MX2007002772A

MX2007002772A - Aptameros para el factor de von willebrand y su uso como agentes terapeuticos para la enfermedad trombotica.

Info

Publication number: MX2007002772A
Application number: MX2007002772A
Authority: MX
Inventors: John L Diener; Daniel H A Lagasse
Original assignee: Archemix Corp
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2008-03-05
Also published as: WO2006033854A3; KR20070101227A; BRPI0514984A; JP2008512098A; CA2579374A1; US7998940B2; US20090149643A1; AU2005287273A1; EP1789096A2; EP1789096A4; AU2005287273B2; IL181689A0; WO2006033854A2; SG156618A1

Abstract

La invencion se relaciona generalmente con el campo de los acidos nucleicos y mas particularmente con aptameros capaces de unirse al Factor de von Willebrand, utiles como agentes terapeuticos y de diagnostico de las enfermedades tromboticas y/u otras enfermedades o trastornos en los cuales se ha implicado la agregacion de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand. La invencion se relaciona ademas con materiales y metodos para la administracion de aptameros capaces de unirse al Factor de von Willebrand.

Description

APTAMEROS PARA EL FACTOR DE VON ILLEBRAND Y SU USO COMO AGENTES TERAPÉUTICOS PARA LA ENFERMEDAD TROMBÓTICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona generalmente con el campo de los ácidos nucleicos, y más particularmente con aptá eros capaces de unirse al Factor de von Willebrand, útiles como agentes terapéuticos en, y agentes de diagnóstico de las enfermedades trombóticas y/u otras enfermedades o trastornos en los cuales está implicada la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand. La invención se relaciona además con materiales y métodos para la administración de aptámeros capaces de unirse al Factor de von Willebrand.

JUsfTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los aptámeros son moléculas de ácidos nucleicos que tienen afinidad de unión especifica a moléculas a través de interacciones diferentes al apareamiento clásico de las bases de Watson-Crick. Los aptámeros, como los péptidos generados mediante la representación del fago o anticuerpos monoclonales ("mAbs") , son capaces de unirse de manera especifica a objetivos seleccionados y modular la actividad o las interacciones de unión del objetivo, por ejemplo, a través de la unión, los aptámeros pueden bloquear la capacidad de funcionar del objetivo. Descubiertos por un proceso de selección in vitro de recolecciones de oligonucleótidos de secuencia aleatoria, los aptámeros se han generado para más de 130 proteínas, incluyendo factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas y receptores. Un aptámero tipico es de 10-15 kDa de tamaño (20-45 nucleótidos), se une a su objetivo con afinidad nanomolar a subnanomolar, y discrimina los objetivos relacionados estrechamente (por ejemplo, los aptámeros típicamente no se unirán a otras proteínas de la misma familia génica) . Una serie de estudios estructurales ha mostrado que los aptámeros son capaces de utilizar los mismos tipos de interacciones de unión (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, complementariedades electrostáticas, contactos hidrofóbicos, exclusión estérica), que accionan la afinidad y la especificidad en los complejos anticuerpo-antigeno-. Los aptámeros tienen varias características deseables para utilizarse como agentes terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo alta especificidad y afinidad, eficacia biológica y excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, ofrecen ventajas competitivas especificas con respecto a los anticuerpos y otros compuestos biológicos de la proteina, por ejemplo: 1) Velocidad y control. Los aptámeros son producidos por un proceso totalmente in vitro, permitiendo la generación rápida de sondas iniciales, incluyendo sondas terapéuticas . La selección in vitro permite que la especificidad y afinidad del aptámero se controle de manera estrecha y permite la generación de sondas, incluyendo sondas contra los objetivos tóxicos y no inmunogénicos. 2) Toxicidad e Inmunogenicidad. Los aptámeros como una clase, han demostrado una toxicidad terapéuticamente aceptable y falta de inmunogenicidad. Mientras que la eficacia de muchos anticuerpos monoclonales puede limitarse severamente por la respuesta inmune a los anticuerpos mismos, es extremadamente difícil provocar anticuerpos para aptámeros, más probablemente debido a que los aptámeros no pueden presentarse por los linfocitos T vía MHC y la respuesta inmune entrenada generalmente para no reconocer los fragmentos de ácido nucleico. 3) Administración. Mientras que la mayoría de los agentes terapéuticos para anticuerpos aprobados en la actualidad se administran mediante infusión intravenosa (típicamente durante 2-4 horas) , los aptámeros pueden administrarse mediante inyección subcutánea (la biodisponibilidad del aptámero vía la administración subcutánea es >80% en estudios con monos (Tucker et al, J. Chromatography B. 732:203-212, 1999)). Con buena solubilidad (>150 mg/mL) y un peso molecular comparativamente bajo (aptámero: 10-50 kDa; anticuerpo: 150 kDa) , una dosis semanal de aptámero puede suministrarse mediante inyección en un volumen de menos que 0.5 mL. Además, el pequeño tamaño de los aptámeros les permite penetrar en las áreas de constricciones conformacionales que no permiten que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos penetren, presentando aún otra ventaja de los agentes terapéuticos o la profilaxis basada en aptámeros. 4) Escalabilidad y costo. Los aptámeros terapéuticos son sintetizados químicamente, y en consecuencia pueden escalarse fácilmente conforme se necesite para cumplir la demanda de la producción. Mientras que las dificultades en escalar la producción están limitando actualmente la disponibilidad de algunos compuestos biológicos y el costo capital de una planta de producción de proteína a gran escala es enorme, un solo sintetizador de oligonucleótidos a gran escala puede producir hasta 100 kg/año, y requiere una inversión inicial relativamente modesta. El costo actual de los bienes para la síntesis de los aptámeros a escala de kilogramos, se estima en $500/gramo, en comparación con aquél para los anticuerpos altamente optimizados. Se espera que las mejoras continuas en el desarrollo del proceso disminuyan el costo de los bienes a < $100/gramo en cinco años. 5) Estabilidad. Los aptámeros son químicamente robustos. Estas adaptados intrínsecamente para recuperar la actividad después de la exposición a factores tales como calor y desnaturalizantes, y pueden almacenarse durante periodos extendidos (>1 año) a temperatura ambiente como polvos liofilizados.

ENFERMEDAD TROMBÓTICA Durante la hemostasis normal, controlada, las plaquetas no se adhieren a los vasos sanos, sino que las plaquetas típicamente se adhieren al subendotelio de los vasos lesionados. La adhesión de las plaquetas desencadena una serie de procesos de activación de las plaquetas que resultan finalmente en la formación de un trombo y el cese del sangrado. El Factor de von Willebrand ("vWF") , es un mediador de la adhesión de las plaquetas en sitios de daño vascular. El vWF es un factor multimérico soluble, con múltiples subunidades grandes, producido principalmente por las células endoteliales vasculares. El Factor de von Willebrand se inmoviliza en la pared del vaso sanguíneo vía interacciones entre el dominio A3 del Factor de von Willebrand y el colágeno expuesto. Las interacciones transitorias de la glucoproteína Ib del receptor de las plaquetas ("de aquí en adelante GPIb") y el dominio Al del Factor de von Willebrand inmovilizado, facilita la adhesión y activación de las plaquetas en los sitios de lesión vascular. E.G. Huizinga et al., Science, 297, 1176 (2002). En consecuencia, el factor de von Willebrand es protrombótico, jugando un papel importante durante la hemostasis al facilitar la formación de trombos en los sitios de lesión vascular. De manera inversa, el Factor de von Willebrand, mediante el mismo mecanismo, también juega un papel clave en las condiciones patológicas, tales como enfermedades cardiovasculares, que involucran la agregación de plaquetas y la formación de trombosis. Aunque las terapias antitrombóticas están actualmente disponibles, hay todavía una gran necesidad no cumplida para terapias adicionales. La Asociación .Americana del Corazón estima que más de 60 millones de personas sólo en los Estados Unidos, tienen una o más formas de enfermedad cardiovascular, y que una alta proporción de gente con enfermedad cardiovascular tiene un riesgo mayor de trombosis arterial. S.P. Jackson y S.M. Schoenwaelder, Nature Reviews, 2, 1-12 (2003) . Un problema significativo con las terapias actualmente disponibles es que la mejora de la eficacia reduce la seguridad. S.P. Jackson y S.M. Schoenwaelder, Nature Reviews, 2, 1-12 (2003) . En consecuencia, sería benéfico tratar o prevenir la enfermedad trombótica previniendo la agregación de las plaquetas en la vasculatura, mientras que se reducen al mínimo los efectos laterales del sangrado. La presente invención proporciona materiales y métodos para cumplir con estas y otras necesidades .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática del proceso de selección del aptámero in vitro (SELEX™) de recolecciones de oligonucleótidos de secuencia aleatoria. La Figura 2 es una ilustración que describe varias estrategias de PEGilación que representan la monoPEGilación estándar, PEGilación múltiple y oligomerización vía PEGilación. La Figura 3 es una tabla que lista las secuencias de aminoácidos de las proteínas del dominio Al del Factor de von Willebrand utilizadas en los experimentos de la invención. La Figura 4 es una tabla que lista la secuencia de aminoácidos de la proteína del Factor de von Willebrand humano de longitud completa, utilizado en los experimentos de la invención. La Figura 5 es una ilustración que describe la estructura secundaria propuesta de ARC1029 (SEQ ID NO 214) . La Figura 6 es una gráfica de las curvas de unión de la transferencia por puntos para ARC1029 (SEQ ID NO 214) al vWF de longitud completa y dominio Al del vWF de conejo.

Un recuadro negro en esta tabla indica una supresión. La Figura 7 es una gráfica de los datos de FACS que muestran que ARC1029 (SEQ ID NO 214), inhibe la unión de vWF humano y el dominio Al del vWF de conejo a las plaquetas humanas liofilizadas. La Figura 8 es una gráfica de un trazo de un agregómetro que muestra que ARC1029 (SEQ ID NO 214), inhibe la agregación de las plaquetas por botrocetina con el tiempo . La Figura 9 es una representación gráfica de ARC1029 (SEQ ID NO 214), que inhibe la agregación de las plaquetas inducida por botrocetina. La Figura 10 es una ilustración que describe la estructura secundaria propuesta para la SEQ ID NO 217, en donde C = fC, T = fü, N = cualquier nucleótido pero en las regiones apareadas adopta un par de bases de Watson/Crick, y X = 1 a 4 nucleótidos o Nx-Nx-Nx-Nx, puede reemplazarse con un separador de PEG. La Figura 11 es una ilustración que describe la secuencia para tres aptámeros de la Familia #1 de SELEX™ rRdY del vWF. La Figura 12 es una ilustración que describe la estructura secundaria propuesta para la SEQ ID NO 218. La Figura 13 es una ilustración describe la estructura secundaria propuesta para la SEQ ID NO 219.

La Figura 14 es una ilustración que describe la alineación de la secuencia para 26 aptámeros de la Familia #1 de SELEX™ 2 del ADN del vWF. La línea negra en la parte superior de la alineación representa la secuencia de unión al ácido nucleico central propuesta, requerida para unirse al objetivo del Factor de von Willebrand. La Figura 15 es una ilustración que describe la estructura secundaria propuesta para la SEQ ID NO 220. La Figura 15B es una ilustración que describe la estructura secundaria de ARC1172 (SEQ ID NO 222), y cuáles residuos son tolerantes de la sustitución 2' -OMe. La Figura 16 es una tabla que describe las secuencias de ácidos nucleicos que incluyen cualesquier modificaciones de ARC1029 (SEQ ID NO 214), ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), y ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1243 (SEQ ID NO 272) . La Figura 17 es una tabla que describe las secuencias de ácidos nucleicos que incluyen cualesquier modificaciones de ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1348 (SEQ ID NO 283) y ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304) . Un bloque negro en esta tabla indica una supresión. Un "s" que precede a un indicador nucleotídico (por ejemplo, T o dA) , indica una sustitución de fosforotioato en la cadena principal del fosfato 5' al nucleótido indicado.

La Figura 18 es una tabla que describe las secuencias de ácidos nucleicos que incluyen cualesquier modificaciones de ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1524 (SEQ ID NO 305) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317) y ARC1759 (SEQ ID NO 318) . Un bloque negro en esta tabla indica una supresión. La Figura 19 es una ilustración de la estructura secundaria de ARC1368 (SEQ ID NO 291) y ARC1534 (SEQ ID NO 315) . La Figura 20 es una gráfica que describe el tiempo de coagulación, en el ensayo PFA-100, para sangre humana completa tratada con ARC1368 (SEQ ID NO 291) o ARC1525 (SEQ ID NO 306) , como una función de la concentración del aptámero . La Figura 21 es una gráfica que describe el tiempo de oclusión, en un ensayo PFA-100, de la sangre humana completa tratada con Integrili (™) , ReoPro (™) o ARC1368 (SEQ ID NO 291) , como una función de la concentración del fármaco . La Figura 22 es una gráfica que describe el por ciento de inhibición en BIPA, de PRP humano, tratado con Integrilin(™) , ReoPro (™) o ARC1368 (SEQ ID NO 291), como una función de la concentración del fármaco. La Figura 23 es una gráfica que describe el por ciento de inhibición en AIPA, de PRP humano, tratado con Integrilin(™) , ReoPro (™) o ARC1368 (SEQ ID NO 291), como una función de la concentración del fármaco. La Figura 24 es una gráfica que describe el porcentaje de ARC1172 de longitud completa (SEQ ID NO 222) o ARC1368 (SEQ ID NO 291), detectado en plasma humano,, como una función del tiempo. La Figura 25 es una gráfica que describe la concentración del aptámero en plasma de primate (determinado utilizando un análisis Oligreen) , graficado como una función del tiempo después de la administración de ARC1368 (SEQ ID NO 291), ARC1779 (SEQ ID NO 320) o ARC1780 (SEQ ID NO 321). La Figura 26 es una gráfica que muestra los puntos de medición en el eje horizontal en los cuales la sangre para las pruebas se extrajo de tres macacos de Java, la concentración en plasma de ARC1779 (SEQ ID NO 320) (en nM) , junto con el tercio superior del eje vertical, el tiempo de cierre de PFA-100 (en segundos) en el tercio medio del eje vertical, y la muestra o el tiempo de sangrado cutáneo (en minutos) en el tercio inferior del eje vertical. El promedio de los tres animales para la concentración del aptámero en plasma, el tiempo de cierre de PFA-100 .y el tiempo de sangrado cutáneo se gráfica en el tercio superior, el tercio medio y el tercio inferior de la gráfica, respectivamente . La Figura 27 es una tabla que muestra el tiempo del sangrado subcutáneo (CBT) en minutos, los datos de BIPA sin analizar y el tiempo de cierre de PFA-100 (segundos) a varios puntos de medición, mostrados en la columna 1, con relación a la dosificación de ARC1779 (SEQ ID NO 320) en tres diferentes macacos de Java. La Figura 28 es una gráfica que muestra el tiempo de cierre promedio de PFA-100 a varios puntos de medición después de la dosificación de ARC1779 (SEQ ID NO 320) de los macacos de Java. La Figura 29 es una gráfica que muestra el tiempo de sangrado promedio de tres macacos tratados con ARC1779 (SEQ ID NO 320) , tomado a varios puntos de medición después de la dosificación. La Figura 30 es una gráfica que correlaciona el tiempo de sangrado promedio en macacos de Java tratados con ARC1779 (SEQ ID NO 320) (eje vertical izquierdo) con el tiempo de cierre de PFA-100. La Figura 31 es un esquema que describe el programa de recolección de la muestra de la sangre utilizado en la valoración de ARC1779 (SEQ ID NO 320) en el modelo de trombosis electrolítica del macaco de Java. La Figura 32 es una gráfica de la concentración en plasma de ARC1779 (SEQ ID NO 320) (eje vertical) como una función del tiempo en cada macaco de Java del grupo de tratamiento 3, probado en el modelo de trombosis electrolítica . La Figura 33 es una gráfica del tiempo de oclusión de la arteria carótida derecha (barra sombreada) o izquierda (indicada como una barra sólida) , en cada macaco de Java para cada grupo de tratamiento probado en el modelo de trombosis electrolítica del macaco de Java. Los pares de barras 1, 8 y 9 indican el grupo de tratamiento 1 (vehículo únicamente) . Los pares de barras 2, 10, 11, 12 y 13 indican los grupos de tratamiento 2 y 4 (ReoPro) . Los pares de barras 3 a 7 indican los grupos de tratamiento 3 (grupo objetivo de concentración en plasma del aptámero 1000 nM) . Los pares de barras 20, 22, 16 y 18 indican el grupo de tratamiento 7 (grupo objetivo de concentración del aptámero en plasma de 750 nM) . Los pares de barras 19, 21, 23 y 24 indican el grupo de tratamiento 6 (grupo objetivo de concentración del aptámero en plasma de 500 nM) . Los pares de barras 15 y 17 indican el grupo de tratamiento 5 (.grupo objetivo de concentración del aptámero en plasma de 300 nM) . La Figura 34 es una gráfica que muestra el tiempo de sangrado cutáneo en minutos (eje vertical) de los varios grupos de tratamiento de macacos de Java en el modelo de lesión tomado en los puntos de medición mostrados en el eje horizontal .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona materiales y métodos para el tratamiento de trastornos trombóticos que involucran la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand. La presente invención proporciona aptámeros que se unen de de manera específica a un objetivo del Factor de von Willebrand. En algunas modalidades, el objetivo del Factor de von Willebrand es el Factor de von Willebrand humano. En algunas modalidades, el objetivo del Factor de von Willebrand es una variante del Factor de von Willebrand humano que realiza una función biológica que es esencialmente la misma que la función del Factor de von Willebrand humano. En algunas modalidades, la función biológica del objetivo del Factor de von Willebrand o una variante del mismo es mediar la agregación de las plaquetas . En algunas modalidades, la variante del objetivo del Factor de von Willebrand humano tiene sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad para unirse a un aptámero de la invención, que aquéllas del Factor de von Willebrand humano. En algunas modalidades, el objetivo del vWF es un Factor de von Willebrand no humano. En algunas modalidades, el aptámero de la invención se une al objetivo del Factor de von Willebrand o una variante del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 90% o 95% idéntica a la SEQ ID NO 7 (Figura 4) . En una modalidad, el objetivo del Factor de von Willebrand comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 7. Los términos "identidad de la secuencia" o "% de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas, que tienen un porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para la correspondencia máxima, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de la secuencia o mediante inspección visual. Para la comparación de la secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual las secuencias de prueba se comparan. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de la secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, las coordenadas de la subsecuencia se designan si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. El algoritmo de comparación de la secuencia calcula entonces el por ciento de identidad de la secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados, del programa. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl.

Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la investigación para el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science" Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual (véase, generalmente, Ausubel, F. M. et ah, Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc, y Wiley-Merscience (1987) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de la identidad de la secuencia es el algoritmo utilizado en la herramienta de búsqueda de la alineación local básica (de aquí en adelante "BLAST") , véase, por ejemplo Altschul et al, J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) y Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15:3389-3402 (1997) . El programa para realizar los análisis BLAST están disponibles al público a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (de aquí en adelante "NCBI") . Los parámetros predeterminados utilizados en determinar la identidad de la secuencia utilizando el programa disponible de NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias nucleotídicas) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos), se describen en McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32:W20-W25 (2004), En una modalidad preferida, el por ciento de identidad se determina utilizando el algoritmo implementado por BLAST de Altschul et al, y los parámetros predeterminados de McGinnis et al., que en la presente pueden referirse como el por ciento de identidad BLAST. En una modalidad, el aptámero de vWF de la invención, comprende una constante de disociación para el Factor de von Willebrand humano o una variante del mismo, de aproximadamente 100 nM o menos, de manera preferida 50 nM o menos, de manera preferida 10 nM o menos, de manera preferida 5 nM o menos, de manera preferida 1 nM o menos, y de manera más preferida 500 pM o menos. La constante de disociación puede determinarse mediante el ensayo de transferencia por puntos, utilizando una titulación con múltiples puntos y ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, como se describe en el Ejemplo 1, siguiente . La presente invención también proporciona un aptámero que se une de manera específica a un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand. En algunas modalidades, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand es un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand humano. En algunas modalidades, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand humano es una variante del dominio Al del Factor de von Willebrand humano que realiza una función biológica que es esencialmente la misma que una función del dominio Al del Factor de von Willebrand humano. En algunas modalidades, la función biológica del dominio Al del Factor de von Willebrand o una variante del mismo es unirse a las plaquetas. En algunas modalidades, la variante del objetivo del dominio del Factor de von Willebrand humano tiene sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad para unirse al aptámero que aquéllas del dominio Al del Factor de von Willebrand humano. En otras modalidades, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand es un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand no humano,, por ejemplo, un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand de conejo o de primate no humano. En algunas modalidades, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 90% o 95% idéntica a cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOS 4 a 6. En una modalidad preferida, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste: de las SEQ ID NOS 4 a 6. En una modalidad, el aptámero de vWF de la invención comprende una constante de disociación para el dominio Al del Factor de von Willebrand humano o una variante del mismo, de aproximadamente 100 nM o menos, de manera preferida 50 nM o menos, de manera preferida 10. nM o menos, de manera preferida 5 nM o menos, de manera preferida 1 nM o menos, y de manera más preferida 500 pM o menos. En otra modalidad, el aptámero de la invención comprende una constante de disociación para un dominio Al del Factor de von Willebrand no humano o una variante del mismo, de aproximadamente 100 nM o menos, de manera preferida 50 nM o menos, de manera preferida 10 nM o menos, de manera preferida 5 nM o menos, de manera preferida 1 nM o menos, y de manera más preferida 500 pM o menos. La constante de disociación puede determinarse mediante un ensayo de transferencia por puntos utilizando una titulación con múltiples puntos y ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, como se describe en el Ejemplo 1, siguiente . En algunas modalidades, la invención proporciona un aptámero que se une de manera específica a un objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand. En algunas modalidades, la invención proporciona un aptámero que se une de manera específica a un objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand y a un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand. En algunas modalidades, el objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand es un objetivo de von Willebrand humano o una variante del mismo. En otras modalidades, el objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand es un objetivo de von Willebrand no humano o una variante del mismo. En algunas modalidades, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand es un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand no humano o una variante del mismo. En otras modalidades, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand es un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand humano o una variante del mismo. En algunas modalidades, el objetivo de longitud completa o el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand se selecciona del grupo que consiste de: un objetivo de longitud completa o el dominio Al del Factor de von Willebrand de conejo, cobayo, mono, perro, oveja, ratón y rata. En algunas modalidades, el objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand y el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand al cual el aptámero de la invención se une de manera específica, es de diferentes especies. La presente invención proporciona aptámeros contra un objetivo del Factor de von Willebrand que es un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico y un ácido desoxirribonucleico mezclados.. Los aptámeros de la invención pueden ser un ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico de una sola hebra o un ácido ribonucleico y un ácido desoxirribonucleico mezclados. En algunas modalidades, el aptámero de la invención comprende al menos una modificación química. En algunas modalidades, la modificación química se selecciona del grupo que consiste de: una sustitución química en una posición de un azúcar; una sustitución química en una posición de un fosfato; y una sustitución química en una posición de una base del ácido nucleico. En otras modalidades, la modificación química se selecciona del grupo que consiste de: incorporación de un nucleótido modificado, coronación 3' , conjugación a un peso molecular alto, compuesto no inmunogénico, conjugación' a un compuesto lipofílico e incorporación de fosforotioato en la cadena principal del fosfato. En una modalidad preferida, el compuesto no inmunogénico, de alto peso molecular es un polilalquilenglicol, de manera más preferida polietilenglicol . En algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un aptámero, por ejemplo un aptámero del Factor de von Willebrand, que se une de manera específica a un objetivo, en donde el aptámero comprende una secuencia nucleotídica que tiene no más que cuatro, no más que tres, no más que dos o no más que una modificación de la cadena principal de fosforotioato, y el aptámero tiene una afinidad de unión por el objetivo, en donde la afinidad de unión se incrementa con relación a un segundo aptámero que tiene la misma secuencia nucleotídica, pero que carece de la modificación de la cadena principal de fosforotioato.' En algunas modalidades, el objetivo es una proteína o péptido que no tiene la función conocida del ácido nucleico de unión, particularmente no tiene la función conocida del ácido nucleico de unión. En algunas modalidades, el aptámero de la invención modula una función de cualquiera del grupo que consiste de: el objetivo del Factor de von Willebrand, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand y una variante de cualquier objetivo. En algunas modalidades, la función modulada es la mediación de la agregación de las plaquetas. En algunas modalidades, el aptámero de la invención inhibe la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand in vivo . En otras modalidades, el aptámero de la invención evita la unión de cualquiera del grupo que consiste de: el objetivo del Factor de von Willebrand, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand y una variante del mismo, a las plaquetas. En otras modalidades, el aptámero de la invención evita la unión de cualquiera del grupo que consiste de: el objetivo del Factor de von Willebrand, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand y una variante de cualquier objetivo, a una proteína receptora de las plaquetas. En aún otras modalidades, el aptámero de la invención evita la unión de cualquiera del grupo que consiste de: el objetivo del Factor de von Willebrand, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand y una variante de cualquier objetivo, a la proteína del receptor de las plaquetas GPIb . En algunas modalidades, el aptámero de la invención evita la agregación de las plaquetas mediadas por el Factor de vWF, mientras que no se incrementa de manera significativa el tiempo de sangrado. En algunas modalidades, un incremento no significativo en el tiempo de sangrado es menos que 15 minutos, de manera preferida menos que 10 minutos, de manera más preferida menos que 5 minutos, y en algunas modalidades, menos que 3 minutos con relación al tiempo de sangrado de un sujeto no tratado con el aptámero de la invención. En algunas modalidades, el tiempo de sangrado se determina mediante el tiempo de sangrado cutáneo (o patrón) . En algunas modalidades, el aptámero de la invención tiene sustancialmente la misma capacidad para unirse a cualquiera del grupo que consiste de: el objetivo del Factor de von Willebrand, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand y una variante del mismo, que aquélla de un aptámero seleccionada del grupo que consiste de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En .otras modalidades, el aptámero de la invención tiene sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad para unirse a cualquiera del grupo que consiste de: el objetivo del Factor de von Willebrand, el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand y una variante del mismo, que aquéllas de un aptámero seleccionado del grupo de secuencias que consiste de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En aún otras modalidades, el aptámero de la invención se selecciona del grupo que consiste de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En una modalidad particular, el aptámero de la invención comprende la secuencia primaria de ácidos nucleicos de ARC1172 (SEQ ID NO 222) o ARC1115 (SEQ ID NO 221) o ARC1029 (SEQ ID NO 214) o la SEQ ID NO 220, y no comprende un nucleótido sustituido con 2'-0-Me en la posición 6 a 9, 20, 22, 24 a 27, 30 ó 32 a 33. En otra modalidad, el aptámero de la invención comprende la secuencia de ácido nucleico de ARC1172 (SEQ ID NO 222) o ARC1115 (SEQ ID NO 221) o ARC1029 (SEQ ID NO 214) o la SEQ ID NO 220, y comprende un nucleótido sustituido con 2'-0-Me en una o más posiciones, en 5 o más posiciones, en 10 o más posiciones, en 15 o más posiciones, o en 20 o más posiciones. En otra modalidad, el aptámero de la invención comprende la secuencia de ácido nucleico de ARC1172 (SEQ ID NO 222) o ARC1115 (SEQ ID NO 221) o ARC1029 (SEQ ID NO 214) o la SEQ ID NO 220, y comprende un nucleótido sustituido con 2'-0-Me en todas las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: posición 1 a 5, posición 10 a 19, posición 21, posición 23, posición 28 a 29, y posición 34 a 41, en donde la numeración de la posición empieza en el extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos . En una modalidad particular de la invención, se proporciona un aptámero comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de: las SEQ ID NO 95 a 97 y las SEQ ID NO 217 a 219, en donde: Y = C o T/ü, R = A o G, N = cualquier nucleótido pero en las regiones apareadas adopta un par de bases de Watson/Crick; y X = 1 a 4. En otra modalidad, un aptámero de la invención se selecciona del grupo que consiste de: las SEQ ID NO 217 y 220, en donde Nx-Nx-Nx-Nx-, o N(3_?o), puede reemplazarse con un enlazante de PEG. En aún otra modalidad, un aptámero de la invención se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOS 325-327, en donde Y= C o T, R = A o G. En una modalidad particular, el aptámero que se une de manera específica a un Factor de von Willebrand, comprende un motivo de una estructura secundaria de unión de una hélice de tres vías, que tiene la estructura de la secuencia de consenso de la SEQ ID NO 220 descrita en la Figura 15. En otra modalidad particular, el aptámero que tiene la unión de la hélice de tres vías comprende la estructura de consenso descrita en la Figura 19A (ARC1368 (SEQ ID NO 291) ) . Mientras que en otra modalidad, el aptámero que tiene la unión de la hélice de tres vías comprende la estructura de consenso descrita en la Figura 19B (ARC1534 (SEQ ID NO 315)). En otra modalidad, el aptámero que se une de manera específica al Factor de von Willebrand, comprende un motivo de una estructura secundaria de tallo-espira-tallo-espira que tiene la estructura de la secuencia de consenso de la SEQ ID NO 217, descrita en la Figura 10. En otra modalidad, el aptámero que se une de manera específica al Factor de von Willebrand, comprende el motivo de la estructura secundaria tallo-espira-espira que tiene la estructura de la secuencia de consenso de la SEQ ID NO 218, descrita en la Figura 12. En otra modalidad, el aptámero que se une de manera específica al Factor de von Willebrand, comprende un motivo de una estructura secundaria de unión de tres vías con dos tallos helicoidales y un tallo-espira de la SEQ ID NO 19, como se describe en la Figura 13. En algunas modalidades, el motivo de la estructura secundaria del aptámero de la invención se predice mediante: RNAstructure, Versión 4.1 (Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, S.J.; Zuker, M.; y Turner, D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secundary structure", 2004. Actas de sesiones de la Academia Nacional de Ciencias, EUA, 101, 7287-7292) . En una modalidad preferida, se proporciona un aptámero que se une de manera específica a un objetivo del Factor de von Willebrand humano y a un objetivo del Factor de von Willebrand no humano. En una modalidad, se proporciona un aptámero que comprende la siguiente estructura o una sal del mismo: H3C(OCH2CH2)ñ-0— 9 C-HN™™- 5' Aptamero 3' en donde: n es aproximadamente 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) "ww * es un enlazante, y el aptámero es un aptámero anti-vWF de la invención. En una modalidad particular, el aptámero comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos o fragmento de la misma: mGmCmGmüdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmC dCmUdCdCmGmüdCmAmCmGmC-3T (SEQ ID NO 291), en donde m se refiere a una sustitución con 2 '-OMe, la "d" se refiere a un desoxinucleótido, la "s" se refiere a una sustitución con fosforotioato y "3T" se refiere a una desoxitimidina invertida. En otra modalidad, el aptámero comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos o fragmentos de la misma: dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdC dGdGdTdGdCdCdTdCdCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T (SEQ ID NO 323), en donde "d" se refiere a un desoxinucleótido y "3T" se refiere a una desoxitimidina invertida. En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el enlazante es un enlazante alquilo. En modalidades particulares, el enlazante alquilo comprende de 2 a 18 grupos CH2 consecutivos. En modalidades preferidas, en enlazante alquilo comprende de 2 a 12 grupos CH2 consecutivos. En las modalidades particularmente preferidas, el enlazante alquilo comprende de 3 a 6 grupos CH2 consecutivos. En una modalidad particular, el aptámero de la invención comprende la siguiente estructura: ' Aptámero 3' en donde: n es aproximadamente 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) , y la secuencia de ácidos nucleicos del aptámero es un aptámero anti-vWF de la invención. En una modalidad particular, el aptámero comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos o un fragmento de la misma: mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmümCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmC dCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T (SEQ ID NO 291), en donde m se refiere a una sustitución con 2 '-OMe, la "d" se refiere a un desoxinucleótido, la "s" se refiere a una sustitución con fosforotioato y "3T" se refiere a una desoxitimidina invertida. En otra modalidad, el aptámero comprende la siguiente secuencia de ácidos nucleicos o un fragmento de la misma : dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdC dGdGdTdGdCdCdTdCdCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T (SEQ ID NO 323), en donde "d" se refiere a un desoxinucleótido y "3T" se refiere a una desoxitimidina invertida. En otra modalidad, se proporciona una sal de un aptámero de la invención. En una modalidad particular, se proporciona la siguiente sal del aptámero: N- ( etoxi-polietilenglicol) -6-aminohexilil- (1?5' ) -2' -OMe-guanilil- (3'?5' ) -2' -OMe-citidilil- (3' ->5' ) -2' -OMe-guanilil-(3X5' )-2'~OMe-uracilil-(3'?5' ) -2' -desoxiguanilil- (3X5' )-2'-desoxicitidilil-(3X5' ) -2' -desoxiadenilil- (3X5' ) -!' -OMe-guanilil- (3X5' ) -2' -OMe-uracilil- (3X5' )-2'-OMe-guanilil- (3X5' ) -2' -OMe-citidilil- (3'?5' ) -2' -OMe-citidilil- (3X5' ) -2' -OMe-uracilil- (3X5') -2' -OMe-uracilil- (3X5' ) -2' -OMe-citidilil- (3X5' ) -2' -OMe-guanilil- (3X5' )-2 '-OMe-guanilil- (3X5' ) -2' -OMe-citidilil- (3X5' ) -2'-desoxicitidilil-(3X5' ) -2' -OMe-P-tioguanilil- (3X5' ) -2 ' -desoxitimidilil-(3X5' ) -2' -OMe-guanilil- (3'?5')-2'-desoxicitidilil- (3X5' ) -2' -desoxiguanilil- (3' ?5' ) -2'-desoxiguanilil- (3X5' ) .2' -desoxitimidilil- (3X5' ) -2' -OMe-guanilil- (3X5') -2 '-OMe-citidilil- (3'?5')-2'-desoxicitidilil- (3X5' ) -2' -OMe-uracilil- (3X5' )-2'-desoxicitidilil- (3'?5') -2' -desoxicitidilil- (3X5' ) -2' -OMe-guanilil- (3' ?5' ) -2' -OMe-uracilil- (3X5' ) -2 ' -desoxicitidilil- (3X5' ) -2' -OMe-adenilil- (3X5' ) -2' -OMe-citidilil- (3' ?5' ) -2' -OMe-guanilil- (3X5' ) -2'-OMe-citidilil- (3'-5' ) - (3'-»3' ) -2' -desoxitimidina, sal de sodio 40, en donde el metoxi polietilenglicol comprende un peso molecular de 20 kDa. En aún otra modalidad, se proporciona • una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los aptámeros de la invención o una sal de los mismos y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, la composición farmacéutica de la invención comprende ARC1779. En una modalidad más particular, la composición farmacéutica comprende un aptámero que tiene la siguiente estructura o una sal del mismo : Aptámero 3' en donde: n es aproximadamente 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) , y el aptámero comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico o un fragmento del mismo : mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T (SEQ ID NO 291), en donde m se refiere a una sustitución con 2' -OMe, la "d" se refiere a un desoxinucleótido, la "s" se refiere a una sustitución con fosforotioato y "3T" se refiere a una desoxitimidina invertida. La invención proporciona un método para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad mediada por el Factor de von Willebrand, que comprende administrar un aptámero o una composición farmacéutica de la invención a un vertebrado, de manera preferida un mamífero, de manera más preferida un humano. En algunas modalidades, la enfermedad a ser tratada, evitada o aliviada se selecciona del grupo que consiste de: trombocitopenia esencial, púrpura trombocitopénica trombótica ("TTP") , enfermedad de von Willebrand del Tipo Ilb, pseudoenfermedad de von Willebrand, enfermedad de la arteria periférica, por ejemplo, enfermedad oclusiva de la arteria periférica, angina inestable, angina pectoral, trombosis arterial, aterosclerosis, infarto al miocardio, síndrome coronario agudo, fibrilación atrial, estenosis de la carótida, infarto cerebral, trombosis cerebral, apoplejía isquémica y ataque isquémico cerebral transitorio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica de la invención se administra antes de/durante y/o después de la diálisis, cirugía CABG, intervención coronaria percutánea o reemplazo de la válvula cardiaca. La longitud de la vida media in vivo del aptámero de la invención, puede variar dependiendo de la enfermedad a ser tratada, aliviada y/o evitada. For ejemplo, en algunas modalidades en las cuales la administración crónica del aptámero es deseable debido a las características de la enfermedad a ser tratada, aliviada y/o evitada, el aptámero de la invención puede comprender una vida media relativamente larga, por ejemplo, una vida media mayor que cinco horas en humanos . En otras modalidades, el aptámero de la invención comprende una vida media funcional deseada o duración del efecto. La vida media funcional o duración del efecto es una función de la vida media farmacocinética y la actividad farmacodinámica del aptámero. En algunas modalidades, la vida media funcional o duración del efecto humano deseado para un aptámero terapéutico anti-vWF es del orden de 1-5 horas para las indicaciones propuestas de PCI y. ACS electivos. Los aptámeros con tales cinéticas, representan un equilibrio entre el objetivo doble de (1) reducir al mínimo la dosis total del aptámero (logrado con una vida media más larga) y (2) permitir la normalización rápida de la función de las plaquetas después del cese del tratamiento (logrado con una vida media más corta) . En algunas modalidades, la normalización rápida de la función de las plaquetas es importante, puesto que permite a los clínicos la opción de una intervención rápida (por ejemplo, CABG) si un paciente falla en estabilizarse en respuesta al tratamiento . En consecuencia, en algunas modalidades, el aptámero for para utilizarse en los métodos de tratamiento y/o composiciones farmacéuticas de la invención, comprende una vida media funcional relativamente corta, por ejemplo, una vida media funcional en humanos de aproximadamente 1 a 5 horas. En algunas modalidades, la vida media funcional en humanos es de al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas y no más que aproximadamente 5 horas. En algunas modalidades, la vida media funcional o duración del efecto es aproximadamente el mismo que la distribución de la vida media T?/2a del aptámero. En algunas modalidades, el aptámero de la invención que comprende la vida media funcional corta en humanos, es para utilizarse en métodos y composiciones para el tratamiento, alivio o prevención de enfermedades que potencialmente pueden requerir intervención quirúrgica, tales como síndrome coronario agudo. En algunas modalidades, el aptámero de este aspecto de la invención que comprende una vida media funcional corta en humanos, se conjuga a un PEG, por ejemplo, un PEG de 5, 10 ó 20 kDa. En algunas modalidades, el aptámero de este aspecto de la invención que comprende una vida media corta en humanos es ARC1779. La invención también proporciona un método de diagnóstico que comprende poner en contacto un aptámero de la invención con una composición que se sospecha que comprende un Factor de von Willebrand, un dominio Al del Factor de von Willebrand o una variante del mismo, y detectar la presencia o ausencia del Factor de von Willebrand, el dominio Al del Factor de von Willebrand o una variante del mismo. En algunas modalidades, el método de diagnóstico es para utilizarse in vitro, mientras que en otras modalidades, el método de diagnóstico es para utilizarse in vivo . La invención también proporciona un método para identificar un aptámero que bloquea una función biológica in vivo, que comprende: a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos de una sola hebra; b) poner en contacto la mezcla candidata con un objetivo de proteína de longitud completa y un dominio del objetivo de proteína de longitud completa; c) dividir los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por el objetivo de proteína de longitud completa o el dominio objetivo de la proteína; y d) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada, in vitro, para proporcionar una mezcla de aptámeros enriquecida, específica para el objetivo de la proteína . En algunas modalidades, el método de identificación comprende además; e) poner en contacto la mezcla del aptámero enriquecida, específica del objetivo con el objetivo de proteína de longitud completa; f) separar los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por el objetivo de la proteína de longitud completa; y g) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada, in vitro; para proporcionar una mezcla del aptámero enriquecida, específica del objetivo; h) poner en contacto la mezcla del aptámero enriquecida, específica del objetivo con el dominio objetivo de la proteína; i) dividir los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por el dominio objetivo de la proteína; y j ) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada, in vitro, para proporcionar una mezcla del aptámero enriquecida, específica del objetivo de la proteína . En algunas modalidades, el método de identificación comprende además seleccionar un aptámero que bloquea una función biológica del objetivo de la proteína de longitud completa in vivo, mientras que en otras modalidades, el método comprende además seleccionar un aptámero que bloquea una función biológica de un dominio objetivo de la proteína in vivo . En algunas modalidades del método de identificación de la invención, el objetivo de la proteína de longitud completa es de una primera especie y el dominio objetivo de la proteína es de una segunda especie. En modalidades adicionales del método de identificación de la invención, el método comprende además seleccionar un aptámero capaz de unirse a los objetivos de la proteína de la primera y segunda especies, de manera preferida, seleccionando un aptámero que bloquea una función biológica de la proteína objetivo en la primera y segunda especies. En algunas modalidades del método de identificación de la invención, el objetivo de la proteína objetivo de longitud completa es el Factor de von Willebrand. En algunas modalidades del método de identificación de la invención, el objetivo de la proteína objetivo de longitud completa es el Factor de von Willebrand, en donde se prefiere que el aptámero seleccionado bloquee la agregación de las plaquetas mediadas por el Factor de von Willebrand. En algunas modalidades, el dominio objetivo de la proteína es el dominio Al del Factor de von Willebrand. La invención también proporciona un aptámero identificado mediante el método de identificación de la invención. En algunas modalidades, la invención también proporciona un aptámero que se une de manera específica al Factor de von Willebrand que comprende una secuencia primaria de ácido nucleico al menos 80% idéntica, particularmente al menos 90% idéntica, y más particularmente al menos 95% idéntica a cualquiera de las secuencias primarias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En algunas modalidades, el % de identidad de la secuencia de los aptámeros de la invención es una identidad de la secuencia BLAST . En otra modalidad, el aptámero de la invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene modificaciones químicas que incluyendo las modificaciones químicas, es al menos 80% idéntica, particularmente 90% idéntica, y más particularmente al menos 95% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En aún otra modalidad, la invención proporciona un aptámero que tras unirse a un objetivo del Factor de von Willebrand, modula una función del Factor de von Willebrand, de manera preferida in vivo, y comprende una secuencia de 30 nucleótidos contiguos que son idénticos a una secuencia de 30 nucleótidos contiguos comprendida en cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En aún otra modalidad, el aptámero de la invención tras la unión a un objetivo del Factor de von Willebrand, modula una función del Factor de von Willebrand, de manera preferida in vivo, y comprende 20 nucleótidos contiguos que son idénticos a una secuencia de 20 nucleótidos contiguos en la región de la secuencia única de cualquiera de los aptámeros seleccionados del grupo de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En aún otra modalidad, el aptámero de la invención, tras la unión a un objetivo del Factor de von Willebrand, modula una función del Factor de von Willebrand, de manera preferida in vivo, y comprende 8 nucleótidos contiguos que son idénticos a una secuencia de 8 nucleótidos contiguos en la región única de la secuencia de cualquiera de los aptámeros seleccionados del grupo de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En aún otra modalidad, el aptámero de la invención, tras la unión a un objetivo del Factor de von Willebrand, modula una función del Factor de von Willebrand, de manera preferida in vivo, y comprende 4 nucleótidos contiguos que son idénticos a una secuencia de 4 nucleótidos contiguos en la región única de la secuencia de cualquiera de los aptámeros seleccionados del grupo de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARCH 15 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SÉQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en la descripción acompañante siguiente. Aunque cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a aquéllos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes de la descripción. En la especificación, las formas en singular también incluyen el plural, a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. En el caso de conflicto, la presente invención tendrá el control.

EL MÉTODO SELEX™ Un método adecuado para generar un aptámero es con el proceso titulado "Evolución Sistemática de Ligandos Mediante Enriquecimiento Exponencial" ("SELEX™") descrito generalmente en la Figura 1. El proceso SELEX™ es un método para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con una unión altamente específica a moléculas objetivo y se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, presentada en Junio 11, de 1990, ahora abandonada, la Patente de los Estados Unidos No. 5,475,096, titulada "Ligandos de Ácidos Nucleicos", y la Patente de los Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también la WO 91/19813), titulada "Ligandos de Ácidos Nucleicos". Cada ligando de ácido nucleico identificado por SELEX™, es decir, cada aptámero, es un ligando específico de un compuesto o molécula objetivo dado. El proceso SELEX™ se basa en el discernimiento único de que los ácidos nucleicos tienen suficiente capacidad para formar una variedad de estructuras de dos y tres dimensiones y suficiente versatilidad química disponible dentro de sus monómeros para actuar como ligandos (es decir, formar pares de unión específicos), con virtualmente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como objetivos. El SELEX™ se basa como el punto de inicio en una biblioteca o recolección grande de oligonucleótidos de una sola hebra que comprenden secuencias aleatorizadas. Los oligonucleótidos pueden ser ADN, ARN o híbridos de ADN/ARN modificados o no modificados. En algunos ejemplos, la recolección comprende 100% de oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios. En otros ejemplos, la recolección comprende oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios que contienen al menos una secuencia fija y/o una secuencia conservada incorporada dentro de la secuencia aleatorizada. En otros ejemplos, la recolección comprende oligonucleótidos aleatorios o parcialmente aleatorios que contienen al menos una secuencia fija y/o conservada en su extremo 5' y/o 3' que pueden comprender una secuencia compartida por todas las moléculas de la recolección de oligonucleótidos. Las secuencias fijas son secuencias comunes a los oligonucleótidos en la recolección, que se incorporan para un propósito preseleccionado, tales • como motivos CpG descritos adicionalmente a continuación, sitios de hibridación para los cebadores de la PCR, secuencias promotoras para las ARN polimerasas (por ejemplo, T3, T4, T7 y SP6) , sitios de restricción o secuencias homopoliméricas, tales como regiones poli A o poli T, núcleos catalíticos, sitios para la unión selectiva a columnas de afinidad y otras secuencias para facilitar la clonación y/o secuenciamiento de un oligonucleótido de interés. Las secuencias conservadas son secuencias diferentes a las secuencias fijas descritas previamente, compartidas por un número de aptámeros que se unen al mismo objetivo. Los oligonucleótidos de la recolección incluyen de manera preferida una porción de la secuencia aleatorizada, así como secuencias fijas necesarias para una amplificación eficiente. Típicamente, los oligonucleótidos de la recolección inicial contienen secuencias terminales 5' • y 3' fijas, que flanquean una región interna de 30-50 nucleótidos aleatorios . Los nucleótidos aleatorizados pueden producirse de varias maneras, incluyendo síntesis química y selección del tamaño de ácidos nucleicos celulares escindidos de manera aleatoria. La variación de la secuencia en los ácidos nucleicos de prueba también puede introducirse o incrementarse mediante mutagénesis antes o durante las iteraciones de selección/amplificación. La porción de la secuencia aleatoria del oligonucleótido puede ser de cualquier longitud y puede comprender ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos, y puede incluir nucleótidos o análogos de nucleótidos modificados o no naturales. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,958,691; la Patente de los Estados Unidos No. 5,660,985; la Patente de los Estados Unidos No. 5,958,691; la Patente de los Estados Unidos No. 5,698,687; la Patente de los Estados Unidos No. 5,817,635; la Patente de los Estados Unidos No. 5,672,695, y la Publicación del PCT WO 92/07065. Los oligonucleótidos aleatorios pueden sintetizarse a partir de nucleótidos enlazados a fosfodiéster utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Froehler et al, Nucí. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) y Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Los oligonucleótidos aleatorios también pueden sintetizarse utilizando métodos de fase en solución tales como métodos de síntesis de triéster. Véase, por ejemplo, Sood et al, Nucí. Acid Res. 4:2557 (1977) y Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449 (1978). Las síntesis típicas llevadas a cabo en un equipo de síntesis de ADN automatizado, proporcionaron 101-1016 moléculas individuales, un número suficiente para la mayoría de los experimentos SELEX™. Las regiones suficientemente grandes de la secuencia aleatoria en el diseño de la secuencia incrementan la probabilidad de que cada molécula sintetizada represente probablemente una secuencia única. La biblioteca de inicio de los oligonucleótidos puede generarse mediante síntesis química automática en un sintetizador de ADN. Para sintetizar secuencias aleatorizadas, mezclas de los cuatro nucleótidos se agregan a cada paso de adición del nucleótido durante el proceso de síntesis, permitiendo la incorporación aleatoria de los nucleótidos. Como se indicó anteriormente, en una modalidad, los oligonucleótidos aleatorios comprende secuencias totalmente aleatorias; sin embargo, en otras modalidades, los oligonucleótidos aleatorios pueden comprender tramos de secuencias no aleatorias o parcialmente aleatorias. Las secuencias parcialmente aleatorias pueden crearse agregando los cuatro nucleótidos en diferentes relaciones molares en cada paso de adición. La biblioteca de inicio de los oligonucleótidos puede ser de ARN o ADN, o ARN o ADN sustituido. En aquellos casos en donde se utiliza una biblioteca de ARN como la biblioteca de inicio, se genera típicamente sintetizando una biblioteca de ADN, opcionalmente, amplificando mediante PCR, a continuación transcribiendo la biblioteca de ADN in vitro utilizando la ARN polimerasa T7 o ARN polimerasa T7 modificadas, y purificando la biblioteca transcrita. La biblioteca de ARN o ADN se mezcla a continuación con el objetivo bajo condiciones favorables para la unión y se someten a iteraciones paso a paso de unión, división y amplificación, utilizando el mismo esquema de selección general, para alcanzar virtualmente cualquier criterio deseado de afinidad de unión y selectividad. De manera más específica, iniciando con una mezcla que contiene la recolección inicial de ácidos nucleicos, el método SELEX™ incluye los pasos de: (a) poner en contacto la mezcla con el objetivo bajo condiciones favorables para la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido de manera específica a las moléculas objetivo; (c) disociar los complejos de ácido nucleico-objetivo; (d) amplificar los ácidos nucleicos disociados con los complejos de ácido nucleico-objetivo. para proporcionar una mezcla enriquecida con ligando de ácidos nucleicos; y (e) volver a iterar los pasos de unión, división, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee, para proporcionar ligandos de ácido nucleico altamente específicos, de alta afinidad con la molécula objetivo. En aquellos casos en donde los aptámeros de ARN se están seleccionado, el método SELEX™ comprende además los pasos de: (i) invertir la transcripción de los ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo antes de la amplificación en el paso (d) ; y (ii) transcribir los ácidos nucleicos amplificados del paso (d) antes de reiniciar el proceso. Dentro de una mezcla de ácidos nucleicos que contiene un gran número de posibles secuencias y estructuras, existe una amplia gama de afinidades de unión para un objetivo dado. Una mezcla de ácido nucleico que comprende, por ejemplo, un segmento aleatorizado de 20 nucleótidos puede tener 420 posibilidades candidatas. Aquéllos que tienen la afinidad más alta (constantes de disociación más bajas) para el objetivo, se unen más probablemente al objetivo. Después de la división, disociación y amplificación, se genera una segunda mezcla de ácidos nucleicos, enriquecida con los candidatos con la afinidad de unión más alta. Las rondas adicionales de selección favorecen progresivamente los mejores ligandos hasta que la mezcla de ácidos nucleicos resultantes está compuesta de manera predominante de únicamente una o unas cuantas secuencias. Estas pueden clonarse, secuenciarse y probarse de manera individual para la afinidad de unión como ligandos puros o aptámeros. Los ciclos de selección y de amplificación se repiten hasta que se logra un objetivo deseado. En el caso más general, la selección/amplificación se continúa hasta que no se logran mejoras significativas en la fuerza de unión con la repetición del ciclo. El método se utiliza típicamente para tomar muestras de aproximadamente 1014 especies diferentes de ácidos nucleicos, pero puede utilizarse para tomar muestras de tantas como aproximadamente 1018 especies diferentes de ácidos nucleicos. Generalmente, las moléculas de aptámero de ácido nucleico se seleccionan en un procedimiento de 5 a 20 ciclos. En una modalidad, la heterogeneidad se introduce únicamente en las etapas de la selección inicial y no ocurre a través del proceso de replicación. En una modalidad del SELEX™, el proceso de selección es tan eficiente para aislar esos ligandos de ácido nucleico que se unen más fuertemente al objetivo seleccionado, que únicamente un ciclo de selección y amplificación se requiere. Tal selección eficiente puede ocurrir, por ejemplo, en un proceso del tipo cromatográfico, en donde la capacidad de los ácidos nucleicos para asociarse con los objetivos unidos a una columna, opera de tal manera que la columna es suficientemente capaz de permitir la separación y aislamiento de los ligandos de ácidos nucleicos con afinidad más alta. En muchos casos, no es necesariamente deseable realizar los pasos iterativos del SELEX™ hasta que un solo ligando de ácido nucleico se identifica. La solución de ligando de ácido nucleico específica del objetivo puede incluir una familia de estructuras o motivos de ácidos nucleicos que tienen varias secuencias conservadas y varias secuencias que pueden sustituirse o agregarse sin afectar de manera significativa la afinidad de los ligandos de ácido nucleico al objetivo. Al terminar el proceso SELEX™ antes de completarse, es posible determinar la secuencia de varios miembros de la familia de la solución del ligando de ácido nucleico . Se sabe que existe una variedad de estructuras primarias, secundarias y terciarias de ácido nucleico. Las estructuras o motivos que han mostrado estar involucradas más comúnmente en interacciones del tipo que no son Watson-Crick, se refieren como espiras de horquilla, protuberancias simétricas y asimétricas, pseudonudos y miles de combinaciones de los mismos. La mayoría de todos los casos conocidos de tales motivos, sugieren que pueden formarse en una secuencia de ácidos nucleicos de no más de 30 nucleótidos. Por esta razón, con frecuencia se prefiere que los procedimientos SELEX™ con segmentos aleatorizados inicien con secuencias de ácidos nucleicos que contienen un segmento aleatorizado de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos, y de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nucleótidos en algunas modalidades. En un ejemplo, la secuencia 5' -fija : aleatoria : 3' -fija comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nucleótidos. El método SELEX™ central, se ha modificado para lograr un número de objetivos específicos. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,707,796, describe el uso del SELEX™ en conjunto con la electroforesis en gel para seleccionar las moléculas de ácidos nucleicos con características estructurales específicas, tales como ADN flexionado. La Patente de los Estados Unidos No. 5,763,177, describe métodos basados en SELEX™ para seleccionar ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotorreactivos capaces de unirse y/o fotorreticularse a, y/o fotoinactivar una molécula objetivo. La Patente de los Estados Unidos No. 5,567,588 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,861,254, describen métodos basados en SELEX™ que logran una división altamente eficiente entre los oligonucleótidos que tienen alta y baja afinidad para una molécula objetivo. La Patente de los Estados Unidos No. 5,496,938, describe métodos para obtener ligandos mejorados de ácidos nucleicos después de que se ha realizado el proceso SELEX™. La Patente de los Estados Unidos No. 5,705,337, describe métodos para enlazar de manera covalente un ligando a su objetivo. El SELEX™ también puede utilizarse para obtener ligandos de ácidos nucleicos para unirse a más de un sitio en la molécula objetivo, y para obtener ligandos de ácido nucleico que incluyen especies que no son de ácidos nucleico que se unen a sitios específicos en el objetivo. El SELEX™ proporciona medios para aislar e identificar los ligandos de ácido nucleico que se unen a cualquier objetivo considerable, incluyendo biomoléculas grandes y pequeñas tales como proteínas que se unen a ácidos nucleicos y proteínas que no se sabe si se unen a ácidos nucleicos, como parte de su función biológica, así como cofactores y otras moléculas pequeñas. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,737, describe secuencias de ácido nucleico identificadas a través de SELEX™, que son capaces de unirse con alta afinidad a la cafeína y a su análogo estrechamente relacionados, teofilina. El contra-SELEX™ es un método para mejorar la especificidad de los ligandos de ácido nucleico a una molécula objetivo, eliminando las secuencias del ligando de ácido nucleico con reactividad cruzada a una o más moléculas no objetivo. El contra-SELEX™ está comprendido de los pasos de: (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos; (b) poner en contacto la mezcla candidata con el objetivo, en donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada para el objetivo con relación a la mezcla candidata pueden dividirse del resto de la mezcla candidata; (c) dividir los ácidos nucleicos de afinidad incrementada del resto de la mezcla candidata; (d) disociar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada del objetivo; (e) poner en contacto los ácidos nucleicos de afinidad incrementada con una o más moléculas que no son objetivo, de manera que los ligandos de ácido nucleico con afinidad específica por la molécula que no es objetivo se eliminan; y (f) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad específica únicamente para la molécula objetivo, para proporcionar una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos para las secuencias de ácido nucleico con una afinidad y especificidad relativamente más alta para unirse a la molécula objetivo. Como se describió anteriormente, los ciclos SELEX™ de selección y amplificación se repiten conforme sea necesario hasta que se logra un objetivo deseado. Un problema potencial encontrado en el uso de los ácidos nucleicos como agentes terapéuticos y vacunas, es que los oligonucleótidos en su forma de fosfodiéster pueden degradarse rápidamente en los fluidos corporales mediante las enzimas intracelulares y extracelulares, tales como las endonucleasas y exonucleasas, antes de que se manifieste el efecto deseado. El método SELEX™ abarca así la identificación de ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como estabilidad in vivo mejorada o características de suministro mejoradas. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones del azúcar y/o el fosfato y/o la base. Los ligandos de ácido nucleico identificados con SELEX™ contienen nucleótidos modificados como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,660,985, que describe oligonucleótidos que contienen derivados nucleotídicos modificados químicamente en la posición 2' de ribosa, la posición 5 de las pirimidinas, y la posición 8 de las purinas, la Patente de los Estados Unidos No. 5,756,703, que describe oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas modificadas en 2', y la Patente de los Estados Unidos No. 5,580,737, que describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con sustituyentes 2 '-amino (2'-NH2), 2 '-fluoro (2'-F), y/o 2 '-OMe. Las modificaciones de los ligandos de ácido nucleico contempladas en esta invención, incluyen, de manera no exclusiva, aquéllas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando del ácido nucleico como un todo. Las modificaciones para generar poblaciones de oligonucleótidos que son resistentes a las nucleasas pueden también incluir uno o más enlaces internucleótidos sustitutos, azúcares alteradas, bases alteradas o combinaciones de los mismos. Tales modificaciones incluyen, de manera no exclusiva, modificaciones del azúcar en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo, modificaciones de la cadena principal, modificaciones de fosforotioato o fosfato de alquilo, metilaciones, y combinaciones de apareamiento de bases inusuales, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones 3' y 5' , tales como coronación.

En una modalidad, se proporcionan oligonucleótidos en los cuales el grupo P(0)0 se reemplaza por P (0) S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , P(0)NR2 ("amidato") , P(0)R, P(0)0R', CO o CH2 ("formacetal") o 3'-amina (-NH-CH2-CH2-) , en donde cada R o R' es de manera independiente H o alquilo sustituido o no sustituido. Los grupos de enlace pueden unirse a los nucleótidos adyacentes a través de un enlace -0-, -N- o -S-. No se requiere que todos los enlaces en el oligonucleótido sean idénticos. Como se utiliza en la presente, el término fosforotioato abarca uno o más átomos de oxígeno que no son de puente en un enlace fosfodiéster reemplazado por uno o más átomos de azufre. En modalidades adicionales, los oligonucleótidos comprenden grupos de azúcar modificados, por ejemplo, uno o más de los grupos hidroxilo se reemplaza con halógeno, grupos alifáticos o funcionalizados como éteres o aminas. En una modalidad, la posición 2' del residuo de furanosa se sustituye por cualquiera de un grupo O-metilo, O-alquilo, 0-alilo, S-alquilo, S-alilo o halo. Los métodos de síntesis de los azúcares modificados en 2' se describen, por ejemplo, en Sproat, et al., Nucí. Acid Res. 19:733-738 (1991); Gotten, et al, Nucí. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); y Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145 (1973). Otras modificaciones son conocidas por alguien con experiencia en la técnica. Tales modificaciones pueden ser las modificaciones de proceso pre-SELEX™ o las modificaciones del proceso post-SELEX™ (modificación de ligandos no modificados identificados previamente) , o pueden hacerse mediante la incorporación en el proceso SELEX™. Las modificaciones del proceso pre-SELEX™ o aquéllas hechas mediante la incorporación en el proceso SELEX, proporcionan ligandos de ácidos nucleicos con especificidad para su objetivo SELEX™ y estabilidad mejorada, por ejemplo, estabilidad in vivo . Las modificaciones del proceso post-SELEX™ hechas a ligandos de ácidos nucleicos pueden resultar en estabilidad mejorada, por ejemplo, en la estabilidad in vivo sin afectar de manera adversa la capacidad de unión del ligando del ácido nucleico . El método SELEX™ abarca combinar los oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son de oligonucleótidos, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,637,459 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,683,867. El método SELEX™ abarca además combinar los ligandos de ácido nucleico seleccionados con compuestos de alto peso molecular lipofílicos o no inmunogénicos en un complejo de diagnóstico o terapéutico, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,011,020, la Patente de los Estados Unidos No. 6,051,698, y la Publicación del PCT No. WO 98/18480. Estas patentes y solicitudes enseñan la combinación de un amplio arreglo de formas y otras propiedades, con propiedades de amplificación y replicación eficientes de los oligonucleótidos, y con las propiedades deseables de otras moléculas . La identificación de los ligandos de ácidos nucleicos a péptidos pequeños, flexibles, vía el método SELEX™ también se ha explorado. Los péptidos pequeños tienen estructuras flexibles y usualmente existen en solución en un equilibrio de confórmeros múltiples, y por lo tanto, se pensó inicialmente que las afinidades de unión pueden limitarse por la pérdida de entropía conformacional tras la unión a un péptido flexible. Sin embargo, la factibilidad de identificar ligandos de ácido nucleico con péptidos pequeños en solución, se demostró en la Patente de los Estados Unidos No. 5,648,214, en la cual se identificaron ligandos de ácidos nucleicos de ARN de alta afinidad para la sustancia P, un péptido de 11 aminoácidos. Los aptámeros con especificidad y afinidad de unión a los objetivos de la presente invención, se seleccionan típicamente por el proceso SELEX™ como se describe en la presente. Como parte del proceso SELEX™, las secuencias seleccionadas para unirse al objetivo son reducidas al mínimo opcionalmente entonces, para determinar la secuencia mínima que tiene la afinidad de unión deseada. Las secuencias del aptámero seleccionadas y/o las secuencias del aptámero reducidas al mínimo, se optimizan opcionalmente realizando mutagénesis aleatoria o dirigida de la secuencia, para incrementar la afinidad de unión o de manera alterna, para determinar cuáles posiciones en la secuencia son esenciales para la actividad de unión. Por ejemplo, pueden utilizarse "reselecciones con adyuvantes" para explorar los requisitos de la secuencia dentro de un aptámero. Durante la reselección con adyuvante, las selecciones se llevan a cabo con una recolección sintética, degenerada, que se ha diseñado basándose en una sola secuencia. El nivel de degeneración usualmente varía del 70% al 85% de nucleótidos del tipo silvestre. En general, las mutaciones neutrales se observan después de la reselección con adyuvantes, pero en algunos casos, pueden resultar cambios de la secuencia en las mejoras en la afinidad. Además, las selecciones pueden realizarse con secuencias que incorporan secuencias modificadas para estabilizar las moléculas de aptámero contra la degradación in vivo .

SELEX™ MODIFICADO EN LA POSICIÓN 2 ' Con el fin de que un aptámero sea adecuado, para utilizarse como un agente terapéutico, es de manera preferida barato de sintetizar, seguro y estable in vivo .

Los aptámeros de ARN y de ADN del tipo silvestre son típicamente no estables in vivo debido a su susceptibilidad la degradación por las nucleasas . La resistencia a la degradación por las nucleasas puede incrementarse en gran medida, si se desea, mediante la incorporación de grupos modificantes en la posición 2X Los grupos 2 '-fluoro y 2 '-amino se han incorporado exitosamente en bibliotecas de oligonucleótidos de las cuales los aptámeros se han seleccionado posteriormente. Sin embargo, estas modificaciones incrementan el gran medida el costo de síntesis del aptámero resultante, y pueden introducir preocupaciones para la seguridad en algunos casos, debido a la posibilidad de que los nucleótidos modificados puedan reciclarse en un ADN hospedero mediante la degradación de los oligonucleótidos modificados y el uso posterior de los nucleótidos como sustratos para la síntesis del ADN. Los aptámeros que contienen nucleótidos 2'-0- etilo ("2'-OMe"), como se proporciona en algunas modalidades de la presente, superan muchas de estas desventajas. Los oligonucleótidos que contienen los nucleótidos 2' -OMe son resistentes a la nucleasa y baratos de sintetizar. Aunque los nucleótidos 2' -OMe son ubicuos en los sistemas biológicos, las polimerasas naturales no aceptan los 2 '-OMe NTP como sustratos bajo condiciones fisiológicas, por lo tanto, no hay preocupaciones de la seguridad con respecto al reciclado de los nucleótidos 2'-OMe en el ADN hospedero. Los métodos SELEX™ utilizados para generar los aptámeros modificados en la posición 2' se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/430,761, presentada en Diciembre 3, del 2002, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/487,474, presentada en Julio 15, del 2003, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/517,039, presentada en Noviembre 4, del 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/729,581, presentada en Diciembre 3, del 2003, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/873,856, presentada en Junio 21, del 2004, titulada "Método para la Selección in vitro de Ácidos Nucleicos Sustituidos con 2' -OMe", y la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de Serie 60/696,295, presentada en Junio 30, del 2005, titulada "Materiales y Métodos Mejorados para la Generación de Transcriptos de Ácidos Nucleicos que contiene una Modificación Completa en 2 ' " , cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. La presente invención incluye aptámeros que se unen a, y modulan la función del Factor de von Willebrand, que contienen nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos que tienen una modificación en la posición 2'), para hacer al oligonucleótido más estable que el oligonucleótido no modificado a la degradación enzimática y química, así como a la degradación térmica y física. Aunque hay varios ejemplos de aptámeros que contienen 2 '-OMe en la literatura (véase, por ejemplo, Ruckman et al., J. Biol. Chem, 1998, 273, 20556-20567-695), éstos se generaron mediante la selección in vitro de bibliotecas de transcriptos modificados, en los cuales los residuos C y U estaban modificados con 2' -fluoro (2'-F) y los residuos A y G eran 2 '-OH. Una vez que las secuencias funcionales se identificaron, entonces cada residuo A y G se probó para la tolerancia a la sustitución con 2' -OMe, y el aptámero se sintetizó nuevamente teniendo todos los residuos A y G que toleraron la sustitución con 2' -OMe como residuos de 2' -OMe. La mayoría de los residuos A y G de los aptámeros generados de esta manera en dos pasos, toleró la sustitución con los residuos 2 '-OMe, aunque en promedio, aproximadamente 20% no. En consecuencia, los aptámeros generados utilizando este método tienden a contener de dos a cuatro residuos de 2' -OH, y la estabilidad y costo de síntesis están comprometidos como resultado. Mediante la incorporación de nucleótidos modificados en la reacción de transcripción que genera oligonucleótidos estabilizados utilizados en las bibliotecas de oligonucleótidos de las cuales se seleccionan, los aptámeros y enriquecidos mediante SELEX™ (y/o cualquiera de sus variaciones y mejoras, incluyendo aquéllas descritas en la presente) , los métodos de la presente invención eliminan la necesidad de estabilizar los oligonucleótidos" del aptámero seleccionado (por ejemplo, resintetizando los oligonucleótidos del aptámero con nucleótidos modificados) . En una modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden las combinaciones de modificaciones de 2'-0H, 2'-F, 2'-desoxi y 2'-0Me de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y UTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden combinaciones de modificaciones 2' -OH, 2'-F, 2'-desoxi, 2' -OMe, 2'-NH2, y 2' -metoxietilo de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y UTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona aptámeros que comprenden 56 combinaciones de modificaciones de 2' -OH, 2'-F, T-desoxi, 2' -OMe, 2'-NH2 y 2' -metoxietilo de los nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP y UTP. Los aptámeros modificados en la posición 2' de algunas modalidades de la invención son creados utilizando polimerasas modificadas, por ejemplo, una polimerasa T7 modificada, que tiene una velocidad de incorporación de los nucleótidos modificados que tienen sustituyentes voluminosos en la posición 2' de la furanosa, que es más alta que aquélla de las polimerasas del tipo silvestre. Por ejemplo, una sola polimerasa T7 mutante (Y639F) , en la cual el residuo de tirosina en la posición 639 se ha cambiado a fenilalanina, utiliza fácilmente los trifosfatos " del nucleótido (NTP) de 2'desoxi, 2' amino- y 2' fluoro, como sustratos y se ha utilizado ampliamente para sintetizar ARN modificados para una variedad de aplicaciones. Sin embargo, se dice que esta polimerasa mutante T7 no puede utilizar fácilmente (es decir, incorporar) los NTP con sustituyentes voluminosos en la posición 2', tales como sustituyentes 2'-OMe o 2' -azido (2'-N3) . Para la incorporación de sustituyentes voluminosos en la posición 2', un mutante de polimerasa T7 doble (Y639F/H784A) , que tiene la histidina en la posición 784 cambiada a un residuo de alanina además de la mutación Y639F, se ha descrito y se ha utilizado en circunstancias limitadas para incorporar pirimidin NTP modificados. Véase, Padilla, R. y Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24) :138. Una polimerasa de ARN T7 mutante Y639F/H784A/K378R se ha utilizado en circunstancias limitadas para incorporar purin y pirimidin NTP modificados, por ejemplo, 2' -OMe NTP, pero requieren un pico de 2' -OH GTP para la transcripción. Véase, Burmeister et . al., Chemistry and Biology, 2005, 12:25-33. Una polimerasa T7 mutante única (H784A) , que tiene la histidina en la posición 784 cambiada a un residuo de alanina, también se ha descrito. Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30:138. En ambas de las polimerasas T7 mutantes dobles Y639F/H784A y mutante única H784A, el cambio a un residuo de aminoácido más pequeño tal como alanina, permite la incorporación de sustratos nucleotídicos más voluminosos, por ejemplo, nucleótidos sustituidos con 2'-0 metilo. Véase, Chelliserry, K. y Ellington, A. D., Nature Biotech, 2004, 9:1155-60. Una ARN polimerasa T7 adicional se ha descrito con mutaciones en el sitio activo de la ARN polimerasa T7 que incorpora más fácilmente los sustratos modificados voluminosos en la posición 2', por ejemplo, una ARN polimerasa mutante T7 única, que tiene el residuo de tirosina en la posición 639 cambiada a una leucina (Y639L) . Sin embargo, la actividad se sacrifica con frecuencia para una especificidad incrementada del sustrato conferida por tales mutaciones, conduciendo a bajos rendimientos del transcripto. Véase, Padilla R y Sousa, R. , Nucleic Acids Res., 1999, 27 (6) :1561. Generalmente, se ha encontrado que bajo las condiciones descritas en la presente, el mutante único Y693F puede utilizarse para la incorporación de todos los NTP sustituidos con 2' -OMe, excepto GTP y las ARN polimerasas T7 mutantes Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A y Y639L/H784A/K378R, pueden utilizarse para la incorporación de todos los NTP sustituidos con 2 '-OMe, incluyendo GTP. Se espera que el mutante único H784A, posea propiedades similares a los mutantes Y639F y Y639F/H784A, cuando se utilizan bajo las condiciones descritas en la presente. Los oligonucleótidos modificados en la posición 2' pueden sintetizarse enteramente de nucleótidos modificados, o con un subconjunto de nucleótidos modificados. Todos los nucleótidos pueden modificarse, y todos pueden contener la misma modificación. Todos los nucleótidos pueden modificarse, pero contener diferentes modificaciones, por ejemplo, todos los nucleótidos que contienen la misma base, pueden tener un tipo de modificación, mientras que los nucleótidos que contienen otras bases, pueden tener diferentes tipos de modificaciones. Todos los nucleótidos de purina pueden tener un tipo de modificación (o estar no modificados), mientras que todos los nucleótidos de pirimidina tienen otro tipo diferente de modificación (o no están modificados). De esta manera, se generan transcriptos o bibliotecas de transcriptos utilizando cualquier combinación de modificaciones, incluyendo por ejemplo, ribonucleótidos (2'-OH), desoxirribonucleótidos (2'-desoxi), 2'-F, y nucleótidos 2 '-OMe. Una mezcla de transcripción que contiene C y U 2 '-OMe y A y G 2' -OH, se refiere como una mezcla "rRmY" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros "rRmY". Una mezcla de transcripción que contiene A y G desoxi y U y C 2 '-OMe se refiere como una mezcla "dRmY" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros "dRmY" . . Una mezcla de transcripción que contiene A, C y U 2 '-OMe y G 2'-OH, se refiere como una mezcla "rGmH" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como los aptámeros "rGmH". Una mezcla de transcripción que contiene de manera alterna A, C, U y G 2' -OMe y A, U y C 2' -OMe A y G 2'-F, se refiere como una "mezcla alternante", y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros de la "mezcla alternante". Una mezcla de transcripción que contiene A, U, C 2' -OMe, en donde hasta 10% de las G son ribonucleótidos, se refiere como una mezcla "r/mGmH" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros X/mGmH". Una mezcla de transcripción que contiene A, U y C 2 '-OMe y G 2'-F, se refiere como una mezcla "fGmH" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "fGmH". Una mezcla de transcripción que contiene A, U y C 2' -OMe y G desoxi, se refiere como una mezcla "dGmH", y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "dGmH". Una mezcla de transcripción que contiene A desoxi y C, G y u 2' -OMe, se refiere como una mezcla "d.AmB", y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "d.AmB", y una mezcla de transcripción que contiene todos los nucleótidos 2 '-OH se refiere como una mezcla "rN" y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "rN", "rRrY" o "ARN".

Una mezcla de transcripción que contiene 2 '-0H adenosin trifosfato y guanosin trifosfato y desoxi citidin trifosfato y timidin trifosfato, se refiere como una mezcla rRdY y los aptámeros seleccionados de la misma se refieren como aptámeros "rRdY". Un aptámero "mRmY" es uno que contiene únicamente nucleótidos 2' -OMe, excepto por el nucleótido inicial que es 2 '-hidroxi. Una modalidad preferida incluye cualquier combinación de nucleótidos 2' -OH, 2' -desoxi y 2 '-OMe. Otra modalidad incluye cualquier combinación de nucleótidos 2'-desoxi y 2 '-OMe. Aún otra modalidad incluye cualquier combinación de nucleótidos 2' -desoxi y 2' -OMe, en los cuales las pirimidinas son 2' -OMe (tales como dRmY, mRmY o dGmH) . La incorporación de los nucleótidos modificados en los aptámeros de la invención puede lograrse antes (pre) el proceso de selección (por ejemplo, una modificación del proceso pre-SELEX™) . Opcionalmente, los aptámeros de la invención en los cuales los nucleótidos modificados se ha incorporado mediante la modificación del proceso pre-SELEX™, pueden modificarse además mediante un proceso de modificación post-SELEX™ (es decir, una modificación del proceso post-SELEX™ después de una modificación pre-SELEX™) . Las modificaciones del proceso pre-SELEX™ proporcionan ligandos de ácidos nucleicos modificados con especificidad para el objetivo SELEX™ y también estabilidad in vivo mejorada. Las modificaciones del proceso post-SELEX™, es decir, modificaciones (por ejemplo, truncamiento, supresión, sustitución o modificaciones adicionales del nucleótido de ligandos identificados previamente que tienen nucleótidos incorporados mediante la modificación del proceso pre-SELEX™) , puede resultar en una mejora adicional de la estabilidad in vivo, sin afectar de manera adversa la capacidad de unión del ligando de ácido nucleico que tiene nucleótidos incorporados mediante la modificación del proceso pre-SELEX™. Para generar recolecciones de transcriptos de ARN modificados en la posición 2' (por ejemplo, 2' -OMe) en condiciones bajo las cuales una polimerasa acepta NTP modificados en la posición 2' , pueden utilizarse Y693F, Y693F/ K378R, Y693F/H784A, Y693F/H784A/K378R, Y693L/H784A, Y693L/H784A/K378R Y639L, o las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/K378R. Una polimerasa preferida es la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A. Otra polimerasa preferida es la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R. Otras ARN polimerasas T7, particularmente aquéllas que exhiben una alta tolerancia para sustituyentes 2' voluminosos, también pueden utilizarse en la presente invención. Cuando se utiliza en una polimerización dirigida a la plantilla utilizando las condiciones descritas en la presente, la ARN polimerasa T7 mutante Y639L/H784A o la Y639L/H784A/K378R, pueden utilizarse para la incorporación de todos los 2' -OMe NTP, incluyendo GTP, con rendimientos del transcripto más altos que los que se logran utilizando las ARN polimerasas T7 mutantes Y639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L o la Y639L/K378R. Las ARN polimerasas T7 mutantes Y639L/H784A y Y639L/H784A/K378R pueden utilizarse con, pero no requieren 2' -OH GTP para alcanzar altos rendimientos de oligonucleótidos modificados en la posición 2', por ejemplo, que contienen 2'-OMe. Se han determinado varios factores que son importantes para las condiciones de transcripción útiles en los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, los incrementos en los rendimientos del transcripto modificado se observan cuando una secuencia líder se incorpora en el extremo 5' de la plantilla de transcripción del ADN. La secuencia líder es típicamente de 6-15 nucleótidos de longitud, y puede estar compuesta de purinas, una mezcla de nucleótidos de purina y pirimidina. La transcripción puede dividirse en dos fases : la primera fase es el inicio, durante el cual un NTP se agrega al extremo 3' -hidroxilo de GTP (u otra guanosina sustituida) , para proporcionar un dinucleótido que es a continuación extendido por aproximadamente 10-12 nucleótidos; la segunda fase es el alargamiento, durante el cual la transcripción procede más allá de la adición de los primeros aproximadamente 10-12 nucleótidos. Se ha encontrado que pequeñas cantidades de 2 '-OH GTP agregados a la mezcla de transcripción que contienen un exceso de 2 '-OMe GTP, son suficientes para permitir que la polimerasa inicie la transcripción utilizando 2' -OH GTP, pero una vez que la transcripción entra a la fase de alargamiento, la discriminación reducida entre 2 '-OMe y 2 '-OH GTP, y el exceso de 2 '-OMe GTP con respecto a 2 '-OH GTP, permite la incorporación de principalmente 2 '-OMe GTP. Otro factor importante en la incorporación de nucleótidos sustituidos con 2' -OMe en transcriptos en el uso de magnesio y manganeso divalentes en la mezcla de transcripción. Se ha encontrado que diferentes combinaciones de concentraciones de cloruro de magnesio y cloruro de manganeso afectan los rendimientos de los transcriptos 2' -O-metilados, la concentración óptima del cloruro de magnesio y manganeso es dependiente de la concentración en la mezcla de reacción de la transcripción de NTP, que compleja los iones metálicos divalentes. , Para obtener los rendimientos más grandes de los transcriptos 2 ' -O-metilados al máximo (es decir, todos de A, C y U 2' -OMe y aproximadamente 90% de nucleótidos G) , se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de manganeso 5 mM y cloruro de manganeso 1.5 mM cuando cada NTP está presente a una concentración de 0.5 mM. Cuando la concentración de cada NTP es de 1.0 mM, se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de magnesio 6.5 M y cloruro de manganeso 2.0 mM. Cuando la concentración de cada NTP es 2.0 mM, se prefieren concentraciones de aproximadamente cloruro de magnesio 9.5 mM y cloruro de manganeso 3.0 M. En cualquier caso, las separaciones de estas concentraciones hasta dos veces, siguen proporcionando cantidades significativas de los transcriptos modificados. La transcripción con cebador con GMP o guanosina, u otro no trifosfato no de 2 '-OMe también es importante. Este efecto resulta de la especificidad de la polimerasa para el nucleótido de inicio. Como resultado, el nucleótido 5' -terminal de cualquier transcripto generado en esta manera, es probablemente 2 '-OH G. La concentración preferida de GMP (o guanosina), es de 0.5 mM y aún de manera más preferida 1 mM. También se ha encontrado que la inclusión de PEG, de manera preferida PEG-8000, en la reacción de transcripción es útil para maximizar la incorporación de los nucleótidos modificados . Para la máxima incorporación de 2' -OMe ATP (100%), UTP (100%), CTP (100%) y GTP (-90%) ("r/mGmH") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen), Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 5 mM ( 6.5 mM en donde la concentración de cada 2' -OMe NTP es 1.0 M) , MnCl2 1.5 mM (2.0 mM en donde la concentración de cada 2 '-OMe NTP es 1.0 mM) , 2 '-OMe NTP (cada uno) 500 µM (de manera más preferida, 1.0 mM) , 2 '-OH GTP 30 µM, 2' -OH GMP 500 µM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639F/H784A 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder toda de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Como se utiliza en la presente, una unidad de la ARN polimerasa T7 mutante Y639F/H784A (o cualquier otra ARN polimerasa T7 mutante especificada en la presente) , se define como la cantidad de enzima requerida para incorporar 1 nmol de 2 '-OMe NTP en los transcriptos bajo las condiciones r/mGmH. Como se utiliza en la presente, una unidad de pirofosfatasa inorgánica se define como la cantidad de enzimas que libera 1.0 mol de ortofosfato inorgánico por minuto a pH 7.2 y 25°C. Para una incorporación máxima (100%) de 2 '-OMe ATP, UTP y CTP ("rGmH") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen) , Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 5 M (9.5 mM en donde la concentración de cada 2 '-OMe NTP es 2.0 mM) , MnCl2 1.5 mM (3.0 mM en donde la concentración de cada 2 '-OMe NTP es 2.0 mM) , 2' -OMe NTP (cada uno) 500 µM (de manera más preferida, 2.0 mM) , pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639F 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder toda de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para la máxima incorporación de 2'-0Me ATP (100%), 2'-OMe UTP (100%), 2'-OMe CTP (100%) y 2'-0Me GTP (100%) "mRmY") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen) , Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, 2'-OMe NTP (cada uno) 1.5 mM, 2 '-OH GMP 1 mM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 mutante Y639L/H784A/K378R 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder que incrementa el rendimiento de transcripción bajo las condiciones de transcripción derivadas. En una modalidad, la secuencia líder es una secuencia líder toda de purina. En otra modalidad, la secuencia líder es una mezcla de purinas y pirimidinas. Como se utiliza en la presente, una unidad de pirofosfatasa inorgánica se define como la cantidad de enzima que liberará 1.0 moles de ortofosfato inorgánico por minuto a pH 7.2 y 25°C. Para una incorporación máxima (100%) de 2 '-OMe UTP y CTP ("rRmY") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen) , Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 5 mM (9.5 mM en donde la concentración de cada 2 '-OMe NTP es 2.0 mM) , MnCl2 1.5 mM (3.0 mM en donde la concentración de cada 2 '-OMe NTP es 2.0 mM) , 2' -OMe NTP (cada uno) 500 µM (de manera más preferida, 2.0 mM) , pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639F/H784A 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder toda de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una incorporación máxima (100%) de desoxí ATP y GTP y 2 '-OMe UTP y CTP ("dRmY") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen), Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 9.5 mM, MnCl2 3.0 mM, 2 '-OMe NTP (cada uno) 2.0 mM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639F 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder toda de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una incorporación máxima (100%) de 2' -OMe ATP, UTP y 2'-F CTP y GTP ("fGmH") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 M, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 ala 10% (peso/volumen), Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 9.5 mM, MnCl2 3.0 mM, 2' -OMe NTP (cada uno) 2.0 mM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639F 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder toda de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para una incorporación máxima (100%) de desoxi ATP y UTP, 2' -OMe GTP y CTP ("dAmB") en los transcriptos, se prefieren las siguientes condiciones: amortiguador HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 al 10% (peso/volumen), Tritón X-100 al 0.01% (peso/volumen), MgCl2 9.5 mM, MnCl2 3.0 mM, 2' -OMe NTP (cada uno) 2.0 mM, pH 7.5, ARN Polimerasa T7 Y639F 200 nM, pirofosfatasa inorgánica 5 unidades/ml, y una secuencia líder toda de purina de al menos 8 nucleótidos de longitud. Para cada uno de lo anterior, (a) la transcripción se realiza de manera preferida a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50 °C, de manera preferida de aproximadamente 30°C a 45°C, y de manera más preferida a aproximadamente 37 °C durante un periodo de al menos dos horas y (b) se utiliza 50-300 nM de una plantilla de transcripción del ADN de doble hebra (la plantilla de 200 nM se utiliza en la ronda 1 para incrementar la diversidad (la plantilla de 300 nM se utiliza en las transcripciones de dRmY) ) , y para las rondas posteriores, se utilizan aproximadamente 50 nM, una dilución 1/10 de una reacción de PCR optimizada, utilizando las condiciones descritas en al presente) . Las plantillas de transcripción del ADN preferidas se describen a continuación (en donde ARC254 y ARC256 se transcriben bajo condiciones de todo 2' -OMe y ARC255 se transcribe bajo condiciones de rRmY) .

SEQ ID NO: 1 S'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCMMtWp^^ GTGAGTCGTATTA-3* SEQ ID NO : 2 5^CATGCATCGCGACTGACTAGCCG ^lN>MNNNN^ TGAGTCGTATTA-3' SEQ ID NO 3 : 5».CATCGATCGATCGATCGACAsCO l^lNNN^lNN NNNN^ TGAGTCGTAGGA-3' Bajo las condiciones de transcripción rN de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2 '-0H adenosin trifosfatos (ATP), 2 '-0H guanosin trifosfatos (GTP), 2' -OH citidin trifosfatos (CTP), y 2' -OH uridin trifosfatos (UTP) . Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción rN de la presente invención, comprenden sustancialmente todos de 2'-OH adenosina, 2 '-0H guanosina, 2 '-OH citidina y 2 '-OH uridina. En una modalidad preferida de transcripción rN, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -OH adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2' -OH citidina, y al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2' -OH uridina. En una modalidad más preferida de transcripción rN, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia en donde al menos 90% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -OH adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2' -OH citidina, y al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2 '-OH uridina. En una modalidad más preferida de transcripción rN, los oligonucleótidos modificados de la presente invención comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -OH adenosina, 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2' -OH citidina, y 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2 '-OH uridina. Bajo las condiciones de transcripción rRmY de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2 '-OH adenosin trifosfatos, 2 '-OH guanosin trifosfatos, 2' -OMe citidin trifosfatos y 2' -OMe uridin trifosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción rRmY de la presente invención comprenden sustancialmente todos de 2'-OH adenosina, 2 '-OH guanosina, 2 '-OMe citidina y 2 '-OMe uridina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2 '-OH adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2 '-0H guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2' -OMe citidina y al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2' -OMe uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 90% de todos los nucleótidos de adenosina son 2 '-OH adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2 '-OMe citidina y al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2' -OMe uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -OH adenosina, 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2 '-OMe citidina y 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2 '-OMe uridina. Bajo las condiciones de transcripción dRmY de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2 ' -desoxi adenosin trifosfatos, 2 ' -desoxi guanosin trifosfatos, 2'-0-metil citidin trisfosfatos y 2'-0-metil uridin trisfosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción dRmY de la presente invención, comprenden sustancialmente todos de 2' -desoxi adenosina, 2' -desoxi guanosina, 2'-0-metil citidina y 2'-0-metil uridina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia, en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2 '-desoxi adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-desoxi guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, y al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia en donde al menos 90% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -desoxi adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -desoxi guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, y al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2 ' -O- metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2 '-desoxi adenosina, 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2 '-desoxi guanosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-O-metil citidina, y 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina. Bajo las condiciones de transcripción rGmH de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2 '-OH guanosin trifosfatos, 2'-0-metil citidin trisfosfatos, 2'-0-metil uridin trisfosfatos, y 2'-0-metil adenosin trisfosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción rGmH de la presente invención comprenden sustancialmente todos de 2 '-0H guanosina, 2'-0-metil citidina, 2'-0-metil uridina, y 2'-0-metil adenosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, y al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 90% de todo.s los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, y al menos 90% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2 '-OH guanosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, y 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina.

Bajo las condiciones de transcripción r/mGmH de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2'-0-metil adenosin trifosfato, 2'-0-metil citidin trifosfato, 2'-0-metil guanosin trifosfato, 2'-0-metil uridin trifosfato y 2' -OH guanosin trifosfato. Los oligonucleótidos modificados resultantes producidos utilizando las mezclas de transcripción r/mGmH de la presente invención, comprenden sustancialmente todos de 2'-0-metil adenosina, 2'-0-metil citidina, 2'-0-metil guanosina y 2'-0-metil uridina, en donde la población de nucleótidos de guanosina tiene un máximo de aproximadamente 10% de 2 '-OH guanosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados de r/mGmH resultantes de la presente invención, comprenden una secuencia en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-0-metil guanosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, y no más que aproximadamente 10% de todos los nucleótidos de guanosina son 2 '-OH guanosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 90% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-0-metil guanosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, y no más que aproximadamente 10% de todos los nucleótidos de guanosina son 2 '-OH guanosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-O-metil guanosina, y 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, y no más que aproximadamente 10% de todos los nucleótidos de guanosina son 2' -OH guanosina . Bajo las condiciones de transcripción mRmY de la presente invención, la mezcla de transcripción comprende únicamente 2'-0-metil adenosin trifosfato, 2'-0-metil citidin trifosfato, 2'-0-metil guanosin trifosfato, 2'-0-metil uridin trifosfato. Los oligonucleótidos modificados resultantes producidos utilizando las mezclas de transcripción mRmY de la presente invención, comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-0-metil guanosina, y 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina . Bajo las condiciones de transcripción fGmH de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2'-0-metil adenosin trisfosfatos, 2'-0-metil uridin trisfosfatos, 2'-0-metil citidin trisfosfatos y 2'-F guanosin trifosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las condiciones de transcripción fGmH de la presente invención, comprenden sustancialmente todos de 2'-0-metil adenosina, 2'-0-metil uridina, 2'-0-metil citidina y 2'-F guanosina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, y al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-F guanosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 90% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, y al menos 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-F guanosina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2'-0-metil adenosina, 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, y 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-F guanosina. Bajo las condiciones de transcripción d.AmB de la presente invención, la mezcla de reacción de transcripción comprende 2 '-desoxi adenosin trifosfatos, 2'-0-metil citidin trisfosfatos, 2'-0-metil guanosin trifosfatos y 2'-0-metil uridin trisfosfatos. Los oligonucleótidos modificados producidos utilizando las mezclas de transcripción d.AmB de la presente invención, comprenden sustancialmente todos de 2' -desoxi adenosina, 2'-0-metil citidina, 2'-0-metil guanosina y 2'-0-metil uridina. En una modalidad preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 80% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -desoxi adenosina, al menos 80% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 80% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-0-metil guanosina, y al menos 80% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes comprenden una secuencia, en donde al menos 90% de todos los ¡7 nucleótidos de adenosina son 2 '-desoxi adenosina, al menos 90% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, al menos 90% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-0-metil guanosina, y al menos 90% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos modificados resultantes de la presente invención, comprenden una secuencia en donde 100% de todos los nucleótidos de adenosina son 2' -desoxi adenosina, 100% de todos los nucleótidos de citidina son 2'-0-metil citidina, 100% de todos los nucleótidos de guanosina son 2'-0-metil guanosina, y 100% de todos los nucleótidos de uridina son 2'-0-metil uridina . En cada caso, los productos de la transcripción pueden utilizarse entonces para introducirse en el proceso SELEX™ para identificar los aptámeros y/o para determinar las secuencias conservadas que tienen especificidad de unión a un objetivo dado. Las secuencias resultantes ya están estabilizadas parcialmente, eliminando este paso del proceso post-SELEX™ para arribar a una secuencia de aptámero optimizada, y proporcionar un aptámero más altamente estabilizado como resultado. Otra ventaja del proceso SELEX™ con 2' -OMe, es que las secuencias resultantes probablemente tienen menos nucleótidos 2 '-OH requeridos en la secuencia, posiblemente ninguno. Al grado en los nucleótidos 2 '-0H permanezcan, pueden eliminarse realizando modificaciones post-SELEX TM. Como se describe a continuación, pueden obtenerse rendimientos menores pero todavía útiles de los transcriptos que incorporan completamente los nucleótidos sustituidos en la posición 2' bajo condiciones diferentes a las condiciones optimizadas descritas anteriormente. Por ejemplo, las variaciones a las condiciones de transcripción anteriores incluyen: La concentración del amortiguador HEPES puede variar de 0 a 1 M. La presente invención también contempla el uso de otros agentes amortiguadores que tienen una pKa entre 5 y 10, incluyendo, por ejemplo, Tris-hidroximetil-aminometano . La concentración de DTT puede variar de 0 a 400 mM. Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otros agentes reductores, incluyendo, por ejemplo, mercaptoetanol. La concentración de la espermidina y/o espermina puede variar de 0 a 20 mM. La concentración del PEG-8000 puede variar de 0 a 50% (peso/volumen) . Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otro polímero hidrofílico incluyendo, por ejemplo, PEG de otro peso molecular u otros polialquilenglicoles.

La concentración de Tritón X-100 puede variar se 0 a 0.1% (peso/volumen). Los métodos de la presente invención también proporcionan el uso de otros detergentes no iónicos incluyendo, por ejemplo, otros detergentes, incluyendo otros detergentes de Triton-X. La concentración del MgCl2 puede variar de 0.5 mM a 50 mM. La concentración de MnCl2 puede variar de 0.15 mM a 15 mM. Tanto el MgCl2 como el MnCl2 deben estar presentes dentro de los intervalos descritos, y en una modalidad preferida, están presentes en una relación de 10 a aproximadamente 3 de MgCl2:MnCl , de manera preferida, la relación es de aproximadamente 3-5:1, de manera más preferida, la relación es de aproximadamente 3-4:1. La concentración de 2' -OMe NTP (cada NTP) puede variar de 5 µM a 5 mM. La concentración de 2 '-OH GTP puede variar de 0 µM a 300 µM. La concentración de 2 '-OH GMP puede variar de 0 a 5 mM. El pH puede variar de pH 6 a pH 9. Los métodos de la presente invención pueden practicarse dentro del intervalo de pH de actividad de la mayoría de las polimerasas que incorporan los nucleótidos modificados . Además, los métodos de la presente invención proporcionan el uso opcional de agentes quelantes en la condición de reacción de la transcripción incluyendo, por ejemplo, EDTA, EGTA y DTT.

QUÍMICA MEDICINAL DEL APTÁMERO La Química Medicinal del Aptámero es una técnica de mejora del aptámero en la cual conjuntos de aptámeros variantes se sintetizan químicamente. Estos conjuntos de variantes difieren típicamente del aptámero original por la introducción de un solo sustituyente, y difieren unos de otros por la ubicación de este sustituyente. Estas variantes son comparadas entonces unas con otras con el original. Las mejoras en las características pueden ser suficientemente profundas de manera que la inclusión de un solo sustituyente puede ser todo lo necesario para lograr un criterio terapéutico particular. De manera alterna, la información recogida del conjunto de variantes únicas puede utilizarse para diseñar conjuntos adicionales de variantes, en los cuales se introduce más de un sustituyente de manera simultánea. En una estrategia de diseño, todas las variantes con un solo sustituyente se clasifican, las 4 superiores se eligen y todas las posibles combinaciones dobles (6), triples (4) y cuádruples (1) de estas 4 variantes con un solo sustituyente se sintetizan y prueban. En una segunda estrategia de diseño, la mejor variante con un solo sustituyente se considera como el nuevo original, y todas las posibles variantes con un doble sustituyente que incluyen esta variante con un solo sustituyente con la más alta calificación se sintetizan y prueban. Pueden utilizarse otras estrategias, y estas estrategias pueden aplicarse de manera repetida, de manera que el número de sustituyentes se incrementa gradualmente, mientras que se continúa identificando variantes más mejoradas. La Química Medicinal del Aptámero puede utilizarse particularmente como un método para explorar la introducción local, más que global de los sustituyentes. Debido a que los aptámeros se descubren dentro de bibliotecas que son generadas mediante transcripción, cualesquier sustituyentes que se introduzcan durante el proceso SELEX™ deben introducirse globalmente. Por ejemplo, si se desean introducir enlaces de fosforotioato entre los nucleótidos, entonces estos sólo pueden introducirse en cada A (o cada G, C, T, U, etc.) (sustituido globalmente). Los aptámeros que requieren fosforotioatos en algunas A (o algunas G, C, T, U, etc.) (sustituidas localmente), pero no pueden tolerarlo en otras A, no pueden descubrirse fácilmente mediante este proceso . Las clases de sustituyentes que pueden utilizarse mediante el proceso de la Química Medicinal del Aptámero están limitados únicamente por la capacidad para generarlos como reactivos de síntesis en fase sólida e introducirlos en un esquema de síntesis del oligómero. El proceso ciertamente no está limitado a los nucleótidos solos . Los esquemas de la Química Medicinal del Aptámero pueden incluir sustituyentes que introducen volumen esférico, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, lipofobicidad, carga positiva, carga negativa, carga neutra, zwitteriones, polarizabilidad, resistencia a las nucleasas, rigidez conformacional, flexibilidad conformacional, características de unión a la proteína, masa, etc. Los esquemas de la Química Medicinal del Aptámero pueden incluir modificaciones de bases, modificaciones de azúcares o modificaciones del enlace fosfodiéster. Cuando se consideran las clases de sustituyentes que probablemente son benéficos dentro del contexto de un aptámero terapéutico, puede ser deseable introducir sustituciones que caigan en una o más de las siguientes categorías : (1) Sustituyentes ya presentes en el cuerpo, por ejemplo, 2' -desoxi, 2' -ribo, 2'-0-metil purinas o pirimidinas o 5-metil citosina. (2) Sustituyentes que ya son parte de un agente terapéutico aprobado, por ejemplo, oligonucleótidos enlazados a fosforotioato. (3) Sustituyentes que se hidrolizan o degradan a una de las dos categorías anteriores, por ejemplo, oligonucleótidos enlazados a metilfosfonato. Los aptámeros de vWF de la invención incluyen aptámeros desarrollados a través de la química medicinal del aptámero como se describe en la presente.

APTÁMEROS DE UNIÓN ESPECÍFICOS AL FACTOR DE VON WILLEBRAND Los materiales de la presente invención comprenden una serie de aptámeros de ácidos nucleicos de 29 a 76 nucleótidos de longitud, que se unen de manera específica al Factor de von Willebrand. En una modalidad, los materiales de la presente invención comprenden una serie de aptámeros de ácidos nucleicos de 29 a 76 nucleótidos de longitud, que se unen de manera específica al Factor de von Willebrand y que modulan funcionalmente, por ejemplo, bloquean, una actividad del Factor de von Willebrand in vivo u/o en ensayos basados en células. Los aptámeros específicamente capaces de unirse y modular el Factor de von Willebrand de longitud completa y/o el dominio Al del Factor de von Willebrand se exponen en la presente. Estos aptámeros proporcionan una modalidad de baja toxicidad, segura y efectiva para tratar y/o prevenir las enfermedades o trastornos cardiovasculares. En una modalidad, los aptámeros de la invención se utilizan en un método para tratar y/o prevenir las enfermedades de la arteria coronaria, incluyendo cualquiera de los trastornos seleccionados del grupo que consiste de: trombosis arterial y síndromes coronario agudos tales como angina inestable e infarto al miocardio, que se sabe son causados por o están asociados de otra manera con la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand. En las modalidades particulares, los aptámeros de la invención se utilizan en un método para tratar y/o prevenir las enfermedades de la arteria coronaria, incluyendo cualquiera de los trastornos seleccionados del grupo que consiste de: trombosis arterial y síndromes coronario agudos tales como angina inestable e infarto al miocardio, que se sabe son causados por, o están asociados de otra manera con la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand, mientras que reduce al mínimo los efectos laterales del sangrado. En otra modalidad, los aptámeros de la invención se utilizan en un método para tratar y/o prevenir las enfermedades vasculares periféricas que se sabe son causadas por, o están asociadas de otra manera con agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand. En una modalidad particular, los aptámeros de la invención se utilizan en un método para tratar y/o prevenir las enfermedades vasculares periféricas que se sabe son causadas por, o están asociadas de otra manera con la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand, de manera preferida, mientras que se reducen al mínimo los efectos laterales del sangrado. En otra modalidad, los aptámeros de la invención se utilizan para tratar y/o prevenir las enfermedades cerebrovasculares, incluyendo cualquiera de los trastornos seleccionados del grupo que consiste de: ataque isquémico cerebral transitorio, apoplejía y estenosis de la carótida que se sabe son causados por, o están asociados de otra manera con la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand, de manera preferida, mientras que se reducen al mínimo los efectos laterales del sangrado. Además, los aptámeros de la invención son útiles para inhibir la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand en un sujeto antes de, durante y/o después de que un sujeto se ha sometido a una intervención coronaria percutánea incluyendo angioplastia, tratamiento trombolítico o cirugía de derivación coronaria. Los aptámeros de la invención también son útiles para mantener la permeabilidad de los vasos sanguíneos en un sujeto antes de, durante y/o después de que el sujeto se ha sometido a cirugía de derivación coronaria. Los aptámeros de la invención también son útiles para tratar a pacientes que se someten a diálisis. Los aptámeros de la invención también son útiles para inhibir la trombosis mediada por el Factor de von Willebrand en un sujeto, de manera preferida también mientras se reducen al mínimo los efectos laterales del sangrado. La trombosis a ser tratada y/o inhibida, puede asociarse con una respuesta inflamatoria. En una modalidad, el aptámero de unión específico del Factor de von Willebrand para utilizarse en agentes terapéuticos y/o de diagnóstico, se selecciona del grupo que consiste de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635, ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En otra modalidad, los aptámeros de unión específico del Factor de von Willebrand para utilizarse como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico, incluyen cualquiera de las siguientes secuencias: la SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 49, SEQ ID NOS 98-100, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 109, SEQ ID NOS 114 toll5, SEQ ID NO 118, SEQ ID NO 127, SEQ ID NO 134, SEQ ID NO 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 208, and SEQ ID NOS 212 a 214. En algunas modalidades, los aptámeros de unión específica al Factor de von Willebrand para utilizarse como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico, incluyen cualquiera de las siguientes secuencias: ARC1029 (SEQ ID NO 214), ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284), ARC1368 (SEQ ID NO 291), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320), ARC1780 (SEQ ID NO 321), ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . Otros aptámeros de la invención que se unen al Factor de von Willebrand se describen a continuación en los Ejemplos 1 y 2. Estos aptámeros pueden incluir modificaciones- como se describe en la presente, incluyendo, por ejemplo, conjugación a compuestos lipofílicos o de peso molecular alto (por ejemplo, PEG), incorporación de una porción de coronación, incorporación de nucleótidos modificados, y modificación de la cadena principal del fosfato (incluyendo la incorporación de fosforotioato en la cadena principal del fosfato) . En una modalidad de la invención, se proporciona un aptámero aislado, no natural, que se une al Factor de von Willebrand. En otra modalidad, el aptámero de la invención modula una función del Factor de von Willebrand. En otra modalidad, el aptámero de la invención inhibe una función del Factor de von Willebrand, mientras que en otra modalidad, el aptámero estimula una función del Factor de von Willebrand. En otra modalidad de la invención, el aptámero se une y/o modula una función de una variante del Factor de von Willebrand. Una variante del Factor de von Willebrand como se utiliza en la presente, abarca variantes que realizan esencialmente la misma función que la función del Factor de von Willebrand, comprende de manera preferida sustancialmente la misma estructura y en algunas modalidades, comprende al menos 70% de identidad de la secuencia, de manera preferida al menos 80% de identidad de la secuencia, de manera más preferida al menos 90% de identidad de la secuencia, y de manera más preferida al menos 95% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos del Factor de von Willebrand humano. En otra modalidad de la invención, el aptámero tiene sustancialmente la misma capacidad para unirse a un Factor de von Willebrand que aquélla de un aptámero que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115, ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635, ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En otra modalidad de la invención, el aptámero tiene sustancialmente la misma estructura y capacidad para unirse a un Factor de von Willebrand que aquéllas de un aptámero que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115, ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ED NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635, ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En otra modalidad, los aptámeros de la invención comprenden una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-213, ARC1115, ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635, ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En otra modalidad, los aptámeros de la invención comprenden una secuencia que es al menos 80% idéntica, de manera preferida al menos 90% idéntica y en algunas modalidades al menos 95% idéntica a una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115, ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635, ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) . En otra modalidad, los aptámeros de la invención se unen específicamente al Factor de von Willebrand y comprenden una secuencia de 30 nucleótidos contiguos que son idénticos a 30 nucleótidos contiguos en cualquiera de los aptámeros seleccionados del grupo que consiste de: las SEQ ID NOS 11 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 169, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212- 214, ARC1115, ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1635, ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) .

En otra modalidad, los aptámeros de la invención se utilizan como un ingrediente activo en composiciones farmacéuticas . En otra modalidad, los aptámeros de la invención o las composiciones que comprenden los aptámeros de la invención, se utilizan para tratar una enfermedad trombótica tal como un trastorno cardiovascular, incluyendo síndrome coronario agudo; enfermedad arterial periférica; y trastornos cerebrovasculares, incluyendo apoplejía. En algunas modalidades, los aptámeros de la invención o composiciones que comprenden los aptámeros de la invención, se utilizan para tratar, prevenir o aliviar un trastorno seleccionado del grupo que consiste de: trombocitopenia esencial, púrpura trombocitopénica trombótica ("TTP") , enfermedad de von Willebrand del Tipo Ilb, pseudoenfermedad de von Willebrand, enfermedad de la arteria periférica, por ejemplo, enfermedad oclusiva de la arteria periférica, angina inestable, angina pectoral, trombosis arterial, aterosclerosis, infarto al miocardio, síndrome coronario agudo, fibrilación atrial, estenosis de la carótida, infarto cerebral, trombosis cerebral, apoplejía isquémica y ataque isquémico cerebral transitorio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica de la invención se administra antes de/durante y/o después de la diálisis, cirugía de CABG, intervención coronaria percutánea o reemplazo de la válvula cardiaca. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos de aptámeros de la presente invención tienen una - gran afinidad y especificidad con sus objetivos, mientras que reducen los efectos laterales dañinos de las sustituciones de nucleótidos no naturales, si los agentes terapéuticos del aptámero se rompen en el cuerpo de los pacientes o sujetos.

En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas que contienen los agentes terapéuticos del aptámero de la presente invención están libres de, o tienen una cantidad reducida de nucleótidos fluorados . Los aptámeros de la presente invención pueden sintetizarse utilizando cualesquier técnicas de síntesis de oligonucleótidos conocidas en la técnica, incluyendo técnicas de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida (véase, por ejemplo, Froehler et al, Nucí. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) y Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)), y métodos de fase en solución, tales como métodos de síntesis de triéster (véase, por ejemplo, Sood et al, Nucí. Acid Res. 4:2557 (1977) y Hirose et al, Tet. Lett, 28:2449 (1978)), ambas de las cuales son bien conocidas en la técnica.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La invención también incluye composiciones farmacéuticas que contienen las moléculas de aptámero que se unen al Factor de von Willebrand. En algunas modalidades, las composiciones son adecuadas para uso interno, e incluyen una cantidad efectiva de un compuesto farmacológicamente activa de la invención, solo o en combinación, con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los compuestos son especialmente útiles en que tienen toxicidad muy baja, si la tienen. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para tratar o prevenir una patología, tal como una enfermedad o trastorno, o aliviar los síntomas de tal enfermedad o trastorno en un paciente. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para tratar o prevenir una patología asociada con la agregación de las plaquetas. En algunas modalidades, la enfermedad a ser tratada, evitada o aliviada, se selecciona del grupo que consiste de: trombocitopenia esencial; púrpura trombocitopénica trombótica ("TTP") , enfermedad de von Willebrand del Tipo Ilb, pseudoenfermedad de von Willebrand, enfermedad de la arteria periférica, por ejemplo, enfermedad oclusiva de la arteria periférica, angina inestable, angina pectoral, trombosis arterial, aterosclerosis, infarto al miocardio, síndrome coronario agudo, fibrilación atrial, estenosis de la carótida, infarto cerebral, trombosis cerebral, apoplejía isquémica, y ataque isquémico cerebral transitorio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica de la invención se administra antes de, durante y/o después de la diálisis, cirugía CABG, intervención coronaria percutánea o reemplazo de la válvula cardiaca. Las composiciones de la invención son útiles para la administración a un sujeto que sufre de, o está predispuesto a una enfermedad o trastorno que se relaciona con, o se deriva de un objetivo al cual los aptámeros de la invención se unen de manera específica. Las composiciones de la invención pueden utilizarse en un método para tratar un paciente o sujeto que tiene una patología. El método involucra administrar a un paciente o sujeto un aptámero o una composición que comprende los aptámeros que se unen al Factor de von Willebrand involucrado con la patología, de manera que la unión del aptámero al objetivo altera la función biológica del Factor de von Willebrand, tratando por lo tanto la patología . El paciente o sujeto que tiene una patología, es decir, el paciente o sujeto tratado mediante los métodos de esta invención puede ser un mamífero, más particularmente un vertebrado, o más particularmente, un humano. En la práctica, los aptámeros o sus sales farmacéuticamente aceptables, se administran en cantidades que serán suficientes para ejercer su actividad biológica deseada, por ejemplo, evitar la agregación de las plaquetas dependientes del vWF. Un aspecto de la invención comprende una composición de aptámero de la invención en combinación con otros tratamientos para los trastornos trombóticos relacionados. La composición de aptámero de la invención puede contener, por ejemplo, más de un aptámero, por ejemplo, un aptámero antitrombina y un aptámero anti-vWF. En algunos ejemplos, una composición de aptámero de la invención, que contiene uno o más aptámeros de la invención, se administra en combinación con otra composición útil tal como un agente antiinflamatorio, un inmunosupresor, un agente antiviral, o lo similar. En general, las formas de dosificación actualmente disponibles de los agentes terapéuticos conocidos para utilizarse en tales combinaciones serán adecuadas. La "terapia de combinación" (o "coterapia") , incluye la administración de una composición de aptámero de la invención, y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico pretendido para proporcionar el efecto benéfico de la coacción de estos agentes terapéuticos. El efecto benéfico de la combinación incluye, de manera no exclusiva, una coacción farmacocinética o farmacodinámica que resulta de la combinación de los agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación, típicamente se lleva a cabo durante un periodo de tiempo definido (usualmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada) . La "terapia de combinación" puede, aunque generalmente no, estar pretendida para abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regimenes de monoterapia separada, que resultan de manera incidental y arbitraria en las combinaciones de la presente invención. La "terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, esto es, en donde cada agente terapéutico se administra a una hora diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea puede lograrse, por ejemplo, administrando al sujeto una sola cápsula que tiene una relación fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas únicas para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse mediante cualquier ruta apropiada incluyendo, de manera no exclusiva, rutas tópicas, rutas orales, rutas intravenosas, rutas intramusculares y la absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa. Los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante la misma ruta o mediante rutas diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse mediante la inyección, mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse tópicamente. De manera alterna, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse tópicamente o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección. La secuencia en la cual los agentes terapéuticos se administran no es estrictamente crítica, a menos que se indique de otra manera. La "terapia de combinación", también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se describió anteriormente, en una combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos . En conde la terapia de combinación comprende además un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármacos puede realizarse en cualquier momento adecuado, siempre que el efecto benéfico de la coacción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármacos se alcance. Por ejemplo, en los casos apropiados, el efecto benéfico se logra todavía cuando el tratamiento sin fármaco se retira temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, tal vez durante días o incluso semanas. Las composiciones terapéuticas o farmacológicas de la presente invención comprenderán generalmente una cantidad efectiva del componente activo de la terapia, disuelto o disperso en un medio farmacéuticamente aceptable. El medio o los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción y lo similar. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas, es bien conocido en la técnica; Lo ingredientes activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones terapéuticas de la presente invención. La preparación de las composiciones farmacéuticas o farmacológicas se conocerá por aquellos con experiencia en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, tales composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en un líquido antes de la inyección; como tabletas u otros sólidos para la administración oral; como cápsulas de liberación temporal; o en cualquier otra forma actualmente utilizada incluyendo, gotas para ojos, lociones, ungüentos, inhalantes y lo similar. El uso de formulaciones estériles, tales como lavados basados en suero fisiológico, por los cirujanos, médicos o trabajadores del cuidado de la salud para tratar un área particular en el campo de operación también puede ser particularmente útil. Las composiciones también pueden suministrarse vía un microdispositivo, micropartícula o esponja.

Tras la formulación, los agentes terapéuticos se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que es farmacológicamente efectiva. Las formulaciones son administradas fácilmente en una variedad de formas de dosificación. En una modalidad preferida, el aptámero de la invención se formula como una solución inyectable descrita anteriormente, pero también puede emplearse cápsulas de liberación del fármaco y lo similar. En este contexto, la cantidad del ingrediente activo y el volumen de la composición a ser administrada dependen del animal hospedero a ser tratado. Las cantidades precisas del compuesto activo requeridas para la administración, dependen del juicio del prácticamente y son peculiares para cada individuo. Se utiliza típicamente un volumen mínimo de una composición, requerido para dispersar los compuestos activos . Los regímenes adecuados para la administración también son variables, pero estarían tipificados al administrar inicialmente el compuesto y verificando los resultados y a continuación dando dosis controladas a intervalos adicionales. Los efectos de la administración del aptámero anti-vWF de la invención pueden verificarse midiendo la formación de la agregación de las plaquetas, tal como midiendo la agregación de las plaquetas inducida por la botrocetina ("BIPA") y/o la formación de un tapón hemostático inducido por la fuerza de corte, utilizando el instrumento PFA-100 como se describe en el Ejemplo 3 siguiente . Por ejemplo, para la administración oral en la forma de una tableta o cápsula (por ejemplo, una cápsula de gelatina) , el componente del fármaco activo puede combinarse con un portador oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua y lo similar. Además, cuando se desea o es necesario, pueden incorporarse también a la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes adecuados. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto al alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y lo similar. Los lubricantes utilizados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol y lo similar. Los desintegrantes incluyen, de manera no exclusiva, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, goma xantana, almidones, agar, ácido algínico o su sal de sodio o mezclas efervescentes y lo similar. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina. Las composiciones inyectables son de manera preferida, soluciones o suspensiones isotónicas acuosas, y se preparan supositorios de manera ventajosa de emulsiones o suspensiones grasas. Las composiciones pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes, tales como agentes de conservación, estabilizantes, humectantes o emulsificantes, promotores de la solución, sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores. Además, también pueden contener otras sustancia terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con el mezclado, granulación o métodos de recubrimientos convencionales, respectivamente, y contienen típicamente de aproximadamente 0.1 a 75%, de manera preferida, de aproximadamente 1 a 50%, del ingrediente activo. Los compuestos de la invención también pueden administrarse en formas de dosificación oral tales como tabletas o cápsulas de liberación sincronizada y sostenida, pildoras, polvos, granulos, elíxires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Las composiciones líquidas, particularmente inyectables pueden, por ejemplo, prepararse mediante disolución, dispersión, etc. El compuesto activo se disuelve en o se mezcla con un solvente farmacéuticamente puro, tal como, por ejemplo, agua, suero fisiológico, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y lo similar, para formar por lo tanto la solución o suspensión inyectable. Además, pueden formularse formas sólidas para disolverse en un líquido antes de la inyección. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en forma intravenosa (tanto en bolo como en infusión) , intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, utilizando todas las formas bien conocidas para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica farmacéutica. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. La administración inyectable parenteral se utiliza generalmente para las inyecciones e infusiones subcutáneas, intramusculares o intravenosas. Además, un procedimiento para la administración parenteral emplea el implante de sistemas de liberación lenta o de liberación sostenida, que aseguran que se mantiene un nivel constante de la dosificación, de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos No. 3,710,795, incorporada en la presente como referencia . Además, los compuestos preferidos para la presente invención pueden administrarse en forma intranasal vía el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, inhalantes o vía rutas transdérmicas, utilizando aquellas formas de parches transdérmicos para la piel, bien conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Para ser administrada en la forma de un sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosificación, será, por supuesto, continua más que intermitentes a través del régimen de dosificación. • Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, ungüentos, lociones, rocíos en aerosol y geles, en donde la concentración del ingrediente activo variaría típicamente de 0.01% a 15%, peso/peso o peso/volumen . Para las composiciones sólidas, los excipientes incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y lo similar puede utilizarse. El compuesto activo definido anteriormente, también puede formularse como supositorios, utilizando, por ejemplo, polialquilenglicoles, por ejemplo, propilenglicol, como el portador. En algunas modalidades, los supositorios se preparan de manera ventajosa de emulsiones o suspensiones grasas . Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en la forma de sistemas de suministro de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares . Los liposomas pueden formarse de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas modalidades, una película de los componentes lipidíeos se hidrata con una solución acuosa del fármaco, para formar una capa de lípido que encapsula el fármaco, como se describe en la in Patente de los Estados Unidos No. 5,262,564. Por ejemplo, las moléculas del aptámero descrito en la presente pueden proporcionarse como un complejo con un compuesto lipofílico o un compuesto no inmunogénico con un alto peso molecular, const.ruido utilizando los métodos conocidos en la técnica. Además, los liposomas pueden portar aptámeros en su superficie, para seleccionar y portar agentes citotóxicos de manera interna, para mediar la destrucción celular. Un ejemplo de complejos asociados con ácidos nucleicos se proporciona en la Patente de los Estados Unidos No. 6,011,020. Los compuestos de la presente invención también pueden acoplarse con polímeros solubles como portadores del fármaco seleccionables . Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, polímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietil-aspanamidafenol u óxido de polietileno polilisina sustituidos con residuos de palmitoilo. Además, los compuestos de la presente invención pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles en lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque reticulados o antipáticos de hidrogeles. Si se desea, la composición farmacéutica a ser administrada puede contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores del pH y otras sustancias tales como por ejemplo, acetato de sodio y oleato de trimetanolamina . El régimen de dosificación que utiliza los aptámeros se selecciona de acuerdo con una variedad de factores, incluyendo el tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la severidad de la condición a ser tratada; la ruta de administración; la función renal y hepática del paciente; y el aptámero particular o la sal del mismo empleados. Un médico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerida para evitar, contrarrestar o detener el progreso de la condición. Las dosificaciones orales de la presente invención, cuando se utilizan para los efectos indicados, variará entre aproximadamente 0.05 a 7500 mg/día, oralmente.

Las composiciones se proporcionan, de manera preferida, en la forma de tabletas ranuradas que contienen 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 y 1000.0 mg del ingrediente activo. Las dosificaciones infundidas, las dosificaciones intranasales y las dosificaciones transdérmicas variarán entre 0.05 a 7500 mg/día. Las dosificaciones subcutáneas, intravenosas e intraperitoneales variarán entre 0.05 a 3800 mg/día. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse en una sola dosis diaria, o la dosificación diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Los niveles en plasma efectivos de los compuestos de la presente invención varían de 0.002 mg/mL a 50 mg/mL. En las dosificaciones de la presente invención, la masa se refiere sólo al peso molecular de la porción de oligonucleótido del aptámero, sin importar la masa conferida por la conjugación con PEG.

MODULACIÓN DE LA FARMACOCINÉTICA Y BIODISTRIBUCIÓN DEL AGENTE TERAPÉUTICO DEL APTÁMERO Es importante que las propiedades farmacocinéticas para todos los agentes terapéuticos basados en oligonucleótidos, incluyendo los aptámeros, se ajusten para que coincidan con la aplicación farmacéutica deseada.

Aunque los aptámeros dirigidos contra los objetivos extracelulares no sufren de las dificultades asociadas con el suministro intracelular (como es el caso con los agentes terapéuticos basados en ARNi y antisentido) , tales aptámeros deben ser todavía capaces de distribuirse a los órganos y tejidos objetivo, y permanecer en el cuerpo (no modificados) durante un periodo de tiempo consistente con el régimen de dosificación deseado. Así, la presente invención proporciona materiales y métodos para afectar la farmacocinética de las composiciones del aptámero, y en particular, la capacidad para afinar la farmacocinética del aptámero. La capacidad de afinación de (es decir, la capacidad de modular) la farmacocinética del aptámero se logra a través de la conjugación de las porciones modificantes (por ejemplo, polímeros de PEG) al aptámero y/o la incorporación de los nucleótidos modificados (por ejemplo, 2 '-fluoro o 2'-0-metilo) para alterar la composición química del .ácido nucleico. La capacidad para afinar la farmacocinética del aptámero se utiliza en la mejora de las aplicaciones terapéuticas existentes, o de manera alterna, en el desarrollo de nuevas aplicaciones terapéuticas . Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en entornos anti-neoplásicos o de cuidado agudo en donde puede desearse la rápida eliminación o anulación del fármaco, es deseable disminuir los tiempos de residencia de los aptámeros en la circulación. De manera alterna, en otras aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, las terapias de mantenimiento en donde se desea la circulación de un agente terapéutico, pueden ser deseables para incrementar los tiempos de residencia de los aptámeros en la circulación . Además, la capacidad de afinación de la farmacocinética del aptámero se utiliza para modificar la biodistribución de un agente terapéutico del aptámero en un sujeto. Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, puede ser deseable alterar la biodistribución de un agente terapéutico del aptámero, en un esfuerzo para seleccionar un tipo particular de tejido o un órgano específico (o conjunto de órganos) . En estas aplicaciones, el agente terapéutico del aptámero se acumula de manea preferida en un tejido u órgano específico. En otras aplicaciones terapéuticas, puede ser deseable seleccionar tejidos que muestran un marcador celular o un síntoma asociado con una enfermedad dada, lesión celular u otra patología anormal, de manera que el agente terapéutico del aptámero se acumula de manera preferida en el tejido afectado. Por ejemplo, como se describió en la solicitud provisional copendiente de los Estados Unidos No. de Serie 60/550790, presentada en marzo 5 del 2004, y titulada "Modulación Controlada de la Farmacocinética y la Biodistribución de los Agentes Terapéuticos del Aptámero) , la PEGilación de un agente terapéutico del aptámero (por ejemplo, PEGilación con un polímero de PEG de 20 kDa) se utiliza para seleccionar tejidos inflamados, de manea que el agente terapéutico del aptámero PEGilado se acumula de manera preferida en el tejido inflamado. Para determinar los perfiles de la farmacocinética y la biodistribución de los agentes terapéuticos del aptámero (por ejemplo, conjugados del aptámero o aptámeros que tienen químicas alteradas, tales como nucleótidos modificados), se verifica una variedad de parámetros. Tales parámetros incluyen, por ejemplo, la vida media (t?/2) , la eliminación en plasma (CL) , el volumen de la distribución (Vss), el área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC), concentración máxima observada en suero o plasma (Cmax) y el tiempo de residencia medio (MRT) de una composición de un aptámero. Como se utiliza en la presente, el término "AUC" se refiere al área bajo la gráfica de la concentración en plasma de un agente terapéutico del aptámero versus el tiempo después de la administración del aptámero. El valor de la AUC se utiliza para estimar la biodisponibilidad (es decir, el porcentaje del agente terapéutico del aptámero administrado en la circulación después de la administración del aptámero) y/o la eliminación total (CL) (es decir, la velocidad a la cual el agente terapéutico del aptámero se elimina de la circulación) de un agente terapéutico del aptámero dado. El volumen de la distribución se relaciona con la concentración en plasma de un agente terapéutico del aptámero con la cantidad del aptámero presente en el cuerpo. Entre mayor sea el Vss, más aptámero se encuentra fuera del plasma (es decir, más extravasación) . La presente invención proporciona materiales y métodos para modular, de una manera controlada, la farmacocinética y la biodistribución de las composiciones estabilizadas de aptámero in vivo mediante la conjugación de un aptámero a una porción moduladora tal como una molécula pequeña, péptido o grupo terminal polimérico, o mediante la incorporación de nucleótidos modificados en el aptámero. Como se describe en la presente, la conjugación de una porción modificante y/o alterar la composición química de los nucleótidos, altera los aspectos fundamentales del tiempo de residencia en la circulación y la distribución a los tejidos. Además de la eliminación por las nucleasas, los agentes terapéuticos de oligonucleótidos son sometidos- a la eliminación vía filtración renal. Por lo tanto, un oligonucleótido resistente a las nucleasas, administrado de manera intravenosa, típicamente exhibe una vida media in vivo de <10 minutos, a menos que la filtración pueda bloquearse. Esto puede lograrse facilitando la distribución rápida fuera de la corriente sanguínea en los tejidos o incrementando el peso molecular aparente del oligonucleótido por encima de su corte de tamaño efectivo para los glomérulos . La conjugación de agentes terapéuticos pequeños a un polímero de PEG (PEGilación) , descrita a continuación, puede alargar dramáticamente los tiempos de residencia de los aptámeros en circulación, disminuyendo por lo tanto la frecuencia de la dosificación y mejorando la efectividad contra los objetivos vasculares. Los aptámeros pueden conjugarse a una variedad de porciones modificantes, tales como polímeros de alto peso molecular, por ejemplo, PEG; péptidos, por ejemplo, Tat (un fragmento de 13 aminoácidos de la proteína Tat de VIH (Vives, et al, (1997), J. Biol. Chem. 272 (25) : 16010-7 )) , Ant (una secuencia de 16 aminoácidos derivada de la tercera hélice de la proteína homeótica de Drosophila antennapedia (Pietersz, et al, (2001), Vaccine 19 (11-12) : 1397-405) ) y Arg7 (un péptido corto, cargado positivamente que permea las células, compuesto de poliarginina (Arg7) (Rothbard, et al, (2000), Nat. Med. 6 (11) : 1253-7; Rothbard, J et al, (2002), J. Med. Chem. 45 (17 ): 3612-8 )) ; y moléculas pequeñas, por ejemplo, compuestos lipofílicos tales como colesterol.

Entre los varios conjugados descritos en la presente, las propiedades in vivo de los aptámeros son alteradas de manera más profunda mediante la complejación con grupos PEG. Por ejemplo, la complejación de un agente terapéutico del aptámero modificado con 2'F y 2 '-OMe, mezclado con un polímero de PEG de 20 kDa impide la filtración renal y promueve la distribución del aptámero en los tejidos sanos e inflamados. Además, el conjugado del polímero de PEG de 20 kDa-aptámero probó ser casi tan efectivo como un polímero de PEG de 40 kDa en evitar la filtración renal de los aptámeros. Mientras que un efecto de la PEGilación es la eliminación del aptámero, la exposición sistémica prolongada proporcionada por la presencia de la porción de 20 kDa también facilita la distribución del aptámero a los tejidos, particularmente aquéllos de órganos altamente perfundidos y aquéllos en el sitio de la inflamación. El conjugado del aptámero-polímero de PEG de 20 kDa dirige la distribución del aptámero al sitio de inflamación, de manera que el aptámero PEGilado se acumula de manera preferida en el tejido inflamado. En algunos casos, el conjugado del aptámero PEGilado de 20 kDa es capaz de acceder al interior de las células, tal como por ejemplo, las células del riñon. Los nucleótidos modificados también pueden utilizarse para modular la eliminación en plasma de los aptámeros. Por ejemplo, un aptámero no conjugado, que incorpora tanto las químicas estabilizantes de 2'-F y 2'-OMe, que es típico de la generación actual de aptámeros, puesto que exhibe un alto grado de estabilidad de la nucleasa in vitro e in vivo, muestra una rápida pérdida del plasma (es decir, rápida eliminación del plasma) y una rápida distribución en los tejidos, principalmente en el riñon, cuando se compara con el aptámero no modificado. ÁCIDOS NUCLEICOS DERIVADOS DE PEG Como se describió anteriormente, la derivación de los ácidos nucleicos con polímeros no inmunogénicos de alto peso molecular tiene el potencial de alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los ácidos nucleicos, haciéndolos agentes terapéuticos más efectivos. Los cambios favorables en la actividad pueden incluir resistencia incrementada a la degradación por las nucleasas, filtración disminuida a través de los riñones, exposición disminuida al sistema inmune y distribución alterada del agente terapéutico a través del cuerpo. Las composiciones del aptámero de la invención pueden derivarse con porciones de polialquilenglicol (PAG) . Los ejemplos de ácidos nucleicos derivados con PAG se encuentran en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/718,833, presentada en noviembre 21 del 2003, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Los polímeros típicos utilizados en la invención incluyen poli (etilenglicol) (PEG), también conocido como poli (óxido de etileno) (PEO) y polipropilenglicol (incluyendo poliisopropilenglicol) . Además, pueden utilizarse copolímeros aleatorios o de bloque de diferentes óxidos de alquileno (por ejemplo, óxido de etileno y óxido de propileno) en muchas aplicaciones. En su forma más común, un polialquilenglicol, tal como PEG, es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: H0-CH2CH20- (CH2CH20)n-CH2CH2-0H. Este polímero, alfa-, omega-dihidroxilpoli (etilenglicol) , también puede representarse como HO-PEG-OH, en donde se entiende que el símbolo -PEG-representa la siguiente unidad estructural: -CH2CH20-(CH2CH20) n_CH2CH2-, en donde n varía típicamente de aproximadamente 4 a aproximadamente 10,000. Como se muestra, la molécula de PEG es difuncional y algunas veces se refiere como un "diol PEG." Las porciones terminales de la molécula de PEG son porciones hidroxilo relativamente no reactivas, los grupos -OH, que pueden activarse o convertirse a porciones funcionales, para la unión del PEG a otros compuestos en los sitios reactivos del compuesto. Tales dioles PEG activados son referidos en la presente como PEG biactivados . Por ejemplo, las porciones terminales del diol PEG se han funcionarizado como un éster de carbonato activo para la reacción selectiva con porciones amino mediante la sustitución de porciones hidroxilo relativamente no reactivas, -OH, con porciones de éster de succinimidilo activas de la N-hidroxi succinimida. En muchas aplicaciones, es deseable coronar la molécula de PEG en un extremo con una porción esencialmente no reactiva, de manera que la molécula de PEG es monofuncional (o monoactivada) . En el caso de agentes terapéuticos de proteína que muestran generalmente múltiples sitios de reacción para los PEG activados, los PEG activados bifuncionales conducen a una reticulación extensa, proporcionando agregados funcionales de manera deficiente. Para generar PEG monoactivados, una porción hidroxilo en el término de la molécula de diol PEG típicamente se sustituye con una porción de extremo metoxi no reactiva, -OCH3. El otro término no coronado de la molécula de PEG típicamente se convierte a una porción de extremo reactiva que puede activarse para la unión a un sitio respectivo en una superficie o una molécula tal como una proteína. Los PAG son polímeros que típicamente tienen las propiedades de solubilidad en agua y en muchos solventes orgánicos, carecen de toxicidad y carecen de inmunogenicidad. Un uso de los PAG es unir de manera covalente el polímero a moléculas insolubles para hacer soluble el "conjugado" de la molécula de PAG resultante. Por ejemplo, se ha mostrado que el fármaco insoluble en agua paclitaxel, cuando se acopla al PEG, se vuelve soluble en agua. Greenwald, et at, J. Org. Chem., 60:331-336 (1995).

Los conjugados de PAG con frecuencia se utilizan no sólo para mejorar la solubilidad y estabilidad, sino también para prolongar la vida media en la circulación sanguínea de las moléculas . Los compuestos polialquilados de la invención son típicamente de entre 5 y 80 kDa de tamaño, sin embargo, puede utilizarse cualquier tamaño, la elección depende del aptámero y de la aplicación. Otros compuestos de PAG de la invención son de entre 10 y 80 kDa de tamaño. Aún otros compuestos de PAG de la invención son de entre 10 y 60 kDa de tamaño. Por ejemplo, un polímero PAG puede ser de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 u 80 kDa de tamaño. Tales polímeros pueden ser lineales o ramificados . En contraste con los agentes terapéuticos de proteína expresados biológicamente, los agentes terapéuticos de ácidos nucleico son típicamente, sintetizados químicamente a partir de nucleótidos de monómero activados . Los conjugados de PEG-ácido nucleico pueden prepararse incorporando el PEG utilizando la misma síntesis iterativa del monómero. Por ejemplo, los PEG activados mediante la conversión a una forma de fosforamidita pueden incorporarse en la síntesis del oligonucleótido en fase sólida. De manera alterna, la síntesis del oligonucleótido puede terminarse con la incorporación específica del sitio de un sitio de unión del PEG reactivo. De manera más común, esto se ha logrado mediante la adición de una amina primaria libre en el término 5' (incorporada utilizando una fosforamidita modificadora en el último paso de acoplamiento de la síntesis en fase sólida) . Utilizando este procedimiento, un PEG reactivo (por ejemplo, uno que es activado de manera que reaccionará y formará un enlace con una amina) se combina con el oligonucleótido purificado y la reacción de acoplamiento se lleva a cabo en solución. La capacidad de la conjugación con PEG para alterar la biodistribución de un agente terapéutico se relaciona con varios factores, incluyendo el tamaño aparente (por ejemplo, como se mide en términos del radio hidrodinámico) del conjugado. Los conjugados más grandes (>10kDa) son conocidos por bloquear de manera más efectiva la filtración vía el riñon y de incrementar en consecuencia la vida media en suero de las macromoléculas pequeñas (por ejemplo, péptidos, oligonucleótidos antisentido). La capacidad de los conjugados de PEG para bloquear la filtración ha mostrado incrementarse con el tamaño del PEG hasta aproximadamente 50 kDa (los incrementos adicionales tienen un efecto mínimo puesto que la vida media se define por el metabolismo mediado por el macrófago, más que por la eliminación vía los riñones) . La producción de PEG de alto peso molecular (>10 kDa) puede ser difícil, ineficiente y cara. Como una ruta hacia la síntesis de conjugados de PEG-ácido nucleico de alto peso molecular, el trabajo previo se ha enfocado hacia la generación de PEG activados de peso molecular más alto. Un método para generar tales moléculas involucra la formación de un PEG activado ramificado, en el cual dos o más PEG se unen a un núcleo central que porta el grupo activado. Las porciones terminales de estas moléculas de PEG de peso molecular más alto, es decir, las porciones hidroxilo (-0H) relativamente no reactivas, pueden activarse o convertirse a porciones funcionales, para la unión de uno o más de los PEG a otros compuestos en los sitios reactivos en el compuesto. Los PEG activados ramificados tendrán más de dos términos, y en los casos en donde dos o más términos se han activado, tales moléculas de PEG activadas, de peso molecular más alto son referidas en la presente como PEG con múltiples activaciones. En algunos casos, no todos los términos en una molécula de PEG ramificada están activados. En los casos en donde cualquiera de dos términos de una molécula de PEG ramificada está activado, tales moléculas de PEG son referidas como PEG biactivados . En algunos casos en donde sólo un término en una molécula de PEG ramificada está activado, tales moléculas de PEG se refieren como monoactivadas . Como un ejemplo de este procedimiento, se ha descrito un PEG activado preparado mediante la unión de dos PEG de monometoxi a un núcleo de lisina que es activado posteriormente para la reacción (Harris et al, Nature, vol.2: 214-221, 2003) . La presente invención proporciona otra ruta efectiva en costo para la síntesis de conjugados de PEG-ácido nucleico de alto peso molecular (de manera preferida, aptámeros) que incluyen múltiples ácidos nucleicos PEGilados. La presente invención también abarca oligonucleótidos multiméricos enlazados a PEG, por ejemplo, aptámeros dimerizados. La presente invención también se refiere a composiciones de alto peso molecular en donde una porción estabilizante de PEG es un enlazante que separa diferentes porciones de un aptámero, por ejemplo, el PEG se conjuga dentro de una sola secuencia del aptámero, de manera que el arreglo lineal del aptámero de alto peso molecular es, por ejemplo, ácido nucleico-PEG-ácido nucleico (-PEG-ácido nucleico) n en donde n es mayor que o igual a 1. Las composiciones de alto peso molecular de la invención incluyen aquéllas que tienen un peso molecular de al menos 10 kDa. Las composiciones típicamente tienen un peso molecular entre 10 y 80 kDa de tamaño. Las composiciones de alto peso molecular de la invención son de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60 u 80 kDa de tamaño. Una porción estabilizante es una molécula o porción de una molécula, que mejora las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de las composiciones de aptámero de alto peso molecular de la invención, en algunos casos, una porción estabilizante es una molécula o porción de una molécula que lleva dos o más aptámeros, o dominios del aptámero en proximidad, o proporciona una libertad rotacional total disminuida de las composiciones del aptámero de alto peso molecular de la invención. Una porción estabilizante puede ser un polialquilenglicol, tal como polietilenglicol, que puede ser lineal o ramificado, un homopolímero o un heteropolímero. Otras porciones estabilizantes incluyen polímeros tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) . Los oligonucleótidos también pueden ser porciones estabilizantes; tales oligonucleótidos pueden incluir nucleótidos modificados y/o enlaces modificados, tales como fosforotioatos . Una porción estabilizante puede ser una parte integral de una composición de un aptámero, es decir, se une de manera covalente al aptámero. Las composiciones de la invención incluyen composiciones de aptámero de alto peso molecular, en las cuales dos o más porciones de ácido nucleico están conjugadas de manera covalente a al menos una porción de polialquilenglicol. Las porciones de polialquilenglicol sirven como porciones estabilizantes. En las composiciones en donde una porción de polialquilenglicol está unida de manera covalente a cualquier extremo de un aptámero, de manera que el polialquilenglicol une las porciones de ácido nucleico en una molécula, se dice que el polialquilenglicol es una porción enlazante. En tales composiciones, la estructura primaria de la molécula covalente incluye el arreglo lineal ácido nucleico-PAG-ácido nucleico. Un ejemplo es una composición que tiene la estructura primaria ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Otro ejemplo es un arreglo lineal de: ácido nucleico-PEG-ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Para producir el conjugado de ácido nucleico-PEG-ácido nucleico, el ácido nucleico es sintetizado originalmente de manera que porte un solo sitio reactivo (por ejemplo, es onoactivado) . En una modalidad preferida, este sitio reactivo es un grupo amino introducido en el término 5' mediante la adición de un modificador de fosforamidita como el último paso en la síntesis en fase sólida del oligonucleótido. Después de la desprotección y purificación del oligonucleótido modificado, éste se reconstituye a una alta concentración en una solución que reduce el mínimo la hidrólisis espontánea del PEG activado. En una modalidad preferida, la concentración del oligonucleótido es de 1 mM y la solución reconstituida contiene amortiguador de NaHC03200 mM, pH 8.3. La síntesis del conjugado se inicia mediante la adición lenta, paso a paso, del PEG bifuncional altamente purificado. En una modalidad preferida, el PEG diol está activado en ambos extremos (biactivado) mediante la derivación con propionato de succinimidilo. Después de la reacción, el conjugado de PEG-ácido nucleico se purifica mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida para separar las especies conjugadas de manera completa y parcial y las especies no conjugadas. Múltiples moléculas de PAG concatenadas (por ejemplo, como copolímero aleatorios o de bloque) o cadenas de PAG más pequeñas pueden enlazarse para lograr varias longitudes (o pesos moleculares). Pueden utilizarse enlazantes que no son de PAG entre las cadenas de PAG de longitudes variables . Las modificaciones de 2' -O-metilo, 2' -fluoro y otras modificaciones de nucleótido estabilizan el aptámero contra las nucleasas e incrementa su vida media in vivo. La corona 3'-3'-dT también incrementa la resistencia a la exonucleasa. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5,674,685; 5,668,264; 6,207,816 y 6,229,002, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

DERIVACIÓN CON PAG DE UN ÁCIDO NUCLEICO REACTIVO Los conjugados de PAG-ácido nucleico-PAG de alto peso molecular pueden prepararse mediante la reacción de un PEG activado monofuncional con un ácido nucleico que contiene más de un sitio reactivo. En una modalidad, el ácido nucleico es birreactivo, o está biactivado, y contiene dos sitios reactivos: un grupo 5' -amino y un grupo 3 '-amino introducido en el oligonucleótido a través de la síntesis convencional de la fosforamidita, por ejemplo: 3'-5'-di-PEGilación como se ilustra en la Figura 2. En modalidades alternas, los sitios reactivos pueden introducirse en posiciones internas, utilizando, por ejemplo, la posición 5 de las pirimidinas, la posición 8 de las purinas o la posición 2' de la ribosa en los sitios para la unión de las aminas primarias. En tales modalidades, el ácido nucleico puede tener varios sitios activados o reactivos y se dice que está activado de manera múltiple. Después de la síntesis y la purificación, el oligonucleótido modificado se combina con el PEG monoactivado bajo condiciones que fomentan la reacción selectiva con los sitios reactivos del oligonucleótido, mientras que reduce al mínimo la hidrólisis espontánea. En la modalidad preferida, el monometoxi-PEG es activado con propionato de succinimidilo y la reacción acoplada se lleva a cabo a pH 8.3. Para accionar la síntesis del PEG bisustituido, se proporciona un exceso estequiométrico con relación al oligonucleótido. Después de la reacción, el conjugado de PEG-ácido nucleico se purifica mediante electroforesis en gel o cromatografía líquida para separar las especies conjugadas de manera completa y parcial y las especies no conjugadas. Los dominios de enlace también pueden tener una o más porciones de polialquilenglicol unidas a los mismos.

Tales PAG puede ser de una variedad de longitudes y pueden utilizarse en combinaciones apropiadas para lograr el peso molecular deseado de la composición. El efecto de un enlazante particular puede influenciarse por su composición química y su longitud. Un enlazante que es demasiado largo, demasiado corto o forma interacciones esféricas y/o iónicas desfavorables con el objetivo, excluirá la formación de un complejo entre el aptámero y el objetivo. Un enlazante, que es más largo que lo necesario para abarcar la distancia entre los ácidos nucleicos, puede reducir la estabilidad de unión disminuyendo la concentración efectiva del ligando. Así, con frecuencia es necesario optimizar las composiciones y longitudes del enlazante, con el fin de maximizar la afinidad de un aptámero para un objetivo. Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente se incorporan como referencia como si cada publicación o documento se indicara de manera específica e individual como incorporado en la presente como referencia. La cita de las publicaciones y documentos de patente no pretende ser una admisión de que cualquiera es una técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión del contenido o la fecha de los mismos. Habiéndose descrito ahora la invención por medio de la descripción escrita, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes son para propósitos de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.

EJEMPLOS EJ?MPLO 1: SELECCIÓN Y SECUENCIAS DEL APTÁMERO EJEMPLO ÍA: Selección de los aptámeros del dominio Al de vWF de rRfY Las selecciones se realizaron para identificar aptámeros que se unen al dominio Al de vWF humano de conejo, utilizando una recolección de nucleótidos que consiste de los nucleótidos 2 '-OH purina y 2'-F pirimidina (rRfY) . La estrategia de selección proporcionó aptámeros con alta afinidad específica para los dominios Al de vWF humano y de conejo que se han inmovilizado en una placa hidrofóbica.

Preparación de la Recolección Se sintetizó una plantilla de ADN con la secuencia 5 ' -GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC-3' (SEQ ID NO 8), utilizando un sintetizador de ADN ABl EXPEDITE™, y se desprotegió mediante métodos estándar. La serie de N' en la plantilla de ADN (SEQ ID NO 8), puede ser cualquier combinación de nucleótidos y da lugar a la región de la secuencia única de los aptámeros resultantes. La plantilla se amplificó con los cebadores 5'~ TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3' (SEQ ID NO 9) y 5'-GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3' (SEQ ID NO 10), y continuación se utilizó como una plantilla para la transcripción in vitro con la ARN polimerasa T7 (Y639F) . Las transcripciones se incubaron, típicamente a 37 °C durante la noche, utilizando Tris 40 mM pH 8.0, DTT 40 mM, espermidina-HCl 1 mM, Tritón X-100 al 0.002%, PEG-8000 al 4% (peso/volumen), MgCl2 12 mM, 2'-F-CTP 3 M, 2'-F-UTP 3 M, GTP 3 mM, ATP 3 mM, pirofosfatasa inorgánica 0.5X y polimerasa T7 IX (Y639F) , y aproximadamente un ADN de plantilla 0.5 µM.

Selección Para la selección del dominio Al de vWF humano, las primeras diez rondas se iniciaron inmovilizando 24 pmoles del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 4, Figura 4) a la superficie de una placa hidrofóbica Nunc Maxisorp (Nunc Cat. # 446612, Rochester, NY) durante 1 hora a temperatura ambiente en 100 µL de PBS de Dulbecco IX (Gibco BRL Cat. # 14040-133, Carlsbad, CA) . Para las Rondas once y doce, 12 pmoles del vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7, número de acceso VWHU, disponible de Calbiochem Cat. # 681300, La Jolla, CA) , se inmovilizaron en la placa hidrofóbica. Para la selección del vWF de conejo, cada ronda se inició inmovilizando 24 pmoles del dominio Al de vWF de conejo (SEQ ED NO 6: número de acceso AAB51555, Figura 3), bajo las mismas condiciones que para el dominio Al de vWF humano . En todos los casos, después de una hora de inmovilización de la proteína, el sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. El pozo inmovilizado con las proteínas se bloqueó a continuación con 100 uL de amortiguador de bloqueo (PBS de Dulbecco IX con BSA al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. En la Ronda uno, 333 pmoles del ARN de la recolección (2 x 1014 moléculas únicas), se incubaron en 100 µL de PBS de Dulbecco IX en los pozos que contienen el objetivo de la proteína inmovilizada bloqueada con BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, el sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. En las rondas posteriores, se agregaron lavados adicionales para incrementar el rigor del paso de la selección positiva (véanse las Tablas 1 y 2) . Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se incluyeron dos pasos de selección negativa antes del paso de selección positiva. Primero, el ARN de la recolección se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un pozo no bloqueado para eliminar cualesquier secuencias de unión al plástico de la recolección. En el segundo paso de selección negativa, el ARN se transfirió a un pozo bloqueado con BSA (que no contiene el objetivo de la proteína) durante 1 hora a temperatura ambiente, para eliminar cualesquier secuencias que se unen al BSA de la recolección antes de la selección positiva. Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se rociaron 0.1 mg/mL de ARNt y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón en la reacción de selección positiva como competidores no específicos. En todos los casos, el ARN de la recolección unido al objetivo de la proteína inmovilizada se transcribió de manera inversa directamente en la placa de selección con la adición de una mezcla RT (Ronda 1: 100 uL; Ronda 2+: 50 uL; que contienen el cebador 3' de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y Thermoscript RT (Invitrogen Cat. # 11146-016, Carlsbad, CA) , seguido por la incubación a 65°C durante 1 hora. El ADNc resultante se utilizó como una plantilla para la PCR (Ronda 1: 500 uL; Ronda 2+: 250 uL; que contienen el cebador 5' de acuerdo con la (SEQ ID NO 9) , el cebador 3' de acuerdo con la (SEQ ID NO 10) , y la Taq polimerasa (New England Biolabs Cat. # M0267L, Beverly, MA) ) . Las reacciones de la PCR se hicieron bajo las siguientes condiciones: a) paso de desnaturalización: 94 °C durante 2 minutos; b) pasos de ciclización: 94 °C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto; c) paso de extensión final: 72°C durante 3 minutos. Los ciclos se repitieron hasta que se generó suficiente producto de la PCR. El número mínimo de ciclos requeridos para generar suficiente producto de la PCR se reporta en las Tablas 1 y 2 como el "Umbral de la PCR". El ADN de la plantilla de la recolección amplificado, se precipitó a continuación con isopropanol y la mitad del producto de la PCR se utilizó como plantilla para la transcripción del ARN de la recolección para la siguiente ronda de selección. La recolección de ARN transcrito se purificó con gel utilizando un gel de poliacrilamida al 10% en cada tercera ronda. Cuando no se purificó con gel, la recolección del ARN transcrito se desaló utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) . En todos los casos, un equivalente a un décimo del producto de la transcripción total se utilizó como la recolección inicial para la ronda de selección posterior.

Tabla 1. Condiciones de selección del dominio Al de vWF humano utilizando una recolección rRfY Tabla 2. Condiciones de selección del dominio Al de vWF de conejo utilizando una recolección de rRfY Análisis de la Unión del dominio Al de vWF El progreso de la selección se verificó utilizando un ensayo de unión al filtro emparedado. El ARN de la recolección marcado con 5'-32P (concentración en trazas), se incubó con ningún control de la proteína objetivo, el dominio Al de vWF humano 100 nM (SEQ ID NO 4) o el dominio Al de vWF de conejo 100 nM (SEQ ID NO 6) en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de ARNt, y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón (en un volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se aplicó a un filtro de nitrocelulosa y nylon emparedado en un aparato de transferencia por puntos (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . El porcentaje del ARN de la recolección unido a la nitrocelulosa, se calculó después de las Rondas 6, 9 y 12 con una selección de tres puntos (dominio Al de vWF humano 100 nM, dominio Al de vWF de conejo 100 nM, y un sin control del objetivo) . La unión de la recolección se comparó con aquélla del ARN de la recolección sin tratar (Ronda 0) . Los resultados de los análisis de unión de la recolección de rRfY se encuentran en la Tabla 3.

Tabla 3. Ensayos de unión de la recolección para la selección rRfY del dominio Al de vWF Cuando se observó una relación positiva significativa de unión del ARN en la presencia del dominio Al de vWF humano o de conejo versus la ausencia de la proteína, las recolecciones se clonaron utilizando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen, Cat. # 45-0641, Carlsbad, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las plantillas de la recolección de la Ronda 9 y 12 se clonaron y secuenciaron (125 secuencias totales) , produciendo 48 clonas únicas. Todas las clonas únicas se transcribieron, desalaron, marcaron en el extremo con 5-32P, y se probaron en una selección de transferencia por puntos de 3 puntos (sin control del o jetivo de la proteína, dominio Al de vWF humano 100 nM (SEQ ID NO 5, Figura 3) , o dominio Al de vWF de conejo 100 nM (SEQ ID NO 6, Figura 3) . Los datos se presentan en la tercera y cuarta columnas de la Tabla 4 siguiente, como la relación de la fracción del aptámero unido a la nitrocelulosa en la presencia de la proteína objetivo a la fracción del aptámero unida en ausencia de la proteína objetivo. Basándose en esta selección inicial, se determinaron las KD para 12 de las mejores secuencias que se unen dependiendo del vWF utilizando el ensayo de transferencia por puntos y se reportan en la columna 5 de la Tabla 4 siguiente. Para la determinación de la KD, los transcriptos del aptámero se purificaron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 10%, se marcaron en el extremo 5' con ATP ?-32P. Una titulación de 8 puntos del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5) , se utilizó en el ensayo de transferencia por puntos (1 uM, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0 nM) , y los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software) . Para todos los ensayos de la transferencia por puntos utilizados para determinar las KD de la clona única en los Ejemplos descritos en la presente, la proteína objetivo, por ejemplo, el dominio Al de vWF humano, se diluye con amortiguador de PBS de Dulbecco IX, que incluye 0.1 mg/mL de BSA y se incubó con el aptámero marcado durante 30 minutos a 24 °C antes de la filtración y la cuantificación.

Tabla 4. Actividad de unión del aptámero rRfY del dominio Al de vWF humano y de conejo * (ND = no se realizó) * utilizó el dominio Al de vWF humano SEQ ID NO 5 para la selección del aptámero y las KD del aptámero Las secuencias de ácidos nucleicos de los aptámeros rRfY caracterizados en la Tabla 4 anterior, se proporcionan a continuación. La secuencia única de cada aptámero siguiente empieza en el nucleótidos 18, seguido inmediatamente por la secuencia GGAGCGCACTCAGCCAC (SEQ ID NO 221) , y corre hasta que se encuentra con la secuencia de ácidos nucleicos fija en el extremo 3' TTTCGACCTCTCTGCTAGC (SEQ ID NO 222) . A menos que se indique de otra manera, las secuencias individuales listadas a continuación se representan en la orientación 5' a 3' y se seleccionaron bajo condiciones SELEX™ de rFfY, en donde las purinas (A y G) son 2' -OH (ribo) y las pirimidinas (U y C) son 2' -fluoro.

(AMX201.B1) SEQ ID NO 11 GGAGCGCACUCAGCCACAGAGCCCUGAGUGUAUGAUCGCCUAGAUCUAUCGAUGCUUUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX198.G1) SEQ ID NO 12 GGAGCGCACUCAG(XACAACACUAAUGGGGAAAGUUCAAGGAUUCUUGACCGGUsCGUUUCGACsJCUCUsCUAsC (AMX201.H3) SEQ ID NO 13 GGAGCGCACUCAGCCACUAACGGUUGAUCUCAGGACUAAAUAGUCAACAAGGAUGCGUUUCGACCUCUCUsCUAGC (AMX201.B3) SEQ ID NO 14 GGAGCGCACUCAGCCACAGAGCCCUGAGUGUAUGAUCGCCGAGAUCUAUCGAUGCUUUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.G1) SEQ ID NO 15 GGAGCGCACUCAGCCACGCUCGGUGGGGAAAUUUUAGCCUAAUUGGCUACUUGUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX198.C6) SEQ ID NO 16 GGAGCGCACUCAGCCACGGUsGUCAGUCAGUGAUAUsAUUAAGUUCAGCUGUGGCUGUUUCsACCUCUCUGCUAGC (AMX201.B11) SEQ ID NO 17 GGAGCGCACUCAGCCACACCGAGGCUGGAUAUCUACGAGAGGAAGUGCUGCUUGAAUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.D10) SEQ ID NO 18 GGAGCGCACUCAGCCACACUGAGGCUGGAUAUCUACGAGAGGAAGUGCUGCUUGGAUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX198.C10) SEQ ID NO 19 GGAGCGCACUCAGCCACUGGUCCUUAGCUAGUUGUACUAGCGACGCGUUCAGGUGGUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.H4) SEQ ID NO 20 GGAGCGCACUCAGCCACUAACGGUUGAUCUCAGGACUAAUAGUCAACAAGGAUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.G9) SEQ ID NO 21 GGAGCGCACUCAGCCACUAACGGCUGAUCUCAGGACUAAAUAGUCAACAAGGAUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.H11) SEQ ID NO 22 GGAGCGCACUCAGCCACCCUGUCGUCUUUUGGUAGUCAGCCAAAAGCUAGUUGGUUGUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.C8) (ARC840) SEQ ID NO 23 GGAGCGCACU CAGCCACCCUCGC4AG CAUTJUUAAGAAUGA CTUGUGCCGCUGGCUG UUUUCGACCUCUCUGCUAG C (AMX201.H1) SEQ ID NO 24 sGAGCGCACUCAGCCACUUUACGGUGAAAGUCUCUCGGGGUUCCGAGUUACGGUGCGUUUCGACCUCUCUGCUAsC (AMX198.E11) SEQ ID NO 25 GGAGCsCACUCAGCCACGGUAACAUUGUUUCCGGCGAUUCUUUGAACGCCGUCGUGGUUUCGACCUCUCUsCUAGC (AMX198.A10) SEQ ID NO 26 GGAGCGCACUCAGCCACCAGUUAUGCUGGCUUUGGUCUUUGACUGUCUGAGUGUUCsUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.D4) SEQ ID NO 27 GGAGCGCACUCAGCCACUGGGGCUGAUCUCGCACGAUAGUUCGUGUCAAGGAUGCGUUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201 . D3 ) SEQ I D NO 28 GGAGCGCACUCAGCCACGCCCACGUCAAAUUAUAGUCUACUUUGAUGUGCCCGUGGUUaCGACCUCUCUGCUAGC (AMX201.A8) SEQ ID NO 29 GGAGCGCACUCAGCCACGCUGUACACUGAUGUUGUAACAUGUACCCCCUGGCUGUUUCGACCUCUCUGCUAGC (AMX198.E5) SEQ ID NO 30 GGAGCGCACUCAGCCACUUCGACUUUCAUGUCUGAAGUCCCUGCAGUGCGAGAGACGUUUCGACCUCUCUGCUAGC Aunque no se desea estar apegado a ninguna teoría, basándose en los datos de la unión presentados en la Tabla 4 anterior y la actividad en los ensayos celulares presentados en la Tabla 21 siguiente, para los aptámeros de longitud completa de esta selección SELEX™ y las secuencias de los aptámeros reducidas al mínimo (véase el Ejemplo 2a siguiente) , la estructura secundaria genérica predicha y la secuencia de los ácidos nucleicos central predicha requeridas para unirse al objetivo del vWF de todas las modalidades de la invención, derivadas de esta selección del aptámero, se describen en la Figura 10 como la SEQ ID NO 217 (RNAstructure, Versión 4.1, Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, SJ.; Zuker, M.; y Turner, D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secundary structure", 2004. Actas de sesiones de la Academia Nacional de Ciencias, EUA, 101, 7287-7292) . ARC840 (SEQ ID NO 23), es un ejemplo de un aptámero que tiene la secuencia descrita en la Figura 10, en donde las regiones en negrillas, subrayadas, mostradas en la secuencia listada anteriormente, denotan las bases requeridas.

EJEMPLO IB: Selección de los aptámeros del dominio Al de vWF de rRdY Las selecciones se realizaron para identificar los aptámeros que se unen a (1) el dominio Al de vWF humano, (2) el dominio Al de vWF de conejo, o (3) los dominios Al de vWF humano y de conejo utilizando una recolección de nucleótidos que consiste de los nucleótidos 2' -OH purina y desoxi-pirimidina (rRdY) . La estrategia de selección proporcionó aptámeros con alta afinidad específicos para los dominios Al de vWF humano y de conejo, que se han inmovilizado en una placa hidrofóbica.

Preparación de la Recolección Se sintetizó una plantilla de ADN con la secuencia 5 ' -GAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC-3' (SEQ ID NO 8), utilizando un sintetizados de ARN ABl EXPEDITE™, y se desprotegió mediante métodos estándar. La serie de N en la plantilla de ADN (SEQ ID NO 8), puede ser cualquier combinación de nucleótidos y da lugar a la región de la secuencia única de los aptámeros resultantes. La plantilla se amplificó con los cebadores 5' -TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3' (SEQ ID NO 9) y 5'-GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3' (SEQ ID NO 10) y a continuación se utilizó como una plantilla para la transcripción in vitro con la ARN polimerasa T7 _ (Y639F) . Las transcripciones se incubaron típicamente a 37 °C durante la noche, utilizando Tris 40 mM pH 8.0, DTT 40 mM, espermidina-HCl 1 mM, Tritón X-100 al 0.002%, PEG-8000 al 4% (peso/volumen) , MgCl2 12 mM, dCTP 3 mM, dTTP 3 mM, rGTP 3 mM, rATP 3 mM, pirofosfatasa inorgánica 0.5X y polimerasa T7 IX (Y639F) , y aproximadamente el ADN de la plantilla 0.5 µM.

Selección Para la selección del vWF humano, las primeras diez rondas se iniciaron inmovilizando 24 pmoles del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 4) a la superficie de una placa hidrofóbica Nunc Maxisorp (Nunc, Cat. # 446612 Rochester, NY) durante 1 hora a temperatura ambiente en 100 µL de PBS de Dulbecco IX (Gibco BRL Cat. # 14040-133, Carlsbad, CA) . Para las Rondas once y doce, 12 pmoles de vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7, Figura 4) se inmovilizaron en la placa hidrofóbica. Para la selección del vWF de conejo, cada ronda se inició inmovilizando 24 pmoles del dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) bajo las mismas condiciones. Para las primeras dos rondas de la selección alternada de humano/conejo, 12 pmoles del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 4) y 12 pmoles del dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6), se inmovilizaron a una .placa hidrofóbica como se describió previamente. En las rondas posteriores de la selección alternada, el objetivo de la proteína se alternó cada ronda entre el dominio Al de vWF humano y de conejo (SEQ ID NOS 4 y 5, respectivamente) , excepto en la ronda 11, en donde se utilizó vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7) . En todos los casos, después de una hora de inmovilización de la proteína, el sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. El pozo inmovilizado con las proteínas se bloqueó a continuación con 100 uL de amortiguador de bloqueo (PBS de Dulbecco IX con BSA al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. En la Ronda uno, 333 pmoles del ARN de la recolección (2 x 1014 moléculas únicas), se incubaron en 100 µL de PBS de Dulbecco IX en los pozos que contienen el objetivo de la proteína inmovilizada bloqueada con BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. En las rondas posteriores, se agregaron lavados adicionales para incrementar el rigor del paso de la selección positiva (véanse las Tablas 5, 6 y 7) . Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se incluyeron dos pasos de selección negativa antes del paso de selección positiva. Primero, el ARN de la recolección se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un pozo no bloqueado para eliminar cualesquier secuencias de unión al plástico de la recolección. En el segundo paso de selección negativa, el ARN se transfirió a un pozo bloqueado con BSA (que no contiene el objetivo de la proteína) durante 1 hora a temperatura ambiente, para eliminar cualesquier secuencias que se unen al BSA de la recolección antes de la selección positiva. Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se rociaron 0.1 mg/mL de ARNt y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón en la reacción de selección positiva como competidores no específicos. En todos los casos, el ARN de la recolección unido al objetivo de la proteína inmovilizada se transcribió de manera inversa directamente en la placa de selección con la adición de una mezcla RT (Ronda 1: 100 uL; Ronda 2+: 50 uL; que contienen el cebador 3' de acuerdo con la (SEQ ID NO 10) y Ther oscript RT (Invitrogen Cat. # 11146-016, Carlsbad, CA) , seguido por la incubación a 65°C durante 1 hora. El ADN resultante se utilizó como una plantilla para la PCR (Ronda 1: 500 uL; Ronda 2+: 250 uL; que contienen el cebador 5' de acuerdo con la (SEQ ID NO 9) , el cebador 3' de acuerdo con la (SEQ ID NO 10) , y la Taq polimerasa (New England Biolabs Cat. # M0267L, Beverly, MA) ) . Las reacciones de la PCR se hicieron bajo las siguientes condiciones: a) paso de desnaturalización: 94 °C durante 2 minutos; b) pasos de ciclización: 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 minuto; c) paso de extensión final: 72 °C durante 3 minutos. Los ciclos se repitieron hasta que se generó suficiente producto de la PCR. El número mínimo de ciclos requeridos para generar suficiente producto de la PCR se reporta en las Tablas 5, 6 y 7 como el "Umbral de la PCR". El ADN de la plantilla de la recolección amplificado, se precipitó a continuación con isopropanol y la mitad del producto de la PCR se utilizó como una plantilla para la transcripción del ARN de la recolección para la siguiente ronda de selección. La recolección de ARN transcrito se purificó con gel utilizando un gel de poliacrilamida al 10% cada dos rondas. Cuando no se purificó con gel, la recolección del transcrito se desaló utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) . En todos los casos, un equivalente a un décimo del producto de la transcripción total se utilizó como la recolección inicial para la ronda de selección siguiente.

Tabla 5. Condiciones de selección del dominio Al de vWF humano utilizando una recolección rRdY Tabla 6. Condiciones de selección del dominio Al de vWF de conejo utilizando una recolección de rRdY Tabla 7. Condiciones de selección alternadas del dominio Al de vWF de humano/conejo utilizando una recolección de rRdY Análisis de la Unión de vWF El progreso de la selección se verificó utilizando un ensayo de unión al filtro emparedado. El ARN de la recolección marcado con 5'-32P (concentración en trazas), se incubó con ningún control de la proteína objetivo, el dominio Al de vWF humano 100 nM o el dominio Al de vWF de conejo 100 nM, en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de ARNt, y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón (en un volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se aplicó a un filtro de nitrocelulosa y nylon emparedado en un aparato de transferencia por puntos (Schleícher y Schuell, Keene, NH) . El porcentaje del ARN de la recolección unido a la nitrocelulosa, se calculó después de las Rondas 6, 9 y 12 con una selección de tres puntos (dominio Al de vWF humano 100 nM, dominio Al de vWF de conejo 100 nM, y un sin control del objetivo). La unión de la recolección se comparó con aquélla del ARN de la recolección sin tratar (Ronda 0) . Los resultados de los análisis de unión de la recolección de rRdY se encuentran en la Tabla 8.

Tabla 8. Ensayos de unión de la recolección para la selección rRdY del dominio Al de vWF Cuando se observó una relación positiva significativa de unión del ARN en la presencia del dominio Al de vWF humano o de conejo (SEQ ID NOS 4 y 6, respectivamente) versus la ausencia de la proteína, las recolecciones se clonaron utilizando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen, Cat. # 45-0641, Carlsbad, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las plantillas de la recolección de la Ronda 9 y 12 se clonaron y secuenciaron (185 secuencias totales) , produciendo 78 clonas únicas en 3 familias de secuencias. Todas las clonas únicas se transcribieron, desalaron, marcaron en el extremo con 5-32P, y se analizaron en una selección de transferencia por puntos de 3 puntos (sin control del objetivo de la proteína, dominio Al de vWF humano 100 nM (SEQ ID NO 5), o dominio Al de vWF de conejo 100 nM (SEQ ID NO 6) . Los datos se presentan en la tercera y cuarta columnas de la Tabla 9 siguiente, como la relación de la fracción del aptámero unido a la nitrocelulosa en la presencia de la proteína objetivo a la fracción del aptámero unida en ausencia de la proteína objetivo. De las tres familias de secuencias, los miembros de la Familia #1 y #2 y dos aptámeros individuales que no son de la familia, se unieron al dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5) y el dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) . Basándose en esta selección inicial, se determinaron las KD para 16 de las mejores secuencias que se unen dependiendo del vWF utilizando el ensayo de transferencia por puntos. Para la determinación de la KD, los aptámeros se purificaron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes y se marcaron en el extremo 5' con ATP ?-32P . Una titulación de la proteína de 6 puntos del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5) , se utilizó en el ensayo de transferencia por puntos (333 nM, 100 nM, 33 nM, 10 nM, 3 nM, 0 nM) en DPBS IX más 0.1 mg/mL de BSA a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software). Los resultados de la caracterización de la unión a la proteína se tabulan en la columna final de la Tabla 9 siguiente .

Tabla 9. Actividad de unión del aptámero rRdY del dominio Al de vWF humano y de conejo* * utilizó el dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5) para la selección del aptámero y las KD del aptámero ND = no se realizó Las secuencias de ácidos nucleicos de los aptámeros rRdY caracterizados en la Tabla 9 anterior, se describen a continuación. La secuencia única de cada aptámero siguiente empieza en el nucleótido 18, seguido inmediatamente por la secuencia GGAGCGCACTCAGCCAC (SEQ ID NO 221) , y corre hasta que se encuentra con la secuencia del ácido nucleico fija en el extremo 3' TTTCGACCTCTCTGCTAGC (SEQ ID NO 222) . A menos que se indique de otra manera, las secuencias individuales listadas a continuación se representan en la orientación 5' a 3' y se seleccionaron bajo las condiciones SELEX™ de rRdY, en donde el adenosin trifosfato y el guanosin trifosfato son 2 '-OH y el citidin trifosfato y el timidin trifosfato son desoxi.

SELEX™ rRdY de vWF, Familia #1 Los motivos que se unen a la proteína objetivo central para la Familia #1 rRdY de vWF, se muestran en negrillas y subrayadas en las secuencias siguientes: (AMX203.G9) (ARC842) SEQ ID NO 44 GGAGCGCACT CAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTG GTGTCGAAGGGTTTCGACCTCTCTGCtAGC (AMX203.F9) SEQ ID NO 47 OGAGCGCACTCAGC CACTGAAGGGTAAGGACGAGGAGGGTATACAGTG TGCGCGTGTATTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX203.A6) SEQ ID NO 42 GGAGCGCACTCA GCCACCACGGGGACGGGTAGGGCGGGCGAGGTGGTGGC ATTAGCGTTTCGACCTCTCTGCTAGC La estructura secundaria y las secuencias del ácido nucleico central predichas, requeridas para unirse al objetivo de vWF de algunas modalidades de la invención, se describen en la Figura 12 como la SEQ ID NO 218.

SELEX™ rRdY de vWF, Familia #2 (AMX203.D6) SEQ ID NO 31 GsAscsCACTCAGCCACAGTTCtGtCGGTGATGAATTAGCGCGAGAGCTGTGGGACGTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX205.H8), SEQ ID NO 32 GGAGCGCACTCAGCCACAAACGGACGGTGATGGATTAACGCGGGTTTATGsCAAGGTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX205.H11) , SEQ ID NO 33 GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCtCTGCTAGC (AMX205.D11) , SEQ ID NO 35 GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACsGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCA?TrCGACCTCTCTGCTAGC (AMX206.F9), SEQ ID NO 36 GGAGCsCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGsCTCCGTGGTACACATrTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX206.H9) , SEQ ID NO 37 GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCsGTsATGsATTAGCGCGGTTCCGTGGTACACCTTTCGACCTCTCTsCTAsC (AMX206.A10) , SEQ ID NO 38 GGAGCGCACTCAGCCACGGCATGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX205.F9) , SEQ ID NO 39 GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCsGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACGCCTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX206.E7) , SEQ ID NO 40 GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACACCTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX206.D7) , SEQ ID NO 41 GGAsCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTTATTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX203.A1) , SEQ ID NO 43 GGAGCGCACTCAGCCACAGTTCTGTCsGTGATGAATTAGCGCGGGAGCTGTGGGACGTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX205.H9) , SEQ ID NO 45 GGAGCGCACTCAGCCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGGAGAAGATGCGCTGTtGTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX206.D8), SEQ ID NO 46 GGAGCGCACTCAGCCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGGATCTTAACGTGCGAGTTTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX205.G9) , SEQ ID NO 48 GGAGCGCACTCAsCCACAACTGGTTGTCGGTGATGGCATTAACGCGGACCAGGCATGTrTCGACCTCTCTGCTAGC (AMX205.H10) , SEQ ID NO 50 GGAGCsCACTCAsCCACTGTTGCCGACGGTGATGTAtTAACGCGGGCAACGTTGGTGTTTCGACCTCTCTGCTAGC Secuencias únicas SELEX rRdY de vWF El motivo que se une al ácido nucleico central predicho para la SEQ ID NO 49 se muestra en negrillas y subrayado a continuación: (AMX205.F7) (ARC 841) SEQ ID NO 49 GGAGCGCACtCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCrGTTTGTTTCGACCtCTCTGCTAGC (AMX205 .A7 ) , SEQ ID NO 34 GGAGCGCACTCAGCCACTCAAGGGGGTCGCGTGGGGACGAAGGGT GCAGTGTGTCGTTTCGACCTCTCTGCTAGC Las secuencias del ácido nucleico central y la estructura secundaria predichas , requeridas para unirse al obj etivo del vWF de algunas modalidades de la invención, se describe en la Figura 13 como la SEQ ID NO 219 .

EJEMPLO 1C : Selección #1 de los aptámeros del dominio Al de vWF de ADN Las selecciones se realizaron para identificar los aptámeros que se unen (1) el dominio Al de vWF humano, (2) el dominio Al de vWF de conejo, o (3) los dominios Al de vWF humano y de conejo, utilizando una recolección de nucleótidos que consiste de los desoxinucleótidos (ADN) . La estrategia de selección proporcionó aptámeros con alta afinidad, específicos para los dominios Al de vWF humano y de conejo que se han inmovilizado en una placa hidrofóbica.

Preparación de la Recolección Se sintetizó una plantilla de ADN con la secuencia ' -CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC-3' (SEQ ID NO 51) (ARC 493) , utilizando un sintetizador de ADN ABl EXPEDITE™, y se desprotegió mediante métodos estándar. La serie de N en la plantilla de ADN (SEQ ID NO 51) , puede ser cualquier combinación de nucleótidos y da lugar a la región de la secuencia única de los aptámeros resultantes. La plantilla se amplificó mediante PCR con los cebadores (5'-CTACCTACGATCTGACTAGC-3' ) (SEQ ID NO 52) y (5'-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(0H)-3' ) (SEQ ID NO 53) bajo condiciones estándar. El producto de la PCR se sometió a hidrólisis alcalina (NaOH 333 mM, 90°C, 15 minutos) , seguido por precipitación. Las hebras se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10%, y la recolección del ADN de una sola hebra, que migra con una movilidad más baja, se escindió del gel, se eluyó de manera pasiva y se precipitó con isopropanol.

Selección Para la selección del vWF humano, las primeras diez rondas se iniciaron inmovilizando 24 pmoles del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 4) a la superficie de una placa hidrofóbica Nunc Maxisorp (Nunc, Cat. # 446612 Rochester, NY) durante 1 hora a temperatura ambiente en 100 µL de PBS de Dulbecco IX (Gibco BRL Cat. # 14040-133, Carlsbad, CA) . Para las Rondas once y doce, 12 pmoles de vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7) , se inmovilizaron en la placa hidrofóbica. Para la selección del vWF de conejo, cada ronda se inició inmovilizando 24 pmoles del dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) bajo las mismas condiciones. Para las primeras dos rondas de la selección alternada de humano/conejo, 12 pmoles del dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 4) y 12 pmoles del dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) , se inmovilizaron en una placa hidrofóbica como se describió previamente. En las rondas posteriores de la selección alternada, el objetivo de la proteína se alternó cada ronda entre el dominio Al de vWF humano y de conejo, excepto en la Ronda 11, en donde se utilizó el vWF de longitud completa humano (SEQ ID NO 7) . En todos los casos, después de una hora de inmovilización de la proteína, el sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. El pozo inmovilizado con las proteínas se bloqueó a continuación con 100 uL de amortiguador de bloqueo (PBS de Dulbecco IX con BSA al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. En la Ronda uno, 333 pmoles del ADN de la recolección (2 x 1014 moléculas únicas), se incubaron en 100 µL de PBS de Dulbecco IX en los pozos que contienen el objetivo de la proteína inmovilizada bloqueada con BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó a continuación y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. En las rondas posteriores, se agregaron lavados adicionales para incrementar el rigor del paso de la selección positiva (véanse las Tablas 10, 11 y 12) . Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se incluyeron dos pasos de selección negativa antes del paso de selección positiva. Primero, el ADN de la recolección se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un pozo no bloqueado para eliminar cualesquier secuencias de unión al plástico de la recolección. En el segundo, paso de selección negativa, el ADN se transfirió a un pozo bloqueado con BSA (que no contiene el objetivo de la proteína) durante 1 hora a temperatura ambiente, para eliminar cualesquier secuencias que se unen al BSA de la recolección antes de la selección positiva. Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se rociaron 0.1 mg/mL de ARNt y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón en la reacción de selección positiva como competidores no específicos. En todos los casos, el ADN de la recolección unido al objetivo de la proteína inmovilizada se eluyó con 2 lavados x 100 µL con amortiguador de elusión (precalentado a 90°C, Urea 7 M, NaOAc 100 mM pH 5.3, EDTA 3 mM) durante cinco minutos. .Ambas elusiones se recolectaron y precipitaron mediante la adición de etanol, a continuación se amplificaron en una reacción de PCR inicial (reacciones de 100 µL incluyendo el cebador 5' de acuerdo con la SEQ ID NO 52, y el cebador 3' de acuerdo con la SEQ ID NO 53, y la Taq polimerasa (New England BioLabs, Cat. # M0267L, Beverly, MA) . Las reacciones de la PCR se hicieron bajo las siguientes condiciones: a) paso de desnaturalización: 94°C durante 2 minutos; b) pasos de ciclización: 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto; c) paso de extensión final: 72 °C durante 3 minutos. Los ciclos se repitieron hasta que se generó suficiente producto de la PCR. El número mínimo de ciclos requeridos para generar suficiente producto de la PCR se reporta en las Tablas 10, 11 y 12 como el "Umbral de la PCR". 10 µL del producto de la PCR se agregaron a otros 300 µL de la mezcla de la PCR para una reacción de PCR a escala preparativa. El producto de la PCR a escala preparativa se precipitó con etanol y se sometió a hidrólisis alcalina (NaOH 333 mM, 90°C, 15 minutos) . Las hebras se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y la recolección del ADN de una sola hebra, que migra con una movilidad más baja, se escindió del gel, se eluyó de manera pasiva y se precipitó con isopropanol. En todos los casos, un equivalente a la mitad de todo el producto del ADN de una sola hebra se utilizó como la recolección inicial para la ronda de selección posterior.

Tabla 10. Condiciones de selección del dominio Al de v F humano utilizando una recolección de ADN Tabla 11. Condiciones de selección del dominio Al de vWF de conejo utilizando una recolección de ADN Tabla 12. Condiciones de selección alternadas del dominio Al de vWF de humano/conejo utilizando una recolección de ADN Análisis de la Unión de vWF El progreso de la selección se verificó utilizando un ensayo de unión al filtro emparedado. El ADN de la recolección marcado con 5'-32P (concentración en trazas), se incubó con ningún control de la proteína objetivo, el dominio Al de vWF humano 100 nM (SEQ ID NO 4) o el dominio Al de vWF de conejo 100 nM (SEQ ID NO 6), en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de ARNt, y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón en un (volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se aplicó a un filtro de nitrocelulosa y nylon emparedado en un aparato de transferencia por puntos (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . El porcentaje del ADN de la recolección unido a la nitrocelulosa, se calculó después de las Rondas 6, 9 y 12 con una selección de tres puntos (sin control del objetivo de la proteína, dominio Al de vWF humano 100 nM (SEQ ID NO 5), dominio Al de vWF de conejo 100 nM (SEQ ID NO 6). La unión de la recolección se comparó con aquélla del ADN de la recolección sin tratar (Ronda 0) . Los resultados de los análisis de unión de la recolección de ADN se encuentran en la Tabla 13.

Tabla 13. Ensayos de unión de la recolección para la selección de ADN del dominio Al de vWF Cuando se observó una relación positiva significativa de unión del ADN en la presencia del dominio Al de vWF humano o de conejo versus la ausencia de la proteína, las recolecciones se clonaron utilizando el equipo de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat. # 45- 0641), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las plantillas de la recolección de la Ronda 9 y 12 se clonaron y secuenciaron (243 secuencias totales) , produciendo 106 clonas únicas dentro de 8 familias de secuencias, 41 de las cuales se unen al objetivo de vWF y caen en las familias descritas a continuación. Todas las clonas únicas se probaron en una selección de transferencia por puntos de 3 puntos (sin control del objetivo de la proteína, dominio Al de vWF humano 100 nM (SEQ ID NO 5), o dominio Al de vWF de conejo 100 nM (SEQ ID NO 6) . Los datos se presentan en la tercera y cuarta columnas de la Tabla 14 siguiente, como la relación de la fracción del aptámero unido a la nitrocelulosa en la presencia de la proteína objetivo a la fracción del aptámero unida en ausencia de la proteína objetivo. Basándose en esta selección inicial, se determinaron las KD para 10 de las secuencias que se unen dependientes del vWF. Para la determinación de la KD, los aptámeros se marcaron en el extremo 5' con ATP ?-32P y se utilizó un ensayo de transferencia por puntos de competencia con una concentración de la proteína constante de 100 nM y una titulación del ADN del competidor frío de 8 puntos (333 nM, 100 nM, 33 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 33 pM, 0 pM) en DPBS IX más 0.1 mg/mL de BSA a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software). Los resultados de la caracterización de la unión a la proteína se tabulan en la Tabla 14.

Tabla 14. Actividad de unión del aptámero de ADN del dominio Al de vWF de humano y de conejo* * utilizó el dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5) para la selección del aptámero y las K del aptámero ND = no se realizó Las secuencias de ácidos nucleicos de los aptámeros de ADN caracterizados en la Tabla 14 anterior, se describen a continuación. La secuencia única de cada aptámero siguiente empieza en el nucleótido 21, seguida inmediatamente por la secuencia CTACCTACGATCTGACTAGC (SEQ ID NO 52), y corre hasta que se encuentra con la secuencia de ácido nucleico fija en el extremo 3' GCTTACTCTCATGTAGTTCC (SEQ ID NO 223) . A menos que se indique de otra manera, las secuencias individuales listadas a continuación se representan en la orientación 5' a 3' y se seleccionaron bajo SELEX™ de ADN, en donde todos los nucleótidos son desoxi .

SELEX™ de ADN 1, Familia #1 Las secuencias de unión del ácido nucleico central predichas para el SELEX™ de ADN, Familia #1, se muestran en negrillas y subrayadas para el aptámero AMX199.B3 (SEQ ID NO 54) y la secuencia de consenso (SEQ ID NO 95) a continuación.

(AMX199.B3) SEQ ID NO 54 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCnrGCTGGCTGCTrACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.C11) SEQ ID NO 59 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTsctGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCrrACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.G11) SEQ ID NO 56 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAACGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.D11) SEQ ID NO 55 CTACCTACGATCTGACtAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCtGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.D8) SEQ ID NO 58 CTACCTACGAtCTGACTAGCGGAATGAGAATGTTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.D11) SEQ ID NO 57 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATAAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.F7) SEQ ID NO 61 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.A7) SEQ ID NO 62 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGTTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX202.D6) SEQ ID NO 91 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.B1) SEQ ID NO 64 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCCCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.G10) SEQ ID NO 60 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGTTGGTGGA'I OCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.B8) SEQ ID NO 66 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAsAATGCTGATGGATTGCACAGGTCtGCTGGCTsCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.B9) SEQ ID NO 63 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGACTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX202.B8) SEQ ID NO 90 CTACCTACGATCTGACTAsCGGAATGAGTATGCTsATsGATTGCTCAGGTCTGCTssCTGCTrACTCTCATGTAGTTCC (AMX202.H10) SEQ ID NO 89 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGsCTGGTGGATrGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.F9) SEQ ID NO 69 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGATGGATTGGTCAGGTCTGCTGGCTGCTGACTCTCATGTAGTTCC (AMX202.A3) SEQ ID NO 92 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGCGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.C2) SEQ ID NO 65 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCCCAGGTCTGCTGsCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.F11) SEQ ID NO 67 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATK3CTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.D1) SEQ ID NO 68 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGATGGATTGCTCAGG CTACTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.C4) SEQ ID NO 72 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAssATGCTGATGGATTGCACAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATsTAGTTCC (AMX200.D3) SEQ ID NO 71 CTACCTACGATCTGACTAGCGCAATGAGGATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTsCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.B7) SEQ ID NO 70 CTACCTACGATCTGACTAGCGGGATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.E8) SEQ ID NO 73 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGTTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC La secuencia de consenso para el SELEX™ de ADN 1, Familia #1 es como sigue: SEQ ID NO 95 CrACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGRATGYTGRTGGATTGCHCAGGTCmYTGRCTGCrrACTCTCATGTAGTl'CC En donde Y = C o T, R = A o G y H = A, C o T SELEX™ de ADN 1 , Familia #2 (AMX199 . F10 ) SEQ ID NO 74 C? CCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCCGTTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199 . F6 ) SEQ ID NO 75 CTACCTACGATCTGACTAsCGAAACACTAGGTTGsTTAGGATTGGtGTGTtCCCGCTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199 . H7 ) SEQ ID NO 78 CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTGCC (AMX199 . G5 ) SEQ ID NO 76 CTACCtACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTtCCCGCCCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199 . F11 ) SEQ ID NO 77 CtACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCTGCTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199 . A10 ) SEQ ID NO 79 CTACCTACGATCTGACTAGCGGAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGTTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199 . G1 ) SEQ ID NO 80 CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.G4) SEQ ID NO 82 CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGGTTGGTGTGTTCCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX199.F1) SEQ ID NO 81 CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCTATGCTTACTCTCATGTAGTTCC La secuencia de consenso para el SELEX™ de ADN, Familia #2 es como sigue: SEQ ID NO 96 CTACCTACGATCTGACTAGCGRAACACTAGGTTGGTTAGGRTTGGTGTGTTYCYGYYHGCTTACTCTCATGTAGTTCC En donde Y= C o T, R = A o G y H = A, C o T SELEX™ de ADN 1, Familia §3 (AMX199.B6) SEQ ID NO 86 CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGTACCTCCGGCTTACrCTCATGTAGTTCC (AMX199.D8) SEQ ID NO 87 CTACCtACGATCTGACTAGCA?GGGsATTGGCTCCGGGTCTGGCsTsCTTGGCATCTTCGGCTTACTCTCATsTAGTTCC (AMX199.F8) SEQ ID NO 85 CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCACCTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.E10) SEQ ID NO 88 CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTCGGCACCTTTGGCTTACTCTCATGTAsTTCC (AMX202.F6) SEQ ID NO 94 CTACCTACGATCtGACTAGCAAGGGGATtGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTCGGCACCTtCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX202.A8) SEQ ID NO 93 CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGtGCTCGGCACTTCCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC SELEX™ de ADN 1, Familia #4 (AMX200.A11) SEQ ID NO 83 CTACCTACGATCTGACTAGCTGAGTAGTTAGTAACTIT?'ATTATGGTTGGGTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC (AMX200.H8) SEQ ID NO 84 CTACCTACGATCTGACTAGCTGAGTAGTCAGTAATTTTTTATTATGGTTTGGTGGGCCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC EJEMPLO ID: Selección #2 de los aptámeros de vWF de ADN Se hizo un solo conjunto de selecciones de ADN utilizando el vWF humano de longitud completa y el dominio Al de vWF de conejo en una selección cruzada. Aunque no se desea apegarse a ninguna teoría, nuestra hipótesis es que tal selección debe requerir los aptámeros seleccionados de manera exitosa para unirse al vWF de longitud completa, para unirse al dominio Al de manera específica y para reaccionar de manera cruzada entre las proteínas humana y de conejo. La familia de la secuencia dominante de este segundo conjunto de selecciones de ADN se une al vWF humano de longitud completa, al dominio Al de vWF de conejo y es funcional en los ensayos biológicos de FACS y BIPA como se describe en el Ejemplo 3 a continuación. Las selecciones se realizaron para identificar los aptámeros que se unen al vWF humano de longitud completa y al dominio Al de vWF de conejo, utilizando la selección alternada del vWF humano de longitud completa/dominio Al de vWF de conejo. Esta selección utilizó una recolección de nucleótidos que consiste de los desoxinucleótidos (ADN) . La estrategia de selección proporcionó aptámeros con alta afinidad específicos para el vWF humano de longitud completa y el dominio Al de vWF de conejo, que se han inmovilizado en una placa hidrofóbica.

Preparación de la Recolección Se sintetizó una plantilla de ADN con la secuencia 5' -CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC-3' (SEQ ID NO 51) (ARC 493) , utilizando un sintetizador de ADN ABl EXPEDITE™, y se desprotegió mediante métodos estándar. La serie de N en la plantilla de ADN (SEQ ID NO 51) , puede ser cualquier combinación de nucleótidos y da lugar a la región de la secuencia única de los aptámeros resultantes . La plantilla se amplificó mediante PCR con los cebadores (5'-CTACCTACGATCTGACTAGC-3' ) (SEQ ID NO 52) y (5'-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(0H)-3' ) (SEQ ID NO 53) bajo condiciones estándar. El producto de la PCR se sometió a hidrólisis alcalina (NaOH 333 mM, 90°C, 15 minutos) , seguido por precipitación. Las hebras se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10%, y la recolección del ADN de una sola hebra, que migra con una movilidad inferior, se escindió del gel, se eluyó de manera pasiva y se precipitó con isopropanol.

Selección Para las primeras tres rondas de la selección alternada vWF humano de longitud completa/dominio Al de vWF de conejo, 24 pmoles del vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7) y 24 moles del dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) se inmovilizaron. En las rondas posteriores, el objetivo de la proteína se alternó en cada ronda entre el vWF humano de longitud completa y el dominio Al de vWF de conejo. En todos los casos, después de una hora de inmovilización de la proteína, el sobrenadante se eliminó y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. El pozo inmovilizado con las proteínas se bloqueó a continuación con 100 uL de amortiguador de bloqueo (PBS de Dulbecco IX con BSA al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. En la Ronda uno, 333 pmoles del ADN de la recolección (2 x 1014 moléculas únicas) , se incubaron en 100 µL de PBS de Dulbecco IX en los pozos que contienen el objetivo de la proteína inmovilizada bloqueada con BSA durante 1 hora. El sobrenadante se eliminó a continuación y los pozos se lavaron 4 veces con 120 µL de PBS de Dulbecco IX. En las rondas posteriores, se agregaron lavados adicionales para incrementar el rigor del paso de la selección positiva (véase la Tabla 15). En la ronda 8, la selección se dividió para incluir una condición de lavado con alto contenido de sal como un medio posible para incrementar el rigor del SELEX™ (utilizando PBS de Dulbecco IX + NaCl 400 mM) (véase la Tabla 15) . Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se incluyeron dos pasos de selección negativa antes del paso de selección positiva. Primero, el ADN de la recolección se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un pozo no bloqueado para eliminar cualesquier secuencias de unión al plástico de la recolección. En el segundo paso de selección negativa, el ADN se transfirió a un pozo bloqueado con BSA (que no contiene el objetivo de la proteína) durante 1 hora a temperatura ambiente, para eliminar cualesquier secuencias que se unen al BSA de la recolección antes de la selección positiva. Iniciando en la Ronda 2 y en todas las rondas posteriores, se rociaron 0.1 mg/mL de ARNt y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón en la reacción de selección positiva como competidores no específicos. En todos los casos, el ADN de la recolección unido al objetivo de la proteína inmovilizada se eluyó con 2 lavados x 100 µL con amortiguador de elusión (precalentado a 90°C, Urea 7 M, NaOAc 100 mM pH 5.3, EDTA 3 mM) durante cinco minutos. .Ambas elusiones se recolectaron y precipitaron mediante la adición de etanol, a continuación se amplificaron en una reacción de PCR inicial (reacciones de 100 µL incluyendo el cebador 5' de acuerdo con la SEQ ID NO 52, el cebador 3' de acuerdo con la SEQ ID NO 53, y la Taq polimerasa (New England BioLabs, Cat. # M0267L, Beverly, MA) . Las reacciones de la PCR se hicieron bajo las siguientes condiciones: a) paso de desnaturalización: 94°C durante 2 minutos; b) pasos de ciclización: 94°C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 minuto; c) paso de extensión final: 72 °C durante 3 minutos. Los ciclos se repitieron hasta que se generó suficiente producto de la PCR. El número mínimo de ciclos requeridos para generar suficiente producto de la PCR se reporta en la Tabla 15 como el "Umbral de la PCR". 10 µL del producto de la PCR se agregaron a otros 300 µL de la mezcla de la PCR para una reacción de PCR a escala preparativa. El producto de la PCR a escala preparativa se precipitó con etanol y se sometió a hidrólisis alcalina (NaOH 333 mM, 90°C, 15 minutos) . Las hebras se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y la recolección del ADN de una sola hebra, que migra con una movilidad menor, se escindió del gel, se eluyó de manera pasiva y se precipitó con isopropanol. En todos los casos, un equivalente de la mitad del producto del ADN de una sola hebra se utilizó como la recolección inicial para la ronda de selección posterior.

Tabla 15. Condiciones de selección alternadas de vWF humano de longitud completa/dominio Al de v F de conejo, utilizando una recolección de ADN Análisis de la Unión de vWF El progreso de la selección se verificó utilizando un ensayo de unión al filtro emparedado. El ADN de la recolección marcado con 5'-32P (concentración en trazas), se incubó con ningún control de la proteína objetivo, el vWF humano 100 nM (Calbiochem Cat. # 681300, La Jolla, CA) , o el dominio Al de vWF de conejo 100 nM en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de ARNt, y 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón y 0.1 mg/mL de BSA en un (volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se aplicó a un filtro de nitrocelulosa y nylon emparedado en un aparato de transferencia por puntos (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . El porcentaje del ADN de la recolección unido a la nitrocelulosa, se calculó después de las Rondas 7 y 9 mediante selección con un control del objetivo sin proteína, vWF humano de longitud completa 30 nM/100 nM (Calbiochem Cat. # 681300, La Jolla, CA) , y el dominio Al de vWF de conejo 30 nM/100 nM (SEQ ID NO 6) . La unión de la recolección se comparó con aquélla del ADN de la recolección sin tratar (Ronda 0) . Los resultados de los análisis de unión de la recolección de ADN se encuentran en la Tabla 16 siguiente.

Tabla 16. Ensayos de unión a la recolección de la selección de ADN de vWF humano de longitud completa/dominio Al de vWF de conejo.

Cuando se observa una relación positiva significativa de unión del ADN en la presencia del dominio Al de vWF humano o de conejo versus en la ausencia de la proteína, las recolecciones se clonaron utilizando el quipo de clonación TOPO TA (Invitrogen Cat. # 45-0641, Carlsbad, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las plantillas de la recolección de la Ronda 7 y 11 se clonaron y secuenciaron (218 secuencias totales), produciendo 146 clonas únicas dentro de 12 familias de secuencias, de las cuales, las secuencias de 6 familias mostraron una actividad de unión al objetivo de vWF. Todas las clonas únicas se probaron dos veces en una selección de transferencia por puntos de 3 puntos (sin control del objetivo de la proteína, vWF humano de longitud completa 20 nM (Calbiochem Cat. # 681300, La Jolla, CA) , o dominio Al de vWF de conejo 20 nM. Los datos se presentan en la tercera y cuarta columnas de la Tabla 17 siguiente, como la relación de la fracción del aptámero unido a la nitrocelulosa en la presencia de la proteína objetivo a la fracción del aptámero unida en ausencia de la proteína objetivo. Basándose en esta selección inicial, se determinaron las KD para 3 de las secuencias que se unen dependientes del vWF utilizando en ensayo de transferencia por puntos . Para la determinación de la KD, los aptámeros se marcaron en el extremo 5' con ATP ?-32P y se probaron para la unión directa al vWF humano de longitud completa • y al dominio Al de vWF de conejo. Se utilizó una titulación de proteína de 12 puntos en el ensayo de transferencia por puntos (300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 3 pM, 0 pM) en DPBS IX más 0.1 mg/mL de BSA a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software). Los resultados de la caracterización de la unión a la proteína se tabulan en la Tabla 17 siguiente. Tabla 17. Actividad de unión del aptámero de ADN del vWF humano de longitud completa y el dominio Al del vWF de conejo * * utilizó el vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7) y el dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) para la selección del aptámero y las KD del aptámero ND = no se realizó Las secuencias de ácidos nucleicos de los aptámeros de ADN caracterizados en la Tabla 17 anterior, se describen a continuación. La secuencia única de cada aptámero siguiente empieza en el nucleótido 21, seguido inmediatamente por la secuencia CTACCTACGATCTGACTAGC (SEQ ID NO 52) , y corre hasta que se encuentra con la secuencia del ácido nucleico fija en el extremo 3' GCTTACTCTCATGTAGTTCC (SEQ ID NO 223) . A menos que se indique de otra manera, las secuencias individuales listadas a continuación están representadas en la orientación 5' a 3' y se seleccionaron bajo SELEX™ de ADN, en donde todos los nucleótidos son desoxi .

SELEX™ 2 de ADN de vWF, Familia 1 . 1 Las familias 1.1 y 1.2 proporcionaron el original de ARC1029 (SEQ ID NO 214) . Las secuencias de unión del ácido nucleico central predichas para el Factor de von Willebrand objetivo están subrayadas y se muestran en negrillas para los aptámeros AMX237.E9 (SEQ ID NO 104) y AMX238.H5 (SEQ ID NO 118) siguientes.

AMX237.E9 (SEQ ID NO 104) CTACCTACGATCTGACTAGCrCCAG?GTrTTGtCTAATAACCGTGCGGTGCCrCCGTGAGCTTACrCTCATGTAGTTCC AMX237.B11 (SEQ ID NO 109) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAAT ACCGTGCGGTGCCTCCOTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.A11 (SEQ ID NO 98) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.G5 (SEQ ID NO 106) CTACCT,ACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTtCC AMX238.D8 (SEQ ID NO 111) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAACAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.E2 (SEQ ID NO 102) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTACTCTCATGTAGTTCC AMX237 . H5 ( SEQ ID NO 101 ) CTACCTACGATCTGACGAGCTCCAGTGTTTCATTTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTGACTCTCATGTAGTTCC AMX238 . D5 ( SEQ ID NO 108 ) CTACCTACGATCTGAOTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGTCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237 . A2 ( SEQ ID NO 99 ) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.D12 (SEQ ID NO 100) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.F6 (SEQ ID NO 110) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTp ATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.D11 (SEQ ID NO 105) CTACCTACGATCTGACTAGCTC ^GTGTTTTATATAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGpCC AMX237.B4 (SEQ ID NO 103) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCCAATAACCGTGCGGTGCTTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.F8 (SEQ ID NO 113) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCaAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.C7 (SEQ ID NO 107) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.G6 (SEQ ID NO 112) CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGGGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCC SELEX™ 2 de ADN de vWF, Familia 1.2 AMX238.H5 (SEQ ID NO 118) CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.C11 (SEQ ID NO 119) CTACCTACGAICTGACTAGCGTGCAGtGCCTATTCTAsGCCGTGCGGTGCCTCCGTCAtGCTTACTCTCATGtAGTTCC AMX238.E7 (SEQ ID NO 116) CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTTTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGT?GTTCC AMX237.G6 (SEQ ID NO 114) CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTCCAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTrACTCTCATGTAGtTCC AMX238 . F2 ( SEQ ID NO 120 ) CTACCTACGATCTGACTAGCATGCAGTGCCCATTCTAGGCCGTGCsGTGCCTCCGTCATGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238 . E9 ( SEQ ID NO 115 ) CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCCATCTTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.F3 (SEQ ID NO 117) CtACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGtGCCTATTTTAGGTCGtGCGGGGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.F10 (SEQ ID NO 124) CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCCATTCCAGGCCGTGCGGTATCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.C5 (SEQ ID NO 126) CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCtATCTCAGGCCGTGCGGTATCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.H2 (SEQ ID NO 125) CTACCtACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATCCCAGGCCGTGCGGTAGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGttCC La estructura secundaria y las secuencias del ácido nucleico central predichas, requeridas para la unión al objetivo del vWF de algunas modalidades de la invención, comprendidas en la Familia #1 de esta selección del aptámero, se describen en la Figura 15 como la SEQ ID NO 220.

SELEX™ 2 de ADN de vWF. Familia #2 de Unión AMX237 . C9 ( SEQ ID NO 123 ) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGTGACTTTGTGGAGCTGCGGTrTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237 . F12 ( SEQ ID NO 122 ) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGATTGTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237 . F9 ( SEQ ID NO 121 ) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGATrCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.G7 (SEQ ID NO 134) CTACCTACGATCtGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.A12 (SEQ ID NO 127) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.G4 (SEQ ID NO 136) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGATGCGGTTTGGTTGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.C12 (SEQ ID NO 132) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCCGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.A11 (SEQ ID NO 129) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTCTGGCCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.E6 (SEQ ID NO 131) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACCCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.B8 (SEQ ID NO 128) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTCTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.H8 (SEQ ID NO 135) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGtGGAGCTGCGGTTTGGTCGACATCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.D5 (SEQ ID NO 130) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACACTGTGGAGCTGCGGTTTGGTTGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.H10 (SEQ ID NO 133) CTACCTACGATCTsACTAsCTTGGTAGCGACTCAGAGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.B1 (SEQ ID NO 149) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACAC?GTGGAGCTGCGGTTGGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC La secuencia de consenso para el SELEX™ 2 de ADN, Familia #2, es como sigue: SEQ ID NO 325 CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAG Y GA Y (Y/A) Y (Y/A) G (TÍA) GGAG (C/A) TGCGGT Y TGG YY GAC R TCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC En donde Y = C o T, R = A o G y (Y/A)=C, T o A, SELEX™ 2 de ADN de vWF, Familia #3 de Unión Esta familia es equivalente al SELEX™ 1 de ADN de vWF, Familia #1, descrito anteriormente, en que las secuencias de arabas familias son más de 90% idénticas. \ AMX238.A11 (SEQ ID NO 143) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAsAGTGTTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.C1 (SEQ ID NO 140) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.C6 (SEQ ID NO 144) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTsCTGGTGGATTGCTCAGGtCTGCTsGCTGCTrACTCTCATGTAGTTCC AMX236.C1 (SEQ ID NO 137) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGTTGGTsGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.E10 (SEQ ID NO 138) CTACCTACGATCTGACTAGCGGÁATGAGAATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.F6 (SEQ ID NO 145) CTACCTACGATCTGACTAGCsGAATGAGTATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTsCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.E2 (SEQ ID NO 146) CTACCTACGATCTGACtAGCGGAATGAGTATGCTGAtGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.B12 (SEQ ID NO 141) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATOAGAATGCAGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.A6 (SEQ ID NO 142) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCAGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.F5 (SEQ ID NO 139) CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC SELEX1M 2 de ADN de vWF, Familia #4 de Unión AMX237.G2 (SEQ ID NO 156) CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTTCATATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.C4 (SEQ ID NO 151) CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCCACATrTAT?GGGTTrGGCATTGaGTCTGGCTTACTCTCATGTAGtTCC AMX237.F5 (SEQ ID NO 154) CGACCTACGATCTGACGAGCTTG AGTC? CCACATGTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.H11 (SEQ ID NO 155) -, CTACCTACGATCTGACTAGCTrrCAGTCTTTCACATTTATAGGGTTTGGCATTGsGTCTGGCtTACTCTCATGTAGTrCC AMX238.G4 (SEQ ID NO 147) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGTCGCACTTTTGGTTGGtCTGGTTGGTTCTAAGTGCGCTTACtCTCATGTAGTrCC AMX237.E5 (SEQ ID NO 152) CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCTACATTI'ATAGGsTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238.H9 (SEQ ID NO 148) CTACCTACGATCTGACTAGCTTGTCGCACTTTTGGTTGGTCTCGTTGGTTTTAAGTGCGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX237.F1 (SEQ ID NO 153) CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCCACGTTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTX1ATGTAGTTCC SELEX1M 2 de ADN de vWF, Familia #5 AMX236.G1 (SEQ ID NO 164) CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATGGACTCCGGCTGACTTGT?TAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.B3 (SEQ ID NO 161) CTACCTACGATCTGACTAGCCTTACCTATTCCCTTCTGCGGAATACGTCGAGTACTATGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.F7 (SEQ ID NO 160) CTACCTACGATCTGACTAGCCCCCACTTATCGTGTACCTTATGATATGTCGAATACTCI GCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.H1 (SEQ ID NO 159) CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCCGACTGGTGTTAATCTTCTGAGTGCT ACTCTCATGTAGTTCC Las secuencias de consenso para el SELEX™ 2 de ADN, Familia #5, son como sigue: SEQ ID NO 326 Familia 5.1 = SEQ ID NO 164 y SEQ ID NO 159 CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCYGACTTGTTTTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCC En donde Y = C o T SEQ ID NO 327 Familia 5.2 = SEQ ID NO 161 y SEQ ID NO 160 CTACCTACGATCTGACTAGCC YY AC Y TAT Y (C/G) Y (C/G) T (T/A) C Y (G/T) Y R (G/T) RATA Y GTCGA R TACT (A/C) TGCTTACTCTCATGTAGTTCC En donde Y= C o T, R = A o G SELEX™ 2 de ADN de vWF, Familia #6 AMX238.A3 (SEQ ID NO 150) CTACCTACGATC.TGACTAGCTCAAAGTATTACpAp^ AMX238.F7 (SEQ ID NO 163) CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCATCTTTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX236.C9 (SEQ ID NO 158) CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATTATTTTTTTATTGCGATCGTATTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238 . D9 ( SEQ ID NO 162 ) CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTGCTGGGAAAAATCATTTGGTATTTCGATCGTATTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC AMX238 . A12 ( SEQ ID NO 157 ) CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATrATTTrTTTATTTCGATCGTATATGCTTACTCTCATGTAGTTCC EJEMPLO 2: COMPOSICIÓN Y OPTIMIZACION DE LA SECUENCIA Y SECUENCIAS EJEMPLO 2A: Truncamiento de los aptámeros de vWF rRfY Basándose en los análisis de unión de vWF descritos en el Ejemplo 1 anterior, y los datos del ensayo basados en las células descritos en el Ejemplo 3 siguiente, el aptámero ARC840 (AMX201.C8) (SEQ ID NO 23), se eligió de las selecciones de rRfY para una caracterización adicional. Con el fin de identificar los elementos estructurales centrales requeridos para la unión a vWF, se determinó el límite 3' de ARC840 (AMX201.C8) (SEQ ID NO 23). El transcripto de ARN de longitud completa se marcó en el extremo 5' con ATP ?-32P y polinucleótido cinasa T4. Los ligandos radiomarcados se sometieron a hidrólisis alcalina parcial, y a continuación se unieron selectivamente en solución al dominio Al del Factor de von Willebrand humano (SEQ ID NO 5) a 500 nM antes de pasarse a través de los filtros de nitrocelulosa. Tanto los oligonucleótidos retenidos como los no retenidos se resolvieron de manera separada en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 8%. El oligonucleótido más pequeño unido a vWF define el límite 3' . Basándose en los experimentos del límite, así como la inspección visual de los pliegues predichos, se diseñó un panel de secuencias reducidas al mínimo. Los pliegues de todas las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se predijeron utilizando RNAstructure, Versión 4.1, descargado de la Universidad de Rochester. RNAstructure es una implementación del Windows del algoritmo de Zuker para la predicción de la estructura secundaria del ARN basándose en la reducción al mínimo de la energía libre (Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, SJ. ; Zuker, M.; y Turner, D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure", 2004. Actas de sesiones de la Academia Nacional de Ciencias, EUA, 101, 7287-7292). RNAstructure 4.1, utiliza los parámetros termodinámicos más actuales del laboratorio Turner. Para los aptámeros rRfY reducidos al mínimo, descritos a continuación, las purinas comprenden una modificación 2 '-OH y las pirimidinas comprenden una modificación 2'-F, mientras que las plantillas y los cebadores comprenden desoxirribonucleótidos no modificados. Para el aptámero rRfY reducido al mínimo 5'-GGAGCGCACUCAGCCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUÜGUGCCGCUGGCUG-3 ' (SEQ ID NO 165), el cebador de la PCR 5', 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-CAGCCAGCGGCACAAGTC-3' (SEQ ID NO 167)', se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-TCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACCCTCGCAAGCATTTTAAGAA TGACTTGTGCCGCTGGCTG-3' (SEQ ID NO 168) . Para el aptámero reducido al mínimo 5'-GGACCACCCUCGCAAGC?UUUUAAGA?UGACUUGUGCCGCÜGGÜCC-3' (SEQ ID NO 169), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGACCAGCGGCACAAGTC-3' (SEQ ID NO 170), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'- GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAAGCATTTTAAGAATGACTTGT GCCGCTGGTCC-3' (SEQ ID NO 171) . Para el aptámero reducido al mínimo 5'- GGACCACCCUCGCAAGCAUUGAGAAAUGACUUGUGCCGCÜGGUCC-3' (SEQ ID NO 172), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGACCAGCGGCACAAGTC-3' (SEQ ID NO 170), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'- GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAAGCATTGAGAAATGACTTGTG CCGCTGGTCC-3' (SEQ ID NO 173) . Para el aptámero reducido al mínimo ' 5'-GGACCACCCUCGCAACGAGAGUÜGUGCCGCUGGUCC-3' (SEQ ID NO 174), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5' -GGACCAGCGGCACAACTC-3' (SEQ ID NO 175), se utilizaron para amplificar la plantilla 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCA CCCTCGCAACGAGAGTTGTGCCGCTGGTCC-3' (SEQ ID NO 176) . Todas las secuencias del aptámero reducido al mínimo anteriores se transcribieron, se purificaron en gel sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 15%, se marcaron en el extremo 5-32P con ATP ?32P, y a continuación se desalaron utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) . Estos minímeros se caracterizaron principalmente en el ensayo celular descrito en el Ejemplo 3 siguiente.

EJEMPLO 2B: Truncamiento de los aptámeros de vWF rRdY Basándose en los análisis de unión de vWF descritos en el Ejemplo 1 anterior y los datos de ensayo basado en las células descrito en el Ejemplo 3 siguiente, los aptámeros AMX203.G9 (SEQ ID NO 44) y AMX205.F7 (SEQ ID NO 49) , respectivamente, se identificaron para la caracterización adicional. Con el fin de identificar los elementos estructurales centrales requeridos para la unión al vWF, se determinaron los límites 3' de los aptámeros AMX203.G9 (SEQ ID NO 44) y AMX205.F7 (SEQ ID NO 49). Los transcriptos de ARN de longitud completa se marcaron en el extremo 5' con ATP ?-32P y polinucleótido cinasa T4. Los ligandos radiomarcados se sometieron a hidrólisis alcalina parcial y a continuación se unieron selectivamente en solución al dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5) a 500 nM antes de pasarse a través de los filtros de nitrocelulosa. Los oligonucleótidos retenidos se resolvieron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 8%. El oligonucleótido más pequeño unido a vWF define el límite 3' . Basándose en los experimentos de los límites así como la inspección visual de los pliegues predichos utilizando RNAstructure, Versión 4.1, se diseñó un panel de secuencias reducidas al mínimo . Para los aptámeros rRfY reducidos al mínimo, descritos a continuación, las purinas son 2' -OH purinas y las pirimidinas son desoxipirimidinas, mientras que las plantillas y los cebadores comprenden desoxirribonucleótidos no modificados. Las siguientes tres secuencias de aptámeros reducidas al mínimo se derivaron de DL.159.87.70 (SEQ ID NO 44): Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo '-GGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCT-3' (SEQ ID NO 177), el cebador de la PCR 5', 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-AGCCACATACCCGCCGTC-3' (SEQ ID NO 178), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGG GTATGTGGCT-3' (SEQ ID NO 179) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTCC-3' (SEQ ID NO 180), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5' -GGAGCCACATACCCGCCG-3' (SEQ ID NO 181) , se utilizaron para amplificar la plantilla 5'- GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGC TCC-3' (SEQ ID NO 182) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTCCC-3' (SEQ ID NO 183), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCT ATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y cebador de la PCR 3', 5' -GGGACATACCCGCCG-3' (SEQ ID NO 184), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGACGGGGTGGGTAGACGG CGGGTATGTCCC-3' (SEQ ID NO 185) . Las siguientes siete secuencias del aptámero reducidas al mínimo se derivaron del aptámero de acuerdo con la SEQ ID NO 49: Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5 ' -GGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTG-3' (SEQ ID NO 186), el cebador de la PCR 5', 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5' -CAGCCATGCGTGGTAATT-3' (SEQ ID NO 187), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGT AATTACCACGCATGGCTG-3' (SEQ ID NO 188) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3' (SEQ ID NO 189), el cebador de la PCR 5', 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGAGCCATGCGTGG-3' (SEQ ID NO 190), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCAC GCATGGCTCC-3' (SEQ ID NO 191) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-S' (SEQ ID NO 192), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGAGCCATGCGTGG-3' (SEQ ID NO 190), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'- GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCA TGGCTCC-3' (SEQ ID NO 193) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo '-GGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3' (SEQ ID NO 194), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGAGCCATGCGTGG-3' (SEQ ID NO 190), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGC TCC-3' (SEQ ID NO 195) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3' (SEQ ID NO 196), el cebador de la PCR 5', 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGAGCCATGCGTGG-3' (SEQ ID NO 190), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATTACCAC GCATGGCTCC-3' (SEQ ID NO 197) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCC-3' (SEQ ID NO 198), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGCCATGCGTGGCTCTC-3' (SEQ ID NO 199), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'- GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATG GCC-3' (SEQ ID NO 200) . Para la secuencia del aptámero reducida al mínimo 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCTCC-3' (SEQ ID NO 201), el cebador de la PCR 5', 5' -GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3' (SEQ ID NO 166) y el cebador de la PCR 3', 5'-GGAGCCATGCGCTCTCG-3' (SEQ ID NO 202), se utilizaron para amplificar la plantilla 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCT CC-3' (SEQ ID NO 203) .

Unión al Minímero de vWF rRdY Todas las secuencias del minímero se transcribieron, se purificaron en gel sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 15%, se marcaron en el extremo 5-32P con ATP ?32P, y a continuación se desalaron utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) . Para la determinación de la KD, los transcriptos del minímero se probaron para la unión directa al vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7), el dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5), y el dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6), utilizando una titulación de la proteína de 8 puntos de 0-300 nM (diluciones de 3 veces) en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de BSA (en un volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se aplicaron a un filtro de nitrocelulosa y nylon emparedado en un aparato de transferencia por puntos (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . Los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software) . Los resultados de la caracterización de la unión a la proteína se tabulan en la Tabla 18.

Tabla 18: Datos de unión del minímero al aptámero rRdY, únicamente a los aptámeros que mostraron una actividad potente en los ensayos celulares se les midió su afinidad de unión. (ND = no realizada) EJEMPLO 2C: Truncamiento del Aptámero vWF de SELEX™ #1 de ADN Basándose en los análisis de unión de vWF descritos en el Ejemplo 1 anterior, así como la inspección visual de los pliegues predichos, se diseñó un panel de secuencias reducidas al mínimo para la mejor clase de aglutinantes de la Familia #1. En este caso, todos los aglutinantes de la Familia #1 están estructuralmente relacionados y caen en uno de cuatro pliegues mutuamente excluyentes (predichos mediante RNAstructure 4.1), como se determina mediante las restricciones de apareamiento de las bases en los extremos 5' y 3' de las moléculas.

Sintetizamos y probamos cada uno de los cuatro pliegues predichos. La secuencia de cada uno de los aptámeros de ADN reducidos al mínimo sintetizados es como sigue: SEQ ID NO 204 5'-CCAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGG-3' ARC 845 (SEQ ID NO 205) 5' ATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCAT -3' SEQ ID NO 206 5'- CGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATCG -3' SEQ ID NO 207 5'- GATCTGACTAGCGCAATGAGGATGCdTGATGGATTGCTCAGGTC -3' Todas las secuencias del ADN del minímero se sintetizaron químicamente, se marcaron en el extremo 5-32P con ATP ? P, y a continuación se desalaron utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations, Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) . Para la determinación de la KD, los minímeros se probaron para la unión al dominio Al de vWF humano (SEQ ID NO 5), utilizando un ensayo de transferencia por puntos de competencia con una concentración constante de proteína de 10 nM y una titulación de ADN del competidor frió de 12 puntos (3 uM, 1 uM, 333 nM, 100 nM, 33 nM, 10 nM, 3.3 nM, 1 nM, 333 pM, 100 pM, 33.3 pM, 0 pM) en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de BSA (volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los valores de KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software) . Los resultados de la caracterización de unión a la proteína se tabulan en la Tabla 19 siguiente. Como se muestra, únicamente ARC845 de los constructos reducidos al mínimo mantuvo la capacidad de unirse al dominio Al de vWF de humano o de conejo.

Tabla 19. Datos de la Unión al Minímero 1 de ADN (ND = No Realizado) Basándose en estos resultados de la unión, ARC 845 (SEQ ID NO 205) , representa la secuencia de unión del ácido nucleico central de los aptámeros de SELEX™ 1 de ADN, Familia 1.

EJEMPLO 2D : Reducción al Mínimo del Aptámero de la Selección Alternada de vWF de ADN Basándose en los análisis de unión al vWF descritos en el Ejemplo 1 anterior y los datos del ensayo basado en las células descrito en el Ejemplo 3 siguiente, así como la inspección visual de los pliegues predichos para los aptámeros AMX237.B11 (SEQ ID NO 109) y AMX236.A12 (SEQ ID NO 127), se diseñó una serie de secuencias reducidas al mínimo. Además, basándose en la observación de que los aptámeros AMX237.G6 (SEQ ID NO 114), AMX238.E9 (SEQ ID NO 115), y AMX238.H5 (SEQ ID NO 118) parecieron ser ligeramente más potentes en los ensayos celulares, se sintetizó una serie de secuencias reducidas al mínimo de ARC1027-1031 (SEQ ID NOS 212-216) . Las secuencias reducidas al mínimo de acuerdo con la SEQ ID NO 208 y la SEQ ID NO 209, representan dos pliegues mutuamente excluyentes predichos del aptámero de longitud completa AMX237.B11 (SEQ ID NO 109) . Las secuencias del ácido nucleico para los aptámeros de ADN reducidos al mínimo descritos anteriormente son como sigue: (SEQ ID NO 208) 55~ GGACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTCC -3' (SEQ ID NO 209) 5'- GGAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTCC -3' (SEQ ID NO 210) 5'- GGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTCC -3' ( SEQ I D NO 211 ) 5'- GGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGG -3' ARC1027 ( SEQ ID NO 212 ) S'-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-ST-S5 ARC1028 ( SEQ ID NO 213 ) 5'-dGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3' ARC1029 ( SEQ ID NO 214 ) 5'-GGCGTGCAGTGCC-[PEG]-GGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T -3' ARC1030 ( SEQ ID NO 215 ) 5'- GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T -3' ARC1031 ( SEQ ID NO 216 ) 5'- GGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T -3' Todas las secuencias del aptámero reducidas al mínimo anteriores se sintetizaron químicamente, se purificaron sobre gel en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 15% y a continuación se desalaron utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) , utilizando los métodos y técnicas estándar. Las secuencias reducidas al mínimo se caracterizaron en los ensayos celulares como se describe en el Ejemplo 3 siguiente. De la serie inicial, de la SEQ ID NO 208 a SEQ ID NO 211, únicamente la SEQ ID NO 208 demostró actividad en los ensayos celulares (véase el Ejemplo 3, siguiente) . La comparación de las secuencias de los aptámeros AMX237.B11 (SEQ ID NO 109) y AMX237.G6 (SEQ ID NO 114), AMX238.E9 (SEQ ID NO 115) y AMX238.H5 (SEQ ID NO 118), reveló que están estrechamente relacionados y que apoyan la estructura secundaria predicha del aptámero reducido al mínimo (SEQ ID NO 208) (véanse las Figuras 14 y 15). Estas moléculas, ARC1027-1031 (SEQ ID NOS 212-216), probaron adicionalmente nuestra hipótesis sobre el pliegue y la estructura secundaria de los aptámeros AMX237.G6 (SEQ ID NO 114), AMX238.E9 (SEQ ID NO 115) y AMX238.H5 (SEQ ID NO 118) (véanse las Figuras 5, 14 y 15) . Para la determinación de la KD, las secuencias reducidas al mínimo que mostraron actividad potente en los ensayos celulares se describen en el Ejemplo 3 siguiente, en donde se marcaron en el extremo 5-32P con ATP ?-32P, y a continuación se desalaron utilizando dos columnas Centri-Spin 10 (Princeton Separations Cat. # CS-101, Adelphia, NJ) . Los minímeros se probaron para la unión directa al vWF humano de longitud completa (SEQ ID NO 7), y al dominio Al de vWF de conejo (SEQ ID NO 6) , utilizando una titulación de la proteína de 9 puntos (100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 0 pM) (véase la Figura 6) en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 mg/mL de BSA (volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación se aplicaron a un filtro de nitrocelulosa y nylon emparedado en un aparato de transferencia por puntos (Schleicher y Schuell, Keene, NH) . Los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software). Los resultados de la caracterización de la unión a la proteína se tabulan en la Tabla 20.

Tabla 20. Datos de unión del minímero al aptámero 2 de ADN, únicamente a los minímeros del aptámero que mostraron una actividad potente en los ensayos celulares se les medió su afinidad de unión (véase el Ejemplo 3 siguiente) ("ND" = no se realizó) EJEMPLO 2E : Optimización de ARC1029 a través de la Química Medicinal del Aptámero Se identificaron variantes altamente estables y potentes de ARC1029 (SEQ ID NO 214) a través de un procedimiento de modificación sintética sistémica que involucra 5 fases de síntesis del aptámero, purificación y ensayo para la actividad de la unión. Para facilitar la síntesis química durante la modificación del aptámero, el separador de PEG de ARC1029 (SEQ ID NO 214, se reemplazó con una corta secuencia de oligonucleótido, dTdTdC, que resulta en ARC1115 (SEQ ID NO 221) como se observa en la Figura 16 y la Tabla 21 siguiente. Un dT invertido en el extremo 3' altamente estabilizante se sintetizó en el extremo 3' de ARC1115 (SEQ ID NO 221), resultando en ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222), también como se observa en la Figura 16 y la Tabla 21 siguiente. Una vez que ambos de ARC1115 (SEQ ID NO 221) y ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222) mostraron unirse al vWF humano, se utilizó ARC1172 (SEQ ID NO 222) (SEQ ID NO 222) como la plantilla básica para la modificación como se describe en los Ejemplos siguientes. En la fase 1 del proceso de modificación, cada residuo individual en ARC1172 (SEQ ID NO 222), se reemplazó por el residuo que contiene 2' -O metilo correspondiente (con dT siendo reemplazado por mU a menos que se especifique de otra manera), resultando en ARC1194 (SEQ ID NO 223) -ARC1234 , como se muestra en la Tabla 21 siguiente y la Figura 16. Además en la fase 1, se hizo un conjunto de reemplazos compuestos en las regiones del tallo de ARC1172 (SEQ ID NO 222) , que resultan en ARC1235 a 1243, también como se muestra en la Tabla 21 y en la Figura 16. Como se describe en la presente, véase por ejemplo, en los Ejemplos 1, 2 y 3, durante los procesos de selección y truncamiento de la clona que conducen a ARC1029 (SEQ ID NO 214, hubo un acuerdo excelente entre la potencia relativa de los aptámeros en los ensayos de unión (transferencia por puntos), FACS y BIPA. En consecuencia, de acuerdo con el vWF humano de longitud completa medido como se mide en el ensayo de transferencia por puntos, los ensayos de unión se utilizaron para caracterizar la afinidad relativa de la mayoría de las variantes de prueba sintetizadas del aptámero. Para la determinación de la KD, los aptámeros sintetizados químicamente se purificaron utilizando electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, se marcaron en el extremo 5' con ATP ?-32P, y se probaron para la unión directa al vWF humano de longitud completa (Calbiochem Cat. # 681300, La Jolla, CA) . Se utilizó una titulación de proteína de 8 puntos en el ensayo de unión de transferencia por puntos (100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 0 pM) en PBS de Dulbecco IX que contiene 0.1 de BSA (volumen final de 50 uL) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los valores de la KD se calcularon ajustando la ecuación y = (max/ (1+K/proteína) ) +yint, utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software) . Las secuencias de los derivados de ARC1029 (SEQ ID NO 214) se sintetizaron, purificaron y se probaron, para la unión a un vWF humano de longitud completa, así como los resultados de la caracterización de la unión a la proteína, que se tabulan en la Tabla 21 siguiente. La afinidad de unión (KD) se presenta en la cuarta columna y el grado de unión al aptámero al vWF 100 nM se presenta en la columna final de la Tabla 21.

Tabla 21: Resultados de la Unión de la Modificación de la Fase 1 Como puede observarse de los datos de unión en la Tabla 21, las posiciones que toleran más fácilmente la sustitución de un residuo desoxi por un residuo 2'-0 metilo, se correlacionan bien con la conservación de la secuencia mapeada en la estructura secundaria de ARC1029 (SEQ ID NO 214) mostrada en la Figura 15, proporcionando así un apoyo adicional independiente para la estructura propuesta del aptámero. Las posiciones de ARC1172 (SEQ ID NO 222) que no toleran la modificación 2'-0-Me así como las posiciones que lo hacen, se muestran en la Figura 15B. Basándose en los resultados de la relación de la actividad de la estructura (SAR) de los aptámeros individuales y compuestos desoxi a metoxi descritos inmediatamente en lo anterior en el proceso de modificación de la fase 1, se diseñó, sintetizó, purificó y probó para la unión a vWF, una segunda serie de aptámeros. Para éstos y todos los aptámeros posteriores, las moléculas que mantienen una afinidad (KD) de -10 nM o mejor, así como el grado de unión al vWF 100 nM de al menos 35% fueron el objetivo.

ARC1338 (SEQ ID NO 273J-ARC1348 (SEQ ID NO 283), como se muestra en la Figura 17 y la Tabla 21, se sintetizaron durante la fase 2 del proceso de modificación. ARC1338 (SEQ ID NO 273) a 1342, se sintetizaron con modificaciones de bloque basándose en las sustituciones individuales toleradas de la modificación de la fase 1. ARC1343 (SEQ ID NO 278)-ARC1345, se sintetizaron cada una con una diferente modificación de la cadena principal del fosfato de fosforotioato (véase la Figura 17 y la Tabla 22 siguiente) . Finalmente, ARC1346 (SEQ ID NO 281)-ARC1348 (SEQ ID NO 283), se sintetizaron para probar la eliminación de un solo par de bases del tallo 1, tallo 2 y de ambos tallos de ARC1342 como se muestra en la Figura 17 y la Tabla 22 siguiente.

Tabla 22 : Resultados de la Unión de la Modificación de la Fase 2 Como se observa en la Tabla 22, los resultados de la fase 2 de la modificación del aptámero revelaron que ARC1346 (SEQ ID NO 281) es el más potente de los aptámeros derivados de ARC1029 (SEQ ID NO 214) altamente sustituidos, generados hasta ahora. De manera interesante como se muestra por los resultados con ARC1347 (SEQ ID NO 282) y ARC1348 (SEQ ID NO 283), la eliminación de un par de bases de tallo 2, no se tolera en este contexto altamente modificado. ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), mostrados en la Tabla 23 y la Figura 17, se sintetizaron durante la fase 3 del proceso de modificación del aptámero. Como la sustitución de dG a mG en la posición 6 se toleró de manera deficiente en las variantes probadas en la fase 1 de la modificación del aptámero, y la guanosina en la posición 6 se aparea con la citidina en la posición 36, ARC1346 (SEQ ID NO 281) , se sintetizó con una modificación de mC a dC en la posición 36, que resulta en ARC1361 (SEQ ID NO 284), como se muestra en la Tabla 23 siguiente. ARC1361 (SEQ ID NO 284), sirvió como la secuencia de base para introducir una sola modificación de la cadena de fosfato de fosforotioato, que resultó en ARC1362 a ARC1381 (SEQ ID NO 304), también mostrado en la Tabla 23 siguiente.

Tabla 23 : Resultados de la Unión de la Modificación en la Fase 3 Como se muestra en la Tabla 23 anterior, aunque la mayoría de las modificaciones probadas en la fase 3 tuvieron poco o ningún efecto benéfico, ARC1368 (SEQ ID NO 291) , que contiene una sola modificación de fosforotioato entre mG-20 y dT-21, se une al vWF humano con una afinidad idéntica (dentro del error experimental) a aquélla del compuesto original, ARC1172 (SEQ ID NO 222) . Durante la modificación del aptámero en la fase 4 y la fase 5, se sintetizaron ARC1524 (SEQ ID NO 305) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317) y ARC1759 (SEQ ID NO 318), mostrados en la Figura 18. Se sintetizó una permutación circular de la secuencia que cerró el tallo 1 y abrió el tallo 2, como se ilustra en la Figura 19. Como se muestra en la Tabla 24 siguiente, muchos de estos aptámeros se unen a vWF, sin embargo, ninguno fue tan potente como ARC1368 (SEQ ID NO 291) . De manera interesante, aunque consistente con la SAR generada en la Fase 1 de la modificación del aptámero, ARC1525, que contiene solo un cambio único de dT a mT en la posición 27, no mostró unión al vWF. Se utilizó ARC1525 como el control negativo en muchos de los ensayos biológicos en los cuales ARC1368 (SEQ ID NO 291) se probó posteriormente. Nuevamente, de manera consistente con los datos de SAR de la Fase 3 de la modificación del aptámero, ARC1759 (SEQ ID NO 318), que es idéntica a ARC1172 (SEQ ID NO 222), excepto en que tiene una sola sustitución de fosforotioato entre la G en la posición 21 y la T en la posición 22, mostró una mejora mensurable en la afinidad con relación a ARC1172 (SEQ ID NO 222) .

Tabla 24 : Resultados de la Unión de la Modificación del Aptámero en la Fase 4 y 5 EJEMPLO 2F: Conjugación de las porciones de PEG a los aptámeros modificados Las porciones de polietilenglicol se conjugaron al término 5' de ARC1368 (SEQ ID NO 291) y ARC1172 (SEQ ID NO 222), vía las químicas reactivas de la amina. Los oligonucleótidos ARC1635 . NH2- mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCniGmGmCdCmG-s- dTmGdCdGdGdTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T (ARC1368 (SEQ ID NO 291) con una modificación 5' hexilamina) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) NH2- dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCTdTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdC dCdGTdCdAdCdGdCdC-3T (ARC1172 (SEQ ID NO 222) con una modificación 5' hexilamina), se sintetizaron químicamente. Los aptámeros modificados con amina se conjugaron a diferentes porciones de PEG, como se indica en la Tabla 25 siguiente, posteriormente a la síntesis.

Tabla 25: Aptámeros modificados con hexilamina o conjugados a PEG EJEMPLO 3: ENSAYOS FUNCIONALES CELULARES Ensayos Biológicos que Dependen de vWF La efectividad de varios aptámeros en el bloqueo de la función del vWF en varios ensayos biológicos se describe en este Ejemplo. En un ensayo se utilizó botrocetina. La botrocetina, una proteína aislada del veneno de víbora, se conoce por inducir la unión del Factor de von Willebrand al receptor gplb en las plaquetas vivas y fijas. Esta reacción causa la aglutinación de las suspensiones de las plaquetas fijas via la multimerización del vWF. En las preparaciones de plasma rico en plaquetas (aquí posteriormente "PRP") , la inducción por vWF/botrocetina de la aglutinación, es seguida por una segunda fase de agregación de las plaquetas causada por la activación metabólica de las plaquetas. Estas dos reacciones: unión de vWF a las plaquetas fijas y agregación de las plaquetas mediada por vWF, pueden . utilizarse para medir la actividad de los aptámeros de la invención. La cantidad de vWF unido a las plaquetas fijas puede medirse con un anticuerpo para el vWF. La señal de la fluorescencia del anticuerpo unido incubado con un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína se detecta y cuantifica a continuación mediante citometría de flujo. La capacidad de un aptámero de la invención para bloquear la unión del vWF a las plaquetas, se correlaciona con una reducción en la señal de la fluorescencia.

La botrocetina induce la unión del dominio Al del vWF a las plaquetas, así como la proteína de longitud completa. Se determinó por los inventores que la proteína purificada de vWF del dominio Al de conejo marcada con 6-Histidina puede inducirse a unirse a plaquetas liofilizadas humanas con botrocetina. La unión de Al de conejo a las plaquetas se mide con un anticuerpo anti-poli-His seguido por la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con ficoeritrina. El grado de unión puede cuantificarse mediante análisis de citometría de flujo. La capacidad de los aptámeros para bloquear la unión del Al de conejo a las plaquetas fijas humanas, se correlaciona con la señal de la fluorescencia disminuida. En el plasma rico en plaquetas aislado de sangre humana fresca, la botrocetina induce la agregación de las plaquetas vía el vWF. La formación del agregado de las plaquetas puede medirse óptimamente como un incremento en el % de transmitancia de la luz en un Agregómetro Chronolog Modelo 490-4D, debido a que la agregación de las plaquetas aclara el plasma. Los aptámeros de la invención se analizaron por su capacidad para inhibir la agregación de las plaquetas inducidas por botrocetina ("BIPA") en sangre humana. Un aptámero de la invención se considera como activo si puede evitar la formación del agregado durante seis minutos posteriores a la adición de botrocetina.

Otro ensayo de este Ejemplo, utilizando el instrumento PFA-100, es un ensayo dependiente de vWF, pero independiente del agonista que utiliza el instrumento PFA-100 (Harrison et al., Clin. Lab. Haem. , v24, p. 225-32 (2002)). El PFA-100 simula la formación de un tapón hemostático ba o condiciones de fuerza de corte alto in vivo, registrando el tiempo requerido para que las plaquetas se agreguen y bloqueen el flujo de sangre completa cifrada a través de una abertura microscópica en una membrana recubierta con colágeno y epinefrina o ADP. Esta actividad es dependiente del factor de von Willebrand puesto que multímeros de vWF de alto MW se unen al colágeno inmovilizado de la membrana y a continuación se unen a, y activan las plaquetas debido a la fuerza de corte inducida por la extracción de la sangre a través de la abertura microscópica. Así, este ensayo es complementario a los ensayos de BIPA y FACS en que es dependiente del vWF, sin embargo, tiene algunas ventajas en que no requiere la adición del agonista de vWF botrocetina y utiliza sangre completa en lugar de plasma rico en plaquetas. Otro ensayo de este Ejemplo utiliza ADP para inducir la agregación de las plaquetas . La agregación de plasma rico en plaquetas (PRP) , puede inducirse de múltiples maneras. La botrocetina, una proteína del veneno de víbora actúa en el vWF como se describió anteriormente, estabilizando su interacción con el receptor de las plaquetas gplb, induciendo por lo tanto la agregación de las plaquetas . La unión del vWF a gplb es un paso inicial en la agregación de las plaquetas, por lo tanto, hay la esperanza de que los inhibidores que bloquean los componentes corriente abajo del proceso de agregación (es decir, los antagonistas IlblIIa de Integrelin™ y ReoPro™) , también evitarán la agregación de las plaquetas inducida por la botrocetina. Sin embargo, en el caso de los agonistas que actúan directamente en las plaquetas e inducen agregación (ADP, por ejemplo), uno esperaría que los antagonistas corrientes arriba del agonista fueran inefectivos (un aptámero anti-vWF, por ejemplo), mientras que los antagonistas que actúan directamente en las plaquetas (antagonistas IlblIIa) permanecerían potentes. . Las especificidad de un antagonistas de vWF con relación : a un antagonista de IlblIIa incrementaría la seguridad del antagonista anti-vWF disminuyendo el tiempo de sangrado asociado con el tratamiento. Para pacientes con placas ateroscleróticas en arterias estenosadas, la agregación de las plaquetas ocurre conforme las plaquetas se unen al vWF inmovilizado por el colágeno en la placa. Por lo tanto, la inhibición de la interacción de vWF/gpIb, así como el bloque de la unión al receptor IlblIIa a la fibrina, evitaría la agregación de las plaquetas. La especificidad biológica conferida seleccionando el vWF asegura que a diferencia del tratamiento con anti-IIblIIa, las paquetas mismas no son seleccionadas directamente, asegurando que pueden activarse todavía por otros medios, reduciendo así las complicaciones de sangrado potencial asociadas con la terapia antiplaquetas . Los siguientes materiales se utilizaron en los Ejemplos 3A-3D descritos a continuación: el Factor de von Willebrand humano (vWF) (SEQ ID NO 7), y la seroalbúmina bovina se compraron de Calbiochem (Cat# 681300 y #126593, respectivamente) (La Jolla, CA) ; el vWF de conejo del dominio Al (SEQ ID NO 6) se expresó y purificó utilizando métodos y condiciones estándar. Las plaquetas humanas liofilizadas (P/N 299-2), cubetas (P/N 312), barras de agitación (P/N 311) , agregómetro de plaquetas (modelo 490-4D) , y el Programa AGGRO/LINK se compraron de Chronolog (Haverton, PA) . La botrocetina (12201-100U-B) se fabricó por Pentapharm (Basel, Suiza) . La sangre fresca se obtuvo de donadores libres del fármaco antiinflamatorio no esferoidal ("NSAID") aparentemente sanos, y se extrajo en tubos Vacutainer con Citrato de Sodio 0.105 M de 5 mL (Cat# 369714) (Becton Dickinson-Franklin Lakes, NJ) . El suero fisiológico se fabricó por Aldon (Cat # 9420306) (Avon, NY) , y el suero fisiológico amortiguado con fosfato (Cat # 21-040-CV) se compró de Cellgro (Herndon, VA) . Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en una máquina FACSCAN de BD Biosciences y se analizaron con el Programa CellQuest (San José, CA) . El anticuerpo monoclonal de ratón del Antifactor de von Willebrand (Cat# GTI-V1A) , se compró de GTI (Waukesha, Wl) . El anticuerpo monoclonal del conjugado de penta-HIS-biotina (Cat # 34440) , se compró de Qiagen (Alemania) . El conjugado IgG2a anti-ratón-FITC (Cat # 553390), se compró de BD Biosciences (San Diego, CA) .. En anticuerpo del conjugado IgG-anti-ratón PE (Cat # 715-116-150), se compró de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA) .

EJEMPLO 3A: Ensayo de Unión a las Plaquetas del Factor de von Willebrand Humano de Longitud Completa La potencia del aptámero para bloquear la unión del vWF humano a las plaquetas liofilizadas, se valoró mediante análisis de citometría de flujo. Las titulaciones de los aptámeros (0 nM, 0.1 nM a 1000 nM) , se preincubaron brevemente con 5 nM de vWF humano de longitud completa en amortiguador FACS (PBS más seroalbúmina bovina al 0.5%) a temperatura ambiente en un volumen de 50 uL . Otros 50 uL que contienen 5 uL de plaquetas liofilizadas más 1 uL de 0.1 U/uL de botrocetina en amortiguador FACS se agregaron al aptámero/vWF. Esta reacción se dejó proceder durante 15 minutos a 37 grados C, después de los cuales se agregaron 200 uL de amortiguador FACS. Las plaquetas se recolectaron mediante centrifugación de 6 minutos a 1470 RCF y el sobrenadante se desechó. Las pelotillas se resuspendieron en 100 uL de amortiguador FACS que contiene una dilución 1:100 de anticuerpo anti-vWF y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la dilución con 200 uL de amortiguador FACS, las plaquetas se centrifugaron a 1470 RCF durante 6 minutos y el sobrenadante se desechó. Las pelotillas se resuspendieron en una solución 1:100 del anticuerpo anti-IgG2a-FITC y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los 100 uL completos se diluyeron en 200 uL de amortiguador de FACS y se analizaron inmediatamente mediante análisis de citometría de flujo en el FACSCAN. Los datos de los artefactos de los desechos contaminantes se eliminaron de los análisis al dibujar un círculo alrededor de la población de las plaquetas únicas y agregadas. Las lecturas de la intensidad fluorescente media ( MFI") se cuantificaron para . cada muestra analizada mediante citometría de flujo. La MFI de fondo se sustrajo de todos los puntos de datos. El por ciento de inhibición se reportó calculando el valor del por ciento de unión del vWF humano de longitud completa a las plaquetas en la presencia de un aptámero a una concentración dada relativa a la unión en la ausencia de cualquier aptámero (véase la Figura 7) . Los valores de CI5o se determinaron ajustando el por ciento de inhibición de la unión del vWF a las plaquetas como una función de la concentración del aptámero a la ecuación: % de inhibición = % de inhibiciónmax/ (l+CI50/concentración del aptámero) Los resultados de la caracterización de la unión del vWF inducidos por botrocetina se tabulan en la Tabla 26 siguiente.

EJEMPLO 3B : Ensayo de Unión de las Plaquetas del Dominio Al del Factor de von Willebrand de Conejo La capacidad de los aptámeros de la invención para bloquear el dominio Al de vWF de conejo que se une a las plaquetas liofilizadas también se valoró mediante análisis de citometría de flujo. Las titulaciones de los aptámeros (0 nM, 0.1 nM a 1000 nM) , se preincubaron brevemente con 4 nM de vWF Al de conejo en amortiguador FACS (PBS más seroalbúmina bovina al 0.5%) a temperatura ambiente en un volumen de 50 uL . Otros 50 uL que contienen 5 uL de las plaquetas liofilizadas más 1 uL de 0.1 U/uL de botrocetina en amortiguador FACS se agregaron al aptámero/vWF. Esta reacción se dejo proceder durante 15 minutos a 37 grados C, después de los cuales se agregaron 200 uL de amortiguador FACS. Las plaquetas se recolectaron mediante centrifugación a 1470 RCF durante 6 minutos, y el sobrenadante se desechó. Las pelotillas se resuspendieron en 100 uL de amortiguador FACS que contiene una dilución 1:200 de anticuerpo del conjugado de anti-Penta-HIS-Biotina y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la dilución con 200 uL de amortiguador de FACS, las plaquetas se centrifugaron a 1470 RCF durante 10 minutos, y el sobrenadante se desechó. Las pelotillas se resuspendieron en una solución 1:100 del anticuerpo anti-IgG-PE y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los 100 uL completos se diluyeron en 200 uL de amortiguador FACS y se analizaron inmediatamente mediante análisis de citometría de flujo en el FACSCAN. Los desechos contaminantes se eliminaron de los análisis al dibujar un círculo alrededor de la población de las plaquetas únicas y agregadas y recolectando los datos de 10000 eventos. Las lecturas de la intensidad fluorescente mediana ("MedFI") (que son generalmente equivalentes a las lecturas de MFI, descritas en el Ejemplo 3a anterior, para propósitos comparativos) , se cuantificaron para cada muestra analizada mediante citometría de flujo. La MedFI de fondo se sustrajo de todos los puntos de datos. El por ciento de inhibición se reportó calculando el valor del por ciento de unión del vWF humano de longitud completa a las plaquetas en la presencia de un aptámero a una concentración dada con relación a la unión en la ausencia de cualquier aptámero (véase la Figura 7) . Los valores de CI50 se determinaron ajustando el por ciento de inhibición de la unión del vWF a las plaquetas como una función de la concentración del aptámero a la ecuación: % de inhibición = % de inhibiciónmax/ (l+CI50/concentración del aptámero) Los resultados de la caracterización de la unión del vWF Al de conejo inducida por botrocetina se tabulan a continuación en la Tabla 26.

Tabla 26: Resultados de los Ensayos FACS y BIPA ("ND" = no se realizó) EJEMPLO 3C: Inhibición de la agregación de las plaquetas inducidas por Botrocetina (ensayo BIPA) Con el fin de determinar la actividad de los aptámeros en las plaquetas humanas vivas, se hicieron ensayos BIPA utilizando plasma rico en plaquetas preparado recientemente. La sangre se obtuvo de donadores humanos sanos que no habían tomado NSAID durante al menos cinco días. Se utilizaron agujas de mariposa calibre 21 3/4 (Cat# 367287) de Becton Dickinson, para extraer la sangre en tubos vacutainer con citrato de sodio 0.105 M. La sangre recolectada se reunió en tubos cónicos de 15 mL y se centrifugó a 200 g durante 20 minutos. La capa amarilla turbia de plasma rico en plaquetas ("PRP") , se extrajo de los tubos, se recolectó y se apartó a temperatura ambiente. La sangre restante se centrifugó a 2500 g durante diez minutos. La capa de plasma clarificada, conocida como plasma pobre en plaquetas ("PPP") , se extrajo y se separó a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas de PRP en cubetas que contienen barras de agitación a un volumen de 470 uL. Se tomó un alícuota de una muestra de 500 uL de PPP en una cubeta y se colocó en la celda de referencia de PPP del agregó etro para las plaquetas. Las muestras de PRP se precalentaron a 37 grados C en el agregómetro para las plaquetas durante 3-5 minutos antes de utilizarse en los ensayos BIPA. Primero, la concentración de botrocetina requerida para inducir la agregación de las plaquetas para cada donador individual se determinó mediante titulación. Esta concentración de botrocetina se utilizó para el resto del experimento. A continuación, el aptámero se probó agregando titulaciones de aptámero (cero, 1 nM a 1000 nM) a PRP precalentador durante un minuto, seguido por la adición de botrocetina. Con la agregación de las plaquetas, se observa un incremento en la transmisión de la luz (Figura 8) . La concentración a la cual la agregación de las plaquetas se bloquea al 90% o mayor después de 6 minutos, se reporta en la columna final de la Tabla 26. Utilizando el Programa Aggro/LINK, puede generarse el área bajo la curva ("AUC") del trazo del agregómetro y utilizarse para calcular el por ciento de inhibición del aptámero a cualquier concentración dada en la agregación de las plaquetas inducida por botrocetina, como se observa en la Figura 9 para el Aptámero ARC1029 (SEQ ID NO 214) .

EJEMPLO 3D : Actividad biológica de los aptámeros modi icados seleccionados en una serie de ensayos biológicos : ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1368 (SEQ ID NO 291), ARC1525 (control negativo), ARC1779 (SEQ ID NO 320), ARC1780 (SEQ ID NO 321), y ARC1885 (SEQ ID NO 323) , identificados en el proceso de modificación medchem descrito en el Ejemplo 2 anterior, se probaron en una serie de ensayos biológicos. Estos ensayos incluyeron los ensayos FACS (como se describe en el Ejemplo 3A y 3B) y BIPA (como se describe en el Ejemplo 3C) , así como el ensayo PFA-100 de las plaquetas descrito a continuación.

Materiales : Los siguientes materiales se utilizaron en el ensayo del analizador de la función de las plaquetas (PFA) : la sangre completa fresca se recolectó de donadores libres de fármacos antiinflamatorio no esteroidales (NSAID) sanos, en tubos con citrato de sodio 0.105 M de 5 ml (Cat# 369714, Becton Dickenson) , utilizando agujas de mariposa calibre 21 3/4 (Cat#367287, Becton Dickenson) . La sangre completa fresca se recolectó de macacos de Java libres del fármaco antiinflamatorio no esferoidal (NSAID) sanos. Los aptámeros se diluyeron con suero fisiológico de Aldon (Cat#9420306) en tubos vacutainer sin aditivo (Cat#366434, Becton Dickenson). Las muestras se cargaron en cartuchos de prueba con colágeno/epinefriña (Cat#B4170-20A, Dade Behring) , que se utilizaron en la máquina PFA-100 (Dade Behring) . La solución desencadenante (Cat#B4170-50, Dade Behring) , se utilizó en la autoprueba y para prehumedecer los cartuchos de prueba. Se utilizaron almohadillas de limpieza de juntas toroidales (Cat#B4170-73, Dade Behring) en la autoprueba y en el proceso de limpieza de las juntas toroidales. Ensayo PFA: Una autoprueba, que incluye un proceso de limpieza de las juntas toroidales, se corre siempre en la máquina PFA-100 antes de correr cualquier muestra para asegurar el funcionamiento apropiado de la máquina. La sangre completa fresca se recolectó de donadores sanos o de macacos de Java, como se indica en la Tabla 27 siguiente, quienes/que, no habían tomado NSAID durante al menos tres días . La sangre de donadores humanos se recolectó en tubos con citrato de sodio 0.105 M de 5 ml, utilizando una aguja de mariposa calibre 21 3/4, y los tubos se invirtieron suavemente tres veces para asegurar la mezcla de la sangre con citrato de sodio. Durante todo el experimento, los tubos de la sangre completa se invirtieron suavemente cada cinco minutos para evitar la sedimentación. Con el fin de probar la titulación del aptámero en la sangre completa, el aptámero se agregó a tubos vacutainer sin aditivo y se diluyeron a las concentraciones deseadas (por ejemplo: 0 nM, 1 nM a 1000 nM) , utilizando suero fisiológico de manera que el volumen final fue de 60 µl . Cuando la PFA-100 estuvo lista para correr el siguiente conjunto de muestras, se agregaron 1940 µl de sangre completa al tubo que contiene una concentración de aptámero. Este tubo se invirtió suavemente tres veces para mezclar completamente el aptámero y la sangre. Las muestras se corrieron siempre por duplicado en la máquina PFA-100. 800 µl de esta mezcla de sangre se cargaron en los cartuchos de prueba con colágeno/epinefriña . Los cartuchos de prueba se cargaron en la máquina PFA-100. El tiempo de oclusión de la abertura se midió por la PFA-100, con un tiempo máximo de 300 segundos. Estimamos la CI95 en este ensayo como la concentración mínima de aptámero que extiende el tiempo de cierre a 300 segundos. La Figura 20 describe el tiempo de coagulación en la sangre completa humana como una función de la concentración del aptámero en el ensayo PFA-100 para ARC1368 (SEQ ID NO 291) y el control negativo ARC1525. Los resultados adicionales de los ensayos FACS, BIPA y PFA-100 se tabulan en la Tabla 27 siguiente. Tabla 27: Resultados de FACS, BIPA y PFA-100 Como se espera, hubo una fuerte correlación entre las afinidades observadas de los aptámeros para vWF en el ensayo de unión descrito en el Ejemplo 2 anterior y su potencia relativa en los ensayos biológicos. El control negativo que no se une ARC1525, no muestra actividad en ningún ensayo en el cual se probó.

EJEMPLO 3E: ARC1368, Integrilin™ y ReoPro™ en los ensayos BIPA, PFA-100 y AIPA La potencia de ARC1368 (SEQ ID NO 291), Integrillin™ y ReoPro™ se evaluó en sangre completa humana en los ensayos de PFA-100, en PRP humano en BPA (como se describió anteriormente en los Ejemplos 3D y 3C respectivamente) , y Agregación de las Plaquetas Inducida por ADP (AIPA) . La AIPA se realizó con PRP humano exactamente como se hizo para BIPA descrito anteriormente en el Ejemplo 3C, con la excepción de que en lugar de agregar botrocetina, se agregó ADP 10 micromolar (Chronolog, Haverton, PA) para inducir la agregación de las plaquetas. Los resultados de PFA-100 se muestran en la Figura 21. Los resultados de BIPA se muestran en la Figura 22. Los resultados de AIPA se muestran en la Figura 23. Como puede observarse en las Figuras 21 y 22, ARC1368 (SEQ ID NO 291) muestra una potencia comparable con ReoPro™ en los ensayos de PFA-100 y BIPA. De manera consistente con el mecanismo dependiente del vWF descrito anteriormente, el aptámero anti-vWF no muestra capacidad para bloquear la AIPA mientras que los antagonistas IlblIIa permanecen potentes en ese ensayo como se muestra en la Figura 23.

EJEMPLO 4: ESTUDIOS FARMACOCINÉTICOS En los Ejemplos 4 y 5, todos los datos de la concentración basados en la masa, se refieren únicamente al peso molecular de la porción oligonucleotídica del aptámero, sin importar la masa conferida por la conjugación con PEG.

EJEMPLO 4A: Estabilidad de los aptámeros anti-vWF en plasma humano y de rata ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1368 (SEQ ID NO 291) y ARC1533 se probaron para la estabilidad con nucleasa en plasma humano y de rata. La degradación de la nucleasa del plasma se midió en electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante como se describe a continuación. Brevemente, para la determinación de la estabilidad en plasma, los aptámeros sintetizados químicamente se purificaron utilizando electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, marcados en el extremo 5' con ATP ?-32P y a continuación se purificaron con gel nuevamente. El aptámero marcado con 32-P se incubó en la presencia del aptámero no marcado 100 nM en plasma humano de rata al 95% en una reacción de unión de 200 microlitros. La reacción para el punto de tiempo cero se hizo de manera separada con los mismos componentes, excepto que el plasma se volvió a colocar con PBS. Esto aseguró que la cantidad o radioactividad cargada en los geles fuera consistente a través del experimento. Las reacciones se incubaron a 37 °C en un termociclador durante 1, 3, 10, 30 y 100 horas a menos que se especifique de otra manera. En cada punto de medición, se retiraron 20 microlitos de la reacción, combinados con 200 microlitros de tinte de carga de formamida y se congelaron de manera instantánea en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20°C. Después de que el último punto de medición se tomó, las muestras congeladas se descongelaron y se retiraron 20 microlitros de cada punto de medición. Se agregó a continuación SDS a las pequeñas muestras a una concentración final de 0.1%. Las muestras se incubaron a continuación a 90°C durante 10-15 minutos y se cargaron directamente en gel PAGE al 15% y se corrieron a 12 W durante 35 minutos. La radioactividad de los geles se cuantificó utilizando un sistema de formación de fosforoimágenes Storm 860. El porcentaje del aptámero de longitud completa en cada punto de medición se determinó cuantificando la banda del aptámero de longitud completa y dividiendo entre los conteos totales en el carril. La fracción del aptámero de longitud completa en cada punto de medición se normalizó entonces al porcentaje del aptámero de longitud completa del punto de medición de la hora 0. La fracción del aptámero de longitud completa como una función del tiempo se ajustó a la ecuación : ml*e?(-m2*mO) en donde ml es el % máximo del aptámero de longitud completa (ml = 100) ; y m2 es la velocidad de degradación. La vida media del aptámero (T?/2) es igual a (In 2) /m2. Los datos de la muestra para el plasma humano se muestran en la Figura 24, y los resultados para los aptámeros probados se resumen en la Tabla 28. De manera consistente con nuestras esperanzas, los aptámeros son más estables en el plasma humano que en el plasma de rata y el incremento del número de modificaciones de 2 '-OMe se correlaciona con la estabilidad que se incrementa del plasma .

Tabla 28 Vida Media de la Estabilidad en Plasma del Aptámero EJEMPLO 4B: PK/PD de derivados PEGilados de ARC1368 en Macacos de Java ARC1368 (SEQ ID NO 291), 1779 (SEQ ID NO 320) y 1780 (SEQ ID NO 321) (como se describe en el Ejemplo 2 anterior) , se inyectaron de manera intravenosa en macacos de Java (n = 3/grupo) a una dosificación de 3 mg/kg, que se espera proporcione una concentración en plasma instantánea de 3 uM, aproximadamente 30 veces más alta que la dosis efectiva putativa. Posteriormente, las muestras de sangre cifradas se recolectaron a intervalos regulares y se procesaron para el plasma. Para demostrar que los aptámeros eran farmacológicamente activos in vivo, se realizó la agregación de las plaquetas inducida por Botracetina (BIPA) 5 minutos postdosificación, a la Cmax de plasma supuesta. Todos los animales tuvieron una inhibición completa de BIPA en este punto, demostrando que los aptámeros eran funcionales in vivo . Posteriormente, las concentraciones del aptámero en plasma se determinaron utilizando el ensayo Oligreen (Gray et al, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7 (3):133-140 (1997). Los datos se analizaron posteriormente utilizando el programa WinNonlin, para proporcionar los parámetros farmacocinéticos listados en las Tablas 29 a 31 siguientes . Además, la concentración del aptámero en plasma del primate, graficada como una función del tiempo, se describe en la gráfica de la Figura 25. Los perfiles de concentración media-tiempos basados en el ensayo OliGreen™, mostraron que los perfles farmacocinéticos de ARC1368 (SEQ ID NO 291), ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1779 (SEQ ID NO 320) eran principalmente monofásicos. El aptámero no PEGilado (ARC1368 (SEQ ID NO 291)), mostró una rápida fase de distribución en comparación con ARC1779 (SEQ ID NO 320) y ARC1780 (SEQ ID NO 321) . A diferencia de ARC1368 (SEQ ID NO 291), el conjugado de PEG de 40 kDa ARC1780 (SEQ ID NO 321), mostró una fase de distribución prolongada en comparación con ARC1779 (SEQ ID NO 320). ARC1779 (PEG de 20 kDa), mostró una fase de distribución con una vida media a de -2 horas .

Tabla 29 - Estimados de los Parámetros Farmacocinéticos no Compartimentales para ARC1368 Después de una Administración de 3 mg/kg IV en Monos Basándose en los Datos del Ensayo Oligreen Parámetro PK Unidad 1101 1102 1103 Media Desv. Est.

Tmax hr 0.08 0.08 0.08 0.08 0.00 Cmax ng/mL 26409 19170 23301 22960 3632 AUCO-último hr*ng/mL 23096 31926 20650 25224 5932 MRTúltimo hr 4.50 5.46 3.48 4.48 0.99 Tabla 30 - Estimados de los Parámetros Farmasocinéticos no Compartimentales para ARC1779 Después de una Administración de 3 mg/kg IV en Monos Basándose en los Datos del Ensayo Oligreen Parámetro PK Unidad 2101 2103 2104 Media Desv. Est.

Tmax hr 0.25 0.50 0.25 0.33 0.14 Cmax ng/mL 69065 65717 70344 68375 2389 AUCO-último hr*ng/mL 309245 336590 235503 293779 52288 MRTúltimo hr 5.27 4.66 2.69 4.21 1.35 Tabla 31 - Estimados de los Parámetros Farmacocinéticos no Compartimentales para ARC1780 Después de una Administración de 3 mg/kg IV en Monos Basándose en los Datos del Ensayo Oligreen Parámetro PK Unidad 3101 3101 3103 Media Desv. Est.

Tmax hr 2.00 2.00 0.25 1.42 1.01 Cmax ng/mL 55965 37320 50690 47992 9611 AUCO-último hr*ng/mL 740559 613180 899455 751065 143426 MRTúltimo hr 8.69 9.54 14.11 10.78 2.91 Después de los análisis del ensayo Oligreen, las concentraciones del aptámero en plasma se determinaron para los animales dosificados con ARC1779 (SEQ ID NO 320), utilizando el ensayo basado en HPLC validado. Los datos de HPLC se analizaron vía un análisis no compartimental y de 2 compartimientos utilizando el programa WinNonlin. El reanálisís de las muestras de los monos con un método de HPLC más sensible, generó un perfil de concentración-tiempo de ARC1779 (SEQ ID NO 320) que es bifásico, mostrando tanto la fase de distribución como de eliminación. De manera consistente con los resultados observados utilizando el ensayo OliGreen, los resultados basados en HPLC indicaron que la vida media de la distribución (t?/2a) fue de 1.4 horas, y la vida media de la eliminación fue de 12.9 (t?/2p) para ARC1779 (SEQ ID NO 320) .

EJEMPLO 4C: PK/PD de ARC1779 en Macacos de Java La correlación de -PK/PD de ARC1779 se evaluó en tres macacos de Java después de una sola dosis de un bolo intravenoso (IV) a 0.5 mg/kg. Los niveles de ARC1779 en el plasma se correlacionaron con los efectos PD de ARC1779 en la inhibición de la función de las plaquetas a la prolongación del tiempo de sangrado subcutáneo (CBT) . Después de la administración IV, la sangre se recolectó de manera percutánea a varios puntos de medición postdosis para los análisis de PK y PD. El efecto PD de ARC1779 en la función de las plaquetas, se determinó por ensayos PFA-100 y el efecto de ARC1779 en el sangrado se midió por el tiempo de CBT. Además, las muestras de plasma se analizaron mediante HPLC para la cuantificación de los niveles de ARC1779. Los estimados del parámetro de PK se determinaron por un análisis con 2 compartimientos. Los resultados se presentan en la Figura 26. Los perfiles de concentración-tiempo generados para los monos individuales mostraron de manera predominante la fase de distribución de la farmacocinética de ARC1779. La vida media de distribución se determinó de aproximadamente 1.0 hora (t?/2a) . La vida media de eliminación (t?/2ß) , no se determinó bien de los datos disponibles . El efecto de PD de ARC1779 en la agregación de las plaquetas medido por en ensayo PFA-100, se muestra en la Figura 26. Cuando las concentraciones en plasma de ARC1779 están en exceso de 300 nM, la función de las plaquetas se inhibió, como se valoró por el instrumento PFA-100. Sin embargo, cuando las concentraciones del aptámero en plasma disminuyeron a aproximadamente 77 nM, la función de las plaquetas regresó a lo normal. Como también se observa en la Figura 26, el efecto PD de ARC1779 en la prolongación del tiempo de sangrado se encontró que es mínimo en estos estudios. En resumen, ARC1779 inhibió la función de las plaquetas in vivo a una concentración en plasma de aproximadamente 300 nM. Esta concentración in vivo fue aproximadamente 3 veces más alta que la concentración observada del aptámero, necesaria para inhibir la función de las plaquetas in vi tro . En contraste, incluso a concentraciones en plasma mayores (1000 nM) , ARC1779 mostró un efecto mínimo en el tiempo del sangrado subcutáneo después de una dosificación de un solo bolo. EJEMPLO 5: ENSAYOS ANIMALES FUNCIONALES En los Ejemplos 4 y 5 descritos en la presente, todos los datos de concentración basados en masa, se refieren únicamente al peso molecular de la porción oligonucleotídica del aptámero, sin importar la masa conferida por la conjugación con PEG.

EJEMPLO 5A: Farmacodinámica de ARC1779 en Macacos de Java Los macacos de Java se dosificaron a un bolo IV de 0.5 mg/kg con ARC1779 (SEQ ID NO 320). El tiempo de cierre con PFA-100, BIPA y el tiempo del sangrado cutáneo ("CBT") , se midieron todos como una función del tiempo a través de los estudios. El BIPA y los tiempos de cierre con PFA-100, se midieron como se describió previamente en el Ejemplo 3. Los tiempos de sangrado cutáneos se midieron utuilizando los protocolos estándar descritos como sigue. Un puño para la presión sanguínea se aplicó a la región del bíceps del antebrazo para probarse e inflarse para mantener una presión constante de 40 mmHg. Utilizando un Dispositivo de Incisión Automática Surgicutt® (ITC, Edison, NJ) , se hizo una incisión longitudinal sobre la cara lateral de la superficie volar del brazo distal al pliegue antecubital. Un cronómetro se inició en el tiempo de la incisión. A los 15-30 segundos posteriores a la incisión, la sangre se absorbió con Papel para Transferencia del Tiempo de Sangrado Surgicutt® (ITC, Edison, NJ) , mientras se evita el contacto directo con la incisión. Cada 15-30 segundos, el papel para la transferencia se giró y volvió a transferir a un sitio fresco en el papel. La transferencia se repitió hasta que ya no se absorbió sangre en el papel o durante 30 minutos, lo que ocurra primero. El tiempo de sangrado se determian en el transcurso de 30 segundos cuando la sangre ya no se absorbe en el papel. La tabla de la Figura 27 muestra el tiempo del sangrado subcutáneo en minutos, CI90 de BIPA en nM y CI95 de PFA en nM a varios puntos de medición, mostrados en la columna 1, con relación a la dosificación de ARC1779 (SEQ ID NO 320) para tres animales diferentes. La Figura 28 muestra una gráfica de tiempo de cierre con PFA-100 promedio de la sangre de tres macacos tratados con ARC1779 (SEQ ID NO 320) tomadas a varios puntos de medición después de la dosificación. La Figura 29 muestra el tiempo del sangrado cutáneo de tres macacos tratados con ARC1779 (SEQ ID NO 320) , tomada a varios puntos de medición después de la dosificación. La Figura 30 correlaciona el tiempo de sangrado promedio en los macacos de Java tratados con ARC1779 (SEQ ID NO 320) (eje vertical izquierdo) con el tiempo de cierre de PFA-100 (eje vertical derecho) . Como se muestra en las Figuras 27 a 30, en los puntos de medición hasta a, y que incluyen 2 horas, en donde BIPA y el tiempo de cierre con PFA-100 se inhibieron de manera máxima, hay muy poco incremento en los tiempos de sangrado cutáneos. A concentraciones del antagonista anti-gpllbllla Integrilin™, que proporciona una inhibición similar de la agregación de las plaquetas ex vivo, los tiempos de sangrado de la plantilla o cutáneos son de entre 20 y 30 minutos. Véase, por ejemplo Phillips, D.R. y Scarborough, R.M., Am J Cardiol, 80 (4A) :11B-20B (1997). Aunque no se desea apegarse a ninguna teoría en particular, estos datos son consistentes con, y apoyan nuestra hipótesis de que la el antagonista del aptámero del diminio Al de anti-vWF bloquea la actividad de las plaquetas in vivo bloqueando las plaquetas para que se unan al vWF inmovilizada en los sitios de daño vascular sin inhibir la función de las plaquetas y por lo tanto, sin incrementar los tiempos de sangrado cutáneo.

EJEMPLO 5B: Valoración de ARC1779 en un modelo de trombosis electrolítica en macacos de Java Se realizó un estudio para probar la eficacia de ARC1779 (SEQ ID NO 320) para inhibir la trombosis intraarterial en un modelo de trombosis electrolítica de primate no humano bien documentado. Véase, por ejemplo, Rote et al, Stroke, 1994:25, 1223-1233. Trece monos de Java se dividieron en cuatro grupos y se asignaron a un régimen de tratamiento como se indica en la tabla 30 siguiente.

Tabla 32. Diseño de la Trombosis Electrolítica DVE Equivalente del Volumen de la Dosis, IV = Intravenosa Cada animal se anestesió antes de la preparación quirúrgica, se intubó y se mantuvo con anestesia con el anestésico inhalado isoflurano para efectuar el suministro a través del respirador con volumen regulado. También se colocó un catéter intravenoso en la vena periférica para la administración de solución de Ringer lactato durante el procedimiento . Se colocó un catéter en la arteria femoral de cada animal para la verificación continua de la presión sanguínea arterial. De manera similar, se colocó un catéter en la vena femoral para la recolección de la muestra de sangre.

Cada arteria carótida se instrumentó con una sonda de flujo Doppler conectada a un medidor de flujo. Las sondas de flujo se colocaron alrededor de la arteria en un punto próximo a la inserción del electrodo intraarterial y la estenosis . La estenosis se colocó alrededor de cada arteria carótida, de manera que el flujo de sangre se redujo por aproximadamente 50% a 60% sin alterar el flujo sanguíneo medio. El flujo de sangre en las arterias carótidas se verificó y registró de manera continua a través de los periodos de observación. La lesión electrolítica en la superficie íntima de cada arteria carótida se logró vía la colocación de un electrodo intravascular. Cada electrodo se conectó al polo positivo de un dispositivo de corriente constante, y el cátodo se conectó a un sitio subcutáneo distante. La corriente continua se suministró a cada vaso durante un periodo de 3 horas o 30 minutos después de la oclusión completa, lo que sea más corto. Una vez que los electrodos se colocaron en la arteria carótida derecha ("RCA") , se le administró al animal el artículo de prueba como se indicó en la Tabla 32 anterior. Aproximadamente 15 minutos después de la administración del artículo de prueba, la corriente eléctrica se aplicó a 100 µA. Las muestras de sangre y las mediciones CBT se recolectaron en los puntos de medición especificados en el Programa de Recolección de las Muestras de Sangre como se indica en la Figura 31. La corriente se terminó a ~30 minutos después de que la señal del flujo de sangre permanecía estable a flujo cero (que indica que se ha formado un trombo oclusor en el sitio) , o después de 180 minutos de estimulación eléctrica. Aproximadamente 195 minutos después de que el artículo de prueba se administró, la arteria carótida izquierda ("LCA") , tuvo una corriente eléctrica administrada de una manera similar a como se describió previamente para la RCA. Después de la terminación de todos los procedimientos quirúrgicos y la recolección de sangre, cada animal se sometió a eutanasia. La concentración en plasma de ARC1779 (SEQ ID NO 320) (como se mide mediante HPLC) , con respecto al tiempo para cada animal en el grupo de tratamiento 3, se describe en la Figura 32. El tiempo para la oclusión medida vía el flujo Doppler para cada grupo de tratamiento, se indica en la Figura 33. Como puede determinarse de la Figura 33, ARC1779 (SEQ ID NO 320), inhibió la formación de trombos durante las lesiones eléctricas de 180 minutos secuenciales a las arterias carótidas de los monos de Java en este modelo de trombosis animal.

Ejemplo 5C : Valoración de ARC1779 a varias dosis en un modelo de trombosis electrolítica del macaco de Java El estudio descrito en el Ejemplo 5B anterior se extendió para probar la eficacia de ARC1779 (SEQ ID NO 320) en la inhibición de la trombosis intraarterial en el modelo de la trombosis electrolítica de primate no humano a niveles de dosificación del aptámero más bajos. 10 monos de Java adicionales (2.5 a 3.5 kg) , se dividieron en los grupo de tratamientos 5 a 7 y se trataron de acuerdo con el régimen indicado en la Tabla 33 siguiente.

El procedimiento animal para cada grupo de tratamiento en la Tabla 33, se realizó como se reporta para los animales en el Ejemplo 5B. El tiempo de oclusión medido vía el flujo Doppler para cada grupo de tratamiento se indica en la Figura 33. Sin ninguna terapia antagonista de las plaquetas (animales control) 100% de las arterias carótidas desarrollaron trombos oclusores en el transcurso de 60 minutos. En contraste, únicamente 20% o las arterias desarrollaron trombos oclusores en animales tratados con Reopro. En los grupos de tratamiento con ARC1779 a velocidades de infusión seleccionadas para alcanzar niveles en plasma constantes de 1000 nM, 750 nM, 500 nM y 300 nM, 0%, 25%, 63% y 100% de las arterias carótidas desarrollaron trombos oclusores . Además de la formación de trombos oclusores, también valoramos el efecto de ARC1779 en los tiempos del sangrado cutáneos, que se muestran en la Figura 34. Como puede observarse en la Figura 34, a algunas dosis y/o puntos de medición en este modelo animal, se observó CBT prolongado, mientras que a otras dosis y puntos de medición, el CBT no se prolongó. Habiéndose descrito ahora la invención por medio de la descripción escrita y los ejemplos, aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse en una variedad de modalidades y que la descripción y ejemplos anteriores son para propósitos de ilustración y no de limitación de las siguientes reivindicaciones .

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Un aptámero que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: ARC1029 (SEQ ID NO 214), ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284), ARC1368 (SEQ ID NO 291), SEQ ID NO 1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) . 2. El aptámero según la reivindicación 1, en donde el aptámero comprende una secuencia primaria de ácidos nucleicos que es 95% idéntica a una secuencia primaria de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste de: ARC1029 (SEQ ID NO 214), ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284), ARC1368 (SEQ ID NO 291), SEQ ID NO 1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) . 3. El aptámero según la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácidos nucleicos del aptámero comprende una modificación química y es 95% idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos, incluyendo la modificación química, seleccionada del grupo que consiste de: ARC1029
(SEQ ID NO 214), ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID
NO 222), ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284), ARC1368 (SEQ ID NO 291), SEQ ID NO 1635 (SEQ ID NO 319), ARC1759 (SEQ ID NO 318) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) .
4. El aptámero según la reivindicación 1, en donde el aptámero está conjugado a un compuesto con alto peso molecular, no inmunogénico o un compuesto lipofílico.
5. El aptámero según la reivindicación 4, en donde el aptámero está conjugado a un compuesto no inmunogénico, de alto peso molecular, el cual es polialquilenglicol .
6. El aptámero según la reivindicación 5, en donde el polialquilenglicol es polietilenglicol.
7. El aptámero según la reivindicación 6, en donde el polietilenglicol comprende un peso molecular seleccionado del grupo que consiste de: 5 kDa, 10 kDA, 20 kDa y 40 kDa.
8. El aptámero según la reivindicación 7, en donde el aptámero se selecciona del grupo que consiste de: ARC1779 (SEQ ID NO 320), ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1885 (SEQ ID NO 323) .
9. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un aptámero según la reivindicación 1 o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. Un método para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad mediada por el vWF, que comprende administrar la composición según la reivindicación 9 a un mamífero.
11. Un método para tratar un paciente, que comprende administrar la composición según la reivindicación 9 a un paciente en necesidad del mismo antes, durante y/o después de la diálisis, cirugía CABG, intervención coronaria percutánea o reemplazo de la válvula cardiaca .
12. El método según la reivindicación 10, en donde la composición comprende ARC1368 (SEQ ID NO 291) o un fragmento del mismo conjugado a un PEG de 20 kDA.
13. El método según la reivindicación 12, en donde la composición comprende ARC1779 (SEQ ID NO 320) .
14. El método según la reivindicación 11, en donde la composición comprende ARC1368 (SEQ ID NO 291) o un fragmento del mismo conjugado a un PEG de 20 kDA.
15. El método según la reivindicación 14, en donde la composición comprende ARC1779 (SEQ ID NO 320) .
16. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un aptámero según la reivindicación 8 o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
17. Un método para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad mediada por el vWF, que comprende administrar la composición según la reivindicación 16 a un mamífero.
18. Un aptámero que se une de manera específica a un objetivo del Factor de von Willebrand.
19. El aptámero según la reivindicación 18, en donde el objetivo del Factor de von Willebrand es el Factor de von Willebrand humano.
20. El aptámero según la reivindicación 18, en donde el aptámero modula la agregación de las plaquetas mediada por el Factor de von Willebrand.
21. Un aptámero según la reivindicación 18, que se une de manera específica a un objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand y un objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand.
22. El aptámero según la reivindicación 21, en donde el objetivo de longitud completa del Factor de von Willebrand y el objetivo del dominio Al del Factor de von Willebrand son de diferentes especies.
23. Un método de diagnóstico que comprende poner en contacto un aptámero según la reivindicación 18 con una composición que se sospecha que comprende el Factor de von Willebrand o una variante del mismo, y detectar la presencia o ausencia del Factor de von Willebrand o una variante del mismo.
24. Un método para identificar un aptámero que modula una función biológica de un aptámero objetivo, que comprende: a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos de una sola hebra; b) poner en contacto la mezcla candidata con el objetivo de la proteína de longitud completa y un dominio del objetivo de la proteína de longitud completa; c) separar los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada para el objetivo de la proteína de longitud completa o el dominio objetivo de la proteína; y d) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada, in vitro, para proporcionar una mezcla del aptámero enriquecida específica del objetivo de la proteína.
25. El método según la reivindicación 24, en donde el método comprende además; e) poner en contacto la mezcla del aptámero enriquecida específica del objetivo con el objetivo de la proteína de longitud completa; f) separar los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada para el objetivo de la proteína de longitud completa; y g) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada, in vitro; para proporcionar una mezcla del aptámero enriquecida específica del objetivo; h) poner en contacto la mezcla del aptámero enriquecida específica del objetivo con el dominio objetivo de la proteína; f) separar los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada para el dominio objetivo de la proteína; y g) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada, in vitro, para proporcionar una mezcla del aptámero enriquecida específica del objetivo de la proteína.
26. El método según la reivindicación 25, en donde el método comprende además seleccionar un aptámero que bloquea una función biológica del objetivo de la proteína de longitud completa in vivo .
27. El método según la reivindicación 25, en donde el objetivo de la proteína de longitud completa es de una primer especie y el dominio objetivo de la proteína es de una segunda especie.
28. El método según la reivindicación 27, que comprende además seleccionar un aptámero capaz de unirse a la proteína objetivo de la primera y la segunda especies.
29. Un aptámero identificado por el método de la reivindicación 26.
30. Un aptámero que se une de manera específica al Factor de von Willebrand, que comprende una secuencia primaria de ácido nucleico al menos 95% idéntica a cualquiera de las secuencias primarias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste de: las SEQ ID NOS 31 a 50, SEQ ID NOS 54 a 94, SEQ ID NOS 98 a 164, SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 183, SEQ ID NO 186, SEQ ID NO 189, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 201, SEQ ID NO 205, SEQ ID NO 208, SEQ ID NOS 212-214, ARC1115 (SEQ ID NO 221), ARC1172 (SEQ ID NO 222), ARC1194 (SEQ ID NO 223) a ARC1240 (SEQ ID NO 269), ARC1338 (SEQ ID NO 273) a ARC1346 (SEQ ID NO 281), ARC1361 (SEQ ID NO 284) a ARC1381 (SEQ ID NO 304), ARC1524 (SEQ ID NO 305), ARC1526 (SEQ ID NO 307) a ARC1535 (SEQ ID NO 316), ARC1546 (SEQ ID NO 317), ARC1759 (SEQ ID NO 318), ARC1635 (SEQ ID NO 319), ARC1779 (SEQ ID NO 320) a ARC1780 (SEQ ID NO 321) y ARC1884 (SEQ ID NO 322) a ARC1885 (SEQ ID NO 323) .
31. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un aptámero según la reivindicación 30 o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
32. Un método para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad mediada por el vWF, que comprende administrar una composición según la reivindicación 31 a un mamífero .
33. Un método para tratar un paciente, que comprende administrar la composición según la reivindicación 31 a un paciente en necesidad del mismo antes, durante y/o después de la diálisis, cirugía CABG, intervención coronaria percutánea o reemplazo de la válvula cardiaca.
34. Un método de diagnóstico que comprende poner en contacto un aptámero de 30 con una composición que se sospecha comprende el Factor de von Willebrand o una variante del mismo y detectar la presencia o ausencia del Factor de von Willebrand o una variante del mismo.
35. Un aptámero según la reivindicación 30, para utilizarse como un diagnóstico in vitro.
36. Un aptámero según la reivindicación 30, para utilizarse como un diagnóstico in vivo .
37. El método según la reivindicación 24, en donde el aptámero objetivo es el Factor de von Willebrand.
38. El método según la reivindicación 24, en donde el dominio del objetivo de la proteína de longitud completa es el dominio Al del Factor de von Willebrand.
39. El método según la reivindicación 25, en donde el objetivo de la proteína de longitud completa es el Factor de von Willebrand.
40. El método según la reivindicación 39, en donde el dominio objetivo de la proteína es el dominio Al del Factor de von Willebrand.
41. El método según la reivindicación 28, en donde la proteína objetivo de la primera y segunda especies es un objetivo del Factor de von Willebrand.
42. Un aptámero identificado según el método de la reivindicación 41.