JP2022500444A - クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドa1をコードするポリヌクレオチド - Google Patents
クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドa1をコードするポリヌクレオチド Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2018年9月14日に出願した、米国仮出願第62/731,467号の優先権利益を主張するものであって、本明細書の一部を構成するものとして、同出願の全内容を援用する。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出した、参照により、その全内容を本明細書で援用する配列表を含む。2019年9月11日に作成した当該ASCIIコピーは、名称が458l7−0050WO1_SL.txtであり、サイズが116,205バイトである。
ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)は、ビリルビンのグルクロン酸化に重要な役割を果たす代謝酵素である。UGT1A1の生物学的機能は、ビリルビンをグルクロン酸にコンジュケートさせ、それにより、体外への排出を可能ならしめる水溶性複合体を生産すること(グルクロン酸化と称するプロセス)である。UGT1A1は、主に、肝細胞の小胞体に認められる。
本発明は、CN−1の処置または予防において使用するためのmRNAを特徴とする。本発明における使用を特徴とするmRNAを対象に投与すると、インビボでヒトUGT1A1タンパク質をコードする。したがって、本発明は、ヒトUGT1A1(配列番号1)、その機能性フラグメント、及びUGT1A1を含む融合タンパク質をコードする連結したヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、例えば、mRNAに関する。特に、本発明は、ヒトUGT1A1のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
(i)完全長UGT1A1ポリペプチド(例えば、野生型UGT1A1と同じ、または本質的に同じ長さを有するもの;例えば、ヒトUGT1A1);
(ii)本明細書に記載したUGT1A1の機能的フラグメント(例えば、UGT1A1よりも短い(例えば、カルボキシ、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列;しかしながら、UGT1A1酵素活性をなおも保持している);
(iii)そのバリアント(例えば、1つ以上のアミノ酸を置換した全長または短縮UGT1A1タンパク質、例えば、参照タンパク質に関してポリペプチドのUGT1A1活性の全部または大半を保持しているバリアント(例えば、アスパラギン酸で置換した配列番号1のアミノ酸Ala46(A46D)、グルタミン酸で置換した配列番号1のアミノ酸Asp70(D70E)、グリシンで置換した配列番号1のアミノ酸Ser157(S157G)、及びグリシンで置換した配列番号1のアミノ酸Ser381(S381G)、または当該技術分野で公知のあらゆる天然または人工バリアント));または
(iv)(i)全長UGT1A1タンパク質を含む融合タンパク質(例えば、配列番号1)、またはそのバリアント、及び(ii)異種タンパク質、からなる群から選択することができる。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、コードされたポリペプチドの治療的に関連する部位への輸送を促すさらなる特徴をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。タンパク質輸送を補助するそのような特徴の1つは、シグナル配列、または標的配列である。これらのシグナル配列がコードするペプチドは、標的ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドなどの様々な名称で公知である。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、本明細書に記載したUGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、目的のポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列(例えば、ORF)を含むことができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、UGT1A1ポリペプチド、その機能性フラグメント、またはバリアントをコードする単一のORFを含む。しかしながら、一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、2つ以上のORF、例えば、UGT1A1ポリペプチド(第1の目的のポリペプチド)、その機能性フラグメント、またはバリアントをコードする第1のORFと、第2の目的のポリペプチドを発現する第2のORFとを含み得る。一部の実施形態では、目的の2つ以上のポリペプチドは、遺伝子融合することができ、すなわち、2つ以上のポリペプチドは、同じORFでコードすることができる。一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、2つ以上の目的のポリペプチドの間にリンカー(例えば、G4S(配列番号86)ペプチドリンカー、または当該技術分野で公知の別のリンカー)をコードする核酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、本開示のmRNAは、2つ以上のUGT1A1ドメイン、または異種ドメインをコードし、本明細書では多量体コンストラクトと称する。当該多量体コンストラクトのある特定の実施形態では、当該mRNAは、それぞれのドメインの間に位置するリンカーをさらにコードする。当該リンカーを、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーとすることができる。特定の実施形態では、当該リンカーを、F2Aリンカー、P2Aリンカー、T2Aリンカー、E2Aリンカー、及びそれらの組合せからなる群から選択する。このファミリーの自己切断ペプチドリンカー、別名、2Aペプチドは、当該技術分野で記載されている(例えば、Kim,J.H.et al.(2011)PLoS ONE 6:e18556を参照されたい)。ある特定の実施形態では、当該リンカーは、F2Aリンカーである。ある特定の実施形態では、当該リンカーは、GGGS(配列番号197)リンカーである。ある特定の実施形態では、当該リンカーは(GGGS)n(配列番号190)リンカーであり、式中、n=2、3、4、または5である。ある特定の実施形態では、当該多量体コンストラクトは、3つのドメインを介在リンカーと共に含有し、構造:ドメイン−リンカー−ドメイン−リンカー−ドメイン、例えば、UGT1A1ドメイン−リンカー−UGT1A1ドメイン−リンカー−UGT1A1ドメインを有する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、配列最適化する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、任意に、目的の別のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、5’−UTR、3’−UTR、当該5’UTR、または3’UTRは、任意に、少なくとも1つのマイクロRNA結合部位を含む、リンカーをコードする任意のヌクレオチド配列、ポリA尾部、またはそれらの任意の組合せ)を含み、ここで、当該ORF(複数可)は配列最適化している。
(i)参照ヌクレオチド配列での少なくとも1つのコドン(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするORF)を代替コドンで置換して、ウリジン含有量を増減させて、ウリジン修飾配列を生成する;
(ii)参照ヌクレオチド配列での少なくとも1つのコドン(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするORF)を、同義コドンセットにおいてコドン頻度が高い代替コドンで置換する;
(iii)参照ヌクレオチド配列での少なくとも1つのコドン(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするORF)を、代替コドンで置換して、G/C含有量を増加させる;または
(iv)それらの組合せ、を含む方法に従って配列最適化する。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示したUGT1A1ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、UGT1A1ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、その際、当該ORFは配列最適化されている。
(i)本明細書で提供する5’キャップ、例えば、Cap1;
(ii)本明細書で提供する配列、例えば、配列番号3などの5’UTR;
(iii)UGT1A1ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号2または5〜12に記載のUGT1A1をコードする配列最適化核酸配列;
(iv)少なくとも1つの終止コドン(存在しない場合は、3’UTRの5’末端);
(v)本明細書で提供する配列、例えば、配列番号150、151、または178などの3’UTR;及び
(vi)上記したポリA尾部、を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’から3’の末端に向けて:
(i)本明細書で提供する5’キャップ、例えば、Cap1;
(ii)本明細書で提供する配列、例えば、配列番号3、39、193、または194などの5’UTR;
(iii)UGT1A1ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号2または5〜12に記載のUGT1A1をコードする配列最適化核酸配列;
(iv)少なくとも1つの終止コドン(存在しない場合は、3’UTRの5’末端);
(v)本明細書で提供する配列、例えば、配列番号4、111、150、175、177、178、195、または196などの3’UTR;及び
(vi)上記したポリA尾部、を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルは、N1−メチルシュードウラシル(G5)である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドでのすべてのウラシルは、5−メトキシウラシル(G6)である。
本発明の一部の実施形態では、UGT1A1ポリペプチドをコードする本明細書に開示した配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、少なくとも1つの核酸配列特性(例えば、ヌクレアーゼに曝露された場合の安定性)、または発現特性が、非配列最適化核酸に対して改善されているか否かを決定するために試験することができる。
本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列に固有の特性である。例えば、ヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、インビボまたはインビトロでの安定性のために、配列最適化することができる。一部の実施形態では、当該ヌクレオチド配列を、特定の標的組織または細胞での発現のために、配列最適化することができる。一部の実施形態では、当該核酸配列を配列最適化して、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによって、配列が分解することを防止することで、その血漿中半減期を延長する。
本発明の一部の実施形態では、当該ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示した配列最適化配列がコードするUGT1A1ポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、1つ以上の発現系を用いて測定することができる。一部の実施形態では、発現を、細胞培養系、例えば、CHO細胞、またはHEK293細胞で測定することができる。一部の実施形態では、例えば、ウサギ網状赤血球溶解産物のような生存細胞の抽出物から調製したインビトロ発現系を使用し、あるいは、精製した個々の成分を寄せ集めて調製したインビトロ発現系を使用して、発現を測定することができる。その他の実施形態では、タンパク質の発現を、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サルなどにおいて測定する。
一部の実施形態では、核酸配列がコードする異種治療用タンパク質の発現は、標的組織もしくは細胞において有害作用を示し、タンパク質収量を減少させる、または(例えば、封入体内にタンパク質フラグメントが存在する、または発現タンパク質が沈殿することで)発現産物の質を低下させ得る、あるいは、毒性を惹起し得る。
一部の事例では、UGT1A1ポリペプチドをコードする配列最適化核酸、またはその機能性フラグメントの投与は、(i)治療薬(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするmRNA)、または(ii)そのような治療薬の発現産物(例えば、mRNAがコードするUGT1A1ポリペプチド)、または(iv)その組合せに起因し得るであろう免疫応答を誘発することができる。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示した核酸配列(例えば、mRNA)の配列最適化を使用して、UGT1A1ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、あるいは、そのような核酸がコードするUGT1A1の発現産物によって誘発される免疫応答または炎症応答を減少させることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、化学修飾した核酸塩基、例えば、化学修飾したウラシル、例えば、シュードウラシル、N1−メチルシュードウラシル、5−メトキシウラシルなどを含む。一部の実施形態では、当該mRNAは、UGT1A1ポリペプチドをコードするORFを含むウラシル修飾配列であり、その際、当該mRNAは、化学修飾した核酸塩基、例えば、化学修飾したウラシル、例えば、シュードウラシル、N1−メチルシュードウラシル、または5−メトキシウラシルを含む。
本開示は、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、ポリヌクレオチド、例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むmRNA)を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。当該修飾ポリヌクレオチドは、化学修飾、及び/または構造修飾することができる。本発明のポリヌクレオチドが、化学修飾、及び/または構造修飾している場合、当該ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称することができる。
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、様々なシス作用性核酸構造により与えられる様々な機構で調節及び制御することができる。例えば、ヘアピンまたはその他の高次(例えば、シュードノット)分子内mRNA二次構造を形成する天然に生じるシス作用性RNAエレメントは、翻訳制御活性をポリヌクレオチドに与えることができ、その際、特に、RNAエレメントが、5’キャップ構造に近似する5’UTRに位置している場合には、RNAエレメントは、ポリヌクレオチド翻訳の開始に影響を及ぼす、またはそれを調節する(Pelletier and Sonenberg(1985)Cell 40(3):515−526、Kozak(1986)Proc Natl Acad Sci 83:2850−2854)。
本開示は、所望の翻訳制御活性を与える修飾を含む合成ポリヌクレオチド(例えば、RNAエレメント)を提供する。一部の実施形態では、本開示は、5’非翻訳領域(UTR)、開始コドン、ポリペプチドをコードする全長オープンリーディングフレーム、3’UTR、及び少なくとも1つの修飾を含むポリヌクレオチドを提供し、その際、当該少なくとも1つの修飾は、所望の翻訳制御活性、例えば、mRNA翻訳の翻訳忠実性を促進、及び/または増強する修飾を与える。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、シス作用性制御活性である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、またはその近位での43S転写前複合体(PIC)、またはリボソームの滞留時間の増大である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、またはそこからのポリペプチド合成の開始の増大である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、全長オープンリーディングフレームから翻訳するポリペプチドの量の増加である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実性の上昇である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる読み漏らしの阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる開始コドンの解読速度の低下である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、開始コドン以外のmRNAでのあらゆるコドンでのポリペプチド合成の開始の阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、全長オープンリーディングフレーム以外のmRNAでのあらゆるオープンリーディングフレームから翻訳するポリペプチドの量の阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、異常な翻訳産物の産生の阻害または減少である。一部の実施形態では、当該所望の翻訳制御活性は、前掲の翻訳制御活性のうちの1つ以上の組合せである。
表2
5’UTR−001(上流UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号3);
5’UTR−002(上流UTR)(GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号89);
5’UTR−003(上流UTR)(WO2016/100812を参照されたい);
5’UTR−004(上流UTR)(GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC)(配列番号90);
5’UTR−005(上流UTR)(GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号91);
5’UTR−006(上流UTR)(WO2016/100812を参照されたい);
5’UTR−007(上流UTR)(GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC)(配列番号92);
5’UTR−008(上流UTR)(GGGAAUUAACAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号93);
5’UTR−009(上流UTR)(GGGAAAUUAGACAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号94);
5’UTR−010、上流(GGGAAAUAAGAGAGUAAAGAACAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号95);
5’UTR−011(上流UTR)(GGGAAAAAAGAGAGAAAAGAAGACUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号96);
5’UTR−012(上流UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAUAUAUAAGAGCCACC)(配列番号97);
5’UTR−013(上流UTR)(GGGAAAUAAGAGACAAAACAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号98);
5’UTR−014(上流UTR)(GGGAAAUUAGAGAGUAAAGAACAGUAAGUAGAAUUAAAAGAGCCACC)(配列番号99);
5’UTR−015(上流UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAUAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号100);
5’UTR−016(上流UTR)(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAAUUAAGAGCCACC)(配列番号101);
5’UTR−017(上流UTR);または
(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUUUAAGAGCCACC)(配列番号102);
5’UTR−018(上流UTR)5’UTR
(UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号88)を含む。
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号104);
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号105);または
142−3p 3’UTR(R142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号106);
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号107);
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号108);
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号109);
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACUGAGUGGGCGGC)(配列番号110);
3’UTR−018(配列番号150を参照されたい);
3’UTR(miR142及びmiR126結合部位バリアント1)
(UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号111)
3’UTR(miR142及びmiR126結合部位バリアント2)
(UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号112);または
3’UTR(miR142−3p結合部位バリアント3)
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号176)、を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列、及び/またはモチーフ、内因性核酸結合分子の偽受容体として作用するように操作した人工結合部位、ならびに、それらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むものと称する。
表3.miR−l42、miR−l26、及びmiR−l42、及びmiR−l26結合部位
表4A.5’UTR、3’UTR、miR配列、及びmiR結合部位
終止コドン=太字
miRl42−3p結合部位=下線
miRl26−3p結合部位=太字の下線
miRl55−5p結合部位=イタリック体
miRl42−5p結合部位=イタリック体で太字の下線
表4B.例示的な好ましいUTR
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明のUGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、3’UTRをさらに含む。
本発明は、5’キャップと、本発明のポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ポリA尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のために、ポリA尾部上に末端基を組み込むことができる。その他の実施形態では、ポリA尾部は、des−3’ヒドロキシル尾部を含む。
また、本発明は、開始コドン領域、及び本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域、または開始コドン領域と同様に機能する領域を有することができる。
また、本発明は、終止コドン領域、及び本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)の前に、少なくとも2つの終止コドンを含むことができる。DNAの場合は、TGA、TAA、及びTAGからコドンを選択することができ、RNAの場合は、UGA、UAA、及びUAGから終止コドンを選択することができる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの場合は、終止コドンTGA、またはRNAの場合は、終止コドンUGA、及び1つのさらなる終止コドンを含む。さらなる実施形態では、さらなる終止コドンは、TAAまたはUAAとすることができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの連続的終止コドン、4つの終止コドン、またはそれより多くの終止コドンを含む。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’から3’に向けて:
(i)上記した5’キャップ;
(ii)上記した配列などの5’UTR;
(iii)ヒトUGT1A1ポリペプチドをコードするORF、例えば、配列番号2及び5〜12からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する当該ORF;
(iv)少なくとも1つの終止コドン;
(v)上記した配列などの3’UTR;及び
(vi)上記したポリA尾部、を含む。
表5−ヒトUGT1A1をコードするORFを含む修飾mRNAコンストラクト(コンストラクト#1〜#14のそれぞれは、Cap1 5’末端キャップと、3’末端ポリA領域を含む)
また、本開示は、本発明のポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、またはその相補体を作り出すための方法を提供する。
本明細書に開示した本発明のポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、インビトロ転写(IVT)系を使用して転写することができる。この系は、一般的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸(NTP)、RNアーゼ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。NTPとして、限定をするものではないが、天然及び非天然(修飾)NTPを含めて、本明細書に記載したものから選択することができる。当該ポリメラーゼとして、T7 RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、及び変異型ポリメラーゼがあるが、これらに限定されず、例えば、本明細書に開示したポリヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼから選択することができるが、それらに限定されない。その全内容を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開US20130259923号を参照されたい。
目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を合成するための標準的な方法を適用することができる。例えば、特定の単離したポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含有する単一のDNAまたはRNAオリゴマーを合成することができる。その他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、ライゲートすることができる。一部の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、一般的には、相補的なアセンブリのために、5’または3’オーバーハングを含有する。
本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、及び品質管理を含むことができるが、これらに限定されない。クリーンアップは、当該技術分野で公知の方法、例えば、限定をするものではないが、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、ポリTビーズ、LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)Inc.,Vedbaek,Denmark)、またはHPLCに基づく精製方法など、例えば、限定をするものではないが、強陰イオン交換HPLC、弱陰イオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、及び疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)などにより、実施することができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、それらの発現産物、ならびに、分解産物及び代謝産物を、当該技術分野で公知の方法に従って定量することができる。
本発明は、当該ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。一部の実施形態では、当該組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
a.脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載した脂質組成物は、治療薬及び/または予防薬、例えば、mRNAを哺乳動物細胞または器官に送達するための脂質ナノ粒子組成物において有利に使用し得る。例えば、本明細書に記載した脂質は、免疫原性が殆どなく、または全くない。例えば、本明細書に開示した脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較して低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示した脂質及び治療薬または予防薬、例えば、mRNAを含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)、及び同じ治療薬または予防薬を含む対応する製剤と比較して、治療指数の増加を示す。
(a)UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;及び
(b)送達剤を含む、医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本発明の核酸(例えば、UGT1A1 mRNA)を、脂質ナノ粒子(LNP)で製剤する。脂質ナノ粒子は、一般的には、イオン性カチオン脂質、非カチオン脂質、ステロール、及びPEG脂質成分を、目的の核酸カーゴと共に含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般的に知られている構成成分、組成、及び方法を使用して生成することができる。例えば、全文献の全内容を参照により本明細書で援用する、PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/52117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575、及びPCT/US2016/069491を参照されたい。
一部の態様では、本開示のイオン性脂質は、式(I)の化合物:
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩、もしくは、異性体の1種以上であり、式中;
R1は、C5〜30アルキル、C5〜20アルケニル、−R*YR”、−YR”、及び−R”M’R’からなる群から選択する;
R2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、C2−14アルケニル、−R*YR”、−YR”、及び−R*OR”からなる群から選択する、またはR2及びR3は、それらが結合している原子と一緒に、複素環または炭素環を形成する;
R4は、水素、C3〜6炭素環、−(CH2)nQ、−(CH2)nCHQR、−CHQR、−CQ(R)2、及び非置換C1−6アルキルからなる群から選択する、ここで、Qは、炭素環、複素環、−OR、−O(CH2)nN(R)2、−C(O)OR、−OC(O)R、−CX3、−CX2H、−CXH2、−CN、−N(R)2、−C(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)C(O)N(R)2、−N(R)C(S)N(R)2、−N(R)R8、−N(R)S(O)2R8、−O(CH2)nOR、−N(R)C(=NR9)N(R)2、−N(R)C(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、−N(OR)C(O)R、−N(OR)S(O)2R、−N(OR)C(O)OR、−N(OR)C(O)N(R)2、−N(OR)C(S)N(R)2、−N(OR)C(=NR9)N(R)2、−N(OR)C(=CHR9)N(R)2、−C(=NR9)N(R)2、−C(=NR9)R、−C(O)N(R)OR、及び−C(R)N(R)2C(O)ORから選択し、かつ各nは、独立して、1、2、3、4、及び5から選択する;
各R5は、独立して、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択する;
各R6は、独立して、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択する;
M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−N(R’)C(O)−、−C(O)−、−C(S)−、−C(S)S−、−SC(S)−、−CH(OH)−、−P(O)(OR’)O−、−S(O)2−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する、ここで、M”は、結合、C1−13アルキルまたはC2−13アルケニルである;
R7は、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択する;
R8は、C3−6炭素環及び複素環からなる群から選択する;
R9は、H、CN、NO2、C1−6アルキル、−OR、−S(O)2R、−S(O)2N(R)2、C2−6アルケニル、C3−6炭素環、及び複素環からなる群から選択する;
各Rは、独立して、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択する;
各R’は、独立して、C1−18アルキル、C2−18アルケニル、−R*YR”、−YR”、及びHからなる群から選択する;
各R”は、独立して、C3−15アルキル、及びC3−15アルケニルからなる群から選択する;
各R*は、独立して、C1−12アルキル、及びC2−12アルケニルからなる群から選択する;
各Yは、独立して、C3−6炭素環である;
各Xは、独立して、F、Cl、Br、及びIからなる群から選択する、かつ、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択する、ここで、R4が−(CH2)nQ、−(CH2)nCHQR、−CHQR、または−CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、または5である場合に、Qは、−N(R)2ではなく、または(ii)nが1または2である場合に、Qは、5員、6員、または7員ヘテロシクロアルキルではない。
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩、もしくは、異性体があり、式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択する;mは、5、6、7、8、及び9から選択する;M1は、結合またはM’である;R4は、水素、非置換C1−3アルキル、または−(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、−NHC(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)R8、−NHC(=NR9)N(R)2、−NHC(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである;M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する;及びR2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択する。例えば、mは、5、7、または9である。例えば、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、または−NHC(O)N(R)2である。例えば、Qは、−N(R)C(O)R、または−N(R)S(O)2Rである。
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩、もしくは、異性体があり、式中、すべての変項は、本明細書で定義するとおりである。例えば、mは、5、6、7、8、及び9から選択する;R4は、水素、非置換C1−3アルキル、または−(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、−NHC(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)R8、−NHC(=NR9)N(R)2、−NHC(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルである;M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する;及びR2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択する。例えば、mは、5、7、または9である。例えば、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、または−NHC(O)N(R)2である。例えば、Qは、−N(R)C(O)R、または−N(R)S(O)2Rである。
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩、もしくは、異性体があり、式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択する;M1は、結合またはM’である;R4は、水素、非置換C1−アルキル、または−(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、かつ、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、−NHC(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)R8、−NHC(=NR9)N(R)2、−NHC(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルである;M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する;及びR2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択する。
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Mは、−C(O)O−または−OC(O)−であり、M”は、C1−6アルキルまたはC2−6アルケニルであり、R2及びR3は、独立して、C5−14アルキル、及びC5−14アルケニルからなる群から選択され、nは、2、3、及び4から選択する]。
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、nは、2、3、または4であり、かつ、m、R’、R”、及びR2〜R6は、本明細書に記載のとおりである。例えば、R2及びR3のそれぞれは、独立して、C5−14アルキル、及びC5−14アルケニルからなる群から選択し得る。
もしくは、そのN−オキシド、またはその塩、もしくは、異性体であり、式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択する;mは、5、6、7、8、及び9から選択する;M1は、結合またはM’である;M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択する;及びR2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択する。例えば、M”は、C1−6アルキル(例えば、C1−4アルキル)、またはC2−6アルケニル(例えば、C2−4アルケニル)である。例えば、R2及びR3は、独立して、C5―14アルキル、及びC5−14アルケニルからなる群から選択する。
またはその塩、もしくは、異性体のうちの1種以上であり、式中、
Wは、
であり、
環Aは、
であり、
tは、1または2である;
A1及びA2は、それぞれ、独立して、CHまたはNから選択する;
Zは、CH2であるか、存在せず、その際、ZがCH2である場合には点線(1)及び(2)はそれぞれ、単結合を表し、かつ、Zが存在しない場合には、点線(1)及び(2)は両方とも存在しない;
R1、R2、R3、R4、及びR5は、独立して、C5−20アルキル、C5−20アルケニル、−R”MR’、−R*YR”、−YR”、及び−R*OR”からなる群から選択する;
Rx1及びRx2は、それぞれ、独立して、HまたはC1−3アルキルである;
各Mは、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)O−、−C(O)N(R’)−、−N(R’)C(O)−、−C(O)−、−C(S)−、−C(S)S−、−SC(S)−、−CH(OH)−、−P(O)(OR’)O−、−S(O)2−、−C(O)S−、−SC(O)−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択する;
M*は、C1−C6アルキルである;
W1及びW2は、それぞれ、独立して、−O−及び−N(R6)−からなる群から選択する;
各R6は、独立して、H、及びC1−5アルキルからなる群から選択する;
X1、X2、及びX3は、独立して、結合、−CH2−、−(CH2)2−、−CHR−、−CHY−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−(CH2)n−C(O)−、−C(O)−(CH2)n−、−(CH2)n−C(O)O−、−OC(O)−(CH2)n−、−(CH2)n−OC(O)−、−C(O)O−(CH2)n−、−CH(OH)−、−C(S)−、及び−CH(SH)−からなる群から選択する;
各Yは、独立して、C3−6炭素環である;
各R*は、独立して、C1−12アルキル、及びC2−12アルケニルからなる群から選択する;
各Rは、独立して、C1−3アルキル、及びC3−6炭素環からなる群から選択する;
各R’は、独立して、C1−12アルキル、C2−12アルケニル、及びHからなる群から選択する、
各R”は、独立して、C3−12アルキル、C3−12アルケニル、及び−R*MR’からなる群から選択する;及び
nは、1〜6の整数である;
環Aが、
である場合、
i)X1、X2、及びX3のうちの少なくとも1つは、−CH2−ではなく;及び/または
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、−R”MR’である。
(IIIa1)、
(IIIa2)、
(IIIa3)、
(IIIa4)、
(IIIa5’)、
(IIIa6)、
(IIIa7)、または
(IIIa8)。
(化合物VII)、またはその塩である。
本明細書に開示した脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、1つ以上のリン脂質、例えば、1つ以上の飽和もしくは(ポリ)不飽和リン脂質、またはそれらの組合せを含むことができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分と、1つ以上の脂肪酸部分を含む。
またはその塩であり、式中:
それぞれのR1は、独立して、任意に置換したアルキルである;または任意に、2個のR1は、間にある原子と一緒になって結合して、任意に置換した単環式カルボシクリルもしくは任意に置換した単環式ヘテロシクリルを形成している;または任意に、3個のR1は、間にある原子と一緒になって結合して、任意に置換した二環式カルボシクリルまたは任意に置換した二環式ヘテロシクリルを形成している;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である;
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である;
Aは、式:
である;
L2のそれぞれの例は、独立して、結合または任意に置換したC1−6アルキレンであり、任意に置換したC1−6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置換している;
R2のそれぞれの例は、独立して、任意に置換したC1−30アルキル、任意に置換したC1−30アルケニル、または任意に置換したC1−30アルキニルである;任意に、R2の1つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、−NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、−C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、−S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換している;
RNのそれぞれの例は、独立して、水素、任意に置換したアルキル、または窒素保護基である;
環Bは、任意に置換したカルボシクリル、任意に置換したヘテロシクリル、任意に置換したアリール、または任意に置換したヘテロアリールである;
pは、1または2である;
ただし、当該化合物は、式:
の化合物ではないことを条件とし、
ここで、R2のそれぞれの例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾リン脂質ヘッド(例えば、修飾コリン基)を含む。ある特定の実施形態では、修飾ヘッドを有するリン脂質は、修飾4級アミンを有するDSPC、またはそのアナログである。例えば、式(IV)の実施形態では、R1のうちの少なくとも1つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、R1のうちの少なくとも1つは、水素またはメチルではない。ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、以下の式のうちの1つの化合物:
またはその塩であり、式中:
それぞれのtは、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である;
それぞれのuは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である;及び
それぞれのvは、独立して、1、2、または3である。
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、修飾尾部を有するDSPC、またはそのアナログである。本明細書に記載する「修飾尾部」とは、より短い、またはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、1つ以上のメチレンが環式もしくはヘテロ原子基により置き換えられている脂肪族鎖、またはそれらのあらゆる組合せを有する尾部のことを指し得る。例えば、ある特定の実施形態では、(IV)の化合物は、式(IV−a)の化合物、またはその塩であり、式中、R2の少なくとも一例は、任意に置換したC1−30アルキルであるR2のそれぞれの例であり、R2の1つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、−S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換する。
またはその塩であり、式中:
それぞれのxは、独立して、0及び30を含む0〜30の整数である;及び
Gのそれぞれの例は、独立して、任意に置換しているカルボシクリレン、任意に置換しているヘテロシクリレン、任意に置換しているアリーレン、任意に置換しているヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、−NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、−C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、−S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oからなる群から選択する。それぞれの可能性は、別個の本発明の実施形態を表す。
のうちの1つの化合物、またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明で有用である、または潜在的に有用である可能性のあるリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に結合するアルキル鎖がエチレンではない(例えば、nは、2ではない)修飾ホスホコリン部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、リン脂質が有用である。
本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上の構造脂質を含むことができる。本明細書で使用する用語「構造脂質」とは、ステロール、さらに、ステロール部分を含有する脂質のことを指す。
本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含むことができる。
またはその塩を提供しており;式中:
R3は、−OROである;
ROは、水素、任意に置換したアルキル、または酸素保護基である;
rは、1及び100を含む、1〜100の整数である;
L1は、任意に置換したC1〜10アルキレンであり、その際、任意に置換したC1−10アルキレンのうちの少なくとも1つのメチレンは、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、−OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で置換する;
Dは、クリックケミストリーにより得られる部分、または生理的条件下で切断可能な部分である;
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である;
Aは、式:
である;
L2のそれぞれの例は、独立して、結合または任意に置換したC1−6アルキレンであり、その際、任意に置換したC1−6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、−NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置換する;
R2のそれぞれの例は、独立して、任意に置換したC1−30アルキル、任意に置換したC1−30アルケニル、または任意に置換したC1−30アルキニルである;任意に、R2の1つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換したカルボシクリレン、任意に置換したヘテロシクリレン、任意に置換したアリーレン、任意に置換したヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、−NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、−C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、−S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換する;
RNのそれぞれの例は、独立して、水素、任意に置換したアルキル、または窒素保護基である;
環Bは、任意に置換したカルボシクリル、任意に置換したヘテロシクリル、任意に置換したアリール、または任意に置換したヘテロアリールである;及び
pは、1または2である。
またはその塩である。
またはその塩を提供しており、式中:
R3は、−OROである;
ROは、水素、任意に置換しているアルキルまたは酸素保護基である;
rは、1及び100を含む、1〜100の整数である;
R5は、任意に置換しているC10−40アルキル、任意に置換しているC10−40アルケニル、または任意に置換している10−40アルキニルであり;及び任意に、R5の1つ以上のメチレン基は、任意に置換しているカルボシクリレン、任意に置換しているヘテロシクリレン、任意に置換しているアリーレン、任意に置換しているヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、−C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、−NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、−S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置換している;
RNのそれぞれの例は、独立して、水素、任意に置換しているアルキル、または窒素保護基である。
(VI−OH)
の化合物、またはその塩である。一実施形態では、rは、1〜100の整数であり、両端の数字を含む。一部の実施形態では、rは、45である。
のイオン性カチオン脂質、DOPEを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式VIIを有する化合物を含むPEG脂質を含む。
本明細書に開示した医薬組成物の脂質組成物は、前出のものに加えて、1つ以上の構成成分を含むことができる。例えば、当該脂質組成物は、1つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤(例えば、界面活性剤)、またはその他の構成成分を含むことができる。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号に記載の分子とすることができる。炭水化物は、単糖(例えば、グルコース)、及び多糖(例えば、グリコーゲン、ならびに、その誘導体及びアナログ)を含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示した医薬組成物を、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤する。したがって、本開示は、(i)本明細書に記載した化合物などの送達剤を含む脂質組成物、及び(ii)UGT1A1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。本開示は、(i)本明細書に記載した化合物などの送達剤を含む脂質組成物、ならびに(ii)UGT1A1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物では、本明細書に開示した脂質組成物は、UGT1A1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入することができる。
a.リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リオプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらのいずれかの組合せを含む。本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させ、及び/またはコードしたタンパク質の翻訳を増加させるので、タンパク質産生を目的とするポリヌクレオチドの有効性を向上させるために使用することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドの安定性を上昇させるために使用することもできる。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、リピドイドと共に製剤することができる。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を調製すると、局所投与経路及び/または全身投与経路を介するリピドイド製剤の注射後に、コードしたタンパク質の産生により判定される、ポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、限定をするものではないが、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含む種々の手段で投与することができる。
一部の実施形態では、注射(例えば、筋肉内注射、または皮下注射)用の本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、及び注射(例えば、筋肉内、または皮下注射)用ヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質障壁の構成成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それにより、組織透過性を増加させる(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427−440)。あるいは、ヒアルロニダーゼを、筋肉内または皮下投与したポリヌクレオチドに曝露した細胞の数を増加させるために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ナノ粒子模倣物内に封入され、及び/またはナノ粒子模倣物に吸収される。ナノ粒子模倣物は、送達機能生体または粒子、例えば、限定をするものではないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、及び細胞を模倣することができる。例として、限定をするものではないが、本明細書に記載したポリヌクレオチドを、ウイルスの送達機能を模倣することができる非ビリオン粒子に封入することができる(例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する国際公開WO2012006376、ならびに、米国特許出願公開第20130171241号、及び同第20130195968号を参照されたい)。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を、送達のための自己組織化ナノ粒子または両親媒性巨大分子(AM)に含む。AMは、アルキル化糖骨格が、ポリ(エチレングリコール)に共有結合した生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液において、AMは、自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第PCT/US2014/027077号に記載されており、AM及びAMを形成する方法は、米国特許出願公開第20130217753号に記載されており、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、ならびに、カチオンまたはアニオン、例えば、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、及びこれらの組合せを含む。例示的な製剤は、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第6,265,389号、及び同第6,555,525号に記載されているように、金属カチオンと複合体を形成したポリマー及びポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態では、カチオンナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組合せを含むことができる。カチオンナノ粒子またはカチオンナノ粒子を含む1つ以上のデポ剤でのポリヌクレオチドの送達は、長時間作用性デポ剤として作用すること、及び/またはヌクレアーゼによる分解の速度を低下させることによって、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを向上させることができる。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質と共に製剤した、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基、及び1つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質、及びアミノ酸脂質を製造する方法の例として、米国特許第8,501,824号に記載されているものがあるが、これに限定されない。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合し、それを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達することができる。例として、本明細書に記載したポリヌクレオチドの放出は、限定をするものではないが、例えば、それぞれの全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第7,098,032号、同第6,897,196号、同第6,426,086号、同第7,138,382号、同第5,563,250号、及び同第5,505,931号に記載されているような酸不安定なリンカーにより提供することができる。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、高分子電解質間複合体に、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが1つ以上のアニオン性分子と複合化するときに形成される。電荷動的ポリマー、及び高分子電解質間複合体、ならびに、高分子電解質間複合体を作り出す方法の例が、全内容を参照により本明細書で援用する米国特許第8,524,368号に記載されているが、これに限定されない。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶性ポリマー系に、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。結晶性ポリマー系は、結晶性部分、及び/または結晶性部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第8,524,259号(その全内容を参照により本明細書で援用する)に記載されている。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、ならびに、天然及び/または合成ポリマーを含む。ポリマーとして、限定をするものではないが、ポリエテン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l−リシン)(PLL)、PLLにグラフトしたPEG、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分枝鎖ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、多元ブロックコポリマー、ポリ[α−(4−アミノブチル)−L−グリコール酸)(PAGA)、生分解性架橋カチオンマルチブロックコポリマー、ポリカルボナート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリラート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−コ−L−リシン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはそれらの組合せがある。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させ、及び/または(例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることにより)ポリヌクレオチドの生体内分布を変更し、及び/またはコードしたタンパク質の翻訳を増加させるペプチド、及び/またはタンパク質(例えば、国際公開WO2012110636及びWO2013123298と共に製剤している、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。一部の実施形態では、当該ペプチドは、米国特許出願公開第20130129726号、同第20130137644号、及び同第20130164219号に記載のものとすることができる。これら参照文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、コンジュゲートとして、担体もしくは標的化基と共有結合している、または融合タンパク質を共に産生する2つのコード領域を含む(例えば、標的化基及び治療的タンパク質もしくはペプチドを持つ)、本明細書に記載したポリヌクレオチド(例えば、UGT1A1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。当該コンジュゲートを、ナノ粒子を、組織もしくは生体内のニューロンに対して選択的に仕向ける、または血液脳関門を横断するうえで役立つペプチドとすることができる。
本開示は、生物学的に活性な薬剤などの反復投与する活性薬剤に対するABCの作用を低下させるための化合物、組成物、及びその使用方法を提供する。自明のことではあるが、投与した活性薬剤に対するABCの作用を全体的に低下させる、または排除することは、その半減期を延ばす、したがって、有効性を効果的に増加させる。
LNPを含む本明細書で提示する種々の化合物及び組成物は、インビボ投与時にABC活性を促進しない。これらのLNPは、多数のアッセイ、例えば、限定をするものではないが、以下に記載した内のいずれか、さらには、実施例の方法のサブセクションを含む実施例セクションに開示したアッセイのいずれかによって、特徴決定、及び/または同定することができる。
本開示で提供する特定の組成物は、B細胞、例えば、B1aまたはB1b細胞(CD19+CD5+)、及び/または従来のB細胞(CD19+CD5−)を活性化しない。B1a細胞、B1b細胞、または従来のB細胞の活性化は、様々な方法で決定することができ、これらの一部を以下に示す。B細胞集団は、分別B細胞集団または脾細胞または末梢血単核細胞(PBMC)の未分画集団として提供し得る。後者の場合、細胞集団を、一定の期間、選択すべきLNPとインキュベーションし、次いで、さらなる分析のために回収し得る。あるいは、上清を、回収及び分析し得る。
B1a細胞、B1b細胞、または従来のB細胞の活性化は、CD86などの後期活性化マーカーを含むB細胞活性化マーカーの発現の増加として実証し得る。例示的なアッセイでは、限定をするものでないが、未分画B細胞は、脾細胞集団として、またはPBMC集団として提供され、特定の期間、選択すべきLNPと共にインキュベーションを行い、次いで、CD19などの標準的なB細胞マーカー、及びCD86などの活性化マーカーについて染色を行い、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析する。適切な陰性コントロールは、培地を用いて同じ集団をインキュベーションすること、次いで、同じ染色及び可視化のステップを実施することを含む。陰性コントロールと比較して、試験集団におけるCD86発現の増加は、B細胞活性化を示す。
B細胞活性化は、サイトカイン放出アッセイでも評価し得る。例えば、活性化は、目的のLNPと共に曝露したときの、IL−6、及び/またはTNF−αなどのサイトカインの産生、及び/または分泌を介して評価し得る。
B細胞へのLNP会合または結合を使用して、目的のLNPを評価し、さらに、そのようなLNPを特徴決定もし得る。会合/結合及び/または取り込み/内在化を、検出可能に標識した、例えば、蛍光標識したLNPを使用して、種々の期間のインキュベーションをした後のB細胞内またはB細胞上でのそのようなLNPの箇所を追跡して評価し得る。
ABCを促進せずに、対象に治療薬などの作用物質を封入することができるLNPを送達するための方法も本明細書で提供する。
本発明は、一部では、LNP投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明をさらに前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性または慢性の別に関係なく、播種性血管内凝固(DIC、別名、消耗性凝固障害)、及び/または血管血栓症を含み得る。一部の事例では、LNPに関連する用量制限毒性は、急性期応答(APR)、または補体活性化関連偽アレルギー(CARPA)である。
本明細書に記載したポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、UGT1A1関連疾患、障害、または状態を、処置及び/または予防するための調製、製造、及び治療用途に使用する。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物、及び製剤は、CN−1を処置、及び/または予防するために使用する。
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物(例えば、齧歯類、霊長類など)、またはヒト対象におけるUGT1A1タンパク質の発現レベル(複数可)の測定、決定、及び/またはモニタリングを特徴とする。動物として、正常な動物、健康な動物、または野生型動物、さらには、CN−1、及びその処置の理解において使用するための動物モデルがある。例示的な動物モデルとして、齧歯類モデル、例えば、ガンラット、及びUGT1A1欠損マウス(別名、UGT1A1−/−マウス)がある。
CN−1患者では、UGT1A1酵素活性は、正常な生理学的活性レベルと比べて減少している。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物(例えば、齧歯類、霊長類など)、またはヒト対象でのUGT1A1タンパク質の活性レベル(複数可)(すなわち、酵素活性レベル(複数可))の測定、決定、及び/またはモニタリングを特徴とする。活性レベルは、生物学的試料での酵素活性レベルを決定するための当該技術分野で認識されているあらゆる方法で、測定または決定することができる。本明細書で使用する用語「活性レベル」、または「酵素活性レベル」とは、好ましくは、試料、または試料内の総タンパク質の体積、質量、または重量当たりの酵素活性のことを意味する。例示的な実施形態では、「活性レベル」、または「酵素活性レベル」とは、流体(例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿など)の1ミリリットル当たりの単位で説明する、または組織の重量当たり、または試料内のタンパク質(例えば、総タンパク質)の重量当たりの単位で説明する。酵素活性の単位(「U」)は、単位時間当たりに加水分解した基質の重量、または質量で表することができる。本発明のある特定の実施形態では、U/血漿ml、またはU/タンパク質(組織)mgで表されるUGT1A1活性を特徴としており、単位(「U」)は、1時間当たりに加水分解する基質のnmol(すなわちnmol/時)を表している。
一部の実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、UGT1A1のバイオマーカー、例えば、ビリルビン、またはビリルビン代謝産物のレベルを下げる。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤を投与すると、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤を投与して短期間の内に、UGT1A1のバイオマーカー、例えば、ビリルビン、またはビリルビン代謝産物の1つ以上のレベルを下げる。
本発明のある特定の態様は、先に開示したポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物、または製剤に関する。
(i)UGT1A1ポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)(例えば、野生型配列、その機能性フラグメント、またはバリアント)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)であって、その際、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾核酸塩基、例えば、N1−メチルシュードウラシル、または5−メトキシウラシルを含み(例えば、ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、N1−メチルシュードウラシル、または5−メトキシウラシルである)、かつ、当該ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miR−142に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR−142−3p、またはmiR−142−5p結合部位)、及び/またはmiR−126に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR−126−3pまたはmiR−126−5p結合部位)をさらに含む、当該ポリヌクレオチド;及び
(ii)送達剤、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物1〜232のいずれか、例えば、化合物II;式(III)、(IV)、(V)、または(VI)を有する化合物、例えば、化合物233〜342のいずれか、例えば、化合物VI;または式(VIII)を有する化合物、例えば、化合物419〜428のいずれか、例えば、化合物I、またはそれらのいずれかの組合せを含む送達剤、を含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物II、化合物VI、その塩もしくは立体異性体、またはそれらのいずれかの組合せを含む脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物II、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、約50:10:38.5:1.5のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物II、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、約47.5:10.5:39.0:3.0のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物VI、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、約50:10:38.5:1.5のモル比で含む。一部の実施形態では、当該送達剤は、化合物VI、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、約47.5:10.5:39.0:3.0のモル比で含む。
上記した本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、治療上有効な結果をもたらすあらゆる経路で投与することができる。これらには、限定をするものではないが、経腸(腸内に)、胃腸内、硬膜外(硬膜内に)、経口(口から)、経皮、硬膜上、大脳内(大脳内に)、脳室内(脳室内に)、経皮(皮膚への適用)、皮内(皮膚自体に)、皮下(皮膚下に)、経鼻投与(鼻を通して)、静脈内(静脈内に)、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内(動脈内に)、筋肉内(筋肉内に)、心臓内(心臓内に)、骨内注入(骨髄内に)、髄腔内(脊髄管内)、腹腔内、(腹膜への注入もしくは注射)、膀胱内注入、硝子体内、(眼を通して)、空洞内注射(病理学的空洞内に)、腔内(陰茎の付け根に)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身分布のためのインタクトな皮膚を通した拡散)、経粘膜(粘膜を通した拡散)、経膣、吹送法(鼻で吸う)、舌下、唇の下、浣腸、点眼(結膜上に)、点耳、耳介(耳の中もしくは耳から)、頬側(頬に向かって)、結膜、皮膚、歯科用(歯(複数可))、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内(軟骨内に)、仙骨内(馬尾内に)、大槽内(脳延髄大槽内に)、角膜内(角膜内に)、歯科内膜、冠動脈内(冠動脈内に)、海綿体内(陰茎の陰核海綿体の拡張可能な空間内の)、椎間板内(椎間板内に)、管内(腺管内に)、十二指腸内(十二指腸内に)、硬膜内(硬膜内もしくは硬膜下に)、表皮内(表皮へ)、食道内(食道へ)、胃内(胃内に)、歯肉内(歯肉内に)、回腸内(小腸の遠位部分内に)、病巣内(局所的な病変内もしくは局所的な病変に直接導入)、管腔内(管の管腔内に)、リンパ腺内(リンパ内に)、髄内(骨の髄腔内に)、髄膜内(髄膜内に)、眼内(眼内に)、卵巣内(卵巣内に)、心膜内(心膜内に)、胸膜腔内(胸膜内に)、前立腺内(前立腺内に)、肺内(肺もしくはその気管支内に)、副鼻腔内(鼻洞もしくは眼窩洞内に)、脊髄内(脊柱内に)、滑液嚢内(関節の滑液腔内に)、腱内(腱内に)、精巣内(精巣内に)髄腔内(脳脊髄軸の任意のレベルで脳脊髄液内に)、胸腔内(胸郭内に)、尿細管内(器官の尿細管内に)、鼓室内(中耳内に)、血管内(血管(複数可)内に)、脳室内(脳室内に)、イオントフォレーゼ(可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流により)、潅注(開いた創傷もしくは体腔を浸し、もしくは洗浄する)、喉頭(喉頭に直接)、経鼻胃(鼻を通して、胃に)、閉塞性包帯技術(領域を閉塞する包帯剤で覆われる局所経路投与)、眼内(外眼部へ)、口咽頭(口及び咽頭に直接)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜上、神経周囲、歯根膜、経直腸、呼吸器(局所的もしくは全身的効果のために経口的もしくは鼻的に吸入することにより気道内に)、眼球後(脳橋の後ろ、もしくは眼球の後ろ)、心筋内(心筋に入る)、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所用、経胎盤(胎盤を通して、もしくは、胎盤を越えて)、経気管(気管の壁を通して)、経鼓室(鼓室を越えて、もしくは、通して)、尿管(尿管への)、尿道(尿道への)、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレシス、または脊髄がある。特定の実施形態では、組成物を、それらが、血液脳関門、血管関門、またはその他の上皮性関門を越えることができるように投与することができる。一部の実施形態では、投与経路のための製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含むことができる。
a.キット
本発明は、本発明の特許請求するヌクレオチドを、都合よく、及び/または効果的に使用するための様々なキットを提供する。一般的には、キットは、使用者が、対象(複数可)に複数の処置を実施し、及び/または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量、及び/または数の構成成分を含む。
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことができるデバイスを提供する。これらのデバイスは、ヒト患者など、それを必要とする対象に直ちに送達するために利用可能な製剤でポリヌクレオチドを合成する試薬を、安定的な剤形で含有する。
カテーテルとルーメンを使用する方法、及びデバイスは、本発明のポリヌクレオチドを、単回投与、複数回投与、または分割投与スケジュールで投与するために用いることができる。そのような方法、及びデバイスは、国際出願公開WO2013151666に記載されており、その全内容を参照により本明細書で援用する。
電流を利用する方法、及びデバイスは、本明細書で教示した単回投与、複数回投与、または分割投与レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。そのような方法、及びデバイスは、国際出願公開WO2013151666に記載されており、その全内容を参照により本明細書で援用する。
本開示の理解を容易ならしめるために、特定の用語をまず定義する。本出願で使用する場合、本明細書に特に断りがない限り、以下の用語は、それぞれ、下記の意味を有するものとする。さらなる定義を、本出願の全体にわたって記載する。
本明細書、及び特許請求の範囲を通じて数値と関連して使用する用語「約」とは、当業者によく知られており、認められている精度の間隔を示す。そのような精度の間隔は、±10%である。
本明細書中で使用する用語「組み合わせて投与する」または「組合せ投与」とは、2つ以上の作用物質を、同時に、または患者においてそれぞれの作用物質の効果の重複が認められる間隔の範囲内で、対象に対して投与することを意味する。一部の実施形態では、それらは、互いに約60、30、15、10、5、または1分以内に投与する。一部の実施形態では、作用物質の投与は、コンビナトリアル(例えば、相乗的)効果を達成するように、互いに十分に接近して配置する。
用語「アミノ酸置換」は、親配列または参照配列(例えば、野生型UGT1A1配列)に存在するアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸は、親配列または参照配列(例えば、野生型UGT1A1ポリペプチド配列)内で、例えば、化学的ペプチド合成、または当該技術分野で公知の組換え法により置換することができる。したがって、「位置Xでの置換」とは、X位に存在するアミノ酸を、代替アミノ酸残基で置換することを指す。一部の態様では、置換パターンは、スキーマAnYに従って記載することができ、Aは、n位に天然に存在する、または元から存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Yは、置換アミノ酸残基である。その他の態様では、置換パターンは、スキーマAn(YZ)に従って記載することができ、Aは、X位に天然に存在する、または元から存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字コードであり、Y及びZは、代替置換アミノ酸残基である。
本明細書で使用する用語「動物」は、動物界のあらゆるメンバーのことを指す。一部の実施形態では、「動物」は、あらゆる発生期のヒトのことを指す。一部の実施形態では、「動物」は、あらゆる発生期の非ヒト動物のことを指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ)である。一部の実施形態では、動物として、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び虫があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作した動物、またはクローンである。
本明細書で使用する場合、目的とする1つ以上の値に付する用語「ほぼ」とは、記載した参照値に類似する値のことを指す。ある特定の実施形態では、用語「ほぼ」とは、特に断りのない限り、または別途文脈から明らかでない限り(そのような数が可能な値の100%を超える場合を除き)、記載した参照値のいずれかの(より大きい、またはより小さい)方向に、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ未満の範囲に入る値のことを指す。
疾患に対して本明細書で使用する用語「関連する」とは、問題の症状、測定値、特徴、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行に関連することを意味する。関連は、原因として疾患と関連する可能性はあるが、関連がある必要はない。例えば、症状、後遺症、またはCN−1の患者の生活の質の減少を引き起こすあらゆる作用は、CN−1と関連すると考えられており、本発明の一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することにより、処置、改善、または予防することができる。
本明細書で使用する用語「二機能性」とは、少なくとも2つの機能の能力がある、または維持するあらゆる物質、分子、または部分のことを指す。機能は、同じ結果または異なる結果に影響を与える可能性がある。機能をもたらす構造は、同じまたは異なる可能性がある。例えば、本発明の二機能性修飾RNAは、UGT1A1ペプチドをコードすることができる(第1機能)が、コード化RNAを含むヌクレオシドは、それ自体として、RNAの半減期を延長することが可能である(第2機能)。この例では、二機能性修飾RNAを、タンパク質欠乏症に罹患している対象に送達すると、疾患または状態を改善または処置することができるペプチドまたはタンパク質分子を産生するだけでなく、長い期間にわたって対象に存在する集団修飾RNAも維持する。その他の態様では、二機能性修飾mRNAは、例えば、UGT1A1ペプチドをコードするRNA(第1の機能)、及び第1のタンパク質に融合する、または第1のタンパク質と同時発現する第2のタンパク質を含むキメラ分子とすることができる。
本明細書で使用する用語「生体適合性」とは、免疫系による傷害、毒性、または拒絶のリスクを殆ど、乃至は、全く有さない生細胞、組織、器官、または系と適合することを意味する。
本明細書で使用する用語「生分解性」とは、生物の作用による無害な産物への分解が可能であることを意味する。
本明細書で使用する語句「生物学的に活性な」とは、生物学的系、及び/または生体内で活性を有するあらゆる物質の特徴のことを指す。例えば、生体に投与した場合に、その生体に生物学的影響を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部でも生物学的活性である、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると考えることができる。
本明細書で使用する「キメラ」とは、2つ以上の不調和または異種の部分または領域を有する実体のことである。例えば、キメラ分子は、UGT1A1ポリペプチドを含む第1の部分、及び第2の治療用タンパク質を含む(例えば、第1の部分と遺伝子融合した)第2の部分(例えば、別個の酵素活性を有するタンパク質、抗原結合部分、またはUGT1A1の血漿中半減期を延長することが可能な部分、例えば、抗体のFc領域)を含むことができる。
用語「配列最適化」とは、参照核酸配列内の核酸塩基が代替核酸塩基で置換されて、特性の向上、例えば、タンパク質発現が向上した、または免疫原性が減少した核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスのことを指す。
配列最適化の文脈での用語「コドン置換(substitution)」または「コドン置換(replacement)」とは、参照核酸配列に存在するコドンを、別のコドンで置換することを指す。コドンは、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該技術分野で公知の組換え方法により、参照核酸配列にて置換することができる。したがって、核酸配列(例えば、mRNA)での特定の箇所での、または核酸配列(例えば、mRNA)のある特定の領域もしくは部分配列内での「置換(substitution)」または「置換(replacement)」とは、そのような箇所または領域でのコドンの代替コドンによる置換のことを指す。
本明細書で使用する用語「化合物」とは、示した構造のすべての立体異性体及び同位体を含むことを意味する。本明細書で使用する用語「立体異性体」とは、化合物のあらゆる幾何異性体(例えば、シス及びトランス異性体)、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体的に純粋な(例えば、幾何学的に純粋な、エナンチオマー的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な)形態を含む、本明細書に記載した化合物のありとあらゆる立体異性体、ならびに、エナンチオマー、及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を含む。化合物のエナンチオマー、及び立体的混合物、ならびに、それらを、構成成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段は、周知である。「同位体」は、細胞核内の異なる数の中性子の結果として生じる、原子番号が同じであるが、質量数が異なる原子のことを指す。例えば、水素の同位体は、三重水素及び重水素を含む。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、ルーチン的な方法により溶媒和物及び水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製することができる。
本明細書で使用する用語「接触する」とは、2つ以上の実体間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞を、ナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳動物細胞、及びナノ粒子が物理的接続を共有させられることを意味する。インビボ及びエクスビボの両方で、細胞を、外部実体と接触させる方法は、生物学的技術分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物と、哺乳動物体内の哺乳動物細胞との接触は、種々の投与経路(例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下)で実施することができ、種々の量のナノ粒子組成物を関係させることができる。さらに、2つ以上の哺乳動物細胞を、ナノ粒子組成物と接触させることができる。
「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列内のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することである。塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、またはグルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン)、ベータ−分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン)を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において規定されている。したがって、ポリペプチドでのアミノ酸を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置換する場合、そのアミノ酸置換は、保存的であると考えられる。別の態様では、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序、及び/または組成が異なる構造的に類似したストリングで保存的に置換することができる。
非保存的アミノ酸置換は、(i)正電荷側鎖(例えば、Arg、His、もしくは、Lys)を有する残基が、負電荷残基(例えば、Glu、もしくは、Asp)と置換され、もしくは、これにより、置換され、(ii)親水性残基(例えば、Ser、もしくは、Thr)が、疎水性残基(例えば、Ala、Leu、Ile、Phe、もしくは、Val)と置換され、もしくは、これにより置換され、(iii)システイン、もしくは、プロリンが、その他のあらゆる残基と置換され、もしくは、これにより置換され、または(iv)嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖(例えば、Val、His、Ile、もしくは、Trp)を有する残基が、より小さい側鎖を有するもの(例えば、Ala、もしくは、Ser)、もしくは、側鎖を有さないもの(例えば、Gly)と置換され、もしくは、これにより置換するものを含む。
本明細書で使用する用語「保存した」とは、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列において、比較する2つ以上の配列の同じ位置で改変されていないヌクレオチドまたはアミノ酸残基のそれぞれのことを指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸とは、配列のその他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも、関連している配列の間において保存がされているヌクレオチドまたはアミノ酸のことである。
本明細書で使用する用語「徐放」とは、治療成績を達成する放出のある特定のパターンに適合する医薬組成物または化合物放出プロファイルのことを指す。
本明細書で使用する用語「環状」とは、連続ループの存在のことを指す。環状分子は、サブユニットが破壊されていない鎖を形成するために、環状である必要はなく、単に結合する。本発明の操作したRNAまたはmRNAなどの環状分子は、単一単位もしくは多量体である、または複合体もしくは高次構造の1つ以上の構成成分を含むことができる。
本明細書で使用する「細胞傷害性」とは、細胞(例えば、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞))、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを、死滅させること、または有害な、有毒な、もしくは、致命的な影響を引き起こすことを指す。
本明細書で使用する用語「送達する」とは、実体を行き先に提供することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを対象に送達することは、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を、対象に対して(例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路により)投与する、ことを含むことができる。ナノ粒子組成物の哺乳動物または哺乳動物細胞への投与は、1つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを含むことができる。
本明細書で使用する「送達剤」とは、ポリヌクレオチドの標的細胞へのインビボ、インビトロ、またはエクスビボ送達を、少なくとも部分的に促すあらゆる物質のことを指す。
本明細書で使用する用語「不安定な(destable)」、「不安定化する」、または「不安定化領域」とは、同じ領域または分子の出発分子、野生型分子、または天然形態分子よりも、安定性の低い領域または分子を意味する。
本明細書で使用する用語「ジアステレオマー」とは、互いの鏡像でなく、かつ、互いに重ね合わせることができない立体異性体のことを意味する。
本明細書で使用する用語「消化」とは、より小さなフラグメントまたは構成成分に分裂することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質の場合、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
本明細書で使用する用語「遠位」とは、中心から離れて、または目的の点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
本明細書で使用する用語「ドメイン」とは、ポリペプチドに言及する場合、1つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性(例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の部位として作用する結合能力)を有するポリペプチドのモチーフのことを指す。
本明細書で使用する「投与レジメン(dosing regimen)」または「投与レジメン(dosing regimen)」は、投与スケジュール、または医師が決定した処置、予防、または対症ケアのレジメンのことである。
本明細書で使用する薬剤の「有効量」という用語は、有益な結果、または所望の結果、例えば、臨床結果を達成するのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用する文脈によって定まる。例えば、タンパク質異常(例えば、UGT1A1異常)を処置する作用物質を投与する状況において、作用物質の有効量は、作用物質を投与しない場合に認められた症状の重症度と比較して、例えば、UGT1A1異常に関連する症状を改善、減少、排除、または予防するのに十分なUGT1A1を発現するmRNAの量である。用語「有効量」とは、「有効用量」、「治療的有効量」、または「治療有効用量」と互換的に使用することができる。
本明細書で使用する用語「エナンチオマー」とは、少なくとも80%(すなわち、1つのエナンチオマーが少なくとも90%、その他のエナンチオマーが多くとも10%)、少なくとも90%、または少なくとも98%の(当該技術分野で標準的な方法により決定する)光学純度またはエナンチオマー過剰を有する本発明の化合物のそれぞれ個々の光学活性形態を意味する。
本明細書で使用する用語「封入」とは、閉じ込めること、取り囲むこと、または内包することを意味する。
本明細書で使用する「封入効率」とは、ナノ粒子組成物の調製に使用するポリヌクレオチドの初期総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量のことを指す。例えば、組成物に最初に提供した合計100mgのポリヌクレオチドのうちの97mgのポリヌクレオチドが、ナノ粒子組成物に封入する場合、封入効率は97%として与えることができる。本明細書で使用する「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な閉じ込め、拘束、取り囲み、または内包を指すことができる。
本明細書で使用する「コードしたタンパク質切断シグナル」とは、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列のことを指す。
本明細書で使用する場合、構造的または化学的に関係なく、出発点、野生型、または天然分子から変化する特徴または性質を有するように設計すれば、本発明の実施形態を「操作した」ことになる。
本明細書で使用する用語「増強した送達」とは、ポリヌクレオチドのコントロールナノ粒子による目的の標的組織(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)への送達のレベルと比較して、より多く(例えば、少なくとも1.5倍多く、少なくとも2倍多く、少なくとも3倍多く、少なくとも4倍多く、少なくとも5倍多く、少なくとも6倍多く、少なくとも7倍多く、少なくとも8倍多く、少なくとも9倍多く、少なくとも10倍多く)のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織(例えば、哺乳動物の肝臓)への送達のことを意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織中で産生したタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織でのポリヌクレオチドの量を該組織の重量と比較すること、組織中で産生したタンパク質の量を当該組織での総タンパク質の量と比較すること、または組織でのポリヌクレオチド量を、当該組織での総ポリヌクレオチドの量と比較することで、測定することができる。ナノ粒子の標的組織への送達の増強は、処置する対象において決定する必要はなく、それは、動物モデル(例えば、ラットモデル)などの代用物で決定することができる、ことを理解されたい。
本明細書で使用する「エキソソーム」とは、哺乳動物細胞が分泌するベシクル、またはRNA分解に関与する複合体のことである。
本明細書で使用する核酸配列の「発現」とは、以下のイベント:(1)(例えば、転写による)mRNA鋳型のDNA配列からの生成;(2)(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、及び/または3’末端プロセシングによる)mRNA転写のプロセシング;(3)mRNAのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳;及び(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの1つ以上のことを指す。
本明細書で使用する用語「エクスビボ」とは、生体(例えば、動物、植物、もしくは、微生物、またはその細胞、もしくは、組織)の外側で発生するイベントのことを指す。エクスビボイベントは、天然(例えば、インビボ)環境から最小限に変更した環境で行うことができる。
本明細書で使用する「特徴」とは、特徴、特性、または特有の要素のことを指す。ポリペプチドの場合、「特徴」は、分子の異なるアミノ酸配列に基づく構成成分として定義する。本発明のポリヌクレオチドがコードしたポリペプチドの特徴は、表面症状発現、局所立体配座形状、フォールディング、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらのあらゆる組合せを含む。
本明細書で使用する「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、ならびに、担体、賦形剤、及び送達剤のうちの1つ以上を含む。
本明細書で使用する「フラグメント」は、部分を指す。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離した全長タンパク質を消化して得られるポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、フラグメントは、N末端、及び/またはC末端、及び/または内部の部分配列が欠失している全長タンパク質(例えば、UGT1A1)の部分配列である。本発明の一部の好ましい態様では、本発明のタンパク質のフラグメントは、機能性フラグメントである。
本明細書で使用する「機能性」生物学的分子とは、特徴となる特性、及び/または活性を示す形態の生物学的分子である。したがって、本発明のポリヌクレオチドの機能性フラグメントは、機能性UGT1A1フラグメントを発現することが可能なポリヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、UGT1A1の機能性フラグメントは、野生型UGT1A1のフラグメント(すなわち、天然に生じるそのアイソフォームのいずれかのフラグメント)、またはその変異体もしくはバリアントのことを指し、そのフラグメントは、対応する全長タンパク質の生物学的活性の少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%を保持する。
本明細書で使用する用語「UGT1A1関連疾患」、または「UGT1A1関連障害」とは、それぞれ、異常なUGT1A1活性(例えば、活性の低下、または活性の増加)に起因する疾患、または障害のことを指す。CN−1は、UGT1A1関連疾患であるが、これに限定されない。数多くのCN−1の臨床的バリアントが、当該技術分野で公知である。例えば、www.omim.org/entry/2l8800を参照されたい。UGT1A1関連疾患のその他の例として、II型クリグラー−ナジャー症候群(例えば、www.omim.org/entry/606785を参照されたい)、ジルベール症候群(例えば、www.omim.org/entry/l43500を参照されたい)、及び一過性家族性新生児高ビリルビン血症(www.omim.org/entry/237900を参照されたい)があるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「ヘルパー脂質」とは、(脂質層、例えば、脂質二重層に挿入するための)脂質部分、及び(脂質層の表面での生理学的溶液との相互作用のための)極性部分を含む化合物または分子のことを指す。一般的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、例えば、アミノ脂質を「補完」して二重層の融合性を増加させること、及び/または例えば、細胞に送達した核酸のエンドソーム脱出を促すことである。ヘルパー脂質は、LNPの表面の重要な構造構成成分であるとも考えられている。
本明細書で使用する用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子、及び/またはRNA分子)間、及び/またはポリペプチド分子間の全体的な相関性のことを指す。一般に、用語「相同性」とは、2つの分子間の進化的関係を意味する。したがって、相同である2つの分子は、共通の進化的先祖を有する。本発明の文脈では、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を含む。
本明細書で使用する用語「同一性」とは、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子、及び/またはRNA分子)間、及び/またはポリペプチド分子間の全体的なモノマーの保存のことを指す。2つのポリヌクレオチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、最適な比較のために2つの配列をアラインする(例えば、最適なアラインメントのために、ギャップを第1及び第2の核酸配列のうちの一方または両方に導入することができ、同一でない配列は、比較のために無視してよい)ことで、実施することができる。ある特定の実施形態では、比較のためにアラインした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第1の配列での位置が、第2の配列での対応する位置と同じヌクレオチドにより占有する場合、分子は、その位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有する同一位置の数の関数であり、その際、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップ数、及びそれぞれのギャップ長さを考慮に入れる。配列の比較、及び2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。DNA及びRNAを比較する場合、チミン(T)及びウラシル(U)は、同等と考えることができる。
用語「免疫応答」とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、ならびに、当該細胞または肝臓が産生する可溶性巨大分子(抗体、サイトカイン、及び補体を含む)の作用であって、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的な損傷、破壊、または身体からの排除をもたらす作用のことを指す。一部の事例では、脂質構成成分、及び封入した治療薬を含むナノ粒子の投与は、(i)封入した治療薬(例えば、mRNA)、(ii)そのような封入した治療薬(例えば、mRNAがコードしたポリペプチド)の発現産物、(iii)ナノ粒子の脂質構成成分、または(iv)それらの組合せが引き起こすことができる免疫応答を誘発することができる。
「炎症性応答」は、特異的及び非特異的な防御系を含む免疫応答のことを指す。特定の防御系反応は、抗原に対する特異的な免疫系反応である。特異的防御系反応の例として、抗体応答がある。非特異的防御系反応は、免疫記憶が一般的に不可能な白血球、例えば、マクロファージ、好酸球、及び好中球が媒介する炎症応答である。一部の態様では、免疫応答は、炎症性サイトカインの分泌を含み、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす。
用語「炎症性サイトカイン」とは、炎症応答において上昇するサイトカインのことを指す。炎症性サイトカインの例として、インターロイキン−6(IL−6)、CXCL1(ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド1;別名、GROα、インターフェロンγ(IFNγ)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターフェロンγ誘導性タンパク質10(IP−10)、または顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)がある。炎症性サイトカインの用語には、当該技術分野で公知の炎症性応答と関連するその他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−8(IL−8)、インターロイキン−12(IL−12)、インターロイキン−13(IL−13)、インターフェロンα(IFN−α)なども含まれる。
本明細書で使用する用語「インビトロ」とは、生体(例えば、動物、植物、または微生物)内の代わりに、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などで生じるイベントのことを指す。
本明細書で使用する用語「インビボ」とは、生体(例えば、動物、植物、もしくは、微生物、またはその細胞もしくは組織)内で発生するイベントのことを指す。
ポリペプチドに言及する場合の「挿入バリアント」は、天然配列または出発配列での特定の位置のアミノ酸に対して、直接に隣接して挿入した1つ以上のアミノ酸を有する。アミノ酸に「直接に隣接する」は、アミノ酸のアルファ−カルボキシ、またはアルファ−アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。ポリペプチドに言及する場合の「欠失バリアント」は、天然または出発アミノ酸配列での1つ以上のアミノ酸を除去したものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域で1つ以上のアミノ酸が欠失している。
本明細書で使用する用語「インタクト」は、ポリペプチドの文脈では、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異させない、または置換しないことを意味する。逆に、用語「インタクト」は、核酸との関連では、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持すること、例えば、野生型核酸塩基を変異させない、または置換しないことを意味する。
用語「イオン性アミノ脂質」は、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖、及びpH滴定可能なアミノヘッド基(例えば、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノヘッド基)を有する脂質を含む。イオン性アミノ脂質は、一般的には、アミノヘッド基のpKa未満のpHでプロトン化され(すなわち、正に荷電し)、pKaを上回るpHで、実質的に荷電していない。そのようなイオン性アミノ脂質として、限定をするものではないが、DLin−MC3−DMA(MC3)、及び(13Z,165Z)−N,N−ジメチル−3−ノニドコサ−13−16−ジエン−1−アミン(L608)がある。
本明細書で使用する用語「単離した」とは、(天然または実験的設定に関係なく)関連した構成成分の少なくともいくつかから分離されている物質または実体のことを指す。単離した物質(例えば、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド)は、それらが単離されている物質に関して、様々なレベルの純度を有することができる。単離した物質、及び/または実体は、最初に関連したその他の構成成分の少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、またはそれ以上から分離することができる。一部の実施形態では、単離した物質は、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%を超える、または約99%を超える純度である。本明細書で使用する場合、その他の構成成分を実質的に含まない場合、その物質は、「純粋」である。
「実質的に単離した」は、化合物を形成または検出した環境から実質的に分離することを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の化合物を豊富に含む組成物を含むことができる。実質的な分離は、本開示の化合物またはその塩の少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97重量%、または少なくとも約99重量%を含有する組成物を含むことができる。
本明細書で使用する用語「異性体」とは、本発明のあらゆる化合物でのあらゆる互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーのことを意味する。本発明の化合物は、1つ以上のキラル中心、及び/または二重結合を有することができ、したがって、二重結合異性体(すなわち、幾何E/Z異性体)などの立体異性体、あるいは、ジアステレオマー(例えば、エナンチオマー(すなわち、(+)もしくは(−))、またはシス/トランス異性体)としての存在が認められる。本発明によれば、本明細書に記載した化学構造、したがって、本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、つまり、立体的に純粋な(例えば、幾何学的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な)形態と、エナンチオマー及び立体異性体の混合物、例えば、ラセミ体との両方を含む。本発明の化合物のエナンチオマー混合物、及び立体異性体混合物は、一般的に、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体として化合物を結晶化すること、またはキラル溶媒中で化合物を結晶化することで、それらの構成成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分離させることができる。エナンチオマー、及び立体異性体は、周知の不斉合成法によって、立体異性または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。
本明細書で使用する「リンカー」は、原子の群、例えば、10〜1,000の原子のことを指し、限定をするものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子または基からなることができる。リンカーは、第1の末端で、核酸塩基または糖部分での修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、第2の末端で、ペイロード、例えば、検出可能な作用物質または治療薬に、結合させることができる。リンカーは、核酸配列への取り込みを阻害しない程度に十分な長さとすることができる。リンカーは、あらゆる有用な目的、例えば、(例えば、2つ以上のキメラポリヌクレオチド分子、またはIVTポリヌクレオチドの結合により)ポリヌクレオチド多量体、またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するために、かつ、本明細書に記載したように、ペイロードを投与するために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例として、限定をするものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルがあり、これらは、それぞれ、本明細書に記載したように、任意に置換することができる。リンカーの例として、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール(例えば、エチレン、またはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール)、及びデキストランポリマー、ならびに、その誘導体があるが、これらに限定されない。その他の例として、限定をするものではないが、還元剤または光分解を使用して切断することができる、例えば、ジスルフィド結合(−S−S−)、またはアゾ結合(−N=N−)などのリンカー内の切断可能な部分がある。選択的に切断が可能な結合の例として、例えば、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、もしくは、その他の還元剤の使用、及び/または光分解により切断できるアミド結合、ならびに、例えば、酸性または塩基性の加水分解により切断できるエステル結合があるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「投与方法」として、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または組成物を対象に送達するその他の方法がある。投与方法は、身体の特異的領域または系に標的送達するために(例えば、特異的に送達するために)、選択することができる。
本明細書で使用する「修飾した」は、本発明の分子の変化した状態または構造のことを指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む、多くの方式で修飾することができる。一部の実施形態では、本発明のmRNA分子は、非天然ヌクレオシド、及び/またはヌクレオチドの導入により修飾されており、例えば、それが天然リボヌクレオチドA、U、G、及びCに関連するような場合である。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、A、C、G、Uリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾した」とはみなされない。
本明細書で使用する「粘液」は、粘性であり、かつ、ムチン糖タンパク質を含む天然物質のことを指す。
本明細書で使用する「ナノ粒子組成物」は、1つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、一般的には、マイクロメートル台以下の大きさであり、脂質二重層を含むことができる。ナノ粒子組成物として、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム(例えば、脂質ベシクル)、及びリポプレックスがある。例えば、ナノ粒子組成物を、500nm以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームとすることができる。
本明細書で使用する「天然に生じる」は、人工的な援助なしに、天然に存在することを意味する
本明細書で使用する「非ヒト脊椎動物」として、野生種、及び家畜種を含む、ホモサピエンスを除くすべての脊椎動物がある。非ヒト脊椎動物の例として、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤール、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、及びヤクがあるが、これらに限定されない。
用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」は、互換的に使用されるものであり、連続した核酸配列のことを指す。配列は、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAのいずれか、例えば、mRNAとすることができる。
本明細書で使用する「オフターゲット」は、任意の1つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない作用のことを指す。
本明細書で使用する「オープンリーディングフレーム」または「ORF」とは、所与のリーディングフレームに終止コドンを付与していない配列のことを指す。
本明細書で使用する語句「作動可能に連結した」とは、2つ以上の分子、コンストラクト、転写物、実体、部分などの間の機能性結合のことを指す。
本明細書では、「任意に置換したX」(例えば、任意に置換したアルキル)という形態の語句は、「X(式中、Xは任意に置換している)」(例えば、「アルキル(式中、当該アルキルは、任意に置換している)」と同等であるものとする。特徴「X」(例えば、アルキル)自体が任意にあることを意味するものではない。
本明細書で使用するポリヌクレオチドの「一部」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長よりも短いポリヌクレオチドのあらゆる部分として定義する。
本明細書で使用する「患者」は、処置を望む、もしくは、処置を必要とする可能性がある、処置を必要とする、処置を受けている、処置を受けることになっている対象、または特定の疾患もしくは状態のための、訓練を受けた専門家によるケアの下にある対象のことを指す。一部の実施形態では、急性疾患を発症するリスクを予防、または減少させる処置を必要としており、必ず必要としており、または施しており、すなわち、それは、予防的処置である。
語句「医薬として許容可能な」は、適切な医学的判断の範囲内にあり、合理的な利益/リスク比に見合う、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題、もしくは、合併症を招かない、ヒト及び動物の組織との接触での使用に適した化合物、材料、組成物、及び/または剤形を指すために、本明細書で使用している。
本明細書で使用する語句「医薬として許容可能な賦形剤」とは、本明細書に記載した化合物以外のあらゆる成分(例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル)のことを指し、患者に対して実質的に非毒性及び非炎症性の特性を有する。賦形剤として、例えば:付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料(顔料)、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤(希釈剤)、フィルム形成剤、またはコーティング剤、香味料、香料、流動促進剤(流動増進剤)、潤滑剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水があるが、これらに限定されない。例示的な賦形剤として、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(二塩基性)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、プレゼラチン化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミタート、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、及びキシリトールがあるが、これらに限定されない。
本開示は、本明細書に記載した化合物の医薬として許容可能な塩も含む。本明細書で使用する「医薬として許容可能な塩」は、親化合物が、存在する酸または塩基部分を、その塩形態に変換して(例えば、遊離塩基基を、適切な有機酸と反応させて)修飾している開示した化合物の誘導体のことを指す。医薬として許容可能な塩の例として、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などがあるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸、パモ酸塩、ペクチナート(pectinate)、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などがある。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、さらには、非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むアミンカチオンがあるが、これらに限定されない。本開示の医薬として許容可能な塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成する親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の医薬として許容可能な塩は、従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、水中もしくは有機溶媒中、またはその2つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体を使用する。適切な塩のリストは、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl and C.G.Wermuth(eds.),Wiley−VCH,2008,及びBerge et al.,Journal of Pharmaceutical Science,66,1−19(1977)に認めることができ、これら文献の全内容を参照により本明細書で援用する。
本明細書で使用する用語「医薬として許容可能な溶媒和物」とは、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物のことを意味する。適切な溶媒は、投与した投薬量で生理学的に許容する。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿により調製することができる。適切な溶媒の例として、エタノール、水(例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物)、N−メチルピロリジノン(NMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N’−ジメチルアセトアミド(DMAC)、1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン(DMEU)、1,3−ジメチル−3,4,5,6−テトラヒドロ−2−(1H)−ピリミジノン(DMPU)、アセトニトリル(ACN)、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどがある。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称する。
本明細書で使用する「薬物動態学」は、生体に投与する物質の結末の決定に関係する場合、分子または化合物のあらゆる1つ以上の特性のことを指す。薬物動態学は、吸収、分布、代謝、及び排泄の程度、及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは、(A)吸収が、血液循環に入る物質のプロセスであり、(D)分布が、身体の体液及び組織を通した物質の分散または拡散であり、(M)代謝(または生体内変換)が、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、及び(E)排泄(または除去)が、物質の身体からの除去を指す場合、ADMEと一般に称する。稀な事例では、一部の薬物が、体内組織に不可逆的に蓄積する。
本明細書で使用する「物理化学的」は、物理的、及び/または化学的特性を意味しており、またはそれに関連する。
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含む、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーのことを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸(「DNA」)、ならびに、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸(「RNA」)を含む。また、この用語は、例えば、アルキル化、及び/またはキャッピングによる修飾形態のポリヌクレオチド、ならびに、非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」は、(2−デオキシ−D−リボースを含有する)ポリデオキシリボヌクレオチド、スプライシングまたは未スプライシングに関係なく、tRNA、rRNA、hRNA、siRNA、及びmRNAを含む(D−リボースを含有する)ポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドまたはC−グリコシドのであるその他のあらゆるタイプのポリヌクレオチド、ならびに、正常ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸「PNA」)、及びポリモルホリノポリマー、ならびに、その他の合成配列特異的核酸ポリマーを含むが、ただし、ポリマーは、DNA及びRNAに認められるような塩基対合、及び塩基スタッキングを可能にする立体配置の核酸塩基を含有する。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、mRNAを含む。その他の態様では、mRNAは、合成mRNAである。一部の態様では、合成mRNAは、少なくとも1つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、特定のクラスのすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置換している(例えば、本明細書に開示したポリヌクレオチドでのすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、5−メトキシウリジンで置換することができる)。一部の態様では、ポリヌクレオチド(例えば、合成RNA、または合成DNA)は、合成DNAの場合には、天然の核酸塩基、すなわち、A(アデノシン)、G(グアノシン)、C(シチジン)、及びT(チミジン)だけを、または合成RNAの場合には、A、C、G、及びU(ウリジン)だけを含む。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用する。ポリマーは、修飾アミノ酸を含むことができる。この用語は、天然に修飾しているアミノ酸ポリマー、または介入的に修飾しているアミノ酸ポリマー:例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはその他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば、標識構成成分と複合化して修飾しているアミノ酸ポリマーも含む。さらに、例えば、アミノ酸の1つ以上のアナログ(例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、p−アセチルフェニルアラニン、D−アミノ酸、及びクレアチンなど)を含有するポリペプチド、ならびに、当該技術分野で公知のその他の修飾が、この定義に含まれる。
本明細書で使用する用語「ポリペプチドバリアント」とは、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子のことを指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に、置換、欠失、及び/または挿入を有することができる。通常、バリアントは、天然配列または参照配列と、少なくとも約50%の同一性、少なくとも約60%の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約99%の同一性を有する。一部の実施形態では、それらは、天然配列または参照配列と、少なくとも約80%同一、または少なくとも約90%同一である。
本明細書で使用するPUD、すなわち、単位薬物当たりの産物は、体液または組織中で測定するような産物(例えば、ポリペプチド)の総1日用量、通常は、1mg、pg、kgなどの細別した部分として定義しており、通常は、濃度、例えば、pmol/mL、mmol/mLなどで定義され、体液中での測定値で分けられる。
本明細書で使用する用語「予防する」とは、感染、疾患、障害、及び/または状態の発症を、部分的もしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状、特徴、もしくは、臨床症状発現の発症を、部分的にもしくは完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状、特徴、もしくは、症状発現の発症を、部分的もしくは完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害、及び/または状態からの進行を、部分的もしくは完全に遅延させること、及び/または感染、疾患、障害、及び/または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させることを指す。
本明細書で使用する用語「増殖する」とは、成長する、拡大する、または増加する、または急速に成長する、拡大する、または増加する、ことを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有する、ことを意味する。「抗増殖性」とは、増殖特性に対抗する、または反対の特性を有する、ことを意味する。
本明細書で使用する用語「予防的」とは、疾患の拡大を防ぐために使用する治療効果、または一連の効果のことを指す。
本明細書で使用する「予防」は、健康を維持し、疾患の拡大を防ぐための措置のことを指す。「免疫予防」は、疾患の拡大を予防するための能動免疫または受動免疫を生じる措置のことを指す。
本明細書で使用する「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段により、アミノ酸鎖の制御した切断を達成することができる部位のことを指す。
本明細書で使用する「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグを立てる、またはマークする少なくとも1つのアミノ酸のことを指す。
本明細書で使用する用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書で提供するタンパク質、ならびに、そのフラグメント、変異体、バリアント、及び改変体を含む。
本明細書で使用する用語「近位」は、中心、または目的の点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
本明細書で使用するシュードウリジン(Ψ)は、ヌクレオシドウリジンのC−グリコシド異性体のことを指す。「シュードウリジンアナログ」は、シュードウリジンのあらゆる改変体、バリアント、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジンアナログとして、1−カルボキシメチルシュードウリジン、1−プロピニルシュードウリジン、1−タウリノメチルシュードウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−シュードウリジン、1−メチルシュードウリジン(m1Ψ)(N1−メチルシュードウリジンとしても公知である)、1−メチル−4−チオシュードウリジン(m1s4Ψ)、4−チオ−1−メチルシュードウリジン、3−メチル−シュードウリジン(m3Ψ)、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2−チオジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオウリジン、4−メトキシシュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3Ψ)、及び2’−O−メチルシュードウリジン(Ψm)があるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「精製する」、「精製した」、「精製」は、望ましくない構成成分、材料汚染、混合物、または不完全性から実質的に純粋またはクリアにすることを意味する。
用語「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」は、配列最適化することができる出発核酸配列(例えば、RNA、例えば、mRNA配列)のことを指す。一部の実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、そのフラグメントまたはバリアントである。一部の実施形態では、参照核酸配列は、以前に配列最適化した核酸配列である。
一部の態様では、送達のための医薬組成物を、本明細書に開示しており、それらの脂質成分の一部の塩を含む。用語「塩」は、あらゆるアニオン性、及びカチオン性複合体を含む。アニオンの例として、無機、及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩(例えば、ヘミシュウ酸塩)、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「試料」または「生物学的試料」は、その組織、細胞、または構成成分部分(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、及び精液などの体液があるが、これらに限定されない)のサブセットのことを指す。さらに、試料として、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸、及び泌尿生殖路、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、または器官など、完全な生体もしくはその組織、細胞もしくは構成成分部分のサブセット、またはその画分もしくは一部から調製するホモジネート、溶解物、もしくは、抽出物もあるが、これらに限定されない。さらに、試料は、タンパク質または核酸分子などの細胞構成成分を含有することができる、栄養ブロスまたはゲルなどの培地のことを指す。
本明細書で使用する語句「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」は、互換的に使用され、ある特定の細胞小器官、細胞区画、または細胞外排出へのタンパク質の輸送または局在化を導くことができる配列のことを指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチド及びシグナル配列をコードする核酸配列の両方を含む。したがって、核酸の文脈でのシグナル配列への言及は、実際には、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列のことを指す。
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子の間の生化学的関係のことを指す。本明細書で使用する句「細胞表面受容体」は、例えば、シグナルを受信することができる分子と分子の複合体、ならびに、細胞の原形質膜を横断する、そのようなシグナルの伝達を含む。
本明細書で使用する用語「類似性」は、ポリマー分子間の、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子、及び/またはRNA分子)間の、及び/またはポリペプチド分子間の、全体的な関連性を指す。ポリマー分子の相互のパーセント類似性の計算は、パーセント類似性の計算が、当該技術分野で理解するような保存的置換を考慮に入れていることを除いて、パーセント同一性の計算と同じ方法で実施することができる。
本明細書で使用する「単回単位用量」とは、1回の用量で/一度に/単一経路で/単一の接触点、すなわち、単回投与イベントで、投与するあらゆる治療薬の用量である。
本明細書で使用する「分割用量」は、単回単位用量、または総1日用量の2回以上の用量への分割である。
本明細書で使用する用語「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」は、オフターゲットの組織(例えば、哺乳動物の脾臓)と比較して、より多く(例えば、少なくとも1.5倍多く、少なくとも2倍多く、少なくとも3倍多く、少なくとも4倍多く、少なくとも5倍多く、少なくとも6倍多く、少なくとも7倍多く、少なくとも8倍多く、少なくとも9倍多く、少なくとも10倍多く)のポリヌクレオチドのナノ粒子による目的の標的組織(例えば、哺乳動物の肝臓)への送達を意味する。ナノ粒子の特定の組織への送達レベルは、組織内で産生したタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織でのポリヌクレオチドの量を当該組織の重量と比較すること、組織内で産生したタンパク質の量を当該組織での総タンパク質の量と比較すること、または組織でのポリヌクレオチド量を、当該組織での総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。例えば、腎血管の標的化では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達するものと比較して、組織1g当たり、1.5、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、または20倍多いポリヌクレオチドが腎臓に送達する場合に、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳動物の腎臓に特異的に提供する。ナノ粒子が標的組織に特異的に送達する能力は、処置する対象において決定する必要はなく、動物モデル(例えば、ラットモデル)などの代用物で決定することができる、と理解する。
本明細書で使用する「安定性」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離を耐え抜く十分な強さを有し、一部の事例では、有効な治療薬への製剤化が可能な化合物のことを指す。
本明細書で使用する用語「安定化する」、「安定化した」、「安定化した領域」は、安定にさせる、または安定になることを意味する。
本明細書で使用する用語「立体異性体」は、化合物(例えば、本明細書に記載したあらゆる式の化合物)が有することができるすべての可能な異なる異性体形態、及び立体配座形態、特に、基本分子構造のすべての可能な立体化学的、及び立体配座的異性体形態、すべてのジアステレオマー、エナンチオマー、及び/または立体配座異性体のことを指す。本発明の一部の化合物は、異なる互変異性体形態で存在することができ、後者は、すべて本発明の範囲内に含まれる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれるあらゆる対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象として、ヒト、飼育動物、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ;霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー;イヌ科動物、例えば、イヌ及びオオカミ;ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ;ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ;クマ、食用動物、例えば、雌ウシ、ブタ、及びヒツジ;有蹄動物、例えば、シカ、及びキリン;齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどがあるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒト対象である。その他の実施形態では、対象は、ヒト患者である。特定の実施形態では、対象は、処置を必要とするヒト患者である。
本明細書で使用する用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全体、またはほぼ全体の程度(extent)または程度(degree)を示す定性的条件のことを指す。生物学の当業者であれば、生物学的及び化学的特徴があるとしても、完結し、及び/または完全まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが殆どないことを理解する。したがって、用語「実質的に」とは、本明細書では、多くの生物学的及び化学的特徴に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用する。
用量間の時間差に関連して本明細書で使用する場合、この用語は、プラス/マイナス2%を意味する。
本明細書で使用し、かつ、複数の用量に関連する場合、この用語は、2秒以内を意味する。
疾患、障害、及び/または病態に「罹患している」個人が、疾患、障害、及び/または病態であるとの診断を受けている、またはそれらの1つ以上の症状を示していること。
疾患、障害、及び/または病態に「感受性」がある個人が、疾患、障害、及び/または病態であるとの診断を受けておらず、またはそれらの症状を示していないが、疾患、または症状を発症する傾向が見受けられること。一部の実施形態では、疾患、障害、及び/または病態(例えば、CN−1)に対して感受性のある個体は:(1)疾患、障害、及び/または状態の発症に関連する遺伝的変異、(2)疾患、障害、及び/または状態の発症に関連する遺伝的多型、(3)疾患、障害、及び/または状態に関連するタンパク質及び/または核酸の発現及び/または活性の増加及び/または減少、(4)疾患、障害、及び/または状態の発症に関連する習慣及び/または生活様式、(5)疾患、障害、及び/または状態の家族歴、ならびに、(6)疾患、障害、及び/または状態の発症に関連する微生物への曝露及び/または感染のうちの1つ以上で特徴決定することができる。一部の実施形態では、疾患、障害、及び/または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び/または状態を発症する。一部の実施形態では、疾患、障害、及び/または状態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び/または状態を発症しない。
本明細書で使用する用語「持続放出」とは、ある特定の期間にわたる放出速度に適合する医薬組成物または化合物の放出プロファイルのことを指す。
用語「合成」とは、ヒトの手により生成、調製、及び/または製造することを意味する。本発明のポリヌクレオチド、またはその他の分子の合成は、化学的または酵素的に行うことができる。
本明細書で使用する「標的細胞」は、目的の1つ以上のあらゆる細胞のことを指す。細胞は、インビトロで、インビボ、インサイチュ、または生体の組織もしくは器官で認めることができる。生体は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象、または患者とすることができる。
本明細書で使用する「標的組織」とは、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的、及び/または薬理学的効果をもたらす目的の1つ以上のあらゆる組織型のことを指す。目的の標的組織の例として、特定の組織、器官、及びそれらの系または群がある。特定の用途では、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管内(例えば、冠動脈内または大腿内)の血管内皮とすることができる。「オフターゲットの組織」とは、コードしたタンパク質の発現が所望の生物学的、及び/または薬理学的効果をもたらさないあらゆる1つ以上の組織型のことを指す。
本明細書で使用する語句「標的配列」とは、タンパク質、またはポリペプチドの輸送または局在化を導くことができる配列のことを指す。
本明細書で使用する用語、「末端(複数可)」とは、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの末端のことを指す。そのような末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初の部位、または最終の部位だけに限定をするものではなく、末端領域にさらなるアミノ酸を含むことができる。本発明のポリペプチドをベースとする分子は、(遊離アミノ基(NH2)を有するアミノ酸で末端処理した)N末端、及び(遊離カルボキシル基(COOH)を有するアミノ酸で末端処理した)C末端の両方を有することで特徴決定することができる。本発明のタンパク質は、一部の事例では、ジスルフィド結合または非共有結合力によって1つにした、複数のポリペプチド鎖(多量体、オリゴマー)で構成されている。これらのタイプのタンパク質は、複数のN末端と、C末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端を、それらが、場合に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドをベースとする部分で、開始または終了するように修飾することができる。
用語「治療薬」とは、対象に投与する場合、治療的、診断的、及び/または予防的効果を有し、及び/または所望の生物学的、及び/または薬理学的効果を誘発する作用物質のことを指す。例えば、一部の実施形態では、UGT1A1ポリペプチドをコードするmRNAを、治療薬とすることができる。
本明細書で使用する用語「治療的有効量」は、感染、疾患、障害、及び/または状態に罹患している、またはこれらに罹患しやすい対象に投与する場合、感染、疾患、障害、及び/または状態を処置し、これらの症状を改善し、診断し、予防し、及び/またはこれらの発症を遅延させるのに十分である送達すべき薬剤(例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など)の量を意味する。
本明細書で使用する用語「治療上有効な結果」は、感染、疾患、障害、及び/または状態に罹患している、またはこれらに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、及び/または状態を処置し、これらの症状を改善し、診断し、予防し、及び/またはこれらの発症を遅延させるのに十分である結果を意味する。
本明細書で使用する「総1日用量」とは、24時間の期間に与えられる、または処方する量のことである。総1日用量を、単回単位用量または分割用量として投与することができる。
本明細書で使用する用語「転写因子」とは、例えば、転写の活性化または抑制により、DNAのRNAへの転写を制御するDNA結合タンパク質のことを指す。一部の転写因子は、単独で転写の制御を行うが、その他のものは、その他のタンパク質と協調して作用する。一部の転写因子は、特定の条件下で転写を活性化することも、抑制することもできる。一般的に、転写因子は、標的遺伝子の制御領域において特異的標的配列または特異的コンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独で、またはその他の分子との複合体において調節することができる。
本明細書で使用する用語「転写」とは、DNA(例えば、DNA鋳型、または配列)からmRNA(例えば、mRNA配列、または鋳型)を産生する方法のことを指す。
本明細書で使用する「トランスフェクション」は、ポリヌクレオチド(例えば、外因性核酸)の細胞への導入のことを指しており、ポリヌクレオチドがコードしたポリペプチドが発現する(例えば、mRNA)、またはポリペプチドが細胞機能を調節する(例えば、siRNA、miRNA)。本明細書で使用する核酸配列の「発現」は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、及び/またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾のことを指す。トランスフェクションの方法として、化学的方法、物理的処理、及びカチオン脂質または混合物があるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「処置すること」または「処置」または「治療」は、疾患、例えば、CN−1の1つ以上の症状または特徴を、部分的または完全に緩和すること、改善すること、好転させること、軽減すること、これらの発症を遅延させること、これらの進行を阻害すること、これらの重症度を低下させること、及び/またはこれらの発生率を低下させることを指す。例えば、CN−1を「処置すること」は、疾患と関連する症状の減少、患者の寿命延長(生存率の増加)、疾患の重症度の低下、疾患の発症の予防または遅延などを指すことができる。処置は、疾患、障害、及び/または状態に関連する病状を発症するリスクを減少させるために、疾患、障害、及び/または状態の徴候を示していない対象、及び/または疾患、障害、及び/または状態の初期徴候だけを示している対象に投与することができる。
本明細書で使用する「非修飾」は、何らかの方法で変更する前のあらゆる物質、化合物、または分子のことを指す。非修飾は、必ずしも常にではないが、野生型または天然形態の生体分子を指すことができる。分子は、一連の修飾を受けることができ、それにより、それぞれの修飾分子は、その後の修飾のための「非修飾」出発分子として役立てることができる。
ウラシルは、RNAの核酸の4つの核酸塩基のうちの1つであり、これは、文字Uで表す。ウラシルは、β−N1−グリコシド結合を介して、リボース環、またはより具体的には、リボフラノースと結合して、ヌクレオシドウリジンをもたらすることができる。また、ヌクレオシドウリジンは、一般的には、その核酸塩基の1文字コード、すなわち、Uに略記する。したがって、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列でのモノマーがUである場合、そのようなUは、「ウラシル」または「ウリジン」として互換的に称する。
用語「ウリジン含有量」または「ウラシル含有量」は、互換的であり、特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量のことを指す。ウリジン含有量またはウラシル含有量は、絶対値(配列でのウリジンまたはウラシルの総数)、または相対値(核酸配列での核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ)として表することができる。
用語「ウリジン修飾配列」とは、候補核酸配列のウリジン含有量、及び/またはウリジンパターンに対して、異なる全体的または局所的ウリジン含有量(より高い、またはより低いウリジン含有量)を有する、または異なるウリジンパターン(例えば、勾配分布、またはクラスタリング)を有する配列最適化核酸(例えば、合成mRNA配列)のことを指す。本開示の記載内容では、用語「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」は、同等であり、互換性があると考えられる。
本明細書で使用する用語「ウリジン富化」、及び文法上の変形語は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸(例えば、合成mRNA配列)での(絶対値で、またはパーセンテージ値として表す)ウリジン含有量の増加のことを指す。ウリジン富化は、候補核酸配列でのコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換して実施することができる。ウリジン富化は、全体的(すなわち、候補核酸配列の全長に対する)、または局所的(すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する)とすることができる。
本明細書で使用する用語「ウリジン希薄化」、及び文法上の変形語は、対応する候補核酸配列のウリジン含有量に対する配列最適化核酸(例えば、合成mRNA配列)での(絶対値で、またはパーセンテージ値として表す)ウリジン含有量の減少のことを指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列でのコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換して実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的(すなわち、候補核酸配列の全長に対する)、または局所的(すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対する)にすることができる。
本開示で使用するバリアントという用語は、天然バリアント(例えば、多型、アイソフォームなど)と、天然または出発配列(例えば、野生型配列)での少なくとも1つのアミノ酸残基が除去されており、異なるアミノ酸が同じ箇所のその位置に挿入されている人工バリアントとの両方を指す。これらのバリアントは、「置換バリアント」として記載することができる。置換は、分子での1つのアミノ酸だけが置換している単一置換とすることができ、または2つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換している複数置換とすることもできる。アミノ酸を挿入する、または欠失させる場合、得られるバリアントは、それぞれ「挿入バリアント」または「欠失バリアント」である。
本明細書で使用する用語「出発コドン」と互換的に使用する用語「開始コドン」は、リボソームが翻訳するオープンリーディングフレームの第1のコドンを指しており、結合したアデニン−ウラシル−グアニン核酸塩基の三重項からなる。開始コドンは、アデニン(A)、ウラシル(U)、及びグアニン(G)の第1の1文字コードにより示され、大抵の場合は、「AUG」と略記する。天然mRNAは、開始コドンとして、本明細書では「代替開始コドン」と称するAUG以外のコドンを使用し得るが、本明細書に記載したポリヌクレオチドの開始コドンは、AUGコドンを用いる。翻訳開始のプロセスの間に、開始コドンを含む配列は、リボソームにより結合したイニシエーターtRNA(Met−tRNAi Met)のアンチコドンとの相補的塩基対合を介して認識する。オープンリーディングフレームは、2つ以上のAUG開始コドンを含み得るものであり、それらは本明細書では「交代用開始コドン」と称する。
用語「コザック配列」(別名、「コザックコンセンサス配列」)とは、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を増強する翻訳開始エンハンサーエレメントのことを指すものであり、真核生物では、5’UTRに位置する。コザックコンセンサス配列は元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する開始コドン(AUG)周囲の単一変異の作用の解析に従って、配列GCCRCC(配列番号41)として定義した(ここで、R=プリン)(Kozak(1986)Cell 44:283−292)。本明細書に開示したポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体または変更形態を含む(翻訳エンハンサー組成、及びその使用方法の例については、全内容を参照により本明細書で援用する、Andrews et al.付与された米国特許第5,807,707号;全内容を参照により本明細書で援用する、Chernajovsky付与された米国特許第5,723,332号;全内容を参照により本明細書で援用する、Wilson付与された米国特許第5,891,665号を参照されたい)。
本明細書で使用する「修飾した」または「修飾」は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)の組成または構造が変化した状態、またはその変化のことを指す。ポリヌクレオチドを、化学的、構造的、及び/または機能的を含む様々な方式で修飾することができる。例えば、ポリヌクレオチドを、1つ以上のRNAエレメントの組み込みにより構造的に修飾することができ、その際、RNAエレメントは、1つ以上の機能(例えば、翻訳制御活性)を与える配列、及び/またはRNA二次構造(複数可)を含む。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、1つ以上の修飾を含み得る(例えば、1つ以上の化学的、構造的、または機能的修飾を、それらのあらゆる組合せを含めて、含み得る)。
本明細書で使用する用語「核酸塩基」(あるいは、「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」)とは、改良した特性(例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性)を、核酸またはその部分もしくはセグメントに付与する、天然に生じるプリン及びピリミジンのあらゆる誘導体またはアナログを含む、核酸において認められるプリンまたはピリミジン複素環式化合物のことを指す。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが、天然核酸において主に認められる核酸塩基である。当該技術分野で公知である、及び/または本明細書に記載したその他の天然、非天然、及び/または合成核酸塩基を核酸に組み込むことができる。
本明細書で使用する用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基(例えば、プリンまたはピリミジン)、またはその誘導体もしくはアナログ(別名、「核酸塩基」)に共有結合した糖分子(例えば、RNAでのリボース、またはDNAでのデオキシリボース)、またはその誘導体もしくはアナログを含有するが、インターヌクレオシド結合基(例えば、リン酸基)が存在しない化合物のことを指す。本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」は、改良した化学的、及び/または機能的特性(例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性、化学的安定性)を、核酸またはその部分もしくはセグメントに付与するインターヌクレオシド結合基(例えば、リン酸基)、またはあらゆるその誘導体、アナログ、もしくは、変更形態に共有結合したヌクレオシドのことを指す。
本明細書で使用する用語「核酸」とは、その最も広い意味で使用しており、ヌクレオチドのポリマー、またはその誘導体もしくはアナログを含むあらゆる化合物及び/または物質を含む。これらのポリマーは、大抵の場合、「ポリヌクレオチド」と称する。したがって、本明細書で使用する用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、同等であり、互換的に使用する。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとして、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、DNA−RNAハイブリッド、RNAi誘発薬、RNAi薬、siRNA、shRNA、mRNA、修飾mRNA、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA、三重らせん形成を誘発するRNA、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロック核酸(β−D−リボ配置を有するLNA、α−L−リボ配置を有するα−LNA(LNAのジアステレオ異性体)、2’−アミノ官能基化を有する2’−アミノ−LNA、及び2’−アミノ官能基化を有する2’−アミノ−α−LNAを含むLNA)、またはそれらのハイブリッドがあるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「核酸構造」(「ポリヌクレオチド構造」と互換的に用いられる)は、核酸(例えば、mRNA)を構成する結合したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学的構成成分、エレメント、モチーフ、及び/または配列の配置または組織化のことを指す。また、この用語は、核酸の二次元または三次元状態を指す。したがって、用語「RNA構造」とは、RNA分子(例えば、mRNA)を構成する結合したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学的構成成分、エレメント、モチーフ、及び/または配列の配置または編成のことを指し、及び/またはRNA分子の二次元または三次元状態のことを指す。核酸構造を、組織的複雑性の上昇に基づいて、本明細書では、「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と称する4つの組織カテゴリーに、さらに区別することができる。
本明細書で使用する用語「オープンリーディングフレーム」は、「ORF」と略記されるものであって、ポリペプチドをコードするmRNA分子のセグメントまたは領域のことを指す。ORFは、開始コドンから始まって終止コドンで終了する非重複インフレームコドンの連続ストレッチを含み、リボソームが翻訳する。
本明細書で使用する用語「前開始複合体」(あるいは、「43S前開始複合体」;「PIC」と略記する)は、40Sリボソームサブユニット、真核開始ファクター(eIFl、eIFlA、eIF3、eIF5)、及びeIF2−GTP−Met−tRNAi Met三元複合体を含むリボ核タンパク質複合体のことを指し、これは、内因的にmRNA分子の5’キャップに結合することができ、結合した後に、5’UTRのリボソームスキャニングを行うことができる。
本明細書で使用する用語「RNAエレメント」とは、生物学的機能を提供する、及び/または生物学的活性(例えば、翻訳調節活性)を有するRNA分子の一部、フラグメント、またはセグメントのことを指す。本明細書に記載したものなど、1つ以上のRNAエレメントの取り込みによるポリヌクレオチドの修飾は、修飾したポリヌクレオチドに対して1つ以上の望ましい機能特性を提供する。本明細書に記載したようなRNAエレメントは、天然に存在するもの、天然に存在しないもの、合成のもの、操作したもの、またはそれらのあらゆる組合せ、とし得る。例えば、制御活性を与える天然に生じるRNAエレメントとして、ウイルス、原核及び真核生物(例えば、ヒト)のトランスクリプトームを通じて認められるエレメントがある。RNAエレメント、特に、真核mRNA及び翻訳ウイルスRNAは、細胞における多くの機能の媒介に関与していることが示されている。例示的な天然RNAエレメントとして、翻訳開始エレメント(例えば、配列内リボソーム進入部位(IRES)、Kieft et al.,(2001)RNA 7(2):194−206を参照されたい)、翻訳エンハンサーエレメント(例えば、APP mRNA翻訳エンハンサーエレメント、Rogers et al.,(1999)J Biol Chem 274(10):6421−6431を参照されたい)、mRNA安定性エレメント(例えば、AUリッチエレメント(ARE)、Gameau et al.,(2007)Nat Rev Mol Cell Biol 8(2):113−126を参照されたい)、翻訳抑制エレメント(例えば、Blumer et al.,(2002)Meeh Dev 110(1−2):97−112を参照されたい)、タンパク質結合RNAエレメント(例えば、鉄応答エレメント、Selezneva et al.,(2013)J Mol Biol 425(18):3301−3310を参照されたい)、細胞質ポリアデニル化エレメント(Villalba et al.,(2011)Curr Opin Genet Dev 21(4):452−457)、及び触媒RNAエレメント(例えば、リボザイム、Scott et al.,(2009)Biochim Biophys Acta 1789(9−10):634−641を参照されたい)があるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「滞留時間」とは、mRNA分子に沿った別個の位置または箇所での前開始複合体(PIC)またはリボソームの占有時間のことを指す。
本明細書で使用する用語「翻訳制御活性」(「翻訳制御機能」と互換的に用いられる)は、PIC及び/またはリボソームの活性を含む翻訳装置の活性を調節する(例えば、制御する、影響を及ぼす、調節する、変化させる)生物学的機能、機構、またはプロセスのことを指す。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、mRNA翻訳の翻訳忠実性を促進及び/または増強する。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、読み漏らしを減少させる、及び/または阻害する。
当業者であれば、ルーチン的な実験だけを使用して、本明細書に記載した本発明による特定の実施形態に対する数多くの均等物を認識することができる、または確認することができる。本発明の範囲は、当該明細書に限定することは意図しておらず、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載しているとおりである。
コンストラクト配列
「G5」とは、mRNAでのすべてのウラシル(U)を、N1−メチルシュードウラシルで置き換えている、ことを意味する。
「G6」とは、mRNAでのすべてのウラシル(U)を、5−メトキシウラシルで置き換えている、ことを意味する。
キメラポリヌクレオチド合成
A.三リン酸経路
三リン酸化学構造を用いて、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分を接合する、またはライゲートすることができる。この方法により、100ヌクレオチド以下の第1の領域または部分は、5’一リン酸、及び末端の3’desOHまたはブロックしたOHを用いて、化学的に合成することができる。この領域が80ヌクレオチドよりも長い場合、このものは、ライゲーション用の2本鎖として合成することができる。
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作り出することができる。そのようなセグメントとして、以下のものがある:
(a)通常の3’OHを含む、キャップして保護された5’セグメント(SEG.1)
(b)ポリペプチドのコード領域を含むことができ、かつ、正常な3’OHを含む、5’三リン酸セグメント(SEG.2)
(c)コルジセピンを含む、または3’OHを含まない、キメラポリヌクレオチドの3’末端(例えば、テイル)のための5’一リン酸セグメント(SEG.3)。
cDNA生成のためのPCR
cDNAの調製のためのPCR手順は、Kapa Biosystems(Woburn,MA)の2×KAPA HIFI(商標)HotStart Ready Mixを使用して行うことができる。このシステムは、2×KAPA ReadyMix12.5μl;フォワードプライマー(10μM)0.75μl;リバースプライマー(10μM)0.75μl;鋳型cDNA100ng;及び25.0μlに希釈したdH2Oを含む。このPCR反応条件は;95℃で5分間、及び98℃で20秒間、次いで、58℃で15秒間、次いで、72℃で45秒間、次いで、72℃で5分間、次いで、終了まで4℃からなるサイクルを25回行うことができる。
インビトロ転写(IVT)
インビトロ転写反応は、均一に修飾したポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成することができる。そのような均一に修飾したポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含むことができる。インプットヌクレオチド三リン酸(NTP)ミックスは、天然及び非天然のNTPを使用して作り出することができる。
1 鋳型cDNA:1.0μg
2 10×転写緩衝液(400mMのトリス−HCl pH8.0、190mMのMgCl2、50mMのDTT、10mMのスペルミジン):2.0μl
3 特注NTP(各25mM):7.2μl
4 RNアーゼ阻害剤:20U
5 T7 RNAポリメラーゼ:3000U
6 dH2O:最高20.0μl、及び
7 37℃で3時間〜5時間のインキュベーション、を含む。
酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングを、IVT RNA 60μg〜180μg、及びdH2Oを最高72μlを含む混合物を使用して行うことができる。混合物を、65℃で、5分間にわたってインキュベーションして、RNAを変性させ、次いで、直ちに氷に移することができる。
ポリA尾部反応
cDNAがポリTを含んでいなければ、ポリA尾部反応は、最終産物を洗浄する前に実施しなければならない。この反応は、キャップ化IVT RNA(100μl);RNアーゼ阻害剤(20U);10×尾部緩衝剤(0.5M Tris−HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl);20mM ATP(6.0μl);ポリAポリメラーゼ(20U);最高123.5μLのdH2Oを混合することと、37℃で、30分間のインキュベーションをして行うことができる。ポリA尾部が転写物に既に存在する場合、尾部反応をスキップし、AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)(最大500μg)を使用するクリーンアップに直接進むことができる。ポリAポリメラーゼは、一部の事例では、酵母で発現する組換え酵素である。
天然5’キャップ、及び5’キャップアナログ
ポリヌクレオチドの5’キャッピングを、製造業者のプロトコルに従って、5’−グアノシンキャップ構造を生成するために、以下の化学的RNAキャップアナログを使用して、インビトロ転写反応中に付随して完了させることができる:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G[ARCAキャップ];G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G;m7G(5’)ppp(5’)A;m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。修飾RNAの5’−キャッピングは、「Cap0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)を生成するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了させることができる。Cap1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素、及び2’−O−メチルトランスフェラーゼの両方を使用して、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルを生成することができる。Cap2構造を、Cap1構造から生成し、続いて、2’−O メチルトランスフェラーゼを使用して、5’末端から3番目のヌクレオチドを、2’−O−メチル化することができる。Cap3構造を、Cap2構造から生成し、続いて、2’−O−メチルトランスフェラーゼを使用して、5’末端から4番目のヌクレオチドを、2’−O−メチル化することができる。酵素は、組換え供給源に由来するものとすることができる。
キャッピングアッセイ
A.タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、等濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションをした後の6、12、24、及び/または36時間目に、培養培地に分泌されたタンパク質の量を、ELISAでアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力を有するCap構造を有する合成ポリヌクレオチドに対応するであろう。
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動、またはHPLC分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動による単一のまとまったバンドを有するポリヌクレオチドは、複数のバンドまたはストリーキングバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、より高純度の産物に対応する。単一のHPLCピークを有する合成ポリヌクレオチドは、より高純度の産物にも対応する。より高い効率でのキャッピング反応は、より純粋なポリヌクレオチド集団を提供するであろう。
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、複数の濃度で、細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションした後の6、12、24、及び/または36時間目に、培地に分泌されたTNF−アルファ、及びIFN−ベータなどの炎症誘発性サイトカインの量を、ELISAでアッセイすることができる。より高レベルの炎症誘発性サイトカインの培地への分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに対応するであろう。
本明細書で教示したキャップのいずれかを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ処理した後に、LC−MSにより、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップ化ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチド、及びLC−MSで検出可能なキャップ化5’−5−トリホスファートキャップ構造体の混合物をもたらすであろう。LC−MSスペクトルでのキャップ化産物の量は、反応由来の総ポリヌクレオチドのパーセントとして表することができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、LC−MSによると、より多量のキャップ化産物を有するであろう。
修飾RNA、またはRT PCR産物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド(20μlの体積に200〜400ng)、または逆転写PCR産物(200〜400ng)を、ウェルでの非変性1.2%のアガロースE−Gel(Invitrogen,Carlsbad,CA)に加えて、製造業者のプロトコルに従って、12〜15分間にわたって実行することができる。
ナノドロップ修飾RNA定量、及びUVスペクトルデータ
修飾ポリヌクレオチドを含むTE緩衝剤(1μl)を使用して、Nanodrop UV吸光度読み取りを行うことで、化学合成またはインビトロ転写反応でのそれぞれのポリヌクレオチドの収率を定量することができる。
リピドイドを使用した修飾mRNAの製剤
ポリヌクレオチドを、細胞に添加する前に、ポリヌクレオチドを、リピドイドと規定の比で混合することにより、インビトロ実験のために製剤することができる。インビボ製剤は、身体全体での循環を促すために特別な成分の添加を必要とすることができる。これらのリピドイドについて、インビボ研究に適した粒子の形成能力を試験するために、siRNA−リピドイド製剤に使用する標準的な製剤プロセスを、出発点として使用することができる。粒子を形成した後に、ポリヌクレオチドを、添加し、複合体を一体化させることができる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを使用して決定することができる。
タンパク質発現のスクリーニング方法
A.エレクトロスプレーイオン化
対象に対して投与したポリヌクレオチドがコードするタンパク質を含むことができる生物学的試料は、1つ、2つ、3つ、または4つの質量分析計を使用したエレクトロスプレーイオン化(ESI)のための製造業者のプロトコルに従って、調製及び分析することができる。生物学的試料は、タンデムESI質量分析システムを使用して、分析することもできる。
対象に対して投与した1つ以上のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を含むことができる生物学的試料を、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)の製造業者のプロトコルに従って、調製及び分析することができる。
1つ以上のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を含むことができる生物学的試料を、トリプシン酵素で処理して、そこに含まれるタンパク質を消化することができる。得られたペプチドは、液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析(LC/MS/MS)で分析できる。それらのペプチドを、質量分析計で断片化して、コンピューターアルゴリズムを介してタンパク質配列データベースと照合することができる診断パターンを生成できる。消化した試料は、所定のタンパク質の出発物質が1ng以下になるまで希釈することができる。単純なバッファーバックグラウンド(例えば、水、または揮発性塩)を含む生物学的試料は、溶液での直接消化に適している;より複雑なバックグラウンド(例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール)では、試料分析を促すためのさらなるクリーンアップステップが必要である。
UGT1A1をコードするmRNAの合成
UGT1A1ポリペプチドをコードする配列最適化mRNAを、後述する実施例のために調製し、そして、実施例1〜11に記載するようにして合成と、特徴決定を行った。
5’UTR:
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3)
3’UTR:
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号151)
別の例示的なコンストラクトでは、5’UTR、及び3’UTR配列は、それぞれ、配列番号3、及び150である(以下を参照されたい):
5’UTR:
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3)
3’UTR:
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号150)
別の例示的なコンストラクトでは、5’UTR、及び3’UTR配列は、それぞれ、配列番号3、及び178である(以下を参照されたい):
5’UTR:
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3)
3’UTR:
UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号178)
インビトロでの内因性UGT1A1発現の検出
UGT1A1の発現は、マウスとヒトの両方に由来する様々な細胞株で特徴決定している。細胞を、標準的な条件で培養し、そして、細胞抽出物は、細胞を溶解緩衝剤に入れて得ることができる。比較のために、適切なコントロールも準備する。UGT1A1の発現を分析するために、溶解物試料を、試験細胞から調製し、そして、ドデシル硫酸リチウム試料ローディング緩衝剤と混合し、そして、標準的なウエスタンブロット分析に供する。UGT1A1の検出に使用する抗体は、市販の抗UGT1A1抗体である。ロードコントロールの検出に使用する抗体は、抗グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)抗体である。
ヒトUGT1A1変異体及びキメラコンストラクト
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトUGT1A1をコードする連結したヌクレオシドの少なくとも第1の領域を含むことができ、このものは、上記実施例に従って構築、発現、及び特徴決定することができる。同様に、ポリヌクレオチド配列は、増大した活性、または減少した活性を有するヒトUGT1A1の発現を招く1つ以上の変異を含むことができる。さらに、UGT1A1をコードするポリヌクレオチド配列は、キメラ融合タンパク質をコードするコンストラクトの一部とすることができる。
ナノ粒子組成物の製造
A.ナノ粒子組成物の製造
ナノ粒子は、マイクロ流体技術、及び一方にポリヌクレオチド、他方に脂質成分を含む、2つの流体のT字ジャンクションでの混合などの混合プロセスで作り出することができる。
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Ma1vern,Worcestershire,UK)を使用して、ナノ粒子組成物の粒子サイズ、多分散度指数(PDI)、及びゼータ電位を決定することができ、粒子サイズの決定には1×PBS、及びゼータ電位の決定には15mM PBSでのナノ粒子組成物を使用する。
表6.ナノ粒子の例示的な組成
コドン最適化、miRNAを標的としたUGT1A1 mRNAの発現と、インビボでの有効性
コドン最適化の影響と、ヒトUGT1A1をコードする修飾mRNAの3’UTRへのmiRNA−142標的部位の取り込みの影響を評価するために、ヒトUGT1A1をコードするバリアントmRNA(配列番号18、28、及び29(G5化学構造))を、ガンラットに対して投与した。使用したコンストラクトは、次のとおりである。
CN−1モデルラットにおけるヒトUGT1A1 mRNAコンストラクトの複数回投与の効果
CN−1のラットモデルにおけるUGT1A1の複数回投与の効果の持続時間を評価するために、実施例16に記載した実験でのラットに、ヒトUGT1A1をコードする修飾mRNA、またはコントロールとしてPBS、ルシフェラーゼをコードするmRNA、またはラットUGT1A1をコードするmRNAの追加用量を注射した。さらなる注射は、最初の注射の35、49、及び63日後に実施した。36、42、48、50、56、62、及び64日目にラットから採血し、そして、血漿を回収した。採取した血漿での総ビリルビンレベルを、実施例16に記載したようにして決定した。
CN−1モデルラットにおけるポリA、及びポリA/UバリアントヒトUGT1A1 mRNA
ヒトUGT1A1をコードする修飾したmRNAでのポリA、及びポリA/Uトラクトの影響を評価するために、ヒトUGT1A1をコードするバリアントmRNA(配列番号14、15、18〜22、及び29(G5化学構造))をガンラットに投与した。使用するコンストラクトは、次のとおりである:
CN−1モデルラットにおけるヒトUGT1A1 mRNAによる治療と、光線療法による治療との比較
hUGT1A1_002(配列番号18(G5化学構造))の有効性を、CN−1の標準治療と比較するために、ガンラットに対して、毎日、10時間/日の光線療法による治療、または0.2mg/kgのhUGT1A1_002(配列番号18(G5化学構造))の尾静脈を介した単回静脈内への投与のいずれかを行った。mRNAは、脂質ナノ粒子(MC3を含む)で製剤した。コントロールとして、ガンラットに対して、リン酸緩衝生理食塩水の注射を行うか、あるいは、処置を行わなかった。治療して0、1、7、14、21、及び/または28日後に、ラットの採血を行った。血清を回収し、血清に含まれる総ビリルビンレベルを、実施例16に記載したようにして決定した。
Claims (66)
- mRNAを含む医薬組成物であって、前記mRNAは、ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記組成物の、それを必要とするヒト対象に対する、単回静脈内投与での投与が:
(i)肝臓組織でのUGT1A1活性のレベルを、投与した後の少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、または少なくとも21日間は、正常なUGT1A1活性レベルの少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%以内で引き上げる;
(ii)肝臓組織でのUGT1A1活性のレベルを、投与した後の少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、または少なくとも21日間は、1型クリグラー−ナジャー症候群(CN−1)を有するヒト対象でのヒト対象のベースラインUGT1A1活性レベル、または参照UGT1A1活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、または少なくとも50倍に引き上げる:
(iii)ビリルビンの血中、血漿、及び/または血清レベルを、投与した後の少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、または少なくとも21日間は、CN−1を有するヒト対象でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び/または血清レベル、または参照血中、血漿、及び/または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%下げる;
(iv)ビリルビンの血中、血漿、及び/または血清レベルを、投与した後の少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、または少なくとも21日間は、CN−1を有する患者でのヒト対象のビリルビンのベースライン血中、血漿、及び/または血清レベル、または参照血中、血漿、及び/または血清ビリルビンレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、または少なくとも50倍下げる;及び/または
(v)ビリルビンの血中、血漿、及び/または血清レベルを、投与した後の少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、少なくとも20日間、または少なくとも21日間は、CN−1を有する患者において、0.1mg/dL、0.2mg/dL、0.3mg/dL、0.4mg/dL、0.5mg/dL、0.6mg/dL、0.7mg/dL、0.8mg/dL、0.9mg/dL、1.0mg/dL、1.5mg/dL、2.0mg/dL、2.5mg/dL、3.0mg/dL、4.0mg/dL、5.0mg/dL、7.5mg/dL、または10.0mg/dL未満にまで下げる、には十分である、前記医薬組成物。 - 前記UGT1A1ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ORFが、配列番号2、及び5〜12からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、マイクロRNA(miR)結合部位を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNAが、造血系免疫細胞、またはTLR7、及び/またはTLR8を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び/またはケモカインを分泌する細胞で発現する、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−126、miR−142、miR−144、miR−146、miR−150、miR−155、miR−16、miR−2l、miR−223、miR−24、miR−27、miR−26a、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロRNAのためのものである、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR126−3p、miR−142−3p、miR−142−5p、miR−155、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロRNAのためのものである、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−142−3p結合部位である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、前記mRNAの3’UTRに位置する、請求項4〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、3’UTRを含み、前記3’UTRが、配列番号4、111、150、151、175、177、178、195、または196の3’UTR配列と、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%が同一である核酸配列を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、5’UTRを含み、前記5’UTRが、配列番号3、39、193、または194の5’UTR配列と、少なくとも90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%が同一である核酸配列を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、5’末端キャップを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記5’末端キャップが、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、ポリA領域を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ポリA領域が、長さが、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約100個のヌクレオチドである、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記ポリA領域が、長さが、約10〜約200、約20〜約180、約50〜約160、約70〜約140、または約80〜約120個のヌクレオチドである、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル(Ψ)、N1メチルシュードウラシル(m1Ψ)、1−エチルシュードウラシル、2−チオウラシル(s2U)、4’−チオウラシル、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%を、N1−メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している、請求項17または18に記載の医薬組成物。
- 送達剤をさらに含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記送達剤が:
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG−DMG、または化合物I;
(i)化合物II、(ii)DSPC、またはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG−DMG、または化合物I;
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I;または
(i)化合物II、(ii)DSPC、またはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、
を含む脂質ナノ粒子を含む、請求項20に記載の医薬組成物。 - 前記ヒト対象が、1型クリグラー−ナジャー症候群(CN−1)を有する、請求項1〜21のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- (i)5’UTR;
(ii)ヒトウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、前記ORFは、配列番号2、及び5〜12からなる群から選択する核酸配列に対して、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、前記ORF;
(iii)終止コドン;及び
(iv)3’UTR。
を含む、メッセンジャーRNA(mRNA)を含むポリヌクレオチド。 - 前記UGT1A1ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列からなる、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、マイクロRNA(miR)結合部位を含む、請求項23または24に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNAが、造血系免疫細胞、またはTLR7、及び/またはTLR8を発現し、かつ、炎症誘発性サイトカイン、及び/またはケモカインを分泌する細胞で発現する、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−126、miR−142、miR−144、miR−146、miR−150、miR−155、miR−16、miR−2l、miR−223、miR−24、miR−27、miR−26a、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロRNAのためのものである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR126−3p、miR−142−3p、miR−142−5p、miR−155、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択するマイクロRNAのためのものである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−142−3p結合部位である、請求項25に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、前記mRNAの3’UTRに位置する、請求項25〜29のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記3’UTRが、配列番号4、111、150、151、175、177、178、195、または196の3’UTRと、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%が同一である核酸配列を含む、請求項23〜30のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記5’UTRが、配列番号3、39、193、194の5’UTR配列と、少なくとも90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%が同一である核酸配列を含む、請求項23〜31のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、5’末端キャップを含む、請求項23〜32のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記5’末端キャップが、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項33に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、ポリA領域を含む、請求項23〜34のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、長さが、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約100個のヌクレオチドである、請求項35に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、長さが、約10〜約200、約20〜約180、約50〜約160、約70〜約140、または約80〜約120個のヌクレオチドである、請求項35に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項23〜37のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル(Ψ)、N1メチルシュードウラシル(m1Ψ)、1−エチルシュードウラシル、2−チオウラシル(s2U)、4’−チオウラシル、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、請求項38に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%を、N1−メチルシュードウラシルに対して化学的に修飾している、請求項38または39に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号14〜27からなる群から選択する核酸配列を含む、請求項23に記載のポリヌクレオチド。
- (i)5’末端キャップ;
(ii)配列番号3、39、193、または194の核酸配列を含む5’UTR;
(iii)配列番号1のウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、前記ORFは、配列番号2、及び5〜12からなる群から選択する配列を含む、前記ORF;
(iv)配列番号4、111、150、151、175、177、178、195、または196の核酸配列を含む3’UTR;及び
(vi)ポリA領域、
を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含むポリヌクレオチド。 - 前記5’末端キャップが、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、長さが、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90個のヌクレオチド、または長さが、少なくとも約100個のヌクレオチドである、請求項42または43に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、長さが、約10〜約200、約20〜約180、約50〜約160、約70〜約140、または約80〜約120個のヌクレオチドである、請求項42または43に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学的に修飾した核酸塩基、糖、主鎖、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項42〜45のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの化学的に修飾した前記核酸塩基を、シュードウラシル(Ψ)、N1メチルシュードウラシル(m1Ψ)、1−エチルシュードウラシル、2−チオウラシル(s2U)、4’−チオウラシル、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択する、請求項46に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号14〜27からなる群から選択する核酸配列を含む、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 前記5’末端キャップが、Cap1を含み、かつ、前記ポリヌクレオチドのすべてのウラシルが、N1−メチルシュードウラシルである、請求項48に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、長さが、100個のヌクレオチドである、請求項49に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項23〜50のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、送達剤を含む医薬組成物。
- 前記送達剤が:
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG−DMG、または化合物I;
(i)化合物II、(ii)DSPC、またはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG−DMG、または化合物I;
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I;または
(i)化合物II、(ii)DSPC、またはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物I、
を含む脂質ナノ粒子を含む、請求項51に記載の医薬組成物。 - ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)ポリペプチドの発現を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項1〜22、51、及び52のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項23〜50のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
- 1型クリグラー−ナジャー症候群(CN−1)の発症、及び/または進行の治療、予防、または遅延を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項1〜22、51、及び52のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項23〜50のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
- ウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1(UGT1A1)ポリペプチドの活性を高めることを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項1〜22、51、及び52のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項23〜50のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
- ビリルビンレベルを下げることを、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、前記対象に対して、有効量の請求項1〜22、51、及び52のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項23〜50のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを投与する、ことを含む前記方法。
- 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与して24時間後に、前記対象のビリルビンのレベルを、前記対象でのベースラインビリルビンと比較して、少なくとも約100%、少なくとも約90%、少なくとも約80%、少なくとも約70%、少なくとも約60%、少なくとも約50%、少なくとも約40%、少なくとも約30%、少なくとも約20%、または少なくとも約10%下げる、請求項53〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを前記対象に対して投与して24時間後に、前記対象のビリルビンのレベルが、0.1mg/dL未満、0.2mg/dL未満、0.3mg/dL未満、0.4mg/dL未満、0.5mg/dL未満、0.6mg/dL未満、0.7mg/dL未満、0.8mg/dL未満、0.9mg/dL未満、1.0mg/dL未満、1.5mg/dL未満、2.0mg/dL未満、2.5mg/dL未満、3.0mg/dL未満、4.0mg/dL未満、5.0mg/dL未満、7.5mg/dL未満、または10.0mg/dL未満である、請求項56に記載の方法。
- 前記ビリルビンのレベルが、前記対象の血中で減少する、請求項56〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ビリルビンが、総ビリルビンである、請求項56〜59のいずれか1項に記載の方法。
- ビリルビンのレベルの低下が、前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを投与してから少なくとも24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、96時間、120時間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、または21日間持続する、請求項56〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを前記対象に対して投与して24時間後に、前記対象のUGT1A1活性が、正常な個人のUGT1A1活性の、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、少なくとも500%、または少なくとも600%に増加する、請求項53〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記UGT1A1活性が、前記対象の心臓、肝臓、脳、または骨格筋で高まる、請求項62に記載の方法。
- 高まった前記UGT1A1活性が、前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを対象に対して投与してから少なくとも24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、96時間、120時間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、または21日間持続する、請求項62または63に記載の方法。
- 前記対象に対する前記投与が、週に約1回、2週間に約1回、または月に約1回である、請求項53〜64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物、またはポリヌクレオチドを、静脈内投与する、請求項53〜65のいずれか1項に記載の方法。
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