JP5242918B2 - 補体関連障害の治療に有用なアプタマー治療法 - Google Patents

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Description

(発明の分野)
本発明は一般的には核酸の分野、そして特に、補体関連の心臓、炎症及び自己免疫の障害、虚血再灌流傷害及び/又はC5媒介補体活性化が関与する他の疾患又は障害における治療薬及び診断薬として有用な、補体系のC5蛋白に結合することができるアプタマーに関する。本発明は更にC5補体系蛋白に結合できるアプタマーの投与のための物質及び方法に関する。
(発明の背景)
アプタマーは古典的なワトソンクリック塩基対形成とは異なる相互作用を介した分子への特異的結合親和性を有する核酸分子である。
アプタマーはファージディスプレイにより形成されるペプチド又はモノクローナル抗体(「MAb」)と同様、選択された標的に特異的に結合し、そして標的の活性をモジュレートすることができ、例えば結合アプタマーを介してその標的が機能する能力をブロックする場合がある。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから得られたインビトロの選択過程により作成された場合、アプタマーは成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン及び受容体を包含する100超の蛋白について作成されている。典型的なアプタマーは10〜15kDaの大きさ(30〜45ヌクレオチド)であり、ナノモル未満の親和性でその標的に結合し、そして、緊密に関連する標的を識別する(例えばアプタマーは典型的には同じ遺伝子ファミリーに属する別の蛋白に結合しない)。一連の構造の研究によれば、アプタマーは抗体−抗原複合体における親和性及び特異性を駆動する結合相互作用(例えば水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体的排除)の同じ型を用いることができる。
アプタマーは高い特異性及び親和性、生物学的薬効及び優れた薬物動態を含む治療薬及び診断薬として使用するための多くの望ましい特性を有している。更にまた、例えば以下に示すような抗体及び他の蛋白の生物学的特徴を超えた特異的競合性の利点を与える。
1)速度及び制御性。アプタマーは完全にインビトロの工程により生産され、治療の手がかりを含む初期の手がかりの急速な形成を可能にする。インビトロの選択はアプタマーの特異性及び親和性を着実に制御できるようにし、そして、毒性及び非免疫学的な標的に対する手がかりを含む手がかりの形成を可能にする。
2)毒性及び免疫原性。アプタマーはクラスとして毒性又は免疫原性が僅かであるか皆無である。ラット又はウッドチャックに高水準のアプタマーを長期投与した場合(毎日10mg/kg、90日間)、如何なる臨床、細胞又は生化学的尺度においても毒性は観察されなかった。多くのモノクローナル抗体の薬効は抗体自体への免疫学的応答により大きく低減されるが、アプタマーはMHCを介してT細胞により呈示されず、そして免疫応答は一般的に核酸フラグメントを認識しないように訓練されているという最も可能性の高い理由のため、アプタマーに対する抗体を誘導することは極めて困難である。
3)投与。現在認可されている抗体治療薬の大部分は静注(典型的には2〜4時間)により投与されるが、アプタマーは皮下注射により投与できる(皮下投与によるアプタマーの生体利用性はサルによる試験では>80%である(非特許文献1)。この相違の主な原因は、比較的低い溶解度、及び、それによる大部分の治療用MAbで必要とされる大容量である。良好な溶解度(>150mg/ml)及び比較的小さい分子量(アプタマー:10〜50kDa;抗体:150kDa)のためアプタマーを0.5ml未満の容量の注射により毎週送達してよい。更にまた、アプタマーは小型であるために、それは、抗体又は抗体フラグメントが浸透できないコンホーメーション的に緊縮した領域にも浸透することができ、アプタマー系の治療又は予防の別の利点をもたらす。
4)拡張性及び費用。治療用アプタマーは化学的に合成され、そしてその結果、製造の要求性に合致するために必要とされるとおり容易に拡張することができる。製造の拡張における困難な点のため現在は一部の生物学的な利用性が制限されており、そして大規模蛋白製造プラントの資本経費は多大であるが、単一の大規模オリゴヌクレオチド合成器は100kg/年超を生産することができ、そして初期投資も比較的適度ですむ。キログラム規模におけるアプタマーの合成のための現在の資材経費は推定で500ドル/gであり、高度に至適化された抗体と同等である。工程の開発の持続的改良により5年以内に100ドル/g未満にまで資材経費を低減できることが期待される。
5)安定性。治療用アプタマーは化学的に頑健である。それらは熱及び変性物質のような要因への曝露後に活性を回復できるよう固有に適合されており、凍結粉末として室温で長期間(>1年)保存できる。
(補体系)
補体系は病原体の細胞外形態(例えば細菌)を攻撃するための調節されたカスケード系において共に機能する血漿及び膜蛋白少なくとも20種のセットを含む。補体系は2つの異なる酵素活性化カスケード、即ち、古典的代替経路(図1)及び膜攻撃経路として知られている非酵素的経路を包含する。
古典的経路として知られている第1の酵素的に活性化されるカスケードは数種の成分、即ちC1、C4、C2、C3及びC5(経路の順に列挙)を含む。補体系の古典的経路の開始は免疫性及び非免疫性の活性化物質の両方による第1の補体成分(C1)の結合及び活性化の後に起こる。C1は成分C1q、C1r及びC1sのカルシウム依存性複合体を含み、C1q成分の結合を介して活性化される。C1qは6つの同一のサブユニットを含有し、各サブユニットは3つの鎖(A、B及びC鎖)を含む。各鎖はコラーゲン様テイル部に連結した球状のヘッド領域を有する。抗原−抗体複合体によりC1qの結合及び活性化はC1qヘッド基領域を介して起こる。多くの非抗体C1q活性化物質、例えば蛋白、脂質及び核酸がコラーゲン様ストーク領域上の異なる部位を介してC1qに結合して活性化する。次にC1qrs複合体は補体成分C4及びC2の活性化を触媒し、C4bC2a複合体を形成し、これがC3コンバターゼとして機能する。
代替経路として知られている第2の酵素的に活性化されるカスケードは補体系の活性化及び増幅に関する急速な抗体非依存性の経路である。代替経路は数種の成分、即ちC3、B因子及びD因子(経路の順に列挙)を含む。代替経路の活性化はC3b、すなわちC3の蛋白分解性切断形態が細菌のような活性化表面物質に結合した場合に起こる。次に因子BがC3bに結合し、そしてD因子により切断されて活性酵素のBaを生成する。次に酵素Baが更にC3を切断して更にC3bを形成し、活性化表面上にC3b−Ba複合体の広範な付着をもたらす。
即ち、古典的及び代替の補体経路は共にC3因子をC3a及びC3bに分離するC3コンバターゼを生産する。この時点において、両方のC3コンバターゼは更に組み立てられてC5コンバターゼとなる(C4b2a3b及びC3b3bBb)。これ等の複合体はその後補体成分C5を2つの成分、即ちC5aポリペプチド(9kDa)及びC5bポリペプチド(170kDa)に切断する。C5aポリペプチドは元は白血球に関連していたが現在は肝細胞及びニューロンを含む種々の組織上で発現されることが分かっている7膜貫通G蛋白結合受容体に結合する。C5a分子はヒト補体系の主に走化性の成分であり、白血球の化学走性、平滑筋の収縮、細胞内シグナル伝達経路の活性化、好中球−内皮細胞接着、サイトカイン及び脂質メディエーターの放出及び酸化物質形成を包含する種々の生物学的応答をトリガーすることができる。
より大型のC5bフラグメントは補体カスケードの後の成分、C6、C7、C8及びC9に順次結合し、C5b−9膜攻撃複合体(「MAC」)を形成する。C5b−9MACは赤血球を直接溶解し、そしてより大量には白血球に対しても溶解性であり、筋肉、上皮及び内皮のような組織を損傷する。溶解未満の量においては、MACは接着分子のアップレギュレーション、細胞内カルシウムの増大及びサイトカインの放出を促進することができる。更にまた、C5b−9MACは細胞溶解を起こすことなく内皮細胞及び血小板のような細胞を刺激することができる。C5a及びC5b−9MACの非溶解性作用は場合により極めて同様である。
補体系は健康の維持において重要な役割を有するが疾患を誘発又はこれに寄与する可能性もある。例えば補体系は冠動脈バイパスグラフト(「CABG」)手術に関連する副作用、多くの腎臓、リューマチ性、神経学的、皮膚科的、血液学的、血管/肺、アレルギー、感染及び生体適合性/ショック性の疾患及び/又は状態及び糖尿病性網膜症に関与するとされている。補体系は必ずしも疾患状態の唯一の原因ではなく、病因に寄与する数種の因子の1つであると考えられる。
非特許文献2において、心肺バイパス(CPB)を伴う冠動脈バイパスグラフト手術を受けた患者に対する抗C51本鎖抗体フラグメントペキセリズマブの作用が試験されている。個々の患者に、0.5mg/kg、1.0mg/kg及び2.0mg/kgでCPBを投与する直前に10分の単回投与においてペキセリズマブを投与した。CPBの投与前、投与後5分、28℃5分後、再加温開始後、37℃5分後、及び7日後まで、血液試料を採取して補体活性を試験した。薬力学的分析によれば、2mg/kgの用量で14時間まで補体溶血活性の有意な用量依存的抑制が明らかになり、そして前炎症補体副生成物(sC5b−9)の形成は用量依存的な態様で効果的に抑制された。しかしながら、前述した通り、抗体治療薬には特定の限界がある。
Tucker et al.,J.Chromatography B.732:203−212(1999) Fitch et al.,Circ.100:2499−506(1999)
従って、補体関連障害の治療における治療薬及び診断薬として使用するための補体系の新しい抑制剤を保有することが有利である。
(発明の要旨)
本発明は補体関連疾患の治療、予防及び軽減のための物質及び方法を提供する。1つの実施形態において、自身の5’末端にコンジュゲートしたPEGを有するARC186(配列番号4)に従ったヌクレオチド配列を含むアプタマーを提供する。特定の実施形態においては、このARC186アプタマー/PEGコンジュゲートは配列番号4の配列を含むアプタマーと実質的に同じC5補体蛋白に対する結合親和性を有している。本明細書においては実質的に同じ結合親和性とは、ドットブロット分析により測定した場合の解離定数が約2〜10倍差以下、好ましくは2〜5倍差以下であることを意味する。一部の実施形態においては、解離定数は後述する実施例1Aに記載する通り競合ドットブロット分析により測定する。一部の実施形態においてはアプタマー/PEGコンジュゲートは霊長類において少なくとも15時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間の、ツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。一部の実施形態においては、アプタマー/PEGコンジュゲートはラットにおいて少なくとも10時間、好ましくは少なくとも15の、ツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。一部の実施形態においては、ARC186(配列番号4)の5’末端にコンジュゲートしたPEGは40kDaPEGである。特定の実施形態においては、40kDaPEGは分枝鎖PEGである。一部の実施形態においては、分枝鎖40kDaPEGは1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)である。他の実施形態においては、分枝鎖40kDaPEGは2,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−1−カルバモイルである。
分枝鎖40kDaPEGが1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)である実施形態においては、下記式:
Figure 0005242918
の構造を有するアプタマーが提供され、ここで、
Figure 0005242918
はリンカーを指し、
Figure 0005242918
であり、ここで、fC及びfU=2’−フルオロヌクレオチド、そしてmG及びmA=2’−OMeヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは2’−OHである。
分枝鎖40kDaPEGが2,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−1−カルバモイルである実施形態においては、下記式:
Figure 0005242918
の構造を有するアプタマーが提供され、ここで、
Figure 0005242918
はリンカーを指し、
Figure 0005242918
であり、ここで、fC及びfU=2’−フルオロヌクレオチド、そしてmG及びmA=2’−OMeヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは2’−OHである。
本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、リンカーはアルキルリンカーである。特定の実施形態においては、アルキルリンカーは2〜18連続CH基を有する。好ましい実施形態においては、アルキルリンカーは2〜12連続CH基を有する。特に好ましい実施形態においては、アルキルリンカーは3〜6連続CH基を有する。
特定の実施形態においては、下記式:
Figure 0005242918
の構造を有するアプタマー、ARC187(配列番号5)が提供され、ここで、
Figure 0005242918
であり、ここで、fC及びfU=2’−フルオロヌクレオチド、そしてmG及びmA=2’−OMeヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは2’−OHである。
別の実施形態においては、下記式:
Figure 0005242918
の構造を有するアプタマー、ARC1905(配列番号67)が提供され、ここで、
Figure 0005242918
であり、ここで、fC及びfU=2’−フルオロヌクレオチド、そしてmG及びmA=2’−OMeヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは2’−OHである。
別の特徴において、本発明は医薬組成物を提供する。1つの実施形態において、ARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)又はその塩の治療有効量を含む医薬組成物が提供される。本発明のこの特徴において、インビボの疾患の治療、予防又は軽減において使用するためのARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)の医薬組成物が提供される。
本発明の別の特徴において、治療方法が提供される。1つの実施形態において、本発明の方法はC5補体蛋白、及び/又はその誘導体C5a及びC5b−9により媒介される疾患を治療、予防又は軽減することを包含し、方法は、脊椎動物に対し、ARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)又はその塩を含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、方法は哺乳類に本発明の医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態においては、哺乳類はヒトである。
一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、急性虚血性疾患(心筋梗塞、脳卒中、虚血/再灌流傷害);急性炎症性疾患(感染性疾患、敗血症、ショック、急性/超急性移植片拒絶);慢性炎症性及び/又は免疫媒介性の疾患(アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLE)又は亜急性/慢性の移植片拒絶、糸球体腎炎及び他の腎疾患)である。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、透析又は血液が合成チューブ及び/又は外来性の物質を通過する環境に関連する補体活性化を包含する。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、CABG手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害及び再狭窄に関連する心筋傷害よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、CABG手術に関連する合併症である。特定の実施形態においては、治療すべき疾患はCABG手術に関連する心筋傷害である。
一部の実施形態においては、本発明の方法は、内因性C5補体蛋白の約0.5〜約10倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために、ARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)を含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、医薬品ARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)アプタマー組成物は、内因性C5補体蛋白の約0.75倍〜約5倍、0.75〜約3倍、及び1.5〜約2倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与されるが、別の実施形態においてはアプタマー組成物は内因性補体蛋白と等しい濃度を達成するために投与される。一部の実施形態においては、ARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)を含む本発明の医薬組成物は約5μM、約4μM、約3μM、約2μM、約1.5μM、約1μM又は約500nMのアプタマー血漿中濃度を達成するために投与される。
本発明のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与の経路、期間及び速度の何れかの組み合わせを用いてよい。一部の実施形態においては、医薬組成物は静脈内投与する。一部の実施形態においては、医薬組成物は瞬時及び/又は連続注入により投与する。
CABG手術に関連する合併症、特にCABG手術に関連する心筋傷害を治療、予防及び/又は軽減する特定の実施形態において、本発明の方法は、手術の前に医薬組成物を投与すること、及び、投与を少なくとも24時間、一部の実施形態においては約48時間、又は一部の実施形態においては約72時間継続することを包含する。本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、アプタマーのより低用量の静注の前、これと同時、又は、その後に、治療すべき患者のkg当たり約0.75〜1.25、好ましくは約1mgのアプタマーの静脈内瞬時投与により、内因性補体蛋白濃度の約2倍の血漿中アプタマー濃度を達成し、ここでmg用量はコンジュゲートPEGの重量を含まない。一部の実施形態においては、より低用量を0.001〜0.005mg/kg/分の範囲から選択される速度で注入し、ここで、mg用量はコンジュゲートPEGの重量を含まない。特定の実施形態においては、より低用量は約0.0013mg/kg/分の速度で注入する。アプタマー/コンジュゲートが十分長い半減期を有するこの特徴の更に別の実施形態においては、アプタマーの医薬組成物は静脈内瞬時投薬として1日1回又は2回投与してよい。
本発明の別の特徴において、診断方法が提供される。1つの実施形態において、診断方法は、C5補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる組成物にARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)を接触させること、及び、C5補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在を検出することを含む。一部の実施形態においては、補体蛋白又はその変異体は脊椎動物、特に哺乳類、とりわけヒトである。本発明はインビトロ又はインビボの診断薬として使用するためのARC187(配列番号5)又はARC1905(配列番号67)組成物を提供する。
本発明の別の特徴においては、ARC330(配列番号2)及びARC188〜189、ARC250、ARC296〜297、ARC331〜334、ARC411〜440、ARC457〜459、ARC473、ARC522〜525、ARC532、ARC543〜544、ARC550〜554、ARC657〜658、ARC672、ARC706、ARC1537、ARC1730(配列番号6〜配列番号66)よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列を含むアプタマーは配列番号1の配列を含む。特定の実施形態においては、配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。アプタマーが配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む一部の実施形態においては、アプタマーは配列番号4の配列を含むアプタマーと実質的に同じC5補体蛋白に対する結合親和性を有する。
アプタマーが配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む一部の実施形態においては、アプタマーは霊長類において少なくとも15、好ましくは少なくとも30時間のツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。アプタマーが配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む一部の実施形態においては、アプタマーはラットにおいて少なくとも1時間半、好ましくは少なくとも7時間のツーコンパートメントモデルにおける半減期、好ましくは終末半減期を有する。
アプタマーが配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、アプタマーは以下の通り、即ち
Figure 0005242918
となるように5’リンカーを用いて合成され、ここで、
Figure 0005242918
はリンカーである。一部の実施形態においては、リンカーは以下の通り、即ちHN−(CH−5’アプタマー3’であるアルキルリンカーであり、ここでn=2〜18、好ましくはn=2〜12、より好ましくはn=3〜6、更に好ましくはn=6であり、
Figure 0005242918
(配列番号4){式中、fC及びfU=2’−フルオロヌクレオチド、そしてmG及びmA=2’−OMeヌクレオチドであり、そして他の全てのヌクレオチドは2’−OHである}である。得られるアミン修飾アプタマーは10kDaPEG、20kDaPEG、30kDaPEG及び40kDa線状PEGよりなる群から選択されるPEG部分にコンジュゲートしてよい。一部の実施形態においては、配列番号1、配列番号2及び配列番号6〜配列番号66よりなる群から、特に配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーの治療有効量を含む医薬組成物またはその塩が提供される。本発明の医薬組成物は製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含んでよい。本発明のこの特徴において、配列番号2及び配列番号6〜配列番号66よりなる群から、特に配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを含む、インビボにおける疾患の治療、予防又は軽減において使用するための医薬組成物が提供される。
別の実施形態においては、アプタマーが配列番号2及び配列番号6〜配列番号66よりなる群から、特に配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、哺乳類に対し、アプタマー又はその塩を含む医薬組成物を投与することを含むC5補体蛋白により媒介される疾患を治療、予防又は軽減する方法が提供される。本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、方法は本発明の医薬組成物を哺乳類、好ましくはヒトに投与することを含む。
一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、急性虚血性疾患(心筋梗塞、脳卒中、虚血/再灌流傷害);急性炎症性疾患(感染性疾患、敗血症、ショック、急性/超急性移植片拒絶);慢性炎症性及び/又は免疫媒介性の疾患(アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLE)又は亜急性/慢性の移植片拒絶、糸球体腎炎及び他の腎疾患)である。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、透析又は血液が合成チューブ及び/又は外来性の物質を通過する環境に関連する補体活性化を包含する。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、CABG手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害及び再狭窄に関連する心筋傷害よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、CABG手術に関連する合併症である。特定の実施形態においては、治療すべき疾患はCABG手術に関連する心筋傷害である。
一部の実施形態においては、本発明の方法は、内因性C5補体蛋白の約0.5〜約10倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために、患者に対し、配列番号2及び配列番号6〜配列番号66よりなる群から、特に配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、医薬品組成物は、内因性C5補体蛋白の約0.75倍〜約5倍、0.75〜約3倍、及び1.5〜約2倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与されるが、別の実施形態においてはアプタマー組成物は内因性補体蛋白と等しい濃度を達成するために投与される。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は約5μM、約4μM、約3μM、約2μM、約1.5μM、約1μM又は約500nMのアプタマー血漿中濃度を達成するために投与される。
本発明のアプタマー血漿中濃度を達成するために十分な投与の経路、期間及び速度の何れかの組み合わせを用いてよい。一部の実施形態においては、医薬組成物は静脈内投与する。一部の実施形態においては、医薬組成物は瞬時及び/又は連続注入により投与する。
CABG手術に関連する合併症、特にCABG手術に関連する心筋傷害を治療、予防及び/又は軽減する特定の実施形態において、本発明の方法は、手術の前に医薬組成物を投与すること、及び、投与を少なくとも24時間、一部の実施形態においては約48時間、又は一部の実施形態においては約72時間継続することを包含する。本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、アプタマーのより低用量の静注の前、これと同時、又は、その後に、治療すべき患者に対するアプタマーの静脈内瞬時投与により、所望の血漿中アプタマー濃度、例えば一部の実施形態においては内因性補体蛋白濃度の約2倍を達成する。アプタマー/コンジュゲートが十分長い半減期を有する本発明のこの特徴の更に別の実施形態においては、アプタマーの医薬組成物は静脈内瞬時投薬として1日1回又は2回投与してよい。
本発明の別の特徴において、診断方法が提供される。1つの実施形態において、診断方法は、C5補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる組成物に配列番号2及び配列番号6〜配列番号66よりなる群から、特に配列番号61、配列番号62及び配列番号64〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを接触させること、及び、C5補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在を検出することを含む。一部の実施形態においては、補体蛋白又はその変異体は脊椎動物、特に哺乳類、とりわけヒトである。本発明はインビトロ又はインビボの診断薬として使用するための配列番号2及び配列番号6〜配列番号66よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを有するアプタマー組成物を提供する。
本発明の別の特徴において、ARC915、ARC874〜878、ARC954、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つに80%同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。一部の実施形態においては、配列番号75〜81及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つの独特の領域に80%同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。別の実施形態において、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つに90%同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。特定の実施形態において、配列番号75〜81及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つの独特の領域に90%同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。更に別の実施形態において、配列番号75〜81及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つに含まれる40近接ヌクレオチドに同一である40近接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。更に別の実施形態において、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つに含まれる30近接ヌクレオチドに同一の30近接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。また更に別の実施形態において、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択される配列の何れか1つに含まれる10近接ヌクレオチドに同一の10近接ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むC5補体蛋白に特異的に結合するアプタマーが提供される。好ましい実施形態においては、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の何れか1つによるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。
一部の実施形態においては、上記した本発明のこの特徴のアプタマーは、核酸配列の糖位置における化学的置換;ホスフェート位置における化学的置換;及び塩基位置における化学的置換よりなる群から選択される化学的修飾を更に含んでよい。一部の実施形態においては、修飾は修飾されたヌクレオチドの取り込み、3’キャッピング、高分子量の非免疫学的化合物へのコンジュゲート形成、親油性化合物へのコンジュゲート形成、及びホスフェート骨格の修飾よりなる群から選択される。
本発明のこの特徴の好ましい実施形態においては、アプタマーはC5補体蛋白又はその変異体の機能をモジュレートする。特に好ましい実施形態においては、アプタマーは好ましくはインビボで、より好ましくはヒトにおいてインビボで、C5補体蛋白又はその変異体の機能を抑制する。本発明のこの特徴の1つの実施形態において、アプタマーによりモジュレートされる、また好ましくは抑制される機能はC5補体蛋白切断である。
別の一部の実施形態においては、本発明はインビボでC5補体蛋白の切断をブロックするアプタマー又はその塩の治療有効量及び製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態においては、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に80%同一、好ましくは90%同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマー又はその塩の治療有効量を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態においては、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の独特の領域に80%同一、好ましくは90%同一であるヌクレオチド配列を含むアプタマー又はその塩の治療有効量を含む医薬組成物が提供される。別の実施形態においては、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列にそれぞれ40、30又は10ヌクレオチドと同一である40、30又は10近接ヌクレオチドを有するアプタマーの治療有効量を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含んでよい。本発明のこの特徴において、インビボで疾患の治療、予防又は軽減において使用するための医薬組成物が提供され、ここで、医薬組成物は配列番号3〜4、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマー又はその塩を含む。
一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、急性虚血性疾患(心筋梗塞、脳卒中、虚血/再灌流傷害);急性炎症性疾患(感染性疾患、敗血症、ショック、急性/超急性移植片拒絶);慢性炎症性及び/又は免疫媒介性の疾患(アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLE)又は亜急性/慢性の移植片拒絶、糸球体腎炎及び他の腎疾患)である。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、透析又は血液が合成チューブ及び/又は外来性の物質を通過する環境に関連する補体活性化を包含する。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、CABG手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害及び再狭窄に関連する心筋傷害よりなる群から選択される。一部の実施形態においては、治療すべきC5補体蛋白、C5a及び/又は及びC5b−9により媒介される疾患は、CABG手術に関連する合併症である。特定の実施形態においては、治療すべき疾患はCABG手術に関連する心筋傷害である。
一部の実施形態においては、本発明の方法は、内因性C5補体蛋白の約0.5〜約10倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために、患者に対し、配列番号3〜4、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを含む医薬組成物を投与することを包含する。一部の実施形態においては、医薬品アプタマー組成物は、内因性C5補体蛋白の約0.75倍〜約5倍、0.75〜約3倍、及び1.5〜約2倍のアプタマー血漿中濃度を達成するために投与されるが、別の実施形態においてはアプタマー組成物は内因性補体蛋白と等しい濃度を達成するために投与される。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は約5μM、約4μM、約3μM、約2μM、約1.5μM、約1μM又は約500nMのアプタマー血漿中濃度を達成するために投与される。
本発明のアプタマー血漿中濃度を達成するために十分な投与の経路、期間及び速度の何れかの組み合わせを用いてよい。一部の実施形態においては、医薬組成物は静脈内投与する。一部の実施形態においては、医薬組成物は瞬時及び/又は連続注入により投与する。
CABG手術に関連する合併症、特にCABG手術に関連する心筋傷害を治療、予防及び/又は軽減する特定の実施形態において、本発明の方法は、手術の前に医薬組成物を投与すること、及び、投与を少なくとも24時間、一部の実施形態においては約48時間、又は一部の実施形態においては約72時間継続することを包含する。本発明のこの特徴の特定の実施形態においては、アプタマーのより低用量の静注の前、これと同時、又は、その後に、治療すべき患者に対するアプタマーの静脈内瞬時投与により、所望の血漿中アプタマー濃度、例えば一部の実施形態においては内因性補体蛋白濃度の約2倍を達成する。アプタマー/コンジュゲートが十分長い半減期を有する本発明のこの特徴の更に別の実施形態においては、アプタマーの医薬組成物は静脈内瞬時投薬として1日1回又は2回投与してよい。
別の実施形態において、診断方法が提供され、方法は、C5補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる組成物に、配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するアプタマーを接触させること、及び、C5補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在を検出することを含む。一部の実施形態においては、補体蛋白又はその変異体は脊椎動物、特に哺乳類、とりわけヒトである。本発明はインビトロ又はインビボの診断薬として使用するための配列番号75〜81、配列番号83及び配列番号88〜98よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを有するアプタマー組成物を提供する。
一部の実施形態においては、配列番号68及び69よりなる群から選択されるヌクレオチド配列より本質的になるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。一部の実施形態においては、配列番号68及び69よりなる群から選択されるヌクレオチド配列よりなるヌクレオチド配列を含むアプタマーが提供される。本発明のこの特徴の一部の実施形態においては、アプタマーは診断方法において使用してよい。
本発明の実施形態の1つ以上の詳細を以下の説明において記載する。本明細書に記載したものと同様又は等価な如何なる方法及び物質も本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び物質はこれから詳述するとおりである。本発明の他の特徴、目標及び利点は説明より明らかにされる。明細書において、内容について明確な特段の記載が無い限り、単数と複数を区別しない。特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての専門的および技術的な用語は本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、本明細書を優先する。
(SELEX(商標)法)
アプタマーを形成するための適当な方法は図2に一般的に示す「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment](「SELEX(商標)」)と題された方法を用いる。SELEX(商標)法は標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロの進化のための方法であり、例えば1990年6月11日に出願された米国特許出願07/536,428、現在は放棄された「Nucleic Acid Ligands」と題された米国特許5,475,096及び「Nucleic Acid Ligands」と題された米国特許5,270,163(WO91/19813も参照)に記載されている。各SELEX(商標)識別核酸リガンド、即ち、各アプタマーは所定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。SELEX(商標)法は、核酸が種々の2次元又は3次元構造を形成するための十分な能力、及び、単量体又は重合体にかかわらず実質的に如何なる化学的化合物とのリガンドとして機能する(即ち特異的結合対を形成する)ためのその単量体内で可能な十分な化学的汎用性を有しているという独特の見識に基づいている。あらゆる大きさ又は組成の分子が標的として作用できる。
SELEX(商標)法は開始点としてランダム配列を含む1本鎖オリゴヌクレオチドの大規模なライブラリ又はプールに依存している。オリゴヌクレオチドは修飾又は未修飾のDNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドであることができる。一部の例においては、プールは100%ランダム又は部分ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては、プールはランダム化された配列内に取り込まれた固定及び/又は保存された配列少なくとも1つを含有するランダム又は部分ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては、プールはオリゴヌクレオチドプールの全ての分子により共有される配列を含んでよいその5’及び/又は3’末端に固定及び/又は保存された配列少なくとも1つを含有するランダム又は部分ランダムのオリゴヌクレオチドを含む。固定された配列はPCRプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列(例えばT3、T4、T7及びSP6)、制限部位又は単独重合体配列、例えばポリA又はポリTトラクト、触媒コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、及び、目的のオリゴヌクレオチドのクローニング及び/又は配列決定を容易にするための他の配列のような配列である。保存された配列は、前述の固定配列以外には、同じ標的に結合する多くのアプタマーにより共有される配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは好ましくはランダム化された配列部分並びに効率的な増幅のために必要な固定された配列を包含する。典型的には出発プールのオリゴヌクレオチドは30〜50ランダムヌクレオチドの内部領域にフランキングする固定された5’及び3’末端の配列を含有する。ランダム化されたヌクレオチドはランダムに切断された細胞核酸からの化学合成及びサイズ選択を含む多くの方法において製造することができる。被験核酸の配列の変動もまた、選択/増幅の反復の前又は最中における突然変異誘発により導入又は増大させることができる。
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は何れかの長さであることができ、そしてリボヌクレオチド及び/又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、そして、修飾された、又は、非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体を含むことができる。例えば米国特許5,958,691;米国特許5,660,985;米国特許5,958,691;米国特許5,698,687;米国特許5,817,635;米国特許5,672,695及びPCT公開WO92/07065を参照できる。ランダムオリゴヌクレオチドは当該分野でよく知られている固相オリゴヌクレオチド合成法を用いてホスホジエステル連結ヌクレオチドから合成できる。例えばFroehler et al.,Nucl.Acid Res.14:5399−5467(1986)及びFroehler et al.,Tet.Lett.27:5575−5578(1986)を参照できる。ランダムオリゴヌクレオチドはまたトリエステル合成法のような溶液相の方法を用いて合成することもできる。例えばSood et al.,Nucl.Acid Res.4:2557(1977)及びHirose et al.,Tet.Lett.,28:2449(1978)を参照できる。自動DNA合成装置上で行われる典型的な合成では大部分のSELEX(商標)機材に対して十分な数量である1014〜1016の個々の分子が得られる。配列設計におけるランダム配列の十分大きい領域は各合成分子が独特の配列を示す可能性があるという確率を増大させる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはDNA合成装置上の自動化学合成により形成してよい。ランダム化配列を合成するためには、合成過程中の各ヌクレオチド添加工程において全ての4種のヌクレオチドの混合物を添加することによりヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。上記した通り、1つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムの配列を含む;しかしながら、別の実施形態においては、ランダムオリゴヌクレオチドは非ランダム又は部分的にランダムな配列のストレッチを含むことができる。部分的にランダムな配列は各添加工程において異なるモル比の4種のヌクレオチドを添加することにより生成できる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはRNA又はDNAの何れであってもよい。RNAライブラリを出発ライブラリとして使用したい場合は、これは典型的にはT7RNAポリメラーゼ又は修飾T7RNAポリメラーゼを用いてインビトロでDNAライブラリを転写することにより形成され、そして精製される。次にRNA又はDNAライブラリを結合に好都合な条件下に標的と混合し、そして同じ全般的選択スキームを用いながら結合、分画及び増幅の段階的反復に付すことにより、結合親和性及び選択性の実質的に如何なる所望の基準も達成できる。より詳しくは、核酸の出発プールを含有する混合物から出発する場合、SELEX(商標)法は(a)結合に好都合な条件下で標的に混合物を接触させること;(b)標的ヌクレオチドに特異的に結合している核酸から未結合の核酸を分画すること;(c)核酸−標的複合体を解離させること;(d)核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して核酸のリガンドリッチ化混合物を得ること;および(e)標的分子に対して高度に特異的で高度に親和性の核酸リガンドを得るために必要な回数、結合、分画、解離及び増幅の工程を反復すること、の工程を包含する。RNAアプタマーが選択される場合においては、SELEX(商標)法は更に(i)工程(d)における増幅の前に核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写すること;及び(ii)方法を再開する前に工程(d)由来の増幅核酸を転写すること、の工程を含む。
可能な配列及び構造の多数を含有する核酸混合物内において、所定の標的に対して広範な結合親和性が存在する。例えば20ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は420通りの候補可能性を有する。標的に対してより高い親和性定数を有するものが標的に結合する可能性が最も高い。分画、解離及び増幅の後、第2の核酸混合物が形成され、より高値の結合親和性の候補がリッチ化される。選択のラウンドを重ねるにつれ、ますます良好なリガンドの傾向が大きくなり、最終的には得られる核酸混合物は僅か1種又は数種の配列より優先的に構成される。次にこれ等をクローニング、配列決定及び純粋なリガンド又はアプタマーとしての結合親和性に関する個々の試験に付すことができる。
選択及び増幅のサイクルは所望の目標が達成されるまで反復する。大部分の一般的に場合においては、選択/増幅はサイクルの反復において結合強度の顕著な向上が達成されなくなるまで継続する。方法は典型的には約1014種の核酸物質種を採取するために使用するが、約1018種もの多数の核酸物質種が採取するために使用してもよい。一般的に、核酸アプタマー分子は5〜20サイクルの手順において選択される。1つの実施形態においては、初期の選択段階においてのみ異種性が導入され、複製過程を通じて発生しない。
SELEX(商標)の1つの実施形態においては、選択過程は選択された標的に最も強力に結合する核酸リガンドの単離において効率的であるため、選択及び増幅は僅か1サイクルを要するのみである。このような効率的な選択は、例えばクロマトグラフィー型の過程において起こりえるものであり、この場合、カラム上に結合している標的と会合する核酸の能力は、カラムが最高親和性核酸リガンドの分離及び単離を可能にするのに十分な能力を有するような態様において作動する。
多くの場合において、単一の核酸リガンドが発見されるまでSELEX(商標)の反復工程を実施することが必ずしも望まれない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多くの保存された配列及び標的への核酸リガンドの親和性に有意に影響することなく置換又は付加され得る多くの配列を有する核酸構造又はモチーフのファミリーを包含してよい。完了前にSELEX(商標)過程を終了することにより、核酸リガンド溶液ファミリーの多くのメンバーの配列を決定することが可能である。
核酸の一次、二次及び三次構造の種々のものが存在することがわかっている。非ワトソンクリック型の相互作用に関与することが最も一般的にわかっている構造又はモチーフはヘパリンループ、対称及び非対称のバルジ部、擬似ノット部及びこれ等の多数の組み合わせと称されている。このようなモチーフのほぼ全ての知られた例はそれらが30ヌクレオチド以下の核酸配列において形成できることを示唆している。この理由のため、近接ランダム化セグメントを有するSELEX(商標)操作法は約20〜約50ヌクレオチド、及び一部の実施形態においては約30〜約40ヌクレオチドのランダム化セグメントを含有する核酸配列で開始することが好ましい場合が多い。1つの実施形態において5’−固定:ランダム:3’固定配列は約30〜約50ヌクレオチドのランダム配列を含む。
コアSELEX(商標)法は特定の目的の多くのものを達成するために改変されている。例えば米国特許5,707,796はベントDNAのような特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と組み合わせたSELEX(商標)の使用を記載している。米国特許5,763,177は標的分子に対して結合及び/又は光交差結合及び/又は光不活性化が可能な光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するためのSELEX(商標)系の方法を記載している。米国特許5,567,588及び米国特許5,861,254は標的分子に対して高及び低親和性であるオリゴヌクレオチドの間の高効率の分画を達成するSELEX(商標)系の方法を記載している。米国特許5,496,938はSELEX(商標)法を実施した後に改良された核酸リガンドを得るための方法を記載している。米国特許5,705,337はリガンドをその標的に共有結合するための方法を記載している。
SELEX(商標)はまた標的分子上の1つより多い部位に結合する核酸リガンドを得るため、及び標的上の特定の部位に結合する非核酸物質種を含む核酸リガンドを得るために使用することができる。SELEX(商標)は大型及び小型の生体分子、例えば核酸結合蛋白及び自身の生物学的機能の部分としては核酸に結合することが知られていない蛋白、並びにコファクター及び他の小型分子を包含する何れかの想定される標的に結合する核酸リガンドを単離して同定するための手段を提供する。例えば米国特許5,580,737はカフェイン及び緊密に関連する類縁体であるテオフィリンに対して高い親和性で結合することができるSELEX(商標)を介して発見された核酸配列を開示している。
カウンターSELEX(商標)は非標的分子1つ以上に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することにより標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改良するための方法である。カウンターSELEX(商標)は(a)核酸候補混合物を製造すること;(b)標的に候補混合物を接触させること、その際、候補混合物に対して相対的に標的への増大した親和性を有する核酸が候補混合物の残余から分画してよいものであること;(c)増大親和性核酸を候補混合物の残余から分画すること;(d)標的から増大親和性核酸を解離させること;e)非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように非標的分子1つ以上に増大親和性核酸を接触させること;およびf)標的分子に結合する親和性及び特異性が相対的に高値である核酸配列がリッチ化された核酸混合物を得るように標的分子にのみ特定の親和性を有する核酸を増幅すること、の工程よりなる。SELEX(商標)について上記した通り、所望の目標が達成されるまで必要に応じて選択及び増幅のサイクルを反復する。
治療薬及びワクチンとして核酸を使用する場合の1つの潜在的な問題はそのホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドは所望の作用が顕在化するよりも前にエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外酵素により体液中で急速に分解されることである。即ちSELEX(商標)法は向上したインビボの安定性又は向上した送達特性のようなリガンドに対して向上した特性を与える修飾ヌクレオチドを含有する高親和性の核酸リガンドの発見を包含する。このような修飾の例はリボース及び/又はホスフェート及び/又は塩基の位置における化学的置換を包含する。修飾されたヌクレオチドを含有するSELEX(商標)により発見された核酸リガンドは例えば、リボースの2位、ピリミジンの5位及びプリンの8位において化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許5,660,985、種々の2’修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載している米国特許5,756,703、及び2’−アミノ(2’−NH)、2’−フルオロ(2’−F)及び/又は2’−OMe(2’−OMe)置換基で修飾されたヌクレオチド1つ以上を含有する高度に特異的な核酸リガンドを記載している米国特許5,580,737に記載されている。
本発明において意図される核酸リガンドの修飾は、例えば核酸リガンドの塩基又は核酸リガンド全体に更に電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用及び流動性を組み込む他の化学基を与えるものである(ただし、これらに限定されない)。ヌクレアーゼに対して耐性のオリゴヌクレオチド集団を形成する修飾はまた、置換ヌクレオチド間連結、改変された糖、改変された塩基又はこれ等の組み合わせの1つ以上を包含することができる。このような修飾は、例えば2’位の糖の修飾、5位のピリミジンの修飾、8位のプリンの修飾、環外のアミンの修飾、4チオウリジンの置換、5−ブロモ又は5−ヨード−ウラシルの置換;骨格の修飾、ホスホロチオエート及びアルキルホスフェートの修飾、メチル化及び通常でない塩基対形成の組み合わせ、例えば非天然塩基のイソシチジン及びイソグアニジンを包含する(ただし、これらに限定されない)。修飾はまたキャッピングのような3’及び5’修飾も包含できる。
1つの実施形態においてP(O)基がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、P(O)NR(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR’、CO又はCH(「ホルムアセタール」)又は3’−アミン(−NH−CH−CH−)で置き換えられたオリゴヌクレオチドが提供され、ここで各R又はR’は相互に独立してH又は置換又は未置換のアルキルである。連結基は−O−、−N−又は−S−連結を介して隣接ヌクレオチドに結合することができる。オリゴヌクレオチド内の全ての連結が同一である必要はない。本明細書においては、「ホスホロチオエート」という用語はイオウ原子1つ以上により置き換えられたホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子1つ以上を包含する。
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾された糖基を含み、例えばヒドロキシル基の1つ以上がハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、又は、エーテル又はアミンとして官能性付与されている。1つの実施形態において、フラノース残基の2’位はOMe、O−アルキル、O−アリル、S−アルキル、S−アリル又はハロ基の何れかにより置換されている。2’修飾糖の合成方法は例えばSproat, et al.,Nucl.Acid Res.19:733−738(1991);Cotten, et al.,Nucl.Acid.Res.19:2629−2635(1991);およびHobbs,et al.,Biochemistry 12:5138−5145(1973)に記載されている。他の修飾は当業者のよく知るとおりである。このような修飾はプレSELEX(商標)法修飾又はポストSELEX(商標)法修飾(以前に発見された未修飾のリガンドの修飾)であってよいか、又は、SELEX法に組み込むことにより作成してよい。
プレSELEX法修飾又はSELEX法に組み込むことにより作成されたものは、そのSELEX(商標)法標的に対する特異性及び向上した安定性、例えばインビボの安定性の両方を有する核酸リガンドを与える。核酸リガンドに対して行われるポストSELEX(商標)法修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく向上した安定性、例えばインビボの安定性をもたらす。
SELEX(商標)法は米国特許5,637,459及び米国特許5,683,867に記載の通り,選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチドの官能性単位と組み合わせることを包含する。SELEX(商標)法は更に例えば米国特許6,011,020、米国特許6,051,698およびPCT公開WO98/18480に記載の通り、選択された核酸リガンドを親油性又は非免疫原性の高分子量化合物と、診断用又は治療用の複合体中で組み合わせることを包含する。これ等の特許及び出願は広範なアレイの形状及び他の特性の、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅及び複製の特性と、そして、他の分子の所望の特性との組み合わせを記載している。
SELEX(商標)法を介した小型可撓性ペプチドとしての核酸リガンドの同定もまた開発されている。小型ペプチドは可撓性の構造を有しており、通常は複数のコンホーマーの平衡状態において溶液中に存在しており、従って当初は、結合親和性は可撓性ペプチドに結合した時点で失われるコンホーメーションエントロピーにより制限されると考えられていた。しかしながら、溶液中の小型ペプチドに対する核酸リガンドが同定されたことの現実性は、米国特許5,648,214において明らかにされた。この特許において、物質P、即ち11アミノ酸ペプチドに対して高親和性のRNA核酸リガンドが発見された。
本発明の標的に特異性及び結合親和性を有するアプタマーは典型的には本明細書に記載するSELEX(商標)法により選択される。SELEX(商標)法の部分として、次に、標的に結合させるために選択された配列を場合により最小限として、所望の結合親和性を有する最小の配列を決定する。選択された配列及び/又は最小限化された配列は場合により、配列のランダム又は指向性の突然変異誘発を行うことにより至適化させて、結合親和性を増大させるか、或いは、配列のどの位置が結合活性に必須であるかを調べる。更にまた、選択はインビボの分解に対抗してアプタマーを安定化させるために修飾されたヌクレオチドを取り込んだ配列を用いて実施できる。
2’修飾SELEX(商標)
治療薬としての使用に適するアプタマーを得るためには、インビボで安全及び安定して合成することが安価に行えるのが好ましい。野生型RNA及びDNAアプタマーは典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性のため、インビボでは安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は2’位に修飾基を導入することにより大きく増大させることができる。
フルオロ及びアミノ基は後にアプタマーを選択する元となるオリゴヌクレオチドライブラリ内に良好に取り込まれている。しかしながら、これ等の修飾は得られるアプタマーの合成コストを大きく増大させ、そして、修飾されたヌクレオチドが修飾されたオリゴヌクレオチドの分解により宿主DNA内にリサイクルされる可能性及びその後のDNA合成の基質としてのヌクレオチドの使用のために、一部の場合においては安全性の懸念を生じさせる。
本明細書の一部の実施形態において提供される2’−OMe(「2’−OMe」)ヌクレオチドを含有するアプタマーはこれ等の難点の多くを克服する。2’−OMeヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、安価に合成できる。2’−OMeヌクレオチドは生物系にユビキタスに存在するが、天然のポリメラーゼは2’−O−メチルNTPを生理学的条件下の基質として許容しないため、宿主DNAへの2’−OMeヌクレオチドのリサイクルに関する安全性の懸念が存在しない。2’−修飾アプタマーを形成するために使用されるSELEX(商標)法は、例えばそれぞれが、参照により全体が本明細書に組み込まれる「Method for in vitro Selection of 2’−OMe Substituted Nucleic Acids」と題された2002年12月3日出願の米国特許暫定出願60/430,761、2003年7月15日出願の米国特許暫定出願60/487,474、2003年11月4日出願の米国特許暫定出願60/517,039、2003年12月3日出願の米国特許出願10/729,581及び2004年6月21日出願の米国特許出願10/873,856に記載されている。
本発明は酵素的及び化学的な分解並びに熱的及び物理的な分解に対して未修飾のオリゴヌクレオチドよりも安定であるオリゴヌクレオチドを作成するための修飾ヌクレオチド(例えば2’位に修飾を有するヌクレオチド)を含有する補体蛋白C5に結合してその機能をモジュレートするアプタマーを包含する。文献には2’−OMe含有アプタマーの数例が存在する(例えばGreen et al.,Current Biology 2,683−695,1995参照)が、それらはC及びU残基が2’−フルオロ(2’−F)置換され、A及びG残基が2’−OHである修飾された転写物のライブラリのインビトロ選択により形成されている。機能的配列が発見された後、各々のAおよびG残基の2’−OMe置換に対する耐容性を試験し、そして2’−OMe残基として2’−OMe置換に耐容性であった全てのA及びG残基を有するアプタマーを再合成している。この2工程の様式で形成されたアプタマーのA及びG残基の大部分は2’−OMe残基による置換に耐容性を示したが、平均では約20%は耐容性でなかった。結果的に、この方法を用いて形成されたアプタマーは2〜4個の2’−OH残基を含有する傾向を有し、合成の安定性及びコストが結果的に犠牲となる。アプタマーの選択元であり、そしてSELEX(商標)によりリッチ化されるオリゴヌクレオチドプールにおいて使用される安定化オリゴヌクレオチドを形成する転写反応物に修飾されたヌクレオチドを組み込むこと(及び/又はその変法又は改良法、例えば本明細書に記載したもの)により、本発明の方法は選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化させる(例えば修飾されたヌクレオチドを用いたアプタマーオリゴヌクレオチドの再合成による)必要性を排除する。
1つの実施形態において、本発明はATP、GTP、CTP、TTP及びUTPヌクレオチドの2’−OH、2’−F、2’−デオキシ及び2’−OMe修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。別の実施形態において、本発明はATP、GTP、CTP、TTP及びUTPヌクレオチドの2’−OH、2’−F、2’−デオキシ、2’−OMe、2’−NH及び2’−メトキシエチル修飾の組み合わせを含むアプタマーを提供する。
別の実施形態において、本発明はATP、GTP、CTP、TTP及びUTPヌクレオチドの2’−OH、2’−F、2’−デオキシ、2’−OMe、2’−NH及び2’−メトキシエチル修飾の5通りの組み合わせを含むアプタマーを提供する。
本発明の2’修飾アプタマーは野生型ポリメラーゼよりも高値のフラノース2’位における嵩高置換基を有する修飾ヌクレオチドの一定比率の取り込みを有する修飾されたポリメラーゼ、例えば修飾T4ポリメラーゼを用いて作成する。例えば639位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化している単一突然変異体T7ポリメラーゼ(Y639F)は基質として2’デオキシ、2’アミノ−及び2’フルオロ−ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)を容易に利用し、そして種々の用途のための修飾RNAを合成するために広範に使用されている。しかしながら、この突然変異体T7ポリメラーゼは2’−OMe又は2’−アジド(2’−N)置換基のような嵩高の2’−置換基を有するNTPを容易に利用する(即ち取り込む)ことはできないとされている。嵩高の2’置換基を取り込むためには、Y639F突然変異に加えて784位のヒスチジンがアラニン残基に変化した二重T7ポリメラーゼ突然変異体(Y639F/H784A)が記載されており、修飾されたピリミジンNTPを取り込むための限定された状況において使用されている。Padilla, R.and Sousa,R.,Nucleic Acid Res.,2002,30(24):138を参照できる。784位のヒスチジンがアラニン残基に変化した単一突然変異体T7ポリメラーゼ(H784A)もまた記載されている。Padilla,et al.,Nucleic Acid Res.,2002,30:138を参照できる。Y639F/H784A二重突然変異体及びH784A単一突然変異体のT7ポリメラーゼの両方において、アラニンのようなより小型のアミノ酸残基への変化はより嵩高のヌクレオチド基質、例えば2’−Oメチル置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。
一般的に本明細書に記載した条件下においては、Y693F単一突然変異体はGTPを除くすべての2’−OMe置換NTPの取り込みのために使用でき、そしてY639F/H784A二重突然変異体はGTPを含むすべての2’−OMe置換NTPの取り込みのために使用できることが分かっている。H784A単一突然変異体は本明細書に記載した条件下において使用した場合にY639F及びY639F/H784A突然変異体と同様の特性を保有することが期待される。
2’−修飾オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチド全体として、又は修飾ヌクレオチドの部分集合として合成してよい。修飾は同じか又は異なっていることができる。全ヌクレオチドを修飾してよく、そして全てが同じ修飾を含有してよい。全ヌクレオチドを修飾してよいが、異なる修飾を含有してよく、例えば同じ塩基を含有する全ヌクレオチドが1つの型の修飾を有してよいが、他の塩基を含有するヌクレオチドが異なる型の修飾を有していてよい。全プリンヌクレオチドが1つの型の修飾を有して(又は未修飾で)よいが、全ピリミジンヌクレオチドは別の異なる型の修飾を有して(又は未修飾で)よい。このようにして、例えばリボヌクレオチド(2’−OH)、デオキシリボヌクレオチド(2’−デオキシ)、2’−F及び2’−OMeヌクレオチドを包含する修飾の何れかの組み合わせを用いて転写物又は転写物のプールを形成する。2’−OMeのC及びU及び2’−OHのA及びGを含有する転写混合物を「rRmY」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「rRmY」アプタマーと称する。デオキシAおよびG及び2’−OMeのU及びCを含有する転写混合物は「dRmY」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「dRmY」アプタマーと称する。2’−OMeのA、C及びU及び2’−OHのGを含有する転写混合物を「rGmH」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「rGmH」アプタマーと称する。2’−OMeのA、C、U及びG及び2’−OMeのA、U及びC及び2’−FのGを含有する交互に転写混合物を「オルタネーティング混合物」と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「オルタネーティング混合物」アプタマーと称する。2’−OMeのA、U、C及びGを含有し、Gの10%までがリボヌクレオチドである転写混合物を「r/mGmH」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「r/mGmH」アプタマーと称する。2’−OMeのA、UおよびC及び2’−FのGを含有する転写混合物を「fGmH」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「fGmH」アプタマーと称する。2’−OMeのA、UおよびC及びデオキシGを含有する転写混合物を「dGmH」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「dGmH」アプタマーと称する。デオキシAおよび2’−OMeのC、G及びUを含有する転写混合物を「dAmB」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「dAmB」アプタマーと称し、そして、全2’−OHヌクレオチドを含有する転写混合物を「rN」混合物と称し、そしてこれから選択されたアプタマーを「rN」又は「rRrY」アプタマーと称する。「mRmY」アプタマーは全2’−OMeヌクレオチドを含有するものであり、そして通常は可能であれば何れかの2’−OHのGと2’−OMeのGのポストSELEX置き換えによりr/mGmHオリゴヌクレオチドから誘導される。
好ましい実施形態は2’−OH、2’−デオキシ及び2’−OMeヌクレオチドの何れかの組み合わせを包含する。より好まし位実施形態は2’−デオキシ及び2’−OMeヌクレオチドの組み合わせを包含する。更により好ましい実施形態はピリミジンが2’−OMeである2’−デオキシ及び2’−OMeヌクレオチドの何れかの組み合わせを伴っている(例えばdRmY、mRmY又はdGmH)。
修飾ヌクレオチドの本発明のアプタマーへの取り込みは選択過程の前(プレ)に行う(例えばプレSELEX(商標)法の修飾)。場合により、修飾ヌクレオチドがプレSELEX(商標)法の修飾により取り込まれている本発明のアプタマーを更にポストSELEX(商標)法の修飾により修飾することができる(即ちプレSELEX(商標)法の修飾の後のポストSELEX(商標)法の修飾)。プレSELEX(商標)法の修飾はSELEX(商標)標的に対する特異性及び向上したインビボの安定性を有する修飾された核酸リガンドを与える。ポストSELEX(商標)法の修飾、即ち修飾(例えばプレSELEX(商標)法の修飾により取り込まれたヌクレオチドを有する以前に発見されたリガンドのトランケーション、欠失、置換又は付加によるヌクレオチドの修飾)はプレSELEX(商標)法の修飾により取り込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、インビボの安定性を更に向上させることができる。
ポリメラーゼが2’−修飾NTPを許容する条件において2’−修飾(例えば2’−OMe)RNA転写物のプールを形成するためには、好ましいポリメラーゼはY639F/H784A二重突然変異体又はY639F単一突然変異体である。他のポリメラーゼ、特に嵩高の2’−置換基に対して高い耐容性を示すものも本発明において使用してよい。このようなポリメラーゼのこのような能力は本明細書に開示した転写条件下に修飾ヌクレオチドを取り込むその能力について試験することによりスクリーニングすることができる。
多くの因子が本明細書に開示した方法において有用な転写条件のために重要であることがわかっている。例えば、修飾転写物の収量の増大は、得られる転写物の最初の少なくとも約6残基が全てプリンであるようにDNA転写鋳型の5’末端の固定配列の5’末端内にリーダー配列を取り込んだ場合に観察される。
修飾ヌクレオチドを取り込んだ転写物を得る場合の別の重要な因子は2’−OHのGTPの存在又は濃度である。転写は2相に分けられ、第1の相は開始であり、その間、NTPをGTP(又は他の置換グアノシン)の3’−ヒドロキシル末端に付加させることにより得られたジヌクレオチドを次に約10〜12ヌクレオチドまで伸長させ;第2の相は長鎖化であり、その間転写は最初の約10〜12ヌクレオチドの付加を超えて進行する。2’−OMeのGTPの過剰量を含有する転写混合物に付加した少量の2’−OHのGTPは、2’−OHのGTPを用いた転写をポリメラーゼが開始できるようになるためには十分であるが、いったん転写が長鎖化の相に入れば、2’−OMeと2’−OHのGTPの間の判別性の低下及び2’−OHのGTPを超えた2’−OMeのGTPの超過により、主に2’−OMeのGTPの取り込みが起こることが分かっている。
転写物への2’−OMe置換ヌクレオチドの取り込みにおける別の重要な因子は転写混合物中の2価のマグネシウム及びマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウム及び塩化マンガンの濃度の種々の組み合わせが2’−OMe転写物の収量に影響することがわかっており、マグネシウム及びマンガンの塩化物の至適濃度は2価の金属イオンと複合体形成するNTPの転写反応混合物中の濃度に依存している。最大2’置換OMe転写物の最大収量(即ち全てのA、C及びU及び約90%のGヌクレオチド)を得るためには、各NTPが0.5mMの濃度で存在する場合は約5mMの塩化マグネシウム及び1.5mM塩化マンガンの濃度が好ましい。各NTPの濃度が1.0mMである場合は、約6.5mMの塩化マグネシウム及び2.0mMの塩化マンガンの濃度が好ましい。各NTPの濃度が2.0mMである場合は、約9.6mMの塩化マグネシウム及び2.9mMの塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合においても、これ等の濃度から二倍までの変動では修飾された転写物のかなりの量がなお得られる。
GMP又はグアノシンによるプライミング転写もまた重要である。この作用は開始ヌクレオチドに対するポリメラーゼの特異性に起因する。結果として、この様式において形成された何れかの転写産物の5’末端ヌクレオチドは2’−OHのGである可能性が高い。GMP(又はグアノシン)の好ましい濃度は0.5mMであり、更に好ましくは1mMである。更にまた転写反応にPEG、好ましくはPEG−8000を含有させることは修飾ヌクレオチドの取り込みを最大限とするのに有用であることがわかっている。
転写物への2’−OMeのATP(100%)、UTP(100%)、CTP(100%)およびGTP(〜90%)(「r/mGmH」)の最大取り込みのためには、以下の条件、即ち:HEPES緩衝液200mM、DTT40mM、スペルミジン2mM、PEG−8000 10%(w/v)、TritonX−100 0.01%(w/v)、MgCl5mM(各2’−OMeNTPの濃度が1.0mMである場合は6.5mM)、MnCl1.5mM(各2’−OMeNTPの濃度が1.0mMである場合は2.0mM),2’−OMeNTP(各々)500μM(より好ましくは、1.0mM)、2’−OHGTP30μM、2’−OHGMP500μM、pH7.5、Y639F/H784AT7RNAポリメラーゼ15単位/ml、無機ピロホスファターゼ5単位/ml及び少なくとも8ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。本明細書においては、Y639F/H784A突然変異体T7RNAポリメラーゼ(又は本明細書に特記する何れかの他のT7RNAポリメラーゼ)1単位は1ナノモルの2’−OMeNTPをr/mGmH条件下にて転写物に取り込むために必要な酵素の量として定義する。本明細書においては、無機ピロホスファターゼ1単位はpH7.2及び25℃において分当たり無機オルトホスフェート1.0モルを放出する酵素の量として定義する。
転写物への2’−OMe、ATP、UTP及びCTP(「rGmH」)の最大取り込み(100%)のためには、以下の条件、即ち:HEPES緩衝液200mM、DTT40mM、スペルミジン2mM、PEG−8000 10%(w/v)、TritonX−100 0.01%(w/v)、MgCl5mM(各2’−OMeNTPの濃度が2.0mMである場合は9.6mM)、MnCl1.5mM(各2’−OMeNTPの濃度が2.0mMである場合は2.9mM),2’−OMeNTP(各々)500μM(より好ましくは、2.0mM)、pH7.5、Y639FT7RNAポリメラーゼ15単位/ml、無機ピロホスファターゼ5単位/ml及び少なくとも8ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
転写物への2’−OMeUTP及びCTP(「rRmY」)の最大取り込み(100%)のためには、以下の条件、即ち:HEPES緩衝液200mM、DTT40mM、スペルミジン2mM、PEG−8000 10%(w/v)、TritonX−100 0.01%(w/v)、MgCl5mM(各2’−OMeNTPの濃度が2.0mMである場合は9.6mM)、MnCl1.5mM(各2’−OMeNTPの濃度が2.0mMである場合は2.9mM),2’−OMeNTP(各々)500μM(より好ましくは、2.0mM)、pH7.5、Y639F/H784AT7RNAポリメラーゼ15単位/ml、無機ピロホスファターゼ5単位/ml及び少なくとも8ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
転写物へのデオキシATP及びGTP及び2’−OMeUTP及びCTP(「dRmY」)の最大取り込み(100%)のためには、以下の条件、即ち:HEPES緩衝液200mM、DTT40mM、スペルミン2mM、スペルミジン2mM、PEG−8000 10%(w/v)、TritonX−100 0.01%(w/v)、MgCl9.6mM、MnCl2.9mM,2’−OMeNTP(各々)2.0mM、pH7.5、Y639FT7RNAポリメラーゼ15単位/ml、無機ピロホスファターゼ5単位/ml及び少なくとも8ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
転写物への2’−OMeATP、UTP及びCTP及び2’−FGTP(「fGmH」)の最大取り込み(100%)のためには、以下の条件、即ち:HEPES緩衝液200mM、DTT40mM、スペルミジン2mM、PEG−8000 10%(w/v)、TritonX−100 0.01%(w/v)、MgCl9.6mM、MnCl2.9mM,2’−OMeNTP(各々)2.0mM、pH7.5、Y639FT7RNAポリメラーゼ15単位/ml、無機ピロホスファターゼ5単位/ml及び少なくとも8ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列が好ましい。
転写物へのデオキシATP及び2’−OMeUTP、GTP及びCTP(「dAmB」)の最大取り込み(100%)のためには、以下の条件、即ち:HEPES緩衝液200mM、DTT40mM、スペルミジン2mM、PEG−8000 10%(w/v)、TritonX−100 0.01%(w/v)、MgCl9.6mM、MnCl2.9mM,2’−OMeNTP(各々)2.0mM、pH7.5、Y639FT7RNAポリメラーゼ15単位/ml、無機ピロホスファターゼ5単位/ml及び少なくとも8ヌクレオチド長の全プリンリーダー配列、が好ましい。
上記の各々について、(a)転写は好ましくは約20℃〜約50℃、好ましくは約30℃〜45℃、より好ましくは約37℃の温度で、少なくとも2時間実施し、そして(b)2本鎖DNA転写鋳型50〜300nMを使用し(多様性を増大させるためにはラウンド1において200nMの鋳型を使用(dRmY転写では300nM鋳型を使用)し、そしてその後のラウンドについては、本明細書に記載した条件を用いながら至適PCR反応の1/10希釈である約50nMを使用する)。好ましいDNA転写鋳型は以下に記載する通りである(ARC254及びARC256は全2’−OMe条件下で転写し、ARC255はrRmY条件下で転写する)。
Figure 0005242918
本明細書のrN転写条件下においては、転写反応混合物は2’−OHアデノシントリホスフェート(ATP)、2’−OHグアノシントリホスフェート(GTP)、2’−OHシチジントリホスフェート(CTP)及び2’−OHウリジントリホスフェート(UTP)を含む。本発明のrN転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−OHアデノシン、2’−OHグアノシン、2’−OHシチジン及び2’−OHウリジンを含む。rN転写の好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHウリジンである配列を含む。rN転写のより好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHウリジンである配列を含む。rN転写の最も好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−OHアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの100%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−OHシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−OHウリジンである配列を含む。
本明細書のrRmY転写条件下においては、転写反応混合物は2’−OHアデノシントリホスフェート、2’−OHグアノシントリホスフェート、2’−OMeシチジントリホスフェート及び2’−OMeウリジントリホスフェートを含む。本発明のrRmY転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−OHアデノシン、2’−OHグアノシン、2’−OMeシチジン及び2’−OMeウリジンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−OHアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの100%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−OMeシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−OMeウリジンである配列を含む。
本明細書のdRmY転写条件下においては、転写反応混合物は2’−デオキシアデノシントリホスフェート、2’−デオキシグアノシントリホスフェート、2’−O−メチルシチジントリホスフェート及び2’−O−メチルウリジントリホスフェートを含む。本発明のdRmYr転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−デオキシアデノシン、2’−デオキシグアノシン、2’−O−メチルシチジン及び2’−O−メチルウリジンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−O−メチルシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−O−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−O−メチルシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−O−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾された本発明のオリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−デオキシアデノシンであり、全グアノシンヌクレオチドの100%が2’−デオキシグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−O−メチルシチジンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−O−メチルウリジンである配列を含む。
本明細書のrGmH転写条件下においては、転写反応混合物は2’−OHグアノシントリホスフェート、2’−OMeシチジントリホスフェート、2’−OMeウリジントリホスフェート及び2’−OMeアデノシントリホスフェートを含む。本発明のrGmH転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−OHグアノシン、2’−OMeシチジン、2’−OMeウリジンおよび2’−OMeアデノシンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeウリジンであり、そして、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeウリジンであり、そして、全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾されたオリゴヌクレオチドは全グアノシンヌクレオチドの100%が2’−OHグアノシンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−OMeシチジンであり、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−OMeウリジンであり、そして、全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−OMeアデノシンである配列を含む。
本明細書のr/mGmH転写条件下においては、転写反応混合物は2’−OMeアデノシントリホスフェート、2’−OMeシチジントリホスフェート、2’−OMeグアノシントリホスフェート、2’−OMeウリジントリホスフェートおよび2’−OHグアノシントリホスフェートを含む。本発明のr/mGmH転写混合物を用いて製造される得られた修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−OMeアデノシン、2’−OMeシチジン、2’−OMeグアノシン及び2’−OMeウリジンを含み、ここでグアノシンヌクレオチドの集団は最大約10%の2’−OHグアノシンを有する。好ましい実施形態においては、得られる本発明のr/mGmH修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeウリジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの10%以下が2’−OHグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeウリジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの10%以下が2’−OHグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−OMeアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−OMeシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeグアノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−OMeウリジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの10%以下が2’−OHグアノシンである配列を含む。
本明細書のfGmH転写条件下においては、転写反応混合物は2’−OMeアデノシントリホスフェート、2’−OMeウリジントリホスフェート、2’−OMeシチジントリホスフェートおよび2’−Fグアノシントリホスフェートを含む。本発明のfGmH転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−OMeアデノシン、2’−OMeウリジン、2’−OMeシチジンおよび2’−Fグアノシンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeシチジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−Fグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeシチジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−Fグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−OMeアデノシンであり、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−OMeウリジンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−OMeシチジンであり、そして、全グアノシンヌクレオチドの100%が2’−Fグアノシンである配列を含む。
本明細書のdAmB転写条件下においては、転写反応混合物は2’−デオキシアデノシントリホスフェート、2’−OMeシチジントリホスフェート、2’−OMeグアノシントリホスフェートおよび2’−OMeウリジントリホスフェートを含む。本発明のdAmB転写混合物を用いて製造される修飾オリゴヌクレオチドは実質的に全ての2’−デオキシアデノシン、2’−OMeシチジン、2’−OMeグアノシン及び2’−OMeウリジンを含む。好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeグアノシンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも80%が2’−OMeウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeグアノシンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの少なくとも90%が2’−OMeウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態においては、得られる修飾オリゴヌクレオチドは全アデノシンヌクレオチドの100%が2’−デオキシアデノシンであり、全シチジンヌクレオチドの100%が2’−OMeシチジンであり、全グアノシンヌクレオチドの少なくとも100%が2’−OMeグアノシンであり、そして、全ウリジンヌクレオチドの100%が2’−OMeウリジンである配列を含む。
それぞれの場合において、転写産物を、アプタマーを発見し、及び/又は所定の標的に対する結合特異性を有する配列の保存されたモチーフを決定するために、SELEX(商標)法におけるライブラリとして用いることが出来る。得られる配列はすでに安定しており、このステップから、安定化したアプタマーに達し結果としてさらに高度に安定したアプタマーを得るという工程が除かれる。2’−OMeSELEX(商標)法の別の利点は、得られる配列は、配列中に要する2’−OHヌクレオチドより少ない可能性が高い(必要としない場合もある)ということである。2’OHヌクレオチドが残る程度に、ポストSELEX(商標)修飾を行うことでそれらを取り除くことが出来る。
後述する通り、上記した至適条件以外の条件下でも、2’置換ヌクレオチドを完全に取り込んだ転写物の収率は、より低値とはなるがなお有用な水準である。例えば上記転写条件の変法としては以下の通りである。
HEPES緩衝液濃度は0〜1Mの範囲である。本発明はまた例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタンを含む5〜10のpKaを有する他の緩衝剤の使用も意図する。
DTT濃度は0〜400mMの範囲である。本発明の方法はまた他の還元剤、例えばメルカプトエタノールの使用も可能とする。
スペルミジン及び/又はスペルミンの濃度は0〜20mMの範囲である。
PEG−8000濃度は0〜50%(w/v)の範囲である。本発明の方法はまた他の親水性重合体、例えば他の分子量のPEG又は他のポリアルキレングリコールの使用も可能である。
TritonX−100濃度は0〜0.1(w/v)の範囲である。本発明の方法は他の非イオン系洗剤、例えばTriton−X洗剤以外のものの使用も可能である。
MgCl濃度は0.5mM〜50mMの範囲である。MnCl濃度は0.15mM〜15mMの範囲である。MgCl及びMnClは共に記載した範囲内で存在しなければならず、そして好ましい実施形態においては約10〜約3のMgCl:MnCl比で存在し、好ましくは比は約3〜5:1、より好ましくは比は約3〜4:1である。
2’−OMeNTP濃度(各NTP)は5μM〜5mMの範囲である。
2’−OHGTP濃度は0μM〜300μMの範囲である。
2’−OHGMP濃度は0〜5mMの範囲である。
pHはpH6〜pH9の範囲である。本発明の方法は修飾ヌクレオチドを取り込む大部分のポリメラーゼの活性のpH領域内で実施することができる。更にまた、本発明の方法は転写反応条件におけるキレート剤の任意の使用も可能とし、例えばEDTA、EGTA及びDTTが挙げられる。
後述する実施例において記載する通り生物学的試験により示される最も高値の親和性及び特定の結合を有する選択されたアプタマーはC5補体蛋白が病因に関与する状態を治療するための適当な治療薬である。
(補体系蛋白C5に対する結合親和性を有するアプタマー)
補体系は健康の維持において重要な役割を有するが、疾患を誘発するか、それに寄与する潜在能力を有する。即ち、治療用途のための補体系の阻害剤の開発が望まれている。補体蛋白C5の阻害剤は、それが補体活性化カスケードの古典的及び代替の経路の両方の要素であるため、開発することが特に望ましい(Matis and Rollins(1995)Nature Medicine 1(8):839−842)。従って、C5の抑制は何れかの経路により生じる補体媒介損傷を予防できる。一部の補体系蛋白、例えばC1q及びC3は微生物に対抗する正常な防御機序において、そして、免疫成分及び損傷組織のクリアランスにおいて、重要であるが;C5はこれ等の機能のためには比較的重要性が低い。即ち、C5機能は補体系の保護的役割を犠牲にすることなく短時間又は長期間に亘り抑制される。
治療用C5阻害剤はまた、C5の分解を抑制することが2種の潜在的に損傷的な補体の活動の形成を防止することからも、望ましいものである。第1にC5の分解からC5aが形成されることを抑制することは、主要な補体遊走及び血管作用性の活性を排除する。第2に、C5の分解からC5bが形成されることを抑制することは細胞溶解性のC5b−9膜攻撃複合体(MAC)の組み立てをブロックする。C5切断の抑制は白血球に対する、そして、内皮細胞のような組織に対する、C5aおよびC5bの両方の作用をブロックする(Wand(1996)Am.J.Pathol.149:1079)。
C5aおよびMACは両方ともヒトの疾患に関連する急性及び慢性の炎症に関与することがわかっており、疾患状態におけるその役割は動物モデルにおいて確認されている。C5aは補体及び好中球依存性の肺血管傷害に必要であり(Ward(1997)J.Lab.Clin.Med.129:400;Mulligan et al.,(1998)J.Clin,Invest.98:503)、そして、ショック及び熱傷における好中球及び血小板の活性化に関連している(Schmid et al.,(1997)Shock 8:119)。MACは急性の自己免疫性の重症筋無力症における筋肉の傷害(Biesecker and Gomez(1989)J.Immunol.142:2654)、移植における臓器の拒絶反応(Baldwin et al.,(1995)Transplantation 59:797;Brauer et al.,(1995)Transplantation 59:288;Takahashi et al.,(1997)Immunol.Res.16:273)、および、自己免疫性の糸球体腎炎における腎傷害(Biesecker(1981)J.Exp.Med.39:1779;Nangaku(1997)Kidney Int.52:1570)を媒介する。C5aおよびMACは両方とも急性心筋虚血(Homeister and Lucchesi(1994)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.34:17)、急性(Bednar et al.,(1997)J.Meurosurg.86:139)及び慢性のCNS傷害(Morgan(1997)Exp.Clin.Immunogenet.14:19)、体外循環の間(Sun et al.,(1995)Nucleic Acids Res.23:2909;Spycher and Nydegger(1995)Infusionsther.Transfusionsmed.22:36)および関節炎及び狼瘡のような自己免疫疾患に関連する組織傷害における白血球活性化(Wang et al.,(1996)Immunology 93:8563)に関与するとされる。
補体活性化はまた糖尿病性網膜症にも関与するとされており、網膜血管の損傷を悪化又は発症させる。低水準の構成的な補体の活性化は通常は非糖尿病性の眼において起こり、これは非糖尿病ラットの眼におけるMAC及び補体調節蛋白の存在により顕在化され、補体の調節不全が糖尿病患者で起こることを示している(Sohn et al.,(2000)IOVS 41:3492)。更にまた、C5b−9の付着が糖尿病ヒトドナー由来の網膜血管中に検出され、非糖尿病ヒトドナーでは存在せず(Zhang et al.)、CD55およびCD59の低減した発現が糖尿病網膜で観察され(Zhang et al.)、そして、グリケートされたCD59が糖尿病患者の尿中に存在するが非糖尿病患者では観察されない(Acosta et al.,(2002)PNAS 97,5450−5455)。更にまた、補体及び血管系はI型糖尿病において活性化されることがわかっている。例えばHansen,T.K.et al.,Diabetes,53:1570−1576(2004)を参照できる。C5aは免疫系及び補体系との相互作用を介して内皮細胞を活性化する。例えばAlbrecht, E.A.et al.,Am J Pathology,164:849−859(2004)を参照できる。血管系は糖尿病性網膜症を含む眼疾患において活性化される。例えばGert, V.B.et al.,Invest Opthalmol Vis Sci,43:1104−1108(2002)を参照できる。補体系はまた糖尿病性網膜症においても活性化される。例えばGert, V.B.et al.,Invest Opthalmol Vis Sci,43:1104−1108(2002)およびBadouin,C.et al.,Am J Ophthalmol,105:383−388(1988)を参照できる。
一部の実施形態においては、本発明の物質は補体蛋白C5に特異的に結合し、インビボ及び/又は細胞系の試験において補体蛋白C5の活性化を機能的にモジュレート、例えばブロックする、約15〜約60ヌクレオチド長の一連の核酸アプタマーを含む。
補体蛋白C5に特異的に結合してモジュレートすることができるアプタマーは本明細書に記載する通りである。これらのアプタマーは種々の補体関連の疾患又は障害、例えば、補体関連心臓障害(例えば心筋傷害;冠動脈バイパスグラフト(CABG)に関わるC5媒介補体合併症、例えば術後出血、全身好中球及び白血球の活性化、心筋梗塞の危険性亢進、及び亢進認知障害;再狭窄;および経皮的冠動脈介入に関わるC5媒介補体合併症)、虚血再灌流傷害(例えば心筋梗塞、脳卒中、凍傷)、補体関連炎症性障害(例えば喘息、関節炎、敗血症及び臓器移植後の拒絶反応)及び補体関連自己免疫障害(例えば重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLE))の治療、軽減及び/又は予防の低毒性、安全で効果的な治療様式を与える。C5抑制が望ましい他の適応症は例えば肺炎症(Milligan et al.,(1988)J.Clin.Invest.98:503)、体外循環補体活性化(Rinder et al.,(1995)J.Clin.Invest.96:1564)、抗体媒介補体活性化(Bieseckeret al.,(1989)J.Immunol.142:2654)、糸球体腎炎及び他の腎疾患、眼の適応症、例えばC5媒介眼組織損傷、例えば糖尿病性網膜症及び発作性夜間性ヘモグロビン尿症を包含する。これ等のアプタマーはまた診断においても使用してよい。
これ等のアプタマーは本明細書に記載する通り修飾を含んでいてよく、例えば親油性又は高分子量の化合物(例えばPEG)とのコンジュゲート形成、キャッピング部分の取り込み、修飾されたヌクレオチドの取り込み、及び、ホスフェート骨格への修飾が挙げられる。
本発明の1つの実施形態においては、C5補体蛋白に結合する単離された天然には存在しないアプタマーが提供される。一部の実施形態においては、単離された天然には存在しないアプタマーは100μM未満、1μM未満、500nM未満、100nM未満、50nM未満、1nM未満、500pM未満、100pM未満、50pM未満のC5補体蛋白に対する解離定数(K)を有する。本発明の一部の実施形態においては、解離定数は後述する実施例1に記載する通りドットブロット滴定により決定する。
別の実施形態において、本発明のアプタマーはC5補体蛋白の機能をモジュレートする。別の実施形態において本発明のアプタマーはC5の機能を抑制し、別の実施形態においてはアプタマーはC5の機能を促進する。本発明において使用されるC5補体蛋白変異体は本質的にC5補体蛋白の機能と同じ機能を行う変異体を包含する。C5補体蛋白変異体は好ましくは実質的に同じ構造を有し、そして一部の実施形態においては、以下のアミノ酸配列(配列番号102)を含むC5補体蛋白のアミノ酸配列と80%の配列同一性、より好ましくは90%の配列同一性、そして更に好ましくは95%の配列同一性を有する(Haviland et al.,J Immunol.1991 Jan 1;146(1):362−8において引用)。
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本発明の一部の実施形態においては、標的変異体の配列同一性は後述する通りBLASTを用いて測定できる。2つ以上の核酸又は蛋白の配列の関連において「配列同一性」という用語は、比較して最大の一致があるように配置し、以下の配列比較アルゴリズム又のひとつを用いるか、又は目視による検査により測定した場合に、同じであるか、又は、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定の比率を有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す。配列比較のためには、典型的には1つの配列が被験配列を比較する相手となる比較参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験及び比較参照配列はコンピューターに入力し、サブ配列の座標を必要に応じて指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、指定のプログラムのパラメーターに基づいて比較参照配列と相対比較した場合の被験配列に関するパーセント配列同一性を配列比較アルゴリズムが計算する。比較のための配列の至適アライメントは例えばSmith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによるか、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによるか、Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)の同様性検索法によるか、これ等のアルゴリズムのコンピューター処理(Wisconsin Genetic Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WisのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)によるか、又は、目視による検査(一般的に後述のAusubel et al.,参照)により実施することができる。
パーセント配列同一性を決定するために適するアルゴリズムの1つの例はベーシックローカルアライメントサーチツール(以降「BLAST」と称する)において使用されるアルゴリズムであり、Altschul et al.,J Mol.Biol.215:403−410(1990)及びAltschul et al.,Nucleic Acid Res.,15:3389−3402(1997)を参照できる。BLAST分析を行うソフトウエアはNational Center for Biotechnology Information(以降「NCBI」と称する)を介して公的に入手できる。NCBIから入手できるソフトウエア、例えばBLASTIN(ヌクレオチド配列用)及びBLASTP(アミノ酸配列用)を用いて配列同一性を決定する場合に使用されるデフォルトパラメーターはMcGinnis et al.,Nucleic Acid Res.,32:W20−W25(2004)に記載されている。
本発明の別の実施形態において、アプタマーは配列番号1〜2、5〜67、75〜81又は88〜98の何れか1つを含むアプタマーと実質的に同様のC5補体蛋白結合能力を有する。本発明の別の実施形態においては、アプタマーは配列番号1〜2、5〜67、75〜81又は88〜98の何れか1つを含むアプタマーと実質的に同様の構造及びC5補体蛋白結合能力を有する。別の実施形態において、本発明のアプタマーは配列番号2、5〜67、75〜81又は88〜98の何れか1つに従った、何れかの化学修飾も含めた配列を有する。別の実施形態においては、本発明のアプタマーは医薬組成物における活性成分として使用される。別の実施形態においては、アプタマー又は本発明のアプタマーを含む組成物は補体関連心臓障害(例えば心筋傷害;冠動脈バイパスグラフト(CABG)に関わるC5媒介補体合併症、例えば術後出血、全身好中球及び白血球の活性化、心筋梗塞の危険性亢進、及び亢進認知障害;再狭窄;および経皮的冠動脈介入に関わるC5媒介補体合併症)、虚血再灌流傷害(例えば心筋梗塞、脳卒中、凍傷)、補体関連炎症性障害(例えば喘息、関節炎、敗血症及び臓器移植後の拒絶反応)及び補体関連自己免疫障害(例えば重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLE))、肺の炎症、体外循環の補体活性化、抗体媒介補体活性化、及び眼の適応症、例えば補体媒介眼組織損傷、例えば糖尿病性網膜症よりなる群から選択される何れか1つを包含する種々の補体関連の疾患又は障害を治療するために使用される。
1つの実施形態において、本発明の抗C5アプタマーは2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−OMe修飾ヌクレオチド(「2’−OMe」)及び2’−OHプリン残基の混合物を含む。修飾された抗C5アプタマーに関する記述的包括的配列(配列番号1)は以下の表1に示す通りであり、構造は図3Aに示す。プリンの大部分(A及びG)は2’−OHのままとなっている2つのG残基(アウトラインで示す残基)を除き、2’−OMeに修飾されている。○で囲んだ残基はアプタマーの抗C5活性を大きく改変することなく2’−Hに同時に修飾できるピリミジンの部分集合を示す(下記の表1のARC330(配列番号2、図3B)参照)。図3Aの下線を付した残基は2’−フルオロ又は2’−H修飾の何れか(2’−OMeではない)を含むことが出来るピリミジン残基を示し、□で囲んだ残基は2’−フルオロ又は2’−OMe修飾の何れか(2’−Hではない)を含むことが出来るピリミジン残基を示す。矢印(→)を付した残基は2’−フルオロ修飾を含んでいなければならない。矢印(→)を付した残基において2’−フルオロ修飾がない場合、得られるアプタマーの溶血活性は実質的に低減する。好ましい実施形態においては、本発明の抗C5アプタマーは配列番号1に従ったヌクレオチド配列を含む。
本発明の抗C5アプタマーの例は図3Cに示し、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許6,395,888に記載のARC186(配列番号4)である。ARC186の全21ピリミジン残基は2’−修飾されている。プリンの大部分(14残基)は3つの2’−OHプリン残基(図3Cにおいてアウトラインで示す)を除き2’−OMe修飾を有する。本発明の抗C5アプタマーは2’−フルオロ及び2’−H修飾の種々の混合物も包含できる。例えば別の本発明の抗C5アプタマーは図3Bに示すARC330(配列番号2)である。ARC330(配列番号2)は2’−H修飾(図3Bに示す○で囲んだ残基)7個、2’−フルオロ修飾を有するピリミジン残基14個、2’−OMe修飾を有するプリン残基14個、及び2’−OHプリン残基3個を含有する(図3Bにおいてアウトラインで示す)。
2’−フルオロ修飾、2’−OMe修飾、2’−OHプリン残基の混合物を含有するアプタマーの他の組み合わせ及び種々のサイズの非免疫原性高分子量化合物(例えばPEG)へのコンジュゲート形成は、各々がARC186(配列番号4)より誘導されたものであり、以下の表1に示す通りである。本発明は以下の表1に示すアプタマー並びに3’キャップが欠如又は付加されている(例えば反転dT)以下のアプタマーを包含する。
特段の記載が無い限り、以下の表1に示すヌクレオチド配列は5’から3’の方向に列挙した。表1における個々の配列の各々につき、全ての2’−OMeプリン又はピリミジン修飾は相当するヌクレオチドの前の「m」により示し;全ての2’−フルオロピリミジン修飾は相当するヌクレオチドの前の「f」により示し;全てのプリン又はピリミジンのデオキシ修飾は相当するヌクレオチドの前の「d」により示し;そしてヌクレオチドの前に「m」、「f」又は「d」を伴わずに示されている何れのプリン又はピリミジンも2’−OH残基を示す。
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補体蛋白C5に結合する本発明の他のアプタマーは実施例3において後述する通りである。
一部の実施形態においては、本発明のアプタマー治療薬はその標的に対して高度の親和性及び特異性を有するが、アプタマー治療薬が患者又は対象の身体内で分解した場合に天然に存在しないヌクレオチドの置換に起因する望ましくない副作用は低減されている。一部の実施形態においては、本発明のアプタマー治療薬を含有する治療用組成物はフッ素化ヌクレオチドは全く含まないか低減された量のみ有する。
本発明のアプタマーは当該分野で知られた何れかのオリゴヌクレオチド合成法、例えば当該分野でよく知られた固相オリゴヌクレオチド合成(Froehler et al.,Nucl.Acid Res.14:5399−5467(1986)およびFroehler et al.,Tet.Lett.27:5575−5578(1986))および溶液相の方法、例えばトリエステル合成法(例えばSood et al.,Nucl.Acid Res.4:2557(1977)およびHirose et al.,Tet.Lett.,28:2449(1978))を用いて合成できる。
(医薬組成物)
本発明はまた、補体蛋白C5に結合するアプタマー分子を含有する医薬組成物を包含する。一部の実施形態においては、組成物は内用に適しており、そして、本発明の薬理学的に活性な化合物の治療有効量を、単独で、又は、製薬上許容しうる担体1つ又は1つより多くと組み合わせて包含する。化合物はその毒性がある場合でも極めて低値である点において特に有用である。
本発明の組成物は患者における病的状態、例えば疾患又は障害を治療又は予防するため、又は、そのような疾患又は障害の症状を軽減するために使用できる。例えば本発明の組成物は補体関連心臓障害(例えば心筋傷害;冠動脈バイパスグラフト(CABG)に関わるC5媒介補体合併症、例えば術後出血、全身好中球及び白血球の活性化、心筋梗塞の危険性亢進、及び亢進認知障害;再狭窄;および経皮的冠動脈介入に関わるC5媒介補体合併症)、虚血再灌流傷害(例えば心筋梗塞、脳卒中、凍傷)、補体関連炎症性障害(例えば喘息、関節炎、敗血症及び臓器移植後の拒絶反応)及び補体関連自己免疫障害(例えば重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLEまたは狼瘡))、肺の炎症、体外循環の補体活性化、抗体媒介補体活性化、及び眼の適応症、例えば糖尿病性網膜症に関連する病的状態を治療又は予防するために使用できる。本発明の組成物は本発明のアプタマーが特異的に結合する補体蛋白C5に関連するか、これより誘導される疾患又は障害に罹患した、又は、その素因のある対象に対して投与するために有用である。
本発明の組成物は病的状態を有する患者又は対象を治療するための方法において使用できる。本発明の方法は、補体蛋白C5へのアプタマーの結合がその生物学的機能を改変することにより病的状態が治療されるように、患者又は対象に補体蛋白C5に結合するアプタマー又はアプタマーを含む組成物を投与することを包含する。
病的状態を有する患者又は対象、即ち、本発明の方法により治療される患者又は対象は脊椎動物、特に哺乳類、更にはヒトであることができる。
実際においては、アプタマー又は製薬上許容しうるその塩は所望の生物学的活性を発揮するため、例えばアプタマー標的のその受容体への結合を抑制、標的蛋白の切断を防止するために十分な量で投与する。
本発明の1つの特徴はC5媒介補体障害の他の治療と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のアプタマー組成物は例えば1つより多いアプタマーを含有してよい。一部の実施形態においては、本発明の化合物1つ以上を含有する本発明のアプタマー組成物は、他の有用な組成物、例えば抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウィルス剤等と組み合わせて投与される。更にまた、本発明の化合物は、上記した通り、細胞毒製剤、細胞増殖抑制剤又は化学療法剤、例えばアルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂抑制剤又は細胞毒性抗生物質と組み合わせて投与してよい。一般的に、このような組み合わせにおいて使用される既知治療薬の現在使用可能な剤型が適している。
「複合療法」(又は「共同療法」)は、本発明のアプタマー組成物及び少なくとも第2の薬剤をそれらの治療薬の共同作用から有益な効果がもたらされることを意図した特定の治療計画の部分として投与することを包含する(ただし、これらに限定されない)。組み合わせの有益な効果は、例えば治療薬の組み合わせから得られる薬物動態又は薬力学的な共同作用を包含する。組み合わせにおけるこれ等の治療薬の投与は典型的には所定の期間にわたって実施する(選択された組み合わせに応じて、通常は、分、時間、日又は週単位)。
「複合療法」は、通常とは異なるが、本発明の組み合わせが偶然又は自由にもたらされる個別の単独療法の部分としてこれ等の治療薬2種以上を投与することを包含してよいものとする。「複合療法」は逐次的にこれ等の治療薬を投与することを包含することを意図し、その場合、各治療薬は異なる時点において投与され、或いは、これ等の治療薬又は少なくとも2種の治療薬の投与は実質的に同時に行う。実質的に同時の投与は例えば各治療薬の固定された比率を有する単独カプセル、又は、治療薬各々に対する単独カプセル複数を対象に投与することにより実施してよい。
各治療薬の逐次的、又は実質的に同時の投与は、何れかの適切な経路、例えば局所、経口、静脈内、筋肉内及び粘膜組織経由の直接吸収を包含する経路により実施される(ただし、これらに限定されない)。治療薬は同じ経路又は異なる経路で投与できる。例えば選択された組み合わせの第1の治療薬を注射により投与し、そして組み合わせの他の治療薬を局所投与してよい。
或いは、例えば全治療薬を局所投与してよく、或いは、全治療薬を注射により投与してよい。治療薬を投与する順序は特段の記載が無い限り厳密ではない。「複合療法」はまた更に別の生物学的に活性な成分との組み合わせにおける上記した治療薬の投与を包含することができる。複合療法が更に非薬剤の治療を含む場合は、非薬剤の投与は、治療薬と非薬剤治療の組み合わせの共同作用から有利な効果が達成される限り、何れかの適当な時点で実施してよい。例えば、適切な場合においては、非薬剤の投与を治療薬の投与から恐らくは数日又は数週間も隔たらせてもなお有利な効果が達成される。
本発明の治療薬又は薬理学的組成物は一般的には製薬上許容しうる媒体中に溶解又は分散された治療の活性成分の有効量を含む。製薬上許容しうる媒体又は担体は種々の溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗カビ剤、等張性付与剤及び吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は当該分野でよく知られている。補助的活性成分もまた本発明の治療用組成物中に配合できる。
医薬組成物又は薬理学的組成物の製造は本発明の開示を鑑みれば当業者のよく知る通りである。典型的には、このような組成物は液体の溶液又は懸濁液の何れかとしての注射液;注射の前に液体中の溶液又は懸濁液とするのに適する固体形態;経口投与用の錠剤又は他の個体;除放性カプセル;又は現在使用されている何れかの他の形態、例えば点眼液、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤等として製造してよい。手術現場における特定の領域を処置するための滅菌製剤、例えば生理食塩水系洗浄剤の外科医、内科医又は医療従事者による使用もまた特に有用である。組成物は微小装置、微粒子又はスポンジを介して送達してもよい。
製剤においては、治療薬は投薬に適合した態様において、そして、生理学的に有効な量において投与される。製剤は種々の剤型、例えば上記した注射用の液として容易に投与されるが、薬剤放出カプセル等も使用できる。
この関連においては、投与すべき活性成分の量及び組成物の容量は治療するべき宿主動物に応じて変化する。投与に必要な活性化合物の厳密な量は担当者の判断によるものであり、各個体に特定のものである。
活性化合物を分散させるために必要な組成物の最小容量を典型的には使用する。投与に適する用法も変動するが、まず化合物を投与して結果をモニタリングし、そして次に更に間隔を置いて更に制御された用量を与えることにより典型化される。
例えば、錠剤又はカプセル(例えばゼラチンカプセル)の形態における経口投与のためには、活性薬剤成分は、経口用非毒性の製薬上許容しうる不活性の担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と混合することができる。更に、所望又は必要に応じて、適当な結合剤、潤滑剤、錠剤崩壊剤及び着色剤も混合物に配合できる。適当な結合剤は澱粉、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、澱粉ペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/又はポリビニルピロリドン、天然の糖類、例えばグルコース又はベータラクトース、とうもろこし甘味料、天然及び合成のガム類、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックス等を包含する。これ等の剤型で使用する潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び/又はポリエチレングリコール等を包含する。錠剤崩壊剤は例えば澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム澱粉、寒天、アルギン酸、またはそのナトリウム塩、または発泡性の混合物などを含有する(ただし、それらに限定されない)。希釈剤は例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び/又はグリシンを包含する。
注射用組成物は好ましくは水性の等張性の溶液又は懸濁液であり、そして座剤は脂肪の乳液又は懸濁液から好都合に製造される。組成物は滅菌及び/又はアジュバント含有、例えば保存料、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤、溶液促進剤、浸透圧調節用塩及び/又は緩衝物質含有であってよい。更にまた、他の治療上価値ある物質も含有してよい。組成物は従来の混合、顆粒化又はコーティング法によりそれぞれ製造され、そして典型的には活性成分約0.1〜75%、好ましくは約1〜50%を含有する。
本発明の化合物は時間指定放出及び持続放出の錠剤又はカプセル、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップ及び乳液のような経口用剤型において投与することができる。
液体、特に注射用組成物は例えば溶解、分散等により製造できる。活性化合物を薬学的に純粋な溶媒、例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等に溶解又は混合することにより注射可能な溶液又は懸濁液を形成する。更にまた、注射前に液体に溶解するのに適する固体形態も製剤できる。
本発明の化合物は、全て医薬品分野の当該分野でよく知られている形態を用いて、静脈内(瞬時及び注入の両方)、腹腔内、経皮又は筋肉内の剤型において投与できる。注射用剤は液体の溶液又は懸濁液の何れかの従来の形態で製造できる。
皮下、筋肉内又は静脈内の注射及び注入のためには非経腸の注射投与を一般的に使用する。更にまた、非経腸投与のための1つの手法は参照により本明細書に組み込まれる米国特許3,710,795に従って一定量の用量が確実に維持されるようにした緩徐放出又は持続放出の系のインプラント処置を使用している。
更にまた本発明のために好ましい化合物は適当な鼻内のベヒクル、吸入剤の局所使用を介して鼻内投与するか、又は、当該分野でよく知られた経皮投薬用の皮膚パッチの形態を用いた経皮の経路を介して投与できる。経皮送達系の形態で投与するためには、用量の投与は当然ながら用法を通じて完結的である場合よりも継続的となる。他の好ましい局所用調製物はクリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー及びゲルを包含し、その場合、活性成分の濃度は典型的には0.01%〜15%w/w又はv/vとなる。
固体組成物の場合は、賦形剤は医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用してよい。上記した活性化合物はまた例えばポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールを担体として使用しながら座剤として製剤してもよい。一部の実施形態においては、座剤は好都合には脂肪の乳液又は懸濁液から製造する。
本発明の化合物は小型1層小胞、大型1層小胞及び多層小胞のようなリポソーム送達系の形態で投与することができる。リポソームはコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含有するリン脂質の種々のものから形成できる。一部の実施形態においては米国特許5,262,564に記載の通り、脂質成分のフィルムを薬剤の水溶液で水和させ、薬剤をカプセル化する脂質層を形成する。例えば本明細書に記載したアプタマー分子を当該分野で知られた方法を用いて構築された親油性化合物又は非免疫原性の高分子量の化合物との複合体として提供することができる。核酸関連複合体の例は米国特許6,011,020に記載されている。
本発明の化合物はまたターゲティング可能な薬剤担体としての可溶性重合体とカップリングしてよい。このような重合体はポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを包含する。更にまた、本発明の化合物は、薬剤の制御された放出を達成する場合に有用な生体分解性の重合体のクラス、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び交差結合又は両親媒性のヒドロゲルブロック共重合体とカップリングさせてよい。
所望により投与すべき医薬組成物は少量の非毒性の副次的物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤及び他の物質、例えば酢酸ナトリウム及びオレイン酸トリエタノールアミンを含有してよい。
アプタマーを利用した投薬の用法は種々の要因、例えば患者の型、種、年齢、体重、性別および医療状態;治療すべき状態の重症度;投与経路;患者の腎及び肝機能;及び使用すべき特定のアプタマー及びその塩に従って選択する。当該分野の医師又は獣医師は状態の進行を予防、逆行又は停止させるために必要な薬剤の有効量を容易に決定して処方することができる。
本発明の経口用量は、指定の作用のために使用される場合、約0.05〜7500mg/日経口量の間で変動する。組成物は好ましくは活性成分0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0及び1000.0mgを含む分割錠の形態で提供される。本発明の化合物は単回一日当たり用量において投与してよく、或いは、総一日当たり用量は1日に2回、3回又は4回の分割用量において投与してよい。
注入による投薬、鼻内投薬及び経皮の投薬の用量は、0.05〜7500mg/日の範囲とする。皮下、静脈内及び腹腔内の投薬の用量は0.05〜3800mg/日の範囲とする。
本発明の化合物の有効血漿中濃度は0.002mg/ml〜50mg/mlの範囲である。
(アプタマー治療薬の薬物動態及び生体内分布のモジュレーション)
アプタマーを含む全オリゴヌクレオチド系治療薬の薬物動態特性は所望の医薬品用途と合致するように調節することが重要である。細胞外標的に対して指向されたアプタマーは細胞内送達に関連する難点(アンチセンス及びRNAi系の治療薬の場合等)から開放されているが、そのようなアプタマーは標的の臓器及び組織に分布することがなお可能でなければならず、そして所望の用量用法に合致する時間に亘り身体内に残存(未修飾で)しなければならない。
即ち、本発明はアプタマー組成物の薬物動態に影響する物質及び方法、特に、アプタマーの薬物動態を調整する能力を提供する。アプタマー薬物動態の調整性(即ちモジュレートする能力)は修飾部分(例えばPEG重合体)のアプタマーへのコンジュゲート形成及び/又は核酸の化学組成を改変するための修飾ヌクレオチド(例えば2’−フルオロ又は2’−OMe)の取り込みを介して達成される。アプタマーの薬物動態を調整する能力は既存の治療用途の向上において、又は、新しい治療用途の開発において使用される。例えば一部の治療用途において、例えば急速な薬物クリアランス又はターンオフが望まれる抗新生物又は急性の処置状況においては、循環系内のアプタマーの滞留時間を低減することが望ましい。或いは、他の治療用途、例えば治療薬の全身循環が望ましい維持療法においては、循環中のアプタマーの滞留時間を増大させることが望ましい。
更にまた、アプタマーの薬物動態の調整性を用いて対象におけるアプタマー治療薬の生体内分布性を変える。例えば、一部の治療用途においては、組織の特定の型又は特定の臓器(又は臓器セット)をターゲティングする試みにおいて、アプタマー治療薬の生体内分布を改変することが望ましい場合がある。このような用途において、アプタマー治療薬は特定の組織又は臓器に優先的に蓄積する。他の治療用途においては、アプタマー治療薬が罹患組織に優先的に蓄積するように、所定の疾患、細胞傷害又は他の異常な病的状態に関わる細胞マーカー又は症状を示す組織をターゲティングすることが望ましい。例えば2004年3月5日出願の「アプタマー治療薬の薬物動態及び生体内分布の制御されたモジュレーション」と題された同時係争中の米国特許暫定出願60/550790に記載の通り、PEG化アプタマー治療薬が優先的に炎症組織に蓄積するように、アプタマー治療薬のPEG化(例えば20kDaのPEG重合体によるPEG化)を用いて炎症組織をターゲティングする。
アプタマー治療薬(例えばアプタマーコンジュゲート又は改変された化学特性を有するアプタマー、例えば修飾されたヌクレオチド)の薬物動態及び生体内分布のプロファイルを測定するために、種々のパラメーターをモニタリングする。このようなパラメーターは例えばアプタマー組成物の半減期(t1/2)、血漿中クリアランス(Cl)、分布容量(Vss)、濃度時間曲線下面積(AUC)、最大観察血清中又は血漿中濃度(Cmax)及び平均滞留時間(MRT)を包含する。本明細書においては、「AUC」という用語はアプタマー治療薬の血漿中濃度のアプタマー投与後時間に対するプロットの下部の面積を指す。AUC値は所定のアプタマー治療薬の生体利用性(即ちアプタマー投与後の循環中の投与アプタマー治療薬のパーセント)及び/又は総クリアランス(Cl)(即ちアプタマー治療薬は循環から除去される速度)を推定するために使用される。分布の容量はアプタマー治療薬の血漿中濃度を身体内に存在するアプタマーの量に関連付ける。Vssが大きいほどより多くのアプタマーが血漿外に存在(即ち管外遊出が大きい)することになる。
本発明はアプタマーをモジュレート部分、例えば小分子、ペプチド又は重合体の末端基にコンジュゲートすることにより、又は、アプタマーに修飾されたヌクレオチドを取り込むことにより、安定化されたアプタマー組成物のインビボの薬物動態及び生体内分布を制御された態様でモジュレートする物質及び方法を提供する。本明細書に記載したとおり、修飾部分のコンジュゲート形成及び/又はヌクレオチド化学組成を改変することは、循環中のアプタマーの滞留時間及び組織への分布の基本的特徴を改変する。
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド療法は腎濾過による排出にも付される。そのため、静脈内投与されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは典型的には濾過をブロックできない限り10分未満のインビボの半減期を示す。これは血流から出て組織にいたる急速な分布を促進することか、又は、糸球体の有効サイズカットオフを超えるようにオリゴヌクレオチドの見かけ上分子量を増大させることの何れかにより達成できる。後述するPEG重合体への小型治療薬のコンジュゲート形成(PEG化)は循環中のアプタマーの滞留時間を劇的に長時間化させ、これにより投薬頻度を低減し、血管標的に対する有効性を増大させる。
アプタマーは種々の修飾部分、例えば高分子量重合体、例えばPEG;ペプチド、例えばTat(HIVのTat蛋白の13アミノ酸フラグメント(Vives,et al.(1997),J.Biol.Chem.272(25):16010−7))、Ant(Drosophila antennapediaのホメオ蛋白の第3螺旋から誘導される16アミノ酸配列(Pietersz,et al.(2001)、Vaccine19(11−12):1397−405)、及びArg(ポリアルギニン(Arg)よりなる短い正荷電の細胞浸透性のペプチド(Rothbard,et al.(2000),Nat.Med.6(11):1253−7;Rothbard,J et al.(2002),J.Med.Chem.45(17):3612−8))及び小型分子、例えばコレステロールのような親油性の化合物にコンジュゲートできる。本明細書に記載した種々のコンジュゲートのうち、アプタマーのインビボの特性はPEG基との複合体形成により最も大きく改変される。例えば20kDaのPEG重合体との混合型の2’F及び2’−OMe修飾アプタマー治療薬の複合体形成は腎濾過を遮蔽し、健常及び炎症組織の両方へのアプタマーの分布を促進する。更にまた、20kDaのPEG重合体アプタマーコンジュゲートはアプタマーの腎濾過の防止において、40kDaPEG重合体ほぼ同様に効果的であることがわかっている。PEG化の1つの作用はアプタマーのクリアランスであるが、20kDa部分の存在により得られた延長された全身曝露もまた、組織、特に高度に灌流された臓器及び炎症部位へのアプタマーの分布を促進している。アプタマー−20kDaPEG重合体コンジュゲートはPEG化アプタマーが優先的に炎症組織に蓄積するように炎症部位にアプタマー分布を指向させる。一部の例においては、20kDaのPEG化アプタマーコンジュゲートは例えば腎細胞のような細胞の内部に到達できる。
全体として、低分子量修飾部分、例えばコレステロール及び細胞浸透性ペプチドによりもたらされるアプタマーの薬物動態及び組織分布に対する作用はヌクレオチドのPEG化又は修飾の結果としてもたらされるもの(例えば、改変された化学組成)よりも著明性が低い。理論に制約されないが、アンチセンスコンジュゲートの場合に起こるとされている血漿リポ蛋白とのコレステロール媒介会合はアプタマーコレステロールコンジュゲート折りたたみ構造の特定の意味から除外される、及び/又はコレステロール基の親油性の特徴と関連することが示唆されている。コレステロールと同様、Tatペプチドタグの存在は血流からのアプタマーのクリアランスを促進し、比較的高値のコンジュゲート濃度は48時間に腎において生じる。インビトロにおける巨大分子の細胞膜通過を媒介することが当該分野で知られている他のペプチド(例えばAnt、Arg)は循環系からのアプタマーのクリアランスを促進しないと考えられる。しかしながら、Tatと同様、Antコンジュゲートは他のアプタマーと相対比較して腎に顕著に蓄積する。理論に制約されないが、インビボの三次元折りたたみアプタマーの関連においてAnt及びArgペプチド修飾部分の不都合な存在は、これ等のペプチドがアプタマー輸送特性に影響する能力を損なう可能性がある。
修飾されたヌクレオチドはまたアプタマーの血漿中クリアランスをモジュレートするために使用できる。例えば、インビトロ及びインビボで高水準のヌクレアーゼ安定性を示すことから現世代のアプタマーに典型的なものである2’−F及び2’−OMeの安定化化学構造の両方を取り込んだ未コンジュゲートアプタマーは、未修飾アプタマーと比較した場合に、急速な血漿中からの消失(即ち急速な血漿中クリアランス)及び組織、主に腎臓への急速な分布を示す。
(PEG誘導体化核酸)
前記した通り、高分子量非免疫原性重合体を有する核酸の誘導体化は核酸の薬物動態及び薬力学的な特性を改変してそれらをより有効な治療薬とする潜在能力を有する。活性の望ましい変化は、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性の増大、腎経由濾過の低下、免疫系への曝露の低下、および身体への治療薬の分布の変化を包含する。
本発明のアプタマー組成物はポリアルキレングリコール(「PAG」)部分で誘導体化してよい。PAG誘導核酸の例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる2003年11月21日出願の米国特許出願10/718,833に記載されている。本発明で使用される典型的な重合体は、ポリ(エチレングリコール)(「PEG」)、ポリ(エチレンオキシド)(「PEO」)としても知られているもの及びポリプロピレングリコール(ポリイソプロピレングリコールも包含する)を包含する。更にまた、種々のアルキレンオキシド(例えばエチレンオキシド及びプロピレンオキシド)のランダム又はブロック共重合体も多くの用途において使用できる。大部分の一般的な形態においては、ポリアルキレングリコール、例えばPEGは、各末端においてヒドロキシル基で終わる線状の重合体:HO−CHCHO−(CHCHO)−CHCH−OHである。この重合体、アルファ−、オメガ−ジヒドロキシポリ(エチレングリコール)はHO−PEG−OHとして表すことができ、ここで−PEGという標記は以下の構造単位:−CHCHO−(CHCHO)−CHCH−を表すものとし、ここでnは典型的には約4〜約10,000の範囲である。
記載したとおり、PEG分子は2官能性であり、場合により「PEGジオール」と称される。PEG分子の末端部分は比較的非反応性のヒドロキシル部分、−OH基であり、これは化合物の反応性の部位における他の化合物へのPEGの結合のために、活性化又は官能性部分に変換することができる。このような活性化されたPEGジオールは本明細書においては、ビ活性化PEGと称する。例えば、PEGジオールの末端部分は、N−ヒドロキシスクシンイミド由来のスクシンイミジル活性エステルによる比較的非反応性のヒドロキシル部分−OHの置換により、アミノ部分との選択的反応のための活性カーボネートエステルとして官能性付与されている。
多くの用途において、本質的に非反応性の部分により一端上でPEG分子をキャッピングすることによりPEG分子を1官能性とする(又はモノ活性化する)ことが望ましい。一般的に活性化PEGに対して複数の反応部位をディスプレイする蛋白治療薬の場合は、2官能性の活性化PEGは広範な交差結合をもたらし、官能性の低い凝集物をもたらす。モノ活性化PEGを形成するためには、PEGジオール分子の末端の1つのヒドロキシル部分は典型的には非反応性のメトキシ末端部分、−OCHで置換される。PEGのもう一端の非キャッピングの末端は典型的には表面上又は蛋白のような分子の上にある反応性の部位における結合のために活性化することができる反応性の末端部分に変換される。
PAGは典型的には水及び多くの有機溶媒中の溶解性を有し、毒性はなく、免疫原性もない重合体である。PAGの1つの使用は、不溶性の分子に重合体を共有結合することにより得られるPAG分子「コンジュゲート」を可溶性とすることである。例えば、水不溶性の薬剤パクリタキセルをPEGにカップリングすると水溶性になることがわかっている(Greenwald,et al.,J.Org.Chem.,60:331−336(1995))。PAGコンジュゲートは溶解度及び安定性の増強のみではなく、分子の血中循環半減期の延長のためにも使用される場合が多い。
本発明のポリアルキル化化合物は典型的には5〜80kDの大きさであるが、アプタマー及び用途に応じて何れかの大きさのものを選択して使用することができる。本発明の他のPAG化合物は10〜80kDの大きさである。本発明の更に他のPAG化合物は10〜60kDの大きさである。例えばPAG重合体は少なくとも10、20、30、40、50、60又は80kDの大きさであってよい。このような重合体は直鎖又は分枝鎖であることができる。
生物学的に発現された蛋白の治療薬とは対照的に、核酸治療薬は典型的には活性化された単量体ヌクレオチドから化学合成される。PEG核酸コンジュゲートは同じ反復単量体の合成を用いてPEGを取り込むことにより製造してよい。例えば、ホスホアミダイト形態に変換することにより活性化されたPEGを固相オリゴヌクレオチド合成に取り込むことができる。或いは、オリゴヌクレオチド合成は反応性PEG結合部位の部位特異的取り込みにより完了することができる。最も一般的には、これは5’末端の遊離の第1アミンの付加(固相合成の最終カップリング工程において修飾ホスホアミダイトを用いて取り込む)により達成されている。この手法を用いれば、反応性のPEG(例えばアミンと反応して結合を形成できるように活性化されたもの)を精製されたオリゴヌクレオチドと組み合わせ、そしてカップリング反応を溶液中で行う。一部の実施形態においては、重合体は分枝鎖PEG分子である。更に別の実施形態においては、重合体は40kDaの分枝鎖PEGであり、例えば図4に示した1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)を参照できる。一部の実施形態においては、40kDの分枝鎖1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)が図5に示す通りアプタマーの5’末端に結合している。
治療薬の生体内分布性を改変するPEGコンジュゲート化の能力はコンジュゲートの見かけの大きさ(例えば水力学的半径として測定)を含む多くの要因に関連する。より大きいコンジュゲート(>10kDa)は腎を介する濾過をより効果的にブロックし、そして、結果的に小型のマクロ分子(例えば、ペプチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド)の血清中半減期を増大させることがわかっている。濾過をブロックするPEGコンジュゲートの能力は、PEGの大きさを約50kDaまで増大させることがわかっている(更に増大しても、半減期は腎経由排出よりはむしろマクロファージ媒介代謝により決定されることになるため、利益は小さい)。
高分子量PEG(>10kDa)の製造は困難、非効率的及び高価となる場合がある。高分子量PEG−核酸コンジュゲートの合成に向けた経路として、過去の研究は高分子量活性化PEGの形成に着目していた。そのような分子を形成するための1つの方法では、2つ以上のPEGが活性化基を担持した中央コア部に結合している分枝鎖活性化PEGの形成を行う。これ等の高分子量PEG分子の末端部分、即ち比較的非反応製のヒドロキシル(−OH)部分は、他の化合物との化合物上の反応性の部位におけるPEG1つ以上の結合のために、活性化されるか、又は官能性部分に変換される。分枝鎖活性化PEGは2つより多い末端を有し、そして2つ以上の末端が活性化されている場合は、そのような活性化高分子量PEG分子は、本明細書においては多重活性化PEGと称する。分枝鎖PEG分子の全ての末端が活性化されるわけではない場合もある。分枝鎖PEG分子の何れか2つの末端が活性化される場合、そのようなPEG分子はビ活性化PEGと称する。分枝鎖PEG分子の1末端のみが活性化される一部の場合において、そのようなPEGはモノ活性化されたと称する。この方法の1例として、後に活性化されて反応に付されるリジンコアへの2つのモノメトキシPEGの結合により製造された活性化PEGが記載されている(Harris et al.,Nature,vol.2:214−221,2003)。
本発明は多重PEG化核酸を含む高分子量PEG−核酸(好ましくはアプタマー)コンジュゲートの合成のための別の費用効果的な経路を提供する。本発明はまたPEG連結多量体オリゴヌクレオチド、例えば2量体化されたアプタマーも包含する。本発明はまたPEG安定化部分がアプタマーの異なる部分を分離するリンカーであるような、例えば高分子量アプタマー組成物の直鎖上の配置が例えば核酸−PEG−核酸(−PEG−核酸)(式中nは1以上)であるように、単一のアプタマー配列内にPEGがコンジュゲートしているような高分子量組成物に関する。
本発明の高分子量組成物は少なくとも10kDの分子量を有するものを包含する。組成物は典型的には10〜80kDの分子量の大きさを有する。本発明の高分子量組成物は少なくとも10、20、30、40、50、60又は80kDの大きさである。
安定化部分は分子であるか、分子の部分であり、これは本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態および薬力学の特性を向上させる。一部の場合においては、安定化部分は2個以上のアプタマー又はアプタマードメインを近接させるか、又は本発明の高分子量アプタマー組成物の全体的な回転の自由度を低減するような分子又は分子の一部である。安定化部分はポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールであることができ、これは直鎖又は分枝鎖の単独重合体又はヘテロ重合体であることができる。他の安定化部分はペプチド核酸(PNA)のような重合体を包含する。オリゴヌクレオチドはまた安定化部分であることもでき;このようなオリゴヌクレオチドは修飾されたヌクレオチド及び/又は修飾された結合、例えばホスホロチオエートを包含できる。安定化部分はアプタマー組成物の一体化部分であることができ、即ちアプタマーに共有結合している。
本発明の組成物は核酸部分2つ以上がポリアルキレングリコール部分の少なくとも1つに共有結合的にコンジュゲートしている高分子量アプタマー組成物を包含する。ポリアルキレングリコール部分は安定化部分として作用する。ポリアルキレングリコールが1分子内で核酸部分と合体するようにアプタマーに何れかの末端においてポリアルキレングリコール部分が共有結合している組成物においては、ポリアルキレングリコールは連結部分ということができる。このような組成物において、共有結合分子の基本的構造は直鎖上に配置した核酸−PAG−核酸を包含する。1例としては基本的構造である核酸−PEG−核酸を有する組成物である。別の例は直鎖上配置:核酸−PEG−核酸−PEG−核酸である。
核酸−PEG−核酸コンジュゲートを製造するためには核酸を予めそれが単一の反応部位を担持するように合成する(例えばモノ活性化する)。好ましい実施形態においてはこの反応部位はオリゴヌクレオチドの固相合成の最終工程として修飾されたホスホアミダイトの付加により5’末端に導入されたアミノ酸基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護及び精製の後、活性化PEGの自発的加水分解を最小限にする溶液中で高濃度に再調整される。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドの濃度は1mMであり、再調整溶液は200mMNaHCO緩衝液、pH8.3を含有する。コンジュゲートの合成は高度に精製された2官能性のPEGの緩徐な段階的添加により開始する。好ましい実施形態においては、PEGジオールはスクシンイミジルプロピオネートによる誘導体化により両端で活性化する(ビ活性化)。反応後、PEG−核酸コンジュゲートはゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーにより精製することにより、完全、部分的又は未コンジュゲートの物質種を分離する。連結された複数のPAG分子(例えばランダム又はブロック共重合体)又はより小型のPAG鎖を連結して種々の長さ(又は分子量)を得てよい。非PAGリンカーを種々の長さのPAG鎖の間に使用できる。
2’−OMe、2’−フルオロ及び他の修飾されたヌクレオチドの修飾はヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化させ、そして、そのインビボの半減期を増大させる。3’−3’−dTキャップもまたエキソヌクレアーゼ耐性を増大させる。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許5,674,685;5,668,264;6,207,816;および6,229,002を参照できる。
(反応性核酸のPAG誘導体化)
高分子量PAG−核酸−PAGコンジュゲートは1つより多い反応部位を含有する核酸との1官能性の活性化PEGの反応により製造できる。1つの実施形態において、核酸は二反応性、又は二活性化され、そして、図6に示すような3’−5’−ジ−PEG化のような従来のホスホアミダイト合成を介してオリゴヌクレオチドに導入された2つの反応性部位、即ち、5’−アミノ基および3’−アミノ基を含有する。別の実施形態において、反応性部位は、第1アミンの結合のための部位として例えばピリミジンの5位、プリンの8位、又はリボースの2’位を用いて内部の位置に導入することができる。このような実施形態においては、核酸は数個の活性化又は反応性の部位を有することができ、そして多重活性化されるといえる。合成及び精製の後、自発的加水分解を最小限にしつつオリゴヌクレオチドの反応性の部位との選択的反応を促進するような条件下にモノ活性化PEGに修飾されたオリゴヌクレオチドを混合する。好ましい実施形態においては、モノメトキシ−PEGをスクシンイミジルプロピオネートで活性化し、カップリング反応はpH8.3で実施する。ビ置換PEGの合成を行うためには、オリゴヌクレオチドに対して化学量論的に過剰量のPEGを使用する。反応後、PEG−核酸コンジュゲートをゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーで精製し、完全、部分及び未コンジュゲートの物質種を分離する。
連結ドメインはまたそれに結合したポリアルキレングリコール部分1つ以上を有することができる。このようなPAGは種々の長さを有し、そして組成物の所望の分子量を達成するために適切な組み合わせにおいて使用してよい。
特定のリンカーの作用はその化学組成及び長さの両方により影響を受ける。長すぎる、短すぎる又は標的に対して望ましくない立体及び/又はイオン相互作用を起こすリンカーはアプタマーと標的の間の複合体の形成からは除外される。核酸間の距離に行き渡るために必要な分より長いリンカーはリガンドの有効な集中を損なうことにより結合の安定性を低下させる。即ち、標的へのアプタマーの親和性を最大限にするためにはリンカーの組成及び長さを至適化する必要がある場合が多い。
本明細書において引用した全ての公開物及び特許文書は、そのような公開物及び文書が特別に、そして個々に、参照により本明細書に組み込まれる用に記載されているが如く、参照により本明細書に組み込まれる。公開物及び特許文書の引用は何れも関連する従来技術であることの受諾として意図されるものではなく、また、それらの内容及び日付に関して如何なる受諾を構成するものでもない。本発明は書面により記載したが、当業者の知るとおり、本発明は種々の実施形態において実施でき、そして上記した説明及び後述する実施例は説明を目的としており、添付する請求項を限定するものではない。
(実施例1:古典的代替補体経路における抗C5アプタマー活性)
(実施例1A:溶血試験)
CH50試験は抗体コーティングヒツジ赤血球の標準化懸濁液中の細胞の50%を溶解する血清被験試料中の補体系の能力を測定する。種々の抗C5アプタマーの存在下及び非存在下で0.2%ヒト血清の溶液を抗体コーティングヒツジ赤血球(Diamedix EZ Complement CH50 Kit,Diamedix Corp.,Miami,FL)と混合した。試験はカルシウム、マグネシウム及び1%ゼラチン(GVB++補体緩衝液)を含有するベロナール緩衝食塩水中キットのプロトコルに従って実施し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離し、未損傷の赤血球を沈殿させた。上澄みの412nmにおける光学密度(OD412)を読み取ることにより溶血の程度と比例する可溶性ヘモグロビンの放出を定量した(Green et al.,(1995)Chem.Biol.2:683−95)。アプタマーがC5活性化をブロックしたことを確認するために、一部の溶血上澄みをELISAによりC5a及びC5b−9の存在について分析した(C5b−9ELISAキット、Quidel,San Diego,CA;C5aELISAキット、BD Biosciences,San Diego,CA)。
非PEG化抗C5アプタマー(ARC186)(配列番号4)の反応混合物への添加により図7Aのグラフに示す通り用量依存的に溶血を抑制し、IC50は0.5±0.1nM(図7B参照)であり、ニトロセルロース濾過により測定したKと合致する値であった。極めて高値のアプタマー濃度(>10nM)においては、溶血の程度は本質的にバックグラウンド(血清無添加)と識別不能であり、ARC186(配列番号4)が補体活性を完全にブロックできたことが示された。20kDa(ARC657;配列番号61)、30kDa(ARC658;配列番号62)、分枝鎖40kDa(1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)(ARC187;配列番号5)、分枝鎖40kDa(2,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−1−カルバモイル)(ARC1905;配列番号67)、直鎖40kDa(ARC1537;配列番号65)及び直鎖2×20kDa(ARC1730;配列番号66)のPEG基とのARC186(配列番号4)のコンジュゲート形成はアプタマー抑制活性にほとんど影響しなかった(図7A〜図7D)。最終的に、溶血上澄みのELISA分析はこの機能的抑制がC5a放出の遮断と相関していたことを示していた。即ち、溶血データはARC186(配列番号4)及びそのPEG化コンジュゲートがC5のコンバターゼ触媒活性化をブロックすることにより機能する高度に強力な補体抑制剤であることを示している。
非PEG化物質を用いた溶血試験では抗C5アプタマーがラット、モルモット、イヌ及びブタを含む多くの非霊長類動物種由来のC5とは交差反応しないことを示していた。しかしながら顕著な抑制活性はマカクカニクイザル、マカクアカゲザル及びチンパンジー由来の血清を包含する霊長類血清のスクリーンにおいて観察された。抗C5アプタマーのインビトロの薬効はARC186(配列番号4)の30kDa−PEG類縁体であるARC658(配列番号62)を用いてカニクイザルの血清において更に調べた。併置して比較した場合(n=3)、ARC658は0.21±0.0nMのIC50でヒト補体活性を、そして、1.7±0.4nMのIC50でカニクイザル補体活性を抑制した(図8)。即ち、ARC658(配列番号62)はこの測定ではヒトと比較してカニクイザルの血清中で8±3倍低値の力価であった。
ニトロセルロースフィルター結合試験。γ−32P−ATP及びポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)と共にインキュベートすることにより5’末端において個々のアプタマーを32P標識した。放射標識アプタマーはゲル濾過とその後のポリアクリルアミドゲル電気泳動により遊離のATPから単離精製した。抗C5アプタマー親和性を測定するために、放射標識アプタマー(≦10pM)を漸増濃度(0.05〜100nM)の精製C5蛋白(Quidel,San Diego,CA)と共に1mMMgCl含有リン酸塩緩衝食塩水中、室温(23℃)及び37℃で、15分及び4時間の時間間隔でインキュベートした。結合反応はMinifold Iドットブロット、96穴真空濾過マニホールド(Schleicher&Schuell,Keene,NH)を用いてニトロセルロース濾過により分析した。(上から下に)Protranニトロセルロース(Schleicher&Schuell)、Hybond−Pナイロン(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)およびGB002ゲルブロット紙(Schleicher&Schuell)よりなる3層の濾過媒体を使用した。核酸よりも蛋白に選択的に結合するニトロセルロース層は蛋白リガンドとの複合体において抗C5アプタマーを優先的に保持していたが、非複合体化抗C5アプタマーはニトロセルロースを通過し、ナイロンに付着していた。ゲルブロット紙は単に他のフィルターの支持媒体として使用した。濾過後、フィルター層を分離し、乾燥し、りん光スクリーン(Amersham Biosciences)に曝露し、Storm 860 Phosphorimager(登録商標)ブロット画像化システム(Amersham Biosciences)を用いて定量した。
図9及び図10に示す通り、漸増C5濃度はニトロセルロース膜上に捕獲されたARC186の比率を増大させた。漸増C5濃度に対する結合ARC186の依存性は単一部位結合モデルにより十分説明される(C5+ARC186⇔C5・ARC186;%結合=Cmax/(1+K/[C5]);Cmaxは飽和時の最大%結合[C5];Kは解離定数)。15分または4時間のインキュベートの何れかの後の2温度におけるARC186結合曲線を図9及び10に示す。15分インキュベートした後、23及び37℃のARC186結合曲線は本質的に誤差範囲で差がなくなり、0.5〜0.6nMのK値となった(図9)。23と37℃の結合曲線の差はインキュベーション時間が延長するに従ってより顕著となった。4時間インキュベートした後(図10)、23℃で観察されたK値は0.08±0.01nMであり、37℃で観察されたK値は不変であった(0.6±0.1nM)。
室温における長いインキュベーション時間の必要性の根拠を調べるために、この温度における親和性を速度論的方法を用いて更に検討した。C5・ARC186の解離を示す逆反応の速度はvrev=k−1[C5・ARC186]であり、式中、vrevは速度(Mmin−1単位)でありk−1は一次解離速度定数(min−1単位)である。C5・ARC186複合体の形成を示す正方向の反応の速度はvfor=k[C5][ARC186]であり、式中、vforは速度(Mmin−1単位)でありkは二次会合速度定数(M−1min−1単位)である。データは擬一次推定を用いて分析し、1つの反応体(この場合はC5)の濃度を他方より大過剰に保持し([C5]>>[ARC186])、そしてこれは反応の過程全体にわたり本質的に不変とする。このような条件下、正方向の反応は一次過程の速度式、vfor=k’[ARC186]で表され、式中、k’=k[C5]である。
C5・ARC186の解離を分析するために、放射標識ARC(≦10pM)を室温(23℃)において1mMMgClを含有するリン酸塩緩衝食塩水中5nMC5蛋白とあらかじめ平衡化させた。解離反応は遊離のC5に対するトラップとして作用する非標識ARC186(1μM)を添加することにより開始し、結合及び遊離の放射標識ARC186のニトロセルロース濾過分画により停止した。ARC186の解離の経時変化は解離反応開始と濾過の間の時間を変化させることにより得た。ニトロセルロースフィルター上に捕獲された放射標識ARC186のパーセントの低下(C5に結合したパーセントに等しい)として観察される解離の経時変化は単一指数減衰により適切に説明され、ここで%結合ARC186=100×e−k−1となる(図11参照)。解離速度定数k−1の値はこの方法で求めれば0.013±0.02min−1となり、52±8minの半減期(t1/2=ln2/k−1)に相当する。
会合反応を分析するために、C5・ARC186の形成に関する平衡速度定数(keq)を種々の濃度のC5蛋白(1〜5nM)の存在下に測定した。複合体の形成は室温(23℃)において1mMMgCl含有PBS中C5蛋白と放射標識ARC186を混合することにより開始し、ニトロセルロース濾過分画により停止した。解離反応に関して記載した通り、反応開始と濾過の間の時間を変化させることにより複合体形成の経時変化を求めた。ニトロセルロースフィルター上に捕獲される放射標識ARC186のパーセントの増大として観察される平衡の経時変化は単一指数減衰により適切に説明され、ここで%結合ARC186=100×(1−e−k)となる。1、2および4nMのC5に対する平衡の経時変化は図12に示す通りである。予測された通り、keqの値は[C5]とともに直線的に増大する(keq(1nM)=0.19±0.02min−1;keq(2nM)=0.39±0.03min−1;keq(3nM)=0.59±0.05min−1;keq(4nM)=0.77±0.06min−1;keq(5nM)=0.88±0.06min−1)。実験条件下においては、keq、kおよびk−1の間の関係はkeq=k[C5]+k−1となった。即ち、kの推定値はkeqvs[C5]の傾きから誘導され(図12の一部参照)、この場合0.18±0.01nM−1min−1である。
これ等のデータは低C5濃度(例えば0.1nM)下においてはC5と放射標識ARC186の混合物が平衡に達するためには延長されたインキュベーションが必要であることを示している。これ等の条件下では、keq=(0.18±0.01nM−1min−1)(0.1nM)+0.013min−1=0.03min−1となり、22分の半減期に相当する。即ち、室温インキュベーション約2時間(〜5半減期)が完全(>95%)平衡のためには必要である。15分(K=0.5nM)vs4時間(K=0.08nM)インキュベーションで観察された親和性の相違により上記において示された通り、短いインキュベート時間(例えば15分)は複合体の実際の親和性を顕著に過小評価している。室温Kの別の推定値は関係式K=k−1/kに従った速度論的データから計算できる。この場合、計算されたKは0.07±0.01nMであり、これは熱力学的な方法により上記測定されたKと完全に合致している。
ARC186(配列番号4)のC5に対する特異性はまた、補体カスケードにおけるC5から上流及び下流の両方の補体成分との比較によるニトロセルロース濾過試験において評価した。結果は図13に示す通りである。アプタマーは、可溶性のC5b−9には弱い親和性(K>0.2μM)を示すが、本質的にはC5aを認識せず(K>>3μM)、その原因は恐らくはC5b成分との相互作用である。他の補体成分はアプタマーに対して中等度〜低い親和性を示す。非活性化C3は本質的にはアプタマーに結合しないが、H因子(K〜100nμM)、及び、かなり低値ではあるがC1q(K>0.3μM)は結合する。総括すれば、データは、ARC186(配列番号4)がC5bドメインの認識を主に介してヒトC5に高親和性で結合することを示している。
PEG修飾アプタマーは標的蛋白の非存在下でもなおニトロセルロースに接着するこれ等のアプタマーの傾向のため、ニトロセルロース濾過試験により容易に評価することはできない。しかしながら、これ等のアプタマーの相対的親和性は標的への結合に関して放射標識非PEG化アプタマー(≦10pM)と競合するその相当する能力から評価できる。冷(即ち非放射標識)競合物質の濃度が増大するに従い、標的蛋白に結合した放射標識アプタマーのパーセントは低下する。図14に示す通り、冷ARC186(配列番号4)またはPEG化アプタマー(ARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)およびARC187(配列番号5))の漸増濃度(0.05〜1000nM)は2nMC5蛋白の存在下の結合に関して、放射標識ARC186(配列番号4)と容易に競合する。更にまた、全4種のアプタマーの滴定曲線はほぼ重複しており、PEGコンジュゲート形成はC5についてはアプタマーの親和性に殆ど、又は全く影響しないことを示している。
(実施例1B:全血試験)
補体系の代替経路に対する抗C5アプタマーの作用を以下に記載する全血試験を用いて分析した。抗凝固剤の非存在下において、血液を正常ヒトボランティアから採取した。血液の小分量(抗凝固剤非含有)を漸増濃度のARC186(配列番号4)と共に5時間室温又は37℃でインキュベートした。試料を遠心分離して血清を単離し、そして血清中のC5bの存在をsC5b−9ELISA(C5b−9ELISAキット、Quidel,San Diego,CA)により検出した。図15に示す通り、抗補体活性は、C5b−9の生産において反映される通り、異なる温度でインキュベートした試料の間では3μMにおいて異なっていた。室温データは定量的抑制のために必要なアプタマーの濃度が3〜6μMの範囲であったことを示していたのに対し、C5の報告された濃度は約400nMであった。これ等の結果は、抗C5アプタマー(ARC186;配列番号4)の10倍モル過剰量を超過する量がC5活性の完全な抑制のためには必要であることを示唆している。
(実施例1C:チモサンによる補体活性化)
チモサンはコウボ細胞壁の多糖類成分であり、そして、代替補体カスケードの強力な活性化剤である。血液、血漿又は血清のエクスビボの試料にチモサンを添加すると、C5a及び可溶性型C5b−9(sC5b−9)を包含する補体活性化産物の蓄積が起こる。未希釈ヒト血清(Center for Blood Research,Boston,MA)、クエン酸添加ヒト全血(Center for Blood Research,Boston,MA)又はカニクイザル血清(Charles River Labs,Wilmington,MA)の試料を漸増濃度のARC653(配列番号62)、即ちARC186(配列番号4)の30KPEG類縁体でスパイクした。補体を活性化するために、10倍懸濁液のチモサン(Sigma,St.Louis,MO)を試料に最終濃度5mg/mlとなるように添加した。37℃で15分インキュベートした後、チモサン粒子を遠心分離により除去し、補体活性化の程度をC5a及び/又はsC5b−9(C5b−9ELISAキット、Ouidel,San Diego,CA;C5aELISAキット、BD Biosciences,San Diego,CA)により測定した。
アプタマーの非存在下においては、チモサン投与は血清又は全血のC5の〜50%を活性化したのに対し、未投与試料では〜1%の活性化であった。50nMまでの抗C5アプタマーの添加(血中C5濃度〜10%)はsC5b−9形成に対しては殆ど影響しなかった。しかしながら、ARC658(配列番号62)の漸増濃度でC5を更に滴定したところ、図16に示す通り用量依存的な態様でC5活性化を抑制した。ヒト血清又は全血において、定量的(〜99%)抑制が0.8〜1μMのARC658(配列番号62)で観察され、C5へのアプタマーの〜2モル等量に相当した。カニクイザルの血清において同様の抑制を達成するためにはより高濃度のアプタマーが必要であった。この場合、10μMアプタマー又はC5に対してアプタマー〜20モル等量の存在下においてのみ99%抑制が達成された。
(実施例1D:補体活性化のチュービングループモデル)
心肺バイパス回路において観察されるような外来性物質への曝露により誘導された補体活性化を抗C5アプタマーがブロックする能力を試験するために、本発明者等はNilsson等により記載されたチュービングループモデルを使用した(Gong et al,(1996)Journal of Clinical Immunology 16,222−9;Nilsson et al,(1998)Blood 92,1661−7)。TygonS−50−HL医療用/手術用チュービング(1/4”内径)を約300mm(約9ml容量)の長さに切断し、0.4単位/mLヘパリン(Celsus)及び種々の濃度のARC658(配列番号62)(0〜5μM)を含有するヒトドナー血液5mlを充填した。Gong等の記載の通り、Tygonチュービングの各長さを1本のシリコーンチュービングのループ内に入れ込んだ。チュービングループを37℃の水浴中約30rpmで1時間回転させた。次にループの内容物をEDTA(最終濃度10mM)の入ったポリプロピレン三角チューブに注ぎ込み、補体活性化をクエンチングした。貧血小板血漿を遠心分離により単離し、C5a及びC3aに関してELISA(C3a ELISAキット、Quidel, San Diego, CA;C5aELISAキット、BD Biosciences,San Diego,CA)により分析した。
アプタマー非存在下の総補体活性化はチモサン試験と比較して低値であった。典型的にはC5a濃度は1時間のインキュベート後に約6ng/ml上昇し、使用可能なC5の<1%の活性化に相当した。しかしなお、この上昇は再現性があり、ARC658(配列番号62)による滴定により抑制された。図17に示す通り300〜400nMのARC658(配列番号62)はC5活性化の99%抑制を達成するのに十分であり、血中のC5のモル濃度とほぼ同等か僅かに低値の水準であった。如何なる理論にも制約されないが、チモサンモデルと比較してこのモデルのほうがC5活性化の99%抑制を達成するためにより少量のアプタマーが必要であるが、この観察結果は2つの試験で用いられる補体活性化の刺激の実質的相違を反映していると考えられる。C3aの形成もまた対照としてモニタリングすることにより、ARC658(配列番号62)が補体カスケード中のC5よりも早期に活性化工程をブロックしなかったことを確認した。C3a濃度は1時間のインキュベート後に約4000ng/mL上昇し、使用可能なC3の約10%の活性化に相当した。C5aとは対照的に、C3a形成の用量依存性抑制はARC658(配列番号62)による滴定では殆ど観察されず、ARC658(配列番号62)が特異的にC5切断をブロックすることを示していた。
(実施例2:新規の選択及び配列)
(dRmYプールによるC5選択)
2種の選択を実施することによりヒト完全長C5蛋白に対するdRmYアプタマーを発見した。C5蛋白(Quidel,San Diego,CA又はAdvanced Research Technologies, San Diego, CA)を完全長(FL)及び部分トリプシン化(TP)の形態で使用し、両方の選択は疎水性プレートに固定化されている蛋白標的に対する直接選択とした。両方の選択によりナイーブの非選択プールと比較して完全長C5結合について顕著にリッチ化されているプールが得られる。この実施例に示す全配列は5’から3’側に示す。
プールの調製:以下の配列:TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GGTCGATCGATCGATCATCGATG(ARC520;配列番号70)を有するDNA鋳型をABI EXPEDITE(商標)DNA合成装置を用いて合成し、標準的方法により脱保護した。鋳型は、以下の5’プライマー TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(配列番号71)および3’プライマー CATCGATGATCGATCGATCGACC(配列番号72)で増幅し、次にY639F単一突然変異体T7RNAポリメラーゼを用いてインビトロ転写のための鋳型として使用した。転写は200mMHEPES、40mMDDT、2mMスペルミジン、0.01%TritonX−100 、10%PEG−8000,9.5mMMgCl、2.9mMMnCl、2.0mMNTP、2mMGMP、2mMスペルミン、0.01単位/μl無機ピロホスファターゼ及びY639F単一突然変異体T7ポリメラーゼを用いて実施した。
選択:ラウンド1において、正の選択工程をニトロセルロースフィルター結合カラム上で実施した。要約すれば、1×1015分子(0.5ナノモル)のプールRNAを100μLの結合緩衝液(1×DPBS)中、3uMの完全長C5又は2.6uMの部分トリプシン化C5と共に1時間室温でインキュベートした。RNA:蛋白複合体及び遊離のRNA分子をShleicher&Schuell(Keene,NH)から入手した0.45umのニトロセルローススピンカラムを用いて分離した。カラムは1mLの1×DPBSで予備洗浄し、次にRNA:蛋白含有溶液をカラムに添加し、2分間1500gで遠心分離機により回転させた。1mlの3回緩衝液洗浄を実施することによりフィルターから非特異的結合物を除去し、次にフィルターに結合したRNA:蛋白複合体を溶離緩衝液(7M尿素、100mM酢酸ナトリウム、3mMEDTA、予備加熱95℃)200μl洗浄2回により溶出させた。溶出したRNAを沈殿させた(2μLグリコーゲン、1容量のイソプロパノール、1/2容量のエタノール)。RNAを上記した3’プライマー(配列番号72)を用いながら製造元の説明に従ってThermoScriptRT−PCR(商標)システム(Invitrogen,Carlsbad,CA)で逆転写し、その後PCR増幅した(20mMTrispH8.4、50mMKCl、2mMMgCl、0.5uMプライマー配列番号71及び配列番号72、0.5mM各dNTP、0.05単位/μLTaqポリメラーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA))。PCR鋳型はCentricepカラム(Princeton Separations,Princeton,NJ)を用いて精製し、次のラウンドのプールを転写するために使用した。
選択のその後のラウンドにおいては、結合及び遊離のRNAの分離をNunc Maxsorp疎水性プレート(Nunc,Rochester,NY)を用いて実施した。ラウンドは完全長C5及び部分トリプシン化C5の両方の20ピコモルを100μLの1×DPBS中室温で1時間プレート表面に固定化することにより開始した。次に上澄みを除去し、ウェルを120μLの洗浄緩衝液(1×DPBS)で4回洗浄した。次に蛋白ウェルを0.1mg/mlコウボtRNA及び0.1mg/mlサケ精子DNAを競合物質として含有する1×DPBSでブロックした。使用したプールの濃度は常時蛋白濃度の少なくとも5倍過剰とした。プールRNAはまた空のウェル中室温で1時間インキュベートすることにより存在するプラスチック結合配列を除去し、次に蛋白を含まないブロックされたウェル中でインキュベートすることにより正の選択工程の前にプールから如何なる競合物質結合配列も除去されるようにした。次にプールRNAを室温で1時間インキュベートし、そして固定化されたC5に結合したRNAをRTミックス(3’プライマー、配列番号72、及び、Thermoscript RT,Invitrogen)を添加し、その後1時間65℃でインキュベートすることにより選択プレート中直接逆転写した。得られたcDNAをPCR用の鋳型として使用した(Taqポリメラーゼ、New England Biolabs)。増幅されたプール鋳型DNAを製造元の推奨する条件に従ってCentrisepカラム(Princeton Separations)で脱塩し、選択の次のラウンドのためのプールRNAの転写をプログラムするために使用した。転写されたプールは各ラウンドごとに10%ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。
選択の進行はサンドイッチフィルター結合(ドットブロット)試験によりモニタリングした。5’−32P標識プールRNA(痕跡濃度)をC5、1×DPBS+0.1mg/mltRNA及び0.1mg/mlサケ精子DNAと共に室温で30分間インキュベートし、次にドットブロット装置(Schleicher and Schuell)中のニトロセルロース及びナイロンフィルターサンドイッチに適用した。ニトロセルロースに結合したプールRNAのパーセンテージは、1点スクリーン(+/−300nMC5)を用いて概ね各3ラウンド毎に計算してモニタリングした。プールK測定値は上記した蛋白滴定及びドットブロット装置を用いて測定した。
選択データ:両方の選択はナイーブのプールと比較して10ラウンド後にリッチ化された。図18を参照できる。ラウンド10において、プールKは完全長で概ね115nMおよびトリプシン化選択で150nMとなったが、結合の程度は両方において定常状態でわずか約10%であった。R10プールはTOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、配列決定した。
配列情報:各プールから45クローンを配列決定した。R10完全長プールは単一のクローンARC913(配列番号75)により優先的に占められており、これはプールの24%までを構成しており、2セットの二重及び単一の配列が残余を構成していた。R10トリプシン化プールは同じ配列ARC913(配列番号75)の8コピーを含有していたが、プールは別の配列(AMX221.A7;46%)により優先的に占められていた。クローンARC913(配列番号75)は約140nMのKを有しており、結合の程度は20%にいたった。図19を参照できる。
表5に列挙した個々の配列は5’から3’の方向に列挙しており、与えられたdRmYSELEX(商標)条件下に選択されたアプタマーのリボヌクレオチド配列を示す。この選択から誘導された(及び配列表に反映されている通りの)本発明の実施形態において、プリン(A及びG)はデオキシであり、そしてピリミジン(U及びC)は2’−OMeである。表5に列挙した配列はキャッピングを含んでいてもいなくてもよい(例えば3’−逆方向dT)。以下に示すアプタマーの独特の配列は以下の固定配列:
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(配列番号73)の直後のヌクレオチド23で開始し、そしてそれが以下の3’固定核酸配列:GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG(配列番号74)に出会うまで進行する。
Figure 0005242918
溶血試験:補体系の古典的経路に対するARC913(配列番号75)の作用を前記した溶血試験を用いて分析し、ARC186(配列番号4)(抗C5アプタマー、陽性対照)及び非選択のdRmYプール(陰性対照)と比較した。溶血抑制の試験において、0.2%全ヒト血清の溶液を、滴定されたARC913(配列番号75)の存在下、抗体コーティングヒツジ赤血球(Diamedix EZ Cimplement CH50 Test,Diamedix Corporation,Miami,FL)と混合した。試験はカルシウム、マグネシウム及び1%ゼラチン(GVB++補体緩衝液)を含有するベロナール緩衝食塩水中で実施し、25℃で1時間インキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離した。上澄みの415nmにおける光学密度(OD415)を読み取った。溶血活性の抑制は対照と比較した場合の%溶血活性として表示する。図20を参照できる。アプタマーのIC50は約30nMと計算された。
(実施例3:組成及び配列の至適化)
(実施例3A:ARC913の最小限化)
ARC913(配列番号75)系の6種のコンストラクトを転写し、ゲル精製し、そしてC5への結合に関するドットブロットにおいて試験した。ARC954は130nMのK及び20%の結合程度を有する親クローンと同様であるのに対し、ARC874(配列番号76)は1uMのKを有するC5に結合した唯一の別のクローンであった。
表6に列挙する個々の配列は5’から3’の方向に列挙しており、与えられたdRmYSELEX条件下に選択されたアプタマーから誘導した。この選択から誘導された(及び配列表に反映されている通りの)本発明の実施形態において、プリン(A及びG)はデオキシであり、そしてピリミジン(U及びC)は2’−OMeである。表6に列挙した配列はキャッピングを含んでいてもいなくてもよい(例えば3’−逆方向dT)。
Figure 0005242918
(実施例3B:ARC913の至適化:ドープ処理された再選択)
C5結合親和性についてクローンARC913(配列番号75)を至適化すること、及び、キー結合エレメントを求めることの両方のために、ドープ処理された再選択を実施した。ドープ処理された再選択を用いて活性クローン又はミニマー内の配列の基準を調べる。選択は単一の配列に基づいて設計されている合成縮重プールを用いて実施する。縮重度は通常は70%〜85%野生型ヌクレオチドの範囲である。一般的に天然の突然変異が観察されるが、場合により配列の変化が親和性の向上をもたらす場合もある。次に複合的配列情報を用いて最小結合モチーフを発見し、至適化作業に役立てる。
プールの調製:鋳型配列GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GTTACGACTAGCATCGATG(配列番号82)はARC913(配列番号75)に基づいており、そして15%水準でドープ処理したランダム領域を起源とする各残基を用いて合成され、即ち、各ランダム(「N」)位置において、残基は野生型配列CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG(配列番号83)に存在するヌクレオチドである可能性85%であり、他の3ヌクレオチドの1つである可能性15%である。
ドープ処理再選択のための鋳型及びRNAプールは本質的に上記した通り調製した。鋳型は、taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(配列番号84)及び、CATCGATGCTAGTCGTAAC(配列番号85)のプライマーを用いて増幅した。2選択は完全長C5を用いて行い、1選択は洗浄工程においてより高濃度の塩を用いた。選択プロトコルは以下の2つの例外、即ち1)ラウンド1は正の工程のみによる疎水性プレート(全ての後のラウンドも同様)上で実施し;そして2)選択中は競合物質は全く使用しなかったことを除き前述の通り行った。C5濃度およびRNAプール濃度はそれぞれ200nM及び1uMで一定に保持した。
ドープ処理再選択データ。通常及び高値の塩の選択によりナイーブプールと比較して5ラウンド後にリッチ化された。ラウンド5において、プールのKは高値の塩の選択では約165nMであり、通常の塩の選択では175nMであった。結合の程度は両方において平衡時に約20%であった。R4プールはTOPOTAクローニングキット(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いてクローニングし、各プールから48クローンを配列決定した。各プールの12クローンを転写し、500nMC5において1点ドットブロット試験において試験した。解離定数(K)を再度前述のドットブロットを用いて測定した。Kは式:結合RNA画分=増幅度/(K+[C5])にデータをフィットさせることにより1点スクリーンにおいて発見された最良11クローンについて推定した。最良3Kを有するクローンは配列番号91(73nM)、配列番号96(84nM)及び配列番号95(92nM)であった。これ等の11クローンの配列を以下の表7に示す。表7に列挙した各配列は5’から3’の方向に列挙しており、与えられたdRmYSELEX条件下に選択されたアプタマーのヌクレオチド配列を示す。この選択から誘導された(及び配列表に反映されている通りの)本発明の実施形態において、テキスト中に示す通り、相当する配列は残基のdRmYの組み合わせを含み、ここでプリン(A及びG)はデオキシであり、そしてピリミジン(U及びC)は2’−OMeである。
表7に列挙した配列はキャッピングを含んでいてもいなくてもよい(例えば3’−逆方向dT)。以下に示すアプタマーの独特の配列は以下の5’固定配列:GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(配列番号86)の直後のヌクレオチド23で開始し、そしてそれが以下の3’固定核酸配列:GUUACGACUAGCAUCGAUG(配列番号87)に出会うまで進行する。
Figure 0005242918
(実施例3C:ARC186の40kDa分枝鎖PEG修飾)
下記オリゴヌクレオチド:
Figure 0005242918
(配列番号63)を標準的な市販の2’−OMeRNA及び2’−FRNA及びTBDMS保護RNAホスホアミダイト(Glen Research,Sterling,VA)及び逆方向デオキシチミジンCPG支持体を用いながら、推奨された製造元による操作法に従ってExpedite DNA合成装置(ABI,Foster City,CA)上で合成した。末端アミン官能基は5’−アミノ−修飾物質C6−TFA(Glen Research,Sterling,VA)により結合した。脱保護の後、オリゴヌクレオチドをSuperQ5PW(30)樹脂(Tosho Biosciences)上のイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、エタノール沈殿させた。
アミン修飾アプタマーを種々のPEG部分に合成後コンジュゲートした。アプタマーを1.5〜3mMの濃度となるように水/DMSO(1:1)溶液に溶解した。炭酸ナトリウム緩衝液pH8.5を最終濃度100mMとなるように添加し、オリゴを等しい容量のアセトニトリルに溶解した所望のPEG試薬(例えばARC1905 40kDaSunbright GL2−400NP p−ニトロフェニルカーボネートエステル[NOF Corp,Japan]又はARC187 40kDamPEG2−NHSエステル[Nektar,Huntsville AL])の1.7モル過剰量と一夜反応させた。得られた生成物をSuperQ5PW(30)樹脂(Tosho Biosciences)上のイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、AmberchromCG300−S樹脂(Rohm and Haas)上の逆相クロマトグラフィーを用いて脱塩し、そして凍結乾燥した。ARC187(配列番号5)の構造は図21に示し、ARC1905(配列番号67)は図22に示す。
(実施例4)
(単離灌流心臓モデル)
(実施例4A:ARC186の原理の証明)
ヒト血漿中の補体成分C5の平均濃度は約500nMである。6%ヒト血漿へのKrebs Heinseleit緩衝液で灌流した単離マウス心臓の曝露により、ヒト補体カスケードが活性化され、C5からC5a及びC5bへの分解が起こる。成分C5bはその後「膜攻撃複合体」(「MAC」又はC5b−9)としても知られている補体成分C6、C7、C8及びC9との複合体を形成し、これは心臓血管及び心筋細胞を損傷し、これにより心筋機能不全(亢進拡張末期圧力、不整脈)及び収縮不全をもたらす(Evans et al.,Molecular Immunology,32,1183−1195(1995))。以前にヒトC5切断をブロックするモノクローナルの1本鎖抗体(ぺキセリツマブ又はぺキセリツマブの1本鎖scFv型)がこのモデルにおいて試験され、心筋の損傷及び機能不全を抑制することがわかっている(Evans et al,1995)。
このモデルを用いてC5ブロッキングアプタマーARC186(配列番号4)がぺキセリツマブのように単離灌流マウス心臓に対するヒトC5媒介補体損傷を抑制することを明らかにした。C57B1/6マウスはCharles River Laboratories(Wilmington,MA)より購入した。要約すれば、深麻酔誘導の後、各マウス心臓を摘出し、大動脈内に挿入した閉塞針上に搭載し、これを介して心臓を持続的にKrebs Heinseleit緩衝液で灌流した。圧変換器(Mouse Specifics,Bostin,MA)を左心室に挿入し、心拍数及び心室内圧力を持続的に測定できるようにした。ベースライン測定を行った15分の平衡期間の後、心臓はその後緩衝液及び6%ヒト血漿+/−アプタマーの種々の濃度と共に灌流した。これ等の試験の間、そしてEvans等が記載したとおり、本発明者等はKrebs Heinseleit緩衝液+6%ヒト血漿で灌流した心臓が灌流液への血漿の添加の5分以内に障害を起こしたのに対し、緩衝液のみで持続的に灌流した心臓は2時間超拍動を継続したことを明らかにした。従って、各実験の長さは任意に15分と決定した。ARC186を用いたこの試験の概略は図23に示す通りである。
心室内圧力は継続的にモニタリングして記録することにより圧力波追跡を行った(図24及び25)。最低動揺点は拡張末期圧力(EDP)を示し、最高動揺点は収縮期圧力(SP)を示す。ベースライン圧力波は各追跡において示される「0」とマークされた垂直の黒線の左に生じる。以前に報告されている通り(Evans et al,1995)、6%ヒト血漿と共に灌流した心臓は左心室拡張末期圧力の急速な上昇を経験し、最終的には5分以内に収縮不全(心停止)に至った(図24)。無関連のアプタマーを50倍モル過剰量でヒト血漿に添加した場合、上昇したEDP及び収縮不全がやはり観察された(図24)。
ARC186をモル等量で系に添加した場合、EDPの急激な上昇が起こり、収縮不全に至った(図25)。補体媒介損傷、上昇EDP及び収縮不全を経験した心臓の全3群において、心臓は目視によれば浮腫を示しており、実験終了時には腫脹していた。ARC186を血漿に10倍又は50倍(図25)モル過剰量で添加した場合、心室圧力波は正常に維持され、収縮不全は観察されなかった。更にまた、以前に記載した浮腫及び腫脹はこれ等の群では現れなかった。
各実験の間、心拍数を5分間隔で記録し、各間隔の群の平均心拍数をグラフ化した。図26に示す通り、アプタマーを伴うことなく、又は、非関連のアプタマーを伴って灌流した心臓は急速に、通常は5分以内に収縮不全を発症した。モル等量で系に添加したARC186は収縮不全の発症を僅かに遅延させた。しかしながらこの群の心臓は最終的には障害を起こした。10倍又は50倍モル過剰量で血漿に添加したARC186は各実験の間心拍数を温存した。
ベースラインを超える心臓重量のパーセント増大は障害心臓(アプタマー非存在又は非関連アプタマーの50倍モル過剰)の代表的試料について計算し、ARC186保護心臓(ARC186の10倍及び50倍モル過剰)と比較した。図27に示す通り、ARC186保護心臓は対照群における障害心臓よりも有意に低値の重量増加を示した。
ARC186はC5の切断は抑制するがC3は抑制しないため、C3切断産物(C3a)はARC186により保護された単離心臓からの流出物中に存在し、C5切断産物(C5a又はC5b)は存在しないはずである。ARC186がヒト血漿C5の切断を抑制することを直接示すために、ヒト補体蛋白C5a及びC5b(C5切断産物)及びC3a(C3切断産物)の相対量を、市販のELISAキットにより種々の群からの緩衝液流出物中で測定した(C5b−9ELISAキット、Quidel,San Diego,CA;C5aおよびC3aELISAキット、BD Biosciences,San Diego,CA)。ARC186はヒト血漿C5切断、及びC5a(図28)及びC5b−9(図29)の生成を用量依存的な態様で抑制した。これとは対照的に、ARC186はヒトC3からC3aおよびC3bへの分解に対して作用を有さず(図30)、分子のC5特異性が更に明らかにされた。
形成後、補体C3b及びC5bのフラグメントは補体活性化の部位の近接部の組織上に局所的に付着する。実験終了後、マウス心臓をOCT培地(Sakura Finetek,Torrance,CA)中に凍結し、切片化し、次にヒトC3b(クローンH11、Chemicon,Temecula,CA)、ヒトC5b−9(クローンaE11、DAKO,Carpinteria,CA)又は対照マウスIgG(Vector Laboratories,Burlingame,CA)の存在について、標準的な免疫組織化学的方法を用いて染色した。試験の結果を図31に示す。
本試験において説明した通り、補体系に対する抗C5抗体であるぺキセリツマブの作用を試験した以前に公開されている試験(Evans,Molecular Imunol.32:1183,(1995))において記載されたモデルに基づき、Krebs Heinseleit緩衝液及び6%ヘパリン添加ヒト血漿で灌流した単離マウス心臓を使用する補体成分C5媒介組織損傷のエクスビボモデルにおいて、C5ブロッキングアプタマーARC186を試験した。このモデルを用いた場合、C5ブロッキングアプタマーは(a)ヒト血漿中C5の切断を抑制し(C3は抑制せず)、(b)マウス心臓組織上のヒトC5bの付着を抑制せず(C3は抑制せず)、そして、(c)臨床的に該当する濃度(5μM、アプタマーvsC5で10倍モル過剰量)でヒトC5b−9媒介心筋機能不全を抑制したことが明らかにされた。これ等のデータはヒト補体カスケードを生理学的に該当する態様で活性化した場合、C5ブロッキングアプタマーは血漿中C5の分解を抑制し、新規の損傷及び機能不全を防止することを示している。
(実施例4B:PEG化アプタマーの薬効)
本試験において使用した材料及び方法は上記実施例4Aに記載したものと全く同様であった。実験設計及び結果は図32に示す。実験の前半ではヒトヘパリン添加血漿(Center for Blood Research,Harvard,Medical School,Boston,MA)を補体原料として使用し、そして後半ではヘパリン添加マカクカニクイザル血漿(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)を補体原料として使用した。PEG化アプタマー(ARC658;配列番号62)を漸増モル比で系に添加した。該当する心室圧力追跡の全てを収集したが、表は拡張末期圧力(EDP)の増大の有無、収縮不全の発生の有無、及び、心不全(上昇EDP及び収縮不全の存在として定義)までの時間を列挙している。
ヒト血漿を用いた実験の間、ARC658(配列番号62)の至適用量はモル等量(500nM)であることがわかったが、非ヒト霊長類血漿を用いた実験の間ではC5b媒介損傷から心臓を保護するためには50倍モル過剰(25μM)が必要であった(図32参照)。
これ等のデータはインビトロデータにより示されるヒトvs非ヒト霊長類の抗C5アプタマーの親和性の差に合致している。理論に制約されないが、実施例5に記載する本発明者等の後のマカクカニクイザルPK/PD試験においては、本発明者等は更にチモサン媒介血漿中C5切断を抑制するためには30倍モル過剰量のアプタマーが必要であることを明らかにしており、ヒトC5よりも低い親和性で霊長類C5にアプタマーが結合するという考えを更に裏付けている。
総括すれば、これ等の試験はC5ブロッキングアプタマーARC186(配列番号4)及び更に高い水準でARC658(配列番号62)がマウス単離灌流心臓モデルにおいて効果を有していることを示している。このモデルはまたマカクカニクイザル血漿中C5媒介心臓損傷(30+モル過剰)を抑制するためには、ヒトC5媒介心臓損傷(モル等量)と比較して顕著により多い量のARC658(配列番号62)を使用しなければならないことを示しており、霊長類C5に対して低値の親和性をアプタマーが有していたことを示すインビトロのデータを更に裏付けている。最後に、これ等のデータは、PK/PD試験中のインビボのC5ブロッキングを明らかにするためには30倍モル過剰量を超えてマカクカニクイザルに投与しなければならないことを示している。
(実施例5:動物における抗C5アプタマーの薬剤代謝及び薬物動態)
実施例5A〜5Gにおいて、全ての質量に基づいた濃度のデータはPEGコンジュゲート形成により生じる質量とは無関係に、アプタマーのオリゴヌクレオチド部分の分子量のみを指す。
(実施例5A:霊長類及びラットの血漿中のC5阻害剤ARC186の代謝安定性)
アプタマーの非PEG化オリゴヌクレオチド前駆体(即ちARC186;配列番号4)をラット及びマカクカニクイザル血漿(Charles River Labs,Wilmington,MA)中において試験することによりその安定性、速度動態、及び分解経路を調べた。試験は50時間の過程に亘り、95%プール血漿(クエン酸添加)中37℃でインキュベートした5’末端放射標識(32P)アプタマーを用いて実施した。選択された時点において、アプタマー含有血漿の一部を採取し、液体窒素中急速凍結し、そして−80℃で保存した。血漿中のアプタマー及びその代謝産物の検出及び分析は液−液(フェノール−クロロホルム)抽出、ついでゲル電気泳動(10%変性ポリアクリルアミド配列決定ゲル上)及び高解像度オートラジオグラフィーを用いて行った。
図33はラット及びマカクカニクイザルの両方の血漿中のインキュベーション時間の関数としての完全長アプタマーの残存パーセントの片対数プロットを示す。両動物種における分解のプロファイルは本質的に1相性であり、速度定数は約k〜0.002hr−1であった。
(実施例5B:静脈内投与後のラットにおけるARC657、ARC658及びARC187の薬物動態)
ARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)の薬物動態プロファイルを調べるため、及び、霊長類及びヒトにおける必要な投薬水準及び頻度を推定するために、薬物動態試験をカテーテル処置したSprague−Dawleyラット(Charles River Labs,Wilmington,MA)において実施した。アプタマーは標準的生理食塩水中に10mg/ml(オリゴ重量)となるように注射用に製剤し、濾過滅菌(0.2μm)して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填した。ラット試験に対して使用した投与経路は10mg/kgの用量における尾部静脈を介した静脈内瞬時投与とした。試験方法は群当たり3匹とし、これより投与前及び48時間の過程に亘る特定の時点において一連の採血を行った。試験設計は図34に概説する。血液試料は外科的にインプラント処置された頸静脈カテーテルから採取し、直接EDTAコーティングチューブに移し、反転させて混合し、血漿の処理まで氷上に置いた。
5分間5000rpmで血液EDTAチューブを遠心分離することにより血漿を回収して新しい標識前試験管に上澄み(血漿)を移した。血漿試料は分析時まで−80℃で保存した。ARC187の血漿試料の分析は市販の蛍光核酸検出試薬Oligreen(商標)(Molecular Probes,Eugene,OR)を含有する試験ウェルに血漿の小区分を直接添加することにより均質な試験フォーマットを用いて行った。遮光して室温で短時間(5分)のインキュベートの後、試験プレートを蛍光プレートリーダー(SpectraMax Gemini XS,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)により読み取った。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル中のアプタマー濃度に比例しており、試料濃度は蛍光−濃度標準曲線から蛍光値を当てはめることにより計算した(2連又は3連の曲線の平均値)。平均血漿中濃度は各群3匹から各時点において得た。血漿中濃度vs時間のデータを産業用標準薬物動態モデリングソフトウエアWinNonLin(商標)v.4.0(Pharsight Corp.,Mountain View,CA)を用いたノンコンパートメント分析(NCA)に付した。推定値は以下の基本的薬物動態パラメーター、即ち、最大血漿中濃度、Cmax;濃度−時間曲線下面積、AUC;終末期半減期、t1/2;終末期クリアランス、Cl;及び定常状態における分布容量、Vssについて求めた。
平均血漿中濃度vs時間のデータは図35に示す通りであり、図36にプロットした。濃度vs時間のデータをWinNonLin(商標)v.4.0を用いたノンコンパートメント分析(NCA)に付した。この分析は図37に示す数値をもたらした。
予測された通り、40kDaアプタマーARC187(配列番号5)は最長の半減期を有し、そして20kDaのアプタマーARC657(配列番号61)が最短であった。既知血漿容量(〜40ml/kg)に対して観察されたVssは血管外空間における蛋白及び/又は組織マトリックスに対するARC187(配列番号5)の中等度の結合/封鎖を示唆していた。アプタマーの5倍モル過剰量を維持する必要があると仮定すれば、この試験の結果は所望の血漿中濃度を維持するために必要なアプタマーの投与頻度及び総量の点においてARC187(配列番号5)が多大な利点をもたらすことを示唆している。
同様の組成のアプタマーを用いたげっ歯類及び霊長類における以前の試験(データ示さず)は30mg/kgまでの用量では正比例/直線性を示しており、この用量水準が非直線的な薬物動態の挙動をもたらすとは考えられない。
(実施例5C:静脈内投与後のマウスにおけるARC187及びARC1905の薬物動態)
ARC187(配列番号5)の場合とは異なる40kDaの分枝鎖PEGにコンジュゲートしたARC186(配列番号4)オリゴヌクレオチド骨格の薬物動態プロファイルを評価するために、雌性CD−1マウス(Charles River Labs,Wilmington,MAより入手)において薬物動態試験を実施した。アプタマーは標準的生理食塩水中に2.5mg/ml(オリゴ重量)となるように注射用に製剤し、濾過滅菌(0.2μm)して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填した。マウス試験に対して使用した投与経路は10mg/kgの用量における尾部静脈を介した静脈内瞬時投与とした。試験方法は群当たり3匹とし、これより投与前(即ち非投与対照群)及び72時間の過程に亘る特定の時点において末端血液を採取した。試験設計は図38Aに概説する。
血液試料は末端心穿刺により採取し、EDTAコーティングチューブに直接移し、反転させて混合し、血漿の処理まで氷上に置いた。5分間5000rpmで血液EDTAチューブを遠心分離することにより血漿を回収して新しい標識前試験管に上澄み(血漿)を移した。血漿試料は分析時まで−80℃で保存した。ARC187及び1905の血漿試料の分析は市販の蛍光核酸検出試薬Oligreen(商標)(Molecular Probes,Eugene,OR)を含有する試験ウェルに血漿の小区分を直接添加することにより均質な試験フォーマットを用いて行った。遮光して室温で短時間(5分)のインキュベートの後、試験プレートを蛍光プレートリーダー(SpectraMax Gemini XS,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)により読み取った。各ウェルからの蛍光シグナルはウェル中のアプタマー濃度に比例しており、試料濃度は蛍光−濃度標準曲線から蛍光値を当てはめることにより計算した(2連又は3連の曲線の平均値)。平均血漿中濃度は各群3匹から各時点において得た。血漿中濃度vs時間のデータを産業用標準薬物動態モデリングソフトウエアWinNonLin(商標)v.4.0(Pharsight Corp.,Mountain View,CA)を用いたノンコンパートメント分析(NCA)に付した。推定値は以下の基本的薬物動態パラメーター、即ち、最大血漿中濃度、Cmax;濃度−時間曲線下面積、AUC;終末期半減期、t1/2;終末期クリアランス、Cl;及び定常状態における分布容量、Vssについて求めた。平均血漿中濃度vs時間のデータは図38Bに示す通りである。
濃度vs時間のデータをWinNonLin(商標)v.4.0を用いたノンコンパートメント分析(NCA)に付した。この分析は図38Cに示す数値をもたらした。予測された通り、両方の入手元の40kDaPEGはマウスにおいて薬物動態の同等性を示した。
(実施例5D:静脈内瞬時投与後のマウスにおけるC5阻害剤ARC657、ARC658及びARC187の組織取り込み試験)
雌性CD−1マウスはCharles River Labs(Wilmington,MA)より入手した。注射用のARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)の製剤は生理食塩水中5mg/mlとした。投薬製剤は濾過滅菌(0.2μm)して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填し、25mg/kgの用量における尾部静脈を介した静脈内瞬時投与により動物に与えた。試験は4時点、即ちt=投与前、3,6、12時間の各々につき3匹の群よりなるものとした。放血の後、各動物の血管を食塩水で十分洗浄(V〜30ml)することにより血管内に残存する血液をすべて除去した。組織(心臓、肝臓、腎臓)を採取し、計量し、次に標準的生理食塩水中50%w/vとなるようにホモゲナイズし、分析時まで−80℃で保存した。
ARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)についての組織の分析はハイブリダイゼーション形ELISA型試験を用いて実施した。この試験においては、ビオチニル化キャプチャープローブを3時間125nMの結合溶液濃度において96穴マイクロプレートのウェル中に予備固定した。プレートウェルを1×PBSで5回洗浄した。次にプレートをTBS中1×SuperBlock(Pierce Chemical, Rockford,IL)の150μl/ウェルでブロックした。プレートを再度洗浄し、被覆し、使用時まで4℃で保存した。別のチューブにおいて、10分間90℃において200nMでFAM標識(5’−フルオレセイン)試料検出プローブを含有する緩衝液中で試料をアニーリングし、次に氷上でクエンチングした。血漿/組織の濃度標準物質及び対照試料もまた試料検出プローブ溶液で予備アニーリングし、次に固定化されたビオチンキャプチャープローブを含有する試験プレートウェルにピペッティングし、2.5時間45℃でアニーリングした。次にプレートを再度洗浄し、そして、1×PBS中セイヨウワサビパーオキシダーゼにコンジュゲートした抗フルオレセインモノクローナル抗体(抗FITCMAb−HRP,Molecular Probes,Eugene,OR)1μg/mlを含有する1×PBSを含有する溶液100μl/ウェルを充填し、そして約1時間インキュベートした。プレートを上記した通り再度洗浄した。次に試験プレートウェルに蛍光発生HRP基質(QuantaBlu,Pierce Chemical,Rockford,IL)を含有する溶液100μlを充填し、そして遮光しながら20〜30分間インキュベートした。45分インキュベートした後、停止溶液100μl/ウェルを添加して蛍光沈殿生成反応をクエンチングした。プレートを即座に蛍光励起325nm及び発光検出420nmで蛍光マイクロプレートリーダー(SpectraMax Gemini XS,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上で読み取った。各ウェルは10回読み取った。全3種のアプタマーとも3時点において心臓組織中で検出可能であった(図39)。
(実施例5E:静脈内投与後のマカクカニクイザルにおけるC5阻害剤ARC657、ARC658及びARC187の薬物動態及び薬力学的特徴−試験1)
注射用のARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)の製剤は生理食塩水中5mg/mlとし、投薬製剤は濾過滅菌(0.2μm)して無菌的条件下に予備滅菌投薬バイアル中に充填した。マカク試験に用いた投与経路は30mg/kgの用量(約50倍モル過剰)における外科的にインプラント処置した大腿静脈カテーテルを介した静脈内瞬時投与とした。試験設計は図40に概説する。血液試料は大腿静脈カテーテルから採取し、クエン酸ナトリウムコーティングチューブに直接移して反転により混合し、血漿分離のために遠心分離(5分間3000rpm)するまで氷上に置いた。血漿を250μlの小区分に分注し、これを−80℃で保存し、各試料の1小区分を上記ラットPKのセクションで前述した蛍光系Oligreen(商標)試験を用いてアプタマー濃度について評価した。
一次血漿中濃度vs時間のデータは図41において表に示す通りである。予測された通り、40kDaPEGアプタマーARC187(配列番号5)は最長時間に亘り血漿中に存続していたのに対し、20kDaPEGアプタマーARC657(配列番号61)は最短時間の存続であった。図41に示したデータを検討したところ、データはツーコンパートメントモデルにより最も良好にフィットした。即ち、図42に報告した薬物動態パラメーターの推定値は産業用標準薬物動態モデリングソフトウエアWinNonLin(商標)v.4.0(Pharsight Corp.,Mountain View,CA)を用いたツーコンパートメント分析から誘導した。
図42に示す通り、全てのアプタマーは同様のCmax値、23〜30μMを有しており、アプタマー用量(30mg/kg)が50倍モル過剰の血漿中アプタマーvsC5濃度(50倍モル過剰、約25μM)を達成するために十分であることを示している。10000分子量の相違があるものの、ARC657(20kDaPEG)(配列番号61)およびARC658(30kDaPEG)(配列番号62)は同様の曝露(AUC)、t1/2(α)およびt1/2(β)の値を有していた。これとは対照的に、ARC187(配列番号5)は他の分子よりも有意に高値の曝露(AUC)値、延長されたt1/2(α)および僅かにより長いt1/2(β)を有していた。
薬物動態試験中に採取された血漿試料の別の小区分をその後インビトロで分析することにより霊長類C5ブロッキングの薬効を調べた。チモサン活性化試験を前述の通り行い、それぞれ形成された霊長類C5b−9及びC5aの量を求めた。データをC5b−9濃度vs採取時間(図43a)、C5b−9濃度vsアプタマー濃度(図43b)、C5a濃度vs採取時間(図43c)及びC5a濃度vsアプタマー濃度(図43d)を含む数種のフォーマットでプロットした。
40kDaPEGアプタマーARC187(配列番号5)は最長時間霊長類C5切断(C5b−9及びC5a濃度)を抑制した(図35a及び35c)。C5b−9及びC5aデータをアプタマー濃度に対してプロットした場合、C5ブロッキングアプタマー濃度はPEG分子の大きさに関わらず30倍モル過剰を超過しており、C5切断を完全に抑制する水準であったことを示している(図35b及び35d)。
総括すれば、マカクカニクイザルのPK/PD試験で得られたデータは(a)予測された通り、PEG基の大きさに関わらず、アプタマーの少なくとも30倍モル過剰(約15μM血漿中アプタマー濃度)がマカクカニクイザルにおいてインビボでC5切断を抑制するために必要であり、(b)C5ブロッキングアプタマーはこの動物種において明らかな毒性をもたらさず、そして(c)動物に比較的高濃度(50倍モル過剰)を投与した場合、血漿中アプタマー濃度は試料採取の期間中適切な試験範囲内に十分とどまり、薬物動態パラメーターの計算を可能にすることを示している。
(実施例5F:静脈内投与後のマカクカニクイザルにおけるC5阻害剤ARC658及びARC187の薬物動態及び薬力学的特徴−試験2)
試験2は以下の例外、即ち、a)2化合物のみ(ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5))を評価し;b)動物数を群当たり4匹に増加し;そしてc)1分血漿試料は除外して144時間の試料と交換することにより終末半減期の計算がより多くのデータ点に基づくようにしたことを除き上記試験1と同様である。これ等の2アプタマーの製剤及び投薬、採血及び血漿の単離手法は試験1において上記した方法と同一とした。試験2の設計は図44に総括する通りである。
試験2の終了後、血漿の小区分を試験1において記載したとおり分析することによりa)静脈内投与後の種々の時点における血漿中アプタマーの濃度、及びb)C5ブロッキングの薬効を調べた。
血漿中アプタマー濃度を時間の関数としてプロットし(図45)、そしてARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)に関する主要データをそれぞれ図39及び40において表形式で示した。40kDaPEGアプタマーARC187(配列番号5)は最長時間血漿中に残存した。図45を検討したところ、データはツーコンパートメントモデルにより最も良好にフィットした。即ち、図46に報告した薬物動態パラメーターの推定値はWinNonLin(商標)v.4.0(Pharsight Corp.,Mountain View,CA)を用いたツーコンパートメント分析から誘導した。
上記PK/PD試験1及び試験2の間に得られた薬物動態パラメーターを比較するとARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)はARC187のt1/2(α)測定の例外を除き同様であった。理論に制約されないが、2つの試験の間でARC187に関してt1/2(α)測定に矛盾があったことは、パイロット試験における小さいサンプルサイズが原因と考えられる。
図46において示した通り、Cmax値はARC658(配列番号62)とARC187(配列番号5)で同様であった。これとは対照的に、薬剤曝露(AUC)はARC187(配列番号5)を投与した動物において有意に高値であった。更にまた、ACR187はARC658(配列番号62)と比較して延長したt1/2(α)およびt1/2(β)の値を有していた。これ等のデータはPK/PD試験1で得られたデータとあわせるとC5ブロッキングアプタマーARC187は所定の用量に関して最も有効なインビボのC5ブロッキングをもたらすと考えられる。
薬物動態試験中に採取された血漿試料の別の小区分をその後インビトロで分析することにより霊長類C5ブロッキングの薬効を調べた。チモサン活性化試験を前述の通り行い、それぞれ形成された霊長類C5b−9及びC5aの量を求めた。データをC5b−9濃度vsアプタマー濃度(図47)及びC5a濃度vsアプタマー濃度(図48)としてプロットした。PK/PD試験1で前に明らかにされた通り、C5ブロッキングアプタマー濃度はPEG分子の大きさに関わらず30倍モル過剰(血漿中C5濃度に対するアプタマー)、又は約15μMを超過しているはずであり、霊長類C5切断を完全に抑制する水準であったことを示している(図41及び42)。
図39及び40の表におけるデータを検討したところ、30mg/kgIV瞬時投与の後、ARC658(配列番号62)は約4時間15μM超で残存したのに対し、ACR187は約8時間15μM超で残存した。即ち薬剤用量が同様であれば、40KアプタマーARC187は30KアプタマーARC658(配列番号62)の約2倍の長時間にわたり臨床効果をもたらす。
総括すればマカクカニクイザルはインビボでC5変換をブロックするためには少なくとも30倍モル過剰アプタマーvs血漿中C5で投与する必要がある。これらのデータはC5結合アプタマーがヒトC5と比較して霊長類C5に対してより低値の親和性を有していたことを示唆していた以前のインビトロ(溶血)及びエクスビボ(単離灌流マウス心臓)の試験と合致している。C5ブロッキングアプタマーはC5濃度に対して約50倍モル過剰のアプタマーに等しい30mg/kg間での用量で静脈内瞬時投与物として安全に送達できることがわかった。
(実施例5G:瞬時IV投与及び注入の後のマカクカニクイザルにおけるC5阻害剤ARC187の薬物動態及び薬力学的特徴)
ARC187(配列番号5)の薬物動態(PK)及び薬力学的(PD)のプロファイルはまた、静脈内瞬時投入とその直後の静脈内注入の開始の後にマカクカニクイザルにおいて評価した。この試験設計は図49に示す通りである。
1uMの目標定常状態血漿中濃度を達成するために必要な瞬時投入の用量及び注入の速度は図50に示すIV瞬時単独試験から誘導された薬物動態パラメーターを用いて計算した。
合計3匹のマカクカニクイザルに1mg/kgでARC187をIV瞬時投与し、その直後に48時間に亘る0.0013mg/kg/分の速度でのIV注入を開始した。全血試料は投与後0〜192時間収集し、湿潤氷上に保存し、血漿を調整し、次に−80℃で保存した。血漿試料中のARC187の濃度は蛍光核酸染色試験(実施例5Bに記載)及びGLP有効化性能液体クロマトグラフィー(HPLC)試験の両方を用いて測定した。サル血漿中のARC187の測定のためのHPLC試験法はClinTrials Bio−Research(Montreal,Canada)により有効化されている。有効化試験は米国食品医薬品局(FDA)のGood Laboratory Practice(GLP)規正法(21CFR§58)を遵守している。HPLC試験法は、選択性、直線性、定量下限(LLOQ)、キャリーオーバー、試験内精度及び確度、試験間精度及び確度、保存溶液の安定性、注入媒体の安定性、短期のマトリックス安定性、凍結解凍安定性、長期のマトリックス安定性及び希釈の一貫性に関して有効化されている。使用可能な試験濃度の直線性ダイナミックレンジは0.080〜50.0μMと測定されている。
これ等の条件下に測定されたARC187のPKプロファイルはIV瞬時PKパラメーターのみを用いて得られた計算プロファイルによく合致していた(図51参照)。1uMの目標血漿中濃度は投与後5分未満に確立され、注入の全時間に亘り維持された。注入停止後は、アプタマーは終末クリアランス半減期t1/2(β)〜40〜60時間を示した。
マカクカニクイザルにおけるARC187(配列番号5)の薬力学的活性は、カニクイザル試料血漿は10%ヒト血漿中に10倍希釈し、次に5mg/mlチモサンで処理したという変更を加えた前述のチモサン活性化試験においてPK試験中に採取した血漿を用いてエクスビボで評価した。C5a切断性生物の発生を反映したC5活性化は、ヒトC5aに特異的なELISAを用いて測定した(C5aELISAキット、BD Biosciences,San Diego,CA)。次に既知ARC187濃度を用いて調製した試料を用いたチモサン試験で得られた標準曲線との比較により各試料中の活性ARC187の濃度を定量した(図52参照)。この試験はARC187が注入の最中及びその後の期間を通じてその抗補体活性を上記薬物動態プロファイルと実質的に合致した水準に維持することを示している。
(実施例5H:ヒト投薬条件の予測)
CABG手術に関連する合併症の予防、軽減又は治療のためのヒト投薬条件の根拠となる推測として、第1にCABG患者には手術開始前に抗C5アプタマーの単回静脈内瞬時用量を投与し、その後連続注入を行いCABG術後24〜48時間1.5μMの定常状態血漿中濃度を確立して維持する。瞬時用量及び注入速度の推定値は以前に記載したマカクカニクイザルにおけるIV瞬時のみ及び瞬時+注入の試験から得られた薬物動態パラメーターを用いた計算に基づく。推定されたARC187瞬時用量は1mg/kgであり、関連する注入速度は0.0013mg/kg/分である。この瞬時+48時間注入の用法については、予測される総薬剤必要量はARC187で0.4gであり、ここで質量はオリゴヌクレオチド重量のみを指す(図53の表中のコラム7参照)。図53の表のコラム2はARC187のオリゴヌクレオチド部分にコンジュゲートしたPEG基の重量を指し、コラム3はARC187のオリゴヌクレオチド部分の分子量を指し(そしてそのオリゴヌクレオチド配列としてARC186(配列番号4)を含む本明細書記載の全アプタマーについて同様)、コラム4は上記実施例3Cに記載したとおりアミン反応化学を介してARC186(配列番号4)にコンジュゲートした40kDaのPEGの分子量を指し、カラム5はツーコンパートメントモデルにおけるARC187のα相の半減期を指し、そして、カラム6はツーコンパートメントモデルにおけるARC187のβ相の半減期を指す。
(実施例6)
(抗C5アプタマー及びヘパリン/プロタミン相互作用)
抗C5アプタマーの1つの予測される用途は冠動脈バイパスグラフト(CABG)手術に関わる炎症性の副作用の予防又は緩解のための予防薬としてのものである。血栓を防止し、バイパスポンプの部品内の開存性を維持するためにCABG中に典型的には高濃度の抗凝固剤ヘパリン(3〜5単位/ml又は1〜2μM)が投与され;処置後のヘパリンの作用の退行および正常な止血性の回復が同様に高濃度のプロタミン(〜5μM)の投与により達成される。これ等の薬剤の何れかの有効性において何らかの干渉を受ける危険性を患者が負うとすれば、抗C5アプタマーは(1)何れの薬剤の活性も改変せず、そして(2)患者の抗凝固治療を複雑化させる止血に対する固有の作用を示さないことを明らかにする必要がある。
ヘパリンは抗トロンビンとの相互作用を促進することにより凝固カスケードにおいて多くのプロテアーゼに対し阻害作用を示す実質負電荷で平均分子量約15kDaの硫酸化多糖類である。プロタミンは高度に正荷電したポリペプチドであり、少なくとも部分的に静電気的な性質である特徴が明確でない相互作用を介してヘパリン活性をブロックすることができる。ARC187(配列番号5)の機能的コアはヘパリン同様、高度にアニオン性である。すなわちARC187がヘパリン結合部位又はプロタミンと非特異的に結合してこれ等の分子の活性を妨害することが疑われる。以下の試験ではARC187の固有(即ちヘパリン様)の抗凝固特性、ヘパリン機能に対するARC187の作用、プロタミンによるヘパリン中和に対するARC187の作用、及び、ARC187の補体抑制特性に対するプロタミンの作用を検討した。
(実施例6A:凝固に対するARC187のインビトロ作用)
血漿凝固性に対するARC187(配列番号5)の固有の作用は、凝固カスケードの外因性及び内因性の方法の標準的な臨床試験、プロトロンビン時間(PT)及び活性部分トロンボプラスチン時間(aPTT)をそれぞれ使用しながら調べた。図54に示す通り、クエン酸添加ヒト血漿を予測された用量(20μM以下)の過剰量で濃度ウェルを用いて滴定したところ、PTは変化せず、そしてaPTTは僅かに上昇したのみであった。
ヘパリン及びプロタミンの機能に対するARC187のインビトロの作用を評価するために、3個体から得た血液をCABG手術中で使用されるヘパリン濃度に関連する用量である4〜5単位/mlヘパリン中に導入した。これ等の試料の凝固性は活性化凝固時間(ATC)、手術中ヘパリン活性をモニタリングするために日常的に使用されている全血凝固試験を用いて評価した。ヘパリンのこれ等の濃度において、他の添加物の非存在下においては、ACTは〜150秒のベースライン値から4U/mlヘパリン存在下で〜500秒、又は、5U/mlヘパリン存在下で〜800秒まで、有意に延長された。これ等の試料に10μMのARC187を添加しても凝固時間には殆ど影響はなく、ARC187はヘパリンの抗凝固活性を妨害しないことを示している。
ヘパリン抗凝固作用は6〜8μM(4U/mlヘパリン)又は12μM(5U/mlヘパリン)までプロタミンによる滴定により容易に中和された。ヘパリン存在下のACT値及びプロタミンの中和濃度は本質的にベースラインから識別不能であった。ARC187(12kDa)の核酸コアはプロタミン(5kDa)より大きい分子量であるため、プロタミンに添加されたARC187の等モル濃度でプロタミンの中和活性を完全に退行させるのに十分であると期待されそうである。しかしながら、概ね等しい濃度のARC187と共にプロタミンを予備インキュベートしてもACTには殆ど影響しなかった。中和濃度のプロタミンを含有する血液試料は10μMARC187の存在下又は非存在下で同様のACT値を示し、ARC187がプロタミンのプロ凝固活性に対し、最高でも僅かな作用しか有さないことを示している。これ等の結果は図55に総括する。
(実施例6B:凝固に対するARC187のインビボの作用)
臨床用量のヘパリン及び臨床/臨床未満/超臨床用量のプロタミンにおける、抗C5アプタマーARC187(配列番号5)の同時投与の間のヘパリンとプロタミンの間の相互作用を調べることにより、ARC187の臨床未満/超臨床の血漿中濃度がプロタミンによるヘパリン抗凝固の退行を妨害するかどうか調べた。試験の結果は図56に総括する。要約すれば、ベースラインACT値は試験した全てのヘパリン用量においてARC187(配列番号5)の10uM(即ち臨床用量の10倍モル過剰量)により影響されなかった。同様に、ヘパリンによる抗凝固の程度も10uMのARC187により影響されなかった。ARC187の非存在下においては、プロタミンの最小有効用量は〜30%(臨床用量=100%)。更にまた、30%プロタミンによるヘパリン抗凝固の退行はARC187の臨床用量(即ち10uM)の10倍モル過剰によっても影響されなかった。即ち、臨床状況(例えばCABG)における補体の抑制について、ARC187の使用は典型的な用量におけるヘパリン及びプロタミンの同時使用により影響されない。
(実施例6C:ARC187抗補体機能に対するヘパリン及びプロタミンの作用)
ARC187(配列番号5)の抗補体活性に対するヘパリン及びプロタミンの作用を実施例1に記載する通りチモサンで活性化したクエン酸添加全血試料において調べた。チモサン活性化の直前、ARC187を以下の4条件下、即ち1)未投与(ヘパリン又はプロタミン無添加);2)4U/mlヘパリン;3)6μMプロタミン;4)4U/mlヘパリン+6μMプロタミンにおいて投与されたクエン酸添加血液の試料中に滴定導入した。チモサン活性化の後、C5の活性化を血漿中のsC5b−9のELISA測定(C5b−9ELISAキット、Quidel,San Diego,CA)により定量した。各条件について、C5活性化のパーセント抑制vsARC187濃度として表示した結果は誤差範囲内であった(図57参照)。全ての場合において、1〜2μMARC187で完全な抑制が達成された。即ち、ヘパリン及びプロタミンは、CABG手術におけるそれらの使用に該当する濃度では個々又は組み合わせにおいて、ARC187の抗補体活性に影響しないと考えられる。
本発明を以上の通り書面による説明及び実施例により記載したが、当業者の知る通り、本発明は種々の実施形態において実施することができ、そして、上記した説明及び実施例は例示を目的としており、添付する請求項を制限するものではない。
図1は補体系の古典的及び代替の経路を示す。 図2はオリゴヌクレオチドのランダム配列のプールからのインビトロのアプタマー選択(SELEX(商標))工程の模式図である。 図3Aは抗C5アプタマー(配列番号1)のヌクレオチド配列及び二次構造を示す図であり、ここで下線の残基は2’−Hピリミジン残基又は2’−フルオロピリミジン残基であり、□で囲んだ残基は2’−フルオロピリミジン残基又は2’−OMeピリミジン残基であり、そして、矢印(→)で示された残基は2’−フルオロ修飾を含有していなければならない残基を示す。 図3BはARC330抗C5アプタマー(配列番号2)のヌクレオチド配列及び二次構造を示す図であり、ここで○で囲んだ残基は2’−H残基であり、ピリミジン残基は2’−フルオロ置換されており、そしてアウトラインで示した3個の2’−OHプリン残基を除き、プリン残基の大部分は2’−OMe置換されている。 図3CはARC186抗C5アプタマー(配列番号4)のヌクレオチド配列及び二次構造を示す図であり、ここで全ての21ピリミジン残基は2’−フルオロ修飾を有し、そしてアウトラインで示した3個の2’−OHプリン残基を除き、プリン(14残基)の大部分は2’−OMe修飾されている。 図4は40kDの分枝鎖PEG(1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)を示す。 図5はアプタマーの5’末端に結合した40kDの分枝鎖PEG(1,3−ビス(mPEG−[20kDa])−プロピル−2−(4’−ブタミド)を示す。 図6は高分子量のPEG−核酸コンジュゲートの合成に関する種々の手法を示す図である。 図7AはPEG化抗C5アプタマー(ARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5))による溶血の用量依存性抑制を非PEG化抗C5アプタマー(ARC186(配列番号4))と比較したグラフである。 図7Bは図7Aで示した溶血試験で用いたアプタマーのIC50値の表である。 図7CはPEG化抗C5アプタマーARC187(配列番号5)、ARC1537(配列番号65)、ARC1730(配列番号66)及びARC1905(配列番号67)による溶血の用量依存性抑制を比較したグラフである。 図7Dは図7Cで示した溶血試験で用いたアプタマーのIC50値の表である。 図8はカニクイザルの血清中補体とヒト血清中補体を比較した場合の抗C5アプタマー、ARC658(配列番号62)による溶血のパーセント抑制のグラフである。 図9は15分インキュベートした後の37℃及び室温(23℃)の両方における精製C5蛋白へのARC186(配列番号4)の結合を示すグラフである。 図10は4時間インキュベートした後の37℃及び室温(23℃)の両方における精製C5蛋白へのARC186(配列番号4)の結合を示す別のグラフである。 図11は23℃におけるC5・ARC186複合体の解離の経時変化を示すグラフである。 図12は23℃におけるC5・ARC186複合体の形成における平衡の経時変化を示すグラフである。 図13は複合体カスケードにおける上流及び下流の蛋白成分と比較した場合のC5蛋白に結合したARC186(配列番号4)を示すグラフである。 図14は未標識の競合物質であるARC186(配列番号4)、ARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)の存在下におけるC5に結合した放射標識ARC186(配列番号4)のパーセンテージを示すグラフである。 図15はARC186(配列番号4)アプタマーの種々の濃度での存在下において25℃及び37℃で5時間インキュベートした血液試料中で生産されたC5b補体蛋白の量を示すグラフである。 図16は未希釈のヒト血清、クエン酸添加ヒト全血又はカニクイザル血清中のチモサンの存在下のARC187(配列番号5)によるパーセント補体抑制を示すグラフである。 図17は実施例1Dに記載したチュービングループモデルにおける補体活性化(C5a)をARC658(配列番号62)が完全に抑制することを示すグラフである。 図18はC5選択プールのラウンド10に関する解離定数を示すグラフである。解離定数(K)は式:結合RNA画分=増幅/(K+[C5])にデータを当てはめることにより推定した。「ARC520」(配列番号70)はナイーブの非選択のdRmYプールを指し、そして「+」は競合物質(0.1mg/mlのtRNA、0.1mg/mlのサケ精子DNA)の存在を示す。 図19はC5クローンの解離定数の曲線を示すグラフである。解離定数(K)は式:結合RNA画分=増幅/(K+[C5])にデータを当てはめることにより推定した。 図20はARC186(配列番号4)と比較した場合の抗C5アプタマークローンARC913(配列番号75)の種々の濃度の溶血活性に対する抑制作用を説明するIC50曲線を示すグラフである。 図21はARC187(配列番号5)の構造を示す図である。 図22はARC1905(配列番号67)の構造を示す図である。 図23は第1の単離された灌流心臓の試験の実験設計を示す表である。 図24はヒト血漿に曝露した単離心臓の左心室(LV)における心室内圧力に関する圧力追跡(A)を対照アプタマー溶液に曝露した単離心臓のLVP圧の追跡(B)に比較したグラフである。 図25はモル等量、10×及び50×のアプタマー/C5溶液に曝露した単離心臓の左心室(LV)における心室内圧力に関する圧力追跡を比較したグラフである(約500nMの濃度が正常未希釈ヒト血漿中のC5について推定される)。 図26はヒト血漿及び種々の血漿/アプタマー溶液への曝露の後の単離マウス心臓における分当たり拍数(bpm)における心拍数の変化を比較したグラフである。 図27は0〜1×モル比のARC186(配列番号4)(不良の心臓)又は10〜50×モル比(C5アプタマーで保護された心臓)を含むヒト血漿への曝露の前後の単離マウス心臓における心臓重量の変化を比較したグラフである。 図28は単離マウス心臓を通過する灌流の後の種々のアプタマー濃度を含有するヒト血漿中の相対的C5a生産を比較したグラフである。相対的C5a濃度は吸光度単位(Abs)でプロットし、より高値の読み取り値がより高値のC5a濃度の存在を反映している。 図29は単離マウス心臓を通過する灌流の後の種々のアプタマー濃度を含有するヒト血漿中の相対的可溶性C5b−9生産を比較したグラフである。 図30はマウス心臓流出物中のC3切断に対するARC186(配列番号4)の作用を示すグラフである。 図31は単離灌流マウス心臓試験に関する免疫組織化学的染色の結果を示す表である。 図32はC5b媒介損傷から心臓を保護するためにヒト又は霊長類の血清中で必要とされるARC658(配列番号62)のモル比を示す表である。 図33はラット及びマカクカニクイザルの両方の血漿中のインキュベート時間の関数としての完全長ARC186の残存パーセントの方対数プロットを示すグラフである。 図34は実施例5に記載したSprague−Dawleyラットで実施した薬物動態試験の実験設計を示す表である。 図35はSprague−DawleyラットにおけるARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)又はARC187(配列番号5)の平均血漿中濃度を時間に対して示した表である。 図36はラットにおけるアプタマーの静脈内投与後の経時的なARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)の平均血漿中濃度を示すグラフである。 図37は図35及び36に示した濃度vs時間のデータのノンコンパートメント分析を示す表である。 図38AはマウスにおけるARC187(配列番号5)及びARC1905(配列番号67)の薬物動態試験の設計を示す表であり;図38Bは単回IV瞬時投与後のCD−1マウスにおけるARC187(配列番号5)及びARC1905(配列番号67)の薬物動態プロファイルを示すグラフであり;図38Cは図38Bにおいて示した濃度vs時間のデータのノンコンパートメント分析を示す表である。 図39は静脈内投与後のマウス心臓組織における列挙したアプタマーの検出を示す表である。 図40は実施例5Eに記載した動物試験1の実験設計を示す表である。 図41はマカクカニクイザルへのアプタマーの静脈内瞬時投与の後のアプタマーの血漿中濃度vs時間を示す表である。 図42は試験1においてマカクカニクイザルに静脈内投与したARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)及びARC187(配列番号5)に関する薬物動態パラメーターを列挙した表である。 図43(a)及び43(c)はマカクカニクイザルへの抗C5アプタマーARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)又はARC187(配列番号5)の静脈内投与後の経時的なsC5b−9及びC5aの血漿中濃度を示すグラフである。 図43(b)及び43(d)は抗C5アプタマーARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)又はARC187(配列番号5)の濃度に対するsC5b−9及びC5aの血漿中濃度を示すグラフである。 図43(a)及び43(c)はマカクカニクイザルへの抗C5アプタマーARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)又はARC187(配列番号5)の静脈内投与後の経時的なsC5b−9及びC5aの血漿中濃度を示すグラフである。 図43(b)及び43(d)は抗C5アプタマーARC657(配列番号61)、ARC658(配列番号62)又はARC187(配列番号5)の濃度に対するsC5b−9及びC5aの血漿中濃度を示すグラフである。 図44は実施例5Fに記載した試験2の実験設計を示す表である。 図45はマカクカニクイザルへのARC658(配列番号62)又はARC187(配列番号5)の静脈内投与後の種々の時点における平均アプタマー血漿中濃度を示すグラフである。 図46はマカクカニクイザルへの静脈内瞬時アプタマー投与後の濃度vs時間のデータのツーコンパートメント分析を示す表である。 図47はカニクイザルの血漿中チモサンの存在下のARC187(配列番号5)又はARC658(配列番号62)に対するC5b−9濃度を示すグラフである。 図48はカニクイザルの血漿中チモサンの存在下のARC187(配列番号5)又はARC658(配列番号62)に対するC5a濃度を示すグラフである。 図49はマカクカニクイザルへのIV瞬時+注入投与の最中及び後におけるARC187(配列番号5)のPK−PD試験を総括する表である。 図51はIV瞬時投与後のマカクカニクイザルにおけるARC187(配列番号5)に関する薬物動態パラメーターを総括する表である。 図51はマカクカニクイザルへのIV瞬時+注入投与の最中及び後におけるARC187(配列番号5)の薬物動態プロファイルの計算値及び実測値を示すグラフである。 図52はマカクカニクイザルへのIV瞬時+注入投与の最中及び後において活性ARC187(配列番号5)の血漿中濃度が一定であり続けることを示すグラフである。 図53はCABG手術における抗C5アプタマーに関する予測されたヒトへの投与条件を示す表である。 図54はプロトロンビン時間(PT)及び活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)により測定した場合の凝固に対するインビトロの作用をARC187(配列番号5)が比較的に保有していないことを示すグラフである。 図55はヘパリンの抗凝固活性及びプロタミンのプロ凝固活性に対するARC187(配列番号5)のインビトロの作用を総括した表である。 図56はインビボのヘパリンの抗凝固の逆行をARC187(配列番号5)が起こさないことを示すグラフである。 図57はチモサンの補体活性化の抑制により測定したARC187(配列番号5)の抗補体機能に対してヘパリン及びプロタミンの両方が作用を有さないことを示すグラフである。

Claims (21)

  1. 配列番号4に従うヌクレオチド配列を有するアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩であって、更に該配列の5’末端にリンカーを介してコンジュゲートした40kDaの分枝鎖PEG部分を有する、アプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  2. 前記リンカーがアルキルリンカーである、請求項記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  3. 前記アルキルリンカーが2〜18連続CH基を有する、請求項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  4. 前記アルキルリンカーが2〜12連続CH基を有する、請求項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  5. 前記アルキルリンカーが3〜6連続CH基を有する、請求項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  6. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲート又はその塩の治療有効量を含む、組成物。
  7. 製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含む、請求項に記載の組成物。
  8. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲート又はその塩の治療有効量および製薬上許容しうる担体又は希釈剤を含む、C5、C5a及び/又はC5b−9補体蛋白により媒介される、脊椎動物における疾患を治療、予防又は軽減するための組成物。
  9. 前記脊椎動物が哺乳類である、請求項に記載の組成物。
  10. 前記哺乳類がヒトである、請求項に記載の組成物。
  11. 前記疾患が、急性虚血性疾患、急性炎症性疾患又は慢性炎症性疾患及び/又は免疫媒介疾患である、請求項10に記載の組成物。
  12. 前記疾患が、心筋梗塞、脳卒中、虚血/再灌流傷害、感染性疾患、敗血症、ショック、急性/超急性移植片拒絶、アレルギー、喘息、慢性関節リューマチ及び他のリューマチ性疾患、多発性硬化症及び他の神経疾患、乾癬及び他の皮膚疾患、重症筋無力症、全身エリテマトーデス(SLE)亜急性/慢性の移植片拒絶、又は糸球体腎炎及び他の腎疾患である、請求項11に記載の組成物。
  13. 前記疾患が、CABG手術に関連する心筋傷害、バルーン血管形成術に関連する心筋傷害又は再狭窄に関連する心筋傷害である、請求項10に記載の組成物。
  14. 記疾患が、CABG手術に関連するC5、C5a及び/又はC5b−9補体蛋白媒介合併症である、請求項10に記載の組成物。
  15. 前記組成物は、術前術後に投与されることを特徴とする、請求項10に記載の組成物。
  16. 前記組成物は、静脈内投与されることを特徴とする、請求項に記載の組成物。
  17. 請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩を含む診断用組成物であって、該組成物は、C5補体蛋白又はその変異体を含むことが疑われる試料に接触させ、C5補体蛋白又はその変異体の存在又は非存在が検出されることを特徴とする、診断用組成物。
  18. 前記C5補体蛋白又はその変異体がヒトC5補体蛋白又はその変異体である、請求項17に記載の診断用組成物。
  19. インビトロ診断薬として使用するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  20. インビボ診断薬として使用するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
  21. インビボの疾患の治療、予防又は軽減において使用するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー/PEGコンジュゲートまたはその塩
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