ES2462090T5 - Nanopartículas poliméricas cargadas de fármaco y procedimientos de fabricación y uso de las mismas - Google Patents

Nanopartículas poliméricas cargadas de fármaco y procedimientos de fabricación y uso de las mismas Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Nanopartfculas polimericas cargadas de farmaco y procedimientos de fabricacion y uso de las mismas Solicitudes relacionadas
Antecedentes
Se ha reconocido como beneficiosos los sistemas que entregan ciertos farmacos a un paciente (por ejemplo, dirigidos a un tipo particular de tejido o celula, o dirigidos a un tejido enfermo espedfico pero no al tejido normal), o que controlan la liberacion de farmacos. El documento WO 2003/086369 desvela nanoesferas biodegradables polimericas furtivas y usuarios de las mismas.
Por ejemplo, los productos terapeuticos que contienen un principio activo y que estan dirigidos, por ejemplo, a un tipo particular de tejido o celula, o dirigidos a un tejido enfermo espedfico, pero no al tejido normal, pueden reducir la cantidad de farmaco en los tejidos corporales a los que no se dirigen. Esto es particularmente importante en el tratamiento de una afeccion tal como el cancer, donde es deseable la entrega de una dosis citotoxica del farmaco a las celulas cancerosas sin destruir el tejido circundante no canceroso. El direccionamiento de farmacos eficaz puede disminuir los efectos secundarios indeseables y a veces mortales, habituales en la terapia antineoplasica. Ademas, dichos productos terapeuticos pueden permitir que los farmacos lleguen a ciertos tejidos que de lo contrario senan incapaces de alcanzar.
Los productos terapeuticos que ofrecen liberacion controlada y/o terapia dirigida tambien deben ser capaces de entregar una cantidad eficaz de farmaco, que es una limitacion conocida en otros sistemas de entrega de nanopartfculas. Por ejemplo, puede ser un desaffo preparar sistemas de nanopartfculas que tengan una cantidad apropiada de farmaco asociada a cada nanopartfcula, manteniendo al mismo tiempo el tamano de las nanopartfculas lo suficientemente pequeno para que tengan propiedades de entrega ventajosas. Sin embargo, si bien es deseable cargar una nanopartfcula con una alta cantidad de un agente terapeutico, las preparaciones de nanopartfculas que usan una carga de farmaco que es demasiado alta daran como resultado nanopartfculas que son demasiado grandes para el uso terapeutico practico.
En consecuencia, existe la necesidad de productos terapeuticos en nanopartfculas y procedimientos de fabricacion de dichas nanopartfculas, que sean capaces de entregar niveles terapeuticos de farmacos para tratar enfermedades tales como el cancer, reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios en el paciente.
Sumario
La invencion proporciona un procedimiento de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas, que comprende:
combinar un agente terapeutico, un primer polfmero y opcionalmente un segundo polfmero, con un disolvente organico para formar una primera fase organica que tenga del 5 al 50 % de solidos; combinar la primera fase organica con una primera solucion acuosa para formar una segunda fase; emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion;
enfriamiento de la fase en emulsion para formar una fase enfriada; donde el enfriamiento se realiza al menos parcialmente a una temperatura de 5 °C o menos;
anadir un solubilizante de farmacos a la fase enfriada para formar una fase solubilizada de un agente terapeutico no encapsulado; y filtrar la fase solubilizada para recuperar las nanopartfculas furtivas espedficas para la diana, formando asf una suspension de nanopartfculas terapeuticas con un diametro de 80 nm a 150 nm.
En el presente documento tambien se desvela una nanopartfcula terapeutica que se prepara mediante:
la emulsion de una primera fase organica que comprende un primer polfmero y un agente terapeutico y una segunda fase que forma una fase en emulsion; en la que la fase en emulsion se enfna despues a una temperatura de entre 0 °C y 5 °C formando una fase enfriada; y
la filtracion de la fase enfriada a una primera temperatura de entre -5 °C y 10 °C; y la filtracion de la fase enfriada a una segunda temperatura de 25 °C; formando de este modo nanopartfculas terapeuticas que son estables durante al menos 5 dfas a 25 °C.
La presente invencion proporciona nanopartfculas terapeuticas que incluyen un principio activo o agente terapeutico, por ejemplo, taxano y uno, dos o tres polfmeros biocompatibles. Por ejemplo, en el presente documento se desvela una nanopartfcula terapeutica que comprende de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 35 por ciento en peso de un agente terapeutico; de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 99 por ciento en peso de copolfmero acido poli(lactico)-Wogue-poli(etilen)glicol o copolfmero acido poli(lactico)-co-poli(glicolico)-bloque- poli(etilen)glicol; y de aproximadamente el 0 a aproximadamente el 50 por ciento en peso de acido poli(lactico) o acido poli(lactico)-co-acido poli(glicolico). Los agentes terapeuticos de ejemplos incluyen agentes antineoplasicos tales como taxanos, por ejemplo, docetaxel y pueden incluir de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 30 por ciento en peso de un agente terapeutico, por ejemplo, un taxano.
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En el presente documento se proporciona, en parte, un procedimiento de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas desveladas, que comprende combinar un agente terapeutico, un primer poUmero y opcionalmente un segundo poKmero, con un disolvente organico (por ejemplo, un disolvente elegido entre: acetato de etilo, alcohol bendlico, cloruro de metileno, dimetilformamida, Tween 80 y Span 80 y las combinaciones de dos o mas de estos) para formar una primera fase organica que contenga del 5 al 50 % de solidos; combinar la primera fase organica con una primera solucion acuosa (que puede, en algunas realizaciones, incluir un reactivo elegido entre: colato de sodio, acetato de etilo, alcohol bendlico o sus combinaciones) para formar una segunda fase; emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion; enfriar la fase en emulsion para formar una fase enfriada; anadir un solubilizante de farmacos a la fase enfriada para formar una fase solubilizada de un agente terapeutico no encapsulado; y filtrar la fase solubilizada para recuperar las nanopartfculas furtivas espedficas para la diana, formando de este modo una suspension de nanopartfculas terapeuticas con un diametro de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 150 nm. En algunas realizaciones, emulsionar la segunda fase puede implicar emulsionar la segunda fase para formar una emulsion gruesa y emulsionar la emulsion gruesa para formar una fase en emulsion fina. La emulsion de la segunda fase se puede realizar, por ejemplo, utilizando un homogeneizador de rotor y estator, una sonda de ultrasonidos, una barra de agitacion o un mezclador de alta presion. La emulsion de la emulsion gruesa se puede realizar utilizando, por ejemplo, un homogeneizador de alta presion que puede tener multiples camaras de interaccion (2, 3, 4 o mas) y con, por ejemplo, una presion de alimentacion de aproximadamente 2000 a aproximadamente 8000, por ejemplo, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 6000, por camara de interaccion.
En algunas realizaciones, el enfriamiento se puede realizar al menos parcialmente a una temperatura de aproximadamente 5°Co menos, por ejemplo, de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C. Una relacion de enfriamiento:emulsion puede ser de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 5:1, o de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 40:1.
Los solubilizantes de farmacos de ejemplos para su uso en los procedimientos desvelados pueden incluir Tween 80, Tween 20, polivinilpirrolidona, ciclodextrano, dodecilsulfato de sodio o colato de sodio. En algunas realizaciones, un solubilizante de farmacos se selecciona entre el grupo que consiste en dietilnitrosamina, acetato de sodio, urea, glicerina, propilenglicol, glicofurol, poli(etilen)glicol, bis(polioxietilenglicoldodecil)eter, benzoato de sodio y salicilato de sodio. La relacion entre solubilizante de farmacos y agente terapeutico puede ser de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 10:1.
En una realizacion, un procedimiento puede incluir filtrar la fase solubilizada que contiene nanopartfculas usando por ejemplo un sistema de filtracion de flujo tangencial. La filtracion se puede realizar, por ejemplo, a una primera temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y despues a una segunda temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C. Como alternativa, la filtracion se puede realizar, por ejemplo, a una primera temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C y despues a una segunda temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C. En algunas realizaciones, la filtracion comprende procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y procesar al menos un diavolumen a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C, por ejemplo, la filtracion puede implicar procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y procesar de aproximadamente 1 diavolumen a aproximadamente 15 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C. En una realizacion, la filtracion puede implicar procesar diferentes diavolumenes a diferentes temperaturas definidas. La fase solubilizada se puede purificar antes de dicha filtracion para eliminar sustancialmente dicho disolvente organico, agente terapeutico no encapsulado y/o solubilizante de farmacos.
Los procedimientos desvelados pueden comprender la filtracion esterilizante de la suspension de nanopartfculas terapeuticas utilizando un tren de filtracion a una velocidad controlada. Por ejemplo, se puede usar un tren de filtracion que comprenda un filtro de profundidad y un filtro esterilizante.
Tambien se desvela en el presente documento un procedimiento de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas que comprende combinar un agente terapeutico, un primer polfmero y opcionalmente un segundo polfmero, con un disolvente organico para formar una primera fase organica, combinar la primera fase organica con una primera solucion acuosa para formar una segunda fase; emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion; enfriar la fase en emulsion para formar una fase enfriada; anadir un solubilizante de farmacos a la fase enfriada para formar una fase solubilizada de agente terapeutico no encapsulado; y filtrar la fase solubilizada utilizando filtracion de flujo tangencial con diafiltracion de volumen constante en la que al menos un diavolumen se expone a aproximadamente 25 °C despues de haber expuesto un diavolumen diferente a una temperatura de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 10 °C. Por ejemplo, filtrar puede implicar procesar de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y despues procesar al menos un diavolumen a 25 °C durante al menos un penodo de tiempo.
En el presente documento se proporcionan procedimientos de formacion de nanopartfculas terapeuticas que pueden ser estables durante al menos 2 dfas a 25 °C a una concentracion de aproximadamente 10mg/ml. Las nanopartfculas terapeuticas formadas utilizando los procedimientos desvelados pueden liberar menos del 10 % en peso de agente terapeutico en al menos 5 dfas a 25 °C. En algunas realizaciones, una nanopartfcula terapeutica
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formada utilizando un procedimiento desvelado puede, por ejemplo, encapsular de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 30 % del agente terapeutico.
En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas desveladas que comprenden combinar un agente terapeutico, un primer polfmero (por ejemplo, copolfmero en dibloque PLGA-PEG o dibloque PLA-PEG), un segundo polfmero opcional (por ejemplo, homopolfmero PLA) y opcionalmente un tercer polfmero (por ejemplo, PLA) en los que el primer polfmero o el segundo polfmero pueden estar unidos opcionalmente a un ligando con un peso molecular menor de aproximadamente 1000 g/mol, por ejemplo, un ligando de bajo peso molecular, por ejemplo, un ligando de PSMA. Dicho ligando de PSMA de bajo peso molecular se puede seleccionar entre el grupo que consiste en los compuestos I, II, III y IV:
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que
my n cada uno, independientemente, es 0, 1, 2 o 3; p es 0 o 1;
R1, R2, R4 y R5 cada uno, independientemente, se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir y cualquier combinacion de los mismos; y R3 es H o CH3;
en los que R1, R2, R4 o R5 comprenden un punto de union covalente a la nanopartfcula. Por ejemplo, R1, R2, R4 y R5 pueden ser cada uno, independientemente, alquilo C1-6 o fenilo, o cualquier combinacion de alquilo C1-6 o fenilo, que estan independientemente sustituidos una o mas veces con OH, SH, NH2 o CO2H y en los que el grupo alquilo puede estar interrumpido por N(H), S u O. En otra realizacion, por ejemplo, R1, R2, R4 y R5 cada uno, independientemente, es CH2-Ph, (CH2)2-SH, CH2-SH, (CH2)2C(H)(NH2)CO2H, CH2C(H)(NH2)CO2H, CH(NH2)CH2CO2H, (CH2)2C(H)(SH)CO2H, CH2-N(H)-Ph, O-CH2-Ph o O-(CH2)2-Ph, en los que cada Ph puede estar independientemente sustituido una o mas veces con OH, NH2, CO2H o SH. El ligando de PSMA de bajo peso molecular de ejemplo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en
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y
y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; y en los que los grupos NH2, OH o SH sirven como el punto de union covalente a la primera partfcula, o se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en
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y
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; en los que R se elige independientemente entre el grupo que consiste en NH2, SH, OH, CO2H, alquilo C1-6 que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H y fenilo que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, y en los que R sirve como el punto de union covalente al primer polfmero. Los ligandos de ejemplo incluyen
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y
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; cualquiera de los cuales puede estar sustituido ademas con NH2, SH, OH, CO2H, alquilo C1-6 que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, o fenilo que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, en los que estos grupos funcionales sirven como el punto de union covalente al primer polfmero, por ejemplo, un ligando de PSMA de bajo peso molecular puede ser
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15 y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; en los que los grupos NH2 sirven como el punto de union covalente al primer polfmero.
En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas desveladas que comprenden combinar un agente terapeutico, un primer polfmero (por ejemplo, PLGA- PEG o PLA- PEG) y opcionalmente un segundo polfmero (por ejemplo PLA, pLgA o PEG, o sus copolfmeros) y un 20 tercer polfmero opcional (por ejemplo PLA o pLgA no unido a un ligando). En algunas realizaciones, el agente terapeutico es docetaxel. En otras realizaciones, el agente terapeutico se selecciona entre el grupo que consiste en antineoplasicos tales como doxorrubicina (adriamicina), mitoxantrona, gemcitabina (gemzar), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposido, metotrexato, 5-fluorouracilo (5-FU), vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfan, carboplatino, cladribina, 25 camptotecina, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), dacarbazina, S-I capecitabina, ftorafur, 5'desoxiflurouridina, eniluracilo, desoxicitidina, 5-azacitosina, 5-azadesoxicitosina, alopurinol, 2-cloroadenosina, trimetrexato,
aminopterina, metileno-10-deazaaminopterina (MDAM), oxaplatino, picoplatino, tetraplatino, satraplatino, platino- DACH, ormaplatino y sus analogos, epirrubicina, fosfato de etoposido, 9-aminocamptotecina, 10,11- metilenodioxicamptotecina, karenitecina, 9-nitrocamptotecina, vindesina, mostaza de L-fenilalanina,
30 ifosfamidamefosfamida, perfosfamida, trofosfamida, carmustina, semustina, epotilones A-E, tomudex, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, amsacrina, fosfato de etoposido, karenitecina, aciclovir, valaciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, lamivudina, zidovudina, bevacizumab, trastuzumab, rituximab y 5-fluorouracilo, metotrexato, budesonida, sirolimus, vincristina y sus combinaciones, o el agente terapeutico puede ser un ARNip.
Tambien se proporcionan en el presente documento procedimientos para tratar el cancer de prostata en un sujeto 35 que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de la nanopartfcula preparada por los procedimientos desvelados.
En una realizacion, tambien se proporciona en el presente documento una nanopartfcula terapeutica preparada mediante: la emulsion de una primera fase organica que comprende un primer polfmero y un agente terapeutico y una segunda fase que forma una fase en emulsion; en la que la fase en emulsion se enfna despues a una
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Tambien se proporciona en una realizacion, un procedimiento de estabilizacion de nanopartfculas terapeuticas que tienen un agente terapeutico que comprende: proporcionar una suspension que contenga un agente terapeutico encapsulado por nanopartfculas y un solubilizante de farmacos; filtrar la suspension a una primera temperatura de - 5 °C a 10 °C; filtrar la suspension a una segunda temperatura de 25 °C.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 describe una representacion grafica de una realizacion de una nanopartfcula desvelada.
La figura 2 describe un esquema de smtesis de ejemplo para una nanopartfcula desvelada.
La figura 3 es un diagrama de flujo para un procedimiento de emulsion para formar la nanopartfcula desvelada.
La figura 4 es un diagrama de flujo para un procedimiento de emulsion desvelado.
La figura 5 describe el efecto de la preparacion de la emulsion gruesa sobre el tamano de la partfcula enfriada. Se uso placebo organico con el 30% de solidos, emulsionado a 5:1 W:O usando fase acuosa convencional (colato de sodio al 1 %, alcohol bendlico al 2 %, acetato de etilo al 4 %).
La figura 6 describe el efecto de la presion de alimentacion sobre el tamano de partfcula resultante.
La figura 7 describe la dependencia del tamano de partfcula con la escala.
La figura 8 describe el efecto de la concentracion de solidos sobre el tamano de partfcula.
La figura 9 describe el efecto de la concentracion de solidos sobre la carga de farmaco.
La figura 10 describe el efecto del homopolfmero PLA con PLGA-PEG o PLA-PEG sobre la carga de DTXL (docetaxel).
La figura 11 describe el efecto del homopolfmero PLA como parte de una nanopartfcula sobre la velocidad de liberacion del farmaco desde una nanopartfcula.
La figura 12 describe el efecto del alcohol cetflico sobre la velocidad inicial de liberacion del farmaco desde una nanopartfcula.
La figura 13 describe la liberacion in vitro de docetaxel desde las nanopartfculas desveladas en comparacion con docetaxel convencional.
La figura 14 describe el efecto de la concentracion de solidos y el homopolfmero poli(lactico) sobre el porcentaje de carga de sirolimus (rapamicina).
La figura 15 describe la liberacion in vitro de sirolimus en el tiempo para las nanopartfculas desveladas.
La figura 16 describe los efectos del homopolfmero poli(lactico) sobre el porcentaje de carga de temsirolimus.
La figura 17 describe el efecto de la concentracion de solidos sobre el tamano de las partfculas que contienen temsirolimus.
La figura 18 describe la liberacion in vitro de temsirolimus en el tiempo para las nanopartfculas desveladas.
La figura 19 describe las propiedades de liberacion in vitro de una nanopartfcula desvelada de ejemplo que incluye vinorelbina.
La figura 20 describe las propiedades de liberacion in vitro de las nanopartfculas desveladas que incluyen vincristina o docetaxel.
La figura 21 describe la farmacocinetica de vincristina y vincristina PTNP en ratas.
La figura 22 describe el volumen promedio del tumor despues de la administracion de las nanopartfculas desveladas que incluyen docetaxel en un modelo de xenoinjerto MX-1 de cancer de mama en raton.
La figura 23 describe la concentracion de docetaxel en tumores de raton en un modelo de xenoinjerto MX-1 de cancer de mama en raton, 24 horas despues de una dosis intravenosa de las nanopartfculas desveladas que incluyen docetaxel.
La figura 24 describe la distribucion en el tumor de prostata de las nanopartfculas desveladas que tienen docetaxel, despues de la administracion a ratones inoculados con celulas LNCaP de cancer de prostata humano. La figura 25 muestra la supresion del crecimiento tumoral en ratones inoculados con celulas LNCaP de cancer de prostata humano despues de la administracion de las nanopartfculas desveladas con docetaxel.
Descripcion detallada
La presente divulgacion se refiere en general a nanopartfculas polimericas que incluyen un agente activo o terapeutico o farmaco y a procedimientos de fabricacion y de uso de dichas nanopartfculas terapeuticas. En general, una "nanopartfcula" se refiere a cualquier partfcula que tenga un diametro menor de 1000 nm, por ejemplo, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm. Las nanopartfculas terapeuticas desveladas pueden incluir nanopartfculas que tengan un diametro de aproximadamente 60 a aproximadamente 120 nm, o de aproximadamente 70 a aproximadamente 130 nm, o de aproximadamente 60 a aproximadamente 140 nm.
Las nanopartfculas desveladas pueden incluir de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 35 % en peso, de aproximadamente el 3 a aproximadamente el 40 % en peso, de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 30 % en peso, de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 30 % en peso, de aproximadamente el 15 y 25 % en peso, o incluso de aproximadamente el 4 a aproximadamente el 25 % en peso de un agente activo, tal como un agente antineoplasico, por ejemplo un agente taxano (por ejemplo docetaxel).
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Las nanopardculas desveladas en el presente documento incluyen uno, dos, tres o mas poKmeros biocompatibles y/o biodegradables. Por ejemplo, una nanopardcula contemplada puede incluir de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 99 por ciento en peso de uno o mas copolfmeros en bloque que incluyan un polfmero biodegradable y polietilenglicol y de aproximadamente el 0 a aproximadamente el 50 % en peso de un homopolfmero biodegradable.
En una realizacion, las nanopartfculas terapeuticas desveladas pueden incluir un ligando para administracion dirigida, por ejemplo, un ligando de PSMA de bajo peso molecular eficaz para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, tal como el cancer de prostata, en un sujeto que lo necesita. En ciertas realizaciones, el ligando de bajo peso molecular se conjuga con un polfmero y la nanopartfcula comprende una cierta relacion de polfmero conjugado con ligando (por ejemplo, PLA-PEG-Ligando) a polfmero no funcionalizado (por ejemplo PLA-PEG o PLGA-PEG). La nanopartfcula puede tener una relacion optimizada de estos dos polfmeros de manera que una cantidad eficaz de ligando se asocie a la nanopartfcula para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, tal como el cancer. Por ejemplo, una mayor densidad de ligando puede aumentar la union a la diana (union a la celula/absorcion por la diana) haciendo que la partfcula sea "espedfica para la diana". Como alternativa, una cierta concentracion de polfmero no funcionalizado (por ejemplo, copolfmero PLGA-PEG no funcionalizado) en la nanopartfcula puede controlar la inflamacion y/o la inmunogenia (es decir, la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria) y permitir que la nanopartfcula tenga una vida media de circulacion que sea adecuada para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cancer de prostata). Ademas, el polfmero no funcionalizado puede, en algunas realizaciones, reducir la velocidad de aclaramiento del sistema circulatorio a traves del sistema reticuloendotelial (RES). Por tanto, el polfmero no funcionalizado puede proporcionar la nanopartfcula con caractensticas que pueden permitir a la partfcula desplazarse a traves del organismo despues de su administracion. En algunas realizaciones, un polfmero no funcionalizado puede equilibrar la concentracion de ligando, de lo contrario elevada, que de otra manera puede acelerar el aclaramiento por el sujeto, dando como resultado una menor entrega a las celulas que son la diana.
Por ejemplo, en el presente documento se desvelan nanopartfculas que pueden incluir polfmeros funcionalizados conjugados con un ligando que constituye aproximadamente el 0,1 - 30, por ejemplo, el 0,1 - 20, por ejemplo, el 0,1 - 10 por ciento en moles de toda la composicion polimerica de la nanopartfcula (es decir, polfmero funcionalizado + no funcionalizado). Tambien se desvelan en el presente documento, en otra realizacion, nanopartfculas que incluyen un polfmero conjugado (por ejemplo, covalentemente con (es decir a traves de un engarce (por ejemplo un engarce alquileno) o un enlace) con uno o mas ligandos de bajo peso molecular, en las que el porcentaje en peso de ligando de bajo peso molecular con respecto al polfmero total es de entre aproximadamente el 0,001 y el 5, por ejemplo, entre aproximadamente el 0,001 y el 2, por ejemplo, entre aproximadamente el 0,001 y el 1.
Tambien se proporcionan en el presente documento nanopartfculas polimericas que incluyen de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 20 por ciento en peso de agente activo. Por ejemplo, una composicion que comprende dichas nanopartfculas puede ser capaz de administrar una cantidad eficaz por ejemplo la zona corporal diana de un paciente.
Por ejemplo, las partfculas desveladas pueden ser capaces de unirse eficientemente o asociarse de otra manera a una entidad biologica, por ejemplo, un componente de membrana particular o un receptor de superficie celular. El direccionamiento de un agente terapeutico (por ejemplo, a un tipo de tejido o celula particular, a un tejido enfermo espedfico pero no al tejido normal, etc.) es deseable para el tratamiento de enfermedades tisulares espedficas tales como canceres de tumor solido (por ejemplo, cancer de prostata). Por ejemplo, en contraste con la administracion sistemica de un anticancengeno citotoxico, las nanopartfculas desveladas en el presente documento pueden evitar en gran medida que el agente provoque la muerte de celulas sanas. Ademas, las nanopartfculas desveladas pueden permitir la administracion de una dosis menor del agente (en comparacion con una cantidad eficaz de un agente administrado sin las nanopartfculas o formulaciones desveladas) lo que puede reducir los efectos secundarios indeseables habitualmente asociados a la quimioterapia tradicional.
Polmeros
En algunas realizaciones, las nanopartfculas de la invencion comprenden una matriz de polfmeros y un agente terapeutico. En algunas realizaciones, un agente terapeutico y/o un resto de direccionamiento (es decir un ligando de PSMA de bajo peso molecular) se pueden asociar al menos a parte de la matriz polimerica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un resto de direccionamiento (por ejemplo un ligando) se puede asociar covalentemente a la superficie de una matriz polimerica. En algunas realizaciones, la asociacion covalente esta mediada por un engarce. El agente terapeutico puede asociarse a la superficie de, ser encapsulado dentro de, ser rodeado por y/o dispersarse en toda, la matriz polimerica.
Se conoce una amplia diversidad de polfmeros y procedimientos para formar partfculas a partir de ellos en la tecnica de la entrega de farmacos. En algunas realizaciones, la divulgacion se refiere a nanopartfculas con al menos dos macromoleculas, en las que la primera macromolecula comprende un primer polfmero unido a un ligando de bajo peso molecular (por ejemplo, un resto de direccionamiento); y la segunda macromolecula comprende un segundo polfmero que no esta unido a un resto de direccionamiento. La nanopartfcula puede incluir opcionalmente uno o mas polfmeros no funcionalizados adicionales.
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Se puede usar cualquier poKmero de acuerdo con la presente invencion. Los poKmeros pueden ser naturales o no naturales (sinteticos). Los poUmeros pueden ser homopoUmeros o copoKmeros que comprenden dos o mas monomeros. En terminos de secuencia, los copolfmeros pueden ser aleatorios, en bloque o comprender una combinacion de secuencias aleatorias y en bloque. Normalmente, los polfmeros de acuerdo con la presente invencion son polfmeros organicos.
Al termino "polfmero", como se usa en el presente documento, se le da su significado habitual como se usa en la tecnica, es decir, una estructura molecular que comprende una o mas unidades de repeticion (monomeros) conectadas por enlaces covalentes. Las unidades de repeticion pueden ser todas identicas, o en algunos casos, puede haber presente mas de un tipo de unidades de repeticion dentro del polfmero. En algunos casos, el polfmero puede ser un derivado biologico, es decir, un biopolfmero. Los ejemplos no limitantes incluyen peptidos o protemas. En algunos casos, tambien pueden estar presentes en el polfmero restos adicionales, por ejemplo, restos biologicos tales como los que se describen a continuacion. Si esta presente mas de un tipo de unidades de repeticion dentro del polfmero, entonces se dice que el polfmero es un "copolfmero". Se debe entender que en cualquier realizacion que emplee un polfmero, el polfmero que se emplee puede ser, en algunos casos, un copolfmero. Las unidades de repeticion que forman el copolfmero pueden estar dispuestas de cualquier manera. Por ejemplo, las unidades de repeticion se pueden disponer en un orden aleatorio, en un orden alternante, o como un copoifmero en bloque, es decir, que comprende una o mas regiones, cada una de las cuales contiene una primera unidad de repeticion (por ejemplo, un primer bloque) y una o mas regiones que cada una contiene una segunda unidad de repeticion (por ejemplo un segundo bloque), etc. Los copolfmeros en bloque pueden tener dos (copolfmero en dibloque), tres (copolfmero en tribloque) o un mayor numero de bloques diferentes.
Las partfculas desveladas pueden incluir copolfmeros, los que, en algunas realizaciones, describen dos o mas polfmeros (tales como los que se describen en el presente documento) que se han asociado entre sf, por lo general mediante union covalente de los dos o mas polfmeros. Por tanto, un copolfmero puede comprender un primer polfmero y un segundo polfmero, que se han conjugado para formar un copolfmero en bloque en el que el primer polfmero puede ser un primer bloque del copolfmero en bloque y el segundo polfmero puede ser un segundo bloque del copolfmero en bloque. Por supuesto, los expertos en la materia entenderan que un copolfmero en bloque puede, en algunos casos, contener multiples bloques de polfmero y que un "copolfmero en bloque", como se usa en el presente documento, no esta limitado solo a copolfmeros en bloque que tengan unicamente un unico primer bloque y un unico segundo bloque. Por ejemplo, un copolfmero en bloque puede comprender un primer bloque que comprenda un primer polfmero, un segundo bloque que comprenda un segundo polfmero y un tercer bloque que comprenda un tercer polfmero o el primer polfmero, etc. En algunos casos, los copolfmeros en bloque pueden contener cualquier cantidad de primeros bloques de un primer polfmero y segundos bloques de un segundo polfmero (y en ciertos casos, terceros bloques, cuartos bloques, etc.). Ademas, se debe destacar que los copolfmeros en bloque tambien se pueden formar, en algunos casos, a partirde otros copolfmeros en bloque. Por ejemplo, un primer copolfmero en bloque se puede conjugar con otro polfmero (que puede ser un homopolfmero, un biopolfmero, otro copolfmero en bloque, etc.), para formar un nuevo copolfmero en bloque que contenga multiples tipos de bloques y/o con otros restos (por ejemplo, con restos no polimericos).
En algunas realizaciones, el polfmero (por ejemplo, copolfmero, por ejemplo, copolfmero en bloque) puede ser anfifflico, es decir tener una porcion hidrofila y una porcion hidrofoba, o una porcion relativamente hidrofila y una porcion relativamente hidrofoba. Un polfmero hidrofilo puede ser uno que generalmente atrae agua y un polfmero hidrofobo puede ser uno que generalmente repele el agua. Se puede identificar un polfmero hidrofilo o un polfmero hidrofobo, por ejemplo, preparando una muestra del polfmero y midiendo su angulo de contacto con el agua (normalmente, el polfmero hidrofilo tendra un angulo de contacto menor de 60°, en tanto el polfmero hidrofobo tendra un angulo de contacto mayor de aproximadamente 60 °). En algunos casos, la hidrofilia de dos o mas polfmeros se puede medir en uno con respecto al otro, es decir, un primer polfmero puede ser mas hidrofilo que un segundo polfmero. Por ejemplo, el primer polfmero puede tener un angulo de contacto menor que el segundo polfmero.
En un conjunto de realizaciones, un polfmero (por ejemplo copolfmero, por ejemplo copolfmero en bloque) contemplado en el presente documento incluye un polfmero biocompatible, es decir, el polfmero que normalmente no induce una respuesta adversa cuando se lo introduce o inyecta en un sujeto vivo, por ejemplo, sin una inflamacion significativa y/o un rechazo agudo del polfmero por el sistema inmunitario, por ejemplo, a traves de la respuesta de los linfocitos T. En consecuencia, las partfculas terapeuticas contempladas en el presente documento pueden ser no inmunogenas. La expresion no inmunogeno como se usa en el presente documento se refiere al factor de crecimiento endogeno en su estado nativo que normalmente no produce, o produce solo niveles mmimos de, anticuerpos circulantes, linfocitos T o celulas inmunorreactivas y que normalmente no produce en el individuo una respuesta contra sf mismo.
Biocompatibilidad se refiere normalmente al rechazo agudo de un material por al menos una porcion del sistema inmunitario, es decir, un material no biocompatible implantado en un sujeto provoca una respuesta inmunitaria en el sujeto que puede ser lo suficientemente grave para que el rechazo del material por el sistema inmunitario no pueda ser controlado adecuadamente y con frecuencia es de tal magnitud que el material debe ser retirado del sujeto. Una prueba simple para determinar la biocompatibilidad puede ser exponer un polfmero a las celulas in vitro; los polfmeros biocompatibles son polfmeros que generalmente no producen una muerte celular significativa a concentraciones moderadas, por ejemplo, a concentraciones de 50 microgramos/106 celulas. Por ejemplo, un
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poKmero biocompatible puede provocar menos de aproximadamente el 20 % de muerte celular cuando se expone a celulas tales como fibroblastos o celulas epiteliales, incluso si es fagocitado o absorbido de otra manera por dichas celulas. Los ejemplos no limitantes de polfmeros biocompatibles que pueden ser utiles en diversas realizaciones de la presente invencion incluyen polidioxanona (PDO), polihidroxialcanoato, polihidroxibutirato, poli(sebacato de glicerol), poliglicolido, polilactido, PLGA, policaprolactona o copoUmeros o derivados que incluyen estos y otros polfmeros.
En ciertas realizaciones, los polfmeros biocompatibles contemplados pueden ser biodegradables, es decir el polfmero es capaz de degradarse, qmmica y/o biologicamente en un ambiente fisiologico, tal como dentro del organismo. Como se usa en el presente documento, polfmeros "biodegradables" son los que, cuando se introducen en las celulas, son escindidos por la maquinaria celular (biologicamente degradables) y/o por un proceso qmmico, tal como la hidrolisis, (qmmicamente degradables) en componentes que las celulas pueden reutilizar o desechar sin un efecto toxico significativo sobre las celulas. En una realizacion, el polfmero biodegradable y sus subproductos de degradacion pueden ser biocompatibles.
Por ejemplo, un polfmero contemplado puede ser uno que se hidrolice espontaneamente tras la exposicion al agua (por ejemplo, dentro de un sujeto), el polfmero se puede degradar al exponerse al calor (por ejemplo, a temperaturas de aproximadamente 37 °C). La degradacion de un polfmero puede ocurrir a diversas velocidades, dependiendo del polfmero o copolfmero utilizado. Por ejemplo, la vida media del polfmero (el tiempo al cual el 50 % del polfmero se puede degradar en monomeros y/u otros restos no polimericos) puede ser del orden de dfas, semanas, meses o anos, dependiendo del polfmero. Los polfmeros pueden ser degradados biologicamente, es decir mediante actividad enzimatica o la maquinaria celular, en algunos casos, por ejemplo, a traves de la exposicion a una lisozima (por ejemplo, que tiene un pH relativamente bajo). En algunos casos, los polfmeros se pueden escindir en monomeros y/u otros restos no polimericos que las celulas pueden reutilizar o desechar sin efecto toxico significativo sobre las celulas (por ejemplo, el polilactido se puede hidrolizar para formar acido lactico, el poliglicolido se puede hidrolizar para formar acido glicolico, etc.).
En algunas realizaciones, los polfmeros pueden ser poliesteres, incluidos los copolfmeros que comprenden unidades de acido lactico y acido glicolico, tales como poli(acido lactico-co-acido glicolico) y poli(lactido-co-glicolido), denominados colectivamente en el presente documento "PLGA"; y homopolfmeros que comprenden unidades de acido glicolico, denominados en el presente documento "PGA" y unidades de acido lactico, tales como acido poli-L- lactico, acido poli-D-lactico, acido poli-D,L-lactico, poli-L-lactido, poli-D-lactido y poli-D,L-lactido, denominados colectivamente en el presente documento "PLA". En algunas realizaciones, los poliesteres de ejemplo incluyen, por ejemplo, polihidroxiacidos; polfmeros PEGilados y copolfmeros de lactido y glicolido (por ejemplo, PLA PEGilado, pGa PEGilado, PLGA PEGilado y derivados de los mismos. En algunas realizaciones, los poliesteres incluyen, por ejemplo, poliantndridos, poli(orto ester), poli(orto ester) PEGilado, poli(caprolactona), poli(caprolactona) PEGilada, polilisina, polilisina PEGilada, poli(etilenimina), poli(etilenimina) PEGilada, poli(L-lactido-co-L-lisina), poli(ester serina), poli(ester 4-hidroxi-L-prolina), poli[acido a-(4-aminobutil)-L-glicolico] y derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, un polfmero puede ser PLGA. PLGA es un copolfmero biocompatible y biodegradable de acido lactico y acido glicolico y diversas formas de PLGA se pueden caracterizar mediante la relacion acido lactico:acido glicolico. El acido lactico puede ser acido L-lactico, acido D-lactico, o acido D,L-lactico. La velocidad de degradacion de PLGA se puede ajustar alterando la relacion acido lactico-acido glicolico. En algunas realizaciones, el PLGA que se va a usar de acuerdo con la presente invencion se puede caracterizar por una relacion acido lactico:acido glicolico de aproximadamente 85:15, aproximadamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75 o aproximadamente 15:85. En algunas realizaciones, la relacion entre los monomeros de acido lactico y acido glicolico en el polfmero de la partfcula (por ejemplo, el copolfmero en bloque PLGA o copolfmero en bloque PLGA-PEG), se puede seleccionar para optimizar diversos parametros tales como la absorcion de agua; se pueden optimizar la liberacion del agente terapeutico y/o la cinetica de degradacion del polfmero.
En algunas realizaciones, los polfmeros pueden ser uno o mas polfmeros acnlicos. En ciertas realizaciones, los polfmeros acnlicos incluyen, por ejemplo, copolfmeros de acido acnlico y acido metacnlico, copolfmeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolfmero de amino alquil metacrilato, poli(acido acnlico), poli(acido metacnlico), copolfmero de acido metacnlico alquilamida, poli(metacrilato de metilo), poli(acido metacnlico poliacrilamida, copolfmero de amino alquil metacrilato, copolfmeros de metacrilato de glicidilo, policianoacrilatos y combinaciones que comprenden uno o mas de los polfmeros anteriores. El polfmero acnlico puede comprender copolfmeros totalmente polimerizados de esteres de acido acnlico y metacnlico con un bajo contenido de grupos amonio cuaternario.
En algunas realizaciones, los polfmeros pueden ser polfmeros cationicos. En general, los polfmeros cationicos son capaces de condensar y/o proteger cadenas de acidos nucleicos cargadas negativamente (por ejemplo, ADN, ARN o sus derivados). Se contemplan polfmeros que contienen amina tale como poli(lisina), polietileno imina (PEI) y dendnmeros poli(amidoamina) para su uso, en algunas realizaciones, en una partfcula desvelada.
En algunas realizaciones, los polfmeros pueden ser poliesteres degradables quetienen cadenas laterales cationicas. Los ejemplos de estos poliesteres incluyen poli(L-lactido-co-L-lisina), poli(ester serina), poli(ester 4-hidroxi-L-prolina).
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Las partfculas desveladas en el presente documento pueden, o no, contener PEG. Ademas, ciertas realizaciones pueden referirse a copoKmeros que contienen poli(ester-eter), por ejemplo, poUmeros que tienen unidades de repeticion unidas por enlaces ester (por ejemplo, enlaces R-C(O)-O-R') y enlaces eter (por ejemplo, enlaces R-OR'). En algunas realizaciones de la invencion, un polfmero biodegradable, tal como un poUmero hidrolizable que contiene grupos acido carbox^lico, se puede conjugar con unidades de repeticion de poli(etilenglicol) para formar un poli(ester- eter). Un poKmero (por ejemplo, copolfmero, por ejemplo, copolfmero en bloque) que contiene unidades de repeticion poli(etilenglicol) tambien se puede denominar un polfmero "PEGilado".
Se contempla que PEG puede incluir un grupo en el extremo terminal, por ejemplo, cuando PEG no esta conjugado con un ligando. Por ejemplo, PEG puede terminar en un hidroxilo, un metoxi u otro grupo alcoxilo, un grupo metilo u otro grupo alquilo, un grupo arilo, un acido carboxflico, una amina, una amida, un grupo acetilo, un grupo guanidino o un imidazol. Otros grupos terminales contemplados incluyen grupos azida, alquino, maleimida, aldetudo, hidrazida, hidroxilamina, alcoxiamina o tiol.
Los expertos en la materia conoceran procedimientos y tecnicas para PEGilar un polfmero, por ejemplo, utilizando EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida) para hacer reaccionar un polfmero con un grupo PEG que termina en una amina, mediante tecnicas de polimerizacion de apertura del anillo (ROMP, por sus siglas en ingles), o analogas.
En una realizacion, el peso molecular de los polfmeros se puede optimizar para un tratamiento eficaz como el desvelado en el presente documento. Por ejemplo, el peso molecular de un polfmero puede influir en la velocidad de degradacion de la partfcula (tal como cuando el peso molecular de un polfmero biodegradable se puede ajustar), la solubilidad, la absorcion de agua y la cinetica de liberacion del farmaco. Por ejemplo, el peso molecular del polfmero se puede ajustar de modo que la partfcula se biodegrade en el sujeto en tratamiento en un penodo razonable de tiempo (que vane de unas pocas horas a 1-2 semanas, 3-4 semanas, 5-6 semanas, 7-8 semanas, etc.). Una partfcula desvelada puede, por ejemplo, comprender un copolfmero en dibloque de PEG y PL(G)A, en el que por ejemplo, la porcion PEG puede tener un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 1.000-20.000, por ejemplo, de aproximadamente 2.000-20.000, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10.000 y la porcion PL(G)A puede tener un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 20.000, o de aproximadamente 5.000 y 100.000, por ejemplo, de aproximadamente 20.000 y 70.000, por ejemplo, de aproximadamente 15.000 y 50.000.
Por ejemplo, en el presente documento se desvela una nanopartfcula terapeutica de ejemplo que incluye de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 99 por ciento en peso de copolfmero acido poli(lactico)-bloque- poli(etilen)glicol o copolfmero acido poli(lactico)-co-poli(glicolico)-bloque-poli(etilen)glicol, o de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 80 por ciento en peso, de aproximadamente el 40 a aproximadamente el 80 por ciento en peso, o de aproximadamente el 30 y alrededor 50 por ciento en peso, o de aproximadamente el 70 a aproximadamente el 90 por ciento en peso de copolfmero acido poli(lactico)-poli(etilen)glicol o copolfmero acido poli(lactico)-co-poli(glicolico)-poli(etilen)glicol. Los copolfmeros de acido poli(lactico)-poli(etilen)glicol de ejemplo pueden incluir un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 kDa, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 kDa de acido poli(lactico) y un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, o de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 10 kDa de poli(etilen)glicol.
Las nanopartfculas desveladas pueden incluir opcionalmente de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 50 por ciento en peso de acido poli(lactico) o acido poli(lactico)-co-acido poli(glicolico) (que no incluya PEG), o pueden opcionalmente incluir de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 50 por ciento en peso, o de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 50 por ciento en peso o de aproximadamente el 30 a aproximadamente el 50 por ciento en peso de acido poli(lactico) o acido poli(lactico)-co-acido poli(glicolico). Por ejemplo, el acido poli(lactico) o el acido poli(lactico)-co-poli(glicolico) puede tener un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 kDa, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 12 kDa. El PLA de ejemplo puede tener un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 kDa. El PLGa de ejemplo puede tener un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 8 a aproximadamente 12 kDa.
En ciertas realizaciones, los polfmeros de las nanopartfculas pueden estar conjugados con un lfpido. El polfmero puede ser, por ejemplo, PEG terminado en lfpido. Como se ha descrito anteriormente, la porcion lipfdica del polfmero se puede usar para el autoensamblaje con otro polfmero, facilitando la formacion de una nanopartfcula. Por ejemplo, se podna conjugar un polfmero hidrofilo con un lfpido que se autoensamblara con un polfmero hidrofobo.
En algunas realizaciones, los lfpidos son aceites. En general, cualquier aceite conocido en la tecnica se puede conjugar con los polfmeros utilizados en la invencion. En algunas realizaciones, un aceite puede comprender uno o mas grupos acido graso o sales de los mismos. En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede comprender, hidrocarburos digeribles de cadena larga (por ejemplo, C8-C50), sustituidos o sin sustituir. En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede ser un acido graso C10-C20 o una sal del mismo. En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede ser un acido graso C15-C20 o una sal del mismo. En algunas realizaciones, un acido graso puede estar insaturado. En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede estar monoinsaturado. En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede estar poliinsaturado. En algunas realizaciones, un doble enlace de un
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grupo acido graso insaturado puede estar en la conformacion cis. En algunas realizaciones, un doble enlace de un grupo acido graso insaturado puede estar en la conformacion trans.
En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede ser uno mas de entre acido butmco, caproico, capnlico, caprico, laurico, minstico, palmttico, estearico, araqmdico, behenico o lignocerico. En algunas realizaciones, un grupo acido graso puede ser uno o mas de entre acido palmitoleico, oleico, vaccenico, linoleico, alfa-linolenico, gamma-linoleico, araquidonico, gadoleico, araquidonico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico o erucico.
En una realizacion particular, el Kpido tiene la formula V:
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y sales de la misma, en la que cada R es, independientemente, alquilo C1-30. En una realizacion de formula V, el lfpido es 1,2 diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) y sales de la misma, por ejemplo, la sal de sodio.
En una realizacion, los restos de direccionamiento de molecula pequena opcionales estan unidos, por ejemplo, unidos covalentemente, al componente lipfdico de la nanopardcula. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona una nanopartfcula que comprende un agente terapeutico, una matriz polimerica que comprende polfmeros funcionalizados y no funcionalizados y lfpido y un ligando de direccionamiento de PSMA de bajo peso molecular, en los que el ligando de direccionamiento esta unido, por ejemplo, unido covalentemente, al componente lipfdico de la nanopardcula. En una realizacion, el componente lipfdico que esta unido al resto de direccionamiento de bajo peso molecular tiene la formula V. En otra realizacion, la invencion proporciona una nanopartfcula espedfica para la diana que comprende un agente terapeutico, una matriz polimerica, DSPE y un ligando de direccionamiento de PSMA de bajo peso molecular, en la que el ligando esta unido, por ejemplo, unido covalentemente, a DSPE. Por ejemplo, la nanopartfcula de la invencion puede comprender una matriz polimerica constituida por PLGA-DSPE- PEG-Ligando.
Una nanopartfcula contemplada puede incluir una relacion entre polfmero unido a ligando y polfmero no funcionalizado eficaz para el tratamiento del cancer de prostata, en la que el polfmero hidrofilo unido al ligando, se conjuga con un lfpido que se autoensamblara con el polfmero hidrofobo, de modo que los polfmeros hidrofobo e hidrofilo que constituyen la nanopartfcula no esten unidos covalentemente. "Autoensamblaje" se refiere a un procedimiento de ensamblaje espontaneo de una estructura de orden superior que depende de la atraccion natural de los componentes de la estructura de orden superior (por ejemplo, moleculas) entre sf Se produce normalmente a traves de movimientos aleatorios de las moleculas y la formacion de enlaces basandose en el tamano, la forma, la composicion o las propiedades qrnmicas. Por ejemplo, un procedimiento de este tipo consiste en proporcionar un primer polfmero que se hace reaccionar con un lfpido para formar un conjugado polfmero/lfpido. El conjugado polfmero/lfpido se hace reaccionar despues con el ligando de bajo peso molecular para preparar un conjugado polfmero unido a ligando/lfpido; y se mezcla el conjugado polfmero unido a ligando/lfpido con un segundo polfmero no funcionalizado y el agente terapeutico; de modo que se forme la nanopartfcula. En ciertas realizaciones, el primer polfmero es PEG, de modo que se forma un PEG terminado en lfpido. En una realizacion, el lfpido tiene la formula V, por ejemplo, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) y sales de la misma, por ejemplo, la sal de sodio. Despues el PEG terminado en lfpido se puede, por ejemplo, mezclar con PLGA para formar una nanopartfcula.
Restos de direccionamiento
En el presente documento se proporcionan nanopartfculas que pueden incluir un resto de direccionamiento opcional, es decir un resto capaz de unirse o asociarse de otra manera a una entidad biologica, por ejemplo, un componente de membrana, un receptor de superficie celular, un antfgeno prostetico espedfico de membrana o similares. Un resto de direccionamiento presente en la superficie de la partfcula puede permitir que la partfcula se localice en un sitio particular que es la diana, por ejemplo, un tumor, un sitio de enfermedad, un tejido, un organo, un tipo de celula, etc. como tal, la nanopartfcula puede ser entonces "espedfica para la diana". El farmaco, o carga util, puede despues, en algunos casos, ser liberado de la partfcula y habilitado a interactuar localmente con el sitio particular que es la diana.
En una realizacion, una nanopartfcula desvelada incluye un resto de direccionamiento que es un ligando de bajo peso molecular, por ejemplo, un ligando de PSMA de bajo peso molecular. El termino "unirse" o "que se une", como
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se usa en el presente documento, se refiere a la interaccion entre un par correspondiente de moleculas o sus porciones que tienen afinidad mutua o capacidad de union, normalmente debido a una union o interaccion espedfica o no espedfica, incluidas, pero no exclusivamente, las interacciones bioqmmicas, fisiologicas y/o qmmicas. "Union biologica" define un tipo de interaccion que se produce entre pares de moleculas que incluyen protemas, acidos nucleicos, glucoprotemas, hidratos de carbono, hormonas o similares. La expresion "companero de union" se refiere a una molecula que puede unirse a otra molecula particular. "Union espedfica" se refiere a moleculas, como polinucleotidos, que son capaces de unirse o reconocer a un companero de union (o a un numero limitado de companeros de union) en mayor medida que a otras entidades biologicas similares En un conjunto de realizaciones, el resto de direccionamiento tiene una afinidad (medida a traves de la constante de disociacion) menor de aproximadamente 1 micromolar, al menos de aproximadamente 10 micromolar, o al menos de aproximadamente 100 micromolar.
Por ejemplo, una porcion de direccionamiento puede hacer que las partmulas se localicen en un tumor (por ejemplo un tumor solido), un sitio de enfermedad, un tejido, un organo, un tipo de celula, etc. en el organismo de un sujeto, dependiendo del resto de direccionamiento utilizado. Por ejemplo, un ligando de PSMA de bajo peso molecular se puede localizar en un tumor solido, por ejemplo, tumores de mama o prostata, o celulas cancerosas. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano. Los ejemplos de sujetos incluyen, pero no exclusivamente, un mairnfero tal como un perro, un gato, un caballo, un burro, un conejo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, una rata, un raton, una cobaya, un hamster, un primate, un ser humano o similares.
Los restos de direccionamiento contemplados incluyen moleculas pequenas. En ciertas realizaciones, la expresion "molecula pequena" se refiere a compuestos organicos, ya sean naturales o creados artificialmente (por ejemplo, por smtesis qmmica) que tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son protemas, polipeptidos ni acidos nucleicos. Las moleculas pequenas tienen normalmente multiples enlaces carbono-carbono. En ciertas realizaciones, las moleculas pequenas tienen menos de aproximadamente 2000 g/mol de tamano. En algunas realizaciones, las moleculas pequenas tienen menos de aproximadamente 1500 gramos/mol o menos de aproximadamente 1000 g/mol. En algunas realizaciones, las moleculas pequenas tienen menos de aproximadamente 800 g/mol o menos de aproximadamente 500 g/mol, por ejemplo de aproximadamente 100 g/mol a aproximadamente 600 g/mol, o de aproximadamente 200 g/mol a aproximadamente 500 g/mol.
Por ejemplo un resto de direccionamiento puede dirigirse a tumores de cancer prostatico, por ejemplo un resto de direccionamiento puede ser el inhibidor de la PSMA peptidasa. Estos restos tambien se denominan en el presente documento "ligandos de PSMA de bajo peso molecular". Cuando se compara con la expresion en tejidos normales, la expresion del antfgeno prostatico espedfico de membrana (PSMA, de ingles prostate specific membrane antigen) esta al menos sobreexpresada 10 veces en el tumor de prostata con respecto al tejido normal y el nivel de expresion de PSMA aumenta aun mas a medida que la enfermedad progresa a las fases metastasicas (Silver y col. 1997, Clin. Cancer Res., 3:81).
En algunas realizaciones, el ligando de PSMA de bajo peso molecular tiene las formulas I, II, III o IV:
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; en los que my n cada uno, independientemente, es 0, 1, 2 o 3; p es 0 o 1;
R1, R2, R4 y R5, cada uno, independientemente, se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo, C1-1 o-alquilo, alquilo C1-6 o alquilo C1-4), arilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo, fenilo o piridinilo) y cualquier combinacion de los mismos; y R3 es H o alquilo C1-6 (por ejemplo, CH3).
Para los compuestos de formulas I, II, III y IV, R1, R2, R4 o R5 comprenden puntos de union a la nanopartmula, por ejemplo, un punto de union a un polfmero que forma parte de una nanopartmula desvelada, por ejemplo, PEG. El punto de union puede estar formado por un enlace covalente, un enlace ionico, un enlace de hidrogeno, un enlace formado por adsorcion incluidas la adsorcion qmmica y la adsorcion ffsica, un enlace formado a partir de enlaces de van der Waals, o fuerzas de dispersion. Por ejemplo, si R1, R2, R4 o R5 se definen como una anilina o un grupo C1-6- alquil-NH2, podna eliminarse cualquier hidrogeno (por ejemplo, un hidrogeno de amino) de estos grupos funcionales de forma que el ligando de PSMa de bajo peso molecular se una covalentemente a la matriz polimerica (por ejemplo, el bloque PEG de la matriz polimerica) de la nanopartmula. Como se usa en el presente documento, la expresion "enlace covalente" se refiere a un enlace entre dos atomos formado compartiendo al menos un par de electrones.
En realizaciones particulares de las formulas I, II, III o IV, R1, R2, R4 y R5 cada uno, independientemente, es alquilo
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Ci-6 o fenilo, o cualquier combinacion de alquilo C1-6 o fenilo, que estan independientemente sustituidos una o mas veces con OH, SH, NH2 o CO2H, y en las que el grupo alquilo puede estar interrumpido por N(H), So O. En otra realizacion, por ejemplo, R1, R2, R4 y R5 cada uno, independientemente, es CH2-Ph, (CH2)2-SH, CH2-SH, (CH2)2C(H)(NH2)CO2H, CH2C(H)(NH2)CO2H, CH(NH2)CH2CO2H, (CH2)2C(H)(SH)CO2H, CH2-N(H)-Ph, O-CH2-Ph o O-(CH2)2-Ph, en los que cada Ph puede estar independientemente sustituido una o mas veces con OH, NH2, CO2H o SH. Para estas formulas, los grupos NH2, OH o SH sirven como el punto de union covalente a la nanopartfcula (por ejemplo, -N(H)-PEG, -O-PEG o -S-PEG).
En otra realizacion mas, el ligando de PSMA de bajo peso molecular se selecciona entre el grupo que consiste en
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos y en los que los grupos NH2, OH o SH sirven como el punto de union covalente a la nanopartfcula (por ejemplo, -N(H)-PEG, - O-PEG o -S-PEG).
En otra realizacion, el ligando de PSMA de bajo peso molecular se selecciona entre el grupo que consiste en
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; en los que R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en NH2, SH, OH, CO2H, alquilo C1-6 que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H y fenilo que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H y en los que R sirve como el punto de union covalente a la nanopartfcula (por ejemplo, -N(H)-PEG, -S-PEG, -O-PEG o CO2-PEG).
En otra realizacion, el ligando de PSMA de bajo peso molecular se selecciona entre el grupo que consiste en
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racemates de los mismos y en los que los grupos NH2 o CO2H sirven como el punto de union covalente a la nanopartteula (por ejemplo, -N(H)-PEG o CO2-PEG). Estos compuestos se pueden sustituir adicionalmente con NH2, sH, OH, CO2H, alquilo C1-6 que esta 5 sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, o fenilo que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, en los que estos grupos funcionales pueden tambien servir como el punto de union covalente a la nanopartteula.
En otra realizacion, el ligando de PSMA de bajo peso molecular es
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos y en los 10 que n es 1,2, 3, 4, 5 o 6. Para este ligando, el grupo NH2 sirve como punto de union covalente a la nanopartteula (por ejemplo, -N(H)-PEG).
En otra realizacion mas, el ligando de PSMA de bajo peso molecular es
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos. En 15 particular, el compuesto butilamina tiene la ventaja de una smtesis facil, especialmente debido a la falta de un anillo benceno. Ademas, sin desear quedar ligado a teona alguna, el compuesto de butilamina se escindira probablemente en las moleculas de origen natural (es decir, lisina y acido glutamico) minimizando de este modo los problemas de toxicidad.
En algunas realizaciones, los restos de direccionamiento de molecula pequena que se pueden usar para dirigirse a 20 celulas asociadas a tumores solidos tales como los tumores del cancer de prostata o mama incluyen inhibidores de la PSMA peptidasa tal como 2-PMPA, GPI5232, VA-033, fenilalquilfosfonamidatos y/o sus analogos y derivados. En algunas realizaciones, los restos de direccionamiento de molecula pequena que se pueden usar para tratar celulas asociadas a tumores de cancer prostatico incluyen derivados de tiol e indol tiol, tales como 2-MPpA y derivados del acido 3-(2-mercaptoetil)-1H-indol-2-carboxflico. En algunas realizaciones, los restos de direccionamiento de 25 molecula pequena que se pueden usar para dirigirse a celulas asociadas a tumores de cancer prostatico incluyen derivados de hidroxamato. En algunas realizaciones, los restos de direccionamiento de molecula pequena que se pueden usar para dirigirse a celulas asociadas a tumores de cancer prostatico incluyen inhibidores a base de urea y PBDA, tales como ZJ 43, ZJ 11, ZJ 17, ZJ 38 y/o analogos y derivados de los mismos, agentes dirigidos a receptores de androgenos (ARTA), poliaminas, tales como putrescina, espermina y espermidina e inhibidores de la 30 enzima glutamato carboxilasa II (GCPII), tambien conocida como peptidasa NAAG o NAALADasa.
En otra realizacion de la invencion actual, el resto de direccionamiento puede ser un ligando dirigido a Her2, EGFR o receptores toll.
Por ejemplo, los restos de direccionamiento contemplados pueden incluir un acido nucleico, un polipeptido, una glucoprotema, un hidrato de carbono o un lfpido. Por ejemplo, un resto de direccionamiento puede ser un resto de 35 direccionamiento acido nucleico (por ejemplo, un aptamero, por ejemplo, el aptamero A10) que se une a un marcador espedfico de un tipo de celulas. En general, un aptamero es un oligonucleotido (por ejemplo, AdN, ARN o un analogo o derivado de los mismos) que se une a una diana particular, tal como un polipeptido. En algunas realizaciones, un resto de direccionamiento puede ser un ligando natural o sintetico para un receptor de la superficie celular, por ejemplo, un factor de crecimiento, una hormona, LDL, transferrina, etc. Un resto de direccionamiento 40 puede ser un anticuerpo, termino que pretende incluir fragmentos de anticuerpo, porciones caractensticas de
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anticuerpos, los restos de direccionamiento de una sola cadena se pueden identificar, por ejemplo, usando procedimientos tales como presentacion en fago.
Los restos de direccionamiento que pueden ser un peptido de direccionamiento o peptidomimetico de direccionamiento que tenga una longitud de hasta aproximadamente 50 restos. Por ejemplo, un resto de direccionamiento puede incluir la secuencia de aminoacidos AKERC, CREKA, ARYLQKLN o AxyLzZLN, en los que X y Z son aminoacidos variables, o variantes conservadoras o peptidomimeticos de los mismos. En realizaciones particulares, el resto de direccionamiento es un peptido que incluye la secuencia de aminoacidos AKERC, CREKA, ARYLQKLN o AXYLZZLN, en los que X y Z son aminoacidos variables y tiene una longitud de menos de 20, 50 o 100 restos. El peptido CREKA (Cys Arg Glu Lys Ala) o un peptidomimetico del mismo o el octapeptido AXYLZZLN tambien se contemplan como restos de direccionamiento, asf como los peptidos, o variantes conservadoras o peptidomimeticos de los mismos, que se unen o forman un complejo con colageno IV, o la membrana basal de los tejidos diana (por ejemplo, la membrana basal de un vaso sangumeo), se puede usar como un resto de direccionamiento. Los restos de direccionamiento de ejemplo incluyen peptidos que se dirigen a ICAM (molecula de adhesion intercelular, por ejemplo ICAM-1).
Los restos de direccionamiento desvelados en el presente documento se conjugan normalmente con un polfmero o copolfmero desvelado (por ejemplo PLA-PEG) y dicho conjugado polimerico puede formar parte de una nanopartfcula desvelada. Por ejemplo, una nanopartfcula terapeutica desvelada puede incluir opcionalmente de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 10 por ciento en peso de un PLA-PEG o PLGA-PEG, en los que el PEG esta funcionalizado con un ligando de direccionamiento (por ejemplo PLA-PEG-Ligando). Las nanopartfculas terapeuticas contempladas pueden incluir, por ejemplo, de aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 10 por ciento en moles de PLA-PEG-GL2 o acido poli(lactico)-co-acido poli(glicolico)-PEG-GL2. Por ejemplo, PLA-PEG-GL2 puede incluir un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 20 kDa y un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 8.000.
Un ligando de direccionamiento de este tipo puede estar, en algunas realizaciones, unido covalentemente al PEG, por ejemplo, unido al PEG a traves de un engarce alquileno, por ejemplo PLA-PEG-alquileno-GL2. Por ejemplo, una nanopartfcula desvelada puede incluir de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 10 por ciento en moles de pLA- PEG-GL2 o acido poli(lactico)-co-acido poli(glicolico)-PEG-GL2. Se debe entender que la referencia a PLA-PEG-GL2 o PLGA-PEG-GL2 se refiere a grupos que pueden incluir un engarce alquileno (por ejemplo C1-C20, por ejemplo, (CH2)s) que una un PLA-PEG o PLGA-PEG a GL2.
Los ejemplos de conjugados polimericos incluyen:
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en los que R1 se selecciona entre el grupo que consiste en H y un grupo alquilo C1-C20 opcionalmente sustituido con uno, dos, tres o mas halogenos;
R2 es un enlace, una union ester o una union amida;
R3 es un alquileno C1-C10 o un enlace;
x es de 50 a aproximadamente 1500, o de aproximadamente 60 a aproximadamente 1000; y es 0 a aproximadamente 50; y
z es de aproximadamente 30 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 180.
En una realizacion diferente, x representa de 0 a aproximadamente 1 fraccion molar; e y puede representar de 5 aproximadamente 0 a aproximadamente 0,5 fraccion molar. En una realizacion de ejemplo, x+y puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 1720 y/o z puede ser de aproximadamente 25 a aproximadamente 455.
Por ejemplo, una nanopartfcula desvelada puede incluir un grupo de direccionamiento polimerico representado por la formula VI:
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10 en la que n es de aproximadamente 200 a aproximadamente 300, por ejemplo, aproximadamente 222 y m es de aproximadamente 80 a aproximadamente 130, por ejemplo aproximadamente 114. Las nanopartfculas desveladas, en ciertas realizaciones, pueden incluir de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 4% en peso de, por ejemplo, un conjugado polimerico de formula VI, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 2% o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 1 %, o de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 0,8 % 15 en peso de, por ejemplo, un conjugado polimerico de formula VI.
En una realizacion de ejemplo, una nanopartfcula desvelada comprende una nanopartfcula que tiene un conjugado PLA-PEG-alquileno-GL2, en el que, por ejemplo, PLA tiene un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 16.000 Da, PEG tiene un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 5.000 Da y por ejemplo, el engarce alquileno es un alquileno C1-C20, por ejemplo (CH2)5.
20 Por ejemplo, una nanopartfcula desvelada puede incluir un conjugado representado por:
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en el que y es aproximadamente 222 y z es aproximadamente 114.
Un conjugado polimerico desvelado se puede formar usando cualquier tecnica de conjugacion adecuada. Por ejemplo, dos compuestos tales como un resto de direccionamiento y un polfmero biocompatible, un polfmero 25 biocompatible y un poli(etilenglicol), etc., se pueden conjugar entre sf usando tecnicas tales como qmmica de EDC- NHS (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y N-hidroxisuccinimida) o una reaccion que implique una maleimida o un acido carboxflico, que se pueden conjugar con un extremo de un tiol, una amina o un polieter similarmente funcionalizado. La conjugacion de dichos polfmeros, por ejemplo, la conjugacion de un poli(ester) y un
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poli(eter) para formar un poli(ester-eter), se puede realizar en un disolvente organico, tal como, pero no limitado a, diclorometano, acetonitrilo, cloroformo, dimetilformamida, tetrahidrofurano, acetona o similares. Las condiciones de reaccion espedficas pueden ser determinadas por los expertos en la materia utilizando simplemente la experimentacion habitual.
En otro conjunto de realizaciones, se puede realizar una reaccion de conjugacion haciendo reaccionar un polfmero que comprende un grupo funcional acido carbox^lico (por ejemplo, un compuesto poli(ester-eter)) con un polfmero u otro resto (tal como un resto de direccionamiento) que comprenda una amina. Por ejemplo, un resto de direccionamiento, tal como un ligando de PSMA de bajo peso molecular, se puede hacer reaccionar con una amina para formar un resto que contenga amina, que despues se puede conjugar con el acido carboxflico del polfmero. Una reaccion de este tipo se puede producir como una reaccion de un solo paso, es decir, la conjugacion se realiza sin utilizar productos intermedios tales como N-hidroxisuccinimida o una maleimida. La reaccion de conjugacion entre el resto que contiene amina y el polfmero terminado en acido carboxflico (tal como un compuesto poli(ester- eter)) se puede lograr, en un conjunto de realizaciones, anadiendo el resto que contiene amina solubilizado en un disolvente organico tal como (pero no limitado a) diclorometano, acetonitrilo, cloroformo, tetrahidrofurano, acetona, formamida, dimetilformamida, piridinas, dioxano o dimetilsulfoxido, a una solucion que contiene el polfmero terminado en acido carboxflico. El polfmero terminado en acido carboxflico puede estar contenido en un disolvente organico tal como, pero no limitado a, diclorometano, acetonitrilo, cloroformo, dimetilformamida, tetrahidrofurano o acetona. La reaccion entre el resto que contiene amina y el polfmero terminado en acido carboxflico puede, en algunos casos, producirse espontaneamente. Los reactivos no conjugados se pueden retirar por lavado despues de dichas reacciones y el polfmero se puede precipitar en disolventes tales como, por ejemplo, eter etflico, hexano, metanol o etanol.
Como ejemplo espedfico, un ligando de PSMA de bajo peso molecular se puede preparar como un resto de direccionamiento en una partfcula de la manera siguiente. Se puede conjugar poli(lactido-co-glicolido) (PLGA- COOH) modificado con acido carboxflico con un poli(etilenglicol) (NH2-PEG-COOH) heterobifuncional modificado con amina para formar un copolfmero PLGA-PEG-COOH. Utilizando un ligando de PSMA de bajo peso molecular modificado con amina (NH2-Lig), se puede formar un polfmero en tribloque de PLGA-PEG-Lig conjugando el extremo acido carboxflico del PEG con el grupo funcional amina del ligando. El polfmero multibloque despues se puede usar, por ejemplo, como se trato antes, por ejemplo, para aplicaciones terapeuticas.
Como se usa en el presente documento, el termino "alquilo" comprende grupos alifaticos saturados, incluidos grupos alquilo de cadena lineal (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de cadena ramificada (isopropilo, terc-butilo, isobutilo, etc.), grupos cicloalquilo (alidclicos) (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo.
El termino "arilo" comprende grupos, incluidos grupos aromaticos de un solo anillo de 5 y 6 miembros que pueden tener de cero a cuatro heteroatomos, por ejemplo, fenilo, pirrol, furano, tiofeno, tiazol, isotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina y analogos. Ademas, el termino "arilo" incluye grupos arilo multidclicos, por ejemplo, tridclicos, bidclicos, como naftaleno, benzoxazol, benzodioxazol, benzotiazol, bencimidazol, benzotiofeno, metilenodioxifenilo, quinolina, isoquinolina, antrilo, fenantrilo, naftridina, indol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina o indolizina. Los grupos arilo que tienen heteroatomos en la estructura del anillo tambien se pueden denominar "aril heterociclos", "heterociclos", "heteroarilos" o "heteroaromaticos". El anillo aromatico puede estar sustituido en una o mas posiciones del anillo con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, alquilo, halogeno, hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alquilaminocarbonilo, aralquilaminocarbonilo, alquenilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, alquenilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluidos alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluidos alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o un resto aromatico o heteroaromatico. Los grupos arilo tambien se pueden condensar o unir por puentes anillos alidclicos o heterodclicos que no sean aromaticos para formar un policiclo (por ejemplo, tetralina).
Los restos de direccionamiento pueden estar, por ejemplo, sustituidos adicionalmente con un grupo funcional que se puede hacer reaccionar con un polfmero de la invencion (por ejemplo, PEG) para producir un polfmero conjugado con un resto de direccionamiento. Los grupos funcionales incluyen cualquier resto que se pueda usar para crear un enlace covalente con un polfmero (por ejemplo, PEG), tal como amino, hidroxi y tio. En una realizacion particular, las moleculas pequenas pueden estar sustituidas con NH2, SH u OH, los cuales estan unidos directamente a la molecula pequena, o unidos a la molecula pequena a traves de un grupo adicional, por ejemplo, alquilo o fenilo. En un ejemplo no limitante, las moleculas pequenas desveladas en las patentes, solicitudes de patentes y la bibliograffa no de patentes citada en el presente documento, se pueden unir a anilina, alquil-NH2 (por ejemplo, (CH2)i-aNH2), o alquil-SH (por ejemplo, (CH2)i-aNH2), en los que los grupos NH2 y SH se pueden hacer reaccionar con un polfmero (por ejemplo, PEG), para formar un enlace covalente con ese polfmero, es decir, formar un conjugado polimerico.
Por ejemplo, en el presente documento se desvela una nanopartfcula que tiene un agente terapeutico; y una primera
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macromolecula que comprende un copoUmero PLGA-PEG o un copoUmero PLA-PEG conjugado con un ligando que tiene un peso molecular de aproximadamente 100g/mol y 500 g/mol en la que el copolfmero PLGA-PEG o el copolfmero PLA-PEG que esta conjugado con el ligando, representa de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 30 por ciento en moles del contenido total de polfmero, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 20 por ciento en moles, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10 por ciento en moles o de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 5 por ciento en moles del contenido total de polfmero de una nanopartfcula. Una nanopartfcula de este tipo puede incluir ademas una segunda macromolecula que comprenda un copolfmero PLGA- PEG o un copolfmero PLA-PEG, en los que el copolfmero no esta unido a un resto de direccionamiento; y un excipiente farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, el primer copolfmero puede tener de aproximadamente el 0,001 al 5 por ciento en peso del ligando con respecto al contenido total de polfmero.
Las nanopartfculas de ejemplo pueden incluir un agente terapeutico; y una composicion polimerica, en las que la composicion polimerica comprende: una primera macromolecula que comprende un primer polfmero unido a un ligando; y una segunda macromolecula que comprende un segundo polfmero no unido a un resto de direccionamiento; en las que la composicion polimerica comprende de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 5,0 por ciento en peso de dicho ligando. Dichos ligandos pueden tener un peso molecular de aproximadamente 100 g/mol a aproximadamente 6000 g/mol, o menos de aproximadamente 1000 g/mol, por ejemplo de aproximadamente 100 g/mol a aproximadamente 500 g/mol. En otra realizacion, se proporciona en el presente documento una composicion farmaceutica, que comprende una pluralidad de nanopartfculas polimericas espedficas para la diana comprendiendo cada una un agente terapeutico; y una composicion polimerica, en la que la composicion polimerica contiene de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 30 por ciento en moles, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 20 por ciento en moles, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10 por ciento en moles de una primera macromolecula que comprende un primer polfmero unido a un ligando; y una segunda macromolecula que comprende un segundo polfmero no unido a un resto de direccionamiento; y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Nanoparticulas
Las nanoparticulas desveladas pueden tener una configuracion sustancialmente esferica (es decir las partfculas parecen en general ser esfericas), o no esferica. Por ejemplo, las partfculas, despues de hincharse o encogerse, pueden adoptar una configuracion no esferica. En algunos casos, las partfculas pueden incluir mezclas polimericas. Por ejemplo, se puede formar una mezcla polimerica de modo que incluya un primer polfmero que comprenda un resto de direccionamiento (es decir, un ligando de PSMA de bajo peso molecular) y un polfmero biocompatible y un segundo polfmero que comprenda un polfmero biocompatible pero no comprenda el resto de direccionamiento. Controlando la relacion entre el primer y segundo polfmeros en el polfmero final, la concentracion y la ubicacion del resto de direccionamiento en el polfmero final pueden controlarse facilmente en cierto grado.
Las nanoparticulas desveladas pueden tener una dimension caractenstica de menos de aproximadamente 1 micrometro, en las que la dimension caractenstica de la partfcula es el diametro de una esfera perfecta que tiene el mismo volumen que una partfcula. Por ejemplo, la partfcula puede tener una dimension caractenstica de partfcula que puede ser inferior a aproximadamente 300 nm, inferior a aproximadamente 200 nm, inferior a aproximadamente 150 nm, inferior a aproximadamente 100 nm, inferior a aproximadamente 50 nm, inferior a aproximadamente 30 nm, inferior a aproximadamente 10 nm, inferior a aproximadamente 3 nm o inferior a aproximadamente 1 nm en algunos casos. En realizaciones particulares, la nanopartfcula de la presente invencion tiene un diametro de aproximadamente 80 nm y 200 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 150 nm o de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 200 nm.
En un conjunto de realizaciones, las partfculas pueden tener un interior y una superficie, en las que la superficie tiene una composicion diferente del interior, es decir, puede haber al menos un compuesto presente en el interior que no esta presente en la superficie (o vice versa) y/o al menos un compuesto esta presente en el interior y en la superficie a concentraciones diferentes. Por ejemplo, en una realizacion, un compuesto, tal como un resto de direccionamiento (es decir, un ligando de bajo peso molecular) de un conjugado polimerico de la presente divulgacion, puede estar presente tanto en el interior como en la superficie de la partfcula, pero a una concentracion mayor en la superficie que en el interior de la partfcula, aunque en algunos casos, la concentracion en el interior de la partfcula puede ser esencialmente distinta de cero, es decir, existe una cantidad detectable del compuesto presente en el interior de la partfcula.
En algunos casos, el interior de la partfcula es mas hidrofobo que la superficie de la partfcula. Por ejemplo, el interior de la partfcula puede ser relativamente hidrofobo con respecto a la superficie de la partfcula, y un farmaco, u otra carga util, puede ser hidrofobo y asociarse facilmente al centro relativamente hidrofobo de la partfcula. El farmaco, u otra carga util, puede entonces estar contenido en el interior de la partfcula, que lo puede resguardar del entorno externo que rodea la partfcula (o vice versa). Por ejemplo, un farmaco, u otra carga util, contenido en la partfcula administrada a un sujeto estara protegido del organismo del sujeto y el sujeto tambien estara aislado del farmaco. Otro aspecto de la invencion se refiere a partfculas polimericas que tienen mas de un polfmero o una macromolecula presente y bibliotecas que implican dichos polfmeros o macromoleculas. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, las partfculas pueden contener mas de un polfmero distinguible (por ejemplo, copolfmeros como copolfmeros en bloque) y las relaciones entre los dos (o mas) polfmeros pueden controlarse independientemente, lo
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que permite controlar las propiedades de la pardcula. Por ejemplo, un primer poUmero puede ser un conjugado polimerico que comprenda un resto de direccionamiento y una porcion biocompatible y un segundo poKmero puede comprender una porcion biocompatible, pero no contener el resto de direccionamiento, o el segundo polfmero puede contener una porcion biocompatible distinguible del primer polfmero. El control de las cantidades de estos polfmeros dentro de la partfcula polimerica se puede usar entonces para controlar diversas propiedades ffsicas, biologicas o qmmicas de la partfcula, por ejemplo, el tamano de la partfcula (por ejemplo, variando los pesos moleculares de uno o ambos polfmeros), la carga superficial (por ejemplo, controlando las relaciones entre los polfmeros si los polfmeros tienen cargas o grupos terminales diferentes), la hidrofilia superficial (por ejemplo, si los polfmeros tienen pesos moleculares y/o hidrofilias diferentes), la densidad superficial del resto de direccionamiento (por ejemplo, controlando las relaciones entre los dos o mas polfmeros), etc.
Como ejemplo espedfico, una partfcula puede comprender un primer polfmero en dibloque que comprenda un poli(etilenglicol) y un resto de direccionamiento conjugado con el poli(etilenglicol) y un segundo polfmero que comprenda el poli(etilenglicol) pero no el resto de direccionamiento, o comprender tanto el poli(etilenglicol) como el resto de direccionamiento, en los que el poli(etilenglicol) del segundo polfmero tiene una longitud diferente (o numero de unidades de repeticion) que el poli(etilenglicol) del primer polfmero. Como otro ejemplo, una partfcula puede comprender un primer polfmero que comprenda una primera porcion biocompatible y un resto de direccionamiento y un segundo polfmero que comprenda una segunda porcion biocompatible diferente de la primera porcion biocompatible (por ejemplo, quetenga una composicion diferente, un numero sustancialmente diferente de unidades de repeticion, etc.) y el resto de direccionamiento. Como otro ejemplo mas, un primer polfmero puede comprender una porcion biocompatible y un primer resto de direccionamiento y un segundo polfmero puede comprender una porcion biocompatible y un segundo resto de direccionamiento diferente del primer resto de direccionamiento.
Por ejemplo, en el presente documento se desvela una nanopartfcula polimerica terapeutica capaz de unirse a una diana, que comprende un primer polfmero no funcionalizado; un segundo polfmero no funcionalizado opcional; un polfmero funcionalizado que comprende un resto de direccionamiento; y un agente terapeutico; en el que dicha nanopartfcula comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 300 moleculas de polfmero funcionalizado, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 moleculas, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 moleculas de polfmero funcionalizado.
En una realizacion particular, el polfmero de las macromoleculas primera o segunda de la nanopartfcula de la invencion es PLA, PLGA o PEG, o copolfmeros de los mismos. En una realizacion espedfica, el polfmero de la primera macromolecula es un copolfmero PLGA-PEG y la segunda macromolecula es un copolfmero PLGA-PEG o un copolfmero PLA-PEG. Por ejemplo3, una nanopartfcula de ejemplo puede tener una 3corona de PEG con una densidad de aproximadamente 0,065 g/cm3, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,10 g/cm3.
Las nanopartfculas desveladas pueden ser estables (por ejemplo conservar sustancialmente todo el agente activo) por ejemplo en una solucion que puede contener un sacarido, durante al menos 3 dfas, aproximadamente 4 dfas o al menos aproximadamente 5 dfas a temperatura ambiente, o a 25 °C.
En algunas realizaciones, las nanopartfculas desveladas tambien pueden incluir un alcohol graso, que puede aumentar la velocidad de liberacion del farmaco. Por ejemplo, las nanopartfculas desveladas pueden incluir un alcohol Cs-C30tal como alcohol cetflico, octanol, alcohol esteanlico, alcohol araquidflico, docosonal u octasonal.
Las nanopartfculas pueden tener propiedades de liberacion controlada, por ejemplo, pueden ser capaces de administrar una cantidad de agente activo a un paciente, por ejemplo, a un sitio espedfico del paciente, durante un penodo de tiempo prolongado, por ejemplo durante 1 dfa, 1 semana, o mas. En algunas realizaciones, las nanopartfculas desveladas liberan sustancialmente inmediatamente (por ejemplo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos) menos de aproximadamente el 2 %, menos de aproximadamente el 5 % o menos de aproximadamente el 10% de un agente activo (por ejemplo un taxano), por ejemplo, por ejemplo cuando estan colocados en una solucion tampon de fosfato a temperatura ambiente y/o a 37 °C.
Por ejemplo, las nanopartfculas desveladas que incluyen un agente terapeutico, pueden, en algunas realizaciones, liberar el agente terapeutico cuando estan colocadas en una solucion acuosa, por ejemplo a 25 °C con una velocidad que corresponde sustancialmente a: a) de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 20 % del agente terapeutico total se libera despues de aproximadamente 1 hora; b) de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 60 % del agente terapeutico se libera despues de aproximadamente 8 horas; c) de aproximadamente el 30 a aproximadamente el 80 % del agente terapeutico total se libera despues de aproximadamente 12 horas; y d) no menos de aproximadamente el 75 % del total se libera despues de aproximadamente 24 horas.
En algunas realizaciones, despues de la administracion a un sujeto o paciente de una nanopartfcula desvelada o una composicion que incluye una nanopartfcula desvelada, la concentracion plasmatica maxima (Cmax) del agente terapeutico en el paciente es sustancialmente mayor en comparacion con la Cmax del agente terapeutico si se administra solo (por ejemplo, no como parte de una nanopartfcula).
En otra realizacion, una nanopartfcula desvelada que incluye un agente terapeutico, cuando se administra a un sujeto, puede tener un tmax del agente terapeutico sustancialmente mas prolongado en comparacion con el tmax del
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agente terapeutico administrado solo.
Tambien se pueden formar bibliotecas de dichas parffculas. Por ejemplo, variando las relaciones entre los dos (o mas) poffmeros en la parffcula, estas bibliotecas pueden ser utiles para pruebas de cribado, ensayos de alto rendimiento o similares. Las entidades de la biblioteca pueden variar en propiedades tales como las que se han descrito anteriormente y en algunos casos, mas de una propiedad de las parffculas puede variar dentro de la biblioteca. En consecuencia, una realizacion de la invencion se refiere a una biblioteca de nanoparffculas quetienen diferentes relaciones entre poffmeros con propiedades distintas. La biblioteca puede incluir cualquier relacion o relaciones adecuadas entre los poffmeros.
La figura 1 ilustra que se pueden producir bibliotecas usando poffmeros tales como los que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, en la figura 1, se pueden usar parffculas polimericas que comprenden una primera macromolecula que comprende un poffmero hidrofobo biocompatible, un poffmero hidrofilo biocompatible y un ligando de PSMA de bajo peso molecular y una segunda macromolecula que comprende un poffmero hidrofobo biocompatible y un poffmero hidrofilo biocompatible para crear una biblioteca de parffculas con diferentes relaciones entre la primera y la segunda macromoleculas.
Una biblioteca de este tipo puede ser util para lograr parffculas que tengan cualquier numero de propiedades deseables, por ejemplo, propiedades tales como funcionalidad superficial, carga superficial, tamano, potencial zeta (5), hidrofobia, capacidad para controlar la inmunogenia, o similares.
Como ejemplos espedficos, en algunas realizaciones de la presente invencion, la biblioteca incluye parffculas que comprenden conjugados polimericos de un poffmero biocompatible y un ligando de bajo peso molecular, como se trato en el presente documento. En referencia ahora a la figura 1, se muestra una de dichas parffculas como un ejemplo no limitante. En esta figura, un conjugado polimerico de la divulgacion se usa para formar una parffcula 10. El poffmero que forma la parffcula 10 incluye un ligando de bajo peso molecular 15, presente en la superficie de la parffcula y una porcion biocompatible 17. En algunos casos, como se muestra en el presente documento, el resto de direccionamiento 15 se puede conjugar con la porcion biocompatible 17. Sin embargo, no toda la porcion biocompatible 17 se muestra conjugada con el resto de direccionamiento 15. Por ejemplo, en algunos casos, las parffculas tales como la parffcula 10 se pueden formar usando un primer poffmero que comprenda una porcion biocompatible 17 y un ligando de bajo peso molecular 15 y un segundo poffmero que comprenda la porcion biocompatible 17 pero no el resto de direccionamiento 15. Controlando la relacion entre el primer y el segundo poffmeros, se pueden formar parffculas con propiedades diferentes y en algunos casos, se pueden formar bibliotecas de dichas parffculas. Ademas, contenido en el centro de la parffcula 10 se encuentra el farmaco 12. En algunos casos, el farmaco 12 puede estar contenido dentro de la parffcula debido a efectos hidrofobos. Por ejemplo, el interior de la parffcula puede ser relativamente hidrofobo con respecto a la superficie de la parffcula y el farmaco puede ser un farmaco hidrofobo, que se asocia al centro relativamente hidrofobo de la parffcula. En una realizacion, el agente terapeutico se asocia a la superficie de, se encapsula dentro de, es rodeado por, o esta dispersado en toda, la nanoparffcula. En otra realizacion, el agente terapeutico esta encapsulado dentro del centro hidrofobo de la nanoparffcula.
Como ejemplo espedfico, la parffcula 10 puede contener poffmeros que incluyen un poffmero biocompatible relativamente hidrofobo y un resto de direccionamiento relativamente hidrofilo 15, de manera que, durante la formacion de la parffcula, una mayor concentracion del resto de direccionamiento hidrofilo se expone en la superficie y una mayor concentracion del poffmero biocompatible hidrofobo esta presente en el interior de la parffcula.
En algunas realizaciones, el poffmero biocompatible es un poffmero hidrofobo. Los ejemplos no limitantes de poffmeros biocompatibles incluyen polilactido, poliglicolido y/o poli(lactido-co-glicolido).
En una realizacion diferente, la presente divulgacion proporciona una nanoparffcula que comprende 1) una matriz polimerica; 2) opcionalmente, un compuesto, o capa, anfifflico que rodea o esta disperso dentro de la matriz polimerica formando una coraza continua o discontinua para la parffcula; 3) un poffmero no funcionalizado que puede formar parte de la matriz polimerica y 4) un ligando de PSMA de bajo peso molecular unido covalentemente a un poffmero que puede formar parte de la matriz polimerica. Por ejemplo, una capa anfifflica puede reducir la penetracion de agua en la nanoparffcula, aumentando la eficiencia de encapsulacion del farmaco y retardando la liberacion del mismo.
Como se usa en el presente documento, el termino "anfifflico" se refiere a una propiedad en la que la molecula tiene tanto una porcion polar como una porcion no polar. Con frecuencia, un compuesto anfifflico tiene una cabeza polar unida a una cola hidrofoba larga. En algunas realizaciones, la porcion polar es soluble en agua en tanto la no polar es insoluble en agua. Ademas, la porcion polar puede tener una carga positiva formal o una carga negativa formal. Como alternativa, la porcion polar puede tener tanto una carga positiva formal como una carga negativa formal y ser un zwitterion o sal interna. A los efectos de la invencion, el compuesto anfifflico puede ser, pero no limitarse a, uno o una pluralidad de los siguientes: ffpidos derivados naturalmente, tensioactivos o compuestos sintetizados con grupos tanto hidrofilos como hidrofobos.
Los ejemplos espedficos de compuestos anfifflicos incluyen, pero no se limitan a, fosfoffpidos, como 1,2 diestearoil-
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sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibehenoilfosfatidilcolina (DBPC), ditricosanoilfosfatidilcolina (DTPC) y dilignoceroilfatidilcolina (DLPC), incorporado en una relacion entre 0,01 y 60 (peso de ffpido/peso de poffmero), mas preferentemente entre 0,1 y 30 (peso de ffpido/peso de poffmero). Los fosfoffpidos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, acidos fosfaffdicos, fosfatidilcolinas tanto con ffpidos saturados como insaturados, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, derivados lisofosfatidilo, cardiolipina y p-acil-y-alquil fosfoffpidos. Los ejemplos de fosfoffpidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolinas como dioleoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipentadecanoilfosfatidilcolina, dilauroilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), dibehenoilfosfatidilcolina (DBPC), ditricosanoilfosfatidilcolina (DTPC), dilignoceroilfatidilcolina (DLPC); y fosfatidiletanolaminas como dioleoilfosfatidiletanolamina o 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina. Tambien se pueden utilizar fosfoffpidos sinteticos con cadenas de acilo asimetricas (por ejemplo, con una cadena de acilo de 6 carbonos y otra cadena acilo de 12 carbonos).
En una realizacion particular, un componente anfifflico que se puede usar para formar una capa anfifflica es lecitina y en particular, fosfatidilcolina. La lecitina es un ffpido anfifflico y como tal, forma una bicapa fosfolipfdica que tiene las cabezas hidrofilas (polares) enfrentando sus alrededores, que la mayor parte de las veces son acuosos y las colas hidrofobas enfrentandose entre sff La lecitina tiene la ventaja de ser un ffpido natural que se encuentra, por ejemplo, en la soja y que ya tiene la aprobacion de la FDA para su uso en otros dispositivos de administracion. Ademas, una mezcla de ffpidos como lecitina es mas ventajosa que un unico ffpido puro.
En ciertas realizaciones una nanoparffcula desvelada tiene una monocapa anfifflica, lo que significa que la capa no es una bicapa fosfolipfdica, sino que existe como una unica capa continua o discontinua alrededor, o dentro, de la nanoparffcula. La capa anfifflica esta "asociada a" la nanoparffcula de la invencion, lo que significa que esta ubicada en la proximidad de la matriz polimerica, como rodeando el exterior de la carcasa polimerica o dispersa en los poffmeros que constituyen la nanoparffcula.
Preparacion de las nanoparticulas
Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a sistemas y procedimientos para elaborar las nanoparticulas desveladas. En algunas realizaciones, utilizando dos o mas poffmeros diferentes (por ejemplo, copoffmeros, por ejemplo, copoffmeros en bloque) en diferentes proporciones y produciendo parffculas a partir de los poffmeros (por ejemplo, copoffmeros, por ejemplo, copoffmeros en bloque), se pueden controlar las propiedades de las parffculas. Por ejemplo, un poffmero (por ejemplo, copoffmero, por ejemplo, copoffmeros en bloque) puede, o no, incluir un ligando de PSMA de bajo peso molecular, aunque se puede elegir otro poffmero opcional (por ejemplo, copoffmero, por ejemplo, copoffmero en bloque) por su biocompatibilidad y/o su capacidad para controlar la inmunogenia de la parffcula resultante.
En un conjunto de realizaciones, las parffculas se forman proporcionando una solucion que contiene uno mas poffmeros y poniendo en contacto la solucion con un poffmero no disolvente para producir la parffcula. La solucion puede ser miscible o inmiscible con el poffmero no disolvente. Por ejemplo, un ffquido miscible con agua tal como acetonitrilo puede contener los poffmeros y las parffculas se forman a medida que el acetonitrilo se pone en contacto con agua, un poffmero no disolvente, por ejemplo, vertiendo el acetonitrilo en el agua a una velocidad controlada. El poffmero contenido en la solucion, despues del contacto con el poffmero no disolvente, se puede entonces precipitar para formar parffculas tales como las nanoparffculas. Se dice que dos ffquidos son "inmiscibles" o no miscibles, entre sf cuando uno no es soluble en el otro en una medida de hasta al menos el 10 % en peso a presion y temperatura ambientes. Normalmente, una solucion organica (por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, cloroformo, tetrahidrofurano, acetona, formamida, dimetilformamida, piridinas, dioxano, dimetilsulfoxido, etc.) y un ffquido acuoso (por ejemplo, agua o agua que contenga sales disueltas u otras especies, medios celulares o biologicos, etanol, etc.) son inmiscibles entre sff Por ejemplo, la primera solucion se puede verter en la segunda solucion (a una velocidad adecuada). En algunos casos, se pueden formar parffculas tales como nanoparffculas a medida que la primera solucion se pone en contacto con el segundo ffquido inmiscible, por ejemplo, la precipitacion del poffmero despues del contacto causa que el poffmero forme nanoparffculas mientras la primera solucion se vierte en el segundo ffquido y en algunos casos, por ejemplo, cuando la velocidad de introduccion es cuidadosamente controlada y mantenida a una velocidad relativamente lenta, se pueden formar nanoparffculas. El control de dicha formacion de parffculas puede ser facilmente optimizada por un experto en la materia usando simplemente la experimentacion de rutina.
Propiedades tales como funcionalidad superficial, carga superficial, tamano, potencial zeta (£), hidrofobia, capacidad para controlar la inmunogenia y similares; pueden ser altamente controladas usando un procedimiento desvelado. Por ejemplo, se puede sintetizar una biblioteca de parffculas y cribar para identificar las parffculas que tienen una relacion particular entre los poffmeros que permita que las parffculas tengan una densidad espedfica de restos (por ejemplo, ligandos de PSMA de bajo peso molecular) presentes en la superficie de la parffcula. Esto permite preparar parffculas que tengan una o mas propiedades espedficas, por ejemplo, un tamano espedfico y una densidad superficial espedfica de restos, sin un esfuerzo indebido. En consecuencia, ciertas realizaciones de la invencion apuntan a tecnicas de cribado utilizando dichas bibliotecas, asf como a todas las parffculas identificadas utilizando dichas bibliotecas. Ademas, la identificacion se puede realizar mediante cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, la identificacion puede ser directa o indirecta, o proceder cuantitativa o cualitativamente.
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En algunas realizaciones, se funcionalizan nanopartfculas ya formadas con un resto de direccionamiento utilizando procedimientos analogos a los descritos para producir conjugados ligando-poUmero funcionalizado. Por ejemplo, se mezcla un primer copolfmero (PLGA-PEG, poli(lactido-co-glicolido) y poli(etilenglicol)) con un agente terapeutico para formar partfculas. Despues las pardculas se asocian a un ligando de bajo peso molecular para formar nanopardculas que se puedan usar para el tratamiento del cancer. Las partfculas se pueden asociar a diversas cantidades de ligando de bajo peso molecular para controlar la densidad superficial de ligando de la nanopartfcula, alterando de ese modo las caractensticas terapeuticas de dicha nanopartfcula. Ademas, por ejemplo, controlando parametros tales como el peso molecular, el peso molecular de PEG y la carga superficial de la nanopartfcula, se pueden obtener partfculas controladas muy precisamente.
En otra realizacion, se proporciona un procedimiento de nanoemulsion, que esta representado en las figuras 3 y 4. Por ejemplo, un agente terapeutico, un primer polfmero (por ejemplo, un copolfmero en dibloque tal como PLA-PEG o PLGA-PEG, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente unido a un ligando, por ejemplo, GL2) y un segundo polfmero opcional (por ejemplo (PL(G)A-PEG o PLA), con una solucion organica para formar una primera fase organica. Dicha primera fase puede incluir de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 50 % de solidos en peso, de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 40% de solidos o de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 30 % de solidos. La primera fase organica se puede combinar con una primera solucion acuosa para formar una segunda fase. La solucion organica puede incluir, por ejemplo, tolueno, metil etil cetona, acetonitrilo, tetrahidrofurano, acetato de etilo, alcohol isopropflico, acetato de isopropilo, dimetilformamida, cloruro de metileno, diclorometano, cloroformo, acetona, alcohol bendlico, Tween 80, Span 80, o similares y combinaciones. En una realizacion, la fase organica puede incluir alcohol bendlico, acetato de etilo y combinaciones de los mismos. La segunda fase puede tener entre aproximadamente el 1 y el 50 % en peso, por ejemplo, aproximadamente el 5-40 % en peso de solidos. La solucion acuosa puede ser agua, opcionalmente en combinacion con uno o mas de entre colato de sodio, acetato de etilo, acetato de polivinilo y alcohol bendlico.
Por ejemplo, la fase oleosa u organica puede utilizar disolvente que sea solo parcialmente miscible con el no disolvente (agua). Por consiguiente, cuando se mezcla en proporciones suficientemente bajas y/o cuando se usa agua presaturada con los disolventes organicos, la fase oleosa permanece lfquida. La fase oleosa se puede emulsionar en una solucion acuosa y, como gotitas lfquidas, cizallar en nanopartfculas utilizando, por ejemplo, sistemas de dispersion de alta energfa, tales como homogeneizadores o sondas de ultrasonido. La porcion acuosa de la emulsion, conocida tambien como "fase acuosa", puede ser una solucion tensioactiva consistente en colato de sodio y presaturada con acetato de etilo y alcohol bendlico.
La emulsion de la segunda fase para formar una fase en emulsion se puede realizar en uno o dos pasos de emulsion. Por ejemplo, se puede preparar una emulsion primaria y despues emulsionar para formar una emulsion fina. La emulsion primaria se puede formar, por ejemplo, utilizando mezcla simple, un homogeneizador de alta presion, una sonda de ultrasonido, una barra de agitacion o un homogeneizador de rotor y estator. La emulsion primaria se puede convertir en una emulsion fina a traves del uso, por ejemplo, de una sonda de ultrasonido o un homogeneizador de alta presion, por ejemplo, usando 1, 2, 3 o mas pases a traves de un homogeneizador. Por ejemplo, cuando se usa un homogeneizador de alta presion, la presion puede ser de aproximadamente 1000 psi (6,89 MPa) a aproximadamente 8000 psi (55,14 MPa), de aproximadamente 2000 psi (13,79 Mpa) a aproximadamente 4000 psi (27,57 MPa), de aproximadamente 4000 psi (27,57 MPa) a aproximadamente 8000 psi (55,14 MPa), o de aproximadamente 4000 psi (27,57 MPa) a aproximadamente 5000 psi (34,46 MPa), por ejemplo, de aproximadamente 2000 psi (13,79 MPa), 2500 (17,23 MPa), 4000 psi (27,57 MPa) o 5000 psi (34,46 MPa).
Puede ser necesaria la evaporacion del disolvente o la dilucion para completar la extraccion del disolvente y solidificar las partfculas. Para un mayor control de la cinetica de extraccion y un procedimiento mas escalable, se puede usar una dilucion del disolvente a traves de medio de enfriamiento acuoso. Por ejemplo, la emulsion se puede diluir en agua fna hasta una concentracion suficiente para disolver todo el disolvente organico para formar una fase enfriada. El enfriamiento se puede realizar al menos parcialmente a una temperatura de aproximadamente 5 °C o menos. Por ejemplo, el agua utilizada en el enfriamiento puede estar a una temperatura menor que la temperatura ambiente (por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 10 °C, o de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 °C).
En algunas realizaciones, no todo el agente terapeutico (por ejemplo, docetaxel) se encapsula en las partfculas en esta etapa y se agrega un solubilizante de farmacos a la fase enfriada para formar una fase solubilizada. El solubilizante de farmacos puede ser, por ejemplo, Tween 80, Tween 20, polivinilpirrolidona, ciclodextrano, dodecilsulfato de sodio o colato de sodio. Por ejemplo, se puede anadir Tween 80 a la suspension de nanopartfculas enfriada para solubilizar el farmaco libre y evitar la formacion de cristales de farmaco. En algunas realizaciones, una relacion entre solubilizante de farmaco y agente terapeutico (por ejemplo docetaxel) es de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 10:1.
La fase solubilizada se puede filtrar para recuperar las nanopartfculas. Por ejemplo, se pueden utilizar membranas de ultrafiltracion para concentrar la suspension de nanopartfculas y eliminar sustancialmente el disolvente organico, el farmaco libre y otros adyuvantes del procedimiento (tensioactivos). Un ejemplo de filtracion se puede realizar usando un sistema de filtracion de flujo tangencial. Por ejemplo, utilizando una membrana con un tamano de poro adecuado para retener nanopartfculas mientras se permite pasar solutos, micelas y disolvente organico, las
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nanopardculas se pueden separar selectivamente. Se pueden usar membranas de ejemplo con pesos moleculares de corte de aproximadamente 300-500 kDa (~5-25 nm).
Se puede realizar una diafiltracion usando un enfoque de volumen constante, lo que significa que el diafiltrado (agua desionizada fna, por ejemplo de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 °C, o entre 0 a aproximadamente 10 °C) se puede anadir a la suspension de alimentacion a la misma velocidad que se retira el filtrado de la suspension. En algunas realizaciones, el filtrado puede incluir una primera filtracion utilizando una primera temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 °C, o entre 0 a aproximadamente 10 °C y una segunda temperatura de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 °C, o entre 15 a aproximadamente 35 °C. Por ejemplo, el filtrado puede incluir procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 5°C y procesar al menos un diavolumen (por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 o de aproximadamente 1 y 2 diavolumenes) a una temperatura de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 °C.
Despues de purificar y concentrar la suspension de nanopartfculas, las partfculas se pueden pasar a traves de uno, dos o mas filtros esterilizantes y/o de profundidad, por ejemplo, usando un prefiltro de profundidad de ~0,2 pm.
En otra realizacion de preparacion de nanopartfculas, se forma una fase organica compuesta por una mezcla de un agente terapeutico, por ejemplo docetaxel y un polfmero (homopolfmero, copolfmero y copolfmero con ligando). La fase organica se mezcla con una fase acuosa a una relacion de aproximadamente 1:5 (fase oleosa:fase acuosa, (O:W)) en la que la fase acuosa esta compuesta por un tensioactivo y algo de disolvente disuelto. La emulsion primaria se forma combinando las dos fases por mezcla simple o mediante el uso de un homogeneizador de rotor y estator. La emulsion primaria se convierte despues en una emulsion fina mediante el uso de un homogeneizador de alta presion. La emulsion fina se enfna despues anadiendo agua desionizada mientras se mezcla. La relacion medio de enfriamiento:emulsion (Q:E) es aproximadamente 8,5:1. Despues se agrega una solucion de Tween (por ejemplo, Tween 80) al medio de enfriamiento para conseguir aproximadamente el 2 % de Tween total. Esto sirve para disolver el farmaco libre no encapsulado. Despues las nanopartfculas se afslan por centrifugacion o ultrafiltracion/diafiltracion.
Se apreciara que las cantidades de polfmero y agente terapeutico o agente activo que se usan en la preparacion de la formulacion pueden diferir de una formulacion final. Por ejemplo, algo de agente activo puede no quedar completamente incorporado en una nanopartfcula y dicho agente terapeutico libre puede, por ejemplo, retirarse por filtracion. Por ejemplo, en una realizacion, se puede usar aproximadamente el 20 % de agente activo (por ejemplo docetaxel) a aproximadamente el 80 % de polfmero (por ejemplo el polfmero puede incluir aproximadamente el 2,5 por ciento en moles de PLA-PEG-GL2 y aproximadamente el 97,5 por ciento en moles de PLA-PEG), en la preparacion de una formulacion que da como resultado una nanopartfcula final que comprende aproximadamente el 10 por ciento en peso del agente activo (por ejemplo docetaxel) a aproximadamente el 90 por ciento en peso de polfmero (en la que el polfmero puede incluir aproximadamente el 1,25 por ciento en moles de PLA-PEG-GL2 a aproximadamente el 98,75 por ciento en moles de PLA-PEG). Dichos procedimientos pueden proporcionar nanopartfculas finales adecuadas para la administracion a un paciente que contengan de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 20 por ciento en peso de agente terapeutico, por ejemplo, aproximadamente el 5, aproximadamente el 8, aproximadamente el 10, aproximadamente el 15 por ciento en peso de agente terapeutico.
Agentes terapeuticos
De acuerdo con la presente invencion, todos los agentes, incluidos, por ejemplo, agentes terapeuticos (por ejemplo antineoplasicos), agentes de diagnostico (por ejemplo agentes de contraste; radionuclidos y grupos fluorescentes, luminiscentes y magneticos), agentes profilacticos (por ejemplo vacunas) y/o agentes nutraceuticos (por ejemplo vitaminas, minerales, etc.) se pueden administrar mediante las nanopartfculas desveladas. Los agentes de ejemplo que se pueden administrar de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, moleculas pequenas (por ejemplo citotoxicos), acidos nucleicos (por ejemplo, ARNip, ARNi y micro ARN), protemas (por ejemplo anticuerpos), peptidos, lfpidos, hidratos de carbono, hormonas, metales, elementos y compuestos radiactivos, farmacos, vacunas, agentes inmunologicos, etc. y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente que se va administrar es un agente util en el tratamiento del cancer (por ejemplo, cancer de prostata).
Por ejemplo, un resto de direccionamiento, si se usa, se puede dirigir a, o hacer que la partfcula se localice en, porciones espedficas dentro de un sujeto y la carga util puede entregarse a esas porciones. En una realizacion particular, el farmaco, u otra carga util, se libera de manera controlada desde una partfcula y se permite que interaccione localmente con el sitio particular que es la diana (por ejemplo, un tumor). La expresion "liberacion controlada" (y las variantes de ese termino) como se usa en el presente documento (por ejemplo, en el contexto de "sistema de liberacion controlada") pretende abarcar en general la liberacion de una sustancia (por ejemplo, un farmaco) en un sitio seleccionado, o de lo contrario controlable en la velocidad, el intervalo y/o la cantidad. La liberacion controlada abarca, pero no esta necesariamente limitada a, sustancialmente la administracion continua, la entrega segun un patron (por ejemplo, administracion intermitente en un penodo de tiempo que es interrumpida a intervalos regulares o irregulares) y la administracion de un bolo de una sustancia seleccionada (por ejemplo, como una cantidad discreta, predeterminada, si es una sustancia durante un penodo de tiempo relativamente corto (por ejemplo, unos pocos segundos o minutos)).
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El agente activo o farmaco puede ser un agente terapeutico tal como un antineoplasico tal como los inhibidores de mTor (por ejemplo, sirolimus, temsirolimus, o everolimus), alcaloides de la vinca tales como vincristina, un derivado diterpenico o un taxano tal como paclitaxel (o sus derivados tales como DHA-paclitaxel o PG-paclitaxel) o docetaxel.
En un conjunto de realizaciones, la carga util es un farmaco o una combinacion de mas de un farmaco. Dichas partfculas pueden ser utiles, por ejemplo, en realizaciones en las que un resto de direccionamiento se puede usar para dirigir una partfcula que contenga un farmaco a una ubicacion localizada particular dentro de un sujeto, por ejemplo, para permitir que se produzca la entrega localizada del farmaco. Los agentes terapeuticos de ejemplo incluyen antineoplasicos tales como doxorrubicina (adriamicina), gemcitabina (gemzar), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposido, metotrexato, vinorelbina, 5-fluorouracilo (5-FU), alcaloides de la vinca como vinblastina o vincristina; bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfan, carboplatino, cladribina, camptotecina, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), dacarbazina, S-I capecitabina, ftorafur, 5'desoxiflurouridina, eniluracilo, desoxicitidina, 5-azacitosina, 5-azadesoxicitosina, alopurinol, 2-cloroadenosina, trimetrexato, aminopterina, metileno-10-deazaaminopterina (MDAM), oxaplatino, picoplatino, tetraplatino, satraplatino, platino-DACH, ormaplatino y analogos del mismo, epirrubicina, fosfato de etoposido, 9- aminocamptotecina, 10,11-metilenodioxicamptotecina, karenitecina, 9-nitrocamptotecina, vindesina, mostaza de L- fenilalanina, ifosfamidamefosfamida, perfosfamida, trofosfamida, carmustina, semustina, epotilones A-E, tomudex, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, amsacrina, fosfato de etoposido, karenitecina, aciclovir, valaciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, lamivudina, zidovudina, bevacizumab, trastuzumab, rituximab, 5-fluorouracilo y combinaciones de los mismos.
Los ejemplos no limitantes de farmacos potencialmente adecuados incluyen antineoplasicos, incluyendo, por ejemplo, docetaxel, mitoxantrona y clorhidrato de mitoxantrona. En otra realizacion, la carga util puede ser un anticancengeno tal como 20-epi-1, 25 dihidroxivitamina D3, 4-ipomeanol, 5-etiniluracilo, 9-dihidrotaxol, abiraterona, acivicina, aclarrubicina, clorhidrato de acodazol, acronina, acilfiilveno, adecipenol, adozelesina, aldesleucina, todos los antagonistas de tk, altretamina, ambamustina, ambomicina, acetato de ametantrona, amidox, amifostina, aminoglutetimida, acido aminolevulmico, amrrubicina, amsacrina, anagrelida, anastrozol, andrografolida, inhibidores de la angiogenesis, antagonista D, antagonista G, antarelix, antramicina, protema morfogenetica-1 anti- dorsalizacion, antiestrogeno, antineoplaston, oligonucleotidos antisentido, glicinato de afidicolina, moduladores del gen de la apoptosis, reguladores de la apoptosis, acido apurmico, ARA-CDP-DL-PTBA, arginina desaminasa, asparaginasa, asperlina, asulacrina, atamestano, atrimustina, axinastatina 1, axinastatina 2, axinastatina 3, azacitidina, azasetron, azatoxina, azatirosina, azetepa, azotomicina, derivados de la bacatina III, balanol, batimastat, benzoclorinas, benzodepa, benzoilestaurosporina, derivados de la beta lactama, beta-aletina, betaclamicina B, acido betulmico, inhibidor de BFGF, bicalutamida, bisantreno, clorhidrato de bisantreno, bisazuidinilespermina, bisnafida, dimesilato de bisnafida, bistrateno A, bizelesina, bleomicina, sulfato de bleomicina, antagonistas de BRC/ABL, breflato, brequinar sodico, bropirimina, budotitano, busulfan, butionina sulfoximina, cactinomicina, calcipotriol, calfostina C, calusterona, derivados de camptotecina, canaripox IL-2, capecitabina, caraceraide, carbetimero, carboplatino, carboxamida-amino-triazol, carboxiamidotriazol, carest M3, carmustina, earn 700, inhibidor derivado del cartflago, clorhidrato de carrubicina, carzelesina, inhibidores de la casema cinasa, castanoespermina, cecropina B, cedefingol, cetrorelix, clorambucilo, clorinas, cloroquinoxalina sulfonamida, cicaprost, cirolemicina, cisplatino, cis- porfirina, cladribina, analogos de clomifeno, clotirimazol, colismicina A, colismicina B, combretastatina A4, analogos de combretastatina, conagenina, crambescidina 816, crisnatol, mesilato de crisnatol, criptoficina 8, derivados de criptoficina A, curacina A, ciclopentaantraquinonas, ciclofosfamida, cicloplatam, cipemicina, citarabina, ocfosfato de citarabina, factor citolttico, citostatina, dacarbazina, dacliximab, dactinomicina, clorhidrato de daunorrubicina, decitabina, deshidrodidemnina B, deslorelina, dexifosfamida, dexormaplatino, dexrazoxano, dexverapamilo, dezaguanina, mesilato de dezaguanina, diaziquona, didemnina B, didox, dietihiorspermina, dihidro-5-azacitidina, dioxamicina, difenil espiromustina, docetaxel, docosanol, dolasetron, doxifluridina, doxorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, droloxifeno, citrato de droloxifeno, propionato de dromostanolona, dronabinol, duazomicina, duocanicina SA, ebseleno, ecomustina, edatrexato, edelfosina, edrecolomab, eflomitina, clorhidrato de eflomitina, elemeno, elsamitrucina, emitefur, enloplatino, enpromato, epipropidina, epirrubicina, clorhidrato de epirrubicina, epristerida, erbulozol, sistema vector de terapia genica de eritrocitos, clorhidrato de esorrubicina, estramustina, analogos de estramustina, fosfato sodico de estramustina, agonistas de estrogenos, antagonistas de estrogenos, etanidazol, etoposido, fosfato de etoposido, etoprina, exemestano, fadrozol, clorhidrato de fadrozol, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasterida, flavopiridol, flezelastina, floxuridina, fluasterona, fludarabina, fosfato de fludarabina, clorhidrato de fluorodaunorrubicina, fluorouracilo, flurocitabina, forfenimex, formestano, fosquidona, fostriecina, fostriecina sodica, fotemustina, texafirina de gadolinio, nitrato de galio, galocitabina, ganirelix, inhibidores de la gelatinasa, gemcitabina, clorhidrato de gemcitabina, inhibidores del glutation, hepsulfam, heregulina, bisacetamida de hexametileno, hidroxiurea, hipericina, acido ibandronico, idarrubicina, clorhidrato de idarrubicina, idoxifeno, idramantona, ifosfamida, ihnofosina, ilomastat, imidazoacridonas, imiquimod, peptidos inmunoestimulantes, inhibidor del receptor de factor de crecimiento-1 similar a la insulina, agonistas del interferon, interferon alfa-2A, interferon alfa-2B, interferon alfa-N1, interferon alfa-N3, interferon beta-IA, interferon gamma-IB, interferones, interleucinas, iobenguano yododoxorrubicina, iproplatm, irinotecan, clorhidrato de irinotecan, iroplact, irsogladina, isobengazol, isohomohalicondrina B, itasetron, jasplakinolida, kahalalida F, triacetato de lamelarina-N, lanreotida, acetato de lanreotida, leinamicina, lenograstim, sulfato de lentinano, leptolestatina, letrozol, factor de inhibicion de la leucemia, interferon alfa de leucocito, acetato de leuprolida, leuprolida/estrogeno/progesterona, leuprorelina, levamisol, liarozol, clorhidrato de liarozol, analogos lineales de poliamina, peptido disacarido lipofilo, compuestos de platino lipofilos,
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lisoclinamida, lobaplatino, lombricina, lometrexol, lometrexol sodico, lomustina, lonidamina, losoxantrona, clorhidrato de losoxantrona, lovastatina, loxoribina, lurtotecan, texafirina de lutecio, lisofilina, peptidos ltticos, maitansina, manostatina A, marimastat, masoprocol, maspina, inhibidores de matrilisina, inhibidores de metaloproteinasa de matriz, maitansina, clorhidrato de mecloretamina, acetato de megestrol, acetato de melengestrol, melfalan, menogaril, merbarona, mercaptopurina, meterelina, metioninasa, metotrexato, metotrexato sodico, metoclopramida, metoprina, meturedepa, inhibidores de la protema cinasa C microalgal, inhibidor de MIF, mifepristona, miltefosina, mirimostim, ARN bicatenario mal apareado, mitindomida, mitocarcina, mitocromina, mitogilina, mitoguazona, mitolactol, mitomalcina, mitomicina-saporina, analogos de mitomicina, mitonafida, mitosper, mitotano, mitotoxina, factor de crecimiento de fibroblastos, mitoxantrona, clorhidrato de mitoxantrona, mofaroteno, molgramostim, anticuerpo monoclonal, gonadotrofina corionica humana, monofosforil lfpido del esqueleto de la pared celular de micobacteria, mopidamol, inhibidor del gen de multirresistencia a farmacos, terapia a base de supresor tumoral multiple 1, anticancengeno de mostaza, micaperoxida B, extracto de pared celular micobacteriana, acido micofenolico, miriaporona, n-acetildinalina, nafarelina, nagrestip, naloxona/pentazocina, napavina, nafterpina, nartograstim, nedaplatino, nemorrubicina, acido neridronico, endopeptidasa neutra, nilutamida, nisamicina, moduladores del oxido mtrico, antioxidante nitroxido, nitrulina, nocodazol, nogalamicina, benzamidas n-sustituidas, O6-benzilguanina, octreotida, oquiicenona, oligonucleotidos, onapristona, ondansetron, oracina, inductor de citosina oral, ormaplatino, osaterona, oxaliplatino, oxaunomicina, oxisurano, paclitaxel, analogos de paclitaxel, derivados de paclitaxel, palauamina, palmitoilrizoxina, acido pamidronico, panaxitriol, panomifeno, parabactina, pazeliptina, pegaspargasa, peldesina, peliomicina, pentamustina, polisulfato sodico de pentosano, pentostatina, pentrozol, sulfato de peplomicina, perflubron, perfosfamida, alcohol perilflico, fenazinomicina, fenilacetato, inhibidores de la fosfatasa, picibanilo, clorhidrato de pilocarpina, pipobromano, piposulfano, pirarrubicina, piritrexim, clorhidrato de piroxantrona, placetina A, placetina B, inhibidor del activador de plasminogeno, complejo de platino, compuestos de platino, complejo platino-triamina, plicamicina, plomestano, porffmero sodico, porfiromicina, prednimustina, clorhidrato de procarbazina, propil bis-acridona, prostaglandina J2, antiandrogeno de carcinoma prostatico, inhibidores del proteasoma, modulador inmunitario a base de protema A, inhibidor de la protema cinasa C, inhibidores de la protema tirosina fosfatasa, inhibidores de la purina-nucleosido fosforilasa, puromicina, clorhidrato de puromicina, purpurinas, pirazorurina, pirazoloacridina, conjugado de hemoglobina piridoxilada-polioxietileno, antagonistas de RAF, raltitrexed, ramosetron, inhibidores de la protema farnesil transferasa RAS, inhibidores de RAS, inhibidor de RAS-GAP, reteliptina desmetilada, etidronato de renio RE 186, rizoxina, riboprina, ribozimas, RH retinarnida, ARNi, rogletimida, rohituquina, romurtida, roquinimex, rubiginona B1, ruboxil, safingol, clorhidrato de safingol, saintopina, sarcnu, sarcofitol A, sargramostim, mimeticos de SDI1, semustina, derivado del inhibidor 1 de la senescencia, oligonucleotidos sentido, inhibidores de la transduccion de senales, moduladores de la transduccion de senales, simtrazeno, protema de union al antfgeno de una sola cadena, sizofirano, sobuzoxano, borocaptato de sodio, fenilacetato de sodio, solverol, protema de union a somatomedina, sonermina, esparfosato sodico, acido esparfosico, esparsomicina, espicamicina D, clorhidrato de espirogermanio, espiromustina, espiroplatino, esplenopentina, espongistatina 1, escualamina, inhibidor de celulas madre, inhibidores de la division de celulas madre, estipiamida, estreptonigrina, estreptozocina, inhibidores de la estromelisina, sulfinosina, sulofenur, antagonistas del peptido intestinal vasoactivo superactivo, suradista, suramina, swainsonina, glucosaminoglucanos sinteticos, talisomicina, talimustina, metyoduro de tamoxifeno, tauromustina, tazaroteno, tecogalan sodico, tegafur, telurapirilio, inhibidores de la telomerasa, clorhidrato de teloxantrona, temoporfina, temozolomida, teniposido, teroxirona, testolactona, tetraclorodecaoxido, tetrazomina, taliblastina, talidomida, tiamiprina, tiocoralina, tioguanina, tiotepa, trombopoyetina, mimeticos de trombopoyetina, timalfasina, agonista del receptor de timopoyetina, timotrinano, hormona estimulante de la tiroides, tiazofurina, etiopurpurina de etilo de estano, tirapazamina, dicloruro de titanoceno, clorhidrato de topotecan, topsentina, toremifeno, citrato de toremifeno, factor de celulas madre totipotentes, inhibidores de la traduccion, acetato de trestolona, tretinoina, triacetiluridina, triciribina, fosfato de triciribina, trimetrexato, trimetrexato glucuronato, triptorelina, tropisetron, clorhidrato de tubulozol, turosterida, inhibidores de la tirosina cinasa, tirfostinas, inhibidores de UBC, ubenimex, mostaza de uracilo, uredepa, factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital, antagonistas del receptor de urocinasa, vapreotida, variolina B, velaresol, veramina, verdinas, verteporfina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, sulfato de vindesina, sulfato de vinepidina, sulfato de vinglicinato, sulfato de vinleurosina, vinorelbina o tartrato de vinorelbina, sulfato de vinrosidina, vinxaltina, sulfato de vinzolidina, vitaxina, vorozol, zanoterona, zeniplatino, zilascorb, zinostatina, zinostatina, estimalamero o clorhidrato de zorrubicina.
Formulaciones farmaceuticas
Las nanopartmulas desveladas en el presente documento se pueden combinar con vehmulos farmaceuticamente aceptables para formar una composicion farmaceutica, de acuerdo otro aspecto de la invencion. Como apreciaran los expertos en la materia, los vehmulos se pueden elegir basandose en la via de administracion como se describe a continuacion, la ubicacion del problema que es la diana, el farmaco que se va entregar, el tiempo de entrega del farmaco, etc.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden administrar a un paciente mediante cualquier medio conocido en el area incluidas las vfas oral y parenteral. El termino "paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a seres humanos asf como no humanos, incluidos, por ejemplo, mairnferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Por ejemplo, los no humanos pueden ser marnfferos (por ejemplo un roedor, un raton, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un primate o un cerdo). En ciertas realizaciones las rutas parenterales son
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deseables puesto que evitan el contacto con las enzimas digestivas que se encuentran en el canal alimentario. De acuerdo con dichas realizaciones, las composiciones de la invencion se pueden administrar mediante inyeccion (por ejemplo, inyeccion intravenosa, subcutanea, intramuscular o peritoneal), por via rectal, vaginal, topica (por ejemplo mediante polvos, cremas, pomadas o gotas), o por inhalacion (por ejemplo mediante pulverizaciones).
En una realizacion particular, las nanopartfculas de la presente invencion se administran a un sujeto que lo necesita sistemicamente, por ejemplo, mediante infusion o inyeccion IV.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones esteriles inyectables acuosas u oleosas se pueden formular de acuerdo con las tecnicas conocidas usando agentes dispersantes o agentes humectantes y agentes de suspension adecuados. La preparacion esteril inyectable tambien puede ser una solucion, suspension o emulsion esteril inyectable en un diluyente o disolvente atoxico aceptable para su uso parenteral, por ejemplo, como una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vetuculos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solucion de Ringer U.S.P. y la solucion de cloruro de sodio isotonica. Ademas, convencionalmente se emplean aceites no volatiles esteriles como disolvente o medio de suspension. Para este fin se puede utilizar cualquier aceite no volatil suave incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, en la preparacion de inyectables se usan acidos grasos tales como el acido oleico. En una realizacion, el conjugado de la invencion se suspende en un fluido vehfculo que comprende el 1 % (p/v) de carboximetilcelulosa de sodio y el 0,1 % (v/v) de TWEEN™ 80. Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtracion a traves de un filtro que retenga bacterias, o mediante la incorporacion de agentes esterilizante en forma de composiciones solidas esteriles que se pueden disolver o dispersar en agua esteril o cualquier otro medio inyectable esteril antes de su uso.
Las formas farmaceuticas solidas para la administracion oral incluyen capsulas, comprimidos, pfldoras, polvos y granulos. En dichas formas farmaceuticas solidas, el conjugado encapsulado o no encapsulado se mezcla con al menos un excipiente o vetuculo inerte, farmaceuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato dicalcico y/o (a) cargas o expansores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y acido silfcico, (b) aglutinantes tales como por ejemplo carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arabiga, (c) humectantes tales como glicerol, (d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido algmico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (e) agentes retardantes de la solucion tales como parafina; (f) aceleradores de la absorcion tales como compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetflico y monoestearato de glicerol, (h) absorbentes como caolm y bentonita y (i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de las capsulas, los comprimidos y las pfldoras, las formas farmaceuticas tambien pueden contener tampones.
Se apreciara que la dosis exacta de la partfcula dirigida al PSMA es elegida por el medico individual a la vista del paciente que se va a tratar; en general, la dosis y la administracion se ajustan para proporcionar una cantidad eficaz de la partfcula dirigida al PSMA al paciente en tratamiento. Como se usa en el presente documento, la "cantidad eficaz" de una partfcula dirigida al PSMA se refiere a la cantidad necesaria para producir una respuesta biologica deseada. Como apreciaran los expertos en la materia, la cantidad eficaz de partfcula dirigida al PSMA puede variar dependiendo de factores tales como el criterio de valoracion biologico deseado, el farmaco que se va a administrar, el tejido que es la diana, la via de administracion, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de partfcula dirigida al PSMA que contiene un antineoplasico podna ser la cantidad que produzca una reduccion en el tamano del tumor en una cantidad deseada en un determinado penodo de tiempo. Otros factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado patologico; la edad, el peso y el genero del paciente en tratamiento; la dieta, el tiempo y la frecuencia de administracion; las combinaciones de farmacos; las reacciones de sensibilidad; y la tolerancia/respuesta al tratamiento.
Las nanopartfculas de la divulgacion se pueden formular en formas farmaceuticas unitarias para facilitar la administracion y la uniformidad de dosis. La expresion "forma farmaceutica unitaria" como se usa en el presente documento se refiere a una unidad ffsicamente discreta de nanopartfcula apropiada para el paciente que se va a tratar. Se comprendera, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones de la presente invencion sera decidido por el medico tratante segun su criterio profesional. Para cualquier nanopartfcula, la dosis terapeuticamente eficaz se puede calcular inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, generalmente en ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal tambien se usa para conseguir un intervalo de concentracion y una via de administracion deseables. Dicha informacion se puede usar despues para determinar las dosis y las vfas utiles para la administracion en los seres humanos. La eficacia terapeutica y la toxicidad de las nanopartfculas se puede determinar mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentacion, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50 % de la poblacion) y la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y se puede expresar como el cociente, DL50/DE50. Las composiciones farmaceuticas que tienen indices terapeuticos grandes pueden ser utiles en algunas realizaciones. Los datos obtenidos de esos ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosis para su uso en humanos.
En una realizacion, las composiciones desveladas en el presente documento pueden incluir menos de aproximadamente 10 ppm de paladio, o menos de aproximadamente 8 ppm, o menos de aproximadamente 6 ppm de paladio. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona una composicion que incluye nanopartfculas que
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tienen un conjugado polimerico PLA-PEG-GL2 en las que la composicion tiene menos de aproximadamente 10 ppm de paladio.
En una realizacion de ejemplo, se desvela una composicion farmaceutica que incluye una pluralidad de nanopartmulas cada una de las cuales comprende un agente terapeutico; de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 30 por ciento en moles del contenido total de polfmero, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 20 por ciento en moles, o de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 10 por ciento en moles, o de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 5 por ciento en moles del contenido total de polfmero de una nanopartmula de una primera macromolecula que comprende un copolfmero PLGA-PEG o un copolfmero PLA- PEG conjugado con un ligando que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 100 g/mol y 500 g/mol; y una segunda macromolecula que comprende un copolfmero PLGA-PEG o un copolfmero PLA-PEG, en los que el copolfmero no esta unido a un resto de direccionamiento; y un excipiente farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, el primer copolfmero puede tener de aproximadamente el 0,001 y el 5 por ciento en peso del ligando con respecto al contenido total de polfmero.
En algunas realizaciones, se considera una composicion adecuada para congelacion, que incluye nanopartmulas desveladas en el presente documento y una solucion adecuada para congelacion, por ejemplo, se anade una solucion de sacarosa a la suspension de nanopartmulas. La sacarosa puede actuar, por ejemplo, como un crioprotector para evitar que las partmulas se agreguen al congelarlas. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona una formulacion de nanopartmulas que comprenden una pluralidad de nanopartmulas desveladas, sacarosa y agua; en los que la relacion nanopartmulas/sacarosa/agua es de aproximadamente el 3-30 %/10- 30 %/50-90 % (p/p/p) o aproximadamente el 5-10 %/10-15 %/80-90 % (p/p/p).
Procedimientos de tratamiento
En algunas realizaciones, las partmulas dirigidas de acuerdo con la presente invencion se pueden usar para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar el inicio de, inhibir el avance de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de, uno o mas smtomas o caractensticas de una enfermedad, un trastorno y/o una afeccion. En algunas realizaciones, las partmulas dirigidas de la invencion se pueden usar para tratar tumores solidos por ejemplo cancer y/o celulas cancerosas. En ciertas realizaciones, las partmulas dirigidas de la invencion se pueden usar para tratar cualquier cancer en el que se exprese el PSMA sobre la superficie de celulas cancerosas o la neovasculatura del tumor en un sujeto que lo necesita, incluida la neovasculatura de tumores solidos de prostata o no prostaticos. Los ejemplos de indicaciones relacionadas con PSMA incluyen, pero no se limitan a, cancer de prostata, cancer de mama, carcinoma pulmonar no microcftico, carcinoma colorrectal y glioblastoma.
El termino "cancer" incluye canceres premalignos asf como malignos. Los canceres incluyen, pero no se limitan a, cancer de prostata, cancer gastrico, cancer colorrectal, cancer de piel, por ejemplo, melanomas o carcinomas de celulas basales, cancer de pulmon, cancer de mama, canceres de cabeza y cuello, cancer bronquial, cancer pancreatico, cancer de vejiga urinaria, cancer cerebral o del sistema nervioso central, cancer de sistema nervioso periferico, cancer esofagico cancer de la cavidad oral o la faringe, cancer de hngado, cancer de rinon, cancer testicular, cancer del tracto biliar, cancer de intestino delgado o apendice, cancer de glandula salival, cancer de glandula tiroides, cancer de glandula suprarrenal, osteosarcoma, condrosarcoma, cancer de tejidos hematologicos y similares. Las "celulas cancerosas" pueden estar en forma de un tumor, existir solas en un sujeto (por ejemplo celulas de leucemia), o ser lmeas celulares derivadas de un cancer.
El cancer se puede asociar a una diversidad de smtomas ffsicos. Los smtomas del cancer dependen generalmente del tipo y la ubicacion del tumor. Por ejemplo, el cancer de pulmon puede provocar tos, falta de aliento y dolor toracico, mientras que el cancer de colon con frecuencia causa diarrea, estrenimiento y sangre en las heces. Sin embargo, para proporcionar unos pocos ejemplos, los smtomas siguientes se asocian en general, con frecuencia, a muchos tipos de cancer: fiebre, escalofnos, sudoracion nocturna, tos, disnea, perdida de peso, perdida del apetito, anorexia, nauseas, vomitos, diarrea, anemia, ictericia, hepatomegalia, hemoptisis, fatiga, malestar general, disfuncion cognitiva, depresion, trastornos hormonales, neutropenia, dolor, ulceras que no cicatrizan, ganglios linfaticos agrandados, neuropatfa periferica y disfuncion sexual.
En un aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para el tratamiento del cancer (por ejemplo el cancer de prostata o de mama). En algunas realizaciones, el tratamiento del cancer comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de las partmulas dirigidas de la invencion a un sujeto que lo necesita, en tales cantidades y durante tal tiempo como sea necesario para conseguir el resultado deseado. En ciertas realizaciones de la presente invencion una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una partmula dirigida de la invencion es la cantidad eficaz para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar el inicio de, inhibir el avance de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de, uno o mas smtomas o caractensticas del cancer.
En un aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para administrar composiciones de la invencion a un sujeto que sufre de cancer (por ejemplo de cancer de prostata). En algunas realizaciones, se proporcionan partmulas a un sujeto en tales cantidades y portal tiempo como sea necesario para lograr el resultado deseado (es decir, el tratamiento del cancer). En ciertas realizaciones de la presente invencion una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una partmula dirigida de la invencion es la cantidad eficaz para tratar, aliviar, mejorar, mitigar, retrasar el
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inicio de, inhibir el avance de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de, uno o mas smtomas o caractensticas del cancer.
Los protocolos terapeuticos de la invencion implican administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una partmula dirigida de la invencion a un individuo sano (es decir, un sujeto que no presenta ningun smtoma de cancer y/o al que no se le ha diagnosticado cancer). Por ejemplo, los individuos sanos pueden ser "vacunados" con una partmula dirigida de la invencion antes de padecer cancer y/o el inicio de los smtomas del cancer; los individuos que corren riesgo (por ejemplo, pacientes que tienen antecedentes familiares de cancer; pacientes que tienen una o mas mutaciones geneticas asociadas a la aparicion de cancer; pacientes que tienen un polimorfismo genetico asociado a la aparicion de cancer; pacientes infectados por un virus asociado a la aparicion de cancer; pacientes con habitos y/o estilos de vida asociados a la aparicion de cancer; etc.) se pueden tratar sustancialmente contemporaneamente con (por ejemplo, dentro de las 48 horas, dentro de las 24 horas o dentro de las 12 horas ) el inicio de los smtomas del cancer. Por supuesto los individuos que se sabe que padecen cancer pueden recibir el tratamiento de la invencion en cualquier momento.
En otras realizaciones, las nanopartmulas de la presente invencion se pueden usar para inhibir el crecimiento de celulas cancerosas, por ejemplo de celulas de cancer prostatico. Como se usa en el presente documento, la expresion "inhibe el crecimiento de celulas cancerosas" o "inhibe el crecimiento de celulas cancerosas" se refiere a reducir la velocidad de la proliferacion y/o la migracion de celulas cancerosas, detener la proliferacion y/o la migracion de celulas cancerosas, o provocar la muerte de las celulas cancerosas, de modo que la velocidad de crecimiento de las celulas cancerosas se reduzca en comparacion con la velocidad observada o prevista de crecimiento de celulas cancerosas de control sin tratar. La expresion "inhibe el crecimiento" tambien se puede referir a una reduccion en el tamano o a la desaparicion de una celula cancerosa o un tumor, asf como a la reduccion de su potencial metastasico. Preferentemente, dicha inhibicion a nivel celular puede reducir el tamano, impedir el crecimiento, reducir la agresividad, o prevenir o inhibir las metastasis de un cancer en un paciente. Los expertos en la materia pueden determinar facilmente, mediante cualquiera de una diversidad de indicios adecuados, si el crecimiento de las celulas cancerosas es inhibido.
La inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas puede ser evidenciada, por ejemplo, por detencion de las celulas cancerosas en una fase particular del ciclo celular, por ejemplo, detener en la fase G2/M del ciclo celular. La inhibicion del crecimiento de celulas cancerosas tambien se puede evidenciar por medicion directa o indirecta del tamano de las celulas cancerosas o el tumor. En pacientes humanos con cancer, dichas mediciones se hacen generalmente usando procedimientos de formacion de imagenes bien conocidos tales como resonancia magnetica, tomograffa computarizada axial y radiograffas. El crecimiento de celulas cancerosas tambien se puede determinar indirectamente, determinando los niveles circulantes de antfgeno carcinoembrionario, antfgeno prostatico espedfico u otros antfgenos espedficos del cancer que se correlacionan con el crecimiento de celulas cancerosas. La inhibicion del crecimiento del cancer tambien se correlaciona generalmente con una supervivencia prolongada y/o mayor salud y bienestar del sujeto.
Tambien se proporcionan en el presente documento procedimientos de administracion a un paciente de una nanopartmula desvelada que incluye un agente activo, en los que, despues de la administracion al paciente, dichas nanopartmulas reducen sustancialmente el volumen de distribucion y/o reducen sustancialmente la Cmax libre, en comparacion con la administracion del agente activo solo (es decir, no como una nanopartmula desvelada).
Ejemplos
La invencion que se describe ahora en general, se comprendera mas facilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente con fines de ilustracion de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invencion y no pretenden limitar la invencion en modo alguno.
Ejemplo 1: Smtesis de un ligando de PSMA de bajo peso molecular (GL2)
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Se disolvieron 5 g (10,67 mmol) del compuesto de partida en 150 ml de DMF anhidra. A esta solucion se le anadio bromuro de alilo (6,3 ml, 72 mmol) y K2CO3 (1,47 g, 10,67 mmol). La reaccion se agito durante 2 h, se retiro el disolvente, el material en bruto se disolvio en AcOEt y se lavo con H2O hasta pH neutro. La fase organica se seco con MgSO4 (anhidro) y se evaporo para proporcionar 5,15 g (95 %) del material. (CCF en CH2Ch:MeOH 20:1 Rf = 5 0,9, comenzo Rf compuesto = 0,1, se revelo con ninhidrina y luz UV).
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A una solucion del compuesto (5,15 g, 10,13 mmol) en CH3CN (50 ml) se le anadio Et2NH (20 ml, 0,19 mol). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 40 min. El disolvente se retiro y el compuesto se purifico por cromatograffa en columna (hexano:AcOEt 3:2) para proporcionar 2,6 g (90 %). (CCF en CH2Ch:MeOH 10:1 Rf = 0,4, 10 se revelo con ninhidrina (el compuesto tiene un color violeta). RMN-1H (CDCl3, 300 MHz) 8 5,95-5,85 (m, 1H, - CH2CHCH2), 5,36-5,24 (m, 2H, -CH2CHCH2), 4,62-4,60 (m, 3H, -CH2CHCH2, NHBoc), 3,46 (t, 1H, CH(Lys)), 3,113,07 (m, 2H, CH2NHBoc), 1,79 (s a, 2H, NH2), 1,79-1,43 (m, 6H, 3CH2(Lys)), 1,43 (s, 9H, Boc).
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A una solucion agitada de glutamato de dialilo (3,96 g, 15 mmol) y trifosgeno (1,47 g, 4,95 mmol) en CH2Ch(143 ml) 15 a -78 °C se le anadio Et3N (6,4 ml, 46 mmol) en CH2Cl2 (28 ml). Se permitio que la mezcla de reaccion se calentara a temperatura ambiente y se agito durante 1,5 h. Despues se anadio el derivado de lisina (2,6 g, 9,09 mmol) en una solucion de CH2CI2 (36 ml) a -78 °C y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 12 h. La solucion se diluyo con CH2Cl2, se lavo dos veces con H2O, se seco en MgSO4 (anh.) y se purifico por cromatograffa en columna (hexano:AcOEt 3:1^2:1^AcOEt) para proporcionar 4 g (82 %) (cCf en C^Cl2:MeoH 20:1 Rf = 0,3, se revelo con 20 ninhidrina). RMN-1H (EDCls, 300 MHz) 8 5,97-5,84 (m, 3H, 3-CH2CHCH2), 5,50 (t a, 2H, 2NHurea), 5,36-5,20 (m, 6H, 3-CH2CHCH2), 4,81 (s a, 1H, NHBoc), 4,68-4,40 (m, 8H, 3-CH2CHCH2, CH(Lys), CH(glu)), 3,09-3,05 (m, 2H, CH2NHBoc), 2,52-2,39 (m, 2H, CH2(glu.)), 2,25-2,14 y 2,02-1,92 (2m, 2H, CH2(glu.)), 1,87-1,64 (m, 4H, 2CH2(Lys)), 1,51-1,35 (m, 2H, CH2(Lys)), 1,44 (s, 9H, Boc).
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1TA/CH,CI
A una solucion del compuesto (4 g, 7,42 mmol) en CH2CI2 seco (40 ml) se le anadio TFA (9 ml) a 0 °C. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente se retiro al vado a sequedad total para proporcionar 4,1 g (cuantitativo). (CCF en C^C^MeOH 20:1 Rf = 0,1, se revelo con ninhidrina). RMN-1H (CDCb, 300 MHz) 8 6,27-6,16 (2d, 2H, 2NHurea), 5,96-5,82 (m, 3H, 3-CH2CHCH2), 5,35-5,20 (m, 6H, 3-CH2CHCH2), 4,61-4,55 (m, 6H, 3- CH2CHCH2), 4,46-4,41 (m, 2H, CH(Lys), CH(glu)), 2,99 (m, 2H, CH2NHBoc), 2,46 (m, 2H, CH2(glu.)), 2,23-2,11 y 2,01-1,88 (2m, 2H, CH2(glu.)), 1,88-1,67 (m, 4H, 2CH2(Lys)), 1,45 (m, 2H, CH2(Lys)).
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A una solucion del compuesto (2 g, 3,6 mmol) en DMF (anh.) (62 ml) en atmosfera de argon se le anadio Pd(PPh3)4 (0,7 g, 0,6 mmol) y morfolina (5,4 ml, 60,7 mmol) a 0 °C. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente se retiro. Despues el producto en bruto se lavo dos veces con CH2Cl2 y despues se disolvio en H2O. A esta solucion se le anadio una solucion diluida de NaOH (0,01 N) hasta que el pH fue muy basico. El disolvente se retiro a presion reducida. El solido se volvio a lavar con CH2Cl2, AcOEt y una mezcla de MeOH-CH2Cl2 (1:1), se disolvio en H2O y se neutralizo con resina Amberlite IR-120 H+. El disolvente se evaporo y el compuesto se precipito con MeOH, para proporcionar 1 g (87 %) de GL2. RMN-1H (D2O, 300 MHz) 8 4,07 (m, 2H, CH(Lys), CH(glu)), 2,98 (m, 2H, CH2NH2), 2,36 (m, 2H, CH2(glu.)), 2,08-2,00 (m, 1H, CH2(glu)), 1,93-1,60 (m, 5H, CH2(glu.), 2CH2(Lys)), 1,41 (m, 2H, CH2(Lys)). IEN de masas: 320,47 [M + H+], 342,42 [M + Na+].
Ejemplo 2: Smtesis de un ligando de PSMA de bajo peso molecular (GL1)
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Se disolvieron 130 mg (0,258 mmol) del compuesto de partida en 3 ml de DMF anhidra. A esta solucion se le anadio bromuro de alilo (150 pl, 1,72 mmol) y K2CO3 (41 mg, 0,3 mmol). La reaccion se agito durante 1 h, se retiro el disolvente, el producto en bruto se disolvio en AcOEt y se lavo con H2O hasta pH neutro. La fase organica se seco con MgSO4 (anhidro) y se evaporo para proporcionar 130 mg (93 %). (CCF en CH2Ch:MeOH 20:1 Rf = 0,9, comenzo Rf del compuesto = 0,1, se revelo con ninhidrina y luz UV).RMN-1H (CdCl3, 300 MHz) 8 7,81-7,05 (12H, aromaticos), 6,81 (s a, 1H, NHFmoc), 5,93-5,81. (m, 1H, -CH2CHCH2), 5,35-5,24 (m, 2H, -CH2CHCH2), 5,00 (d a, 1H, NHboc), 4,61-4,53 (m, 5H, -CH2CHCH2, CH2(Fmoc), CH(pheaIa.)), 4,28 (t, 1H, CH(Fmoc)), 3,12-2,98 (m, 2H, CH2(pheaIa.),
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1,44 (s, 9H, Boc).
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A una solucion del compuesto (120 mg, 0,221 mmol) en CH2CI2 seco (2 ml) se le anadio TFA (1 ml) a 0 °C. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente se retiro al vado, se anadio agua y se volvio a retirar, se anadio CH2O2 y se volvio a retirar a sequedad total para proporcionar 120 mg (cuantitativo). (CCF en CH2Cl2:MeOH 20:1 Rf = 0,1, se revelo con ninhidrina y luz UV). RMN-1H (CDCI3, 300 MHz) 8 7,80-7,00 (13H, aromaticos, NHFmoc), 5,90-5,75 (m, 1H, -CH2CHCH2), 5,35-5,19 (m, 3H, -CH2CHCH2, NHboc), 4,70-4,40 (2m, 5H, - CH2CHCH2, CH2(Fmoc), CH(pheala.)), 4,20 (t, 1H, CH(Fmoc)), 3,40-3,05 (m, 2H, CH2(pheala.)).
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A una solucion agitada de glutamato de dialilo (110 mg, 0,42 mmol) y trifosgeno (43 mg, 0,14 mmol) en CH2Ch(4 ml) a -78 °C se le anadio Et3N (180 pl, 1,3 mmol) en CH2CI2 (0,8 ml). Se permitio que la mezcla de reaccion se calentara a temperatura ambiente y se agito durante 1,5 h. Despues se anadio el derivado de fenilalanina (140 mg, 0,251 mmol) en una solucion de CH2CI2 (1 ml) y Et3N (70 pl, 0,5 mmol) a -78 °C y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante 12 h. La solucion se diluyo con CH2CI2, se lavo dos veces con H2O, se seco en MgSo4 (anh.) y se purifico por cromatograffa en columna (hexano:AcOEt 3:1) para proporcionar 100 mg (57 %) (CCF en CH2Ch:MeOH 20:1 Rf = 0,3, se revelo con ninhidrina y luz UV). RMN-1H (CDCI3, 300 MHz) 8 7,80-6,95 (13H, aromaticos, NHFmoc), 5,98-5,82 (m, 3H, 3-CH2CHCH2), 5,54 (d a, 1H, NHurea),5,43-5,19 (m, 7H, 3-CH2CHCH2, NHurea), 4,854,78 (m, 1H, CH(pheaIa.)), 4,67-4,50 (m, 9H, 3-CH2CHCH2, CH2(Fmoc), CH(gIu.)), 4,28 (t, 1H, CH(Fmoc)), 3,05 (d, 2H, CH2(pheaIa.)), 2,53-2,33 (m, 2H, CH2(gIu.)), 2,25-2,11 y 1,98-1,80 (2m, 2H, CH2(gIu.)).
imagen30
A una solucion del compuesto de partida (60 mg, 0,086 mmol) en CH3CN (1 ml) se le anadio Et2NH (1 ml, 10 mmol). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 40 min. El disolvente se retiro y el compuesto se purifico por cromatograffa en columna (hexano:AcOEt 2:1) para proporcionar 35 mg (85 %). (CCF en CH2Ch:MeOH 1,0:1 Rf = 0,5, comenzo Rf compuesto = 0,75, se revelo con ninhidrina (el compuesto tiene color violeta) y luz UV). RMN-1H (CDCI3, 300 MHz) 8 6,85 y 6,55 (2d, 4H, aromaticos), 5,98-5,82 (m, 3H, 3-CH2CHCH2), 5,56 (d a, 1H, NHurea), 5,445,18 (m, 7H, 3-CH2CHCH2, NHurea), 4,79-4,72 (m, 1H, CH(pheaIa.)), 4,65-4,49 (m, 7H, 3-CH2CHCH2, CH(gIu.)), 3,64 (s a, 2H, NH2), 3,02-2,89 (m, 2H, CH2(pheaIa.)), 2,49-2,31 (m, 2H, CH2(gIu.)), 2,20-2,09 y 1,91-1,78 (2m, 2H, CH2(gIu.)).
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A una solucion del compuesto (50 mg, 0,105 mmol) en DMF (anh., 1,5 ml) en atmosfera de argon se le anadio Pd(PPh3)4 (21 mg, 0,018 mmol) y morfolina (154 pi, 1,77 mmol) a 0 °C. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Se retiro el disolvente. El material en bruto se lavo dos veces con CH2Cl2 y despues se disolvio en H2O. A esta solucion se le anadio una solucion diluida de NaOH (0,01 N) hasta que el pH fue muy basico. El disolvente se retiro a presion reducida. El solido se volvio a lavar con CH2Cl2, AcOEt y mezcla de MeOH-CH2Cl2 (1:1), se disolvio en H2O y se neutralizo con resina Amberlite IR-120 H+. El disolvente se evaporo y el compuesto se precipito con MeOH, para proporcionar 25 mg (67 %) de GL1. RMN-1H (D2O, 300 MHz) 8 7,08 y 6,79 (2d, 4H, aromaticos), 4,21 (m, 1H, CH(pheala.)), 3,90 (m, 1H, CH(glu.)), 2,99 y 2,82 (2dd, 2H, CH2(pheala.)), 2,22-2,11 (m, 2H, CH2(glu.)), 2,051,70 (2m, 2H, CH2(glu.)). RMN-13C (D2O, 75 MHz) 8 176,8, 174,5, 173,9 (3 COO), 153,3 (NHCONH), 138,8 (H2N- C(Ph)), 124,5, 122,9, 110,9 (aromaticos), 51,3 (CH(pheala.)), 49,8 (CH(glu.)), 31,8 (CH2(pheala.)), 28,4 y 23,6 (2CH2-glu.)). IEN de masas: 354,19 [M + H+], 376,23 [M + Na+].
Ejemplo 3: Preparacion de PLA-PEG
La smtesis se realizo mediante polimerizacion de apertura del anillo de d, 1 -lactido con a-hidroxi-w- metoxipoli(etilenglicol) como el iniciador macro y se realizo a una temperatura elevada usando 2-etilhexanoato de estano (II) como catalizador, como se muestra a continuacion (PEG Pn (peso molecular promedio en numero) “ 5.000 Da; PLA Pn « 16.000 Da; PEG-PLA Pn « 21.000 Da)
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El polfmero se purifico disolviendo el polfmero en diclorometano y precipitandolo en una mezcla de hexano y eter dietilico. El poKmero recuperado de este paso se debe secar en una estufa.
Ejemplo 4: Preparacion de PLA-PEG-Ligando
La smtesis, que se muestra en la figura 2, comienza con la conversion de FMOC, BOC lisina en FMOC, BOC, alil lisina haciendo reaccionar FMOC, BOC lisina con bromuro de alilo y carbonato de potasio en dimetilformamida, seguido de tratamiento con dietilamina en acetonitrilo. Despues se hace reaccionar bOc, alil lisina con trifosgeno y glutamato de dialilo, seguido de tratamiento con acido trifluoroacetico en cloruro de metileno para proporcionar el compuesto "GL2P".
La cadena lateral amina de la lisina en GL2P se pegila despues mediante adicion de hidroxil-PEG-acido carboxflico con EDC y NHS. La conjugacion de GL2P a PEG es a traves de una union amida. La estructura de este compuesto resultante es etiquetada "HO-PEG-GL2P". Despues de la pegilacion, se usa polimerizacion por apertura del anillo (ROP, del ingles ring opening polymerization) de d, 1 -lactido con el grupo hidroxilo de HO-PEG-GL2P como iniciador para unir un polfmero en bloque de polilactido a HO-PEG-GL2P a traves de un enlace ester para proporcionar "PLA- PEG-GL2P". Se usa 2-etilhexanoato de estano (II) como catalizador para la polimerizacion de apertura del anillo.
Finalmente, se retiran los grupos alilo de PLA-PEG-GL2P usando morfolina y tetraquis(trifenilfosfina)paladio (como catalizador) en diclorometano, para proporcionar el producto final PLA-PEG-Ligando. El compuesto final se purifica por precipitacion en eter dietflico/hexano 30/70 % (v/v).
Ejemplo 5: Preparacion de nanopartfculas -Nanoprecipitacion
Se pueden preparar nanopartmulas utilizando ligando GL1 o GL2. El inhibidor de PSMA a base de urea GL2, que tiene un grupo amino libre ubicado en una region no critica para la union de PSMA, se sintetiza a partir de materiales de partida disponibles en el mercado Boc-Phe(4NHFmoc)-OH y acido dialil glutamico de acuerdo con el
procedimiento que se muestra en el esquema 1. Las nanopartfculas se forman usando nanoprecipitacion. El conjugado poKmero-ligando se disuelve en un disolvente organico miscible con agua junto con un farmaco u otro agente para seguir la absorcion de la partfcula. Se puede incluir un polfmero no funcionalizado adicional para modular la densidad superficial del ligando. La solucion de polfmero se dispersa en una fase acuosa y las partfculas 5 resultantes se recogen por filtracion. Las partfculas se pueden secar o analizar inmediatamente con relacion a la absorcion celular in vitro o la actividad antitumor prostetico in vivo.
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Ejemplo 6: Preparacion de nanoparticulas - Procedimiento de emulsion
Se forma una fase organica compuesta por un 5 % de solidos (% en peso) que incluye un 2 % de copolfmero en 10 dibloque poli(lactido-co-glicolido)-poli(etilenglicol) (PLGA-PEG; 45 kDa-5 kDa), un 2% de poli(D, L-lactido) (PLA; 8,5 kDa) y un 1 % de docetaxel (DTXL) en los que el docetaxel tiene la estructura
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Los disolventes organicos son acetato de etilo (EA) y alcohol bendlico (BA) en los que BA constituye el 20 % (% en peso) de la fase organica. Se usa BA en parte para solubilizar el docetaxel. La fase organica se mezcla con una fase
15 acuosa en una relacion de aproximadamente 1:5 (fase oleosa:fase acuosa) en la que la fase acuosa esta compuesta por un 0,5 % de colato de sodio, un 2 % de BA y un 4 % de EA (% en peso) en agua. La emulsion primaria se forma combinando las dos fases por mezcla simple o mediante el uso de un homogeneizador de rotor y estator. La emulsion primaria se convierte despues en una emulsion fina mediante el uso de una sonda de ultrasonido o un homogeneizador de alta presion.
20 Despues la emulsion fina se enfna anadiendo un medio de enfriamiento enfriado (0-5 °C) de agua desionizada mientras se mezcla. La relacion medio de enfriamiento:emulsion es de aproximadamente 8,5:1. Despues se anade una solucion del 25 % (% en peso) de Tween 80 al medio de enfriamiento para obtener aproximadamente el 2 % de Tween 80 total. Despues las nanoparticulas se afslan por centrifugacion o ultrafiltracion/diafiltracion. Posteriormente, la suspension de nanoparticulas se puede congelar con un crioprotector, tal como sacarosa al 10 % en peso.
25 Se encontro que la adicion de PLA ademas del copolfmero PLGA-PEG aumentaba significativamente la carga de
farmaco. Es posible el uso de BA por sf mismo tambien sirva para aumentar la eficiencia de la encapsulacion, aumentando la eficiencia de la encapsulacion aun cuando el BA no fuera necesario para solubilizar el DTXL. Se encontro que la temperatura del medio de enfriamiento tema un papel fundamental en la carga de farmaco. El uso de un medio de enfriamiento fno (generalmente mantenido a 0-5 °C) aumento significativamente la carga de farmaco 5 en comparacion con la carga de farmaco cuando se uso un medio de enfriamiento a temperatura ambiente.
El DTXL tiene una solubilidad muy baja en agua y se encontro que el DTXL no encapsulado con frecuencia formaba cristales que eran diffciles de aislar de las nanopartfculas formadas. Se anadio solubilizante de farmaco (Tween 80) despues de que se hubiera enfriado la emulsion fina. El Tween 80 es capaz de solubilizar eficazmente los cristales de DTXL y permitir el aislamiento de nanopartfculas de DTXL no encapsulado evitando la formacion de cristales de 10 DTXL y/o solubilizando eficazmente todos los cristales de DTXL que se formaron cuando se templo la emulsion fina. Un conjunto convencional de condiciones de nanoemulsion fueron las siguientes:
Control:
Atributo
Valor
Copolfmero en bloque (tipo/cantidad)
45/5 PLGA (50/50 L:G)-PEG (5 kDa), 80 %
Homopolfmero (tipo/cantidad)
Ninguno
Farmaco (cantidad de DTXL)
10 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Acetato de etilo (EA)
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Ninguno
Fase acuosa
1 % de PVA con 6,5 % de EA
Temperatura del medio de enfriamiento
~5 °C
RESULTADOS
Atributo
Valor
Tamano de partfcula
191 nm
Carga de farmaco
0,8 %
Liberacion in vitro (24 horas a 37 °C)
No determinado (ND)
Otro
NA
La adicion de homopolfmero como aditivo produjo una mayor carga de farmaco si bien el tamano de partfcula es menor, como se muestra a continuacion:
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Copolfmero en bloque (tipo/cantidad)
45/5 PLGA (50/50 L:G)-PEG (5 kDa), 90 % 45/5 PLGA (50/50 L:G)-PEG (5 kDa), 45 %
Homopolfmero (tipo/cantidad)
Ninguno 8,5 kDa PLA, 45 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
10 % 10 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
EA EA, 80 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Ninguno Alcohol bendlico (BA), 20 %
Fase acuosa
1 % de PVA con 6,5 % de EA 1 % de PVA con 6,5 % de EA
Temperatura del medio de enfriamiento
~5 °C ~5 °C
RESULTADOS
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Tamano de partfcula
191 nm 134 nm
Carga de farmaco
0,8 % 2,4 %
Liberacion in vitro (24 horas a 37 °C
No determinado (ND) No determinado (ND)
Otro
NA NA
Temperatura de enfriamiento
En este caso el control utilizado para la comparacion es diferente del control anterior, ya que este ya se realizaron a temperatura de enfriamiento fna.
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Copolfmero en bloque (tipo/cantidad)
45/5 PLGA (50/50 L:G)-PEG 47,5 % 45/5 PLGA (50/50 L:G), 47,5 %
Homopolfmero (tipo/cantidad)
—30 kDa PLGA (50/50 L:G), 47,5 % —30 kDa PLGA (50/50 L:G), 47,5 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
5 % 5 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Diclorometano (DCM) Diclorometano (DCM)
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Ninguno Ninguno
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio 0,5 % de colato de sodio
Temperatura del medio de enfriamiento
—25 °C —5 °C
RESULTADOS
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Tamano de partfcula
210 nm 214 nm
Carga de farmaco
1,2 % 3,6 %
Liberacion in vitro (24 horas a 37 °C)
No determinado (ND) No determinado (ND)
Otro
NA NA
Parametros de ejemplo
Atributo
Valor
Copolfmero en bloque (tipo/cantidad)
45/5 PLA-PEG, 40 % (5 moles % que contienen PLA- PEG-GL2)
Homopolfmero (tipo/cantidad)
8,5 kDa PLA, 40 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
20 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
EA, 80 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
BA, 20 %
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio, 4 % de EA, 2 % de BA
Temperatura del medio de enfriamiento
—5 °C
RESULTADOS
Atributo
Valor
Tamano de partfcula
98,5 nm
Carga de farmaco
3,0 %
Liberacion in vitro (24 horas a 37 °C)
—60 %
5 Ejemplo 7: Procedimiento de emulsion
El procedimiento que se describe a continuacion usa un aumento en el contenido de solidos de la fase oleosa Un diagrama de flujo general del procedimiento se describe en la figura 3 y un diagrama de flujo del procedimiento se representa en la figura 4. Reduciendo el contenido de disolvente de la fase oleosa emulsionada, se pierde menos
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farmaco en el Ifquido de enfriamiento cuando las nanopartfculas se endurecen. Se elige un sistema de solidos y disolvente para evitar que sea excesivamente viscoso, que puede limitar la capacidad de emulsionarse en gotitas de ~100 nm. El uso de un copolfmero de peso molecular relativamente bajo (PLA-PEG de ~16 kDa-5 kDa) y homopolfmero de bajo peso molecular (PLA de ~7 kDa) permite que la formulacion mantenga una viscosidad suficientemente baja con un elevado contenido de solidos. Se elige un sistema de disolventes que tenga un poder de solvatacion adecuado para mantener el farmaco en solucion a concentraciones altas. El uso de un sistema cosolvente (normalmente acetato de etilo:alcohol bendlico 79:21) permite una solucion continua de hasta el 50 % de solidos con una mezcla polfmero:docetaxel 80:20.
Se forma una fase organica compuesta por una mezcla de docetaxel (DTXL) y polfmero (homopolfmero, copolfmero y copolfmero con ligando). La fase organica se mezcla con una fase acuosa a una relacion de aproximadamente 1:5 (fase oleosa:fase acuosa) en la que la fase acuosa esta compuesta por un tensioactivo y algo de disolvente disuelto. Para conseguir una carga de farmaco elevada, se usa aproximadamente el 30 % de solidos en la fase organica.
Se forma una fase organica compuesta por una mezcla de docetaxel (DTXL) y polfmero (homopolfmero, copolfmero y copolfmero con ligando). Las composiciones y disolventes organicos se enumeran en la tabla. La fase organica se mezcla con una fase acuosa a una relacion de aproximadamente 1:5 (fase oleosa:fase acuosa) en la que la fase acuosa esta compuesta por un tensioactivo y algo de disolvente disuelto. La emulsion primaria se forma combinando las dos fases por mezcla simple o mediante el uso de un homogeneizador de rotor y estator. La emulsion primaria se convierte despues en una emulsion fina mediante el uso de un homogeneizador de alta presion. Despues la emulsion fina se enfna anadiendo agua desionizada a una temperatura dada (enumerada en la tabla) mientras se mezcla. La relacion medio de enfriamiento:emulsion es de aproximadamente 8,5:1. Despues se anade una solucion del 25 % (% en peso) de Tween 80 al medio de enfriamiento para obtener aproximadamente el 2 % de Tween 80 total. Esto sirve para disolver el farmaco libre, no encapsulado y hace factible el procedimiento de aislamiento de la nanopartfcula. Despues las nanopartfculas se afslan por centrifugacion o ultrafiltracion/diafiltracion.
Control
A continuacion se proporciona un conjunto convencional de condiciones de nanoemulsion. Se forman partfculas que no contienen ligando (nanopartfculas no dirigidas).
Atributo
Valor
N.° de Lote
15-157D
Homopolfmero (tipo/cantidad)
6,5 kDa PLA
Copolfmero (tipo/cantidad)
16/5 PLA-PEG, 40 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
20 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Acetato de etilo (EA), 79 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Alcohol bendlico (BA), 21 %
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua
[solidos] en fase oleosa
5 % en peso
RESULTADOS
Atributo
Valor
Tamano de partfcula
114,7 nm
Carga de farmaco
3,97 %
10 % de solidos
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
N.° de Lote
15-157D 15-157C
Homopolfmero (tipo/cantidad)
6,5 kDa PLA 6,5 kDa PLA
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Copolfmero (tipo/cantidad)
16/5 PLA-PEG, 40 % 16/5 PLA-PEG, 40 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
20 % 20 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Acetato de etilo (EA), 79 % Acetato de etilo (EA), 79 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Alcohol bendlico (BA), 21 % Alcohol bendlico (BA), 21 %
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua 0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua
[solidos] en fase oleosa
5 % en peso 10 % en peso
RESULTADOS
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Tamano de partfcula
114,7 nm 11,5,1 nm
Carga de farmaco
3,97 % 13,36 %
20 % de solidos
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
N.° de Lote
15-157D 15-157A
Homopolfmero (tipo/cantidad)
6,5 kDa PLA 6,5 kDa PLA
Copolfmero (tipo/cantidad)
16/5 PLA-PEG, 40 % 16/5 PLA-PEG, 40 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
20 % 20 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Acetato de etilo (EA), 79 % Acetato de etilo (EA), 79 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Alcohol bendlico (BA), 21 % Alcohol bendlico (BA), 21 %
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua 0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua
[solidos] en fase oleosa
5 % en peso 20 % en peso
RESULTADOS
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Tamano de partfcula
114,7 nm 130,3 nm
Carga de farmaco
3,97 % 16,15 %
40 % de solidos
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
N.° de Lote
15-157D 15-171A
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Homopolfmero (tipo/cantidad)
6,5 kDa PLA 6,5 kDa PLA
CopoKmero (tipo/cantidad)
16/5 PLA-PEG, 40 % 16/5 PLA-PEG, 40 %
Farmaco (cantidad de DTXL)
20 % 20 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Acetato de etilo (EA), 79 % Acetato de etilo (EA), 79 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Alcohol bendlico (BA), 21 % Alcohol bendlico (BA), 21 %
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua 0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua
[solidos] en fase oleosa
5 % en peso 40 % en peso
RESULTADOS
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Tamano de partfcula
114,7 nm 130 nm
Carga de farmaco
3,97 % 14,07 %
30 % de solidos con mayor concentracion de tensioactivo para la reduccion del tamano de particula: lote de nanoparticula dirigida.
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
N.° de Lote
15-157D 35-03A
Homopolfmero (tipo/cantidad)
6,5 kDa PLA 8,2 kDa PLA
Copolfmero (tipo/cantidad)
16/5 PLA-PEG, 40 % 16/5 PLA-PEG, 40 %, con 1 % en peso como GL2-PEG-PLA
Farmaco (cantidad de DTXL)
20 % 20 %
Disolvente organico (tipo/cantidad)
Acetato de etilo (EA), 79 % Acetato de etilo (EA), 79 %
Cosolvente organico (tipo/cantidad)
Alcohol bendlico (BA), 21 % Alcohol bendlico (BA), 21 %
Fase acuosa
0,5 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua 1 % de colato de sodio, 2 % de BA, 4 % de EA en agua
[solidos] en fase oleosa
5 % en peso 30 % en peso
RESULTADOS
Atributo
Valor de control Valor de ejemplo
Tamano de partfcula
114,7 nm 114,1 nm
Carga de farmaco
3,97 % 11,85 %
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 8: Preparacion de nanoparticulas - Procedimiento de emulsion 2
Se forma una fase organica compuesta por una mezcla de docetaxel (DTXL) y poUmero (homopoKmero, copoKmero y copoKmero con ligando). La fase organica se mezcla con una fase acuosa a una relacion de aproximadamente 1:5 (fase oleosa:fase acuosa) en la que la fase acuosa esta compuesta por un tensioactivo y algo de disolvente disuelto. Para lograr una carga de farmaco elevada, se usa aproximadamente el 30 % de solidos en la fase organica.
La emulsion gruesa primaria se forma combinando las dos fases por mezcla simple o mediante el uso de un homogeneizador de rotor y estator. El rotor/estator produjo una solucion lechosa homogenea, mientras que la barra de agitacion produjo una emulsion gruesa visiblemente mas grande. Se observo que el procedimiento de la barra de agitacion dio como resultado gotitas de fase oleosa significativas que se adhirieren al lateral del vaso de alimentacion, lo que sugiere que si bien el tamano de la emulsion gruesa no es un parametro cntico del procedimiento para la calidad, se debe hacer suficientemente fina para evitar perdidas de rendimiento o separacion de fase. Por tanto, el rotor y estator se usan como el procedimiento convencional de formacion de la emulsion gruesa, aunque puede ser adecuado un mezclador de alta velocidad a una escala mayor.
La emulsion primaria se convierte despues en una emulsion fina mediante el uso de un homogeneizador de alta presion. El tamano de la emulsion gruesa no afecta significativamente al tamano de partfcula despues de los pases sucesivos (103) atraves del homogeneizador. M-110-EH (Figura 5).
Se encontro que la presion de alimentacion del homogeneizador tema un impacto significativo sobre el tamano de partfcula resultante. En los homogeneizadores tanto neumaticos como electricos M-110EH, se encontro que reducir la presion de alimentacion tambien reducfa el tamano de partfcula (Figura 6). Por tanto, la presion operativa convencional utilizada para el M-110EH es 4000-5000 psi (27,57-34,46 MPa) por camara de interaccion, que es la presion de procesamiento minima de la unidad. El M-110EH tambien tiene la opcion de una o dos camaras de interaccion. Viene por defecto con una camara Y restrictiva, en serie con una camara Z menos restrictiva de 200 pm. Se encontro que el tamano de partfcula se redujo realmente cuando se retiro la camara Y y se la reemplazo por una camara de blanco. Ademas, retirar la camara Y aumento significativamente la velocidad de flujo de emulsion durante el procesamiento.
Despues de 2-3 pases el tamano de partfcula no se redujo significativamente y los pases sucesivos incluso pueden provocar un aumento del tamano de partfcula. Los resultados se resumen en la figura 7, en la que la fase organica placebo consistfa en un 25,5% de polfmero combinado de 50:50 16,5/5 PLA/PEG:8,2 PLA. La fase organica se emulsiono 5:1 O:W con fase acuosa convencional y se realizaron multiples pases discretos, enfriando una pequena porcion de la emulsion despues de cada pase. La escala indicada representa los solidos totales de la formulacion.
El efecto de la escala sobre el tamano de partfcula mostro una sorprendente dependencia de la escala. La tendencia muestra que en el intervalo de tamano del lote de 2-10 g, los lotes mas grandes producen partfculas mas pequenas. Se demostro que esta dependencia de la escala se elimina al considerar lotes a escala superior a 10 g. La cantidad de solidos utilizados en la fase oleosa fue de aproximadamente el 30 %. Las figuras 8 y 9 representan los efectos de la concentracion de solidos sobre el tamano de partfcula y la carga de farmaco; con la excepcion de las series 15175, todos los lotes son placebo. Para los lotes de placebo el valor de % de solidos representa el % de solidos cuando el farmaco esta presente en el 20 % p/p convencional.
La tabla A resume los parametros del procedimiento de emulsion.
TABLA A
Parametro
Valor Observacion
Formacion de la emulsion gruesa
Homogeneizador de rotor y estator El tamano de la emulsion gruesa no afecta el tamano final de partfcula, pero la emulsion gruesa grande puede provocar una mayor retencion de la fase oleosa en el recipiente de alimentacion
Presion de alimentacion del homogeneizador
4000-5000 psi por camara Menores presiones reducen el tamano de partfcula
Camara(s) de interaccion
Camara Z 2 x 200 pm La camara Z de 200 pm produce el menor tamano de partfcula y permite el rendimiento mas alto del homogeneizador
Numero de pases por el homogeneizador
2-3 pases Los estudios demostraron que el tamano de partfcula no se reduce significativamente despues de 2 pases discretos y el tamano puede incluso aumentar con los pases sucesivos
5
10
15
20
25
Parametro
Valor Observacion
Fase acuosa [colato de sodio]
0,1 % [colato de sodio] puede alterar eficazmente el tamano de partfcula; el valor se optimiza para un procedimiento y una formulacion determinados
Relacion W:O
5:1 La relacion mas baja sin un aumento significativo del tamano de partfcula es ~5:1
[Solidos] en fase oleosa
30 % Mayor eficiencia del procedimiento, mayor encapsulacion del farmaco, viscosidad que se puede trabajar
Despues la emulsion fina se enfna anadiendo agua desionizada a una temperatura dada mientras se mezcla. En la operacion de la unidad de enfriamiento, la emulsion se anade a un medio de enfriamiento acuoso fno en agitacion. Esto sirve para extraer una porcion significativa de los disolventes de la fase oleosa, endureciendo eficazmente las nanopartfculas para la filtracion posterior. Enfriar el medio de enfriamiento mejoro significativamente la encapsulacion del farmaco. La relacion medio de enfriamiento:emulsion es de aproximadamente 5:1.
Se anade una solucion del 35 % (% en peso) de Tween 80 al medio de enfriamiento para lograr aproximadamente el 2 % de Tween 80 total. Una vez que se enfna la emulsion se anade una solucion de Tween 80 que actua como solubilizante del farmaco, permitiendo la eliminacion eficaz del farmaco no encapsulado durante la filtracion. La tabla B indica cada uno de los parametros del procedimiento de enfriamiento.
Tabla B Resumen de los parametros del procedimiento de enfriamiento
Parametro
Valor Observacion
Temperatura inicial del enfriamiento
< 5 °C La baja temperatura produce mayor encapsulacion del farmaco
Solucion de [Tween 80]
35 % Mayor concentracion que se puede preparar y dispersar facilmente en el medio de enfriamiento
Relacion Tween 80:farmaco
25:1 Cantidad minima de Tween 80 necesaria para eliminar eficazmente el farmaco no encapsulado
Relacion Q:E
5:1 Minima relacion Q:E que mantiene una elevada encapsulacion del farmaco
Mantenimiento del enfriamiento/temperatura de procesamiento
< 5 °C (con relacion Q:E 5:1, relacion Tween- 80:farmaco 25:1) Temperatura que evita una filtracion significativa del farmaco durante el tiempo de retencion del enfriamiento y el paso de concentracion inicial
La temperatura debe mantenerse lo suficientemente fna con una suspension suficientemente diluida (concentracion suficientemente baja de disolventes) para mantenerse debajo de Tg de las partfculas. Si la relacion Q:E no es suficientemente alta, entonces la mayor concentracion de disolvente plastifica las partfculas y permite la filtracion del farmaco. A la inversa, temperaturas menores permiten una elevada encapsulacion del farmaco a bajas relaciones Q:E (~3:1), haciendo posible que el procedimiento tenga lugar mas eficientemente.
Despues las nanopartfculas se afslan a traves de un procedimiento de filtracion de flujo tangencial para concentrar la suspension de nanopartfculas y el intercambio de los disolventes, el farmaco libre y el solubilizante de farmacos de la solucion de enfriamiento en agua. Se usa una membrana de celulosa regenerada con un peso molecular de corte (MWCO, del ingles molecular weight cutoff) de 300.
Se realiza una diafiltracion (DF) de volumen constante para retirar los disolventes del medio de enfriamiento, el farmaco libre y el Tween-80. Para realizar una DF de volumen constante, se anade tampon al recipiente del retenido a la misma velocidad que se retira el filtrado. Los parametros del procedimiento para las operaciones TFF se resumen en la tabla C. La velocidad de flujo cruzado se refiere a la velocidad de flujo de la solucion a traves de los canales de alimentacion y a traves de la membrana. Este flujo proporciona la fuerza para barrer las moleculas que pueden ensuciar la membrana y restringir el flujo de filtrado. La presion transmembrana es la fuerza que conduce las moleculas permeables a traves de la membrana.
Tabla C: parametros de TFF
Parametro
Valor optimizado Efecto
Material de membrana
Celulosa regenerada - Membrana de malla gruesa No hay diferencia en el comportamiento entre RC y PES, pero la compatibilidad del disolvente es superior para RC.
Peso molecular de corte
300 kDa No hay diferencia en las caractensticas NP (es decir Tween residual) se observa un aumento en la velocidad de flujo con membrana de.500 kDa pero no se dispone de.500 kDa para RC
Velocidad de flujo cruzado
11 l/min/m2 Mayor velocidad de flujo cruzado condujo a mayor flujo
Presion transmembrana
20 psid (0,14 MPa) Las membranas de canal abierto tienen velocidades de flujo maximas entre 10 psid (0,07 MPa) y 30 psid (0,21 MPa). Las membranas de canal grueso tienen velocidades de flujo con TMP min (~20 psid (0,14 MPa)).
Concentracion de la suspension de nanopartfculas por diafiltracion
30 mg/ml La diafiltracion es mas eficiente a [NP] ~50 mg/ml con membranas TFF de canal abierto basandose en velocidades de flujo y rendimiento. Con membranas de canal grueso la velocidad de flujo se optimiza a ~30 mg/ml en el tampon de partida.
Numero de diavolumenes
>15 (basandose en el aumento del flujo) Se necesitan aproximadamente 15 diavolumenes para eliminar eficazmente el Tween 80. El punto final de la diafiltracion se determina mediante control en procedimiento (meseta del aumento de flujo).
Area de la membrana
~1 m2/kg Las membranas se dimensionaron basandose en las velocidades de flujo anticipadas y los volumenes requeridos.
La suspension de nanopartfculas filtrada se cicla termicamente a una temperatura elevada durante el tratamiento. Una porcion pequena (normalmente el 5-10%) del farmaco encapsulado se libera desde las nanopartfculas muy rapidamente despues de su exposicion a 25 °C. Debido a este fenomeno, los lotes que se mantienen fnos durante 5 todo el tratamiento son susceptibles de liberar farmaco o cristales de farmaco que se forman durante la administracion o cualquier porcion del almacenamiento no congelado. Exponiendo la suspension de nanopartfculas a temperatura elevada durante el tratamiento, se puede eliminar este farmaco "encapsulado libremente" y mejorar la estabilidad del producto a expensas de una gota mas pequena al cargar el farmaco. La tabla D resume dos ejemplos de procesamiento a 25 °C. Otros experimentos demostraron que el producto es suficientemente estable despues de 10 ~2-4 diavolumenes para exponerlo a 25 °C sin perder la mayor parte del farmaco encapsulado. Se usan 5
diavolumenes como la cantidad para el procesamiento en fno antes del tratamiento a 25 °C.
Tabla D:
Lotes A Lotes B
Carga de farmaco
Tratamiento en fno 11,3 % 9,7 %
Tratamiento a 25 °C1
8,7-9,1 % 9,0-9,9%
Estabilidad2
Tratamiento final en fno <1 dfa <1 dfa
Tratamiento a 25 °C1
5-7 dfas 2-7 dfas
Estallido in vitro3
Tratamiento en fno ~10 % No se realizo
Tratamiento a 25 °C1
~2 %
1Los sublotes del tratamiento a 25 °C se expusieron a 25 °C despues de al menos 5 diavolumenes durante diversos periodos de tiempo. Se informan los intervalos porque hubo multiples sublotes con exposicion a 25 °C. 2Los datos de estabilidad representan el tiempo que el producto final pudo ser mantenido a 25 °C a concentraciones de nanopartfculas de 10-50 mg/ml antes de la formacion de cristales en la suspension (visible por microscopfa) 3El estallido in vitro representa el farmaco liberado en el primer tiempo (casi inmediatamente)
Despues del procedimiento de filtracion la suspension de nanopartfculas se hace pasar a traves de un filtro de grado esterilizante (0,2 pm absoluto). Se usan prefiltros para proteger el filtro de grado esterilizante para usar una relacion area de filtracion/tiempo razonable para el procedimiento. Los valores se resumen en la tabla E.
Tabla E:
Parametro
Valor O Efecto
Concentracion de la suspension de nanopartfculas
50 mg/ml A mayor [NP], las perdidas de rendimiento son mayores pero la capacidad de filtrar a 50 mg/ml obvia la necesidad de concentrar asepticamente despues de la filtracion
Velocidad de flujo de filtracion
~1,3 l/min/m2 La capacidad de filtracion disminuye a medida que aumenta la velocidad de flujo
5 El tren de filtracion es Ertel Alsop Micromedia XL filtro de profundidad M953P membrana (0,2 pm Nominal); Pall SUPRAcap con Seitz EKSP medio de filtracion en profundidad (0,1 - 0,3 pm Nominal); Pall Life Sciences Supor EKV 0,65/ 0,2 micrometros filtro PES de grado esterilizante.
Se pueden usar 0,2 m2 de superficie de filtracion por kg de nanopartfculas para los filtros de profundidad y 1,3 m2 de superficie de filtracion por kg de nanopartfculas para los filtros de grado esterilizante.
10 Ejemplo9
Se pueden preparar nanopartfculas espedficas para la diana que incluyan un conjugado de polfmero biocompatible con, por ejemplo, PEG, los quimioterapicos descritos en el presente documento y opcionalmente conjugado con GL1 o GL2. Las nanopartfculas de ejemplo se muestran en la tabla 1 a continuacion:
Tabla 1 Nanoparticulas que tienen un agente terapeutico enumerado y un conjugado polimerico que comprende: polimero biocompatible-polimero-(resto de direccionamiento)
Agente terapeutico
Polimero biocompatible Polimero Resto de direccionamiento (opcional)
vincristina
PLGA PEG GL1
vincristina
PLA PEG GL1
vincristina
PGA PEG GL1
vincristina
PLGA PEG GL2
vincristina
PLA PEG GL2
vincristina
PGA PEG GL2
vincristina
PLGA PEG-DSPE GL1
vincristina
PLA PEG-DSPE GL1
vincristina
PGA PEG-DSPE GL1
vincristina
PLGA PEG-DSPE GL2
vincristina
PLA PEG-DSPE GL2
vincristina
PGA PEG-DSPE GL2
docetaxel
PLGA PEG GL1
docetaxel
PLA PEG GL1
docetaxel
PGA PEG GL1
docetaxel
PLGA PEG GL2
docetaxel
PLA PEG GL2
Tabla 1 Nanopartfculas que tienen un agente terapeutico enumerado y un conjugado polimerico que comprende: polimero biocompatible-polimero-(resto de direccionamiento)
Agente terapeutico
Polimero biocompatible Polimero Resto de direccionamiento (opcional)
Docetaxel
PGA PEG GL2
Docetaxel
PLGA PEG-DSPE GL1
docetaxel
PLA PEG-DSPE GL1
docetaxel
PGA PEG-DSPE GL1
docetaxel
PLGA PEG-DSPE GL2
docetaxel
PLA PEG-DSPE GL2
docetaxel
PGA PEG-DSPE GL2
sirolimus
PLGA PEG GL1
sirolimus
PLA PEG GL1
sirolimus
PGA PEG GL1
sirolimus
PLGA PEG GL2
sirolimus
PLA PEG GL2
sirolimus
PGA PEG GL2
sirolimus
PLGA PEG-DSPE GL1
sirolimus
PLA PEG-DSPE GL1
sirolimus
PGA PEG-DSPE GL1
sirolimus
PLGA PEG-DSPE GL2
sirolimus
PLA PEG-DSPE GL2
sirolimus
PGA PEG-DSPE GL2
gemcitabina
PLGA PEG GL1
gemcitabina
PLA PEG GL1
gemcitabina
PGA PEG GL1
gemcitabina
PLGA PEG GL2
gemcitabina
PLA PEG GL2
gemcitabina
PGA PEG GL2
gemcitabina
PLGA PEG-DSPE GL1
gemcitabina
PLA PEG-DSPE GL1
gemcitabina
PGA PEG-DSPE GL1
gemcitabina
PLGA PEG-DSPE GL2
gemcitabina
PLA PEG-DSPE GL2
gemcitabina
PGA PEG-DSPE GL2
Tabla 1 Nanopartfculas que tienen un agente terapeutico enumerado y un conjugado polimerico que comprende: polimero biocompatible-polimero-(resto de direccionamiento)
Agente terapeutico
Polimero biocompatible Polimero Resto de direccionamiento (opcional)
5-fluorouracilo
PLGA PEG GL1
5-fluorouracilo
PLA PEG GL1
5-fluorouracilo
PGA PEG GL1
5-fluorouracilo
PLGA PEG GL2
5-fluorouracilo
PLA PEG GL2
5-fluorouracilo
PGA PEG GL2
5-fluorouracilo
PLGA PEG-DSPE GL1
5-fluorouracilo
PLA PEG-DSPE GL1
5-fluorouracilo
PGA PEG-DSPE GL1
5-fluorouracilo
PLGA PEG-DSPE GL2
5-fluorouracilo
PLA PEG-DSPE GL2
5-fluorouracilo
PGA PEG-DSPE GL2
paclitaxel
PLGA PEG GL1
paclitaxel
PLA PEG GL1
paclitaxel
PGA PEG GL1
paclitaxel
PLGA PEG GL2
paclitaxel
PLA PEG GL2
paclitaxel
PGA PEG GL2
paclitaxel
PLGA PEG-DSPE GL1
paclitaxel
PLA PEG-DSPE GL1
paclitaxel
PGA PEG-DSPE GL1
paclitaxel
PLGA PEG-DSPE GL2
paclitaxel
PLA PEG-DSPE GL2
paclitaxel
PGA PEG-DSPE GL2
daunorrubicina
PLGA PEG GL1
daunorrubicina
PLA PEG GL1
daunorrubicina
PGA PEG GL1
daunorrubicina
PLGA PEG GL2
daunorrubicina
PLA PEG GL2
daunorrubicina
PGA PEG GL2
daunorrubicina
PLGA PEG-DSPE GL1
Tabla 1 Nanopartfculas que tienen un agente terapeutico enumerado y un conjugado polimerico que comprende: polimero biocompatible-polimero-(resto de direccionamiento)
Agente terapeutico
Polimero biocompatible Polimero Resto de direccionamiento (opcional)
Daunorrubicina
PLA PEG-DSPE GL1
daunorrubicina
PGA PEG-DSPE GL1
daunorrubicina
PLGA PEG-DSPE GL2
daunorrubicina
PLA PEG-DSPE GL2
daunorrubicina
PGA PEG-DSPE GL2
Ejemplo 10
Las nanopartfculas que se muestran en la tabla 2 se preparan utilizando el procedimiento del ejemplo 8. Las nanopartfculas que comprenden macromoleculas de PLGA-PEG y macromoleculas de PLGA-PEG-ligando de molecula pequena (SML, del ingles small molecule ligand) se prepararon como se muestra en los estudios 1 y 2, a 5 continuacion. En los estudios 3 y 4, se prepararon nanopartfculas que comprendfan macromoleculas de PLA-PEG, macromoleculas de PLGA-PEG-SML y macromoleculas de PLA (DB = copolfmero en dibloque).
La relacion entre macromoleculas funcionalizadas con restos de direccionamiento de molecula pequena y macromoleculas no funcionalizadas se puede ajustary usando el estudio 1, se pueden preparar nanopartfculas con composiciones polimericas que son aproximadamente el 0,94 % en moles, el 4,63 % en moles y el 9,01 % en moles 10 de macromoleculas funcionalizadas (vease "% en moles de DB-GL2 del Polm total"). Ademas, usando esos procedimientos, se pueden preparar nanopartfculas que comprenden aproximadamente el 0,015, el 0,073 y el 0,143 % en peso de ligando de molecula con respecto al polfmero total (vease "% en peso de GL2 polim. wrt").
Tambien se pueden preparar nanopartfculas con polfmeros funcionalizados que constituyen aproximadamente el 0,1 - 30, por ejemplo, el 0,1 - 20, por ejemplo, el 0,1-10 por ciento en moles de toda la composicion polimerica de la 15 nanopartfcula, asf como nanopartfculas que tienen un porcentaje en peso de ligando de bajo peso molecular respecto al polfmero total entre 0,001 y 5, por ejemplo, entre 0,001 y 2, por ejemplo, entre 0,001 y 1.
Tabla 2
% en peso de solidos % en peso de polimero % en peso de DB-GL2 en PLA-PEG % en moles de DB-GL2 del Polim. total
Estudio 1
0,362 0,381052632 NA 0,947217483
1,81 1,905263158 NA 4,630814102
3,62 3,810526316 NA 9,011251618
Estudio 2
0,181 0,190526316 NA 0,474958408
0,362 0,381052632 NA 0,947217483
0,543 0,571578947 NA 1,416800171
1,81 1,905263158 NA 4,630814102
Estudio 3
0,362 0,4525 NA 0,178974269
1,81 2,2625 NA 0,891043972
Tabla 2
% en peso de solidos % en peso de polimero % en peso de DB-GL2 en PLA-PEG % en moles de DB-GL2 de Polim. total
Estudio 4
0,080241 0,100300903 0,200601805 0,079390136
Calc. para 45K-5K PLA- PEG
0,161616 0,202020202 0,404040404 0,159825753
0,842105 1,052631579 2,105263158 0,829427309
1,702128 2,127659574 4,255319149 1,668024361
Estudio 4 Calc. para 16K-5K PLA-PEG
0,190522 0,238151941 0,476303882 0,16998719
0,381134 0,476417342 0,952834683 0,340027827
1,909308 2,386634845 4,77326969 1,702280075
3,827751 4,784688995 9,56937799 3,409927685
SIN PLA
0,323232 0,404040404 0,404040404 0,159825753
Tabla 2 (continuacion)
% en moles de GL2 % en peso de GL2 polim. wrt Contenido de GL2 ppm
Estudio 1
0,947217483 0,015108 151,0812
4,630834102 0,07386] 738,6148
9,01125J618 0,143729 1437,295
Estudio 2
0,474958408 0,007576 75,75587
0,947217483 0,015108 J51,08J2
1,416800173 0,022598 225,9796
4,630814102 0,073861 738,6148
Estudio 3
0,178974269 0,002855 28,5464
0,891043972 0,014212 142,1215
Estudio 4 Calc. para 45K-SK PIA-PEG
0 079390136 0,001266 12,66273
0,159825753 0,002549 25,4922 ]
0,829427309 0,013229 132,2937
Tabla 2 (continuacion)
% en moles de GL2 % en peso de GL2 polim. wrt Contenido de GL2 ppm
1,668024361 0,026605 266 0499
Estudio 4 Calc. para I6K-5K PIA-PEG
0,169987)9 0002711 27,11296
0,340027827 0-005423 54,23444
1,702280075 0,027151 271,5137
3,409927685 0-054388 543,8835
SIN PLA
0,159825753 0,002549 25,49221
Ejemplo 11
Se forman diversas formulaciones de nanopartfculas usando el procedimiento del ejemplo 8 como se describe y compara en la tabla F:
5 Tabla F:
Formulacion
Tipo de polimero % de solidos Carga y tamano de partfcula
Relacion poUmero-PEG:PLA (80:0; 60:20;40:40 (al inicio), 20:60)
Relacion 16-5 PLA- PEG:PLA 5 %
Relacion 45-5 PLGA-PEG:PLA
5 %
Peso molecular de PLA = 1,9, 4, 6,5 (al inicio), 8,5 kDa
16-5 PLA-PEG:PLA (40:40) 5 % 1,9 y 4 kDa tuvieron menor carga = 2,5 %
15-5 Vs 16-5 PLA-PEG: PLA (40:40)
15-5 PLA-PEG:PLA (40:40) 5 % Tanto 15-5 PLA-PEG como 16-5 PLA-PEG son iguales en carga y tamano de partfcula
% de solidos totales 5 % Vs. 15 %
16-5 PLA-PEG:PLA (40:40) 5 % o 15 % Cuando se usa 15 % de solidos; 3X mayor eficiencia de encapsulacion
16-5 PLGA-PEG Vs. PLA-PEG (al inicio) con PLA (40:40)
16-5 PLGA- PEG:PLA (40:40) 15 % Tanto 16-5 PLGA-PEG como 16-5 PLA-PEG son equivalentes en porcentaje de carga y tamano de partfcula
Polfmero alternativo: PLGA-PEG
28-5 PLGA- PEG:PLA (40:40) 15 % 28-5 PLGA-PEG = mayor tamano de partfcula en comparacion con los otros
45-5 PLGA- PEG:PLA (40:40)
15 % 45-5 PLGA-PEG = mayor tamano de partfcula
Relacion entre alcohol bendlico y acetato de etilo: 11:89, 21:79 (al inicio), 32:68 BA:EA
16-5 PLA-PEG:PLA (40:40) 15 % Relacion = 21:79 (10,8 % de carga); 32:68 y 11:89 resulto en 9,4 y 8,8 % de carga, respectivamente.
Disolvente comparado a alcohol bendlico: heptanol o hexanol
16-5 PLA-PEG:PLA (40:40) 15 % Disolvente = alcohol bendlico (10,8 % de carga); heptanol y hexanol ambos resultaron en ~2 % de carga
Carga buscada 10, 20 (al inicio), 30 %
16-5 PLA-PEG:PLA (40:40) 15 % La carga aumento con la carga buscada: % de carga = 5,8 %, 9 %, 13,3 %, respectivamente
Se puede lograr un tamano de partfcula optimo sin usar homopoKmero PLA y sin sacrificar significativamente la carga de farmaco, como se muestra en la figura 10. Los lotes con homopolfmero PLA liberan el farmaco significativamente mas rapido que los lotes fabricados usando copoKmero solo (Figura 11). Los diversos tipos de polfmero y pesos moleculares no anadieron valor adicional en la optimizacion de la carga de farmaco y el tamano de 10 partfcula. Al contrario, al 15% de solidos totales con "polfmero alternativo" los tamanos de partfcula fueron normalmente mas grandes que un tamano buscado de 100-120 nm. La incorporacion de alcohol cetflico al 5 % en peso aumento en general la velocidad de liberacion in vitro (Figura 12).
Ejemplo 12 Crioprotector
La congelacion de una suspension de una nanoemulsion de nanopartfculas en agua desionizada sola da como resultado la agregacion de partfculas. Se cree que esto se debe a la cristalizacion y enredo de las cadenas de PEG en la superficie de las nanopartfculas (Jaeghere y col.; Pharmaceutical Research 16(6), pags. 859-852). Los 5 excipientes a base de azucar (sacarosa, trehalosa o manitol) pueden actuar como crioprotectores de las nanopartfculas en condiciones de congelacion/descongelacion, a una concentracion tan baja como del 1 % en peso para suspensiones de nanopartfculas diluidas (~10 mg/ml). Una formulacion incluye sacarosa al 10 % en peso, que contiene sacarosa en exceso a la necesaria y es la misma osmolalidad que la solucion salina fisiologica
La tabla G muestra que el copolfmero 16/5 PLA-PEG es menos susceptible a la agregacion por congelacion- 10 descongelacion.
Tabla G
Descripcion
Mediana original de PSD/PD Mediana de PS post cong./descong (nm) Poli-dispersidad post C/D Indice basal post C/D
1:1 45/5 y PLA(al inicio)
143,4, 0,124 358,9 0,358 0,0/23,16 %
16/5 PLA-PEG y PLA(1:1)
186,7, 0,080 189,5 0,126 9,7/91,57 %
2:1:1 16/5:PLA:cetilo
174,1, 0,084 232,7 0,146 0,0/61,19 %
2:1:1 45/5:PLA:cetilo
111,0, 0,182 0 0 0,0/1,55%
16/5 PLA-PEG solo
218,8, 0,098 226,9 0,03 7,3/60,56 %
16/5 PLA-PEG y PLA(3:1)
222,2, 0,126 230,7 0,065 4,1/35,36 %
45/5 PLGA-PEG y PLA (3:1)
162,7, 0,099 178,6 0,091 7,7/95,41 %
2:1:1 45/5 PLA- PEG:PLA:cetilo
115,9, 0,154 734,6 0,392 0,0/13,27 %
Ejemplo 13 Retirada del paladio
Basandose en un nivel de dosis (pgMa) en ensayos clmicos humanos, un nivel maximo aceptable de paladio en una composicion PLA-PEG-GL2 es aproximadamente 10 ppm. Se cargaron soluciones de polfmero (PLA-PEG-GL2) (20 15 o 35 mg/ml) en diclorometano (DCM) en columnas de 5 g de resina (presolvatadas con 10 ml de DCM) y posteriormente se eluyeron usando 30 ml de DCM por gravedad. El polfmero se recupero mediante retirada del disolvente usando evaporacion rotatoria seguida de secado al vado a temperatura ambiente. La recuperacion del polfmero se determino gravimetricamente y el contenido de paladio residual se determino por espectroscopfa con plasma acoplado inductivamente (ICP, del ingles Inductively Coupled Plasma) en Galbraith Laboratories Inc.
20 Tabla H
Resina
Solucion de PLA-PEG-GL2 y rendimiento Contenido de paladio (ppm)
utilizada
Disolvente mg/ml mg/5 g de resina % en peso de recuperacion Prueba 1 Prueba 2 Promedio
Guanidina
DCM 20 220 23 337 347 342
Tiol
DCM 20 220 62 39 30 34,5
TMT
DCM 20 220 92 11 7 9
Urea
DCM 20 220 60 4470 NA 4470
Tiourea
DCM 20 220 45 40 36 38
Control
DCM 20 NA NA 4060 3980 4020
TMT
DCM 35 335 91 9 7 8
Urea
DCM 35 335 60 5360 4920 5140
Resina
Solucion de PLA-PEG-GL2 y rendimiento Contenido de paladio (ppm)
utilizada
Disolvente mg/ml mg/5 g de resina % en peso de recuperacion Prueba 1 Prueba 2 Promedio
Control
DCM NA NA NA 4240 4300 4270
TMT
DCM 35 1050 92 3,8 2,7 3,25
Control
DCM NA NA NA 3780 3880 3830
Como se ve en la tabla H, las funcionalidades tiol, TMT, urea y tiourea llevaron los niveles de paladio por debajo de 50 ppm, a la carga de polfmero por unidad de peso de resina evaluada. Sin embargo, solo la resina de TMT (trimecaptotriazina) produjo una buena recuperacion del polfmero (>90 %). Ademas, la resina de TMT tambien 5 produjo contenidos de paladio por debajo del umbral de aceptacion de 10 ppm. Parecio haber alguna variabilidad de los resultados dependiendo de las condiciones experimentales utilizadas. En particular, la retirada del paladio fue mas eficaz cuando la columna de 5 g de resina de TMT se cargo con 1050 mg de polfmero. Esto puede deberse al mayor tiempo de residencia de la especie polimerica y el catalizador de paladio en esas condiciones experimentales.
Ejemplo 14 Formulacion
10 Una formulacion que incluya nanopartfculas de PLA-PEG-ligando, PLA, PLA-PEG y docetaxel, en una composicion de sacarosa/agua esta formada por:
Componente
Concentracion nominal (mg/ml)
Docetaxel
5
PLA-PEG-Ligando
1,1
PLA-PEG
21,4
PLA
22,5
Sacarosa
100
Agua
c.s.
Ejemplo 15 - Liberacion in vitro
Se usa un procedimiento de liberacion in vitro para determinar la fase de aceleracion inicial de la liberacion desde esas nanopartfculas, tanto a temperatura ambiente como a 37 °C. Para mantener las condiciones de libre saturacion 15 y evitar que las nanopartfculas ingresen en las muestras de liberacion, se diseno un sistema de dialisis. Despues de obtener una ultracentnfuga capaz de sedimentar partfculas de 100 nm, se retiraron las membranas de dialisis y se uso centrifugacion para separar el farmaco liberado del farmaco encapsulado.
El sistema de dialisis es como se indica a continuacion: se colocan por pipeteo 3 ml de suspension de nanopartfculas de docetaxel (aprox 250 pg/ml de nanopartfculas de farmaco/PLGA/PLA, correspondientes a una 20 concentracion de solido de 2,5 mg/ml) en agua DI, en un tubo interior de un dializador de un MWCO de 300 kDa. La nanopartfcula se suspende en este medio. El dializador se coloca en frascos de vidrio que contienen 130 ml de medio de liberacion (hidroxil beta ciclodextrina al 2,5 % en PBS), que es continuamente agitado a 150 rpm usando un agitador para evitar la formacion de una capa de agua sin agitar en la superficie de contacto de membrana/solucion externa. A tiempos predeterminados, se extrajeron alfcuotas de las muestras (1 ml) de la 25 solucion externa (dializado) y se analizaron para determinar la concentracion de docetaxel por HPLC.
El sistema centnfugo se opera usando condiciones similares, a menores volumenes de suspension, sin bolsas de dialisis. Las muestras se centrifugan a 60.000 g durante 30 minutos y el sobrenadante se somete a ensayo para determinar el contenido de farmaco respecto al farmaco liberado medido.
Ejemplo 16 Liberacion in vitro de nanoparticulas de docetaxel
30 Una suspension de nanoparticulas de docetaxel preparada como en el ejemplo 8 (docetaxel al 10% en peso y polfmero al 90 % en peso (PLA-PEG-GL2 al 1,25 % en peso y PLA-PEG al 98,75 % en peso, Pn de PLA = 16 Da; Pn de PEG = 5 Da) se coloco en un modulo de dialisis y se incubo en un deposito de pBs a 37 °C con agitacion. Se recogieron muestras del dializado y se analizaron para determinar docetaxel utilizando HPLC de fase inversa. A efectos comparativos, se sometio docetaxel convencional al mismo procedimiento. La figura 13 describe el perfil de
5
10
15
20
25
30
35
40
liberacion in vitro de las nanopardculas en comparacion con el docetaxel convencional. La liberacion del docetaxel encapsulado de la matriz polimerica fue esencialmente lineal en las primeras 24 horas siendo el resto liberado gradualmente de las pardculas en un penodo de aproximadamente 96 horas.
Ejemplo 17 Nanoparticulas de sirolimus
Se prepararon lotes de nanopardculas usando el procedimiento general del ejemplo 8, con polfmero-PEG o polfmero-PEG al 80 % (p/p) con homopolfmero de pLa al 40 % (p/p) cada uno, con un lote de porcentaje total de solidos del 5 %, el 15 % y el 30 %. Los disolventes utilizados fueron: alcohol bendlico al 21 % y acetato de etilo al 79 % (p/p). Para cada lote de 2 g detamano, se usaron 400 mg de farmaco y 1,6 g de 16-5 polfmero-PEG o 0,8 g de 16-5 polfmero-PEG + 0,8 g de PLA (homopolfmero) de 10 kDa. Se uso el polfmero en dibloque 16-5 PLA-PEG o PLGA-PEG (50:50 L:G) y cuando se uso, el homopolfmero: PLA con un Pn = 6,5 kDa, Pm (peso molecular promedio en masa) =10 kDa y Pm/Pn =1,55.
La fase organica (farmaco y polfmero) se preparo en lotes de 2 g: anadir farmaco y polfmero o polfmeros a un vial de centelleo de 20 ml. La masa de disolventes necesaria a la concentracion en % de solidos, se muestra a continuacion:
i. 5 % de solidos: 7,98 g de alcohol bendlico + 30,02 g de acetato de etilo
ii. 15 % de solidos: 2,38 g de alcohol bendlico + 8,95 g de acetato de etilo
iii. 30 % de solidos: 0,98 g de alcohol bendlico + 3,69 g de acetato de etilo
Se prepara una solucion acuosa con colato de sodio al 0,5 %, alcohol bendlico al 2 % y acetato de etilo al 4 % en agua. A un frasco de 2 l anadir 7,5 g de colato de sodio, 1402,5 g de agua DI, 30 g de alcohol bendlico y 60 g de acetato de etilo y mezclar sobre placa de agitacion hasta disolucion.
Para formar la emulsion, se usa una relacion entre fase acuosa y fase oleosa de 5:1. La fase organica se vierte en la solucion acuosa y se homogeniza usando IKA durante 10 segundos a temperatura ambiente para formar una emulsion gruesa. La solucion se introduce a traves del homogeneizador (110S) a 9 Kpsi (62,05 MPa) (45 psi (0,06 MPa) de manometro) para 2 pases discretos para formar la nanoemulsion.
La emulsion se vierte en el medio de enfriamiento (agua D.I.) a <5 °C mientras se agita sobre la placa de agitacion. La relacion de medio de enfriamiento a emulsion es de 8:1. Se anade Tween 80 al 35 % (p/p) en agua al medio de enfriamiento en una relacion de 25:1 de Tween 80 a farmaco. Las nanoparticulas se concentran a traves de TFF y el medio de enfriamiento se concentra en TFF con modulo Pall de.500 kDa (membrana 2) hasta ~100 ml. Se usa diafiltracion utilizando ~20 diavolumenes (2 litros) de agua DI fria y el volumen se reduce hasta un volumen mmimo y despues se recoge la suspension final, ~100 ml. Se determina la concentracion de solidos de la suspension final sin filtrar, usando un vial de centelleo de 20 ml tarado, anadiendo 4 ml de suspension final y secando al vado en liofilizador/estufa y se determina el peso de las nanoparticulas en los 4 ml de suspension seca. Se anade sacarosa concentrada (0,666 g/g) a la muestra de suspension final para obtener sacarosa al 10 %.
La concentracion de solidos de la suspension final filtrada por 0,45 um se determino filtrando aproximadamente 5 ml de muestra de suspension final antes de anadir la sacarosa a traves de un filtro de jeringa de 0,45 pm; a un vial de centelleo de 20 ml tarado se le anadieron 4 ml de muestra filtrada y se seco al vado en liofilizador/estufa.
La muestra restante de la suspension final sin filtrar se congelo con sacarosa. Formulaciones de rapamicina (sirolimus):
Nombre
Polfmero Tamano (nm) Carga de farmaco Liberacion de farmaco (t = h)
o II 1-
CM II 1- ii l- "3 CM II 1-
5 % de solidos
16/5 PLA/PEG 123,1 3,61 % ND ND ND ND
16/5 PLA/PEG + PLA
119,7 4,49 % ND ND ND ND
15 % de solidos
16/5 PLA/PEG 82,1 4,40 % ND ND ND ND
16/5 PLA/PEG+PLA
120,6 11,51 % ND ND ND ND
23 % de solidos
16/5 PLA/PEG 88,1 7,40 % ND ND ND ND
16/5 PLA/PEG + PLA
118,3 7,8 % ND ND ND ND
30 % de solidos
16/5 PLA/PEG 88,5 10,26 % 8,5 17,3 22,4 64,2
16/5 PLA/PEG + PLA
118,3 10,18 % 9,3 30,4 44,7 98,2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El efecto del contenido de solidos y las inclusiones de homopoKmero de acido poli(lactico) se muestran en la figura 14.
Se estudian experimentos de liberacion in vitro dispersando nanopardculas en PBS que contienen el 10 %(p/p) de Tween 20 (T20) a 37 °C. Se uso T20 para aumentar la solubilidad de la rapamicina en PBS hasta niveles bien detectables por HPLC asf como manteniendo las condiciones de libre saturacion. Se redispersaron 3 ml de nanopardculas cargadas de farmaco en 130 ml de medio de liberacion en un frasco a una concentracion conocida (aproximadamente 250 pg/ml). Estos volumenes se eligieron para asegurar que la maxima concentracion del farmaco en el medio de liberacion siempre sena menor del 10 % de la solubilidad maxima es decir, las condiciones de libre saturacion. El medio y la suspension de nanoparrtculas se agitaron a 150 rpm. Atiempos predeterminados, se centrifugaron alfcuotas de 4 ml a 50.000 rpm (236.000 g) durante 1 h para separar las nanoparrtculas del medio de elucion. El medio de elucion se inyecto en un HPLC para determinar el farmaco liberado de las nanoparrtculas. La liberacion de rapamicina mostro una liberacion lenta y sostenida, como se muestra en la figura 15.
Ejemplo 18 - Temsirolimus
Se prepararon nanopartfculas como en los ejemplos 17 y 8, excepto por que se uso temsirolimus con un 30% de contenido de solidos en la fase organica antes de la emulsion:
Nombre
Polfmero Tamano (nm) Carga de farmaco Liberacion de farmaco (t = h)
T = 0
T = 2 T = 4 "3 CM II 1-
30 % de solidos
16/5 PLA/PEG 97,5 9,9 % 11,5 15,6 17,9 40,9
16/5 PLA/PEG + PLA
112,8 14,2 % 9,8 22,3 29,9 88,0
16/5 PLCA/PEG + PLA
150,3 4,6 ND ND ND ND
16/5 PLGA/PEG + PLA
ND 6,9 10,6 35,7 45,8 87,0
La figura 16 representa el % en peso de temsirolimus y la figura 17 describe la nanopartfcula para las diferentes nanopartfculas polimericas que tienen temsirolimus. Los resultados de un experimento de liberacion in vitro como en el ejemplo 17 muestran la liberacion lenta y sostenida de temsirolimus como se muestra en la figura 18.
Ejemplo 19 Nanoparticulas de vinorelbina
Se prepararon lotes de nanoparticulas usando el procedimiento general del ejemplo 8, con 80 % (p/p) de polfmero- PEG o polfmero-PEG con homopolfmero PLA a 40 % (p/p) cada uno, con un lote del % total de solidos del 5 %, el 15 % y el 30 %. Los disolventes utilizados fueron: alcohol bendlico al 21 % y acetato de etilo al 79 % (p/p). Para cada lote de 2 g de tamano, se usaron 400 mg de vinorelbina y 1,6 g de 16-5 polfmero-PEG o 0,8 g de 16-5 polfmero-PEG + 0,8 g de PLA (homopolfmero) de 10 kDa. Se uso el polfmero en dibloque 16-5 PLA-PEG o PLGA- PEG (50:50 L:G) y cuando se uso, el homopolfmero: PLA con un Pn = 6,5 kDa, Pm=10 kDa y Pm/Pn=1,55.
La fase organica (farmaco y polfmero) se preparo en lotes de 2 g: a un vial de centelleo de 20 ml anadir farmaco y polfmero o polfmeros. La masa de disolventes necesaria al % de solidos se muestra a continuacion:
i. 5 % de solidos: 7,98 g de alcohol bendlico + 30,02 g de acetato de etilo
ii. 15 % de solidos: 2,38 g de alcohol bendlico + 8,95 g de acetato de etilo
iii. 30 % de solidos: 0,98 g de alcohol bendlico + 3,69 g de acetato de etilo
Se prepara una solucion acuosa con colato de sodio al 0,5 %, alcohol bendlico al 2 % y acetato de etilo al 4 % en agua. Anadir al frasco 7,5 g de colato de sodio, 1402,5 g de agua DI, 30 g de alcohol bendlico y 60 g de acetato de etilo y mezclar sobre placa de agitacion hasta disolucion.
Para la formacion de la emulsion, se usa una relacion entre fase acuosa y fase oleosa de 5:1. La fase organica se vierte en la solucion acuosa y se homogeniza usando IKA durante 10 segundos a temperatura ambiente para formar una emulsion gruesa. La solucion se introduce a traves del homogeneizador (110S) a 9 Kpsi (62,05 MPa) (45 psi (0,06 MPa) de manometro) para 2 pases discretos para formar la nanoemulsion.
La emulsion se vierte en el medio de enfriamiento (agua D.I.) a <5 °C mientras se agita sobre la placa de agitacion. La relacion entre medio de enfriamiento y emulsion es 8:1. Se anade Tween 80 al 35 % (p/p) en agua al medio de enfriamiento en una relacion de 25:1 entre Tween 80 y farmaco. Las nanoparticulas se concentran a traves de TFF y el medio de enfriamiento se concentra en TFF con modulo Pall de.500 kDa (membrana 2) hasta ~100 ml. Se usa diafiltracion utilizando ~20 diavolumenes (2 litros) de agua DI fria, el volumen se reduce hasta un volumen mmimo y despues se recoge la suspension final, ~100 ml. La concentracion de solidos de la suspension final sin filtrar, se determina usando un vial de centelleo de 20 ml tarado y anadiendo 4 ml de suspension final y secando al vado en liofilizador/estufa y se determina el peso de las nanoparticulas en los 4 ml de suspension seca. Se anade sacarosa concentrada (0,666 g/g) a la muestra de suspension final para conseguir sacarosa al 10 %.
Se determino la concentracion de solidos de suspension final filtrada por 0,45 pm, filtrando aproximadamente 5 ml de muestra de suspension final antes de anadir la sacarosa a traves de un filtro de jeringa de 0,45 pm; a un vial de centelleo de 20 ml tarado anadir 4 ml de muestra filtrada y secar al vado en liofilizador/estufa.
La muestra restante de la suspension final sin filtrar se congelo con sacarosa. Formulaciones de vinorelbina:
% de solidos
Liberacion in vitro conducida Tipo de polfmero: % de carga de vinorelbina (HPLC) Tamano de partfcula (nm)
5 %
16-5 PLA-PEG 4,27 143,3
16-5 PLA-PEG + PLA 3,39 105,7
15 %
16-5 PLA-PEG 6,2 100,3
16-5 PLA-PEG + PLA 15,95 141,3
30 %
16-5 PLA-PEG (n = 3) 10,41 90,8
10,31 84,4
*
12,01 95
*
16-5 PLA-PEG + PLA 15,03 125,5
*
16-5 PLGA-PEG + PLA 14,66 120,3
* = liberacion in vitro hecha en las muestras
5 La liberacion in vitro se realizo en tres formulaciones con un 30 % de solidos totales: 16-5 PLA-PEG; 16-5 PLA-PEG + PLA; y 16-5 PLGA-PEG + PLA y los datos de liberacion in vitro se recogieron a 37 °C en una camara de aire utilizando urea al 10 % en solucion de PBS como medio de liberacion. La tabla siguiente y la figura 19 describen los resultados:
16-5 PLAPEG 16-5 PLA-PEG + PLA 10 kDa 16-5 PLGA-PEG + PLA 10 kDa
Tiempo (horas)
0
5,62 0,84 4,79
2
35,29 35,35 67,63
5
41,28 49,58 87,05
24
65,20 91,81 101,62
48
73,02 88,63 89,57
144
81,08 84,98 91,46
Ejemplo 20 - Vincristina
10 Las formulaciones de nanopartfculas que incluyen vincristina se prepararon usando el procedimiento general del ejemplo 8.
Formulaciones de vincristina:
N.° de ref.
Componentes Composicion en peso (%)
50-103-3-5
mPEG(5k)-/PLA(16K) /Vincristina 96/4
50-117-1-5
mPEG(5k)-/PLA(16K) /Vincristina 95/5
50-117-2-5
mPEG(5k)-/PLA(16K) /Vincristina 96/4
50-103-4
mPEG(5k)-/PLA(16K) / /PLA(16K) /Vincristina 46/46/8
50-103-2
mPEG(5k)-/PLA(16K) / /PLA(16K) /Vincristina 47/47/6
5
10
15
20
25
30
Caracterizacion analttica de las formulaciones de vincristina:
N.° de ref.
Tamano (nm) Carga de farmaco (%) Eficiencia de la encapsulacion (%)
50-103-3-5
103 4,4 21,8
50-117-1-5
110 4,6 22,8
50-117-2-5
115 4,2 20,8
50-103-4
146 8,3 41,6
50-103-2
98 6,0 30,0
Se realizo la liberacion in vitro en las formulaciones de vincristina y se obtuvieron los datos de liberacion in vitro a 37 °C en una camara de aire, usando urea al 10% en solucion de PBS como medio de liberacion. La figura 20 describe la liberacion in vitro para varios de los lotes a los que se hace referencia.
Ejemplo 21 Farmacocinetica
Se determino la farmacocinetica (FC) de las nanopartfculas que tienen vincristina preparadas como en el ejemplo 20 y que tienen docetaxel preparadas como en el ejemplo 8 en ratas Sprague-Dawley (SD). Se administro a las ratas (Sprague Dawley machos, de aproximadamente 300 g con canula yugular) una unica dosis intravenosa de 0,5 mg/kg de farmaco libre o nanopartfculas dirigidas pasivamente que encapsulaban farmaco (10% en peso de farmaco, 90 % en peso de polfmero (PLA-PEG, Pn de PLA=16 Da; Pn de pEG=5 Da, PTNP) con 5 mg/kg y PTNP en el tiempo = 0. Se extrajeron muestras de sangre de la canula yugular, a diversos tiempos despues de la administracion, en tubos que conteman heparina de litio y se preparo el plasma. Los niveles plasmaticos se determinaron mediante extraccion de los farmacos del plasma seguida de analisis LCMS.
La figura 21 describe los perfiles farmacocineticos de vincristina y vincristina PTNP y de docetaxel y docetaxel PTNP.
Ejemplo 22 Analisis del tamano de particula
El tamano de partfculas se analiza por dos tecnicas: dispersion dinamica de la luz (DLS, del ingles dynamic light scattering) y difraccion laser. La DLS se realiza utilizando un instrumento Brookhaven ZetaPals a 25 °C en suspension acuosa diluida utilizando un laser de 660 nm dispersado a 90 ° y se analiza utilizando los procedimientos Cumulants y NNLS (TP008). La difraccion laser se realiza con un instrumento Horiba LS950 en suspension acuosa diluida utilizando tanto un laser de HeNe a 633 nm como un LED a 405 nm, dispersados a 90° y se analiza usando el procedimiento optico Mie (TP009). El resultado de la DLS se asocia al radio hidrodinamico de las partfculas, que incluye la 'corona' de PEG, mientras que el instrumento de difraccion laser esta mas estrechamente asociado al tamano geometrico del 'centro' de la partfcula de PLA.
Ejemplo 23 - Densidad de ligando
Suponiendo que el diametro general de partfcula es equivalente al diametro hidrodinamico medido con el dimensionador de partfculas Brookhaven, las nanopartfculas son esferas perfectas y todo el PEG hidrofilo y el ligando se expresan sobre la superficie asf como todo el PEG esta totalmente hidratado, se puede construir un modelo de la superficie de la partfcula como se muestra en la tabla I:
Tabla I: Modelo de la superficie de la nanoparticula para particulas de 100 nm de 16/5 copolimero y homopolimero
de 6,5 kDa
% de ligando
Polimero (moleculas o SA/particula) Cobertura de ligando
% en moles de copotfmero
Homopol'imero Copol'imero nm2/PEG mol/g de NP Moleculas/partfcula nm2/ligando
0 % (NTNP)
7050 2182 14,40 0 0 NA
1 % de GL2
7049 2183 14,39 1,72 x 10-07 22 1439
5 % de GL2
7047 2187 14,37 8,63 x 10'07 109 287
10 % de GL2
7043 2191 14,34 1,73 x 10'07 219 143
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Ejemplo 24 - Direccionamiento al tumor de cancer de mama
Se evaluo la capacidad de las nanopartfculas administradas por via intravenosa preparadas como en el ejemplo 8 (docetaxel al 10 % en peso, polfmero al 90 % en peso (PLA-PEG-GL2 al ~1,25 % en peso; y PLA-PEG al ~98,75 %, Pn de PLA = 16 Da; Pn de PEG = 5 Da) (etiquetadas como BIND-14) para inhibir el crecimiento del tumor no prostatico en comparacion con docetaxel convencional y partfculas de control no dirigidas que teman la misma composicion farmaco/polfmero (PTNP) en ratones a los que se les implantaron xenoinjertos MX-1. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 300 mm3, a los ratones se les administraron los artfculos de ensayo (sacarosa, docetaxel, PTNP, BIND-14) cada 4 dfas por 3 dosis. Los volumenes tumorales promedio con el paso del tiempo para cada grupo de tratamiento se muestran en la figura 22.
Se evaluo la capacidad de las partfculas dirigidas (BIND-14) para potenciar la entrega de docetaxel a los tumores despues de la administracion intravenosa en ratones que teman xenoinjertos de cancer de mama humano MX-1, con un volumen promedio de tumor de 1700 mm3. Se analizaron las concentraciones de docetaxel (ng/mg) en tumores extirpados 24 horas despues de la dosis IV, de animales a los que se les administro BIND-14, PTNP y docetaxel convencional, para determinar el contenido de docetaxel utilizando CL/EM/M y se presentan en la figura 23.
Ejemplo 25 - Direccionamiento al tumor de cancer de prostata
Se evaluo la entrega de nanopartfculas de docetaxel utilizando nanopartfculas preparadas como en el ejemplo 8 (docetaxel al 10 % en peso, polfmero al 90 % en peso (PLA-PEG-GL2 al ~1,25 % en peso; y PLA-PEG al -98J5 %, Pn PLA = 16 Da; Pn PEG = 5 Da; BIND-14) a tumores, despues de la administracion intravenosa en ratones SCID machos con xenoinjertos de LNCaP de cancer de prostata humano. Los ratones SCID machos se inocularon por via subcutanea con celulas LNCaP de cancer de prostata humano. Tres a cuatro semanas despues de la inoculacion, se administro una unica dosis IV de 5 mg/kg de docetaxel como BIND-014 o como docetaxel convencional. Los ratones se sacrificaron 2 h o 12 h post administracion. Se extirparon y analizaron los tumores de cada grupo para determinar docetaxel mediante un procedimiento CL-EM.
Doce horas despues de una unica dosis de 50 mg/kg de BIND-14, la concentracion de docetaxel en el tumor en animales que recibieron BIND-014 fue aproximadamente 7 veces mayor que en los animales que recibieron DTXL convencional, lo que indica que las nanopartfculas dirigidas a PSMA de circulacion prolongada entrgan mas DTXL al sitio del tumor como se muestra la figura 24.
Tambien se evaluo la capacidad de dosis repetidas de BIND-014 para suprimir el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto de tumor LNCaP como se muestra en la figura 25. Los ratones SCID machos se inocularon por via subcutanea con celulas LNCaP de cancer prostatico humano. Tres a cuatro semanas despues de la inoculacion, los ratones se trataron dfa por medio por cuatro dosis con BIND-014, docetaxel (DTXL) convencional, DTXL encapsulado en nanopartfculas no dirigidas (PTNP) y vehfculo (Control). Despues de las cuatro dosis de 5 mg/kg, la reduccion del volumen del tumor fue mayor en los animales que recibieron BIND-014 en comparacion con el docetaxel convencional o las partfculas no dirigidas (PTNP). El aumento en la concentracion de docetaxel en el tumor resulto en un efecto citotoxico mas pronunciado.
En un aspecto, la divulgacion proporciona nanopartfculas terapeuticas que incluyen un agente activo o agente terapeutico, por ejemplo taxano y uno, dos o tres polfmeros biocompatibles. Por ejemplo, en el presente documento se desvela una nanopartfcula terapeutica que comprende aproximadamente el 0,2 a aproximadamente el 35 por ciento en peso de un agente terapeutico; de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 99 por ciento en peso de copolfmero acido poli(lactico)-poli(etilen)glicol o copolfmero acido poli(lactico)-co-poli(glicolico)-poli(etilen)glicol; y de aproximadamente el 0 a aproximadamente el 50 por ciento en peso de acido poli(lactico) o acido poli(lactico)-co- acido poli(glicolico). Los agentes terapeuticos de ejemplo incluyen antineoplasicos tales como taxanos, por ejemplo docetaxel y pueden incluir de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 30 por ciento en peso de un agente terapeutico, por ejemplo, un agente taxano.
En el presente documento se proporciona, en parte, un procedimiento para preparar una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas desveladas, que comprende combinar un agente terapeutico, un primer polfmero y un segundo polfmero, con un disolvente organico (por ejemplo, un disolvente elegido entre: acetato de etilo, alcohol bendlico, cloruro de metileno, dimetilformamida, Tween 80 y Span 80 y combinaciones de dos o mas de estos) para formar una primera fase organica que tenga de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 50 % de solidos; combinar la primera fase organica con una primera solucion acuosa (que en algunas realizaciones, puede incluir un reactivo elegido entre: colato de sodio, acetato de etilo, alcohol bendlico o combinaciones de los mismos) para formar una segunda fase; emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion; enfriar la fase en emulsion para formar una fase enfriada; anadir un solubilizante de farmaco a la fase enfriada para formar una fase solubilizada de agente terapeutico no encapsulado; y filtrar la fase solubilizada para recuperar las nanopartfculas furtivas espedficas para la diana, formando de este modo una suspension de nanopartfculas terapeuticas con un diametro de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 150 nm. En algunas realizaciones, emulsionar la segunda fase puede implicar emulsionar la segunda fase para formar una emulsion gruesa y emulsionar la emulsion gruesa para formar una fase en emulsion fina. La emulsion de la segunda fase se puede realizar, por ejemplo, utilizando un homogeneizador de rotor y estator, una sonda de ultrasonidos, una barra de agitacion o un mezclador de alta
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presion. La emulsion de la emulsion gruesa se puede realizar utilizando, por ejemplo, un homogeneizador de alta presion que puede tener multiples camaras de interaccion (2, 3, 4 o mas) y con, por ejemplo, una presion de alimentacion de aproximadamente 4000 psi (27,57 Mpa) a aproximadamente 8000 psi (55,14 MPa) por camara de interaccion.
En algunas realizaciones, el enfriamiento se puede realizar por lo menos parcialmente a una temperatura de aproximadamente 5°C o menos, por ejemplo, de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C. Una relacion medio de enfriamiento:emulsion puede ser de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 5:1, o de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 40:1.
Los solubilizantes de farmaco de ejemplo para su uso en los procedimientos desvelados pueden incluir Tween 80, Tween 20, polivinilpirrolidona, ciclodextrano, dodecilsulfato de sodio o colato de sodio. En algunas realizaciones, un solubilizante de farmacos se selecciona entre el grupo que consiste en dietilnitrosamina, acetato de sodio, urea, glicerina, propilenglicol, glicofurol, poli(etilen)glicol, bis(polioxietilenglicoldodecil) eter, benzoato de sodio y salicilato de sodio. La relacion entre solubilizante de farmacos y agente terapeutico puede ser de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 10:1.
En una realizacion, un procedimiento puede incluir filtrar la fase solubilizada que contiene nanopartfculas usando por ejemplo un sistema de filtracion de flujo tangencial. La filtracion se puede realizar, por ejemplo, a una primera temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5°C y despues a una segunda temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C. Como alternativa, la filtracion se puede realizar por ejemplo, a una primera temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C y despues a una segunda temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C. En algunas realizaciones, la filtracion comprende procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y procesar al menos un diavolumen a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C, por ejemplo, filtrar puede implicar procesar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y procesar de aproximadamente 1 diavolumen a aproximadamente 15 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C. En una realizacion, filtrar puede incluir procesar diferentes diavolumenes a diferentes temperaturas definidas. La fase solubilizada se puede purificar anteriormente de dicha filtracion para retirar sustancialmente dicho disolvente organico, agente terapeutico no encapsulado y/o solubilizante de farmacos.
Los procedimientos desvelados pueden comprender la filtracion esterilizante de la suspension de nanopartfculas terapeuticas utilizando un tren de filtracion a una velocidad controlada. Por ejemplo, se puede usar un tren de filtracion que comprenda un filtro de profundidad y un filtro esterilizante.
Tambien se desvela en el presente documento un procedimiento de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas que comprende combinar un agente terapeutico, un primer polfmero y un segundo polfmero, con un disolvente organico para formar una primera fase organica, combinar la primera fase organica con una primera solucion acuosa para formar una segunda fase; emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion; enfriar la fase en emulsion para formar una fase enfriada; anadir un solubilizante de farmacos a la fase enfriada para formar una fase solubilizada de agente terapeutico no encapsulado; y filtrar la fase solubilizada utilizando filtracion de flujo tangencial con diafiltracion de volumen constante en la que al menos un diavolumen se expone a aproximadamente 25 °C despues de haber expuesto un diavolumen diferente a una temperatura de aproximadamente - 5 °C a aproximadamente 10 °C. Por ejemplo, filtrar puede incluir procesar de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 diavolumenes a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C y despues procesar al menos un diavolumen a 25 °C durante al menos un penodo de tiempo.
En el presente documento se proporcionan procedimientos de fabricacion de nanopartfculas terapeuticas que pueden ser estables durante al menos 2 dfas a 25 °C a una concentracion de aproximadamente 10mg/ml. Las nanopartfculas terapeuticas formadas utilizando los procedimientos desvelados, pueden liberar menos del 10 % en peso de agente terapeutico en al menos 5 dfas a 25 °C. En algunas realizaciones, una nanopartfcula terapeutica formada utilizando un procedimiento desvelado puede, por ejemplo, encapsular de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 30 por ciento de agente terapeutico.
En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas desveladas que comprenden combinar un agente terapeutico, un primer polfmero (por ejemplo, copolfmero PLGA-PEG o PLA) y un segundo polfmero (por ejemplo PLA, PLGA o PEG, o copolfmeros de los mismos) y opcionalmente un tercer polfmero (por ejemplo PLA o PLGA no unido a un ligando) en los que el primer polfmero esta unido a un ligando que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 1000 g/mol, por ejemplo, un ligando de bajo peso molecular, por ejemplo, un ligando de PSMA. Dicho ligando de PSMA de bajo peso molecular se puede seleccionar entre el grupo que consiste en los compuestos I, II, III y IV:
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que
my n cada uno, independientemente, es 0, 1,2 o 3; p es 0 o 1;
R1, R2, R4 y R5 cada uno, independientemente, se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituiry cualquier combinacion de los mismos; y R3esHo CH3;
en los que R1, R2, R4 o R5 comprenden un punto de union covalente a la nanopartfcula. Por ejemplo, R1, R2, R4 y R5 puede ser cada uno, independientemente, alquilo C1-6 o fenilo, o cualquier combinacion de alquilo C1-6 o fenilo, que estan independientemente sustituidos una o mas veces con OH, SH, NH2 o CO2H y en los que el grupo alquilo puede estar interrumpido por N(H), S u O. En otra realizacion, por ejemplo, R1, R2, R4 y R5 cada uno, independientemente, es CH2-Ph, (CH2)2-SH, CH2-SH, (CH2)2C(H)(NH2)CO2H, CH2C(H)(NH2)CO2H,
CH(NH2)CH2CO2H, (CH2)2C(H)(SH)CO2H, CH2-N(H)-Ph, O-CH2-Ph o O-(CH2)2-Ph, en los que cada Ph puede estar independientemente sustituido una o mas veces con OH, NH2, CO2H o SH. El ligando de PSMA de bajo peso molecular de ejemplo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en
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y
y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; y en los que los grupos NH2, OH o SH sirven como el punto de union covalente a la primera partfcula, o se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; en los que R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en NH2, SH, OH, CO2H, alquilo C1-6 que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H y fenilo que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, y en los que R sirve como el punto de union covalente al primer polfmero. Los ligandos de ejemplo incluyen
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y
y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; cualquiera de los cuales puede estar sustituido ademas con NH2, SH, OH, CO2H, alquilo C1-6 que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, o fenilo que esta sustituido con NH2, SH, OH o CO2H, en los que estos grupos funcionales sirven como el punto de union covalente al primer polfmero, por ejemplo, un ligando de PSMA de bajo peso molecular puede ser
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y los enantiomeros, estereoisomeros, rotameros, tautomeros, diastereoisomeros o racematos de los mismos; en los que los grupos NH2 sirven como el punto de union covalente al primer polfmero.
En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de preparacion de una pluralidad de nanopartfculas terapeuticas desveladas que comprenden combinar un agente terapeutico, un primer polfmero (por ejemplo, copolfmero PLGA-PEG o PLA) y un segundo polfmero (por ejemplo, PLA, PLGA o PEG, o copolfmeros de los mismos) y opcionalmente un tercer polfmero (por ejemplo PLA o PLGA no unido a un ligando). En algunas realizaciones, el agente terapeutico es docetaxel. En otras realizaciones, el agente terapeutico se selecciona entre el grupo que consiste en agentes antineoplasicos tales como doxorrubicina (adriamicina), mitoxantrona, gemcitabina (gemzar), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposido, metotrexato, 5-fluorouracilo (5-FU), vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfan, carboplatino, cladribina, camptotecina, CTP-11, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), dacarbazina, S-I capecitabina, ftorafur, 5'desoxiflurouridina, UFT, eniluracilo, desoxicitidina, 5-azacitosina, 5-azadesoxicitosina, alopurinol, 2- cloroadenosina, trimetrexato, aminopterina, metileno-10-deazaaminopterina (MDAM), oxaplatino, picoplatino, tetraplatino, satraplatino, platino-DACH, ormaplatino, CI-973, JM-216 y analogos de los mismos, epirrubicina, fosfato de etoposido, 9-aminocamptotecina, 10,11-metilenodioxicamptotecina, karenitecina, 9-nitrocamptotecina, TAS 103, vindesina, mostaza de L-fenilalanina, ifosfamidamefosfamida, perfosfamida, trofosfamida, carmustina, semustina, epotilones A-E, tomudex, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, amsacrina, fosfato de etoposido, karenitecina, aciclovir, valaciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, lamivudina, zidovudina, bevacizumab, trastuzumab, rituximab y 5- fluorouracilo, metotrexato, budesonida, sirolimus, vincristina y combinaciones de los mismos, o el agente terapeutico puede ser un ARNip.
Tambien se proporcionan en el presente documento procedimientos para tratar el cancer de prostata en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de la nanopartfcula preparada por los procedimientos desvelados.
En una realizacion, tambien se proporciona en el presente documento una nanopartfcula terapeutica preparada mediante: la emulsion de una primera fase organica que comprende un primer polfmero y un agente terapeutico y una segunda fase que forma una fase en emulsion; en la que la fase en emulsion se enfna despues a una temperatura de aproximadamente 0°Ca aproximadamente 5 °C formando una fase enfriada; y la filtracion de la fase enfriada a una primera temperatura de aproximadamente -5°C a aproximadamente 10 °C; y la filtracion de la fase enfriada a una segunda temperatura de aproximadamente 25 °C; formando de este modo nanopartfculas terapeuticas que son estables durante al menos 5 dfas a 25 °C.
Tambien se proporciona en una realizacion, un procedimiento de estabilizacion de nanopartfculas terapeuticas que tienen un agente terapeutico que comprende: proporcionar una suspension que comprenda un agente terapeutico encapsulado por nanopartfculas y un solubilizante de farmacos; filtrar la suspension a una primera temperatura de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 10 °C; filtrar la suspension a una segunda temperatura de aproximadamente 25 °C.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de preparacion de una pluralidad de nanopardculas terapeuticas, que comprende:
    combinar un agente terapeutico, un primer polfmero y opcionalmente un segundo poUmero, con un disolvente organico para formar una primera fase organica que tenga solidos del 5 al 50 %; combinar la primera fase organica con una primera solucion acuosa para formar una segunda fase; emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion;
    enfriar la fase en emulsion para formar una fase enfriada, en el que el enfriamiento se realiza al menos parcialmente a una temperatura de 5 °C o menos;
    anadir un solubilizante de farmacos a la fase enfriada para formar una fase solubilizada del agente terapeutico no encapsulado; y
    filtrar la fase solubilizada para recuperar las nanopartfculas furtivas espedficas para la diana, formando de este modo una suspension de nanopartfculas terapeuticas con un diametro de 80 nm a 150 nm.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que emulsionar la segunda fase comprende:
    emulsionar la segunda fase para formar una fase en emulsion gruesa, y emulsionar la emulsion gruesa para formar una fase en emulsion fina.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que:
    a) el disolvente organico comprende un disolvente elegido entre: acetato de etilo, alcohol bendlico, cloruro de metileno, cloroformo, tolueno, metil etil cetona, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, acetona, acetonitrilo, acido acetico, Tween 80 y Span 80 y combinaciones de dos o mas de los mismos; y/o
    b) la solucion acuosa comprende un reactivo elegido entre: colato de sodio, acetato de etilo, alcohol bendlico o combinaciones de los mismos.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que emulsionar la segunda fase comprende usar un homogeneizador de rotor y estator, una sonda de ultrasonido, una barra de agitacion o un homogeneizador de alta presion.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 2 o 4, en el que emulsionar la emulsion gruesa comprende usar un homogeneizador de alta presion, opcionalmente en el que emulsionar la emulsion primaria comprende de 2 a 3 pases a traves del homogeneizador.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que:
    a) la presion de alimentacion del homogeneizador es de 13,79 a 55,14 MPa por camara de interaccion y/o
    b) el homogeneizador comprende multiples camaras de interaccion.
  7. 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el enfriamiento se realiza de 0 °C a 5 °C.
  8. 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la relacion de enfriamiento:emulsion es:
    a) de 8:1 a 5:1, o
    b) de 2:1 a 40:1.
  9. 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que filtrar comprende usar un sistema de filtracion de flujo tangencial.
  10. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que filtrar comprende filtrar a una primera temperatura de 0 °C a 5 °C.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, que comprende adicionalmente filtrar a una segunda temperatura de 20 °C a 30 °C, opcionalmente en el que filtrar comprende:
    a) procesar de 1 a 6 diavolumenes de 0 °C a 5 °C y procesar al menos un diavolumen de 20 °C a 30 °C, o
    b) procesar de 1 a 6 diavolumenes de 0 °C a 5 °C y procesar de un diavolumen a 15 diavolumenes de 20 °C a 30 °C.
  12. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que: a) el primer o segundo polfmero se selecciona entre el grupo que consiste en:
    (i) acido poli-L-lactico, acido poli-D-lactico, acido poli-D,L-lactico, poli-L-lactido, poli-D-lactido y poli-D,L-lactido (denominados colectivamente "PLA");
    (ii) poli(acido lactico-co-acido glicolico) y poli(lactido-co-glicolido) (denominados colectivamente "PLGA"); y
    (iii) poli(etilenglicol) ("PEG");
    10
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    o copoKmeros de los mismos; y/o
    b) el primer poUmero es un PLGA-PLA o PLA y el segundo poKmero es un copoKmero PLGA-PLA-PEG, un copoKmero PLGA-W/ogue-PEG, o un copoKmero PLA-W/ogue-PEG.
  13. 13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el agente terapeutico:
    a) es docetaxel; o
    b) se selecciona entre el grupo que consiste en agentes quimioterapicos tales como doxorrubicina (adriamicina), mitoxantrona, gemcitabina (gemzar), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposido, metotrexato, 5-fluorouracilo (5-FU), vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfan, carboplatino, cladribina, camptotecina, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), dacarbazina, S-I capecitabina, ftorafur, 5'-desoxifluorouridina, eniluracilo, desoxicitidina, 5-azacitosina, 5- azadesoxicitosina, alopurinol, 2-cloroadenosina, trimetrexato, aminopterina, metileno-10-deazaaminopterina (MDAM), oxaplatino, picoplatino, tetraplatino, satraplatino, platino-DACH, ormaplatino y analogos del mismo, epirrubicina, fosfato de etoposido, 9-aminocamptotecina, 10,11-metilenodioxicamptotecina, karenitecina, 9- nitrocamptotecina, vindesina, mostaza de L-fenilalanina, ifosfamidamefosfamida, perfosfamida, trofosfamida, carmustina, semustina, epotilones A-E, tomudex, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, amsacrina, fosfato de etoposido, karenitecina, aciclovir, valaciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, lamivudina, zidovudina, bevacizumab, trastuzumab, rituximab y 5-fluorouracilo, metotrexato, budesonida, sirolimus, vincristina y combinaciones de los mismos, o
    c) un ARNip.
  14. 14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en el que filtrar la fase solubilizada comprende la concentracion, la diafiltracion y la filtracion terminal de la fase solubilizada.
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