JP5242918B2 - 補体関連障害の治療に有用なアプタマー治療法 - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は一般的には核酸の分野、そして特に、補体関連の心臓、炎症及び自己免疫の障害、虚血再灌流傷害及び／又はＣ５媒介補体活性化が関与する他の疾患又は障害における治療薬及び診断薬として有用な、補体系のＣ５蛋白に結合することができるアプタマーに関する。本発明は更にＣ５補体系蛋白に結合できるアプタマーの投与のための物質及び方法に関する。
（発明の背景）
アプタマーは古典的なワトソンクリック塩基対形成とは異なる相互作用を介した分子への特異的結合親和性を有する核酸分子である。
アプタマーはファージディスプレイにより形成されるペプチド又はモノクローナル抗体（「ＭＡｂ」）と同様、選択された標的に特異的に結合し、そして標的の活性をモジュレートすることができ、例えば結合アプタマーを介してその標的が機能する能力をブロックする場合がある。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから得られたインビトロの選択過程により作成された場合、アプタマーは成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン及び受容体を包含する１００超の蛋白について作成されている。典型的なアプタマーは１０〜１５ｋＤａの大きさ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル未満の親和性でその標的に結合し、そして、緊密に関連する標的を識別する（例えばアプタマーは典型的には同じ遺伝子ファミリーに属する別の蛋白に結合しない）。一連の構造の研究によれば、アプタマーは抗体−抗原複合体における親和性及び特異性を駆動する結合相互作用（例えば水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体的排除）の同じ型を用いることができる。
アプタマーは高い特異性及び親和性、生物学的薬効及び優れた薬物動態を含む治療薬及び診断薬として使用するための多くの望ましい特性を有している。更にまた、例えば以下に示すような抗体及び他の蛋白の生物学的特徴を超えた特異的競合性の利点を与える。
１）速度及び制御性。アプタマーは完全にインビトロの工程により生産され、治療の手がかりを含む初期の手がかりの急速な形成を可能にする。インビトロの選択はアプタマーの特異性及び親和性を着実に制御できるようにし、そして、毒性及び非免疫学的な標的に対する手がかりを含む手がかりの形成を可能にする。
２）毒性及び免疫原性。アプタマーはクラスとして毒性又は免疫原性が僅かであるか皆無である。ラット又はウッドチャックに高水準のアプタマーを長期投与した場合（毎日１０ｍｇ／ｋｇ、９０日間）、如何なる臨床、細胞又は生化学的尺度においても毒性は観察されなかった。多くのモノクローナル抗体の薬効は抗体自体への免疫学的応答により大きく低減されるが、アプタマーはＭＨＣを介してＴ細胞により呈示されず、そして免疫応答は一般的に核酸フラグメントを認識しないように訓練されているという最も可能性の高い理由のため、アプタマーに対する抗体を誘導することは極めて困難である。
３）投与。現在認可されている抗体治療薬の大部分は静注（典型的には２〜４時間）により投与されるが、アプタマーは皮下注射により投与できる（皮下投与によるアプタマーの生体利用性はサルによる試験では＞８０％である（非特許文献１）。この相違の主な原因は、比較的低い溶解度、及び、それによる大部分の治療用ＭＡｂで必要とされる大容量である。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）及び比較的小さい分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）のためアプタマーを０．５ｍｌ未満の容量の注射により毎週送達してよい。更にまた、アプタマーは小型であるために、それは、抗体又は抗体フラグメントが浸透できないコンホーメーション的に緊縮した領域にも浸透することができ、アプタマー系の治療又は予防の別の利点をもたらす。
４）拡張性及び費用。治療用アプタマーは化学的に合成され、そしてその結果、製造の要求性に合致するために必要とされるとおり容易に拡張することができる。製造の拡張における困難な点のため現在は一部の生物学的な利用性が制限されており、そして大規模蛋白製造プラントの資本経費は多大であるが、単一の大規模オリゴヌクレオチド合成器は１００ｋｇ／年超を生産することができ、そして初期投資も比較的適度ですむ。キログラム規模におけるアプタマーの合成のための現在の資材経費は推定で５００ドル／ｇであり、高度に至適化された抗体と同等である。工程の開発の持続的改良により５年以内に１００ドル／ｇ未満にまで資材経費を低減できることが期待される。
５）安定性。治療用アプタマーは化学的に頑健である。それらは熱及び変性物質のような要因への曝露後に活性を回復できるよう固有に適合されており、凍結粉末として室温で長期間（＞１年）保存できる。
（補体系）
補体系は病原体の細胞外形態（例えば細菌）を攻撃するための調節されたカスケード系において共に機能する血漿及び膜蛋白少なくとも２０種のセットを含む。補体系は２つの異なる酵素活性化カスケード、即ち、古典的代替経路（図１）及び膜攻撃経路として知られている非酵素的経路を包含する。
古典的経路として知られている第１の酵素的に活性化されるカスケードは数種の成分、即ちＣ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３及びＣ５（経路の順に列挙）を含む。補体系の古典的経路の開始は免疫性及び非免疫性の活性化物質の両方による第１の補体成分（Ｃ１）の結合及び活性化の後に起こる。Ｃ１は成分Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓのカルシウム依存性複合体を含み、Ｃ１ｑ成分の結合を介して活性化される。Ｃ１ｑは６つの同一のサブユニットを含有し、各サブユニットは３つの鎖（Ａ、Ｂ及びＣ鎖）を含む。各鎖はコラーゲン様テイル部に連結した球状のヘッド領域を有する。抗原−抗体複合体によりＣ１ｑの結合及び活性化はＣ１ｑヘッド基領域を介して起こる。多くの非抗体Ｃ１ｑ活性化物質、例えば蛋白、脂質及び核酸がコラーゲン様ストーク領域上の異なる部位を介してＣ１ｑに結合して活性化する。次にＣ１ｑｒｓ複合体は補体成分Ｃ４及びＣ２の活性化を触媒し、Ｃ４ｂＣ２ａ複合体を形成し、これがＣ３コンバターゼとして機能する。
代替経路として知られている第２の酵素的に活性化されるカスケードは補体系の活性化及び増幅に関する急速な抗体非依存性の経路である。代替経路は数種の成分、即ちＣ３、Ｂ因子及びＤ因子（経路の順に列挙）を含む。代替経路の活性化はＣ３ｂ、すなわちＣ３の蛋白分解性切断形態が細菌のような活性化表面物質に結合した場合に起こる。次に因子ＢがＣ３ｂに結合し、そしてＤ因子により切断されて活性酵素のＢａを生成する。次に酵素Ｂａが更にＣ３を切断して更にＣ３ｂを形成し、活性化表面上にＣ３ｂ−Ｂａ複合体の広範な付着をもたらす。
即ち、古典的及び代替の補体経路は共にＣ３因子をＣ３ａ及びＣ３ｂに分離するＣ３コンバターゼを生産する。この時点において、両方のＣ３コンバターゼは更に組み立てられてＣ５コンバターゼとなる（Ｃ４ｂ２ａ３ｂ及びＣ３ｂ３ｂＢｂ）。これ等の複合体はその後補体成分Ｃ５を２つの成分、即ちＣ５ａポリペプチド（９ｋＤａ）及びＣ５ｂポリペプチド（１７０ｋＤａ）に切断する。Ｃ５ａポリペプチドは元は白血球に関連していたが現在は肝細胞及びニューロンを含む種々の組織上で発現されることが分かっている７膜貫通Ｇ蛋白結合受容体に結合する。Ｃ５ａ分子はヒト補体系の主に走化性の成分であり、白血球の化学走性、平滑筋の収縮、細胞内シグナル伝達経路の活性化、好中球−内皮細胞接着、サイトカイン及び脂質メディエーターの放出及び酸化物質形成を包含する種々の生物学的応答をトリガーすることができる。
より大型のＣ５ｂフラグメントは補体カスケードの後の成分、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９に順次結合し、Ｃ５ｂ−９膜攻撃複合体（「ＭＡＣ」）を形成する。Ｃ５ｂ−９ＭＡＣは赤血球を直接溶解し、そしてより大量には白血球に対しても溶解性であり、筋肉、上皮及び内皮のような組織を損傷する。溶解未満の量においては、ＭＡＣは接着分子のアップレギュレーション、細胞内カルシウムの増大及びサイトカインの放出を促進することができる。更にまた、Ｃ５ｂ−９ＭＡＣは細胞溶解を起こすことなく内皮細胞及び血小板のような細胞を刺激することができる。Ｃ５ａ及びＣ５ｂ−９ＭＡＣの非溶解性作用は場合により極めて同様である。
補体系は健康の維持において重要な役割を有するが疾患を誘発又はこれに寄与する可能性もある。例えば補体系は冠動脈バイパスグラフト（「ＣＡＢＧ」）手術に関連する副作用、多くの腎臓、リューマチ性、神経学的、皮膚科的、血液学的、血管／肺、アレルギー、感染及び生体適合性／ショック性の疾患及び／又は状態及び糖尿病性網膜症に関与するとされている。補体系は必ずしも疾患状態の唯一の原因ではなく、病因に寄与する数種の因子の１つであると考えられる。
非特許文献２において、心肺バイパス（ＣＰＢ）を伴う冠動脈バイパスグラフト手術を受けた患者に対する抗Ｃ５１本鎖抗体フラグメントペキセリズマブの作用が試験されている。個々の患者に、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ及び２．０ｍｇ／ｋｇでＣＰＢを投与する直前に１０分の単回投与においてペキセリズマブを投与した。ＣＰＢの投与前、投与後５分、２８℃５分後、再加温開始後、３７℃５分後、及び７日後まで、血液試料を採取して補体活性を試験した。薬力学的分析によれば、２ｍｇ／ｋｇの用量で１４時間まで補体溶血活性の有意な用量依存的抑制が明らかになり、そして前炎症補体副生成物（ｓＣ５ｂ−９）の形成は用量依存的な態様で効果的に抑制された。しかしながら、前述した通り、抗体治療薬には特定の限界がある。
Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．７３２：２０３−２１２（１９９９） Ｆｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．１００：２４９９−５０６（１９９９）
従って、補体関連障害の治療における治療薬及び診断薬として使用するための補体系の新しい抑制剤を保有することが有利である。
（発明の要旨）
本発明は補体関連疾患の治療、予防及び軽減のための物質及び方法を提供する。１つの実施形態において、自身の５’末端にコンジュゲートしたＰＥＧを有するＡＲＣ１８６（配列番号４）に従ったヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。特定の実施形態においては、このＡＲＣ１８６アプタマー／ＰＥＧコンジュゲートは配列番号４の配列を含むアプタマーと実質的に同じＣ５補体蛋白に対する結合親和性を有している。本明細書においては実質的に同じ結合親和性とは、ドットブロット分析により測定した場合の解離定数が約２〜１０倍差以下、好ましくは２〜５倍差以下であることを意味する。一部の実施形態においては、解離定数は後述する実施例１Ａに記載する通り競合ドットブロット分析により測定する。一部の実施形態においてはアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートは霊長類において少なくとも１５時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間の、ツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。一部の実施形態においては、アプタマー／ＰＥＧコンジュゲートはラットにおいて少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも１５の、ツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。一部の実施形態においては、ＡＲＣ１８６（配列番号４）の５’末端にコンジュゲートしたＰＥＧは４０ｋＤａＰＥＧである。特定の実施形態においては、４０ｋＤａＰＥＧは分枝鎖ＰＥＧである。一部の実施形態においては、分枝鎖４０ｋＤａＰＥＧは１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）である。他の実施形態においては、分枝鎖４０ｋＤａＰＥＧは２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイルである。
分枝鎖４０ｋＤａＰＥＧが１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）である実施形態においては、下記式：
Figure 0005242918
 の構造を有するアプタマーが提供され、ここで、
Figure 0005242918
 はリンカーを指し、
Figure 0005242918
 であり、ここで、ｆＣ及びｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、そしてｍＧ及びｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは２’−ＯＨである。
分枝鎖４０ｋＤａＰＥＧが２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイルである実施形態においては、下記式：
Figure 0005242918
 の構造を有するアプタマーが提供され、ここで、
Figure 0005242918
 はリンカーを指し、
Figure 0005242918
 であり、ここで、ｆＣ及びｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、そしてｍＧ及びｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは２’−ＯＨである。
本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、リンカーはアルキルリンカーである。特定の実施形態においては、アルキルリンカーは２〜１８連続ＣＨ２基を有する。好ましい実施形態においては、アルキルリンカーは２〜１２連続ＣＨ２基を有する。特に好ましい実施形態においては、アルキルリンカーは３〜６連続ＣＨ２基を有する。
特定の実施形態においては、下記式：
Figure 0005242918
 の構造を有するアプタマー、ＡＲＣ１８７（配列番号５）が提供され、ここで、
Figure 0005242918
 であり、ここで、ｆＣ及びｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、そしてｍＧ及びｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは２’−ＯＨである。
別の実施形態においては、下記式：
Figure 0005242918
 の構造を有するアプタマー、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）が提供され、ここで、
Figure 0005242918
 であり、ここで、ｆＣ及びｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、そしてｍＧ及びｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは２’−ＯＨである。
別の特徴において、本発明は医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、ＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）又はその塩の治療有効量を含む医薬組成物が提供される。本発明のこの特徴において、インビボの疾患の治療、予防又は軽減において使用するためのＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の医薬組成物が提供される。
本発明の別の特徴において、治療方法が提供される。１つの実施形態において、本発明の方法はＣ５補体蛋白、及び／又はその誘導体Ｃ５ａ及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患を治療、予防又は軽減することを包含し、方法は、脊椎動物に対し、ＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）又はその塩を含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、方法は哺乳類に本発明の医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態においては、哺乳類はヒトである。
一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、急性虚血性疾患（心筋梗塞、脳卒中、虚血／再灌流傷害）；急性炎症性疾患（感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶）；慢性炎症性及び／又は免疫媒介性の疾患（アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は亜急性／慢性の移植片拒絶、糸球体腎炎及び他の腎疾患）である。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、透析又は血液が合成チューブ及び／又は外来性の物質を通過する環境に関連する補体活性化を包含する。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、ＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害及び再狭窄に関連する心筋傷害よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、ＣＡＢＧ手術に関連する合併症である。特定の実施形態においては、治療すべき疾患はＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害である。
一部の実施形態においては、本発明の方法は、内因性Ｃ５補体蛋白の約０．５〜約１０倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために、ＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、医薬品ＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）アプタマー組成物は、内因性Ｃ５補体蛋白の約０．７５倍〜約５倍、０．７５〜約３倍、及び１．５〜約２倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与されるが、別の実施形態においてはアプタマー組成物は内因性補体蛋白と等しい濃度を達成するために投与される。一部の実施形態においては、ＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を含む本発明の医薬組成物は約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ、約１．５μＭ、約１μＭ又は約５００ｎＭのアプタマー血漿中濃度を達成するために投与される。
本発明のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与の経路、期間及び速度の何れかの組み合わせを用いてよい。一部の実施形態においては、医薬組成物は静脈内投与する。一部の実施形態においては、医薬組成物は瞬時及び／又は連続注入により投与する。
ＣＡＢＧ手術に関連する合併症、特にＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害を治療、予防及び／又は軽減する特定の実施形態において、本発明の方法は、手術の前に医薬組成物を投与すること、及び、投与を少なくとも２４時間、一部の実施形態においては約４８時間、又は一部の実施形態においては約７２時間継続することを包含する。本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、アプタマーのより低用量の静注の前、これと同時、又は、その後に、治療すべき患者のｋｇ当たり約０．７５〜１．２５、好ましくは約１ｍｇのアプタマーの静脈内瞬時投与により、内因性補体蛋白濃度の約２倍の血漿中アプタマー濃度を達成し、ここでｍｇ用量はコンジュゲートＰＥＧの重量を含まない。一部の実施形態においては、より低用量を０．００１〜０．００５ｍｇ／ｋｇ／分の範囲から選択される速度で注入し、ここで、ｍｇ用量はコンジュゲートＰＥＧの重量を含まない。特定の実施形態においては、より低用量は約０．００１３ｍｇ／ｋｇ／分の速度で注入する。アプタマー／コンジュゲートが十分長い半減期を有するこの特徴の更に別の実施形態においては、アプタマーの医薬組成物は静脈内瞬時投薬として１日１回又は２回投与してよい。
本発明の別の特徴において、診断方法が提供される。１つの実施形態において、診断方法は、Ｃ５補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる組成物にＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）を接触させること、及び、Ｃ５補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在を検出することを含む。一部の実施形態においては、補体蛋白又はその変異体は脊椎動物、特に哺乳類、とりわけヒトである。本発明はインビトロ又はインビボの診断薬として使用するためのＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）組成物を提供する。
本発明の別の特徴においては、ＡＲＣ３３０（配列番号２）及びＡＲＣ１８８〜１８９、ＡＲＣ２５０、ＡＲＣ２９６〜２９７、ＡＲＣ３３１〜３３４、ＡＲＣ４１１〜４４０、ＡＲＣ４５７〜４５９、ＡＲＣ４７３、ＡＲＣ５２２〜５２５、ＡＲＣ５３２、ＡＲＣ５４３〜５４４、ＡＲＣ５５０〜５５４、ＡＲＣ６５７〜６５８、ＡＲＣ６７２、ＡＲＣ７０６、ＡＲＣ１５３７、ＡＲＣ１７３０（配列番号６〜配列番号６６）よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列を含むアプタマーは配列番号１の配列を含む。特定の実施形態においては、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。アプタマーが配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む一部の実施形態においては、アプタマーは配列番号４の配列を含むアプタマーと実質的に同じＣ５補体蛋白に対する結合親和性を有する。
アプタマーが配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む一部の実施形態においては、アプタマーは霊長類において少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０時間のツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。アプタマーが配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む一部の実施形態においては、アプタマーはラットにおいて少なくとも１時間半、好ましくは少なくとも７時間のツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。
アプタマーが配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、アプタマーは以下の通り、即ち
Figure 0005242918
 となるように５’リンカーを用いて合成され、ここで、
Figure 0005242918
 はリンカーである。一部の実施形態においては、リンカーは以下の通り、即ちＨ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−５’アプタマー３’であるアルキルリンカーであり、ここでｎ＝２〜１８、好ましくはｎ＝２〜１２、より好ましくはｎ＝３〜６、更に好ましくはｎ＝６であり、
Figure 0005242918
 （配列番号４）｛式中、ｆＣ及びｆＵ＝２’−フルオロヌクレオチド、そしてｍＧ及びｍＡ＝２’−ＯＭｅヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは２’−ＯＨである｝である。得られるアミン修飾アプタマーは１０ｋＤａＰＥＧ、２０ｋＤａＰＥＧ、３０ｋＤａＰＥＧ及び４０ｋＤａ線状ＰＥＧよりなる群から選択されるＰＥＧ部分にコンジュゲートしてよい。一部の実施形態においては、配列番号１、配列番号２及び配列番号６〜配列番号６６よりなる群から、特に配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーの治療有効量を含む医薬組成物またはその塩が提供される。本発明の医薬組成物は製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含んでよい。本発明のこの特徴において、配列番号２及び配列番号６〜配列番号６６よりなる群から、特に配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを含む、インビボにおける疾患の治療、予防又は軽減において使用するための医薬組成物が提供される。
別の実施形態においては、アプタマーが配列番号２及び配列番号６〜配列番号６６よりなる群から、特に配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、哺乳類に対し、アプタマー又はその塩を含む医薬組成物を投与することを含むＣ５補体蛋白により媒介される疾患を治療、予防又は軽減する方法が提供される。本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、方法は本発明の医薬組成物を哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含む。
一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、急性虚血性疾患（心筋梗塞、脳卒中、虚血／再灌流傷害）；急性炎症性疾患（感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶）；慢性炎症性及び／又は免疫媒介性の疾患（アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は亜急性／慢性の移植片拒絶、糸球体腎炎及び他の腎疾患）である。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、透析又は血液が合成チューブ及び／又は外来性の物質を通過する環境に関連する補体活性化を包含する。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、ＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害及び再狭窄に関連する心筋傷害よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、ＣＡＢＧ手術に関連する合併症である。特定の実施形態においては、治療すべき疾患はＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害である。
一部の実施形態においては、本発明の方法は、内因性Ｃ５補体蛋白の約０．５〜約１０倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために、患者に対し、配列番号２及び配列番号６〜配列番号６６よりなる群から、特に配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、医薬品組成物は、内因性Ｃ５補体蛋白の約０．７５倍〜約５倍、０．７５〜約３倍、及び１．５〜約２倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与されるが、別の実施形態においてはアプタマー組成物は内因性補体蛋白と等しい濃度を達成するために投与される。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ、約１．５μＭ、約１μＭ又は約５００ｎＭのアプタマー血漿中濃度を達成するために投与される。
本発明のアプタマー血漿中濃度を達成するために十分な投与の経路、期間及び速度の何れかの組み合わせを用いてよい。一部の実施形態においては、医薬組成物は静脈内投与する。一部の実施形態においては、医薬組成物は瞬時及び／又は連続注入により投与する。
ＣＡＢＧ手術に関連する合併症、特にＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害を治療、予防及び／又は軽減する特定の実施形態において、本発明の方法は、手術の前に医薬組成物を投与すること、及び、投与を少なくとも２４時間、一部の実施形態においては約４８時間、又は一部の実施形態においては約７２時間継続することを包含する。本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、アプタマーのより低用量の静注の前、これと同時、又は、その後に、治療すべき患者に対するアプタマーの静脈内瞬時投与により、所望の血漿中アプタマー濃度、例えば一部の実施形態においては内因性補体蛋白濃度の約２倍を達成する。アプタマー／コンジュゲートが十分長い半減期を有する本発明のこの特徴の更に別の実施形態においては、アプタマーの医薬組成物は静脈内瞬時投薬として１日１回又は２回投与してよい。
本発明の別の特徴において、診断方法が提供される。１つの実施形態において、診断方法は、Ｃ５補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる組成物に配列番号２及び配列番号６〜配列番号６６よりなる群から、特に配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６４〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを接触させること、及び、Ｃ５補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在を検出することを含む。一部の実施形態においては、補体蛋白又はその変異体は脊椎動物、特に哺乳類、とりわけヒトである。本発明はインビトロ又はインビボの診断薬として使用するための配列番号２及び配列番号６〜配列番号６６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを有するアプタマー組成物を提供する。
本発明の別の特徴において、ＡＲＣ９１５、ＡＲＣ８７４〜８７８、ＡＲＣ９５４、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つに８０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。一部の実施形態においては、配列番号７５〜８１及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つの独特の領域に８０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。別の実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つに９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。特定の実施形態において、配列番号７５〜８１及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つの独特の領域に９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。更に別の実施形態において、配列番号７５〜８１及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つに含まれる４０近接ヌクレオチドに同一である４０近接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。更に別の実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つに含まれる３０近接ヌクレオチドに同一の３０近接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。また更に別の実施形態において、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択される配列の何れか１つに含まれる１０近接ヌクレオチドに同一の１０近接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むＣ５補体蛋白に特異的に結合するアプタマーが提供される。好ましい実施形態においては、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の何れか１つによるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。
一部の実施形態においては、上記した本発明のこの特徴のアプタマーは、核酸配列の糖位置における化学的置換；ホスフェート位置における化学的置換；及び塩基位置における化学的置換よりなる群から選択される化学的修飾を更に含んでよい。一部の実施形態においては、修飾は修飾されたヌクレオチドの取り込み、３’キャッピング、高分子量の非免疫学的化合物へのコンジュゲート形成、親油性化合物へのコンジュゲート形成、及びホスフェート骨格の修飾よりなる群から選択される。
本発明のこの特徴の好ましい実施形態においては、アプタマーはＣ５補体蛋白又はその変異体の機能をモジュレートする。特に好ましい実施形態においては、アプタマーは好ましくはインビボで、より好ましくはヒトにおいてインビボで、Ｃ５補体蛋白又はその変異体の機能を抑制する。本発明のこの特徴の１つの実施形態において、アプタマーによりモジュレートされる、また好ましくは抑制される機能はＣ５補体蛋白切断である。
別の一部の実施形態においては、本発明はインビボでＣ５補体蛋白の切断をブロックするアプタマー又はその塩の治療有効量及び製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態においては、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に８０％同一、好ましくは９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマー又はその塩の治療有効量を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態においては、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の独特の領域に８０％同一、好ましくは９０％同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマー又はその塩の治療有効量を含む医薬組成物が提供される。別の実施形態においては、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列にそれぞれ４０、３０又は１０ヌクレオチドと同一である４０、３０又は１０近接ヌクレオチドを有するアプタマーの治療有効量を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含んでよい。本発明のこの特徴において、インビボで疾患の治療、予防又は軽減において使用するための医薬組成物が提供され、ここで、医薬組成物は配列番号３〜４、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマー又はその塩を含む。
一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、急性虚血性疾患（心筋梗塞、脳卒中、虚血／再灌流傷害）；急性炎症性疾患（感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶）；慢性炎症性及び／又は免疫媒介性の疾患（アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）又は亜急性／慢性の移植片拒絶、糸球体腎炎及び他の腎疾患）である。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、透析又は血液が合成チューブ及び／又は外来性の物質を通過する環境に関連する補体活性化を包含する。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、ＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害及び再狭窄に関連する心筋傷害よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、治療すべきＣ５補体蛋白、Ｃ５ａ及び／又は及びＣ５ｂ−９により媒介される疾患は、ＣＡＢＧ手術に関連する合併症である。特定の実施形態においては、治療すべき疾患はＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害である。
一部の実施形態においては、本発明の方法は、内因性Ｃ５補体蛋白の約０．５〜約１０倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために、患者に対し、配列番号３〜４、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、医薬品アプタマー組成物は、内因性Ｃ５補体蛋白の約０．７５倍〜約５倍、０．７５〜約３倍、及び１．５〜約２倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与されるが、別の実施形態においてはアプタマー組成物は内因性補体蛋白と等しい濃度を達成するために投与される。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は約５μＭ、約４μＭ、約３μＭ、約２μＭ、約１．５μＭ、約１μＭ又は約５００ｎＭのアプタマー血漿中濃度を達成するために投与される。
本発明のアプタマー血漿中濃度を達成するために十分な投与の経路、期間及び速度の何れかの組み合わせを用いてよい。一部の実施形態においては、医薬組成物は静脈内投与する。一部の実施形態においては、医薬組成物は瞬時及び／又は連続注入により投与する。
ＣＡＢＧ手術に関連する合併症、特にＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害を治療、予防及び／又は軽減する特定の実施形態において、本発明の方法は、手術の前に医薬組成物を投与すること、及び、投与を少なくとも２４時間、一部の実施形態においては約４８時間、又は一部の実施形態においては約７２時間継続することを包含する。本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、アプタマーのより低用量の静注の前、これと同時、又は、その後に、治療すべき患者に対するアプタマーの静脈内瞬時投与により、所望の血漿中アプタマー濃度、例えば一部の実施形態においては内因性補体蛋白濃度の約２倍を達成する。アプタマー／コンジュゲートが十分長い半減期を有する本発明のこの特徴の更に別の実施形態においては、アプタマーの医薬組成物は静脈内瞬時投薬として１日１回又は２回投与してよい。
別の実施形態において、診断方法が提供され、方法は、Ｃ５補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる組成物に、配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを接触させること、及び、Ｃ５補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在を検出することを含む。一部の実施形態においては、補体蛋白又はその変異体は脊椎動物、特に哺乳類、とりわけヒトである。本発明はインビトロ又はインビボの診断薬として使用するための配列番号７５〜８１、配列番号８３及び配列番号８８〜９８よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを有するアプタマー組成物を提供する。
一部の実施形態においては、配列番号６８及び６９よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より本質的になるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。一部の実施形態においては、配列番号６８及び６９よりなる群から選択されるヌクレオチド配列よりなるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、アプタマーは診断方法において使用してよい。
本発明の実施形態の１つ以上の詳細を以下の説明において記載する。本明細書に記載したものと同様又は等価な如何なる方法及び物質も本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び物質はこれから詳述するとおりである。本発明の他の特徴、目標及び利点は説明より明らかにされる。明細書において、内容について明確な特段の記載が無い限り、単数と複数を区別しない。特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての専門的および技術的な用語は本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、本明細書を優先する。
（ＳＥＬＥＸ（商標）法）
アプタマーを形成するための適当な方法は図２に一般的に示す「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ］（「ＳＥＬＥＸ（商標）」）と題された方法を用いる。ＳＥＬＥＸ（商標）法は標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロの進化のための方法であり、例えば１９９０年６月１１日に出願された米国特許出願０７／５３６，４２８、現在は放棄された「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された米国特許５，４７５，０９６及び「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題された米国特許５，２７０，１６３（ＷＯ９１／１９８１３も参照）に記載されている。各ＳＥＬＥＸ（商標）識別核酸リガンド、即ち、各アプタマーは所定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ（商標）法は、核酸が種々の２次元又は３次元構造を形成するための十分な能力、及び、単量体又は重合体にかかわらず実質的に如何なる化学的化合物とのリガンドとして機能する（即ち特異的結合対を形成する）ためのその単量体内で可能な十分な化学的汎用性を有しているという独特の見識に基づいている。あらゆる大きさ又は組成の分子が標的として作用できる。
ＳＥＬＥＸ（商標）法は開始点としてランダム配列を含む１本鎖オリゴヌクレオチドの大規模なライブラリ又はプールに依存している。オリゴヌクレオチドは修飾又は未修飾のＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができる。一部の例においては、プールは１００％ランダム又は部分ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては、プールはランダム化された配列内に取り込まれた固定及び／又は保存された配列少なくとも１つを含有するランダム又は部分ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては、プールはオリゴヌクレオチドプールの全ての分子により共有される配列を含んでよいその５’及び／又は３’末端に固定及び／又は保存された配列少なくとも１つを含有するランダム又は部分ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。固定された配列はＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えばＴ３、Ｔ４、Ｔ７及びＳＰ６）、制限部位又は単独重合体配列、例えばポリＡ又はポリＴトラクト、触媒コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、及び、目的のオリゴヌクレオチドのクローニング及び／又は配列決定を容易にするための他の配列のような配列である。保存された配列は、前述の固定配列以外には、同じ標的に結合する多くのアプタマーにより共有される配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは好ましくはランダム化された配列部分並びに効率的な増幅のために必要な固定された配列を包含する。典型的には出発プールのオリゴヌクレオチドは３０〜５０ランダムヌクレオチドの内部領域にフランキングする固定された５’及び３’末端の配列を含有する。ランダム化されたヌクレオチドはランダムに切断された細胞核酸からの化学合成及びサイズ選択を含む多くの方法において製造することができる。被験核酸の配列の変動もまた、選択／増幅の反復の前又は最中における突然変異誘発により導入又は増大させることができる。
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は何れかの長さであることができ、そしてリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、そして、修飾された、又は、非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体を含むことができる。例えば米国特許５，９５８，６９１；米国特許５，６６０，９８５；米国特許５，９５８，６９１；米国特許５，６９８，６８７；米国特許５，８１７，６３５；米国特許５，６７２，６９５及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／０７０６５を参照できる。ランダムオリゴヌクレオチドは当該分野でよく知られている固相オリゴヌクレオチド合成法を用いてホスホジエステル連結ヌクレオチドから合成できる。例えばＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）及びＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照できる。ランダムオリゴヌクレオチドはまたトリエステル合成法のような溶液相の方法を用いて合成することもできる。例えばＳｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）及びＨｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照できる。自動ＤＮＡ合成装置上で行われる典型的な合成では大部分のＳＥＬＥＸ（商標）機材に対して十分な数量である１０１４〜１０１６の個々の分子が得られる。配列設計におけるランダム配列の十分大きい領域は各合成分子が独特の配列を示す可能性があるという確率を増大させる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはＤＮＡ合成装置上の自動化学合成により形成してよい。ランダム化配列を合成するためには、合成過程中の各ヌクレオチド添加工程において全ての４種のヌクレオチドの混合物を添加することによりヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。上記した通り、１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムの配列を含む；しかしながら、別の実施形態においては、ランダムオリゴヌクレオチドは非ランダム又は部分的にランダムな配列のストレッチを含むことができる。部分的にランダムな配列は各添加工程において異なるモル比の４種のヌクレオチドを添加することにより生成できる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはＲＮＡ又はＤＮＡの何れであってもよい。ＲＮＡライブラリを出発ライブラリとして使用したい場合は、これは典型的にはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ又は修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでＤＮＡライブラリを転写することにより形成され、そして精製される。次にＲＮＡ又はＤＮＡライブラリを結合に好都合な条件下に標的と混合し、そして同じ全般的選択スキームを用いながら結合、分画及び増幅の段階的反復に付すことにより、結合親和性及び選択性の実質的に如何なる所望の基準も達成できる。より詳しくは、核酸の出発プールを含有する混合物から出発する場合、ＳＥＬＥＸ（商標）法は（ａ）結合に好都合な条件下で標的に混合物を接触させること；（ｂ）標的ヌクレオチドに特異的に結合している核酸から未結合の核酸を分画すること；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させること；（ｄ）核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して核酸のリガンドリッチ化混合物を得ること；および（ｅ）標的分子に対して高度に特異的で高度に親和性の核酸リガンドを得るために必要な回数、結合、分画、解離及び増幅の工程を反復すること、の工程を包含する。ＲＮＡアプタマーが選択される場合においては、ＳＥＬＥＸ（商標）法は更に（ｉ）工程（ｄ）における増幅の前に核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写すること；及び（ｉｉ）方法を再開する前に工程（ｄ）由来の増幅核酸を転写すること、の工程を含む。
可能な配列及び構造の多数を含有する核酸混合物内において、所定の標的に対して広範な結合親和性が存在する。例えば２０ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は４２０通りの候補可能性を有する。標的に対してより高い親和性定数を有するものが標的に結合する可能性が最も高い。分画、解離及び増幅の後、第２の核酸混合物が形成され、より高値の結合親和性の候補がリッチ化される。選択のラウンドを重ねるにつれ、ますます良好なリガンドの傾向が大きくなり、最終的には得られる核酸混合物は僅か１種又は数種の配列より優先的に構成される。次にこれ等をクローニング、配列決定及び純粋なリガンド又はアプタマーとしての結合親和性に関する個々の試験に付すことができる。
選択及び増幅のサイクルは所望の目標が達成されるまで反復する。大部分の一般的に場合においては、選択／増幅はサイクルの反復において結合強度の顕著な向上が達成されなくなるまで継続する。方法は典型的には約１０１４種の核酸物質種を採取するために使用するが、約１０１８種もの多数の核酸物質種が採取するために使用してもよい。一般的に、核酸アプタマー分子は５〜２０サイクルの手順において選択される。１つの実施形態においては、初期の選択段階においてのみ異種性が導入され、複製過程を通じて発生しない。
ＳＥＬＥＸ（商標）の１つの実施形態においては、選択過程は選択された標的に最も強力に結合する核酸リガンドの単離において効率的であるため、選択及び増幅は僅か１サイクルを要するのみである。このような効率的な選択は、例えばクロマトグラフィー型の過程において起こりえるものであり、この場合、カラム上に結合している標的と会合する核酸の能力は、カラムが最高親和性核酸リガンドの分離及び単離を可能にするのに十分な能力を有するような態様において作動する。
多くの場合において、単一の核酸リガンドが発見されるまでＳＥＬＥＸ（商標）の反復工程を実施することが必ずしも望まれない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多くの保存された配列及び標的への核酸リガンドの親和性に有意に影響することなく置換又は付加され得る多くの配列を有する核酸構造又はモチーフのファミリーを包含してよい。完了前にＳＥＬＥＸ（商標）過程を終了することにより、核酸リガンド溶液ファミリーの多くのメンバーの配列を決定することが可能である。
核酸の一次、二次及び三次構造の種々のものが存在することがわかっている。非ワトソンクリック型の相互作用に関与することが最も一般的にわかっている構造又はモチーフはヘパリンループ、対称及び非対称のバルジ部、擬似ノット部及びこれ等の多数の組み合わせと称されている。このようなモチーフのほぼ全ての知られた例はそれらが３０ヌクレオチド以下の核酸配列において形成できることを示唆している。この理由のため、近接ランダム化セグメントを有するＳＥＬＥＸ（商標）操作法は約２０〜約５０ヌクレオチド、及び一部の実施形態においては約３０〜約４０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含有する核酸配列で開始することが好ましい場合が多い。１つの実施形態において５’−固定：ランダム：３’固定配列は約３０〜約５０ヌクレオチドのランダム配列を含む。
コアＳＥＬＥＸ（商標）法は特定の目的の多くのものを達成するために改変されている。例えば米国特許５，７０７，７９６はベントＤＮＡのような特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ（商標）の使用を記載している。米国特許５，７６３，１７７は標的分子に対して結合及び／又は光交差結合及び／又は光不活性化が可能な光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ（商標）系の方法を記載している。米国特許５，５６７，５８８及び米国特許５，８６１，２５４は標的分子に対して高及び低親和性であるオリゴヌクレオチドの間の高効率の分画を達成するＳＥＬＥＸ（商標）系の方法を記載している。米国特許５，４９６，９３８はＳＥＬＥＸ（商標）法を実施した後に改良された核酸リガンドを得るための方法を記載している。米国特許５，７０５，３３７はリガンドをその標的に共有結合するための方法を記載している。
ＳＥＬＥＸ（商標）はまた標的分子上の１つより多い部位に結合する核酸リガンドを得るため、及び標的上の特定の部位に結合する非核酸物質種を含む核酸リガンドを得るために使用することができる。ＳＥＬＥＸ（商標）は大型及び小型の生体分子、例えば核酸結合蛋白及び自身の生物学的機能の部分としては核酸に結合することが知られていない蛋白、並びにコファクター及び他の小型分子を包含する何れかの想定される標的に結合する核酸リガンドを単離して同定するための手段を提供する。例えば米国特許５，５８０，７３７はカフェイン及び緊密に関連する類縁体であるテオフィリンに対して高い親和性で結合することができるＳＥＬＥＸ（商標）を介して発見された核酸配列を開示している。
カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は非標的分子１つ以上に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することにより標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改良するための方法である。カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は（ａ）核酸候補混合物を製造すること；（ｂ）標的に候補混合物を接触させること、その際、候補混合物に対して相対的に標的への増大した親和性を有する核酸が候補混合物の残余から分画してよいものであること；（ｃ）増大親和性核酸を候補混合物の残余から分画すること；（ｄ）標的から増大親和性核酸を解離させること；ｅ）非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように非標的分子１つ以上に増大親和性核酸を接触させること；およびｆ）標的分子に結合する親和性及び特異性が相対的に高値である核酸配列がリッチ化された核酸混合物を得るように標的分子にのみ特定の親和性を有する核酸を増幅すること、の工程よりなる。ＳＥＬＥＸ（商標）について上記した通り、所望の目標が達成されるまで必要に応じて選択及び増幅のサイクルを反復する。
治療薬及びワクチンとして核酸を使用する場合の１つの潜在的な問題はそのホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドは所望の作用が顕在化するよりも前にエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外酵素により体液中で急速に分解されることである。即ちＳＥＬＥＸ（商標）法は向上したインビボの安定性又は向上した送達特性のようなリガンドに対して向上した特性を与える修飾ヌクレオチドを含有する高親和性の核酸リガンドの発見を包含する。このような修飾の例はリボース及び／又はホスフェート及び／又は塩基の位置における化学的置換を包含する。修飾されたヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸ（商標）により発見された核酸リガンドは例えば、リボースの２位、ピリミジンの５位及びプリンの８位において化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許５，６６０，９８５、種々の２’修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許５，７５６，７０３、及び２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−ＯＭｅ（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾されたヌクレオチド１つ以上を含有する高度に特異的な核酸リガンドを記載している米国特許５，５８０，７３７に記載されている。
本発明において意図される核酸リガンドの修飾は、例えば核酸リガンドの塩基又は核酸リガンド全体に更に電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用及び流動性を組み込む他の化学基を与えるものである（ただし、これらに限定されない）。ヌクレアーゼに対して耐性のオリゴヌクレオチド集団を形成する修飾はまた、置換ヌクレオチド間連結、改変された糖、改変された塩基又はこれ等の組み合わせの１つ以上を包含することができる。このような修飾は、例えば２’位の糖の修飾、５位のピリミジンの修飾、８位のプリンの修飾、環外のアミンの修飾、４チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換；骨格の修飾、ホスホロチオエート及びアルキルホスフェートの修飾、メチル化及び通常でない塩基対形成の組み合わせ、例えば非天然塩基のイソシチジン及びイソグアニジンを包含する（ただし、これらに限定されない）。修飾はまたキャッピングのような３’及び５’修飾も包含できる。
１つの実施形態においてＰ（Ｏ）基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置き換えられたオリゴヌクレオチドが提供され、ここで各Ｒ又はＲ’は相互に独立してＨ又は置換又は未置換のアルキルである。連結基は−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−連結を介して隣接ヌクレオチドに結合することができる。オリゴヌクレオチド内の全ての連結が同一である必要はない。本明細書においては、「ホスホロチオエート」という用語はイオウ原子１つ以上により置き換えられたホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子１つ以上を包含する。
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾された糖基を含み、例えばヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、又は、エーテル又はアミンとして官能性付与されている。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位はＯＭｅ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル又はハロ基の何れかにより置換されている。２’修飾糖の合成方法は例えばＳｐｒｏａｔ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。他の修飾は当業者のよく知るとおりである。このような修飾はプレＳＥＬＥＸ（商標）法修飾又はポストＳＥＬＥＸ（商標）法修飾（以前に発見された未修飾のリガンドの修飾）であってよいか、又は、ＳＥＬＥＸ法に組み込むことにより作成してよい。
プレＳＥＬＥＸ法修飾又はＳＥＬＥＸ法に組み込むことにより作成されたものは、そのＳＥＬＥＸ（商標）法標的に対する特異性及び向上した安定性、例えばインビボの安定性の両方を有する核酸リガンドを与える。核酸リガンドに対して行われるポストＳＥＬＥＸ（商標）法修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく向上した安定性、例えばインビボの安定性をもたらす。
ＳＥＬＥＸ（商標）法は米国特許５，６３７，４５９及び米国特許５，６８３，８６７に記載の通り，選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチドの官能性単位と組み合わせることを包含する。ＳＥＬＥＸ（商標）法は更に例えば米国特許６，０１１，０２０、米国特許６，０５１，６９８およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８４８０に記載の通り、選択された核酸リガンドを親油性又は非免疫原性の高分子量化合物と、診断用又は治療用の複合体中で組み合わせることを包含する。これ等の特許及び出願は広範なアレイの形状及び他の特性の、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅及び複製の特性と、そして、他の分子の所望の特性との組み合わせを記載している。
ＳＥＬＥＸ（商標）法を介した小型可撓性ペプチドとしての核酸リガンドの同定もまた開発されている。小型ペプチドは可撓性の構造を有しており、通常は複数のコンホーマーの平衡状態において溶液中に存在しており、従って当初は、結合親和性は可撓性ペプチドに結合した時点で失われるコンホーメーションエントロピーにより制限されると考えられていた。しかしながら、溶液中の小型ペプチドに対する核酸リガンドが同定されたことの現実性は、米国特許５，６４８，２１４において明らかにされた。この特許において、物質Ｐ、即ち１１アミノ酸ペプチドに対して高親和性のＲＮＡ核酸リガンドが発見された。
本発明の標的に特異性及び結合親和性を有するアプタマーは典型的には本明細書に記載するＳＥＬＥＸ（商標）法により選択される。ＳＥＬＥＸ（商標）法の部分として、次に、標的に結合させるために選択された配列を場合により最小限として、所望の結合親和性を有する最小の配列を決定する。選択された配列及び／又は最小限化された配列は場合により、配列のランダム又は指向性の突然変異誘発を行うことにより至適化させて、結合親和性を増大させるか、或いは、配列のどの位置が結合活性に必須であるかを調べる。更にまた、選択はインビボの分解に対抗してアプタマーを安定化させるために修飾されたヌクレオチドを取り込んだ配列を用いて実施できる。
２’修飾ＳＥＬＥＸ（商標）
治療薬としての使用に適するアプタマーを得るためには、インビボで安全及び安定して合成することが安価に行えるのが好ましい。野生型ＲＮＡ及びＤＮＡアプタマーは典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性のため、インビボでは安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は２’位に修飾基を導入することにより大きく増大させることができる。
フルオロ及びアミノ基は後にアプタマーを選択する元となるオリゴヌクレオチドライブラリ内に良好に取り込まれている。しかしながら、これ等の修飾は得られるアプタマーの合成コストを大きく増大させ、そして、修飾されたヌクレオチドが修飾されたオリゴヌクレオチドの分解により宿主ＤＮＡ内にリサイクルされる可能性及びその後のＤＮＡ合成の基質としてのヌクレオチドの使用のために、一部の場合においては安全性の懸念を生じさせる。
本明細書の一部の実施形態において提供される２’−ＯＭｅ（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含有するアプタマーはこれ等の難点の多くを克服する。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、安価に合成できる。２’−ＯＭｅヌクレオチドは生物系にユビキタスに存在するが、天然のポリメラーゼは２’−Ｏ−メチルＮＴＰを生理学的条件下の基質として許容しないため、宿主ＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドのリサイクルに関する安全性の懸念が存在しない。２’−修飾アプタマーを形成するために使用されるＳＥＬＥＸ（商標）法は、例えばそれぞれが、参照により全体が本明細書に組み込まれる「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２’−ＯＭｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された２００２年１２月３日出願の米国特許暫定出願６０／４３０，７６１、２００３年７月１５日出願の米国特許暫定出願６０／４８７，４７４、２００３年１１月４日出願の米国特許暫定出願６０／５１７，０３９、２００３年１２月３日出願の米国特許出願１０／７２９，５８１及び２００４年６月２１日出願の米国特許出願１０／８７３，８５６に記載されている。
本発明は酵素的及び化学的な分解並びに熱的及び物理的な分解に対して未修飾のオリゴヌクレオチドよりも安定であるオリゴヌクレオチドを作成するための修飾ヌクレオチド（例えば２’位に修飾を有するヌクレオチド）を含有する補体蛋白Ｃ５に結合してその機能をモジュレートするアプタマーを包含する。文献には２’−ＯＭｅ含有アプタマーの数例が存在する（例えばＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，６８３−６９５，１９９５参照）が、それらはＣ及びＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、Ａ及びＧ残基が２’−ＯＨである修飾された転写物のライブラリのインビトロ選択により形成されている。機能的配列が発見された後、各々のＡおよびＧ残基の２’−ＯＭｅ置換に対する耐容性を試験し、そして２’−ＯＭｅ残基として２’−ＯＭｅ置換に耐容性であった全てのＡ及びＧ残基を有するアプタマーを再合成している。この２工程の様式で形成されたアプタマーのＡ及びＧ残基の大部分は２’−ＯＭｅ残基による置換に耐容性を示したが、平均では約２０％は耐容性でなかった。結果的に、この方法を用いて形成されたアプタマーは２〜４個の２’−ＯＨ残基を含有する傾向を有し、合成の安定性及びコストが結果的に犠牲となる。アプタマーの選択元であり、そしてＳＥＬＥＸ（商標）によりリッチ化されるオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される安定化オリゴヌクレオチドを形成する転写反応物に修飾されたヌクレオチドを組み込むこと（及び／又はその変法又は改良法、例えば本明細書に記載したもの）により、本発明の方法は選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化させる（例えば修飾されたヌクレオチドを用いたアプタマーオリゴヌクレオチドの再合成による）必要性を排除する。
１つの実施形態において、本発明はＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅ修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明はＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２及び２’−メトキシエチル修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。
別の実施形態において、本発明はＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ及びＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２及び２’−メトキシエチル修飾の５６通りの組み合わせを含むアプタマーを提供する。
本発明の２’修飾アプタマーは野生型ポリメラーゼよりも高値のフラノース２’位における嵩高置換基を有する修飾ヌクレオチドの一定比率の取り込みを有する修飾されたポリメラーゼ、例えば修飾Ｔ４ポリメラーゼを用いて作成する。例えば６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化している単一突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は基質として２’デオキシ、２’アミノ−及び２’フルオロ−ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）を容易に利用し、そして種々の用途のための修飾ＲＮＡを合成するために広範に使用されている。しかしながら、この突然変異体Ｔ７ポリメラーゼは２’−ＯＭｅ又は２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基のような嵩高の２’−置換基を有するＮＴＰを容易に利用する（即ち取り込む）ことはできないとされている。嵩高の２’置換基を取り込むためには、Ｙ６３９Ｆ突然変異に加えて７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化した二重Ｔ７ポリメラーゼ突然変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載されており、修飾されたピリミジンＮＴＰを取り込むための限定された状況において使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ， Ｒ．ａｎｄ Ｓｏｕｓａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２００２，３０（２４）：１３８を参照できる。７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化した単一突然変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載されている。Ｐａｄｉｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２００２，３０：１３８を参照できる。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異体及びＨ７８４Ａ単一突然変異体のＴ７ポリメラーゼの両方において、アラニンのようなより小型のアミノ酸残基への変化はより嵩高のヌクレオチド基質、例えば２’−Ｏメチル置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。
一般的に本明細書に記載した条件下においては、Ｙ６９３Ｆ単一突然変異体はＧＴＰを除くすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用でき、そしてＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異体はＧＴＰを含むすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用できることが分かっている。Ｈ７８４Ａ単一突然変異体は本明細書に記載した条件下において使用した場合にＹ６３９Ｆ及びＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ突然変異体と同様の特性を保有することが期待される。
２’−修飾オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチド全体として、又は修飾ヌクレオチドの部分集合として合成してよい。修飾は同じか又は異なっていることができる。全ヌクレオチドを修飾してよく、そして全てが同じ修飾を含有してよい。全ヌクレオチドを修飾してよいが、異なる修飾を含有してよく、例えば同じ塩基を含有する全ヌクレオチドが１つの型の修飾を有してよいが、他の塩基を含有するヌクレオチドが異なる型の修飾を有していてよい。全プリンヌクレオチドが１つの型の修飾を有して（又は未修飾で）よいが、全ピリミジンヌクレオチドは別の異なる型の修飾を有して（又は未修飾で）よい。このようにして、例えばリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドを包含する修飾の何れかの組み合わせを用いて転写物又は転写物のプールを形成する。２’−ＯＭｅのＣ及びＵ及び２’−ＯＨのＡ及びＧを含有する転写混合物を「ｒＲｍＹ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｒＲｍＹ」アプタマーと称する。デオキシＡおよびＧ及び２’−ＯＭｅのＵ及びＣを含有する転写混合物は「ｄＲｍＹ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｄＲｍＹ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅのＡ、Ｃ及びＵ及び２’−ＯＨのＧを含有する転写混合物を「ｒＧｍＨ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｒＧｍＨ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅのＡ、Ｃ、Ｕ及びＧ及び２’−ＯＭｅのＡ、Ｕ及びＣ及び２’−ＦのＧを含有する交互に転写混合物を「オルタネーティング混合物」と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「オルタネーティング混合物」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅのＡ、Ｕ、Ｃ及びＧを含有し、Ｇの１０％までがリボヌクレオチドである転写混合物を「ｒ／ｍＧｍＨ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｒ／ｍＧｍＨ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅのＡ、ＵおよびＣ及び２’−ＦのＧを含有する転写混合物を「ｆＧｍＨ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｆＧｍＨ」アプタマーと称する。２’−ＯＭｅのＡ、ＵおよびＣ及びデオキシＧを含有する転写混合物を「ｄＧｍＨ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｄＧｍＨ」アプタマーと称する。デオキシＡおよび２’−ＯＭｅのＣ、Ｇ及びＵを含有する転写混合物を「ｄＡｍＢ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｄＡｍＢ」アプタマーと称し、そして、全２’−ＯＨヌクレオチドを含有する転写混合物を「ｒＮ」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「ｒＮ」又は「ｒＲｒＹ」アプタマーと称する。「ｍＲｍＹ」アプタマーは全２’−ＯＭｅヌクレオチドを含有するものであり、そして通常は可能であれば何れかの２’−ＯＨのＧと２’−ＯＭｅのＧのポストＳＥＬＥＸ置き換えによりｒ／ｍＧｍＨオリゴヌクレオチドから誘導される。
好ましい実施形態は２’−ＯＨ、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドの何れかの組み合わせを包含する。より好まし位実施形態は２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドの組み合わせを包含する。更により好ましい実施形態はピリミジンが２’−ＯＭｅである２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅヌクレオチドの何れかの組み合わせを伴っている（例えばｄＲｍＹ、ｍＲｍＹ又はｄＧｍＨ）。
修飾ヌクレオチドの本発明のアプタマーへの取り込みは選択過程の前（プレ）に行う（例えばプレＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾）。場合により、修飾ヌクレオチドがプレＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾により取り込まれている本発明のアプタマーを更にポストＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾により修飾することができる（即ちプレＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾の後のポストＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾）。プレＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾はＳＥＬＥＸ（商標）標的に対する特異性及び向上したインビボの安定性を有する修飾された核酸リガンドを与える。ポストＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾、即ち修飾（例えばプレＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾により取り込まれたヌクレオチドを有する以前に発見されたリガンドのトランケーション、欠失、置換又は付加によるヌクレオチドの修飾）はプレＳＥＬＥＸ（商標）法の修飾により取り込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、インビボの安定性を更に向上させることができる。
ポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを許容する条件において２’−修飾（例えば２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のプールを形成するためには、好ましいポリメラーゼはＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重突然変異体又はＹ６３９Ｆ単一突然変異体である。他のポリメラーゼ、特に嵩高の２’−置換基に対して高い耐容性を示すものも本発明において使用してよい。このようなポリメラーゼのこのような能力は本明細書に開示した転写条件下に修飾ヌクレオチドを取り込むその能力について試験することによりスクリーニングすることができる。
多くの因子が本明細書に開示した方法において有用な転写条件のために重要であることがわかっている。例えば、修飾転写物の収量の増大は、得られる転写物の最初の少なくとも約６残基が全てプリンであるようにＤＮＡ転写鋳型の５’末端の固定配列の５’末端内にリーダー配列を取り込んだ場合に観察される。
修飾ヌクレオチドを取り込んだ転写物を得る場合の別の重要な因子は２’−ＯＨのＧＴＰの存在又は濃度である。転写は２相に分けられ、第１の相は開始であり、その間、ＮＴＰをＧＴＰ（又は他の置換グアノシン）の３’−ヒドロキシル末端に付加させることにより得られたジヌクレオチドを次に約１０〜１２ヌクレオチドまで伸長させ；第２の相は長鎖化であり、その間転写は最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進行する。２’−ＯＭｅのＧＴＰの過剰量を含有する転写混合物に付加した少量の２’−ＯＨのＧＴＰは、２’−ＯＨのＧＴＰを用いた転写をポリメラーゼが開始できるようになるためには十分であるが、いったん転写が長鎖化の相に入れば、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨのＧＴＰの間の判別性の低下及び２’−ＯＨのＧＴＰを超えた２’−ＯＭｅのＧＴＰの超過により、主に２’−ＯＭｅのＧＴＰの取り込みが起こることが分かっている。
転写物への２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドの取り込みにおける別の重要な因子は転写混合物中の２価のマグネシウム及びマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウム及び塩化マンガンの濃度の種々の組み合わせが２’−ＯＭｅ転写物の収量に影響することがわかっており、マグネシウム及びマンガンの塩化物の至適濃度は２価の金属イオンと複合体形成するＮＴＰの転写反応混合物中の濃度に依存している。最大２’置換ＯＭｅ転写物の最大収量（即ち全てのＡ、Ｃ及びＵ及び約９０％のＧヌクレオチド）を得るためには、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合は約５ｍＭの塩化マグネシウム及び１．５ｍＭ塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は、約６．５ｍＭの塩化マグネシウム及び２．０ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は、約９．６ｍＭの塩化マグネシウム及び２．９ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合においても、これ等の濃度から二倍までの変動では修飾された転写物のかなりの量がなお得られる。
ＧＭＰ又はグアノシンによるプライミング転写もまた重要である。この作用は開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性に起因する。結果として、この様式において形成された何れかの転写産物の５’末端ヌクレオチドは２’−ＯＨのＧである可能性が高い。ＧＭＰ（又はグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、更に好ましくは１ｍＭである。更にまた転写反応にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含有させることは修飾ヌクレオチドの取り込みを最大限とするのに有用であることがわかっている。
転写物への２’−ＯＭｅのＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）およびＧＴＰ（〜９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大取り込みのためには、以下の条件、即ち：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２５ｍＭ（各２’−ＯＭｅＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２１．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合は２．０ｍＭ），２’−ＯＭｅＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨＧＴＰ３０μＭ、２’−ＯＨＧＭＰ５００μＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４ＡＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。本明細書においては、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ突然変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（又は本明細書に特記する何れかの他のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）１単位は１ナノモルの２’−ＯＭｅＮＴＰをｒ／ｍＧｍＨ条件下にて転写物に取り込むために必要な酵素の量として定義する。本明細書においては、無機ピロホスファターゼ１単位はｐＨ７．２及び２５℃において分当たり無機オルトホスフェート１．０モルを放出する酵素の量として定義する。
転写物への２’−ＯＭｅ、ＡＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大取り込み（１００％）のためには、以下の条件、即ち：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２５ｍＭ（各２’−ＯＭｅＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２１．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ），２’−ＯＭｅＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９ＦＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
転写物への２’−ＯＭｅＵＴＰ及びＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大取り込み（１００％）のためには、以下の条件、即ち：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２５ｍＭ（各２’−ＯＭｅＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は９．６ｍＭ）、ＭｎＣｌ２１．５ｍＭ（各２’−ＯＭｅＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合は２．９ｍＭ），２’−ＯＭｅＮＴＰ（各々）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４ＡＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
転写物へのデオキシＡＴＰ及びＧＴＰ及び２’−ＯＭｅＵＴＰ及びＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大取り込み（１００％）のためには、以下の条件、即ち：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミン２ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．９ｍＭ，２’−ＯＭｅＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９ＦＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
転写物への２’−ＯＭｅＡＴＰ、ＵＴＰ及びＣＴＰ及び２’−ＦＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大取り込み（１００％）のためには、以下の条件、即ち：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．９ｍＭ，２’−ＯＭｅＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９ＦＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列が好ましい。
転写物へのデオキシＡＴＰ及び２’−ＯＭｅＵＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大取り込み（１００％）のためには、以下の条件、即ち：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．９ｍＭ，２’−ＯＭｅＮＴＰ（各々）２．０ｍＭ、ｐＨ７．５、Ｙ６３９ＦＴ７ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ及び少なくとも８ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
上記の各々について、（ａ）転写は好ましくは約２０℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜４５℃、より好ましくは約３７℃の温度で、少なくとも２時間実施し、そして（ｂ）２本鎖ＤＮＡ転写鋳型５０〜３００ｎＭを使用し（多様性を増大させるためにはラウンド１において２００ｎＭの鋳型を使用（ｄＲｍＹ転写では３００ｎＭ鋳型を使用）し、そしてその後のラウンドについては、本明細書に記載した条件を用いながら至適ＰＣＲ反応の１／１０希釈である約５０ｎＭを使用する）。好ましいＤＮＡ転写鋳型は以下に記載する通りである（ＡＲＣ２５４及びＡＲＣ２５６は全２’−ＯＭｅ条件下で転写し、ＡＲＣ２５５はｒＲｍＹ条件下で転写する）。
Figure 0005242918
 本明細書のｒＮ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−ＯＨアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジントリホスフェート（ＣＴＰ）及び２’−ＯＨウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン及び２’−ＯＨウリジンを含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
本明細書のｒＲｍＹ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−ＯＨアデノシントリホスフェート、２’−ＯＨグアノシントリホスフェート、２’−ＯＭｅシチジントリホスフェート及び２’−ＯＭｅウリジントリホスフェートを含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＭｅシチジン及び２’−ＯＭｅウリジンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。
本明細書のｄＲｍＹ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−デオキシアデノシントリホスフェート、２’−デオキシグアノシントリホスフェート、２’−Ｏ−メチルシチジントリホスフェート及び２’−Ｏ−メチルウリジントリホスフェートを含む。本発明のｄＲｍＹｒ転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾された本発明のオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
本明細書のｒＧｍＨ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−ＯＨグアノシントリホスフェート、２’−ＯＭｅシチジントリホスフェート、２’−ＯＭｅウリジントリホスフェート及び２’−ＯＭｅアデノシントリホスフェートを含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＭｅシチジン、２’−ＯＭｅウリジンおよび２’−ＯＭｅアデノシンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、そして、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、そして、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンであり、そして、全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅアデノシンである配列を含む。
本明細書のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−ＯＭｅアデノシントリホスフェート、２’−ＯＭｅシチジントリホスフェート、２’−ＯＭｅグアノシントリホスフェート、２’−ＯＭｅウリジントリホスフェートおよび２’−ＯＨグアノシントリホスフェートを含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を用いて製造される得られた修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−ＯＭｅアデノシン、２’−ＯＭｅシチジン、２’−ＯＭｅグアノシン及び２’−ＯＭｅウリジンを含み、ここでグアノシンヌクレオチドの集団は最大約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態においては、得られる本発明のｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの１０％以下が２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。
本明細書のｆＧｍＨ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−ＯＭｅアデノシントリホスフェート、２’−ＯＭｅウリジントリホスフェート、２’−ＯＭｅシチジントリホスフェートおよび２’−Ｆグアノシントリホスフェートを含む。本発明のｆＧｍＨ転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−ＯＭｅアデノシン、２’−ＯＭｅウリジン、２’−ＯＭｅシチジンおよび２’−Ｆグアノシンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
本明細書のｄＡｍＢ転写条件下においては、転写反応混合物は２’−デオキシアデノシントリホスフェート、２’−ＯＭｅシチジントリホスフェート、２’−ＯＭｅグアノシントリホスフェートおよび２’−ＯＭｅウリジントリホスフェートを含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての２’−デオキシアデノシン、２’−ＯＭｅシチジン、２’−ＯＭｅグアノシン及び２’−ＯＭｅウリジンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅグアノシンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅグアノシンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも１００％が２’−ＯＭｅグアノシンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＭｅウリジンである配列を含む。
それぞれの場合において、転写産物を、アプタマーを発見し、及び／又は所定の標的に対する結合特異性を有する配列の保存されたモチーフを決定するために、ＳＥＬＥＸ（商標）法におけるライブラリとして用いることが出来る。得られる配列はすでに安定しており、このステップから、安定化したアプタマーに達し結果としてさらに高度に安定したアプタマーを得るという工程が除かれる。２’−ＯＭｅＳＥＬＥＸ（商標）法の別の利点は、得られる配列は、配列中に要する２’−ＯＨヌクレオチドより少ない可能性が高い（必要としない場合もある）ということである。２’ＯＨヌクレオチドが残る程度に、ポストＳＥＬＥＸ（商標）修飾を行うことでそれらを取り除くことが出来る。
後述する通り、上記した至適条件以外の条件下でも、２’置換ヌクレオチドを完全に取り込んだ転写物の収率は、より低値とはなるがなお有用な水準である。例えば上記転写条件の変法としては以下の通りである。
ＨＥＰＥＳ緩衝液濃度は０〜１Ｍの範囲である。本発明はまた例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンを含む５〜１０のｐＫａを有する他の緩衝剤の使用も意図する。
ＤＴＴ濃度は０〜４００ｍＭの範囲である。本発明の方法はまた他の還元剤、例えばメルカプトエタノールの使用も可能とする。
スペルミジン及び／又はスペルミンの濃度は０〜２０ｍＭの範囲である。
ＰＥＧ−８０００濃度は０〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲である。本発明の方法はまた他の親水性重合体、例えば他の分子量のＰＥＧ又は他のポリアルキレングリコールの使用も可能である。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度は０〜０．１（ｗ／ｖ）の範囲である。本発明の方法は他の非イオン系洗剤、例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ洗剤以外のものの使用も可能である。
ＭｇＣｌ２濃度は０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲である。ＭｎＣｌ２濃度は０．１５ｍＭ〜１５ｍＭの範囲である。ＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２は共に記載した範囲内で存在しなければならず、そして好ましい実施形態においては約１０〜約３のＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２比で存在し、好ましくは比は約３〜５：１、より好ましくは比は約３〜４：１である。
２’−ＯＭｅＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は５μＭ〜５ｍＭの範囲である。
２’−ＯＨＧＴＰ濃度は０μＭ〜３００μＭの範囲である。
２’−ＯＨＧＭＰ濃度は０〜５ｍＭの範囲である。
ｐＨはｐＨ６〜ｐＨ９の範囲である。本発明の方法は修飾ヌクレオチドを取り込む大部分のポリメラーゼの活性のｐＨ領域内で実施することができる。更にまた、本発明の方法は転写反応条件におけるキレート剤の任意の使用も可能とし、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＴが挙げられる。
後述する実施例において記載する通り生物学的試験により示される最も高値の親和性及び特定の結合を有する選択されたアプタマーはＣ５補体蛋白が病因に関与する状態を治療するための適当な治療薬である。
（補体系蛋白Ｃ５に対する結合親和性を有するアプタマー）
補体系は健康の維持において重要な役割を有するが、疾患を誘発するか、それに寄与する潜在能力を有する。即ち、治療用途のための補体系の阻害剤の開発が望まれている。補体蛋白Ｃ５の阻害剤は、それが補体活性化カスケードの古典的及び代替の経路の両方の要素であるため、開発することが特に望ましい（Ｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｒｏｌｌｉｎｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １（８）：８３９−８４２）。従って、Ｃ５の抑制は何れかの経路により生じる補体媒介損傷を予防できる。一部の補体系蛋白、例えばＣ１ｑ及びＣ３は微生物に対抗する正常な防御機序において、そして、免疫成分及び損傷組織のクリアランスにおいて、重要であるが；Ｃ５はこれ等の機能のためには比較的重要性が低い。即ち、Ｃ５機能は補体系の保護的役割を犠牲にすることなく短時間又は長期間に亘り抑制される。
治療用Ｃ５阻害剤はまた、Ｃ５の分解を抑制することが２種の潜在的に損傷的な補体の活動の形成を防止することからも、望ましいものである。第１にＣ５の分解からＣ５ａが形成されることを抑制することは、主要な補体遊走及び血管作用性の活性を排除する。第２に、Ｃ５の分解からＣ５ｂが形成されることを抑制することは細胞溶解性のＣ５ｂ−９膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の組み立てをブロックする。Ｃ５切断の抑制は白血球に対する、そして、内皮細胞のような組織に対する、Ｃ５ａおよびＣ５ｂの両方の作用をブロックする（Ｗａｎｄ（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１０７９）。
Ｃ５ａおよびＭＡＣは両方ともヒトの疾患に関連する急性及び慢性の炎症に関与することがわかっており、疾患状態におけるその役割は動物モデルにおいて確認されている。Ｃ５ａは補体及び好中球依存性の肺血管傷害に必要であり（Ｗａｒｄ（１９９７）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２９：４００；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．９８：５０３）、そして、ショック及び熱傷における好中球及び血小板の活性化に関連している（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｓｈｏｃｋ ８：１１９）。ＭＡＣは急性の自己免疫性の重症筋無力症における筋肉の傷害（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｏｍｅｚ（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２６５４）、移植における臓器の拒絶反応（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９：７９７；Ｂｒａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９：２８８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１６：２７３）、および、自己免疫性の糸球体腎炎における腎傷害（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ（１９８１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．３９：１７７９；Ｎａｎｇａｋｕ（１９９７）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５２：１５７０）を媒介する。Ｃ５ａおよびＭＡＣは両方とも急性心筋虚血（Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ ａｎｄ Ｌｕｃｃｈｅｓｉ（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３４：１７）、急性（Ｂｅｄｎａｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｅｕｒｏｓｕｒｇ．８６：１３９）及び慢性のＣＮＳ傷害（Ｍｏｒｇａｎ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１４：１９）、体外循環の間（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２９０９；Ｓｐｙｃｈｅｒ ａｎｄ Ｎｙｄｅｇｇｅｒ（１９９５）Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓｍｅｄ．２２：３６）および関節炎及び狼瘡のような自己免疫疾患に関連する組織傷害における白血球活性化（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９３：８５６３）に関与するとされる。
補体活性化はまた糖尿病性網膜症にも関与するとされており、網膜血管の損傷を悪化又は発症させる。低水準の構成的な補体の活性化は通常は非糖尿病性の眼において起こり、これは非糖尿病ラットの眼におけるＭＡＣ及び補体調節蛋白の存在により顕在化され、補体の調節不全が糖尿病患者で起こることを示している（Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＩＯＶＳ ４１：３４９２）。更にまた、Ｃ５ｂ−９の付着が糖尿病ヒトドナー由来の網膜血管中に検出され、非糖尿病ヒトドナーでは存在せず（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、ＣＤ５５およびＣＤ５９の低減した発現が糖尿病網膜で観察され（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、そして、グリケートされたＣＤ５９が糖尿病患者の尿中に存在するが非糖尿病患者では観察されない（Ａｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＰＮＡＳ ９７，５４５０−５４５５）。更にまた、補体及び血管系はＩ型糖尿病において活性化されることがわかっている。例えばＨａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５３：１５７０−１５７６（２００４）を参照できる。Ｃ５ａは免疫系及び補体系との相互作用を介して内皮細胞を活性化する。例えばＡｌｂｒｅｃｈｔ， Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６４：８４９−８５９（２００４）を参照できる。血管系は糖尿病性網膜症を含む眼疾患において活性化される。例えばＧｅｒｔ， Ｖ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，４３：１１０４−１１０８（２００２）を参照できる。補体系はまた糖尿病性網膜症においても活性化される。例えばＧｅｒｔ， Ｖ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，４３：１１０４−１１０８（２００２）およびＢａｄｏｕｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１０５：３８３−３８８（１９８８）を参照できる。
一部の実施形態においては、本発明の物質は補体蛋白Ｃ５に特異的に結合し、インビボ及び／又は細胞系の試験において補体蛋白Ｃ５の活性化を機能的にモジュレート、例えばブロックする、約１５〜約６０ヌクレオチド長の一連の核酸アプタマーを含む。
補体蛋白Ｃ５に特異的に結合してモジュレートすることができるアプタマーは本明細書に記載する通りである。これらのアプタマーは種々の補体関連の疾患又は障害、例えば、補体関連心臓障害（例えば心筋傷害；冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）に関わるＣ５媒介補体合併症、例えば術後出血、全身好中球及び白血球の活性化、心筋梗塞の危険性亢進、及び亢進認知障害；再狭窄；および経皮的冠動脈介入に関わるＣ５媒介補体合併症）、虚血再灌流傷害（例えば心筋梗塞、脳卒中、凍傷）、補体関連炎症性障害（例えば喘息、関節炎、敗血症及び臓器移植後の拒絶反応）及び補体関連自己免疫障害（例えば重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ））の治療、軽減及び／又は予防の低毒性、安全で効果的な治療様式を与える。Ｃ５抑制が望ましい他の適応症は例えば肺炎症（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：５０３）、体外循環補体活性化（Ｒｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１５６４）、抗体媒介補体活性化（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２６５４）、糸球体腎炎及び他の腎疾患、眼の適応症、例えばＣ５媒介眼組織損傷、例えば糖尿病性網膜症及び発作性夜間性ヘモグロビン尿症を包含する。これ等のアプタマーはまた診断においても使用してよい。
これ等のアプタマーは本明細書に記載する通り修飾を含んでいてよく、例えば親油性又は高分子量の化合物（例えばＰＥＧ）とのコンジュゲート形成、キャッピング部分の取り込み、修飾されたヌクレオチドの取り込み、及び、ホスフェート骨格への修飾が挙げられる。
本発明の１つの実施形態においては、Ｃ５補体蛋白に結合する単離された天然には存在しないアプタマーが提供される。一部の実施形態においては、単離された天然には存在しないアプタマーは１００μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満のＣ５補体蛋白に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。本発明の一部の実施形態においては、解離定数は後述する実施例１に記載する通りドットブロット滴定により決定する。
別の実施形態において、本発明のアプタマーはＣ５補体蛋白の機能をモジュレートする。別の実施形態において本発明のアプタマーはＣ５の機能を抑制し、別の実施形態においてはアプタマーはＣ５の機能を促進する。本発明において使用されるＣ５補体蛋白変異体は本質的にＣ５補体蛋白の機能と同じ機能を行う変異体を包含する。Ｃ５補体蛋白変異体は好ましくは実質的に同じ構造を有し、そして一部の実施形態においては、以下のアミノ酸配列（配列番号１０２）を含むＣ５補体蛋白のアミノ酸配列と８０％の配列同一性、より好ましくは９０％の配列同一性、そして更に好ましくは９５％の配列同一性を有する（Ｈａｖｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１ Ｊａｎ １；１４６（１）：３６２−８において引用）。
Figure 0005242918
 本発明の一部の実施形態においては、標的変異体の配列同一性は後述する通りＢＬＡＳＴを用いて測定できる。２つ以上の核酸又は蛋白の配列の関連において「配列同一性」という用語は、比較して最大の一致があるように配置し、以下の配列比較アルゴリズム又のひとつを用いるか、又は目視による検査により測定した場合に、同じであるか、又は、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定の比率を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列比較のためには、典型的には１つの配列が被験配列を比較する相手となる比較参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験及び比較参照配列はコンピューターに入力し、サブ配列の座標を必要に応じて指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、指定のプログラムのパラメーターに基づいて比較参照配列と相対比較した場合の被験配列に関するパーセント配列同一性を配列比較アルゴリズムが計算する。比較のための配列の至適アライメントは例えばＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の同様性検索法によるか、これ等のアルゴリズムのコンピューター処理（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によるか、又は、目視による検査（一般的に後述のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，参照）により実施することができる。
パーセント配列同一性を決定するために適するアルゴリズムの１つの例はベーシックローカルアライメントサーチツール（以降「ＢＬＡＳＴ」と称する）において使用されるアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照できる。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以降「ＮＣＢＩ」と称する）を介して公的に入手できる。ＮＣＢＩから入手できるソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴＩＮ（ヌクレオチド配列用）及びＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いて配列同一性を決定する場合に使用されるデフォルトパラメーターはＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３２：Ｗ２０−Ｗ２５（２００４）に記載されている。
本発明の別の実施形態において、アプタマーは配列番号１〜２、５〜６７、７５〜８１又は８８〜９８の何れか１つを含むアプタマーと実質的に同様のＣ５補体蛋白結合能力を有する。本発明の別の実施形態においては、アプタマーは配列番号１〜２、５〜６７、７５〜８１又は８８〜９８の何れか１つを含むアプタマーと実質的に同様の構造及びＣ５補体蛋白結合能力を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは配列番号２、５〜６７、７５〜８１又は８８〜９８の何れか１つに従った、何れかの化学修飾も含めた配列を有する。別の実施形態においては、本発明のアプタマーは医薬組成物における活性成分として使用される。別の実施形態においては、アプタマー又は本発明のアプタマーを含む組成物は補体関連心臓障害（例えば心筋傷害；冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）に関わるＣ５媒介補体合併症、例えば術後出血、全身好中球及び白血球の活性化、心筋梗塞の危険性亢進、及び亢進認知障害；再狭窄；および経皮的冠動脈介入に関わるＣ５媒介補体合併症）、虚血再灌流傷害（例えば心筋梗塞、脳卒中、凍傷）、補体関連炎症性障害（例えば喘息、関節炎、敗血症及び臓器移植後の拒絶反応）及び補体関連自己免疫障害（例えば重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ））、肺の炎症、体外循環の補体活性化、抗体媒介補体活性化、及び眼の適応症、例えば補体媒介眼組織損傷、例えば糖尿病性網膜症よりなる群から選択される何れか１つを包含する種々の補体関連の疾患又は障害を治療するために使用される。
１つの実施形態において、本発明の抗Ｃ５アプタマーは２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（「２’−ＯＭｅ」）及び２’−ＯＨプリン残基の混合物を含む。修飾された抗Ｃ５アプタマーに関する記述的包括的配列（配列番号１）は以下の表１に示す通りであり、構造は図３Ａに示す。プリンの大部分（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨのままとなっている２つのＧ残基（アウトラインで示す残基）を除き、２’−ＯＭｅに修飾されている。○で囲んだ残基はアプタマーの抗Ｃ５活性を大きく改変することなく２’−Ｈに同時に修飾できるピリミジンの部分集合を示す（下記の表１のＡＲＣ３３０（配列番号２、図３Ｂ）参照）。図３Ａの下線を付した残基は２’−フルオロ又は２’−Ｈ修飾の何れか（２’−ＯＭｅではない）を含むことが出来るピリミジン残基を示し、□で囲んだ残基は２’−フルオロ又は２’−ＯＭｅ修飾の何れか（２’−Ｈではない）を含むことが出来るピリミジン残基を示す。矢印（→）を付した残基は２’−フルオロ修飾を含んでいなければならない。矢印（→）を付した残基において２’−フルオロ修飾がない場合、得られるアプタマーの溶血活性は実質的に低減する。好ましい実施形態においては、本発明の抗Ｃ５アプタマーは配列番号１に従ったヌクレオチド配列を含む。
本発明の抗Ｃ５アプタマーの例は図３Ｃに示し、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，３９５，８８８に記載のＡＲＣ１８６（配列番号４）である。ＡＲＣ１８６の全２１ピリミジン残基は２’−修飾されている。プリンの大部分（１４残基）は３つの２’−ＯＨプリン残基（図３Ｃにおいてアウトラインで示す）を除き２’−ＯＭｅ修飾を有する。本発明の抗Ｃ５アプタマーは２’−フルオロ及び２’−Ｈ修飾の種々の混合物も包含できる。例えば別の本発明の抗Ｃ５アプタマーは図３Ｂに示すＡＲＣ３３０（配列番号２）である。ＡＲＣ３３０（配列番号２）は２’−Ｈ修飾（図３Ｂに示す○で囲んだ残基）７個、２’−フルオロ修飾を有するピリミジン残基１４個、２’−ＯＭｅ修飾を有するプリン残基１４個、及び２’−ＯＨプリン残基３個を含有する（図３Ｂにおいてアウトラインで示す）。
２’−フルオロ修飾、２’−ＯＭｅ修飾、２’−ＯＨプリン残基の混合物を含有するアプタマーの他の組み合わせ及び種々のサイズの非免疫原性高分子量化合物（例えばＰＥＧ）へのコンジュゲート形成は、各々がＡＲＣ１８６（配列番号４）より誘導されたものであり、以下の表１に示す通りである。本発明は以下の表１に示すアプタマー並びに３’キャップが欠如又は付加されている（例えば反転ｄＴ）以下のアプタマーを包含する。
特段の記載が無い限り、以下の表１に示すヌクレオチド配列は５’から３’の方向に列挙した。表１における個々の配列の各々につき、全ての２’−ＯＭｅプリン又はピリミジン修飾は相当するヌクレオチドの前の「ｍ」により示し；全ての２’−フルオロピリミジン修飾は相当するヌクレオチドの前の「ｆ」により示し；全てのプリン又はピリミジンのデオキシ修飾は相当するヌクレオチドの前の「ｄ」により示し；そしてヌクレオチドの前に「ｍ」、「ｆ」又は「ｄ」を伴わずに示されている何れのプリン又はピリミジンも２’−ＯＨ残基を示す。
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補体蛋白Ｃ５に結合する本発明の他のアプタマーは実施例３において後述する通りである。
一部の実施形態においては、本発明のアプタマー治療薬はその標的に対して高度の親和性及び特異性を有するが、アプタマー治療薬が患者又は対象の身体内で分解した場合に天然に存在しないヌクレオチドの置換に起因する望ましくない副作用は低減されている。一部の実施形態においては、本発明のアプタマー治療薬を含有する治療用組成物はフッ素化ヌクレオチドは全く含まないか低減された量のみ有する。
本発明のアプタマーは当該分野で知られた何れかのオリゴヌクレオチド合成法、例えば当該分野でよく知られた固相オリゴヌクレオチド合成（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６））および溶液相の方法、例えばトリエステル合成法（例えばＳｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８））を用いて合成できる。
（医薬組成物）
本発明はまた、補体蛋白Ｃ５に結合するアプタマー分子を含有する医薬組成物を包含する。一部の実施形態においては、組成物は内用に適しており、そして、本発明の薬理学的に活性な化合物の治療有効量を、単独で、又は、製薬上許容しうる担体１つ又は１つより多くと組み合わせて包含する。化合物はその毒性がある場合でも極めて低値である点において特に有用である。
本発明の組成物は患者における病的状態、例えば疾患又は障害を治療又は予防するため、又は、そのような疾患又は障害の症状を軽減するために使用できる。例えば本発明の組成物は補体関連心臓障害（例えば心筋傷害；冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）に関わるＣ５媒介補体合併症、例えば術後出血、全身好中球及び白血球の活性化、心筋梗塞の危険性亢進、及び亢進認知障害；再狭窄；および経皮的冠動脈介入に関わるＣ５媒介補体合併症）、虚血再灌流傷害（例えば心筋梗塞、脳卒中、凍傷）、補体関連炎症性障害（例えば喘息、関節炎、敗血症及び臓器移植後の拒絶反応）及び補体関連自己免疫障害（例えば重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥまたは狼瘡））、肺の炎症、体外循環の補体活性化、抗体媒介補体活性化、及び眼の適応症、例えば糖尿病性網膜症に関連する病的状態を治療又は予防するために使用できる。本発明の組成物は本発明のアプタマーが特異的に結合する補体蛋白Ｃ５に関連するか、これより誘導される疾患又は障害に罹患した、又は、その素因のある対象に対して投与するために有用である。
本発明の組成物は病的状態を有する患者又は対象を治療するための方法において使用できる。本発明の方法は、補体蛋白Ｃ５へのアプタマーの結合がその生物学的機能を改変することにより病的状態が治療されるように、患者又は対象に補体蛋白Ｃ５に結合するアプタマー又はアプタマーを含む組成物を投与することを包含する。
病的状態を有する患者又は対象、即ち、本発明の方法により治療される患者又は対象は脊椎動物、特に哺乳類、更にはヒトであることができる。
実際においては、アプタマー又は製薬上許容しうるその塩は所望の生物学的活性を発揮するため、例えばアプタマー標的のその受容体への結合を抑制、標的蛋白の切断を防止するために十分な量で投与する。
本発明の１つの特徴はＣ５媒介補体障害の他の治療と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のアプタマー組成物は例えば１つより多いアプタマーを含有してよい。一部の実施形態においては、本発明の化合物１つ以上を含有する本発明のアプタマー組成物は、他の有用な組成物、例えば抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウィルス剤等と組み合わせて投与される。更にまた、本発明の化合物は、上記した通り、細胞毒製剤、細胞増殖抑制剤又は化学療法剤、例えばアルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂抑制剤又は細胞毒性抗生物質と組み合わせて投与してよい。一般的に、このような組み合わせにおいて使用される既知治療薬の現在使用可能な剤型が適している。
「複合療法」（又は「共同療法」）は、本発明のアプタマー組成物及び少なくとも第２の薬剤をそれらの治療薬の共同作用から有益な効果がもたらされることを意図した特定の治療計画の部分として投与することを包含する（ただし、これらに限定されない）。組み合わせの有益な効果は、例えば治療薬の組み合わせから得られる薬物動態又は薬力学的な共同作用を包含する。組み合わせにおけるこれ等の治療薬の投与は典型的には所定の期間にわたって実施する（選択された組み合わせに応じて、通常は、分、時間、日又は週単位）。
「複合療法」は、通常とは異なるが、本発明の組み合わせが偶然又は自由にもたらされる個別の単独療法の部分としてこれ等の治療薬２種以上を投与することを包含してよいものとする。「複合療法」は逐次的にこれ等の治療薬を投与することを包含することを意図し、その場合、各治療薬は異なる時点において投与され、或いは、これ等の治療薬又は少なくとも２種の治療薬の投与は実質的に同時に行う。実質的に同時の投与は例えば各治療薬の固定された比率を有する単独カプセル、又は、治療薬各々に対する単独カプセル複数を対象に投与することにより実施してよい。
各治療薬の逐次的、又は実質的に同時の投与は、何れかの適切な経路、例えば局所、経口、静脈内、筋肉内及び粘膜組織経由の直接吸収を包含する経路により実施される（ただし、これらに限定されない）。治療薬は同じ経路又は異なる経路で投与できる。例えば選択された組み合わせの第１の治療薬を注射により投与し、そして組み合わせの他の治療薬を局所投与してよい。
或いは、例えば全治療薬を局所投与してよく、或いは、全治療薬を注射により投与してよい。治療薬を投与する順序は特段の記載が無い限り厳密ではない。「複合療法」はまた更に別の生物学的に活性な成分との組み合わせにおける上記した治療薬の投与を包含することができる。複合療法が更に非薬剤の治療を含む場合は、非薬剤の投与は、治療薬と非薬剤治療の組み合わせの共同作用から有利な効果が達成される限り、何れかの適当な時点で実施してよい。例えば、適切な場合においては、非薬剤の投与を治療薬の投与から恐らくは数日又は数週間も隔たらせてもなお有利な効果が達成される。
本発明の治療薬又は薬理学的組成物は一般的には製薬上許容しうる媒体中に溶解又は分散された治療の活性成分の有効量を含む。製薬上許容しうる媒体又は担体は種々の溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗カビ剤、等張性付与剤及び吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は当該分野でよく知られている。補助的活性成分もまた本発明の治療用組成物中に配合できる。
医薬組成物又は薬理学的組成物の製造は本発明の開示を鑑みれば当業者のよく知る通りである。典型的には、このような組成物は液体の溶液又は懸濁液の何れかとしての注射液；注射の前に液体中の溶液又は懸濁液とするのに適する固体形態；経口投与用の錠剤又は他の個体；除放性カプセル；又は現在使用されている何れかの他の形態、例えば点眼液、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤等として製造してよい。手術現場における特定の領域を処置するための滅菌製剤、例えば生理食塩水系洗浄剤の外科医、内科医又は医療従事者による使用もまた特に有用である。組成物は微小装置、微粒子又はスポンジを介して送達してもよい。
製剤においては、治療薬は投薬に適合した態様において、そして、生理学的に有効な量において投与される。製剤は種々の剤型、例えば上記した注射用の液として容易に投与されるが、薬剤放出カプセル等も使用できる。
この関連においては、投与すべき活性成分の量及び組成物の容量は治療するべき宿主動物に応じて変化する。投与に必要な活性化合物の厳密な量は担当者の判断によるものであり、各個体に特定のものである。
活性化合物を分散させるために必要な組成物の最小容量を典型的には使用する。投与に適する用法も変動するが、まず化合物を投与して結果をモニタリングし、そして次に更に間隔を置いて更に制御された用量を与えることにより典型化される。
例えば、錠剤又はカプセル（例えばゼラチンカプセル）の形態における経口投与のためには、活性薬剤成分は、経口用非毒性の製薬上許容しうる不活性の担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と混合することができる。更に、所望又は必要に応じて、適当な結合剤、潤滑剤、錠剤崩壊剤及び着色剤も混合物に配合できる。適当な結合剤は澱粉、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、澱粉ペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン、天然の糖類、例えばグルコース又はベータラクトース、とうもろこし甘味料、天然及び合成のガム類、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックス等を包含する。これ等の剤型で使用する潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール等を包含する。錠剤崩壊剤は例えば澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム澱粉、寒天、アルギン酸、またはそのナトリウム塩、または発泡性の混合物などを含有する（ただし、それらに限定されない）。希釈剤は例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシンを包含する。
注射用組成物は好ましくは水性の等張性の溶液又は懸濁液であり、そして座剤は脂肪の乳液又は懸濁液から好都合に製造される。組成物は滅菌及び／又はアジュバント含有、例えば保存料、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤、溶液促進剤、浸透圧調節用塩及び／又は緩衝物質含有であってよい。更にまた、他の治療上価値ある物質も含有してよい。組成物は従来の混合、顆粒化又はコーティング法によりそれぞれ製造され、そして典型的には活性成分約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％を含有する。
本発明の化合物は時間指定放出及び持続放出の錠剤又はカプセル、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップ及び乳液のような経口用剤型において投与することができる。
液体、特に注射用組成物は例えば溶解、分散等により製造できる。活性化合物を薬学的に純粋な溶媒、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等に溶解又は混合することにより注射可能な溶液又は懸濁液を形成する。更にまた、注射前に液体に溶解するのに適する固体形態も製剤できる。
本発明の化合物は、全て医薬品分野の当該分野でよく知られている形態を用いて、静脈内（瞬時及び注入の両方）、腹腔内、経皮又は筋肉内の剤型において投与できる。注射用剤は液体の溶液又は懸濁液の何れかの従来の形態で製造できる。
皮下、筋肉内又は静脈内の注射及び注入のためには非経腸の注射投与を一般的に使用する。更にまた、非経腸投与のための１つの手法は参照により本明細書に組み込まれる米国特許３，７１０，７９５に従って一定量の用量が確実に維持されるようにした緩徐放出又は持続放出の系のインプラント処置を使用している。
更にまた本発明のために好ましい化合物は適当な鼻内のベヒクル、吸入剤の局所使用を介して鼻内投与するか、又は、当該分野でよく知られた経皮投薬用の皮膚パッチの形態を用いた経皮の経路を介して投与できる。経皮送達系の形態で投与するためには、用量の投与は当然ながら用法を通じて完結的である場合よりも継続的となる。他の好ましい局所用調製物はクリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー及びゲルを包含し、その場合、活性成分の濃度は典型的には０．０１％〜１５％ｗ／ｗ又はｖ／ｖとなる。
固体組成物の場合は、賦形剤は医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用してよい。上記した活性化合物はまた例えばポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールを担体として使用しながら座剤として製剤してもよい。一部の実施形態においては、座剤は好都合には脂肪の乳液又は懸濁液から製造する。
本発明の化合物は小型１層小胞、大型１層小胞及び多層小胞のようなリポソーム送達系の形態で投与することができる。リポソームはコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含有するリン脂質の種々のものから形成できる。一部の実施形態においては米国特許５，２６２，５６４に記載の通り、脂質成分のフィルムを薬剤の水溶液で水和させ、薬剤をカプセル化する脂質層を形成する。例えば本明細書に記載したアプタマー分子を当該分野で知られた方法を用いて構築された親油性化合物又は非免疫原性の高分子量の化合物との複合体として提供することができる。核酸関連複合体の例は米国特許６，０１１，０２０に記載されている。
本発明の化合物はまたターゲティング可能な薬剤担体としての可溶性重合体とカップリングしてよい。このような重合体はポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを包含する。更にまた、本発明の化合物は、薬剤の制御された放出を達成する場合に有用な生体分解性の重合体のクラス、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び交差結合又は両親媒性のヒドロゲルブロック共重合体とカップリングさせてよい。
所望により投与すべき医薬組成物は少量の非毒性の副次的物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び他の物質、例えば酢酸ナトリウム及びオレイン酸トリエタノールアミンを含有してよい。
アプタマーを利用した投薬の用法は種々の要因、例えば患者の型、種、年齢、体重、性別および医療状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎及び肝機能；及び使用すべき特定のアプタマー及びその塩に従って選択する。当該分野の医師又は獣医師は状態の進行を予防、逆行又は停止させるために必要な薬剤の有効量を容易に決定して処方することができる。
本発明の経口用量は、指定の作用のために使用される場合、約０．０５〜７５００ｍｇ／日経口量の間で変動する。組成物は好ましくは活性成分０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０及び１０００．０ｍｇを含む分割錠の形態で提供される。本発明の化合物は単回一日当たり用量において投与してよく、或いは、総一日当たり用量は１日に２回、３回又は４回の分割用量において投与してよい。
注入による投薬、鼻内投薬及び経皮の投薬の用量は、０．０５〜７５００ｍｇ／日の範囲とする。皮下、静脈内及び腹腔内の投薬の用量は０．０５〜３８００ｍｇ／日の範囲とする。
本発明の化合物の有効血漿中濃度は０．００２ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
（アプタマー治療薬の薬物動態及び生体内分布のモジュレーション）
アプタマーを含む全オリゴヌクレオチド系治療薬の薬物動態特性は所望の医薬品用途と合致するように調節することが重要である。細胞外標的に対して指向されたアプタマーは細胞内送達に関連する難点（アンチセンス及びＲＮＡｉ系の治療薬の場合等）から開放されているが、そのようなアプタマーは標的の臓器及び組織に分布することがなお可能でなければならず、そして所望の用量用法に合致する時間に亘り身体内に残存（未修飾で）しなければならない。
即ち、本発明はアプタマー組成物の薬物動態に影響する物質及び方法、特に、アプタマーの薬物動態を調整する能力を提供する。アプタマー薬物動態の調整性（即ちモジュレートする能力）は修飾部分（例えばＰＥＧ重合体）のアプタマーへのコンジュゲート形成及び／又は核酸の化学組成を改変するための修飾ヌクレオチド（例えば２’−フルオロ又は２’−ＯＭｅ）の取り込みを介して達成される。アプタマーの薬物動態を調整する能力は既存の治療用途の向上において、又は、新しい治療用途の開発において使用される。例えば一部の治療用途において、例えば急速な薬物クリアランス又はターンオフが望まれる抗新生物又は急性の処置状況においては、循環系内のアプタマーの滞留時間を低減することが望ましい。或いは、他の治療用途、例えば治療薬の全身循環が望ましい維持療法においては、循環中のアプタマーの滞留時間を増大させることが望ましい。
更にまた、アプタマーの薬物動態の調整性を用いて対象におけるアプタマー治療薬の生体内分布性を変える。例えば、一部の治療用途においては、組織の特定の型又は特定の臓器（又は臓器セット）をターゲティングする試みにおいて、アプタマー治療薬の生体内分布を改変することが望ましい場合がある。このような用途において、アプタマー治療薬は特定の組織又は臓器に優先的に蓄積する。他の治療用途においては、アプタマー治療薬が罹患組織に優先的に蓄積するように、所定の疾患、細胞傷害又は他の異常な病的状態に関わる細胞マーカー又は症状を示す組織をターゲティングすることが望ましい。例えば２００４年３月５日出願の「アプタマー治療薬の薬物動態及び生体内分布の制御されたモジュレーション」と題された同時係争中の米国特許暫定出願６０／５５０７９０に記載の通り、ＰＥＧ化アプタマー治療薬が優先的に炎症組織に蓄積するように、アプタマー治療薬のＰＥＧ化（例えば２０ｋＤａのＰＥＧ重合体によるＰＥＧ化）を用いて炎症組織をターゲティングする。
アプタマー治療薬（例えばアプタマーコンジュゲート又は改変された化学特性を有するアプタマー、例えば修飾されたヌクレオチド）の薬物動態及び生体内分布のプロファイルを測定するために、種々のパラメーターをモニタリングする。このようなパラメーターは例えばアプタマー組成物の半減期（ｔ１／２）、血漿中クリアランス（Ｃｌ）、分布容量（Ｖｓｓ）、濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）、最大観察血清中又は血漿中濃度（Ｃｍａｘ）及び平均滞留時間（ＭＲＴ）を包含する。本明細書においては、「ＡＵＣ」という用語はアプタマー治療薬の血漿中濃度のアプタマー投与後時間に対するプロットの下部の面積を指す。ＡＵＣ値は所定のアプタマー治療薬の生体利用性（即ちアプタマー投与後の循環中の投与アプタマー治療薬のパーセント）及び／又は総クリアランス（Ｃｌ）（即ちアプタマー治療薬は循環から除去される速度）を推定するために使用される。分布の容量はアプタマー治療薬の血漿中濃度を身体内に存在するアプタマーの量に関連付ける。Ｖｓｓが大きいほどより多くのアプタマーが血漿外に存在（即ち管外遊出が大きい）することになる。
本発明はアプタマーをモジュレート部分、例えば小分子、ペプチド又は重合体の末端基にコンジュゲートすることにより、又は、アプタマーに修飾されたヌクレオチドを取り込むことにより、安定化されたアプタマー組成物のインビボの薬物動態及び生体内分布を制御された態様でモジュレートする物質及び方法を提供する。本明細書に記載したとおり、修飾部分のコンジュゲート形成及び／又はヌクレオチド化学組成を改変することは、循環中のアプタマーの滞留時間及び組織への分布の基本的特徴を改変する。
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド療法は腎濾過による排出にも付される。そのため、静脈内投与されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは典型的には濾過をブロックできない限り１０分未満のインビボの半減期を示す。これは血流から出て組織にいたる急速な分布を促進することか、又は、糸球体の有効サイズカットオフを超えるようにオリゴヌクレオチドの見かけ上分子量を増大させることの何れかにより達成できる。後述するＰＥＧ重合体への小型治療薬のコンジュゲート形成（ＰＥＧ化）は循環中のアプタマーの滞留時間を劇的に長時間化させ、これにより投薬頻度を低減し、血管標的に対する有効性を増大させる。
アプタマーは種々の修飾部分、例えば高分子量重合体、例えばＰＥＧ；ペプチド、例えばＴａｔ（ＨＩＶのＴａｔ蛋白の１３アミノ酸フラグメント（Ｖｉｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａのホメオ蛋白の第３螺旋から誘導される１６アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ１９（１１−１２）：１３９７−４０５）、及びＡｒｇ７（ポリアルギニン（Ａｒｇ７）よりなる短い正荷電の細胞浸透性のペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８））及び小型分子、例えばコレステロールのような親油性の化合物にコンジュゲートできる。本明細書に記載した種々のコンジュゲートのうち、アプタマーのインビボの特性はＰＥＧ基との複合体形成により最も大きく改変される。例えば２０ｋＤａのＰＥＧ重合体との混合型の２’Ｆ及び２’−ＯＭｅ修飾アプタマー治療薬の複合体形成は腎濾過を遮蔽し、健常及び炎症組織の両方へのアプタマーの分布を促進する。更にまた、２０ｋＤａのＰＥＧ重合体アプタマーコンジュゲートはアプタマーの腎濾過の防止において、４０ｋＤａＰＥＧ重合体ほぼ同様に効果的であることがわかっている。ＰＥＧ化の１つの作用はアプタマーのクリアランスであるが、２０ｋＤａ部分の存在により得られた延長された全身曝露もまた、組織、特に高度に灌流された臓器及び炎症部位へのアプタマーの分布を促進している。アプタマー−２０ｋＤａＰＥＧ重合体コンジュゲートはＰＥＧ化アプタマーが優先的に炎症組織に蓄積するように炎症部位にアプタマー分布を指向させる。一部の例においては、２０ｋＤａのＰＥＧ化アプタマーコンジュゲートは例えば腎細胞のような細胞の内部に到達できる。
全体として、低分子量修飾部分、例えばコレステロール及び細胞浸透性ペプチドによりもたらされるアプタマーの薬物動態及び組織分布に対する作用はヌクレオチドのＰＥＧ化又は修飾の結果としてもたらされるもの（例えば、改変された化学組成）よりも著明性が低い。理論に制約されないが、アンチセンスコンジュゲートの場合に起こるとされている血漿リポ蛋白とのコレステロール媒介会合はアプタマーコレステロールコンジュゲート折りたたみ構造の特定の意味から除外される、及び／又はコレステロール基の親油性の特徴と関連することが示唆されている。コレステロールと同様、Ｔａｔペプチドタグの存在は血流からのアプタマーのクリアランスを促進し、比較的高値のコンジュゲート濃度は４８時間に腎において生じる。インビトロにおける巨大分子の細胞膜通過を媒介することが当該分野で知られている他のペプチド（例えばＡｎｔ、Ａｒｇ７）は循環系からのアプタマーのクリアランスを促進しないと考えられる。しかしながら、Ｔａｔと同様、Ａｎｔコンジュゲートは他のアプタマーと相対比較して腎に顕著に蓄積する。理論に制約されないが、インビボの三次元折りたたみアプタマーの関連においてＡｎｔ及びＡｒｇ７ペプチド修飾部分の不都合な存在は、これ等のペプチドがアプタマー輸送特性に影響する能力を損なう可能性がある。
修飾されたヌクレオチドはまたアプタマーの血漿中クリアランスをモジュレートするために使用できる。例えば、インビトロ及びインビボで高水準のヌクレアーゼ安定性を示すことから現世代のアプタマーに典型的なものである２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅの安定化化学構造の両方を取り込んだ未コンジュゲートアプタマーは、未修飾アプタマーと比較した場合に、急速な血漿中からの消失（即ち急速な血漿中クリアランス）及び組織、主に腎臓への急速な分布を示す。
（ＰＥＧ誘導体化核酸）
前記した通り、高分子量非免疫原性重合体を有する核酸の誘導体化は核酸の薬物動態及び薬力学的な特性を改変してそれらをより有効な治療薬とする潜在能力を有する。活性の望ましい変化は、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性の増大、腎経由濾過の低下、免疫系への曝露の低下、および身体への治療薬の分布の変化を包含する。
本発明のアプタマー組成物はポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分で誘導体化してよい。ＰＡＧ誘導核酸の例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる２００３年１１月２１日出願の米国特許出願１０／７１８，８３３に記載されている。本発明で使用される典型的な重合体は、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）としても知られているもの及びポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールも包含する）を包含する。更にまた、種々のアルキレンオキシド（例えばエチレンオキシド及びプロピレンオキシド）のランダム又はブロック共重合体も多くの用途において使用できる。大部分の一般的な形態においては、ポリアルキレングリコール、例えばＰＥＧは、各末端においてヒドロキシル基で終わる線状の重合体：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨである。この重合体、アルファ−、オメガ−ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）はＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表すことができ、ここで−ＰＥＧという標記は以下の構造単位：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を表すものとし、ここでｎは典型的には約４〜約１０，０００の範囲である。
記載したとおり、ＰＥＧ分子は２官能性であり、場合により「ＰＥＧジオール」と称される。ＰＥＧ分子の末端部分は比較的非反応性のヒドロキシル部分、−ＯＨ基であり、これは化合物の反応性の部位における他の化合物へのＰＥＧの結合のために、活性化又は官能性部分に変換することができる。このような活性化されたＰＥＧジオールは本明細書においては、ビ活性化ＰＥＧと称する。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド由来のスクシンイミジル活性エステルによる比較的非反応性のヒドロキシル部分−ＯＨの置換により、アミノ部分との選択的反応のための活性カーボネートエステルとして官能性付与されている。
多くの用途において、本質的に非反応性の部分により一端上でＰＥＧ分子をキャッピングすることによりＰＥＧ分子を１官能性とする（又はモノ活性化する）ことが望ましい。一般的に活性化ＰＥＧに対して複数の反応部位をディスプレイする蛋白治療薬の場合は、２官能性の活性化ＰＥＧは広範な交差結合をもたらし、官能性の低い凝集物をもたらす。モノ活性化ＰＥＧを形成するためには、ＰＥＧジオール分子の末端の１つのヒドロキシル部分は典型的には非反応性のメトキシ末端部分、−ＯＣＨ３で置換される。ＰＥＧのもう一端の非キャッピングの末端は典型的には表面上又は蛋白のような分子の上にある反応性の部位における結合のために活性化することができる反応性の末端部分に変換される。
ＰＡＧは典型的には水及び多くの有機溶媒中の溶解性を有し、毒性はなく、免疫原性もない重合体である。ＰＡＧの１つの使用は、不溶性の分子に重合体を共有結合することにより得られるＰＡＧ分子「コンジュゲート」を可溶性とすることである。例えば、水不溶性の薬剤パクリタキセルをＰＥＧにカップリングすると水溶性になることがわかっている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５））。ＰＡＧコンジュゲートは溶解度及び安定性の増強のみではなく、分子の血中循環半減期の延長のためにも使用される場合が多い。
本発明のポリアルキル化化合物は典型的には５〜８０ｋＤの大きさであるが、アプタマー及び用途に応じて何れかの大きさのものを選択して使用することができる。本発明の他のＰＡＧ化合物は１０〜８０ｋＤの大きさである。本発明の更に他のＰＡＧ化合物は１０〜６０ｋＤの大きさである。例えばＰＡＧ重合体は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０又は８０ｋＤの大きさであってよい。このような重合体は直鎖又は分枝鎖であることができる。
生物学的に発現された蛋白の治療薬とは対照的に、核酸治療薬は典型的には活性化された単量体ヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ核酸コンジュゲートは同じ反復単量体の合成を用いてＰＥＧを取り込むことにより製造してよい。例えば、ホスホアミダイト形態に変換することにより活性化されたＰＥＧを固相オリゴヌクレオチド合成に取り込むことができる。或いは、オリゴヌクレオチド合成は反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的取り込みにより完了することができる。最も一般的には、これは５’末端の遊離の第１アミンの付加（固相合成の最終カップリング工程において修飾ホスホアミダイトを用いて取り込む）により達成されている。この手法を用いれば、反応性のＰＥＧ（例えばアミンと反応して結合を形成できるように活性化されたもの）を精製されたオリゴヌクレオチドと組み合わせ、そしてカップリング反応を溶液中で行う。一部の実施形態においては、重合体は分枝鎖ＰＥＧ分子である。更に別の実施形態においては、重合体は４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧであり、例えば図４に示した１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）を参照できる。一部の実施形態においては、４０ｋＤの分枝鎖１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）が図５に示す通りアプタマーの５’末端に結合している。
治療薬の生体内分布性を改変するＰＥＧコンジュゲート化の能力はコンジュゲートの見かけの大きさ（例えば水力学的半径として測定）を含む多くの要因に関連する。より大きいコンジュゲート（＞１０ｋＤａ）は腎を介する濾過をより効果的にブロックし、そして、結果的に小型のマクロ分子（例えば、ペプチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清中半減期を増大させることがわかっている。濾過をブロックするＰＥＧコンジュゲートの能力は、ＰＥＧの大きさを約５０ｋＤａまで増大させることがわかっている（更に増大しても、半減期は腎経由排出よりはむしろマクロファージ媒介代謝により決定されることになるため、利益は小さい）。
高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の製造は困難、非効率的及び高価となる場合がある。高分子量ＰＥＧ−核酸コンジュゲートの合成に向けた経路として、過去の研究は高分子量活性化ＰＥＧの形成に着目していた。そのような分子を形成するための１つの方法では、２つ以上のＰＥＧが活性化基を担持した中央コア部に結合している分枝鎖活性化ＰＥＧの形成を行う。これ等の高分子量ＰＥＧ分子の末端部分、即ち比較的非反応製のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、他の化合物との化合物上の反応性の部位におけるＰＥＧ１つ以上の結合のために、活性化されるか、又は官能性部分に変換される。分枝鎖活性化ＰＥＧは２つより多い末端を有し、そして２つ以上の末端が活性化されている場合は、そのような活性化高分子量ＰＥＧ分子は、本明細書においては多重活性化ＰＥＧと称する。分枝鎖ＰＥＧ分子の全ての末端が活性化されるわけではない場合もある。分枝鎖ＰＥＧ分子の何れか２つの末端が活性化される場合、そのようなＰＥＧ分子はビ活性化ＰＥＧと称する。分枝鎖ＰＥＧ分子の１末端のみが活性化される一部の場合において、そのようなＰＥＧはモノ活性化されたと称する。この方法の１例として、後に活性化されて反応に付されるリジンコアへの２つのモノメトキシＰＥＧの結合により製造された活性化ＰＥＧが記載されている（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２：２１４−２２１，２００３）。
本発明は多重ＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくはアプタマー）コンジュゲートの合成のための別の費用効果的な経路を提供する。本発明はまたＰＥＧ連結多量体オリゴヌクレオチド、例えば２量体化されたアプタマーも包含する。本発明はまたＰＥＧ安定化部分がアプタマーの異なる部分を分離するリンカーであるような、例えば高分子量アプタマー組成物の直鎖上の配置が例えば核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）ｎ（式中ｎは１以上）であるように、単一のアプタマー配列内にＰＥＧがコンジュゲートしているような高分子量組成物に関する。
本発明の高分子量組成物は少なくとも１０ｋＤの分子量を有するものを包含する。組成物は典型的には１０〜８０ｋＤの分子量の大きさを有する。本発明の高分子量組成物は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０又は８０ｋＤの大きさである。
安定化部分は分子であるか、分子の部分であり、これは本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態および薬力学の特性を向上させる。一部の場合においては、安定化部分は２個以上のアプタマー又はアプタマードメインを近接させるか、又は本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転の自由度を低減するような分子又は分子の一部である。安定化部分はポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールであることができ、これは直鎖又は分枝鎖の単独重合体又はヘテロ重合体であることができる。他の安定化部分はペプチド核酸（ＰＮＡ）のような重合体を包含する。オリゴヌクレオチドはまた安定化部分であることもでき；このようなオリゴヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド及び／又は修飾された結合、例えばホスホロチオエートを包含できる。安定化部分はアプタマー組成物の一体化部分であることができ、即ちアプタマーに共有結合している。
本発明の組成物は核酸部分２つ以上がポリアルキレングリコール部分の少なくとも１つに共有結合的にコンジュゲートしている高分子量アプタマー組成物を包含する。ポリアルキレングリコール部分は安定化部分として作用する。ポリアルキレングリコールが１分子内で核酸部分と合体するようにアプタマーに何れかの末端においてポリアルキレングリコール部分が共有結合している組成物においては、ポリアルキレングリコールは連結部分ということができる。このような組成物において、共有結合分子の基本的構造は直鎖上に配置した核酸−ＰＡＧ−核酸を包含する。１例としては基本的構造である核酸−ＰＥＧ−核酸を有する組成物である。別の例は直鎖上配置：核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸である。
核酸−ＰＥＧ−核酸コンジュゲートを製造するためには核酸を予めそれが単一の反応部位を担持するように合成する（例えばモノ活性化する）。好ましい実施形態においてはこの反応部位はオリゴヌクレオチドの固相合成の最終工程として修飾されたホスホアミダイトの付加により５’末端に導入されたアミノ酸基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護及び精製の後、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小限にする溶液中で高濃度に再調整される。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再調整溶液は２００ｍＭＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．３を含有する。コンジュゲートの合成は高度に精製された２官能性のＰＥＧの緩徐な段階的添加により開始する。好ましい実施形態においては、ＰＥＧジオールはスクシンイミジルプロピオネートによる誘導体化により両端で活性化する（ビ活性化）。反応後、ＰＥＧ−核酸コンジュゲートはゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーにより精製することにより、完全、部分的又は未コンジュゲートの物質種を分離する。連結された複数のＰＡＧ分子（例えばランダム又はブロック共重合体）又はより小型のＰＡＧ鎖を連結して種々の長さ（又は分子量）を得てよい。非ＰＡＧリンカーを種々の長さのＰＡＧ鎖の間に使用できる。
２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ及び他の修飾されたヌクレオチドの修飾はヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化させ、そして、そのインビボの半減期を増大させる。３’−３’−ｄＴキャップもまたエキソヌクレアーゼ耐性を増大させる。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，６７４，６８５；５，６６８，２６４；６，２０７，８１６；および６，２２９，００２を参照できる。
（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧコンジュゲートは１つより多い反応部位を含有する核酸との１官能性の活性化ＰＥＧの反応により製造できる。１つの実施形態において、核酸は二反応性、又は二活性化され、そして、図６に示すような３’−５’−ジ−ＰＥＧ化のような従来のホスホアミダイト合成を介してオリゴヌクレオチドに導入された２つの反応性部位、即ち、５’−アミノ基および３’−アミノ基を含有する。別の実施形態において、反応性部位は、第１アミンの結合のための部位として例えばピリミジンの５位、プリンの８位、又はリボースの２’位を用いて内部の位置に導入することができる。このような実施形態においては、核酸は数個の活性化又は反応性の部位を有することができ、そして多重活性化されるといえる。合成及び精製の後、自発的加水分解を最小限にしつつオリゴヌクレオチドの反応性の部位との選択的反応を促進するような条件下にモノ活性化ＰＥＧに修飾されたオリゴヌクレオチドを混合する。好ましい実施形態においては、モノメトキシ−ＰＥＧをスクシンイミジルプロピオネートで活性化し、カップリング反応はｐＨ８．３で実施する。ビ置換ＰＥＧの合成を行うためには、オリゴヌクレオチドに対して化学量論的に過剰量のＰＥＧを使用する。反応後、ＰＥＧ−核酸コンジュゲートをゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーで精製し、完全、部分及び未コンジュゲートの物質種を分離する。
連結ドメインはまたそれに結合したポリアルキレングリコール部分１つ以上を有することができる。このようなＰＡＧは種々の長さを有し、そして組成物の所望の分子量を達成するために適切な組み合わせにおいて使用してよい。
特定のリンカーの作用はその化学組成及び長さの両方により影響を受ける。長すぎる、短すぎる又は標的に対して望ましくない立体及び／又はイオン相互作用を起こすリンカーはアプタマーと標的の間の複合体の形成からは除外される。核酸間の距離に行き渡るために必要な分より長いリンカーはリガンドの有効な集中を損なうことにより結合の安定性を低下させる。即ち、標的へのアプタマーの親和性を最大限にするためにはリンカーの組成及び長さを至適化する必要がある場合が多い。
本明細書において引用した全ての公開物及び特許文書は、そのような公開物及び文書が特別に、そして個々に、参照により本明細書に組み込まれる用に記載されているが如く、参照により本明細書に組み込まれる。公開物及び特許文書の引用は何れも関連する従来技術であることの受諾として意図されるものではなく、また、それらの内容及び日付に関して如何なる受諾を構成するものでもない。本発明は書面により記載したが、当業者の知るとおり、本発明は種々の実施形態において実施でき、そして上記した説明及び後述する実施例は説明を目的としており、添付する請求項を限定するものではない。
（実施例１：古典的代替補体経路における抗Ｃ５アプタマー活性）
（実施例１Ａ：溶血試験）
ＣＨ５０試験は抗体コーティングヒツジ赤血球の標準化懸濁液中の細胞の５０％を溶解する血清被験試料中の補体系の能力を測定する。種々の抗Ｃ５アプタマーの存在下及び非存在下で０．２％ヒト血清の溶液を抗体コーティングヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ ＥＺ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ＣＨ５０ Ｋｉｔ，Ｄｉａｍｅｄｉｘ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）と混合した。試験はカルシウム、マグネシウム及び１％ゼラチン（ＧＶＢ＋＋補体緩衝液）を含有するベロナール緩衝食塩水中キットのプロトコルに従って実施し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離し、未損傷の赤血球を沈殿させた。上澄みの４１２ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４１２）を読み取ることにより溶血の程度と比例する可溶性ヘモグロビンの放出を定量した（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６８３−９５）。アプタマーがＣ５活性化をブロックしたことを確認するために、一部の溶血上澄みをＥＬＩＳＡによりＣ５ａ及びＣ５ｂ−９の存在について分析した（Ｃ５ｂ−９ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｃ５ａＥＬＩＳＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
非ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６）（配列番号４）の反応混合物への添加により図７Ａのグラフに示す通り用量依存的に溶血を抑制し、ＩＣ５０は０．５±０．１ｎＭ（図７Ｂ参照）であり、ニトロセルロース濾過により測定したＫＤと合致する値であった。極めて高値のアプタマー濃度（＞１０ｎＭ）においては、溶血の程度は本質的にバックグラウンド（血清無添加）と識別不能であり、ＡＲＣ１８６（配列番号４）が補体活性を完全にブロックできたことが示された。２０ｋＤａ（ＡＲＣ６５７；配列番号６１）、３０ｋＤａ（ＡＲＣ６５８；配列番号６２）、分枝鎖４０ｋＤａ（１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）（ＡＲＣ１８７；配列番号５）、分枝鎖４０ｋＤａ（２，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−１−カルバモイル）（ＡＲＣ１９０５；配列番号６７）、直鎖４０ｋＤａ（ＡＲＣ１５３７；配列番号６５）及び直鎖２×２０ｋＤａ（ＡＲＣ１７３０；配列番号６６）のＰＥＧ基とのＡＲＣ１８６（配列番号４）のコンジュゲート形成はアプタマー抑制活性にほとんど影響しなかった（図７Ａ〜図７Ｄ）。最終的に、溶血上澄みのＥＬＩＳＡ分析はこの機能的抑制がＣ５ａ放出の遮断と相関していたことを示していた。即ち、溶血データはＡＲＣ１８６（配列番号４）及びそのＰＥＧ化コンジュゲートがＣ５のコンバターゼ触媒活性化をブロックすることにより機能する高度に強力な補体抑制剤であることを示している。
非ＰＥＧ化物質を用いた溶血試験では抗Ｃ５アプタマーがラット、モルモット、イヌ及びブタを含む多くの非霊長類動物種由来のＣ５とは交差反応しないことを示していた。しかしながら顕著な抑制活性はマカクカニクイザル、マカクアカゲザル及びチンパンジー由来の血清を包含する霊長類血清のスクリーンにおいて観察された。抗Ｃ５アプタマーのインビトロの薬効はＡＲＣ１８６（配列番号４）の３０ｋＤａ−ＰＥＧ類縁体であるＡＲＣ６５８（配列番号６２）を用いてカニクイザルの血清において更に調べた。併置して比較した場合（ｎ＝３）、ＡＲＣ６５８は０．２１±０．０ｎＭのＩＣ５０でヒト補体活性を、そして、１．７±０．４ｎＭのＩＣ５０でカニクイザル補体活性を抑制した（図８）。即ち、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）はこの測定ではヒトと比較してカニクイザルの血清中で８±３倍低値の力価であった。
ニトロセルロースフィルター結合試験。γ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と共にインキュベートすることにより５’末端において個々のアプタマーを３２Ｐ標識した。放射標識アプタマーはゲル濾過とその後のポリアクリルアミドゲル電気泳動により遊離のＡＴＰから単離精製した。抗Ｃ５アプタマー親和性を測定するために、放射標識アプタマー（≦１０ｐＭ）を漸増濃度（０．０５〜１００ｎＭ）の精製Ｃ５蛋白（Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に１ｍＭＭｇＣｌ２含有リン酸塩緩衝食塩水中、室温（２３℃）及び３７℃で、１５分及び４時間の時間間隔でインキュベートした。結合反応はＭｉｎｉｆｏｌｄ Ｉドットブロット、９６穴真空濾過マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を用いてニトロセルロース濾過により分析した。（上から下に）Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐナイロン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＧＢ００２ゲルブロット紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）よりなる３層の濾過媒体を使用した。核酸よりも蛋白に選択的に結合するニトロセルロース層は蛋白リガンドとの複合体において抗Ｃ５アプタマーを優先的に保持していたが、非複合体化抗Ｃ５アプタマーはニトロセルロースを通過し、ナイロンに付着していた。ゲルブロット紙は単に他のフィルターの支持媒体として使用した。濾過後、フィルター層を分離し、乾燥し、りん光スクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に曝露し、Ｓｔｏｒｍ ８６０ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）ブロット画像化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量した。
図９及び図１０に示す通り、漸増Ｃ５濃度はニトロセルロース膜上に捕獲されたＡＲＣ１８６の比率を増大させた。漸増Ｃ５濃度に対する結合ＡＲＣ１８６の依存性は単一部位結合モデルにより十分説明される（Ｃ５＋ＡＲＣ１８６⇔Ｃ５・ＡＲＣ１８６；％結合＝Ｃｍａｘ／（１＋ＫＤ／［Ｃ５］）；Ｃｍａｘは飽和時の最大％結合［Ｃ５］；ＫＤは解離定数）。１５分または４時間のインキュベートの何れかの後の２温度におけるＡＲＣ１８６結合曲線を図９及び１０に示す。１５分インキュベートした後、２３及び３７℃のＡＲＣ１８６結合曲線は本質的に誤差範囲で差がなくなり、０．５〜０．６ｎＭのＫＤ値となった（図９）。２３と３７℃の結合曲線の差はインキュベーション時間が延長するに従ってより顕著となった。４時間インキュベートした後（図１０）、２３℃で観察されたＫＤ値は０．０８±０．０１ｎＭであり、３７℃で観察されたＫＤ値は不変であった（０．６±０．１ｎＭ）。
室温における長いインキュベーション時間の必要性の根拠を調べるために、この温度における親和性を速度論的方法を用いて更に検討した。Ｃ５・ＡＲＣ１８６の解離を示す逆反応の速度はｖｒｅｖ＝ｋ−１［Ｃ５・ＡＲＣ１８６］であり、式中、ｖｒｅｖは速度（Ｍｍｉｎ−１単位）でありｋ−１は一次解離速度定数（ｍｉｎ−１単位）である。Ｃ５・ＡＲＣ１８６複合体の形成を示す正方向の反応の速度はｖｆｏｒ＝ｋ１［Ｃ５］［ＡＲＣ１８６］であり、式中、ｖｆｏｒは速度（Ｍｍｉｎ−１単位）でありｋ１は二次会合速度定数（Ｍ−１ｍｉｎ−１単位）である。データは擬一次推定を用いて分析し、１つの反応体（この場合はＣ５）の濃度を他方より大過剰に保持し（［Ｃ５］＞＞［ＡＲＣ１８６］）、そしてこれは反応の過程全体にわたり本質的に不変とする。このような条件下、正方向の反応は一次過程の速度式、ｖｆｏｒ＝ｋ１’［ＡＲＣ１８６］で表され、式中、ｋ１’＝ｋ１［Ｃ５］である。
Ｃ５・ＡＲＣ１８６の解離を分析するために、放射標識ＡＲＣ（≦１０ｐＭ）を室温（２３℃）において１ｍＭＭｇＣｌ２を含有するリン酸塩緩衝食塩水中５ｎＭＣ５蛋白とあらかじめ平衡化させた。解離反応は遊離のＣ５に対するトラップとして作用する非標識ＡＲＣ１８６（１μＭ）を添加することにより開始し、結合及び遊離の放射標識ＡＲＣ１８６のニトロセルロース濾過分画により停止した。ＡＲＣ１８６の解離の経時変化は解離反応開始と濾過の間の時間を変化させることにより得た。ニトロセルロースフィルター上に捕獲された放射標識ＡＲＣ１８６のパーセントの低下（Ｃ５に結合したパーセントに等しい）として観察される解離の経時変化は単一指数減衰により適切に説明され、ここで％結合ＡＲＣ１８６＝１００×ｅ−ｋ−１ｔとなる（図１１参照）。解離速度定数ｋ−１の値はこの方法で求めれば０．０１３±０．０２ｍｉｎ−１となり、５２±８ｍｉｎの半減期（ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ−１）に相当する。
会合反応を分析するために、Ｃ５・ＡＲＣ１８６の形成に関する平衡速度定数（ｋｅｑ）を種々の濃度のＣ５蛋白（１〜５ｎＭ）の存在下に測定した。複合体の形成は室温（２３℃）において１ｍＭＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ中Ｃ５蛋白と放射標識ＡＲＣ１８６を混合することにより開始し、ニトロセルロース濾過分画により停止した。解離反応に関して記載した通り、反応開始と濾過の間の時間を変化させることにより複合体形成の経時変化を求めた。ニトロセルロースフィルター上に捕獲される放射標識ＡＲＣ１８６のパーセントの増大として観察される平衡の経時変化は単一指数減衰により適切に説明され、ここで％結合ＡＲＣ１８６＝１００×（１−ｅ−ｋ１ｔ）となる。１、２および４ｎＭのＣ５に対する平衡の経時変化は図１２に示す通りである。予測された通り、ｋｅｑの値は［Ｃ５］とともに直線的に増大する（ｋｅｑ（１ｎＭ）＝０．１９±０．０２ｍｉｎ−１；ｋｅｑ（２ｎＭ）＝０．３９±０．０３ｍｉｎ−１；ｋｅｑ（３ｎＭ）＝０．５９±０．０５ｍｉｎ−１；ｋｅｑ（４ｎＭ）＝０．７７±０．０６ｍｉｎ−１；ｋｅｑ（５ｎＭ）＝０．８８±０．０６ｍｉｎ−１）。実験条件下においては、ｋｅｑ、ｋ１およびｋ−１の間の関係はｋｅｑ＝ｋ１［Ｃ５］＋ｋ−１となった。即ち、ｋ１の推定値はｋｅｑｖｓ［Ｃ５］の傾きから誘導され（図１２の一部参照）、この場合０．１８±０．０１ｎＭ−１ｍｉｎ−１である。
これ等のデータは低Ｃ５濃度（例えば０．１ｎＭ）下においてはＣ５と放射標識ＡＲＣ１８６の混合物が平衡に達するためには延長されたインキュベーションが必要であることを示している。これ等の条件下では、ｋｅｑ＝（０．１８±０．０１ｎＭ−１ｍｉｎ−１）（０．１ｎＭ）＋０．０１３ｍｉｎ−１＝０．０３ｍｉｎ−１となり、２２分の半減期に相当する。即ち、室温インキュベーション約２時間（〜５半減期）が完全（＞９５％）平衡のためには必要である。１５分（ＫＤ＝０．５ｎＭ）ｖｓ４時間（ＫＤ＝０．０８ｎＭ）インキュベーションで観察された親和性の相違により上記において示された通り、短いインキュベート時間（例えば１５分）は複合体の実際の親和性を顕著に過小評価している。室温ＫＤの別の推定値は関係式ＫＤ＝ｋ−１／ｋ１に従った速度論的データから計算できる。この場合、計算されたＫＤは０．０７±０．０１ｎＭであり、これは熱力学的な方法により上記測定されたＫＤと完全に合致している。
ＡＲＣ１８６（配列番号４）のＣ５に対する特異性はまた、補体カスケードにおけるＣ５から上流及び下流の両方の補体成分との比較によるニトロセルロース濾過試験において評価した。結果は図１３に示す通りである。アプタマーは、可溶性のＣ５ｂ−９には弱い親和性（ＫＤ＞０．２μＭ）を示すが、本質的にはＣ５ａを認識せず（ＫＤ＞＞３μＭ）、その原因は恐らくはＣ５ｂ成分との相互作用である。他の補体成分はアプタマーに対して中等度〜低い親和性を示す。非活性化Ｃ３は本質的にはアプタマーに結合しないが、Ｈ因子（ＫＤ〜１００ｎμＭ）、及び、かなり低値ではあるがＣ１ｑ（ＫＤ＞０．３μＭ）は結合する。総括すれば、データは、ＡＲＣ１８６（配列番号４）がＣ５ｂドメインの認識を主に介してヒトＣ５に高親和性で結合することを示している。
ＰＥＧ修飾アプタマーは標的蛋白の非存在下でもなおニトロセルロースに接着するこれ等のアプタマーの傾向のため、ニトロセルロース濾過試験により容易に評価することはできない。しかしながら、これ等のアプタマーの相対的親和性は標的への結合に関して放射標識非ＰＥＧ化アプタマー（≦１０ｐＭ）と競合するその相当する能力から評価できる。冷（即ち非放射標識）競合物質の濃度が増大するに従い、標的蛋白に結合した放射標識アプタマーのパーセントは低下する。図１４に示す通り、冷ＡＲＣ１８６（配列番号４）またはＰＥＧ化アプタマー（ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）およびＡＲＣ１８７（配列番号５））の漸増濃度（０．０５〜１０００ｎＭ）は２ｎＭＣ５蛋白の存在下の結合に関して、放射標識ＡＲＣ１８６（配列番号４）と容易に競合する。更にまた、全４種のアプタマーの滴定曲線はほぼ重複しており、ＰＥＧコンジュゲート形成はＣ５についてはアプタマーの親和性に殆ど、又は全く影響しないことを示している。
（実施例１Ｂ：全血試験）
補体系の代替経路に対する抗Ｃ５アプタマーの作用を以下に記載する全血試験を用いて分析した。抗凝固剤の非存在下において、血液を正常ヒトボランティアから採取した。血液の小分量（抗凝固剤非含有）を漸増濃度のＡＲＣ１８６（配列番号４）と共に５時間室温又は３７℃でインキュベートした。試料を遠心分離して血清を単離し、そして血清中のＣ５ｂの存在をｓＣ５ｂ−９ＥＬＩＳＡ（Ｃ５ｂ−９ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により検出した。図１５に示す通り、抗補体活性は、Ｃ５ｂ−９の生産において反映される通り、異なる温度でインキュベートした試料の間では３μＭにおいて異なっていた。室温データは定量的抑制のために必要なアプタマーの濃度が３〜６μＭの範囲であったことを示していたのに対し、Ｃ５の報告された濃度は約４００ｎＭであった。これ等の結果は、抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６；配列番号４）の１０倍モル過剰量を超過する量がＣ５活性の完全な抑制のためには必要であることを示唆している。
（実施例１Ｃ：チモサンによる補体活性化）
チモサンはコウボ細胞壁の多糖類成分であり、そして、代替補体カスケードの強力な活性化剤である。血液、血漿又は血清のエクスビボの試料にチモサンを添加すると、Ｃ５ａ及び可溶性型Ｃ５ｂ−９（ｓＣ５ｂ−９）を包含する補体活性化産物の蓄積が起こる。未希釈ヒト血清（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、クエン酸添加ヒト全血（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）又はカニクイザル血清（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の試料を漸増濃度のＡＲＣ６５３（配列番号６２）、即ちＡＲＣ１８６（配列番号４）の３０ＫＰＥＧ類縁体でスパイクした。補体を活性化するために、１０倍懸濁液のチモサン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を試料に最終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。３７℃で１５分インキュベートした後、チモサン粒子を遠心分離により除去し、補体活性化の程度をＣ５ａ及び／又はｓＣ５ｂ−９（Ｃ５ｂ−９ＥＬＩＳＡキット、Ｏｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｃ５ａＥＬＩＳＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により測定した。
アプタマーの非存在下においては、チモサン投与は血清又は全血のＣ５の〜５０％を活性化したのに対し、未投与試料では〜１％の活性化であった。５０ｎＭまでの抗Ｃ５アプタマーの添加（血中Ｃ５濃度〜１０％）はｓＣ５ｂ−９形成に対しては殆ど影響しなかった。しかしながら、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）の漸増濃度でＣ５を更に滴定したところ、図１６に示す通り用量依存的な態様でＣ５活性化を抑制した。ヒト血清又は全血において、定量的（〜９９％）抑制が０．８〜１μＭのＡＲＣ６５８（配列番号６２）で観察され、Ｃ５へのアプタマーの〜２モル等量に相当した。カニクイザルの血清において同様の抑制を達成するためにはより高濃度のアプタマーが必要であった。この場合、１０μＭアプタマー又はＣ５に対してアプタマー〜２０モル等量の存在下においてのみ９９％抑制が達成された。
（実施例１Ｄ：補体活性化のチュービングループモデル）
心肺バイパス回路において観察されるような外来性物質への曝露により誘導された補体活性化を抗Ｃ５アプタマーがブロックする能力を試験するために、本発明者等はＮｉｌｓｓｏｎ等により記載されたチュービングループモデルを使用した（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，２２２−９；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２，１６６１−７）。ＴｙｇｏｎＳ−５０−ＨＬ医療用／手術用チュービング（１／４”内径）を約３００ｍｍ（約９ｍｌ容量）の長さに切断し、０．４単位／ｍＬヘパリン（Ｃｅｌｓｕｓ）及び種々の濃度のＡＲＣ６５８（配列番号６２）（０〜５μＭ）を含有するヒトドナー血液５ｍｌを充填した。Ｇｏｎｇ等の記載の通り、Ｔｙｇｏｎチュービングの各長さを１本のシリコーンチュービングのループ内に入れ込んだ。チュービングループを３７℃の水浴中約３０ｒｐｍで１時間回転させた。次にループの内容物をＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）の入ったポリプロピレン三角チューブに注ぎ込み、補体活性化をクエンチングした。貧血小板血漿を遠心分離により単離し、Ｃ５ａ及びＣ３ａに関してＥＬＩＳＡ（Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；Ｃ５ａＥＬＩＳＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により分析した。
アプタマー非存在下の総補体活性化はチモサン試験と比較して低値であった。典型的にはＣ５ａ濃度は１時間のインキュベート後に約６ｎｇ／ｍｌ上昇し、使用可能なＣ５の＜１％の活性化に相当した。しかしなお、この上昇は再現性があり、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）による滴定により抑制された。図１７に示す通り３００〜４００ｎＭのＡＲＣ６５８（配列番号６２）はＣ５活性化の９９％抑制を達成するのに十分であり、血中のＣ５のモル濃度とほぼ同等か僅かに低値の水準であった。如何なる理論にも制約されないが、チモサンモデルと比較してこのモデルのほうがＣ５活性化の９９％抑制を達成するためにより少量のアプタマーが必要であるが、この観察結果は２つの試験で用いられる補体活性化の刺激の実質的相違を反映していると考えられる。Ｃ３ａの形成もまた対照としてモニタリングすることにより、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）が補体カスケード中のＣ５よりも早期に活性化工程をブロックしなかったことを確認した。Ｃ３ａ濃度は１時間のインキュベート後に約４０００ｎｇ／ｍＬ上昇し、使用可能なＣ３の約１０％の活性化に相当した。Ｃ５ａとは対照的に、Ｃ３ａ形成の用量依存性抑制はＡＲＣ６５８（配列番号６２）による滴定では殆ど観察されず、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）が特異的にＣ５切断をブロックすることを示していた。
（実施例２：新規の選択及び配列）
（ｄＲｍＹプールによるＣ５選択）
２種の選択を実施することによりヒト完全長Ｃ５蛋白に対するｄＲｍＹアプタマーを発見した。Ｃ５蛋白（Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ又はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を完全長（ＦＬ）及び部分トリプシン化（ＴＰ）の形態で使用し、両方の選択は疎水性プレートに固定化されている蛋白標的に対する直接選択とした。両方の選択によりナイーブの非選択プールと比較して完全長Ｃ５結合について顕著にリッチ化されているプールが得られる。この実施例に示す全配列は５’から３’側に示す。
プールの調製：以下の配列：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮ（３０）ＧＧＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ（ＡＲＣ５２０；配列番号７０）を有するＤＮＡ鋳型をＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（商標）ＤＮＡ合成装置を用いて合成し、標準的方法により脱保護した。鋳型は、以下の５’プライマー ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ（配列番号７１）および３’プライマー ＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＣ（配列番号７２）で増幅し、次にＹ６３９Ｆ単一突然変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写のための鋳型として使用した。転写は２００ｍＭＨＥＰＥＳ、４０ｍＭＤＤＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ 、１０％ＰＥＧ−８０００，９．５ｍＭＭｇＣｌ２、２．９ｍＭＭｎＣｌ２、２．０ｍＭＮＴＰ、２ｍＭＧＭＰ、２ｍＭスペルミン、０．０１単位／μｌ無機ピロホスファターゼ及びＹ６３９Ｆ単一突然変異体Ｔ７ポリメラーゼを用いて実施した。
選択：ラウンド１において、正の選択工程をニトロセルロースフィルター結合カラム上で実施した。要約すれば、１×１０１５分子（０．５ナノモル）のプールＲＮＡを１００μＬの結合緩衝液（１×ＤＰＢＳ）中、３ｕＭの完全長Ｃ５又は２．６ｕＭの部分トリプシン化Ｃ５と共に１時間室温でインキュベートした。ＲＮＡ：蛋白複合体及び遊離のＲＮＡ分子をＳｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）から入手した０．４５ｕｍのニトロセルローススピンカラムを用いて分離した。カラムは１ｍＬの１×ＤＰＢＳで予備洗浄し、次にＲＮＡ：蛋白含有溶液をカラムに添加し、２分間１５００ｇで遠心分離機により回転させた。１ｍｌの３回緩衝液洗浄を実施することによりフィルターから非特異的結合物を除去し、次にフィルターに結合したＲＮＡ：蛋白複合体を溶離緩衝液（７Ｍ尿素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、３ｍＭＥＤＴＡ、予備加熱９５℃）２００μｌ洗浄２回により溶出させた。溶出したＲＮＡを沈殿させた（２μＬグリコーゲン、１容量のイソプロパノール、１／２容量のエタノール）。ＲＮＡを上記した３’プライマー（配列番号７２）を用いながら製造元の説明に従ってＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で逆転写し、その後ＰＣＲ増幅した（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、５０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｕＭプライマー配列番号７１及び配列番号７２、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））。ＰＣＲ鋳型はＣｅｎｔｒｉｃｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を用いて精製し、次のラウンドのプールを転写するために使用した。
選択のその後のラウンドにおいては、結合及び遊離のＲＮＡの分離をＮｕｎｃ Ｍａｘｓｏｒｐ疎水性プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて実施した。ラウンドは完全長Ｃ５及び部分トリプシン化Ｃ５の両方の２０ピコモルを１００μＬの１×ＤＰＢＳ中室温で１時間プレート表面に固定化することにより開始した。次に上澄みを除去し、ウェルを１２０μＬの洗浄緩衝液（１×ＤＰＢＳ）で４回洗浄した。次に蛋白ウェルを０．１ｍｇ／ｍｌコウボｔＲＮＡ及び０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを競合物質として含有する１×ＤＰＢＳでブロックした。使用したプールの濃度は常時蛋白濃度の少なくとも５倍過剰とした。プールＲＮＡはまた空のウェル中室温で１時間インキュベートすることにより存在するプラスチック結合配列を除去し、次に蛋白を含まないブロックされたウェル中でインキュベートすることにより正の選択工程の前にプールから如何なる競合物質結合配列も除去されるようにした。次にプールＲＮＡを室温で１時間インキュベートし、そして固定化されたＣ５に結合したＲＮＡをＲＴミックス（３’プライマー、配列番号７２、及び、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、その後１時間６５℃でインキュベートすることにより選択プレート中直接逆転写した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。増幅されたプール鋳型ＤＮＡを製造元の推奨する条件に従ってＣｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）で脱塩し、選択の次のラウンドのためのプールＲＮＡの転写をプログラムするために使用した。転写されたプールは各ラウンドごとに１０％ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。
選択の進行はサンドイッチフィルター結合（ドットブロット）試験によりモニタリングした。５’−３２Ｐ標識プールＲＮＡ（痕跡濃度）をＣ５、１×ＤＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌｔＲＮＡ及び０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと共に室温で３０分間インキュベートし、次にドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）中のニトロセルロース及びナイロンフィルターサンドイッチに適用した。ニトロセルロースに結合したプールＲＮＡのパーセンテージは、１点スクリーン（＋／−３００ｎＭＣ５）を用いて概ね各３ラウンド毎に計算してモニタリングした。プールＫｄ測定値は上記した蛋白滴定及びドットブロット装置を用いて測定した。
選択データ：両方の選択はナイーブのプールと比較して１０ラウンド後にリッチ化された。図１８を参照できる。ラウンド１０において、プールＫｄは完全長で概ね１１５ｎＭおよびトリプシン化選択で１５０ｎＭとなったが、結合の程度は両方において定常状態でわずか約１０％であった。Ｒ１０プールはＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングし、配列決定した。
配列情報：各プールから４５クローンを配列決定した。Ｒ１０完全長プールは単一のクローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）により優先的に占められており、これはプールの２４％までを構成しており、２セットの二重及び単一の配列が残余を構成していた。Ｒ１０トリプシン化プールは同じ配列ＡＲＣ９１３（配列番号７５）の８コピーを含有していたが、プールは別の配列（ＡＭＸ２２１．Ａ７；４６％）により優先的に占められていた。クローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）は約１４０ｎＭのＫｄを有しており、結合の程度は２０％にいたった。図１９を参照できる。
表５に列挙した個々の配列は５’から３’の方向に列挙しており、与えられたｄＲｍＹＳＥＬＥＸ（商標）条件下に選択されたアプタマーのリボヌクレオチド配列を示す。この選択から誘導された（及び配列表に反映されている通りの）本発明の実施形態において、プリン（Ａ及びＧ）はデオキシであり、そしてピリミジン（Ｕ及びＣ）は２’−ＯＭｅである。表５に列挙した配列はキャッピングを含んでいてもいなくてもよい（例えば３’−逆方向ｄＴ）。以下に示すアプタマーの独特の配列は以下の固定配列：
ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号７３）の直後のヌクレオチド２３で開始し、そしてそれが以下の３’固定核酸配列：ＧＧＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号７４）に出会うまで進行する。
Figure 0005242918
 溶血試験：補体系の古典的経路に対するＡＲＣ９１３（配列番号７５）の作用を前記した溶血試験を用いて分析し、ＡＲＣ１８６（配列番号４）（抗Ｃ５アプタマー、陽性対照）及び非選択のｄＲｍＹプール（陰性対照）と比較した。溶血抑制の試験において、０．２％全ヒト血清の溶液を、滴定されたＡＲＣ９１３（配列番号７５）の存在下、抗体コーティングヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘ ＥＺ Ｃｉｍｐｌｅｍｅｎｔ ＣＨ５０ Ｔｅｓｔ，Ｄｉａｍｅｄｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）と混合した。試験はカルシウム、マグネシウム及び１％ゼラチン（ＧＶＢ＋＋補体緩衝液）を含有するベロナール緩衝食塩水中で実施し、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離した。上澄みの４１５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ４１５）を読み取った。溶血活性の抑制は対照と比較した場合の％溶血活性として表示する。図２０を参照できる。アプタマーのＩＣ５０は約３０ｎＭと計算された。
（実施例３：組成及び配列の至適化）
（実施例３Ａ：ＡＲＣ９１３の最小限化）
ＡＲＣ９１３（配列番号７５）系の６種のコンストラクトを転写し、ゲル精製し、そしてＣ５への結合に関するドットブロットにおいて試験した。ＡＲＣ９５４は１３０ｎＭのＫｄ及び２０％の結合程度を有する親クローンと同様であるのに対し、ＡＲＣ８７４（配列番号７６）は１ｕＭのＫｄを有するＣ５に結合した唯一の別のクローンであった。
表６に列挙する個々の配列は５’から３’の方向に列挙しており、与えられたｄＲｍＹＳＥＬＥＸ条件下に選択されたアプタマーから誘導した。この選択から誘導された（及び配列表に反映されている通りの）本発明の実施形態において、プリン（Ａ及びＧ）はデオキシであり、そしてピリミジン（Ｕ及びＣ）は２’−ＯＭｅである。表６に列挙した配列はキャッピングを含んでいてもいなくてもよい（例えば３’−逆方向ｄＴ）。
Figure 0005242918
 （実施例３Ｂ：ＡＲＣ９１３の至適化：ドープ処理された再選択）
Ｃ５結合親和性についてクローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）を至適化すること、及び、キー結合エレメントを求めることの両方のために、ドープ処理された再選択を実施した。ドープ処理された再選択を用いて活性クローン又はミニマー内の配列の基準を調べる。選択は単一の配列に基づいて設計されている合成縮重プールを用いて実施する。縮重度は通常は７０％〜８５％野生型ヌクレオチドの範囲である。一般的に天然の突然変異が観察されるが、場合により配列の変化が親和性の向上をもたらす場合もある。次に複合的配列情報を用いて最小結合モチーフを発見し、至適化作業に役立てる。
プールの調製：鋳型配列ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣＮ（３０）ＧＴＴＡＣＧＡＣＴＡＧＣＡＴＣＧＡＴＧ（配列番号８２）はＡＲＣ９１３（配列番号７５）に基づいており、そして１５％水準でドープ処理したランダム領域を起源とする各残基を用いて合成され、即ち、各ランダム（「Ｎ」）位置において、残基は野生型配列ＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＴＡＣＧＣＡＧＧＧＧＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号８３）に存在するヌクレオチドである可能性８５％であり、他の３ヌクレオチドの１つである可能性１５％である。
ドープ処理再選択のための鋳型及びＲＮＡプールは本質的に上記した通り調製した。鋳型は、ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＴＣＴＡＣ（配列番号８４）及び、ＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＡＧＴＣＧＴＡＡＣ（配列番号８５）のプライマーを用いて増幅した。２選択は完全長Ｃ５を用いて行い、１選択は洗浄工程においてより高濃度の塩を用いた。選択プロトコルは以下の２つの例外、即ち１）ラウンド１は正の工程のみによる疎水性プレート（全ての後のラウンドも同様）上で実施し；そして２）選択中は競合物質は全く使用しなかったことを除き前述の通り行った。Ｃ５濃度およびＲＮＡプール濃度はそれぞれ２００ｎＭ及び１ｕＭで一定に保持した。
ドープ処理再選択データ。通常及び高値の塩の選択によりナイーブプールと比較して５ラウンド後にリッチ化された。ラウンド５において、プールのＫｄは高値の塩の選択では約１６５ｎＭであり、通常の塩の選択では１７５ｎＭであった。結合の程度は両方において平衡時に約２０％であった。Ｒ４プールはＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてクローニングし、各プールから４８クローンを配列決定した。各プールの１２クローンを転写し、５００ｎＭＣ５において１点ドットブロット試験において試験した。解離定数（Ｋｄ）を再度前述のドットブロットを用いて測定した。Ｋｄは式：結合ＲＮＡ画分＝増幅度＊Ｋｄ／（Ｋｄ＋［Ｃ５］）にデータをフィットさせることにより１点スクリーンにおいて発見された最良１１クローンについて推定した。最良３Ｋｄを有するクローンは配列番号９１（７３ｎＭ）、配列番号９６（８４ｎＭ）及び配列番号９５（９２ｎＭ）であった。これ等の１１クローンの配列を以下の表７に示す。表７に列挙した各配列は５’から３’の方向に列挙しており、与えられたｄＲｍＹＳＥＬＥＸ条件下に選択されたアプタマーのヌクレオチド配列を示す。この選択から誘導された（及び配列表に反映されている通りの）本発明の実施形態において、テキスト中に示す通り、相当する配列は残基のｄＲｍＹの組み合わせを含み、ここでプリン（Ａ及びＧ）はデオキシであり、そしてピリミジン（Ｕ及びＣ）は２’−ＯＭｅである。
表７に列挙した配列はキャッピングを含んでいてもいなくてもよい（例えば３’−逆方向ｄＴ）。以下に示すアプタマーの独特の配列は以下の５’固定配列：ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＧＵＵＣＵＡＣ（配列番号８６）の直後のヌクレオチド２３で開始し、そしてそれが以下の３’固定核酸配列：ＧＵＵＡＣＧＡＣＵＡＧＣＡＵＣＧＡＵＧ（配列番号８７）に出会うまで進行する。
Figure 0005242918
 （実施例３Ｃ：ＡＲＣ１８６の４０ｋＤａ分枝鎖ＰＥＧ修飾）
下記オリゴヌクレオチド：
Figure 0005242918
 （配列番号６３）を標準的な市販の２’−ＯＭｅＲＮＡ及び２’−ＦＲＮＡ及びＴＢＤＭＳ保護ＲＮＡホスホアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）及び逆方向デオキシチミジンＣＰＧ支持体を用いながら、推奨された製造元による操作法に従ってＥｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で合成した。末端アミン官能基は５’−アミノ−修飾物質Ｃ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）により結合した。脱保護の後、オリゴヌクレオチドをＳｕｐｅｒＱ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｈｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、エタノール沈殿させた。
アミン修飾アプタマーを種々のＰＥＧ部分に合成後コンジュゲートした。アプタマーを１．５〜３ｍＭの濃度となるように水／ＤＭＳＯ（１：１）溶液に溶解した。炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５を最終濃度１００ｍＭとなるように添加し、オリゴを等しい容量のアセトニトリルに溶解した所望のＰＥＧ試薬（例えばＡＲＣ１９０５ ４０ｋＤａＳｕｎｂｒｉｇｈｔ ＧＬ２−４００ＮＰ ｐ−ニトロフェニルカーボネートエステル［ＮＯＦ Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ］又はＡＲＣ１８７ ４０ｋＤａｍＰＥＧ２−ＮＨＳエステル［Ｎｅｋｔａｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ］）の１．７モル過剰量と一夜反応させた。得られた生成物をＳｕｐｅｒＱ５ＰＷ（３０）樹脂（Ｔｏｓｈｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ３００−Ｓ樹脂（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）上の逆相クロマトグラフィーを用いて脱塩し、そして凍結乾燥した。ＡＲＣ１８７（配列番号５）の構造は図２１に示し、ＡＲＣ１９０５（配列番号６７）は図２２に示す。
（実施例４）
（単離灌流心臓モデル）
（実施例４Ａ：ＡＲＣ１８６の原理の証明）
ヒト血漿中の補体成分Ｃ５の平均濃度は約５００ｎＭである。６％ヒト血漿へのＫｒｅｂｓ Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で灌流した単離マウス心臓の曝露により、ヒト補体カスケードが活性化され、Ｃ５からＣ５ａ及びＣ５ｂへの分解が起こる。成分Ｃ５ｂはその後「膜攻撃複合体」（「ＭＡＣ」又はＣ５ｂ−９）としても知られている補体成分Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９との複合体を形成し、これは心臓血管及び心筋細胞を損傷し、これにより心筋機能不全（亢進拡張末期圧力、不整脈）及び収縮不全をもたらす（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２，１１８３−１１９５（１９９５））。以前にヒトＣ５切断をブロックするモノクローナルの１本鎖抗体（ぺキセリツマブ又はぺキセリツマブの１本鎖ｓｃＦｖ型）がこのモデルにおいて試験され、心筋の損傷及び機能不全を抑制することがわかっている（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９５）。
このモデルを用いてＣ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８６（配列番号４）がぺキセリツマブのように単離灌流マウス心臓に対するヒトＣ５媒介補体損傷を抑制することを明らかにした。Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より購入した。要約すれば、深麻酔誘導の後、各マウス心臓を摘出し、大動脈内に挿入した閉塞針上に搭載し、これを介して心臓を持続的にＫｒｅｂｓ Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で灌流した。圧変換器（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓ，Ｂｏｓｔｉｎ，ＭＡ）を左心室に挿入し、心拍数及び心室内圧力を持続的に測定できるようにした。ベースライン測定を行った１５分の平衡期間の後、心臓はその後緩衝液及び６％ヒト血漿＋／−アプタマーの種々の濃度と共に灌流した。これ等の試験の間、そしてＥｖａｎｓ等が記載したとおり、本発明者等はＫｒｅｂｓ Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液＋６％ヒト血漿で灌流した心臓が灌流液への血漿の添加の５分以内に障害を起こしたのに対し、緩衝液のみで持続的に灌流した心臓は２時間超拍動を継続したことを明らかにした。従って、各実験の長さは任意に１５分と決定した。ＡＲＣ１８６を用いたこの試験の概略は図２３に示す通りである。
心室内圧力は継続的にモニタリングして記録することにより圧力波追跡を行った（図２４及び２５）。最低動揺点は拡張末期圧力（ＥＤＰ）を示し、最高動揺点は収縮期圧力（ＳＰ）を示す。ベースライン圧力波は各追跡において示される「０」とマークされた垂直の黒線の左に生じる。以前に報告されている通り（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９５）、６％ヒト血漿と共に灌流した心臓は左心室拡張末期圧力の急速な上昇を経験し、最終的には５分以内に収縮不全（心停止）に至った（図２４）。無関連のアプタマーを５０倍モル過剰量でヒト血漿に添加した場合、上昇したＥＤＰ及び収縮不全がやはり観察された（図２４）。
ＡＲＣ１８６をモル等量で系に添加した場合、ＥＤＰの急激な上昇が起こり、収縮不全に至った（図２５）。補体媒介損傷、上昇ＥＤＰ及び収縮不全を経験した心臓の全３群において、心臓は目視によれば浮腫を示しており、実験終了時には腫脹していた。ＡＲＣ１８６を血漿に１０倍又は５０倍（図２５）モル過剰量で添加した場合、心室圧力波は正常に維持され、収縮不全は観察されなかった。更にまた、以前に記載した浮腫及び腫脹はこれ等の群では現れなかった。
各実験の間、心拍数を５分間隔で記録し、各間隔の群の平均心拍数をグラフ化した。図２６に示す通り、アプタマーを伴うことなく、又は、非関連のアプタマーを伴って灌流した心臓は急速に、通常は５分以内に収縮不全を発症した。モル等量で系に添加したＡＲＣ１８６は収縮不全の発症を僅かに遅延させた。しかしながらこの群の心臓は最終的には障害を起こした。１０倍又は５０倍モル過剰量で血漿に添加したＡＲＣ１８６は各実験の間心拍数を温存した。
ベースラインを超える心臓重量のパーセント増大は障害心臓（アプタマー非存在又は非関連アプタマーの５０倍モル過剰）の代表的試料について計算し、ＡＲＣ１８６保護心臓（ＡＲＣ１８６の１０倍及び５０倍モル過剰）と比較した。図２７に示す通り、ＡＲＣ１８６保護心臓は対照群における障害心臓よりも有意に低値の重量増加を示した。
ＡＲＣ１８６はＣ５の切断は抑制するがＣ３は抑制しないため、Ｃ３切断産物（Ｃ３ａ）はＡＲＣ１８６により保護された単離心臓からの流出物中に存在し、Ｃ５切断産物（Ｃ５ａ又はＣ５ｂ）は存在しないはずである。ＡＲＣ１８６がヒト血漿Ｃ５の切断を抑制することを直接示すために、ヒト補体蛋白Ｃ５ａ及びＣ５ｂ（Ｃ５切断産物）及びＣ３ａ（Ｃ３切断産物）の相対量を、市販のＥＬＩＳＡキットにより種々の群からの緩衝液流出物中で測定した（Ｃ５ｂ−９ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｃ５ａおよびＣ３ａＥＬＩＳＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＡＲＣ１８６はヒト血漿Ｃ５切断、及びＣ５ａ（図２８）及びＣ５ｂ−９（図２９）の生成を用量依存的な態様で抑制した。これとは対照的に、ＡＲＣ１８６はヒトＣ３からＣ３ａおよびＣ３ｂへの分解に対して作用を有さず（図３０）、分子のＣ５特異性が更に明らかにされた。
形成後、補体Ｃ３ｂ及びＣ５ｂのフラグメントは補体活性化の部位の近接部の組織上に局所的に付着する。実験終了後、マウス心臓をＯＣＴ培地（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中に凍結し、切片化し、次にヒトＣ３ｂ（クローンＨ１１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ヒトＣ５ｂ−９（クローンａＥ１１、ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）又は対照マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）の存在について、標準的な免疫組織化学的方法を用いて染色した。試験の結果を図３１に示す。
本試験において説明した通り、補体系に対する抗Ｃ５抗体であるぺキセリツマブの作用を試験した以前に公開されている試験（Ｅｖａｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｕｎｏｌ．３２：１１８３，（１９９５））において記載されたモデルに基づき、Ｋｒｅｂｓ Ｈｅｉｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液及び６％ヘパリン添加ヒト血漿で灌流した単離マウス心臓を使用する補体成分Ｃ５媒介組織損傷のエクスビボモデルにおいて、Ｃ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８６を試験した。このモデルを用いた場合、Ｃ５ブロッキングアプタマーは（ａ）ヒト血漿中Ｃ５の切断を抑制し（Ｃ３は抑制せず）、（ｂ）マウス心臓組織上のヒトＣ５ｂの付着を抑制せず（Ｃ３は抑制せず）、そして、（ｃ）臨床的に該当する濃度（５μＭ、アプタマーｖｓＣ５で１０倍モル過剰量）でヒトＣ５ｂ−９媒介心筋機能不全を抑制したことが明らかにされた。これ等のデータはヒト補体カスケードを生理学的に該当する態様で活性化した場合、Ｃ５ブロッキングアプタマーは血漿中Ｃ５の分解を抑制し、新規の損傷及び機能不全を防止することを示している。
（実施例４Ｂ：ＰＥＧ化アプタマーの薬効）
本試験において使用した材料及び方法は上記実施例４Ａに記載したものと全く同様であった。実験設計及び結果は図３２に示す。実験の前半ではヒトヘパリン添加血漿（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｒｖａｒｄ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を補体原料として使用し、そして後半ではヘパリン添加マカクカニクイザル血漿（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を補体原料として使用した。ＰＥＧ化アプタマー（ＡＲＣ６５８；配列番号６２）を漸増モル比で系に添加した。該当する心室圧力追跡の全てを収集したが、表は拡張末期圧力（ＥＤＰ）の増大の有無、収縮不全の発生の有無、及び、心不全（上昇ＥＤＰ及び収縮不全の存在として定義）までの時間を列挙している。
ヒト血漿を用いた実験の間、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）の至適用量はモル等量（５００ｎＭ）であることがわかったが、非ヒト霊長類血漿を用いた実験の間ではＣ５ｂ媒介損傷から心臓を保護するためには５０倍モル過剰（２５μＭ）が必要であった（図３２参照）。
これ等のデータはインビトロデータにより示されるヒトｖｓ非ヒト霊長類の抗Ｃ５アプタマーの親和性の差に合致している。理論に制約されないが、実施例５に記載する本発明者等の後のマカクカニクイザルＰＫ／ＰＤ試験においては、本発明者等は更にチモサン媒介血漿中Ｃ５切断を抑制するためには３０倍モル過剰量のアプタマーが必要であることを明らかにしており、ヒトＣ５よりも低い親和性で霊長類Ｃ５にアプタマーが結合するという考えを更に裏付けている。
総括すれば、これ等の試験はＣ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８６（配列番号４）及び更に高い水準でＡＲＣ６５８（配列番号６２）がマウス単離灌流心臓モデルにおいて効果を有していることを示している。このモデルはまたマカクカニクイザル血漿中Ｃ５媒介心臓損傷（３０＋モル過剰）を抑制するためには、ヒトＣ５媒介心臓損傷（モル等量）と比較して顕著により多い量のＡＲＣ６５８（配列番号６２）を使用しなければならないことを示しており、霊長類Ｃ５に対して低値の親和性をアプタマーが有していたことを示すインビトロのデータを更に裏付けている。最後に、これ等のデータは、ＰＫ／ＰＤ試験中のインビボのＣ５ブロッキングを明らかにするためには３０倍モル過剰量を超えてマカクカニクイザルに投与しなければならないことを示している。
（実施例５：動物における抗Ｃ５アプタマーの薬剤代謝及び薬物動態）
実施例５Ａ〜５Ｇにおいて、全ての質量に基づいた濃度のデータはＰＥＧコンジュゲート形成により生じる質量とは無関係に、アプタマーのオリゴヌクレオチド部分の分子量のみを指す。
（実施例５Ａ：霊長類及びラットの血漿中のＣ５阻害剤ＡＲＣ１８６の代謝安定性）
アプタマーの非ＰＥＧ化オリゴヌクレオチド前駆体（即ちＡＲＣ１８６；配列番号４）をラット及びマカクカニクイザル血漿（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）中において試験することによりその安定性、速度動態、及び分解経路を調べた。試験は５０時間の過程に亘り、９５％プール血漿（クエン酸添加）中３７℃でインキュベートした５’末端放射標識（３２Ｐ）アプタマーを用いて実施した。選択された時点において、アプタマー含有血漿の一部を採取し、液体窒素中急速凍結し、そして−８０℃で保存した。血漿中のアプタマー及びその代謝産物の検出及び分析は液−液（フェノール−クロロホルム）抽出、ついでゲル電気泳動（１０％変性ポリアクリルアミド配列決定ゲル上）及び高解像度オートラジオグラフィーを用いて行った。
図３３はラット及びマカクカニクイザルの両方の血漿中のインキュベーション時間の関数としての完全長アプタマーの残存パーセントの片対数プロットを示す。両動物種における分解のプロファイルは本質的に１相性であり、速度定数は約ｋ〜０．００２ｈｒ−１であった。
（実施例５Ｂ：静脈内投与後のラットにおけるＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８及びＡＲＣ１８７の薬物動態）
ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態プロファイルを調べるため、及び、霊長類及びヒトにおける必要な投薬水準及び頻度を推定するために、薬物動態試験をカテーテル処置したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において実施した。アプタマーは標準的生理食塩水中に１０ｍｇ／ｍｌ（オリゴ重量）となるように注射用に製剤し、濾過滅菌（０．２μｍ）して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填した。ラット試験に対して使用した投与経路は１０ｍｇ／ｋｇの用量における尾部静脈を介した静脈内瞬時投与とした。試験方法は群当たり３匹とし、これより投与前及び４８時間の過程に亘る特定の時点において一連の採血を行った。試験設計は図３４に概説する。血液試料は外科的にインプラント処置された頸静脈カテーテルから採取し、直接ＥＤＴＡコーティングチューブに移し、反転させて混合し、血漿の処理まで氷上に置いた。
５分間５０００ｒｐｍで血液ＥＤＴＡチューブを遠心分離することにより血漿を回収して新しい標識前試験管に上澄み（血漿）を移した。血漿試料は分析時まで−８０℃で保存した。ＡＲＣ１８７の血漿試料の分析は市販の蛍光核酸検出試薬Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含有する試験ウェルに血漿の小区分を直接添加することにより均質な試験フォーマットを用いて行った。遮光して室温で短時間（５分）のインキュベートの後、試験プレートを蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により読み取った。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル中のアプタマー濃度に比例しており、試料濃度は蛍光−濃度標準曲線から蛍光値を当てはめることにより計算した（２連又は３連の曲線の平均値）。平均血漿中濃度は各群３匹から各時点において得た。血漿中濃度ｖｓ時間のデータを産業用標準薬物動態モデリングソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いたノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）に付した。推定値は以下の基本的薬物動態パラメーター、即ち、最大血漿中濃度、Ｃｍａｘ；濃度−時間曲線下面積、ＡＵＣ；終末期半減期、ｔ１／２；終末期クリアランス、Ｃｌ；及び定常状態における分布容量、Ｖｓｓについて求めた。
平均血漿中濃度ｖｓ時間のデータは図３５に示す通りであり、図３６にプロットした。濃度ｖｓ時間のデータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０を用いたノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）に付した。この分析は図３７に示す数値をもたらした。
予測された通り、４０ｋＤａアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は最長の半減期を有し、そして２０ｋＤａのアプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）が最短であった。既知血漿容量（〜４０ｍｌ／ｋｇ）に対して観察されたＶｓｓは血管外空間における蛋白及び／又は組織マトリックスに対するＡＲＣ１８７（配列番号５）の中等度の結合／封鎖を示唆していた。アプタマーの５倍モル過剰量を維持する必要があると仮定すれば、この試験の結果は所望の血漿中濃度を維持するために必要なアプタマーの投与頻度及び総量の点においてＡＲＣ１８７（配列番号５）が多大な利点をもたらすことを示唆している。
同様の組成のアプタマーを用いたげっ歯類及び霊長類における以前の試験（データ示さず）は３０ｍｇ／ｋｇまでの用量では正比例／直線性を示しており、この用量水準が非直線的な薬物動態の挙動をもたらすとは考えられない。
（実施例５Ｃ：静脈内投与後のマウスにおけるＡＲＣ１８７及びＡＲＣ１９０５の薬物動態）
ＡＲＣ１８７（配列番号５）の場合とは異なる４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧにコンジュゲートしたＡＲＣ１８６（配列番号４）オリゴヌクレオチド骨格の薬物動態プロファイルを評価するために、雌性ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡより入手）において薬物動態試験を実施した。アプタマーは標準的生理食塩水中に２．５ｍｇ／ｍｌ（オリゴ重量）となるように注射用に製剤し、濾過滅菌（０．２μｍ）して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填した。マウス試験に対して使用した投与経路は１０ｍｇ／ｋｇの用量における尾部静脈を介した静脈内瞬時投与とした。試験方法は群当たり３匹とし、これより投与前（即ち非投与対照群）及び７２時間の過程に亘る特定の時点において末端血液を採取した。試験設計は図３８Ａに概説する。
血液試料は末端心穿刺により採取し、ＥＤＴＡコーティングチューブに直接移し、反転させて混合し、血漿の処理まで氷上に置いた。５分間５０００ｒｐｍで血液ＥＤＴＡチューブを遠心分離することにより血漿を回収して新しい標識前試験管に上澄み（血漿）を移した。血漿試料は分析時まで−８０℃で保存した。ＡＲＣ１８７及び１９０５の血漿試料の分析は市販の蛍光核酸検出試薬Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含有する試験ウェルに血漿の小区分を直接添加することにより均質な試験フォーマットを用いて行った。遮光して室温で短時間（５分）のインキュベートの後、試験プレートを蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により読み取った。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル中のアプタマー濃度に比例しており、試料濃度は蛍光−濃度標準曲線から蛍光値を当てはめることにより計算した（２連又は３連の曲線の平均値）。平均血漿中濃度は各群３匹から各時点において得た。血漿中濃度ｖｓ時間のデータを産業用標準薬物動態モデリングソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いたノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）に付した。推定値は以下の基本的薬物動態パラメーター、即ち、最大血漿中濃度、Ｃｍａｘ；濃度−時間曲線下面積、ＡＵＣ；終末期半減期、ｔ１／２；終末期クリアランス、Ｃｌ；及び定常状態における分布容量、Ｖｓｓについて求めた。平均血漿中濃度ｖｓ時間のデータは図３８Ｂに示す通りである。
濃度ｖｓ時間のデータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０を用いたノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）に付した。この分析は図３８Ｃに示す数値をもたらした。予測された通り、両方の入手元の４０ｋＤａＰＥＧはマウスにおいて薬物動態の同等性を示した。
（実施例５Ｄ：静脈内瞬時投与後のマウスにおけるＣ５阻害剤ＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８及びＡＲＣ１８７の組織取り込み試験）
雌性ＣＤ−１マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より入手した。注射用のＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）の製剤は生理食塩水中５ｍｇ／ｍｌとした。投薬製剤は濾過滅菌（０．２μｍ）して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填し、２５ｍｇ／ｋｇの用量における尾部静脈を介した静脈内瞬時投与により動物に与えた。試験は４時点、即ちｔ＝投与前、３，６、１２時間の各々につき３匹の群よりなるものとした。放血の後、各動物の血管を食塩水で十分洗浄（Ｖ〜３０ｍｌ）することにより血管内に残存する血液をすべて除去した。組織（心臓、肝臓、腎臓）を採取し、計量し、次に標準的生理食塩水中５０％ｗ／ｖとなるようにホモゲナイズし、分析時まで−８０℃で保存した。
ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）についての組織の分析はハイブリダイゼーション形ＥＬＩＳＡ型試験を用いて実施した。この試験においては、ビオチニル化キャプチャープローブを３時間１２５ｎＭの結合溶液濃度において９６穴マイクロプレートのウェル中に予備固定した。プレートウェルを１×ＰＢＳで５回洗浄した。次にプレートをＴＢＳ中１×ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の１５０μｌ／ウェルでブロックした。プレートを再度洗浄し、被覆し、使用時まで４℃で保存した。別のチューブにおいて、１０分間９０℃において２００ｎＭでＦＡＭ標識（５’−フルオレセイン）試料検出プローブを含有する緩衝液中で試料をアニーリングし、次に氷上でクエンチングした。血漿／組織の濃度標準物質及び対照試料もまた試料検出プローブ溶液で予備アニーリングし、次に固定化されたビオチンキャプチャープローブを含有する試験プレートウェルにピペッティングし、２．５時間４５℃でアニーリングした。次にプレートを再度洗浄し、そして、１×ＰＢＳ中セイヨウワサビパーオキシダーゼにコンジュゲートした抗フルオレセインモノクローナル抗体（抗ＦＩＴＣＭＡｂ−ＨＲＰ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）１μｇ／ｍｌを含有する１×ＰＢＳを含有する溶液１００μｌ／ウェルを充填し、そして約１時間インキュベートした。プレートを上記した通り再度洗浄した。次に試験プレートウェルに蛍光発生ＨＲＰ基質（ＱｕａｎｔａＢｌｕ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含有する溶液１００μｌを充填し、そして遮光しながら２０〜３０分間インキュベートした。４５分インキュベートした後、停止溶液１００μｌ／ウェルを添加して蛍光沈殿生成反応をクエンチングした。プレートを即座に蛍光励起３２５ｎｍ及び発光検出４２０ｎｍで蛍光マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で読み取った。各ウェルは１０回読み取った。全３種のアプタマーとも３時点において心臓組織中で検出可能であった（図３９）。
（実施例５Ｅ：静脈内投与後のマカクカニクイザルにおけるＣ５阻害剤ＡＲＣ６５７、ＡＲＣ６５８及びＡＲＣ１８７の薬物動態及び薬力学的特徴−試験１）
注射用のＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）の製剤は生理食塩水中５ｍｇ／ｍｌとし、投薬製剤は濾過滅菌（０．２μｍ）して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填した。マカク試験に用いた投与経路は３０ｍｇ／ｋｇの用量（約５０倍モル過剰）における外科的にインプラント処置した大腿静脈カテーテルを介した静脈内瞬時投与とした。試験設計は図４０に概説する。血液試料は大腿静脈カテーテルから採取し、クエン酸ナトリウムコーティングチューブに直接移して反転により混合し、血漿分離のために遠心分離（５分間３０００ｒｐｍ）するまで氷上に置いた。血漿を２５０μｌの小区分に分注し、これを−８０℃で保存し、各試料の１小区分を上記ラットＰＫのセクションで前述した蛍光系Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（商標）試験を用いてアプタマー濃度について評価した。
一次血漿中濃度ｖｓ時間のデータは図４１において表に示す通りである。予測された通り、４０ｋＤａＰＥＧアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は最長時間に亘り血漿中に存続していたのに対し、２０ｋＤａＰＥＧアプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）は最短時間の存続であった。図４１に示したデータを検討したところ、データはツーコンパートメントモデルにより最も良好にフィットした。即ち、図４２に報告した薬物動態パラメーターの推定値は産業用標準薬物動態モデリングソフトウエアＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いたツーコンパートメント分析から誘導した。
図４２に示す通り、全てのアプタマーは同様のＣｍａｘ値、２３〜３０μＭを有しており、アプタマー用量（３０ｍｇ／ｋｇ）が５０倍モル過剰の血漿中アプタマーｖｓＣ５濃度（５０倍モル過剰、約２５μＭ）を達成するために十分であることを示している。１００００分子量の相違があるものの、ＡＲＣ６５７（２０ｋＤａＰＥＧ）（配列番号６１）およびＡＲＣ６５８（３０ｋＤａＰＥＧ）（配列番号６２）は同様の曝露（ＡＵＣ）、ｔ１／２（α）およびｔ１／２（β）の値を有していた。これとは対照的に、ＡＲＣ１８７（配列番号５）は他の分子よりも有意に高値の曝露（ＡＵＣ）値、延長されたｔ１／２（α）および僅かにより長いｔ１／２（β）を有していた。
薬物動態試験中に採取された血漿試料の別の小区分をその後インビトロで分析することにより霊長類Ｃ５ブロッキングの薬効を調べた。チモサン活性化試験を前述の通り行い、それぞれ形成された霊長類Ｃ５ｂ−９及びＣ５ａの量を求めた。データをＣ５ｂ−９濃度ｖｓ採取時間（図４３ａ）、Ｃ５ｂ−９濃度ｖｓアプタマー濃度（図４３ｂ）、Ｃ５ａ濃度ｖｓ採取時間（図４３ｃ）及びＣ５ａ濃度ｖｓアプタマー濃度（図４３ｄ）を含む数種のフォーマットでプロットした。
４０ｋＤａＰＥＧアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は最長時間霊長類Ｃ５切断（Ｃ５ｂ−９及びＣ５ａ濃度）を抑制した（図３５ａ及び３５ｃ）。Ｃ５ｂ−９及びＣ５ａデータをアプタマー濃度に対してプロットした場合、Ｃ５ブロッキングアプタマー濃度はＰＥＧ分子の大きさに関わらず３０倍モル過剰を超過しており、Ｃ５切断を完全に抑制する水準であったことを示している（図３５ｂ及び３５ｄ）。
総括すれば、マカクカニクイザルのＰＫ／ＰＤ試験で得られたデータは（ａ）予測された通り、ＰＥＧ基の大きさに関わらず、アプタマーの少なくとも３０倍モル過剰（約１５μＭ血漿中アプタマー濃度）がマカクカニクイザルにおいてインビボでＣ５切断を抑制するために必要であり、（ｂ）Ｃ５ブロッキングアプタマーはこの動物種において明らかな毒性をもたらさず、そして（ｃ）動物に比較的高濃度（５０倍モル過剰）を投与した場合、血漿中アプタマー濃度は試料採取の期間中適切な試験範囲内に十分とどまり、薬物動態パラメーターの計算を可能にすることを示している。
（実施例５Ｆ：静脈内投与後のマカクカニクイザルにおけるＣ５阻害剤ＡＲＣ６５８及びＡＲＣ１８７の薬物動態及び薬力学的特徴−試験２）
試験２は以下の例外、即ち、ａ）２化合物のみ（ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５））を評価し；ｂ）動物数を群当たり４匹に増加し；そしてｃ）１分血漿試料は除外して１４４時間の試料と交換することにより終末半減期の計算がより多くのデータ点に基づくようにしたことを除き上記試験１と同様である。これ等の２アプタマーの製剤及び投薬、採血及び血漿の単離手法は試験１において上記した方法と同一とした。試験２の設計は図４４に総括する通りである。
試験２の終了後、血漿の小区分を試験１において記載したとおり分析することによりａ）静脈内投与後の種々の時点における血漿中アプタマーの濃度、及びｂ）Ｃ５ブロッキングの薬効を調べた。
血漿中アプタマー濃度を時間の関数としてプロットし（図４５）、そしてＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）に関する主要データをそれぞれ図３９及び４０において表形式で示した。４０ｋＤａＰＥＧアプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）は最長時間血漿中に残存した。図４５を検討したところ、データはツーコンパートメントモデルにより最も良好にフィットした。即ち、図４６に報告した薬物動態パラメーターの推定値はＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いたツーコンパートメント分析から誘導した。
上記ＰＫ／ＰＤ試験１及び試験２の間に得られた薬物動態パラメーターを比較するとＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）はＡＲＣ１８７のｔ１／２（α）測定の例外を除き同様であった。理論に制約されないが、２つの試験の間でＡＲＣ１８７に関してｔ１／２（α）測定に矛盾があったことは、パイロット試験における小さいサンプルサイズが原因と考えられる。
図４６において示した通り、Ｃｍａｘ値はＡＲＣ６５８（配列番号６２）とＡＲＣ１８７（配列番号５）で同様であった。これとは対照的に、薬剤曝露（ＡＵＣ）はＡＲＣ１８７（配列番号５）を投与した動物において有意に高値であった。更にまた、ＡＣＲ１８７はＡＲＣ６５８（配列番号６２）と比較して延長したｔ１／２（α）およびｔ１／２（β）の値を有していた。これ等のデータはＰＫ／ＰＤ試験１で得られたデータとあわせるとＣ５ブロッキングアプタマーＡＲＣ１８７は所定の用量に関して最も有効なインビボのＣ５ブロッキングをもたらすと考えられる。
薬物動態試験中に採取された血漿試料の別の小区分をその後インビトロで分析することにより霊長類Ｃ５ブロッキングの薬効を調べた。チモサン活性化試験を前述の通り行い、それぞれ形成された霊長類Ｃ５ｂ−９及びＣ５ａの量を求めた。データをＣ５ｂ−９濃度ｖｓアプタマー濃度（図４７）及びＣ５ａ濃度ｖｓアプタマー濃度（図４８）としてプロットした。ＰＫ／ＰＤ試験１で前に明らかにされた通り、Ｃ５ブロッキングアプタマー濃度はＰＥＧ分子の大きさに関わらず３０倍モル過剰（血漿中Ｃ５濃度に対するアプタマー）、又は約１５μＭを超過しているはずであり、霊長類Ｃ５切断を完全に抑制する水準であったことを示している（図４１及び４２）。
図３９及び４０の表におけるデータを検討したところ、３０ｍｇ／ｋｇＩＶ瞬時投与の後、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）は約４時間１５μＭ超で残存したのに対し、ＡＣＲ１８７は約８時間１５μＭ超で残存した。即ち薬剤用量が同様であれば、４０ＫアプタマーＡＲＣ１８７は３０ＫアプタマーＡＲＣ６５８（配列番号６２）の約２倍の長時間にわたり臨床効果をもたらす。
総括すればマカクカニクイザルはインビボでＣ５変換をブロックするためには少なくとも３０倍モル過剰アプタマーｖｓ血漿中Ｃ５で投与する必要がある。これらのデータはＣ５結合アプタマーがヒトＣ５と比較して霊長類Ｃ５に対してより低値の親和性を有していたことを示唆していた以前のインビトロ（溶血）及びエクスビボ（単離灌流マウス心臓）の試験と合致している。Ｃ５ブロッキングアプタマーはＣ５濃度に対して約５０倍モル過剰のアプタマーに等しい３０ｍｇ／ｋｇ間での用量で静脈内瞬時投与物として安全に送達できることがわかった。
（実施例５Ｇ：瞬時ＩＶ投与及び注入の後のマカクカニクイザルにおけるＣ５阻害剤ＡＲＣ１８７の薬物動態及び薬力学的特徴）
ＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）のプロファイルはまた、静脈内瞬時投入とその直後の静脈内注入の開始の後にマカクカニクイザルにおいて評価した。この試験設計は図４９に示す通りである。
１ｕＭの目標定常状態血漿中濃度を達成するために必要な瞬時投入の用量及び注入の速度は図５０に示すＩＶ瞬時単独試験から誘導された薬物動態パラメーターを用いて計算した。
合計３匹のマカクカニクイザルに１ｍｇ／ｋｇでＡＲＣ１８７をＩＶ瞬時投与し、その直後に４８時間に亘る０．００１３ｍｇ／ｋｇ／分の速度でのＩＶ注入を開始した。全血試料は投与後０〜１９２時間収集し、湿潤氷上に保存し、血漿を調整し、次に−８０℃で保存した。血漿試料中のＡＲＣ１８７の濃度は蛍光核酸染色試験（実施例５Ｂに記載）及びＧＬＰ有効化性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）試験の両方を用いて測定した。サル血漿中のＡＲＣ１８７の測定のためのＨＰＬＣ試験法はＣｌｉｎＴｒｉａｌｓ Ｂｉｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）により有効化されている。有効化試験は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のＧｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）規正法（２１ＣＦＲ§５８）を遵守している。ＨＰＬＣ試験法は、選択性、直線性、定量下限（ＬＬＯＱ）、キャリーオーバー、試験内精度及び確度、試験間精度及び確度、保存溶液の安定性、注入媒体の安定性、短期のマトリックス安定性、凍結解凍安定性、長期のマトリックス安定性及び希釈の一貫性に関して有効化されている。使用可能な試験濃度の直線性ダイナミックレンジは０．０８０〜５０．０μＭと測定されている。
これ等の条件下に測定されたＡＲＣ１８７のＰＫプロファイルはＩＶ瞬時ＰＫパラメーターのみを用いて得られた計算プロファイルによく合致していた（図５１参照）。１ｕＭの目標血漿中濃度は投与後５分未満に確立され、注入の全時間に亘り維持された。注入停止後は、アプタマーは終末クリアランス半減期ｔ１／２（β）〜４０〜６０時間を示した。
マカクカニクイザルにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬力学的活性は、カニクイザル試料血漿は１０％ヒト血漿中に１０倍希釈し、次に５ｍｇ／ｍｌチモサンで処理したという変更を加えた前述のチモサン活性化試験においてＰＫ試験中に採取した血漿を用いてエクスビボで評価した。Ｃ５ａ切断性生物の発生を反映したＣ５活性化は、ヒトＣ５ａに特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定した（Ｃ５ａＥＬＩＳＡキット、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。次に既知ＡＲＣ１８７濃度を用いて調製した試料を用いたチモサン試験で得られた標準曲線との比較により各試料中の活性ＡＲＣ１８７の濃度を定量した（図５２参照）。この試験はＡＲＣ１８７が注入の最中及びその後の期間を通じてその抗補体活性を上記薬物動態プロファイルと実質的に合致した水準に維持することを示している。
（実施例５Ｈ：ヒト投薬条件の予測）
ＣＡＢＧ手術に関連する合併症の予防、軽減又は治療のためのヒト投薬条件の根拠となる推測として、第１にＣＡＢＧ患者には手術開始前に抗Ｃ５アプタマーの単回静脈内瞬時用量を投与し、その後連続注入を行いＣＡＢＧ術後２４〜４８時間１．５μＭの定常状態血漿中濃度を確立して維持する。瞬時用量及び注入速度の推定値は以前に記載したマカクカニクイザルにおけるＩＶ瞬時のみ及び瞬時＋注入の試験から得られた薬物動態パラメーターを用いた計算に基づく。推定されたＡＲＣ１８７瞬時用量は１ｍｇ／ｋｇであり、関連する注入速度は０．００１３ｍｇ／ｋｇ／分である。この瞬時＋４８時間注入の用法については、予測される総薬剤必要量はＡＲＣ１８７で０．４ｇであり、ここで質量はオリゴヌクレオチド重量のみを指す（図５３の表中のコラム７参照）。図５３の表のコラム２はＡＲＣ１８７のオリゴヌクレオチド部分にコンジュゲートしたＰＥＧ基の重量を指し、コラム３はＡＲＣ１８７のオリゴヌクレオチド部分の分子量を指し（そしてそのオリゴヌクレオチド配列としてＡＲＣ１８６（配列番号４）を含む本明細書記載の全アプタマーについて同様）、コラム４は上記実施例３Ｃに記載したとおりアミン反応化学を介してＡＲＣ１８６（配列番号４）にコンジュゲートした４０ｋＤａのＰＥＧの分子量を指し、カラム５はツーコンパートメントモデルにおけるＡＲＣ１８７のα相の半減期を指し、そして、カラム６はツーコンパートメントモデルにおけるＡＲＣ１８７のβ相の半減期を指す。
（実施例６）
（抗Ｃ５アプタマー及びヘパリン／プロタミン相互作用）
抗Ｃ５アプタマーの１つの予測される用途は冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）手術に関わる炎症性の副作用の予防又は緩解のための予防薬としてのものである。血栓を防止し、バイパスポンプの部品内の開存性を維持するためにＣＡＢＧ中に典型的には高濃度の抗凝固剤ヘパリン（３〜５単位／ｍｌ又は１〜２μＭ）が投与され；処置後のヘパリンの作用の退行および正常な止血性の回復が同様に高濃度のプロタミン（〜５μＭ）の投与により達成される。これ等の薬剤の何れかの有効性において何らかの干渉を受ける危険性を患者が負うとすれば、抗Ｃ５アプタマーは（１）何れの薬剤の活性も改変せず、そして（２）患者の抗凝固治療を複雑化させる止血に対する固有の作用を示さないことを明らかにする必要がある。
ヘパリンは抗トロンビンとの相互作用を促進することにより凝固カスケードにおいて多くのプロテアーゼに対し阻害作用を示す実質負電荷で平均分子量約１５ｋＤａの硫酸化多糖類である。プロタミンは高度に正荷電したポリペプチドであり、少なくとも部分的に静電気的な性質である特徴が明確でない相互作用を介してヘパリン活性をブロックすることができる。ＡＲＣ１８７（配列番号５）の機能的コアはヘパリン同様、高度にアニオン性である。すなわちＡＲＣ１８７がヘパリン結合部位又はプロタミンと非特異的に結合してこれ等の分子の活性を妨害することが疑われる。以下の試験ではＡＲＣ１８７の固有（即ちヘパリン様）の抗凝固特性、ヘパリン機能に対するＡＲＣ１８７の作用、プロタミンによるヘパリン中和に対するＡＲＣ１８７の作用、及び、ＡＲＣ１８７の補体抑制特性に対するプロタミンの作用を検討した。
（実施例６Ａ：凝固に対するＡＲＣ１８７のインビトロ作用）
血漿凝固性に対するＡＲＣ１８７（配列番号５）の固有の作用は、凝固カスケードの外因性及び内因性の方法の標準的な臨床試験、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）をそれぞれ使用しながら調べた。図５４に示す通り、クエン酸添加ヒト血漿を予測された用量（２０μＭ以下）の過剰量で濃度ウェルを用いて滴定したところ、ＰＴは変化せず、そしてａＰＴＴは僅かに上昇したのみであった。
ヘパリン及びプロタミンの機能に対するＡＲＣ１８７のインビトロの作用を評価するために、３個体から得た血液をＣＡＢＧ手術中で使用されるヘパリン濃度に関連する用量である４〜５単位／ｍｌヘパリン中に導入した。これ等の試料の凝固性は活性化凝固時間（ＡＴＣ）、手術中ヘパリン活性をモニタリングするために日常的に使用されている全血凝固試験を用いて評価した。ヘパリンのこれ等の濃度において、他の添加物の非存在下においては、ＡＣＴは〜１５０秒のベースライン値から４Ｕ／ｍｌヘパリン存在下で〜５００秒、又は、５Ｕ／ｍｌヘパリン存在下で〜８００秒まで、有意に延長された。これ等の試料に１０μＭのＡＲＣ１８７を添加しても凝固時間には殆ど影響はなく、ＡＲＣ１８７はヘパリンの抗凝固活性を妨害しないことを示している。
ヘパリン抗凝固作用は６〜８μＭ（４Ｕ／ｍｌヘパリン）又は１２μＭ（５Ｕ／ｍｌヘパリン）までプロタミンによる滴定により容易に中和された。ヘパリン存在下のＡＣＴ値及びプロタミンの中和濃度は本質的にベースラインから識別不能であった。ＡＲＣ１８７（１２ｋＤａ）の核酸コアはプロタミン（５ｋＤａ）より大きい分子量であるため、プロタミンに添加されたＡＲＣ１８７の等モル濃度でプロタミンの中和活性を完全に退行させるのに十分であると期待されそうである。しかしながら、概ね等しい濃度のＡＲＣ１８７と共にプロタミンを予備インキュベートしてもＡＣＴには殆ど影響しなかった。中和濃度のプロタミンを含有する血液試料は１０μＭＡＲＣ１８７の存在下又は非存在下で同様のＡＣＴ値を示し、ＡＲＣ１８７がプロタミンのプロ凝固活性に対し、最高でも僅かな作用しか有さないことを示している。これ等の結果は図５５に総括する。
（実施例６Ｂ：凝固に対するＡＲＣ１８７のインビボの作用）
臨床用量のヘパリン及び臨床／臨床未満／超臨床用量のプロタミンにおける、抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）の同時投与の間のヘパリンとプロタミンの間の相互作用を調べることにより、ＡＲＣ１８７の臨床未満／超臨床の血漿中濃度がプロタミンによるヘパリン抗凝固の退行を妨害するかどうか調べた。試験の結果は図５６に総括する。要約すれば、ベースラインＡＣＴ値は試験した全てのヘパリン用量においてＡＲＣ１８７（配列番号５）の１０ｕＭ（即ち臨床用量の１０倍モル過剰量）により影響されなかった。同様に、ヘパリンによる抗凝固の程度も１０ｕＭのＡＲＣ１８７により影響されなかった。ＡＲＣ１８７の非存在下においては、プロタミンの最小有効用量は〜３０％（臨床用量＝１００％）。更にまた、３０％プロタミンによるヘパリン抗凝固の退行はＡＲＣ１８７の臨床用量（即ち１０ｕＭ）の１０倍モル過剰によっても影響されなかった。即ち、臨床状況（例えばＣＡＢＧ）における補体の抑制について、ＡＲＣ１８７の使用は典型的な用量におけるヘパリン及びプロタミンの同時使用により影響されない。
（実施例６Ｃ：ＡＲＣ１８７抗補体機能に対するヘパリン及びプロタミンの作用）
ＡＲＣ１８７（配列番号５）の抗補体活性に対するヘパリン及びプロタミンの作用を実施例１に記載する通りチモサンで活性化したクエン酸添加全血試料において調べた。チモサン活性化の直前、ＡＲＣ１８７を以下の４条件下、即ち１）未投与（ヘパリン又はプロタミン無添加）；２）４Ｕ／ｍｌヘパリン；３）６μＭプロタミン；４）４Ｕ／ｍｌヘパリン＋６μＭプロタミンにおいて投与されたクエン酸添加血液の試料中に滴定導入した。チモサン活性化の後、Ｃ５の活性化を血漿中のｓＣ５ｂ−９のＥＬＩＳＡ測定（Ｃ５ｂ−９ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕｉｄｅｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により定量した。各条件について、Ｃ５活性化のパーセント抑制ｖｓＡＲＣ１８７濃度として表示した結果は誤差範囲内であった（図５７参照）。全ての場合において、１〜２μＭＡＲＣ１８７で完全な抑制が達成された。即ち、ヘパリン及びプロタミンは、ＣＡＢＧ手術におけるそれらの使用に該当する濃度では個々又は組み合わせにおいて、ＡＲＣ１８７の抗補体活性に影響しないと考えられる。
本発明を以上の通り書面による説明及び実施例により記載したが、当業者の知る通り、本発明は種々の実施形態において実施することができ、そして、上記した説明及び実施例は例示を目的としており、添付する請求項を制限するものではない。
図１は補体系の古典的及び代替の経路を示す。 図２はオリゴヌクレオチドのランダム配列のプールからのインビトロのアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ（商標））工程の模式図である。 図３Ａは抗Ｃ５アプタマー（配列番号１）のヌクレオチド配列及び二次構造を示す図であり、ここで下線の残基は２’−Ｈピリミジン残基又は２’−フルオロピリミジン残基であり、□で囲んだ残基は２’−フルオロピリミジン残基又は２’−ＯＭｅピリミジン残基であり、そして、矢印（→）で示された残基は２’−フルオロ修飾を含有していなければならない残基を示す。 図３ＢはＡＲＣ３３０抗Ｃ５アプタマー（配列番号２）のヌクレオチド配列及び二次構造を示す図であり、ここで○で囲んだ残基は２’−Ｈ残基であり、ピリミジン残基は２’−フルオロ置換されており、そしてアウトラインで示した３個の２’−ＯＨプリン残基を除き、プリン残基の大部分は２’−ＯＭｅ置換されている。 図３ＣはＡＲＣ１８６抗Ｃ５アプタマー（配列番号４）のヌクレオチド配列及び二次構造を示す図であり、ここで全ての２１ピリミジン残基は２’−フルオロ修飾を有し、そしてアウトラインで示した３個の２’−ＯＨプリン残基を除き、プリン（１４残基）の大部分は２’−ＯＭｅ修飾されている。 図４は４０ｋＤの分枝鎖ＰＥＧ（１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）を示す。 図５はアプタマーの５’末端に結合した４０ｋＤの分枝鎖ＰＥＧ（１，３−ビス（ｍＰＥＧ−［２０ｋＤａ］）−プロピル−２−（４’−ブタミド）を示す。 図６は高分子量のＰＥＧ−核酸コンジュゲートの合成に関する種々の手法を示す図である。 図７ＡはＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５））による溶血の用量依存性抑制を非ＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマー（ＡＲＣ１８６（配列番号４））と比較したグラフである。 図７Ｂは図７Ａで示した溶血試験で用いたアプタマーのＩＣ５０値の表である。 図７ＣはＰＥＧ化抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ１８７（配列番号５）、ＡＲＣ１５３７（配列番号６５）、ＡＲＣ１７３０（配列番号６６）及びＡＲＣ１９０５（配列番号６７）による溶血の用量依存性抑制を比較したグラフである。 図７Ｄは図７Ｃで示した溶血試験で用いたアプタマーのＩＣ５０値の表である。 図８はカニクイザルの血清中補体とヒト血清中補体を比較した場合の抗Ｃ５アプタマー、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）による溶血のパーセント抑制のグラフである。 図９は１５分インキュベートした後の３７℃及び室温（２３℃）の両方における精製Ｃ５蛋白へのＡＲＣ１８６（配列番号４）の結合を示すグラフである。 図１０は４時間インキュベートした後の３７℃及び室温（２３℃）の両方における精製Ｃ５蛋白へのＡＲＣ１８６（配列番号４）の結合を示す別のグラフである。 図１１は２３℃におけるＣ５・ＡＲＣ１８６複合体の解離の経時変化を示すグラフである。 図１２は２３℃におけるＣ５・ＡＲＣ１８６複合体の形成における平衡の経時変化を示すグラフである。 図１３は複合体カスケードにおける上流及び下流の蛋白成分と比較した場合のＣ５蛋白に結合したＡＲＣ１８６（配列番号４）を示すグラフである。 図１４は未標識の競合物質であるＡＲＣ１８６（配列番号４）、ＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）の存在下におけるＣ５に結合した放射標識ＡＲＣ１８６（配列番号４）のパーセンテージを示すグラフである。 図１５はＡＲＣ１８６（配列番号４）アプタマーの種々の濃度での存在下において２５℃及び３７℃で５時間インキュベートした血液試料中で生産されたＣ５ｂ補体蛋白の量を示すグラフである。 図１６は未希釈のヒト血清、クエン酸添加ヒト全血又はカニクイザル血清中のチモサンの存在下のＡＲＣ１８７（配列番号５）によるパーセント補体抑制を示すグラフである。 図１７は実施例１Ｄに記載したチュービングループモデルにおける補体活性化（Ｃ５ａ）をＡＲＣ６５８（配列番号６２）が完全に抑制することを示すグラフである。 図１８はＣ５選択プールのラウンド１０に関する解離定数を示すグラフである。解離定数（Ｋｄ）は式：結合ＲＮＡ画分＝増幅＊Ｋｄ／（Ｋｄ＋［Ｃ５］）にデータを当てはめることにより推定した。「ＡＲＣ５２０」（配列番号７０）はナイーブの非選択のｄＲｍＹプールを指し、そして「＋」は競合物質（０．１ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）の存在を示す。 図１９はＣ５クローンの解離定数の曲線を示すグラフである。解離定数（Ｋｄ）は式：結合ＲＮＡ画分＝増幅＊Ｋｄ／（Ｋｄ＋［Ｃ５］）にデータを当てはめることにより推定した。 図２０はＡＲＣ１８６（配列番号４）と比較した場合の抗Ｃ５アプタマークローンＡＲＣ９１３（配列番号７５）の種々の濃度の溶血活性に対する抑制作用を説明するＩＣ５０曲線を示すグラフである。 図２１はＡＲＣ１８７（配列番号５）の構造を示す図である。 図２２はＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の構造を示す図である。 図２３は第１の単離された灌流心臓の試験の実験設計を示す表である。 図２４はヒト血漿に曝露した単離心臓の左心室（ＬＶ）における心室内圧力に関する圧力追跡（Ａ）を対照アプタマー溶液に曝露した単離心臓のＬＶＰ圧の追跡（Ｂ）に比較したグラフである。 図２５はモル等量、１０×及び５０×のアプタマー／Ｃ５溶液に曝露した単離心臓の左心室（ＬＶ）における心室内圧力に関する圧力追跡を比較したグラフである（約５００ｎＭの濃度が正常未希釈ヒト血漿中のＣ５について推定される）。 図２６はヒト血漿及び種々の血漿／アプタマー溶液への曝露の後の単離マウス心臓における分当たり拍数（ｂｐｍ）における心拍数の変化を比較したグラフである。 図２７は０〜１×モル比のＡＲＣ１８６（配列番号４）（不良の心臓）又は１０〜５０×モル比（Ｃ５アプタマーで保護された心臓）を含むヒト血漿への曝露の前後の単離マウス心臓における心臓重量の変化を比較したグラフである。 図２８は単離マウス心臓を通過する灌流の後の種々のアプタマー濃度を含有するヒト血漿中の相対的Ｃ５ａ生産を比較したグラフである。相対的Ｃ５ａ濃度は吸光度単位（Ａｂｓ）でプロットし、より高値の読み取り値がより高値のＣ５ａ濃度の存在を反映している。 図２９は単離マウス心臓を通過する灌流の後の種々のアプタマー濃度を含有するヒト血漿中の相対的可溶性Ｃ５ｂ−９生産を比較したグラフである。 図３０はマウス心臓流出物中のＣ３切断に対するＡＲＣ１８６（配列番号４）の作用を示すグラフである。 図３１は単離灌流マウス心臓試験に関する免疫組織化学的染色の結果を示す表である。 図３２はＣ５ｂ媒介損傷から心臓を保護するためにヒト又は霊長類の血清中で必要とされるＡＲＣ６５８（配列番号６２）のモル比を示す表である。 図３３はラット及びマカクカニクイザルの両方の血漿中のインキュベート時間の関数としての完全長ＡＲＣ１８６の残存パーセントの方対数プロットを示すグラフである。 図３４は実施例５に記載したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで実施した薬物動態試験の実験設計を示す表である。 図３５はＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）又はＡＲＣ１８７（配列番号５）の平均血漿中濃度を時間に対して示した表である。 図３６はラットにおけるアプタマーの静脈内投与後の経時的なＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）の平均血漿中濃度を示すグラフである。 図３７は図３５及び３６に示した濃度ｖｓ時間のデータのノンコンパートメント分析を示す表である。 図３８ＡはマウスにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）及びＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の薬物動態試験の設計を示す表であり；図３８Ｂは単回ＩＶ瞬時投与後のＣＤ−１マウスにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）及びＡＲＣ１９０５（配列番号６７）の薬物動態プロファイルを示すグラフであり；図３８Ｃは図３８Ｂにおいて示した濃度ｖｓ時間のデータのノンコンパートメント分析を示す表である。 図３９は静脈内投与後のマウス心臓組織における列挙したアプタマーの検出を示す表である。 図４０は実施例５Ｅに記載した動物試験１の実験設計を示す表である。 図４１はマカクカニクイザルへのアプタマーの静脈内瞬時投与の後のアプタマーの血漿中濃度ｖｓ時間を示す表である。 図４２は試験１においてマカクカニクイザルに静脈内投与したＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）及びＡＲＣ１８７（配列番号５）に関する薬物動態パラメーターを列挙した表である。 図４３（ａ）及び４３（ｃ）はマカクカニクイザルへの抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）又はＡＲＣ１８７（配列番号５）の静脈内投与後の経時的なｓＣ５ｂ−９及びＣ５ａの血漿中濃度を示すグラフである。 図４３（ｂ）及び４３（ｄ）は抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）又はＡＲＣ１８７（配列番号５）の濃度に対するｓＣ５ｂ−９及びＣ５ａの血漿中濃度を示すグラフである。 図４３（ａ）及び４３（ｃ）はマカクカニクイザルへの抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）又はＡＲＣ１８７（配列番号５）の静脈内投与後の経時的なｓＣ５ｂ−９及びＣ５ａの血漿中濃度を示すグラフである。 図４３（ｂ）及び４３（ｄ）は抗Ｃ５アプタマーＡＲＣ６５７（配列番号６１）、ＡＲＣ６５８（配列番号６２）又はＡＲＣ１８７（配列番号５）の濃度に対するｓＣ５ｂ−９及びＣ５ａの血漿中濃度を示すグラフである。 図４４は実施例５Ｆに記載した試験２の実験設計を示す表である。 図４５はマカクカニクイザルへのＡＲＣ６５８（配列番号６２）又はＡＲＣ１８７（配列番号５）の静脈内投与後の種々の時点における平均アプタマー血漿中濃度を示すグラフである。 図４６はマカクカニクイザルへの静脈内瞬時アプタマー投与後の濃度ｖｓ時間のデータのツーコンパートメント分析を示す表である。 図４７はカニクイザルの血漿中チモサンの存在下のＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ６５８（配列番号６２）に対するＣ５ｂ−９濃度を示すグラフである。 図４８はカニクイザルの血漿中チモサンの存在下のＡＲＣ１８７（配列番号５）又はＡＲＣ６５８（配列番号６２）に対するＣ５ａ濃度を示すグラフである。 図４９はマカクカニクイザルへのＩＶ瞬時＋注入投与の最中及び後におけるＡＲＣ１８７（配列番号５）のＰＫ−ＰＤ試験を総括する表である。 図５１はＩＶ瞬時投与後のマカクカニクイザルにおけるＡＲＣ１８７（配列番号５）に関する薬物動態パラメーターを総括する表である。 図５１はマカクカニクイザルへのＩＶ瞬時＋注入投与の最中及び後におけるＡＲＣ１８７（配列番号５）の薬物動態プロファイルの計算値及び実測値を示すグラフである。 図５２はマカクカニクイザルへのＩＶ瞬時＋注入投与の最中及び後において活性ＡＲＣ１８７（配列番号５）の血漿中濃度が一定であり続けることを示すグラフである。 図５３はＣＡＢＧ手術における抗Ｃ５アプタマーに関する予測されたヒトへの投与条件を示す表である。 図５４はプロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）により測定した場合の凝固に対するインビトロの作用をＡＲＣ１８７（配列番号５）が比較的に保有していないことを示すグラフである。 図５５はヘパリンの抗凝固活性及びプロタミンのプロ凝固活性に対するＡＲＣ１８７（配列番号５）のインビトロの作用を総括した表である。 図５６はインビボのヘパリンの抗凝固の逆行をＡＲＣ１８７（配列番号５）が起こさないことを示すグラフである。 図５７はチモサンの補体活性化の抑制により測定したＡＲＣ１８７（配列番号５）の抗補体機能に対してヘパリン及びプロタミンの両方が作用を有さないことを示すグラフである。

Claims (21)

  1. 配列番号４に従うヌクレオチド配列を有するアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩であって、更に該配列の５’末端にリンカーを介してコンジュゲートした４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ部分を有する、アプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  2. 前記リンカーがアルキルリンカーである、請求項１記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  3. 前記アルキルリンカーが２〜１８連続ＣＨ２基を有する、請求項２に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  4. 前記アルキルリンカーが２〜１２連続ＣＨ２基を有する、請求項３に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  5. 前記アルキルリンカーが３〜６連続ＣＨ２基を有する、請求項４に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲート又はその塩の治療有効量を含む、組成物。
  7. 製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲート又はその塩の治療有効量および製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含む、Ｃ５、Ｃ５ａ及び／又はＣ５ｂ−９補体蛋白により媒介される、脊椎動物における疾患を治療、予防又は軽減するための組成物。
  9. 前記脊椎動物が哺乳類である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記哺乳類がヒトである、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記疾患が、急性虚血性疾患、急性炎症性疾患又は慢性炎症性疾患及び／又は免疫媒介疾患である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記疾患が、心筋梗塞、脳卒中、虚血／再灌流傷害、感染性疾患、敗血症、ショック、急性／超急性移植片拒絶、アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性／慢性の移植片拒絶、又は糸球体腎炎及び他の腎疾患である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記疾患が、ＣＡＢＧ手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害又は再狭窄に関連する心筋傷害である、請求項１０に記載の組成物。
  14. 前記疾患が、ＣＡＢＧ手術に関連するＣ５、Ｃ５ａ及び／又はＣ５ｂ−９補体蛋白媒介合併症である、請求項１０に記載の組成物。
  15. 前記組成物は、術前術後に投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
  16. 前記組成物は、静脈内投与されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  17. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩を含む診断用組成物であって、該組成物は、Ｃ５補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる試料に接触させ、Ｃ５補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在が検出されることを特徴とする、診断用組成物。
  18. 前記Ｃ５補体蛋白又はその変異体がヒトＣ５補体蛋白又はその変異体である、請求項１７に記載の診断用組成物。
  19. インビトロ診断薬として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  20. インビボ診断薬として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
  21. インビボの疾患の治療、予防又は軽減において使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー／ＰＥＧコンジュゲートまたはその塩。
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