MX2007016561A

MX2007016561A - Materiales y metodos para la generacion de transcriptos de acido nucleico completamente modificados en la posicion 2.

Info

Publication number: MX2007016561A
Application number: MX2007016561A
Authority: MX
Inventors: John L Diener; Kristin Thompson; Sharon T Cload; Chunhua Wang; Anthony Dominic Keefe
Original assignee: Archemix Corp
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2008-03-10
Also published as: US20070117112A1; BRPI0611701A2; JP2009504139A; IL188206A0; WO2007005645A3; CN101495504A; RU2008103346A; WO2007005645A2; CA2613442C; AU2006265896B2; CA2613442A1; EP1907590B1; EP1907590A4; JP5015923B2; KR20080025181A; EP1907590A2; AU2006265896A1; US8105813B2

Abstract

Se proporcionan materiales y metodos para producir agentes terapeuticos de aptameros que tienen trifosfatos del nucleotido completamente modificados incorporados en su secuencia.

Description

MATERIALES Y MÉTODOS PARA LA GENERACIÓN DE TRANSCRIPTOS DE ÁCIDO NUCLEICO COMPLETAMENTE MODIFICADOS EN LA POSICIÓN 2' REFERENCIA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud de patente no provisional reclama la prioridad bajo 35 U.S.C. §119 (e) de la siguiente solicitud provisional: Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Número de Serie 60/696,292, presentada en junio 30 del 2005, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. La invención se relaciona generalmente con el campo de los ácidos nucleicos y más particularmente con los aptámeros .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con materiales y métodos para transcribir ácidos nucleicos, particularmente enzimas modificadas y materiales y métodos para utilizar las enzimas modificadas en la polimerización dirigida a la plantilla para incrementar la incorporación de los nucleótidos modificados en los ácidos nucleicos, particularmente aptámeros. Además, la invención se relaciona con métodos y materiales para seleccionar las secuencias del componente de la plantilla de transcripción y el uso de tales secuencias del componente para mejorar el rendimiento del transcripto, particularmente para mejorar el rendimiento del transcripto durante el método SELEX .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un aptámero, por definición, es una molécula de ácido nucleico que se une con alta especificidad y afinidad a algún objetivo, tal como una proteína, a través de interacciones diferentes al apareamiento de las bases de Watson-Crick. Aunque los aptámeros son moléculas basadas en ácidos nucleicos, existe una diferencia fundamental entre los aptámeros y otras moléculas de ácidos nucleicos, tales como los genes y el ARNm. En el último, la estructura del ácido nucleico codifica la información a través de su secuencia lineal de la base y por lo tanto, esta secuencia es de importancia para la función del almacenamiento de la información. En completo contraste, la función del aptámero, que se basa en la unión específica de una molécula objetivo, no depende de una secuencia lineal de la base conservada, sino de una estructura secundaria/terciaria particular. Esto es, los aptámeros son secuencias no codificantes. Cualquier potencial codificante que un aptámero pueda poseer es enteramente fortuito y no juega ningún papel en la unión de un aptámero a su objetivo cognado. Así, aunque puede ser que los aptámeros que se unen al mismo objetivo, e incluso al mismo sitio en ese objetivo, compartan una secuencia lineal de base similar, la mayoría no lo hace. Los aptámeros deben también diferenciarse de las secuencias de ácidos nucleicos naturales que se unen a ciertas proteínas. Estas últimas secuencias son secuencias naturales incluidas adentro del genoma del organismo, que se unen a un subgrupo especializado de proteínas que está involucrado en la transcripción, traducción y transporte de los ácidos nucleicos naturales, es decir, proteínas que se unen al ácido nucleico. Por otra parte, los aptámeros son moléculas de ácidos nucleicos cortas aisladas no naturales. Aunque los aptámeros pueden identificarse como que se unen a las proteínas que se unen al ácido nucleico, en la mayoría de los casos, tales aptámeros tienen poca o ninguna identidad de la secuencia con las secuencias reconocidas por las proteínas que se unen al ácido nucleico en la naturaleza. De manera más importante, los aptámeros pueden unirse virtualmente a cualquier proteína (no sólo las proteínas que se unen al ácido nucleico) , así como a casi cualquier objetivo de interés, incluyendo moléculas pequeñas, carbohidratos, péptidos, etc. Para la mayoría de los objetivos, incluso las proteínas, una secuencia de ácido nucleico natural a la cual se une, no existe. Para esos objetivos que tienen tal secuencia, es decir, las proteínas que se unen al ácido nucleico, tales secuencias diferirán de los aptámeros como un resultado de la afinidad de unión relativamente baja utilizada en la naturaleza, en comparación con los aptámeros que se unen estrechamente. Los aptámeros, como los péptidos generados mediante representación del fago o anticuerpos, son capaces de unirse de manera específica a objetivos seleccionados y modular la actividad o las interacciones de unión del objetivo, por ejemplo, a través de la unión, los aptámeros pueden bloquear la capacidad de sus objetivos para funcionar. Como con los anticuerpos, esta propiedad funcional de unión específica a un objetivo es una propiedad inherente. También como con los anticuerpos, aunque la persona con experiencia puede no conocer que características estructurales precisas tendrá un aptámero para un objetivo, la persona con experiencia sabe cómo identificar, hacer y utilizar tal molécula en la ausencia de una definición estructural precisa. Los aptámeros también son análogos a los agentes terapéuticos de molécula pequeña en que un solo cambio estructural, sin embargo, aparentemente menor, puede afectar dramáticamente (por varios órdenes de magnitud) la unión y/u otra actividad (o actividades) del aptámero. Por otra parte, algunos cambios estructurales tendrán poco efecto o no tendrán ninguno. Esto resulta de la importancia de la estructura secundaria/terciaria de los aptámeros. En otras palabras, un aptámero es una estructura tridimensional mantenida en una conformación fija, que proporciona contactos químicos para unirse de manera específica a su objetivo dado. En consecuencia: (1) algunas áreas o secuencias particulares son esenciales como (a) puntos específicos de contacto con el objetivo y/o como (b) secuencias que colocan las moléculas en contacto con el objetivo; (2) algunas áreas o secuencias particulares tienen una gama de variabilidad, por ejemplo, el nucleótido X debe ser una pirimidina, o el nucleótido Y debe ser una purina, o los nucleótidos X y Y deben ser complementarios; y (3) algunas áreas o secuencias particulares pueden ser cualquier cosa, es decir, son esencialmente elementos separadores, por ejemplo, pueden ser cualquier serie de nucleótidos de una longitud dada o incluso un separador que no es de nucleótidos, tal como una molécula de PEG. Descubiertos por un proceso de selección in vi tro de recolecciones de oligonucleótidos de secuencia aleatoria, los aptámeros se han generado para más de 130 proteínas, incluyendo factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas y receptores. Un aptámero típico es de 10-15 kDa de tamaño (20-45 nucleótidos) , se une a su objetivo con afinidad nanomolar a subnanomolar, y discrimina los objetivos relacionados estrechamente (por ejemplo, los aptámeros típicamente no se unirán a otras proteínas de la misma familia génica) . Una serie de estudios estructurales ha mostrado que los aptámeros son capaces de utilizar los mismos tipos de interacciones de unión (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, complementariedades electrostáticas, contactos hidrofóbicos, exclusión estérica) , que accionan la afinidad y la especificidad en los complejos anticuerpo-antígeno. Los aptámeros tienen varias características deseables para utilizarse como agentes terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo alta especificidad y afinidad, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, ofrecen ventajas competitivas específicas con respecto a los anticuerpos y otros compuestos biológicos de la proteína, por ejemplo: 1) Velocidad y control. Los aptámeros son producidos por un proceso totalmente in vi tro, permitiendo la generación rápida de sondas iniciales, incluyendo sondas terapéuticas. La selección in vi tro permite que la especificidad y afinidad del aptámero se controle de manera estrecha y permite la generación de sondas, incluyendo sondas contra los objetivos tóxicos y no inmunogénicos. 2) Toxicidad e Inmunogenicidad. Los aptámeros como una clase, han demostrado una toxicidad terapéuticamente aceptable y falta de inmunogenicidad. Mientras que la eficacia de muchos anticuerpos monoclonales puede limitarse severamente por la respuesta inmune a los anticuerpos mismos, es extremadamente difícil provocar anticuerpos para aptámeros, más probablemente debido a que los aptámeros no pueden presentarse por los linfocitos T vía MHC y la respuesta inmune entrenada generalmente para no reconocer los fragmentos de ácido nucleico. 3) Administración. Mientras que la mayoría de los agentes terapéuticos para anticuerpos aprobados en la actualidad se administran mediante infusión intravenosa (típicamente durante 2-4 horas) , los aptámeros pueden administrarse mediante inyección subcutánea (la biodisponibilidad del aptámero vía la administración subcutánea es >80% en estudios con monos (Tucker et al, J. Chromatography B. 732:203-212, 1999)). Con buena solubilidad (>150 mg/mL) y un peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 10-50 kDa; anticuerpo: 150 kDa) , una dosis semanal de aptámero puede suministrarse mediante inyección en un volumen de menos que 0.5 mL. Además, el pequeño tamaño de los aptámeros les permite penetrar en las áreas de constricciones conformacionales que no permiten que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos penetren, presentando aún otra ventaja de los agentes terapéuticos o la profilaxis basada en aptámeros. 4) Escalabilidad y costo. Los aptámeros terapéuticos son sintetizados químicamente, y en consecuencia pueden escalarse fácilmente conforme se necesite para cumplir la demanda de la producción. Mientras que las dificultades en escalar la producción están limitando actualmente la disponibilidad de algunos compuestos biológicos y el costo capital de una planta de producción de proteína a gran escala es enorme, un solo sintetizador de oligonucleótidos a gran escala puede producir hasta 100 kg/año, y requiere una inversión inicial relativamente modesta. El costo actual de los bienes para la síntesis de los aptámeros a escala de kilogramos, se estima en $500/gramo, en comparación con aquél para los anticuerpos altamente optimizados. Se espera que las mejoras continuas en el desarrollo del proceso disminuyan el costo de los bienes a < $100/gramo en cinco años. 5) Estabilidad. Los aptámeros son químicamente robustos. Estas adaptados intrínsecamente para recuperar la actividad después de la exposición a factores tales como calor y desnaturalizantes, y pueden almacenarse durante periodos extendidos (>1 año) a temperatura ambiente como polvos liofilizados. En contraste, los anticuerpos deben almacenarse refrigerados. Además de la estabilidad intrínseca de los aptámeros, los nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos modificados en la posición 2'), que son baratos, no tóxicos y que pueden incrementar la resistencia a la degradación enzimática, química, térmica y física, pueden incorporarse durante el método SELEX™, como se describió en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/729,851, presentada en diciembre 3 del 2002, y la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/873,856, presentada en junio 21 del 2004. Aunque la incorporación de los nucleótidos modificados durante el proceso SELEX™ es algunas veces preferible la modificación post-SELEX™, debido a la pérdida potencial de afinidad de unión y actividad que puede ocurrir con la selección post-SELEX™, la incorporación de nucleótidos modificados, por ejemplo, nucleótidos 2'-0-metilo ("2-OMe" ) , durante el proceso SELEX™ ha sido históricamente difícil debido a los bajos rendimientos de la transcripción. Las condiciones de la solución y las mezclas de transcripción se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/729,851 presentada en diciembre 3 del 2002, y la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/873,856, presentada en junio 21 del 2004, que proporcionan rendimientos de transcripción mejorados para los aptámeros que incorporan los nucleótidos 2' -OMe. Sin embargo, los rendimientos de transcripción para los aptámeros completamente 2 ' -O-metilados permanecen siendo problemáticos . Además de las ventajas de los aptámeros como un agente terapéutico, dada la naturaleza barata, baja toxicidad y resistencia incrementada a la nucleasa, conferida por la incorporación de los nucleótidos 2' -OMe en los aptámeros, sería benéfico tener materiales y métodos para incrementar los rendimientos del transcripto de los aptámeros completamente 2' -O-metilados, por ejemplo, para prolongar o incrementar la estabilidad de los agentes terapéuticos de aptámeros in vivo . La presente invención proporciona materiales y métodos mejorados para cumplir con éstas y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente se relaciona con las ARN polimerasas T7, que pueden purificarse, aislarse y/o recombinarse. Como se utiliza en la presente, el término aislado abarca las polimerasas de la invención cuando se expresan de manera recombinante en una célula o tejido. Como se utiliza en la presente, el término aislado abarca secuencias de ácidos nucleicos de la invención cuando se diseñan en una célula o tejido. En una modalidad, se proporciona una AR? polimerasa T7 comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y la posición 784, en donde el aminoácido alterado en la posición 639 no es fenilalanina cuando el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina. En otra modalidad, se proporciona una AR? polimerasa T7 descrita anteriormente comprende además un aminoácido alterado en la posición 378. En otra modalidad, se proporcionan las ARN polimerasas T7 descritas anteriormente, que comprenden además un aminoácido alterado en la posición 266. En una modalidad particular el aminoácido alterado en la posición 639 es una leucina y el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina. En una modalidad adicional, el aminoácido alterado en la posición 266 es una leucina. En una modalidad adicional, el aminoácido alterado en la posición 378 es una arginina. En las modalidades preferidas, los aminoácidos alterados incrementan el rendimiento transcripcional de los ácidos nucleicos que comprenden las modificaciones 2' -OMe por la polimerasa en una reacción de transcripción que comprende sólo el trifosfato del nucleótido 2' -OMe. En una modalidad particular, el incremento en el rendimiento de la transcripción es relativo a una ARN polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados cuando la transcripción se lleva a cabo para la AR? polimerasa T7 con el aminoácido alterado y la AR? polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados bajo condiciones de transcripción idénticas. En otra modalidad, los aminoácidos alterados disminuyen la discriminación contra los trifosfatos del nucleótido 2' -OMe. En una modalidad particular, la discriminación disminuida contra los trifosfatos del nucleótidos 2' -OMe es relativa a una ARN polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados cuando ambas polimerasas se utilizan bajo condiciones de transcripción idénticas. En modalidades particulares de este aspecto, la AR? polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados es la AR? polimerasa T7 del tipo silvestre que comprende un aminoácido en la posición 639 alterado a una fenilalanina y un aminoácido en la posición 784 alterado a una alanina o una polimerasa mutante que tiene la secuencia del aminoácido del tipo silvestre, excepto que una fenilalanina se ha sustituido por la tirosina en la posición 639, y una alanina se ha sustituido por la histidina en la posición 784 y un residuo de arginina sustituido por el residuo de lisina en la posición 378 (Y639F/H784A/K378R) . En una modalidad particular, un polipéptido aislado comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID ?O 1, SEQ ID ?O 2, SEQ ID ?O 102 y SEQ ID ?O 103. En una modalidad particular, se proporciona un equipo que comprende un recipiente que contiene una AR? polimerasa T7 de la invención. En algunas modalidades, se proporciona un método para transcribir un ácido nucleico de una sola hebra, que comprende incubar una AR? polimerasa T7 mutante con un ácido nucleico de plantilla bajo condiciones de reacción suficientes para resultar en la transcripción.

En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de la invención. En una modalidad particular, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionad del grupo que consiste de: SEQ ID NO 122, SEQ ID NO 123, SEQ ID NO 124 y SEQ ID NO 125. En algunas modalidades, se proporciona un vector que comprende una secuencia de un ácido nucleico aislado de la invención. En una modalidad particular, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención enlazado de manera operable a un promotor. En otra modalidad de la invención, se proporciona una célula que comprende el vector de expresión de la invención. En una modalidad particular, se proporciona una célula en donde la ARN polimerasa T7 mutante de la invención se expresa por la célula. En algunas modalidades, se proporciona un equipo que comprende un recipiente que contiene un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa T7 de la invención. En otra modalidad, se proporciona un método para transcribir un aminoácido completamente 2' -OMe, que comprende los pasos de a) incubar el ácido nucleico de plantilla en una mezcla de reacción bajo condiciones que comprenden una AR? polimerasa mutante, una plantilla de transcripción del ácido nucleico y trifosfatos del nucleósido, en donde los trifosfatos del nucleósido son 2'- OMe, y b) transcribir la mezcla de reacción de la transcripción para resultar en un ácido nucleico de una sola hebra, en donde todos los nucleótidos de los ácidos nucleicos de una sola hebra están modificados con 2' -OMe, excepto que el primer nucleótido del transcripto puede estar no modificado en la posición 2'. En algunas modalidades, el primer nucleósido del transcripto puede ser 2 '-0H guanosina. En algunas modalidades del método, la ARN polimerasa mutante es una ARN polimerasa T7 mutante que comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y la posición 784, particularmente una ARN polimerasa T7 que comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y en la posición 784, en donde el aminoácido alterado en la posición 639 no es una fenilalanina cuando el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina, particularmente, una AR? polimerasa T7 que comprende además un aminoácido alterado en la posición 378 y/o un aminoácido alterado en la posición 266. En una modalidad particular, el aminoácido alterado en la posición 639 es una leucina y el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina en la polimerasa para utilizarse en los métodos de la invención. En una modalidad adicional, el aminoácido alterado en la posición 266 es una leucina de la polimerasa para utilizarse en los métodos de la invención. En una modalidad adicional, el aminoácido alterado en la posición 378 es una arginina en la polimerasa para utilizarse en los métodos de la invención. En una modalidad particular, se proporciona un polipéptido aislado que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 102 y SEQ ID NO 103. En algunas modalidades del método de la invención, la reacción de transcripción comprende además iones de magnesio. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende además iones de manganeso. En otra modalidad, los iones de magnesio están presentes en la reacción de transcripción a una concentración que es entre 3.0 a 3.5 veces mayor que la de los iones de manganeso. En otra modalidad, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 6.5 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.0 mM. En otra modalidad, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.5 mM, la concentración de iones de magnesio es 8 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.5 mM. En otra modalidad, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 2.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 9.5 mM y la concentración de iones de manganeso es 3.0 mM. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende además un residuo que no es de trifosfato ni de 2' -OMe guanosina, particularmente en donde el residuo que no es de trifosfato ni de 2 '-OMe guanosina se selecciona del grupo que consiste de: monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina, monofosfato de 2 '-fluoro guanosina, difosfato de 2' -fluoro guanosina, monofosfato de 2' -amino guanosina, difosfato de 2' -amino guanosina, monofosfato de 2' -desoxi guanosina y difosfato de 2' -desoxi guanosina. En otra modalidad, la plantilla de transcripción comprende un promotor de la ARN polimerasa T7. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende además polietilenglicol. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende pirofosfatasa inorgánica. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar aptámeros. En una modalidad, se proporciona un método para identificar un aptámero, que comprende: a) preparar una mezcla de reacción de la transcripción que comprende una polimerasa mutante de la invención, y una o más plantillas de transcripción del ácido nucleico, b) transcribir la mezcla de reacción de la transcripción para resultar en una mezcla candidata de ácidos nucleicos de una sola hebra, en donde todos, menos opcionalmente uno de los nucleótidos de los ácidos nucleicos de una sola hebra están modificados en la posición 2', c) poner en contacto la mezcla candidata con la molécula objetivo, d) dividir los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por la molécula objetivo, con relación a una afinidad de la mezcla candidata, de la mezcla candidata, y e) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad incrementada para proporcionar una mezcla enriquecida de aptámeros, por lo que se identifican los aptámeros para la molécula objetivo que comprenden todos los nucleótidos modificados en la posición 2', excepto que el primer nucleótido de los aptámeros pueden no estar modificado en la posición 2'. En algunas modalidades, el paso de amplificación f) comprende (i) opcionalmente, disociar los ácidos nucleicos con afinidad incrementada del objetivo, ii) transcribir de manera inversa los ácidos nucleicos con afinidad incrementada disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo, iii) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad incrementada transcritos de manera inversa; y (ii) preparar una mezcla de reacción de la transcripción, que comprende los ácidos nucleicos con afinidad incrementada transcritos de manera inversa amplificados como la plantilla de transcripción y transcribir la mezcla de transcripción. En algunas modalidades del método de identificación del aptámero de la invención, la ARN polimerasa mutante es una ARN polimerasa T7 mutante que comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y la posición 784, particularmente una AR? polimerasa T7 que comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y la posición 784, en donde el aminoácido alterado en la posición 639 no es una fenilalanina, cuando el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina, particularmente, una AR? polimerasa T7 que comprende además un aminoácido alterado en la posición 378 y/o un aminoácido alterado en la posición 266. En una modalidad particular, el aminoácido alterado en la posición 639 es una leucina y el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina en la polimerasa para utilizarse en los métodos de la invención. En una modalidad adicional, el aminoácido alterado en la posición 266 es una leucina de la polimerasa para utilizarse en los métodos de la invención. En una modalidad adicional, el aminoácido alterado en la posición 378 es una arginina en la polimerasa para utilizarse en los métodos de la invención. En una modalidad particular, un polipéptido aislado que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID ?O 1, SEQ ID ?O 2, SEQ ID ?O 102 y SEQ ID ?O 103 se utiliza en el método de identificación del aptámero de la invención. En algunas modalidades, todos los trifosfatos del nucleótido en la reacción de transcripción están modificados con 2' -OMe. En una modalidad, una o más plantillas de transcripción del ácido nucleico comprende un promotor de la ARN polimerasa T7 y una secuencia líder inmediatamente a 3', un promotor de la ARN polimerasa T7. En algunas modalidades de este aspecto, el método comprende repetir los pasos a) a e) de manera iterativa. En algunas modalidades del método de identificación del aptámero de la invención, la reacción de transcripción comprende además iones de magnesio. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende además iones de manganeso. En otra modalidad, los iones de magnesio están presentes en la reacción de transcripción a una concentración que es entre 3.0 a 3.5 veces mayor que los iones de manganeso. En otra modalidad, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 6.5 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.0 mM. En otra modalidad, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.5 mM, la concentración de iones de magnesio es 8 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.5 mM. En otra modalidad, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 2.0 M, la concentración de iones de magnesio es 9.5 mM y la concentración de iones de manganeso es 3.0 mM. En otra modalidad de este aspecto, la reacción de transcripción para utilizarse en el método de identificación del aptámero de la invención, comprende además un residuo que no es de trifosfato ni de 2' -OMe guanosina, particularmente en donde el residuo que no es de trifosfato ni de 2' -OMe guanosina se selecciona del grupo que consiste de: monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina, monofosfato de 2' fluoro guanosina, difosfato de 2' fluoro guanosina, monofosfato de 2' -amino guanosina, difosfato de 2' -amino guanosina, monofosfato de 2' -desoxi guanosina y difosfato de 2' -desoxi guanosina. En otra modalidad, la plantilla de transcripción comprende un promotor de la ARN polimerasa T7. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende además polietilenglicol. En otra modalidad, la reacción de transcripción comprende pirofosfatasa inorgánica. La presente invención también se relaciona con un método para seleccionar las secuencias del componente de plantillas de ácido nucleico para dirigir la transcripción. En una modalidad, la secuencia del componente mejora el rendimiento del transcripto de la transcripción dirigida a la plantilla. En una modalidad particular, la invención se relaciona con métodos para seleccionar secuencias líderes para mejorar el rendimiento del transcripto y para las secuencias líderes, plantillas de ácido nucleico que comprenden las secuencias líderes y métodos para utilizar las secuencias líderes y las plantillas de ácido nucleico de la invención. La presente invención también se relaciona con novedosas polimerasas mutantes y con su uso en la transcripción, particularmente su uso para mejorar el rendimiento del transcripto, en donde se incorporan nucleótidos modificados en la posición 2', más particularmente, en donde todos los nucleótidos que se incorporan están modificados en la posición 2', por ejemplo, son 2' -OMe. La presente invención también se relaciona con condiciones de reacción de la transcripción modificadas, para mejorar el rendimiento del transcripto. La presente invención se relaciona particularmente con combinaciones apareadas y triples de los aspectos anteriores, particularmente para mejorar el rendimiento del transcripto en donde todos, menos el nucleótido inicial de los transcriptos están modificados en la posición 2', particularmente, modificados con 2' -OMe ("completamente 2'-OMe" o transcriptos "mRmY" o "MNA" ) . En una modalidad del primer aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar una secuencia del componente de la plantilla del ácido nucleico para mejorar la transcripción, que comprende: a) preparar una biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción, en donde las plantillas comprenden un promotor, una primera región fija inmediatamente a 3' para el promotor, una región degenerada inmediatamente a 3' para la primera región fija y una segunda región fija en 3' para la región degenerada; b) transcribir la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción en una reacción de transcripción para proporcionar una biblioteca de transcriptos; c) transcribir de manera inversa la mezcla de transcripción para obtener una mezcla candidata de ADNc, en donde las plantillas de ADNc comprenden un término 5' y 3 ' ; d) ligar una secuencia de ADN que codifica el promotor al término 3' de las plantillas de ADNc en una reacción de ligadura; e) amplificar las plantilla de ADNc para resultar en una biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción; y f) identificar un componente de la secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la transcripción de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción, en donde el componente de la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia derivada de al menos una porción de la región degenerada. En una modalidad de este método de la invención, el paso f) comprende i) clonar la biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción en plantillas de transcripción individuales; ii) transcribir las plantillas de transcripción individuales en una reacción de transcripción para resultar en un rendimiento de los transcriptos; iii) valorar el rendimiento del transcripto de las plantillas de transcripción individuales; y iv) identificar el componente de la secuencia de ácidos nucleicos en una plantilla de transcripción que resulta en un rendimiento del transcripto predeterminado. En una modalidad particular de este método de la invención, el rendimiento del transcripto predeterminado es un rendimiento mayor que el rendimiento del transcripto obtenido en el paso b) al transcribir la mezcla candidata de la plantilla de transcripción. En otra modalidad de este método de la invención, el paso f) comprende analizar la composición de base de la región degenerada de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción e identificar el componente de la secuencia de ácidos nucleicos, basándose en la composición de base promedio de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción. En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el paso b) del método comprende además tratar la mezcla de transcripción transcrita con DNasa. En las modalidades adicionales de este método de la invención, el paso b) comprende además purificar la mezcla de transcripción transcrita dividiendo las plantillas de transcripción transcritas lejos de los otros componentes de la reacción de transcripción. En una modalidad particular de este método de la invención, el paso de purificación comprende reemplazar el amortiguador de la reacción de transcripción corriendo la reacción de transcripción a través de una columna de desalado . En otra modalidad de este aspecto de la invención, el paso d) del método se hace antes del paso c) . En otra modalidad de este aspecto de la invención, el método comprende repetir los pasos b) a e) más de una vez antes de realizar el paso f) . En una modalidad adicional de este aspecto de la invención, la reacción de ligadura es una reacción de ligadura fragmentada y la reacción de ligadura comprende un fragmento de ácido nucleico y un oligonucleótido 5'-monofosforilado que codifica el promotor. En una modalidad particular de este aspecto de la invención, la reacción de transcripción utilizada en el método comprende uno o más trifosfatos del nucleótido modificados y una polimerasa mutada. En algunas modalidades, el trifosfato del nucleótido modificado es un trifosfato del nucleótido modificado en la posición 2', particularmente un trifosfato del nucleótido modificado con 2' -OMe. En algunas modalidades, la polimerasa mutada es una ARN polimerasa T7 mutada. En algunas modalidades, la reacción de transcripción utilizada en el método de la invención comprende iones de magnesio y de manganeso (Mn2+) y la ARN polimerasa T7 mutada se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 100 y SEQ ID NO 101. En algunas modalidades de este aspecto de la invención, los iones de magnesio están presentes en la reacción de transcripción a una concentración que es entre 3.0 a 3.5 veces mayor que la de los iones de manganeso (Mn2+) . En las modalidades adicionales de este aspecto de la invención, cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 6.5 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.0 mM. En las modalidades adicionales de este aspecto de la invención, cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.5 mM, la concentración de iones de magnesio es 8 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.5 mM. En aún otras modalidades de este aspecto de la invención, cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 2.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 9.5 mM y la concentración de iones de manganeso es 3.0 mM. En algunas modalidades del método, la reacción de transcripción comprende además un polialquilenglicol, particularmente polietilenglicol. En algunas modalidades del método, particularmente las modalidades en las cuales se desean transcriptos completamente 2' -OMe, la reacción de transcripción comprende además un residuo de guanosina seleccionado del grupo que consiste de: monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina, monofosfato o difosfato de 2' fluoro guanosina, monofosfato o difosfato de 2' -amino guanosina, monofosfato o difosfato de 2' -desoxi guanosina u otros nucleótidos modificados. En las modalidades adicionales, la reacción de transcripción del método de la invención comprende pirofosfatasa inorgánica. En las modalidades adicionales, la reacción de transcripción del método de la invención comprende opcionalmente una combinación del grupo que consiste de: amortiguador, detergente (por ejemplo, Tritón X-100) , poliamina (por ejemplo, espermina o espermidina) y un agente reductor (por ejemplo, DTT o ßME) . En aún otras modalidades, la reacción de transcripción del método de la invención comprende trifosfatos del nucleótido, iones de magnesio, iones de manganeso (por ejemplo, Mn2+) , polietilenglicol, monofosfato de guanosina, pirofosfatasa inorgánica, amortiguador, detergente, poliamina y DTT, y una o más plantillas de transcripción de los oligonucleótidos y una ARN polimerasa T7, por ejemplo, una ARN polimerasa T7 mutante, por ejemplo, una ARN polimerasa T7 mutante seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO 1, 2, 100 y 101. En algunas modalidades del método de identificación de la invención, la primera región fija de la biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción consiste de 2, 3, 4 ó 5 residuos de guanosina. En algunas modalidades de la invención, la región degenerada de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción comprende al menos 4, 10, 20 ó 30 nucleótidos. En algunas modalidades del método, la secuencia del componente de la plantilla del ácido nucleico a ser identificada es una secuencia líder. En algunas modalidades, la secuencia líder comprende la primera región fija y una secuencia derivada de al menos una porción de la región degenerada de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción. En algunas modalidades, el método de la invención comprende además, incorporar la secuencia líder identificada en una plantilla de transcripción del oligonucleótido. La invención también proporciona secuencias líderes identificadas por el método de identificación de la invención. En algunas modalidades, la secuencia líder de la invención comprende la secuencia de ácidos nucleicos del nucleótido 22 al nucleótido 32 en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO 10 a 99. En algunas modalidades, la secuencia líder de la invención comprende la secuencia de ácidos nucleicos del nucleótido 18 al nucleótido 32, en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO 10-99. La invención también proporciona una plantilla de transcripción del oligonucleótido que comprende una secuencia líder de la invención. En las modalidades particulares, la invención proporciona una plantilla de transcripción del oligonucleótido que se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO 3 a 6 y SEQ ID NO 106. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento del transcripto de un ácido nucleico, en donde la transcripción está dirigida por una plantilla de transcripción del oligonucleótido. En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el método para incrementar el rendimiento del transcripto comprende dirigir la transcripción con una plantilla de transcripción del oligonucleótido, que comprende una secuencia líder, en donde la secuencia líder se ha identificado mediante el método de identificación de la invención, utilizando la misma composición del nucleótido y/o polimerasa y/o condiciones que se utilizan en la reacción de transcripción para la cual se desea la mejora del rendimiento del transcripto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática del proceso de la selección del aptámero in vi tro (SELEX™) de recolecciones de los oligonucleótidos de una secuencia aleatoria. La Figura 2 muestra un diagrama de flujo de un método SELEX™ de la Región Terminal (TR-SELEX™) . La Figura 3 muestra un análisis gráfico de la composición del nucleótido promedio combinada, de las regiones seleccionadas de veinte posiciones degeneradas de una biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción antes (RO) y después (R3) de la selección con TR-SELEX™. La Figura 4 muestra el rendimiento relativo del transcripto, cuantificado del sombreado con UV del análisis PAGE-gel para ARC2118, ARC2119, ARC2120 y ARC2121, utilizando las ARN polimerasas T7 mutantes Y639F/H784A/K378R ("FAR") y Y639L/H784A/K378R ("LAR") con un pico de 2 '-OH GTP en la mezcla de transcripción. El * indica que los rendimientos dados son con relación a ARC2118 transcrita con la polimerasa mutante LAR, que da el rendimiento cuantificado más alto mediante sombreado con UV. La Figura 5A muestra el ácido nucleico (SEQ ID NO 120) y la Figura 5B proporciona la secuencia del aminoácido de la ARN polimerasa T7 del tipo silvestre (SEQ ID NO 121) . La Figura 6A muestra la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO 122) de la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A. La Figura 6B muestra la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO 123) de la polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R. La Figura 6C muestra la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO 124) de la polimerasa T7 mutante P266L/Y639L/H784A. La Figura 6D muestra la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO 125) de la polimerasa T7 mutante P266L/Y639L/H784A/K378R. La Figura 7 muestra el rendimiento relativo del transcripto, cuantificado mediante el sombreado con UV del análisis PAGE-gel para ARC2118 y ARC2119, utilizando la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R con una titulación de rGTP (2' -OH GTP) en la mezcla de transcripción. El * indica que los rendimientos dados son con relación a ARC2118 transcrita con rGTP 20 uM, que proporciona el rendimiento cuantificado más alto mediante sombreado con UV. La Figura 8 muestra el rendimiento relativo del transcripto, cuantificado del sombreado con UV del análisis PAGE-gel para ARC2119, utilizando la AR? polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R con concentraciones variables de 2' -OMe ?TP (A, U, C y G) , MgCl2 y MnCl2 y sin rGTP (2' -OH GTP) en la mezcla de transcripción. Los rendimientos dados son con relación a condiciones de transcripción 1 mM de cada uno de 2 '-OMe NTP, MgCl2 6.5 mM y MnCl2 2 mM. La Figura 9 es una tabla que muestra un análisis de las inserciones, supresiones y sustituciones del nucleótido de la transcripción completamente 2' -OMe (100% de 2' -OMe A, U, C, G) con la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R, en comparación con la fidelidad de toda la transcripción del ARN o 2' -OMe, utilizando la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/K378R. En la tabla, (1) indica los datos de "Direct in Vitro Selection of a 2'-0-Methyl Aptamer to VEGF" Burmeister et . al., (2005) Chemistry and Biology, 12:25-33, en donde las transcripciones se hicieron con la polimerasa T7 mutante FAR y (2) indica que la transcripción se hizo con la polimerasa T7 mutante LAR. La Figura 10 es una tabla que muestra un análisis del por ciento de la composición del nucleótido de los transcriptos completamente 2' -OMe (100% de 2' -OMe A, T, C, G) antes y después de una ronda de transcripción completamente 2' -OMe utilizando la AR? polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R, seguido por el tratamiento con D?asa, transcripción inversa, ligadura fragmentada y amplificación con PCR. La Figura 11 es un esquema de un aptámero anti-lgE M?A minimizado, mostrado en la dirección 5' a 3', que tiene una corona en su extremo 3' (esfera de color negro) . La Figura 12 es un esquema del aptámero anti-lgE MNA minimizado, el aptámero anti-lgE MNA minimizado tiene dos sustituciones desoxi y el aptámero anti-lgE MNA minimizado tiene una sustitución desoxi y sustituciones de fosforotioato, cada uno mostrado en la dirección 5' a 3' y cada uno tiene una corona en su extremo 3' (esfera de color negro) . La Figura 13 es una ilustración que describe varias estrategias de PEGilación que representan la mono-PEGilación estándar, PEGilación múltiple y la dimerización vía la PEGilación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en la descripción acompañante siguiente. Aunque cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes de la descripción. En la especificación, las formas en singular también incluyen el plural, a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. En el caso de conflicto, la presente invención tendrá el control.

EL MÉTODO SELEX™ El método preferido para generar un aptámero es con el proceso titulado "Evolución Sistemática de Ligandos Mediante Enriquecimiento Exponencial" ("SELEX™") descrito generalmente en la Figura 1 y también referido como la selección in vi tro . El proceso SELEX™ es un método para la evolución in vi tro de moléculas de ácido nucleico con una unión altamente específica a moléculas objetivo y se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, presentada en junio 11 de 1990, ahora abandonada, la Patente de los Estados Unidos No. 5,475,096, titulada "Ligandos de Ácidos Nucleicos", y la Patente de los Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también la WO 91/19813), titulada "Ligandos de Ácidos Nucleicos" . Al realizar ciclos iterativos de selección y amplificación, el SELEX™ puede utilizarse para obtener aptámeros, también referidos en la presente como "ligandos de ácidos nucleicos" con cualquier nivel deseado de afinidad de unión al objetivo.

El proceso SELEX™ se basa en el discernimiento único de que los ácidos nucleicos tienen suficiente capacidad para formar una variedad de estructuras de dos y tres dimensiones y suficiente versatilidad química disponible dentro de sus monómeros para actuar como ligandos (es decir, formar pares de unión específicos) , con virtualmente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como objetivos. El proceso SELEX™ se basa en la capacidad para unirse a un objetivo. Los aptámeros obtenidos a través del procedimiento SELEX™ tendrán así, la propiedad de unirse al objetivo. La mera unión al objetivo, sin embargo, no proporciona información del efecto funcional, si lo hay, que puede ejercerse en el objetivo por la acción de la unión al aptámero. La alteración de una propiedad de la molécula objetivo requiere que el aptámero se una en una cierta ubicación en el objetivo con el fin de efectuar un cambio en una propiedad del objetivo. En teoría, el método SELEX™ puede resultar en la identificación de un gran número de aptámeros, en donde cada aptámero se une a un sitio diferente en el objetivo. En la práctica, las interacciones de unión del aptámero-objetivo ocurren con frecuencia en un número relativamente pequeño de sitios de unión preferidos en el objetivo, que proporcionan interfases estables y estructuralmente accesibles para la interacción. Además, cuando el método SELEX™ se realiza en una molécula objetivo fisiológica, la persona con experiencia generalmente no es capaz de controlar la ubicación del aptámero con respecto al objetivo. En consecuencia, la ubicación del sitio de unión del aptámero en el objetivo puede o no estar en, o cerca de uno de varios sitios de unión potenciales que conducirían al efecto deseado, o puede no tener algún efecto en la molécula objetivo. Incluso en donde se encuentra que un aptámero, en virtud de su capacidad para unirse al objetivo, tiene un efecto, no hay manera de predecir la existencia de ese efecto o de saber de antemano que efecto tendrá. Al realizar un experimento SELEX™, la persona con experiencia puede sólo saber con alguna certeza de que los aptámeros, al grado de que es posible obtener un aptámero contra un objetivo, tendrán la propiedad de unirse al objetivo. Uno puede realizar un experimento SELEX™ con la esperanza de que algunos de los aptámeros identificados también tendrán un efecto en el objetivo, más allá de unirse a éste, pero esto es incierto. El proceso SELEX™ se basa como el punto de inicio en una biblioteca o recolección grande de oligonucleótidos de una sola hebra que comprenden secuencias aleatorizadas. Los oligonucleótidos pueden ser ADN, ARN o híbridos de ADN/ARN modificados o no modificados. En algunos ejemplos, la recolección comprende 100% de oligonucleótidos degenerados o parcialmente degenerados. En otros ejemplos, la recolección comprende oligonucleótidos degenerados o parcialmente degenerados que contienen al menos una secuencia fija y/o una secuencia conservada incorporada dentro de la secuencia aleatorizada. En otros ejemplos, la recolección comprende oligonucleótidos degenerados o parcialmente degenerados que contienen al menos una secuencia fija y/o conservada en su extremo 5' y/o 3' que pueden comprender una secuencia compartida por todas las moléculas de la recolección de oligonucleótidos. Las secuencias fijas son secuencias comunes a los oligonucleótidos en la recolección, que se incorporan para un propósito preseleccionado, tales como motivos CpG descritos adicionalmente a continuación, sitios de hibridación para los cebadores de la PCR, secuencias promotoras para las ARN polimerasas (por ejemplo, T3 , T4 , T7 y SP6) , sitios de restricción o secuencias homopoliméricas, tales como regiones poli A o poli T, núcleos catalíticos, sitios para la unión selectiva a columnas de afinidad y otras secuencias para facilitar la clonación y/o secuenciamiento de un oligonucleótido de interés. Las secuencias conservadas son secuencias diferentes a las secuencias fijas descritas previamente, compartidas por un número de aptámeros que se unen al mismo objetivo. Los oligonucleótidos de la recolección incluyen de manera preferida una porción de la secuencia degenerada, así como secuencias fijas necesarias para una amplificación eficiente. Típicamente, los oligonucleótidos de la recolección inicial contienen secuencias terminales 5' y 3' fijas, que flanquean una región interna de 30-40 nucleótidos aleatorios . Los nucleótidos degenerados pueden producirse de varias maneras, incluyendo síntesis química y selección del tamaño de ácidos nucleicos celulares escindidos de manera aleatoria. La variación de la secuencia en los ácidos nucleicos de prueba también puede introducirse o incrementarse mediante mutagénesis antes o durante las iteraciones de selección/amplificación. La porción de la secuencia degenerada del oligonucleótido puede ser de cualquier longitud y puede comprender ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos, y puede incluir nucleótidos o análogos de nucleótidos modificados o no naturales. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,958,691; la Patente de los Estados Unidos No. 5,660,985; la Patente de los Estados Unidos No. 5,958,691; la Patente de los Estados Unidos No. ,698,687; la Patente de los Estados Unidos No. 5,817,635; la Patente de los Estados Unidos No. 5,672,695, y la Publicación del PCT WO 92/07065. Los oligonucleótidos degenerados pueden sintetizarse a partir de nucleótidos enlazados a fosfodiéster utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Froehler et al, Nucí. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) y Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Los oligonucleótidos aleatorios también pueden sintetizarse utilizando métodos de fase en solución tales como métodos de síntesis de triéster.

Véase, por ejemplo, Sood et al, Nucí. Acid Res. 4:2557 (1977) y Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449 (1978). Las síntesis típicas llevadas a cabo en un equipo de síntesis de ADN automatizado, proporcionaron io16-1017 moléculas individuales, un número suficiente para la mayoría de los experimentos SELEX™. Las regiones suficientemente grandes de la secuencia aleatoria en el diseño de la secuencia incrementan la probabilidad de que cada molécula sintetizada represente probablemente una secuencia única. La biblioteca de inicio de los oligonucleótidos puede generarse mediante síntesis química automática en un sintetizador de ADN. Para sintetizar secuencias aleatorizadas, mezclas de los cuatro nucleótidos se agregan a cada paso de adición del nucleótido durante el proceso de síntesis, permitiendo la incorporación aleatoria de los nucleótidos. Como se indicó anteriormente, en una modalidad, los oligonucleótidos aleatorios comprenden secuencias totalmente degeneradas; sin embargo, en otras modalidades, los oligonucleótidos degenerados pueden comprender tramos de secuencias no aleatorias o parcialmente aleatorias. Las secuencias parcialmente aleatorias pueden crearse agregando los cuatro nucleótidos en diferentes relaciones molares en cada paso de adición. En aquellos casos en donde se utiliza una biblioteca de ARN como la biblioteca de inicio, se genera típicamente sintetizando una biblioteca de ADN, opcionalmente, amplificando mediante PCR, a continuación transcribiendo la biblioteca de ADN in vi tro utilizando la ARN polimerasa T7 o ARN polimerasa T7 modificadas, y purificando la biblioteca transcrita. La biblioteca de AR? o AD? se mezcla a continuación con el objetivo bajo condiciones favorables para la unión y se someten a iteraciones paso a paso de unión, división y amplificación, utilizando el mismo esquema de selección general, para alcanzar virtualmente cualquier criterio deseado de afinidad de unión y selectividad. De manera más específica, iniciando con una mezcla que contiene la recolección inicial de ácidos nucleicos, el método SELEX™ incluye los pasos de: (a) poner en contacto la mezcla con el objetivo bajo condiciones favorables para la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido de manera específica a las moléculas objetivo; (c) opcionalmente disociar los complejos de ácido nucleico-objetivo; (d) amplificar los ácidos nucleicos disociados con los complejos de ácido nucleico-objetivo para proporcionar una mezcla enriquecida con ligando de ácidos nucleicos; y (e) volver a iterar los pasos de unión, división, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee, para proporcionar ligandos de ácido nucleico altamente específicos, de alta afinidad con la molécula objetivo. En aquellos casos en donde los aptámeros de ARN se están seleccionado, el método SELEX™ comprende además los pasos de: (i) invertir la transcripción de los ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo antes de la amplificación en el paso (d) ; y (ii) transcribir los ácidos nucleicos amplificados del paso (d) antes de reiniciar el proceso. Dentro de una mezcla de ácidos nucleicos que contiene un gran número de posibles secuencias y estructuras, existe una amplia gama de afinidades de unión para un objetivo dado. Una mezcla de ácidos nucleicos que comprende, por ejemplo, un segmento aleatorizado de 20 nucleótidos puede tener 420 posibilidades candidatas.

Aquéllos que tienen la afinidad más alta (constantes de disociación más bajas) para el objetivo, se unen más probablemente al objetivo. Después de la división, disociación y amplificación, se genera una segunda mezcla de ácidos nucleicos, enriquecida con los candidatos con la afinidad de unión más alta. Las rondas adicionales de selección favorecen progresivamente los mejores ligandos hasta que la mezcla de ácidos nucleicos resultantes está compuesta de manera predominante de únicamente una o unas cuantas secuencias. Estas pueden clonarse, secuenciarse y probarse de manera individual como ligandos o aptámeros para 1) la afinidad de unión al objetivo y/o 2) la capacidad para afectar la función del objetivo. Los ciclos de selección y de amplificación se repiten hasta que se logra un objetivo deseado. En el caso más general, la selección/amplificación se continúa hasta que no se logran mejoras significativas en la fuerza de unión con la repetición del ciclo. El método se utiliza típicamente para tomar muestras de aproximadamente 1014 especies diferentes de ácidos nucleicos, pero puede utilizarse para tomar muestras de tantas como aproximadamente 1018 especies diferentes de ácidos nucleicos. Generalmente, las moléculas de aptámero de ácido nucleico se seleccionan en un procedimiento de 5 a 20 ciclos. En una modalidad, la heterogeneidad se introduce únicamente en las etapas de la selección inicial y no ocurre a través del proceso de replicación. En una modalidad del método SELEX™, el proceso de selección es tan eficiente para aislar esos ligandos de ácido nucleico que se unen más fuertemente al objetivo seleccionado, que únicamente un ciclo de selección y amplificación se requiere. Tal selección eficiente puede ocurrir, por ejemplo, en un proceso del tipo cromatográfico, en donde la capacidad de los ácidos nucleicos para asociarse con los objetivos unidos a una columna, opera de tal manera que la columna es suficientemente capaz de permitir la separación y aislamiento de los ligandos de ácidos nucleicos con afinidad más alta. En muchos casos, no es necesariamente deseable realizar los pasos iterativos del proceso SELEX™ hasta que un solo ligando de ácido nucleico se identifica. La solución de ligando de ácido nucleico específica del objetivo puede incluir una familia de estructuras o motivos de ácidos nucleicos que tienen varias secuencias conservadas y varias secuencias que pueden sustituirse o agregarse sin afectar de manera significativa la afinidad de los ligandos de ácido nucleico al objetivo. Al terminar el proceso SELEX™ antes de completarse, es posible determinar la secuencia de varios miembros de la familia de la solución del ligando de ácido nucleico. Se sabe que existe una variedad de estructuras primarias, secundarias y terciarias de ácidos nucleicos. Las estructuras o motivos que han mostrado estar involucradas más comúnmente en interacciones del tipo que no son Watson-Crick, se refieren como espiras de horquilla, protuberancias simétricas y asimétricas, pseudonudos y miles de combinaciones de los mismos. La mayoría de todos los casos conocidos de tales motivos, sugieren que pueden formarse en una secuencia de ácidos nucleicos de no más de 30 nucleótidos. Por esta razón, con frecuencia se prefiere que los procedimientos SELEX™ con segmentos aleatorizados contiguos inicien con secuencias de ácidos nucleicos que contienen un segmento aleatorizado de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos, y de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nucleótidos en algunas modalidades. En un ejemplo, la secuencia 5' -fija: aleatoria: 3 ' -fija comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nucleótidos. El método SELEX™ central, se ha modificado para lograr un número de objetivos específicos. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,707,796, describe el uso del proceso SELEX™ en conjunto con la electroforesis en gel para seleccionar las moléculas de ácidos nucleicos con características estructurales específicas, tales como ADN flexionado. La Patente de los Estados Unidos No. 5,763,177, describe métodos basados en SELEX™ para seleccionar ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotorreactivos capaces de unirse y/o fotorreticularse a, y/o fotoinactivar una molécula objetivo. La Patente de los Estados Unidos No. 5,567,588 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,861,254, describen métodos basados en SELEX™ que logran una división altamente eficiente entre los oligonucleótidos que tienen alta y baja afinidad para una molécula objetivo. La Patente de los Estados Unidos No. 5,496,938, describe métodos para obtener ligandos mejorados de ácidos nucleicos después de que se ha realizado el proceso SELEX™. La Patente de los Estados Unidos No. 5,705,337, describe métodos para enlazar de manera covalente un ligando a su objetivo. El método SELEX™ también puede utilizarse para obtener ligandos de ácidos nucleicos para unirse a más de un sitio en la molécula objetivo, y para obtener ligandos de ácido nucleico que incluyen especies que no son de ácidos nucleico que se unen a sitios específicos en el objetivo. El método SELEX™ proporciona medios para aislar e identificar los ligandos de ácido nucleico que se unen a cualquier objetivo considerable, incluyendo biomoléculas grandes y pequeñas tales como proteínas que se unen a ácidos nucleicos y proteínas que no se sabe si se unen a ácidos nucleicos, como parte de su función biológica, así como cofactores y otras moléculas pequeñas. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,737, describe secuencias de ácido nucleico identificadas a través del método SELEX™, que son capaces de unirse con alta afinidad a la cafeína y a su análogo estrechamente relacionado, teofilina. El proceso contra-SELEX™ es un método para mejorar la especificidad de los ligandos de ácido nucleico a una molécula objetivo, eliminando las secuencias del ligando de ácido nucleico con reactividad cruzada a una o más moléculas no objetivo. El proceso contra-SELEX™ está comprendido de los pasos de: (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos; (b) poner en contacto la mezcla candidata con el objetivo, en donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada para el objetivo con relación a la mezcla candidata pueden dividirse del resto de la mezcla candidata; (c) dividir los ácidos nucleicos de afinidad incrementada del resto de la mezcla candidata; (d) opcionalmente disociar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada del objetivo; (e) poner en contacto los ácidos nucleicos de afinidad incrementada con una o más moléculas que no son objetivo, de manera que los ligandos de ácido nucleico con afinidad específica por la molécula que no es objetivo se eliminan; y (f) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad específica únicamente para la molécula objetivo, para proporcionar una mezcla enriquecida de ácidos nucleicos para las secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente más alta para unirse a la molécula objetivo. Como se describió anteriormente para el método SELEX™, los ciclos de selección y amplificación se repiten conforme sea necesario hasta que se logra un objetivo deseado. Un problema potencial encontrado en el uso de los ácidos nucleicos como agentes terapéuticos y vacunas, es que los oligonucleótidos en su forma de fosfodiéster pueden degradarse rápidamente en los fluidos corporales mediante las enzimas intracelulares y extracelulares, tales como las endonucleasas y exonucleasas, antes de que se manifieste el efecto deseado. El método SELEX™ abarca así la identificación de ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como estabilidad in vivo mejorada o características de suministro mejoradas. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones del azúcar y/o el fosfato y/o la base. Los ligandos de ácido nucleico identificados con SELEX™ contienen nucleótidos modificados como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,660,985, que describe oligonucleótidos que contienen derivados nucleotídicos modificados químicamente en la posición 2' de ribosa, la posición 5 de las pirimidinas, y la posición 8 de las purinas, la Patente de los Estados Unidos No. 5,756,703, que describe oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas modificadas en la posición 2', y la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,737, que describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con sustituyentes 2 '-amino (2'-NH2), 2' -fluoro (2'-F), y/o 2'-0-metilo (2' -OMe). Las modificaciones de los ligandos de ácido nucleico contempladas en esta invención, incluyen, de manera no exclusiva, aquéllas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando del ácido nucleico como un todo. Las modificaciones para generar poblaciones de oligonucleótidos que son resistentes a las nucleasas pueden también incluir uno o más enlaces internucleótidos sustitutos, azúcares alteradas, bases alteradas o combinaciones de los mismos. Tales modificaciones incluyen, de manera no exclusiva, modificaciones del azúcar en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5 -yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal, modificaciones de fosforotioato o fosfato de alquilo, metilaciones, y combinaciones de apareamiento de bases inusuales, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como coronación. Las modificaciones también incluyen modificaciones en 3 ' y 5' tales como coronación, por ejemplo, la adición de una corona 3'-3'-dT para incrementar la resistencia a la exonucleasa (véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,674,685; 5,668,264; 6,207,816 y 6,229,002, cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente en su totalidad) . En una modalidad, se proporcionan oligonucleótidos en los cuales el grupo P(0)0 se reemplaza por P(0)S ("tioato"), P(S)S ( "ditioato" ) , P(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO o CH2 ( "formacetal" ) o 3' -amina (-NH-CH2-CH2-) , en donde cada R o R' es de manera independiente H o alquilo sustituido o no sustituido. Los grupos de enlace pueden unirse a los nucleótidos adyacentes a través de un enlace -O-, -N- o -S- . No se requiere que todos los enlaces en el oligonucleótido sean idénticos. En modalidades adicionales, los oligonucleótidos comprenden grupos de azúcar modificados, por ejemplo, uno o más de los grupos hidroxilo se reemplaza con halógeno, grupos alifáticos o funcionalizados como éteres o aminas. En una modalidad, la posición 2' del residuo de furanosa se sustituye por cualquiera de un grupo O-metilo, O-alquilo, O-alilo, S-alquilo, S-alilo o halo. Los métodos de síntesis de los azúcares modificados en la posición 2' se describen, por ejemplo, en Sproat, et al., Nucí. Acid Res. 19:733-738 (1991); Gotten, et al, Nucí. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); y Hobbs , et al, Biochemistry 12:5138-5145 (1973) . Otras modificaciones son conocidas por alguien con experiencia en la técnica. Tales modificaciones pueden ser las modificaciones de proceso pre-SELEX™ o las modificaciones del proceso post-SELEX™ (modificación de ligandos no modificados identificados previamente) , o pueden hacerse mediante la incorporación en el proceso SELEX™ . Las modificaciones del proceso pre-SELEX™ o aquéllas hechas mediante la incorporación en el proceso SELEX™, proporcionan ligandos de ácidos nucleicos con especificidad para su objetivo SELEX™ y estabilidad mejorada, por ejemplo, estabilidad in vivo. Las modificaciones del proceso post-SELEX™ (por ejemplo, truncamiento, supresión, sustitución o modificaciones nucleotídicas adicionales de ligandos identificados previamente que tienen nucleótidos incorporados mediante una modificación del proceso pre-SELEX™) hechas a ligandos de ácidos nucleicos pueden resultar en estabilidad mejorada, por ejemplo, en la estabilidad in vivo sin afectar de manera adversa la capacidad de unión del ligando del ácido nucleico. Opcionalmente, los aptámeros en los cuales los nucleótidos modificados se han incorporado mediante la modificación del proceso pre-SELEX™ pueden modificarse además mediante una modificación del proceso post-SELEX™ (es decir, un proceso de modificación post-SELEX™ después del SELEX) . El método SELEX™ abarca combinar los oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son de oligonucleótidos, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,637,459 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,683,867. El método SELEX™ abarca además combinar los ligandos de ácido nucleico seleccionados con compuestos de alto peso molecular lipofílicos o no inmunogénicos en un complejo de diagnóstico o terapéutico, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,011,020, la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,698, y la Publicación del PCT No. WO 98/18480. Estas patentes y solicitudes enseñan la combinación de un amplio arreglo de formas y otras propiedades, con propiedades de amplificación y replicación eficientes de los oligonucleótidos, y con las propiedades deseables de otras moléculas . La identificación de los ligandos de ácidos nucleicos a péptidos pequeños, flexibles, vía el método SELEX™ también se ha explorado. Los péptidos pequeños tienen estructuras flexibles y usualmente existen en solución en un equilibrio de confórmeros múltiples, y por lo tanto, se pensó inicialmente que las afinidades de unión pueden limitarse por la pérdida de entropía conformacional tras la unión a un péptido flexible. Sin embargo, la factibilidad de identificar ligandos de ácido nucleico con péptidos pequeños en solución, se demostró en la Patente de los Estados Unidos No. 5,648,214. En esta patente, se identificaron ligandos de ácidos nucleicos de ARN de alta afinidad para la sustancia P, un péptido de 11 aminoácidos. Como parte del proceso SELEX™, las secuencias seleccionadas para unirse al objetivo son reducidas al mínimo opcionalmente entonces, para determinar la secuencia mínima que tiene la afinidad de unión deseada. Las secuencias del aptámero seleccionadas y/o las secuencias del aptámero reducidas al mínimo, se modifican opcionalmente realizando mutagénesis aleatoria o dirigida de la secuencia, por ejemplo, para incrementar la afinidad de unión o de manera alterna, para determinar cuáles posiciones en la secuencia son esenciales para la actividad de unión.

MÉTODO SELEX™ MODIFICADO EN LA POSICIÓN 2' Con el fin de que un aptámero sea adecuado para utilizarse como un agente terapéutico y/o para tipos particulares de diagnóstico, es de manera preferida barato de sintetizar, seguro y estable in vivo . Los aptámeros de ARN y de ADN del tipo silvestre son típicamente no estables in vivo debido a su susceptibilidad la degradación por las nucleasas. La resistencia a la degradación por las nucleasas puede incrementarse en gran medida, mediante la incorporación de grupos modificantes en la posición 2' . Los grupos 2' -fluoro y 2' -amino se han incorporado exitosamente en bibliotecas de oligonucleótidos de las cuales los aptámeros se han seleccionado posteriormente. Sin embargo, estas modificaciones incrementan el gran medida el costo de síntesis del aptámero resultante, y pueden introducir preocupaciones para la seguridad en algunos casos, debido a la posibilidad de que los nucleótidos modificados puedan reciclarse en un ADN hospedero mediante la degradación de los oligonucleótidos modificados y el uso posterior de los nucleótidos como sustratos para la síntesis del ADN. Los aptámeros que contienen nucleótidos 2'-0-metilo ("2' -OMe"), como se proporcionan en la presente, superan muchas de estas desventajas. Los oligonucleótidos que contienen los nucleótidos 2' -OMe son resistentes a la nucleasa y baratos de sintetizar. Aunque los nucleótidos 2' -OMe son ubicuos en los sistemas biológicos, las polimerasas naturales no aceptan los 2' -OMe NTP como sustratos bajo condiciones fisiológicas, por lo tanto, no hay preocupaciones de la seguridad con respecto al reciclado de los nucleótidos 2 '-OMe en el ADN hospedero. Los métodos SELEX™ utilizados para generar los aptámeros modificados en la posición 2' se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/430,761, presentada en diciembre 3, del 2002, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/487,474, presentada en julio 15, del 2003, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/517,039, presentada en noviembre 4, del 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/729,581, presentada en diciembre 3, del 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/873,856, presentada en junio 21, del 2004, titulada "Método para la Selección in vi tro de Ácidos Nucleicos Sustituidos con 2'-O-Metilo" , cada una de las cuales se incorpora como referencia en la presente en su totalidad. La presente invención incluye aptámeros que se unen a, y modulan la función del aptámero objetivo y que contienen nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos que tienen una modificación en la posición 2'), para hacer al oligonucleótido más estable que el oligonucleótido no modificado a la degradación enzimática y química, así como a la degradación térmica y física. Aunque hay varios ejemplos de aptámeros que contienen 2' -OMe en la literatura (véase, por ejemplo, Ruckman et al., J. Biol. Chem, 1998, 273, 20556-20567-695), éstos se generaron mediante la selección in vi tro de bibliotecas de transcriptos modificados, en los cuales los residuos C y U estaban modificados con 2' -fluoro (2'-F) y los residuos A y G eran 2' -OH. Una vez que las secuencias funcionales se identificaron, entonces cada residuo A y G se probó para la tolerancia a la sustitución con 2' -OMe, y el aptámero se sintetizó nuevamente teniendo todos los residuos A y G que toleraron la sustitución con 2' -OMe como residuos de 2 '-OMe. La mayoría de los residuos A y G de los aptámeros generados de esta manera en dos pasos, toleró la sustitución con los residuos 2' -OMe, aunque en promedio, aproximadamente 20% no. En consecuencia, los aptámeros generados utilizando este método tienden a contener de dos a cuatro residuos de 2' -OH, y la estabilidad y costo de síntesis están comprometidos como resultado. Mediante la incorporación de nucleótidos modificados en la reacción de transcripción que genera oligonucleótidos estabilizados utilizados en las bibliotecas de oligonucleótidos de las cuales se seleccionan los aptámeros y enriquecidos mediante el método SELEX™ (y/o cualquiera de sus variaciones y mejoras, incluyendo aquéllas descritas en la presente) , los métodos de la presente invención eliminan la necesidad de estabilizar los oligonucleótidos del aptámero seleccionado, resintetizando los oligonucleótidos del aptámero con nucleótidos modificados con 2 '-OMe. En una modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden las combinaciones de modificaciones de 2' -OH, 2'-F, 2' -desoxi y 2' -OMe de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y UTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden combinaciones de modificaciones 2' -OH, 2'-F, 2' -desoxi, 2' -OMe, 2'-NH2, y 2 ' -metoxietilo de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y UTP. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden todos o sustancialmente todos los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y/o UTP modificados con 2' -OMe.

Polimerasas Modificadas Los aptámeros modificados en la posición 2' de la invención son creados utilizando polimerasas modificadas, por ejemplo, una polimerasa T7 modificada, que tiene una velocidad de incorporación de los nucleótidos modificados que tienen sustituyentes voluminosos en la posición 2' de la furanosa, que es más alta que aquélla de las polimerasas del tipo silvestre. Por ejemplo, una sola polimerasa T7 mutante, en la cual el residuo de tirosina en la posición 639 se ha cambiado a fenilalanina (Y639F) , utiliza fácilmente los trifosfatos del nucleótido (NTP) de 2 'desoxi, 2 'amino y 2' fluoro, como sustratos y se ha utilizado ampliamente para sintetizar ARN modificados para una variedad de aplicaciones. Sin embargo, se dice que esta polimerasa mutante T7 no puede utilizar fácilmente (es decir, incorporar) los NTP con sustituyentes voluminosos en la posición 2', tales como sustituyentes 2 '-OMe o 2 '-azido (2'-N3). Para la incorporación de sustituyentes voluminosos en la posición 2', un mutante de polimerasa T7 (Y639F/H784A) , que tiene la histidina en la posición 784 cambiada a un residuo de alanina además de la mutación Y639F, se ha descrito y se ha utilizado en circunstancias limitadas para incorporar pirimidin NTP modificados. Véase, Padilla, R. y Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138. Una polimerasa de ARN T7 mutante en la cual el residuo de tirosina en la posición 639 se ha cambiado a fenilalanina, el residuo de histidina en la posición 784 se ha cambiando a alanina y el residuo de lisina en la posición 378 se ha cambiado a arginina (Y639F/H784A/K378R) se ha utilizado en circunstancias limitadas para incorporar purin y pirimidin NTP modificados, por ejemplo, 2' -OMe NTP, pero incluyen un pico de 2' -OH GTP para la transcripción. Véase, Burmeister et. al. (2005) Chemistry and Biology, 12:25-33. La inclusión de un pico de 2 '-OH GTP para la transcripción puede resultar en aptámeros que no están completamente 2' -OMe, sin que pueden depender de la presencia de los 2 '-OH GTP. Una polimerasa T7 mutante (H784A) , que tiene la histidina en la posición 784 cambiada a un residuo de alanina, también se ha descrito. Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30:138. En ambas de las polimerasas T7 mutantes Y639F/H784A y mutante H784A, el cambio a un residuo de aminoácido más pequeño tal como alanina, permite la incorporación de sustratos nucleotídicos más voluminosos, por ejemplo, nucleótidos sustituidos con 2'-OMe. Véase, Chelliserry, K. y Ellington, A. D. (2004), Nature Biotech, 9:1155-60. Una ARN polimerasa T7 adicional se ha descrito con mutaciones en el sitio activo de la ARN polimerasa T7 que incorpora más fácilmente los sustratos modificados voluminosos en la posición 2', por ejemplo, una ARN polimerasa mutante T7 única, que tiene el residuo de tirosina en la posición 639 cambiada a una leucina (Y639L) . Sin embargo, la actividad se sacrifica con frecuencia para una especificidad incrementada del sustrato conferida por tales mutaciones, conduciendo a bajos rendimientos del transcripto. Véase, Padilla R y Sousa, R. (1999) , Nucleic Acids Res., 27(6):1561. La ARN polimerasa T7 mutante P266L se ha descrito por facilitar la eliminación del promotor (Guillerez et al. (2005) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 102 (17) 5958) . La polimerasa hace una transición de la conformación de inicio, en la cual se une al promotor, a 1 conformación de alargamiento, en la cuan no lo hace. Ninguna de las polimerasas mutantes anteriores se reportó como que resultara en transcriptos completamente 2 '-OMe. La presente invención proporciona materiales y métodos para incrementar el rendimiento de la transcripción de los oligonucleótidos. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos y condiciones para utilizar las ARN polimerasas T7 modificadas para incorporar enzimáticamente los nucleótidos modificados en los oligonucleótidos. En una modalidad preferida, la ARN polimerasa T7 modificada utilizada con los métodos de transcripción de la invención no requiere la presencia del 2' -OH GTP. En una modalidad preferida, la polimerasa modificada es una ARN polimerasa T7 mutante que tiene el residuo de tirosina en la posición 639 cambiado a un residuo de leucina y el residuo de histidina en la posición 784 cambiado a un residuo de alanina (Y639L/H784A) . En otra modalidad preferida, la polimerasa modificada es una AR? polimerasa T7 mutante que tiene el residuo de tirosina en la posición 639 cambiado a un residuo de leucina, el residuo de histidina en la posición 784 cambiado a un residuo de alanina, y el residuo de lisina en la posición 378 cambiado a un residuo de arginina (Y639L/H784A/K378R) . En otra modalidad, la polimerasa modificada para utilizarse en los métodos de la invención es una ARN polimerasa T7 mutante que tiene el residuo de tirosina en la posición 639 cambiado a una leucina (Y639L) , mientras que en aún otra modalidad, la ARN polimerasa T7 mutante tiene el residuo de tirosina en la posición 639 cambiado a un residuo de leucina y el residuo de lisina en la posición 378 cambiado a un residuo de arginina (Y639L/K378R) . Aunque no se desea apegarse a alguna teoría, la mutación K378R no está cerca del sitio activo de la polimerasa y por lo tanto, se cree que es una mutación silenciosa. En otra modalidad, la polimerasa modificada para utilizarse en los métodos de la invención es una ARN polimerasa T7 mutante que tiene el residuo de prolina en la posición 266 cambiado a leucina, el residuo de tirosina en la posición 639 cambiado a leucina y el residuo de histidina en la posición 784 cambiado a un residuo de alanina, (P266L/Y639L/H784A) , mientras que en aún otra modalidad, la ARN polimerasa T7 mutante tiene el residuo de prolina en la posición 266 cambiado a leucina, el residuo de tirosina en la posición 639 cambiado a un residuo de leucina, el residuo de histidina en la posición 784 cambiado a un residuo de alanina y el residuo de lisina en la posición 378 cambiado a un residuo de arginina (P266L/Y639L/H784A/K378R) . Las secuencias de aminoácidos de las ARN polimerasas T7 mutantes se muestran a continuación: Y639L/H784A (SEQ ID NO 1) : MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCWPP KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEVVTVTDENTGEISEKVKLGTK ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI WESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA Y639L/H784A/K378R ( SEQ ID NO 2 ) : MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQE1KPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQVVEADMLSKGLLGGEAWSSWHK EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPP KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEVVTVTDENTGEISEKVKLGTK ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI WESVSVTVVAAVEA NWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTWWAHEKYGIESFALIHDSFGTI PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA Y639L ( SEQ ID NO 100 ) : MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQVVEADMLSKGLLGGEAWSSWHK EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGWGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPP KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE RIKFIEENHENI ACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGY AKLI WESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA Y639L/K378R ( SEQ ID NO 101 ) : MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRK FERQLKAGEVADNA AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETiELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCWPP KPWTGiTGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH KAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGY AKLI WESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA P266L/Y639L/H784A ( SEQ ID NO 102 ) MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQE1KPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHK EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISLMFQPCVVPP KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH KAIWFPYN DWRGRVYAVS FNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE RIKFIEENHENIMACAKSPLENTW AEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK ALAGQWLAYGVTRSVTKRSV TLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLI WESVSVT VAAVEA NWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPiQTRLN LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTI PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA P266L/Y639L/H784A/ K378R ( SEQ ID NO 103 ) MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA AAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVAS AIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEAD LSKGLLGGEAWSSWHK EDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGIS'LMFQPC VPP KPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITK WKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANH KAIWFPYNMDWRGRVYAVS FNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPE RIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQH FSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTK ALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKU WESVSVTWAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLN LMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVÁSQDGSHLRKTWWAHEKYGIESFALIHDSFGTI PADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA Para generar recolecciones de transcriptos de ARN modif icados en la posición 2 ' (por ej emplo , 2 ' -OMe ) en condiciones baj o las cuales una polimerasa acepta NTP modif icados en la posición 2 ' , pueden utilizarse las ARN polimerasas T7 mutantes Y693F, Y693F/K378R, Y693F/H784A, Y693F/H784A/K378R, Y693L/H784A, Y693L/H784A/K378R, Y639L , Y639L/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784/K378R . Una polimerasa preferida es la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A . Otra polimerasa preferida es la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R . Otra polimerasa preferida de la invención es la ARN polimerasa T7 mutante P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R . Otras ARN polimerasas T7 , particularmente aquéllas que exhiben una alta tolerancia para sustituyentes 2 ' voluminosos , también pueden utilizarse en los métodos de la presente invención . Cuando se utiliza en una polimerización dirigida a la plantilla utilizando las condiciones descritas en la presente , la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R puede utilizarse para la incorporación de todos los 2 '-OMe NTP, incluyendo 2' -OMe GTP, con rendimientos del transcripto más altos que los que se logran utilizando las ARN polimerasas T7 mutantes Y639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L o la Y639L/K378R. Las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R pueden utilizarse con, pero no requieren 2' -OH GTP para alcanzar altos rendimientos de oligonucleótidos modificados en la posición 2', por ejemplo, que contienen 2' -OMe. En una modalidad preferida, las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/H784A o Y639L/H784A/K378R de la invención se utilizan con una mezcla MNA para fomentar los rendimientos más altos del transcripto completamente 2'-OMe . En algunas modalidades, las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/H784A o Y639L/H784A/K378R pueden utilizarse con una mezcla de transcripción rRmY, dRmY, rGmH, fGmH, dGmH, dAmB, rRdY, dRdY o rN. Como se utiliza en la presente, una mezcla de transcripción que contiene sólo 2' -OMe A, G, C y U trifosfatos se refiere como una mezcla MNA, y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros MNA y contienen sólo nucleótidos 2'-0-metilo. Una mezcla de transcripción que contiene C y U 2 '-OMe y A y G 2' -OH, se refiere como una mezcla "rRmY" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros "rRmY" . Una mezcla de transcripción que contiene A y G desoxi y U y C 2' -OMe se refiere como una mezcla "dRmY" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros "dRmY" . Una mezcla de transcripción que contiene A, C y U 2' -OMe y G 2' -OH, se refiere como una mezcla "rGmH" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros "rGmH" . Una mezcla de transcripción que contiene de manera alterna A, C, U y G 2' -OMe y A, U y C 2' -OMe A y G 2'-F, se refiere como una "mezcla alternante" , y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros de la "mezcla alternante" . Una mezcla de transcripción que contiene A, U, C 2' -Ome y G 2'-F, se refiere como una mezcla "fGmH" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "fGmH" . Una mezcla de transcripción que contiene A, U y C 2' -OMe y G desoxi, se refiere como una mezcla "dGmH" , y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "dGmH" . Una mezcla de transcripción que contiene A desoxi y C, G y u 2' -OMe, se refiere como una mezcla "dAmB" , y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "dAmB" . Una mezcla de transcripción que A 2' -OH y C, G y U 2' -Ome se refiere como "rAmB" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "rAmB" . Una mezcla de transcripción que contiene 2' -OH adenosin trifosfato y guanosin trifosfato y desoxi citidin trifosfato y timidin trifosfato se refiere como una mezcla rRdY y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "rRdY" . Una mezcla de transcripción que contiene todos los nucleótidos 2' -OH se refiere como una mezcla "rN" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "rN" , "rRrY" o aptámeros de ARN y una mezcla de transcripción que contiene todos los nucleótidos desoxi se refiere como una mezcla "dN" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "dN" o "dEdY" o aptámeros de ADN. Los oligonucleótidos modificados en la posición 2' pueden sintetizarse totalmente de los nucleótidos modificados, o con un subconjunto de los nucleótidos modificados. Todos los nucleótidos pueden modificarse, y todos pueden contener la misma modificación. Todos los nucleótidos pueden modificarse, pero contener diferentes modificaciones, por ejemplo, todos los nucleótidos que contienen la misma base pueden tener un tipo de modificación, mientras que los nucleótidos que contienen otras bases pueden tener diferentes tipos de modificación. Todos los nucleótidos de purina pueden tener un tipo de modificación (o están sin modificar) , mientras que todos los nucleótidos de pirimidina tienen otro tipo diferente de modificación (o están sin modificar) . De esta manera, los transcriptos o recolecciones de transcriptos se generan utilizando cualquier combinación de modificaciones, incluyendo por ejemplo, ribonucleótidos (2' -OH), desoxirribonucleótidos (2' -desoxi), 2'-F y nucleótidos 2'-OMe . Además, los oligonucleótidos modificados pueden contener nucleótidos que portan más de una modificación de manera simultánea, tal como una modificación en el enlace internucleótido (por ejemplo, fosforotioato) y en el azúcar (por ejemplo, 2' -OMe) y la base (por ejemplo, inosina) .

Condiciones de la Transcripción Se han determinado varios factores como importantes para la condiciones de transcripción del método SELEX™ modificado en la posición 2', que también pueden aplicarse a los métodos SELEX™ de la Región Terminal descritos a continuación. Por ejemplo, pueden observarse incrementos en los rendimientos del transcripto modificado bajo algunas condiciones cuando se utiliza una combinación particular de una secuencia líder/polimerasa mutante. Una secuencia líder es una secuencia que puede incorporarse en el extremo 3' de una secuencia fija en el extremo 5' de la plantilla de transcripción del ADN. La secuencia líder es típicamente de 6-15 nucleótidos de largo y puede estar compuesta de una composición predeterminada de nucleótidos, por ejemplo, puede ser toda de purinas, o una mezcla particular de nucleótidos de purina y pirimidina. Los ejemplos de plantillas que pueden utilizarse con las polimerasas mutantes y las condiciones de transcripción de la invención, particularmente en combinación con Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R, son ARC2118 (SEQ ID NO 3), ARC2119 (SEQ ID NO 4 ) , y ARC3428 GGGAGACAAGAATAAAGCGAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^ CGATGATGCTTAGCTAG (SEQ ID NO 137) .

Además, la presencia de 2' -OH GTP ha sido históricamente un factor importante en obtener transcriptos que incorporan los nucleótidos modificados . La transcripción puede dividirse en dos fases: la primera fase es el inicio, durante el cual un NTP se agrega al extremo 3' de GTP (u otra guanosina sustituida), para proporcionar un dinucleótido que es a continuación extendido por aproximadamente 10-12 nucleótidos; la segunda fase es el alargamiento, durante el cual la transcripción procede más allá de la adición de los primeros aproximadamente 10-12 nucleótidos. Se ha encontrado previamente que pequeñas cantidades de 2' -OH GTP agregadas a la mezcla de transcripción que contiene el mutante Y639/K378R o la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R y un exceso de 2'-OMe GTP, son suficientes para iniciar la transcripción utilizando 2' -OH GTP (y proporcionar un rendimiento más alto del transcripto que contiene 2' -Ome, que sin 2' -OH GTP) , pero una vez que la transcripción entra a la fase de alargamiento, la discriminación reducida entre 2' -OMe y 2'-OH GTP, y el exceso de 2' -OMe GTP con respecto a 2' -OH GTP, permite la incorporación de principalmente 2 '-OMe GTP. La presente invención proporciona ARN polimerasas T7 mutantes, por ejemplo, Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R que no requieren 2 '-OH GTP en la mezcla de transcripción para un alto rendimiento de transcripción de 2' -OMe. En una modalidad, alto rendimiento significa en promedio, al menos un trascripto por entrada de la plantilla de transcripción. Otro factor en la incorporación de nucleótidos sustituidos con 2' -OMe en transcriptos en el uso de magnesio y manganeso (Mn2+) divalentes en la mezcla de transcripción. Se ha encontrado que diferentes combinaciones de concentraciones de cloruro de magnesio y cloruro de manganeso afectan los rendimientos de los transcriptos 2 ' -O-metilados, la concentración óptima del cloruro de magnesio y manganeso es dependiente de la concentración en la mezcla de reacción de la transcripción de NTP, que compleja los iones metálicos divalentes. Para obtener los rendimientos más grandes de los transcriptos 2' -O-metilados al máximo (es decir, todos de los nucleótidos A, C y U y G 2' -OMe), se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de manganeso 5 mM y cloruro de manganeso 1.5 mM cuando cada NTP está presente a una concentración de 0.5 mM. Cuando la concentración de cada NTP es de 1.0 mM, se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de magnesio 6.5 mM y cloruro de manganeso 2.0 mM. Cuando la concentración de cada NTP es 1.5 mM, se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de magnesio 8 mM y cloruro de manganeso 2.5 mM. Cuando la concentración de cada NTP es de 2.0 mM, se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de magnesio 9.5 mM y cloruro de manganeso 3.0 mM. En cualquier caso, las separaciones de estas concentraciones hasta dos veces, siguen proporcionando cantidades significativas de los transcriptos modificados. La transcripción con cebador con 2' -OH GMP, guanosina u otras 2 '-OH guanosinas sustituidas en otra posición diferente a la posición del azúcar 2 '-Orne también es importante para las mezclas de transcripción que no contienen 2 '-OH GTP. Este efecto resulta de la especificidad de la polimerasa para el nucleótido de inicio. Como resultado, el nucleótido 5' -terminal de cualquier transcripto generado en esta manera, es probablemente 2' -OH G. Una concentración preferida de GMP (o guanosina), es de 0.5 mM y aún de manera más preferida 1 mM. También se ha encontrado que la inclusión de PEG, de manera preferida PEG- 8000, en la reacción de transcripción es útil para maximizar la incorporación de los nucleótidos modificados . Para la máxima incorporación de 2 '-OMe ATP (100%), 2' -OMe UTP (100%), 2' -OMe CTP (100%) y 2' -OMe GTP (100%) ("MNA") en los transcriptos, pueden utilizarse las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen) , Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, 2 '-OMe NTP (cada uno) 1.5 mM, 2 '-OH GMP 1 mM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una plantilla de ADN. En algunas modalidades, la plantilla de ADN puede estar presente en una concentración de manera preferida de aproximadamente 5 a 500 nM. Opcionalmente, la plantilla de ADN utilizada con las condiciones de transcripción anteriores comprende una secuencia líder toda de purina que incrementa el rendimiento de la transcripción con relación a una plantilla que no comprende tal secuencia líder, cuando ambas plantillas se transcriben bajo condiciones idénticas. En otra modalidad, la secuencia líder es una mezcla de purinas y pirimidinas que incrementa el rendimiento de la transcripción con relación a una plantilla que no comprende tal secuencia líder, cuando ambas se transcriben bajo condiciones idénticas. Como se utiliza en la presente, una unidad de pirofosfatasa inorgánica se define como la cantidad de enzimas que liberarán 1.0 mol de ortofosfato inorgánico por minuto a pH 7.2 y 25 °C. La reacción puede llevarse a cabo de aproximadamente 1 a 24 horas. En cada caso, los productos de la transcripción pueden utilizarse entonces para introducirse en el proceso SELEX™ para identificar los aptámeros y/o para determinar las secuencias conservadas que tienen especificidad de unión a un objetivo dado. Las secuencias resultantes ya están estabilizadas parcialmente, eliminando este paso del proceso de modificación post-SELEX™ y proporcionar un aptámero más altamente estabilizado como resultado. Como se describe a continuación, pueden obtenerse rendimientos útiles de los transcriptos que incorporan completamente los nucleótidos sustituidos en la posición 2' bajo condiciones diferentes a las condiciones descritas anteriormente. Por ejemplo, las variaciones a las condiciones de transcripción anteriores incluyen: La concentración del amortiguador HEPES puede variar de 0 a 1 M. La presente invención también contempla el uso de otros agentes amortiguadores que tienen una pKa entre 5 y 10, incluyendo, por ejemplo, Tris-hidroximetil-aminometano . La concentración de DTT puede variar de 0 a 400 mM. Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otros agentes reductores, incluyendo, por ejemplo, mercaptoetanol. La concentración de la espermidina y/o espermina puede variar de 0 a 20 mM. La concentración del PEG-8000 puede variar de 0 a 50% (peso/volumen) . Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otro polímero hidrofílico incluyendo, por ejemplo, PEG de otro peso molecular u otros polialquilenglicoles . La concentración de Tritón X-100 puede variar se 0 a 0.1% (peso/volumen). Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otros detergentes no iónicos incluyendo, por ejemplo, otros detergentes, incluyendo otros detergentes de Triton-X. La concentración del MgCl2 puede variar de 0.5 mM a 50 mM. La concentración de MnCl2 puede variar de 0.15 mM a 15 mM. Tanto el MgCl2 como el MnCl2 deben estar presentes dentro de los intervalos descritos, y en una modalidad preferida, están presentes en una relación de 10 a aproximadamente 3 de MgCl2:MnCl2, de manera preferida, la relación es de aproximadamente 3-5:1, de manera más preferida, la relación es de aproximadamente 3-4:1. La concentración de 2 '-OMe NTP (cada NTP) puede variar de 5 µM a 5 mM. La concentración de 2' -OH GTP puede variar de 0 µM a 300 µM. En una modalidad preferida, la transcripción ocurre en la ausencia de 2' -OH GTP (0 µM) . La concentración de 2' -OH GMP, guanosina u otro 2' -OH G sustituido en una posición diferente a la posición 2' del azúcar puede variar de 0 a 5 mM. En donde el 2' -OH GTP no está incluido en la reacción, el 2' -OH GMP se requiere y puede variar de 5 µM a 5 mM. La concentración de la plantilla de ADN puede variar de 5 nM a 5 µM. La concentración de la polimerasa mutante puede variar de 2 nM a 20 µM. La pirofosfatasa inorgánica puede variar de 0 a 100 unidades/ml. El pH puede variar de pH 6 a pH 9. Los métodos de la presente invención pueden practicarse dentro del intervalo de pH de actividad de la mayoría de las polimerasas que incorporan los nucleótidos modificados. La reacción de transcripción puede dejarse ocurrir de aproximadamente una hora a semanas, de manera preferida, de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas. Además, los métodos de la presente invención proporcionan el uso opcional de agentes quelantes en la condición de reacción de la transcripción incluyendo, por ejemplo, EDTA, EGTA y DTT.

MÉTODO SELEX™ DE LA REGIÓN TERMINAL Un método para el descubrimiento de las secuencias de la plantilla de transcripción del ácido nucleico que en algunas modalidades se utiliza para programar una polimerización del trifosfato del nucleótido dirigido a la plantilla incrementará el rendimiento del transcripto, es una variante del método SELEX™ conocida como el método SELEX™ de la Región Terminal (método TR-SELEX™) . La presente invención proporciona un método para identificar las secuencias del componente de la plantilla de transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, las secuencias líderes, el uso de las cuales incrementa el rendimiento del transcripto, particularmente el rendimiento de los transcriptos que contienen nucleótidos modificados en la posición 2' (por ejemplo, nucleótidos 2' -OMe), cuando se utiliza para programar una polimerización dirigida a la plantilla, utilizando el método TR-SELEX™. Para seleccionar las secuencias líderes que fomentan un rendimiento incrementado de los transcriptos que contienen los nucleótidos modificados en la posición 2', se genera una biblioteca candidata de plantillas de transcripción de los oligonucleótidos, que contiene una secuencia promotora que permite la transcripción de una manera dependiente de la plantilla, una primera región fija que comprende más de un nucleótido fijo inmediatamente a 3' al promotor, para permitir que ocurran las ligaduras fragmentadas, permitiendo por lo tanto la amplificación mediante la extensión de los cebadores unidos a los sitios de unión del cebador en la plantilla ligada; una región degenerada de la cual se seleccionará la secuencia líder y una secuencia fija en el término 3' para permitir la amplificación. En una modalidad preferida, la región degenerada de la plantilla de la biblioteca está cerca del término 5', reduciendo por lo tanto la longitud de la secuencia fija en 5' . Esta biblioteca de plantillas de transcripción se amplifica opcionalmente mediante PCR, y a continuación se utiliza para programar la transcripción utilizando una mezcla de reacción de la transcripción que comprende una polimerasa (incluyendo, de manera no exclusiva, una ARN polimerasa T7 mutada) , trifosfatos del nucleótido (NTP) (incluyendo, de manera no exclusiva uno o más NTP modificados en la posición 2'), e iones de magnesio, bajo las condiciones descritas en la presente. La mezcla del transcripto resultante se transcribe de manera inversa para obtener una mezcla candidata de secuencias de ADNc que se ligan a continuación a una secuencia de ADN que codifica el promotor T7. Opcionalmente, la mezcla del transcripto resultante se somete primero a la ligadura, y a continuación se transcribe de manera inversa. El ADNc que codifica los transcriptos se amplifican entonces mediante PCR, y las clonas se prueban para el rendimiento de la transcripción utilizando análisis en gel. Las plantillas de la transcripción amplificadas de esta manera pueden utilizarse opcionalmente para realizar rondas adicionales del proceso TR-SELEX™ si es necesario para alcanzar un mayor rendimiento del transcripto (véase la Figura 2) . Las secuencias de la clona de los transcriptos amplificados pueden analizarse para identificar el elemento de la secuencia líder 5' que permite la transcripción (incluyendo, de manera no exclusiva la transcripción que incorpora uno o más nucleótidos modificados en la posición 2'). Estos elementos de la secuencia líder 5' son útiles para diseñar bibliotecas candidatas de las plantillas de transcripción de los oligonucleótidos, que pueden utilizarse en el SELEX™ para fomentar un rendimiento incrementado de los transcriptos de ácido nucleico que contienen los nucleótidos modificados en la posición 2'.

Los ejemplos de las bibliotecas preferidas de las plantillas de transcripción de ADN que incorporan los elementos de la secuencia líder 5' identificados por el método TR-SELEX™ (mostrados subrayados) y que fomentan rendimientos más altos de los transcriptos que contienen los nucleótidos modificados en la posición 2', por ejemplo, nucleótidos 2' -OMe, utilizando las condiciones descritas en la presente, se describen a continuación. Para cada una de las secuencias de las bibliotecas de las plantillas de transcripción de ADN listadas a continuación, el elemento de la secuencia líder ' se muestra subrayado, y todas las secuencias están en la dirección 5' -3 ' .

ARC 2118 (SEQ ID NO 3) TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2119 (SEQ ID NO 4) TAATACGACTCACTATAGGGGGTGATATTGACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2120 (SEQ ID NO 5) TAATACGACTCACTATAGGGGTGCGCGGTTACGTTCTCGNNNNNNN NNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2121 (SEQ ID NO 6) TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGGGTGCCGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNN NNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG Para generar las mezclas de transcriptos de los transcriptos de ARN modificados en la posición 2' (por ejemplo, 2' -OMe) bajo las condiciones en las cuales una polimerasa acepta NTPS modificados en la posición 2', la Y639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A) o la ARN polimerasa T7 mutante P266L/Y639L/H784A/K378R) puede utilizarse con las secuencias líderes 5' identificadas por los métodos proporcionados por la presente invención. Una polimerasa preferida para utilizarse con las secuencias líderes 5' de la presente invención, que proporciona el rendimiento más alto de los transcriptos de ácido nucleico que contienen los nucleótidos modificados en la posición 2', el la ARN polimerasa mutante Y639L/H784A descrita previamente. Otra polimerasa preferida para utilizarse con las secuencias líderes 5' de la invención es la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R. Otras ARN polimerasas T7 , particularmente aquéllas que exhiben una alta tolerancia por los sustituyentes 2' voluminosos, también pueden utilizarse en la presente invención. Además de incorporar las secuencias líderes en las bibliotecas candidatas y las polimerasas mutantes que fomentan los rendimientos incrementados de los transcriptos de ácido nucleico que contienen los nucleótidos modificados en la posición 2' (por ejemplo, las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/H784A y Y639L/H784A/K378R) , los numerosos factores descritos anteriormente que se han determinado como importantes para las condiciones de la transcripción, pueden utilizarse para incrementar además, el rendimiento de los transcriptos que contienen los nucleótidos modificados en la posición 2' . Las secuencias líderes identificadas y las ARN polimerasas T7 mutantes Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L, Y639L/K378R, Y639L/H874A, Y639L/H874A/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R, pueden utilizarse en el SELEX™ con las condiciones descritas en la presente para generar los aptámeros que comprenden cualquier combinación de nucleótidos modificados en la posición 2', por ejemplo, modificaciones 2' -OH, 2'-F, 2'-desoxi, 2' -OMe, y 2'-NH2 de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y UTP. Los nucleótidos modificados en la posición 2' incorporados, son de manera preferida nucleótidos de 2'-0-metilo. Se prefiere una composición de aptámero que comprende uno o más nucleótidos de 2'-0-metilo. Una composición de aptámero que comprende 100% de 2'-0-metil purinas y pirimidinas, excepto por el nucleótido inicial, es más preferida. En una modalidad preferida, una de las secuencias líderes identificadas y las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/H874A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A o P266L/Y639L/H784A/K378R se utilizan en el método SELEX™ con las condiciones descritas en la presente para generar rendimientos más altos del transcripto de los aptámeros que comprenden nucleótidos completamente 2' -OMe. Para la incorporación máxima de 2' -OMe ATP (100%), UTP (100%), CTP (100%) y GTP (100%) (MNA") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen), Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, 2' -OMe NTP (cada uno) 1.5 mM, 2' -OH GMP 1 mM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639L/H784A/K378R 200 nM, pirofosfatasa alcalina 5 unidades/ml, y una secuencia líder que incrementa el rendimiento de la transcripción bajo las condiciones de transcripción derivadas. En una modalidad, la secuencia líder es una secuencia líder toda de purina. En otra modalidad, la secuencia líder es una mezcla de purinas y pirimidinas. Como se utiliza en la presente, una unidad de pirofosfatasa inorgánica se define como la cantidad de enzima que liberará 1.0 mol de ortofosfato inorgánico por minuto a pH 7.2 y 25°C.

QUÍMICA MEDICINAL DEL APTAMERO Una vez que los aptámeros que se unen a un objetivo deseado se identifican, pueden realizarse opcionalmente varias técnicas para incrementar además las características de unión y/o funcionales de las secuencias identificadas de los aptámeros. Los aptámeros, por ejemplo, aptámeros AMN, que se unen a un objetivo deseado identificado a través del proceso SELEX™ (por ejemplo, el método SELEX™ modificado en la posición 2'), pueden truncarse opcionalmente para obtener la secuencia mínima del aptámero (también referida en la presente como "constructo minimizado"), que tiene las características de unión y/o funcionales deseadas. Un método de lograr esto es utilizando programas de plegado y de análisis de la secuencia (por ejemplo, alinear las secuencias de la clona que resultan de una selección para buscar los motivos conservados y/o la covariación) , para informar el diseño de los constructos minimizados. Los experimentos con sondas bioquímicas también pueden realizarse para determinar los límites 5' y 3' de una secuencia de un aptámero para informar el diseño de los constructos minimizados. Los constructos minimizados pueden entonces sintetizarse químicamente y probarse para las características de unión y funcionales, en comparación con la secuencia no minimizada de la cual se derivaron. Las variantes de una secuencia de un aptámero que contienen una serie de supresiones 5', 3' y/o internas, también pueden sintetizarse químicamente de manera directa y probarse para las características de unión y funcionales, cuando se comparan con la secuencia del aptámero no minimizado de las cual se derivan. Además, las reselecciones adulteradas pueden utilizarse para explorar los requisitos de la secuencia adentro de una sola secuencia activa del aptámero, tal como un aptámero MNA (es decir, un aptámero que se une a un objetivo deseado identificado a través del proceso SELEX™ (incluyendo el proceso SELEX™ modificado en la posición 2'), o una sola secuencia minimizada del aptámero. Las reselecciones adulteradas se llevan a cabo utilizando una recolección sintética degenerada que se ha diseñado basándose en la única secuencia de interés . El nivel de degeneración usualmente varía del 70% al 85% del nucleótido del tipo silvestre, es decir, la única secuencia de interés. En general, las secuencias con mutaciones neutras se identifican a través del proceso de reselección adulterada, pero en algunos casos, los cambios de la secuencia pueden resultar en mejoras en la afinidad. La información de la secuencia compuesta de las clonas identificadas utilizando las reselecciones adulteradas pueden utilizarse entonces para identificar el motivo de unión mínimo y ayudar en los esfuerzos de la Química Medicinal . Las secuencias de aptámeros identificadas utilizando el proceso SELEX™ tales como los aptámeros MNA (incluyendo el proceso SELEX™ Modificado en la posición 2' y las reselecciones adulteradas) y/o las secuencias de aptámeros minimizadas también pueden modificarse opcionalmente con la selección post-SELEX™ utilizando la Química Medicinal del Aptámero para realizar una mutagénesis aleatoria o dirigida de la secuencia, para incrementar las características de la afinidad de unión y/o funcionales, o de manera alterna, para determinar cuales posiciones en la secuencia son esenciales para las características de la actividad de unión y/o funcionales. La Química Medicinal del Aptámero es una técnica de mejora del aptámero en la cual conjuntos de aptámeros variantes se sintetizan químicamente. Estos conjuntos de variantes difieren típicamente del aptámero original por la introducción de un solo sustituyente, y difieren unos de otros por la ubicación de este sustituyente. Estas variantes son comparadas entonces unas con otras con el original. Las mejoras en las características pueden ser suficientemente profundas de manera que la inclusión de un solo sustituyente puede ser todo lo necesario para lograr un criterio terapéutico particular. De manera alterna, la información recogida del conjunto de variantes únicas puede utilizarse para diseñar conjuntos adicionales de variantes, en los cuales se introduce más de un sustituyente de manera simultánea. En una estrategia de diseño, todas las variantes con un solo sustituyente se clasifican, las 4 superiores se eligen y todas las posibles combinaciones dobles (6) , triples (4) y cuádruples (1) de estas 4 variantes con un solo sustituyente se sintetizan y prueban. En una segunda estrategia de diseño, la mejor variante con un solo sustituyente se considera como el nuevo original, y todas las posibles variantes con un doble sustituyente que incluyen esta variante con un solo sustituyente con la más alta calificación se sintetizan y prueban. Pueden utilizarse otras estrategias, y estas estrategias pueden aplicarse de manera repetida, de manera que el número de sustituyentes se incrementa gradualmente, mientras que se continúa identificando variantes más mejoradas. La Química Medicinal del Aptámero puede utilizarse particularmente como un método para explorar la introducción local, más que global de los sustituyentes. Debido a que los aptámeros se descubren dentro de bibliotecas que son generadas mediante transcripción, cualesquier sustituyentes que se introduzcan durante el proceso SELEX™ deben introducirse globalmente. Por ejemplo, si se desean introducir enlaces de fosforotioato entre los nucleótidos, entonces estos sólo pueden introducirse en cada A (o cada G, C, T, U, etc.) (sustituido globalmente) . Los aptámeros que requieren fosforotioatos en algunas A (o algunas G, C, T, U, etc.) (sustituidas localmente) , pero no pueden tolerarlo en otras A, no pueden descubrirse fácilmente mediante este proceso. Las clases de sustituyentes que pueden utilizarse mediante el proceso de la Química Medicinal del Aptámero están limitados únicamente por la capacidad para generarlos como reactivos de síntesis en fase sólida e introducirlos en un esquema de síntesis del oligómero. El proceso ciertamente no está limitado a los nucleótidos solos. Los esquemas de la Química Medicinal del Aptámero pueden incluir sustituyentes que introducen volumen estérico, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, lipofobicidad, carga positiva, carga negativa, carga neutra, zwitteriones, polarizabilidad, resistencia a las nucleasas, rigidez conformacional, flexibilidad conformacional, características de unión a la proteína, masa, etc. Los esquemas de la Química Medicinal del Aptámero pueden incluir modificaciones de bases, modificaciones de azúcares o modificaciones del enlace fosfodiéster. Cuando se consideran las clases de sustituyentes que probablemente son benéficos dentro del contexto de un aptámero terapéutico, puede ser deseable introducir sustituciones que caigan en una o más de las siguientes categorías : (1) Sustituyentes ya presentes en el cuerpo, por ejemplo, 2' -desoxi, 2' -ribo, 2'-0-metil purinas o pirimidinas o 5-metil citosina. (2) Sustituyentes que ya son parte de un agente terapéutico aprobado, por ejemplo, oligonucleótidos enlazados a fosforotioato. (3) Sustituyentes que se hidrolizan o degradan a una de las dos categorías anteriores, por ejemplo, oligonucleótidos enlazados a fosfonato de metilo. (4) Los aptámeros de la presente invención incluyen aptámeros desarrollados a través de la química medicinal del aptámero como se describe en la presente. La afinidad de unión al objetivo de los aptámeros de la presente invención puede valorarse a través de una serie de reacciones de unión entre el aptámero y el objetivo (por ejemplo, una proteína) en la cual un aptámero marcado con 32P en trazas se incuba con una serie de diluciones del objetivo en un medio amortiguado, a continuación, se analiza mediante filtración con nitrocelulosa utilizando un distribuidor de filtración a vacío. Referido en la presente como el ensayo de unión con transferencia por puntos, este método utiliza un medio de filtración de tres capas que consiste (de la parte superior a la inferior) de nitrocelulosa, un filtro de nylon y un papel de transferencia de gel. El ARN que se une al objetivo se captura en el filtro de nitrocelulosa, mientras que el ARN no unido al objetivo se captura en el filtro de nylon. El papel de transferencia de gel se incluye como un medio de soporte para los otros filtros . Después de la filtración, las capas del filtro se separan, se secan y exponen en una pantalla de fósforo y se cuantifican utilizando un sistema de formación de imágenes con fósforo del cual (sic) . Los resultados cuantificados pueden utilizarse para generar curvas de unión al aptámero de las cuales pueden calcularse las constantes de disociación (KD) . En una modalidad preferida, el medio amortiguado utilizado para realizar las reacciones de unión es IX de PBS de Dulbecco (con Ca++ y Mg++) más 0.1 mg/mL de BSA. Generalmente, la capacidad de un aptámero para modular la actividad funcional de un objetivo, es decir, la actividad funcional del aptámero, puede valorarse utilizando modelos in vi tro e in vivo, que variarán dependiendo de la función biológica del objetivo. En algunas modalidades, los aptámeros de la presente invención pueden inhibir una función biológica conocida del objetivo, mientras que en otras modalidades, los aptámeros de la invención pueden estimular una función biológica conocida del objetivo. La actividad funcional de los aptámeros de la presente invención puede valorarse utilizando modelos in vi tro e in vivo diseñados para medir una función conocida del objetivo del aptámero. Los aptámeros de la presente invención pueden adaptarse de manera rutinaria para propósitos de diagnóstico de acuerdo con cualquier número de técnicas empleadas por aquellos con experiencia en la técnica. La utilización en el diagnóstico puede incluir tanto aplicaciones de diagnóstico in vivo o in vi tro . Los agentes de diagnóstico sólo necesitan ser capaces de permitir al usuario identificar la presencia de un objetivo dado en un escenario o concentración particular. Simplemente la capacidad para formar pares de unión con el objetivo puede ser suficiente para desencadenar una señal positiva para propósitos de diagnóstico. Aquellos con experiencia en la técnica también serían capaces de adaptar cualquier aptámero mediante procedimientos conocidos en la técnica, para incorporar una marca de etiquetado con el fin de rastrear la presencia de tal ligando. Tal marca podría utilizarse en varios procedimientos de diagnóstico.

APTÁMEROS QUE TIENEN MOTIVOS INMUNOESTIMULADORES El reconocimiento del ADN bacteriano por el sistema inmune del vertebrado se basa en el reconocimiento de los dinucleótidos CG no metilados en contextos de la secuencia particulares ( "motivos CpG" ) . Un receptor que reconoce tal motivo es un receptor 9 similar a Toll ("TLR 9"), un miembro de una familia de receptores similares a Toll (-10 miembros) que participa en la respuesta inmune innata reconociendo distintos componentes microbianos . TLR 9 se une a las secuencia de CpG de los oligodesoxinucleótidos no metilados ("ODN") de una manera específica de la secuencia. El reconocimiento de los motivos CpG desencadena los mecanismos de defensa que conducen a las respuestas inmunes innatas y finalmente adquiridas. Por ejemplo, la activación de TLR 9 en ratones induce la activación de las células que presentan el antígeno, la sobrerregulación de las moléculas de MHC clase I y II y la expresión de importantes moléculas y citocinas coestimuladoras incluyendo IL-12 e IL-23. Esta activación mejora tanto directa como indirectamente las respuestas de los linfocitos B y T, incluyendo la sobrerregulación robusta de de la citocina TH1 IFN-gamma. De manera colectiva, la respuesta a las secuencias CpG conduce a: protección contra enfermedades infecciosas, respuesta inmune mejorada a las vacunas, una respuesta efectiva contra el asma y citotoxicidad mejorada medida por las células dependiente del anticuerpo. Así, los ODN CpG pueden proporcionar protección contra enfermedades infecciosas, funcionar como inmunoadyuvantes o agentes terapéuticos para el cáncer (monoterapia o en combinación con un mAb u otras terapias) , y pueden disminuir el asma y la respuesta alérgica. Los aptámeros de la presente invención, por ejemplo, los aptámeros MNA, pueden comprender uno o más CpG u otra secuencia inmunoestimuladora. Tales aptámeros pueden identificarse o generarse mediante una variedad de estrategas, utilizando, por ejemplo, el proceso SELEX™ descrito en la presente. En general, las estrategias pueden dividirse en dos grupos. En un grupo, las estrategias están dirigidas a identificar o generar aptámeros que comprenden tanto un motivo CpG como otra secuencia inmunoestimuladora, así como un sitio de unión para un objetivo, en donde el objetivo (aquí posteriormente "objetivo no de CpG") es un objetivo diferente a uno conocido por reconocer los motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras y conocido por estimular una respuesta inmune tras la unión a un motivo CpG. La primera estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo no CpG específico, utilizando una recolección de oligonucleótidos, en donde un motivo CpG se ha incorporado en cada miembro de la recolección como, o como parte de, una región fija, por ejemplo, en algunas modalidades, la región aleatorizada de los miembros de la recolección comprende una región fija que tiene un motivo CpG incorporado en la misma, e identificar un aptámero que comprende un motivo CpG. La segunda estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo no CpG específico, de manera preferida, un objetivo y después de la selección, anexar un motivo CpG al extremo 5' y/o 3' o diseñar un motivo CpG en una región, de manera preferida, una región no esencial, del aptámero. La tercera estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo no CpG específico, en donde durante la síntesis de la recolección, la relación molar de los varios nucleótidos se desvía en uno o más pasos de adición de nucleótido, de manera que la región aleatorizada de cada miembro de la recolección está enriquecida con motivos CpG, e identificar un aptámero que comprende un motivo CpG. La cuarta estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo no CpG específico, e identificar un aptámero que comprende un motivo CpG. La quinta estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo no CpG específico e identificar un aptámero que, tras la unión, estimule una respuesta inmune, pero que no comprende un motivo CpG. En el grupo dos, las estrategias están dirigidas para identificar o generar aptámeros que comprenden un motivo CpG y/u otras secuencias que están unidas por los receptores para los motivos CpG (por ejemplo, TLR9 o los otros receptores similares a toll) y tras la unión, estimular una respuesta inmune. La primera estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo conocido por unirse a los motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras y tras la unión, estimular una respuesta inmune utilizando una recolección de oligonucleótidos, en donde un motivo CpG se ha incorporado en cada miembro de la recolección, como, o como parte de, una región fija, por ejemplo, en algunas modalidades, la región aleatorizada de los miembros de la recolección comprende una región fija que tiene un motivo CpG incorporado en la misma, e identificar un aptámero que comprende un motivo CpG. La segunda estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo conocido por unirse a los motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras y tras las unión, estimular una respuesta inmune y a continuación anexar un motivo CpG al extremo 5' y/o 3' o diseñar un motivo CpG en una región, de manera preferida, una región no esencial, de un aptámero. La tercera estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo conocido por unirse a los motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras y tras la unión, estimular una respuesta inmune, en donde durante la síntesis de la recolección, la relación molar de los varios nucleótidos se desvía en uno o más pasos de adición del nucleótido, de manera que la región aleatorizada de cada miembro de la recolección está enriquecido con motivos CpG, e identificar un aptámero que comprende un motivo CpG. La cuarta estrategia de este grupo comprendé realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo conocido por unirse a motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras y tras la unión, estimular una respuesta inmune e identificar un aptámero que comprende un motivo CpG. La quinta estrategia de este grupo comprende realizar un SELEX™ para obtener un aptámero para un objetivo conocido por unirse a los motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras, e identificar un aptámero que tras la unión, estimula una respuesta inmune, pero que no comprende un motivo CpG. Se ha identificado una variedad de diferentes clases de motivos CpG, cada una que resulta tras el reconocimiento en una cascada diferente de eventos, en la liberación de citocinas y otras moléculas, y la activación de ciertos tipos de células. Véase, por ejemplo, CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, Annu. Rev. Immunol. 2002, 20:709-760, incorporada en la presente como referencia. Los motivos inmunoestimuladores adicionales se describen en las siguientes Patentes de los Estados Unidos, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia: Patente de los Estados Unidos No. 6,207,646; Patente de los Estados Unidos No. 6,239,116; Patente de los Estados Unidos No. 6,429,199; Patente de los Estados Unidos No. 6,214,806; Patente de los Estados Unidos No. 6,653,292; Patente de los Estados Unidos No. 6,426,434; Patente de los Estados Unidos No. 6,514,948 y Patente de los Estados Unidos No. 6,498,148. Cualquiera de estos CpG u otros motivos inmunoestimuladores pueden incorporarse en un aptámero. La elección de los aptámeros es dependiente de la enfermedad o el trastorno a ser tratado. Los motivos inmunoestimuladores preferidos son como sigue (mostrados 5' a 3' de izquierda a derecha), en donde "r" designa una purina, "y" designa una pirimidina y "X" designa cualquier nucleótido: AACGTTCGAG (SEQ ID NO: 136); AACGTT; ACGT, rCGy; rrCGyy, XCGX, XXCGXX y XiXzCGYxYz en donde Xx es G o A, X2 no es C, Yi no es G y Y2 es de manera preferida T. En aquellos casos en donde un motivo CpG se incorpora en un aptámero que se une a un objetivo específico diferente a un objetivo conocido por unirse a los motivos CpG y tras la unión estimula una respuesta inmune (un "objetivo no CpG"), el CpG se localiza de manera preferida en una región no esencial del aptámero. Las regiones no esenciales de los aptámeros pueden identificase mediante la mutagénesis dirigida al sitio, análisis de la supresión y/o análisis de la sustitución. Sin embargo, cualquier ubicación que no interfiera de manera significativa con la capacidad del aptámero para unirse al objetivo no CpG puede utilizarse. Además de estar incluido adentro de la secuencia del aptámero, el motivo CpG puede anexarse a alguno o ambos de los extremos 5' y 3' o unirse de otra manera al aptámero. Cualquier ubicación o medio de unión puede utilizarse, siempre que no interfiera de manera significativa con la capacidad del aptámero para unirse al objetivo no CpG. Como se utiliza en la presente, "estimulación de una respuesta inmune" puede significar ya sea (1) la inducción de una respuesta específica (por ejemplo, inducción de una respuesta Thl) o de la producción de ciertas moléculas o (2) la inhibición o supresión de una respuesta específica (por ejemplo, inhibición o supresión de la respuesta Th2) o de ciertas moléculas.

MODULACIÓN DE LA FARMACOCINÉTICA Y BIODISTRIBUCIÓN DE LOS AGENTES TERAPÉUTICOS DEL APTÁMERO Es importante que las propiedades farmacocinéticas para todos los agentes terapéuticos basados en oligonucleótidos, incluyendo los aptámeros, se ajusten para que coincidan con la aplicación farmacéutica deseada. Aunque los aptámeros dirigidos contra los objetivos extracelulares no sufren de las dificultades asociadas con el suministro intracelular (como es el caso con los agentes terapéuticos basados en ARNi y antisentido) , tales aptámeros deben ser todavía capaces de distribuirse a los órganos y tejidos objetivo, y permanecer en el cuerpo (no modificados) durante un periodo de tiempo consistente con el régimen de dosificación deseado. Así, la presente invención proporciona materiales y métodos para afectar la farmacocinética de las composiciones del aptámero, y en particular, la capacidad para afinar la farmacocinética del aptámero. La capacidad de afinación de (es decir, la capacidad de modular) la farmacocinética del aptámero se logra a través de la conjugación de las porciones modificantes (por ejemplo, polímeros de PEG) al aptámero y/o la incorporación de los nucleótidos modificados (por ejemplo, 2' -fluoro o 2'-0-metilo) para alterar la composición química del ácido nucleico. La capacidad para afinar la farmacocinética del aptámero se utiliza en la mejora de las aplicaciones terapéuticas existentes, o de manera alterna, en el desarrollo de nuevas aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en entornos antineoplásicos o de cuidado agudo en donde puede desearse la rápida eliminación o anulación del fármaco, es deseable disminuir los tiempos de residencia de los aptámeros en la circulación. De manera alterna, en otras aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, las terapias de mantenimiento en donde se desea la circulación de un agente terapéutico, pueden ser deseables para incrementar los tiempos de residencia de los aptámeros en la circulación. Además, la capacidad de afinación de la farmacocinética del aptámero se utiliza para modificar la biodistribución de un agente terapéutico del aptámero en un sujeto. Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, puede ser deseable alterar la biodistribución de un agente terapéutico del aptámero, en un esfuerzo para seleccionar un tipo particular de tejido o un órgano específico (o conjunto de órganos) . En estas aplicaciones, el agente terapéutico del aptámero se acumula de manera preferida en un tejido u órgano específico. En otras aplicaciones terapéuticas, puede ser deseable seleccionar tejidos que muestran un marcador celular o un síntoma asociado con una enfermedad, lesión celular u otra patología anormal dada, de manera que el agente terapéutico del aptámero se acumula de manera preferida en el tejido afectado. Por ejemplo, como se describió en la solicitud provisional copendiente de los Estados Unidos No. de Serie 60/550790, presentada en marzo 5, del 2004, y titulada "Modulación Controlada de la Farmacocinética y la Biodistribución de los Agentes Terapéuticos del Aptámero" y en la solicitud no provisional de los Estados Unidos No. de Serie. 10/ , , presentada en marzo 7 del 2005, y titulada "Modulación Controlada de la Farmacocinética y la Biodistribución de los Agentes Terapéuticos del Aptámero" , la PEGilación de un agente terapéutico del aptámero (por ejemplo, PEGilación con un polímero de PEG de 20 kDa) se utiliza para seleccionar tejidos inflamados, de manera que el agente terapéutico del aptámero PEGilado se acumula de manera preferida en el tejido inflamado. Para determinar los perfiles de la farmacocinética y la biodistribución de los agentes terapéuticos del aptámero (por ejemplo, conjugados del aptámero o aptámeros que tienen químicas alteradas, tales como nucleótidos modificados) , se verifica una variedad de parámetros. Tales parámetros incluyen, por ejemplo, la vida media (t?/2) , la eliminación en plasma (CL) , el volumen de la distribución (Vss) , el área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC) , concentración máxima observada en suero o plasma (Cmax) y el tiempo de residencia medio (MRT) de una composición de un aptámero. Como se utiliza en la presente, el término "AUC" se refiere al área bajo la gráfica de la concentración en plasma de un agente terapéutico del aptámero versus el tiempo después de la administración del aptámero. El valor de la AUC se utiliza para estimar la biodisponibilidad (es decir, el porcentaje del agente terapéutico del aptámero administrado en la circulación después de la administración del aptámero) y/o la eliminación total (Cl) (es decir, la velocidad a la cual el agente terapéutico del aptámero se elimina de la circulación) de un agente terapéutico del aptámero dado. El volumen de la distribución se relaciona con la concentración en plasma de un agente terapéutico del aptámero con la cantidad del aptámero presente en el cuerpo. Entre mayor sea el Vss, más aptámero se encuentra fuera del plasma (es decir, más extravasación) . La presente invención proporciona materiales y métodos para modular, de una manera controlada, la farmacocinética y la biodistribución de las composiciones estabilizadas de aptámero, por ejemplo, aptámeros MNA in vivo mediante la conjugación de un aptámero, por ejemplo, un aptámero MNA, a una porción moduladora tal como una molécula pequeña, péptido o grupo terminal polimérico, o mediante la incorporación de nucleótidos modificados en el aptámero. Como se describe en la presente, la conjugación de una porción modificante y/o alterar la composición química de los nucleótidos, altera los aspectos fundamentales del tiempo de residencia en la circulación y la distribución a los tejidos.

Además de la eliminación por las nucleasas, los agentes terapéuticos de oligonucleótidos son sometidos a la eliminación vía filtración renal. Por lo tanto, un oligonucleótido resistente a las nucleasas, administrado de manera intravenosa, típicamente exhibe una vida media in vivo de <10 minutos, a menos que la filtración pueda bloquearse. Esto puede lograrse facilitando la distribución rápida fuera de la corriente sanguínea en los tejidos o incrementando el peso molecular aparente del oligonucleótido por encima de su corte de tamaño efectivo para los glomérulos. La conjugación de agentes terapéuticos pequeños a un polímero de PEG (PEGilación) , descrita a continuación, puede alargar dramáticamente los tiempos de residencia de los aptámeros en circulación, disminuyendo por lo tanto la frecuencia de la dosificación y mejorando la efectividad contra los objetivos vasculares. Los aptámeros pueden conjugarse a una variedad de porciones modificantes, tales como polímeros de alto peso molecular, por ejemplo, PEG; péptidos, por ejemplo, Tat (un fragmento de 13 aminoácidos de la proteína Tat de VIH (Vives, et al, (1997), J. Biol. Chem. 272 (25) : 16010-7) ) , Ant (una secuencia de 16 aminoácidos derivada de la tercera hélice de la proteína homeótica de Drosophila antennapedia (Pietersz, et al, (2001), Vaccine 19 (11-12) : 1397-405) ) y Arg7 (un péptido corto, cargado positivamente que permea las células, compuesto de poliarginina (Arg7) (Rothbard, et al, (2000), Nat. Med. 6 (11) : 1253-7 ; Rothbard, J et al, (2002), J. Med. Chem. 45 (17) : 3612-8) ) ; y moléculas pequeñas, por ejemplo, compuestos lipofílicos tales como colesterol. Entre los varios conjugados descritos en la presente, las propiedades in vivo de los aptámeros son alteradas de manera más profunda mediante la complej ación con grupos PEG. Por ejemplo, la complej ación de un agente terapéutico del aptámero modificado con 2'F y 2' -OMe, mezclado con un polímero de PEG de 20 kDa impide la filtración renal y promueve la distribución del aptámero en los tejidos sanos e inflamados. Además, el conjugado del polímero de PEG de 20 kDa-aptámero probó ser casi tan efectivo como un polímero de PEG de 40 kDa en evitar la filtración renal de los aptámeros. Mientras que un efecto de la PEGilación es la eliminación del aptámero, la exposición sistémica prolongada proporcionada por la presencia de la porción de 20 kDa también facilita la distribución del aptámero a los tejidos, particularmente aquéllos de órganos altamente perfundidos y aquéllos en el sitio de la inflamación. El conjugado del aptámero-polímero de PEG de 20 kDa dirige la distribución del aptámero al sitio de inflamación, de manera que el aptámero PEGilado se acumula de manera preferida en el tejido inflamado. En algunos casos, el conjugado del aptámero PEGilado de 20 kDa es capaz de acceder al interior de las células, tal como por ejemplo, las células del riñon. Los nucleótidos modificados también pueden utilizarse para modular la eliminación en plasma de los aptámeros. Por ejemplo, un aptámero no conjugado, que incorpora tanto las químicas estabilizantes de 2'-F y 2'-OMe, que es típico de la generación actual de aptámeros, puesto que exhibe un alto grado de estabilidad de la nucleasa in vi tro e in vivo, muestra una rápida pérdida del plasma (es decir, rápida eliminación del plasma) y una rápida distribución en los tejidos, principalmente en el riñon, cuando se compara con el aptámero no modificado. ÁCIDOS NUCLEICOS DERIVADOS DE PEG Como se describió anteriormente, la derivación de los ácidos nucleicos con polímeros no inmunogénicos de alto peso molecular tiene el potencial de alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los ácidos nucleicos, haciéndolos agentes terapéuticos más efectivos. Los cambios favorables en la actividad pueden incluir resistencia incrementada a la degradación por las nucleasas, filtración disminuida a través de los ríñones, exposición disminuida al sistema inmune y distribución alterada del agente terapéutico a través del cuerpo. Las composiciones del aptámero de la invención pueden derivarse con porciones de polialquilenglicol (PAG) . Los ejemplos de ácidos nucleicos derivados con PAG se encuentran en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/718,833, presentada en noviembre 21 del 2003, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Los polímeros típicos utilizados en la invención incluyen poli (etilenglicol) ("PEG"), también conocido como poli (óxido de etileno) ("PEO") y polipropilenglicol (incluyendo poliisopropilenglicol) . Además, pueden utilizarse copolímeros aleatorios o de bloque de diferentes óxidos de alquileno (por ejemplo, óxido de etileno y óxido de propileno) en muchas aplicaciones. En su forma más común, un polialquilenglicol, tal como PEG, es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: HO-CH2CH20- (CHCH20)n-CH2CH2-OH. Este polímero, alfa-, omega-dihidroxilpoli (etilenglicol) , también puede representarse como HO-PEG-OH, en donde se entiende que el símbolo -PEG-representa la siguiente unidad estructural: -CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2- , en donde n varía típicamente de aproximadamente 4 a aproximadamente 10,000. Como se muestra, la molécula de PEG es difuncional y algunas veces se refiere como un "diol PEG." Las porciones terminales de la molécula de PEG son porciones hidroxilo relativamente no reactivas, los grupos -OH, que pueden activarse o convertirse a porciones funcionales, para la unión del PEG a otros compuestos en los sitios reactivos del compuesto. Tales dioles PEG activados son referidos en la presente como PEG biactivados. Por ejemplo, las porciones terminales del diol PEG se han funcionarizado como un éster de carbonato activo para la reacción selectiva con porciones amino mediante la sustitución de porciones hidroxilo relativamente no reactivas, -OH, con porciones de éster de succinimidilo activas de la N-hidroxi succinimida. En muchas aplicaciones, es deseable coronar la molécula de PEG en un extremo con una porción esencialmente no reactiva, de manera que la molécula de PEG es monofuncional (o monoactivada) . En el caso de agentes terapéuticos de proteína que muestran generalmente múltiples sitios de reacción para los PEG activados, los PEG activados bifuncionales conducen a una reticulación extensa, proporcionando agregados funcionales de manera deficiente. Para generar PEG monoactivados, una porción hidroxilo en el término de la molécula de diol PEG típicamente se sustituye con una porción de extremo metoxi no reactiva, -OCH3. El otro término no coronado de la molécula de PEG típicamente se convierte a una porción de extremo reactiva que puede activarse para la unión a un sitio respectivo en una superficie o una molécula tal como una proteína. Los PAG son polímeros que típicamente tienen las propiedades de solubilidad en agua y en muchos solventes orgánicos, carecen de toxicidad y carecen de inmunogenicidad. Un uso de los PAG es unir de manera covalente el polímero a moléculas insolubles para hacer soluble el "conjugado" de la molécula de PAG resultante. Por ejemplo, se ha mostrado que el fármaco insoluble en agua paclitaxel, cuando se acopla al PEG, se vuelve soluble en agua. Greenwald, et al., J. Org. Chem., 60:331-336 (1995) . Los conjugados de PAG con frecuencia se utilizan no sólo para mejorar la solubilidad y estabilidad, sino también para prolongar la vida media en la circulación sanguínea de las moléculas . Los compuestos polialquilados de la invención son típicamente de entre 5 y 80 kDa de tamaño, sin embargo, puede utilizarse cualquier tamaño, la elección depende del aptámero y de la aplicación. Otros compuestos de PAG de la invención son de entre 10 y 80 kDa de tamaño. Aún otros compuestos de PAG de la invención son de entre 10 y 60 kDa de tamaño. Por ejemplo, un polímero PAG puede ser de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 u 80 kDa de tamaño. Tales polímeros pueden ser lineales o ramificados. En algunas modalidades, los polímeros son PEG. En contraste con los agentes terapéuticos de proteína expresados biológicamente, los agentes terapéuticos de ácidos nucleico son típicamente, sintetizados químicamente a partir de nucleótidos de monómero activados. Los conjugados de PEG-ácido nucleico pueden prepararse incorporando el PEG utilizando la misma síntesis iterativa del monómero. Por ejemplo, los PEG activados mediante la conversión a una forma de fosforamidita pueden incorporarse en la síntesis del oligonucleótido en fase sólida. De manera alterna, la síntesis del oligonucleótido puede terminarse con la incorporación específica del sitio de un sitio de unión del PEG reactivo. De manera más común, esto se ha logrado mediante la adición de una amina primaria libre en el término 5' (incorporada utilizando una fosforamidita modificadora en el último paso de acoplamiento de la síntesis en fase sólida) . Utilizando este procedimiento, un PEG reactivo (por ejemplo, uno que es activado de manera que reaccionará y formará un enlace con una amina) se combina con el oligonucleótido purificado y la reacción de acoplamiento se lleva a cabo en solución. La capacidad de la conjugación con PEG para alterar la biodistribución de un agente terapéutico se relaciona con varios factores, incluyendo el tamaño aparente (por ejemplo, como se mide en términos del radio hidrodinámico) del conjugado. Los conjugados más grandes (>10kDa) son conocidos por bloquear de manera más efectiva la filtración vía el riñon y de incrementar en consecuencia la vida media en suero de las macromoléculas pequeñas (por ejemplo, péptidos, oligonucleótidos antisentido) . La capacidad de los conjugados de PEG para bloquear la filtración ha mostrado incrementarse con el tamaño del PEG hasta aproximadamente 50 kDa (los incrementos adicionales tienen un efecto mínimo puesto que la vida media se define por el metabolismo mediado por el macrófago, más que por la eliminación vía los ríñones) . La producción de PEG de alto peso molecular (>10 kDa) puede ser difícil, ineficiente y cara. Como una ruta hacia la síntesis de conjugados de PEG-ácido nucleico de alto peso molecular, el trabajo previo se ha enfocado hacia la generación de PEG activados de peso molecular más alto. Un método para generar tales moléculas involucra la formación de un PEG activado ramificado, en el cual dos o más PEG se unen a un núcleo central que porta el grupo activado. Las porciones terminales de estas moléculas de PEG de peso molecular más alto, es decir, las porciones hidroxilo (-OH) relativamente no reactivas, pueden activarse o convertirse a porciones funcionales, para la unión de uno o más de los PEG a otros compuestos en los sitios reactivos en el compuesto. Los PEG activados ramificados tendrán más de dos términos, y en los casos en donde dos o más términos se han activado, tales moléculas de PEG activadas, de peso molecular más alto, son referidas en la presente como PEG con múltiples activaciones. En algunos casos, no todos los términos en una molécula de PEG ramificada están activados. En los casos en donde cualquiera de dos términos de una molécula de PEG ramificada está activado, tales moléculas de PEG son referidas como PEG biactivados. En algunos casos en donde sólo un término en una molécula de PEG ramificada está activado, tales moléculas de PEG se refieren como monoactivadas . Como un ejemplo de este procedimiento, se ha descrito un PEG activado preparado mediante la unión de dos PEG de monometoxi a un núcleo de lisina que es activado posteriormente para la reacción (Harris et al, Nature, vol.2: 214-221, 2003). La presente invención proporciona otra ruta efectiva en costo para la síntesis de conjugados de PEG-ácido nucleico de alto peso molecular (de manera preferida, aptámeros) que incluyen múltiples ácidos nucleicos PEGilados. La presente invención también abarca oligonucleótidos multiméricos enlazados a PEG, por ejemplo, aptámeros dimerizados. La presente invención también se refiere a composiciones de alto peso molecular en donde una porción estabilizante de PEG es un enlazante que separa diferentes porciones de un aptámero, por ejemplo, el PEG se conjuga dentro de una sola secuencia del aptámero, de manera que el arreglo lineal del aptámero de alto peso molecular es, por ejemplo, ácido nucleico-PEG-ácido nucleico (-PEG-ácido nucleico) n en donde n es mayor que o igual a 1. Las composiciones de alto peso molecular de la invención incluyen aquéllas que tienen un peso molecular de al menos 10 kDa. Las composiciones típicamente tienen un peso molecular entre 10 y 80 kDa de tamaño. Las composiciones de alto peso molecular de la invención son de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 u 80 kDa de tamaño. Una porción estabilizante es una molécula o porción de una molécula, que mejora las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de las composiciones de aptámero de alto peso molecular de la invención. En algunos casos, una porción estabilizante es una molécula o porción de una molécula que lleva dos o más aptámeros, o dominios del aptámero en proximidad, o proporciona una libertad rotacional total disminuida de las composiciones del aptámero de alto peso molecular de la invención. Una porción estabilizante puede ser un polialquilenglicol, tal como polietilenglicol, que puede ser lineal o ramificado, un homopolímero o un heteropolímero. Otras porciones estabilizantes incluyen polímeros tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) . Los oligonucleótidos también pueden ser porciones estabilizantes; tales oligonucleótidos pueden incluir nucleótidos modificados y/o enlaces modificados, tales como fosforotioatos . Una porción estabilizante puede ser una parte integral de una composición de un aptámero, es decir, se une de manera covalente al aptámero. Las composiciones de la invención incluyen composiciones de aptámero de alto peso molecular, en las cuales dos o más porciones de ácido nucleico están conjugadas de manera covalente a al menos una porción de polialquilenglicol. Las porciones de polialquilenglicol sirven como porciones estabilizantes. En las composiciones en donde una porción de polialquilenglicol está unida de manera covalente a cualquier extremo de un aptámero, de manera que el polialquilenglicol une las porciones de ácido nucleico en una molécula, se dice que el polialquilenglicol es una porción enlazante. En tales composiciones, la estructura primaria de la molécula covalente incluye el arreglo lineal ácido nucleico-PAG-ácido nucleico. Un ejemplo es una composición que tiene la estructura primaria ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Otro ejemplo es un arreglo lineal de: ácido nucleico-PEG-ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Para producir el conjugado de ácido nucleico-PEG-ácido nucleico, el ácido nucleico es sintetizado originalmente de manera que porte un solo sitio reactivo (por ejemplo, es monoactivado) . En una modalidad preferida, este sitio reactivo es un grupo amino introducido en el término 5' mediante la adición de un modificador de fosforamidita como el último paso en la síntesis en fase sólida del oligonucleótido. Después de la desprotección y purificación del oligonucleótido modificado, éste se reconstituye a una alta concentración en una solución que reduce el mínimo la hidrólisis espontánea del PEG activado. En una modalidad preferida, la concentración del oligonucleótido es de 1 mM y la solución reconstituida contiene amortiguador de NaHC03 200 mM, pH 8.3. La síntesis del conjugado se inicia mediante la adición lenta, paso a paso, del PEG bifuncional altamente purificado. En una modalidad preferida, el PEG diol está activado en ambos extremos (biactivado) mediante la derivación con propionato de succinimidilo. Después de la reacción, el conjugado de PEG-ácido nucleico se purifica mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida para separar las especies conjugadas de manera completa y parcial y las especies no conjugadas. Múltiples moléculas de PAG concatenadas (por ejemplo, como copolímeros aleatorios o de bloque) o cadenas de PAG más pequeñas pueden enlazarse para lograr varias longitudes (o pesos moleculares) . Pueden utilizarse enlazantes que no son de PAG entre las cadenas de PAG de longitudes variables . Las modificaciones de 2'-0-metilo, 2' -fluoro y otras modificaciones de nucleótido estabilizan el aptámero contra las nucleasas e incrementa su vida media in vivo . La corona 3'-3'-dT también incrementa la resistencia a la exonucleasa. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos 5,674,685; 5,668,264; 6,207,816 y 6,229,002, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

DERIVACIÓN CON PAG DE UN ÁCIDO NUCLEICO REACTIVO Los conjugados de PAG-ácido nucleico-PAG de alto peso molecular pueden prepararse mediante la reacción de un PEG activado monofuncional con un ácido nucleico que contiene más de un sitio reactivo. En una modalidad, el ácido nucleico es birreactivo, o está biactivado, y contiene dos sitios reactivos: un grupo 5' -amino y un grupo 3' -amino introducido en el oligonucleótido a través de la síntesis convencional de la fosforamidita, por ejemplo: 3'-5' -di-PEGilación como se ilustra en la Figura 2. En modalidades alternas, los sitios reactivos pueden introducirse en posiciones internas, utilizando, por ejemplo, la posición 5 de las pirimidinas, la posición 8 de las purinas o la posición 2' de la ribosa en los sitios para la unión de las aminas primarias. En tales modalidades, el ácido nucleico puede tener varios sitios activados o reactivos y se dice que está activado de manera múltiple. Después de la síntesis y la purificación, el oligonucleótido modificado se combina con el PEG monoactivado bajo condiciones que fomentan la reacción selectiva con los sitios reactivos del oligonucleótido, mientras que reduce al mínimo la hidrólisis espontánea. En la modalidad preferida, el monometoxi-PEG es activado con propionato de succinimidilo y la reacción acoplada se lleva a cabo a pH 8.3. Para accionar la síntesis del PEG bisustituido, se proporciona un exceso estequiométrico con relación al oligonucleótido. Después de la reacción, el conjugado de PEG-ácido nucleico se purifica mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida para separar las especies conjugadas de manera completa y parcial y las especies no conjugadas. Los dominios de enlace también pueden tener una o más porciones de polialquilenglicol unidas a los mismos. Tales PAG pueden ser de una variedad de longitudes y pueden utilizarse en combinaciones apropiadas para lograr el peso molecular deseado de la composición. El efecto de un enlazante particular puede influenciarse por su composición química y su longitud. Un enlazante que es demasiado largo, demasiado corto o forma interacciones estéricas y/o iónicas desfavorables con el objetivo, excluirá la formación de un complejo entre el aptámero y el objetivo. Un enlazante, que es más largo que lo necesario para abarcar la distancia entre los ácidos nucleicos, puede reducir la estabilidad de unión disminuyendo la concentración efectiva del ligando. Así, con frecuencia es necesario optimizar las composiciones y longitudes del enlazante, con el fin de maximizar la afinidad de un aptámero para un objetivo. Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente se incorporan como referencia como si cada publicación o documento se indicara de manera específica e individual como incorporado en la presente como referencia. La cita de las publicaciones y documentos de patente no pretende ser una admisión de que cualquiera es una técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión del contenido o la fecha de los mismos. Habiéndose descrito ahora la invención por medio de la descripción escrita, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes son para propósitos de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen. Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente se incorporan como referencia como si cada publicación o documento se indicara de manera específica e individual como incorporado en la presente como referencia. La cita de las publicaciones y documentos de patente no pretende ser una admisión de que cualquiera es una técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión del contenido o la fecha de los mismos. Habiéndose descrito ahora la invención por medio de la descripción escrita, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes son para propósitos de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.

EJEMPLOS EJEMPLO 1; IDENTIFICACIÓN DE LAS SECUENCIAS 5 ' -LÍDER UTILIZANDO EL MÉTODO TR-SELEX™ Una biblioteca de ADN degenerado con el siguiente diseño (mostrado en la dirección 5' a 3') : Promotor T7/G4/20 nucleótidos degenerados/secuencia 3 '-fija se sintetizó con la siguiente secuencia: 5 ' TAATACGACTCACTATAGGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACGTAACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT3 ' (ARC1140, SEQ ID NO 7)). Esta biblioteca se amplificó utilizando el cebador 3 ' -AGCTAGCTTACTGCATCGAC (SEQ ID NO 104) y el cebador 5 ' -TAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO 105). La biblioteca de doble hebra se transcribió a continuación utilizando IX del Amortiguador de Transcripción (HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%) a 37 °C durante la noche bajo las siguientes condiciones: 2' -OMe ATP, CTP, UTP, GTP 1 mM cada uno, 2' -OH GTP 30 µM, MgCl2, 6.5 mM, MnCl2 2.0 mM, PEG-8000 al 10% peso/volumen, GMP 1 mM, pirofosfatasa inorgánica 0.5 unidades por 100 µL de reacción y la ARN polimerasa T7 Y639F/H784A/K378R 200 nM. La mezcla resultante se precipitó a continuación (isopropanol, cloruro de sodio, EDTA) , se purificó con gel (PAGE al 10%) , se escindió y se extrajo del gel, se trató con DNasa (RQ1, Promega, Madison Wl) , se transcribió de manera inversa a 65 °C (Thermoscript , Invitrogen, Carlsbad, CA) , utilizando el cebador 3' utilizado para la PCR, y se diluyó directamente en una reacción de ligadura fragmentada con los siguientes oligonucleótidos. oligonucleótido fosforilado 5' que codifica un promotor T7 (en donde p significa la 5' -fosforilación) : pTATAGTGAGTCGTATTA 3' (SEQ ID NO 8 ) Fragmentación para la ligadura: 5 ' TAATACGACTCACTATAGGGG 3' (SEQ ID NO 9) . Esta mezcla se desnaturalizó con calor, se recoció y a continuación se agregó la ADN ligasa T4 (NEB, Beverley MA) , seguido por la incubación a 16 °C durante la noche. Posterior al paso de ligadura, la reacción se diluyó directamente en una PCR con los cebadores ya descritos para amplificar las secuencias transcritas para la introducción a la siguiente ronda del método SELEX™. Este esquema se presenta en la Figura 2. Después de tres rondas de la selección TR-SELEX™, la biblioteca se clonó utilizando un equipo de clonación TOPO TA siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) , se secuenció, y las estadísticas de la aparición de los nucleótidos en las regiones degeneradas se analizaron. Las clonas individuales se valoraron mediante análisis de PAGE-gel por su capacidad para aplantillar la transcripción de grandes concentraciones del transcripto, y las secuencias de aquéllas que produjeron los rendimientos más altos del transcripto, se utilizaron a continuación en el diseño de bibliotecas que, a su vez, se probaron mediante análisis con gel por su capacidad para aplantillar la transcripción de altos rendimientos del transcripto. La Figura 3 muestra el porcentaje promedio de la composición del nucleótido de las regiones de las veinte posiciones degeneradas antes y después de 3 rondas de la selección TR-SELEX™. Como se indica por la Figura 3, una fuerte preferencia por G de las posiciones 5 a 13 en el transcripto (1 a 9 en la región degenerada) , se transcribió, posteriormente, ningún nucleótido se transcribió de manera preferencia. Las clonas descubiertas secuenciando después de 3 Rondas de la selección TR-SELEX™ se seleccionaron PAGE-gel por su capacidad para transcribir los nucleótidos 2 '-OMe utilizando una plantilla -200 nM, IX de Amortiguador de Transcripción (HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%), 2'-OMe ATP, CTP, UTP, GTP a 1 mM cada uno, 2 '-OH GTP 30 uM, MgCl2, 6.5 mM, MnCl2 2 mM, PEG-8000 al 10% peso/volumen, GMP 1 mM, pirofosfatasa inorgánica 0.5 unidades por 100 µL de reacción, y la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R 200 nM, a 37°C durante la noche. Un ejemplo de una clona de la Ronda 3, la clona AMX411.D6 proporcionó de manera significativa más transcripto MNA, como se visualiza mediante PAGE-gel, cuando se compara con las clonas de la Ronda 0. Las secuencias de ADN de las clonas generadas de la Ronda 3 se listan a continuación (todas las secuencias listadas están en la dirección 5 '-3'): SEQ ID NO 10 >AMX(411)_A1 ARC 1140 Rd 3_411-A1 TAATACGACTCACTATAGGGGGTGGGGCCAATGGCGGGATATACGTAACCGGTTATACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 11 >AMX(411)_B1 ARC 1140 Rd 3_411-B1 TAATACGACTCACTATAGGGGATGTACATATGTATTCGTGACGTGACCGGTTAAACCCG GGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 12 >AMX(411)_C1 ARC 1140 Rd 3_411-C1 TAATACGACTCACTATAGGGGGAGCGGGGAGACGTAGTCATCACGTAGCCGGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 13 >AMX(411)_D1 ARC 1140 Rd 3_411-D1 TAATACNACTCACTATAGGGGGTGGGGGTGGTGGTGATAACGTAACCGGTTAAACCCGG GTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 14 >AMX(411)_E1 ARC 1140 Rd 3_411-E1 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGTCACCAGATATGCCTTGAACGTAACCCGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 15 >AMX(411)_F1 ARC 1140 Rd 3_411-F1 TAATACGACTCACTATAGGGGGTAGGGGGCACGCACTAACCAACGTAACCGGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 16 >AMX(411)_G1 ARC 1140 Rd 3_411-G1 TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGGGTGCTGACCNCAAACA SEQ ID NO 17 >AMX(411)_H1 ARC 1140 Rd 3_411-H1 TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGGCTCGGATGAGACAATACGTAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 18 >AMX (411) _A2 ARC 1140 Rd 3_411-A2 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGTGGGTAGGCGAGCACTCCACGTAACCAGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 19 >AMX(411)_B2 ARC 1140 Rd 3_411-B2 TAATACGACTCACTATAGGGGGGAAGGACGAGCAGACGAGCAACGTAACCTGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 20 >AMX(411)_C2 ARC 1140 Rd 3_411-C2 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGCGGTTAGAGTGTAAGTACCGACGTAACCGGTTAA ACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 21 >AMX (411) _D2 ARC 1140 Rd 3_411-D2 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTTGCTGTTAGTAACGCCACGTAACCGGTTAAACTTG GTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 22 >AMX(411)_E2 ARC 1140 Rd 3_411-E2 TAATACGACTCACTATAGGGGGGCGGGAGAATGTTATATAGTTACGGTAACCGGTTAAA CCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 23 >AMX(411)_F2 ARC 1140 Rd 3_411-F2 TAATACGACTCACTATAGGGGAAAGGGGCGGTATGGTACACACGTAACAGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 24 >AMX(411)_G2 ARC 1140 Rd 3_411-G2 TAATACGACTCACTATAGGGGGGACGTGTTAGCATTCCAGAATTCGTAACCTAAACCCG GGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 25 >AMX(411)_H2 ARC 1140 Rd 3_411-H2 TAATACGACTCACTATAGGGGGCGTGGGAGATAGGTTCAAGGACGTACCGGTTATACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 26 >AMX(411)_A3 ARC 1140 Rd 3_411-A3 TAATACGACTCACTATAGGGGGGCTCCGTGCTATCGTCGGATAACGTAACCCGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 27 >AMX(411)_B3 ARC 1140 Rd 3_411-B3 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAGAAGGTCTTAAGGTCGCCAACGTAACTGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 28 >AMX(411)_C3 ARC 1140 Rd 3_411-C3 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGCATACGAGTTTAGGTGGAGACGTAACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 29 >AMX(411)_D3 ARC 1140 Rd 3_411-D3 TAATACGACTCACTATAGGGGGATGATGACTTCCCCCITTAATACGTTACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 30 >AMX(411) E3 ARC 1140 Rd 3 411-E3 TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGACGCCGTCTGAGTATAACGTACCCGGTCGGGTCG ATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 31 >AMX(411)_G3 ARC 1140 Rd 3_411-G3 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGGACGTAATCGGCTATCGTTCACGTAACCGGTT AAACCCGGGTCGATGCAGTAAAGGGCGA SEQ ID NO 32 >AMX (411) _H3 ARC 1140 Rd 3_411-H3 TAATACGACTCACTATAGGGTGGGACGGGCAGCGTGGATGTAGGACGTAACCGGTTAAA CGCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 33 >AMX(411)_A4 ARC 1140 Rd 3_411-A4 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTTTGTCTGAAGTGAAGCAGAACGTAACCGGTTAATC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGC SEQ ID NO 34 >AMX(411)_B4 ARC 1140 Rd 3_411-B4 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAGGGCACATCATCGTATCAAACGTAACCAGTTAAT CCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 35 >AMX(411)_C4 ARC 1140 Rd 3_411-C4 TAATACGACTCACTATAGGGGAGGCTAGAGGACGCGACAGAACGTAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 36 >AMX(411)_D4 ARC 1140 Rd 3_411-D4 TAATACGACTCACTATAGGGGGCGATCGCGAAGGGATTTCAACGTAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 37 >AMX(411)_E4 ARC 1140 Rd 3_411-E4 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTAGGGAAAGATTACGGGGCTACGTAACCGGTTATAC CTGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 38 >AMX(411)_F4 ARC 1140 Rd 3_411-F4 TAATACGACTCACTATAGGGGTGGCTATGGCTAACACGTAACCGGTTATACCCGGGTCG ATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 39 >AMX(411)_G4 ARC 1140 Rd 3_411-G4 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGCGGTGGCTGTGCAAGCGGAAACGTAACCGGTTA AACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 40 >AMX(411)_H4 ARC 1140 Rd 3_411-H4 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGGGGCACGGTACTGAGTTACGTTACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 41 >AMX(411)_A5 ARC 1140 Rd 3_411-A5 TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGTGGGGACAATTAGAAGATGACGTAACCGTCCGGG TCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 42 >AMX(411)_B5 ARC 1140 Rd 3_411-B5 TAATACNACTCACTATAGGGGTGCAGTGAGGAGCGACNAGTACGTTACCGGTTAAATCC GAGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 43 >AMX(411)_C5 ARC 1140 Rd 3_411-C5 TAATACNACTCACTATAGGGGGACGGGCACTGTGGATGATTTAACGTTACCGGTTAAAC CCGAGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 44 >AMX(411)_D5 ARC 1140 Rd 3_411-D5 TAATACNACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 45>AMX(411)_E5 ARC 1140 Rd 3_411-E5 TAATACNACTCACTATAGGGGGTGATATTGACCTCTAACAGCACGTAACCGGTTAAACC CGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 46 >AMX(411)_F5 ARC 1140 Rd 3_411-F5 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGTGCAGAGGATGCATCCAAGCTCGTAATCGGTG GTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 47 >AMX(411)_G5 ARC 1140 Rd 3_411-G5 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGCGGGTGCTTGTGCCTAATCACGTAACCGGTTAAA CCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 48 >AMX(411)_H5 ARC 1140 Rd 3_411-H5 TAATACGACTCACTATAGGGGTTTGGTAATCGAACGTGGAACGCAACCGGTTTAACCGG GTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 49 >AMX(411)_A6 ARC 1140 Rd 3_411-A6 TAATACGACTCACTATAGGGGGGATGGAAGAGGCTTGATATCACGTAACCGGTTAAACC TGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 50 >AMX(411)_B6 ARC 1140 Rd 3_411-B6 TAATACGACTCACTATAGGGGGTTATACTAACTCTGTACACAACGTAACCGGCCGGGTC GATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 51 >AMX(411)_C6 ARC 1140 Rd 3_411-C6 TAATACGACTCACTATAGGGGTATAGGGGGGGTATCGGTGTACGTAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 52 >AMX(411)_D6 ARC 1140 Rd 3_411-D6 TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAAGGTTCCGAGAACGCGACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 53 >AMX(411)_E6 ARC 1140 Rd 3_411-E6 TAATACGACTCACTATAGGGGTGCGCGGTTACAAGGCAACATACGTAACCGGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 54 >AMX(411)_F6 ARC 1140 Rd 3_411-F6 TAATACNACTCACTATAGGGGGGACGGGGTGACAAAGTGTCNAACGTAACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 55>AMX(411)_G6 ARC 1140 Rd 3_411-G6 TAATACGACTCACTATAGGGGAGACGGCGGTACAAGTCCATATGTAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 56 >AMX(411)_H6 ARC 1140 Rd 3_411-H6 TAATACGACTCACTATAGGGGAGTGGGGGCTTCTCGTTGCCACGTAACCGCTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 57 >AMX(423)_A7 ARC 1140 R3_423-A7 TAATACGACTCACTATAGGGGGGCTGAGCGTGTTTGAGGGACCACGTTACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 58 >AMX(423)_B7 ARC 1140 R3_423-B7 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGGCGCAATGAAAAGTTGGGCGTAACCGGTTCAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 59 >AMX(423)_C7 ARC 1140 R3_423-C7 TAATACGACTCACTATAGGGGGTAGTGAAGTAAGGCAGTGTTACGTAACCGGTGAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 60 >AMX(423)_D7 ARC 1140 R3_423-D7 TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGGGTGGGCTAGAACACACAACGTAACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 61 >AMX(423)_E7 ARC 1140 R3_423-E7 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGAGAGAGGCGGTTACGTAGGGACGTTACCGATTGAA CTCAGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 62 >AMX(423) F7 ARC 1140 R3 423-F7 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGGCGAATAGGTAGGGCGACGAACGTTACCGGTT AAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 63 >AMX(423)_G7 ARC 1140 R3_423-G7 TAATACGACTCACTATAGGGGGAGAGGAGGTCCGGCTAGACAACGTAACCGGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 64 >AMX(423)_H7 ARC 1140 R3_423-H7 TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGGACGGGTCGTACTGTTAAACCTGGGTCGATGCAG TAAGCTAGCT SEQ ID NO 65 >AMX(423)_B8 ARC 1140 R3_423-B8 TAATACGACTCACTATAGGGGGCGCAACAACGGGAAGTATACGTAACCGGTTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 66 >AMX(423)_C8 ARC 1140 R3_423-C8 TAATACGACTCACTATAGGGGGAAGGAACACGCACATGCATAACGTAACTGGTTGACCC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 67 >AMX(423)_D8 ARC 1140 R3_423-D8 TAATACGACTCACTATAGGGGAGTGGGGAGTACTGTGGACAACGTGACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 68 >AMX(423)_E8 ARC 1140 R3_423-E8 TAATACGACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 69 >AMX(423)_F8 ARC 1140 R3_423-F8 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGCTAGGGCGGTCGGATCGGACGTAACCAGTTAA ACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 70 >AMX(423)_G8 ARC 1140 R3_423-G8 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGTGGGGGTTGCTACATGCCCTCGTAACCGGTTAAGC CCAGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 71 >AMX(423)_H8 ARC 1140 R3_423-H8 TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGCGACGATGGAGAGAATAACGTAATCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 72 >AMX(423)_A9 ARC 1140 R3_423-A9 TAATACGACTCACTATAGGGGGTAGGCGGGCCTCATCAACAACGCAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 73 >AMX(423)_B9 ARC 1140 R3_423-B9 TAATACGACTCACTATAGGGGGTGGCTGGTAAGGACACAAACACGTAACTCGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 74 >AMX(423)_C9 ARC 1140 R3_423-C9 TAATACGACTCACTATAGGGGGGCGGGCAGCGCTTATAGATCCACGTAACCGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 75 >AMX(423) D9 ARC 1140 R3 423-D9 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGTATCTGCGGTTAGGCTATCGACGTACCCAGTTA AACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 76 >AMX(423)_F9 ARC 1140 R3_423-F9 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGTAGGGGACATCATAGGTATACGTAACCGGTTAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 77 >AMX (423 ) _H9 ARC 1140 R3_423-H9 TAATACGACTCACTATAGGGGCGCGTGCGTGTATCCATTAAACGTGACTGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 78 >AMX (423 ) _A10 ARC 1140 R3_423-A10 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGAGCGTGGATCTTGAGTGTATACGTAACCGGTTAA ACCCGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 79 >AMX (423 ) _B10 ARC 1140 R3_423-B10 TAATACGACTCACTATAGGGGATGGAGAGGAGTGTACGCATATACAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 80 >AMX (423 ) _C10 ARC 1140 R3_423-C10 TAATACGACTCACTATAGGGGCGGGTGGTCGCGATGGTTAACGTAACTGGTTAAACCCG GGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 81 >AMX (423 ) _D10 ARC 1140 R3_423-D10 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGGGGACGTTAGCTTCTCTGTATTTACGTAACCG GTTAAGCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 82 >AMX (423 ) _E10 ARC 1140 R3_423-E10 TAATACGACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 83 >AMX (423 ) _F10 ARC 1140 R3_423-F10 TAATACGACTCACTATAGGGGGGATGGAGTGGGTGCAAATAANACGTAACTGGTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 84 >AMX (423 ) _G10 ARC 1140 R3_423-G10 TAATACGACTCACTATAGGGGAGNGTGAGGGGTGAATANTAANGTAANCNGTTAAACCT GGGTCGATGNNNTANNCTNGNT SEQ ID NO 85 >AMX (423 ) _H10 ARC 1140 R3_423-H10 NAATNNGACTCACAANAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 86 >AMX (423 ) _A11 ARC 1140 R3_423-A11 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGTGACGTACGGATCTAAGTAACGTAACCGGTTAAA CCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 87 >AMX (423) _B11 ARC 1140 R3_423-B11 TAATACGACTCACTATAGGGGAGGGACAGACACTTTGTAGACGTAACCAGTTAAACCCG GGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 88 >AMX(423) Cll ARC 1140 R3 423-C11 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGACTTGGCACTACGTAACAACGTAACCGCTTAAAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 89 >AMX (423 ) _D11 ARC 1140 R3_423-D11 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGGCCTCTCGACCAAAAGCCCAACGTAACCGGTTA AACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 90 >AMX (423 ) _E11 ARC 1140 R3_423-E11 TAATACNACTCACTATAGGGGGGGGGGGATAGTCATGACTGATAAAACGTAACTGTTGA GCCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 91 >AMX (423 ) _F11 ARC 1140 R3_423-F11 TAATACGACTCACTATAGGGGACAGTGCTAGTGGAATAGCAACGTAACCAGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 92 >AMX (423 ) _G11 ARC 1140 R3_423-G11 TAATACGACTCACTATAGGGGACGACCACTATACTCCGAGAACGTAACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 93 >AMX (423 ) _H11 ARC 1140 R3_423-H11 TAATACGACTCACTATAGGGGGATGGAGGCGTAGTGTAGTCAACGTTACCGGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 94 >AMX (423 ) _A12 ARC 1140 R3_423-A12 TAATACGACTCACTATAGGGGGGAGGTATAGATGGAATGGTTATGTAACCTGTTAAACC CGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 95 >AMX (423 ) _B12 ARC 1140 R3_423-B12 TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGGAGGACCACTTAGATAACGTCACCGGTTAAACCC GGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 96 >AMX (423 ) _C12 ARC 1140 R3_423-C12 TAATACGACTCACTATAGGGGGGATAGGGGCGAGAGAGTCACAACGTAACCGGTTAATC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 97 >AMX (423 ) _E12 ARC 1140 R3_423-E12 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGATGGCCGAATCATAAAATAACGTAACCGTTAGAC CCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 98 >AMX (423 ) _F12 ARC 1140 R3_423-F12 TAATACGACTCACTATAGGGGGCGATTGCTGAGTCAGTTCGTAATCGGTTAAACCCGGG ' TCGATGCAGTAAGCTAGCT SEQ ID NO 99 >AMX (423 ) _G12 ARC 1140 R3_423-G12 TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGAGGATCCGAAACACAGGGATCCGTAACCGGTTAA AGCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT EJEMPLO 2: BIBLIOTECAS DE INCORPORAN LAS SECUENCIAS LÍDER IDENTIFICADAS MEDIANTE EL MÉTODO TR-SELEX™ Los elementos de la secuencia 5' líder identificada (los primeros 10 nucleótidos de la región degenerada) de las clonas con el rendimiento más alto del transcripto modificado en la posición 2', identificadas utilizando la selección TR-SELEX™ como se describió en el Ejemplo 1, se utilizaron para diseñar bibliotecas que incorporan los elementos de la secuencia líder en la región fija 5', con el objetivo de fomentar un incremento en el rendimiento del transcripto que contiene los nucleótidos modificados en la posición 2'. En una modalidad, la estrategia de diseño incorpora los primeros 14 nucleótidos de las clonas identificadas (las 4 guanosinas que comprenden la región fija 5' más los primeros 10 nucleótidos de la región degenerada) como la secuencia 5' líder, seguida inmediatamente por 6-8 nucleótidos fijos adicionales para facilitar la amplificación mediante PCR posterior, seguido inmediatamente por una región degenerada de 30-40 nucleótidos de longitud, seguido inmediatamente por una región fija 3' para facilitar también la amplificación mediante PCR posterior. Los ejemplos de las secuencias de ADN de las bibliotecas diseñadas que incorporan los elementos de la secuencia líder identificada se listan a continuación. Para cada una de las secuencias de las bibliotecas de las plantillas de la transcripción del ADN listadas a continuación, el elemento de la secuencia 5' líder se muestra subrayado, y todas las secuencias están en la dirección 5 '-3'.

ARC 2118 (SEQ ID NO 3) TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2119 (SEQ ID NO 4) TAATACGACTCACTATAGGGGGTGATATTGACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2120 (SEQ ID NO 5) TAATACGACTCACTATAGGGGTGCGCGGTTACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2121 (SEQ ID NO 6) TAATACGACTCACTATAGGGGGAGGGGGTGCCGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG Una plantilla de transcripción del ADN de control sin una secuencia líder se lista a continuación, en la dirección 5' -3 ' .

TAATACGACTCACTATAGGGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNN NNNNNN NNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGATCGATG (ARC2117, SEQ ID NO 106) Para probar si las bibliotecas diseñadas recientemente fomentan un rendimiento incrementado de los transcriptos que contienen los nucleótidos 2'-0-metilo, las bibliotecas se transcribieron utilizando dos diferentes ARN polimerasas T7 modificadas para comparación, la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R, y la polimerasa mutante Y639L/H784A/K378R (se utilizaron mezclas de reacción de la transcripción sin polimerasa como control negativo) , en una mezcla de transcripción que contiene la plantilla ~200 nM, IX del amortiguador de transcripción (HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%), 2' -OMe ATP, CTP, UTP, y GTP 1 mM cada uno, 2' -OH GTP a 30 uM, MgCl2 6.5 mM, MnCl2 2.0 mM, PEG-8000 al 10% peso/volumen, GMP 1 mM, ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R o ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/mL a 37 °C durante la noche. El rendimiento del transcripto para cada condición, se probó mediante análisis PAGE-gel utilizando 200 uL de la mezcla de reacción, y el rendimiento del transcripto para cada condición se cuantificó del sombreado con UV del análisis PAGE-gel, utilizando el programa ImageQuant versión 5.2 (Molecular Dynamics) . La Figura 4 resume los resultados cuantificados del análisis PAGE-gel, que muestran las veces del incremento del rendimiento del transcripto con las ARN polimerasas T7 mutantes TY639F/H784A/K378R ("FAR") y Y639L/H784A/K378R ("LAR") con relación al control negativo sin polimerasa. Como puede observarse en la Figura 4, se observó una mejora significativa en el rendimiento de los transcriptos que contienen a 2' -OMe completamente, cuando la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R se utilizó para transcribir las nuevas bibliotecas que incorporan los nuevos elementos de la secuencia líder en comparación con la polimerasa mutante Y639F/H784A/K378R. De manera notable, ARC2118, ARC2119, ARC2120, proporcionaron rendimientos significativamente más altos de los transcriptos que contienen a 2' -OMe, cuando se combinan con la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R, en comparación con la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R. Un incremento en el rendimiento del transcripto utilizando la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R, también se observó con ARC2117, una biblioteca diseñada anteriormente, que carece de los elementos de la secuencia líder identificados recientemente, conocida por transcribir bajo las condiciones dadas con la polimerasa mutante Y639F/H794A/K378R, que se utilizó como un control. Estos resultados indican que los rendimientos del transcripto que contiene a 2' -OMe pueden incrementarse utilizando la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R en comparación con la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R. Además, varias de las nuevas bibliotecas (ARC2118 y ARC2119) , que incorporan los elementos de la secuencia líder identificados a través del método TR-SELEX™, también proporcionaron rendimientos más altos de los transcriptos que contienen a 2' -OMe que la biblioteca de control, ARC2117, cuando se utiliza la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R, indicando que puede lograrse una mejora en el rendimiento del transcripto que contiene a 2' -OMe, utilizando la Y639L/H784A/K378R mutante, en combinación con las secuencias líderes particulares identificadas recientemente de la presente invención.

EJEMPLO 3; EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA POLIMERASA La ARN polimerasa T7 mutante, para utilizarse en los métodos de la invención puede prepararse como sigue. La ARN polimerasa T7 (la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos mostrada en la Figura 5A y 5B respectivamente y descrita en Bull, J.J et al., J. Mol. Evol., 57 (3), 241- 248 (2003) , pueden mutarse para resultar en el mutante LA (Y639L/H784A) , el mutante LAR (Y639L/H784A/K378R) , el mutante LLA (P266L/Y639L/H784A) o el muntante LLAR P266L/Y639L/H784A/K378R) . La AR? polimerasa T7 puede estar comprendida en un vector de expresión (un ejemplo de un vector de expresión de la ARN polimerasa T7 se describe en la Patente de Estados Unidos Número de Serie 5,869,320, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) , o puede insertarse en un vector de expresión después de la mutagénesis. La ARN polimerasa T7 mutada puede diseñarse para comprender opcionalmente una marca His para la facilidad durante la purificación de la proteína. Las secuencias oligonucleotídicas complementarias que contienen la mutación de la Leucina para la posición 639 (agtcatgacgctggctCTGgggtccaaagagttcg (SEQ ID NO 107 y gaactctttggacccCAGagccagcgtcatgact (SEQ ID NO 108) , pueden sintetizarse. Las secuencias oligonucleotídicas complementarias (ggctggcatctctcTgatgttccaaccttgc (SEQ ID NO 109) y gcaaggttggaacatcAgagagatgccagcc (SEQ ID NO 110) para la mutación P266L pueden sintetizarse. Las secuencias oligonucleotídicas complementarias (cgctcctaactttgtaGCcagccaagacggtagc (SEQ ID NO 111) y gctaccgtcttggctgGCtacaaagttaggagcg (SEQ ID NO 112) ) para la mutación H784A pueden sintetizarse. Las secuencias oligonucleotídicas complementarias (gctctcaccgcgtggaGacgtgctgccgctgct (SEQ ID NO 113) y agcagcggcagcacgtCtccacgcggtgagagc (SEQ ID NO 114) ) para la mutación K378R pueden sintetizarse. La mutagénesis dirigida al sitio puede realizarse utilizando el Equipo de Mutagénesis Dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para resultar en las secuencias de ácidos nucleicos (Figura 6) , que codifican las polimerasas mutantes que tienen la combinación de mutaciones indicada anteriormente. La secuencia de ácidos nucleicos resultante que codifica una polimerasa mutante de la invención, puede insertarse en el vector de expresión deseado, utilizando técnicas estándar para la expresión y purificación.

Expresión y Purificación El vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la polimerasa T7 mutante se transforma en células competentes BL21 (DE3) (Stratagene, CA) , y se incuba en hielo durante 20 minutos. Se realiza un choque con calor, poniendo el tubo en 42°C durante 2 minutos. Después de poner el tubo en hielo durante 1 minuto, se agrega 1 ml de caldo L ("LB"), y se incuba a 37 °C en un agitador durante 45 minutos. 100 ul de líquido de cultivo se emplacan en una placa de agar LB+Amp y se incuban a 37 °C durante la noche. Una sola colonia de la placa cultivada durante la noche se inocula en 100 ml de LB-Amp+ (150 ug/ml) , a 37 °C durante la noche. En el segundo día, dos matraces de 4 litros que contienen 2 litros de LB+Amp precalentado, se inoculan con 50 ml del cultivo durante la noche, y se cultivan a 37°C hasta que la OD600 alcanza entre 0.6-0.8. 200 ul de IPTG ÍM se agregan a cada 2L de cultivo celular con una concentración final de 100 uM, y se cultivan por otras 3 horas a 37 °C. Las células se granulan mediante centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos. Las células se resuspenden en 200 ml amortiguador de lisis (amortiguador de lisis: Tris-Cl 50 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, Glicerol al 5%, imidazol 1 mM, betamercaptoetanol ("BME") 5 mM) , y se dividen en 6 tubos cónicos de 50 ml . Las células se someten a sonicación a nivel de potencia 8, 3 x 30 minutos para cada tubo y a continuación los desechos bacterianos se centrifugan a 11,000 rpm durante 60 minutos, y el sobrenadante se filtra a través de un filtro de 0.22 uM. El imidazol se agrega al filtrado a una concentración final de 10 mM. El filtrado se carga en una columna Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare Bio-Sciences, NJ) con una bomba de la muestra. La columna se lava con 10 volúmenes de la columna (CV) de amortiguador A (Amortiguador A: Tris-Cl 50 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, Glicerol al 5%, imidazol 10 mM, BME 10 mM) , que contiene imidazol 20 mM. La columna se lava a continuación con 10 CV de amortiguador con un gradiente lineal de concentración de imidazol de 40 mM a 70 mM en amortiguador A. La proteína se eluye con 6 CV de Amortiguador B (Amortiguador B: Tris-Cl 50 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, Glicerol al 5%, imidazol 250 mM, BME 10 mM) . Después de verificar la recolección de las fracciones con 5 µl de muestra en SAD- AGE al 4-12%, todas las fracciones se combinan y dializan (tubería de la diálisis: Spectrum Spectra/membrana porosa por Molecular (VWR) MWCO: 12-14000) en ÍL de amortiguador de diálisis (Amortiguador de diálisis: Tris-Cl 50 mM, pH 7.9, NaCl 100 mM, Glicerol al 50%, EDTA 0.1 mM, Tritón X-100 al 0.1%, BME 20 mM) durante la noche. El amortiguador de diálisis se cambia después de 12 horas y la diálisis se lleva a cabo durante 4 horas adicionales. La concentración de la ARN polimerasa T7 se mide utilizando el ensayo de Bradford como se describe en Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248.

EJEMPLO 4; TRANSCRIPCIÓN QUE INCORPORA 100% DE LOS NUCLEÓTIDOS 2'-0-METILO EJEMPLO 4A; TRANSCRIPCIÓN DE 2'-0-METILO SON 2' -OH GTP Se realizó un experimento para probar la sensibilidad de la polimerasa mutante Y639L/H784A/K378R a la concentración de 2' -OH GTP, utilizando una titulación de 2' -OH GTP. ARC2118 y ARC2119, dos bibliotecas que incorporan los nuevos elementos de la secuencia líder identificados a través de la selección TR-SELEX™ (descrito en el Ejemplo 1) , que mostraron altos rendimientos del transcripto cuando se utilizan con la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R (véase el Ejemplo 2) , se utilizaron para probar la sensibilidad de la transcripción de la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R para la concentración de 2' -OH GTP. Las transcripciones se realizaron utilizando una titulación de 2' -OH GTP (0-160 uM) con IX del amortiguador de transcripción (HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%), plantilla -200 nM, 2' -OMe ATP, CTP, UTP y GTP 1 mM cada uno, MgCl2 6.5 mM, MnCl2 2.0 mM, PEG-8000 al 10% peso/volumen, GMP 1 mM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/mL, ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R 200 nM a 37°C durante la noche. El rendimiento del transcripto bajo cada condición, se probó mediante análisis PAGE-gel utilizando 200 de la mezcla de reacción, y el transcripto para cada condición se cuantificó del sombreado UV del análisis PAGE-gel utilizando el programa ImageQuant versión 5.2 (Molecular Dynamics) . La Figura 7 resume los resultados cuantificados del análisis PAGE-gel, que muestran las veces del incremento del rendimiento del transcripto con cada condición con relación a la base. Como puede observarse en la Figura 7, ARC2118 y ARC2119 se transcribieron con Y639L/H784A/K378R bajo todas las condiciones, incluyendo son 2' -OH GTP, y el rendimiento en la ausencia de 2' -OH GTP fue comparable con el rendimiento de la transcripción en donde 2' -OH GTP se incluyó en la mezcla de reacción. Estos resultados indican que la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R no requiere la presencia de 2' -OH GTP para el rendimiento incrementado del transcripto, en oposición a la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A/K378R, que requiere a 2 '-0H GTP para la transcripción (datos no mostrados) . Se realizó posteriormente un experimento para determinar las condiciones óptimas de la transcripción para ser utilizadas con la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R, cuando se combina con las secuencias líderes identificadas mediante la selección TR-SELEX™ (descrita en el Ejemplo 1) . ARC2119, una biblioteca que incorpora los nuevos elementos de la secuencia líder identificados a través de la selección TR-SELEX™, que mostró un rendimiento del transcripto significativamente más alto cuando se utiliza con la AR? polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R (véase el Ejemplo 2) , se utilizó para probar el efecto de variar las concentraciones de 2' -OMe ?TP, magnesio y manganeso en el rendimiento del transcripto. Las transcripciones se realizaron utilizando IX del amortiguador de transcripción (HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%), plantilla -200 nM, 2 '-OMe ATP, CTP, UTP y GTP (0.5 mM, 1 mM, 1.5 mM y 2 mM cada uno), MgCl2 (5 mM, 6.5 mM, 8 mM y 9.5 mM) , ?MnCl2 (1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 mM) , PEG-8000 al 10% peso/volumen, GMP 1 mM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/mL, ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R 200 nM a 37 °C durante la noche . El rendimiento del transcripto bajo cada condición, se probó mediante análisis PAGE-gel utilizando 200 uL de la mezcla de reacción, y el rendimiento del transcripto para cada condición se cuantificó del sombreado UV del análisis PAGE-gel, utilizando el programa ImageQuant versión 5.2 (Molecular Dynamics). La Figura 8 resume los resultados cuantificados del análisis PAGE-gel, mostrando las veces del incremento del rendimiento del transcripto con cada condición con relación a la base. Basándose en el costo de los 2' -OMe NTP, y los resultados de este experimento, 1.5 mM de cada 2' -OMe NTP (y MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM se adoptaron como las condiciones preferidas para utilizarse con las secuencias líder y la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R de la presente invención.

EJEMPLO 4B: FIDELIDAD Y DESVIACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN MNA UTILIZANDO LA ARN POLIMERASA T7 MUTANTE Y639L/H784A/K378R; Se realizaron experimentos adicionales para valorar la fidelidad y desviación de la transcripción MNA utilizando la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R y sin 2' -OH GTP. Para probar la fidelidad, una sola secuencia clonada identificada mediante la selección TR-SELEX™ (descrita en el Ejemplo 1) , se amplificó mediante PCR, se utilizó para programar una transcripción MNA utilizando la polimerasa Y639L/H784A/K378R y sin 2' -OH GTP, se purificó mediante PAGE, la plantilla de ADN restante se digirió utilizando RQl DNasa (la ausencia de la plantilla de ADN se probó a continuación mediante PCR) , y el material transcrito se transcribió de manera inversa (Thermoscript , Invitrogen, Carlsbad, CA) , y se amplificó a continuación mediante PCR. Este producto de la PCR se secuenció y la estadística de las supresiones, inserciones y sustituciones se calculó a continuación. De las 1300 bases secuenciadas en este experimento, no se observaron supresiones e inserciones, y se observaron tres sustituciones (véase la Figura 9) . Estos números sugieren que la información de la secuencia codificada dentro de una región degenerada de 30 nucleótidos tendría una oportunidad del 93% de ser transmitida fielmente a la siguiente ronda de SELEX™, este número es tan alto que excede aquél medido para el APSf del tipo silvestre. Para probar la desviación de los nucleótidos, la biblioteca ARC2118 se transcribió bajo las siguientes condiciones: HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%, plantilla -200 nM, 2' -OMe ATP, CTP, UTP y GTP 1 mM cada uno (sin 2' -OH GTP), MgCl2 (6.5 mM) , MnCl2 (2 mM) , PEG-8000 al 10% peso/volumen, GMP 1 mM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/mL, ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R 200 nM a 37°C durante la noche, purificada mediante PAGE, la plantilla de ADN restante se digirió utilizando RQl DNasa (la ausencia de la plantilla de ADN se probó a continuación mediante PCR) , y el material transcrito se transcribió de manera inversa y se amplificó utilizando la PCR antes de clonar y secuenciar. 48 clonas de la biblioteca amplificada y 48 clonas de la biblioteca inicial se secuenciaron. Las estadísticas de la aparición de los nucleótidos en la región degenerada se examinaron para ver si ocurrió desviación. Como se indica por la Figura 10, el porcentaje de la composición del nucleótido después de la transcripción fue muy similar al porcentaje de la composición del nucleótido de la biblioteca inicial en la cual el porcentaje de cada nucleótido (A, T, C y G) fue aproximadamente igual, indicando que no ocurrió desviación nucleotídica con la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R utilizada para la transcripción.

EJEMPLO 4C; COMPARACIÓN DEL RENDIMIENTO TRANSCRIPCIONAL CON VARIAS SECUENCIAS LÍDERES Plantillas 1 a 4: Para comparar los rendimientos transcripcionales utilizando la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R con múltiples secuencias líderes diferentes, se sintetizaron 4 plantillas que comprenden relaciones variables de purinas a pirimidinas en la secuencia líder (posiciones 1 a 14 en las SEQ ID NOS 126 a 129 siguientes) , con diferentes regiones constantes. Las plantillas de ADN se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN ABI EXPEDITE™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) , y se desprotegieron mediante métodos estándar. Las secuencias (mostradas en la dirección 5' a 3') son como sigue: Plantilla 1 GGGAGAATTCCGACCAGAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^ NNNNCATATGTGCGTCTACATGGATCCTCA (SEQ ID NO 126) Plantilla 2 GGGAGAGCGGAAGCCGTGCTGGGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^ NNNNN NCATAACCCAGAGGTCGATGGATC (SEQ ID NO 127) Plantilla 3 GGGAGAGACAAGCTTGGGTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^ NAGAAGAGAAAGAGAAGTTAATTAAGGATCCTCAG (SEQ ID NO 128) Plantilla 4 GGGAGAATTCCGACCACAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NCATATGTGCGTCTACATGGATCCTCA (SEQ ID NO 129) Las plantillas se amplificaron con sus respectivos cebadores como se indica a continuación: Plantilla 1: Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAGCTT (SEQ ID NO 130) Cebador 3' TGAGGATCCATGTAGACGCACATATG (SEQ ID NO 131) Plantilla 2: Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCCGTGCTGGGGCC (SEQ ID NO 149) Cebador 3' GATCCATCGACCTCTGGGTTATG (SEQ ID NO 132) Plantilla 3: Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAGACAAGCTTGGGTC (SEQ ID NO 133) Cebador 3' CTGAGGATCCTTAATTAACTTCTCTTTCTCTTCT (SEQ ID NO 134) Plantilla 4: Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCACAAG (SEQ ID NO 135) Cebador 3' TGAGGATCCATGTAGACGCACATATG (SEQ ID NO 148) Las plantillas se utilizaron en una reacción de transcripción in vi tro de 15 mL con la ARN polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) . Las transcripciones se hicieron utilizando Hepes 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%, PEG-8000 al 10%, MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, mCTP 1.5 mM, mUTP 1.5 mM, mGTP 1.5 mM, mATP 1.5 mM, GMP 1 mM, 0.01 unidades/µL de pirofosfatasa inorgánica y -9 µg/ml de polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) y la plantilla de AD? 0.2 µM. El AR? se precipitó y purificó en PAGE desnaturalizante al 10%. El AR? se eluyó del gel en ?aOAc 300 mM, EDTA 20 mM durante la noche, se precipitó y cuantificó con un Espectrofotómetro UV. Los rendimientos no difieren en gran medida entre las cuatro secuencias líderes probadas y se muestran en la Tabla ÍA siguiente.

Tabla ÍA Plantillas 5 a 8 Para las Plantillas 1 a 4 anteriores, los rendimientos transcripcionales para múltiples secuencias líderes se valoraron. Cuatro plantillas se sintetizaron con diferentes regiones constantes. Las plantillas de ADN se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN ABI EXPEDITE™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) , y se desprotegieron mediante métodos estándar. Las secuencias (mostradas en la dirección 5' a 3') son como sigue: Plantilla 5 GGGCCTTGTAGCGTGCATTCTTGNNNNNNNNNNNI NNNNNN^ TACTCCGAATCTGTCGAA (SEQ ID NO 138) Plantilla 6 GGAGCCTTCCTCCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^ TCCGGTTTCCCGAGCTT (SEQ ID NO 139) Plantilla 7 GGGAGACAAGAATAAACGCTCAANNNNNNI IMIMNNN]^^ NNNNTTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC (SEQ ID NO 140) Plantilla 8 GGGGAGTACAATAACCAGACAT-STNNNNNNNNNNNNN^ TACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO 150) Las plantillas se amplificaron con sus cebadores respectivos : Plantilla 5 Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGCCTTGTAGCGTGCATTCTTG (SEQ ID NO 151) Cebador 3' TTCGACAGATTCGGAGTATGTTAG (SEQ ID NO 141) Plantilla 6 Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGAGCCTTCCTCCGGA (SEQ ID NO 142) Cebador 3' AAGCTCGGGAAACCGGA (SEQ ID NO 143) Plantilla 7 Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA (SEQ ID NO 144) Cebador 3' GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA (SEQ ID NO 145) Plantilla 8 Cebador 5' TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACCAGACAT (SEQ ID NO 146) Cebador 3' CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC (SEQ ID NO 147) Las plantillas se utilizaron a continuación para una transcripción in vi tro de 0.5 mL con la ARN polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) . Las transcripciones se hicieron utilizando Hepes 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%, PEG-8000 al 10%, MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, mCTP 1.5 mM, mUTP 1.5 mM, mGTP 1.5 mM, mATP 1.5 mM, GMP 1 mM, 0.01 unidades/µL de pirofosfatasa inorgánica y -9 µg/ml de polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) y la plantilla de AD? 0.2 µM. El AR? se precipitó y cargó en PAGE desnaturalizante al 10%. El AR? se visualizó mediante absorbancia UV en el gel. Los rendimientos no difieren en gran medida entre las cuatro secuencias líderes probadas y se muestran en la Tabla ÍA siguiente (rendimientos de transcripción relativa dados) : Tabla IB En las modalidades particulares, las plantillas identificadas anteriormente, pueden utilizarse en los métodos de transcripción y/o los métodos de selección del aptámero de la invención.

EJEMPLO 4D; TRANSCRIPCIÓN MNA UTILIZANDO LA ARN POLIMERASA T7 MUTANTE P266L/Y639L/H784A/K378R La siguiente plantilla de ADN y los cebadores se utilizaron para programar una reacción en cadena de la polimerasa para generar una plantilla de transcripción de doble hebra. N indica una posición degenerada con una posibilidad aproximadamente igual de ser cada uno de ATGC, todas las secuencias se listan en la dirección 5' a 3' : Plantilla de la PCR (ARC2118) TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNN NNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO 3) Cebador 5' AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAATACGACTC ACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCG (SEQ ID NO 115) Cebador 3' CATCGATGCTAGTCGTAACG (SEQ ID NO 116) La plantilla de la transcripción de doble hebra resultante se utilizó a continuación para programar 200 uL de mezclas de transcripción para cada muestra como sigue: HEPES (200 mM) , DTT (40 mM) , Espermidina (2 mM) , Tritón X-100 (0.01%), MgCl2 (8 mM) , MnCl2 (2.5 mM) , PEG-8000 (10% peso/volumen), 1.5 mM de cada uno de 2' -OMe NTP, GMP 1 mM, plantilla de transcripción 100-200 nM, Pirofosfatasa Inorgánica (1 unidad), pH 7.5, la polimerasa T7 mutante P266L/Y639L/H784A/K378R se diluyó como se indica a continuación. La mezcla de transcripción se incubó a 37 °C durante la noche (16 horas) .

Después de la incubación, las mezclas se precipitaron con isopropanol, la pelotilla resultante se disolvió y se cuantificó utilizando PAGE desnaturalizante (12.5% de acrilamida) durante 60 minutos a 25W. Las muestras se visualizaron y cuantificaron mediante sombreado UV a 260 nm.

Tabla 2 : Rendimiento Transcripcional EJEMPLO 5: SELECCIÓN DEL APTAMERO UTILIZANDO LA ARN POLIMERASA T7 MUTANTE Y639L/H784A/K378R Se realizó una selección para identificar los aptámeros para Ang2 humano (aquí posteriormente "h-Ang2"), utilizando una recolección que consiste de los nucleótidos 2' -OMe de purina y pirimidina (aquí posteriormente "MNA"). La estrategia de selección proporcionó aptámeros de alta afinidad específicos para h-Ang2. El Ang2 humano se compró de R&D Systems, Inc.

(Minneapolis, MN) . La ARN polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) , se expresó y purificó como se describió en el Ejemplo 3 anterior. Los nucleótidos 2' -OMe de purina y pirimidina se compraron de TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) .

Selección del aptámero Ang2 Preparación de la Recolección Una plantilla de ADN con la secuencia 5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG ARC2118 (SEQ ID NO 3) se sintetizó utilizando un sintetizador de ADN ABI EXPEDITE™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) , y se desprotegió mediante métodos estándar. Las plantillas se amplificaron con los cebadores (5'- (GATCGATCGATCGATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTC G-3') (SEQ ID NO 118) y ( 5 '-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-5 ' ) (SEQ ID NO 119) , y a continuación se utilizaron como una plantilla para la transcripción in vi tro con la ARN polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) . Las transcripciones se hicieron utilizando Hepes 200 mM Hepes, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Tritón X-100 al 0.01%, PEG-8000 al 10%, MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, mCTP 1.5 mM, mUTP 1.5 mM, mGTP 1.5 mM, mATP 1.5 mM, GMP 1 mM, 0.01 unidades/µL de pirofosfatasa inorgánica y ~9 µg/mL de polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) , y plantilla de ADN O .5 µM para generar la recolección mRmY ARC2118.

Selección La selección se inició incubando 330 pmoles (2 x 1014 moléculas) de la recolección ARN 2118 MNA con 100 pmoles de proteína en un volumen final de 100 µL de amortiguador de selección (IX de PBS de Dulbecco (DPBS) ) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los complejos de ARN-proteína y las moléculas de ARN no unidas, se separaron utilizando una columna giratoria de nitrocelulosa de 0.45 mieras (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . La columna se pretrató con KOH (remojar el filtro de la columna en 1 mL de KOH 0.5M, 15 minutos a temperatura ambiente; centrifugar completamente. Remojar el filtro en 1 mL de dH20 5 minutos a temperatura ambiente; centrifugar completamente) , se lavó con 2 x 1 mL de IX de PBS, y a continuación la solución que contiene los complejos de la recolección:Ang2, se agregó a la columna y se centrifugó a 1500 x g durante 2 minutos. El filtro se lavó dos veces con 500 µL de DPBS para eliminar los aglutinantes no específicos. El ARN se eluyó mediante la adición de 2 x 100 µL de amortiguador de elución (urea 7M, acetato de sodio 100 mM, EDTA 3 mM, precalentados a 95 °C) y a continuación se precipitó con etanol. El ARN se transcribió de manera inversa con el sistema de RT-PCR™ ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el cebador de la SEQ ID NO 119. El ADNc se amplificó mediante PCR con la polimerasa Taq (New England Biolabs, Beverly, MA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando la SEQ ID NO 118 y la SEQ ID NO 119. Las plantillas se transcribieron como se describió anteriormente para la preparación de la recolección y se purificaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. La ronda 2 se realizó con el mismo método que la ronda 1. Las rondas 3-12 se llevaron a cabo con h-Ang2 inmovilizado en las placas hidrofóbicas. Cada ronda de selección se inició inmovilizando 20 pmoles de h-Ang2 en la superficie de una placa hidrofóbica Nunc Maxisorp durante 1 hora a temperatura ambiente en 100 µL de IX DPBS. La placa se lavó 5x con 120 µL de DPBS, a continuación se incubó con amortiguador de bloque (IX de DPBS y 0.1 mg/mL de BSA) durante 1 hora. El sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 5 veces con 120 µL de IX de DPBS. El ARN de la recolección se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en los pozos vacíos, a continuación durante 1 hora en un pozo que se ha bloqueado previamente con 100 µL de amortiguador de bloqueo. De la ronda 3 en adelante, los pozos inmovilizados con el objetivo, se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en 100 µL de amortiguador de bloqueo (IX de PBS, 0.1 mg/mL de ARNt , 0.1 mg/mL de AD?ss y 0.1 mg/mL de BSA) antes de paso de selección positiva. En todos los casos, el AR? de la recolección unido a h-Ang2 inmovilizado, se transcribió de manera inversa directamente en la placa de selección mediante la adición de una mezcla de transcripción inversa ("RT") (cebador 3', SEQ ID ?O 119, y RT Thermoscript , Invitrogen, Carlsbad, CA) , seguido por incubación a 65 °C durante 1 hora. El AD?c resultante se utilizó como una plantilla para la PCR (polimerasa Taq, ?ew England Biolabs, Beverly, MA) y la transcripción como se describió para la ronda 1. Las condiciones para cada ronda están en la Tabla 3.

Tabla 3 Sumario de la Ronda Análisis de Unión del Aptámero MNA Los ensayos de unión de transferencia por puntos, se realizaron a través de las selecciones para verificar la afinidad de unión a la proteína de las recolecciones. El ARN de la recolección marcada en el extremo con 32P en trazas, se combinó con h-Ang2 y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en amortiguador DPBS en un volumen final de 30 µL. La mezcla se aplicó a un aparato de transferencia por puntos (Transferencia por Puntos Minifold-1, Acrílico, Schleicher y Schuell, Keene, NH) , montado (desde la parte superior a la inferior) con membranas de transferencia de nitrocelulosa, nylon y gel. El ARN que se unió a la proteína se capturó en el filtro de nitrocelulosa; mientras que el ARN no unido a la proteína se capturó en el filtro de nylon. El enriquecimiento para la unión a h-Ang2 se observó que inicia en la ronda 9. Las plantillas de la recolección de la ronda 9, 10 y 12 se clonaron utilizando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eligieron 26 clonas únicas para la síntesis química y se determinaron las constantes de disociación (KD) . Brevemente, los ARN sintéticos se marcaron en el extremo 5' con ?-32P ATP y los valores de KD se determinaron utilizando el ensayo de transferencia por puntos y las condiciones del amortiguador de IX de DPBS (con Ca2+ y Mg2+) (Gibco, # de Catálogo 14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las KD se estimaron ajustando los datos a la ecuación: fracción de ARN unido = amplitud * ( ( (AptConc+ [h-Ang2] +KD) - SQRT ( (AptConc+ [h-Ang2] +KD) 2 -4 (AptConc * [h-Ang2] ) ) ) / (2*AptConc) ) + base. Los resultados se reportan en la Tabla 4 siguiente. Dentro de las 26 secuencias únicas, 8 compartieron un motivo similar y tuvieron una actividad de unión e inhibidora similar. Estas secuencias se identifican como la Familia I. La Familia II comprende 2 secuencias con un motivo compartido que tiene actividades de unión e inhibidoras similares.

Análisis de la Función del Aptámero MNA Ensayo Elisa Algunos de los aptámeros se probaron en un ensayo ELISA que se ajustó para medir su capacidad para interferir con el Ang2 que se une al receptor Tie2. Para capturar el receptor Tie2, 150 ng de Tie2-Fc (R&D systems 313-TI-100-CF, Minneapolis, MN) en 100 µL de PBS (pH 7.4), se pusieron en una placa Maxisorb de 96 pozos (NUNC #446612, Rochester, ?Y) , y se incubaron durante la noche a 4°C. Durante la captura, 50 µL de varias concentraciones del AR? sintético se mezclaron con 50 µL de Ang2 3.6 nM (200 ng/mL) (R&D systems, 623-A?-025/CF, Minneapolis, M?) (en PBS con BSA al 0.2%) con una concentración final de Ang2 de 1.8 nM (100 ng/mL) en PBS con BSA al 0.1%, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de captura se eliminó después de una incubación durante la noche y la placa se lavó con 200 µL de TBST (Tris-HCl 25 mM, pH 7.5, ?aCl 150 mM y Tween 20 al 0.01%) tres veces. La placa se bloqueó a continuación con 200 µL de TBST que contiene leche seca sin grasa al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del bloqueo, la placa se lavó con 200 µL de TBST, nuevamente tres veces a temperatura ambiente y una mezcla de ARN sintético :Ang2 se agregó a la placa y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó entonces con 200 µL de TBST tres veces y 100 µL de anticuerpo anti-Ang2 de cabra biotinilado (1:1000; R&D Systems BAF623, Minneapolis, MN) se agregaron y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con 200 µL de TBST, se agregaron 100 µL de Estreptavidina enlazada a HRP (1:200; R&D systems #DY998, Minneapolis, MN) , y se incubó a temperatura ambiente durante 0.5 horas. A continuación, la placa se lavó nuevamente con 200 µL de TBST tres veces y 100 µL de la solución TMP (Pierce, #34028) se agregaron y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos. Una solución de 100 µL que contiene H2S04 2 N se agregó para detener la reacción, y se la placa se leyó mediante SpectroMax a 450 nm. Los resultados se proporcionan en la columna final de la Tabla 4 siguiente.

Ensayo FACS Se utilizaron las células endoteliales de la vena umbilical humana ("HUVEC") (ATCC) y células K293, una línea celular que sobreexpresa el receptor Tie2 humano, para determinar la CI50 de los aptámeros Ang2 MNA específicos que inhiben la unión de Ang2 al receptor Tie2 de la membrana celular. Brevemente, el vector de expresión de mamífero recombinante pCDNA3.1-Tie2, se transfectó en las células 293 (ATCC, Manassas, VA) , y las clonas estables se obtuvieron a continuación después de la selección con G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La citometría de flujo demostró la expresión de la proteína Tie2 en las células HUVEC y K293. Un ensayo de titulación de Ang2 determinó además las cantidades de Ang2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) para el ensayo de inhibición del aptámero en las células HUVEC y K293, que fueron 1 y 0.1 µg/mL, respectivamente. En el ensayo de unión con citometría de flujo, las células HUVEC y K293 (2 x 105 células/pozo) , se granularon en una placa de 96 pozos con fondo en V, y se resuspendieron e incubaron posteriormente en soluciones de aptámero MNA/Ang2 durante 2 horas. Las soluciones de aptámero/Ang2 se prepararon mediante preincubación de diferentes dosificaciones de los aptámeros (100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.7 nM, 1.2 nM, 0.411 nM, 0.137 nM y 0.0456 nM) con Ang2 en amortiguador FAC (BSA al 1%, azida de sodio al 0.2% en PBS) durante 30 minutos en hielo. Después de tres lavados con amortiguador FAC, las células se incubaron 30 minutos con anticuerpo Ang2 antihumano biotinilado (5 µg/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN) , seguido por otros 30 minutos de incubación con Estreptavidina PE (1:10; BD Biosciences, San José, CA) . El análisis FACS se completó utilizando FACScan (BD Biosciences, San José, CA) . Los resultados se reportan en la Tabla 4 siguiente.

TABLA 4 : Sumario de los resultados de unión y funcionales para los aptámeros MNA anti-Ang2 EJEMPLO 6; SELECCIÓN DEL APTAMERO UTILIZANDO LA ARN POLIMERASA T7 MUTANTE Y639L/H784A/K378R Se realizó una selección para identificar los aptámeros para la IgE humana (aquí posteriormente "h-IgE"), utilizando una recolección que consiste de los nucleótidos 2' -OMe de purina y pirimidina (aquí posteriormente "mRmY" ) . La estrategia de selección proporcionó aptámeros de alta afinidad específicos para h-IgE. La IgE humana se compró de Athens Research & Technology (# de Catálogo 16-16-090705 Athens, GA) . La ARN polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) , se expresó y purificó como se describió en el Ejemplo 3 anterior. Los nucleótidos de 2' -OMe de purina y pirimidina se compraron de TriLink BioTechnologies (San Diego, CA) .

Selección del aptámero de IgE Preparación de la Recolección Se sintetizó una plantilla de ADN con la secuencia 5' -TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG-3' ARC2118 (SEQ ID NO 3) utilizando un sintetizador de ADN ABI EXPEDITE™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) , y se desprotegió mediante métodos estándar. Las plantillas se amplificaron con los cebadores (5'-(GATCGATCGATCGATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTC G-3') (SEQ ID NO 118) y (5 ' -CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-3 ' ) (SEQ ID NO 119) , y a continuación se utilizaron como una plantilla para la transcripción in vi tro con la ARN polimerasa T7 (Y639L/H784A/K378R) . Las transcripciones se hicieron utilizando HEPES 50 mM, DTT 10 mM, espermidina 0.5 mM, Tritón X-100 al 0.0025%, PEG-8000 al 10%, MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, mCTP 1.5 mM, mUTP 1.5 mM, mGTP 1.5 mM, mATP 1.5 mM, GMP 1 mM, 0.01 unidades/µL de pirofosfatasa inorgánica y ~9 µg/mL de polimerasa T7 mutante (Y639L/H784A/K378R) y plantilla de ADN 0.3 µM para generar la recolección de MNA ARC2118.

Selección La selección se inició incubando 330 pmoles (2 x 1014 moléculas) de la recolección ARC 2118 de MNA con 24 pmoles de la proteína unida a la placa hidrofóbica bloqueada con BSA (Maxisorp píate, Nunc, Rochester, NY) , en un volumen final de 100 µL de amortiguador de selección (IX de PBS de Dulbecco (DPBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. El pozo se lavó cuatro veces con 120 µL de DPBS para eliminar los aglutinantes no específicos. El ARN se eluyó y transcribió de manera inversa con el sistema de RT-PCR™ ThermoScript (Thvitrogen, Carlsbad, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando el cebador de la SEQ ID NO 119. El ADNc se amplificó mediante PCR con la polimerasa Taq (New England Biolabs, Beverly, MA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando la SEQ ID NO 118 y la SEQ ID NO 119. Las plantillas se transcribieron como se describió anteriormente para la preparación de la recolección y se purificaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Todas las rondas se llevaron a cabo con h-IgE inmovilizada en placas hidrológicas. Cada ronda de selección se inició inmovilizando 24 pmoles de h-IgE en la superficie de una placa hidrofóbica Nunc Maxisorp durante 1 hora a temperatura ambiente en 100 µL de IX de DPBS. La placa se lavó cuatro veces con 120 µL de DPBS, a continuación se incubó con amortiguador de bloqueo (IX de DPBS y 0.1 mg/mL de BSA) durante 1 hora. El sobrenadante se eliminó a continuación, y los pozos se lavaron cuatro veces con 120 µL de IX de DPBS. Iniciando en la Ronda 2, el ARN de la recolección se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en los pozos vacíos, a continuación durante 1 hora en un pozo que se había bloqueado previamente con 100 µL de amortiguador de bloqueo. De la Ronda 2 en adelante, el competidor no específico se agregó al paso de selección positiva (0.1 mg/mL de AR?t y 0.1 mg/mL de AD?ss) . En todos los casos, el AR? de la recolección unido a h-IgE inmovilizado se transcribió de manera inversa directamente a la placa de selección mediante la adición de la mezcla transcripción inversa ("RT") (cebador 3', SEQ ID NO 119, y RT Thermoscript , Invitrogen, Carlsbad, CA) , seguido por la incubación a 65 °C durante 1 hora. El ADNc resultante se utilizó como una plantilla para la PCR (polimerasa Taq, New England Biolabs, Beverly, MA) y las transcripciones como se describió para la ronda 1. Las condiciones para cada ronda están en la Tabla 5.

Análisis de la Unión al Aptámero MNA Se realizaron ensayos de unión con transferencia por puntos a través de las selecciones para verificar la afinidad de unión a la proteína de las recolecciones. El ARN de la recolección marcado en el extremo con 32P en trazas, se combinó con h-IgE y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en amortiguador de DPBS en un volumen final de 30 µL. La mezcla se aplicó a un aparato de transferencia por puntos (Transferencia por Puntos Minifold-1, Acrílico, Schleicher y Schuell, Keene, ?H) , se montó (de la parte superior a la inferior) con membranas de transferencia de nitrocelulosa, nylon y gel. El AR? que está unido a la proteína se captura en el filtro de nitrocelulosa, mientras que el AR? no unido a la proteína se captura en el filtro de nylon. El enriquecimiento para la unión a h-IgE se observó iniciando en la Ronda 8. Las plantillas de la recolección de las rondas 5, 8 y 12 se clonaron utilizando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos de secuenciamiento revelaron que la recolección de la Ronda 8 había convergido en una sola clona principal que comprendía 59% de las secuencias totales. Esta clona principal y tres posibles minímeros se eligieron para la síntesis química y se determinaron las constantes de disociación (KD) . Brevemente, los AR? sintéticos se marcaron en el extremo 5' con ?-32P ATP y se determinaron los valores de KD utilizando el ensayo de transferencia por puntos y las condiciones del amortiguador de IX de DPBS (con Ca2+ y Mg2+) (Gibco, # de Catálogo 14040, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las KD se estimaron ajustando los datos a la ecuación: fracción de ARN unido = amplitud * ( ( (AptConc+ [h-IgE] +KD) - SQRT ( (AptConc+ [h-IgE] +KD) 4 (AptConc * [h-IgE] )))/ (2*AptConc) ) + base. La clona principal tuvo una KD de aproximadamente 800 pM. El minímero que se une mejor, también se probó para la unión a IgE de mono (m-IgE) , pero no demostró una unión reactiva cruzada a la proteína IgE de mono. Esta falta de reactividad cruzada también se confirmó mediante ELISA. Los minímeros con una dT invertida en el extremo 3' se utilizaron como la molécula original para el proceso de química medicinal.

Química Medicinal La composición química de uno de los minímeros M?A específicos de la IgE (Figura 11) , se alteró para mejorar la afinidad y la potencia, mientras que se mantiene la estabilidad en plasma del compuesto. El proceso incluyó el diseño, síntesis y evaluación de una serie de derivados del aptámero de IgE minimizado, en donde cada derivado de la serie comprende una sola modificación en cada aparición de un nucleótidos predeterminado, para determinar cuales residuos toleraron la sustitución. El primer conjunto de modificaciones fue la sustitución de un nucleótido de desoxi por cada nucleótido 2 '-OMe único. En una ronda de modificación separada, una serie de derivados se sintetizó, en la cual cada derivado comprendió una sola modificación de fosforotioato en una diferente posición del enlace internucleótido . Los datos generados en estas fases de modificación iniciales se utilizaron para establecer una relación de la actividad de la estructura (SAR) para el aptámero minimizado. En una fase de modificación posterior, los aptámeros se sintetizaron y se probaron con conjuntos compuestos de sustituciones que se diseñaron basándose en los datos SAR iniciales. Del panel de sustituciones compuestas, se identificó un aptámero de 39 nucleótidos de longitud con dos sustituciones 2' -OMe a 2' -desoxi introducidas en su composición. Además, un aptámero minimizado modificado resultante, de 39 nucleótidos de longitud con una sustitución 2' -OMe a 2' -desoxi y cuatro sustituciones de fosfato a fosforotioato incorporadas en su composición, se identificaron. Como se muestra en la Figura 12, este aptámero modificado con desoxi/fosforotioato, demuestra una afinidad de unión incrementada en comparación con el aptámero original minimizado pero no modificado, así como con el aptámero minimizado original, que tiene dos sustituciones desoxi por 2' -OMe.

Estabilidad del Suero El aptámero original no modificado minimizado y el modificado con desoxi/fosforotioato se probaron para determinar su estabilidad en sueros humano, de rata y de mono. Cada aptámero se agregó a 1 ml de suero recolectado a una concentración final de 5 µM en 90% de suero. Los aptámeros se incubaron a 37°C con agitación y los puntos de medición se tomaron a O, 0.5, 1, 4, 24, 48, 72 y 98 horas. En cada punto de medición, 90 µl del patrón de las muestras incubadas se agregaron a 10 µl de EDTA 0.5M y se congelaron a -20 °C para el análisis de la estabilidad posterior, utilizando un sistema BIACORE 2000. Todas las mediciones de unión del biosensor se realizaron a 25 °C utilizando un BIACORE 2000 equipado con una microplaqueta del biosensor CM5 grado investigación (BIACORE Inc., Piscataway, NJ) . La IgE humana recombinante purificada (Athens Research & Technology, Athens, GA) , se inmovilizó en la superficie del biosensor utilizando la química de acoplamiento de amino. Para lograr esto, las superficies de dos celdas de flujo se activaron primero durante 7 minutos con una mezcla 1:1 de NHS 0.1 M (Nhidroxisuccinimida) y EDC (3- (N, N-dimetilamin) propil-N- etilcarbodiimida) 0.4 M a una velocidad de flujo de 5 µl/minuto. Después de la activación de la superficie, una celda de flujo se inyectó con 50 µg/ml de IgE a 10 µl/minuto durante 20 minutos, para permitir el establecimiento de enlaces covalentes en la superficie activada. A continuación, se inyectó clorhidrato de etanolamina 1 M a pH 8.5 durante 7 minutos a 5 µl/minutos, para inactivar los esteres residuales. Para la celda de flujo utilizada como blanco, se inyectó clorhidrato de etanolamina 1 M a pH 8.5 durante 7 minutos, para inactivar los esteres residuales sin inyección de la proteína. Un conjunto de estándares del aptámero se corrió a través de la microplaqueta preparada para generar una curva estándar antes de que todos los puntos de medición se analizaran. Para establecer una curva estándar, los aptámeros se diluyeron serialmente (de 200 nM a 12.5 nM) en amortiguador HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, Tensoactivo 20 al 0.005%), suplementado con suero humano al 4% y EDTA 50 mM. Todas las muestras diluidas se inyectaron en el Biacore 2000 para unirse a 20 µl/minuto durante 5 minutos y esperar durante 3 minutos . Para regenerar la microplaqueta, se inyectó NaCl ÍN durante 60 segundos a 30 µl/minuto. La respuesta del pico RU al final de la fase de unión, se gráfico contra la concentración del aptámero y se generó una curva estándar utilizando una función logística de Cuatro Parámetros . Para medir la concentración del aptámero activo en los sueros de humano, rata y mono, las muestras del punto de medición se diluyeron 22.5 veces en HBS-P para hacer la concentración final en suero del 4 inmediatamente antes de la inyección en el Biacore 2000. Las concentraciones del aptámero funcional en cada periodo de incubación del suero se calcularon convirtiendo de la unidad de respuesta RU a la concentración utilizando la curva estándar generada anteriormente. Como una medición de control de calidad adicional, dos estándares del aptámero se probaron de manera independiente al final del experimento para asegurarse que las concentraciones medidas con el BIACORE están desviadas menos del 20% de los estándares. El aptámero original no modificado minimizado y el modificado con desoxi/fosforotioato se determinaron que son más del 90% activos a 98 horas en los sueros de humano, rata y mono. La invención se ha descrito ahora a manera de la descripción y los ejemplos escritos, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse en una variedad de modalidades, y que la descripción y los ejemplos anteriores son para propósitos de ilustración y no de limitación de las siguientes reivindicaciones .

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Una ARN polimerasa T7 aislada que comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y en la posición 784, en donde el aminoácido alterado en la posición 639 no es una fenilalanina cuando el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina.
2. La ARN polimerasa T7 aislada según la reivindicación 1, que comprende además un aminoácido alterado en la posición 378.
3. La ARN polimerasa T7 aislada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un aminoácido alterado en la posición 266.
4. La ARN polimerasa T7 aislada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aminoácido alterado en la posición 639 es una leucina y el aminoácido alterado en la posición 784 es una alanina.
5. La ARN polimerasa T7 aislada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aminoácido alterado en la posición 266 es una leucina.
6. La ARN polimerasa T7 aislada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aminoácido alterado en la posición 378 es una arginina.
7. La AR? polimerasa T7 aislada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los aminoácidos alterados incrementan el rendimiento transcripcional de los ácidos nucleicos que comprenden las modificaciones 2' -OMe mediante la polimerasa en una reacción de transcripción que comprende sólo los trifosfatos del nucleótido 2' -OMe.
8. La ARN polimerasa T7 aislada según la reivindicación 8, en donde el incremento en el rendimiento de la transcripción es relativo a una ARN polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados, cuando la transcripción se lleva a cabo bajo condiciones de transcripción idénticas.
9. La ARN polimerasa T7 aislada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los aminoácidos alterados disminuyen la discriminación contra los trifosfatos del nucleótido 2 '-OMe.
10. La AR? polimerasa T7 aislada según la reivindicación 9, en donde la discriminación disminuida contra los trifosfatos del nucleótido 2' -OMe es relativa a una AR? polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados .
11. La ARN polimerasa T7 aislada según la reivindicación 8 ó 10, en donde la ARN polimerasa T7 que carece de los aminoácidos alterados es la ARN polimerasa T7 del tipo silvestre que comprende un aminoácido en la posición 639 alterado a una fenilalanina y un aminoácido en la posición 784 alterado a alanina.
12. Un polipéptido aislado que comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 102 y SEQ ID NO 103.
13. Un método para transcribir un ácido nucleico de una sola hebra que comprende incubar una polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, con un ácido nucleico de plantilla bajo condiciones de reacción suficientes para resultar en la transcripción.
14. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
15. Una secuencia de ácido nucleico aislada, seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO 122, SEQ ID NO 123, SEQ ID NO 124 y SEQ ID NO 125.
16. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada según la reivindicación 14 ó 15.
17. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 14 ó 15, enlazado de manera operable a un promotor.
18. Una célula que comprende el vector de expresión según la reivindicación 17.
19. La célula según la reivindicación 18, en donde la ARN polimerasa T7 mutante se expresa por la célula.
20. Un equipo que comprende un recipiente que contiene una ARN polimerasa T7 según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
21. Un equipo que comprende un recipiente que contiene un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa T7 según cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
22. Un método para transcribir un ácido nucleico completamente 2' -OMe, que comprende los pasos de a) incubar un ácido nucleico de plantilla en una mezcla de reacción que comprende una ARN polimerasa mutante, una plantilla de transcripción del ácido nucleico y trifosfatos del nucleósido, en donde los trifosfatos del nucleósido son 2' -OMe, y b) transcribir la mezcla de reacción de la transcripción durante un tiempo suficiente para resultar en un ácido nucleico de una sola hebra, en donde todos los nucleótidos de los ácidos nucleicos de una sola hebra están modificados con 2' -OMe, excepto que el primer nucleótido de los transcriptos puede no estar modificado en la posición 2' .
23. El método según la reivindicación 22, en donde la ARN polimerasa mutante es una ARN polimerasa T7 mutante que comprende un aminoácido alterado en la posición 639 y la posición 784.
24. El método según la reivindicación 23, en donde la AR? polimerasa T7 mutante es una AR? polimerasa T7 mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
25. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde la reacción de transcripción comprende además iones de magnesio.
26. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde la reacción de transcripción comprende además iones de manganeso.
27. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde la reacción de transcripción comprende además un residuo que no es de trifosfato ni de 2' -OMe guanosina.
28. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en donde la plantilla de transcripción comprende un promotor de la ARN polimerasa T7.
29. El método según la reivindicación 26 a 28, en donde los iones de magnesio están presentes en la reacción de transcripción a una concentración que es entre 3.0 a 3.5 veces mayor que los iones de manganeso.
30. El método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 6.5 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.0 mM.
31. El método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.5 mM, la concentración de iones de magnesio es 8 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.5 mM.
32. El método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 2.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 9.5 mM y la concentración de iones de manganeso es 3.0 mM.
33. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 32, en donde la reacción de transcripción comprende además polietilenglicol.
34. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 33, en donde el residuo que no es de trifosfato ni de 2 '-OMe guanosina se selecciona del grupo que consiste de: monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina, monofosfato de 2 '-fluoro guanosina, difosfato de 2' -fluoro guanosina, monofosfato de 2' -amino guanosina, difosfato de 2' -amino guanosina, monofosfato de 2' -desoxi guanosina y difosfato de 2 '-desoxi guanosina.
35. El método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, en donde la reacción de transcripción comprende pirofosfatasa inorgánica.
36. Un método para identificar aptámeros, que comprende : a) preparar una mezcla de reacción de transcripción que comprende una polimerasa mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y una o más plantillas de transcripción de ácidos nucleicos; b) transcribir la mezcla de reacción de la transcripción para resultar en una mezcla candidata de ácidos nucleicos de una sola hebra, en donde todos, menos opcionalmente uno de los nucleótidos de los ácidos nucleicos de una sola hebra están modificados en la posición 2' , c) poner en contacto la mezcla candidata con la molécula objetivo, d) dividir los ácidos nucleidos que tienen una afinidad incrementada por la molécula objetivo, con relación a una afinidad de la mezcla candidata, de la mezcla candidata, y e) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad incrementada para proporcionar una mezcla enriquecida de aptámeros, por lo que se identifican los aptámeros para la molécula objetivo que comprenden todos los nucleótidos modificados en la posición 2', excepto que el primer nucleótido de los aptámeros puede no estar modificado en la posición 2' .
37. El método según la reivindicación 36, en donde el paso de amplificar comprende (i) opcionalmente disociar los ácidos nucleicos con afinidad incrementada del objetivo, ii) transcribir de manera inversa los ácidos nucleicos con afinidad incrementada disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo, iii) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad incrementa transcritos de manera inversa; y (ii) preparar una mezcla de reacción de la transcripción, que comprende los ácidos con afinidad incrementada transcritos de manera inversa amplificados, como la plantilla de transcripción y transcribir la mezcla de transcripción.
38. El método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 37, en donde todos los trifosfatos del nucleótido en la reacción de transcripción están modificados con 2 '-OMe.
39. El método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en donde una o más plantillas de transcripción de los ácidos nucleicos comprenden un promotor de la ARN polimerasa T7 y una secuencia líder inmediatamente a 3 ' al promotor de la ARN polimerasa T7.
40. El método según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, que comprende repetir los pasos a) a e) de manera iterativa.
41. Un método para identificar una secuencia del componente de la plantilla del ácido nucleico para mejorar la transcripción, que comprende: a) preparar una biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción, en donde las plantillas comprenden un promotor, una primera región fija inmediatamente a 3' al promotor, una región degenerada inmediatamente a 3' a la primera región fija y una segunda región fija en 3 ' a la región degenerada, b) transcribir la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción en una reacción de transcripción a la mezcla de transcripción resultante que tiene un rendimiento del transcripto, c) transcribir de manera inversa la mezcla de transcripción para obtener una mezcla candidata de plantillas de ADNc, en donde las plantillas de ADNc comprenden un término 5 ' y 3 ' , d) ligar una secuencia de ADN que codifica el promotor al término 3' de las plantillas de ADNc en una reacción de ligadura, e) amplificar las plantillas de ADNc para que resulten en una biblioteca de candidatos de la plantilla de transcripción, y f) identificar un componente de la secuencia de ácidos nucleicos para mejorar la transcripción de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción, en donde el componente de la secuencia del ácido nucleico comprende una secuencia derivada de al menos una porción de la región degenerada.
42. El método según la reivindicación 45, en donde el paso f) comprende los pasos de: i) clonar la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción en las plantillas de transcripción individuales, ii) transcribir las plantillas de transcripción individuales en una reacción de transcripción para resultar en un rendimiento del transcripto, iii) valorar el rendimiento del transcripto de las plantillas de transcripción individuales, y iv) identificar el componente de la secuencia del ácido nucleico en una plantilla de transcripción que resulte en un rendimiento del transcripto predeterminado.
43. El método según la reivindicación 42, en donde el rendimiento del transcripto predeterminado es un rendimiento mayor que el rendimiento del transcripto obtenido en el paso b) transcribiendo la mezcla candidata de la plantilla de transcripción.
44. El método según la reivindicación 41, en donde el paso f) comprende analizar la composición de base de la región degenerada de la biblioteca de los candidatos de la plantilla de transcripción e identificar el componente de la secuencia del ácido nucleico basándose en la composición de la base promedio de la biblioteca candidato de la plantilla de transcripción.
45. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, en donde el paso b) comprende además tratar la mezcla de transcripción transcrita con DNasa.
46. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, en donde el paso comprende además purificar la mezcla de transcripción transcrita dividiendo las plantillas de transcripción transcritas lejos de los otros componentes de la reacción de transcripción.
47. El método según la reivindicación 46, en donde el paso de purificación comprende reemplazar el amortiguador de la reacción de transcripción corriendo la reacción de transcripción a través de una columna de desalado.
48. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, en donde el paso d) se hace antes del paso c) .
49. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48, en donde la reacción de ligadura es una reacción de ligadura fragmentada, y la reacción de ligadura comprende una fragmentación del ácido nucleico y un oligonucleótido 5' -monofosforilado que codifica el promotor .
50. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, que comprende además repetir los pasos b) a e) más de una vez antes de realizar el paso f) .
51. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 50, en donde la reacción de transcripción comprende uno o más trifosfatos del nucleótido modificados y una polimerasa mutada.
52. El método según la reivindicación 51, en donde el uno o más trifosfatos del nucleótido modificados es un trifosfato del nucleótido modificado en la posición 2' .
53. El método según la reivindicación 51 ó 52, en donde la polimerasa mutada es una ARN polimerasa T7 mutada .
54. El método según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 53, en donde el trifosfato del nucleótido modificado es un trifosfato del nucleótido 2' -OMe.
55. El método según cualquiera de las reivindicaciones 51 a 54, en donde la reacción de transcripción comprende iones de magnesio e iones de manganeso.
56. El método según la reivindicación 55, en donde la ARN polimerasa T7 mutada se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO 102 y SEQ ID NO 103.
57. El método según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 56, en donde los iones de magnesio están presentes en la reacción de transcripción a una concentración que es entre 3.0 a 3.5 veces mayor que la concentración del ion de manganeso.
58. El método según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 56, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 6.5 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.0 mM.
59. El método según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 56, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 1.5 mM, la concentración de iones de magnesio es 8 mM, y la concentración de iones de manganeso es 2.5 mM.
60. El método según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 56, en donde cada trifosfato del nucleótido está presente en la reacción de transcripción a una concentración de 2.0 mM, la concentración de iones de magnesio es 9.5 mM, y la concentración de iones de manganeso es 3.0 mM.
61. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 60, en donde la reacción de transcripción comprende además polialquilenglicol.
62. El método según la reivindicación 61, en donde el polialquilenglicol es polietilenglicol.
63. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 61, en donde la reacción de transcripción comprende además un residuo de guanosina seleccionado del grupo que consiste de: monofosfato de guanosina, difosfato de guanosina, monofosfato de 2' -fluoro guanosina, difosfato de 2' -fluoro guanosina, monofosfato de 2' -amino guanosina, difosfato de 2' -amino guanosina, monofosfato de 2' -desoxi guanosina y difosfato de 2' -desoxi guanosina.
64. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 63, en donde la reacción de transcripción comprende pirofosfatasa inorgánica.
65. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 64, en donde la primera región fija consiste de 2, 3, 4 ó 5 residuos de guanosina.
66. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 65, en donde la región degenerada comprende al menos 4, 10, 20 ó 30 nucleótidos.
67. El método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 66, en donde la secuencia del componente de la plantilla del ácido nucleico a ser identificada es una secuencia líder.
68. El método según la reivindicación 67, en donde la secuencia líder comprende la primera región fija y una secuencia derivada de la región degenerada de la plantilla de transcripción de la biblioteca candidata.
69. Una secuencia líder identificada mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 68.
70. Una secuencia líder que comprende la secuencia de ácidos nucleicos del nucleótido 22 al nucleótido 32 de cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOS 10 a 99.
71. Una secuencia líder que comprende la secuencia de ácidos nucleicos del nucleótido 18 al nucleótido 32 en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOS 10 a 99.
72. Una plantilla de transcripción que comprende una secuencia líder según cualquiera de las reivindicaciones 70 a 71. 79. Una plantilla de transcripción oligonucleotídica, seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NOS 3 a 6 y 106.