JPH05501060A

JPH05501060A - Ｒｎａ模倣による遺伝子発現活性変調のための試薬および方法

Info

Publication number: JPH05501060A
Application number: JP3507270A
Authority: JP
Inventors: エッカー，デービッド・ジェイ; ブルース，トーマス・ダブリュー; ヴィッカーズ，ティモシー・エイ
Original assignee: アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド
Priority date: 1990-03-21
Filing date: 1991-03-19
Publication date: 1993-03-04
Also published as: KR970002669B1; WO1991014436A1; CA2078659A1; AU7662091A; US5736294A; US6368863B1; HUT62658A; FI924197A; EP0523140A4; BR9106258A; FI924197A0; KR930700117A; EP0523140A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ＲＮＡ模倣による遺伝子発現活性変調のための試薬および方法状態の細胞特にウィルスおよびレトロウィルスに感染している細胞に見られるＲＮＡ二次構造を模倣したオリゴヌクレオチドの設計、合成および応用に関する。

これらの感染ＲＮＡ構造の模倣でそのような感染の活性変調ができることが観察クレオチドの配列内に蛋白質合成を指示するための情報を含んでいる直線状の分子と考えられている。最近、ｍＲＮＡ中にその機能に重要である多数の二次および三次構造が示された（１．　Ｔｉｎｏｃｏ、Ｐ、　Ｗ、　Ｄａｖｉ　ｓ　；Ｃ，Ｃ，Ｈａｒｄｉｎ、Ｊ、Ｄ、Ｐｕｇｌｉｓｉ、Ｇ、Ｔ、Ｗａｌｋｅｒ、Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒのワトソンークリック型相互作用により主として形成される。重要な二次構造要素には分子内二本鎖領域、ヘアピンループ、デユープレックスＲＮＡ中のバルジおよび内部ループが含まれる。三次構造要素は二次構造要素が互にまたは一本鎖領域と接触しより複雑な三次元構造を生成する場合に形成される。

ＲＮＡの正確な三次構造についてはほとんど知られていない。しかしながら最近、−末鎖、二次および三次構造を含むＲＮＡ構造は直線状配列に蛋白質を合成する情報を単にコードしているだけでなく重要な生物学的機能を持つていることを示した多数の研究がなされた。これらの訂正のいくつかは以下の文献に議論されている：　１．Ｔｉｎｏｃｏ、Ｐ、Ｗ、Ｄａｖｉｓ、Ｃ，Ｃ，Ｈａｒｄｉｎ、Ｊ。

Ｄ、Ｐｕｇｌｉｓｉ、Ｇ、Ｔ、Ｗａｌｋｅｒ、Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ、Ｈａｒｂ、Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、５２，１３５　（１９８７）；Ｏ，Ｒｅ５ｎｅｋｏｕ、Ｍ、Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｙ、Ａｌｏｎｉ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ２６４．９９５３　（１９８９）；Ｃ，Ｔｕｅｒｋ、Ｐ、Ｇａｕｓｓ、Ｃ，Ｔｈｅｒｍｅｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、、Ａｇ３．１３６４　（１９８８）：Ｄ、Ｅ、Ｌａｒｓｏｎ、Ｂ、Ｈ，Ｓｅｌ　Ｉｓ、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７４．５　（１９８７）；およびＧ、Ｋｎａｐｐ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８０，１９２　（１９８９）。

オリゴヌクレオチドはＨＩＶに作用を及ぼすと評価されている。Ａｇａｒｗａｌおよび共同研究者は初期感染および慢性感染細胞においてＨＩＶ感染の阻害にスプライス　ドナー／アクセプタ一部位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を使用した。Ｓ、Ａｇａｒｗａｌ、Ｔ、Ｉｆｅｕｃｈｉ、Ｄ、Ｓｕｎ、Ｐ、Ｓ。

５ａｒｉｎ、Ａ、Ｋｏｎｏｐｋａ、Ｊ、Ｍａｉｚｅｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：７７９０　（１９８９）、５ａｒｉｎおよび共同研究者はキャップおよびスプライス　ドナー／アクセプタ一部位を標的とする化学修飾オリゴヌクレオチド類似体も使用した。Ｐ、Ｓ、５ａｒｉｎ、Ｓ、Ａｇａｒｗａｌ、Ｍ、Ｐ、Ｃ１ｖｅｉｒａ、Ｊ、Ｇｏｏｄｃｈｊｌｄ、Ｔ、Ｉｋｅｕｃｈｉ、Ｐ、Ｃ，Ｚａｍｅｃｎｉｋ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ旦Δ　８５ニア４４８　（１９８８）。Ｚａｉａおよび共同研究者はまたＨＩＶの阻害にスプライスアクセプタ一部位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を使用した。Ｚａｉａ、Ｊ、Ａ、、Ｊ、Ｊ、Ｒｏｓｓ　ｉ、Ｇ、Ｊ、Ｍｕｒａｋａｗａ。

Ｐ、Ａ、５ｐａｌｌｏｎｅ、Ｄ、Ａ、５ｔｅｐｈｅｎｓ、Ｂ、Ｅ、Ｋａｐｌａｎ。

Ｊ、Ｖｉｒｏ　１．６２　：　３９１４　（１９８８）ｏ　Ｍａｔｓｕｋｕｒａおよび共同研究者はｒｅｖ遺伝子ｍＲＮＡの翻訳開始点を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を合成した。Ｍ、Ｍａｔｓｕｋｕｒａ、に、５ｈｉｎｏｚｕｋａ、Ｇ、Ｚ。

ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４ニア７０６　（１９８７）：Ｒ，Ｌ、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｇ、Ｒ，Ｚｈａｎｇ、Ｄ。

Ｋ、Ｓｕｎ、Ｔ、Ｉｋｅｕｃｈｉ、Ｐ、Ｓ、５ａｒｉｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

なったオリゴヌクレオチド類似体を使用した。Ｋ、Ｍｏｒｉ、Ｃ，Ｂｏｊｚｉａｕ、Ｃ，Ｃａｚｅｎａｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７：８２０７　（１９８７）。５ｈｉｂａｈａｒａおよび共同研究者はスプライス　アクセプタ一部位並びに逆転写酵素プライマー結合部位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を使用した。Ｓ、５ｈｉｂａｈａｒａ、Ｓ、Ｍｕｋａｉ。

Ｈ，Ｍｏｒｉｓａｗａ、Ｈ，Ｎａｋａｓｂｉｍａ、Ｓ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｎ。

Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｃ！ｓ　Ｒｅｓ、、１７：２３９　（１９８９）。Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒおよび共同研究者はスプライス部位を標的とする複合されたコレステロールでオリゴヌクレオチド類似体を合成および試験した。Ｋ、　Ｍ。

ｒｉ、Ｃ，Ｂｏｉｚｉａｕ、Ｃ，Ｃａｚｅｎａｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７：８２０７（１９８９）、５ｔｅｖｅｎｓ。

ｎおよびＩｖｅｒｓｅｎはスプライス　ドナーおよびｔａｔ遺伝子の第一のエクソンの５゛末端を標的とするオリゴヌクレオチド類似体にポリリジンを複合させた。Ｍ、５ｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｐ、Ｌ、Ｉｖｅｒｓｅｎ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｖ。

の方法とははっきり異なっているが、各々はＨＩＶ感染におけるヌクレオチド治療が合理的であり、堅固な科学的原理に基づいているという見解を支持している。

これらの報文の各々においてはその方法はＨＩＶ　ｍＲＮＡのある部分に相補的なアンチセンス　オリゴヌクレオチドとして設計されていた。本発明はＲＮＡを模倣し、蛋白質に結合する（ＨＩＶ　ＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドというより）オリゴヌクレオチドに関する。

これまで、遺伝子の発現を調節または疾患を処置するため、ＲＮＡの二次または三次構造を模倣するのに有用であろう方法または材料については本分野では何の示唆もなかった。治療の方法および動物において疾患または疾患状態に関係するであろう遺伝子の発現を阻害する方法に対し長い間感じられてきた要求が無視されてきた。従って、特にウィルスおよびレトロウィルスのための治療物質および方法に対し長い間感じられてきた要求が残されている。

発明の目的ヒト疾患、特にウィルスおよびレトロウィルス疾患のための組成物および治療法を提供するのが本発明の第一の目的である。

天然のＲＮＡの構造を模倣する治療組成物を提供するのが本発明のさらなる目的である。

本発明のさらに別の目的は細胞中の遺伝子発現を調節することである。

本発明のさらに別の目的はヒト免疫不全ウィルス感染の治療法を提供することである。

これらおよび別の本発明の目的は本明細書の再吟味により明らかになるである遺伝子の発現がＲＮ　Ａの模倣ができる組成物を用いることにより変調できるであろうことが発見されている。そのようなＲＮＡの模倣は遺伝子発現を妨害でき、その発現が疾密の原因にかかわっている場合は治療の方法が導かれる。本発明に従うと、遺伝物質によりコードされたＲＮＡのある部分は遺伝子発現に重要な役割をはたす、二次および三次さえの構造を持つことができることが見い出された。

ある種のＲＮＡ　（特に二次または三次構造を持っているメツセンジャーＲＮＡ）と蛋白質との相互作用は、少（ともＲＮＡの一部を模倣するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の使用により阻害されるであろうことがここに見い出された。そのような模倣は蛋白質−ＲＮＡ相互作用を妨害でき、およびそのような妨害により、遺伝子発現および疾患状態の維持を妨害する。

本発明の好適な実施態様に従うと、遺伝子によりコードされているＲＮＡの一部を選択することを含む（そのＲＮＡは１つまたはそれ以上の蛋白質と相互作用できる）遺伝子の発現を変調する方法が提供される。次にそのような方法においてＲＮＡの前記の部分を模倣するようにオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が製造される。その遺伝子を含む細胞を次にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させそのような発現の変調に影響を及ぼさせる。一般的にそれは遺伝子がウィルスまたはレトロウィルスのような感染性生物体である場合であろう。好適には遺伝子はヒト免疫不全ウィルスからのものである。

他の好適な実施態様に従うと、蛋白質はウィルスまたはレトロウィルスのような感染性生物体によりコードされているＲＮＡの第二の部分により産生される。

そのような場合、蛋白質と選択されたＲＮＡの部分の相互作用は、もし起こることが可能なら、この相互作用の阻害が遺伝子発現の抑制または変調を引き起こすので、一般的には遺伝子の発現の刺激を引き起こすであろう。

本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は選択されたＲＮＡの少くとも６つのヌクレオチド単位を模倣することが好適である。約８から約６０のヌクレオチド単位が模倣されることがまださらに好適である。約１０から約３０のヌクレオチド単位が現在のところ最も好適であると思われている。別の好適な実施態様に従うと、選択されたＲＮＡの模倣の程度はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が少くともＲＮＡの二次構造の一部を達成することを可能にするような程度である。

本発明の別の好適な実施態様に従うと、ヒト免疫不全ウィルスメツセンジャーＲＮＡのＴＡＲ領域、ＣＡＲ領域またはＧＡＧ−ＰＯＬ領域がオリゴヌクレオチド模倣物の標的にされている。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は蛋白質と選択されたメツセンジャーＲＮＡ部分の相互作用を妨害するのに有効なほど模倣の程度が十分なように選択される。それ故、例えばもし、選択されたメツセンジャーＲＮＡ部分がＨＩＶのＴＡＲ領域であれば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、ＴＡＲ領域を十分に模倣するように構築され、それ故ＨＩＶメツセンジャーＲＮＡの別の部分によりコードされているｔａｔ蛋白質が模倣分子と有効に複合体形成または結合する。同様の考慮がＨＩＶのＣＡＲおよびＧＡＧ−ＰＯＬ領域に向けられたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体ＲＮＡ模倣物の製造においても伴われる。

図の簡単な説明図ＩＡは直線状ＨｒＶ−Ｉ　ＴＡＲ要素配列を示している。下線部分はループおよびバルジを意味している。

図ＩＢは）ＪＩＶ−Ｉ　ＴＡＲ要素のコンピューターにより予測された二次構造を示している。

図２はヌクレオチド７３５７−７６２７ｉ：対応するＨＩＶ−Ｉ　ＣＡＲＲＮＡ配列の部分直線状構造を示している。

図３はＨＩＶ−Ｉ　ＣＡＲ要素のコンピューター予測二次構造を示している。

図４は１３４．５．１３４６および１３４７と同定されたオリゴヌクレオチドの構造を示している。

図５はオリゴヌクレオチド１３４５，１３４６．１３４７および１３４８で観察されたＨＩＶ　ＬＴＲ遺伝子発現の阻害を示しているグラフである。

図６はオリゴヌクレオチド１３４５．１３４９および対照物で観察されたＨＩＶ　ＬＴＲ遺伝子発現の阻害を示しているグラフである。

図７は２３０６．２８４８および２８５０として同定されたオリゴヌクレオチドのＨＩＶ　ＬＴＲ遺伝子発現の阻害活性を示している。

好適な態様の詳細な説明本発明に従うと、非常に重要な生物ＲＮＡ分子の構造を模倣する組成物が提供される。本発明は生物ＲＮＡ分子の構造を模倣するためにオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を用いる。本発明の文脈において術語“オリゴヌクレオチド”は天然に存在する塩基および天然のホスホジエステル結合により結合されたシクロフラノシル基から形成される複数の結合されたヌクレオチド単位を言う。この術語は実際上天然に存在する化学種または天然に存在するサブユニットから形成された合成化学種を示している。

術ｉ“オリゴヌクレオチド類似体”が本発明に関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドと同等に機能するが、天然には存在しない部分を持つ化学種を言う。即ち、オリゴヌクレオチド類似体は改変された糖部分または部間結合を持つことができる。これらの例としては、ホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種があり、本分野での使用が知られている。また改変塩基単位または本発明の精神に一致する他の修飾を含んでいてもよい。

ある好適な実施態様に従うと、少くともオリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合のいくつかは、その活性が調節されるべきＲＮＡが位置している細胞の領域内へ挿入される組成物の能力を促進するように機能する構造へ置換されている。

そのような結合は硫黄を有していることが好適である。現在のところそのような置換がホスホロチオエート結合を含むことが好適である。アルキルホスホチオエート結合、Ｎ−アルキル　ホスホアミダイト、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネートおよび短鎖アルキルまたはシクロアルキル構造のような他のものもまた有用であろう。別の好適な実施態様に従うと、ホスホジエステル結合はただちに本質的に非イオン的および非キラルである構造で置換される。当業者は本発明の実施に使用するための他の結合も選択できるであろう。

本発明のある実施態様の使用において、少くともいくつかのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のサブユニット中の結合されている糖部分の２ ′の位置が置換されていることが一般的に好適である。即ち、ＯＨ，ＳＨ，Ｆ。

○ＣＨ３，ＯＣＮ、ＯＣＨ，ＣＨ３（式中ｎは１から約１０である）および同様の性質を持つ他の置換基もまたある実施態様では有用であろう。

オリゴヌクレオチド類似体はまた少くともいくつかの修飾塩基形を含む化学種を含んでいてもよい。即ち、天然に通常見い出されるプリンおよびピリミジン以外を用いてもよい。同様に、本発明の本質的教義から離れない限りは、ヌクレオチドサブユニットのシクロフラノース部分を修飾してもよい。

そのような類似体は天然のオリゴヌクレオチド（または天然の方法に沿って合成されたオリゴヌクレオチド）と機能的には交換可能であるが、天然の構造と１つまたはそれ以上の相違点を持つものとして記述される。それらが所望のＲＮＡの構造を模倣するように実際上機能する限りはそれらの類似体のすべてが本発明に包含される。

本発明に従ったオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は好適には約３から約１００のサブユニットを含んでいる。そのようなオリゴヌクレオチドおよび類似体が約６より大きなサブユニットを含んでいることが好適であり、約８から約６０のサブユニットがより好適で約１０から約３０のサブユニットを持っていることがより好適である。サブユニットはホスホジエステルまたは他の結合を通して隣接するサブユニットに適切に結合されている塩基および糖の組合せであることが理解されるであろう。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は診断、治療および研究用試薬およびキットとして使用できる。治療用使用のためにはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、ＡＩＤＳのようなウィルスまたはレトロウィルス感染を受けた動物、特にヒトに投与される。

本発明に従った治療剤は経口、静脈内または筋肉内のように内部へ適用するのが一般的に好適である。経皮、局所または病巣内のような他の投与形もまた有用であろう。座薬への封入もまた有用であろう。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の予防的使用法もまた有用であるようである。ある実施態様においては薬学的に受容可能な担体の使用もまた好適である。本発明に従うと、その実施において有用であるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はそれらが模倣するように設計されたＲＮＡにより最も良く説明される。即ち、本発明により提供されるオリゴヌクレオチドおよび類似体はＲＮＡ。

特に疾患状態と特別な関係を持つメツセンジャーＲＮＡの一部と本質的に同一であることを当業者は理解するであろう。即ち、本発明に従って模倣されるべきＲＮＡは、二次構造を持ち、１つまたはそれ以上の蛋白質と相互作用できるものである。本発明はそれほど制限されないがおよび発明者は本発明の操作の特定の理論に束縛されるのを欲しないが、疾患に関与する遺伝子によりコードされているＲＮＡ上に多数の制御センターが現存していると信じられている。そのような制御ＲＮＡ部分はヘアピンループ、ステムループ、バルジまたは蛋白質（一般的には同一のまたは異なったＲＮＡの異なった部分によりコードされている蛋白質）と相互作用できる同様の構造のような二次構造を持っている。ある場合には蛋白質または蛋白質群と制御ＲＮＡセンターとの相互作用はＲＮＡの蛋白質への翻訳の促進を起こす、または導くと一般的に信じられている。もちろんＲＮＡは前記遺伝子から誘導されているので、全体では基礎にある遺伝子の発現の促進になると考えられる。そのような促進の変調は本発明の目的である。

これらの制御ＲＮＡ部分に対する模倣体の製造およびオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であるそのような模倣体の感染を受けている細胞または組織への大量の導入は感染を減退させる結果となる。基礎にある遺伝子の発現の変調。このことは蛋白質または蛋白質群と模倣分子の相互作用により影響されると信じられ、そのため蛋白質と制御ＲＮＡ部分との相互作用が最小となる。

従って基礎にある遺伝子の発現の促進が同様変調される。本発明はその応用が全く普遍的であると信じられる。すなわち、もしＲＮＡがこれまで議論してきたように制御的意味で蛋白質と相互作用できると信じられるならば、ＲＮＡまたは少くともその一部を模倣するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の設計から治療用物質および方法が導かれるであろう。すなわち、そのような感染を受けた動物を模倣オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることにより、感染を減退させることができる。

現在、上で議論したような制御関係を持っていると信じられているＲＮＡはすべてステムループ、バルジなどのような二次構造を持っているようであるが、そのような二次構造を持たない制御ＲＮＡセグメントが存在するかもしれないことも可能である。そのような場合、本発明は同様にそのようなＲＮＡに対して模倣オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の製造を企図すると理解されたい。同様に、本発明はそのようなＲＮＡのための治療法および組成物にも及ぶことが理解されるであろう。

最近多数のＲＮＡ二次構造が同定されており、それに対する本発明の応用により治療上の有用性が提供されるであろう。そのいくつかとしては、Ｓ、Ｆｅｎｇ。

Ｅ、Ｃ，Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４，１６５　（１９８８）により報告されているようなＨＩＶ　ＴＡＲ構造；Ｌ、Ｒａｔｎｅｒ、Ｗ、Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｒ，Ｐａｔａｒｃａ、に、Ｊ、Ｌｉｒａｋ、Ｂ、５ｔａｒｃｉｃｈ、Ｓ。

Ｆ、Ｊｏｓｅｐｈｓ、Ｎａｔｕｒｅ　３１３，２７７　（１９８５）においてＲａｔｎｅｒにより記述されているようなヌクレオチド配列によるヌクレオチド５ −５４および５８−１０４でのステムループ；Ｓ、Ｌｅ、Ｊ、Ｃｈｅｎ、　Ｍ、Ｊ。

Ｂｒａｕｎ、Ｍ、Ａ、Ｇｏｎｄａ、Ｊ、Ｖ、ｋｉａ　ｉｚｅ　］、Ｎｕｃ　１．Ａｃ　１ｄＧＰ／○ＭＰ領域間の境界；　Ｅ、　Ｔ、　Ｄａｙｔｏｎ、Ｄ、　Ｍ、Ｐｏｗｅ　Ｉ　１．　Ａ。

１、Ｄａｙｔｏｎ、５ｃｊｅｎｃｅ　２４６．１６２５　（１９８９）に報告されているようなＨＩＶのＴＭＰ／ｅｎｖ遺伝子間の境界（前記文献）、ＨＩＶＣＡＲ構造：およびＪ、Ｌ、Ｃａ５ｅｙ、Ｍ、Ｗ、Ｈｅｎｔｚｅ、Ｄ、Ｍ、Ｋｏｅｌｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０，９２４　（１９８８）に記載されているような、ＨＩＶｇａｇおよび２且杏遺伝子間の結合部でのステムループ構造（ヌクレオチド１６２９−１６７４）、ＨＩＶ　ＣＲ’Ｓ要素、およびヒト鉄応答性要素（ＩＲＥ）などが挙げられる。さらに、主として一本鎖領域として考えられ、蛋白質結合のための部位として同定されたＲＮＡの領域がある。

例えば、Ｊ、Ｓ、Ｍａｌｔｅｒ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６，６６４　（１９８９）により記載されているように、配列５°　−ＡＵＵＵＡ−３’　は蛋白質が結合するための信号として同定されており、ＲＮＡの分解を導く。この領域の構造はいまだ不明である。しかしながら、その事はこの配列での本発明の実施を除外するものでしない。まだその構造が未知の別のＲＮＡ要素もまた本発明の主題になりつる。

本発明を実施するために実際のＲＮＡ構造を知る必要はな（、特定のＲＮＡ配列がＲＮＡ結合蛋白質により認識され、およびこの相互作用が重要な生物学的帰結を持っていることさえわかればよい。この点において、ピリオン形成のためのレトロウィルスの構造蛋白質により認識されるウィルスＲＮＡ配列および構造もまた本発明の主題である。蛋白質と相互作用して重要な生物学的機能に影響を与える任意のＲ，Ｎ　Ａ構造の模倣物も本発明の精神および範囲に含まれるであろう。

素で作り上げられた組がウィルスが複製するかまたは休止状態で残るかを決定する。ＨＩＶゲノム中で同定された９つの遺伝子の内、Ｗ、Ａ、Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｆ、Ｗｏｎｇ−３ｔａａ１．５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、１０月、５２　（１９８８）に記載されているようにたったの３つがコアおよびエンベロープからのものである。他の６つの遺伝子はウィルス蛋白質の産生の制御に含まれている。

制御遺伝子はウィルスゲノム上のどこか別の所の応答性要素と相互作用する蛋白質をコードすることにより作用する。複製のバーストの開始の原因となる主制御遺伝子はｔａ±（トランス活性化剤）遺伝子である。１且杏遺伝子の生成物であるｔａｔ蛋白質はＴＡＲ（トランス活性化応答性要素）として知られている短い配列要素と相互作用することにより作用する。ＴＡＲ配列はウィルスロングターミナルリピート（ＬＴＲ’　Ｓ）中にコードされており、それ故すべてのＨＩＶ遺伝子からのｍＲＮＡ中に含まれている。

ｔａｔ蛋白質の発現は他のＨＩＶ遺伝子（工且工遺伝子それ自身を含む）の発現を１，０００倍まで増加させる。この自己制御陽性フィードツク・ツクのため、およびＴＡＲ配列がすべてのＨＩＶ転写体からのｍ　ＲＮ　Ａ中に含まれているというフサイクルに決定的であり、この相互作用の特異的破壊はウィルスの繁殖を中断するらしいと信じられている。遺伝子発現の変調。

ｔａｔ蛋白質によるＴＡＲ−含有遺伝子のトランス活性化の機構は５ｈａｒｐ。

Ｐｈ１ｌｉｐＡ、およびＭａｒｃｉｎｉａｋ、Ｒｏｂｅｒｔ、Ａ、、Ｃｅ１１５９．２２９　（１９８９）により記載されているごと（最近熱心に研究された。

ＡＲはＤＮＡ構造というよりもＲＮＡ構造体として機能しているようである。驚くべき結果は、ｔａｔはＴＡＲ−含有遺伝子の転写を増加させるが、それはＲＮＡ中のＴＡＲ要素と相互作用することによることであった。トランス活性化を達成させるためにはＴＡＲ要素は転写の開始の部位から直ぐの“下流“に位置していなければならない。さらに、ＴＡ、Ｒは配向依存性である；もし、逆の配向に挿入されたら機能しない。ＴＡＲ機能は転写の開始の上流の他のＨＩＶ配列の存在に依存しないが、プロモーターとは独立して働くであろう。

という努力は、２つの株間のＴＡＲ領域領域−次配列の相同性はほとんどないにもかかわらず、ＨＩＶ−１からのｔａｔ蛋白質がＨＩＶ−２（ウィルスの異なった株）のＴＡＲ領域を含むベクターをトランス活性化できたという観察により活気づけられている。Ｓ、Ｆｅｎｇ、Ｅ、Ｃ，Ｈｏ１ｌａｎｃｉ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４．１６５　（１９８８）を参照されタイ。シカシナカラ、ＨＩＶ−１おＪ：びＨＩＶ−２からのＴＡＲ配列のコンピュータープログラムによる検討によると、ＨＩＶ−１のＴＡＲ領域領域−一ステム−ループおよびＨＴＶ−２中の３つのステム−ループ構造を持つＲＮＡステム−ループ構造の可能性を示すＲ，ＮＡ二次構造を予測している。ステムの組成物および長さは異なっていたが、４つのすべてのループはペンタヌクレオチドＣＵＧＧＧを含んでいた。図１はＨＩＶ− Ｉ　ＴＡＲ領域の直線状配列を示しており特色のある所に下線が引いである。Ｆ　ｅ　ｎ、　ｇ（前記文献）による突然変異誘発実験は、ループ中に存在する各々のヌクレオチドはｔａｔによるトランス活性化に必須であるが、ステム！填が維持される限りステム中の塩基置換は許容された。図ＩＡおよびＩＢはＨＩＶ− Ｉ　ＴＡＲの直線状（−次）および二次構造を示している。

ＴＡＲ構造の役割の更なる証拠は天然のＴＡＲステム−ループよりも安定な競合二次構造をＲＮＡに作ることによりステム−ループ構造に隣接する配列が改良された実験から得られた。Ｂｅｎ　Ｂｅｒｋｈｏｕｔ、Ｃｅ１１　５９，２７３（１９８９）参照。このことはＴＡ、Ｒ−含有ＲＮＡ内ヘ内子ステム−ループ構造 ′側に対してアンチセンスである付加的配列を導入することにより達成された。

修飾ＴＡＲ構造のトランス活性化が失われ、ＴＡ、Ｒ配列単独ではトランス活性化には十分ではなく、これらの配列は活性であるような適切な二次構造に折りたたまれていなければならないことを示唆している。また、Ｔ、ＡＲステム−ループに対するアンチセンス配列は天然ＲＮＡ構造を破壊できることも示している。

ＴＡＲステム−ループ構造の直接的生化学的証拠も得られている。ＴＡＲＲＮＡがイン　ビトロで酵素的に合成され、ＲＮＡの一本鎖領域を選択的に切断するがデユープレックス構造は切断しない酵素で証明された。切断パターンの結果はコンピューター予測ＲＮＡ二次構造と一致した。

すなわち、現在以下のことが明らかである：１、ＨＩＶ　ｔａｔ蛋白質は美大な量のウィルス遺伝子発現の引き金を引く原因になる：２、このことはすべてのＨＩＶ　ｍＲＮＡ転写体内へ取り込まれているＴＡＲ配列との相互作用により起こる。

３、ＨＩＶ　ＴＡＲ配列はＲＮＡ二次構造体として機能する；および４、正確なＴＡＲＲＮＡ二次構造はｔａｔｈランス活性化に必須である。

ＴＡＲＲＮＡ構造を特異的に模倣し、ｔａｔトランス活性化を妨害すると信じられる化合物が発見された。これらのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体化合物はＨＩＶ感染の治療薬としての活性を持っているようである。

ＨＩＶのすべての株が本発明の精神および範囲に含まれるつもりである。ＨＩＶの異なった株は異なったＴＡＲ配列を持つであろうし、それは異なった構造に折りたたまれることが了解されるであろう。本発明は異なった株の構造を模倣するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の配列へ変更することにより異なったＨＩＶの株についても実施できる。すなわち、本発明のこの特色はすべてのそのような株および各々のＴＡＲ領域のためのオリゴヌクレオチド模倣体に関係する。

ＴＡＲおよびｔａｔ機能はＨＩＶゲノムから遺伝子を除去することにより研究されてきており、それらは単離された細胞株で研究された。ｔａｔ蛋白質およびＴＡＲ要素間の相互作用の研究のためベクターが構成された。工且工蛋白質はＳＶ４０プロモーター下で発現される。例えば、Ｓ、Ｆｅｎｇ、Ｅ、Ｃ，Ｈａｌｌａｎｄ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４，１６５　（１９８８）およびＰ、Ｈｅｎｔｈａｒｎ、Ｐ、Ｚｅｒｖｏｓ、Ｍ、Ｒａｄｕｃｈａ、Ｈ，Ｈａｒｒｉ　ｓ、Ｔ、Ｋａｄｅｓｃｈ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．６３４２　（１９８８）により報告されているようなりロラムフェニコール　アセチル　トランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）または胎盤アルカリ性ホスファターゼ遺伝子（ＰＡＰ）のような容易にアッセイできるレポーター遺伝子が融合された別々のプラスミドからＴＡＲ領域が発現される。

細胞カルチャーモデル中の酵素活性はＴＡＲ領域の必須要素の存在およびｔａｔ蛋白質の存在の両方に無関係であることは示されている。適切な総説としてはＰｈ１ｌ　ｉｐ　Ａ、５ｈａｒｐ、Ｒｏｂｅｒｔ　Ａ、Ｍａｒｃｉｎｉａｋ、Ｃｅ −ＩＩ　５９，２２９　（１９８９）；Ｆｅｎｇ（前記文献）：Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｆ。

Ｌａ５ｐｉａ、Ａｎｄｒｒｅｗ　Ｐ、Ｒｉｃｅ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｂ、Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｃｅ１ｌ　５９．２８３　（１９８９）；Ｊ、Ａ、Ｇａｒｃｉａ、Ｄ、Ｈａｒｒｉｃｈ、Ｅ、５ｏｕｌｔａｎａｋｉｓ、Ｆ、Ｗｕ、Ｒ，Ｍｉ　ｔｓｕｙａｓｎ、Ｒ，Ｂ、Ｇａｙｎｏｒ、ＥＮＢＯＪ、８．７６５　（１９８９）；およびＢｅｎ　Ｂｅｒｋｈｏｕｔ、Ｃｅ１１　５９，２７３（１９８９）が挙げられる。

本質において、ベクター系はＨＩＶ感染細胞で起こるｔａｔ誘発ＴＡＲトランス活性化の出来事を再構成する。

ｔａｔ／ＴＡＲトランス活性化は、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ遺伝子（ＰＡＰ）　をエンハンサ−、プロモーターおよびＴＡＲ要素を含むＨＩＶ−ＩＬＴＲ配列の制御下に置くことによりアッセイできる。Ｓ、Ｆｅｎｇ、　Ｅ、Ｃ。

Ｈｏｌ　１ａｎ、ｄ、Ｎａｔ、ｕｒｅ　３３４，１６５　（１９８８）に記載されて（ＸるＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ，’ｐＨＩＶｃＡ、Ｔ−Ｏｔ−含むプラスミ）’ はＨＩＶＵ３を全部および＋７８位から上流のＲ領域（ＨｉｎｄＩＩＩ部位）を含んでいる。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡａｔＩＩの組合せで消化すると、Ｒ，ＮＡのプロセッシングに関与するＳＶ４０配列と共にＣＡＴカセットを放出する。Ｐ、Ｈｅｎｔｈｏｒｎ、Ｐ、Ｚｅｒｖｏｓ、Ｍ、Ｒａｄｎｃｈａ、Ｈ，Ｈａｒｒｉｓ、Ｔ、Ｋａｄｅｓｃｈ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．６３４２　（１９８８）で言及されているように、第２のプラスミド、ｐｓＶ２ＡＰＡＰはＳＶ４０プロモーターの転写制御下の真核生物プロセシング信号を持つＰＡＰカセットを含んでいる。Ｈ１ｎｄＴＩＩおよびＡａｔＩＩによる消化によりプラスミドからＰＡＰカセットおよびプロセシング配列が放出できる。新規プラスミド。

ｐＨＩＶＰＡＰはＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲおよびｐＨＩＶＣＡＴ−０から（Ｄベタ９ −配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／Ａａ　を工Ｉ断片をｐＳＶ２ＡＰＡＰからのＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ／ＡａｔＩＩ　ＰＡＰカセットに連結することにより作製された。

ＳＶ４０プロモーターの調節制御下ｔａｔコード領域を発現する第２のプラスミドｐ　ｃＤＥＢ　ｔ　ａ　を存在下でｐＨＩＶｃＡＴ−０がトランス活性化されることが示された。しかしながら、Ｆｅｎｇにより記載されているようにｐｃＤＥＢｔａｔの同時トランスフェクションなしではＣＡＴ活性は観察されない。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の活性を試験するためにカルシウム／リン酸法を用いてヒーラ細胞内へｐｃＤＥＢｔａｔおよびｐＨＩＶＰＡＰを同時トランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間に細胞を採取し、Ｈｅｎｔｈｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、により記載されているようにＰＡＰ活性をア、ノセイした。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の影響は化合物を直接トランスフェクション混合物へ添加することにより、または化合物をトランスフェクション後種々の時間及び濃度で培地に添加し、例えばトランスフェクション後２４−４８時間にＰＡＰアッセイを行うことにより決定された。

細胞は以下の例示のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体配列により処理された：ＧＧＵｔｌＡＧＡＣＣＡＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＩＪＧＧＧＡＧＣ１ｌＣＬＩＣＵＧＧＣ１］ＡＡＣＵＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＵＣＵＵＧＧＧＡＰＡＰ活性によりモニターされたＨＩＶ　ＬＴＲ遺伝子発現の変調が観察された。

前に説明したｔａｔ−誘発病理状態の処置において薬理学的に有用であるためには、ＴＡＲ模倣体は非修飾ＴＡＲＲＮＡでは出会わないある種の一般的な構造／機能基準を最小限満たしていなければならない。ここに示される特定の組成物は以下のゴールを達成するように計画されている。第１におよび最も重要なこととして、ヌクレアーゼ耐性（ＲＮａｓｅおよびＲＮＡ活性ＤＮａｓｅ）を与えなければならない。第２に、ｔａｔ結合に必要とされる最小のＴＡＲ断片を用いるべきである。促進されたｔａｔ結合特異性および親和性および治療指標は結合ＴＡＲの好適な配座の配座安定化により達成できる。最後に、特異性の天然の化学的基礎の改良により、組成物はｔａｔに対する促進された親和性および特異性を持つことができた。表１に示したように本発明の教示に従い多数のＴＡＲ模倣オリゴヌクレオチド配列が製造された：１〜５８１３４８　５’　−ＬＩＣＬ！　Ｃ［ｌＧ　ＧＣＵ　ＡＡＣＬＩＡＧ　ＧＧ−３ ’表１に示された配列を含む２゛−０−メチルオリゴヌクレオチド類似体、化合物２３０６がＨＩＶ遺伝子発現の阻害において著しい活性を持つことが示された。

Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌは高レベルのｔＲＮＡ−ＴＡＲ融合転写体の発現はＨＩＶ−１複製の効果的な阻害に関連し、ＣＥＭ　ＳＳ細胞中のＨＩＶ−１複製に伴う細胞変性効果を防止したと記述しているっＣＥＭＳＳはＨＩＶ−１複製に感受性が高いヒトＴ−リンパ球細胞株である。Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌは結合が直接的にせよ細胞因子を経た間接的なものにせよその機能を現わすためにｔａｔはＴＡＲと物理的に会合しなげればならないと仮定することは合理的であると侶じている。もしそうなら、ＴＡＲ配列をコードしているＲＮＡ種の過剰発現はｔａｔおよび／または細胞因子に結合するおとりとして働くことができ、ウィルスＤＮＡ中にコードされているＴＡＲ配列へのその結合を防止する。

その結果はウィルス遺伝子発現活性化しないことであろうし、ウィルスの子孫の発生がないことであろう。ＣＥＭ　ＳＳ細胞中のＴＡＲおとり誘発ＨＩＶ−１複製の阻害は非常に効果的であることが示されている。ｔａｔ誘発トランス活性化を消滅させるＴＡＲステムまたはループ配列中の塩基変化はまたこれらの細胞においてＨＩＶ複製を阻害するＴＡＲおとりＲＮＡの能力を消滅させることも示されている。これらの結果はｔａｔ誘発トランス活性化が過剰の非つィルスＴＡＲ含有ＲＮＡの存在により競合的に抑制されるので、ＴＡＲおとり含有細胞中でＨＩＶ複製が阻害されていることを示唆しているがしかじ証明しているわけではない。

Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　８７：５８１７−５８２１　（１９９０）はｔａｔ−ＴＡＲ相互作用を阻害する可能な方法は過剰のＴＡＲおとりを提供することであると記述している、即ち、ＴＡＲ配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）はトランス活性化を誘発する因子と競合的に結合し、それらを働かな（なるようにする。Ｔ　、Ａ　Ｒおとりの使用においての問題点は有効なまで標的細胞内へ十分なコピーを入れることができないことであろう。この問題に対して示唆された解答はＴＡＲの多数のコピーを頭−尾縦列配ヒト細胞中でそのようにして産生された転写体は夕　ｅｆにおいてｔａｔ −ＴＡＲ相互作用を妨害したことを示した。

より記載されたＴＡＲおとりと異なっている；生じるＲＮＡ　（ＴＡＲ）はその不安定さのため治療的には有用ではなかった。

る血管腫瘍である。疾患の初期段階の障害は通常転移性というよりも多病巣性である。転移も起こり得るが、通常疾患の経過の後期である。

ＡＩＤＳに伴なったＫＳは従来知られているＫＳ（珍しい病気で、はとんど独置は主として実験的、非特異的であり、非常に勇気づけるものではない。ｒｏｍにおける疾患を記載している。これらの患者における化学療法の使用は、それがさらに細胞免疫性を害し、日和見感染の危険性を増加させるので論争中である。

ビンカアルカロイド　ビンクリスチンおよびビンブラスチンのような単一薬剤およびポロフィロトキシン（ＶＰ−１６）での試みは変化しつる結果および軽い〜中程度の毒性を示した。しかしながら応答持続時間が短（、しばしば病気がぶり返した。組合せ治療もまた試みられたが日和見感染の著しい発生を伴ちた。免疫療法もまた試みられた。アルファインターフェロンが活性であることが示された：しかしながらこれはその抗腫瘍効果によるものであろう。現在まで基礎にある免疫不全を元にもどした処置法はない。

ＡＩＤＳウィルスの主制御遺伝子の一つの生成物であるｔａｔ蛋白質はＡＩＤＳ患者のカポジ肉腫から誘導された培養細胞の増殖因子であることが発見されている。紡錘細胞（ＫＳ細胞またはＫＳ紡錘細胞）と呼ばれているこれらの細胞はＫＳの腫瘍細胞と疑われている。

５ａｌａｈｎｄｄｌｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４２：４３０−４３３　（１９８８）はＡＩＤＳ付随ＫＳおよびおそら＜ＫＳの他の型もこれらのＫＳ細胞の増殖を誘導する信号により開始されるであろうと記載している。ＨＩＬＶ−ＩＩ−感染および形質転換Ｔ細胞株からの条件付は培地存在下でのＡＩＤＳ −ＫＳ細胞の培養が研究された。増殖刺激はＡＩＤＳ−ＫＳ細胞で誘導されたが対照細胞ではなく、これらのＫＳ紡錘細胞がＫＳ障害の進行および維持に重要な役割を果たしているであろうこと、およびより重要な事はＨＩＬＶ−感染および形質転換Ｔ細胞株により放出される因子がＡＩＤＳ−ＫＳ細胞の刺激に関与していたことが示唆された。

Ｃ０８−１細胞の両方から培地中へｔ　ａ、　ｔが放出されたことを開示している。ｔａｔ−含有培地はＡＩＤＳ−ＫＳ細胞（ＡＩＤＳ患者のＫＳ障害部由来の培養紡錘様細胞）を特異的に増殖させ、それは抗−ｔ　ａ、　を抗体で阻害されたのでＨＩＶ−１感染患者のＫＳの発生または進行（または両方）に細胞外ｔａｔが関与するかもしれないことを示唆している。ＡＩＤＳ−ＫＳ細胞のヌードマウスへの移植はＫＳに非常に類似したマウスの障害を生み出した。

ＨＩＶ−１感染ＣＤ４＋Ｔ細胞からの条件付は培地中のＫＳ−増殖促進活性の存在、ＫＳ組織または培養細胞からのＤＮＡ中のＨＩＶ−１配列の不在、および↓ ａ　ｔ、遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスはＫＳ様障害を進行させ皮膚にｔａｔを発現するが腫瘍細胞には発現しないことが観察されたことは、ＫＳにおけるＨＩＶ−１の役割は間接的であること、およびｔ　ａ、　ｔそれ自身は感染細胞から放出され、Ｋ、Ｓの形成に関与する標的細胞の活性化および増殖を促進させることを示している。

ＫＳにおけるｔａｔの役割のさらなる証拠はトランスジェニックマウスによるトのに、Ｓと非常に類似した皮膚腫瘍の発生と関連している。

ついて記載している。得られるトランスジェニック動物はカポジ肉腫（ＫＳ）に類似の皮膚障害を発生させ、ＨＩＶおよび特にｔａｔ遺伝子産生物がＫＳの発生に寄与していることを示唆している。

ｔａｔおよび神経毒性ＨＩＶ−１の感染は痴呆、亜急性脳炎およびを髄の空胞性変性を含む神経学的症候群によりしばしば複雑化される。脳からのＨＩＶ−１の同定および単離は、ＨＩＶ感染患者で観察される神経学的障害はレトロウィルス感染が原因であることを示唆している。

５ａｂａｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６５：９６１−９６７（１９９１）はｔ　ａ、　ｔまたはいくつかのｔａｔ断片の脳室内注射がマウスに神経毒性および致死効果を与えたことを記載している。結合実験および電気生理学を用いてｔａｔ神経毒性が構造−活性相関により研究された。ｔａｔ結合部位は効率的なトランス活性化に決定的な高度に塩基性のドメインを含む４８から６６の領域であることが同定された。ｔａｔは細胞膜の膜脂質二重層へその塩基性ドメインで結合することが示されている。ｔａｔ結合は神経刺激のようないくつかの生物学的影響を直接引起こすことができ、神経学的機能障害の促進することが示唆された。

ｔａｔおよび免疫不全ＡＩＤＳの証明の一つはＴ４細胞の枯渇、続いての免疫不全の発生である。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞の破壊ではＨＩＶ感染の免疫病理学的効果を適切に説明できない。例えば、感染の初期でさえ、患者のリンパ球は、２　Ｍ）ｏで可溶性抗原を認識および応答するその能力に欠陥を持っている（まだＣＤ４＋Ｔリンパ球は正常の数存在するにもかかわらず）。反対に突然変異誘発剤に応答して増殖するリンパ球の能力はこれらの患者で失われていない。Ｖｉｓｃｊｄｉ　ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：１６０６−１６０８　（１９８９）はｔａｔが抗原誘発リンパ球増殖を阻害するが突然変異誘発剤誘発増殖は阻害しないことを記載している。エン　旦上…研究において、５０ｎＭのｔ　ａ、　ｔで５０％阻害に十分であり、ｔａｔは強力な免疫抑制剤であろうことが示唆されている。

Ｖｉｓｃｉｄｉ　ｅｔ　ａｌはｔａｔが細胞外に提供されなければならなかったか、または内部で産生されたｔａｔがこれらの効果を引起こすことができるかどうかは知らなかった。本発明においては局所適用がＫＳの処置に最も有用であると信じられている。しかしながら、投与の形は治療上の用途に依存するであろう。

すなわち以下の点が示された：１、ｔａｔ蛋白質およびそのＴＡＲＲＮＡとの相互作用はＨＩｖ複製のためには決定的である、２、細胞から分泌されるｔａｔ蛋白質はＡＩＤＳにおけるカポジ肉腫の発生および進行に役割を果たしているらしい、３、ｔａｔ蛋白質は特異的神経毒性効果を持っており、ｔａｔの中枢神経系の膜への結合がＡＩＤＳにしはじは伴う神経学的症候群の原因であろうことを示唆している、および４、ｔａｔ蛋白質は特異的様式でＴ細胞増殖を阻害し、ｔａｔがＡＩＤＳに伴う免疫不全に直接寄与しているにちがいないことを示している。

ＨＩＶ　ＣＡＲ要素およびｒｅｖ蛋白質ＨＴＶ　ＣＡＲ要素は本発明の別の好適な実施態様を提供する。ヒト免疫不全ウィルスのライフサイクル中の制御的事件は大きなピリオン構造ＲＮ’　Ａの蓄積であり、それはより短い、制御ＲＮＡを消費して蓄積される。本質において、ウィルスは各々の蛋白質の組をコードするのに多くの同じＲＮＡ材料を使用する。もしＲ，ＮＡがより広範囲にスプライスされると、制御蛋白質が産生される。もしＲＮＡがあまり広範囲にスプライスされないと、構造蛋白質が産生される。例えば、Ｗ、Ａ、Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｆ、Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ、５ｃｉｅｎｔｔｆｉ御される。ｒｅＶ’ｓの機能は細胞の核から細胞質へのＲＮＡの輸送の促進である。ｒｅｖ非存在下ではｍＲＮＡが細胞の核に残り、そこでスプライシング酵素の目標となり、制御蛋白質をコードするｍＲＮＡへ変換される。ｒｅｖ存在下ではｍＲＮＡは細胞質へ運ばれスプライシングが少なくなる。

Ｅ、Ｔ、Ｄａｙｔｏｎ、、Ｄ、Ｍ、Ｐｏｗｅ　１１．Ａ、１．Ｄａｙｔｏｎ、旦旦要素として知られているＲＮＡ構造要素に結合することによりｒｅｖは機能する。

この構造要素はまたｒｒｅ　（ｒｅｖ一応答性要素）とも称されてきた。機能性ＲＮＡは７３５８−７６２７と同等の且ユヱ　ＲＮＡ中の２６９ｂｐ領域に局在していた。例えば、Ｌ、Ｒａｔｎｅｒ、Ｗ、Ｈａｓｅ　１　ｔ　ｉｎｅ、Ｒ，Ｐａｔａｒｃａ、に、Ｊ、Ｌｉｖａｋ、Ｂ、５ｔａｒｃｉｃｈ、Ｓ、Ｆ、Ｊｏｓｅｐｈｓ。

が図２に示されている。便宜上この構造をＣＡＲ要素と称する。ＣＡＲ要素の二次構造は現在のところ確かではない。しかしながら、Ｍ、Ｚｎｋｅｒ、Ｓｃｉｅラムのごとく、当業者には普通に使われているコンピュータープログラムを用いてＣＡＲ要素の二次構造が予測可能である。そのような分析の結果、図３に示したような結果を得た。図３に示した各々のステムループ構造はｒｅｖ遺伝子生成物と相互作用する可能性を持ち、各々が本発明の実施態様としてオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体により模倣できる。コンピュータープログラムにより予想され、図３に図示されている構造が正しいことが確かであるわけではない。しかしながらこのことはＣＡＲ要素構造のための本発明の実施を制限しない。この場合および実際のＲＮＡ構造が不確かなすべての他の場合においても本発明は一連のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を作製することにより実施でき、それはコンピューター予想に従うと最も低いエネルギーを持つと予測される構造から始め、よりエネルギー的に不安定な構造へと連続的に追加のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド組成物を作って配列を調べる。

８８を参照されたい。簡単に説明すると、種々のプロモーターの制御の子細胞中でＨＩＶ　ｍＲＮＡを発現するベクターをｒｅｖ蛋白質を発現するベクターと共に細胞内へトランスフェクトする。ｒｅｖが正常に機能すると細胞質へのｍＲＮＡの輸送が容易になり、輸送されたｍＲＮＡはｇａｇ蛋白質をコードしており、それは免疫吸着アッセイにより検出される。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体がこの過程を妨害した場合、ｇａｇ蛋白質の産生の減少が測定される。これらの実験の実施に必要とされる試薬はＡＩＤＳリサーチ　アンドリファレンス　リージェントプログラムを通して国立保健研究所から入手可能である、１９９０カタログ、国立アレルギーおよび感染疾患研究所。

オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の効果は化合物のトランスフェクション混合物への直接的添加により、またはトランスフェクション後の種々の時間に種々の濃度で培地へ化合物を添加し、次に例えばｌ・ランスフエクンヨン後２４−４８時間にアッセイすることにより決定されるであろう。

本発明は特異的にＨＩＶ　ＲＮＡ構造を模倣し、ウィルスの複製および機能を妨げると信じられている化合物に関する。これらのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体化合物はある種のＨＩＶ蛋白質の発現を調節する活性を持っていることが示された。本発明の教示に従うと、オリゴヌクレオチド合成、精製および分析（特異的オリゴヌクレオチド配列および配座を含む）；およびこれらの例示のオリゴヌクレオチドの細胞を用いた評価に関する以下の実施例が理非修飾オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機上でヨウ素により酸化する標準ホスホアミダイトの化学を用いて合成された。試薬、ＣＰＧ−結合およびβ−ンアノエチルジイソブ口ビルホス７フイトの両方ともＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、（Ａ）から購入された。ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドの製造には標準酸化ボトルはホスホアミダイト結合の段階的硫化のための領　２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン　１，１−ジオキシド（Ｒ，Ｐ、Ｉｙｅｒ、Ｗ、Ｅｇａｎ、Ｊ、Ｂ、ＲｅｇａｎおよびＳ、　Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（１９９０）１１２：１２５３−１２５４）アセトニトリル溶液に置き換えられた。硫化サイクル時間は６８秒に増加された。ＣＰＧ−カラムから切断後、濃水酸化アンモニウム中５５℃で脱保護しく１８時間）、ホスホロチオエートはＰＲＰ−１カラムをつけたトリチル−オンＨＰＬＣにより精製され５０ｍＭのトリエチル−酢酸アンモニウム中、ｐＨ７、アセトニトリルの濃度勾配を用いる（３０分で４％から３２％、流速１．５ｍ１）ことによりホスホロチオエートが精製された。適当な分画をプールし、蒸発させ、５％酢酸で室温にて１５分間処理した。溶液は等量の酢酸エチルで抽出し、水酸化アンモニウムで中和し、凍結し、凍結乾燥した。２’−０−Ｍｅオリゴヌクレオチドの製造のためには通常のホスホアミダイトモノマーをＣｈｅｍｇｅｎｅｓかう購入した２°　−０−Ｍｅ置換ホスホアミダイトに置き換えた。分析ゲル電気泳動は２０％ＡＡ、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリスホウ酸緩衝液、ｐＨ７，４０ｖ／我々の合成により得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量が３１Ｐ　ＮＭＲスペクトロスコピーにより決定された。スペクトルはパリアンＮＭＲスペクトロメータ上３１ｐ周波数１６２ＭＨｚで測定された。

典型的には、１０００回積算された。完全に緩和したスペクトルを確かに得るためにトランジェントの間に７．５秒の緩和遅延時間を使用した。ｓａｐミルスペクトル水またはジメチルスルホキシド−ｄ６を溶媒として使用し、室温で測定した。ホスホロチオエート試料は典型的には１パーセント以下のホスホジエステル結合を含んヒーラ細胞を１０％ＦＣ３を加えたＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで維持した。アンチセンス実験のためには細胞を６ウエルの皿に実験の前日に５０％コンフルエンシーで播種した。

各々の皿に対し、１ＭｇのｐＨＩＶｐａｐおよび１２μｇのｐｃＤＥＢｔａｔを５００、ｃｚｌのＩＸＨＢＳおよび３２μｍの２．５Ｍ　ＣａＣＬ中で沈殿させた。

ＣａＰＯ，沈殿物は６つのＯウェル間で均等に分割し、沈殿の除去および新しい培地の添加に先立って６時間そのま＼にした。１６時間後アンチセンスオリゴヌクレオチドが同じ方法によりトランスフェクトされた。次の日細胞を２回ＴＢＳで洗浄し、５００μｍに取り、その１００μｍは蛋白質アッセイに使用された。

残りの４００μｍの細胞懸濁液はベレット化し、５０μＩＴＢＳ緩衝液に再懸濁した。次に内在性ホスファターゼを６５℃に３０分加熱して不活性化した。熱安定性ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ活性を、５００μｌの５ｍＭ　ＰＮＰＰ（Ｓｉ　ｇｍａ）ＴＥ、Ａ緩衝液溶液を細胞墾濁液に加え続いて３７℃でインキュベーションすることにより検定した。ホスファターゼ活性は反応混合物の１５０μｍアルコートを用い、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣ／３４０ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測ることにより３０分間隔で決定された。ＰＡＰ活性は採取した１１５のＴＢＳ溶液（０，１ｍ１）を３０μｍのＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白質試薬に加え、次に室温で１０分間インキュベートし、続いてＴｉｔｅｒｔｅｋ　プレートリーダーを用いて５９５ｎｍでの吸光度を測定することによるＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイにより決定された各々のウェル中の総蛋白質で規格化された。オリゴヌクレオチド１３４５，１３４６゜１３４７．１３４８および１３４９で観察されたＰ　Ａ　Ｐ活性の阻害は図５および６に示されている。

一ブレックス　ＤＮＡ鋳型はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて合成された。ＰＣＲプライマーはｐＨＩＶ−ＰＡＰの配列に相補的なように設計された：５′−ブライ７−　（３５−ｍａ　ｒ）構成物はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ　プロモーターの１７塩基に対応する最も５°−の配列（ｐＨＩＶ−ＰＡＰ配列と非相同であった）続いてのＴＡＲステム−ループの最初の１８のヌクレオチド（５ ’　−ＡＡＴ＾ＧＣＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧ　ＧＴＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＣＣＡ−３’　）に対して相同的であった１８の塩基から成っている；３′−プライマー（２０−ｍａｒ）はＴＡＲステム−ループの最後の２０塩基（５°−ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＡＧ−３’　）と相同であった。Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅の３０サイクルでの標準的ＰＣＲセットアツプが使用された。増幅されたデユーブレックス鋳型は標準的有機溶媒抽出続いてのエタノール／酢酸ナトリウム沈殿により精製された。

ＴＡＲＲＮＡのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ合成　デユーブレックスＤＮＡ鋳型を１２．５ｍＭの各々にＧＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰおよびＵＴＰ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１，０ｍＭスペルミジン、５ｍＭ　ＤＴＴ；０．０１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００，２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ　８０００．３１ｍＭＭｇＣＩ２および１０％（Ｖ　／　Ｖ　）ポリメラーゼ反応効率の最適化のため前もって添加）のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ調製試料を含む１．０ｍＬの反応混合物へ５００ｐＭで添加された。反応液を３７℃で４ｈインキユベートした。ＲＮＡ生成物はＰＡＧＥ精製され、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化され、ＵＶ吸光度により濃度が決定され、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて高比放射活性（７０００Ｃｉ／ミリモル）で５゛末端を３２ｐで標識した。

実施例４ＴＡＢ−ｔａｔ結合のポリアクリルアミド　ゲル移動度シフトアッセイ［５’　 −”Ｐ］　−ＴＡＲＲＮＡ保存溶液のすべての希釈液を４ｍｇ　ｐｄｌｄＣを含むｐ）（’７．５のＴＥとなし、ｔａｔ３９−ｍａｒペプチド（ｔａｔ３Ｂ；　ｔａｔ蛋白質配列中の４　Ｌ−８６）のすべての保存溶液（水中）のすべての希釈液も同様に５００ｎＭ　ＢＳＡを含むするｐＨ７，５のＴＥとなす。ｐｄｌｄＣおよびＢＳＡの封入は各々ＲＮＡおよびペプチドの希釈溶液の非特異的吸着（固体表面への）の効果を減少させるためになされ、独立してＴＡＲＲＮＡへのｔａｔ３９の特異的結合に対する影響がないことが示されている。使用されたｔａｔ３９はＵＣ３Ｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　Ｃ。

ｒｅ施設から得られ、固相自動化学合成され、ＲＰ　ＨＰＬＣで精製され、アミノ酸分析およびマススペクトロメトリーで確認されたものである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ合成により作製されていないＴＡＲおよび類似物は自動化学オリゴヌク）ノオチド合成により作られたものである（表１に合成番号により示されている）。ゲル移動度シフトアッセイは１０ｍＭｈリスーＨＣｌ　ｐＨ７，５，７０ｍＭ　ＮａＣ１，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％（ｖ／ｖ）グセリセロール、５００ｎＭ’ＢＳＡおよび４０ｍｇ　ｐｄｌｄｃを含む１０μｌの反応液に示した濃度（表１）で［５−３２Ｐｌ　−ＴＡＲＲＮＡおよびｔａｔ３９を添加することより実施された。各々の結合混合物は４℃にて３０分間インキュベートし、次に１０％（７５：　１アクリルアミド・ビスアクリルアミド）天然ＰＡＧ上に直接添加する。電気泳動は１／２ＴＢＥ実施緩衝液を用い、２５０Ｖ、４３℃にて約２時間実施した。放射標識ＴＡ、ＲＲ，ＮＡは続いてオートラジオグラフィーにより検出された。予備的スクリーニング実験として遊離および特異的に結合されたＴＡＲおよびＴＡＰ模倣模倣順／類似体るフィルムの暴露の相対強度を視覚的に見積り、続いて適当な数学的およびグラフによる分析により結合パラメータが決定された。

結果は表２に表されている。

表２ゲル移動度シフトｔａｔ−”ＴＡＲ″′結合アッセイＴＡＲ５−５０００１０− ５００４０−−−２００５９−ｍａｒＵ−ＤＮ人　τＡＩ？　５　１Ｏ−１００ＯＮＤ　＜０．００１　ＮＤ　ＮＤ＄１９７３Ｑ−ｍａｒｌ−５０Ａ：Ｐ＝ＳＴＡＲ５１０−１０００く１０　４　３０　３１ｏｏｐｌｅｓｓ　ＴＡＲ５す１５０００１６−２９（−Ａ１７）　デユーブレ７クス＋３６−４５５−ＢｒＵＴＡＲ５１０−１０００４０１ＮＤ　ＮＤ９−ｍｅｒ２’−ＯＭｅＴＡＲ５１０−１０００１０４１００１０＃２３０６２−ＯＭｅＴＡＲ５００，１２５−１２５０，３２８゜２Ｘ１０３６６８２３０６　（ａｇｅｄ）　１６．４ＸＬＯ３２°−ＯＭｅ、Ｐ＝ＳＴＡＲ５１，０−１０００＜１０　４　ＮＤ　）１００＃２１９５１６−４５（−Ａ１７）２°−ＯＭｅ、Ｐ＝ＳＴＡＲ５００，１２５−４１０８，０Ｘ１０”　２０００＃２１９５　１６．４ｘ１０３２０Ｘ１０”２９−ｔｎｅｒ１６−４５（−Ａ１７）４デユーブレツクス構造が単一オリゴの分子内ハイブリダイゼーションによるよりもむしろ個々のオリゴの分子間会合およびハイブリダイゼーションにより形成される場合、オリゴのただ１つが９２ｐで５”−末端標識され、弗により非標識オリゴから区別されている。

実施例５ＨｒＶ遺伝子発現のためのルシフェラーゼ　アッセイの開発ｐＨＩＶ］ｕｃは）（ＩＶ　ＬＴＲの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含んでいるプラスミドである。このプラスミドが細胞内に存在する場合、酵素ルシフェラーゼを産生することによりＨＩＶ遺伝子発現を活性化する同じ制御信号に応答する。ルシフェラーゼは適当な条件下基質ルンフエリンを添加することにより容易にアッセイでき、産生される光の量を発光計中で測定する。すなわち、細胞中でルシフェラーゼの特異的阻害はＨＩＶ遺伝子発現の阻害と等価であり、ヒトにおける抗ウイルス不活性を断定するものである。このアッセイはＦｅ１ｂｅｒ　Ｂ。

Ｋ、およびＰａｒｌａｋｉｓ　Ｇ、Ｎ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１８４−１８７　（１９８８））により記載されているものに類似しているが主な相違は単に酵素がレポーター遺伝子にコードされていることである。このプラスミドを構成するため、プラスミドｐＴ３／Ｔ７１ｕｃ　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ、）およびＩＰ−ＲＧ−２４（ＨＩＶ　ＬＴＲを含むプラスミド）がＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＴＩで完全に消化された。ルシフェラーゼｃＤＮＡおよびＨＩＶ　ＬＴＲおよび他のプロセシング信号を含む制限断片が単離され連結されて）（ＩＶ　ＬＴＲ制御下にルシフェラーゼ蛋白質を発現するｐＨＩＶｌｕｃを発生させる。

実施例６培養細胞におけるＨＩＶ遺伝子発現の阻害の測定法ＨＩＶ遺伝子発現の阻害を試験するため、ヒーラ細胞を実験の１６時間前に６１ウエルプレートにウェル当り３Ｘ１０’細胞で播種した。試験化合物は示された濃度で三つのウェルに添加した。３時間インキュベーションした後、ＨＩＶ）ランス活性化蛋白質、ｔａｔを発現するｐＨＩＶＩｕｃおよびｐｃＤＥＢｔａｔ（Ｆ　ｅ　ｎ　ｇ　Ｓ、およびＨｏｌ　１ａｎｄ　Ｅ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：１６５〜１６７　（１９８８））で細胞をカルシウムリン酸でトランスフェクトした。

簡単に説明すると５ｔｔｇのｐＨＩＶｌｕｃおよび６μｇのｐｃＤＥＢｔａｔを５００μｍの２５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚに加え、次に５００μｌの２ＸＨＢＳを加え続いてうず巻き状にかきまぜた。３０分後ＤＮＡ沈殿物をプレートの６つのウェル間で均等に分割し、４−６時間インキュベートした。培地および沈殿物を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、最初の濃度の試験化合物を含んでいる新しい培地を加え、１６時間インキュベートした。

ルシフェラーゼ活性は以下のようにして各々のウェルで決定された。培地を除去し、次に細胞を２ＸＰＢＳで洗浄した。細胞は次に２００μＩのＬＢ　（１％トリトンＸ−１００，２５ｍＭグリシルグリシンｐＨ７，８，１５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＜。

４ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ）でプレート上で溶菌させた。各々のウェルから７５μｌのアリコートが７５μｍのアッセイ緩衝液（２５ｍＭグリシルグリシ：／ＤＨ７，８，１５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，４ｍＭ　ＥＧＴＡ、１５ｍＭ　ＫＰＯ４゜１ｍ、Ｍ　ＤＴＴ、２．５ｍＭ　ＡＴＲ）と共に９６ウエルプレートへ加えられた。

プレートは７５μ】のルシフェリン緩衝液（２５ｍＭ　グリンルグリシンｐＨ７゜８．１５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，４ｍＭ　ＥＧＴＡ、４ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ルシフェリン）を各々のウェルに注入し、発光された光を測定するＤｙｎａｔｅｃマルチウェル発光計で読みとられた。

実施例７ＨＩＶ　遺伝子発現の阻害におけるＲＮＡ模倣体の活性化合物２３０６は先端が切れたＨＩＶＴＡＲステム／ループ構造を形成する２′−〇−メチルオリゴヌクレオチド頚似体２９−ｍｅｒである。化合物２３０６はイン　ビトロにおいてもｔａｔペプチドに結合することが発見されている。

化合物２８４８および２８５０も同様の長さを持ちステム／ループ構造を形成するＯ−メチル類似体であるがループおよびバルジ領域中の広範囲な突然変異のためイン　ビトロではｔａｔペプチドと結合できない。ＨＩＶ遺伝子発現アッセイにおいて、化合物２３０６は１μＭ以下の用量で対照２８４８および２８５０化合物よりもＨＩＶ遺伝子発現阻害の有意な活性を示した（図７）。より高い用量（７μＭ）においては対照化合物２８４８および２８５０に何らかの非特異的活性があり、それは特異的化合物２３０６ではより少なかった。

［配列表コ（１）一般情報（ｉ）出願人：Ｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（ｉｆ）発明の名称：ＲＮＡ模倣による遺伝子発現の活性変調のための試薬および方法。

（伍）配列数：５（ｔｖ）連絡住所・（Ａ）受信人：Ｗｏｏｄｃｏｃｋ　Ｗａｓｈｂｕｒｎ　ＫｕｒｔｚＭａｃｋｉｅｗｉｃｚ　＆　Ｎｏｒｒｉｓ（Ｂ）通り：　Ｏｎｅ　Ｌｉｂｅｒｔｙ　Ｐｌａｃｅ−４６階（Ｃ）市：　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ（Ｄ）州二ＰＡ（Ｅ）国：　ＵＳＡ（Ｆ）ジップコード：１９１０３（ｖ）コンピューター読み取り可能形（Ａ）媒体型：ディスケット；３．５インチ、１．４４Ｍｂ保存（Ｂ）コンピューター・ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）オペシーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト　５．　０（ｖｉ）現在の出願データ（Ａ）出願番号：ｎ／ａ（Ｂ）出願日二　同封（Ｃ）分類・（ｖｆｉ）先出願データ（Ａ）出願番号：４９７．０９０（Ｂ）出願日：　１９９０年３月２１日（ｖｉ）弁護士／代理人情報（Ａ）名前：Ｊａｎｅ　Ｍａｓｓｅｙ　Ｌｉｃａｔａ（Ｂ）登録番号　３２．２５７（Ｃ）照会／摘要録番号　ｌ５ＩＳ−０１０９（Ｌｘ）電話通信情報（Ａ）電話＋　（２１５）５６８−３１００（Ｂ）ファックス＋　（２１５）５６８−３４３９配列番号：１配列の長さ：５９配列の型：核酸鎖の数二　−末鎖トポロジー：不明配列、配列番号１：ＧＧＧＵＣＵＣＵＣＵ　ＧＧＵＵＡＧＡＣＣＡ　ＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＵ　ＣＵＧＧＣＵＡＡＣ［ｌ　５０ＡＧＧＧＡＡＣＣＣ９配列番号・２配列の長さ・４０配列の型：核酸ＦＩＧυＲＥ２ＡＣにＣυＧＡＣＧＧ　ＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧ　ＡＣＡＡｔＪ’ＵＡｔＪＵＧ　ＵＣＵＧＧυＡＵＡＧ　ｔ７ＧｃＡＧｃＡＧｃＡＧＭＣＡＡＵＵＵＧ　ＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡ　Ｌ７ＵＧＡＧＧＣＧＣＡ　ＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧ　ＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣｌＪＧＧＧＧ　ＣＡＵＣＭＧＣＡＧ　ＣＵＣＣＡＧＧＣＭ　ＧＭＵＣＣＵＧＧＣｔＪＧＵＧＧＡＡＡＧＡ［７６２７］Ｇ要約書ＲＮＡを模倣できる組成物の採用により遺伝子の発現を変調できる。発現が変調されるべき遺伝子によってコードされるＲＮＡの部分は、ひとつ以上のタンパク質と相互反応できるものが選択される。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は次にＲＮＡの部分を模倣するように調製される。遺伝子を含む細胞は次に変調を起こすようにオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させられる。治療組成物及び方法、とくにヒト免疫不全症の治療が開示される。

手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０１８２２２、発明の名称ＲＮＡ模倣による遺伝子発現活性変調のための試薬および方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人住　所　アメリカ合衆国カリフォルニア用９２００８゜カールズパッド、ファラデイ・アベニュー名　称　アイシス・ファーマシューティカルス・インコーホレーテッド４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番］１号新大手町ビル　２０６区５、補正の対象請求の範囲の欄（別紙）１．請求の範囲の範囲を次のとおりに訂正する。

「１．遺伝子の発現を変調する方法であって；遺伝子によってコードされるＲＮＡの部分イ選択し、該ＲＮＡはタンパク質と相互反応することができ、該部分を模するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を調製し、そして遺伝子を含む細胞を該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることから成る方法。

λ、上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が約８から約５０ヌクレオチド単位を模する請求項１に記載の方法。

３、　５’　−ＣＴＪ　ＧＧＧ　Ａ　−３’配列から成る請求項１記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

Ａ、上記配列の５′の直前、少なくても配列の３°部分が、５°　−ＵＣＵ　ＧＡＧ　Ｃ−３°　ヲサ特表千５−５０１０６０　（１４）らに含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

旦、上記配列の３′の直前、少なくても配列のを　５°部分が、二　５°　−ＧＣＵＣ−３°　ヲサラニ含ム、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリｔ　ゴヌクレオチド類似体。

ＡＧＣＵＣ−３’配列を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

ユ、上記配列の５°の直前、少なくても配列のｒ−３°部分が、５’　−ＣＣＡＧＡ　−３’　をさらに含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

′部分が、５°　−ＧＧＵＣＵ　−３′　をさらに含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

旦・５’　−ＵＣＵ　ＧＡＧ　ＣＣＵ　ＧＧＧ　ＡＧＣＵＣＡ　ＧＡ　−３“配列を含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。

よ旦、配列番号１：５　’　−ＧＧＧ　ＵＣＵ　ＣＵＣＵＧＧ　ＵＵＡ　ＧＡＣＣＡＧｎ’ｕｔ、＋　ＥＬｕＡ　ｖ＋、、ｉ：　ＥＬｕｖ　’ＪｎＧ　ＣＵＣＵＣＣＣＧＣＵＡＡ　ＣＵＡ　ＧＧＧ　ＡＡＣＣＣ−３’　；配列番号２：５　’　−ＧＧＵ　ＵＡＧ　ＡＣＣＡＧＡ　ＵＣＵ　ＧＡＧ　ＣＣＵＧＧｃ−ＡＧＣＵＣＵ　ＣＵＧ　ＧＣＵ　ＡＡＣ［１−３’　；配列番号３；５’　−ＧＣＣＡＧＡ　ＵＣＩＪ　ＧＡＧ　Ｃ−３’　；配列番号４：５’　−ＧＣｔｌ　Ｃ［］ＣＣＵＧＧ　Ｃ−３’　；および配列番号５：５’　−ＧＣＣＡＧＡ　ＵＣＵ　ＧＡＧ　ＣＣ１１ＧＧＧ　ＡＧＣＵＣＵ　ＣＵＧ　ＧＣ−３’　。

のうちのひとつの配列から成る請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。」以上国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．遺伝子の発現を変調する方法であって；遺伝子によってコードされるＲＮＡの部分を選択し、該ＲＮＡはタンパク質と相互反応することができ、該部分を模するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を調製し、そして遺伝子を含む細胞を該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させることから成る方法。
２．上記遺伝子が感染性生物のものである請求項１に記載の方法。
３．上記タンパク質が感染性生物によりコードされたＲＮＡの第二の部分によって生産される請求項２に記載の方法。
４．タンパク質とＲＮＡ部分との相互反応が遺伝子の発現の刺激に影響する請求項１に記載の方法。
５．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が少なくとも約６ヌクレオチド単位を模する請求項１に記載の方法。
６．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が約８から約５０ヌクレオチド単位を模する請求項１に記載の方法。
７．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が約１０から約２０ヌクレオチド単位を模する請求項１に記載の方法。
８．上記ＲＮＡが二次構造を有する請求項１に記載の方法。
９．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が上記二次構造の少なくても部分を再生産する請求項８に記載の方法。
１０．疾病を治療する方法であって、遺伝子の発現が該疾病の原因であると思われる遺伝子によってコードされるＲＮＡの部分を選択し、該部分を模するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を調製し、そして該疾病を有すると疑われる生物と該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
１１．上記遺伝子が感染性生物のものである請求項１０に記載の方法。
１２．上記タンパク質が感染性生物によってコードされるＲＮＡの第二の部分によって生産される請求項１１に記載の方法。
１３．タンパク質とＲＮＡ部分との相互反応が遺伝子の発現の刺激に影響する請求項１０記載の方法。
１４．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が少なくとも約６ヌクレオチド単位を模する請求項１０に記載の方法。
１５．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が約８から約５０ヌクレオチド単位を模する請求項１０に記載の方法。
１６．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が約１０から約２０ヌクレオチド単位を模する請求項１０に記載の方法。
１７．上記ＲＮＡが二次構造を有する請求項１０に記載の方法。
１８．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が上記二次構造の少なくても部分を再生産する請求項１７に記載の方法。
１９．上記接触が上記遺伝子の発現を変調するために有効な量および時間である請求項１０に記載の方法。
２０．上記疾病がヒト免疫不全ウィルス感染である請求項１０に記載の方法。
２１．５′−ＣＵＧＧＧＡ−３′配列から成るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２２．上記配列の５′の直前、少なくても配列の３′部分が、５′−ＵＣＵＧＡＧＣ−３′をさらに含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２３．上記配列の３′の直前、少なくても配列の５′部分が、５′−ＧＣ　ＵＣ −３′をさらに含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２４．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の解重合または破壊を阻害するためにキャップされた少なくてもひとつの５′および３′末端を有する請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２５．天然に存在するサブユットと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド類似体サブユニットから成る請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２６．医薬的に許容される担体中の請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２７．５′−ＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣ−３′配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２８．もとの配列の５′の直前、少なくても配列の３′部分が、５′−ＣＣＡＧＡ−３′をさらに含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
２９．もとの配列の３′の直前、少なくても配列の５′部分が、５′−ＧＧＵＣＵ−３′をさらに含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
３０．オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の解重合または破壊を阻害するためにキャップされた少なくてもひとつの５′および３′末端を有する請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
３１．天然に存在するサブユットと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド類似体サブユニットを含む請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
３２．医薬的に許容される担体中の請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
３３．５′ＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＡＧＡ−３′配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。
３４．レトロウィルスの機能または複製を妨害する方法であって、該ウィルスまたはそれが存在する培地または組織と、５′−ＣＵＧＧＧＡ−３′配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
３５．もとの配列の５′の直前、少なくても配列の３′部分が、５′−ＵＣＵＧＡＧＣ−３′をさらに含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である、請求項３４に記載の方法。
３６．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の３′の直前、少なくても配列の５′部分が、５′−ＧＣ　ＵＣ−３′をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
３７．天然に存在するサブユットと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド類似体サブユニットから成るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項３４に記載の方法。
３８．医薬的に許容される担体中の請求項３４に記載の方法。
３９．上記レトロウィルスがヒト免疫不全ウィルスである請求項３４に記載の方法。
４０．レトロウィルスの機能または複製を妨害する方法であって、該ウィルスまたはそれが存在する培地または組織と、５′−ＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣ−３′配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
４１．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の５′の直前、少なくても配列の３′部分が、５′−ＣＣＡＧＡ−３′をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
４２．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の３′の直前、少なくても配列の５′部分が、５′−ＧＧＵＣＵ−３′をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
４３．天然に存在するサブユットと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド類似体サブユニットから成るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項４０に記載の方法。
４４．医薬的に許容される担体中の請求項４０に記載の方法。
４５．上記レトロウィルスがヒト免疫不全ウィルスである請求項目３４に記載の方法。
４６．免疫不全ウィルスに感染していると疑われる動物の処置方法であって、動物と５′−ＣＵ　ＧＧＧ　Ａ−３′配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
４７．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の５′の直前、少なくても配列の３′部分が、５′−ＵＣＵ　ＧＡＧ　Ｃ−３′ をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
４８．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の３′の直前、少なくても配列の５′部分が、５′−ＧＣ　ＵＣ−３′をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
４９．天然に存在するサブユットと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド類似体サブユニットから成るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項４６に記載の方法。
５０．医薬的に許容される担体中の請求項４６に記載の方法。
５１．免疫不全ウィルスに感染していると疑われる動物の処置方法であって、動物と５′−ＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣ−３′配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
５２．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の５′の直前、少なくても配列の３′部分が、５′−ＣＣＡＧＡ−３′をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
５３．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、もとの配列の３′の直前、少なくても配列の５′部分が、５′−ＧＧＵＣＵ−３′をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
５４．天然に存在するサブユットと比較して改良されたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド類似体サブユニットから成るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である請求項５１に記載の方法。
５５．医薬的に許容される担体中の請求項５１に記載の方法。
５６．免疫不全ウィルスに感染していると疑われる動物の処置方法であって、動物と５′−ＵＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧＣＵＣＡＧＡ−３′配列を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
５７．ヒト免疫不全ウィルス感染の処置方法であって、該感染を有すると疑われる患者に、ＨＩＶｍＲＮＡのＴＡＲ領域の少なくても部分を模するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を投与することから成る方法。
５８．ヒト免疫不全ウィルス感染の処置方法であって、該感染を有すると疑われる患者に、ＨＩＶｍＲＮＡのＣＡＲ領域の少なくても部分を模するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を投与することから成る方法。
５９．ヒト免疫不全ウィルス感染の処置方法であって、該感染を有すると疑われる患者に、ＨＩＶｍＲＮＡのｇａｇ−ｐｏ１領域の少なくても部分を模するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を投与することから成る方法。
６０．配列番号１：【配列があります】；配列番号２：【配列があります】；配列番号３：【配列があります】；配列番号４：【配列があります】；および配列番号５：【配列があります】，のうちのひとつの配列から成るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似．体。
６１．医薬的に許容される担体中の請求項６０に記載の方法。
６２．レトロウィルスの機能または複製を妨害する方法であって、該ウィルスまたはそれが存在する培地または組織と、以下の配列配列番号１：【配列があります】；配列番号２：【配列があります】；配列番号３：【配列があります】；配列番号４：【配列があります】；および配列番号５：【配列があります】、のうちのひとつを有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
６３．医薬的に許容される担体中の請求項６２に記載の方法。
６４．免疫不全ウィルスに感染していると疑われる動物の処置方法であって、動物と以下の配列配列番号１：【配列があります】；配列番号２：【配列があります】；配列番号３：【配列があります】；配列番号４：【配列があります】；および配列番号５：【配列があります】のひとつ有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とを接触させることから成る方法。
６５．上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が医薬的に許容される担体中にある請求項６４に記載の方法。