンの感知は、Toll様受容体5(TLR5)ならびにNod様受容体(NLR)Ipaf及びNaip5によって媒介される。TLR及びNLRは、自然免疫応答及び適応免疫応答を活性化する役割を担うことが特定されている。したがって、フラジェリンは、ワクチンにおいて、アジュバント効果をもたらす。
既知のフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列は、NCBI GenBankデータベースにおいて公開されている。なかでも、S.Typhimurium、H.Pylori、V.Cholera、S.marcesens、S.flexneri、T.Pallidum、L.pneumophila、B.burgdorferei、C.difficile、R.meliloti、A.tumefaciens、R.lupini、B.clarridgeiae、P.mirabilis、B.subtilus、L.monocytogenes、P.aeruginosa及びE.coliに由来するフラジェリン配列が知られている。
フラジェリンポリペプチドは、本明細書で使用されるとき、完全長フラジェリンタンパク質、その免疫原性断片、及びフラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも50%の配列同一性を有するペプチドを指す。例示的なフラジェリンタンパク質には、Salmonella typhi(UniProエントリー番号Q56086)、Salmonella typhimurium(A0A0C9DG09)、Salmonella enteritidis(A0A0C9BAB7)、及びSalmonella choleraesuis(Q6V2X8)ならびに配列番号115~117に由来するフラジェリンが挙げられる。いくつかの実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、フラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して、少なくとも60%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%または99%配列の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を惹起するフラジェリンタンパク質の一部である。いくつかの実施形態において、免疫応答は、TLR5免疫応答である。免疫原性断片の一例は、ヒンジ領域の全てまたは一部が欠失しているか、他のアミノ酸で置き換えられているフラジェリンタンパク質である。例えば、抗原性ポリペプチドは、ヒンジ領域に挿入され得る。ヒンジ領域は、フラジェリンの超可変領域である。フラジェリンのヒンジ領域は、「D3ドメインまたはD3領域」、「プロペラドメインまたはプロペラ領域」、「超可変ドメインまたは超可変領域」及び「可変ドメインまたは領可変域」とも呼ばれる。「ヒンジ領域の少なくとも一部」は、本明細書で使用されるとき、フラジェリンのヒンジ領域の任意の部分またはヒンジ領域全体を指す。他の実施形態において、フラジェリンの免疫原性断片は、フラジェリンの20、25、30、35または40アミノ酸C末端断片である。
フラジェリン単量体は、ドメインD0~D3によって形成される。ステムを形成するD0及びD1は、縦に並んだ長いアルファヘリックスから構成され、種々の細菌間で高度に保存されている。D1ドメインは、TLR5活性化に有用ないくつかのアミノ酸ストレッチを含む。D1ドメイン全体または当該ドメイン内の活性領域のうちの1つ以上がフラジェリンの免疫原性断片である。D1ドメイン内の免疫原性領域の例には、Salmonella typhimurium FliCフラジェリンの残基88~114及び残基411~431が挙げられる。88~100領域の13アミノ酸のうち、SalmonellaフラジェリンとTLR5活性化を保持したままの他のフラジェリンタンパク質との間で少なくとも6置換が可能である。したがって、フラジェリンの免疫原性断片は、TLR5を活性化し、SalmonellaのFliCの88~100の配列(LQRVRELAVQSAN、配列番号118)に対して53%以上同一である13アミノ酸モチーフを含有する、フラジェリン様配列を含む。
いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、フラジェリンと1つ以上の抗原性ポリペプチドの融合タンパク質をコードするRNAを含む。本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、構築物の2つの構成要素の連結を指す。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドのカルボキシ末端がフラジェリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態において、抗原性ポリペプチドのアミノ末端がフラジェリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質は、例えば、1,2、3、4、5、6個またはそれ以上の抗原性ポリペプチドに連結した1、2、3、4、5、6個またはそれ以上のフラジェリンポリペプチドを含み得る。2つ以上のフラジェリンポリペプチド及び/または2つ以上の抗原性ポリペプチドが連結される場合、そのような構築物は、「多量体」と呼ばれることがある。
融合タンパク質の各構成要素は、互いに直接連結されてもよいし、リンカーを介して接続されてもよい。例えば、リンカーは、アミノ酸リンカーであってよい。RNA(例えば、mRNA)ワクチンによってコードされる、融合タンパク質の構成要素を連結するためのアミノ酸リンカーは、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基及びアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも1つの要素を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、1~30、1~25、1~25、5~10、5、15または5~20アミノ酸長である。
他の実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、少なくとも2つの個別のRNAポリヌクレオチドを含み、一方は1つ以上の抗原性ポリペプチドをコードし、他方はフラジェリンポリペプチドをコードする。少なくとも2つのRNAポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子などの担体中に一緒に製剤化され得る。
治療及び予防組成物
例えば、ヒト及び他の動物におけるVZVの予防、治療及び/または診断のための組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。これは、感染症の予防及び/または治療のための薬剤として使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明のVZVワクチンは、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用が想定され得、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)をex vivoで活性化させた後、対象に注入(再注入)する。
例えば、ヒト及び他の動物におけるVZVの予防、治療及び/または診断のための組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。これは、感染症の予防及び/または治療のための薬剤として使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明のVZVワクチンは、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用が想定され得、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)をex vivoで活性化させた後、対象に注入(再注入)する。
例示的な実施形態において、本明細書に記載されるRNAポリヌクレオチドを含有するVZVワクチンは、対象(例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象)に投与することができ、RNAポリヌクレオチドは、in vivoで翻訳されて抗原性ポリペプチドを産生する。
VZV RNAワクチンは、細胞、組織または生物において、ポリペプチド(例えば、抗原または免疫原)の翻訳を誘導し得る。例示的な実施形態において、かかる翻訳は、in vivoで生じるが、かかる翻訳がex vivo、培地またはin vitroで生じる実施形態も想定され得る。例示的な実施形態において、細胞、組織または生物を、抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも1つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含有するVZV RNAワクチンを含有する組成物の有効量と接触させる。
VZV RNAワクチンの「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性(例えば、大きさ及び修飾ヌクレオシドの程度)及びVZV RNAワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子に基づいて提供される。一般に、VZV RNAワクチン組成物の有効量は、細胞中の抗原産生に相関して誘導されたまたはブーストされた免疫応答をもたらす。一般に、少なくとも1つの化学修飾を有するRNAポリヌクレオチドを含有するVZV RNAワクチンの有効量は、好ましくは、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする同様の非修飾型ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも有効である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加(RNAワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ)、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の低下(例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳期間の延長によって示される)、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって示され得る。
「医薬組成物」という用語は、有効物質と不活性または活性担体との組み合わせを指し、これにより、組成物は、in vivoまたはex vivoにおける診断用途または治療用途に特に適したものになる。「薬学的に許容される担体」は、対象への投与後または投与時に、望ましくない生理学的作用を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、有効成分と適合性があり、有効成分を安定化することが可能であるという意味においても「許容される」ものでなければならない。有効物質の送達のための薬学的担体として1つ以上の可溶化剤を利用することができる。薬学的に許容される担体の例には、剤形として使用可能な組成物を達成する、生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤及び希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。更なる好適な薬学的担体及び希釈剤ならびにその使用のための薬学的必要物は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
いくつかの実施形態において、本開示によるRNAワクチン(ポリヌクレオチド及びそのコードされるポリペプチドを含む)は、VZVの治療または予防のために使用することができる。
VZV RNAワクチンは、能動免疫スキームの一環として健康な個体に対して、または潜伏期間中もしくは発症後の活動性感染中の感染初期に、予防的または治療的に投与することができる。いくつかの実施形態において、細胞、組織または対象に提供される本開示のRNAワクチンの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、他の予防化合物または治療化合物とともに投与することができる。非限定的な例として、予防化合物または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであり得る。ワクチンなどの予防組成物に関して本明細書で使用されるとき、「ブースター」という用語は、予防(ワクチン)組成物の追加投与を指す。ブースター(またはブースターワクチン)は、予防組成物の先の投与後に投与され得る。予防組成物の初回投与からブースター投与までの時間は、限定するものではないが、1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、15分、20分35分、40分、45分、50分、55分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、1日、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、1週、10日、2週、3週、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、18ヶ月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年または99年超であり得る。例示的な実施形態において、予防組成物の初回投与からブースター投与までの時間は、限定するものではないが、1週、2週、3週、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月または1年であり得る。
いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、当該技術分野において知られている不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、鼻腔内または皮内に投与することができる。
VZV RNAワクチンは、感染症の罹患率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な環境で利用することができる。非限定的な例として、RNAワクチンは、種々の感染症を治療及び/または予防するために利用することができる。RNAワクチンは、一般に利用可能な抗ウイルスと比べて、抗体力価がより大きく、早い応答をもたらす点で、優れた特性を有する。
VZV RNAワクチン及びRNAワクチン組成物ならびに/または複合体を、任意選択により、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物が本明細書で提供される。
VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、単独で、または1つ以上の他の構成成分とともに、製剤化または投与することができる。例えば、VZV RNAワクチン(ワクチン組成物)は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、アジュバントを含まない(アジュバントフリーである)。
VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、製剤化または投与することができる。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、少なくとも1つの追加の有効物質、例えば、治療上有効な物質、予防上有効な物質または両方の組み合わせなどを含む。ワクチン組成物は、無菌でも、パイロジェンフリーでも、無菌とパイロジェンフリーの両方であってもよい。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び/または製造において一般的に検討すべき項目は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(その全体を参照により本明細書に援用する)に認めることができる。
いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的上、「有効成分」という文言は、一般に、その中に含有されるRNAワクチンまたはポリヌクレオチド、例えば、抗原性ポリペプチドをコードするRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチド)を指す。
本明細書に記載されるワクチン組成物の製剤は、薬理学分野で知られているまたはこれ以後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製法は、有効成分(例えば、mRNAポリヌクレオチド)と、賦形剤及び/または1つ以上の他の副成分とを一緒にするステップと、次いで、必要であり、かつ/または望ましい場合には、製品を所望の単回または複数回用量単位に分割、成形及び/または包装するステップとを含む。
本開示による医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤及び/または任意追加の成分の相対量は、治療を受ける対象の特性、体格及び/または状態に応じて、更には、組成物が投与される経路に応じて、変動し得る。例として、組成物は、0.1%~100%、例えば、0.5~50%、1~30%、5~80%、少なくとも80%(w/w)の有効成分を含み得る。
VZV RNAワクチンは、(1)安定性を高め、(2)細胞トランスフェクションを増加させ、(3)(例えば、デポ製剤からの)持続放出もしくは遅延放出を可能にし、(4)体内分布を変え(例えば、特定の組織または細胞型への標的化)、(5)コードされたタンパク質のin vivoでの翻訳を増加させ、かつ/または(6)コードされたタンパク質(抗原)のin vivoでの放出プロファイルを変える、1つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。賦形剤には、従来の賦形剤、例えば、溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤のいずれか及び全てに加えて、限定するものではないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェル型ナノ粒子、ペプチド、タンパク質、VZV RNAワクチンがトランスフェクトされた細胞(例えば、対象への移植用)、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体及びこれらの組み合わせが含まれ得る。
安定化要素
真核生物の天然mRNA分子は、5’キャップ構造または3’ポリ(A)テールなどの他の構造的特徴に加えて、安定化要素、例えば、限定するものではないが、その5’端にある非翻訳領域(UTR)(5’UTR)及び/またはその3’端にあるUTR(3’UTR)を含有することがわかっている。5’UTR及び3’UTRはいずれも、典型的に、ゲノムDNAから転写されるものであり、未成熟mRNAの要素である。5’キャップ及び3’ポリ(A)テールなどの成熟mRNAの特徴的な構造特徴は、通常、mRNAプロセシング中に、転写された(未成熟)mRNAに付加される。3’ポリ(A)テールは、典型的に、転写されたmRNAの3’端に付加される一続きのアデニンヌクレオチドであり、最大約400個のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、3’ポリ(A)テールの長さは、個々のmRNAの安定性に関して必須の要素であり得る。
真核生物の天然mRNA分子は、5’キャップ構造または3’ポリ(A)テールなどの他の構造的特徴に加えて、安定化要素、例えば、限定するものではないが、その5’端にある非翻訳領域(UTR)(5’UTR)及び/またはその3’端にあるUTR(3’UTR)を含有することがわかっている。5’UTR及び3’UTRはいずれも、典型的に、ゲノムDNAから転写されるものであり、未成熟mRNAの要素である。5’キャップ及び3’ポリ(A)テールなどの成熟mRNAの特徴的な構造特徴は、通常、mRNAプロセシング中に、転写された(未成熟)mRNAに付加される。3’ポリ(A)テールは、典型的に、転写されたmRNAの3’端に付加される一続きのアデニンヌクレオチドであり、最大約400個のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、3’ポリ(A)テールの長さは、個々のmRNAの安定性に関して必須の要素であり得る。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、1つ以上の安定化要素を含み得る。安定化要素には、例えば、ヒストンステムループが含まれ得る。32kDaのタンパク質であるステムループ結合タンパク質(SLBP)が特定されている。SLBPは、核と細胞質の両方において、ヒストンメッセージの3’端にあるヒストンステムループに会合する。その発現レベルは、細胞周期によって調節され、S期中にピークを迎え、そのときにヒストンmRNAレベルも上昇する。このタンパク質は、U7 snRNPによるヒストンpre-mRNAの効率的な3’端プロセシングに必要であることがわかっている。SLBPは、プロセシング後もステムループに会合し続け、次いで、細胞質中で、成熟ヒストンmRNAのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。SLBPのRNA結合ドメインは、後生動物及び原生動物にわたって保存されており、そのヒストンステムループへの結合は、ループ構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して、5’側の少なくとも3つのヌクレオチド及び3’側の2つのヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、コーディング領域、少なくとも1つのヒストンステムループ及び任意選択によりポリ(A)配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ(A)配列またはポリアデニル化シグナルは、一般に、コードされたタンパク質の発現レベルを向上させるものとされる。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態において、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質(例えば、ルシフェラーゼ、GFP、EGFP、β-ガラクトシダーゼ、EGFP)またはマーカーもしくは選択タンパク質(例えば、α-グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン:グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(GPT))ではない。
いくつかの実施形態において、ポリ(A)配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも1つのヒストンステムループの組み合わせは、この両方は、自然では代替的機構を示すが、相乗的に作用して、個々の要素のいずれかで観察されるレベルを超えてタンパク質発現を増加させる。ポリ(A)と少なくとも1つのヒストンステムループの組み合わせの相乗効果は、要素の順序またはポリ(A)配列の長さに依存しないことがわかっている。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、ヒストン下流要素(HDE)を含まない。「ヒストン下流要素」(HDE)は、天然ステムループの3’側に約15~20個のヌクレオチドのプリンリッチポリヌクレオチドストレッチを含み、これは、ヒストンpre-mRNAの成熟ヒストンmRNAへのプロセシングに関与するU7 snRNAの結合部位を表す。いくつかの実施形態において、核酸は、イントロンを含まない。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、エンハンサー配列及び/またはプロモーター配列を含有しても含有しなくてもよく、当該配列は、修飾されていても非修飾でもよく、活性化されていても不活性化されていてもよい。いくつかの実施形態において、ヒストンステムループは、通常、ヒストン遺伝子に由来し、当該構造のループを形成する、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた2つの隣接する部分的または完全に逆相補的な配列の分子内塩基対合を含む。不対合ループ領域は、典型的に、ステムループ要素のいずれとも塩基対合できない。これは、多くのRNA二次構造に重要な構成要素であるため、RNAでより頻繁に生ずるが、同様に一本鎖DNAにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、通常、対合領域の長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び塩基組成に依存する。いくつかの実施形態において、ゆらぎ塩基対合(非ワトソン-クリック塩基対合)が生じ得る。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのヒストンステムループ配列は、15~45の長さのヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、RNAワクチンは、1つ以上のAUリッチ配列が除去され得る。これらの配列は、AURESと呼ばれることもあり、3’UTR中に認められる不安定化配列である。AURESは、RNAワクチンから除去され得る。あるいは、AURESをRNAワクチン中に残してもよい。
ナノ粒子形成
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子と呼ばれる脂質-ポリカチオン複合体中に製剤化される。脂質ナノ粒子の形成は、当該技術分野において知られている方法及び/または米国特許出願公開第20120178702号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンには、カチオン性のペプチドまたはポリペプチドを挙げることができ、限定するものではないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び/またはポリアルギニンならびに国際公開第WO2012013326号または米国特許出願公開第US20130142818号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているカチオン性ペプチドなどがある。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、限定するものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などの非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中に製剤化される。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子と呼ばれる脂質-ポリカチオン複合体中に製剤化される。脂質ナノ粒子の形成は、当該技術分野において知られている方法及び/または米国特許出願公開第20120178702号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンには、カチオン性のペプチドまたはポリペプチドを挙げることができ、限定するものではないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び/またはポリアルギニンならびに国際公開第WO2012013326号または米国特許出願公開第US20130142818号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているカチオン性ペプチドなどがある。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、限定するものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などの非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中に製剤化される。
脂質ナノ粒子製剤は、限定するものではないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和の程度、PEG化の性質、全成分の比率、及び大きさなどの生物物理的パラメーターによる影響を受け得る。Semple et al.(Nature Biotech.2010 28:172-176、その全体を参照により本明細書に援用する)による一例では、脂質ナノ粒子製剤は、57.1%のカチオン性脂質、7.1%のジパルミトイルホスファチジルコリン、34.3%のコレステロール及び1.4%のPEG-c-DMAで構成される。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えると、siRNAが種々の抗原提示細胞により効率的に送達されることが示された(Basha et al.Mol Ther.2011 19:2186-2200、その全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、35~45%のカチオン性脂質、40%~50%のカチオン性脂質、50%~60%のカチオン性脂質及び/または55%~65%のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子の脂質とRNA(例えば、mRNA)の比は、5:1~20:1、10:1~25:1、15:1~30:1及び/または少なくとも30:1であってよい。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤におけるPEG比を増やしても減らしてもよく、かつ/またはPEG脂質の炭素鎖長をC14からC18に変更して脂質ナノ粒子製剤の薬物動態及び/もしくは体内分布を変えてもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、DSPC及びコレステロールと比較して、0.5%~3.0%、1.0%~3.5%、1.5%~4.0%、2.0%~4.5%、2.5%~5.0%及び/または3.0%~6.0%の脂質モル比のPEG-c-DOMG(R-3-[(ω-メトキシ-ポリ(エチレングリコール)2000)カルバモイル)]-1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-アミン)(本明細書においてPEG-DOMGとも呼ばれる)を含有し得る。いくつかの実施形態において、PEG-c-DOMGは、限定するものではないが、PEG-DSG(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)、PEG-DMG(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール)及び/またはPEG-DPG(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)などのPEG脂質で置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、限定するものではないが、DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200及びDLin-KC2-DMAなどの当該技術分野において知られている任意の脂質から選択することができる。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン製剤は、少なくとも1つの脂質を含むナノ粒子である。脂質は、限定するものではないが、DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、(12Z,15Z)-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミン(L608)、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘプタデカン-8-アミン(L530)、PEG化脂質及びアミノアルコール脂質から選択することができる。
いくつかの実施形態において、脂質は、
である。
いくつかの実施形態において、脂質は、
(L530)である。
いくつかの実施形態において、脂質は、限定するものではないが、DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、米国特許出願公開第US20130150625号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている脂質であってもよく、かつ/または当該特許出願公開に記載されている方法によって作製されてもよい。非限定的な例として、カチオン性脂質は、2-アミノ-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-2-{[(9Z,2Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}プロパン-1-オール(US20130150625の化合物1)、2-アミノ-3-[(9Z)-オクタデカ-9-エン-1-イルオキシ]-2-{[(9Z)-オクタデカ-9-エン-1-イルオキシ]メチル}プロパン-1-オール(US20130150625の化合物2)、2-アミノ-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-2-[(オクチルオキシ)メチル]プロパン-1-オール(US20130150625の化合物3)、及び2-(ジメチルアミノ)-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-2-{[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}プロパン-1-オール(US20130150625の化合物4)、またはこれらの任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であってよい。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的に、脂質、特に、イオン性カチオン性脂質、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)またはジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)を含み、中性脂質のステロール及び粒子の凝集を減少させることができる分子、例えばPEG脂質またはPEG修飾脂質を更に含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、(i)2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される少なくとも1つの脂質と、(ii)DSPC、DPPC、POPC、DOPE及びSMから選択される中性脂質と、(iii)ステロール、例えば、コレステロールと、(iv)PEG-脂質、例えば、PEG-DMGまたはPEG-cDMAとから、カチオン性脂質20~60%:中性脂質5~25%:ステロール25~55%:PEG脂質0.5~15%のモル比で、本質的に構成される。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択されるカチオン性脂質を、モル基準で25%~75%、例えば、モル基準で35~65%、45~65%、60%、57.5%、50%または40%含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で0.5%~15%、例えば、モル基準で3~12%、5~10%または15%、10%もしくは7.5%の中性脂質を含む。中性脂質の例には、限定するものではないが、DSPC、POPC、DPPC、DOPE及びSMが挙げられる。いくつかの実施形態において、製剤は、モル基準で5%~50%(例えば、モル基準で15~45%、20~40%、40%、38.5%、35%または31%)のステロールを含む。ステロールの非限定的な例は、コレステロールである。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で0.5%~20%(例えば、モル基準で0.5~10%、0.5~5%、1.5%、0.5%、1.5%、3.5%または5%のPEG脂質またはPEG修飾脂質を含む。いくつかの実施形態において、PEG脂質またはPEG修飾脂質は、平均分子量が2,000DaのPEG分子を含む。いくつかの実施形態において、PEG脂質またはPEG修飾脂質は、平均分子量が2,000未満、例えば、約1,500Da、約1,000Daまたは約500DaのPEG分子を含む。PEG修飾脂質の非限定的な例は、PEG-ジステアロイルグリセロール(PEG-DMG)(本明細書においてPEG-C14またはC14-PEGとも呼ばれる)及びPEG-cDMAが挙げられる(Reyes et al.J.Controlled Release,107,276-287(2005)において更に考察されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される25~75%のカチオン性脂質と、0.5~15%の中性脂質と、5~50%のステロールと、0.5~20%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される35~65%のカチオン性脂質と、3~12%の中性脂質と、15~45%のステロールと、0.5~10%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される45~65%のカチオン性脂質と、5~10%の中性脂質と、25~40%のステロールと、0.5~10%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される60%のカチオン性脂質と、7.5%の中性脂質と、31%のステロールと、1.5%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される50%のカチオン性脂質と、10%の中性脂質と、38.5%のステロールと、1.5%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される50%のカチオン性脂質と、10%の中性脂質と、35%のステロールと、4.5%または5%のPEG脂質またはPEG修飾脂質と、0.5%の標的化脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される40%のカチオン性脂質と、15%の中性脂質と、40%のステロールと、5%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される57.2%のカチオン性脂質と、7.1%の中性脂質と、34.3%のステロールと、1.4%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、PEG脂質、PEG-cDMA(PEG-cDMAは、Reyes et al.(J.Controlled Release,107,276-287(2005)において更に考察されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する)から選択される57.5%のカチオン性脂質と、7.5%の中性脂質と、31.5%のステロールと、3.5%のPEG脂質またはPEG修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質20~70%:中性脂質5~45%:コレステロール20~55%:PEG修飾脂質0.5~15%のモル比の脂質混合物から本質的に構成される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質20~60%:中性脂質5~25%:コレステロール25~55%:PEG修飾脂質0.5~15%のモル比の脂質混合物から本質的に構成される。
いくつかの実施形態において、脂質モル比は、50/10/38.5/1.5(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DMG、PEG-DSGまたはPEG-DPG))、57.2/7.1134.3/1.4(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDPPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-cDMA))、40/15/40/5(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DMG))、50/10/35/4.5/0.5(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DSG))、50/10/35/5(カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DMG))、40/10/40/10(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DMGまたはPEG-cDMA))、35/15/40/10(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DMGまたはPEG-cDMA))、または52/13/30/5(mol% カチオン性脂質/中性脂質(例えばDSPC)/Chol/PEG修飾脂質(例えばPEG-DMGまたはPEG-cDMA)である。
脂質ナノ粒子組成物及びその作製方法の非限定的な例は、例えば、Semple et al.(2010)Nat.Biotechnol.28:172-176;Jayarama et al.(2012),Angew.Chem.Int.Ed.,51:8529-8533、及びMaier et al.(2013)Molecular Therapy 21,1570-1578(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質と、PEG脂質と、構造的脂質とを含み得、任意選択により、非カチオン性脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、40~60%のカチオン性脂質と、5~15%の非カチオン性脂質と、1~2%のPEG脂質と、30~50%の構造的脂質とを含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質50%と、非カチオン性脂質10%と、PEG脂質1.5%と、構造的脂質38.5%とを含み得る。更に別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質55%と、非カチオン性脂質10%と、PEG脂質2.5%と、構造的脂質32.5%とを含み得る。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、限定するものではないが、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA及びL319などの本明細書に記載される任意のカチオン性脂質であってよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤は、4成分脂質ナノ粒子であり得る。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、PEG脂質と、構造的脂質とを含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、40~60%のカチオン性脂質と、5~15%の非カチオン性脂質と、1~2%のPEG脂質と、30~50%の構造的脂質とを含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質50%と、非カチオン性脂質10%と、PEG脂質1.5%と、構造的脂質38.5%とを含み得る。更に別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質55%と、非カチオン性脂質10%と、PEG脂質2.5%と、構造的脂質32.5%とを含み得る。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、限定するものではないが、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA及びL319などの本明細書に記載される任意のカチオン性脂質であってよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、PEG脂質と、構造的脂質とを含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、50%のカチオン性脂質DLin-KC2-DMAと、10%の非カチオン性脂質DSPCと、1.5%のPEG脂質PEG-DOMGと、38.5%の構造的脂質コレステロールとを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、50%のカチオン性脂質DLin-MC3-DMAと、10%の非カチオン性脂質DSPCと、1.5%のPEG脂質PEG-DOMGと、38.5%の構造的脂質コレステロールとを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、50%のカチオン性脂質DLin-MC3-DMAと、10%の非カチオン性脂質DSPCと、1.5%のPEG脂質PEG-DMGと、38.5%の構造的脂質コレステロールとを含む。更に別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、55%のカチオン性脂質L319と、10%の非カチオン性脂質DSPCと、2.5%のPEG脂質PEG-DMGと、32.5%の構造的脂質コレステロールとを含む。
ワクチン組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤及び/または任意追加の成分の相対量は、治療を受ける対象が何であるか、体格及び/または状態に応じて、更には、組成物が投与される経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、0.1%~99%(w/w)の有効成分を含み得る。例として、組成物は、0.1%~100%、例えば、0.5~50%、1~30%、5~80%、少なくとも80%(w/w)の有効成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、RNAワクチン組成物は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含み得、MC3と、コレステロールと、DSPCと、PEG2000-DMGとを含む脂質ナノ粒子、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び注射用水中で製剤化される。非限定的な例として、組成物は、2.0mg/mLの薬剤物質(例えば、VZVをコードするポリヌクレオチド)と、21.8mg/mLのMC3と、10.1mg/mLのコレステロールと、5.4mg/mLのDSPCと、2.7mg/mLのPEG2000-DMGと、5.16mg/mLのクエン酸三ナトリウムと、71mg/mLのスクロースと、1.0mLの注射用水とを含む。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子(例えば、脂質ナノ粒子)は、10~500nm、20~400nm、30~300nm、40~200nmの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子(例えば、脂質ナノ粒子)は、50~150nm、50~200nm、80~100nmまたは80~200nmの平均直径を有する。
リポソーム、リポプレックス及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態において、RNAワクチン医薬組成物は、限定するものではないが、DiLa2リポソーム(Marina Biotech(Bothell,WA))、SMARTICLES(登録商標)(Marina Biotech(Bothell,WA))、中性DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)系リポソーム(例えば、卵巣癌のためのsiRNA送達(Landen et al.Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)、その全体を参照により本明細書に援用する)及びヒアルロナン被覆リポソーム(Quiet Therapeutics(Israel))などのリポソーム中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態において、RNAワクチン医薬組成物は、限定するものではないが、DiLa2リポソーム(Marina Biotech(Bothell,WA))、SMARTICLES(登録商標)(Marina Biotech(Bothell,WA))、中性DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)系リポソーム(例えば、卵巣癌のためのsiRNA送達(Landen et al.Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713)、その全体を参照により本明細書に援用する)及びヒアルロナン被覆リポソーム(Quiet Therapeutics(Israel))などのリポソーム中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、米国特許出願公開第US2012060293号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている凍結乾燥されたゲル相リポソーム組成物で製剤化され得る。
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含み得る。リン酸コンジュゲートは、in vivo循環時間を延長させ得、かつ/またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。本発明で使用されるリン酸コンジュゲートは、WO2013033438または米国特許出願公開第US20130196948号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製することができる。非限定的な例として、リン酸コンジュゲートは、国際公開第WO2013033438号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている式のうちのいずれか1つの化合物を挙げることができる。
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含み得る。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってよい。ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第20130059360号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている構造を有し得る。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第20130072709号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載の方法及び/またはセグメント化ポリマー試薬を使用して作製することができる。他の態様において、ポリマーコンジュゲートは、限定するものではないが、米国特許出願公開第US20130196948号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載のポリマーコンジュゲートなどのように、環部分を含むペンダント側鎖基を有し得る。
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含み得る。更に、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを抑制し得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質CD47から設計された「自己」ペプチド(例えば、Rodriguezら(Science 2013,339,971-975、その全体を参照により本明細書に援用する)によって記載された「自己」粒子)であってよい。Rodriguezらによって示されたように、自己ペプチドは、マクロファージが媒介するナノ粒子のクリアランスを遅延させ、ナノ粒子の送達を向上させた。他の態様において、コンジュゲートは、膜タンパク質CD47であってもよい(例えば、Rodriguez et al.Science 2013,339,971-975参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。Rodriguezらは、CD47が、「自己」ペプチドと同様に、スクランブルペプチド及びPEG被覆ナノ粒子と比較して、対象における循環粒子の比率を増大し得ることを示した。
いくつかの実施形態において、本発明のRNAワクチンは、対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含むナノ粒子中に製剤化される。コンジュゲートは、CD47膜であってもよいし、コンジュゲートは、先に記載された「自己」ペプチドなどの、CD47膜タンパク質に由来するものであってもよい。他の実施形態において、ナノ粒子は、PEGと、CD47のコンジュゲートまたはその誘導体とを含み得る。更に他の実施形態において、ナノ粒子は、上述の「自己」ペプチドと、膜タンパク質CD47の両方を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、「自己」ペプチド及び/またはCD47タンパク質は、本発明のRNAワクチンの送達のために、本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ビリオンにコンジュゲートされ得る。
他の実施形態において、RNAワクチン医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有し得るコンジュゲートとを含む。コンジュゲートの非限定的な例には、イオン性水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーが挙げられる。非限定的な例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物及び当該医薬組成物を送達するための方法は、米国特許出願公開第US20130184443号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と、RNAワクチンとを含む炭水化物ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物変性フィトグリコーゲンもしくはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸,フィトグリコーゲンβ-デキストリン、無水物変性フィトグリコーゲンβ-デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない(例えば、国際公開第WO2012109121号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーで被覆されてもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、限定するものではないが、PEGコーティング及び/または中性の表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆され得る。親水性コーティングは、限定するものではないが、RNAワクチンなどの大きなペイロードを含むナノ粒子を中枢神経系内に送達するのに役立ち得る。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及び当該ナノ粒子を作製する方法は、米国特許出願公開第US20130183244号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であり得る。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子の作製方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第US20130210991号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
他の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、迅速に排除される脂質ナノ粒子(reLNP)として知られる生分解性カチオン性脂質に置き換えることによって改善され得る。限定するものではないが、DLinDMA、DLin-KC2-DMA及びDLin-MC3-DMAなどのイオン性カチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿中及び組織中に蓄積することがわかっており、潜在的な毒性原になり得る。迅速に排除される脂質の迅速な代謝により、ラットにおける脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指数が1mg/kgの用量から10mg/kgの用量の大きさで改善し得る。酵素的に分解されるエステル結合を含めると、reLNP製剤の活性を維持したまま、カチオン性構成成分の分解及び代謝プロファイルが改善し得る。エステル結合は、脂質鎖中に内在してもよいし、脂質鎖の末端に終端で位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換えてもよい。
いくつかの実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
いくつかの実施形態において、免疫応答は、ナノ化学種、ポリマー及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって誘発され得る(米国特許出願公開第20120189700号及び国際公開第WO2012099805号、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
ポリマーは、ナノ化学種を封入し得、またはナノ化学種を部分的に封入し得る。免疫原は、組み換えタンパク質、修飾RNA及び/または本明細書に記載されるポリヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、ワクチン、限定するものではないが、病原体に対するワクチンなどにおける使用のために製剤化され得る。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを通過するように粒子の表面特性を操作して変更してもよい。粘液は、限定するものではないが、口腔(例えば、頬及び食道の膜ならびに扁桃腺組織)、眼、消化管(例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻、呼吸器(例えば、鼻、咽頭、気管及び気管支の膜)及び生殖器(例えば、膣、子宮頸部及び尿道の膜)などの粘膜組織に位置する。10~200nmよりも大きいナノ粒子は、薬剤封入効率が高く、幅広い薬物の持続的送達をもたらす能力において好ましいが、粘膜バリアに迅速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、連続的に、分泌され、排出され、廃棄または消化され、再利用されるので、捕捉された粒子の大部分は、数秒内または数時間内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で高密度に被覆された大きなポリマーナノ粒子(直径200nm~500nm)は、水中で拡散する同じ粒子よりもわずかに4~6倍遅く、粘液を通って拡散した(Lai et al.PNAS 2007 104(5):1482-487;Lai et al.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158-171、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。ナノ粒子の輸送は、通過速度ならびに/または蛍光顕微鏡法、例えば、限定するものではないが、光褪色後蛍光回復法(FRAP)及び高解像多重粒子追跡法(MPT)を使用して決定することができる。非限定的な例として、粘膜バリアを通過できる組成物は、米国特許第8,241,670号または国際公開第WO2013110028号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているように作製することができる。
粘液を通過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料(例えば、ポリマーコア)及び/またはポリマー-ビタミンコンジュゲート及び/またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ(スチレン)、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル及びポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性及び/または生体適合性であり得る。生体適合性ポリマーの非限定的な例は、国際公開第WO2013116804号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。ポリマー材料は、更に、照射されてもよい。非限定的な例として、ポリマー材料は、ガンマ照射され得る(例えば、国際公開第WO201282165号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。具体的なポリマーの非限定的な例には、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、エチレンビニルアセテートポリマー(EVA)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)(PLLGA)、ポリ(D,L-ラクチド)(PDLA)、ポリ(L-ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン-co-グリコリド)、ポリ(D,L-ラクチド-co-PEO-co-D,L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド-co-PPO-co-D,L-ラクチド)、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ-L-リジン(PLL)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ポリエチレングリコール、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ(エステルアミド)、ポリアミド、ポリ(エステルエーテル)、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリアルキレンオキシド(PEO)、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ(ビニルアセテート)、ポリビニルハライド、例えば、ポリ(ビニルクロリド)(PVC)、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン(PS)、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ(メチル(メタ)アクリレート)(PMMA)、ポリ(エチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ヘキシル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソデシル(メタ)アクリレート)、ポリ(ラウリル(メタ)アクリレート)、ポリ(フェニル(メタ)アクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)及びこれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド-co-カプロラクトン)、PEG-PLGA-PEGならびにトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ブロックコポリマー(国際公開第WO2013012476号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている分岐ポリエーテル-ポリアミドブロックコポリマーなど)及び(ポリ(エチレングリコール))-(ポリ(プロピレンオキシド))-(ポリ(エチレングリコール))トリブロックコポリマー(例えば、米国特許出願公開第20120121718号、米国特許出願公開第20100003337号及び米国特許第8,263,665号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)などのコポリマーで被覆され得、またはこれらと会合し得る。コポリマーは、GRAS(一般に安全と認められる)ポリマーであってよく、脂質ナノ粒子の形成は、新規の化学実体が生じないような方法で作製され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新規の化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液を迅速に通過することができる、ポロキサマー被覆PLGAナノ粒子を含み得る(Yang et al.Angew.Chem.Int.Ed.2011 50:25972600、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。ヒト粘液を通過することができるナノ粒子を生成するための非限定的な拡張可能な方法は、Xuらによって記載されている(例えば、J Control Release 2013,170(2):279-86参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
ポリマー-ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンEであってよい。コンジュゲートのビタミン部分は、限定するものではないが、ビタミンA、ビタミンE、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分または他の界面活性剤の疎水性構成成分(例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖)などの他の好適な構成成分で置換されてもよい。
いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチン医薬組成物は、限定するものではないが、DiLa2リポソーム(Marina Biotech(Bothell,WA))、SMARTICLES(登録商標)(Marina Biotech(Bothell,WA))、中性DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)系リポソーム(例えば、卵巣癌のためのsiRNA送達(Landen et al.Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708-1713、その全体を参照により本明細書に援用する))及びヒアルロナン被覆リポソーム(Quiet Therapeutics(Israel))などのリポソーム中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、米国特許出願公開第US2012060293号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている凍結乾燥されたゲル相リポソーム組成物で製剤化され得る。
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含み得る。リン酸コンジュゲートは、in vivo循環時間を延長させ得、かつ/またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。本発明で使用されるリン酸コンジュゲートは、WO2013033438または米国特許出願公開第20130196948号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製することができる。非限定的な例として、リン酸コンジュゲートは、国際公開第WO2013033438号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている式のうちのいずれか1つの化合物を挙げることができる。
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含み得る。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってよい。ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第20130059360号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている構造を有し得る。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第20130072709号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載の方法及び/またはセグメント化ポリマー試薬を使用して作製することができる。他の態様において、ポリマーコンジュゲートは、限定するものではないが、米国特許出願公開第US20130196948号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載のポリマーコンジュゲートなどのように、環部分を含むペンダント側鎖基を有し得る。
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含み得る。更に、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを抑制し得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質CD47から設計された「自己」ペプチド(例えば、Rodriguezら(Science 2013,339,971-975)、その全体を参照により本明細書に援用する)によって記載された「自己」粒子)であってよい。Rodriguezらによって示されたように、自己ペプチドは、マクロファージが媒介するナノ粒子のクリアランスを遅延させ、ナノ粒子の送達を向上させた。他の態様において、コンジュゲートは、膜タンパク質CD47であってもよい(例えば、Rodriguez et al.Science 2013,339,971-975参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。Rodriguezらは、CD47が、「自己」ペプチドと同様に、スクランブルペプチド及びPEG被覆ナノ粒子と比較して、対象における循環粒子の比率を増大し得ることを示した。
いくつかの実施形態において、本発明のRNAワクチンは、対象における本開示のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含むナノ粒子中に製剤化される。コンジュゲートは、CD47膜であってもよいし、コンジュゲートは、先に記載された「自己」ペプチドなどの、CD47膜タンパク質に由来するものであってもよい。他の態様において、ナノ粒子は、PEGと、CD47のコンジュゲートまたはその誘導体とを含み得る。更に他の態様において、ナノ粒子は、上述の「自己」ペプチドと、膜タンパク質CD47の両方を含んでもよい。
いくつかの態様において、「自己」ペプチド及び/またはCD47タンパク質は、本発明のRNAワクチンの送達のために、本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ビリオンにコンジュゲートされ得る。
他の実施形態において、RNAワクチン医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有し得るコンジュゲートとを含む。コンジュゲートの非限定的な例には、イオン性水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーが挙げられる。非限定的な例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物及び当該医薬組成物を送達するための方法は、米国特許出願公開第US20130184443号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と、RNA(例えば、mRNA)ワクチンとを含む炭水化物ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物変性フィトグリコーゲンもしくはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸,フィトグリコーゲンβ-デキストリン、または無水物変性フィトグリコーゲンβ-デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない(例えば、国際公開第WO2012109121号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーで被覆されてもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、限定するものではないが、PEGコーティング及び/または中性の表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆され得る。親水性コーティングは、限定するものではないが、RNAワクチンなどの大きなペイロードを含むナノ粒子を中枢神経系内に送達するのに役立ち得る。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及び当該ナノ粒子を作製する方法は、米国特許出願公開第US20130183244号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であり得る。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子の作製方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第US20130210991号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
他の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、迅速に排除される脂質ナノ粒子(reLNP)として知られる生分解性カチオン性脂質に置き換えることによって改善され得る。限定するものではないが、DLinDMA、DLin-KC2-DMA及びDLin-MC3-DMAなどのイオン性カチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿中及び組織中に蓄積することがわかっており、潜在的な毒性原になり得る。迅速に排除される脂質の迅速な代謝により、ラットにおける脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指数が1mg/kgの用量から10mg/kgの用量の大きさで改善し得る。酵素的に分解されるエステル結合を含めると、reLNP製剤の活性を維持したまま、カチオン性構成成分の分解及び代謝プロファイルが改善し得る。エステル結合は、脂質鎖中に内在してもよいし、脂質鎖の末端に終端で位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換えてもよい。
いくつかの実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
いくつかの実施形態において、免疫応答は、ナノ化学種、ポリマー及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって誘発され得る(米国特許出願公開第20120189700号及び国際公開第WO2012099805号、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
ポリマーは、ナノ化学種を封入し得、またはナノ化学種を部分的に封入し得る。免疫原は、組み換えタンパク質、修飾RNA及び/または本明細書に記載されるポリヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、ワクチン、限定するものではないが、病原体に対するワクチンなどにおける使用のために製剤化され得る。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを通過するように粒子の表面特性を操作して変更してもよい。粘液は、限定するものではないが、口腔(例えば、頬及び食道の膜ならびに扁桃腺組織)、眼、消化管(例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻、呼吸器(例えば、鼻、咽頭、気管及び気管支の膜)及び生殖器(例えば、膣、子宮頸部及び尿道の膜)などの粘膜組織に位置する。10~200nmよりも大きいナノ粒子は、薬剤封入効率が高く、幅広い薬物の持続的送達をもたらす能力において好ましいが、粘膜バリアに迅速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、連続的に、分泌され、排出され、廃棄または消化され、再利用されるので、捕捉された粒子の大部分は、数秒内または数時間内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で高密度に被覆された大きなポリマーナノ粒子(直径200nm~500nm)は、水中で拡散する同じ粒子よりもわずかに4~6倍遅く、粘液を通って拡散した(Lai et al.PNAS 2007 104(5):1482-487;Lai et al.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158-171、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。ナノ粒子の輸送は、通過速度ならびに/または蛍光顕微鏡法、例えば、限定するものではないが、光褪色後蛍光回復法(FRAP)及び高解像多重粒子追跡法(MPT)を使用して決定することができる。非限定的な例として、粘膜バリアを通過できる組成物は、米国特許第8,241,670号または国際公開第WO2013110028号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているように作製することができる。
粘液を通過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料(すなわち、ポリマーコア)及び/またはポリマー-ビタミンコンジュゲート及び/またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ(スチレン)、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル及びポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性及び/または生体適合性であり得る。生体適合性ポリマーの非限定的な例は、国際公開第WO2013116804号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。ポリマー材料は、更に、照射されてもよい。非限定的な例として、ポリマー材料は、ガンマ照射され得る(例えば、国際公開第WO201282165号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。具体的なポリマーの非限定的な例には、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、エチレンビニルアセテートポリマー(EVA)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)(PLLGA)、ポリ(D,L-ラクチド)(PDLA)、ポリ(L-ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン-co-グリコリド)、ポリ(D,L-ラクチド-co-PEO-co-D,L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド-co-PPO-co-D,L-ラクチド)、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ-L-リジン(PLL)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ポリエチレングリコール、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ(エステルアミド)、ポリアミド、ポリ(エステルエーテル)、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリアルキレンオキシド(PEO)、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ(エチレンテレフタレート)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ(ビニルアセテート)、ポリビニルハライド、例えば、ポリ(ビニルクロリド)(PVC)、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン(PS)、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ(メチル(メタ)アクリレート)(PMMA)、ポリ(エチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ヘキシル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソデシル(メタ)アクリレート)、ポリ(ラウリル(メタ)アクリレート)、ポリ(フェニル(メタ)アクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)及びこれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド-co-カプロラクトン)、PEG-PLGA-PEGならびにトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ブロックコポリマー(国際公開第WO2013012476号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている分岐ポリエーテル-ポリアミドブロックコポリマーなど)及び(ポリ(エチレングリコール))-(ポリ(プロピレンオキシド))-(ポリ(エチレングリコール))トリブロックコポリマー(例えば、米国特許出願公開第20120121718号及び米国特許出願公開第20100003337号ならびに米国特許第8,263,665号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)などのコポリマーで被覆され得、またはこれらと会合し得る。コポリマーは、GRAS(一般に安全と認められる)ポリマーであってよく、脂質ナノ粒子の形成は、新規の化学実体が生じないような方法で作製され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新規の化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液を迅速に通過することができる、ポロキサマー被覆PLGAナノ粒子を含み得る(Yang et al.Angew.Chem.Int.Ed.2011 50:25972600、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。ヒト粘液を通過することができるナノ粒子を生成するための非限定的な拡張可能な方法は、Xuらによって記載されている(例えば、J Control Release 2013,170(2):279-86参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
ポリマー-ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンEであってよい。コンジュゲートのビタミン部分は、限定するものではないが、ビタミンA、ビタミンE、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分または他の界面活性剤の疎水性構成成分(例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖)などの他の好適な構成成分で置換されてもよい。
粘液を通過するように操作された脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)、界面活性剤(例えば、例えばジメチルジオクタデシル-臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤)、糖または糖誘導体(例えば、シクロデキストリン)、核酸、ポリマー(例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー)、粘液溶解剤(例えば、N-アセチルシステイン、ムグワート、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アムブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ4ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン)及びrhDNaseを含む各種DNaseなどの表面改質剤を含み得る。表面改質剤は、粒子表面に埋め込むか、粒子表面にからませてもよいし、脂質ナノ粒子の表面上に配置してもよい(例えば、コーティング、吸着、共有結合または他のプロセスによって)(例えば、米国特許出願公開第20100215580号及び米国特許出願公開第20080166414号及びUS20130164343参照、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、粘液を通過する脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中に封入され得、かつ/または粒子の表面上に配置され得る。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に共有結合的に結合され得る。粘液を通過する脂質ナノ粒子製剤は、複数のナノ粒子を含み得る。更に、製剤は、粘液と相互作用し、かつ粘液を通過する脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増大させ得る粘膜付着を低減させる周辺粘液の構造特性及び/または付着性を変え得る粒子を含有してもよい。
他の実施形態において、粘液を通過する脂質ナノ粒子は、粘膜通過を向上させるコーティングを含む低張製剤であり得る。製剤は、送達される上皮に対して低張であり得る。
低張製剤の非限定的な例は、国際公開第WO2013110028号に認めることができ、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、粘膜バリアを通過する送達を向上させるために、RNAワクチン製剤は、低張液を含んでもよいし、低張液であってもよい。低張液は、限定するものではないが、粘液を通過する粒子などの粘液不活性粒子が膣上皮表面に到達できる速度を上げることが可能であることがわかった(例えば、Ensign et al.Biomaterials 2013,34(28):6922-9参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、限定するものではないが、Silence Therapeutics(London,United Kingdom)社のATUPLEX(商標)系、DACC系、DBTC系及び他のsiRNAリポプレックス技術、STEMGENT(登録商標)(Cambridge、MA)社のSTEMFECT(商標)、ならびにポリエチレンイミン(PEI)またはプロタミンに基づいた標的化及び非標的化核酸送達などのリポプレックスとして製剤化される(Aleku et al.Cancer Res.2008 68:9788-9798;Strumberg et al.Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78;Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222-1234;Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360-1370;Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334-344;Kaufmann et al.Microvasc Res 2010 80:286-293;Weide et al.J Immunother.2009 32:498-507;Weide et al.J Immunother.2008 31:180-188;Pascolo,Expert Opin.Biol.Ther.4:1285-1294;Fotin-Mleczek et al.,2011 J.Immunother.34:1-15;Song et al.,Nature Biotechnol.2005,23:709-717;Peer et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 6;104:4095-4100;deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、そのような製剤はまた、限定するものではないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞及び白血球を含む様々な細胞種をin vivoで受動的または能動的に指向するように、構築または組成変更され得る(Akinc et al.Mol Ther.2010 18:1357-1364;Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709-717;Judge et al.,J Clin Invest.2009 119:661-673;Kaufmann et al.,Microvasc Res 2010 80:286-293;Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222-1234;Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360-1370;Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334-344;Basha et al.,Mol.Ther.2011 19:2186-2200;Fenske and Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:25-44;Peer et al.,Science.2008 319:627-630;Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。製剤の肝細胞への受動的標的化の一例には、アポリポタンパク質Eに結合し、in vivoで当該製剤の肝細胞への結合及び取り込みを促進することが示されている、DLin-DMA、DLin-KC2-DMA及びDLin-MC3-DMA系脂質ナノ粒子製剤が挙げられる(Akinc et al.Mol Ther.2010 18:1357-1364、その全体を参照により本明細書に援用する)。製剤はまた、限定するものではないが、葉酸、トランスフェリン、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)及び抗体標的化アプローチによって例示されるように、その表面上に異なるリガンドを発現させることによって選択的に標的化され得る(Kolhatkar et al.,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197-206;Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388-1412;Yu et al.,Mol Membr Biol.2010 27:286-298;Patil et al.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1-61;Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714;Zhao et al.,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309-319;Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357-1364;Srinivasan et al.,Methods Mol Biol.2012 820:105-116;Ben-Arie et al.,Methods Mol Biol.2012 757:497-507;Peer 2010 J Control Release.20:63-68;Peer et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:4095-4100;Kim et al.,Methods Mol Biol.2011 721:339-353;Subramanya et al.,Mol Ther.2010 18:2028-2037;Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709-717;Peer et al.,Science.2008 319:627-630;Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127-1133、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、固形脂質ナノ粒子として製剤化される。固形脂質ナノ粒子(SLN)は、平均直径が1000nmまでの間である球形であり得る。SLNは、親油性分子を可溶化することができ、かつ界面活性剤及び/または乳化剤で安定化し得る固形脂質コアマトリックスを有する。他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質ポリマーナノ粒子であり得る(Zhang et al.,ACS Nano,2008,2(8),pp 1696-1702参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。非限定的な例として、SLNは、国際公開第WO2013105101号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているSLNであってもよい。別の非限定的な例として、SLNは、国際公開第WO2013105101号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法またはプロセスによって作製することができる。
当該製剤は、RNAワクチンによって細胞のトランスフェクションを増やし、かつ/またはコードされたタンパク質の翻訳を増やすことができ得るが、リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を利用して、ポリヌクレオチドが目的とするタンパク質産生の効率を改善することができる。かかる例の1つには、脂質封入を使用してポリプレックスプラスミドDNAの効果的な全身送達を可能にすることがある(Heyes et al.,Mol Ther.2007 15:713-720、その全体を参照により本明細書に援用する)。リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、制御放出及び/または標的化送達用に製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御放出」は、治療成果を達成する特定の放出パターンに一致する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、制御放出及び/または標的化送達のために、本明細書に記載され、かつ/または当該技術分野において知られている送達物質中に、封入され得る。本明細書で使用されるとき、「封入する」という用語は、閉じ込められること、取り囲むこと、または包み込むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関するとき、封入は、実質的なものであっても、完全なものであっても、部分的なものであってもよい。「実質的に封入された」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9超または99.999%超が送達物質内に閉じ込められ、取り囲まれ、または包み込まれることを意味する。「部分的な封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の10%未満、10、20、30、40、50以下が送達物質内に閉じ込められ、取り囲まれ、または包み込まれることを意味する。有利には、封入は、蛍光及び/または電子顕微鏡写真を使用して本発明の医薬組成物または化合物の漏出または活性を測定することによって決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99または99.99%超が送達物質中に封入される。
いくつかの実施形態において、制御放出製剤は、限定するものではないが、トリブロックコポリマーを含み得る。非限定的な例として、製剤は、2つの異なる種類のトリブロックコポリマーを含み得る(国際公開第WO2012131104号及び同第WO2012131106号、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)。
他の実施形態において、RNAワクチンは、脂質ナノ粒子中または迅速に排除される脂質ナノ粒子中に封入することができ、次いで、この脂質ナノ粒子または迅速に排除される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつ/または当該技術分野において知られているポリマー、ヒドロゲル及び/または外科用シーラント内に封入され得る。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲルまたは外科用シーラントは、PLGA、エチレンビニルアセテート(EVAc)、ポロキサマー、GELSITE(登録商標)(Nanotherapeutics,Inc.(Alachua,FL))、HYLENEX(登録商標)(Halozyme Therapeutics(San Diego CA))、フィブリノゲンポリマー(Ethicon Inc.(Cornelia,GA))、TISSELL(登録商標)(Baxter International,Inc(Deerfield,IL))、PEG系シーラント及びCOSEAL(登録商標)(Baxter International,Inc(Deerfield,IL))などの外科用シーラントであってよい。
他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、対象に注射されたときにゲルを形成し得る、当該技術分野において知られている任意のポリマー内に封入されてもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス内に封入されてもよい。
いくつかの実施形態において、制御放出及び/または標的化送達のためのRNAワクチン製剤はまた、少なくとも1つの制御放出コーティングを含み得る。制御放出コーティングには、OPADRY(登録商標)、ポリビニルピロリドン/ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、EUDRAGIT RL(登録商標)、EUDRAGIT RS(登録商標)、及びエチルセルロース水性分散体(AQUACOAT(登録商標)及びSURELEASE(登録商標))などのセルロース誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチン制御放出及び/または標的化送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも1つの分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルには、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リジン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、分解性ポリエステルは、PEG化ポリマーを形成するためのPEGコンジュゲートを含み得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むRNAワクチン制御放出及び/または標的化送達製剤は、米国特許第8,404,222号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている少なくとも1つのPEG及び/またはPEG関連ポリマー誘導体を含み得る。
他の実施形態において、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むRNAワクチン制御放出送達製剤は、米国特許出願公開第20130130348号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている制御放出ポリマー系であってよい。
いくつかの実施形態において、本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、治療用ナノ粒子中に封入され得、これは、本明細書において「治療用ナノ粒子RNAワクチン」と呼ばれる。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載される方法及び当該技術分野において知られている方法、例えば、限定するものではないが、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号、同第WO2010005721号、同第WO2010005723号、同第WO2012054923号、米国特許出願公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、同第US20100068285号、同第US20110274759号、同第US20100068286号、同第US20120288541号、同第US20130123351号及び同第US20130230567号、ならびに米国特許第8,206,747号、同第8,293,276号、同第8,318,208号及び同第8,318,211号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載の方法によって製剤化され得る。他の実施形態において、治療用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第US20120140790号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載の方法によって特定することができる。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子RNAワクチンは、持続放出用に製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたってある放出速度に従う、医薬組成物または化合物を指す。特定の期間には、時間、日、週、月、及び年が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出性ナノ粒子は、ポリマーと、限定するものではないが、本発明のポリヌクレオチドなどの治療薬とを含み得る(国際公開第2010075072号ならびに米国特許出願公開第US20100216804号、同第US20110217377号及び同第US20120201859号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。別の非限定的な例において、持続放出性製剤は、限定するものではないが、結晶、巨大分子ゲル及び/または微粒子懸濁液などの、持続的なバイオアベイラビリティを可能にする作用物質を含み得る(米国特許出願公開第US20130150295号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子RNAワクチンは、標的特異的になるように製剤化することができる。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る(国際公開第WO2011084518号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、国際公開第WO2008121949号、同第WO2010005726号、同第WO2010005725号、同第WO2011084521号及び米国特許出願公開第US20100069426号、同第US20120004293号及び同第US20100104655号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リジン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)またはこれらの組み合わせなどの2つ以上のポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含み得る。いくつかの実施形態において、ジブロックコポリマーは、PEGを、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リジン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)またはこれらの組み合わせなどのポリマーとの組み合わせで含み得る。更に他の実施形態において、ジブロックコポリマーは、国際公開第WO2013120052号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているものなどの高Xジブロックコポリマーであってよい。
非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、PLGA-PEGブロックコポリマーを含む(米国特許出願公開第US20120004293号及び米国特許第8,236,330号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。別の非限定的な例において、治療用ナノ粒子は、PEG及びPLAまたはPEG及びPLGAのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である(米国特許第8,246,968号及び国際公開第WO2012166923号参照、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)。更に別の非限定的な例において、治療用ナノ粒子は、米国特許出願公開第20130172406号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているステルスナノ粒子または標的特異型ステルスナノ粒子である。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、多元ブロックコポリマーを含み得る(例えば、米国特許第8,263,665号及び同第8,287,910号ならびに米国特許出願公開第20130195987号参照、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)。
更に別の非限定的な例において、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーPEG-PLGA-PEGを含む(例えば、Lee et al.“Thermosensitive Hydrogel as a TGF-β1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.” Pharmaceutical Research,2003 20(12):1995-2000においてTGF-β1遺伝子の送達ビヒクルとして使用され、Li et al.“Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel” Pharmaceutical Research 2003 20(6):884- 888;及びChang et al.,“Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.” J Controlled Release.2007 118:245-253において制御された遺伝子送達系として使用された、感熱性ヒドロゲル(PEG-PLGA-PEG)参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、PEG-PLGA-PEGブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、非ポリマーミセルとブロックコポリマーとを含むポリイオン複合体中に含まれていてもよい(例えば、米国特許出願公開第20120076836号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも1つのアクリルポリマーを含み得る。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリシアノアクリレート及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも1つのポリ(ビニルエステル)ポリマーを含み得る。ポリ(ビニルエステル)ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであってよい。非限定的な例として、ランダムコポリマーは、国際公開第WO2013032829号または米国特許出願公開第20130121954号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているものなどの構造を有し得る。いくつかの態様において、ポリ(ビニルエステル)ポリマーは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。他の態様において、本発明で使用することができるポリ(ビニルエステル)ポリマーは、本明細書に記載されるものであってよい。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも1つのジブロックコポリマーを含み得る。ジブロックコポリマーは、限定するものではないが、ポリ(乳)酸-ポリ(エチレン)グリコールコポリマーであってよい(例えば、国際公開第WO2013044219号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。非限定的な例として、治療用ナノ粒子を使用して癌を治療することができる(国際公開第WO2013044219号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつまたは当該技術分野において知られている、少なくとも1つのカチオン性ポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも1つのアミン含有ポリマー、限定するものではないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、ポリ(β-アミノエステル)(例えば、米国特許第8,287,849号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)及びこれらの組み合わせなどを含み得る。他の実施形態において、本明細書に記載されるナノ粒子は、国際公開第WO2013059496号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているものなどのアミンカチオン性脂質を含み得る。いくつかの態様において、カチオン性脂質は、アミノ-アミンまたはアミノ-アミド部分を有し得る。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも1つの分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルには、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リジン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、分解性ポリエステルは、PEG化ポリマーを形成するためのPEGコンジュゲートを含み得る。
他の実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも1つの標的化リガンドのコンジュゲートを含み得る。標的化リガンドは、当該技術分野において知られている任意のリガンド、限定するものではないが、モノクローナル抗体などであってよい(Kirpotin et al,Cancer Res.2006 66:6732-6740、その全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、水溶液に製剤化され得、これを使用して癌を標的にしてもよい(国際公開第WO2011084513号及び米国特許出願公開第20110294717号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子RNAワクチン(例えば、少なくとも1つのRNAワクチンを含む治療用ナノ粒子)は、米国特許第8,404,799号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)においてPodobinskiらが記載した方法を使用して製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、合成ナノ担体中に封入され、当該担体に結合し、かつ/または当該担体と会合し得る。合成ナノ担体には、国際公開第WO2010005740号、同第WO2012149454号及び同第WO2013019669号、ならびに米国特許出願公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号及び同第US20120244222号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。合成ナノ担体は、当該技術分野において知られている方法及び/または本明細書に記載される方法を使用して製剤化することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体は、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号及び同第WO201213501号、ならびに米国特許出願公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号及び同第US2012024422号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって製剤化することができる。他の実施形態において、合成ナノ担体の製剤は、国際公開第WO2011072218号及び米国特許第8,211,473号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法を使用して凍結乾燥され得る。更に他の実施形態において、限定するものではないが、合成ナノ担体を含む本発明の製剤は、米国特許出願公開第20130230568号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって凍結乾燥または再構成され得る。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを放出する反応基を含有し得る(国際公開第WO20120952552号及び米国特許出願公開第US20120171229号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達からの免疫応答を向上させる免疫活性化剤を含有し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のTh1系応答を向上させ得るTh1免疫活性化剤を含み得る(国際公開第WO2010123569号及び米国特許出願公開第20110223201号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、標的化放出用に製剤化され得る。いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、指定のpHで、かつ/または所望の時間間隔後にポリヌクレオチドを放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、RNAワクチンを24時間後、かつ/またはpH4.5で放出するように製剤化され得る(国際公開第WO2010138193号及び同第WO2010138194号ならびに米国特許出願公開第US20110020388号及び同第US20110027217号、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの制御放出及び/または持続放出用に製剤化され得る。非限定的な例として、持続放出用の合成ナノ担体は、当該技術分野において知られている方法、本明細書に記載される方法、ならびに/または国際公開第WO2010138192号及び米国特許出願公開第20100303850号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、制御放出及び/または持続放出用に製剤化され得、製剤は、結晶性側鎖(CYSC)ポリマーであるポリマーを少なくとも1つ含む。CYSCポリマーは、米国特許第8,399,007号に記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、ワクチンとして使用するために製剤化され得る。いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも1つの抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを封入し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、少なくとも1つの抗原とワクチン剤形のための賦形剤とを含み得る(国際公開第WO2011150264号及び米国特許出願公開第20110293723号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。別の非限定的な例として、ワクチン剤形は、同じ抗原または異なる抗原を含む少なくとも2つの合成ナノ担体と、賦形剤とを含み得る(国際公開第WO2011150249号及び米国特許出願公開第20110293701号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。ワクチン剤形は、本明細書に記載される方法、当該技術分野において知られている方法、ならびに/または国際公開第WO2011150258号及び米国特許出願公開第US20120027806号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって選択され得る。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも1つのアジュバントをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムホスフェートまたはジメチルジオクタデシルアンモニウムアセテート(DDA)、及びマイコバクテリウム総脂質抽出物の無極性分画または当該無極性分画の一部を含み得る(例えば、米国特許第8,241,610号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。他の実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも1つのポリヌクレオチドと、アジュバントとを含み得る。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、国際公開第WO2011150240号及び米国特許出願公開第US20110293700号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片または領域をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを封入し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体には、国際公開第WO2012024621号、同第WO201202629号、同第WO2012024632号ならびに米国特許出願公開第US20120064110号、同第US20120058153号及び同第US20120058154号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているナノ担体を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、体液性応答及び/または細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘起することが可能であり得るポリヌクレオチドに結合され得る(例えば、国際公開第WO2013019669号参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、双性イオン脂質中に封入され、当該脂質に結合し、かつ/または当該脂質と会合し得る。双性脂質及び双性脂質の使用方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第20130216607号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。いくつかの態様において、双性イオン脂質は、本明細書に記載されるリポソーム及び脂質ナノ粒子で使用することができる。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、米国特許出願公開第20130197100号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているコロイド状ナノ担体中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、経口投与用に最適化され得る。ナノ粒子は、限定するものではないが、キトサンまたはその誘導体などの少なくとも1つのカチオン性バイオポリマーを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開第20120282343号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、LNPは、脂質KL52を含む(米国特許出願公開第2012/0295832号に開示されているアミノ脂質、その全体を参照により本明細書に明示的に援用する)。LNP投与の活性及び/または安全性(ALT/AST、白血球数及びサイトカイン誘導の1つ以上を調べることによって決定される)は、かかる脂質を組み込むことによって改善され得る。KL52を含むLNPは、静脈内及び/または1用量以上で投与され得る。いくつかの実施形態において、KL52を含むLNPの投与は、MC3を含むLNPと比較して、同量または改善したmRNA及び/またはタンパク質発現をもたらす。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、更に小さなLNPを使用して送達されてもよい。そのような粒子は、直径が0.1μm未満から最大100nm、例えば、限定するものではないが、0.1μm未満、1.0μm未満、5μm未満、10μm未満、15μm未満、20μm未満、25μm未満、30μm未満、35μm未満、40μm未満、50μm未満、55μm未満、60μm未満、65μm未満、70μm未満、75μm未満、80μm未満、85μm未満、90μm未満、95μm未満、100μm未満、125μm未満、150μm未満、175μm未満、200μm未満、225μm未満、250μm未満、275μm未満、300μm未満、325μm未満、350μm未満、375μm未満、400μm未満、425μm未満、450μm未満、475μm未満、500μm未満、525μm未満、550μm未満、575μm未満、600μm未満、625μm未満、650μm未満、675μm未満、700μm未満、725μm未満、750μm未満、775μm未満、800μm未満、825μm未満、850μm未満、875μm未満、900μm未満、925μm未満、950μm未満または975μm未満であってよい。
他の実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、約1nm~約100nm、約1nm~約10nm、約1nm~約20nm、約1nm~約30nm、約1nm~約40nm、約1nm~約50nm、約1nm~約60nm、約1nm~約70nm、約1nm~約80nm、約1nm~約90nm、約5nm~約100nm、約5nm~約10nm、約5nm~約20nm、約5nm~約30nm、約5nm~約40nm、約5nm~約50nm、約5nm~約60nm、約5nm~約70nm、約5nm~約80nm、約5nm~約90nm、約10~約50nm、約20~約50nm、約30~約50nm、約40~約50nm、約20~約60nm、約30~約60nm、約40~約60nm、約20~約70nm、約30~約70nm、約40~約70nm、約50~約70nm、約60~約70nm、約20~約80nm、約30~約80nm、約40~約80nm、約50~約80nm、約60~約80nm、約20~約90nm、約30~約90nm、約40~約90nm、約50~約90nm、約60~約90nm及び/または約70~約90nmの直径であり得る、更に小さなLNPを使用して送達されてもよい。
いくつかの実施形態において、そのようなLNPは、マイクロ流体ミキサーを備える方法を使用して合成される。例示的なマイクロ流体ミキサーには、限定するものではないが、スリット型インターデジタルマイクロミキサーを挙げることができ、例えば、限定するものではないが、Microinnova(Allerheiligen bei Wildon,Austria))社製によるもの及び/またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)がある(Zhigaltsev,I.V.et al.,Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixingが公開されている(Langmuir.2012.28:3633-40;(Belliveau,N.M.et al.,Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.Molecular Therapy-Nucleic Acids.2012.1:e37;Chen,D.et al.,Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.J Am Chem Soc.2012.134(16):6948-51、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、SHMを備えるLNPの生成方法は、少なくとも2つの流入流れの混合を更に含み、この混合は、微細構造誘導型カオス的移流(MICA)によって生じる。この方法によれば、流体流れは、ヘリンボーンのパターンに存在する流路を通って流れ、回転流を引き起こし、流体が互いに折り重なる。この方法はまた、流体が循環している間に表面が方向性を変える、流体混合のための表面を含み得る。SHMを使用してLNPを生成する方法には、米国特許出願公開第2004/0262223号及び同第2012/0276209号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に明示的に援用する)に開示されているものが含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のRNAワクチンは、限定するものではないが、スリット型インターデジタル微細構造ミキサー(SIMM-V2)または標準スリット型インターデジタルマイクロミキサー(SSIMM)またはキャタピラー(CPMM)またはジェット衝突(IJMM)(Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH(Mainz Germany)社製)などのマイクロミキサーを使用して生成された脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、マイクロ流体技術を使用して生成された脂質ナノ粒子中に製剤化され得る(Whitesides,George M.The Origins and the Future of Microfluidics.Nature,2006 442:368-373;及びAbraham et al.Chaotic Mixer for Microchannels.Science,2002 295:647-651参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)。非限定的な例として、制御されたマイクロ流体製剤は、マイクロ流路内にある低いレイノルズ数の定常圧による駆動流の流れを混合する受動的方法を伴う(例えば、Abraham et al.Chaotic Mixer for Microchannels.Science,2002 295:647651参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、限定するものではないが、Harvard Apparatus(Holliston,MA)社製またはDolomite Microfluidics(Royston,UK)社製のものなどのマイクロミキサーチップを使用して生成された脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。マイクロミキサーチップを、スリット及び再結合メカニズムにより2つ以上の流体流れを迅速に混合するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、国際公開第WO2013063468号または米国特許第8,440,614号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている薬物封入マイクロスフェアを使用した送達用に製剤化され得る。マイクロスフェアは、国際公開第WO2013063468号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)または(VI)の化合物を含み得る。他の態様において、本発明のRNAワクチンを細胞に送達するには、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質(APPL)が有用である(国際公開第WO2013063468号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、約10~約100nm、例えば、限定するものではないが、約10~約20nm、約10~約30nm、約10~約40nm、約10~約50nm、約10~約60nm、約10~約70nm、約10~約80nm、約10~約90nm、約20~約30nm、約20~約40nm、約20~約50nm、約20~約60nm、約20~約70nm、約20~約80nm、約20~約90nm、約20~約100nm、約30~約40nm、約30~約50nm、約30~約60nm、約30~約70nm、約30~約80nm、約30~約90nm、約30~約100nm、約40~約50nm、約40~約60nm、約40~約70nm、約40~約80nm、約40~約90nm、約40~約100nm、約50~約60nm、約50~約70nm約50~約80nm、約50~約90nm、約50~約100nm、約60~約70nm、約60~約80nm、約60~約90nm、約60~約100nm、約70~約80nm、約70~約90nm、約70~約100nm、約80~約90nm、約80~約100nm及び/または約90~約100nmの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、約10~500nmの直径を有し得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、100nm超、150nm超、200nm超、250nm超、300nm超、350nm超、400nm超、450nm超、500nm超、550nm超、600nm超、650nm超、700nm超、750nm超、800nm超、850nm超、900nm超、950nmまたは1000nm超の直径を有し得る。
いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、国際公開第WO2013059922号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている限界寸法の脂質ナノ粒子であってよい。限界寸法の脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含み得、ここで、脂質二重層は、限定するものではないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、C8~C20の脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン及び1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(POPC)などのリン脂質を含み得る。他の態様において、限界寸法の脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG及びDSPE-PEGなどのポリエチレングリコール脂質を含み得る。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、国際公開第WO2013063530号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている送達方法を使用して、特定の場所に送達し、局在化させ、及び/または集中させてもよい。非限定的な例として、RNAワクチンを対象に送達する前に、それと同時に、またはその後に、空のポリマー粒子を対象に投与してもよい。空のポリマー粒子は、対象と接触すると、体積が変化し、対象内の特定の位置に、留まり、埋め込まれ、固定化され、または捕捉される。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、有効物質放出系中に製剤化され得る(例えば、米国特許出願公開第US20130102545号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。有効物質放出系は、1)触媒活性をもつ核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドインヒビター鎖に結合した少なくとも1つのナノ粒子と、2)治療上有効な物質(例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド)に結合した少なくとも1つの基質分子に結合した化合物とを含み得、ここで、治療上有効な物質は、触媒活性をもつ核酸による基質分子の切断によって放出される。
いくつかの実施形態において、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、非細胞性物質を含む内側コアと、細胞膜を含む外表面とを含むナノ粒子中に製剤化され得る。細胞膜は、細胞由来でもよいし、ウイルス由来の膜であってもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、国際公開第WO2013052167号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製することができる。別の非限定的な例として、本明細書に記載されるRNAワクチンを送達するために、国際公開第WO2013052167号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているナノ粒子を使用してもよい。
いくつかの実施形態において、RNAワクチンは、多孔性ナノ粒子に支持された脂質二重層(原細胞)中に製剤化され得る。原細胞については、国際公開第WO2013056132号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるRNAワクチンは、米国特許第8,420,123号及び同第8,518,963号ならびに欧州特許第EP2073848B1号(そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているポリマーナノ粒子中、またはこれらに記載されている方法によって作製されたポリマーナノ粒子中に製剤化され得る。非限定的な例として、米国特許第8,518,963号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているナノ粒子または当該特許に記載されている方法によって作製されたナノ粒子などのポリマーナノ粒子は、高いガラス転移温度を有し得る。別の非限定的な例として、経口製剤及び非経口製剤のためのポリマーナノ粒子は、欧州特許第EP2073848B1号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製され得る。
他の実施形態において、本明細書に記載されるRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、イメージングで使用されるナノ粒子中に製剤化され得る。ナノ粒子は、米国特許出願公開第20130129636号(その全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているものなどのリポソームナノ粒子であってよい。非限定的な例として、リポソームは、ガドリニウム(III)2-{4,7-ビス-カルボキシメチル-10-[(N,N-ジステアリルアミドメチル-N’-アミド-メチル]-1,4,7,10-テトラ-アザシクロドデカ-1-イル}-酢酸及び中性の完全に飽和したリン脂質成分を含み得る(例えば、米国特許出願公開第US20130129636号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
いくつかの実施形態において、本発明において使用することができるナノ粒子は、米国特許出願公開第20130130348号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって形成される。
本発明のナノ粒子は、限定するものではないが、欠乏すると貧血から神経管欠陥に及ぶ健康被害をもたらし得るものなどの栄養素を更に含み得る(例えば、国際公開第WO2013072929号に記載のナノ粒子参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。非限定的な例として、栄養素は、第一鉄塩、第二鉄塩または元素状の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミンまたは微量栄養素であってよい。
いくつかの実施形態において、本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、膨潤性ナノ粒子中に製剤化され得る。膨潤性ナノ粒子は、限定するものではないが、米国特許第8,440,231号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているものであってよい。非限定的な実施形態として、本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンを肺系統に送達するために、膨潤性ナノ粒子が使用され得る(例えば、米国特許第8,440,231号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。
本発明のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、限定するものではないが、米国特許第8,449,916号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されるものなどのポリ酸無水物ナノ粒子中に製剤化され得る。本発明のナノ粒子及びマイクロ粒子を幾何学的に操作して、マクロファージ応答及び/または免疫応答を制御してもよい。いくつかの態様において、幾何学的に操作された粒子は、限定するものではないが、肺送達などの標的化送達用の本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、様々な形状、大きさ及び/または表面電荷を有し得る(例えば、国際公開第WO2013082111号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する)。幾何学的に操作される粒子の他の物理的特徴には、限定するものではないが、窓形成、角度のあるアーム、非対称性及び表面粗さ、電荷が含まれ得、これにより、細胞と組織との相互作用を変えることができる。非限定的な例として、本発明のナノ粒子は、国際公開第WO2013082111号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、水溶性ナノ粒子、例えば、限定するものではないが、国際公開第WO2013090601号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されるものなどであってよい。ナノ粒子は、良好な水溶性を示すために、小型で双性イオンのリガンドを有する無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さな流体力学的直径(HD)、時間、pH及び塩濃度に対する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合を有し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第US20130172406号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって開発され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、限定するものではないが、米国特許出願公開第20130172406号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されているものなどのステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第20130172406号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製することができる。
他の実施形態において、ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。ポリマーマトリックスは、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートまたはこれらの組み合わせなどの2つ以上のポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、高密度の核酸層を有するナノ粒子-核酸ハイブリッド構造であってよい。非限定的な例として、ナノ粒子-核酸ハイブリッド構造は、米国特許出願公開第20130171646号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に記載されている方法によって作製することができる。ナノ粒子は、限定するものではないが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び/または当該技術分野において知られているポリヌクレオチドなどの核酸を含み得る。
本発明のナノ粒子の少なくとも1つは、コアナノ構造に埋め込まれ得、またはナノ構造内もしくはナノ構造上で少なくとも1つのペイロードを運搬もしくは会合することが可能である低密度の多孔性3D構造もしくはコーティングで被覆され得る。少なくとも1つのナノ粒子を含むナノ構造の非限定的な例は、国際公開第WO2013123523号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
ワクチン投与方法
VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、治療上有効な成果をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、皮内、筋肉内、鼻腔内及び/または皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。本開示は、それを必要とする対象にRNAワクチンを投与することを含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに変化し得る。VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、典型的に、投与の容易性及び用量の均一性のために単位剤形で製剤化される。しかしながら、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物の一日の総用量は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な用量レベル、予防上有効な用量レベル、適切なイメージング用量レベルは、治療対象の疾病及び疾病の重症度、採用される特定の化合物の活性、採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食生活、採用される特定の化合物の投与の時間、投与経路及び排泄速度、治療の継続期間、採用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野でよく知られている同様の因子を含む、種々の因子に依存し得る。
VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、治療上有効な成果をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、皮内、筋肉内、鼻腔内及び/または皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。本開示は、それを必要とする対象にRNAワクチンを投与することを含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに変化し得る。VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、典型的に、投与の容易性及び用量の均一性のために単位剤形で製剤化される。しかしながら、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物の一日の総用量は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な用量レベル、予防上有効な用量レベル、適切なイメージング用量レベルは、治療対象の疾病及び疾病の重症度、採用される特定の化合物の活性、採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食生活、採用される特定の化合物の投与の時間、投与経路及び排泄速度、治療の継続期間、採用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野でよく知られている同様の因子を含む、種々の因子に依存し得る。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、1日につき対象の体重1kg当たり、0.0001mg/kg~100mg/kg、0.001mg/kg~0.05mg/kg、0.005mg/kg~0.05mg/kg、0.001mg/kg~0.005mg/kg、0.05mg/kg~0.5mg/kg、0.01mg/kg~50mg/kg、0.1mg/kg~40mg/kg、0.5mg/kg~30mg/kg、0.01mg/kg~10mg/kg、0.1mg/kg~10mg/kgまたは1mg/kg~25mg/kgを送達するのに十分な用量レベルで、1日1回以上、週1回以上、月1回以上などで投与されて、所望の治療効果、診断効果、予防効果またはイメージング効果を得ることができる(例えば、国際公開第WO2013078199号に記載されている単位用量範囲を参照、その全体を参照により本明細書に援用する)。所望の用量は、1日3回、1日2回、1日1回、2日に1回、3日に1回、毎週、2週ごと、3週ごと、4週ごと、2ヶ月ごと、3ヶ月ごと、6ヶ月ごとなどに送達され得る。ある特定の実施形態において、所望の用量は、複数回投与(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14回またはそれ以上の投与)を用いて送達され得る。複数回投与が採用される場合、本明細書に記載されるものなどの分割投薬計画を使用してもよい。例示的な実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、0.0005mg/kg~0.01mg/kg、例えば、約0.0005mg/kg~約0.0075mg/kg、例えば、約0.0005mg/kg、約0.001mg/kg、約0.002mg/kg、約0.003mg/kg、約0.004mg/kgまたは約0.005mg/kgを送達するのに十分な用量レベルで投与され得る。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、0.025mg/kg~0.250mg/kg、0.025mg/kg~0.500mg/kg、0.025mg/kg~0.750mg/kgまたは0.025mg/kg~1.0mg/kgを送達するのに十分な用量レベルで、1回または2回(またはそれ以上)投与され得る。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mgもしくは1.0mgの総用量またはこれらの総用量を送達するのに十分な用量レベルで、2回(例えば、0日目及び7日目、0日目及び14日目、0日目及び21日目、0日目及び28日目、0日目及び60日目、0日目及び90日目、0日目及び120日目、0日目及び150日目、0日目及び180日目、0日目及び3ヶ月後、0日目及び6ヶ月後、0日目及び9ヶ月後、0日目及び12ヶ月後、0日目及び18ヶ月後、0日目及び2年後、0日目及び5年後または0日目及び10年後)投与され得る。より高い用量及びより低い用量ならびに投与頻度が本開示に包含される。例えば、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、3回または4回投与され得る。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物は、0.010mg、0.025mg、0.100mgもしくは0.400mgの総用量またはこれらの総用量を送達するのに十分な用量レベルで、2回(例えば、0日目及び7日目、0日目及び14日目、0日目及び21日目、0日目及び28日目、0日目及び60日目、0日目及び90日目、0日目及び120日目、0日目及び150日目、0日目及び180日目、0日目及び3ヶ月後、0日目及び6ヶ月後、0日目及び9ヶ月後、0日目及び12ヶ月後、0日目及び18ヶ月後、0日目及び2年後、0日目及び5年後または0日目及び10年後)投与され得る。
いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、対象へのワクチン接種に有効な量で、10μg/kg~400μg/kgの核酸ワクチンの単回用量が対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるRNAワクチンは、対象へのワクチン接種に有効な量で、10μg~400μgの核酸ワクチンの単回用量が対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、25~1000μgの単回用量(例えば、VZV抗原をコードするmRNAの単回用量)として、対象に投与される。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンは、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950または1000μgの単回用量として対象に投与される。例えば、VZV RNAワクチンは、25~100、25~500、50~100、50~500、50~1000、100~500、100~1000、250~500、250~1000または500~1000μgの単回用量として対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、25~1000μgのVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンに等しい2つの用量として対象に投与される。
本明細書に記載されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチン医薬組成物は、鼻腔内、気管内または注射可能(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内及び皮下)などの本明細書に記載される剤形に製剤化することができる。
VZV RNAワクチン製剤及び使用方法
本開示のいくつかの態様は、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの製剤を提供し、ここで、VZV RNAワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答(例えば、抗VZV抗原性ポリペプチドに特異的な抗体の産生)をもたらすのに有効な量で製剤化される。「有効量」は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの用量である。また、対象の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も本明細書で提供される。
本開示のいくつかの態様は、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの製剤を提供し、ここで、VZV RNAワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答(例えば、抗VZV抗原性ポリペプチドに特異的な抗体の産生)をもたらすのに有効な量で製剤化される。「有効量」は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの用量である。また、対象の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供されるVZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンを投与した対象において産生された抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価を測定することによって特徴付けられる。抗体力価は、対象内の抗体の量、例えば、特定の抗原(例えば、抗VZV抗原性ポリペプチド)または抗原のエピトープに特異的である抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的に、陽性結果をもたらす最大希釈の逆数で表される。例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)が、抗体力価を決定するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態において、抗体力価は、対象が感染したかどうかを評価し、または免疫付与が必要かどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態において、抗体力価は、自己免疫応答の強さを決定し、ブースター免疫が必要であるかを決定し、以前のワクチンが有効であったかを決定し、かつ最近または以前のあらゆる感染を特定するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンによって、対象において誘導された免疫応答の強さを決定するために使用される。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも1log増加する。例えば、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも1.5、少なくとも2、少なくとも2.5または少なくとも3log増加し得る。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、1、1.5、2、2.5または3log増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、1~3log増加する。例えば、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、1~1.5、1~2、1~2.5、1~3、1.5~2、1.5~2.5、1.5~3、2~2.5、2~3または2.5~3log増加し得る。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも2倍増加する。例えば、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍または少なくとも10倍増加し得る。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、2、3、4、5,6、7、8、9または10倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、2~10倍増加する。例えば、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照と比較して、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9または9~10倍増加し得る。
対照は、いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、弱毒化生VZVワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。弱毒化ワクチンは、毒性を低下させることによって作製された生存能力のある(生きた)ワクチンである。弱毒化されたウイルスは、改変されていない生きたウイルスと比較して、無害または低毒性になるように改変される。いくつかの実施形態において、対照は、VZV不活化ワクチンの投与を受けた対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの投与を受けた対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。組み換えタンパク質ワクチンは、典型的に、異種発現系(例えば、細菌または酵母)で産生されたタンパク質抗原または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、対照は、VZVウイルス様粒子(VLP)ワクチン(例えば、ウイルスカプシドタンパク質を含有するが、ウイルスゲノムを含まないので、子孫ウイルスを複製/産生することができない粒子)の投与を受けたことがある対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、融合前または融合後のFタンパク質を含むか、2つの組み合わせを含む、VLP VZVワクチンである。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して少ない用量である。本明細書で提供される「標準治療」は、医学的または心理学的治療ガイドラインを指し、全般的または特定的であり得る。「標準治療」は、科学的証拠及び所与の状態の治療に関わる医療専門家間の協力に基づいた適切な治療法を規定している。これは、ある特定のタイプの患者、疾病または臨床環境に対して医師/臨床医が従うべき診断及び治療プロセスである。「標準治療用量」は、本明細書に記載されるとき、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの用量であって、医師/臨床医または他の医療専門家が、VZVまたはVZV関連状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、VZVまたはVZV関連状態を治療または予防するために対象に投与する用量である。
いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンの有効量を投与した対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/2に減らした用量と同等の用量である。例えば、VZV RNAワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/3、少なくとも1/4、少なくとも1/5、少なくとも1/6、少なくとも1/7、少なくとも1/8、少なくとも1/9または少なくとも1/10に減らした用量と同等の用量であり得る。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも少なくとも1/100、少なくとも1/500または少なくとも1/1000に減らした用量と同等の用量である。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/50、1/100、1/250、1/500または1/1000に減らした用量と同等の用量である。いくつかの実施形態において、VZV RNAワクチンの有効量を投与した対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくはタンパク質VZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を1/2~1/1000(例えば、1/2~1/100、1/10~1/1000)に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチンの標準治療用量を1/2~1/1000、1/2~1/900、1/2~1/800、1/2~1/700、1/2~1/600、1/2~1/500、1/2~1/400、1/2~1/300、1/2~1/200、1/2~1/100、1/2~1/90、1/2~1/80、1/2~1/70、1/2~1/60、1/2~1/50、1/2~1/40、1/2~1/30、1/2~1/20、1/2~1/10、1/2~1/9、1/2~1/8、1/2~1/7、1/2~1/6、1/2~1/5、1/2~1/4、1/2~1/3、1/3~1/1000、1/3~1/900、1/3~1/800、1/3~1/700、1/3~1/600、1/3~1/500、1/3~1/400、1/3~1/300、1/3~1/200、1/3~1/100、1/3~1/90、1/3~1/80、1/3~1/70、1/3~1/60、1/3~1/50、1/3~1/40、1/3~1/30、1/3~1/20、1/3~1/10、1/3~1/9、1/3~1/8、1/3~1/7、1/3~1/6、1/3~1/5、1/3~1/4、1/4~1/1000、1/4~1/900、1/4~1/800、1/4~1/700、1/4~1/600、1/4~1/500、1/4~1/400、1/4~1/400、1/4~1/200、1/4~1/100、1/4~1/90、1/4~1/80、1/4~1/70、1/4~1/60、1/4~1/50、1/4~1/40、1/4~1/30、1/4~1/20、1/4~1/10、1/4~1/9、1/4~1/8、1/4~1/7、1/4~1/6、1/4~1/5、1/4~1/4、1/5~1/1000、1/5~1/900、1/5~1/800、1/5~1/700、1/5~1/600、1/5~1/500、1/5~1/400、1/5~1/300、1/5~1/200、1/5~1/100、1/5~1/90、1/5~1/80、1/5~1/70、1/5~1/60、1/5~1/50、1/5~1/40、1/5~1/30、1/5~1/20、1/5~1/10、1/5~1/9、1/5~1/8、1/5~1/7、1/5~1/6、1/6~1/1000、1/6~1/900、1/6~1/800、1/6~1/700、1/6~1/600、1/6~1/500、1/6~1/400、1/6~1/300、1/6~1/200、1/6~1/100、1/6~1/90、1/6~1/80、1/6~1/70、1/6~1/60、1/6~1/50、1/6~1/40、1/6~1/30、1/6~1/20、1/6~1/10、1/6~1/9、1/6~1/8、1/6~1/7、1/7~1/1000、1/7~1/900、1/7~1/800、1/7~1/700、1/7~1/600、1/7~1/500、1/7~1/400、1/7~1/300、1/7~1/200、1/7~1/100、1/7~1/90、1/7~1/80、1/7~1/70、1/7~1/60、1/7~1/50、1/7~1/40、1/7~1/30、1/7~1/20、1/7~1/10、1/7~1/9、1/7~1/8、1/8~1/1000、1/8~1/900、1/8~1/800、1/8~1/700、1/8~1/600、1/8~1/500、1/8~1/400、1/8~1/300、1/8~1/200、1/8~1/100、1/8~1/90、1/8~1/80、1/8~1/70、1/8~1/60、1/8~1/50、1/8~1/40、1/8~1/30、1/8~1/20、1/8~1/10、1/8~1/9、1/9~1/1000、1/9~1/900、1/9~1/800、1/9~1/700、1/9~1/600、1/9~1/500、1/9~1/400、1/9~1/300、1/9~1/200、1/9~1/100、1/9~1/90、1/9~1/80、1/9~1/70、1/9~1/60、1/9~1/50、1/9~1/40、1/9~1/30、1/9~1/20、1/9~1/10、1/10~1/1000、1/10~1/900、1/10~1/800、1/10~1/700、1/10~1/600、1/10~1/500、1/10~1/400、1/10~1/300、1/10~1/200、1/10~1/100、1/10~1/90、1/10~1/80、1/10~1/70、1/10~1/60、1/10~1/50、1/10~1/40、1/10~1/30、1/10~1/20、1/20~1/1000、1/20~1/900、1/20~1/800、1/20~1/700、1/20~1/600、1/20~1/500、1/20~1/400、1/20~1/300、1/20~1/200、1/20~1/100、1/20~1/90、1/20~1/80、1/20~1/70、1/20~1/60、1/20~1/50、1/20~1/40、1/20~1/30、1/30~1/1000、1/30~1/900、1/30~1/800、1/30~1/700、1/30~1/600、1/30~1/500、1/30~1/400、1/30~1/300、1/30~1/200、1/30~1/100、1/30~1/90、1/30~1/80、1/30~1/70、1/30~1/60、1/30~1/50、1/30~1/40、1/40~1/1000、1/40~1/900、1/40~1/800、1/40~1/700、1/40~1/600、1/40~1/500、1/40~1/400、1/40~1/300、1/40~1/200、1/40~1/100、1/40~1/90、1/40~1/80、1/40~1/70、1/40~1/60、1/40~1/50、1/50~1/1000、1/50~1/900、1/50~1/800、1/50~1/700、1/50~1/600、1/50~1/500、1/50~1/400、1/50~1/300、1/50~1/200、1/50~1/100、1/50~1/90、1/50~1/80、1/50~1/70、1/50~1/60、1/60~1/1000、1/60~1/900、1/60~1/800、1/60~1/700、1/60~1/600、1/60~1/500、1/60~1/400、1/60~1/300、1/60~1/200、1/60~1/100、1/60~1/90、1/60~1/80、1/60~1/70、1/70~1/1000、1/70~1/900、1/70~1/800、1/70~1/700、1/70~1/600、1/70~1/500、1/70~1/400、1/70~1/300、1/70~1/200、1/70~1/100、1/70~1/90、1/70~1/80、1/80~1/1000、1/80~1/900、1/80~1/800、1/80~1/700、1/80~1/600、1/80~1/500、1/80~1/400、1/80~1/300、1/80~1/200、1/80~1/100、1/80~1/90、1/90~1/1000、1/90~1/900、1/90~1/800、1/90~1/700、1/90~1/600、1/90~1/500、1/90~1/400、1/90~1/300、1/90~1/200、1/90~1/100、1/100~1/1000、1/100~1/900、1/100~1/800、1/100~1/700、1/100~1/600、1/100~1/500、1/100~1/400、1/100~1/300、1/100~1/200、1/200~1/1000、1/200~1/900、1/200~1/800、1/200~1/700、1/200~1/600、1/200~1/500、1/200~1/400、1/200~1/300、1/300~1/1000、1/300~1/900、1/300~1/800、1/300~1/700、1/300~1/600、1/300~1/500、1/300~1/400、1/400~1/1000、1/400~1/900、1/400~1/800、1/400~1/700、1/400~1/600、1/400~1/500、1/500~1/1000、1/500~1/900、1/500~1/800、1/500~1/700、1/500~1/600、1/600~1/1000、1/600~1/900、1/600~1/800、1/600~1/700、1/700~1/1000、1/700~1/900、1/700~1/800、1/800~1/1000、1/800~1/900または1/900~1/1000に減らした用量と同等の用量である。前述などのいくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えVZVタンパク質ワクチン標準治療用量を1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/110、1/120、1/130、1/140、1/150、1/160、1/170、1/1280、1/190、1/200、1/210、1/220、1/230、1/240、1/250、1/260、1/270、1/280、1/290、1/300、1/310、1/320、1/330、1/340、1/350、1/360、1/370、1/380、1/390、1/400、1/410、1/420、1/430、1/440、1/450、1/4360、1/470、1/480、1/490、1/500、1/510、1/520、1/530、1/540、1/550、1/560、1/5760、1/580、1/590、1/600、1/610、1/620、1/630、1/640、1/650、1/660、1/670、1/680、1/690、1/700、1/710、1/720、1/730、1/740、1/750、1/760、1/770、1/780、1/790、1/800、1/810、1/820、1/830、1/840、1/850、1/860、1/870、1/880、1/890、1/900、1/910、1/920、1/930、1/940、1/950、1/960、1/970、1/980、1/990または1/1000に減らした用量と同等(または少なくとも同等)の用量である。前述などのいくつかの実施形態において、対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたVZVタンパク質ワクチン、または弱毒化生VZVワクチンもしくは不活化VZVワクチン、またはVZV VLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗VZV抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、50~1000μgの総用量である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、50~1000、50~900、50~800、50~700、50~600、50~500、50~400、50~300、50~200、50~100、50~90、50~80、50~70、50~60、60~1000、60~900、60~800、60~700、60~600、60~500、60~400、60~300、60~200、60~100、60~90、60~80、60~70、70~1000、70~900、70~800、70~700、70~600、70~500、70~400、70~300、70~200、70~100、70~90、70~80、80~1000、80~900、80~800、80~700、80~600、80~500、80~400、80~300、80~200、80~100、80~90、90~1000、90~900、90~800、90~700、90~600、90~500、90~400、90~300、90~200、90~100、100~1000、100~900、100~800、100~700、100~600、100~500、100~400、100~300、100~200、200~1000、200~900、200~800、200~700、200~600、200~500、200~400、200~300、300~1000、300~900、300~800、300~700、300~600、300~500、300~400、400~1000、400~900、400~800、400~700、400~600、400~500、500~1000、500~900、500~800、500~700、500~600、600~1000、600~900、600~900、600~700、700~1000、700~900、700~800、800~1000、800~900または900~1000μgの総用量である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950または1000μgの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計2回投与される、25~500μgの用量である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、対象に合計2回投与される、25~500、25~400、25~300、25~200、25~100、25~50、50~500、50~400、50~300、50~200、50~100、100~500、100~400、100~300、100~200、150~500、150~400、150~300、150~200、200~500、200~400、200~300、250~500、250~400、250~300、300~500、300~400、350~500、350~400、400~500または450~500μgの用量である。いくつかの実施形態において、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンの有効量は、対象に合計2回投与される、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450または500μgの総用量である。
追加の実施形態
1.5’末端キャップと、少なくとも1つの水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含む、VZVワクチン。
1.5’末端キャップと、少なくとも1つの水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含む、VZVワクチン。
2.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号11によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
3.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号92によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
4.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号10によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
5.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号15によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
6.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号93によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
7.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号14によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
8.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号19によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
9.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号94によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
10.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号18によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
11.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号23によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
12.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号95によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
13.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号22によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
14.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号27によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
15.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号96によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
16.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号26によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
17.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号31によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
18.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号97によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
19.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号30によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
20.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号35によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
21.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号98によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
22.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号34によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
23.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号39によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
24.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号99によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
25.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
26.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号62によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
27.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号101によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
28.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落26または27に記載のワクチン。
29.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号66によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
30.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号102によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
31.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落30または31に記載のワクチン。
32.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号70によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
33.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号103によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
34.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落32または33に記載のワクチン。
35.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号74によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
36.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号104によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
37.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落35または36に記載のワクチン。
38.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号78によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
39.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号105によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
40.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落38または39に記載のワクチン。
41.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号82によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
42.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号106によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
43.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落41または42に記載のワクチン。
44.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号86によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
45.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号107または134によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
46.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落44または45に記載のワクチン。
47.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号90によって特定される配列によってコードされる、段落1に記載のワクチン。
48.当該少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号108によって特定される配列を含む、段落1に記載のワクチン。
49.当該少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、段落47または48に記載のワクチン。
50.当該5’末端キャップが、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpであるか、これを含む、段落1~49のいずれか1つに記載のワクチン。
51.当該オープンリーディングフレーム中のウラシルの100%が当該ウラシルの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、段落1~50のいずれか1つに記載のワクチン。
52.DLin-MC3-DMA、コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)及びポリエチレングリコール(PEG)2000-DMGを含む、脂質ナノ粒子中に製剤化される、段落1~51のいずれか1つに記載のワクチン。
53.当該脂質ナノ粒子が、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び水を更に含む、段落52に記載のワクチン。
54.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号92によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号92によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
55.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号93によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号93によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
56.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号94によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号94によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
57.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号95によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号95によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
58.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号96によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号96によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
59.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号97によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号97によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
60.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号98によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号98によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
61.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号99によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号99によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
62.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号101によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号101によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
63.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号102によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号102によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
64.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号103によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号103によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
65.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号104によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号104によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
66.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号105によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号105によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
67.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号106によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号106によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
68.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号107または134によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号107または134によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
69.5’末端キャップ7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpと、配列番号108によって特定される配列と、3’ポリAテールとを有する少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号108によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)ワクチン。
70.DLin-MC3-DMA、コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)及びポリエチレングリコール(PEG)2000-DMGを含む、脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項54~69のいずれか1つに記載のワクチン。
本発明は、その適用において、以下の説明に記載され、または図面に示される構築物の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践または実行することができる。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的としており、限定的なものとみなされるべきではない。本明細書における「including(含む)」、「comprising(含む)」または「having(有する)」、「containing(含有する)」、「involving(伴う)」及びこれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
実施例1:ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば,ポリヌクレオチド及び/またはその部分もしくは領域の製造は、「Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts」と題された国際公開第WO2014/152027号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に教示されている方法を利用して達成することができる。
本開示によれば,ポリヌクレオチド及び/またはその部分もしくは領域の製造は、「Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts」と題された国際公開第WO2014/152027号(その内容全体を参照により本明細書に援用する)に教示されている方法を利用して達成することができる。
精製方法には、国際公開第WO2014/152030号及び国際公開第WO2014/152031号(そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する)に教示されているものが含まれ得る。
ポリヌクレオチドの検知法及び特性評価法は、国際公開第WO2014/144039号(その全体を参照により本明細書に援用する)に教示されているように実施することができる。
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素シーケンシング、電荷分布解析、RNA不純物の検出または前述の2つ以上の任意の組み合わせを使用して達成することができる。「特徴付け」には、RNA転写産物の配列を決定すること、RNA転写産物の純度を決定すること、またはRNA転写産物の電荷不均一性を決定することが含まれる。そのような方法は、例えば、国際公開第WO2014/144711号及び国際公開第WO2014/144767号に教示されており、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する。
実施例2:キメラポリヌクレオチド合成
本開示によれば、三リン酸化学反応を使用して、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分を連結またはライゲートすることができる。例えば、100ヌクレオチド以下の第1の領域または部分は、5’リン酸及び末端3’desOHまたは遮断OHにより、化学的に合成される。領域が80ヌクレオチドよりも長い場合、ライゲーション用の2つの鎖として合成することができる。
本開示によれば、三リン酸化学反応を使用して、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分を連結またはライゲートすることができる。例えば、100ヌクレオチド以下の第1の領域または部分は、5’リン酸及び末端3’desOHまたは遮断OHにより、化学的に合成される。領域が80ヌクレオチドよりも長い場合、ライゲーション用の2つの鎖として合成することができる。
in vitro転写(IVT)を使用して第1の領域または部分を非位置的に改変された領域または部分として合成する場合、5’リン酸への変換と、それに続く3’末端キャッピングとが行われ得る。
一リン酸保護基は、当該技術分野において知られているもののいずれかから選択することができる。
キメラポリヌクレオチドの第2の領域または部分は、化学合成またはIVT方法のいずれかを使用して合成することができる。IVT方法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるRNAポリメラーゼを含み得る。あるいは、130ヌクレオチドまでのキャップを化学的に合成し、IVT領域またはIVT部分に連結してもよい。
ライゲーション法では、DNA T4リガーゼによるライゲーションと、それに続くDNAse処理により、コンカテマー化が容易に回避されるものである。
キメラポリヌクレオチド全体をリン酸-糖骨格で作製する必要はない。領域または部分のうちの1つがポリペプチドをコードする場合、かかる領域または部分は、リン酸-糖骨格を含み得る。
次に、任意の既知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク(solulink)または当業者に知られている他のバイオコンジュゲート化学反応を使用して、ライゲーションを行う。
合成経路
一連の出発セグメントを使用してキメラポリヌクレオチドを作製することができる。かかるセグメントには、
(a)通常の3’OHを含む、キャップ及び保護された5’セグメント(SEG.1)、
(b)ポリペプチドのコーディング領域及び通常の3’OHを含み得る、5’三リン酸セグメント(SEG.2)、
(c)コルジセピンを含み、または3’OHを含まない、キメラポリヌクレオチドの3’端(例えばテール)用の5’リン酸セグメント(SEG.3)
が含まれる。
一連の出発セグメントを使用してキメラポリヌクレオチドを作製することができる。かかるセグメントには、
(a)通常の3’OHを含む、キャップ及び保護された5’セグメント(SEG.1)、
(b)ポリペプチドのコーディング領域及び通常の3’OHを含み得る、5’三リン酸セグメント(SEG.2)、
(c)コルジセピンを含み、または3’OHを含まない、キメラポリヌクレオチドの3’端(例えばテール)用の5’リン酸セグメント(SEG.3)
が含まれる。
合成(化学的合成またはIVT合成)後に、セグメント3(SEG.3)をコルジセピンで処理し、次いで、ピロホスファターゼで処理して、5’リン酸を生成させる。
次いで、RNAリガーゼを使用して、セグメント2(SEG.2)をSEG.3にライゲーションすることができる。次いで、ライゲーションされたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して、二リン酸を切断する。次いで、処理されたSEG.2-SEG.3構築物を精製し、5’末端にSEG.1をライゲーションする。キメラポリヌクレオチドの更なる精製ステップが実施されてもよい。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションされたセグメントまたは連結されたセグメントは、次のように表すことができる。5’UTR(SEG.1)、オープンリーディングフレームまたはORF(SEG.2)及び3’UTR+ポリA(SEG.3)。
各ステップの収率は、90~95%にもなり得る。
実施例3:cDNA生成のためのPCR
cDNAを調製するためのPCR工程は、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2× KAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを使用して実施することができる。このシステムは、2× KAPA ReadyMix 12.5μl、フォワードプライマー(10μM)0.75μl、リバースプライマー(10μM)0.75μl、鋳型cDNA 100ngを含み、dH2Oで25.0μlに希釈される。反応条件は、95℃で5分であってよく、98℃で20秒、次に58℃で15秒、次に72℃で45秒を25サイクル、次に72℃で5分、次に終了まで4℃で反応を実施することができる。
cDNAを調製するためのPCR工程は、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2× KAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを使用して実施することができる。このシステムは、2× KAPA ReadyMix 12.5μl、フォワードプライマー(10μM)0.75μl、リバースプライマー(10μM)0.75μl、鋳型cDNA 100ngを含み、dH2Oで25.0μlに希釈される。反応条件は、95℃で5分であってよく、98℃で20秒、次に58℃で15秒、次に72℃で45秒を25サイクル、次に72℃で5分、次に終了まで4℃で反応を実施することができる。
InvitrogenのPURELINK(商標)PCR Micro Kit(Carlsbad,CA)を製造元の説明書に従って使用して、反応をクリーンアップすることができる(5μgまで)。より大きな反応には、許容量がより大きい製品を使用したクリーンアップが必要とされ得る。クリーンアップに続いて、NANODROP(商標)を使用してcDNAを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、当該cDNAが予想されるサイズであることを確認することができる。次いで、cDNAをシーケンシング解析に供した後、in vitro転写反応に進む。
実施例4:in vitro転写(IVT)
in vitro転写反応により、RNAポリヌクレオチドが生成される。かかるポリヌクレオチドは、化学修飾RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む、本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。化学修飾RNAポリヌクレオチドは、均一に修飾されたポリヌクレオチドであり得る。in vitro転写反応は、カスタムのヌクレオチド三リン酸(NTP)混合物を利用する。NTPは、化学修飾NTP、または天然NTPと化学修飾NTPの混合物を含み得る。
in vitro転写反応により、RNAポリヌクレオチドが生成される。かかるポリヌクレオチドは、化学修飾RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む、本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。化学修飾RNAポリヌクレオチドは、均一に修飾されたポリヌクレオチドであり得る。in vitro転写反応は、カスタムのヌクレオチド三リン酸(NTP)混合物を利用する。NTPは、化学修飾NTP、または天然NTPと化学修飾NTPの混合物を含み得る。
典型的なin vitro転写反応は、以下を含む。
1)鋳型cDNA 1.0μg
2)10×転写バッファー 2.0μl
(400mM Tris-HCl(pH8.0)、190mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン)
3)カスタムNTP(各25mM) 0.2μl
4)RNase阻害剤 20U
5)T7 RNAポリメラーゼ 3000U
6)dH2O 最大20.0μl、及び
7)37℃で3~5時間のインキュベーション。
1)鋳型cDNA 1.0μg
2)10×転写バッファー 2.0μl
(400mM Tris-HCl(pH8.0)、190mM MgCl2、50mM DTT、10mM スペルミジン)
3)カスタムNTP(各25mM) 0.2μl
4)RNase阻害剤 20U
5)T7 RNAポリメラーゼ 3000U
6)dH2O 最大20.0μl、及び
7)37℃で3~5時間のインキュベーション。
粗IVT混合物は、翌日のクリーンアップに備えて、4℃で終夜保存され得る。次いで、1UのRNaseフリーDNaseを使用して、元の鋳型を消化する。37℃で15分のインキュベーション後に、AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)を製造元の説明書に従って使用して、mRNAを精製することができる。このキットは500μgまでのRNAを精製することができる。このクリーンアップに続いて、NANODROP(商標)を使用してRNAポリヌクレオチドを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、RNAポリヌクレオチドが適切なサイズであり、かつRNAの分解が起きていないことを確認することができる。
実施例5:酵素キャッピング
RNAポリヌクレオチドのキャッピングは、以下のとおりに実施される。この場合、混合物は、IVT RNA 60μg~180μg及びdH2Oの最大72μlを含む。混合物を65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性させた後、これを直ちに氷に移す。
RNAポリヌクレオチドのキャッピングは、以下のとおりに実施される。この場合、混合物は、IVT RNA 60μg~180μg及びdH2Oの最大72μlを含む。混合物を65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性させた後、これを直ちに氷に移す。
次いで、本プロトコールは、10×キャッピングバッファー(0.5M トリス-HCl(pH8.0)、60mM KCl、12.5mM MgCl2)(10.0μl)、20mM GTP(5.0μl)、20mM S-アデノシルメチオニン(2.5μl)、RNase阻害剤(100U)、2’-O-メチルトランスフェラーゼ(400U)、ワクシニアキャッピング酵素(グアニリルトランスフェラーゼ)(40U)、dH2O(最大28μl)の混合と、RNAが60μgの場合は30分間、RNAが180μgの場合は最大2時間の37℃でのインキュベーションとを伴う。
次いで、AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)を製造元の説明書に従って使用して、RNAポリヌクレオチドを精製することができる。このクリーンアップに続いて、NanoDrop(商標)(ThermoFisher,Waltham,MA)を使用してRNAを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、RNAポリヌクレオチドが適切なサイズであり、かつRNAの分解が起きていないことを確認することができる。RNAポリヌクレオチド産物はまた、逆転写PCRを行ってシーケンシング用のcDNAを生成させることで、配列決定を行ってもよい。
実施例6:ポリAテーリング反応
cDNA中にポリTがない場合は、最終産物のクリーニング前にポリAテーリング反応を実施する必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μl)、RNase阻害剤(20U)、10×テーリングバッファー(0.5M トリス-HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)、20mM ATP(6.0μl)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH2O 最大123.5μlを混合し、37℃で30分間インキュベートすることによって行われる。ポリAテールが転写産物中に既に存在する場合には、テーリング反応を飛ばして、AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)によるクリーンアップ(500μgまで)に直接進むことができる。ポリ-Aポリメラーゼは、酵母中で発現された組み換え酵素であってよい。
cDNA中にポリTがない場合は、最終産物のクリーニング前にポリAテーリング反応を実施する必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μl)、RNase阻害剤(20U)、10×テーリングバッファー(0.5M トリス-HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)、20mM ATP(6.0μl)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH2O 最大123.5μlを混合し、37℃で30分間インキュベートすることによって行われる。ポリAテールが転写産物中に既に存在する場合には、テーリング反応を飛ばして、AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)によるクリーンアップ(500μgまで)に直接進むことができる。ポリ-Aポリメラーゼは、酵母中で発現された組み換え酵素であってよい。
ポリAテーリング反応の処理能力または完全性は、常に正確なサイズのポリAテールをもたらすとは限らないことを理解されたい。したがって、およそ40~200ヌクレオチド、例えば、約40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150~165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164または165のポリAテールは、本開示の範囲内である。
実施例7:キャッピングアッセイ
タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションから6、12、24及び/または36時間後に、培養培地中に分泌されたタンパク質の量を、ELISAによってアッセイすることができる。より高いレベルのタンパク質を培地中に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力のあるキャップ構造を有する合成ポリヌクレオチドに該当する。
タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションから6、12、24及び/または36時間後に、培養培地中に分泌されたタンパク質の量を、ELISAによってアッセイすることができる。より高いレベルのタンパク質を培地中に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力のあるキャップ構造を有する合成ポリヌクレオチドに該当する。
純度分析合成
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、変性アガロース尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動で単一の統合されたバンドを有するRNAポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは縞状のバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、純度の高い生成物に該当する。単一のHPLCピークを有する化学修飾RNAポリヌクレオチドも、純度の高い生成物に該当する。キャッピング反応の効率が高いほど、より純粋なポリヌクレオチド集団を与える。
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、変性アガロース尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動で単一の統合されたバンドを有するRNAポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは縞状のバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、純度の高い生成物に該当する。単一のHPLCピークを有する化学修飾RNAポリヌクレオチドも、純度の高い生成物に該当する。キャッピング反応の効率が高いほど、より純粋なポリヌクレオチド集団を与える。
サイトカイン分析
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションから6、12、24及び/または36時間後に、培養培地中に分泌されたTNF-α及びIFN-βなどの炎症促進性サイトカインの量を、ELISAによってアッセイすることができる。より高いレベルの炎症誘発性サイトカインを培地中に分泌させるRNAポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに該当する。
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションから6、12、24及び/または36時間後に、培養培地中に分泌されたTNF-α及びIFN-βなどの炎症促進性サイトカインの量を、ELISAによってアッセイすることができる。より高いレベルの炎症誘発性サイトカインを培地中に分泌させるRNAポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに該当する。
キャッピング反応効率
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後にLC-MSによって、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、LC-MSによって検出可能である、遊離ヌクレオチドとキャップされた5’-5-三リン酸キャップ構造との混合物が得られる。LC-MSスペクトルにおけるキャップされた生成物の量は、反応からの総ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に対応する。キャッピング反応効率の高いキャップ構造は、LC-MSによると、キャップされた生成物の量が多い。
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後にLC-MSによって、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、LC-MSによって検出可能である、遊離ヌクレオチドとキャップされた5’-5-三リン酸キャップ構造との混合物が得られる。LC-MSスペクトルにおけるキャップされた生成物の量は、反応からの総ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に対応する。キャッピング反応効率の高いキャップ構造は、LC-MSによると、キャップされた生成物の量が多い。
実施例8:修飾RNAまたはRT PCR産物のアガロースゲル電気泳動
個々のRNAポリヌクレオチド(体積20μl中200~400ng)または逆転写されたPCR産物(200~400ng)を、非変性1.2%アガロースE-Gel(Invitrogen(Carlsbad,CA))上のウェルにローディングし、製造元のプロトコールに従って12~15分間、泳動する。
個々のRNAポリヌクレオチド(体積20μl中200~400ng)または逆転写されたPCR産物(200~400ng)を、非変性1.2%アガロースE-Gel(Invitrogen(Carlsbad,CA))上のウェルにローディングし、製造元のプロトコールに従って12~15分間、泳動する。
実施例9:NANODROP(商標)による修飾RNAの定量及びUVスペクトルデータ
TEバッファー(1μl)中の化学修飾RNAポリヌクレオチドをNanodrop(商標)UV吸光度測定に使用して、化学合成またはin vitro転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量する。
TEバッファー(1μl)中の化学修飾RNAポリヌクレオチドをNanodrop(商標)UV吸光度測定に使用して、化学合成またはin vitro転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量する。
実施例10:リピドイドを使用した修飾mRNAの製剤化
RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、細胞に加える前に、設定した比で、ポリヌクレオチドをリピドイドと混合しすることにより、in vitro実験用に製剤化することができる。in vivo製剤は、全身循環を促進するために追加成分の添加を必要とすることがある。これらのリピドイドのin vivo作用に好適な粒子を形成する能力を試験するために、siRNA-リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを出発点として使用することができる。粒子の形成後に、ポリヌクレオチドを加え、複合体と一体化させる。封入効率は標準的な色素排除アッセイを使用して決定される。
RNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドは、細胞に加える前に、設定した比で、ポリヌクレオチドをリピドイドと混合しすることにより、in vitro実験用に製剤化することができる。in vivo製剤は、全身循環を促進するために追加成分の添加を必要とすることがある。これらのリピドイドのin vivo作用に好適な粒子を形成する能力を試験するために、siRNA-リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを出発点として使用することができる。粒子の形成後に、ポリヌクレオチドを加え、複合体と一体化させる。封入効率は標準的な色素排除アッセイを使用して決定される。
実施例11:VZVワクチンに使用するためのgE RNAポリヌクレオチドをコードする例示的な核酸
以下の配列は、VZVワクチンに使用するためのVZV RNAポリヌクレオチドgEをコードするのに使用することができる例示的な配列である。VZVワクチンは、例えば、以下の配列のうちの少なくとも1つまたは以下の配列のうちの少なくとも1つの断片によってコードされる少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、mRNAは、5’キャップ、例えば、本明細書で開示されるキャップのいずれか、例えば、配列m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有するキャップを更に含む。いくつかの実施形態において、mRNAは、キャップ配列を有しない。いくつかの実施形態において、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾、例えば、本明細書で開示される化学修飾のいずれか、例えば、N1-メチルプソイドウリジン修飾またはN1-エチルプソイドウリジン修飾を有する。他の実施形態において、mRNAは、化学修飾を有しない。
以下の配列は、VZVワクチンに使用するためのVZV RNAポリヌクレオチドgEをコードするのに使用することができる例示的な配列である。VZVワクチンは、例えば、以下の配列のうちの少なくとも1つまたは以下の配列のうちの少なくとも1つの断片によってコードされる少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、mRNAは、5’キャップ、例えば、本明細書で開示されるキャップのいずれか、例えば、配列m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有するキャップを更に含む。いくつかの実施形態において、mRNAは、キャップ配列を有しない。いくつかの実施形態において、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾、例えば、本明細書で開示される化学修飾のいずれか、例えば、N1-メチルプソイドウリジン修飾またはN1-エチルプソイドウリジン修飾を有する。他の実施形態において、mRNAは、化学修飾を有しない。
本明細書に記載される配列のそれぞれは、化学修飾された配列、または修飾ヌクレオチドを含まない非修飾の配列を包含する。
VZV gE完全長Oka株:
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTGAATAAGCCGGTTGTGGGCGTGCTTATGGGCTTTGGGATTATTACCGGTACATTACGAATTACCAATCCAGTGCGCGCCAGTGTGCTGCGTTACGACGACTTTCACATTGACGAGGATAAGCTGGATACTAACAGCGTGTACGAACCTTATTACCACTCAGATCATGCCGAATCAAGCTGGGTTAATAGAGGAGAAAGCAGCCGAAAAGCCTACGACCACAACTCACCTTATATTTGGCCCAGAAACGATTATGACGGTTTCCTGGAAAACGCACATGAACACCATGGAGTCTACAACCAAGGCAGGGGAATCGACAGTGGCGAGCGTCTTATGCAGCCAACACAGATGTCGGCACAGGAGGATCTCGGTGATGACACCGGCATACACGTGATTCCCACATTAAACGGCGACGACAGACATAAGATCGTCAATGTGGATCAGCGTCAGTATGGGGATGTCTTTAAAGGCGATTTGAATCCAAAGCCCCAAGGACAGAGACTGATCGAGGTCTCTGTAGAAGAAAATCACCCCTTCACTTTGCGCGCTCCAATCCAGAGGATTTACGGGGTGCGTTATACCGAAACTTGGAGTTTCTTGCCGTCACTGACGTGTACGGGGGATGCCGCCCCCGCAATCCAGCACATCTGTCTGAAACACACCACATGCTTTCAGGACGTGGTTGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAACACAAAAGAAGACCAACTCGCCGAAATCAGCTATCGTTTTCAGGGTAAAAAAGAGGCCGACCAACCGTGGATTGTTGTGAATACGAGCACGCTCTTCGATGAGCTTGAACTCGATCCCCCGGAAATCGAGCCTGGGGTTCTAAAAGTGTTGAGGACCGAGAAGCAGTACCTCGGGGTTTATATCTGGAATATGAGAGGCTCCGATGGCACCTCTACCTACGCAACGTTTCTGGTTACCTGGAAGGGAGACGAGAAGACACGGAATCCAACGCCCGCTGTGACCCCTCAGCCTAGGGGAGCCGAATTCCACATGTGGAACTATCACTCCCATGTATTCAGTGTGGGTGACACTTTCAGCCTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATTCACGAGGCACCCTTCGACCTCCTGCTGGAGTGGTTGTACGTACCTATTGATCCCACTTGTCAGCCCATGCGCCTGTACTCCACTTGCTTGTACCACCCCAATGCACCACAGTGTCTATCACACATGAACTCCGGGTGTACCTTTACTTCACCCCATCTTGCCCAGCGGGTCGCCAGCACAGTGTATCAGAACTGTGAGCATGCTGACAACTATACTGCTTATTGCCTCGGAATATCCCATATGGAGCCAAGCTTCGGGCTCATACTGCACGATGGTGGTACGACACTCAAGTTCGTGGACACCCCCGAAAGCCTTTCTGGCTTGTACGTGTTCGTGGTCTACTTCAATGGACATGTGGAGGCAGTGGCTTACACAGTGGTTTCGACAGTTGATCACTTTGTAAATGCCATTGAGGAACGCGGCTTCCCGCCTACAGCGGGCCAGCCCCCTGCGACAACAAAACCAAAAGAGATTACGCCCGTTAATCCTGGGACTAGTCCATTGCTGAGGTATGCCGCCTGGACTGGCGGTCTGGCGGCCGTGGTACTTCTGTGTTTAGTCATATTTCTGATCTGTACCGCTAAACGTATGCGGGTCAAGGCTTACCGTGTTGACAAGTCTCCTTACAATCAGTCAATGTACTATGCAGGACTCCCTGTTGACGATTTCGAAGACTCAGAGAGTACAGACACAGAAGAAGAATTCGGAAACGCTATAGGTGGCTCTCACGGAGGTAGCTCGTATACAGTGTACATCGATAAAACCAGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号1)
VZV gE完全長Oka株(mRNA):
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUGAAUAAGCCGGUUGUGGGCGUGCUUAUGGGCUUUGGGAUUAUUACCGGUACAUUACGAAUUACCAAUCCAGUGCGCGCCAGUGUGCUGCGUUACGACGACUUUCACAUUGACGAGGAUAAGCUGGAUACUAACAGCGUGUACGAACCUUAUUACCACUCAGAUCAUGCCGAAUCAAGCUGGGUUAAUAGAGGAGAAAGCAGCCGAAAAGCCUACGACCACAACUCACCUUAUAUUUGGCCCAGAAACGAUUAUGACGGUUUCCUGGAAAACGCACAUGAACACCAUGGAGUCUACAACCAAGGCAGGGGAAUCGACAGUGGCGAGCGUCUUAUGCAGCCAACACAGAUGUCGGCACAGGAGGAUCUCGGUGAUGACACCGGCAUACACGUGAUUCCCACAUUAAACGGCGACGACAGACAUAAGAUCGUCAAUGUGGAUCAGCGUCAGUAUGGGGAUGUCUUUAAAGGCGAUUUGAAUCCAAAGCCCCAAGGACAGAGACUGAUCGAGGUCUCUGUAGAAGAAAAUCACCCCUUCACUUUGCGCGCUCCAAUCCAGAGGAUUUACGGGGUGCGUUAUACCGAAACUUGGAGUUUCUUGCCGUCACUGACGUGUACGGGGGAUGCCGCCCCCGCAAUCCAGCACAUCUGUCUGAAACACACCACAUGCUUUCAGGACGUGGUUGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAACACAAAAGAAGACCAACUCGCCGAAAUCAGCUAUCGUUUUCAGGGUAAAAAAGAGGCCGACCAACCGUGGAUUGUUGUGAAUACGAGCACGCUCUUCGAUGAGCUUGAACUCGAUCCCCCGGAAAUCGAGCCUGGGGUUCUAAAAGUGUUGAGGACCGAGAAGCAGUACCUCGGGGUUUAUAUCUGGAAUAUGAGAGGCUCCGAUGGCACCUCUACCUACGCAACGUUUCUGGUUACCUGGAAGGGAGACGAGAAGACACGGAAUCCAACGCCCGCUGUGACCCCUCAGCCUAGGGGAGCCGAAUUCCACAUGUGGAACUAUCACUCCCAUGUAUUCAGUGUGGGUGACACUUUCAGCCUGGCCAUGCACCUGCAGUAUAAGAUUCACGAGGCACCCUUCGACCUCCUGCUGGAGUGGUUGUACGUACCUAUUGAUCCCACUUGUCAGCCCAUGCGCCUGUACUCCACUUGCUUGUACCACCCCAAUGCACCACAGUGUCUAUCACACAUGAACUCCGGGUGUACCUUUACUUCACCCCAUCUUGCCCAGCGGGUCGCCAGCACAGUGUAUCAGAACUGUGAGCAUGCUGACAACUAUACUGCUUAUUGCCUCGGAAUAUCCCAUAUGGAGCCAAGCUUCGGGCUCAUACUGCACGAUGGUGGUACGACACUCAAGUUCGUGGACACCCCCGAAAGCCUUUCUGGCUUGUACGUGUUCGUGGUCUACUUCAAUGGACAUGUGGAGGCAGUGGCUUACACAGUGGUUUCGACAGUUGAUCACUUUGUAAAUGCCAUUGAGGAACGCGGCUUCCCGCCUACAGCGGGCCAGCCCCCUGCGACAACAAAACCAAAAGAGAUUACGCCCGUUAAUCCUGGGACUAGUCCAUUGCUGAGGUAUGCCGCCUGGACUGGCGGUCUGGCGGCCGUGGUACUUCUGUGUUUAGUCAUAUUUCUGAUCUGUACCGCUAAACGUAUGCGGGUCAAGGCUUACCGUGUUGACAAGUCUCCUUACAAUCAGUCAAUGUACUAUGCAGGACUCCCUGUUGACGAUUUCGAAGACUCAGAGAGUACAGACACAGAAGAAGAAUUCGGAAACGCUAUAGGUGGCUCUCACGGAGGUAGCUCGUAUACAGUGUACAUCGAUAAAACCAGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号123)
VZV gE完全長Oka株:
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTGAATAAGCCGGTTGTGGGCGTGCTTATGGGCTTTGGGATTATTACCGGTACATTACGAATTACCAATCCAGTGCGCGCCAGTGTGCTGCGTTACGACGACTTTCACATTGACGAGGATAAGCTGGATACTAACAGCGTGTACGAACCTTATTACCACTCAGATCATGCCGAATCAAGCTGGGTTAATAGAGGAGAAAGCAGCCGAAAAGCCTACGACCACAACTCACCTTATATTTGGCCCAGAAACGATTATGACGGTTTCCTGGAAAACGCACATGAACACCATGGAGTCTACAACCAAGGCAGGGGAATCGACAGTGGCGAGCGTCTTATGCAGCCAACACAGATGTCGGCACAGGAGGATCTCGGTGATGACACCGGCATACACGTGATTCCCACATTAAACGGCGACGACAGACATAAGATCGTCAATGTGGATCAGCGTCAGTATGGGGATGTCTTTAAAGGCGATTTGAATCCAAAGCCCCAAGGACAGAGACTGATCGAGGTCTCTGTAGAAGAAAATCACCCCTTCACTTTGCGCGCTCCAATCCAGAGGATTTACGGGGTGCGTTATACCGAAACTTGGAGTTTCTTGCCGTCACTGACGTGTACGGGGGATGCCGCCCCCGCAATCCAGCACATCTGTCTGAAACACACCACATGCTTTCAGGACGTGGTTGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAACACAAAAGAAGACCAACTCGCCGAAATCAGCTATCGTTTTCAGGGTAAAAAAGAGGCCGACCAACCGTGGATTGTTGTGAATACGAGCACGCTCTTCGATGAGCTTGAACTCGATCCCCCGGAAATCGAGCCTGGGGTTCTAAAAGTGTTGAGGACCGAGAAGCAGTACCTCGGGGTTTATATCTGGAATATGAGAGGCTCCGATGGCACCTCTACCTACGCAACGTTTCTGGTTACCTGGAAGGGAGACGAGAAGACACGGAATCCAACGCCCGCTGTGACCCCTCAGCCTAGGGGAGCCGAATTCCACATGTGGAACTATCACTCCCATGTATTCAGTGTGGGTGACACTTTCAGCCTGGCCATGCACCTGCAGTATAAGATTCACGAGGCACCCTTCGACCTCCTGCTGGAGTGGTTGTACGTACCTATTGATCCCACTTGTCAGCCCATGCGCCTGTACTCCACTTGCTTGTACCACCCCAATGCACCACAGTGTCTATCACACATGAACTCCGGGTGTACCTTTACTTCACCCCATCTTGCCCAGCGGGTCGCCAGCACAGTGTATCAGAACTGTGAGCATGCTGACAACTATACTGCTTATTGCCTCGGAATATCCCATATGGAGCCAAGCTTCGGGCTCATACTGCACGATGGTGGTACGACACTCAAGTTCGTGGACACCCCCGAAAGCCTTTCTGGCTTGTACGTGTTCGTGGTCTACTTCAATGGACATGTGGAGGCAGTGGCTTACACAGTGGTTTCGACAGTTGATCACTTTGTAAATGCCATTGAGGAACGCGGCTTCCCGCCTACAGCGGGCCAGCCCCCTGCGACAACAAAACCAAAAGAGATTACGCCCGTTAATCCTGGGACTAGTCCATTGCTGAGGTATGCCGCCTGGACTGGCGGTCTGGCGGCCGTGGTACTTCTGTGTTTAGTCATATTTCTGATCTGTACCGCTAAACGTATGCGGGTCAAGGCTTACCGTGTTGACAAGTCTCCTTACAATCAGTCAATGTACTATGCAGGACTCCCTGTTGACGATTTCGAAGACTCAGAGAGTACAGACACAGAAGAAGAATTCGGAAACGCTATAGGTGGCTCTCACGGAGGTAGCTCGTATACAGTGTACATCGATAAAACCAGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号1)
VZV gE完全長Oka株(mRNA):
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUGAAUAAGCCGGUUGUGGGCGUGCUUAUGGGCUUUGGGAUUAUUACCGGUACAUUACGAAUUACCAAUCCAGUGCGCGCCAGUGUGCUGCGUUACGACGACUUUCACAUUGACGAGGAUAAGCUGGAUACUAACAGCGUGUACGAACCUUAUUACCACUCAGAUCAUGCCGAAUCAAGCUGGGUUAAUAGAGGAGAAAGCAGCCGAAAAGCCUACGACCACAACUCACCUUAUAUUUGGCCCAGAAACGAUUAUGACGGUUUCCUGGAAAACGCACAUGAACACCAUGGAGUCUACAACCAAGGCAGGGGAAUCGACAGUGGCGAGCGUCUUAUGCAGCCAACACAGAUGUCGGCACAGGAGGAUCUCGGUGAUGACACCGGCAUACACGUGAUUCCCACAUUAAACGGCGACGACAGACAUAAGAUCGUCAAUGUGGAUCAGCGUCAGUAUGGGGAUGUCUUUAAAGGCGAUUUGAAUCCAAAGCCCCAAGGACAGAGACUGAUCGAGGUCUCUGUAGAAGAAAAUCACCCCUUCACUUUGCGCGCUCCAAUCCAGAGGAUUUACGGGGUGCGUUAUACCGAAACUUGGAGUUUCUUGCCGUCACUGACGUGUACGGGGGAUGCCGCCCCCGCAAUCCAGCACAUCUGUCUGAAACACACCACAUGCUUUCAGGACGUGGUUGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAACACAAAAGAAGACCAACUCGCCGAAAUCAGCUAUCGUUUUCAGGGUAAAAAAGAGGCCGACCAACCGUGGAUUGUUGUGAAUACGAGCACGCUCUUCGAUGAGCUUGAACUCGAUCCCCCGGAAAUCGAGCCUGGGGUUCUAAAAGUGUUGAGGACCGAGAAGCAGUACCUCGGGGUUUAUAUCUGGAAUAUGAGAGGCUCCGAUGGCACCUCUACCUACGCAACGUUUCUGGUUACCUGGAAGGGAGACGAGAAGACACGGAAUCCAACGCCCGCUGUGACCCCUCAGCCUAGGGGAGCCGAAUUCCACAUGUGGAACUAUCACUCCCAUGUAUUCAGUGUGGGUGACACUUUCAGCCUGGCCAUGCACCUGCAGUAUAAGAUUCACGAGGCACCCUUCGACCUCCUGCUGGAGUGGUUGUACGUACCUAUUGAUCCCACUUGUCAGCCCAUGCGCCUGUACUCCACUUGCUUGUACCACCCCAAUGCACCACAGUGUCUAUCACACAUGAACUCCGGGUGUACCUUUACUUCACCCCAUCUUGCCCAGCGGGUCGCCAGCACAGUGUAUCAGAACUGUGAGCAUGCUGACAACUAUACUGCUUAUUGCCUCGGAAUAUCCCAUAUGGAGCCAAGCUUCGGGCUCAUACUGCACGAUGGUGGUACGACACUCAAGUUCGUGGACACCCCCGAAAGCCUUUCUGGCUUGUACGUGUUCGUGGUCUACUUCAAUGGACAUGUGGAGGCAGUGGCUUACACAGUGGUUUCGACAGUUGAUCACUUUGUAAAUGCCAUUGAGGAACGCGGCUUCCCGCCUACAGCGGGCCAGCCCCCUGCGACAACAAAACCAAAAGAGAUUACGCCCGUUAAUCCUGGGACUAGUCCAUUGCUGAGGUAUGCCGCCUGGACUGGCGGUCUGGCGGCCGUGGUACUUCUGUGUUUAGUCAUAUUUCUGAUCUGUACCGCUAAACGUAUGCGGGUCAAGGCUUACCGUGUUGACAAGUCUCCUUACAAUCAGUCAAUGUACUAUGCAGGACUCCCUGUUGACGAUUUCGAAGACUCAGAGAGUACAGACACAGAAGAAGAAUUCGGAAACGCUAUAGGUGGCUCUCACGGAGGUAGCUCGUAUACAGUGUACAUCGAUAAAACCAGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号123)
実施例12:VZVワクチンに使用するためのgI RNAポリヌクレオチドをコードする例示的な核酸
以下の配列は、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンに使用するためのVZV RNAポリヌクレオチドgIをコードするのに使用することができる例示的な配列である。gIポリペプチドは、感染細胞中でgEと複合体を形成する。この複合体は、両糖タンパク質のエンドサイトーシスを促進し、最終的なウイルスエンベロープを獲得する場であるトランスゴルジ網(TGN)に両糖タンパク質を誘導する。VZVワクチンは、例えば、以下の配列のうちの少なくとも1つまたは以下の配列のうちの少なくとも1つの断片によってコードされる少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、mRNAは、5’キャップ、例えば、本明細書で開示されるキャップのいずれか、例えば、配列m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有するキャップを更に含む。他の実施形態において、mRNAは、キャップ配列を有しない。いくつかの実施形態において、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾、例えば、本明細書で開示される化学修飾のいずれか、例えば、N1-メチルプソイドウリジン修飾またはN1-エチルプソイドウリジン修飾を有する。他の実施形態において、mRNAは、化学修飾を有しない。
VZV-GI完全長(Oka株):
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGTTTTTAATCCAATGTTTGATATCGGCCGTTATATTTTACATACAAGTGACCAACGCTTTGATCTTCAAGGGCGACCACGTGAGCTTGCAAGTTAACAGCAGTCTCACGTCTATCCTTATTCCCATGCAAAATGATAATTATACAGAGATAAAAGGACAGCTTGTCTTTATTGGAGAGCAACTACCTACCGGGACAAACTATAGCGGAACACTGGAACTGTTATACGCGGATACGGTGGCGTTTTGTTTCCGGTCAGTACAAGTAATAAGATACGACGGATGTCCCCGGATTAGAACGAGCGCTTTTATTTCGTGTAGGTACAAACATTCGTGGCATTATGGTAACTCAACGGATCGGATATCAACAGAGCCGGATGCTGGTGTAATGTTGAAAATTACCAAACCGGGAATAAATGATGCTGGTGTGTATGTACTTCTTGTTCGGTTAGACCATAGCAGATCCACCGATGGTTTCATTCTTGGTGTAAATGTATATACAGCGGGCTCGCATCACAACATTCACGGGGTTATCTACACTTCTCCATCTCTACAGAATGGATATTCTACAAGAGCCCTTTTTCAACAAGCTCGTTTGTGTGATTTACCCGCGACACCCAAAGGGTCCGGTACCTCCCTGTTTCAACATATGCTTGATCTTCGTGCCGGTAAATCGTTAGAGGATAACCCTTGGTTACATGAGGACGTTGTTACGACAGAAACTAAGTCCGTTGTTAAGGAGGGGATAGAAAATCACGTATATCCAACGGATATGTCCACGTTACCCGAAAAGTCCCTTAATGATCCTCCAGAAAATCTACTTATAATTATTCCTATAGTAGCGTCTGTCATGATCCTCACCGCCATGGTTATTGTTATTGTAATAAGCGTTAAGCGACGTAGAATTAAAAAACATCCAATTTATCGCCCAAATACAAAAACAAGAAGGGGCATACAAAATGCGACACCAGAATCCGATGTGATGTTGGAGGCCGCCATTGCACAACTAGCAACGATTCGCGAAGAATCCCCCCCACATTCCGTTGTAAACCCGTTTGTTAAATAGTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号2)
VZV-GI完全長(Oka株)(mRNA):
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGUUUUUAAUCCAAUGUUUGAUAUCGGCCGUUAUAUUUUACAUACAAGUGACCAACGCUUUGAUCUUCAAGGGCGACCACGUGAGCUUGCAAGUUAACAGCAGUCUCACGUCUAUCCUUAUUCCCAUGCAAAAUGAUAAUUAUACAGAGAUAAAAGGACAGCUUGUCUUUAUUGGAGAGCAACUACCUACCGGGACAAACUAUAGCGGAACACUGGAACUGUUAUACGCGGAUACGGUGGCGUUUUGUUUCCGGUCAGUACAAGUAAUAAGAUACGACGGAUGUCCCCGGAUUAGAACGAGCGCUUUUAUUUCGUGUAGGUACAAACAUUCGUGGCAUUAUGGUAACUCAACGGAUCGGAUAUCAACAGAGCCGGAUGCUGGUGUAAUGUUGAAAAUUACCAAACCGGGAAUAAAUGAUGCUGGUGUGUAUGUACUUCUUGUUCGGUUAGACCAUAGCAGAUCCACCGAUGGUUUCAUUCUUGGUGUAAAUGUAUAUACAGCGGGCUCGCAUCACAACAUUCACGGGGUUAUCUACACUUCUCCAUCUCUACAGAAUGGAUAUUCUACAAGAGCCCUUUUUCAACAAGCUCGUUUGUGUGAUUUACCCGCGACACCCAAAGGGUCCGGUACCUCCCUGUUUCAACAUAUGCUUGAUCUUCGUGCCGGUAAAUCGUUAGAGGAUAACCCUUGGUUACAUGAGGACGUUGUUACGACAGAAACUAAGUCCGUUGUUAAGGAGGGGAUAGAAAAUCACGUAUAUCCAACGGAUAUGUCCACGUUACCCGAAAAGUCCCUUAAUGAUCCUCCAGAAAAUCUACUUAUAAUUAUUCCUAUAGUAGCGUCUGUCAUGAUCCUCACCGCCAUGGUUAUUGUUAUUGUAAUAAGCGUUAAGCGACGUAGAAUUAAAAAACAUCCAAUUUAUCGCCCAAAUACAAAAACAAGAAGGGGCAUACAAAAUGCGACACCAGAAUCCGAUGUGAUGUUGGAGGCCGCCAUUGCACAACUAGCAACGAUUCGCGAAGAAUCCCCCCCACAUUCCGUUGUAAACCCGUUUGUUAAAUAGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号124)
以下の配列は、VZV RNA(例えば、mRNA)ワクチンに使用するためのVZV RNAポリヌクレオチドgIをコードするのに使用することができる例示的な配列である。gIポリペプチドは、感染細胞中でgEと複合体を形成する。この複合体は、両糖タンパク質のエンドサイトーシスを促進し、最終的なウイルスエンベロープを獲得する場であるトランスゴルジ網(TGN)に両糖タンパク質を誘導する。VZVワクチンは、例えば、以下の配列のうちの少なくとも1つまたは以下の配列のうちの少なくとも1つの断片によってコードされる少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、mRNAは、5’キャップ、例えば、本明細書で開示されるキャップのいずれか、例えば、配列m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有するキャップを更に含む。他の実施形態において、mRNAは、キャップ配列を有しない。いくつかの実施形態において、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾、例えば、本明細書で開示される化学修飾のいずれか、例えば、N1-メチルプソイドウリジン修飾またはN1-エチルプソイドウリジン修飾を有する。他の実施形態において、mRNAは、化学修飾を有しない。
VZV-GI完全長(Oka株):
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGTTTTTAATCCAATGTTTGATATCGGCCGTTATATTTTACATACAAGTGACCAACGCTTTGATCTTCAAGGGCGACCACGTGAGCTTGCAAGTTAACAGCAGTCTCACGTCTATCCTTATTCCCATGCAAAATGATAATTATACAGAGATAAAAGGACAGCTTGTCTTTATTGGAGAGCAACTACCTACCGGGACAAACTATAGCGGAACACTGGAACTGTTATACGCGGATACGGTGGCGTTTTGTTTCCGGTCAGTACAAGTAATAAGATACGACGGATGTCCCCGGATTAGAACGAGCGCTTTTATTTCGTGTAGGTACAAACATTCGTGGCATTATGGTAACTCAACGGATCGGATATCAACAGAGCCGGATGCTGGTGTAATGTTGAAAATTACCAAACCGGGAATAAATGATGCTGGTGTGTATGTACTTCTTGTTCGGTTAGACCATAGCAGATCCACCGATGGTTTCATTCTTGGTGTAAATGTATATACAGCGGGCTCGCATCACAACATTCACGGGGTTATCTACACTTCTCCATCTCTACAGAATGGATATTCTACAAGAGCCCTTTTTCAACAAGCTCGTTTGTGTGATTTACCCGCGACACCCAAAGGGTCCGGTACCTCCCTGTTTCAACATATGCTTGATCTTCGTGCCGGTAAATCGTTAGAGGATAACCCTTGGTTACATGAGGACGTTGTTACGACAGAAACTAAGTCCGTTGTTAAGGAGGGGATAGAAAATCACGTATATCCAACGGATATGTCCACGTTACCCGAAAAGTCCCTTAATGATCCTCCAGAAAATCTACTTATAATTATTCCTATAGTAGCGTCTGTCATGATCCTCACCGCCATGGTTATTGTTATTGTAATAAGCGTTAAGCGACGTAGAATTAAAAAACATCCAATTTATCGCCCAAATACAAAAACAAGAAGGGGCATACAAAATGCGACACCAGAATCCGATGTGATGTTGGAGGCCGCCATTGCACAACTAGCAACGATTCGCGAAGAATCCCCCCCACATTCCGTTGTAAACCCGTTTGTTAAATAGTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号2)
VZV-GI完全長(Oka株)(mRNA):
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGUUUUUAAUCCAAUGUUUGAUAUCGGCCGUUAUAUUUUACAUACAAGUGACCAACGCUUUGAUCUUCAAGGGCGACCACGUGAGCUUGCAAGUUAACAGCAGUCUCACGUCUAUCCUUAUUCCCAUGCAAAAUGAUAAUUAUACAGAGAUAAAAGGACAGCUUGUCUUUAUUGGAGAGCAACUACCUACCGGGACAAACUAUAGCGGAACACUGGAACUGUUAUACGCGGAUACGGUGGCGUUUUGUUUCCGGUCAGUACAAGUAAUAAGAUACGACGGAUGUCCCCGGAUUAGAACGAGCGCUUUUAUUUCGUGUAGGUACAAACAUUCGUGGCAUUAUGGUAACUCAACGGAUCGGAUAUCAACAGAGCCGGAUGCUGGUGUAAUGUUGAAAAUUACCAAACCGGGAAUAAAUGAUGCUGGUGUGUAUGUACUUCUUGUUCGGUUAGACCAUAGCAGAUCCACCGAUGGUUUCAUUCUUGGUGUAAAUGUAUAUACAGCGGGCUCGCAUCACAACAUUCACGGGGUUAUCUACACUUCUCCAUCUCUACAGAAUGGAUAUUCUACAAGAGCCCUUUUUCAACAAGCUCGUUUGUGUGAUUUACCCGCGACACCCAAAGGGUCCGGUACCUCCCUGUUUCAACAUAUGCUUGAUCUUCGUGCCGGUAAAUCGUUAGAGGAUAACCCUUGGUUACAUGAGGACGUUGUUACGACAGAAACUAAGUCCGUUGUUAAGGAGGGGAUAGAAAAUCACGUAUAUCCAACGGAUAUGUCCACGUUACCCGAAAAGUCCCUUAAUGAUCCUCCAGAAAAUCUACUUAUAAUUAUUCCUAUAGUAGCGUCUGUCAUGAUCCUCACCGCCAUGGUUAUUGUUAUUGUAAUAAGCGUUAAGCGACGUAGAAUUAAAAAACAUCCAAUUUAUCGCCCAAAUACAAAAACAAGAAGGGGCAUACAAAAUGCGACACCAGAAUCCGAUGUGAUGUUGGAGGCCGCCAUUGCACAACUAGCAACGAUUCGCGAAGAAUCCCCCCCACAUUCCGUUGUAAACCCGUUUGUUAAAUAGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号124)
実施例13:VZVワクチンに使用するための種々のC末端配列を有するバリアントgE抗原をコードするmRNA
VZVは、トランスゴルジ網でエンベロープ化される。糖タンパク質I(gI)は、感染細胞中でgEと複合体を形成する。この複合体は、両糖タンパク質のエンドサイトーシスを促進し、最終的なウイルスエンベロープを獲得する場であるトランスゴルジ網(TGN)に両糖タンパク質を誘導する。gEがER/ゴルジ体/TGNに捕捉されるのを回避し、gE抗原の形質膜への局在化を増加させ、免疫刺激能力が改善するように、種々のC末端バリアント配列を有するgE抗原をコードするmRNAを設計した。gE抗原の模式図を図4に示す。
VZVは、トランスゴルジ網でエンベロープ化される。糖タンパク質I(gI)は、感染細胞中でgEと複合体を形成する。この複合体は、両糖タンパク質のエンドサイトーシスを促進し、最終的なウイルスエンベロープを獲得する場であるトランスゴルジ網(TGN)に両糖タンパク質を誘導する。gEがER/ゴルジ体/TGNに捕捉されるのを回避し、gE抗原の形質膜への局在化を増加させ、免疫刺激能力が改善するように、種々のC末端バリアント配列を有するgE抗原をコードするmRNAを設計した。gE抗原の模式図を図4に示す。
いくつかの異なるgEバリアントmRNA配列(Oka株)を操作した。
(1)C末端領域の末端の62アミノ酸が欠失した切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号17~20)。得られるポリペプチドは、トランスゴルジ網への局在化が減少し、エンドサイトーシスが減少する。
(2)C末端領域の末端の62アミノ酸が欠失しており、かつシグナルペプチドがIgκに置き換えられた(これにより分泌型の切断型gEポリペプチドとなる)切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号21~24)。得られるポリペプチドは、トランスゴルジ網への局在化が減少し、エンドサイトーシスが減少する。
(3)C末端領域の末端の50アミノ酸が欠失した切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号33~36)。得られるポリペプチドは、トランスゴルジ網への局在化が減少し、エンドサイトーシスが減少する。
(4)C末端領域の末端の50アミノ酸が欠失しており、かつ点変異Y569Aを有する切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号37~40)。「AYRV」モチーフ(配列番号119)は、gEポリペプチドをトランスゴルジ網に標的化する輸送モチーフである。したがって、配列番号120のAARV配列を配列番号119のAYRVに変えると、gEポリペプチドのトランスゴルジ網への局在化が減少する。
(5)AEAADA(配列番号58)配列を含む完全長gEポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号25~28)。A-E-A-A-D-A(配列番号58)配列は、SESTDT(配列番号59)に代わるものであり、これは、Ser/Thrに富む「SSTT」(配列番号122)酸性クラスターをAlaに富む配列に置き換えるものである。これによりCKIIリン酸化が減少し、その結果、gEポリペプチドのトランスゴルジ網への局在化が減少する。
(6)AEAADA(配列番号58)配列を含み、かつ点変異Y582Gを有する完全長gEポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号29~32)。「YAGL」(配列番号121)モチーフは、gEポリペプチドのトランスゴルジ網への局在化を促進するエンドサイトーシスモチーフである。したがって、GAGL配列(配列番号132)をYAGL(配列番号121)に変えると、得られるポリペプチドのエンドサイトーシスが減少する。
(1)C末端領域の末端の62アミノ酸が欠失した切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号17~20)。得られるポリペプチドは、トランスゴルジ網への局在化が減少し、エンドサイトーシスが減少する。
(2)C末端領域の末端の62アミノ酸が欠失しており、かつシグナルペプチドがIgκに置き換えられた(これにより分泌型の切断型gEポリペプチドとなる)切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号21~24)。得られるポリペプチドは、トランスゴルジ網への局在化が減少し、エンドサイトーシスが減少する。
(3)C末端領域の末端の50アミノ酸が欠失した切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号33~36)。得られるポリペプチドは、トランスゴルジ網への局在化が減少し、エンドサイトーシスが減少する。
(4)C末端領域の末端の50アミノ酸が欠失しており、かつ点変異Y569Aを有する切断型ポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号37~40)。「AYRV」モチーフ(配列番号119)は、gEポリペプチドをトランスゴルジ網に標的化する輸送モチーフである。したがって、配列番号120のAARV配列を配列番号119のAYRVに変えると、gEポリペプチドのトランスゴルジ網への局在化が減少する。
(5)AEAADA(配列番号58)配列を含む完全長gEポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号25~28)。A-E-A-A-D-A(配列番号58)配列は、SESTDT(配列番号59)に代わるものであり、これは、Ser/Thrに富む「SSTT」(配列番号122)酸性クラスターをAlaに富む配列に置き換えるものである。これによりCKIIリン酸化が減少し、その結果、gEポリペプチドのトランスゴルジ網への局在化が減少する。
(6)AEAADA(配列番号58)配列を含み、かつ点変異Y582Gを有する完全長gEポリペプチドをコードするgEバリアントmRNA(配列番号29~32)。「YAGL」(配列番号121)モチーフは、gEポリペプチドのトランスゴルジ網への局在化を促進するエンドサイトーシスモチーフである。したがって、GAGL配列(配列番号132)をYAGL(配列番号121)に変えると、得られるポリペプチドのエンドサイトーシスが減少する。
これらのバリアントのそれぞれは、コードされたgEタンパク質のトランスゴルジ網への局在化を減少させ、形質膜への輸送を向上させる修飾を有する。表1は、種々のC末端配列を有するバリアントgE抗原をコードするmRNAについてまとめたものである。いくつかの実施形態において、バリアントmRNAは、5’キャップ、例えば、本明細書で開示されるキャップのいずれか、例えば、配列m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有するキャップを更に含む。いくつかの実施形態において、バリアントmRNAは、5’キャップを有しない。いくつかの実施形態において、バリアントmRNAは、少なくとも1つの化学修飾、例えば、本明細書で開示される化学修飾のいずれか、例えば、N1-メチルプソイドウリジン修飾またはN1-エチルプソイドウリジン修飾を有する。いくつかの実施形態において、mRNAは、化学修飾を有しない。mRNAバリアントをコードする配列を以下の表に記載する。
VZV-GE-欠失562
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号3)
VZV-GE-欠失562(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号125)
VZV-GE-欠失562-Igκ
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGAAACCCCGGCGCAGCTGCTGTTTCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCGGATACCACCGGCTCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号4)
VZV-GE-欠失562-Igκ(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGAAACCCCGGCGCAGCUGCUGUUUCUGCUGCUGCUGUGGCUGCCGGAUACCACCGGCUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号126)
VZV-GE-欠失574
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCTATAGGGTAGACAAGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号5)
VZV-GE-欠失574(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCUAUAGGGUAGACAAGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号127)
VZV-GE-欠失574-Y569A
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCGCCAGGGTAGACAAGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号6)
VZV-GE-欠失574-Y569A(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCGCCAGGGUAGACAAGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号128)
VZV-gE-完全長-AEAADA(配列番号58)
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCTATAGGGTAGACAAGTCCCCGTATAACCAAAGCATGTATTACGCTGGCCTTCCAGTGGACGATTTCGAGGACGCCGAAGCCGCCGATGCCGAAGAAGAGTTTGGTAACGCGATTGGAGGGAGTCACGGGGGTTCGAGTTACACGGTGTATATAGATAAGACCCGGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号7)
VZV-gE-完全長-AEAADA(配列番号58)(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCUAUAGGGUAGACAAGUCCCCGUAUAACCAAAGCAUGUAUUACGCUGGCCUUCCAGUGGACGAUUUCGAGGACGCCGAAGCCGCCGAUGCCGAAGAAGAGUUUGGUAACGCGAUUGGAGGGAGUCACGGGGGUUCGAGUUACACGGUGUAUAUAGAUAAGACCCGGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号129)
VZV-GE-完全-AEAADA(配列番号58)-Y582G
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCTATAGGGTAGACAAGTCCCCGTATAACCAAAGCATGTATGGCGCTGGCCTTCCAGTGGACGATTTCGAGGACGCCGAAGCCGCCGATGCCGAAGAAGAGTTTGGTAACGCGATTGGAGGGAGTCACGGGGGTTCGAGTTACACGGTGTATATAGATAAGACCCGGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号8)
VZV-GE-完全-AEAADA(配列番号58)-Y582G(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCUAUAGGGUAGACAAGUCCCCGUAUAACCAAAGCAUGUAUGGCGCUGGCCUUCCAGUGGACGAUUUCGAGGACGCCGAAGCCGCCGAUGCCGAAGAAGAGUUUGGUAACGCGAUUGGAGGGAGUCACGGGGGUUCGAGUUACACGGUGUAUAUAGAUAAGACCCGGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号130)
VZV_gE_Oka_hIgκ
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGAGACTCCCGCTCAGCTACTGTTCCTCCTGCTCCTTTGGCTGCCTGATACTACAGGCTCTGTTTTGCGGTACGACGACTTTCACATCGATGAGGACAAGCTCGACACTAATAGCGTGTATGAGCCCTACTACCATTCAGATCACGCCGAGTCCTCTTGGGTGAACAGGGGTGAAAGTTCTAGGAAAGCCTATGATCACAACAGCCCTTATATTTGGCCACGGAATGATTACGACGGATTTCTCGAAAATGCCCACGAGCATCACGGAGTGTACAACCAGGGCCGTGGAATCGACTCTGGGGAGAGATTGATGCAACCTACACAGATGAGCGCCCAGGAAGATCTCGGGGATGATACAGGAATTCACGTTATCCCTACATTAAACGGAGATGACCGCCACAAAATCGTCAATGTCGATCAAAGACAGTATGGAGATGTGTTCAAAGGCGATCTCAACCCTAAGCCGCAGGGCCAGAGACTCATTGAGGTGTCTGTCGAAGAGAACCACCCTTTCACTCTGCGCGCTCCCATTCAGAGAATCTATGGAGTTCGCTATACGGAGACTTGGTCATTCCTTCCTTCCCTGACATGCACCGGAGACGCCGCCCCTGCCATTCAGCACATATGCCTGAAACATACCACCTGTTTCCAGGATGTGGTGGTTGATGTTGATTGTGCTGAAAATACCAAGGAAGACCAACTGGCCGAGATTAGTTACCGGTTCCAAGGGAAAAAGGAAGCCGACCAGCCATGGATTGTGGTTAATACAAGCACTCTGTTCGATGAGCTCGAGCTGGATCCCCCCGAGATAGAACCCGGAGTTCTGAAAGTGCTCCGGACAGAAAAACAATATCTGGGAGTCTACATATGGAACATGCGCGGTTCCGATGGGACCTCCACTTATGCAACCTTTCTCGTCACGTGGAAGGGAGATGAGAAAACTAGGAATCCCACACCCGCTGTCACACCACAGCCAAGAGGGGCTGAGTTCCATATGTGGAACTATCATAGTCACGTGTTTAGTGTCGGAGATACGTTTTCATTGGCTATGCATCTCCAGTACAAGATTCATGAGGCTCCCTTCGATCTGTTGCTTGAGTGGTTGTACGTCCCGATTGACCCGACCTGCCAGCCCATGCGACTGTACAGCACCTGTCTCTACCATCCAAACGCTCCGCAATGTCTGAGCCACATGAACTCTGGGTGTACTTTCACCAGTCCCCACCTCGCCCAGCGGGTGGCCTCTACTGTTTACCAGAACTGTGAGCACGCCGACAACTACACCGCATACTGCCTCGGTATTTCTCACATGGAACCCTCCTTCGGACTCATCCTGCACGATGGGGGCACTACCCTGAAGTTCGTTGATACGCCAGAATCTCTGTCTGGGCTCTATGTTTTCGTGGTCTACTTCAATGGCCATGTCGAGGCCGTGGCCTATACTGTCGTTTCTACCGTGGATCATTTTGTGAACGCCATCGAAGAACGGGGATTCCCCCCTACGGCAGGCCAGCCGCCTGCAACCACCAAGCCCAAGGAAATAACACCAGTGAACCCTGGCACCTCACCTCTCCTAAGATATGCCGCGTGGACAGGGGGACTGGCGGCAGTGGTGCTCCTCTGTCTCGTGATCTTTCTGATCTGTACAGCCAAGAGGATGAGGGTCAAGGCTTATAGAGTGGACAAGTCCCCCTACAATCAGTCAATGTACTACGCCGGCCTTCCCGTTGATGATTTTGAGGATTCCGAGTCCACAGATACTGAGGAAGAGTTCGGTAACGCTATAGGCGGCTCTCACGGGGGTTCAAGCTACACGGTTTACATTGACAAGACACGCTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号41)
VZV_gE_Oka_hIgκ(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGAGACUCCCGCUCAGCUACUGUUCCUCCUGCUCCUUUGGCUGCCUGAUACUACAGGCUCUGUUUUGCGGUACGACGACUUUCACAUCGAUGAGGACAAGCUCGACACUAAUAGCGUGUAUGAGCCCUACUACCAUUCAGAUCACGCCGAGUCCUCUUGGGUGAACAGGGGUGAAAGUUCUAGGAAAGCCUAUGAUCACAACAGCCCUUAUAUUUGGCCACGGAAUGAUUACGACGGAUUUCUCGAAAAUGCCCACGAGCAUCACGGAGUGUACAACCAGGGCCGUGGAAUCGACUCUGGGGAGAGAUUGAUGCAACCUACACAGAUGAGCGCCCAGGAAGAUCUCGGGGAUGAUACAGGAAUUCACGUUAUCCCUACAUUAAACGGAGAUGACCGCCACAAAAUCGUCAAUGUCGAUCAAAGACAGUAUGGAGAUGUGUUCAAAGGCGAUCUCAACCCUAAGCCGCAGGGCCAGAGACUCAUUGAGGUGUCUGUCGAAGAGAACCACCCUUUCACUCUGCGCGCUCCCAUUCAGAGAAUCUAUGGAGUUCGCUAUACGGAGACUUGGUCAUUCCUUCCUUCCCUGACAUGCACCGGAGACGCCGCCCCUGCCAUUCAGCACAUAUGCCUGAAACAUACCACCUGUUUCCAGGAUGUGGUGGUUGAUGUUGAUUGUGCUGAAAAUACCAAGGAAGACCAACUGGCCGAGAUUAGUUACCGGUUCCAAGGGAAAAAGGAAGCCGACCAGCCAUGGAUUGUGGUUAAUACAAGCACUCUGUUCGAUGAGCUCGAGCUGGAUCCCCCCGAGAUAGAACCCGGAGUUCUGAAAGUGCUCCGGACAGAAAAACAAUAUCUGGGAGUCUACAUAUGGAACAUGCGCGGUUCCGAUGGGACCUCCACUUAUGCAACCUUUCUCGUCACGUGGAAGGGAGAUGAGAAAACUAGGAAUCCCACACCCGCUGUCACACCACAGCCAAGAGGGGCUGAGUUCCAUAUGUGGAACUAUCAUAGUCACGUGUUUAGUGUCGGAGAUACGUUUUCAUUGGCUAUGCAUCUCCAGUACAAGAUUCAUGAGGCUCCCUUCGAUCUGUUGCUUGAGUGGUUGUACGUCCCGAUUGACCCGACCUGCCAGCCCAUGCGACUGUACAGCACCUGUCUCUACCAUCCAAACGCUCCGCAAUGUCUGAGCCACAUGAACUCUGGGUGUACUUUCACCAGUCCCCACCUCGCCCAGCGGGUGGCCUCUACUGUUUACCAGAACUGUGAGCACGCCGACAACUACACCGCAUACUGCCUCGGUAUUUCUCACAUGGAACCCUCCUUCGGACUCAUCCUGCACGAUGGGGGCACUACCCUGAAGUUCGUUGAUACGCCAGAAUCUCUGUCUGGGCUCUAUGUUUUCGUGGUCUACUUCAAUGGCCAUGUCGAGGCCGUGGCCUAUACUGUCGUUUCUACCGUGGAUCAUUUUGUGAACGCCAUCGAAGAACGGGGAUUCCCCCCUACGGCAGGCCAGCCGCCUGCAACCACCAAGCCCAAGGAAAUAACACCAGUGAACCCUGGCACCUCACCUCUCCUAAGAUAUGCCGCGUGGACAGGGGGACUGGCGGCAGUGGUGCUCCUCUGUCUCGUGAUCUUUCUGAUCUGUACAGCCAAGAGGAUGAGGGUCAAGGCUUAUAGAGUGGACAAGUCCCCCUACAAUCAGUCAAUGUACUACGCCGGCCUUCCCGUUGAUGAUUUUGAGGAUUCCGAGUCCACAGAUACUGAGGAAGAGUUCGGUAACGCUAUAGGCGGCUCUCACGGGGGUUCAAGCUACACGGUUUACAUUGACAAGACACGCUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号131)
G*は、5’末端キャップ、例えば、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpを表す。
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号3)
VZV-GE-欠失562(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号125)
VZV-GE-欠失562-Igκ
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGAAACCCCGGCGCAGCTGCTGTTTCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCGGATACCACCGGCTCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号4)
VZV-GE-欠失562-Igκ(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGAAACCCCGGCGCAGCUGCUGUUUCUGCUGCUGCUGUGGCUGCCGGAUACCACCGGCUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号126)
VZV-GE-欠失574
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCTATAGGGTAGACAAGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号5)
VZV-GE-欠失574(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCUAUAGGGUAGACAAGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号127)
VZV-GE-欠失574-Y569A
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCGCCAGGGTAGACAAGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号6)
VZV-GE-欠失574-Y569A(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCGCCAGGGUAGACAAGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号128)
VZV-gE-完全長-AEAADA(配列番号58)
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCTATAGGGTAGACAAGTCCCCGTATAACCAAAGCATGTATTACGCTGGCCTTCCAGTGGACGATTTCGAGGACGCCGAAGCCGCCGATGCCGAAGAAGAGTTTGGTAACGCGATTGGAGGGAGTCACGGGGGTTCGAGTTACACGGTGTATATAGATAAGACCCGGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号7)
VZV-gE-完全長-AEAADA(配列番号58)(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCUAUAGGGUAGACAAGUCCCCGUAUAACCAAAGCAUGUAUUACGCUGGCCUUCCAGUGGACGAUUUCGAGGACGCCGAAGCCGCCGAUGCCGAAGAAGAGUUUGGUAACGCGAUUGGAGGGAGUCACGGGGGUUCGAGUUACACGGUGUAUAUAGAUAAGACCCGGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号129)
VZV-GE-完全-AEAADA(配列番号58)-Y582G
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATATGCCGCATGGACCGGAGGGCTTGCAGCAGTAGTACTTTTATGTCTCGTAATATTTTTAATCTGTACGGCTAAACGAATGAGGGTTAAAGCCTATAGGGTAGACAAGTCCCCGTATAACCAAAGCATGTATGGCGCTGGCCTTCCAGTGGACGATTTCGAGGACGCCGAAGCCGCCGATGCCGAAGAAGAGTTTGGTAACGCGATTGGAGGGAGTCACGGGGGTTCGAGTTACACGGTGTATATAGATAAGACCCGGTGATGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号8)
VZV-GE-完全-AEAADA(配列番号58)-Y582G(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGGACAGUUAAUAAACCUGUGGUGGGGGUAUUGAUGGGGUUCGGAAUUAUCACGGGAACGUUGCGUAUAACGAAUCCGGUCAGAGCAUCCGUCUUGCGAUACGAUGAUUUUCACAUCGAUGAAGACAAACUGGAUACAAACUCCGUAUAUGAGCCUUACUACCAUUCAGAUCAUGCGGAGUCUUCAUGGGUAAAUCGGGGAGAGUCUUCGCGAAAAGCGUACGAUCAUAACUCACCUUAUAUAUGGCCACGUAAUGAUUAUGAUGGAUUUUUAGAGAACGCACACGAACACCAUGGGGUGUAUAAUCAGGGCCGUGGUAUCGAUAGCGGGGAACGGUUAAUGCAACCCACACAAAUGUCUGCACAGGAGGAUCUUGGGGACGAUACGGGCAUCCACGUUAUCCCUACGUUAAACGGCGAUGACAGACAUAAAAUUGUAAAUGUGGACCAACGUCAAUACGGUGACGUGUUUAAAGGAGAUCUUAAUCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACUCAUUGAGGUGUCAGUGGAAGAAAAUCACCCGUUUACUUUACGCGCACCGAUUCAGCGGAUUUAUGGAGUCCGGUACACCGAGACUUGGAGCUUUUUGCCGUCAUUAACCUGUACGGGAGACGCAGCGCCCGCCAUCCAGCAUAUAUGUUUAAAACAUACAACAUGCUUUCAAGACGUGGUGGUGGAUGUGGAUUGCGCGGAAAAUACUAAAGAGGAUCAGUUGGCCGAAAUCAGUUACCGUUUUCAAGGUAAGAAGGAAGCGGACCAACCGUGGAUUGUUGUAAACACGAGCACACUGUUUGAUGAACUCGAAUUAGACCCCCCCGAGAUUGAACCGGGUGUCUUGAAAGUACUUCGGACAGAAAAACAAUACUUGGGUGUGUACAUUUGGAACAUGCGCGGCUCCGAUGGUACGUCUACCUACGCCACGUUUUUGGUCACCUGGAAAGGGGAUGAAAAAACAAGAAACCCUACGCCCGCAGUAACUCCUCAACCAAGAGGGGCUGAGUUUCAUAUGUGGAAUUACCACUCGCAUGUAUUUUCAGUUGGUGAUACGUUUAGCUUGGCAAUGCAUCUUCAGUAUAAGAUACAUGAAGCGCCAUUUGAUUUGCUGUUAGAGUGGUUGUAUGUCCCCAUCGAUCCUACAUGUCAACCAAUGCGGUUAUAUUCUACGUGUUUGUAUCAUCCCAACGCACCCCAAUGCCUCUCUCAUAUGAAUUCCGGUUGUACAUUUACCUCGCCACAUUUAGCCCAGCGUGUUGCAAGCACAGUGUAUCAAAAUUGUGAACAUGCAGAUAACUACACCGCAUAUUGUCUGGGAAUAUCUCAUAUGGAGCCUAGCUUUGGUCUAAUCUUACACGACGGGGGCACCACGUUAAAGUUUGUAGAUACACCCGAGAGUUUGUCGGGAUUAUACGUUUUUGUGGUGUAUUUUAACGGGCAUGUUGAAGCCGUAGCAUACACUGUUGUAUCCACAGUAGAUCAUUUUGUAAACGCAAUUGAAGAGCGUGGAUUUCCGCCAACGGCCGGUCAGCCACCGGCGACUACUAAACCCAAGGAAAUUACCCCCGUAAACCCCGGAACGUCACCACUUCUACGAUAUGCCGCAUGGACCGGAGGGCUUGCAGCAGUAGUACUUUUAUGUCUCGUAAUAUUUUUAAUCUGUACGGCUAAACGAAUGAGGGUUAAAGCCUAUAGGGUAGACAAGUCCCCGUAUAACCAAAGCAUGUAUGGCGCUGGCCUUCCAGUGGACGAUUUCGAGGACGCCGAAGCCGCCGAUGCCGAAGAAGAGUUUGGUAACGCGAUUGGAGGGAGUCACGGGGGUUCGAGUUACACGGUGUAUAUAGAUAAGACCCGGUGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号130)
VZV_gE_Oka_hIgκ
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATGGAGACTCCCGCTCAGCTACTGTTCCTCCTGCTCCTTTGGCTGCCTGATACTACAGGCTCTGTTTTGCGGTACGACGACTTTCACATCGATGAGGACAAGCTCGACACTAATAGCGTGTATGAGCCCTACTACCATTCAGATCACGCCGAGTCCTCTTGGGTGAACAGGGGTGAAAGTTCTAGGAAAGCCTATGATCACAACAGCCCTTATATTTGGCCACGGAATGATTACGACGGATTTCTCGAAAATGCCCACGAGCATCACGGAGTGTACAACCAGGGCCGTGGAATCGACTCTGGGGAGAGATTGATGCAACCTACACAGATGAGCGCCCAGGAAGATCTCGGGGATGATACAGGAATTCACGTTATCCCTACATTAAACGGAGATGACCGCCACAAAATCGTCAATGTCGATCAAAGACAGTATGGAGATGTGTTCAAAGGCGATCTCAACCCTAAGCCGCAGGGCCAGAGACTCATTGAGGTGTCTGTCGAAGAGAACCACCCTTTCACTCTGCGCGCTCCCATTCAGAGAATCTATGGAGTTCGCTATACGGAGACTTGGTCATTCCTTCCTTCCCTGACATGCACCGGAGACGCCGCCCCTGCCATTCAGCACATATGCCTGAAACATACCACCTGTTTCCAGGATGTGGTGGTTGATGTTGATTGTGCTGAAAATACCAAGGAAGACCAACTGGCCGAGATTAGTTACCGGTTCCAAGGGAAAAAGGAAGCCGACCAGCCATGGATTGTGGTTAATACAAGCACTCTGTTCGATGAGCTCGAGCTGGATCCCCCCGAGATAGAACCCGGAGTTCTGAAAGTGCTCCGGACAGAAAAACAATATCTGGGAGTCTACATATGGAACATGCGCGGTTCCGATGGGACCTCCACTTATGCAACCTTTCTCGTCACGTGGAAGGGAGATGAGAAAACTAGGAATCCCACACCCGCTGTCACACCACAGCCAAGAGGGGCTGAGTTCCATATGTGGAACTATCATAGTCACGTGTTTAGTGTCGGAGATACGTTTTCATTGGCTATGCATCTCCAGTACAAGATTCATGAGGCTCCCTTCGATCTGTTGCTTGAGTGGTTGTACGTCCCGATTGACCCGACCTGCCAGCCCATGCGACTGTACAGCACCTGTCTCTACCATCCAAACGCTCCGCAATGTCTGAGCCACATGAACTCTGGGTGTACTTTCACCAGTCCCCACCTCGCCCAGCGGGTGGCCTCTACTGTTTACCAGAACTGTGAGCACGCCGACAACTACACCGCATACTGCCTCGGTATTTCTCACATGGAACCCTCCTTCGGACTCATCCTGCACGATGGGGGCACTACCCTGAAGTTCGTTGATACGCCAGAATCTCTGTCTGGGCTCTATGTTTTCGTGGTCTACTTCAATGGCCATGTCGAGGCCGTGGCCTATACTGTCGTTTCTACCGTGGATCATTTTGTGAACGCCATCGAAGAACGGGGATTCCCCCCTACGGCAGGCCAGCCGCCTGCAACCACCAAGCCCAAGGAAATAACACCAGTGAACCCTGGCACCTCACCTCTCCTAAGATATGCCGCGTGGACAGGGGGACTGGCGGCAGTGGTGCTCCTCTGTCTCGTGATCTTTCTGATCTGTACAGCCAAGAGGATGAGGGTCAAGGCTTATAGAGTGGACAAGTCCCCCTACAATCAGTCAATGTACTACGCCGGCCTTCCCGTTGATGATTTTGAGGATTCCGAGTCCACAGATACTGAGGAAGAGTTCGGTAACGCTATAGGCGGCTCTCACGGGGGTTCAAGCTACACGGTTTACATTGACAAGACACGCTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号41)
VZV_gE_Oka_hIgκ(mRNA)
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGAGACUCCCGCUCAGCUACUGUUCCUCCUGCUCCUUUGGCUGCCUGAUACUACAGGCUCUGUUUUGCGGUACGACGACUUUCACAUCGAUGAGGACAAGCUCGACACUAAUAGCGUGUAUGAGCCCUACUACCAUUCAGAUCACGCCGAGUCCUCUUGGGUGAACAGGGGUGAAAGUUCUAGGAAAGCCUAUGAUCACAACAGCCCUUAUAUUUGGCCACGGAAUGAUUACGACGGAUUUCUCGAAAAUGCCCACGAGCAUCACGGAGUGUACAACCAGGGCCGUGGAAUCGACUCUGGGGAGAGAUUGAUGCAACCUACACAGAUGAGCGCCCAGGAAGAUCUCGGGGAUGAUACAGGAAUUCACGUUAUCCCUACAUUAAACGGAGAUGACCGCCACAAAAUCGUCAAUGUCGAUCAAAGACAGUAUGGAGAUGUGUUCAAAGGCGAUCUCAACCCUAAGCCGCAGGGCCAGAGACUCAUUGAGGUGUCUGUCGAAGAGAACCACCCUUUCACUCUGCGCGCUCCCAUUCAGAGAAUCUAUGGAGUUCGCUAUACGGAGACUUGGUCAUUCCUUCCUUCCCUGACAUGCACCGGAGACGCCGCCCCUGCCAUUCAGCACAUAUGCCUGAAACAUACCACCUGUUUCCAGGAUGUGGUGGUUGAUGUUGAUUGUGCUGAAAAUACCAAGGAAGACCAACUGGCCGAGAUUAGUUACCGGUUCCAAGGGAAAAAGGAAGCCGACCAGCCAUGGAUUGUGGUUAAUACAAGCACUCUGUUCGAUGAGCUCGAGCUGGAUCCCCCCGAGAUAGAACCCGGAGUUCUGAAAGUGCUCCGGACAGAAAAACAAUAUCUGGGAGUCUACAUAUGGAACAUGCGCGGUUCCGAUGGGACCUCCACUUAUGCAACCUUUCUCGUCACGUGGAAGGGAGAUGAGAAAACUAGGAAUCCCACACCCGCUGUCACACCACAGCCAAGAGGGGCUGAGUUCCAUAUGUGGAACUAUCAUAGUCACGUGUUUAGUGUCGGAGAUACGUUUUCAUUGGCUAUGCAUCUCCAGUACAAGAUUCAUGAGGCUCCCUUCGAUCUGUUGCUUGAGUGGUUGUACGUCCCGAUUGACCCGACCUGCCAGCCCAUGCGACUGUACAGCACCUGUCUCUACCAUCCAAACGCUCCGCAAUGUCUGAGCCACAUGAACUCUGGGUGUACUUUCACCAGUCCCCACCUCGCCCAGCGGGUGGCCUCUACUGUUUACCAGAACUGUGAGCACGCCGACAACUACACCGCAUACUGCCUCGGUAUUUCUCACAUGGAACCCUCCUUCGGACUCAUCCUGCACGAUGGGGGCACUACCCUGAAGUUCGUUGAUACGCCAGAAUCUCUGUCUGGGCUCUAUGUUUUCGUGGUCUACUUCAAUGGCCAUGUCGAGGCCGUGGCCUAUACUGUCGUUUCUACCGUGGAUCAUUUUGUGAACGCCAUCGAAGAACGGGGAUUCCCCCCUACGGCAGGCCAGCCGCCUGCAACCACCAAGCCCAAGGAAAUAACACCAGUGAACCCUGGCACCUCACCUCUCCUAAGAUAUGCCGCGUGGACAGGGGGACUGGCGGCAGUGGUGCUCCUCUGUCUCGUGAUCUUUCUGAUCUGUACAGCCAAGAGGAUGAGGGUCAAGGCUUAUAGAGUGGACAAGUCCCCCUACAAUCAGUCAAUGUACUACGCCGGCCUUCCCGUUGAUGAUUUUGAGGAUUCCGAGUCCACAGAUACUGAGGAAGAGUUCGGUAACGCUAUAGGCGGCUCUCACGGGGGUUCAAGCUACACGGUUUACAUUGACAAGACACGCUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号131)
実施例14:Vero細胞及びMewo細胞におけるバリアントgE抗原の分布
種々のC末端バリアントを有するVZV gE抗原の発現及び輸送をVero細胞及びMewo細胞で調べた。
種々のC末端バリアントを有するVZV gE抗原の発現及び輸送をVero細胞及びMewo細胞で調べた。
Vero細胞は、細胞培養で使用される細胞系統である。「Vero」系統は、アフリカミドリザルから採取された腎臓上皮細胞から分離されたものである。MeWo細胞は、VZV感染に感受性のあるヒト悪性黒色腫細胞である。Vero細胞またはMewo細胞に以下の表3に示す構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をgEならびにゴルジ体マーカーのGM130及びゴルジンに対する抗体で染色した。共焦点顕微鏡を使用して染色細胞を可視化した。各構築物の結果を表3(「細胞局在化」の列)に記載する。図9は、例示的な実験を示し、以下のトランスフェクト構築物の結果を示す。(1)C末端に62アミノ酸欠失を有するVZV gEポリペプチドをコードするVZV gE mRNA(配列番号3によってコードされる)、(2)AEAADA配列(配列番号58)を有するVZV gEポリペプチドをコードする完全長VZV gE mRNA(配列番号7によってコードされる)、または(3)PBS(陰性対照)。抗gE抗体を使用すると、図9から、切断型VZV gEポリペプチド(62アミノ酸のC末端欠失を有する)が核周辺位置及びオルガネラに局在することがわかる。AEAADA配列(配列番号58)を有する完全長VZV gEポリペプチドは、ゴルジ体及び核周辺位置に局在した。重要なことは、構築物のいくつか、例えば、gE-切断型-574からの欠失_Y569A、AEAADA(配列番号58)を含むgE完全長、AEAADA(配列番号58)及びY582C変異を含むgE完全長、gE-切断型-574からの欠失、ならびにY569A変異を含むgE-切断型-574からの欠失がそれぞれ細胞膜に局在化するポリペプチドをコードしていることであり、これは、これらのポリペプチドが増大した抗原性を有し得ることを示している。
実施例15:MC3で製剤化したmRNAによりコードされたVZV gE抗原によるBALB/Cマウスの免疫付与
筋肉内投与または皮内投与後のBALB/Cマウスにおいて免疫付与を達成するワクチンの候補である、MC3で製剤化したVZV抗原をコードするmRNAの作用の初期評価として、免疫付与試験を実施した。
筋肉内投与または皮内投与後のBALB/Cマウスにおいて免疫付与を達成するワクチンの候補である、MC3で製剤化したVZV抗原をコードするmRNAの作用の初期評価として、免疫付与試験を実施した。
候補ワクチンは、以下のとおりであった。
(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル、N1-メチルプソイドウリジン化学修飾及び追加のhIgκ配列を有する、MC3製剤化VZVgE-hIgκ mRNA
(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有する、MC3製剤化VZV gE mRNA
(3)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のない、MC3製剤化VZV gE mRNA。
(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル、N1-メチルプソイドウリジン化学修飾及び追加のhIgκ配列を有する、MC3製剤化VZVgE-hIgκ mRNA
(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有する、MC3製剤化VZV gE mRNA
(3)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のない、MC3製剤化VZV gE mRNA。
VZV gE mRNAの全てがOka株であった。
BALB/Cマウスに、10μg用量1回または10μg用量2回(28日目)のMC3製剤化VZV gE mRNA(上記のワクチン(1)、(2)または(3)のいずれか)を筋肉内または皮内のいずれかで投与した。G5は、N1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するmRNAを指す。G0は、非修飾型mRNAを指す。キャップ1は、5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを指す。各処置群には8頭のマウスを含めた。陽性対照はVARIVAX(登録商標)ワクチン、陰性対照はPBSであった。
血液試料を採取し、血清タンパク質及び抗体の存在/レベルを決定した。6時間でウェスタンブロットを実施してVZV-gEタンパク質発現を検出し、ELISAを実施してマウスIgGを検出した。VZV gE(Oka株)をコードする構築物の模式図を図2に示す。本試験の設計及び注射スケジュールの概要を図3及び表3を示す。表4は、種々の試料の採取に関する様々な時点を示す。血液を血清タンパク質及び抗体決定のために採取したが、群1~4、13及び14については0日目の投与後6時間、群2、4及び14については28日目の投与後6時間に、VZVタンパク質発現を調査した。-3日目、14日目、27日目、42日目及び56日目に抗体検出アッセイを実施した。
実施例16:免疫原性試験:ELISA
本試験は、VZV由来の糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計した。種々のVZV mRNAワクチン製剤による免疫付与を指定間隔でマウスに行い、各免疫付与後に血清を採取した。免疫化スケジュールを実施例15の表2に記載する。血清採取スケジュールを実施例15の表4に示す。
本試験は、VZV由来の糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計した。種々のVZV mRNAワクチン製剤による免疫付与を指定間隔でマウスに行い、各免疫付与後に血清を採取した。免疫化スケジュールを実施例15の表2に記載する。血清採取スケジュールを実施例15の表4に示す。
酵素結合免疫吸着法(ELISA)
標準法を使用した酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって、VZV糖タンパク質Eに対する血清抗体力価を決定した。一試験において、抗VZV gEマウスIgGの量を、前採血と、(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE-hIgκ(表2及び3の1番目)、(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のないVZV-gE(表2及び3の6番目)、(3)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE(表2及び3の10番目)、(4)VARIVAX(登録商標)ワクチン(陽性対照)、または(5)PBS(陰性対照)のいずれかの10μg用量2回を筋肉内にワクチン投与したマウスにおけるワクチン接種後14日目及び42日目に採取した血清とで測定した。
標準法を使用した酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって、VZV糖タンパク質Eに対する血清抗体力価を決定した。一試験において、抗VZV gEマウスIgGの量を、前採血と、(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE-hIgκ(表2及び3の1番目)、(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のないVZV-gE(表2及び3の6番目)、(3)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE(表2及び3の10番目)、(4)VARIVAX(登録商標)ワクチン(陽性対照)、または(5)PBS(陰性対照)のいずれかの10μg用量2回を筋肉内にワクチン投与したマウスにおけるワクチン接種後14日目及び42日目に採取した血清とで測定した。
図5~7は、現行のVARIVAX(登録商標)ワクチンと比較して、試験した全てのVZV-gEコードmRNAワクチンによる免疫応答が非常に強かったことを示している。図5は、14日目における抗VZV-gE IgGの力価が、ワクチン候補(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE-hIgκをワクチン投与したマウスの血清で約10μg/mLであり、ワクチン候補(3)VZV-gE 5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾をワクチン投与したマウスの血清で約50μg/mLであったことを示している。VARIVAX(登録商標)をワクチン投与したマウスの血清中の抗VZV-gE IgGレベルは、14日目では検出されなかった。42日目では、ワクチン候補(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE-hIgκまたはワクチン候補(3)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gEをワクチン投与したマウスの血清中に存在する抗VZV-gE IgGの量は、VARIVAX(登録商標)をワクチン投与したマウスの血清中に存在する抗VZV-gE IgGの量よりもほぼ1000倍多かった。ワクチン候補(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のないVZV-gEをワクチン投与したマウスの血清中に存在する抗VZV gE IgGの量は、VARIVAX(登録商標)をワクチン投与したマウスの血清中に存在する抗VZV-gEIgGの量よりもほぼ100倍多かった。本試験は、試験したVZV gE mRNAワクチンのそれぞれが、現行のVARIVAX(登録商標)VZVワクチンよりも免疫原性の高いワクチンであることを示している。
実施例17:免疫原性試験:ELISA
本試験は、VZV由来の糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計した。種々のVZV mRNAワクチン製剤による免疫付与を指定間隔でマウスに行い、各免疫付与後に血清を採取した。免疫化スケジュールを実施例15の表4に記載する。血清採取スケジュールを実施例15の表5に示す。
本試験は、VZV由来の糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計した。種々のVZV mRNAワクチン製剤による免疫付与を指定間隔でマウスに行い、各免疫付与後に血清を採取した。免疫化スケジュールを実施例15の表4に記載する。血清採取スケジュールを実施例15の表5に示す。
標準法を使用した酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって、VZV糖タンパク質Eに対する血清抗体力価を決定した。第2の拡大試験では、血清試料を連続希釈して、シグナルがELISAを使用して検出できる範囲内になるようにした。抗VZV gEマウスIgGの量を、(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE-hIgκ(表2及び3の1番)、(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のないVZV-gE(表2及び3の6番目)、(3)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE(表2及び3の10番目)、(4)VARIVAX(登録商標)ワクチン(陽性対照)、または(5)PBS(陰性対照)のいずれかの10μg用量2回を筋肉内にワクチン投与したマウスにおけるワクチン接種後42日目に採取した血清で測定した。抗VZV-gEマウスIgGの濃度を10倍連続希釈で測定した。
図6は、最も強い免疫応答が、ワクチン候補(1)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有するVZV-gE-hIgκをワクチン投与したマウスでみられたことを示している。2番目に強い応答は、ワクチン候補(3)VZV-gE 5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾をワクチン投与したマウスでみられた。3番目に強い応答は、ワクチン候補(2)5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチルを有し、化学修飾のないVZV-gEをワクチン投与したマウスでみられた。3つ全てのVZV gEmRNAワクチンが、VARIVAX(登録商標)ワクチンよりも著しく大きい免疫応答をもたらした。
図7は、ワクチン(1)~(4)及び(5)陰性対照をワクチン投与したマウスに存在するワクチン投与後3日目、14日目及び42日目の抗VZV-gEマウスIgGの量を示す。
実施例18:免疫原性試験
本試験は、VZV由来のバリアント糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計する。種々のVZV mRNAワクチン製剤による免疫付与を指定間隔でマウスに行い、各免疫付与後の指定時点で血清を採取した。免疫化スケジュールを以下の表6に記載する。血清採取スケジュールを以下の表7に示す。
本試験は、VZV由来のバリアント糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計する。種々のVZV mRNAワクチン製剤による免疫付与を指定間隔でマウスに行い、各免疫付与後の指定時点で血清を採取した。免疫化スケジュールを以下の表6に記載する。血清採取スケジュールを以下の表7に示す。
抗VZV gEマウスIgGの量を、指定した構築物の10μg用量または2μg用量2回を筋肉内にワクチン投与したマウスにおいて、ワクチン接種後の表7に示す時点で採取した血清で測定した。使用したmRNAは全て5’キャップ:m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-メチル及びN1-メチルプソイドウリジン化学修飾を有する。ZOSTAVAX(登録商標)を陽性対照として使用し、19400pfu SCの臨床用量でマウスに2回筋肉内注射した。PBSを陰性対照として使用した。
表6に示すVZV gEバリアントmRNAワクチンで免疫付与したマウスの血清中のVZV gEバリアントポリペプチドに対する抗体力価を酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって決定した。ELISAを実施するために、PBS中のVZV gE抗原(Abcam:ab43050)をプレートの各ウェルにコーティングした。100μlのVZV gE抗原を濃度1、2または4μg/mlで使用して4℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを300μlのPBST(0.05%tween含有PBS)で3回洗浄した。VZV gEをコーティングしたウェルを、PBS中に1%Blottoを含有するブロッキングバッファー200μlにより室温で30分間ブロックした。抗VZV gE抗体を含有するマウス血清を1:2000に希釈し、次いで、PBSTを使用して1:3の連続希釈に供した。希釈した血清をVZV gEコーティングウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ウサギ抗マウス二次抗体(Abcam:ab6728)をPBSTで1:1000に希釈し、100μlの二次抗体含有溶液をウェルに加え、室温で45分間インキュベートした。100μlのHRP基質KPL TMBをウェルに加え、室温で3分間インキュベートした後、100μlの反応停止液(2M H2SO4)を加えてHRP反応を停止した。HRP基質から生成されたシグナルをA450で測定した。結果を図11A、11B、12A、12B、13ならびに表8及び9に示した。
図11Aは、2回の10μg投与後に、全てのgEバリアントがZOSTAVAX(登録商標)よりも非常に強い免疫応答を誘導したことを示している。図11Bは、2回の2μg投与後に、全てのgEバリアントがZOSTAVAX(登録商標)よりも非常に強い免疫応答を誘導したことを示している。どちらの用量でも、gEバリアントのGE-欠失574_Y569A及びGE-欠失562-IgκSPが最も強い免疫応答を誘導し、このgEバリアントで免疫付与したマウスの血清で測定した抗体力価は、ZOSTAVAX(登録商標)で免疫付与したマウスの血清で測定した抗体力価の10倍を超えることから、GE-欠失574_Y569A及びGE-欠失562-IgκSP mRNAがVZVに対する優れたワクチン候補であることが示唆される。
図12Aは、表6に記載のVZV gE mRNAバリアントを10μgで2回免疫付加したマウスから採取した滴定血清中の抗体量を示す。図12Bは、表6に記載のVZV gE mRNAバリアントを2μgで2回免疫付加したマウスから採取した滴定血清中の抗体量を示す。血清を100倍超で希釈した場合、抗体力価は、ZOSTAVAX(登録商標)ワクチン投与マウスの血清よりもVZV gEバリアントワクチン接種マウスの血清のほうが高く、VZV gEmRNAバリアントが、マウスにおいて、ZOSTAVAX(登録商標)よりも非常に強い免疫応答を誘導したことを示唆している。試験した全てのVZV gE mRNAバリアントが、マウスにおいて、類似の免疫応答誘導能力を示した。
図13は、各VZV gEバリアントmRNAワクチンによって誘導された抗VZV gE免疫応答をZOSTAVAX(登録商標)と比較して示すグラフである。VZV gEバリアントのGE-574からの欠失-Y569Aは、マウスにおいて、ZOSTAVAX(登録商標)よりも約1log大きい免疫応答を誘導した。
表9は、10μgまたは2μgの各VZV gEmRNAを2回免疫付加したマウスから採取した血清のIgG逆数力価(IC50)をまとめたものである。GE-574からの欠失-Y569Aは、10μgまたは2μgのいずれの用量でも強い免疫応答を誘導した。幾何平均力価(GMT)を使用して、VZV gEバリアントmRNAワクチンの免疫原性の能力を示した。GE-574からの欠失-Y569Aが最も高いGMT値を示したことから、VZV gEに対する免疫応答を誘導するのに最も有効的であることが示唆される。
実施例19:VZVのin vitro中和アッセイ
VZVのin vitro中和アッセイを実施して,VZVの中和における抗VZV gE抗体を評価した。抗VZV gE抗体は、VZV gEバリアントmRNAワクチンを投与したマウスの血清を採取することによって得た。マウスには、表6に記載のとおり、10μgまたは2μgの用量でVZV gEバリアントmRNAワクチンを投与し、血清を2回目の免疫付与から2週間後に採取した。
VZVのin vitro中和アッセイを実施して,VZVの中和における抗VZV gE抗体を評価した。抗VZV gE抗体は、VZV gEバリアントmRNAワクチンを投与したマウスの血清を採取することによって得た。マウスには、表6に記載のとおり、10μgまたは2μgの用量でVZV gEバリアントmRNAワクチンを投与し、血清を2回目の免疫付与から2週間後に採取した。
アッセイを実施するために、マウス血清を1:5に希釈し、次いで、1:2の連続希釈に供した。VZVウイルスを血清に加え、室温で1時間中和を継続させた。1日前にARPE-19細胞を96ウェルに播種し、ウイルス/血清混合物を50~100pfu/ウェルでARPE-19細胞に加えた。翌日、ARPE-19細胞を固定し、VZV特異的染色を行った。プレートをスキャンし、分析した。VZVのin vitro中和アッセイの結果を表10にまとめた。表10中の値は、VZVウイルスプラークによるウェル被覆範囲が50%の減少を示す血清希釈度である。プラーク数の減少は観察されなかった。表10に示されるように、GE-574からの欠失-Y569AのバリアントmRNAワクチンで免疫付加したマウスの血清の反復試験の1つは、1:80の希釈で、VZVウイルスプラークによるウェル被覆範囲を減少させることができた。
実施例20:マウスにおける免疫原性
帯状ヘルペス(HZ)または帯状疱疹は小水疱性発疹を特徴とする衰弱性疾患であり、最も一般的な合併症は帯状疱疹後神経痛(PHN)である。PHNは、皮膚での発生が解消された後に発症する継続的かつ重度の痛みであり、数年続くこともあるため、罹患した個体の高罹患状態の一因となっている。HZは、知覚神経節から潜伏性水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)が再活性化することによって引き起こされる。VZV一次感染(水疱瘡)中に起こる免疫応答は、潜伏性VZVの再活性化を防ぐことが示されている。しかしながら、HZの発生率は、加齢と強い関連性がある。いくつかの調査により、T細胞媒介性免疫応答は、加齢とともに、また免疫抑制中に低下し、VZVの再活性化をもたらすことが示されている。しかし、抗VZV抗体レベルは、年齢を重ねても比較的安定したままであることから、体液性免疫応答がHZの予防に十分ではない可能性が示されている。いくつかの研究は、VZV特異的CD4+及びCD8+T細胞の誘導を報告しており、CD4+T細胞が記憶応答を支配している。
帯状ヘルペス(HZ)または帯状疱疹は小水疱性発疹を特徴とする衰弱性疾患であり、最も一般的な合併症は帯状疱疹後神経痛(PHN)である。PHNは、皮膚での発生が解消された後に発症する継続的かつ重度の痛みであり、数年続くこともあるため、罹患した個体の高罹患状態の一因となっている。HZは、知覚神経節から潜伏性水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)が再活性化することによって引き起こされる。VZV一次感染(水疱瘡)中に起こる免疫応答は、潜伏性VZVの再活性化を防ぐことが示されている。しかしながら、HZの発生率は、加齢と強い関連性がある。いくつかの調査により、T細胞媒介性免疫応答は、加齢とともに、また免疫抑制中に低下し、VZVの再活性化をもたらすことが示されている。しかし、抗VZV抗体レベルは、年齢を重ねても比較的安定したままであることから、体液性免疫応答がHZの予防に十分ではない可能性が示されている。いくつかの研究は、VZV特異的CD4+及びCD8+T細胞の誘導を報告しており、CD4+T細胞が記憶応答を支配している。
承認されたZostavaxワクチンは、50~60歳の成人で約60~70%の有効性を示しており、年齢とともに低下する。近年、サブユニットアジュバント付加ワクチン(Shingrix:gEタンパク質+ASO1B)が50歳以上の成人の全ての年齢群において約90%の有効性を有することが示された。しかしながら、このワクチンは、ワクチン接種対象の10%でグレード3の重症のAEを示した。Shingrixは、Zostavaxに対して、2回投与後、約1log倍良好なT細胞及びB細胞応答を示した。本試験では、gE構築物を用いたmRNA免疫付与により、マウス及びNHPにおける免疫原性を調べた。
本試験は、VZV由来の糖タンパク質gEをコードするmRNAポリヌクレオチドを含む候補VZVワクチンのBALB/Cマウスにおける免疫原性を試験するように設計した。以下の表11に記載する種々のVZV mRNAワクチン製剤でマウスに免疫付加した。第1群~第5群には一次水痘曝露を再現するためにZOSTAVAX(登録商標)を初回投与し、第6群にはmRNA構築物のVZV-gE-欠失574_Y569Aを初回投与した。表11に示すように、28日目に、全ての群(1~6群)に追加投与を行った。-3日目、21日目、38日目及び42日目に動物から採血した。血清及びT細胞分析のために、38日目及び42日目に血液及び脾臓を採取した。図14Aに示されるように、全ての群がmRNAワクチン投与に対して類似の抗gE抗体応答を与え、mRNAの初回投与及び追加投与を受けた動物(第6群)のほうがより高くなる傾向があった。図15Aに示されるように、全ての群がCD4 T細胞応答を示し、mRNAの初回投与及び追加投与(第6群)がより高い応答になる傾向があった。図15Bに示されるように、多様なCD8 T細胞応答が認められ、mRNAの初回投与及び追加投与(群6)が最も高いCD8T細胞頻度を示した。
実施例21:非ヒト霊長類における免疫原性
実施例20のデータに基づき、mRNA構築物VZV-gE-欠失574_Y569Aの免疫原性を非ヒト霊長類において更に評価した。以下の表12に示すように、アカゲザル3群にmRNA(VZV-gE-欠失574_Y569A)またはZOSTAVAX(登録商標)の初回投与及び追加投与を行った。血清及びT細胞分析のために、0日目、14日目、28日目及び42日目に動物から採血した。T細胞分析を0日目、28日目及び42日目に実施した。図16A及び16Bに示されるように、mRNAの初回投与及び追加投与(第1群)が最も高い抗gE力価を与え、それに続いて、ZOSTAVAX(登録商標)の初回投与mRNAの追加投与(第2群)となった。後者の群(第2群)の抗gE力価は、ZOSTAVAX(登録商標)初回投与/ZOSTAVAX(登録商標)追加投与(第3群)よりも約10倍良好であった。図16C及び16Dに示されるように、ZOSTAVAX(登録商標)初回投与/ZOSTAVAX(登録商標)追加投与群(第3群)では、IFNγ、IL-2またはTNFαを産生するCD4-T細胞は検出されなかった。対照的に、図16C及び16Dに示されるように、mRNA初回投与/mRNA追加投与群(第1群)では、IFNγ、IL-2またはTNFαを産生するCD4 T細胞が妥当な頻度で検出され、ZOSTAVAX(登録商標)初回投与/mRNA追加投与群(第2群)は統計的差異を認めなかった。これらのデータは、Zostavax曝露後のmRNAワクチン単回投与が、類似のT細胞応答を誘導することにおいて、mRNAワクチンの2回投与と同等であることを示している。
実施例20のデータに基づき、mRNA構築物VZV-gE-欠失574_Y569Aの免疫原性を非ヒト霊長類において更に評価した。以下の表12に示すように、アカゲザル3群にmRNA(VZV-gE-欠失574_Y569A)またはZOSTAVAX(登録商標)の初回投与及び追加投与を行った。血清及びT細胞分析のために、0日目、14日目、28日目及び42日目に動物から採血した。T細胞分析を0日目、28日目及び42日目に実施した。図16A及び16Bに示されるように、mRNAの初回投与及び追加投与(第1群)が最も高い抗gE力価を与え、それに続いて、ZOSTAVAX(登録商標)の初回投与mRNAの追加投与(第2群)となった。後者の群(第2群)の抗gE力価は、ZOSTAVAX(登録商標)初回投与/ZOSTAVAX(登録商標)追加投与(第3群)よりも約10倍良好であった。図16C及び16Dに示されるように、ZOSTAVAX(登録商標)初回投与/ZOSTAVAX(登録商標)追加投与群(第3群)では、IFNγ、IL-2またはTNFαを産生するCD4-T細胞は検出されなかった。対照的に、図16C及び16Dに示されるように、mRNA初回投与/mRNA追加投与群(第1群)では、IFNγ、IL-2またはTNFαを産生するCD4 T細胞が妥当な頻度で検出され、ZOSTAVAX(登録商標)初回投与/mRNA追加投与群(第2群)は統計的差異を認めなかった。これらのデータは、Zostavax曝露後のmRNAワクチン単回投与が、類似のT細胞応答を誘導することにおいて、mRNAワクチンの2回投与と同等であることを示している。
等価物
当業者であれば、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の等価物を数多く認識しまたは確認できるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
当業者であれば、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の等価物を数多く認識しまたは確認できるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書で開示される全ての参考文献は、特許文書を含め、その全体が参照により本明細書に援用される。
Claims (112)
- 少なくとも1つの水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、VZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、2つ以上のVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項1に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドが、VZV糖タンパク質またはその抗原性断片もしくはエピトープである、請求項1または2に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドが、VZVテグメントタンパク質またはその抗原性断片もしくはエピトープである、請求項1または2に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV糖タンパク質が、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMから選択される、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV糖タンパク質がVZV gEである、請求項5に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV糖タンパク質がVZV gIである、請求項5に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV糖タンパク質がバリアントVZV gEポリペプチドである、請求項6に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、アンカードメイン(ER保持ドメイン)を欠く切断型ポリペプチドである、請求項8に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、カルボキシ末端のテールドメインを欠く切断型ポリペプチドである、請求項8に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV抗原性断片が、配列番号10のアミノ酸1~561を含む切断型VZV gEポリペプチドである、請求項9に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV抗原性断片が、配列番号18のアミノ酸1~573を含むVZV gEバリアントポリペプチドである、請求項10に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、ER保持、エンドサイトーシス及び/またはゴルジ体もしくはトランスゴルジ網への局在化に関連する少なくとも1つのモチーフ中に少なくとも1つの変異を有する、請求項8に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、少なくとも1つのリン酸化酸性モチーフ中に少なくとも1つの変異を有する、請求項13に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、配列番号10に対してY582G変異を有する、請求項13に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、配列番号10に対してY569A変異を有する、請求項13に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドが、配列番号10に対してY582G変異及びY569A変異を有する、請求項13に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV抗原性断片が、配列番号10に対してY569A変異を有する、請求項12に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドがA-E-A-A-D-A配列(配列番号58)を有する、請求項6または請求項13~17のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記バリアントVZV gEポリペプチドがC末端にIgκ配列を有する、請求項6または請求項13~17のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記VZV gE抗原性断片がC末端にIgκ配列を有する、請求項11または12に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドがVZV gE及びgIの抗原性ポリペプチドをコードする、請求項5に記載のVZVワクチン。
- gI抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む、請求項6または請求項8~21のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- VZV gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMから選択される抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドを含む、請求項6または請求項8~21のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN及びgMから選択されるVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項4に記載のVZVワクチン。
- 弱毒化生VZV、完全不活化VZVまたはVZV VLPを更に含む、請求項5~25のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号1~8 37、39、41、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88もしくは90から選択される、核酸配列の少なくとも1つ、核酸配列の少なくとも1つの断片もしくは核酸配列の少なくとも1つのエピトープによってコードされ、または前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号6、37、39、84もしくは86から選択される、核酸配列の少なくとも1つ、核酸配列の少なくとも1つの断片もしくは核酸配列の少なくとも1つのエピトープ配列によってコードされる、請求項1~3のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号92~108及び123~131から選択される配列を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号92~108及び123~131から選択される、核酸配列の少なくとも1つの断片またはmRNA配列の少なくとも1つのエピトープを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが配列番号1によってコードされる、請求項6に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが配列番号2によってコードされる、請求項7に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが配列番号3によってコードされる、請求項11に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが配列番号5によってコードされる、請求項12に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが配列番号6、37、39、84または86によってコードされる、請求項18に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが配列番号7によってコードされる、請求項19に記載のVZVワクチン。
- 前記RNAポリヌクレオチドが配列番号8によってコードされる、請求項19に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号10、14、26、30、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号10、14、26、30、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号10、14、26、30、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも96%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号10、14、26、30、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも97%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号10、14、26、30、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも98%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドが、配列番号10、14、26、30、38、42及び45~55のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも99%の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードする、請求項3に記載のVZVワクチン。
- 前記ポリヌクレオチドがコードされるオープンリーディングフレームがコドン最適化された、請求項1~42のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 多価である、請求項1~43のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記RNAポリヌクレオチドが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項1~43のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 第2の化学修飾を更に含む、請求項45に記載のVZVワクチン。
- 前記化学修飾が、プソイドウリジン、N1-メチルプソイドウリジン、N1-エチルプソイドウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、5-メトキシウリジン及び2’-O-メチルウリジンからなる群から選択される、請求項45または46に記載のVZVワクチン。
- 前記オープンリーディングフレーム中のウラシルの80%が化学修飾を有する、請求項45に記載のVZVワクチン。
- 前記オープンリーディングフレーム中のウラシルの100%が化学修飾を有する、請求項48に記載のVZVワクチン。
- 前記化学修飾が前記ウラシルの5位にある、請求項45~49のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記化学修飾がN1-メチルプソイドウリジンである、請求項50に記載のVZVワクチン。
- カチオン性脂質ナノ粒子内に製剤化された、請求項1~51のいずれか一項に記載のVZVワクチン。
- 前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質と、PEG修飾脂質と、ステロールと、非カチオン性脂質とを含む、請求項52に記載のVZVワクチン。
- 前記カチオン性脂質がイオン性カチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が中性脂質であり、前記ステロールがコレステロールである、請求項53に記載のVZVワクチン。
- 前記カチオン性脂質が、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、ジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される、請求項52に記載のVZVワクチン。
- 前記カチオン性脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質約20~60%、非カチオン性脂質約5~25%、ステロール約25~55%及びPEG修飾脂質約0.5~15%のモル比を有する、請求項54に記載のVZVワクチン。
- 前記ナノ粒子が、0.4未満の多分散値を有する、請求項52に記載のVZVワクチン。
- 前記ナノ粒子が、中性のpHで中性の正味電荷を有する、請求項52に記載のVZVワクチン。
- 前記ナノ粒子が、50~200nmの平均直径を有する、請求項52に記載のVZVワクチン。
- 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するための請求項1~59のいずれか一項に記載のVZVワクチンであって、前記方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で前記ワクチンを前記対象に投与することを含む、前記VZVワクチン。
- 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するための薬剤の製造における請求項1~59のいずれか一項に記載のVZVワクチンの使用であって、前記方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で前記ワクチンを前記対象に投与することを含む、前記使用。
- 請求項1~59のいずれか一項に記載のワクチンを対象に投与することを含む、VZV感染を予防または治療する方法。
- 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、請求項1~59のいずれか一項に記載のワクチンを、前記対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記抗原特異的免疫応答がT細胞の応答またはB細胞の応答を含む、請求項63に記載の方法。
- 前記対象が前記ワクチンの単回用量の投与を受ける、請求項63または64に記載の方法。
- 前記対象が前記ワクチンの初回用量及び2回目(ブースター)用量の投与を受ける、請求項63または64に記載の方法。
- 前記ワクチンが、皮内注射または筋肉注射によって前記対象に投与される、請求項63~66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも1log増加する、請求項63~67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、1~3log増加する、請求項63~68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも2倍増加する、請求項63~69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも2~10倍増加する、請求項63~70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、前記ウイルスに対するワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項68~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、前記ウイルスに対する弱毒化生ワクチンまたは不活化ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項68~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、前記ウイルスに対する組み換えタンパク質ワクチンまたは精製されたタンパク質ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項68~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、前記ウイルスに対するVLPワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項68~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量が、前記ウイルスに対する組み換えタンパク質ワクチンまたは精製されたタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/2に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、前記ウイルスに対する組み換えタンパク質ワクチンまたは精製されたタンパク質ワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価とそれぞれ同等である、請求項63~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量が、前記ウイルスに対する弱毒化生ワクチンまたは不活化ワクチンの標準治療用量を少なくとも1/2に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、前記ウイルスに対する弱毒化生ワクチンまたは不活化ワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価とそれぞれ同等である、請求項63~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量が、前記ウイルスに対するVLPワクチンの標準治療用量を少なくとも1/2に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価が、前記ウイルスに対するVLPワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項63~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量が50μg~1000μgの総用量である、請求項63~78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量が、前記対象に合計2回投与される、25μg、100μg、400μgまたは500μgの用量である、請求項79に記載の方法。
- 前記ウイルスに対する前記ワクチンの有効性が65%を超える、請求項63~80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクチンが、最大2年間、前記ウイルスに対して前記対象を免疫にする、請求項63~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ワクチンが、2年を超える間、前記ウイルスに対して前記対象を免疫にする、請求項63~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が1歳~約10歳の年齢である、請求項63~83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が前記ウイルスに曝露したことがある、前記対象が前記ウイルスに感染している、または前記対象が前記ウイルスによる感染リスクがある、請求項63~84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が免疫不全状態である、請求項63~85のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~59のいずれか一項に記載のワクチンの少なくとも1つのRNAポリヌクレオチドをコードする、操作された核酸。
- 少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含み、前記RNAポリヌクレオチドは、(i)5’末端キャップと、(ii)少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、(iii)3’ポリAテールとを有する、VZVワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号6によって特定される配列を含む配列によってコードされる、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号37によって特定される配列を含む配列によってコードされる、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号39によって特定される配列を含む配列によってコードされる、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号84によって特定される配列を含む配列によってコードされる、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号86によって特定される配列を含む配列によってコードされる、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号128によって特定される配列を含む、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号99または133によって特定される配列を含む、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのmRNAポリヌクレオチドが、配列番号107または134によって特定される配列を含む、請求項88に記載のワクチン。
- 前記少なくとも1つのVZV抗原性ポリペプチドが、配列番号38によって特定される配列を含む、請求項88に記載のワクチン。
- 前記5’末端キャップが、7mG(5’)ppp(5’)N1mpNpであるか、これを含む、請求項88~97のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記オープンリーディングフレーム中のウラシルの100%が、前記ウラシルの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、請求項88~98のいずれか一項に記載のワクチン。
- 脂質ナノ粒子中に製剤化された、請求項88~99のいずれか一項に記載のワクチン。
- クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び水を更に含む、請求項100に記載のワクチン。
- (i)5’末端キャップと、(ii)VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、(iii)3’ポリAテールとを有し、配列番号99によって特定される核酸配列を含む、少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、前記5’末端キャップは7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpである、VZVワクチン。
- 前記配列番号99によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが、前記ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、請求項102に記載のVZVワクチン。
- (i)5’末端キャップと、(ii)VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、(iii)3’ポリAテールとを有し、配列番号133によって特定される核酸配列を含む、少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、前記5’末端キャップは7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpである、VZVワクチン。
- 前記配列番号133によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが、前記ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、請求項104に記載のVZVワクチン。
- (i)5’末端キャップと、(ii)VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、(iii)3’ポリAテールとを有し、配列番号107によって特定される核酸配列を含む、少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、前記5’末端キャップは7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpである、VZVワクチン。
- 前記配列番号107によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが、前記ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、請求項106に記載のVZVワクチン。
- (i)5’末端キャップと、(ii)VZV抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、(iii)3’ポリAテールとを有し、配列番号134によって特定される核酸配列を含む、少なくとも1つのメッセンジャーリボ核酸(mRNA)ポリヌクレオチドを含み、前記5’末端キャップは7mG(5’)ppp(5’)NlmpNpである、VZVワクチン。
- 前記配列番号134によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが、前記ウラシルヌクレオチドの5位にN1-メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、請求項108に記載のVZVワクチン。
- 対象のワクチン接種に使用するための医薬組成物であって、
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原をコードするmRNAを有効量で含み、
前記有効量は、投与後1~72時間に前記対象の血清中で測定したときに検出可能な抗原レベルをもたらすのに十分なものである、前記医薬組成物。 - 前記抗原のカットオフ指数が1~2である、請求項110に記載の組成物。
- 対象のワクチン接種に使用するための医薬組成物であって、
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)抗原をコードするmRNAを有効量で含み、
前記有効量は、投与後1~72時間に前記対象の血清中で測定したときに、前記抗原に対する中和抗体によってもたらされる1,000~10,000の中和力価をもたらすのに十分なものである前記医薬組成物。
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CIARAMELLA et al. | Patent 3003103 Summary |
Legal Events
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