PT1727567E

PT1727567E - Terapêuticas com aptâmeros úteis no tratamento de desordens relacionadas com o complemento

Info

Publication number: PT1727567E
Application number: PT57134967T
Authority: PT
Inventors: Claude Benedict; John Diener; David Epstein; Dilara Grate; Sara Chesworth Keene; Jeffrey Kurz; Markus Kurz; Thomas Green Mccauley; James Rottman; Kristin Thompson; Charles Wilson; Anna J Zoltoski
Original assignee: Archemix Llc
Priority date: 2004-02-12
Filing date: 2005-02-14
Publication date: 2013-10-14
Also published as: HUE050481T2; LT2860251T; EP2860251A1; ES2531075T3; ES2429442T3; HK1183896A1; WO2005079363A3; ES2808955T3; DK1727567T3; EP1727567A4; EP3385384B1; SI2860251T1; JP2007527714A; HK1210495A1; EP3385384A1; CY1120384T1; DK3385384T3; EP2578683B1; US7538211B2; US20060105980A1

Description

DESCRIÇÃO "Terapêuticas com aptâmeros úteis no tratamento de desordens relacionadas com o complemento"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se genericamente ao campo dos ácidos nucleicos e mais particularmente a aptâmeros capazes de se ligarem à proteina C5 do sistema do complemento, úteis como terapêuticas para, e no diagnóstico de, desordens cardíacas, inflamatórias e auto-imunes relacionadas com o complemento, lesão por reperfusão isquémica e/ou outras doenças ou desordens em que a activação do complemento mediada por C5 foi implicada. A invenção refere-se ainda a materiais e métodos para a administração de aptâmeros capazes de se ligarem à proteina C5 do sistema do complemento.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO

Os aptâmeros são moléculas de ácido nucleico possuindo afinidade de ligação especifica para com moléculas através de interacções outras que não o clássico emparelhamento de bases de Watson-Crick.

Aptâmeros, como péptidos gerados por exibição em fagos ou anticorpos monoclonais ("MAb"), são capazes de se ligar especificamente a alvos seleccionados e modular a actividade dos alvos, e.g., através de ligação os aptâmeros podem bloquear a capacidade dos seus alvos para funcionarem. Criados através de um processo de selecção in vitro a partir de bancos de oligonucleótidos de sequências aleatórias, foram gerados aptâmeros para mais do que 100 proteínas incluindo factores de crescimento, factores de transcrição, enzimas, imunoglobulinas e receptores. Um aptâmero típico tem um tamanho de 10-15 kDa (30-45 nucleótidos), liga-se ao seu alvo com afinidade sub-nanomolar, e discrimina relativamente a alvos proximamente relacionados (e.g., os aptâmeros tipicamente não se ligarão a outras proteínas da mesma família genética). Uma série de estudos estruturais mostraram que os aptâmeros são capazes de utilizar os mesmos tipos de interacções de ligação (e.g., ligações de hidrogénio, 2 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ complementaridade electrostática, contactos hidrófobos, exclusão estereoquimica) que induzem a afinidade e a especificidade nos complexos anticorpo-antigénio.

Os aptâmeros possuem um número de caracteristicas desejáveis para utilização como terapêuticas e em diagnósticos incluindo uma especificidade e uma afinidade elevadas, eficácia biológica, e excelentes propriedades farmacocinéticas. Em adição, oferecem vantagens competitivas especificas sobre os anticorpos e outras proteínas biológicas, por exemplo: 1) Velocidade e controlo. Os aptâmeros são produzidos através de um processo inteiramente in vitro, permitindo a rápida geração de pistas iniciais, incluindo pistas terapêuticas. A selecção in vitro permite que a especificidade e a afinidade do aptâmero sejam estreitamente controladas e permitem a geração de pistas, incluindo pistas contra alvos tóxicos e não imunogénicos. 2) Toxicidade e Imunogenicidade. Os aptâmeros, como classe, demonstraram ter pouca ou nenhuma toxicidade ou imunogenicidade. Na dosagem crónica de ratos ou marmotas ("woodchucks") com níveis elevados de aptâmero (10 mg/kg diariamente durante 90 dias), não foi observada toxicidade em nenhuma medição clínica, celular ou bioquímica. Enquanto a eficácia de muitos anticorpos monoclonais pode ser gravemente limitada pela resposta imunitária aos próprios anticorpos, é extremamente difícil eliciar anticorpos contra aptâmeros, muito provavelmente porque os aptâmeros não podem ser apresentados por células T através do MHC e a resposta imunitária é geralmente treinada para não reconhecer fragmentos de ácido nucleico. 3) Administração. Enquanto a maioria das terapêuticas com anticorpos presentemente aprovadas são administradas por infusão intravenosa (tipicamente ao longo de 2-4 horas) , os aptâmeros podem ser administrados por injecção subcutânea (a biodisponibilidade dos aptâmeros por administração subcutânea é >80% em estudos com macacos (Tucker et ai., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). Esta diferença é principalmente devida à solubilidade comparativamente baixa e 3 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ portanto serem necessários grandes volumes para a maioria dos MAb terapêuticos. Com boa solubilidade (>150 mg/mL) e comparativamente baixo peso molecular (aptâmero: 10-50 kDa; anticorpo: 150 kDa), uma dose semanal de aptâmero pode ser entregue por injecção num volume inferior a 0,5 mL. Em adição, a pequena dimensão dos aptâmeros permite-lhes penetrar em áreas de constrições conformacionais não permitidas aos anticorpos ou fragmentos anticorpos, representando ainda outra vantagem das terapêuticas ou profilaxias baseadas em aptâmeros. 4) Capacidade de aumento de escala e custo. Os aptâmeros terapêuticos são quimicamente sintetizados e consequentemente a sua produção pode ser prontamente escalada conforme necessário para cumprir a procura de produção. Enquanto dificuldades no aumento de escala da produção são presentemente limitantes da disponibilidade de alguns produtos biológicos e o custo do investimento de uma instalação para produção em larga escala de proteínas é enorme, um único sintetizador de oligonucleótidos em larga escala pode produzir acima de 100 kg/ano e requer um investimento inicial relativamente modesto. O custo presente de mercadorias para a síntese de aptâmeros à escala do quilograma está estimada em $500/g, comparável ao dos anticorpos altamente optimizados. São esperados melhoramentos continuados no desenvolvimento do processo para baixar o custo das mercadorias para < $100/g em cinco anos. 5 Estabilidade. Os aptâmeros terapêuticos são quimicamente robustos. Estão intrinsecamente adaptados a retomar a actividade após exposição a factores como o calor e os desnaturantes e podem ser armazenados durante períodos prolongados (>1 ano) à temperatura ambiente sob a forma de pós liofilizados. O Sistema do complemento O sistema do complemento compreende um conjunto de pelo menos 20 proteínas plasmáticas e membranares que actuam conjuntamente num sistema regulado em cascata para atacar formas extracelulares de patogénios (e.g., bactéria). O sistema do complemento inclui duas cascatas distintas de 4 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ activação enzimática, as vias clássica e alternativa (Figura 1), e uma via não enzimática conhecida como a via do ataque à membrana. A primeira cascata activada enzimaticamente, conhecida como a via clássica, compreende vários componentes, Cl, C4, C2, C3 e C5 (enumerados por ordem na via). A iniciação da via clássica do sistema do complemento ocorre após ligação e activação do primeiro componente do complemento (Cl) através de activadores imunitários e não imunitários. Cl compreende um complexo dependente de cálcio de componentes Clq, Clr e Cls, e é activado através da ligação do componente Clq. Clq contém seis subunidades idênticas e cada subunidade compreende três cadeias (as cadeias A, B e C) . Cada cadeia possui uma região de cabeça globular que está ligada a uma cauda semelhante a colagénio. A ligação e a activação de Clq por complexos antigénio-anticorpo ocorre através da região do grupo de cabeça de Clq. Numerosos activadores de Clq que não anticorpos, incluindo proteinas, lípidos e ácidos nucleicos, ligam-se e activam Clq através de um local distinto na região de haste semelhante a colagénio. Os complexos Clqrs catalisam então a activação dos componentes C4 e C2 do complemento, formando o complexo C4bC2a que funciona como uma C3-convertase. A segunda cascata activada enzimaticamente, conhecida como a via alternativa, consiste numa via rápida, independente de anticorpos para activação e amplificação do sistema do complemento. A via alternativa compreende vários componentes, C3, Factor B e Factor D (enumerados por ordem na via) . A activação da via alternativa ocorre quando C3b, uma forma de clivagem proteolitica de C3, é ligada a um agente na superfície de activação tal como uma bactéria. 0 Factor B é então ligado a C3b, e clivado pelo Factor D para originar a enzima activa, Ba. A enzima Ba clica então mais C3 para gerar mais C3b, produzindo deposição extensiva de complexos C3b-Ba na superfície de activação.

Assim, ambas as vias, clássica e alternativa, do complemento produzem C3-convertases que clivam o factor C3 em C3a e C3b. Neste ponto, ambas as C3-convertases montam-se ainda formando C5-convertases (C4b2a3b e C3b3bBb). Estes 5 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ complexos clivam subsequentemente o componente C5 do complemento em dois componentes: o polipéptido C5a (9 kDa) e o polipéptido C5b (170 kDa) . O polipéptido C5a liga-se a um receptor acoplado a proteína G 7-transmembranar, que foi originalmente associado aos leucócitos e hoje se sabe que é expresso numa variedade de tecidos incluindo hepatócitos e neurónios. A molécula de C5a é a componente quimiotáctica principal do sistema do complemento humano e pode desencadear uma variedade de respostas biológicas incluindo quimiotaxia de leucócitos, contracção do músculo liso, activação de vias de transdução de sinal intracelulares, adesão neutrófilo-endotelial, libertação de mediadores de citóquinas e lípidos e formação de oxidantes. O fragmento C5b maior liga-se sequencialmente a componentes tardios da cascata do complemento, C6, C7, C8 e C9, para formar o complexo de ataque à membrana ("MAC") C5b-9. O MAC C5b-9 pode lisar directamente eritrócitos, e em maiores quantidades, é lítico para leucócitos e pode danificar tecidos tais como células musculares, epiteliais e endoteliais. Em quantidades sub-líticas, o MAC pode estimular a supra-regulação de moléculas de adesão, o aumento de cálcio intracelular e a libertação de citóquinas. Em adição, o MAC C5b-9 pode estimular células tais como células endoteliais e plaquetas sem causar lise celular. Os efeitos não líticos de C5a e do MAC C5b-9 são por vezes bastante similares.

Embora o sistema do complemento tenha um papel importante na manutenção da saúde, tem o potencial de causar ou contribuir para doença. Por exemplo, o sistema do complemento foi implicado em efeitos secundários relacionados com a cirurgia de enxerto da artéria coronária ("CABG"), numerosas doenças e/ou condições renais, reumatológicas, neurológicas, dermatológicas, hematológicas, vasculares/pulmonares, alérgicas, infecciosas, e de biocompatibilidade/choque, e retinopatia diabética. O sistema do complemento não é necessariamente a única causa de um estado de doença, mas pode ser um de vários factores que contribuem para a patogénese.

Em Fitch et al., Circ. 100:2499-506 (1999), foram testados os efeitos do fragmento de anticorpo de cadeia única anti-C5, Pexelizumab, em pacientes que submetidos a cirurgia 6 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ de enxerto de bypass da artéria coronária com bypass cardiopulmonar ("CPB"). Pacientes individuais foram administrados com Pexelizumab numa dose de bolus única de 10 minutos, imediatamente antes da CPB a 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg e 2,0 mg/kg. Amostras de sangue foram colhidas e testadas quanto a actividade do complemento antes da dose, 5 min após a dose, após 5 min a 28°C, após a iniciação de reaquecimento, após 5 min a 37°C, e até 7 dias após a CPB. A análise farmacodinâmica demonstrou inibição significativa dependente da dose da actividade hemolitica do complemento durante até 14 horas numa dosagem de 2 mg/kg, e a geração de subprodutos do complemento pró-inflamatórios (sC5b-9) foi eficazmente inibida de uma maneira dependente da dose. Como anteriormente mencionado, contudo, as terapêuticas com anticorpos têm determinadas limitações. WO 99/41271 descreve aptâmeros dirigidos contra C5.

Deste modo, seria benéfico ter novos inibidores do sistema do complemento para utilização como terapêuticas e para diagnóstico no tratamento de desordens relacionadas com o complemento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma ilustração que representa as vias clássica e alternativa do sistema do complemento. A Figura 2 é uma representação esquemática do processo de selecção de aptâmeros in vitro (SELEX ) a partir de bancos de oligonucleótidos de sequência aleatória. A Figura 3A é uma ilustração que representa a sequência de nucleótidos e a estrutura secundária de um aptâmero anti-C5 (SEQ ID NO:1), em que os resíduos sublinhados são, ou resíduos de pirimidina 2'-H ou resíduos de pirimidina 2'-fluoro, os resíduos em caixas são, ou resíduos de pirimidina 2'-fluoro ou resíduos de pirimidina 2'-OMe e os resíduos indicados por uma seta (-►) representam resíduos que têm que conter uma modificação 2'-fluoro. A Figura 3B é uma ilustração que representa a sequência de nucleótidos e a estrutura secundária do aptâmero anti-C5 7 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ARC330 (SEQ ID Ν0:2), em que os resíduos em círculos são resíduos 2'—H, os resíduos de pirimidina estão substituídos com 2'-fluoro, e a maioria dos resíduos de purina estão substituídos com 2'-0Me, excepto os três resíduos de purina 2'-OH mostrados em esboço. A Figura 3C é uma ilustração que representa a sequência de nucleótidos e a estrutura secundária do aptâmero anti-C5 ARC186 (SEQ ID NO:4) em que todos os 21 resíduos de pirimidina possuem modificações 2'-fluoro e a maioria das purinas (14 resíduos) possuem modificações 2'-0Me, excepto os três resíduos de purina 2'-OH mostrados em esboço. A Figura 4 é uma ilustração de um PEG ramificado de 40 kD (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida). A Figura 5 é uma ilustração de um PEG ramificado de 40 kD (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida) ligado à extremidade 5' de um aptâmero. A Figura 6 é uma ilustração que representa várias estratégias para a síntese de conjugados PEG de elevado peso molecular-ácido nucleico. A Figura 7A é um gráfico que compara a inibição dependente da dose da hemólise pelos aptâmeros anti-C5 PEGuilados (ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5)), com um aptâmero anti-C5 não PEGuilado (ARC186 (SEQ ID NO:4)); a Figura 7B é uma tabela dos valores de IC50 dos aptâmeros utilizados no ensaio de hemólise representado na Figura 7A; a Figura 7C é um gráfico que compara a inibição dependente da dose da hemólise pelos aptâmeros anti-C5 PEGuilados ARC187 (SEQ ID NO:5), ARC1537

(SEQ ID NO: 65), ARC1730 (SEQ ID NO (66) e ARC1905 (SEQ ID NO: 67); a Figura 7D é uma tabela dos valores de IC5o dos aptâmeros utilizados no ensaio de hemólise representado na Figura 7C. A Figura 8 é um gráfico da percentagem de inibição da hemólise pelo aptâmero anti-C5, ARC658 (SEQ ID NO:62), de complemento de soro de cynomolgus versus complemento de soro humano. 8 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ A Figura 9 é um gráfico que representa a ligação de ARC186 (SEQ ID N0:4) a proteina C5 purificada a 37°C e à temperatura ambiente (23°C) após uma incubação de 15 minutos. A Figura 10 é outro gráfico que representa a ligação de ARC186 (SEQ ID NO:4) a proteina C5 purificada a 37°C e à temperatura ambiente (23°C) após uma incubação de 4 horas. A Figura 11 é um gráfico que mostra a dissociação de complexo C5»ARC186 a 23°C ao longo do tempo. A Figura 12 é um gráfico que mostra o equilíbrio na formação de complexo CS»ARC186 a 23°C ao longo do tempo. A Figura 13 é um gráfico que representa a ligação de ARC186 (SEQ ID NO:4) a proteína C5 versus componentes de proteínas a montante e a jusante na cascata do complemento. A Figura 14 é um gráfico que representa a percentagem de ARC186 radiomarcado (SEQ ID NO:4) que se liga a C5 na presença de competidor ARC186 não marcado (SEQ ID NO:4), ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC65 8 (SEQ ID NO:62) ou ARC187 (SEQ ID NO:5). A Figura 15 é um gráfico que representa a quantidade de proteina do complemento C5b produzida em amostras de sangue incubadas durante 5 horas a 25°C e 37°C na presença de várias concentrações do aptâmero ARC186 (SEQ ID NO:4). A Figura 16 é um gráfico que representa a percentagem de inibição do complemento por ARC187 (SEQ ID NO:5) na presença de zimosano em soro humano não diluido, sangue completo humano citrado ou soro de cynomolgus. A Figura 17 é um gráfico que mostra que o ARC658 (SEQ ID NO:62) inibe completamente a activação do complemento (C5a) no modelo de laçada de tubagem descrito no Exemplo ID. A Figura 18 é um gráfico que representa as constantes de dissociação para o Ciclo 10 dos bancos de selecção com C5. As constantes de dissociação (Kd) foram estimadas por ajuste dos resultados à equação: fracção de ARN ligado = 9 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ amplitude*Kd/ (Kd + [C5]) . "ARC520" (SEQ ID NO:70) refere-se ao banco dRmY naíve não seleccionado e " + " indica a presença de competidor (0,1 mg/ml de ARNt, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão). A Figura 19 é um gráfico que representa curvas da constante de dissociação do clone C5. As constantes de dissociação (Kd) foram estimadas por ajuste dos resultados à equação; fracção de ARN ligado = amplitude*Kci/ (Kd + [C5]) . A Figura 20 é um gráfico que representa uma curva de IC5o que ilustra o efeito inibidor sobre a actividade de hemólise de várias concentrações de aptâmero anti-C5, clone ARC913 (SEQ ID NO:75), em comparação com ARC186 (SEQ ID NO:4). A Figura 21 é uma ilustração que representa a estrutura de ARC187 (SEQ ID NO:5). A Figura 22 é uma ilustração que representa a estrutura de ARC 1905 (SEQ ID NO:67). A Figura 23 é uma tabela que esboça o desenho experimental do primeiro estudo de coração perfundido isolado. A Figura 24 é um gráfico que compara os traçados de pressão para a pressão intraventricular no ventrículo esquerdo (LV) de um coração isolado exposto a plasma humano (A) com os traçados de pressão de LVP de um coração isolado exposto à solução de aptâmero de controlo (B). A Figura 25 é um gráfico que compara os traçados de pressão para a pressão intraventricular no ventrículo esquerdo (LV) de corações isolados expostos a soluções de equivalente molar, 10X e 50X de aptâmero/C5 (onde se assume uma concentração de aproximadamente 500 nM para o C5 em plasma humano normal, não diluído). A Figura 26 é um gráfico que compara as alterações da frequência cardíaca em batimentos por minuto (bpm) em corações de ratinho isolados após exposição a plasma humano e várias soluções de plasma/aptâmero. 10 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ A Figura 27 é um gráfico que compara as alterações no peso do coração em corações de ratinho isolados antes e após a exposição a plasma humano contendo uma razão molar de 0-1X de ARC186 (SEQ ID NO:4) (corações que falharam), ou uma razão molar de 10-50X (corações protegidos com aptâmero C5). A Figura 28 é um gráfico que compara a produção relativa de C5a em plasma humano, contendo várias concentrações de aptâmero, após perfusão através dos corações de ratinho isolados. As concentrações relativas de C5a estão representadas em unidades de absorvância (Ab), onde as leituras mais elevadas reflectem a presença de niveis mais elevados de C5a. A Figura 29 é um gráfico que compara a produção relativa de C5b-9 solúvel em plasma humano contendo várias concentrações de aptâmero, após perfusão através de corações de ratinho isolados. A Figura 30 é um gráfico que mostra o efeito de ARC186 (SEQ ID NO:4) sobre a clivagem de C3 em efluente de coração de ratinho. A Figura 31 é uma tabela que mostra os resultados de coloração imuno-histoquímica para o estudo do coração de ratinho perfundido isolado. A Figura 32 é uma tabela que mostra a razão molar de ARC658 (SEQ ID NO:62) necessária, em soro humano ou de primata, para proteger o coração de danos mediados por C5b. A Figura 33 é um gráfico que mostra uma representação logarítmica linear da percentagem remanescente de ARC 186 de comprimento completo em função do tempo de incubação no plasma de rato e de macaco cynomolgus. A Figura 34 é uma tabela que mostra o desenho experimental do estudo farmacocinético conduzido com ratos Sprague-Dawley como descrito no Exemplo 5.

A Figura 35 é uma tabela que mostra a concentração plasmática média de ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID 11 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ΝΟ:62) ou ARC187 (SEQ ID Ν0:5) versus tempo em ratos Sprague-Dawley.

A Figura 36 é um gráfico que representa a concentração plasmática média de ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) ao longo do tempo após administração intravenosa de aptâmero em ratos. A Figura 37 é uma tabela que mostra a análise não compartimentada dos resultados de concentração versus tempo representados nas Figuras 35 e 36. A Figura 38A é uma tabela que mostra o desenho para o estudo farmacocinético de ARC 187 (SEQ ID NO:5) e ARC1905 (SEQ ID NO:67) em ratinhos; a Figura 38B é um gráfico que representa o perfil farmacocinético de ARC 187 (SEQ ID NO:5) e ARC1905 (SEQ ID NO:67) em ratinhos CD-I após uma única administração de bolus IV; a Figura 38C é uma tabela que mostra a análise não compartimentada dos resultados de concentração versus tempo representados na Figura 38B. A Figura 3 9 é uma tabela que mostra a detecção dos aptâmeros listados em tecido de coração de ratinho após administração intravenosa. A Figura 4 0 é uma tabela que mostra o desenho experimental do Estudo em animais 1, descrito no Exemplo 5E. A Figura 41 é uma tabela que mostra a concentração plasmática de aptâmero versus tempo após administração de bolus intravenoso de aptâmero a macacos cynomolgus. A Figura 42 é uma tabela que lista os parâmetros farmacocinéticos para ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) administrados intravenosamente a macacos cynomolgus no Estudo 1.

As Figuras 43(a) e 43 (c) são gráficos que representam concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a ao longo do tempo após administração intravenosa dos aptâmeros anti-C5 ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62), ou ARC187 (SEQ ID NO:5) a macacos cynomolgus; as Figuras 43(b) e 43(d) são gráficos 12 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ que representam as concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a versus a concentração de aptâmeros anti-C5, ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62), ou ARC 187 (SEQ ID NO:5). A Figura 44 é uma tabela que mostra o desenho experimental do Estudo 2, descrito no Exemplo 5F. A Figura 45 é um gráfico que mostra a concentração plasmática média de aptâmero em vários pontos de tempo após a administração intravenosa de ARC658 (SEQ ID NO:62), ou ARC187 (SEQ ID NO:5) a macacos cynomolgus. A Figura 4 6 é uma tabela que mostra as duas análises compartimentadas dos resultados de concentração versus tempo após administração de bolus intravenoso de aptâmero a macacos cynomolgus. A Figura 47 é um gráfico que representa a concentração de C5b-9 versus a concentração de ARC187 (SEQ ID NO: 5) ou de ARC658 (SEQ ID NO:62) na presença de zimosano em plasma de cynomolgus. A Figura 48 é um gráfico que representa a concentração de C5a versus a concentração de ARC187 (SEQ ID NO:5) ou de ARC658 (SEQ ID NO: 62) na presença de zimosano em plasma de cynomolgus. A Figura 49 é uma tabela que sumariza o estudo FC-FD de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) durante e após a administração de bolus IV mais infusão a macacos cynomolgus. A Figura 50 é uma tabela que sumariza os parâmetros farmacocinéticos para ARC187 (SEQ ID NO:5) em macacos cynomolgus após administração de bolus IV. A Figura 51 é um gráfico que representa os perfis farmacocinéticos calculado e realmente medido de ARC187 (SEQ ID NO: 5) durante e após a administração do bolus IV mais infusão a macacos cynomolgus. A Figura 52 é um gráfico que mostra os níveis plasmáticos de ARC187 activo (SEQ ID NO:5) permanecem constantes durante e 13 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ após a administração de bolus IV mais infusão a macacos cynomolgus. A Figura 53 é uma tabela que mostra os requisitos de dosagem humanos previstos para aptâmeros anti-C5 em cirurgia CABG. A Figura 54 é um gráfico que ilustra que o ARC187 (SEQ ID NO:5) não possui praticamente efeito in vitro sobre a coagulação como medido pelo tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial activada (APTT). A Figura 55 é uma tabela que sumariza os efeitos in vitro de ARC187 (SEQ ID NO:5) sobre a actividade anti-coagulação da heparina, e actividade pró-coagulação da protamina. A Figura 56 é um gráfico que mostra que ARC187 (SEQ ID NO:5) não efectua a reversão da anti-coagulação da heparina in vi vo. A Figura 57 é um gráfico que mostra que a heparina e a protamina nenhuma possui efeito sobre a função anti-complemento de ARC187 (SEQ ID N0:5), medida pela inibição da activação do complemento de zimosano.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona materiais e métodos para o tratamento, a prevenção e a melhoria de uma doença relacionada com o complemento. Numa concretização, é proporcionado um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos de acordo com ARC186 (SEQ ID NO:4) possuindo um PEG conjugado à sua extremidade 5'. Em concretizações particulares, este conjugado aptâmero ARC186/PEG compreende substancialmente a mesma afinidade de ligação para com a proteina do complemento C5 que um aptâmero compreendendo a sequência de acordo com SEQ ID NO:4. Substancialmente a mesma afinidade de ligação, como aqui se utiliza, significa não mais do que uma diferença de cerca de 2 a dez vezes, preferivelmente não mais do que uma diferença de 2 a cinco vezes nas constantes de dissociação como medido por análise dot blot. Em algumas concretizações as constantes de 14 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ dissociação são medidas por análise dot blot de competição como descrito no Exemplo IA adiante. Em algumas concretizações o conjugado aptâmero/PEG compreende uma semivida, preferivelmente a semivida terminal num modelo de dois compartimentos, de pelo menos 15 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, mais preferivelmente pelo menos 48 horas no primata. Em algumas concretizações o conjugado aptâmero/PEG compreende uma semivida, preferivelmente a semivida terminal num modelo de dois compartimentos, de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 horas no rato. Em algumas concretizações, o PEG conjugado à extremidade 5' de ARC186 (SEQ ID NO: 4) é um PEG de 40 kDa. Em concretizações particulares o PEG de 40 kDa é um PEG ramificado. Como aqui descrito o PEG de 40 kDa ramificado pode ser 1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida). O PEG de 40 kDa ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoílo.

Quando o PEG de 40 kDa ramificado é 1,3-bis (mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida), é descrito um aptâmero possuindo a estrutura estabelecida adiante: Õ

20 kDa rtiPEG-NH-C-0-ι O

~ " H O —OCH2CH2CH2-C—N'wwv5’Aptâmero 3’ 20 kDa mPEG-NH-C-O—I_ onde, bnn/w* indica um ligante Aptâmero = fCmGfCíCGíCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGíUfCfUmGmAmGfUfUfUAíC fCfUmGfCmG-3T (SEQ D> NO: 4), em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH.

Em concretizações onde o PEG de 40 kDa ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoílo, é proporcionado um aptâmero possuindo a estrutura estabelecida adiante: O u 5’Aptâmero 3’

ii H -0'ΝΛηΛΛΛ'

20 kDa mPEG 20 kDa mPEG onde,

Jwuwí indica um ligante 15 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGíUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGi^AinGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAiC fCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH.

Em algumas concretizações deste aspecto da invenção o ligante é um ligante alquilo. Em concretizações particulares, o ligante alquilo compreende 2 a 18 grupos CH2 consecutivos. Em concretizações preferidas, o ligante alquilo compreende 2 a 12 grupos CH2 consecutivos. Em concretizações particularmente preferidas o ligante alquilo compreende 3 a 6 grupos CH2 consecutivos. é descrito possuindo a

Um aptâmero, ARC187 (SEQ ID N0:5), estrutura estabelecida adiante:

O i-NM-G-U—I 0 r -NH-C-O-1 O och2ch2ch2-c-n

0-5’Aptâmero 3’ 20 kDa mPEG-NH~C-0

20kDa mPEG onde

Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGíCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAíC fCfUmGfCmG-3T (SEQ ED NO: 4)_ em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH.

Em outra concretização é proporcionado um aptâmero, ARC1905 (SEQ ID NO:67), possuindo a estrutura estabelecida adiante:

, -/o-5.Aptómero3. 20 kDa mPEG—OH " 0 p 20 kDa mPEG—O—*_ onde

Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGinGfCGfCfUmGinAmGfUfCfUmGmAniGfUfUfUAfC ÍCftJmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4) em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH. 16 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Em outro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas. Numa concretização, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de ARC1905 (SEQ ID NO: 67) ou um seu sal. A composição farmacêutica da invenção pode compreender um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Neste aspecto da invenção é proporcionada uma composição farmacêutica de ARC1905 (SEQ ID NO:67) para utilização no tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença in vivo.

Em outro aspecto, são proporcionados métodos de tratamento. Numa concretização, o método compreende o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, e/ou pelos seus derivados C5a e C5b-9, o método incluindo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo ARC1905 (SEQ ID NO:67) ou um seu sal a um vertebrado. Em algumas concretizações, o método compreende a administração da composição farmacêutica da invenção a um mamífero. Em algumas concretizações, o mamífero é um ser humano.

Em algumas concretizações, a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar é uma doença isquémica agudas (enfarte do miocárdio, icto, danos isquémicos/de reperfusão); uma doença inflamatória aguda (doença infecciosa, septicemia, choque, rejeição de transplante agudo/hiperagudo); uma doença inflamatória crónica e/ou imuno-mediada (alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES), rejeição de transplante subagudo/crónico, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas concretizações, as doenças mediadas pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar incluem a activação do complemento associada com diálise ou circunstâncias em que o sangue é passado sobre, e/ou através de, tubagem sintética e/ou material estranho. Em algumas concretizações, a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar é seleccionada do grupo que consiste em lesão do miocárdio relacionada com a cirurgia CABG, lesão do miocárdio relacionada com angioplastia de balão e lesão do miocárdio 17 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ relacionada com restenose. Em algumas concretizações a doença mediada pela proteina do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar é uma complicação relacionada com a cirurgia CABG. Numa concretização particular, a doença a tratar é lesão do miocárdio relacionada com a cirurgia CABG.

Em algumas concretizações, o método inclui a administração da composição farmacêutica compreendendo ARC1905 (SEQ ID NO:67) para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que seja de cerca de 0,5 a cerca de 10 vezes a da proteina do complemento C5 endógena. Em algumas concretizações, as composições farmacêuticas de aptâmero ARC18 7 (SEQ ID NO:5) ou ARC1905 (SEQ ID NO: 67) são administradas para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que seja de cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes, 0,75 a cerca de 3 vezes, e 1,5 a cerca de 2 vezes a da proteina do complemento C5 endógena enquanto em outras concretizações a composição de aptâmero é administrada para atingir uma concentração equivalente à da proteina do complemento endógena. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica da invenção compreendendo ARC1905 (SEQ ID NO:67) é administrada para atingir uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 μΜ ou de cerca de 500 nM.

Pode ser utilizada qualquer combinação de via, duração e taxa de administração que seja suficiente para atingir as concentrações plasmáticas de aptâmero da invenção. Em algumas concretizações a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica é administrada sob a forma de um bolus e/ou por via de infusão continua.

Em concretizações particulares de tratamento, prevenção e/ou melhoria de complicações relacionadas com a cirurgia CABG, particularmente lesão do miocárdio relacionada com a cirurgia CABG, o método compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e a continuação da administração pelo menos 24 horas, em algumas concretizações cerca de 48 horas ou em algumas concretizações cerca de 72 horas. Numa concretização particular deste aspecto da invenção, é atingida uma concentração plasmática de aptâmero 18 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ de cerca de duas vezes a concentração da proteína do complemento endógena por administração de um bolus intravenoso de cerca de 0,75 a 1,25, preferivelmente de cerca de 1 mg de aptâmero por kg do paciente a tratar antes de, simultaneamente com, ou após infusão intravenosa de uma dose menor de aptâmero em que mg não inclui o peso do PEG conjugado. Em algumas concretizações a dose menor será infundida a uma taxa seleccionada da gama de 0,001 a 0,005 mg/kg/min em que mg não inclui o peso do PEG conjugado. Numa concretização particular, a dose menor será infundida a uma taxa de cerca de 0,0013 mg/kg/min. Em ainda outras concretizações deste aspecto da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma semivida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes por dia sob a forma de uma dose de bolus intravenoso.

Em outro aspecto da invenção, são proporcionados métodos de diagnóstico. Numa concretização, o método de diagnóstico compreende o contacto do ARC1905 (SEQ ID NO 67) com uma composição que se suspeita compreender proteína do complemento C5 ou uma sua variante, e a detecção da presença ou ausência de proteína do complemento C5 ou uma sua variante. Em algumas concretizações a proteína do complemento ou variante são de vertebrado, particularmente de mamífero, e mais particularmente humanas. A presente invenção proporciona uma composição de ARC1905 (SEQ ID NO:67) para utilização como diagnóstico in vitro ou in vivo. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: ARC 330 (SEQ ID NO:2) e ARC188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537, ARC1730, (SEQ ID NOS: 6 a SEQ NO: 66). Numa concretização particular, um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos compreende uma sequência de acordo com SEQ ID NO 1. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:62, e SEQ ID NO:64 a SEQ ID NO:66. Nos presentes exemplos, quando o aptâmero compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende 19 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ substancialmente a mesma afinidade de ligação para com a proteína do complemento C5 que um aptâmero compreendendo a sequência de acordo com SEQ ID NO:4. São divulgados aptâmeros compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, e SEQ ID NO:64 a SEQ ID NO:66, o aptâmero compreende uma semivida, preferivelmente a semivida terminal num modelo de dois compartimentos, de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 30 horas no primata. São divulgados aptâmeros compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende uma semivida, preferivelmente a semivida terminal num modelo de dois compartimentos, de pelo menos 1 e meia, preferivelmente pelo menos sete horas no rato. São divulgados aptâmeros compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, sendo o aptâmero sintetizado com um ligante a 5' como se segue: H2N .Iwwn 5' Aptâmero 3', em que Jwjvw denota o ligante. O ligante pode ser um ligante alquilo como se segue: H2N-(CH2)n-5' Aptâmero 3' em que n=2 a 18, preferivelmente n= 2-12, mais preferivelmente n= 3 a 6, mais preferivelmente n=6, e em que Aptâmero =

íCmGfCíCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUíUAfC fCfUmGfCmG-3T (SEQ 03 NO: 4)_ em que fC e fU = nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA = nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH. 0 aptâmero amino-modifiçado resultante pode ser conjugado com uma porção de PEG seleccionada do grupo que consiste em um PEG de 10 kDa, um PEG de 20 kDa, um PEG de 30 kDa e um PEG de 40 kDa linear. São descritas composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:6 a SEQ NO: 66, particularmente do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO:66 ou um seu sal. A composição farmacêutica da invenção pode compreender um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. São descritas composições 20 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ farmacêuticas para utilização no tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença in vivo, compreendendo um aptâmero que compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente do grupo que consiste em SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, e SEQ ID NO:64 a SEQ ID NO:66. É divulgado um método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um aptâmero ou um seu sal, onde o aptâmero compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente do grupo que consiste em SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, a um vertebrado. Em algumas concretizações deste aspecto da invenção, o método compreende a administração da composição farmacêutica da invenção a um mamífero, preferivelmente um ser humano.

Em algumas concretizações, a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar é uma doença isquémica aguda (enfarte do miocárdio, icto, danos isquémicos/de reperfusão); uma doença inflamatória aguda (doença infecciosa, septicemia, choque, rejeição de transplante agudo/hiperagudo); uma doença inflamatória crónica e/ou imuno-mediada (alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES), rejeição de transplante subagudo/crónico, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas concretizações, as doenças mediadas pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar incluem a activação do complemento associada com diálise ou circunstâncias em que sangue é passado sobre, e/ou através de, tubagem sintética e/ou material estranho. Em algumas concretizações, a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9, a tratar, é seleccionada do grupo que consiste em lesão do miocárdio relacionada com cirurgia CABG, lesão do miocárdio relacionado com angioplastia de balão e lesão do miocárdio relacionada com restenose. Em algumas concretizações a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9, a 21 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ tratar é uma complicação relacionada com a cirurgia CABG. Numa concretização particular, a doença a tratar é lesão do miocárdio relacionada com cirurgia CABG. É divulgado um método gue inclui a administração da composição farmacêutica compreendendo um aptâmero possuindo uma seguência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID N0:2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, particularmente do grupo que consiste em SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, a um paciente, para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que seja cerca de 0,5 a cerca de 10 vezes a da proteína do complemento C5 endógena. Em algumas concretizações, as composições farmacêuticas de aptâmero são administradas para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que seja cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes, 0,75 a cerca de 3 vezes, e 1,5 a cerca de 2 vezes a da proteína do complemento C5 endógena enquanto em outras concretizações a composição de aptâmero é administrada para atingir uma concentração equivalente à da proteína do complemento endógena. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica da invenção é administrada para atingir uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 μΜ ou de cerca de 500 nM.

Pode ser utilizada qualquer combinação de via, duração e taxa de administração que seja suficiente para atingir as concentrações plasmáticas de aptâmero da invenção. Em algumas concretizações a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica é administrada sob a forma de bolus e/ou por via de infusão contínua.

Em concretizações particulares de tratamento, prevenção e/ou melhoria de complicações relacionadas com cirurgia CABG, particularmente lesão do miocárdio relacionada com cirurgia CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e a continuação da administração pelo menos 24 horas, em algumas concretizações cerca de 48 horas ou em algumas concretizações cerca de 72 horas. Numa concretização particular deste aspecto da invenção, a concentração plasmática desejada de 22 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ aptâmero, e.g,. duas vezes a concentração da proteína do complemento endógena em algumas concretizações, é conseguida por administração de um bolus intravenoso ao paciente a tratar antes de, simultaneamente com, ou após, infusão intravenosa de uma dose menor de aptâmero. Em ainda outras concretizações deste aspecto da invenção, quando o aptâmero/conjugado compreende uma semivida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes por dia sob a forma de uma dose de bolus intravenoso.

Em outro aspecto da divulgação são proporcionados métodos de diagnóstico. Um método de diagnóstico pode compreender o contacto de uma composição que se suspeita compreender proteína do complemento C5, ou uma sua variante, com um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID N0:2 e SEQ ID NO:6 a SEQ NO:66, particularmente do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:62, e SEQ ID NO:64 a SEQ ID NO:66, e a detecção da presença ou ausência de proteína do complemento C5 ou de uma sua variante. Em algumas concretizações a proteína do complemento ou variante é de vertebrado, particularmente de mamífero, e mais particularmente humana.

Aqui, é descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos que é 80% idêntica a qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em ARC915, ARC874-878, ARC954, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos que é 80% idêntica à região única de qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos que é 90% idêntica a qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos que é 90% idêntica à região única de qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos de 40 nucleótidos contíguos idênticos a 40 nucleótidos contíguos incluídos em qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e 23 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos de 30 nucleótidos contiguos idênticos a 30 nucleótidos contiguos incluídos em qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero que se liga especificamente a proteina do complemento C5 compreendendo uma sequência de nucleótidos de 10 nucleótidos contiguos idênticos a 10 nucleótidos contiguos incluídos em qualquer uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos de acordo com qualquer uma das sequências de nucleótidos seleccionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98.

Em algumas concretizações, os aptâmeros da invenção podem ainda compreender uma modificação quimica seleccionada do grupo que consiste em: uma substituição quimica numa posição de açúcar; uma substituição quimica numa posição de fosfato; e uma substituição quimica numa posição de base da sequência de ácido nucleico. Em algumas concretizações a modificação é seleccionada do grupo que consiste em: incorporação de um nucleótido modificado; remate a 3', conjugação com um composto não imunogénico de elevado peso molecular; conjugação com um composto lipófilo; e modificação do esqueleto de fosfato.

Em concretizações preferidas da invenção, o aptâmero modula uma função de uma proteina do complemento C5 ou de uma sua variante. Em concretizações particularmente preferidas, o aptâmero inibe uma função da proteina do complemento C5 ou de uma sua variante, preferivelmente in vivo, mais preferivelmente in vivo em seres humanos. Numa concretização deste aspecto da invenção, a função modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é a clivagem da proteina do complemento C5.

Em algumas concretizações de outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que bloqueia a clivagem da proteina do complemento C5 in vivo ou de um seu sal e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. 24 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ É descrita uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos 80% idêntica a, preferivelmente 90% idêntica a uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um seu sal. É descrita uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos 80% idêntica a, preferivelmente 90% idêntica à região única de uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um seu sal. É descrita uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero possuindo 40, 30 ou 10 nucleótidos contiguos idênticos a 40, 30 ou 10 nucleótidos, respectivamente, de uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98. A composição farmacêutica descrita pode compreender um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. É descrita uma composição farmacêutica para utilização no tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença in vivo, onde a composição farmacêutica compreende um aptâmero possuindo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 to 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um seu sal.

Em algumas concretizações, a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar é uma doença isquémica aguda (enfarte do miocárdio, icto, danos isquémicos/de reperfusão); uma doença inflamatória aguda (doença infecciosa, septicemia, choque, rejeição de transplante agudo/hiperagudo); uma doença inflamatória crónica e/ou imuno-mediada (alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outras doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES), rejeição de transplante subagudo/crónico, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas concretizações, as doenças mediadas pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar incluem a activação do complemento associada com diálise ou circunstâncias em que o 25 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ sangue é passado sobre, e/ou através de, tubagem sintética e/ou material estranho. Em algumas concretizações, a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar é seleccionada do grupo que consiste em lesão do miocárdio relacionada com cirurgia CABG, lesão do miocárdio relacionada com angioplastia de balão e lesão do miocárdio relacionada com restenose. Em algumas concretizações a doença mediada pela proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a tratar são complicações relacionadas com cirurgia CABG. Numa concretização particular, a doença a tratar é lesão do miocárdio relacionada com cirurgia CABG. É divulgado um método que inclui a administração da composição farmacêutica compreendendo um aptâmero possuindo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, a um paciente para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que seja cerca de 0,5 a cerca de 10 vezes a da proteína do complemento C5 endógena. Em algumas concretizações, as composições farmacêuticas de aptâmero são administradas para atingir uma concentração plasmática de aptâmero que seja cerca de 0,75 a cerca de 5 vezes, 0,75 a cerca de 3 vezes, e 1,5 a cerca de 2 vezes a da proteína do complemento C5 endógena, enquanto em outras concretizações a composição de aptâmero é administrada para atingir uma concentração equivalente à da proteína do complemento endógena. Em alguns arranjos, a composição farmacêutica é administrada para atingir uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μΜ, cerca de 4 μΜ, cerca de 3 μΜ, cerca de 2 μΜ, cerca de 1,5 μΜ, cerca de 1 μΜ ou de cerca de 500 nM.

Pode ser utilizada qualquer combinação de via, duração e taxa de administração que seja suficiente para atingir as concentrações plasmáticas de aptâmero desejadas. Em algumas concretizações a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em algumas concretizações, a composição farmacêutica é administrada sob a forma de um bolus e/ou por via de infusão contínua.

Em concretizações particulares de tratamento, prevenção e/ou melhoria de complicações relacionadas com cirurgia CABG, 26 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ particularmente lesão do miocárdio relacionada com cirurgia CABG, o método compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e a continuação da administração pelo menos 24 horas, em algumas concretizações cerca de 48 horas ou em algumas concretizações cerca de 72 horas. Numa concretização particular, a concentração plasmática de aptâmero desejada, e.g., duas vezes a concentração da proteína do complemento endógena em algumas concretizações, é conseguida por administração de uma bolus intravenoso ao paciente a tratar antes de, simultaneamente com, ou após, infusão intravenosa de uma dose menor de aptâmero. Em ainda outras concretizações, quando o aptâmero/conjugado compreende uma semivida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes por dia sob a forma de uma dose de bolus intravenoso. É divulgado um método de diagnóstico, o método compreendendo o contacto de uma composição que se suspeita compreender proteína do complemento C5 ou uma sua variante, com um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 e a detecção da presença ou ausência de proteína do complemento C5 ou uma sua variante. Em algumas concretizações a proteína do complemento ou variante é de vertebrado, particularmente de mamífero, e mais particularmente humana. É divulgada uma composição de aptâmero possuindo um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO:83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 para utilização como diagnóstico in vitro ou in vivo. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos que consiste essencialmente numa sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO 68 e 69. É descrito um aptâmero compreendendo uma sequência de nucleótidos que consiste numa sequência de nucleótidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO 68 e 69. Os aptâmeros aqui descritos podem ser utilizados num método de diagnóstico. 27 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção estão estabelecidos na descrição anexa que se segue. Embora possam ser utilizados na prática ou testes da presente invenção quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos que são aqui descritos, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Outras características, objectos e vantagens da invenção serão evidentes da descrição. No fasciculo, as formas singulares também incluem o plural a menos que o contexto dite claramente de outro modo. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que é vulgarmente entendido por uma pessoa competente na matéria à qual a presente invenção pertence. Em caso de conflito, o presente fasciculo será o controlo. O Método SELEX™

Um método adequado para gerar um aptâmero é com o processo intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" ("SELEX™") genericamente representado na Figura 2. 0 processo SELEX™ é um método para a evolução in vitro de moléculas de ácido nucleico com ligação altamente especifica a moléculas alvo e está descrito, e.g., na Pat. U.S. 5,475,096 intitulada "Nucleic Acid Ligands", e na Pat. U.S. 5,270,163 (veja-se também WO 91/19813) intitulada "Nucleic Acid Ligands". Cada ligando de ácido nucleico identificado pelo SELEX™, i.e., cada aptâmero, é um ligando especifico de um determinado composto ou molécula alvo. O processo SELEX e baseado no discernimento unico de que ácidos nucleicos possuem suficiente capacidade para formar uma variedade de estruturas bi- e tri-dimensionais e suficiente versatilidade química disponível dentro dos seus monómeros para actuarem como ligandos (i.e., formam pares de ligação específica) com virtualmente qualquer composto químico, seja monomérico ou polimérico. Podem servir como alvos moléculas de qualquer dimensão ou composição. O SELEX™ assenta, como ponto de partida, numa grande biblioteca ou banco de oligonucleótidos de cadeia simples compreendendo sequências aleatórias. Os oligonucleótidos podem 28 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ser ADN, ARN ou híbridos de ADN/ARN modificados ou não modificados. Em alguns exemplos, o banco compreende oligonucleótidos 100% aleatórios ou parcialmente aleatórios. Em outros exemplos, o banco compreende oligonucleótidos aleatórios ou parcialmente aleatórios contendo pelo menos uma sequência fixa e/ou conservada incorporada no interior da sequência aleatória. Em outros exemplos, o banco compreende oligonucleótidos aleatórios ou parcialmente aleatórios contendo pelo menos uma sequência fixa e/ou conservada na sua extremidade 5' e/ou 3' que pode compreender uma sequência partilhada por todas as moléculas do banco de oligonucleótidos. As sequências fixas são sequências tais como locais de hibridação para iniciadores de PCR, sequências promotoras para ARN-polimerases (e.g., T3, T4, T7, e SP6) , locais de restrição ou sequências homopoliméricas, tais como tractos de polipéptido A ou polipéptido T, núcleos catalíticos, locais para ligação selectiva a colunas de afinidade, e outras sequências para facilitar a clonagem e/ou sequenciação de um oligonucleótido de interesse. As sequências conservadas são sequências, outras que não as sequências fixas previamente descritas, partilhadas por um número de aptâmeros que se ligam ao mesmo alvo.

Os oligonucleótidos do banco incluem preferivelmente uma porção de sequência aleatória assim como sequências fixas necessárias para uma amplificação eficiente. Tipicamente os oligonucleótidos do banco de partida contêm sequências 5'- e 3'-terminais fixas que flanqueiam uma região interna de 30-50 nucleótidos aleatórios. Os nucleótidos aleatórios podem ser produzidos de várias maneiras incluindo por síntese química e selecção por tamanhos a partir de ácidos nucleicos celulares clivados aleatoriamente. A variação de sequências em ácidos nucleicos de teste pode também ser introduzida ou aumentada por mutagénese antes ou durante as iterações de selecção/amplificação. A porção de sequência aleatória do oligonucleótido pode ter qualquer comprimento e pode compreender ribonucleótidos e/ou desoxirribonucleótidos e pode incluir nucleótidos ou análogos de nucleótidos modificados ou não naturais. Veja-se, e.g., a Patente U.S. 5,958,691; a Patente U.S. 5,660,985; a Patente U.S. 5,958,691; a Patente U.S. 5,698,687; a Patente 29 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ U.S. 5,817,635; a Patente U.S. 5,672,695, e a Publicação do PCT WO 92/07065. Os oligonucleótidos aleatórios podem ser sintetizados a partir de nucleótidos ligados através de fosfodiéster utilizando técnicas de sintese de oligonucleótidos em fase sólida bem conhecidas na especialidade. Veja-se, e.g., Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) e Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986). Os oligonucleótidos aleatórios podem também ser sintetizados utilizando métodos em fase de solução tais como métodos de sintese de triésteres. Veja-se, e.g., Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978). As sínteses típicas realizadas em equipamento de síntese de ADN automático originam 1014-1016 moléculas individuais, um número suficiente para a maioria das experiências de SELEX™. Regiões suficientemente grandes de sequência aleatória no desenho da sequência aumentam a probabilidade de que cada molécula sintetizada represente uma sequência única. A biblioteca de oligonucleótidos de partida pode ser gerada por síntese química automatizada num sintetizador de ADN. Para sintetizar sequências aleatórias, misturas de todos os quatro nucleótidos são adicionadas a cada passo de adição de nucleótidos durante o processo de síntese, permitindo a incorporação aleatória de nucleótidos. Como indicado acima, numa concretização, os oligonucleótidos aleatórios compreendem sequências completamente aleatórias; contudo, em outras concretizações, os oligonucleótidos aleatórios podem compreender trechos de sequências não aleatórias ou parcialmente aleatórias. As sequências parcialmente aleatórias podem ser criadas por adição dos quatro nucleótidos em diferentes razões molares em cada passo de adição. A biblioteca de oligonucleótidos de partida pode ser de ARN ou de ADN. Nestas circunstâncias, quando se pretende utilizar uma biblioteca de ARN como biblioteca de partida, esta é tipicamente gerada por transcrição de uma biblioteca de ADN in vitro utilizando ARN-polimerase de T7 ou ARN-polimerases de T7 modificadas, e purificada. A biblioteca de ARN ou de ADN é então misturada com o alvo sob condições favoráveis para ligação e submetida a iterações passo a passo de ligação, separação (partição) e amplificação, utilizando o 30 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ mesmo esquema geral de selecção, para conseguir virtualmente qualquer critério desejado de afinidade e selectividade de ligação. Mais especificamente, partindo de uma mistura contendo o banco de partida de ácidos nucleicos, o método SELEX™ inclui passo de: (a) contacto da mistura com o alvo sob condições favoráveis para ligação; (b) separação (partição) de ácidos nucleicos não ligados dos ácidos nucleicos que se ligaram especificamente a moléculas alvo; (c) dissociação dos complexos ácido nucleico-alvo; (d) amplificação dos ácidos nucleicos dissociados dos complexos ácido nucleico-alvo para originar uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligandos; e (e) reiteração dos passos de ligação, separação (partição), dissociação e amplificação tantos ciclos quantos os desejados para obter ligandos de ácido nucleico de levada afinidade, altamente específicos, para a molécula alvo. Nestas circunstâncias, quando estão a ser seleccionados aptâmeros de ARN, o método SELEX™ compreende ainda os passos de: (i) transcrição inversa dos ácidos nucleicos dissociados dos complexos ácido nucleico-alvo antes da amplificação no passo (d); e (ii) transcrição dos ácidos nucleicos amplificados do passo (d) antes da reiniciação do processo.

Numa mistura de ácidos nucleicos contendo um grande número de sequências e estruturas possíveis, existe uma ampla gama de afinidades de ligação para com um determinado alvo. Uma mistura de ácidos nucleicos compreendendo, por exemplo, um segmento aleatório de 20 nucleótidos pode ter 420 possibilidades de candidatos. Aqueles que possuem as maiores constantes afinidade para o alvo têm maior probabilidade de se ligarem ao alvo. Após separação (partição), dissociação e amplificação, é gerada uma segunda mistura de ácidos nucleicos, enriquecida nos candidatos de maior afinidade de ligação. Ciclos de selecção adicionais favorecem progressivamente os melhores ligandos até a mistura de ácido nucleico resultante ser predominantemente composta por apenas uma ou poucas sequências. Estas podem então ser clonadas, sequenciadas e individualmente testadas quanto à afinidade de ligação sob a forma de ligandos puros ou aptâmeros.

Os ciclos de selecção e amplificação são repetidos até ser atingido o objectivo desejado. No caso mais geral, a selecção/amplificação é continuada até não se conseguir 31 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ melhoria significativa na força da ligação por repetição do ciclo. 0 método é tipicamente utilizado para amostrar aproximadamente 1014 espécies diferentes de ácido nucleico mas pode ser utilizado para amostrar tantas quantas cerca de 1018 espécies diferentes de ácido nucleico. Geralmente, as moléculas de aptâmeros de ácido nucleico são seleccionadas num procedimento de 5 a 20 ciclos. Numa concretização, é introduzida heterogeneidade apenas nas etapas iniciais de selecção e não ocorre através do processo de replicação.

Numa concretização de SELEX™, o processo de selecção é tão eficiente no isolamento dos ligandos de ácido nucleico que se ligam mais fortemente ao alvo seleccionado, que apenas é necessário um ciclo de selecção e amplificação. Esta eficiente selecção pode ocorrer, por exemplo, num processo do tipo cromatográfico em que a capacidade de ácidos nucleicos se associarem com alvos ligados numa coluna funciona de maneira tal que a coluna é suficientemente capaz de permitir a separação e o isolamento dos ligandos de ácido nucleico de maior afinidade.

Em muitos casos, não é necessariamente desejável realizar os passos iterativos de SELEX™ até ser identificado um único ligando de ácido nucleico. A solução de ligandos de ácido nucleico específicos para o alvo pode incluir uma família de estruturas ou motivos de ácido nucleico que possuem um número de sequências conservadas e um número de sequências que podem ser substituídas ou adicionadas sem afectar significativamente a afinidade dos ligandos de ácido nucleico para com o alvo. Terminando o processo SELEX™ antes de estar completo, é possível determinar a sequência de um número de membros da família da solução de ligandos de ácido nucleico.

Sabe-se que existem uma variedade de estruturas primárias, secundária e terciária de ácido nucleico. As estruturas ou motivos que se mostrou estarem mais vulgarmente envolvidas em interacções que não do tipo Watson-Crick são referidas como laços do tipo "gancho de cabelo", protuberâncias simétricas e assimétricas, pseudo-nós e miríades de combinações dos mesmos. Quase todos os casos conhecidos destes motivos sugerem que estes podem ser formados numa sequência de ácido nucleico de não mais do que 32 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 30 nucleótidos. Por esta razão, é frequentemente preferido que os procedimentos de SELEX™ com segmentos aleatórios contíguos sejam iniciados com sequências de ácido nucleico contendo um segmento aleatório entre cerca de 20 e cerca de 50 nucleótidos e em algumas concretizações de cerca de 30 a cerca de 40 nucleótidos. Num exemplo, a sequência 5'-fixa:aleatória:3'-fixa compreende uma sequência aleatória de cerca de 30 a cerca de 50 nucleótidos. O método SELEX™ nuclear foi modificado para atingir vários objectivos específicos. Por exemplo, a Patente U.S. 5,707,796 descreve a utilização de SELEX™ em conjunto com electroforese em gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico com caracteristicas estruturais especificas, tais como ADN dobrado. A Patente U.S. 5,763,177 descreve métodos à base do SELEX™ para a selecção de ligandos de ácido nucleico contendo grupos fotorreactivos capazes de se ligarem a, e/ou se foto-reticularem a e/ou foto-inactivarem, uma molécula alvo. A Patente U.S. 5,567,588 e a Patente U.S. 5,861,254 descrevem métodos à base do SELEX™ que atingem uma separação (partição) altamente eficiente entre oligonucleótidos possuindo elevada e baixa afinidade para com uma molécula alvo. A Patente U.S. 5,496,938 descreve métodos para obtenção de ligandos de ácido nucleico melhorados após o processo SELEX™ ter sido realizado. A Patente U.S. 5,705,337 descreve métodos para a ligação covalente de um ligando ao seu alvo. O SELEX™ pode também ser utilizado para obter ligandos de ácido nucleico que se ligam a mais do que um local na molécula alvo, e para obter ligandos de ácido nucleico que incluem espécies, que não de ácido nucleico, que se ligam a locais específicos no alvo. O SELEX™ proporciona meios para o isolamento e a identificação de ligandos de ácido nucleico que se ligam a qualquer alvo concebível, incluindo biomoléculas grandes e pequenas tais como proteínas de ligação a ácido nucleico e proteínas que se desconhece ligarem-se a ácidos nucleicos como parte da sua função biológica assim como cofactores e outras moléculas pequenas. Por exemplo, a Patente U.S. 5,580,737 divulga sequências de ácido nucleico identificadas através de SELEX™ que são capazes de se ligarem com elevada afinidade a cafeína e ao análogo proximamente relacionado, teofilina. 33 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ Ο Counter-SELEX™ é um método para melhorar a especificidade de ligandos de ácido nucleico para com uma molécula alvo por eliminação de sequências de ligandos de ácido nucleico com reactividade cruzada relativamente a uma ou mais moléculas que não alvos. 0 Counter-SELEX™ é constituído pelos passos de: (a) preparação de uma mistura de ácidos nucleicos candidata; (b) contacto da mistura candidata com o alvo, em que ácidos nucleicos possuindo uma afinidade acrescida para com o alvo relativamente à mistura candidata podem ser separados do restante da mistura candidata; (c) separação (partição) dos ácidos nucleicos com afinidade acrescida do restante da mistura candidata; (d) dissociação dos ácidos nucleicos com afinidade acrescida do alvo; e) contacto dos ácidos nucleicos com afinidade acrescida com uma ou mais moléculas que não alvos de modo a que ligandos de ácido nucleico com afinidade específica para com a(s) molécula(s) que não alvo(s) sejam removidos; e f) amplificação dos ácidos nucleicos com afinidade específica apenas para com a molécula alvo para originar uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácido nucleico com uma afinidade e uma especificidade de ligação relativamente superiores para com a molécula alvo. Como descrito acima para o SELEX™, os ciclos de selecção e amplificação são repetidos enquanto necessário até ser atingido um objectivo desejado.

Um potencial problema encontrado na utilização de ácidos nucleicos como terapêuticas e vacinas é o facto de os oligonucleótidos na sua forma de fosfodiéster poderem ser rapidamente degradados em fluidos corporais por enzimas intracelulares e extracelulares, tais como endonucleases e exonucleases, antes do efeito desejado ser manifestado. 0 método SELEX™ abrange assim a identificação de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidade contendo nucleótidos modificados que conferem características melhoradas ao ligando, tais como estabilidade in vivo melhorada ou características de entrega melhoradas. Os exemplos destas modificações incluem substituições químicas nas posições de riboses e/ou fosfatos e/ou bases. Ligandos de ácido nucleico contendo nucleótidos modificados, identificados pelo SELEX™, estão descritos, e.g., na Patente U.S. 5,660,985, que descreve oligonucleótidos contendo derivados de nucleótidos 34 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ quimicamente modificados na posição 2' da ribose, na posição 5 das pirimidinas e na posição 8 das purinas, na Patente U.S. 5,756,703 que descreve oligonucleótidos contendo várias pirimidinas modificadas em 2', e na Patente U.S. 5,580,737 que descreve ligandos de ácido nucleico contendo um ou mais nucleótidos modificados com substituintes 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'— F) e/ou 2'-OMe (2'-OMe) altamente específicos.

As modificações contempladas dos ligandos de ácido nucleico incluem, mas não se lhes limitam, as que proporcionam outros grupos químicos que incorporam carga adicional, polarizabilidade, hidrofobicidade, ligações de hidrogénio, interacção electrostática e fluxionalidade, às bases do ligando de ácido nucleico ou ao ligando de ácido nucleico como um todo. Modificações para gerar populações de oligonucleótidos que são resistentes a nucleases podem também incluir uma ou mais ligações internucleótidos alternativas, açúcares alterados, bases alteradas, ou suas combinações. Estas modificações incluem, mas não se lhes limitam, modificações na posição 2' do açúcar, modificações na posição 5 da pirimidina, modificações na posição 8 da purina, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracilo; modificações do esqueleto, modificações de fosforotioato ou alquilfosfato, metilações e combinações de emparelhamento de bases invulgares tais como as isobases isocitidina e isoguanidina. As modificações podem também incluir modificações a 3' e 5' tais como remates.

Numa concretização, são proporcionados oligonucleótidos em que o grupo P(0)0 está substituído por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), P(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO ou CH2 ("formacetal") ou 3'-amina (-NH-CH2-CH2-) , em que cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído. Os grupos de ligação podem ser ligados a nucleótidos adjacentes através de uma ligação -O-, -N- ou -S-. Não é necessário que todas as ligações sejam idênticas. Como aqui se utiliza, o termo fosforotioato abrange um ou mais átomos de oxigénio que não formam pontes numa ligação fosfodiéster substituídos por um ou mais átomos de enxofre. 35 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Em outras concretizações, os oligonucleótidos compreendem grupos açúcar modificados, por exemplo, um ou mais dos grupos hidroxilo é substituído por halogéneo, grupos alifáticos, ou é funcionalizado em éteres ou aminas. Numa concretização, a posição 2' do resíduo de furanose é substituída com qualquer um de entre os grupos OMe, O-alquilo, O-alilo, S-alquilo, S-alilo ou halo. Métodos de síntese de açúcares modificados em 2' estão descritos, e.g., em Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); e Hobbs, et al., Biochemistry 12:5138-5145 (1973). Outras modificações são conhecidas de uma pessoa competente na matéria. Estas modificações podem ser modificações pré-processo SELEX™ ou modificações pós-processo SELEX™ (modificação de ligandos não modificados previamente identificados) ou podem ser feitas por incorporação no processo SELEX.

As modificações pré-processo SELEX ou as feitas por incorporação no processo SELEX originaram ligandos de ácido nucleico com especificidade para com o seu alvo SELEX™ e com estabilidade melhorada, e.g., estabilidade in vivo. As modificações pós-processo SELEX™ feitas a ligandos de ácido nucleico podem resultar numa estabilidade melhorada, e.g., estabilidade in vivo sem afectar adversamente a capacidade de ligação do ligando de ácido nucleico. 0 método SELEX™ abrange a combinação de oligonucleótidos seleccionados com outros oligonucleótidos seleccionados e unidades funcionais que não oligonucleótidos, como descrito na Patente U.S. 5,637,459 e na Patente U.S. 5,683,867. 0 método SELEX™ abrange ainda a combinação de ligandos de ácido nucleico seleccionados com compostos lipófilos ou não imunogénicos de elevado peso molecular num complexo diagnóstico ou terapêutico, como descrito, e.g., na Patente U.S. 6,011,020, na Patente U.S. 6,051,698, e na Publicação PCT WO 98/18480. Estas patentes e pedidos de patente ensinam a combinação de um amplo arranjo de formatos e outras propriedades, com eficientes propriedades de amplificação e replicação de oligonucleótidos, e com as propriedades desejáveis de outras moléculas. 36 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Também foi explorada a identificação de ligandos de ácido nucleico para péptidos pequenos, flexíveis, através do método SELEX™. Péptidos pequenos possuem estruturas flexíveis e usualmente existem em solução num equilíbrio de múltiplos confórmeros, e portanto pensou-se inicialmente que as afinidades de ligação podiam ser limitadas pela perda de entropia conformacional por ligação de um péptido flexível. Contudo, a exequibilidade da identificação de ligandos de ácido nucleico para péptidos pequenos em solução foi demonstrada na Patente U.S. 5,648,214. Nesta patente foram identificados ligandos de ácido nucleico de ARN de alta afinidade para a substância P, um péptido de 11 aminoácido,.

Os aptâmeros com especificidade e afinidade de ligação para o(s) alvo(s) aqui descritos são tipicamente seleccionados pelo processo SELEX™ como aqui descrito. Como parte do processo SELEX™, as sequências seleccionadas para se ligarem ao alvo são então opcionalmente minimizadas para determinar a sequência mínima que possui a afinidade de ligação desejada. As sequências seleccionadas e/ou as sequências minimizadas são opcionalmente optimizadas realizando mutagénese aleatória ou dirigida da sequência para aumentar a afinidade de ligação ou alternativamente para determinar que posições na sequência são essenciais para a actividade de ligação. Adicionalmente, podem ser efectuadas selecções com sequências que incorporam nucleótidos modificados para estabilizar as moléculas do aptâmero contra a degradação in vivo. SELEX™ Modificado em 2 '

Para um aptâmero ser adequado para utilização como terapêutica, é preferivelmente de síntese pouco dispendiosa, seguro e estável in vivo. Aptâmeros de ADN e ARN de tipo selvagem não são tipicamente estáveis in vivo devido á sua susceptibilidade à degradação por nucleases. A resistência à degradação por nucleases pode ser grandemente aumentada pela incorporação de grupos de modificação na posição 2'.

Grupos fluoro e amino foram incorporados com sucesso em bibliotecas de oligonucleótidos a partir das quais foram subsequentemente seleccionados aptâmeros. Contudo, estas modificações aumentam grandemente o custo da síntese do 37 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ aptâmero resultante, e podem introduzir questões de segurança em alguns casos devido à possibilidade dos nucleótidos modificados poderem ser reciclados para o ADN hospedeiro por degradação dos oligonucleótidos modificados e subsequente utilização dos nucleótidos como substratos para a síntese de ADN.

Aptâmeros que contêm nucleótidos 2'-OMe ("2'-OMe"), como aqui proporcionado em algumas concretizações, superam muitas destas desvantagens. Oligonucleótidos contendo nucleótidos 2'-OMe são resistentes às nucleases e de síntese pouco dispendiosa. Embora os nucleótidos 2'-OMe sejam ubíquos em sistemas biológicos, as polimerases naturais não aceitam os 2'-O-metil-NTP como substratos sob condições fisiológicas, pelo que não há preocupações com a segurança relativamente á reciclagem de nucleótidos 2'-OMe para o ADN hospedeiro. 0 método SELEX™ utilizado para gerar aptâmeros modificados em 2' está descrito, e.g., no pedido de Patente U.S. 2004/0197804 e no pedido de Patente U.S. 2005/0037394, intitulado "Method for in vitro Selection of 2'-OMe Substituted Nucleic Acids". A presente invenção inclui aptâmeros que se ligam a, e modulam a função da proteína do complemento C5, que contêm nucleótidos modificados (e.g., nucleótidos que possuem uma modificação na posição 2' ) para tornar o oligonucleótido mais estável do que o oligonucleótido não modificado à degradação enzimática e química, assim como à degradação térmica e física. Embora haja vários exemplos de aptâmeros contendo 2'-OMe na literatura (veja-se, e.g., Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995) estes foram gerados pela selecção in vitro de bibliotecas de transcritos modificados em que os resíduos C e U foram substituídos com 2'-fluoro (2'-F) e os resíduos A e G com 2'-OH. Uma vez identificadas sequências funcionais, então cada resíduo A e G foi testado quanto a tolerância à substituição com 2'-OMe, e o aptâmero foi re-sintetizado possuindo todos os resíduos A e G que toleravam substituição com 2'-OMe como resíduos 2'-OMe. A maioria dos resíduos A e G de aptâmeros gerados deste modo em dois passos toleram substituição com resíduos 2'-OMe, embora, em média, aproximadamente 20% não tolerem. Consequentemente, os aptâmeros gerados utilizando este método tendem a conter de dois a quatro resíduos 2'-OH, e como resultado a estabilidade 38 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ e ο custo da síntese são comprometidos. Incorporando nucleótidos modificados na reacção de transcrição que gera oligonucleótidos estabilizados utilizados em bancos de oligonucleótidos a partir dos quais os aptâmeros são seleccionados e enriquecidos por SELEX™ (e/ou quaisquer das suas variações e melhoramentos, incluindo os que são aqui descritos), os métodos da presente invenção eliminam a necessidade de estabilização dos oligonucleótidos aptâmeros seleccionados (e.g., por nova síntese dos oligonucleótidos aptâmeros com nucleótidos modificados).

Numa concretização, a presente invenção proporciona aptâmeros compreendendo combinações de modificações 2'-OH, 2'-F e 2 '-OMe dos nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP e UTP. São aqui descritos aptâmeros compreendendo combinações de modificações 2'-OH, 2'-F, 2'-desoxi, 2'-OMe, 2'-NH2 e 2'-metoxietilo dos nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP e UTP. São aqui descritos aptâmeros compreendendo 5 combinações de modificações 2'-OH, 2'-F, 2'-desoxi, 2'-OMe, 2'-NH2 e 2'-metoxietilo dos nucleótidos ATP, GTP, CTP, TTP e UTP.

Os aptâmeros modificados em 2' da invenção são criados utilizando polimerases modificadas, e.g., uma polimerase de T7 modificada, possuindo uma taxa de incorporação de nucleótidos modificados possuindo substituintes volumosos na posição 2' da furanose que é superior à de polimerases do tipo selvagem. Por exemplo, um mutante simples de polimerase de T7 (Y639F) em que o resíduo de tirosina na posição 639 foi alterado para fenilalanina utiliza prontamente 2'-desoxi-, 2'-amino- e 2'-fluoro- nucleótido-trifosfatos (NTP) como substratos e tem sido amplamente utilizada para sintetizar ARN modificados para uma variedade de aplicações. Contudo, esta polimerase de T7 mutante reportadamente não consegue utilizar prontamente (i.e., incorporar) os NTP com substituintes volumosos em 2' tais como substituintes 2'-OMe ou 2'-azido (2'-N3). Para incorporação de substituintes volumosos em 2', foi descrita uma polimerase de T7 duplamente mutante (Y639F/H784A) possuindo a histidina na posição 784 alterada para um resíduo de alanina em adição à mutação Y639F e foi utilizada em circunstâncias limitadas para incorporar NTP de pirimidina modificados. Veja-se Padilla, R e Sousa, R., Nucleic Acids Res.r 2002, 30(24): 138. Foi também descrito um mutante 39 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ simples de polimerase de T7 (H784A) possuindo a histidina na posição 784 alterada para um residuo de alanina. Padilla et al., Nucleic Acid Research, 2002, 30: 138. Tanto no mutante duplo Y639F/H784A como no mutante simples H784A de polimerase de T7, a alteração para um residuo de aminoácido menor tal como a alanina, permite a incorporação de substratos nucleotidicos mais volumosos, e.g., nucleótidos substituídos com 2'-O metilo.

Genericamente, verificou-se que sob as condições aqui divulgadas, o mutante simples Y693F pode ser utilizado para a incorporação de todos os NTP substituídos com 2'-OMe excepto o GTP e o mutante duplo Y639F/H784A pode ser utilizado para a incorporação de todos os NTP substituídos com 2'-OMe incluindo o GTP. É esperado que o mutante simples H784A possua propriedades similares aos mutantes Y639F e Y639F/H784A quando utilizados sob as condições aqui divulgadas.

Os oligonucleótidos modificados em 2' podem ser sintetizados inteiramente a partir de nucleótidos modificados, ou com um subconjunto de nucleótidos modificados. As modificações podem ser as mesmas ou diferentes. Todos os nucleótidos podem ser modificados, e todos podem conter a mesma modificação. Todos os nucleótidos podem ser modificados, mas conter modificações diferentes, e.g., todos os nucleótidos contendo a mesma base podem ter um tipo de modificação, enquanto os nucleótidos contendo outras bases podem ser tipos diferentes de modificações. Todos os nucleótidos de purina podem ter um tipo de modificação (ou não estarem modificados), enquanto todos os nucleótidos de pirimidina têm outro tipo, diferente, de modificação (ou não estão modificados). Desta maneira, os transcritos, ou bancos de transcritos são gerados utilizando qualquer combinação de modificações, incluindo, por exemplo, ribonucleótidos (2'-OH), desoxirribonucleótidos (2' — desoxi), nucleótidos 2'-F e 2'-OMe. Uma mistura de transcrição contendo C e U 2'-OMe e A e G 2'-OH é referida como uma mistura "rRmY" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "rRmY". Uma mistura de transcrição contendo A e G desoxi e U e C 2' -OMe é referida como uma mistura "dRmY" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "dRmY". Uma mistura de transcrição contendo A, C e U 2'-OMe, e G 2'-OH é referida como uma 40 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ mistura "rGmH" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "rGmH". Uma mistura de transcrição alternadamente contendo A, C, U e G 2'-OMe e A, U e C 2'-OMe e G 2'-F é referida como uma "mistura alternante" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros da "mistura alternante". Uma mistura de transcrição contendo A, U, C e G 2'-OMe, onde até 10% das G são ribonucleótidos é referida como uma mistura "r/mGmH" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "r/mGmH". Uma mistura de transcrição contendo A, U e C 2'-OMe, e G 2'-F é referida como uma mistura "fGmH" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "fGmH". Uma mistura de transcrição contendo A, U e C 2'-OMe, e G desoxi é referida como uma mistura "dGmH" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "dGmH". Uma mistura de transcrição contendo A desoxi, e C, G e U 2'-OMe é referida como uma mistura "dAmB" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "dAmB", e uma mistura de transcrição contendo todos os nucleótidos 2'-OH é referida como uma mistura "rN" e os aptâmeros seleccionados a partir dela são referidos como aptâmeros "rN" ou "rRrY". Um aptâmero "mRmY" é um que contém todos os nucleótidos 2'-OMe e é usualmente derivado a partir de um oligonucleótido r/mGmH por substituição pós-SELEX, quando possível, de quaisquer G 2'-OH por G 2'-OMe.

Os exemplos descritos incluem qualquer combinação de nucleótidos 2'-OH, 2'-desoxi e 2'-OMe. Os exemplos descritos incluem qualquer combinação de nucleótidos 2'-desoxi e 2'-OMe. Os exemplos descritos incluem qualquer combinação de nucleótidos 2'-desoxi e 2'-OMe em que as pirimidinas são 2'-OMe (tais como dRmY, mRmY ou dGmH). A incorporação de nucleótidos modificados nos aptâmeros da invenção é realizada antes (pré-) do processo de selecção (e.g., uma modificação pré-processo SELEX™). Opcionalmente, os aptâmeros da invenção em que nucleótidos modificados foram incorporados por modificação pré-processo SELEX™ podem ser adicionalmente modificados por modificação pós-processo SELEX™ (i.e., uma modificação pós-processo SELEX™ após uma modificação pré-SELEX™). As modificações pré-processo SELEX™ originam ligandos de ácido nucleico modificados com 41 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ especificidade para ο alvo SELEX™ e também estabilidade melhorada in vivo. As modificações pós-processo SELEX™, i.e., modificação (e.g., truncagem, deleção, substituição ou modificações de nucleótidos adicionais de ligandos previamente identificados possuindo nucleótidos incorporados por modificação pré-processo SELEX™) podem resultar num melhoramento adicional da estabilidade in vivo sem afectar adversamente a capacidade de ligação do ligando de ácido nucleico possuindo nucleótidos incorporados por modificação pré-processo SELEX™.

Para gerar bancos de transcritos de ARN modificados em 2' (e.g., 2'-0Me) em condições sob as quais uma polimerase aceita os NTP modificados em 2' , a polimerase preferida é o mutante duplo Y693F/H784A ou o mutante simples Y693F. Outras polimerases, particularmente as que exibem uma tolerância elevada para substituintes volumosos em 2’ , podem também ser utilizadas na presente invenção. Estas polimerases podem ser rastreadas quanto a esta capacidade por ensaio da sua capacidade para incorporar nucleótidos modificados sob as condições de transcrição aqui divulgadas.

Um número de factores foram determinados como sendo importantes para as condições de transcrição úteis nos métodos aqui descritos. Por exemplo, são observados aumentos nos rendimentos de transcrito modificado quando uma sequência de comando é incorporada na extremidade 5' de uma sequência fixada na extremidade 5' do molde de transcrição de ADN, de modo que a que pelo menos cerca dos primeiros 6 resíduos do transcrito resultante sejam todos purinas.

Outro factor importante na obtenção de transcritos que incorporam nucleótidos modificados é a presença ou a concentração de GTP 2'-OH. A transcrição pode ser dividida em duas fases: a primeira fase é a iniciação, durante a qual um NTP é adicionado à extremidade 3'-hidroxilo de GTP (ou outra guanosina substituída) para originar um dinucleótido que é depois alongado em cerca de 10-12 nucleótidos; a segunda fase é o alongamento, durante o qual a transcrição prossegue para além da adição dos primeiros cerca de 10-12 nucleótidos. Verificou-se que pequenas quantidades de GTP 2'-OH adicionadas a uma mistura de transcrição contendo um excesso de GTP 2'-OMe 42 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ são suficientes para permitir que a polimerase inicie a transcrição utilizando GTP 2'-OH, mas logo que a transcrição entra na fase de alongamento a reduzida discriminação entre GTP 2'-OMe e 2'-OH, e o excesso de GTP 2'-OMe relativamente a GTP 2'-OH permitem a incorporação de principalmente o GTP 2 ' -OMe.

Outro factor importante na incorporação de nucleótidos substituídos com 2'-OMe nos transcritos é a utilização de magnésio e manganês bivalentes na mistura de transcrição. Verificou-se que diferentes combinações de concentrações de cloreto de magnésio e cloreto de manganês afectam os rendimentos de transcritos 2'-OMe, sendo a concentração óptima do cloreto de magnésio e de manganês dependente da concentração na mistura da reacção de transcrição dos NTP que complexam iões metálicos bivalentes. Para obter os maiores rendimentos de transcritos substituídos ao máximo em 2' com OMe (i.e., todos os nucleótidos A, C e U e cerca de 90% dos G) , são preferidas concentrações de aproximadamente 5 mM de cloreto de magnésio e 1,5 mM de cloreto de manganês quando cada NTP está presente numa concentração de 0,5 mM. Quando a concentração de cada NTP é de 1,0 mM, são preferidas concentrações de aproximadamente 6,5 mM de cloreto de magnésio e 2,0 mM de cloreto de manganês. Quando a concentração de cada NTP é de 2,0 mM, são preferidas concentrações de aproximadamente 9,6 mM de cloreto de magnésio e 2,9 mM de cloreto de manganês. Em qualquer caso, afastamentos a estas concentrações de até duas vezes ainda originam quantidades significativas de transcritos modificados. A iniciação da transcrição com GMP ou guanosina é também importante. Este efeito resulta da especificidade da polimerase para o nucleótido de iniciação. Em resultado, o nucleótido 5'-terminal de qualquer transcrito gerado desta maneira é provavelmente G 2'-OH. A concentração preferida de GMP (ou guanosina) é 0,5 mM e ainda mais preferivelmente 1 mM. Verificou-se também que incluir PEG, preferivelmente PEG-8000, na reacção de transcrição é útil para maximizar a incorporação de nucleótidos modificados.

Para um máximo de incorporação de ATP (100%), UTP (100%), CTP(100%) e GTP (-90%) 2'-OMe ("r/mGmH") nos transcritos são 43 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ preferidas as condições seguintes: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 a 10% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 5 mM (6,5 mM guando a concentração de cada NTP 2'-OMe é de 1,0 mM) , MnCl2 1,5 mM (2,0 mM quando a concentração de cada NTP 2'-OMe é de 1,0 mM) , NTP 2'-OMe (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 1,0 mM), GTP 2'-OH 30 μΜ, GMP 2'-OH 500 μΜ, pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN-polimerase de T7 Y639F/H784A, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e uma sequência de comando só de purina de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento. Como aqui se utiliza, uma unidade da ARN-polimerase de T7 mutante Y639F/H784A (ou qualquer outra ARN-polimerase de T7 mutante aqui especificada) é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 1 nmol dos NTP 2'-OMe nos transcritos sob as condições de r/mGmH. Como aqui se utiliza, uma unidade de pirofosfatase inorgânica é definida como a quantidade de enzima que irá libertar 1,0 mole de ortofosfato inorgânico por minuto a pH 7,2 e 25°C.

Para o máximo de incorporação (100%) de ATP, UTP e CTP 2'-OMe ("rGmH") nos transcritos são preferidas as condições seguintes: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 a 10% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 5 mM (9,6 mM quando a concentração de cada NTP 2'-OMe é de 2,0 mM), MnCl2 1,5 mM (2,9 mM quando a concentração de cada NTP 2'-OMe é de 2,0 mM), NTP 2'-OMe (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 2.0 mM), pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN-polimerase de T7 Y639F, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e uma sequência de comando só de purinas de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.

Para um máximo de incorporação (100%) de UTP e CTP 2'-OMe ("rRmY") nos transcritos são preferidas as condições seguintes: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-800010% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 5 mM (9,6 mM quando a concentração de cada NTP 2'-OMe é de 2,0 mM), MnCl2 1,5 mM (2,9 mM quando a concentração de cada NTP 2'-OMe é de 2,0 mM) , NTP 2'-OMe (cada) 500 μΜ (mais preferivelmente, 2.0 mM) , pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN-polimerase de T7 Y639F/H784A, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e uma sequência de comando só de purinas de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento. 44 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Para um máximo de incorporação (100%) de ATP e GTP desoxi e UTP e CTP 2'-OMe ("dRmY") nos transcritos são preferidas as condições seguintes: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 a 10% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, NTP 2'-OMe (cada) 2,0 mM, pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN-polimerase de T7 Y639F, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e uma sequência de comando só de purinas de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.

Para um máximo de incorporação (100%) de ATP, UTP e CTP 2'-OMe e GTP 2 '-F ("fGmH") nos transcritos são preferidas as condições seguintes: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 a 10% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, NTP 2'-OMe (cada) 2,0 mM, pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN-polimerase de T7 Y639F, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e uma sequência de comando só de purinas de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.

Para um máximo de incorporação (100%) de ATP desoxi e UTP, GTP e CTP 2'-OMe ("dAmB") nos transcritos são preferidas as condições seguintes: tampão HEPES 200 mM; DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 a 10% (p/v), Triton X-100 a 0,01% (p/v), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, NTP 2'-OMe (cada) 2,0 mM, pH 7,5, 15 unidades/ml de ARN-polimerase de T7 Y639F, 5 unidades/ml de pirofosfatase inorgânica, e uma sequência de comando só de purinas de pelo menos 8 nucleótidos de comprimento.

Para cada uma das transcrições acima (a) é preferivelmente realizada a uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 50°C, preferivelmente de cerca de 30°C a 45°C, e mais preferivelmente a cerca de 37°C, durante um período de pelo menos duas horas e (b) é utilizado 50-300 nM de um molde de transcrição de ADN de cadeia dupla (utiliza-se 200 nM de molde no ciclo 1 para aumentar a diversidade (utiliza-se 300 nM de molde em transcrições dRmY)), e para os ciclos subsequentes aproximadamente 50 nM, utiliza-se uma diluição de 1/10 de uma reacção PCR optimizada, utilizando condições aqui descritas) . Os moldes de transcrição de ADN preferidos estão descritos 45 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ adiante (onde ARC254 e ARC256 transcrevem sob condições de todos 2'-OMe e ARC255 transcreve sob condições rRmY). ARC254 (SEQID NO: 99): 5 ’ -C ATCGATGCT AGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN _ NNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3) ARC255 (SEQ ID NO: 100): 5,-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNN^mNN^ΠWNNNNNN^Π^INNN _ NNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’_ ARC256 (SEQ ID NO: 101): 5ACATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNMSINNNNNNISIN NNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTAITA-3Í_

Sob condições de transcrição rN, a mistura da reacção de transcrição compreende adenosina-trifosfatos (ATP) 2'-OH, guanosina-trifosfatos (GTP) 2'-OH, citidina-trifosfatos (CTP) 2 '-OH e uridina-trifosfatos (UTP) 2'-OH. Os oligonucleótidos modificados produzidos utilizando as misturas de transcrição rN da presente invenção compreendem substancialmente adenosina toda 2'-OH, guanosina toda 2'-OH, citidina toda 2'-OH e uridina toda 2'-OH. Numa concretização preferida de transcrição rN, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OH, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OH, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OH. Numa concretização mais preferida de transcrição rN, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OH, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2’-OH, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2’-OH. Na concretização mais preferida de transcrição rN, os oligonucleótidos modificados compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OH, 100% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2’-OH, 100% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 46 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 2'-0Η, e 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OH.

Sob condições de transcrição rRmY, a mistura da reacção de transcrição compreende adenosina-trifosfatos 2'-OH, guanosina-trifosfatos 2'-OH, citidina-trifosfatos 2'-OMe e uridina-trifosfatos 2'-OMe. Os oligonucleótidos modificados produzidos utilizando as misturas de transcrição rRmY compreendem substancialmente adenosina toda 2'-OH, guanosina toda 2'-OH, citidina toda 2'-OMe e uridina toda 2'-OMe. Numa concretização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OH, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2’-OH, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe. Numa concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2’-OH, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2’-OH, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe. Na concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OH, 100% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH, 100% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe e 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe.

Sob condições de transcrição dRmY, a mistura da reacção de transcrição compreende adenosina-trifosfatos 2'-desoxi, guanosina-trifosfatos 2'-desoxi, citidina-trifosfatos 2'-0-metilo e uridina-trifosfatos 2'-0-metilo. Os oligonucleótidos modificados produzidos utilizando as condições de transcrição dRmY da presente invenção compreendem substancialmente adenosina toda 2'-desoxi, guanosina toda 2'-desoxi, citidina toda 2'-0-metilo e uridina toda 2'-0-metilo. Numa concretização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-desoxi, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são 47 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ guanosina 2'-desoxi, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-O-metilo, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-0-metilo. Numa concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-desoxi, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-desoxi, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-O-metilo, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-O-metilo. Na concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-desoxi, 100% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-desoxi, 100% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-0-metilo, e 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-O-metilo.

Sob condições de transcrição rGmH, a mistura da reacção de transcrição compreende guanosina-trifosfatos 2'-OH, citidina-trifosfatos 2'-OMe, uridina-trifosfatos 2'-OMe e adenosina-trifosfatos 2'-OMe. Os oligonucleótidos modificados produzidos utilizando as misturas de transcrição rGmH compreendem substancialmente guanosina toda 2'-OH, citidina toda 2'-OMe, uridina toda 2'-OMe e adenosina toda 2'-OMe. Numa concretização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2' -OMe, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe. Numa concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2’-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2’-OMe, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2’-OMe. Na concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2’-OH, 100% de todos os nucleótidos de citidina são 48 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ citidina 2'-OMe, 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe, e 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe.

Sob condições de transcrição r/mGmH, a mistura da reacção de transcrição compreende adenosina-trifosfato 2'-OMe, citidina-trifosfato 2'-OMe, guanosina-trifosfato 2'-OMe, uridina-trifosfato 2'-OMe e guanosina-trifosfato 2'-OH. Os oligonucleótidos modificados resultantes produzidos utilizando as misturas de transcrição r/mGmH da presente invenção compreendem substancialmente adenosina toda 2'-OMe, citidina toda 2'-OMe, guanosina toda 2'-OMe e uridina toda 2'-OMe, em que a população de nucleótidos de guanosina possui um máximo de cerca de 10% de guanosina 2'-OH. Numa concretização preferida, os oligonucleótidos modificados r/mGmH resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2’ -OMe, e não mais do que cerca de 10% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2’-OH. Numa concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe, e não mais do que cerca de 10% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH. Na concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe, 100% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OMe e 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe, e não mais do que cerca de 10% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OH.

Sob condições de transcrição fGmH, a mistura da reacção de transcrição compreende adenosina-trifosfatos 2'-OMe, uridina-trifosfatos 2'-OMe, citidina-trifosfatos 2'-OMe e 49 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ guanosina-trifosfatos 2'-F. Os oligonucleótidos modificados produzidos utilizando as condições de transcrição fGmH compreendem substancialmente adenosina toda 2'-0Me, uridina toda 2'-0Me, citidina toda 2'-OMe e guanosina toda 2'-F. Numa concretização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-F. Numa concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-F. Na concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-OMe, 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe, 100% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe e 100% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-F.

Sob condições de transcrição dAmB a mistura da reacção de transcrição compreende adenosina-trifosfatos 2'-desoxi, citidina-trifosfatos 2'-OMe, guanosina-trifosfatos 2'-OMe e uridina-trifosfatos 2'-OMe. Os oligonucleótidos modificados produzidos utilizando as misturas de transcrição dAmB compreendem substancialmente adenosina toda 2'-desoxi, citidina toda 2'-OMe, guanosina toda 2'-OMe e uridina toda 2'-OMe. Numa concretização preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 80% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-desoxi, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, pelo menos 80% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OMe, e pelo menos 80% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe. Numa concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde pelo menos 90% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-desoxi, pelo menos 50 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 90% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, pelo menos 90% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OMe, e pelo menos 90% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-OMe. Na concretização mais preferida, os oligonucleótidos modificados resultantes compreendem uma sequência onde 100% de todos os nucleótidos de adenosina são adenosina 2'-desoxi, 100% de todos os nucleótidos de citidina são citidina 2'-OMe, 100% de todos os nucleótidos de guanosina são guanosina 2'-OMe e 100% de todos os nucleótidos de uridina são uridina 2'-0Me.

Em cada caso, os produtos da transcrição podem depois ser utilizados como biblioteca no processo SELEX™ para identificar aptâmeros e/ou para determinar um motivo conservado de sequências que possuem especificidade de ligação para com determinado alvo. As sequências resultantes estão já estabilizadas, eliminando este passo do processo para obter uma sequência de aptâmero estabilizada e originando um aptâmero mais altamente estabilizado como resultado. Outra vantagem do processo SELEX™ 2'-OMe é que as sequências resultantes requerem provavelmente menos nucleótidos 2'-OH na sequência, possivelmente nenhum. Na medida em que restem nucleótidos 2'-OH estes podem ser removidos realizando modificações pós-SELEX.

Como se descreve adiante, podem ser obtidos rendimentos inferiores mas ainda úteis de transcritos incorporando inteiramente nucleótidos substituídos em 2', sob condições que não as condições optimizadas descritas acima. Por exemplo, as variações às condições de transcrição acima incluem: A concentração do tampão HEPES pode variar de 0 a 1 Μ. A presente invenção também contempla a utilização de outros agentes tamponantes possuindo um pKa entre 5 e 10 incluindo, por exemplo, Tris(hidroximetil)aminometano. A concentração de DTT pode variar de 0 a 400 mM. Os métodos aqui descritos também proporcionam a utilização de outros agentes redutores incluindo, por exemplo, mercaptoetanol. 51 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ A concentração de espermidina e/ou de espermina pode variar de 0 a 20 mM. A concentração de PEG-8000 pode variar de 0 a 50% (p/v).

Os métodos da presente invenção também proporcionam a utilização de outro polimero hidrófilo incluindo, por exemplo, PEG de outro peso molecular ou outros polialquilenoglicóis. A concentração de Triton X-100 pode variar de 0 a 0,1% (p/v) . Os métodos da presente invenção também proporcionam a utilização de outros detergentes não iónicos incluindo, por exemplo, outros detergentes, incluindo outros detergentes Triton-X. A concentração de MgCl2 pode variar de 0,5 mM a 50 mM. A concentração de MnCl2 pode variar de 0,15 mM a 15 mM. Tanto o MgCl2 como o MnCl2 têm que estar presentes dentro das gamas descritas e numa concretização preferida estão presentes numa razão de cerca de 10 a cerca de 3 de MgCl2:MnCl2, preferivelmente, a razão é de cerca de 3-5:1, mais preferivelmente, a razão é de cerca de 3-4:1. A concentração de NTP 2'-OMe (cada NTP) pode variar de 5 μΜ a 5 mM. A concentração de GTP 2'-OH pode variar de 0 μΜ a 300 μΜ. A concentração de GMP 2'-OH pode variar de 0 a 5 mM. O pH pode variar de pH 6 a pH 9. Os métodos aqui descritos podem ser postos em prática dentro da gama do pH de actividade da maioria das polimerases que incorporam nucleótidos modificados. Em adição, os métodos proporcionam a utilização óptima de agentes quelantes nas condições da reacção de transcrição incluindo, por exemplo, EDTA, EGTA e DTT.

Os aptâmeros seleccionados possuindo as maiores afinidade e ligação especifica como demonstrado por ensaios biológicos, como descrito nos exemplos adiante, constituem terapêuticas adequadas para o tratamento de condições em que a proteina do complemento C5 está envolvida na patogénese. 52 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Aptâmeros com Afinidade de Ligação à Proteína do Sistema do Complemento C5

Embora o sistema do complemento tenha um papel importante na manutenção da saúde, possui o potencial de causar, ou contribuir para a doença. Assim, é desejável desenvolver inibidores do sistema do complemento para utilização terapêutica. É particularmente desejável desenvolver inibidores da proteina do complemento C5 porque esta é um componente tanto da via clássica como da alternativa das cascatas de activação do complemento (Matis e Rollins (1995) Nature Medicine 1(8):839-842). Deste modo, a inibição de C5 pode prevenir danos mediados pelo complemento causados por ambas as vias. Algumas proteínas do sistema do complemento, tais como Clq e C3, são importantes nos mecanismos normais de defesa contra microorganismos e na depuração de componentes imunitários e tecido danificado; contudo, a C5 é relativamente pouco importante para estas funções. Assim, a função da C5 pode ser inibida durante períodos curtos ou longos de tempo sem comprometer o papel protector do sistema do complemento.

Um inibidor terapêutico de C5 é também desejável porque inibindo a clivagem de C5 previne-se a geração de duas actividades do complemento potencialmente prejudiciais. Em primeiro lugar, inibindo a geração de C5a a partir da clivagem de C5 elimina-se a actividade quimiotáctica e vasoactiva principal do complemento. Em Segundo lugar, inibindo a geração de C5b a partir da clivagem de C5 bloqueia-se a montagem do complexo de ataque à membrana ("MAC") C5b-9 citolítico. A inibição da clivagem de C5 bloqueia os efeitos tanto de C5a como de C5b nos leucócitos e no tecido tal como em células endoteliais (Ward (1996) Am. J. Pathol. 149:1079).

Tanto a C5a como o MAC foram implicados na inflamação aguda e crónica associada a doença humana, e o seu papel em estados de doença foi confirmado em modelos animais. A C5a é necessária para a lesão vascular pulmonar dependente do complemento e de neutrófilos (Ward (1997) J. Lab. Clin. Med. 129:400; Mulligan et al., (1998) J. Clin. Invest. 98:503), e está associada à activação de neutrófilos e de plaquetas no choque e na lesão por queimadura (Schmid et al., (1997) Shock 53 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 8:119). Ο MAC medeia a lesão muscular na miastenia grave auto-imune aguda (Biesecker e Gomez (1989) J. Immunol. 142:2654), rejeição de órgãos na transplantação (Baldwin et al., (1995) Transplantation 59:797; Brauer et al., (1995) Transplantation 59:288; Takahashi et al., (1997) Immunol. Res. 16:273), e lesão renal em glomerulonefrite auto-imune (Biesecker (1981) J. Exp. Med. 39:1779; Nangaku (1997) Kidney Int. 52:1570). Tanto a C5a como o MAC estão implicados na isquemia aguda do miocárdio (Homeister e Lucchesi (1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17), lesão do SNC aguda (Bednar et al., (1997) J. Neurosurg. 86:139) e crónica (Morgan (1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14:19), activação de leucócitos durante circulação extracorpórea (Sun et al., (1995) Nucleic Acid Res. 23:2909; Spycher e Nydegger (1995) Infushionsther. Transfusionsmed. 22:36) e em lesão dos tecidos associada a doenças auto-imunes incluindo artrite e lúpus (Wang et al., (1996) Immunology 93:8563). A activação do complemento também foi implicada na retinopatia diabética, e pode compor ou iniciar danos vasculares retinais (Zhang et al., (2002) Diabetes 51:3499). Ocorre normalmente activação do complemento constitutiva de baixo grau no olho não diabético, evidenciada pela presença de MAC e proteínas regulatórias do complemento nos olhos de ratos não diabéticos, indicando que ocorre desregulação do complemento em pacientes diabéticos (Sohn et al., (2000) IOVS 41:3492). Em adição, foi detectada deposição de C5b-9 em vasos retinais de dadores humanos diabéticos quando está ausente em dadores humanos não diabéticos (Zhang et al.), é mostrada expressão reduzida de CD55 e CD59 em retinas diabéticas (Zhang et al.), e CD59 glicado está presente na urina de pacientes diabéticos, mas não de pacientes não diabéticos (Acosta et al., (2002) PNAS 97, 5450-5455). Adicionalmente, sabe-se que o sistema do complemento e vascular está activado na diabetes do tipo I. Veja-se, e.g. Hansen, T.K. et al., Diabetes, 53: 1570-1576 (2004) . A C5a activa células endoteliais por via de interacção com os sistemas imunitário e do complemento. Veja-se, e.g., Albrecht, E.A. et al., Am J Patologia, 164: 849-859 (2004) . O sistema vascular está activado em doenças oculares incluindo retinopatia diabética. Veja-se, e.g. Gert, V.B. et al., Invest Opthalmol Vis Sei, 43: 1104-1108 (2002). O sistema do complemento está também activado na retinopatia 54 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ diabética. Veja-se e.g. Gert, V.B. et al., Invest Opthalmol Vis Sei, 43: 1104-1108 (2002) e Badouin, C et al., Am J Opthalmol, 105:383-388 (1988).

Em algumas concretizações, os materiais aqui descritos compreendem uma série de aptâmeros de ácido nucleico de cerca de 15 a cerca de 60 nucleótidos de comprimento que se ligam especificamente à proteína do complemento C5 e que modulam funcionalmente, e.g., bloqueiam, a actividade da proteína do complemento C5 em ensaios in vivo e/ou baseados em células.

Os aptâmeros que são capazes de, especificamente, se ligar e modular a proteína do complemento C5 estão aqui estabelecidos. Estes aptâmeros proporcionam uma modalidade, de baixa toxicidade, segura e eficaz, de tratamento, melhoria e/ou prevenção de uma variedade de doenças ou desordens relacionadas com o complemento incluindo, por exemplo, desordens cardíacas relacionadas com o complemento (e.g., lesão do miocárdio; complicações do complemento mediadas por C5 na cirurgia de enxerto de bypass da artéria coronária (CABG) tais como hemorragia pós-operatória, activação sistémica de neutrófilos e leucócitos, risco acrescido de enfarte do miocárdio e disfunção cognitiva acrescida; restenose; e complicações do complemento mediadas por C5 referentes a intervenção coronária percutânea), lesão por isquemia-reperfusão (e.g., enfarte do miocárdio, icto, lesões pelo frio extremo), desordens inflamatórias relacionadas com o complemento (e.g., asma, artrite, sepsia e rejeição após transplantação de órgãos), e desordens auto-imunes relacionadas com o complemento (e.g., miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES)). Outras indicações para as quais a inibição de C5 é desejável incluem, por exemplo, inflamação pulmonar (Mulligan et al. (1998) J. Clin. Invest. 98:503), activação do complemento extracorpórea (Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564), activação do complemento mediada por anticorpos (Biesecker et al. (1989) J. Immunol. 142:2654), glomerulonefrite e outras doenças renais, indicações oculares tais como danos no tecido ocular mediados por C5, e.g. retinopatia diabética, e hemoglobinúria paroxissómica nocturna. Estes aptâmeros podem também ser utilizados em diagnóstico. 55 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Estes aptâmeros podem incluir modificações, como aqui descrito, incluindo, e.g., conjugação a compostos lipófilos ou de elevado peso molecular (e.g., PEG), incorporação de uma porção de remate, incorporação de nucleótidos modificados e modificações no esqueleto de fosfatos. É aqui proporcionado um aptâmero isolado, que não de ocorrência natural, que se liga à proteína do complemento C5. Em algumas concretizações, o aptâmero isolado, que não de ocorrência natural, possui uma constante de dissociação ("Kd") para a proteína do complemento C5 inferior a 100 μΜ, inferior a 1 μΜ, inferior a 500 nM, inferior a 100 nM, inferior a 50 nM, inferior a 1 nM, inferior a 500 pM, inferior a 100 pM, inferior a 50 pM. Em algumas concretizações, a constante de dissociação é determinada por titulação dot blot como descrito no Exemplo 1 adiante.

Em outra concretização, o aptâmero modula uma função da proteína do complemento C5. Em outra concretização, o aptâmero inibe uma função de C5 enquanto em outra concretização o aptâmero estimula uma função de C5. Uma variante da proteína do complemento C5, como aqui se utiliza, abrange variantes que desempenham essencialmente a mesma função que a proteína do complemento C5. Uma variante da proteína do complemento C5 preferivelmente compreende substancialmente a mesma estrutura e em algumas concretizações compreende 80% de identidade de sequência, mais preferivelmente 90% de identidade de sequência, e mais preferivelmente 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da proteína do complemento C5 compreendendo a sequência de aminoácido adiante (SEQ ID NO: 102) (citado em Haviland et al., J Immunol. 1991 Jan 1;146(1):362-8).: 1 mgllgilcfl iflgktwgqe qtyvisapki frvgaseniv iqvygyteaf datisiksyp 61 dkkfsyssgh vblssenkEq naailtiqpk qlpggqnpvs yvylewskh fskskrmpit 121 ydngflfiht dkpvytpdqs vkvrvyelnd dlkpakretv ltfidpegse vdimreeidbi 181 giisfpdfkl psnprygmwt ikakykedfs ttgtayfevk eyvlphfsvs iepeynfigy 241 knfknfeiti karyfynkw teadvyitfg iredlkddqk emmqtamqnt mlingiaqvt 301 fdsetavkel syysledlnn kylyiavtvi estggfseea eipgikyvls pyklnlvatp 361 lflkpgipyp ikvqvkdsld qlvggvpvtl naqtidvnqe tsdldpsksv trvddgvasf 421 vlnlpsgvtv lefnvktdap dlpeenqare gyraiayssl sqsylyidwt dnhkallvge 481 blniivtpks pyidkithyn ylilekgkii hfgtrekfsd asyqsinipv tqnmvpssrl 541 lvyyivtgeq taelvsdsvw lnieekcgnq lqvhlspdad ayspgqtvel nn\atgmdswv 601 alaavdsavy gvqrgakkpl ervfqfleks dlgcgagggl nnanv£hlag ltfltnanad 661 dsqendepck eilrprrtlq kkieeiaaky khswkkccy dgacvnndet ceqraarlsl 721 gprcikafte ccwasqlra nishkdmqlg rlhmktllpv skpeirsyfp eswlwevhlv 781 prrkqlqfal pdslttweiq gvgisntglc vadtvkakvf kdvflemnip yswrgeqiq 841 lkgtvynyrt sgmqfcvkms avegictses pvidhqgtke skcvrqkveg ssshlvtftv 901 lpleiglhni nfsletwfgk eilvktlrw pegvkresys gvtldprgiy gtierrkefp: 56 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 961 yripldlvpk teikrilsvk gllvgeilsa vlsqeginil thlpkgsaea elmswpvfy 1021 vfhyletgnh wnifhsdpli ekqklkkklk egmlsimsyr nadysyBvwk ggsastwlta 10B1 falrvlgqvn kyveqtlqnsi cnsllwlven yqldngafke nsqyqpiklq gtlpvearen . 1141 slyltaftvi girkafdicp lvkidtalik adnfllentl paqstftlal sayalslgdk 1201 thpqfrsive alkxealvkg nppiyrfwkd nlqhkdsavp ntgtarravet tayalltsln 1261 lkdinyvnpv ikwlseeqry gggfystqdt inaiegltey sllvkqlrls mdidvsykhk 1321 galhnykmtd knflgrpvev llnddlivat gfgaglatvh vttwhktst seevcsfylk 1361 idtqdieash yrgygnsdyk rlvacaaykp areesssgss havmdialpt glsaneedlk 1441 alvegvdqlf tdyqikdghv ilqlnsipss dflcvrfrif elfevgflsp atftvyeyhx 1501 pdkqctmfys tsnikiqkvc egaackcvea dcgqmqeeld ltisaetrkq tackpeiaya 1561 ykvaitsitv envfvkykat lldiyktgea vaekdseitf ikkvtctnae lvkgrqyllm 1621 gkealqikyn fsfrylypld altwieywpr dttcsscqaf lauldefaed iflngc

Em algumas concretizações, a identidade de sequência de variantes alvo é determinada utilizando BLAST como descrito adiante. A expressão "identidade de sequência" no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou proteína, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou possuem uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleótidos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para uma correspondência máxima, como medido utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por inspecção visual. Para a comparação de sequências, tipicamente, uma sequência actua como uma sequência de referência com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são introduzidas num computador, as coordenadas de subsequências são designadas se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequências são designadas. 0 algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequência para a(s) sequência(s) de teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. 0 alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser conduzido, e.g., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela busca para o método de similaridades de Pearson & Lipman, Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software

Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspecção visual (veja-se genericamente, Ausubel et al., infra) . 57 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para a determinação da percentagem de identidade de sequência é o algoritmo utilizado na ferramenta de busca de alinhamento básica (aqui adiante "BLAST"), veja-se, e.g. Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) e Altschul et al., Nucleic

Acid Res., 15: 3389-3402 (1997). O software para a realização de análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (aqui adiante "NCBI"). Os parâmetros por defeito utilizados na determinação da identidade de sequência utilizando o software disponível de NCBI, e.g., BLASTN (para sequências de nucleótidos) e BLASTP (para sequências de aminoácidos) estão descritos em McGinnis et al., Nucleic Acid Res., 32: W20-W25 (2004).

Em outra concretização aqui descrita, o aptâmero tem substancialmente a mesma capacidade para se ligar à proteína do complemento C5 que um aptâmero compreendendo qualquer uma de: SEQ ID NO: 1-2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98. Em outra concretização, o aptâmero possui substancialmente a mesma estrutura e capacidade para se ligar à proteína do complemento C5 que um aptâmero compreendendo qualquer uma de: SEQ ID NO: 1-2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98 . Os aptâmeros aqui descritos como exemplos possuem uma sequência, incluindo quaisquer modificações químicas, de acordo com qualquer uma de SEQ ID NO: 2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98. Em outra concretização, os aptâmeros são utilizados como ingrediente activo em composições farmacêuticas. Em outra concretização, os aptâmeros ou composições compreendendo os aptâmeros são utilizados para tratar uma variedade de doenças ou desordens relacionadas com o complemento incluindo qualquer uma seleccionada do grupo que consiste em: desordens cardíacas relacionadas com o complemento (e.g., lesão do miocárdio; complicações do complemento mediadas por C5 relacionadas com enxerto de bypass da artéria coronária (CABG) tais como hemorragia pós-operatória, activação sistémica de neutrófilos e leucócitos, risco acrescido de enfarte do miocárdio e disfunção cognitiva acrescida; restenose; e complicações do complemento mediadas por C5 relacionadas com intervenção coronária percutânea), lesão por isquemia-reperfusão (e.g., enfarte do miocárdio, icto, lesões pelo frio extremo), desordens inflamatórias relacionadas com o complemento (e.g., asma, artrite, sepsia e rejeição após transplantação de 58 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ órgãos), e desordens auto-imunes relacionadas com o complemento (e.g., miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES), inflamação pulmonar, activação do complemento extracorpórea, activação do complemento mediada por anticorpos e indicações oculares tais como danos do tecido ocular mediados pelo complemento tais como retinopatia diabética.

Numa concretização, os aptâmeros anti-C5 incluem uma mistura de nucleótidos modificados com 2'-fluoro, nucleótidos modificados com 2'-OMe ("2'-0Me") e residuos de purina 2'-OH. Uma sequência genérica descritiva (SEQ ID N0:1) para um aptâmero anti-C5 modificado está mostrada adiante na Tabela 1, e a estrutura está mostrada na Figura 3A. A vasta maioria das purinas (A e G) foram modificadas para 2'-OMe, excluindo dois residuos de G que permanecem 2'-OH (residuos mostrados em esboço). Os residuos em circulos representam um subconjunto de pirimidinas que podem simultaneamente ser modificadas para 2' -H sem substancialmente alterar a actividade anti-C5 do aptâmero (veja-se ARC330 na Tabela 1 adiante (SEQ ID N0:2, Figura 3B) ) . Os residuos sublinhados mostrados na Figura 3A representam residuos de pirimidina que podem conter uma modificação 2'-fluoro ou 2'-H (mas não 2'-OMe), enquanto os residuos em caixas representam residuos de pirimidina que podem conter uma modificação 2'-fluoro ou 2-OMe (mas não 2'-H) . Os residuos indicados com uma seta (->) têm que conter uma modificação 2'-fluoro. Sem uma modificação 2'-fluoro nos residuos indicados por uma seta (->) , a actividade hemolitica resultante do aptâmero resultante é substancialmente reduzida. Numa concretização preferida, um aptâmero anti-C5 compreende a sequência de nucleótidos de acordo com SEQ ID NO 1.

Um exemplo de um aptâmero anti-C5 aqui descrito é ARC186 (SEQ ID N0:4) que é mostrado na Figura 3C e descrito na Pat. U.S. com n.° de série 6, 395, 888. Todos os 21 residuos de pirimidina de ARC186 têm modificações 2'-fluoro. A maioria das purinas (14 residuos) possuem modificações 2'-OMe, excepto três residuos de purina 2'-OH (mostrados em esboço na Figura 3C). Os aptâmeros anti-C5 aqui descritos podem também incluir diferentes misturas de modificações 2'-fluoro e 2'-H. Outro aptâmero anti-C5 descrito é o ARC330 (SEQ ID NO 2) mostrado na Figura 3B. 0 ARC330 (SEQ ID NO: 2) contém sete modificações 2'-H (residuos em circulos na Figura 3B), 59 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 14 resíduos de pirimidina com modificações 2'-fluoro, 14 resíduos de purina com modificações 2'-0Me, e três resíduos de purina 2'-OH (mostrados em esboço na Figura 3B).

Outras combinações de aptâmeros contendo uma mistura de modificações 2'-fluoro, modificações 2'-0Me, resíduos de purina 2'-OH, e conjugação com compostos não imunogénicos de elevado peso molecular (e.g., PEG) de várias dimensões, todos derivados de ARC186 (SEQ ID N0:4), estão descritas na Tabela 1 adiante. A Tabela 1 adiante descreve aptâmeros que não têm, ou que adicionalmente compreendem um remate a 3' (e.g., dT invertido). A menos que indicado de outro modo, as sequências de nucleótidos na Tabela 1 adiante estão listadas no sentido de 5' para 3'. Para cada uma das sequências individuais na Tabela 1, todas as modificações 2'-OMe em purinas ou em pirimidinas estão indicadas por um "m" precedendo o nucleótido correspondente; tosas as modificações 2'-fluoro em pirimidinas estão indicadas por um "f" precedendo o nucleótido correspondente; todas as modificações desoxi em purinas ou pirimidinas estão indicadas por um "d" precedendo o nucleótido correspondente; e qualquer purina ou pirimidina que aparece sem um "m", um "f" ou um "d" precedendo o nucleótido indica um resíduo 2'-OH.

Tabela 1: SEQ ID NO: 1 XíX2£CfCrGfCX3X4fUX5X6X7X8X9XloXlirGXl2Xl3XHXlsXlíXl7X|8Xl9XloX2lXaX23fUfUX24XaX2íX27X28fCX2 9

onde: Xi= fC ou mC x2= rG ou mG X3= zG ou mG x4= rG ou mG Xs = fC ou dC X6= fU ou dT x7= fC ou dC X8= rA ou mA x9= rG ou mG 60 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Xio=rG ou mG Xn=fC ou dC Xi2=C ou mC Xl3 = fU ou mU Xi4=rG ou mG Xis=rA ou mA Xi6=rG ou mG Xi7=fU ou dT Xis=fC ou dC Xi9=fU ou dT X20 = £'G ou mG X21=rA ou mA X22=rG ou mG x23=fu ou dT X24=rA ou mA x25=fc ou dC x26=fc ou dC X27=fU ou dT X28 = ^G ou mG X29=rG ou mG ARC330 (SEQ ID ΝΟ:2) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAiCfCfUmGfCmG ARC185 (SEQ ID NO:3) GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUfCGfUfC ARCl 86 (SEQ Π) NO: 4) fCmGíCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAniGfUfCfUmGmAjnGfUfUfUAfCfCfUiiiGrcmG-

3T ARC187 (SEQ Π5 NO: 5) 40kDaPEG-NH- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCniAmGmGfCGfCfUmGinAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-_3T_

Onde o PEG de 40 kDa ramificado é, 3-bis (mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida) ARC188 (SEQ ID NO:6)

AGGAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfUfCGfUfC ARCl 89 (SEQ ID NO: 7) AGíCmGíCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGinAmGfUíCfUinGraAinGfUfUfUAíCfCíUmOfCm

G ARC250 (SEQ ID NO:8)

GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGGfCGfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfUAfCfCfLTGfCG 61 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ARC296 (SEQ ID Ν0:9)

fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG—3T ARC297 (SEQ EO NO; 10) mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGinGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGíUfUfUAdCdCfUmGmCmG-

3T ARC331 (SEQ ID NO:11) dCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfJAfCfCfUmGdCmG ARC332 (SEQ ID NO:12) dCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC333 (SEQ ID NO:13) fCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC334 (SEQ ID NO:14) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGdCmG ARC411 (SEQ ID NO:15) fCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC412 (SEQ ID NO:16) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGmCmG ARC413 (SEQ ID NO:17) mCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC414 (SEQ ID NO:lS) mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGmCmG ARC415 (SEQ ID NO:19) fCmGfCdCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC416 (SEQ ID NO:20) fCmGfCfCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmCSnAmGTdCTmCSnAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC417 (SEQ ID NO:21) fCmGfCdCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmCSnAmGTdCTmCSnAmGfUfUfUAfUfCfUmGfCmG ARC418 (SEQ ID NO:22) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCfUmCSnAmGTdCTmCSnAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC419 (SEQ ID NO:23) fCmGfCfCGfCmCSnGfUdCTdCmAmGmGdCGfCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC420 (SEQ ID NO:24) fCmGfCfCGfCmCSnGfUdCTdCmAmGmGdCGdCTmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC421 (SEQ ID NO:25) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmCSnAmGTdCTmCSnAmGTfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC422 (SEQ ID NO:26) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmCSnAmGTdCTmCSnAmGfUTfUAfCfCfUmGfCmG ARC423 (SEQ ID NO:27) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmCSnAmGfUfUTAfCfCfUmGfCmG ARC424 (SEQ ID NO:28)

fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmCSnAmGTTTAfCfCfUmGfCmG 62 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ARC425 (SEQ ID ΝΟ:29) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCTmGfCmG ARC426 (SEQ ID NO:30) fCmGfCfCGfCmGmGmUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAdCdCfUmGfCmG ARC427 (SEQ ID NO:31) fCmGfCmCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC428 (SEQ ID NO:32) fCmGfCfCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC429 (SEQ ID NO:33) fCmGfCmCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC430 (SEQ ID NO:34) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCfUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC431 (SEQ ID NO:35) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGfCmUmGmAmGfUdCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCm ARC432 (SEQ ID NO: 36) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCniUmGmAmGfUdCíUmGmAmGfUfUfUAfCfCíUmGíCin

G ARC433 (SEQ ID NO:37) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGmUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC434 (SEQ ID NO:38) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUmUfUAfCfCfUmGfCmG ARC435 (SEQ ID NO:39) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUmUAfCfCfUmGfCmG ARC436 (SEQ ID NO:40) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGmUmUmUAfCfCfUmGfCmG ARC437 (SEQ ID NO:41) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCmUmGfCmG ARC438 (SEQ ID NO:42) fCmGfCfCdGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC439 (SEQ ID NO:43) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCdGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC440 (SEQ ID NO:44)

fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUdAfCfCfUmGfCmG AE.C457 (SEQ DD NO: 45)

mGfCmGfUfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCflCfUmAfCmG

mC ARC458 (SEQ ID NO:46)

mGmGmGfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmCmCmC 63 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ARC459 (SEQID ΝΟ: 47)

inGfCmGfCfCGfCniGmGfLJdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGinAmGTdCrmGniAmGfUíUíUAlCíCfUmGfCniG

mC ARC473 (SEQ ID NO: 48) mGniGmAfCmGfCfCGíÓnGiilGfUfCfU{CmAniGmGfCGfCfUmGmAinGíUfCfUmGmAmGfUfUflJAfCPCfUra

GfCmGfUfCfU-3T ARC522 (SEQ ID NO: 49)

mGmGfCmGfOCGfCmGmGfUciCTdCmAinGmGdCGinCmUmGiiiAmGTdCTniGmAmGTfUfUAdCdCrmGfC

mGmCmC ARC523 (SEQ ID NO: 50)

mGmGmCmGíClCGfCmòmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAinGTdCTmGmAinGiiIAdCdCTmGdC

mGmCmC ARC524 (SEQ ID NO: 51) niGiuGiiiCiDGdCdCGdCmGmGTdCTdCniAmGmGdCGiuCinUiiiGmAmGTdCTmGmAmGTTTmAdCdCTmGd

CmGmCmC ABC525 (SEQ ID NO: 52) mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCmUmCmAniGmGdCGmCmLrmGTnAmGmUmCmUmGmAraGTTTmAdCd

CTmGdCmGmCniC ARC532 (SEQ ID NO: 53)

Biotin- AGfCrnGfCfCGfCmGmGfUfCfUíCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUinGinAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCm

G ARC543 (SEQ ID NO: 54) mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAniGmGdCGíCfUmGmAinGTdCTmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfC .mGmCmC ________ ____ ARC544 (SEQ Π) NO: 55) mGmGfCmGfCfCGfCinGmGfUniCmUmCmAmGmGmCGfCfUniGniAinGiiiUmCinUinGmATiiGfUfUfUAiCfCf

UmGfCmGmCraC ARC550 (SEQ ID NO; 56) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCRJmGmAinGfUfCfUmGmAmGftJfUfUmAfCfCfUinGfCTOG-

3T ARC551 (SEQ ID NO: 57) ÍCmaíCfCGfCmGinGfUíCíUíCraAinGmGfCGniCmUmGinAmGÍUfCfUmGmAmGíUfUfUAfCfCfUmGfCmG-

3T ARC552 (SEQ ID NO:58) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGTfUfUAfCfCfItoiGfCmG-3T ARC553 (SEQ ID NO: 59) fCmGfCíCGfCmGmGfUfCfUfCiiiAiiiGmGfCGraCmUmGinAmGÍUfCfUmGmAmGftJfUfUmAiCfCfUmGflEm

G-3T ARC554 (SEQ ID NO: 60)

fCmGfCíCGfCmGrnGfUfCfUfCinAmGmGfCGrDCmUmGinAmGfLIfCflJmGinAmGTfUfUTnAfCfCfUxtiGíCmG

-3T 64 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ARC 657 (SEQ Π) ΝΟ: 61) 20 kDa PEG-NH- íCmGfCiCGfCmGinGfUftfUÍCtrAniGmGfCGfCfUmGmAinGfUfCfUmGmAjrGfUfUfUAfCfCfUinGfCinG- 3Τ ARC 658 (SEQ Π) NO: 62) 30 kDa PEG-NH- fCmGfCfCGfCmGrnGfUfCfUfCmAinGmGfCGfCfUraGmArttGíUfCfUmGinAinGfUfUfUAÍCfCfUmGfCmG-

3T ARC 672 (SEQ ID NO: 63) NH2- fCmGÍCfCGíCmGmGfUfCfUíCtnAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGtnAniGfUfUfUAfCfCíUinGíCmG-

3T ARC706 (SEQ Π) NO: 64) 10kDaPEG-NH-

fCmGfCíCGfCmGmGfU fCfU fCmAmGraGfCGfCfUmGmAmGfU fCfUmGmAmGíUfU fUAfCfCÍU mGfCmG-3T ARC1537 (SEQ ID NO: 65) 40kDaPEG-NH- íCmGÍCfCGfCmGmGfUfCfUfOmAinGmGfCGfCfUmGtnAinGfUfCfUmGinAniGfUfUfUAíCfCfUmGfCmG-

3T ARC1730) (SEQ ID NO: 66) PEG20K-NH- íCmGfCfCGfCraGmGíUfCfUfCmAmGmGfCGíCfUmGmAinGfUíCfUmGinAinGfUfUÍUAfCfCfUmGfCmG-

NH-PEG20K ARC1905 (SEQ ID NO: 67) 40KPEG-NH-- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGniGíCGíCfUniGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUinGfCm.G-

3T

Onde o PEG de 40 kDa ramificado é 2,3-bis (mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoílo ARC243 (SEQ ID NO:68)

GGfCGAfUfUAfCfUGGGAfCGGAfCfUfCGfCGAfUGfUGAGfCfCfCAGAfCGAfCfUfCGfCfC ARC244 (SEQ ID NO:69)

GGfCfUfUfCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCfCAGAfCfCfCfC

Outros aptâmeros aqui descritos que se ligam à proteina do complemento C5 estão descritos adiante no Exemplo 3.

Em algumas concretizações os aptâmeros terapêuticos da presente invenção possuem grande afinidade e especificidade para com os seus alvos enquanto reduzindo os efeitos secundários prejudiciais de substituições de nucleótidos que não ocorrem naturalmente se os aptâmeros terapêuticos se clivam no corpo dos pacientes ou indivíduos. Em algumas concretizações, as composições terapêuticas contendo os 65 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ aptâmeros terapêuticos estão isentas de, ou possuem uma quantidade reduzida, de nucleótidos fluorados.

Os aptâmeros da presente invenção podem ser sintetizados utilizando quaisquer técnicas de síntese de oligonucleótidos conhecidas na especialidade incluindo técnicas de síntese de oligonucleótidos em fase sólida bem conhecidas na especialidade (veja-se, e.g., Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) e Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)) e métodos em fase de solução tais como os métodos de síntese de triésteres (veja-se, e.g., Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978) ) .

Composições farmacêuticas A invenção também inclui composições farmacêuticas contendo moléculas de aptâmeros que se ligam à proteína do complemento C5. Em algumas concretizações, as composições são adequadas para uso interno e incluem uma quantidade eficaz de um composto farmacologicamente activo da invenção, individualmente ou em combinação com um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos são especialmente úteis na medida em que possuem uma toxicidade muito baixa, se alguma.

As composições da invenção podem ser utilizadas para tratar ou prevenir uma patologia, tal como uma doença ou desordem, ou aliviar os sintomas dessa doença ou desordem num paciente. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para tratar ou prevenir uma patologia associada a desordens cardíacas relacionadas com o complemento (e.g., lesão do miocárdio; complicações do complemento mediadas por C5 relacionadas com cirurgia de enxerto de bypass da artéria coronária (CABG) tais como hemorragia pós-operatória, activação sistémica de neutrófilos e leucócitos, risco acrescido de enfarte do miocárdio e disfunção cognitiva acrescida; restenose; e complicações mediadas por C5 relacionadas com intervenção coronária percutânea); lesão por isquemia-reperfusão (e.g., enfarte do miocárdio, icto, lesões pelo frio extremo); desordens inflamatórias relacionadas com o complemento (e.g., asma, artrite, sepsia e rejeição após 66 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ transplantação de órgãos); e desordens auto-imunes relacionadas com o complemento (e.g., miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES, ou lúpus); inflamação pulmonar; activação do complemento extracorpórea; activação do complemento mediada por anticorpos; e indicações oculares tais como as retinopatia diabética. As composições da invenção são úteis para administração a um indivíduo que sofre de, ou está predisposto para, uma doença ou desordem que está relacionada com, ou é derivada pela proteína do complemento C5 à qual os aptâmeros da invenção especificamente se ligam.

As composições da invenção podem ser utilizadas num método para o tratamento de um paciente ou indivíduo possuindo uma patologia. Os métodos da invenção envolvem a administração ao paciente ou indivíduo de um aptâmero ou de uma composição compreendendo aptâmeros que se ligam à proteína do complemento C5, de modo que a ligação do aptâmero à proteína do complemento C5 altera a sua função biológica, desse modo tratando a patologia. 0 paciente ou indivíduo possuindo a patologia, i.e., o paciente ou indivíduo tratado pelos métodos da presente invenção, pode ser um vertebrado, mais particularmente um mamífero, ou mais particularmente, um ser humano.

Na prática, os aptâmeros ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são administrados em quantidades que serão suficientes para exercer a sua actividade biológica desejada, e.g., inibe a ligação do aptâmero alvo ao seu receptor, prevenindo a clivagem de uma proteína alvo.

Um aspecto da invenção compreende uma composição de aptâmeros da invenção in em combinação com outros tratamentos para desordens do complemento mediadas por C5. A composição de aptâmeros da invenção pode conter, por exemplo, mais do que um aptâmero. Em alguns exemplos, uma composição de aptâmeros da invenção, contendo um ou mais compostos da invenção, é administrada em combinação com outra composição útil tal como um agente anti-inflamatório, um imunossupressor, um agente antiviral, ou similares. Adicionalmente, os compostos da invenção podem ser administrados em combinação com um agente citotóxico, citostático ou quimioterapêutico tal como um 67 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ agente alquilante, um anti-metabolito, um inibidor mitótico ou um antibiótico citotóxico, como descrito acima. Em geral, serão adequadas para utilização nestas combinações as formas de dosagem presentemente disponíveis dos agentes terapêuticos conhecidos. "Terapia de combinação" (ou "co-terapia") inclui a administração de uma composição de aptâmeros da invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico destinado a proporcionar o efeito benéfico da co-acção destes agentes terapêuticos. 0 efeito benéfico da combinação inclui, mas não se lhes limita, co-acção farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração destes agentes terapêuticos em combinação é tipicamente realizada ao longo de um período de tempo definido (usualmente minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação seleccionada). "Terapia de combinação" pode abranger, mas geralmente não abrange, a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como parte de regimes de monoterapia separados que incidentalmente e arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção. Em "terapia de combinação" pretende-se abranger a administração destes agentes terapêuticos de uma maneira sequencial, ou seja, em que cada agente terapêutico é administrado num tempo diferente, assim como a administração destes agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea. A administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, por administração ao indivíduo de uma única cápsula possuindo uma razão fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas individuais para cada um dos agentes terapêuticos. A administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser realizada por qualquer via apropriada incluindo, mas não se lhes limitadas, as vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares, e a absorção directa através de tecidos de membranas mucosas. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente 68 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ terapêutico da combinação seleccionada pode ser administrado por injecção enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.

Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injecção. A sequência em que os agentes terapêuticos são administrados não é estreitamente critica a menos que indicado em contrário. "Terapia de combinação" também pode abranger a administração dos agentes terapêuticos como descrito acima em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente activos. Quando a terapia de combinação compreende adicionalmente um tratamento não farmacológico, o tratamento não farmacológico pode ser conduzido em qualquer momento adequado desde que seja conseguido um efeito benéfico da co-acção da combinação dos agentes terapêuticos e do tratamento não farmacológico. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda conseguido quando o tratamento não farmacológico é temporalmente afastado da administração dos agentes terapêuticos, talvez dias ou mesmos semanas.

As composições terapêuticas ou farmacológicas da presente invenção geralmente compreenderão uma quantidade eficaz do(s) componente(s) activo(s) da terapia, dissolvidos ou dispersos num meio farmaceuticamente aceitável. Os meios ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotónicos e retardadores da absorção, e similares. A utilização destes meios e agentes para substâncias farmacêuticas activas é bem conhecida na especialidade. Ingredientes activos suplementares podem também ser incorporados nas composições terapêuticas da presente invenção. A preparação de composições farmacêuticas ou farmacológicas será conhecida dos peritos na especialidade à luz da presente divulgação. Tipicamente, estas composições podem ser preparadas em formas injectáveis, quer como soluções ou suspensões liquidas; formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em liquido antes da injecção; sob a forma de comprimidos ou outros sólidos para administração oral; sob a 69 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ forma de cápsulas de libertação ao longo do tempo; ou em qualquer outra forma correntemente utilizada, incluindo gotas oculares, cremes, loções, pomadas, inalantes e similares. A utilização de formulações estéreis, tais como lavagens de base salina, por cirurgiões, médicos ou trabalhadores ligados aos cuidados de saúde, para tratar uma área particular no campo operatório, pode também ser particularmente útil. As composições podem também ser entregues por via de microdispositivos, microparticulas ou esponjas.

Após formulação, as terapêuticas serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade que seja farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injectáveis descrito acima, mas podem ser também empregues cápsulas de libertação de fármacos e similares.

Neste contexto, a quantidade de ingrediente activo e o volume da composição a administrar depende do animal hospedeiro a tratar. As quantidades precisas de composto activo necessárias para administração dependem da opinião do médico e são peculiares para cada indivíduo. É utilizado tipicamente um volume mínimo de uma composição necessário para dispersar os compostos activos. Os regimes adequados para administração são também variáveis, mas seriam tipificados por administração inicial do composto e monitorização dos resultados e depois administração de outras doses controladas a outros intervalos.

Por exemplo, para administração oral na forma de um comprimido ou de uma cápsula (e.g., uma cápsula de gelatina), o componente farmacologicamente activo pode ser combinado com um transportador oral, inerte, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, tal como etanol, glicerol, água e similares. Além disso, quando desejado ou necessário, agentes aglutinantes, lubrificantes, desintegrantes e agentes corantes adequados podem também ser incorporados na mistura. Os aglutinantes adequados incluem amido, silicato de alumínio e magnésio, pasta de amido, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares naturais tais 70 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ como glucose ou beta-lactose, edulcorantes de milho, gomas naturais e sintéticas tais como goma-arábica, goma adragante ou alginato de sódio, polietilenoglicol, ceras e similares. Os lubrificantes utilizados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou de cálcio e/ou polietilenoglicol e similares. Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metilcelulose, ágar, bentonite, goma xantana, amidos, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes, e similares. Os diluentes incluem, e.g., lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina.

As composições injectáveis são preferivelmente soluções ou suspensões aquosas isotónicas, e os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões gordas. As composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, estabilizantes, molhantes ou emulsionantes, promotores da dissolução, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões. Em adição, podem também conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos convencionais de mistura, granulação ou revestimento, respectivamente, e contêm tipicamente cerca de 0,1 a 75%, preferivelmente cerca de 1 a 50%, do ingrediente activo.

Os compostos da invenção podem também ser administrados em formas de dosagem orais tais como pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes, emulsões, pílulas, comprimidos ou cápsulas de libertação ao longo do tempo e de libertação sustentada.

As composições líquidas, particularmente as injectáveis, podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. O composto activo é dissolvido em, ou misturado com, um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e similares, para desse modo formar a solução ou suspensão injectável. Adicionalmente, podem ser formuladas formas sólidas adequadas para dissolução em líquidos antes da inj ecção. 71 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Os compostos da presente invenção podem ser administrados na forma intravenosa (tanto em bolus como por infusão), intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular, todas utilizando formas bem conhecidas das pessoas competentes na técnica da farmácia. Os injectáveis podem ser preparados em formas convencionais, na forma de soluções ou suspensões liquidas. A administração injectável parentérica é geralmente utilizada para injecções e infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Adicionalmente, uma abordagem para a administração parentérica emprega a implantação de sistemas de libertação lenta ou libertação sustentada, que asseguram que é mantido um nivel constante de dosagem, de acordo com a Pat. U.S. 3,710,795.

Adicionalmente, os compostos preferidos para a presente invenção podem ser administrados na forma intranasal por via de uso tópico de veiculos intranasais adequados, inalantes ou por vias transdérmicas, utilizando formas de pachos dérmicos transdérmicos bem conhecidos das pessoas competentes na matéria. Para administração na forma de um sistema de entrega transdérmica, a administração da dosagem será, evidentemente, continua e não intermitente ao longo de todo o regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, unguentos, loções, sprays de aerossol e géis, em que a concentração de ingrediente activo variaria tipicamente de 0,01% a 15%, p/p ou p/v.

Para composições sólidas, os excipientes que podem ser utilizados incluem qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glucose, sacarose, carbonato de magnésio, e similares. O composto activo definido acima pode também ser formulado sob a forma de supositórios utilizando por exemplo, polialquilenoglicóis, por exemplo, propilenoglicol, como transportador. Em algumas concretizações, os supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões gordas.

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistema de entrega em lipossomas, 72 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolípidos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas concretizações, um filme de componentes lipídicos é hidratado com uma solução aquosa de fármaco para formar uma camada de lípido a encapsular o fármaco, como descrito na Pat. U.S. 5,262,564. Por exemplo, as moléculas de aptâmero aqui descritas podem ser proporcionadas sob a forma de um complexo com um composto de elevado peso molecular ou lipófilo, não imunogénico, construído utilizando métodos conhecidos na especialidade. Um exemplo de complexos associados a ácido nucleico é proporcionado na Patente U.S. 6,011,020.

Os compostos da presente invenção podem também ser acoplados a polímeros solúveis como transportadores direccionáveis do fármaco. Estes polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poli-hidroxipropil-metacrilamida-fenol, poli-hidroxietilaspanamida-fenol ou poli(óxido de etileno)polilisina substituído com resíduos palmitoílo. Adicionalmente, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para conseguir uma libertação controlada de um fármaco, por exemplo, poli(ácido láctico), poli-epsílon-caprolactona, poli(ácido hidroxibutírico), poliortoésteres, poliacetais, poli-di-hidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de blocos reticulados ou anfipáticos de hidrogéis.

Se desejado, a composição farmacêutica a administrar pode também conter quantidades minoritárias de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH, e outras substâncias tais como, por exemplo, acetato de sódio e oleato de trietanolamina. O regime de dosagem que utiliza os aptâmeros é seleccionado de acordo com uma variedade de factores incluindo o tipo, a espécie, a idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da condição a tratar; a via de administração; a função renal e hepática do paciente; e o aptâmero particular, ou seu sal, empregue. Um médico ou veterinário competentes podem facilmente determinar e 73 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ prescrever a quantidade eficaz do fármaco necessária para prevenir, contrariar ou parar a progressão da condição.

As dosagens orais da presente invenção, quando utilizadas para os efeitos indicados, variarão entre cerca de 0,05 e 7500 mg/dia oralmente. As composições são preferivelmente proporcionadas na forma de comprimidos classificados contendo 0,5, 1, 0, 2,5, 5, 0, 10, 0, 15, 0, 25, 0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 e 1000,0 mg de ingrediente activo. Os compostos da presente invenção podem ser administrados numa única dose diária, ou a dosagem diária total pode ser administrada em doses divididas duas, três ou quatro vezes por dia.

As dosagens em infusão, as dosagens intranasais e as dosagens transdérmicas variarão entre 0,05 e 7500 mg/dia. As dosagens subcutâneas, intravenosas e intraperitoneais variarão entre 0,05 e 3800 mg/dia.

Os niveis plasmáticos eficazes dos compostos da presente invenção variam de 0,002 mg/mL a 50 mg/mL.

Modulação da farmacocinética e da biodistribuição de aptâmeros terapêuticos É importante que as propriedades farmacocinéticas para todas as terapêuticas à base de oligonucleótidos, incluindo aptâmeros, sejam personalizadas para corresponderem à aplicação farmacêutica desejada. Embora os aptâmeros dirigidos contra alvos extracelulares não sofram de dificuldades associadas à entrega intracelular (como é o caso das terapêuticas anti-sentido e baseadas em iARN), estes aptâmeros têm ainda que ser susceptiveis de serem distribuídos em órgãos e tecidos alvo, e permanecerem no corpo (não modificados) durante um período de tempo consistente com o regime de dosagem pretendido.

Assim, o presente fascículo proporciona materiais e métodos para afectar a farmacocinética de composições de aptâmeros, e, em particular, a capacidade para afinar a farmacocinética do aptâmero. A capacidade de afinação (i.e., a capacidade de modular) da farmacocinética dos aptâmeros é conseguida através de conjugação de porções modificação (e.g., 74 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ polímeros PEG) ao aptâmero e/ou da incorporação de nucleótidos modificados (e.g., 2'-fluoro ou 2'-0Me) para alterar a composição química do ácido nucleico. A capacidade de afinação da farmacocinética dos aptâmeros é utilizada para melhorar as aplicações terapêuticas existentes, ou alternativamente, para o desenvolvimento de novas aplicações terapêuticas. Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, e.g., em cenários antineoplásicos ou agudos onde a rápida depuração ou "desligar" do fármaco podem ser desejadas, é desejável diminuir os tempos de residência de aptâmeros na circulação. Alternativamente, em outras aplicações terapêuticas, e.g., terapias de manutenção onde é desejada a circulação sistémica de um terapêutico, pode ser desejável aumentar os tempos de residência de aptâmeros na circulação.

Em adição, a capacidade de afinação da farmacocinética de aptâmeros é utilizada para modificar a biodistribuição de um aptâmero terapêutico num indivíduo. Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, pode ser desejável para alterar a biodistribuição de um aptâmero terapêutico num esforço para atingir um tipo particular de tecido ou um órgão específico (ou conjunto de órgãos). Nestas aplicações, o aptâmero terapêutico acumula-se preferencialmente num tecido ou órgão(s) específicos. Em outras aplicações terapêuticas, pode ser desejável atingir tecidos que apresentam um marcador celular ou um sintoma associado a uma determinada doença, lesão celular ou outra patologia anormal, de modo a que o aptâmero terapêutico se acumule preferencialmente no tecido afectado. Por exemplo, como descrito no pedido provisório co-pendente norte-americano com o n.° de série 60/550790, apresentado em 5 de Março, 2004, e intitulado "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics), a PEGuilação de um aptâmero terapêutico (e.g., PEGuilação com um polímero de PEG de 20 kDa) é utilizada para atingir tecidos inflamados, de modo a que o aptâmero terapêutico PEGuilado se acumule preferencialmente em tecido inflamado.

Para determinar os perfis farmacocinéticos e de biodistribuição de aptâmeros terapêuticos (e.g., conjugados de aptâmeros ou aptâmeros possuindo químicas alteradas, tais como nucleótidos modificados) são monitorizados uma variedade de 75 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ parâmetros. Estes parâmetros incluem, por exemplo, a semivida (ti/2) , a depuração plasmática (Cl), o volume de distribuição (Vss) , a área sob a curva de concentração-tempo (AUC) , a concentração máxima observada (Cmax) sérica ou plasmática, e o tempo de residência médio (M4RT) de uma composição de aptâmeros. Como aqui se utiliza, o termo "AUC" refere-se à área sob o gráfico da concentração plasmática de um aptâmero terapêutico versus o tempo após a administração do aptâmero. 0 valor da AUC é utilizado para estimar a biodisponibilidade (i.e., a percentagem de aptâmero terapêutico administrado na circulação após a administração do aptâmero) e/ou a depuração total (Cl) (i.e., a velocidade a que o aptâmero terapêutico é removido da circulação) de um determinado aptâmero terapêutico. 0 volume de distribuição refere-se à relação entre a concentração plasmática de um aptâmero terapêutico e a quantidade de aptâmero presente no corpo. Quanto maior a Vss, mais um aptâmero é encontrado fora do plasma (i.e., maior a extravasão). 0 presente fascículo proporciona materiais e métodos para modular, de uma maneira controlada, a farmacocinética e a biodistribuição de composições de aptâmeros estabilizadas in vivo por conjugação de um aptâmero com uma porção de modulação tal como uma molécula pequena, um péptido ou um grupo terminal de um polimero, ou por incorporação de nucleótidos modificados num aptâmero. Como aqui descrito, a conjugação de uma porção de modificação e/ou a alteração da composição quimica de nucleótido(s) altera aspectos fundamentais do tempo de residência do aptâmero em circulação e distribuição nos tecidos.

Em adição à depuração por nucleases, os oligonucleótidos terapêuticos estão sujeitos a eliminação por via de filtração renal. Como tal, um oligonucleótido resistente a nucleases administrado intravenosamente exibe tipicamente uma semivida in vivo <10 min, a menos que a filtração possa ser bloqueada. Isto pode ser realizado quer facilitando a rápida distribuição de saida da corrente sanguínea para os tecidos ou aumentando o peso molecular aparente do oligonucleótido acima da dimensão limite eficaz para o glomérulo. A conjugação de terapêuticos pequenos com um polímero de PEG (PEGuilação), descrito adiante, pode prolongar drasticamente os tempos de residência 76 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ de aptâmeros em circulação, desse modo diminuindo a frequência de dosagem e melhorando a eficácia contra alvos vasculares.

Os aptâmeros podem ser conjugados com uma variedade de porções de modificação, tais como polímeros de elevado peso molecular, e.g., PEG; péptidos, e.g., Tat (um fragmento de 13 aminoácidos da proteína Tat de HIV (Vives, et al. (1997), j. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant (uma sequência de 16 aminoácidos derivada da Terceira hélice da proteína homeótica de Drosophila antennapedia (Pietersz, et al. (2001),

Vaccine 19(11-12): 1397-405)) e Arg7 (um péptido curto, carregado positivamente, que permeia as células, composto por poliarginina (Arg7) (Rothbard, et al. (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J et al. (2002), J. Med. Chem. 45(17):3612-8)); e moléculas pequenas, e.g., compostos lipófilos tais como colesterol. Entre os vários conjugados aqui descritos, as propriedades In vivo de aptâmeros são alteradas mais profundamente por complexação com grupos PEG. Por exemplo, a complexação de um aptâmero terapêutico modificado misto com 2'-F e 2'-OMe, com um polímero de PEG de 20 kDa impede a filtração renal e promove a distribuição do aptâmero para tecidos saudáveis e inflamados. Adicionalmente, o conjugado polímero de PEG de 20 kDa - aptâmero prova-se praticamente tão eficaz como um polímero de PEG de 40 kDa na prevenção da filtração renal de aptâmeros. Embora um efeito da PEGuilação seja sobre a depuração dos aptâmeros, a exposição sistémica prolongada produzida pela presença da porção de 20 kDa também facilita a distribuição do aptâmero nos tecidos, particularmente aqueles de órgãos altamente perfundidos e aqueles no local da inflamação. O conjugado aptâmero-polímero de PEG de 20 kDa dirige a distribuição do aptâmero para o local da inflamação, de modo que o aptâmero PEGuilado se acumula preferencialmente em tecido inflamado. Em alguns casos, o conjugado de aptâmero PEGuilado com 20 kDa é capaz de aceder ao interior de células, tais como, por exemplo, células renais.

No global, os efeitos sobre a farmacocinética e a distribuição nos tecidos dos aptâmeros, produzidos por porções de modificação de baixo peso molecular, incluindo colesterol e péptidos que permeiam as células, são menos pronunciados do que os produzidos em resultado da PEGuilação ou da modificação 77 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ de nucleótidos (e.g., uma composição química alterada). Embora não pretendendo uma ligação à teoria, sugere-se que as associações mediadas pelo colesterol com lipoproteínas do plasma, que se postulou ocorrerem no caso do conjugado anti-sentido, estão impedidas no contexto particular da estrutura dobrada do conjugado aptâmero-colesterol, e/ou referem-se ao aspecto da natureza lipófila do grupo colesterol. Como o colesterol, a presença de um marcador péptido Tat promove a depuração do aptâmero da corrente sanguínea, com níveis comparativamente elevados de conjugado a surgirem nos rins em 48 h. Outros péptidos (e.g., Ant, Arg7) que se reportou na especialidade mediarem a passagem de macromoléculas através de membranas celulares in vitro, não parecem promover a depuração do aptâmero da circulação. Contudo, como a Tat, o conjugado de Ant acumula-se significativamente nos rins relativamente a outros aptâmeros. Embora não pretendendo a ligação à teoria, é possível que a desfavorável apresentação das porções de modificação peptídicas Ant e Arg7 no contexto de três aptâmeros dimensionalmente dobrados in vivo impeça a capacidade destes péptidos influenciar propriedades de transporte de aptâmeros.

Os nucleótidos modificados podem também ser utilizados para modular a depuração plasmática de aptâmeros. Por exemplo, um aptâmero não conjugado que incorpora químicas estabilizantes 2'-F e 2'-0Me, o que é típico dos aptâmeros da presente geração pois exibe um elevado grau de estabilidade às nucleases in vitro e in vivo, apresenta uma rápida perda no plasma (i.e., rápida depuração plasmática) e uma rápida distribuição para os tecidos, principalmente para os rins, quando comparado com o aptâmero não modificado.

Ácidos Nucleicos Derivatizados com PEG

Como descrito acima, a derivatização de ácidos nucleicos com polímeros não imunogénicos de elevado peso molecular tem o potencial de alterar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de ácidos nucleicos, tornando-os agentes terapêuticos mais eficazes. As alterações favoráveis na actividade podem incluir resistência aumentada à degradação por nucleases, filtração diminuída através dos rins, exposição 78 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ diminuída ao sistema imunitário, e distribuição alterada do terapêutico pelo corpo.

As composições de aptâmeros da invenção podem ser derivatizadas com porções de polialquilenoglicol ("PAG"). Encontram-se exemplos de ácidos nucleicos derivatizados com PAG no Pedido de Patente dos Estados Unidos com n.° de Série 10/718,833, apresentado em 21 de Novembro, 2003, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os polímeros típicos utilizados na invenção incluem poli(etilenoglicol) ("PEG'), também conhecido como poli(óxido de etileno) ("PEO") e polipropilenoglicol (incluindo poli-isopropilenoglicol). Adicionalmente, podem ser utilizados copolímeros aleatórios ou de blocos de diferentes óxidos de alquileno (e.g., óxido de etileno e óxido de propileno) em muitas aplicações. Na sua forma mais comum, um polialquilenoglicol, tal como PEG, é um polímero linear terminado em cada extremidade com grupos hidroxi: HO-CH2CH20-(CH2CH20) n-CH2CH2-OH. Este polímero, alfa-, omega-di-hidroxilpoli(etilenoglicol), pode também ser representado como HO-PEG-OH, onde se entende que o símbolo -PEG- representa a seguinte unidade estrutural: -CH2CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2- onde n varia tipicamente de cerca de 4 a cerca de 10 000.

Como mostrado, a molécula de PEG é bifuncional e é por vezes referida como "diol de PEG". As porções terminais da molécula de PEG são porções hidroxilo relativamente não reactivas, os grupos -OH, que podem ser activados, ou convertidos em porções funcionais, para ligação do PEG a outros compostos em locais reactivos no composto. Estes dióis de PEG activados são referidos aqui como PEG bi-activados. Por exemplo, as porções terminais do diol de PEG foram funcionalizadas como éster carbonato activo para a reacção selectiva com porções amino por substituição das porções hidroxilo relativamente não reactivas, -OH, por porções éster de succinimidilo activas de N-hidroxissuccinimida.

Em muitas aplicações, é desejável rematar a molécula de PEG numa extremidade com uma porção essencialmente não

reactiva de modo a que a molécula de PEG seja mono-funcional (ou mono-activada) . No caso de terapêuticas com proteínas que geralmente apresentam múltiplos locais de reacção para PEG 79 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ activados, os PEG bifuncionais activados conduzem a reticulação extensiva, originando agregados fracamente funcionais. Para gerar PEG mono-activados, uma porção hidroxilo no terminal da molécula de diol de PEG é tipicamente substituída por uma porção terminal metoxi não reactiva, -OCH3. 0 outro terminal, não rematado, da molécula de PEG é tipicamente convertida numa porção terminal reactiva que pode ser activada para ligação a um local reactivo na superfície ou a uma molécula tal como uma proteína.

Os PAG são polímeros que tipicamente possuem as propriedades de solubilidade em água e em muitos solventes orgânicos, ausência de toxicidade, e ausência de imunogenicidade. Uma utilização dos PAG é ligar covalentemente o polímero a moléculas insolúveis para tornar o "conjugado" PAG-molécula resultante solúvel. Por exemplo, mostrou-se que o fármaco insolúvel em água paclitaxel, quando acoplado a PEG, fica solúvel em água. Greenwald, et al., J. Org. Chem., 60:331-336 (1995). O conjugados de PAG são frequentemente utilizados não apenas para aumentar a solubilidade e a estabilidade mas também para prolongar a semivida das moléculas na circulação sanguínea.

Os compostos polialquilados da invenção têm tipicamente entre 5 e 80 kD de tamanho, contudo, qualquer tamanho pode ser utilizado, dependendo a escolha do aptâmero e da aplicação. Outros compostos de PAG da invenção têm entre 10 e 80 kD de tamanho. Ainda outros compostos de PAG da invenção têm entre 10 e 60 kD de tamanho. Por exemplo, um polímero de PAG pode ter pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kD de tamanho. Estes polímeros podem ser lineares ou ramificados.

Ao contrário das terapêuticas com proteínas expressas biologicamente, os ácidos nucleicos terapêuticos são tipicamente sintetizados quimicamente a partir de nucleótidos monoméricos activados. Os conjugados PEG-ácido nucleico podem ser preparados incorporando o PEG utilizando a mesma síntese monomérica iterativa. Por exemplo, os PEG activados por conversão numa forma de fosforamidito podem ser incorporados na síntese d oligonucleótidos em fase sólida. Alternativamente, a síntese de oligonucleótidos pode ser realizada com incorporação específica do local de um local de 80 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ligação de PEG reactivo. Mais vulgarmente, isto tem sido realizado por adição de uma amina primária livre no terminal 5' (incorporado utilizando um fosforamidito modificado no último passo de acoplamento da síntese em fase sólida). Utilizando esta abordagem, um PEG reactivo (e.g., um que está activado de modo que irá reagir e formar uma ligação com uma amina) é combinado com o oligonucleótido purificado e a reacção de acoplamento é realizada em solução. Em algumas concretizações os polímeros são moléculas de PEG ramificado. Como aqui descrito, os polímeros podem ser PEG ramificados de 40 kDa, veja-se, e.g. (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4 ' -butamida) representado na Figura 4. Como aqui descrito, o PEG ramificado de 40 kD (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4 ' -butamida) pode ser ligado à extremidade 5' do aptâmero como representado na Figura 5. A capacidade da conjugação com PEG alterar a biodistribuição de um terapêutico está relacionada com vários factores incluindo a dimensão aparente (e.g., medida em termos de raio hidrodinâmico) do conjugado. Sabe-se que conjugados maiores (>10kDa) bloqueiam mais eficazmente a filtração por via do rim e consequentemente aumentam a semivida no soro de macromoléculas pequenas (e.g., péptidos, oligonucleótidos anti-sentido). Mostrou-se que a capacidade dos conjuqados de PEG bloquearem a filtração aumenta com a dimensão do PEG até aproximadamente 50 kDa (mais aumentos têm um efeito benéfico mínimo pois a semivida fica definida pelo metabolismo mediado por macrófagos em vez da eliminação por via dos rins). A produção de PEG de elevados pesos moleculares (>10 kDa) pode ser difícil, ineficiente e dispendiosa. Como uma via no sentido da síntese de conjugados PEG de elevado peso molecular-ácido nucleico, o trabalho anterior tem sido focado na geração de PEG activados de maior peso molecular. Um método para gerar estas moléculas envolve a formação de um PEG activado ramificado em que dois ou mais PEG são ligados a um núcleo central portador do grupo activado. As porções terminais destas moléculas de PEG de maior peso molecular, i.e., as porções hidroxilo (-OH) relativamente não reactivas, podem ser activadas, ou convertidas em porções funcionais, para ligação de um ou mais dos PEG a outros compostos em locais reactivos nos compostos. Os PEG activados ramificados 81 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ terão mais do que dois terminais, e em casos em que dois ou mais terminais foram activados, estas moléculas de PEG de maior peso molecular activadas são referidas aqui como PEG multi-activados. Em alguns casos, nem todos os terminais numa molécula de PEG ramificado são activados. Em casos onde quaisquer dois terminais de uma molécula de PEG ramificado são activados, as moléculas de PEG são referidas como PEG bi-activados. Em alguns casos onde apenas um terminal numa molécula de PEG ramificado é activado, as moléculas de PEG são referidas como mono-activadas. A titulo de exemplo desta abordagem, foi descrito um PEG activado preparado pela ligação de dois PEG monometoxi a uma lisina nuclear que é subsequentemente activado para reacção (Harris et ai., Nature, vol.2: 214-221, 2003). 0 presente fascículo proporciona outra via rentável para a síntese de conjugados PEG de elevado peso molecular-ácido nucleico (preferivelmente, aptâmero) incluindo ácidos nucleicos multiplamente PEGuilados. São aqui descritos também oligonucleótidos multiméricos ligados a PEG, e.g., aptâmeros dimerizados, assim como composições de elevado peso molecular onde uma porção estabilizante de PEG é um ligante que separa diferentes porções de um aptâmero, e.g., o PEG está conjugado no interior de uma única sequência do aptâmero, de modo a que o arranjo linear da composição de aptâmero de elevado peso molecular seja, e.g., ácido nucleico - PEG - ácido nucleico (- PEG - ácido nucleico)n onde n é superior ou igual a 1.

As composições de elevado peso molecular incluem as que possuem um peso molecular de pelo menos 10 kD. As composições tipicamente possuem uma dimensão de peso molecular entre 10 e 80 kD. As composições de elevado peso molecular têm pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kD de tamanho.

Uma porção estabilizante é uma molécula, ou uma porção de uma molécula, que melhora as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas das composições de aptâmero de elevado peso molecular. Em alguns casos, uma porção estabilizante é uma molécula ou uma porção de uma molécula que leva dois ou mais aptâmeros, ou domínios de aptâmeros, à proximidade, ou proporciona uma liberdade rotacional global diminuída das composições de aptâmero de elevado peso molecular. Uma porção 82 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ estabilizante pode ser um polialquilenoglicol, tal como um polietilenoglicol, que pode ser linear ou ramificado, um homopolímero ou um heteropolímero. Outras porções estabilizantes incluem polímeros tais como ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Os oligonucleótidos podem também ser porções estabilizantes; estes oligonucleótidos podem incluir nucleótidos modificados e/ou ligações modificadas, tais como fosforotioatos. Uma porção estabilizante pode ser uma parte integrante de uma composição de aptâmeros, i.e., estar covalentemente ligada ao aptâmero.

As composições aqui descritas incluem composições de aptâmero de elevado peso molecular em que duas ou mais porções de ácido nucleico estão covalentemente conjugadas a pelo menos uma porção polialquilenoglicol. As porções polialquilenoglicol servem como porções estabilizantes. Em composições onde uma porção polialquilenoglicol está covalentemente ligada em cada uma das extremidades a um aptâmero, de modo que o polialquilenoglicol une as porções ácido nucleico numa só molécula, o polialquilenoglicol diz-se ser uma porção ligante. Nestas composições, a estrutura primária da molécula covalente inclui o arranjo linear ácido nucleico-PAG-ácido nucleico. Um exemplo é uma composição possuindo a estrutura primária ácido nucleico-PEG-ácido nucleico. Outro exemplo é um arranjo linear de: ácido nucleico - PEG - ácido nucleico - PEG - ácido nucleico.

Para produzir o conjugado ácido nucleico-PEG-ácido nucleico, o ácido nucleico é originalmente sintetizado de modo a possuir um único local reactivo (e.g., é mono-activado) . Numa concretização preferida, este local reactivo é um grupo amino introduzido no terminal 5' por adição de um fosforamidito modificado como último passo na síntese em fase sólida do oligonucleótido. Após desprotecção e purificação do oligonucleótido modificado, este é reconstituído em elevada concentração numa solução que minimiza a hidrólise espontânea do PEG activado. Numa concretização preferida, a concentração de oligonucleótido é 1 mM e a solução reconstituída contém tampão de NaHC03 200 mM, pH 8,3. A síntese do conjugado é iniciada por adição lenta, por passos, de PEG bifuncional altamente purificado. Numa concretização preferida, o diol de PEG é activado em ambas as extremidades (bi-activado) por 83 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ derivatização com propionato de succinimidilo. Após a reacção, o conjugado PEG-ácido nucleico é purificado por electroforese em gel ou cromatografia liquida para separar espécies completamente, parcialmente e não conjugadas. As múltiplas moléculas de PAG concatenadas (e.g., sob a forma de copolimeros aleatórios ou de blocos) ou cadeias de PAG mais pequenas, podem ser ligadas para se conseguirem vários comprimentos (ou pesos moleculares) . Podem ser utilizados ligantes que não PAG entre as cadeias de PAG de vários comprimentos.

As modificações de nucleótidos 2'-0Me, 2'-fluoro e outros nucleótidos modificados estabilizam o aptâmero contra nucleases e aumentam a sua semivida in vivo. 0 remate 3'-3'-dT também aumenta a resistência a exonucleases. Vejam-se, e.g., as Patentes U.S. 5,674,685; 5,668,264; 6,207,816; e 6,229,002.

Derivatização com PAG de um ácido nucleico reactivo

Os conjugados PAG de elevado peso molecular-ácido nucleico-PAG podem ser preparados por reacção de um PEG activado mono-funcional com um ácido nucleico contendo mais do que um local reactivo. Numa concretização, o ácido nucleico é bi-reactivo, ou bi-activado, e contém dois locais reactivos: um grupo 5'-amino e um grupo 3'-amino introduzidos no oligonucleótido através de síntese de fosforamidito convencional, por exemplo: 3 '-5'-di-PEGuilação como ilustrado na Figura 6. Em concretizações alternativas, os locais reactivos podem ser introduzidos em posições internas, utilizando por exemplo, a posição 5 de pirimidinas, a posição 8 de purinas, ou a posição 2' de ribose como locais para ligação de aminas primárias. Nestas concretizações, o ácido nucleico pode ter vários locais activados ou reactivos e diz-se estar multiplamente activado. Após a síntese e a purificação, o oligonucleótido modificado é combinado com o PEG mono-activado sob condições que promovem a reacção selectiva com os locais reactivos do oligonucleótido enquanto minimizando a hidrólise espontânea. Na concretização preferida, monometoxi-PEG é activado com propionato de succinimidilo e a reacção de acoplamento é realizada a pH 8,3. Para conduzir a síntese do PEG bi-substituído, é proporcionado um excesso estequiométrico de PEG relativamente ao 84 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ oligonucleótido. Após a reacção, o conjugado PEG-ácido nucleico é purificado por electroforese em gel ou cromatografia liquida para separar espécies completamente, parcialmente e não conjugadas.

Os dominios de ligação podem também ter uma ou mais porções polialquilenoglicol ligadas. Estes PAG podem ter vários comprimentos e podem ser utilizados em combinações apropriadas para se conseguir o peso molecular desejado da composição. 0 efeito de um ligante particular pode ser influenciado tanto pela sua composição quimica como pelo comprimento. Um ligante que seja demasiado longo, demasiado curto ou forme interacções estereoquimicas e/ou iónicas desfavoráveis com o alvo irá impedir a formação do complexo entre o aptâmero e o alvo. Um ligante, que seja mais longo do que o necessário para se estender pela distância entre ácidos nucleicos, pode reduzir a estabilidade da ligação diminuindo a concentração eficaz do ligando. Assim, é frequentemente necessário optimizar as composições e comprimentos dos ligantes de modo a maximizar a afinidade de um aptâmero para com um alvo. EXEMPLO 1

Actividade anti-C5 de Aptâmeros nas Vias Clássica e Alternativa do Complemento

Exemplo IA: Ensaio de hemólise. 0 teste CH50 mede a capacidade do sistema do complemento numa amostra de teste de soro para lisar 50% de células numa suspensão normalizada de eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo. Uma solução de 0,2% de soro humano foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, EL) na presença ou na ausência de vários aptâmeros anti-C5. O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do kit em solução salina tamponada com veronal contendo cálcio, magnésio e 1% de gelatina (tampão de complemento GVB++) e foi incubada durante 30 minutos a 37°C. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas para formar uma pelete dos eritrócitos intactos. 85 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ A densidade óptica a 412 nm (DO412) do sobrenadante foi lida para quantificar a libertação de hemoglobina solúvel, que é proporcional à extensão da hemólise (Green et al., (1995)

Chem. Biol. 2:683-95). Para verificar que os aptâmeros bloquearam a activação de C5, alguns sobrenadantes da hemólise foram analisados quanto à presença de C5a e C5b-9 por ELISA (kit de ELISA para C5b-9, Quidel, San Diego, CA; kit de ELISA para C5a, BD Biosciences, San Diego, CA). A adição de um aptâmero anti-C5 não PEGuilado (ARC186) (SEQ ID NO:4) à mistura reaccional inibiu a hemólise de uma maneira dependente da dose, como mostrado no gráfico da Figura 7A, com uma IC50 de 0,5 ± 0,1 nM, (veja-se a

Figura 7B) , um valor que é consistente com a KD determinada por filtração em nitrocelulose. Para concentrações muito elevadas de aptâmero (>10 nM), a extensão da hemólise foi essencialmente indistinguível do valor de fundo (sem soro adicionado), indicando que o ARC186 (SEQ ID NO:4) foi capaz de bloquear completamente a actividade do complemento. A conjugação do aptâmero ARC186 (SEQ ID NO:4) com grupos PEG de 20 kDa (ARC657; SEQ ID NO:61), de 30 kDa (ARC658; SEQ ID NO:62), ramificado de 40 kDa (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida) (ARC187; SEQ ID NO:5), ramificado de 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoílo) (ARC1905; SEQ ID NO: 67), linear de 40 kDa (ARC1537; SEQ ID NO: 65) e linear de 2x20 kDa (ARC1730; SEQ ID NO:66) teve pouco efeito sobre a actividade inibitória do aptâmero (Figura 7A-Figura 7D). Finalmente, a análise ELISA dos sobrenadantes da hemólise indicou que esta inibição funcional estava correlacionada com o bloqueio da libertação de C5a. Assim, os resultados da hemólise mostram que o ARC186 (SEQ ID NO:4), e os seus conjugados PEGuilados, são inibidores do complemento altamente potentes que funcionam por bloqueio da activação de C5 catalisada por convertases.

Os ensaios de hemólise com material não PEGuilado indicaram que o aptâmero anti-C5 não reage cruzadamente com C5 de várias espécies não primatas, incluindo rato, porquinho-da-índia, cão e porco. Contudo, foi observada actividade inibitória significativa em rastreios de soro de primata, incluindo soro de macaco cynomolgus, macaco rhesus e chimpanzé. A eficácia in vitro do aptâmero anti-C5 foi 86 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ adicionalmente investigada em soro de cynomolgus utilizando ARC658 (SEQ ID NO: 62), o análogo com PEG de 30 kDa de ARC186 (SEQ ID NO:4) . Numa comparação lado a lado (n = 3) , o ARC658 inibiu a actividade do complemento humano com uma IC50 de 0,21 ± 0,0 nM e a actividade do complemento de cynomolgus com uma IC50 de 1,7 ± 0,4 nM (Figura 8) . Assim, o ARC658 (SEQ ID NO: 62) é 8 ± 3 vezes menos potente em soro de cynomolgus comparativamente com o humano, nesta medição.

Ensaios de Ligação a Filtro de Nitrocelulose. Aptâmeros individuais foram marcados com 32P na extremidade 5' por incubação com γ-32Ρ-ΑΤΡ e polinucleótido-quinase (New England Biolabs, Beverly, MA) . O aptâmero radiomarcado foi purificado do ATP livre por filtração em gel seguida por electroforese em gel de poliacrilamida. Para medir a afinidade anti-C5 do aptâmero, o aptâmero radiomarcado (< 10 pM) foi incubado com concentrações crescentes (0,05 - 100 nM) de proteina C5 purificada (Quidel, San Diego, CA) em solução salina tamponada com fosfato contendo MgCl2 1 mM à temperatura ambiente (23°C) e 37°C, durante intervalos de tempo de 15 min e 4 h. As reacções de ligação foram analisadas por filtração em nitrocelulose utilizando um dot-blot Minifold I, de filtração em vácuo de 96 poços (Schleicher & Schuell, Keene, NH) . Foi utilizado um meio de filtração de três camadas, consistindo (do topo para o fundo) em nitrocelulose Protran (Schleicher & Schuell), nylon Hybond-P (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e papel gel blot GB002 (Schleicher & Schuell). A camada de nitrocelulose, que liga selectivamente a proteina a favor do ácido nucleico, reteve preferencialmente o aptâmero anti-C5 no complexo com um ligando de proteina, enquanto o aptâmero anti-C5 não complexado passou através da nitrocelulose e aderiu ao nylon. O papel gel blot foi incluído simplesmente como meio de suporte para os outros filtros. Após a filtração, as camadas do filtro foram separadas, secas e expostas a um ecrã de fósforo (Amersham Biosciences) e foram quantificadas utilizando um sistema de imagiologia Storm 860 Phosphorimager® (Amersham Biosciences).

Como mostrado na Figura 9 e na Figura 10, concentrações crescentes de C5 aumentam a proporção de ARC186 capturado na membrana de nitrocelulose. A dependência de ARC186 ligado das concentrações crescentes de C5 é bem descrita pelo modelo de 87 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ligação de local único (C5 + ARC186 <-► C5»ARC186; % ligada = Cmax / (1 + KD / [C5] ) ; Cmax é a máxima % ligada à [C5] de saturação; KD é a constante de dissociação). As curvas de ligação de ARC186 a duas temperaturas após uma incubação de 15 min ou de 4 h estão mostradas nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Após uma incubação de 15 min, as curvas de ligação de ARC186 a 23 e 37°C são essencialmente indistinguiveis à parte do erro, ajustando-se a valores de KD de 0,5 - 0,6 nM (Figura 9). As diferenças entre as curvas de ligação a 23 e 37°C tornam-se mais pronunciadas quando o tempo de incubação é prolongado. Após uma incubação de 4 h (Figura 10), a KD observada a 23°C diminui para 0,08 ± 0,01 nM, enquanto a KD observada a 37°C permanece inalterada (0,6 ±0,1 nM).

Para demonstrar a base para o requisito de incubação longa à temperatura ambiente, a afinidade a esta temperatura foi adicionalmente explorada utilizando métodos cinéticos. A velocidade da reacção inversa que descreve a dissociação de C5»ARC186 é vrev = k-χ [C5 · ARC18 6 ] , onde vrev é a velocidade (unidades de M min-1) e k-2 é a constante de velocidade de dissociação de primeira ordem (unidades de min"1) . A velocidade da reacção directa que descreve a formação do complexo C5»ARC186 é vfor = £g[C5] [ARC18 6] , onde vfor é a velocidade (unidades de M min-1) e Ag é a constante de velocidade de associação de segunda ordem (unidades de M-1min-1) . Os dados foram analisados utilizando o pressuposto de pseudo-primeira ordem, onde a concentração de um reagente (C5 neste caso) é mantida em grande excesso relativamente ao outro ( [C5] >> [ARC18 6], e assim permanece essencialmente inalterada ao longo da reacção. Sob estas condições, a reacção directa é descrita pela equação da velocidade para um processo de primeira ordem, vfor = Ag' [ARC18 6], onde Ag' = Ag[C5] .

Para analisar a dissociação de C5»ARC186, ARC186 radiomarcado (< 10 pM) foi pré-equilibrado com proteína C5 5 nM em solução salina tamponada com fosfato contendo MgCl2 1 mM à temperatura ambiente (23°C). A reacção de dissociação foi iniciada pela adição de ARC186 não marcado (1 μΜ) , que actua como uma ratoeira para a C5 livre, e foi parada por separação (partição) por filtração em nitrocelulose de ARC186 radiomarcado ligado e livre. Foi obtido o decurso da 88 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ dissociação de ARC186 no tempo variando a duração entre a iniciação da reacção de dissociação e a filtração. 0 decurso no tempo da dissociação, observado como uma diminuição na percentagem de ARC186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose (igual à percentagem ligada a C5) , é bem descrito por um decaimento exponencial simples onde a % de ARC186 ligado = 100 χ e~k~lk (veja-se a Figura 11) . O valor da constante de velocidade da dissociação, k-lr determinado por este método é de 0,013 ± 0,02 min-1, correspondendo a uma semivida (ti/2 = ln2 / k-i) de 53 1 8 min.

Para analisar a reacção de associação, a constante de velocidade de equilíbrio (keq) para a formação de C5»ARC186 foi medida na presença de várias concentrações de proteína C5 (1 - 5 nM) . A formação do complexo foi iniciada misturando conjuntamente a proteína C5 e o ARC186 radiomarcado em PBS contendo MgCl2 1 mM à temperatura ambiente (23°C), e foi parada por separação (partição) por filtração em nitrocelulose. Como descrito para as reacções de dissociação, foi obtido o decurso da formação de complexo no tempo variando a duração entre a iniciação da reacção e a filtração. O decurso no tempo do equilíbrio, observado como um aumento na percentagem de ARC186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose, é bem descrito por um decaimento exponencial simples onde a % de ARC186 ligado = 100 X (1 - e~klt) . Os decursos no tempo de equilíbrio para C5 1, 2 e 4 nM estão apresentados na Figura 12. Como esperado, o valor de keq aumenta linearmente com [C5] (keg (1 nM) = 0,19 ± 0,02 min-1; keq (2 nM) = 0,39 ± 0,03 min-1; keq. (3 nM) = 0,59 ± 0,05 min-1; keq (4 nM) = 0,77 ± 0,06 min-1; keq (5 nM) = 0,88 ± 0,06 min-1) . Sob as condições da experiência, a relação entre keq, kx e A-i é keq = Jci [C5] + k-i. Assim, uma estimativa de kj é derivada do declive de um gráfico de keq versus [C5] (veja-se a inserção da Figura 12), neste caso 0,18 ± 0,01 nM“1min“1.

Estes dados indicam que, sob condições de baixa concentração de C5 (e.g., 0.1 nM) , é necessária uma incubação prolongada para que a mistura de C5 e ARC186 radiomarcado atinja o equilíbrio. Sob estas condições, keq = (0,18 ± 0,01 nM-1min-1) (0,1 nM) + 0,013 min-1 = 0,03 min-1, correspondendo a uma semivida de 22 min. Assim, são necessárias quase 2 horas de incubação à temperatura ambiente 89 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ (- 5 semividas) para completar o equilíbrio (> 95%) . Um tempo de incubação curto (e.g., 15 min) irá subestimar significativamente a verdadeira afinidade do complexo, como mostrado acima pela diferença nas afinidades observadas para uma incubação de 15 min (KD = 0,5 nM) versus uma de 4 horas (KD = 0,08 nM). Uma estimativa alternativa da KD à temperatura ambiente pode ser calculada a partir dos dados cinéticos de acordo com a relação KD = k__z / klm Neste caso, a KD calculada é de 0,07 ± 0,01 nM, que é completamente consistente com a KD determinada acima por métodos termodinâmicos. A especificidade de ARC186 (SEQ ID NO: 4) para C5 foi também determinada em ensaios de filtração em nitrocelulose por comparação com componentes do complemento tanto a montante como a jusante de C5 na cascata do complemento. Os resultados estão representados na Figura 13. O aptâmero essencialmente não reconhece C5a (KD >> 3 μΜ) , embora exiba afinidade fraca para com C5b-9 solúvel (KD > 0,2 μΜ), presumivelmente devido a interacções com o componente C5b. Outros componentes do complemento exibem afinidade moderada a fraca para com o aptâmero. A C3 não activada essencialmente não se liga ao aptâmero; contudo, o factor H (KD ~ 100 nM) e, numa extensão muito menor, Clq (KD > 0,3 μΜ) ligam-se. Tomados em conjunto, os dados indicam que ARC186 (SEQ ID NO:4) se liga com elevada afinidade a C5 humana, principalmente por via de reconhecimento do domínio C5b.

Os aptâmeros modificados com PEG não são prontamente avaliados por ensaios de filtração em nitrocelulose devido à tendência destes aptâmeros para aderir à nitrocelulose mesmo na ausência de proteína alvo. Contudo, as afinidades relativas destes aptâmeros podem ser determinadas a partir da sua capacidade comparativa para competir com aptâmero não PEGuilado, radiomarcado 10 pM) pela ligação ao alvo. À medida que a concentração de competidor frio (i.e., não radiomarcado) aumenta, a percentagem de aptâmero radiomarcado ligado à proteína alvo diminui. Como mostrado na Figura 14, concentrações crescentes de ARC186 frio (SEQ ID NO:4) ou aptâmero PEGuilado (ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) e ARC187 (SEQ ID NO:5)) (0,05 - 1000 nM) competem prontamente com ARC186 radiomarcado (SEQ ID NO:4) pela ligação na presença de proteína C5 2 nM. Adicionalmente, as curvas de 90 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ titulação para todos os quatro aptâmeros praticamente sobrepõem-se, indicando que a conjugação com PEG tem pouco ou nenhum efeito sobre a afinidade do aptâmero para com C5.

Exemplo 1B: Ensaio de sangue completo. O efeito do aptâmero anti-C5 sobre a via alternativa do sistema do complemento foi analisada utilizando o ensaio seguinte ao sangue completo. Na ausência de anticoagulante, colheu-se sangue de voluntários humanos normais. Aliquotas de sangue (não contendo anticoagulante) foram incubadas com concentrações crescentes de ARC186 (SEQ ID NO:4) durante 5 horas à temperatura ambiente ou a 37°C. As amostras foram centrifugadas para isolar o soro e a presença de C5b no soro foi detectada por ELISA para sC5b-9 (kit ELISA para C5b-9, Quidel, San Diego, CA). Como mostrado na Figura 15, a actividade anti-complemento, reflectida na produção de C5b-9, entre as amostras incubadas a diferentes temperaturas divergiu a 3 μΜ. os dados à temperatura ambiente indicaram que a concentração de aptâmero necessária para uma inibição quantitativa está na gama de 3-6 μΜ, enquanto a concentração reportada de C5 é de aproximadamente 400 nM. Estes resultados sugerem que pode ser necessário um excesso molar superior a 10 vezes do aptâmero anti-C5 (ARC186; SEQ ID NO: 4) para uma inibição completa da actividade de C5.

Exemplo 1C: Activação do complemento por zimosano. 0 zimosano é um componente polissacaridico da parede celular das leveduras, e um potente activador da cascata do complemento alternativa. A adição de zimosano a amostras de sangue, plasma ou soro ex vivo resulta na acumulação de produtos da activação do complemento, incluindo C5a e a versão solúvel de C5b-9 (sC5b-9) . Amostras de soro humano não diluido (Center for Blood Research, Boston, MA), sangue completo humano citrado (Center for Blood Research, Boston, MA) ou soro de cynomolgus (Charles River Labs, Wilmington, MA) foram fortificadas com concentrações crescentes de ARC658 (SEQ ID NO: 62), do análogo com PEG 30K de ARC186 (SEQ ID NO: 4). Para activar o complemento, foi adicionado às amostras zimosano (Sigma, St. Louis, MO) numa suspensão 10X até uma concentração final de 5 mg/mL. Após uma incubação de 15 minutos a 37 °C, 91 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ removeram-se as partículas de zimosano por centrifugação e a extensão da activação do complemento foi determinada por ELISA para C5a e/ou para sC5b-9 (kit ELISA para C5b-9, Quidel, San Diego, CA; kit ELISA para C5a, BD Biosciences, San Diego, CA).

Na ausência de aptâmero, o tratamento com zimosano activa -50% de C5 no soro ou no sangue completo, comparativamente com ~1% de activação na amostra não tratada. A adição de aptâmero anti-C5 até 50 nM (-10% de concentração de C5 no sangue) teve pouco efeito sobre a formação de sC5b-9. Contudo, a titulação adicional de C5 com concentrações crescentes de ARC658 (SEQ ID NO:62) inibiu a activação de C5 de uma maneira dependente da dose como observado na Figura 16. No soro ou no sangue completo humanos, observou-se uma inibição quantitativa (-99%) a 0,8 - 1 μΜ de ARC658 (SEQ ID NO: 62), correspondendo a 2 equivalentes molares de aptâmero para C5. Foram necessárias concentrações superiores de aptâmero para atingir uma inibição comparável no soro de cynomolgus. Neste caso, foi conseguida 99% de inibição apenas na presença de 10 μΜ de aptâmero, ou -20 equivalentes molares de aptâmero para C5.

Exemplo ID: Modelo de laçada de tubagem de activação do complemento

Para testar a capacidade do aptâmero anti-C5 bloquear a activação do complemento induzida por exposição a materiais estranhos, como se encontra num circuito de bypass cardiopulmonar, utilizámos o modelo da laçada de tubagem descrito por Nilsson e colaboradores (Gong et al., (1996) Journal of Clinicai Immunology 16, 222-9; Nilsson et al., (1998) Blood 92, 1661-7). Tubagem médico/cirúrgica Tygon S-50-HL (1/4" de diâmetro interno) foi cortada em comprimentos de aproximadamente 300 mm (volume de aproximadamente 9 mL) e cheia com 5 mL de sangue de dadores humanos contendo 0,4 unidades/ml de heparina (Celsus) e várias concentrações de ARC658 (SEQ ID NO: 62) (0-5 μΜ) . Cada comprimento da tubagem

Tygon foi fechado numa laçada com um pedaço de tubagem de silicone, como descrito em Gong et al. As laçadas de tubagem foram submetidas a rotação durante 1 hora a aproximadamente 30 rpm num banho-maria a 37°C. O conteúdo das laçadas foi então vertido para tubos cónicos de polipropileno contendo EDTA (concentração final de 10 mM) para extinguir a 92 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ activação do complemento. Plasma pobre em plaquetas foi isolado por centrifugação e analisado quanto a C5a e C3a por ELISA (kit ELISA para C3a, Quidel, San Diego, CA; kit ELISA para C5a, BD Biosciences, San Diego, CA). A activação do complemento total na ausência de aptâmero foi pequena em comparação com o ensaio com zimosano. Tipicamente, os niveis de C5a aumentaram em aproximadamente 6 ng/mL após a incubação de 1 hora, correspondendo a activação <1% da C5 disponível. Não obstante, este aumento foi reprodutível e inibido por titulação com ARC658 (SEQ ID NO: 62) . Como mostrado na Figura 17, 300 - 400 nM de ARC658 (SEQ ID NO:62) foi suficiente para atingir 99% de inibição da activação de C5, um nivel que é aproximadamente equivalente ou ligeiramente inferior à concentração molar de C5 no sangue. Apesar de não desejar uma ligação a qualquer teoria, embora seja necessário menos aptâmero para obter 99% de inibição da activação de C5 neste modelo do que no modelo com zimosano, esta observação pode reflectir as diferenças substanciais no estimulo de activação do complemento utilizado nos dois ensaios. A geração de C3a foi também monitorizada como controlo para verificar que o ARC658 (SEQ ID NO:62) não bloqueou os passos de activação anteriores a C5 na cascata do complemento. Os níveis de C3a aumentaram aproximadamente 4000 ng/mL após a incubação de 1 hora, correspondendo a uma activação de cerca de 10% da C3 disponível. Ao contrário da geração de C5a, foi observada pouca inibição dependente da dose da geração de C3a após titulação com ARC658 (SEQ ID NO:62), demonstrando que o ARC658 (SEQ ID NO:62) bloqueia especificamente a clivagem de C5. EXEMPLO 2

Selecções e Sequências De Novo Selecção de C5 com banco dRmY

Foram realizadas duas selecções para identificar aptâmeros dRmY para proteína C5 humana de comprimento completo. A proteína C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA ou Advanced Research Technologies, San Diego, CA) foi utilizada na forma de comprimento completo ("FL") e parcialmente tripsinizada ("TP") e ambas as selecções foram selecções 93 ΕΡ 1 727 567/PT directas contra os alvos de proteína que tinham sido imobilizados numa placa hidrófoba. Ambas as selecções originaram bancos significativamente enriquecidos em ligação a C5 de comprimento completo versus um banco naive, não seleccionado. Todas as sequências mostradas neste exemplo estão apresentadas de 5' para 3'.

Preparação do Banco: Um molde de ADN com a sequência TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GGTCGATCGATCGATCATC GATG (ARC520; SEQ ID NO:70) foi sintetizado utilizando um sintetizador de ADN ABI EXPEDITE™, e desprotegido por métodos padrão. Os moldes foram amplificados com iniciador 5', TAATACGAC T CAC TATAGGGAGAGGAGAGAACGT T C TAC (SEQ ID NO:71), e iniciador 3', CATCGATGATCGATCGATCGACC (SEQ ID NO:72), e depois foram utilizados como molde para transcrição in vitro com mutante simples Y639F de ARN-polimerase de T7. As transcrições foram realizadas utilizando HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, Triton X-100 a 0,01%, PEG-8000 a 10%, MgCÍ2 9,5 mM, MnCÍ2 2,9 mM, os NTP 2 mM, GMP 2 mM, espermina 2 mM, pirofosfatase inorgânica a 0,01 unidades/μΐ, e mutante simples Y639F de Polimerase de T7.

Selecção: No ciclo 1, foi conduzido um passo de selecção positiva em colunas de ligação a filtro de nitrocelulose. Resumidamente, incubaram-se 1 X 1015 moléculas (0,5 nmol) de ARN do banco em 100 pL de tampão de ligação (DPBS IX) com 3 uM de C5 de comprimento completo ou 2,6 uM de C5 parcialmente tripsinizada, durante 1 hora á temperatura ambiente. Os complexos ARN:proteína e as moléculas de ARN livre foram separadas utilizando colunas de spin de nitrocelulose de 0,45 um de Schleicher & Schuell (Keene, NH) . As colunas foram pré-lavadas com 1 mL de DPBS IX, e depois as soluções contendo ARN:proteina foram adicionadas às colunas e centrifugadas numa centrífuga a 1500 g durante 2 min. Foram realizadas três lavagens com 1 mL de tampão para remover aglutinantes não específicos dos filtros, depois eluíram-se os complexos ARN:proteína ligados aos filtros duas vezes com lavagens com 200 μΐ de tampão de eluição (ureia 7 M, acetato de sódio 100 mM, EDTA 3 mM, pré-aquecido a 95°C) . O ARN eluído foi precipitado (2 pL de glicogénio, 1 volume de isopropanol, ^ volume de etanol) . O ARN foi submetido a transcrição inversa com o sistema ThermoScript RT-PCR™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) 94 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ de acordo com as instruções do fabricante, utilizando o iniciador 3' descrito acima, SEQ ID NO:72, seguida por amplificação por PCR (Tris 20 mM, pH 8,4, KC1 50 mM, MgCl2 2 mM, iniciadores SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72 0,5 uM, dNTP 0,5 mM cada, 0,05 unidades/yL de polimerase Taq (New England Biolabs, Beverly, MA) ) . Os moldes de PCR foram purificados utilizando colunas Centricep (Princeton Separations, Princeton, NJ) e utilizados para transcrever o banco do ciclo seguinte.

Em ciclos subsequentes de selecção, foi realizada a separação de ARN ligado e livre em placas hidrófobas Nunc Maxisorp (Nunc, Rochester, NY) . O ciclo foi iniciado por imobilização de 20 pmol tanto da C5 de comprimento completo como da C5 parcialmente tripsinizada na superfície da placa durante 1 hora à temperatura ambiente em 100 yL de DPBS IX. O sobrenadante foi então removido e os poços foram lavados 4 vezes com 120 yL de tampão de lavagem (DPBS IX). Os poços da proteína foram então bloqueados com um tampão DPBS IX contendo 0,1 mg/mL de ARNt de levedura e 0,1 mg/mL de ADN de esperma de salmão como competidores. A concentração utilizada do banco foi sempre em excesso de pelo menos cinco vezes relativamente à concentração de proteína. O ARN do banco de ARN foi também incubado durante 1 hora à temperatura ambiente em poços vazios para remover quaisquer sequências que se liguem ao plástico, e depois foi incubado num poço bloqueado sem proteina para remover do banco quaisquer sequências que se liguem aos competidores antes do passo de selecção positiva. O ARN do banco foi então incubado durante 1 hora à temperatura ambiente e o ARN ligado à C5 imobilizada foi submetido a transcrição inversa directamente na placa de selecção pela adição de mistura de RT (iniciador 3', SEQ ID NO: 72, e RT Thermoscript, Invitrogen) seguida por incubação a 65°C durante 1 hora. O ADNc resultante foi utilizado como molde para PCR (polimerase Taq, New England Biolabs). O ADN molde do banco amplificado foi dessalinizado com uma coluna Centrisep (Princeton Separations) de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante e foi utilizado para programar a transcrição do ARN do banco para o ciclo seguinte de selecção. O banco transcrito foi purificado em gel num gel de poliacrilamida a 10 % em cada ciclo. 95 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ A progressão da selecção foi monitorizada utilizando um ensaio de ligação ao filtro em sanduíche (dot blot) . 0 ARN do banco marcado a 5' com 32P (concentração vestigiária) foi incubado com C5, DPBS IX mais 0,1 mg/mL de ARNt e 0,1 mg/mL de ADN de esperma de salmão, durante 30 minutos à temperatura ambiente, e depois foi aplicado a uma sanduíche de filtros de nitrocelulose e de nylon num equipamento para dot blot (Schleicher and Schuell). A percentagem de ARN do banco ligado à nitrocelulose foi calculada e monitorizada aproximadamente a cada 3 ciclos com um rastreio de um único ponto (+/-300 nM de C5) . As medições de Kd do banco foram medidas utilizando uma titulação da proteína e o equipamento de dot blot como descrito acima.

Dados de selecção: Ambas as selecções foram enriquecidas após 10 ciclos relativamente ao banco naive. Veja-se a Figura 18. No ciclo 10, a Kd do banco era aproximadamente 115 nM para o comprimento completo e 150 nM para a selecção tripsinizada, mas a extensão de ligação era apenas de cerca de 10% no patamar em ambas. Os bancos R10 foram clonados utilizando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen) e sequenciados.

Informação sobre Sequências: Foram sequenciados 45 clones de cada banco. O banco de comprimento completo R10 foi dominado por um único clone de ARC913 (SEQ ID NO:75) que constituía 24% do banco, 2 séries de duplicados e sequências simples constituindo o restante. O banco tripsinizado R10 continha 8 cópias da mesma sequência de ARC913 (SEQ ID NO:75), mas o banco era dominado por outra sequência (AMX221.A7; 46%). O clone ARC913 (SEQ ID NO:75) tinha uma Kd de cerca de 140 nM e a extensão de ligação foi até 20%. Veja-se a Figura 19.

Cada sequência individual listada na Tabela 5 é apresentada no sentido de 5' para 3', e representa a sequência de ribonucleótidos do aptâmero que foi seleccionado sob as condições dRmY do SELEX™ proporcionadas. Nas concretizações da invenção derivadas desta selecção (e como reflectido na listagem de sequências) as purinas (A e G) são desoxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-OMe. A sequência listada na Tabela 5 pode ou não conter remates (e.g., um dT invertido a 3') . A sequência única do aptâmero abaixo começa no 96 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ nucleótido 23, imediatamente após a sequência fixa GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO 73), e segue até encontrar a sequência de ácido nucleico fixa a 3', GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG (SEQ ID NO 74).

Tabela 5: Sequência de nucleótidos do aptâmero dRmY para C5 ARC913 (SEQ ID NO: 75) gggagaggagagaacguucuaccuugguuuggcacaggcauacauacgcaggggucgaucgauc

GAUCAUCGAUG

Ensaio de hemólise: 0 efeito de ARC913 (SEQ ID NO:75) sobre a via clássica do sistema do complemento foi analisado utilizando um ensaio de hemólise previamente descrito, comparativamente com ARC186 (SEQ ID NO:4) (Aptâmero anti-C5, controlo positivo) e banco dRmY não seleccionado (controlo negativo). No ensaio de inibição hemolitica, uma solução de 0,2% de soro humano completo foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos com anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Test, Diamedix Corporation, Miami, FL) na presença de ARC913 titulado (SEQ ID NO:75). O ensaio foi realizado em solução salina tamponada com veronal contendo cálcio, magnésio e 1% de gelatina (tampão de complemento GVB++) e incubada durante 1 h a 25°C. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas. Foi lida a densidade óptica a 415 nm (DO415) do sobrenadante. A actividade de inibição da hemólise é expressa como % de actividade de hemólise comparativamente com o controlo. Veja-se a Figura 20. A IC50 do aptâmero foi calculada como sendo cerca de 30 nM. EXEMPLO 3

Optimização da Composição e da Sequência Exemplo 3A: Minimização de ARC913:

Seis construções baseadas em ARC913 (SEQ ID NO:75) foram transcritas, purificadas em gel e testadas em dot blots quanto à ligação a C5. O ARC954 foi similar ao clone progenitor com uma Kd de 130 nM e extensão de ligação a 20%, enquanto o ARC874 (SEQ ID NO:76) foi o único outro que se ligou a C5 com uma Kd de 1 uM. 97 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

As sequências individuais listadas na Tabela 6 estão apresentadas no sentido de 5' para 3' e foram derivadas de aptâmeros que foram seleccionados sob as condições dRmY do SELEX proporcionadas. Nas concretizações da invenção derivadas desta selecção (e como reflectido na listagem de sequências) as purinas (A e G) são desoxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-0Me. Cada uma das sequências listadas na Tabela 6 pode ou não conter remates (e.g., um dT invertido a 3').

Tabela 6. Sequências de nucleótidos de clones minimizados de ARC 913 ARC874 (SEQ ID NO:76)

CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG ARC875 (SEQ ID NO:77)

CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG ARC876 (SEQ ID NO:78)

GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC ARC877 (SEQ ID NO:79)

GGGUUUGGCACAGGCAUACAAACCC ARC878 (SEQ ID NO:80)

GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC ARC954 (SEQ ID NO:81)

CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG

Exemplo 3B: Optimização de ARC913: Re-selecção dopada

De modo a optimizar o clone ARC913 (SEQ ID NO:75) quanto a afinidade de ligação a C5 e a determinar os elementos de ligação chave, conduziu-se uma re-selecção dopada. As re-selecções dopadas são utilizadas para explorar os requisitos de sequência no interior de um clone ou minimero activo. As selecções são realizadas com um banco sintético degenerado que foi desenhado com base numa única sequência. O nível de degenerescência usualmente varia de 70% a 85% de nucleótido do tipo selvagem. Em geral, são observadas mutações neutras mas em alguns casos as alterações na sequência podem resultar em melhorias na afinidade. A informação sobre a sequência compósita pode então ser utilizada para identificar o motivo de ligação mínimo e auxiliar nos esforços de optimização. 98 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Preparação do banco: A sequência molde taatacgactcactataG GGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GTTACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO: 82) foi baseada em ARC913 (SEQ ID NO:75) e foi sintetizada com cada residuo originário da região aleatória dopado a um nivel de 15%, i.e. em cada posição aleatória ("N"), o residuo tem uma probabilidade de 85% de ser o nucleótido encontrado na sequência de tipo selvagem CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCG ATCG (SEQ ID NO: 83) e uma probabilidade de 15% de ser um dos outros três nucleótidos. 0 molde e o banco de ARN para a re-selecção dopada foram preparados essencialmente como descrito acima. Os moldes foram amplificados com os iniciadores taatacgactcactataGGGAGAG GAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO:84) e CATCGATGCTAGTCGTAAC (SEQ ID NO:85). Foram realizadas duas selecções com C5 de comprimento completo, uma selecção utilizando uma concentração superior de sal no passo de lavagem. 0 protocolo da selecção foi realizado como descrito acima, com duas excepções: 1) o ciclo 1 foi realizado em placas hidrófobas (assim como todos os ciclos subsequentes) com apenas um passo positivo; e 2) não foi utilizado nenhum competidor durante a selecção. A concentração de C5 e a concentração do banco de ARN foram mantidas constantes a 200 nM e luM, respectivamente.

Dados da re-selecção dopada. Ambas as selecções, a normal e alto teor de sal, foram enriquecidas após 5 ciclos relativamente ao banco naive. No ciclo 5 a Kd do banco era de aproximadamente 165 nM para a selecção com elevado teor de sal e de 175 nM para a selecção com teor de sal normal. A extensão da ligação era cerca de 20% no patamar em ambas. Os bancos R4 foram clonados utilizando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) , e foram sequenciados 48 clones de cada banco. 12 clones de cada banco foram transcritos e ensaiados num ensaio dot blot de ponto único a 500 nM de C5. As constantes de dissociação (Kd) foram novamente medidas utilizando o ensaio dot blot previamente descrito. As Kd foram estimadas para os 11 melhores clones identificados no rastreio de ponto único, ajustando os resultados à equação: fracção de ARN ligado = amplitude*Kd/(Kd + [C5] ) . Os clones com as três melhores Kd foram SEQ ID NO:91 (73 nM), SEQ ID NO:96 (84 nM) e SEQ ID NO: 95 (92 nM) . As sequências destes 11 clones estão apresentadas adiante na Tabela 7. 99 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

As sequências listadas na Tabela 7 estão apresentadas no sentido de 5' para 3' e representam as sequências de nucleótidos dos aptâmeros que foram seleccionados sob as condições dRmY do SELEX proporcionadas. Nas concretizações da invenção derivadas desta selecção (e como reflectido na listagem de sequências), as sequências correspondentes compreendendo as combinações dRmY de resíduos, como indicado no texto, em que as purinas (A e G) são desoxi e as pirimidinas (U e C) são 2'-0Me. Cada uma das sequências listadas na Tabela 7 pode ou não conter remates (e.g., um dT invertido a 3'). As sequências únicas de cada um dos aptâmeros adiante começa no nucleótido 23, imediatamente após a sequência fixa a 5', GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO:86), e segue até encontrar a sequência de ácido nucleico fixa a 3', GUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:87).

Tabela 7. Sequências de nucleótidos de clones da re-selecção dopada (SEQ ID NO:88)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCGGUU

ACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:89)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGUGUCGAUCUG

UUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:90)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAAAUACGCAGGGCUCGAUCGG

UUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:91)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCCCAGGCAUAUAUACGCAGGGAUUGAUCCG

UUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:92)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCGCAGGCAUACAUACGCAGGUCGAUCGGUU ACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:93)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGUUGUGGCACAGCCAACCCUACGCACGGAUCGCCCGG

UUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO:94)

GGGAGAGGAGAGAAC GUUCUAC CUUGGUUUGGC AC AGGC AUAC AUACGC AGGUC GAUC GGUU ACGACUA 100 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ (SEQ ID ΝΟ:95)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUAGGUUCGCACUGUCAUACAUACACACGGGCAAUCGGU

UACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID ΝΟ:96)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCNCAGGCAUANAUACGCACGGGUCGAUCGG

UUACGACUAGCAU (SEQ ID ΝΟ:97)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUUCUCUGCCACAAGCAUACCUUCGCGGGGUUCUAUUGG

UUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID ΝΟ:98)

GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGAUUGGCACAGGCAUAUAUACGCAGGGUCGAUCCGU

UACGACUAGCAUCGAUG

Exemplo 3C: Modificação de ARC186 com PEG ramificado de 40 kDa O oligonucleótido 5' NH2-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCG fCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T-3' (SEQ ID NO:63) foi sintetizado num sintetizador de ADN Expedite (ABI, Foster City, CA) de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante utilizando ARN 2'-OMe e ARN 2'-F e fosforamiditos de ARN protegidos com TBDMS padrão comercialmente disponíveis (Glen Research, Sterling, VA) e um suporte de CPG com desoxitimidina invertida. A função amina terminal foi ligada a um modificador de 5'-amino C6-TFA (Glen Research, Sterling, VA) . Após desprotecção, os oligonucleótidos foram purificados por cromatografia de permuta iónica em resina Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences) e precipitados com etanol. O aptâmero modificado com amina foi conjugado a diferentes porções de PEG após a sintese. 0 aptâmero foi dissolvido numa solução água/DMSO (1:1) até uma concentração entre 1,5 e 3 mM. Foi adicionado tampão de carbonato de sódio, pH 8,5, até uma concentração final de 100 mM, e o oligo foi feito reagir durante a noite com um excesso molar de 1,7 do reagente PEG desejado (e.g. ARC1905 de 40 kDa Sunbright GL2-400NP éster p-nitrofenilcarbonato [NOF Corp, Japão], ou ARC187 40 kDa mPEG2-éster NHS [Nektar, Huntsville AL]) dissolvido num volume igual de acetonitrilo. Os produtos resultantes foram purificados por cromatografia de permuta iónica em resina

Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences), e foram dessalinizados utilizando cromatografia de fase inversa realizada em resina 101 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Amberchrom CG300-S (Rohm and Haas), e liofilizados. A estrutura de ARC187 (SEQ ID NO:5) está apresentada na Figura 21 enquanto a estrutura de ARC1905 (SEQ ID NO:67) está mostrada na Figura 22. EXEMPLO 4

Modelo de Coração Isolado Perfundido

Exemplo 4A: Verificação do principio {"proof-of-principie") com ARC186 A concentração média da componente C5 do complemento no plasma humano é de aproximadamente 500 nM. Após exposição de corações de ratinho isolados perfundidos com tampão de Krebs Heinseleit a plasma humano a 6%, é activada a cascata do complemento humana, conduzindo à clivagem da C5 em C5a e C5b. A componente C5b subsequentemente forma um complexo com componentes do complemento C6, C7, C8 e C9 também conhecido como o "complexo de ataque da membrana" ("MAC" ou C5b-9) que danifica os vasos sanguineos do coração e miócitos cardiacos, desse modo conduzindo a disfunção do miocárdio (pressão diastólica final aumentada, arritmias) e assistolia (Evans et al., Molecular Immunology, 32, 1183-1195 (1995)). Previamente, anticorpos monoclonais e de cadeia única que bloqueiam a clivagem da C5 humana (Pexelizumab ou uma versão de scFv de cadeia simples de Pexelizumab) , foram testados neste modelo e mostrou-se que inibem os danos e a disfunção do miocárdio (Evans et al., 1995).

Este modelo foi utilizado para estabelecer que o aptâmero ARC186 que bloqueia C5 (SEQ ID NO:4), como o Pexeluzimab, inibia danos do complemento mediados por C5 humana em corações de ratinho isolados perfundidos. Os ratinhos C57 Bl/6 foram adquiridos ao Charles River Laboratories, (Wilmington, MA) . Resumidamente, após indução de anestesia profunda, cada coração de cada ratinho foi removido e montado numa agulha romba inserida na aorta, através da qual o coração foi continuamente perfundido com tampão de Krebs Heinseleit. Foi inserido um transdutor de pressão (Mouse Specifics, Boston, MA) no ventrículo esquerdo permitindo a medição contínua da frequência cardíaca e da pressão intraventricular. Após um período de 15 minutos de equilíbrio durante os quais se 102 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ fizeram medições da linha de base, os corações foram subsequentemente perfundidos com tampão e 6% de plasma humano +/- aptâmero em várias concentrações (Veja-se a Figura 23). Durante estes estudos, e como descrito em Evans et al., demonstrámos que os corações que foram perfundidos com tampão de Krebs Heinseleit + 6% de plasma humano experimentaram uma falha nos 5 minutos após a adição do plasma ao perfusato, enquanto os corações que foram continuamente perfundidos com tampão apenas continuaram a bater mais duas horas. Portanto, a extensão de cada experiência foi arbitrariamente definido como 15 minutos. O esboço deste estudo com ARC186 está apresentado na Figura 23. A pressão intraventricular foi monitorizada e registada continuamente resultando num traçado de onda de pressão (Figuras 24 e 25). O ponto de deflexão mais baixo representa a pressão diastólica final ("EDP") e o ponto de deflexão mais alto representa a pressão sistólica ("SP"). As ondas de pressão da linha de base surgem à esquerda da linha preta vertical marcada com "0" mostrada em cada traçado. Como anteriormente publicado (Evans et al., 1995), corações perfundidos com plasma humano a 6% experimentaram um rápido aumento na pressão diastólica final ventricular esquerda, ultimamente culminando em assistolia (o coração pára) em 5 minutos (Figura 24) . Quando foi adicionado aptâmero irrelevante ao plasma humano num excesso molar de 50 vezes, foram também observadas EDP aumentada e assistolia (Figura 24) .

Quando foi adicionado ARC186 ao sistema à equivalência molar, houve também um aumento precipitado na EDP, culminando em assistolia (Figura 25). Em todos os três grupos de corações que sofreram danos mediados pelo complemento, EDP aumentada e assistolia, o coração estava visivelmente edematoso e túrgido no final da experiência. Quando foi adicionado ARC186 a plasma num excesso molar de 10 vezes ou 50 vezes (Figura 25) , as ondas de pressão ventricular permaneceram normais e não foi observada assistolia. Em adição, o edema e a turgidez anteriormente descritos não foram evidentes nestes grupos.

Durante cada experiência, a frequência cardíaca foi registada a intervalos de 5 minutos, e a frequência cardíaca 103 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ média para ο grupo durante cada intervalo foi representada em gráfico. Como mostrado na Figura 26, os corações perfundidos sem aptâmero ou com aptâmero irrelevante desenvolveram assistolia rapidamente, usualmente em 5 minutos. O ARC186 adicionado ao sistema em equivalência molar retardou ligeiramente o inicio da assistolia. Os corações neste grupo ultimamente falharam, contudo. O ARC186 adicionado ao plasma num excesso molar de 10 vezes ou de 50 vezes preservaram a frequência cardiaca ao longo da duração de cada experiência. A percentagem de aumento do peso do coração relativamente à linha de base foi calculada para uma amostra representativa de corações que falharam (sem aptâmero ou com excesso molar de 50 vezes de aptâmero irrelevante) e foi comparada com corações protegidos com ARC186 (excesso molar de 10 vezes e de 50 vezes de ARC186). Como mostrado na Figura 27, os corações protegidos com ARC186 ganharam significativamente menos peso do que os corações que falharam nos grupos de controlo.

Como o ARC186 inibe a clivagem de C5 mas não de C3, os produtos da clivagem de C3 (C3a) , mas não os produtos da clivagem de C5 (C5a ou C5b) deverão ser encontrados no efluente que flui dos corações isolados protegidos por ARC186. Para directamente mostrar que o ARC186 inibiu a clivagem de C5 de plasma humano, os niveis relativos de proteínas do complemento C5a e C5b humanas (produtos da clivagem de C5) e de C3a (um produto da clivagem de C3) foram medidos no tampão efluente de vários grupos através de kits de ELISA comercialmente disponíveis (kit ELISA para C5b-9, Quidel, San Diego, CA; kit ELISA para C5a e C3a, BD Biosciences, San Diego, CA). O ARC186 inibiu a clivagem de C5 de plasma humano e a produção de C5a (Figura 28) e C5b-9 (Figura 29) de uma maneira dependente da dose. Pelo contrário, o ARC186 não teve efeito sobre a clivagem de C3 humana em C3a e C3b (Figura 30) demonstrando adicionalmente a especificidade da molécula para com C5.

Uma vez gerados, os fragmentos C3b e C5b do complemento são depositados localmente nos tecidos na vizinhança do local de activação do complemento. Depois de completas as experiências, os corações de ratinho foram congelados em meios OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), seccionados e depois 104 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ corados utilizando imuno-histoquímica padrão para a presença de C3b humana (clone Hll, Chemicon, Temecula, CA), C5b-9 humana (clone aEll, DAKO, Carpinteria, CA) ou IgG de ratinho de controlo (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . Os resultados do estudo estão apresentados na Figura 31.

Como descrito neste estudo, o aptâmero ARC186 que bloqueia C5 foi testado num modelo ex vivo de danos nos tecidos mediados pela componente do complemento C5 que utiliza corações de ratinho isolados perfundidos com tampão de Krebs Heinseleit e plasma humano heparinizado a 6%, com base num modelo descrito num estudo previamente publicado que testou os efeitos do anticorpo anti-C5, Pexeluzimab, no sistema do complemento (Evans, Molecular Immunol 32:1183, (1995).

Utilizando este modelo, foi demonstrado que o aptâmero que bloqueia C5 (a) inibiu a clivagem de C5 do plasma humano (mas não C3) , (b) inibiu a deposição de C5b humana (mas não de C3b) em tecido do coração de ratinho e (c) inibiu a disfunção do miocárdio mediada por C5b-9 humana em concentrações clinicamente relevantes (5 μΜ, um excesso molar de 10 vezes de aptâmero vs. C5). Estes dados mostram que quando a cascata do complemento humano é activada de uma maneira fisiologicamente relevante, os aptâmeros que bloqueiam C5 são capazes de inibir a clivagem de C5 plasmática e prevenir danos e disfunção do miocárdio.

Exemplo 4B: Eficácia do aptâmero PEGuilado 0 material e os métodos utilizados neste estudo foram exactamente os mesmos que se descreveram no Exemplo 4A acima. O desenho experimental e os resultados estão apresentados na Figura 32. Na primeira metade da experiência utilizou-se plasma humano heparinizado (Center for Blood Research, Harvard Medicai School, Boston, MA) como fonte de complemento e na segunda metade utilizou-se plasma de macaco cynomolgus heparinizado (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) como fonte de complemento. Um aptâmero PEGuilado (ARC658; SEQ ID NO:62) foi adicionado ao sistema em razões molares crescentes. Embora tenham sido recolhidos todos os traçados de pressão ventricular relevantes, a tabela lista a presença ou a ausência de um aumento na pressão diastólica final (EDP), e se 105 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ ocorreu ou não assistolia e o tempo até à falha do coração (definida como a presença de uma EDP elevada e assistolia).

Durante as experiências com plasma humano, determinou-se que a dose óptima de AR658 (SEQ ID NO: 62) era a equivalência molar (500 nM) enquanto durante as experiências com plasma de primata não humano, foi necessário um excesso molar de 50 vezes (25 μΜ) para proteger o coração de danos mediados por C5b (veja-se a Figura 32).

Estes dados são consistentes com a diferença na afinidade do aptâmero anti-C5 pela C5 humana vs. de primata não humano indicada pelos dados in vitro. Embora não desejando ligação a qualquer teoria, durante os nossos subsequentes estudos de FC/FD com macacos cynomolgus descritos no Exemplo 5, demonstrámos adicionalmente que era necessário um excesso molar de 30 vezes de aptâmero para inibir a clivagem de C5 mediada por zimosano, adicionalmente suportando a noção de que o aptâmero se liga a C5 de primata com menor afinidade do que a C5 humana.

Colectivamente, estes estudos indicam que ambos os aptâmeros que bloqueiam C5, ARC186 (SEQ ID NO: 4) e, em maior extensão, ARC658 (SEQ ID NO:62), são eficazes no modelo de coração de ratinho isolado, perfundido. Este modelo também demonstra que teve que ser utilizado significativamente mais ARC658 (SEQ ID NO:62) para inibir dos danos no coração mediados C5 de plasma de macaco cynomolgus (excesso molar de 30 + ) , comparativamente com dos danos no coração mediados por C5 humana (equivalência molar), adicionalmente suportando os dados in vitro que indicaram que o aptâmero tinha menor afinidade para com a C5 de primata. Finalmente, estes dados indicaram que os macacos cynomolgus necessitariam de doses para além de um excesso molar de 30 vezes para demonstrar in vivo o bloqueio de C5 durante os estudos de FC/FD. EXEMPLO 5

Metabolismo do Fármaco & Farmacocinética de Aptâmeros anti-C5 em Animais

Nos Exemplos 5A-5G, todos os dados de concentração à base de massa referem-se apenas ao peso molecular da porção 106 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ oligonucleotídica do aptâmero, independentemente da massa conferida pela conjugação com PEG.

Exemplo 5A: Estabilidade metabólica do inibidor de C5 ARC186 em plasma de primata e de rato 0 precursor oligonucleotidico não PEGuilado dos aptâmeros (i.e., ARC186; SEQ ID NO:4) foi testado em plasma de rato e de macaco cynomolgus (Charles River Labs, Wilmington, MA) para determinar a sua estabilidade, cinética de velocidade e vias de degradação. Os testes foram realizados utilizando aptâmero radiomarcado (32P) na extremidade 5' incubado a 37°C em plasma reunido a 95% (citrado) ao longo de 50 h. Em pontos de tempo seleccionados, colheram-se aliquotas de plasma contendo aptâmero, congelaram-se imediatamente em azoto liquido, e armazenaram-se a -80°C. A detecção e a análise do aptâmero e dos seus metabolitos no plasma foram realizadas utilizando extracção líquido-líquido (fenol-clorofórmio) seguida de electroforese em gel (num gel de sequenciação de poliacrilamida desnaturante a 10%) e autorradiografia de alta resolução. A Figura 33 mostra uma representação logarítmica linear da percentagem remanescente de aptâmero de comprimento completo em função do tempo de incubação em plasma de rato e de macaco cynomolgus. O perfil de degradação em ambas as espécies parece ser essencialmente monofásico, com uma constante de velocidade de aproximadamente k - 0,002 h_1.

Exemplo 5B: Farmacocinética de ARC657, ARC658 e ARC187 no rato após administração intravenosa

Para determinar o perfil farmacocinético de ARC657 (SEQ ID NO: 61) , ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID N0:5), e para estimar o nível e a frequência de dosagem necessários em primatas e em seres humanos, conduziu-se um estudo farmacocinético em ratos Sprague-Dawley cateterizados (Charles River Labs, Wilmington, MA) . Os aptâmeros foram formulados para injecção a 10 mg/mL (peso do oligo) em solução salina padrão e esterilizados por filtração (0,2 ym) para um frasco de dosagem pré-esterilizado sob condições assépticas. A via de administração utilizada para o estudo nos ratos foi um bolus 107 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ intravenoso por via da veia da cauda numa dose de 10 mg/kg. Os braços do estudo consistiram em 3 animais por grupo, dos quais foram recolhidas sangrias em série pré-dosagem e em pontos de tempo especificados ao longo de 48 horas. O desenho do estudo está esboçado na Figura 34. A amostras de sangue foram obtidas a partir dos cateteres cirurgicamente implantados na veia jugular, foram transferidas directamente para tubos revestidos com EDTA, misturadas por inversão, e colocadas em gelo até ao processamento para obter o plasma. O plasma foi recolhido por centrifugação de tubos de sangue-EDTA a 5000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante (plasma) foi transferido para um tubo fresco pré-rotulado. As amostras de plasma foram armazenadas a -80°C até ao momento da análise. A análise das amostras de plasma para o ARC187 foi realizada utilizando um formato de ensaio homogéneo utilizando a adição directa de aliquotas de plasma nos poços de ensaio contendo o reagente detecção de ácido nucleico fluorescente comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR) . Após um breve periodo de incubação (5 min) à temperatura ambiente, protegidas da luz, as placas de ensaio foram lidas num leitor de fluorescência para placas (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O sinal de fluorescência de cada poço era proporcional à concentração de aptâmero no poço, e as concentrações na amostra foram calculadas por interpolação dos valores de fluorescência de uma curva padrão de fluorescência-concentração (valores médios de curvas em duplicado ou triplicado). Foram obtidas as concentrações plasmáticas médias em cada ponto de tempo a partir dos três animais em cada grupo. Os dados de concentração plasmática versus tempo foram sujeitos a análise não compartimentada (NCA) utilizando o software de modelação farmacocinética padrão na indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA) . Foram obtidas estimativas para os seguintes parâmetros farmacocinéticos primários: concentração plasmática máxima, Cmax; área sob a curva de concentração-tempo, AUC; semivida terminal, ti/2; depuração terminal, Cl; e volume de distribuição em estado estacionário, Vss.

Os dados de concentração plasmática média versus tempo estão mostrados na Figura 35 e estão representados na Figura 36. Os dados de concentração versus tempo foram 108 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ sujeitos a análise não compartimentada (NCA) utilizando WinNonLin™ v.4.0. Esta análise originou os valores apresentados na Figura 37.

Como antecipado, o aptâmero de 40 kDa, ARC187 (SEQ ID NO:5), teve a semivida mais longa e o aptâmero de 20 kDa, ARC657 (SEQ ID NO: 61), a mais curta. A Vss observada relativamente ao volume de plasma conhecido (—40 mL/kg) sugeriu um grau moderado de ligação/sequestro de ARC187 (SEQ ID NO:5) a proteínas e/ou matriz de tecidos no espaço extravascular. Assumindo uma necessidade de manter um excesso molar de 5 vezes de aptâmero, os resultados deste estudo sugeriram que o ARC187 (SEQ ID NO:5) proporciona uma vantagem significativa em termos da frequência de dosagem e da quantidade total de aptâmero necessária para manter os niveis plasmáticos desejados.

Estudos prévios (dados não mostrados) em roedores e primatas com aptâmeros de composição similar mostraram proporcionalidade/linearidade com as doses para doses até 30 mg/kg, portanto não se antecipa que este nivel de dosagem vá resultar num comportamento farmacocinético não linear.

Exemplo 5C: Farmacocinética de ARC187 e ARC1905 no ratinho após administração intravenosa

Para determinar o perfil farmacocinético do esqueleto oligonucleotidico de ARC186 (SEQ ID NO:4) conjugado com um PEG ramificado de 40 kDa diferente do de ARC187 (SEQ ID NO:5), conduziu-se um estudo farmacocinético em ratinhos CD-I fêmeas (obtidos de Charles River Labs, Wilmington, MA) . Os aptâmeros foram formulados para injecção a 2,5 mg/mL (peso do oligo) em solução salina padrão e foram esterilizados por filtração (0,2 ym) para um frasco de dosagem pré-esterilizado sob condições assépticas. A via de administração utilizada para o estudo nos ratinhos foi um bolus intravenoso por via da veia da cauda numa dose de 10 mg/kg. Os braços do estudo consistiram em 3 animais por grupo, dos quais foram colhidas sangrias terminais pré-dose (i.e., o grupo de controlo não doseado) e em pontos de tempo especificados ao longo de 72 horas. O desenho do estudo está esboçado na Figura 38A. 109 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Obtiveram-se amostras de sangue por punctura cardíaca terminal, transferiram-se directamente para tubos revestidos com EDTA, misturaram-se por inversão e colocaram-se em gelo até ao processamento para obter o plasma. O plasma foi recolhido por centrifugação de tubos de sangue-EDTA a 5000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante (plasma) foi transferido para um tubo fresco pré-rotulado. As amostras de plasma foram armazenadas a -80°C até ao momento da análise. A análise das amostras de plasma para ARC187 e 1905 foi realizada utilizando um formato de ensaio homogéneo utilizando a adição directa de alíquotas de plasma aos poços de ensaio contendo o reagente de detecção de ácido nucleico fluorescente comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR) . Após um breve período de incubação (5 min) à temperatura ambiente, protegidas da luz, as placas de ensaio foram lidas num leitor de fluorescência para placas (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . O sinal de fluorescência de cada poços era proporcional à concentração de aptâmero no poço, e as concentrações na amostra foram calculadas por interpolação dos valores de fluorescência de uma curva padrão de fluorescência-concentração (valores médios de curvas em duplicado ou triplicado). Foram obtidas concentrações plasmáticas médias em cada ponto de tempo dos três animais em cada grupo. Os dados de concentração plasmática versus tempo foram sujeitos a análise não compartimentada (NCA) utilizando o software de modelação farmacocinética padrão na indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Foram obtidas estimativas para os seguintes parâmetros farmacocinéticos primários: concentração plasmática máxima, Cmax; área sob a curva de concentração-tempo, AUC; semivida terminal, ti/2; depuração terminal, Cl; e volume de distribuição em estado estacionário, Vss. Os dados de concentração plasmática média versus tempo estão representados na Figura 38B.

Os dados de concentração versus tempo foram sujeitos a análise não compartimentada (NCA) utilizando WinNonLin™ v.4.0. Esta análise originou os valores apresentados na Figura 38C. Como antecipado, os PEG de 40 kDa de ambos os fornecedores apresentaram equivalência farmacocinética em ratinhos. 110 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Exemplo 5D: Estudo de assimilação nos tecidos dos inibidores de C5, ARC657, ARC658 e ARC187, no ratinho, após administração de bolus intravenoso

Obtiveram-se ratinhos CD-I fêmeas de Charles River Labs (Wilmington, MA). A formulação de ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID N0:5) para injecção foi em solução salina a 5 mg/ml. As formulações de dosagem foram esterilizadas por filtração (0,2 ym) para frascos de dosagem pré-esterilizados sob condições assépticas e os animais receberam um bolus intravenoso por via da veia da cauda numa dose de 25 mg/kg. O estudo consistiu em grupos de 3 animais para cada um de quatro pontos de tempo, t= pré-dose, 3, 6, 12 h. Após a exsanguinação, a vasculatura de cada animal foi lavada extensamente (V~30 mL) com solução salina para remover qualquer sangue deixado na vasculatura. Os tecidos (coração, figado, rim) foram colhidos, pesados e depois homogeneizados a 50% p/v em solução salina padrão, e foram armazenados a -80°C até ao momento da análise. A análise dos tecidos para ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO: 62), e ARC187 (SEQ ID NO:5) foi realizada utilizando um ensaio do tipo ELISA à base de hibridação. Neste ensaio, uma sonda de captura biotinilada foi pré-imobilizada nos poços de uma microplaca de 96 poços a uma concentração na solução de ligação de 125 nM durante 3 h. Os poços da placa foram lavados 5 vezes com PBS IX. as placas foram então bloqueadas com 150 μΐ/poço de um SuperBlock IX em TBS (Pierce Chemical, Rockford, IL) . As placas foram lavadas novamente, cobertas e armazenadas a 4°C até à utilização. Em tubos separados, a(s) amostra(s) foram hibridadas num tampão contendo uma sonda de detecção da amostra marcada com FAM (5'— Fluoresceina) a 200 nM, a 90°C durante 10 min, e depois foram extintas em gelo. Padrões de concentração e amostras de controlo de plasma/tecido foram também pré-hibridados com soluções de sonda de detecção da amostra e depois pipetados para poços das placas de ensaio contendo sonda de captura com biotina imobilizada, e hibridadas a 45°C durante 2,5 h. As placas foram então novamente lavadas, e cheias com 100 μΐ/poço de uma solução contendo PBS IX contendo 1 yg/mL de anticorpo monoclonal anti-fluoresceina conjugado com peroxidase de rábano silvestre (MAb anti-FITC-HRP, Molecular Probes, Eugene, 111 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ OR) em PBS IX, e foram incubadas durante aproximadamente 1 h. As placas foram novamente lavadas como acima. Os poços das placas de ensaio foram então cheios com 100 μΐ de uma solução contendo um substrato de HRP fluorogénico (QuantaBlu, Pierce Chemical, Rockford, IL) , e incubaram-se durante 20-30 min protegidas da luz. Após 45 minutos de incubação, adicionaram-se 100 μΐ/poço de uma solução de paragem para extinguir a reacção de produção de precipitado fluorescente. As placas foram lidas imediatamente num leitor de fluorescência para microplacas (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) com excitação de fluorescência a 325 nm e emissão detectada a 420 nm. Cada poço foi lido 10 vezes. Todos os três aptâmeros eram detectáveis no tecido do coração nos três pontos de tempo (Figura 39).

Exemplo 5E: Farmacocinética e farmacodinâmica dos inibidores de C5, ARC657, ARC658 e ARC187, no macaco cynomolgus após administração intravenosa - estudo 1 A formulação de ARC657 (SEQ ID NO:61), ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) para injecção foi em solução salina padrão a 10 mg/mL e as formulações de dosagem foram esterilizadas por filtração (0,2 pm) para frascos de dosagem pré-esterilizados sob condições assépticas. A via de administração utilizada para o estudo com macacos foi um bolus intravenoso por via de um cateter cirurgicamente implantado na veia femoral numa dose de 30 mg/kg (excesso molar de aproximadamente 50 vezes). O desenho do estudo está esboçado na Figura 40. Amostras de sangue foram obtidas a partir dos cateteres na veia femoral, foram transferidas directamente para tubos revestidos com citrato de sódio, misturadas por inversão e colocadas em gelo até serem centrifugadas para separar o plasma (3000 rpm durante 5 minutos). O plasma foi então dividido em aliquotas de 250 μΐ que foram armazenadas a -80°C e foi avaliada uma aliquota de cada amostra quanto à concentração de aptâmero utilizando o ensaio á base de fluorescência Oligreen” previamente descrito na secção acima da FC no rato.

Os dados de concentração plasmática primária versus tempo estão apresentados na forma tabular na Figura 41. Como antecipado, o aptâmero ARC187 com PEG de 40 kDa (SEQ ID NO: 5) 112 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ persistiu no plasma durante o período de tempo mais longo enquanto o aptâmero ARC657 com PEG de 20 kDa (SEQ ID NO: 61) persistiu durante a menor quantidade de tempo. A inspecção dos dados mostrados na Figura 41 sugeriu que os dados se ajustariam melhor a um modelo de dois compartimentos. Assim, as estimativas dos parâmetros farmacocinéticos reportadas na Figura 42 foram derivadas do modelo de dois compartimentos utilizando o software de modelação farmacocinética padrão na indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA) .

Como mostrado na Figura 42, todos os aptâmeros tinham um valor de Cmax similar, entre 23 e 30 μΜ, indicando que a dose de aptâmero (30 mg/kg) era suficiente para atingir um excesso molar de 50 vezes de aptâmero no plasma vs concentração de C5 (excesso molar de 50 vezes, cerca de 25 μΜ). Embora difiram em 10 000 de peso molecular, o ARC657 (PEG de 20 kDa) (SEQ ID NO: 61) e o ARC658 (PEG de 30 kDa) (SEQ ID NO: 62) tinham valores similares de exposição (AUC) , ti/2 (a) e ti/2 (β) . Pelo contrário, o ARC187 (SEQ ID NO:5) teve valores de exposição (AUC) significativamente superiores, um ti/2 (a) prolongado e um 11/2 (β) ligeiramente mais longo do que as outras moléculas.

Alíquotas adicionais das amostras de plasma recolhidas durante o estudo farmacocinético foram subsequentemente analisadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio de C5 de primata. O ensaio de activação com zimosano foi realizado como descrito acima para determinar a quantidade de C5b-9 e C5a de primata, geradas, respectivamente. Os dados foram representados em gráfico em vários formatos diferentes incluindo concentração de C5b-9 versus tempo de amostragem (Figura 43 a) , concentração de C5b-9 versus concentração de aptâmero (Figura 43b), concentração de C5a versus tempo de amostragem (Figura 43c), e concentração de C5a versus concentração de aptâmero (Figura 43d). O aptâmero ARC187 com PEG de 40 kDa (SEQ ID NO: 5) inibiu a clivagem de C5 de primata (concentração de C5b-9 e C5a) durante o período de tempo mais longo (Figuras 35a e 35c) . Quando os dados de C5b-9 e C5a foram representados em gráfico versus a concentração de aptâmero, isto indicou que a concentração de aptâmero que bloqueia C5 tinha que exceder um 113 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ excesso molar de 30 vezes, independentemente da dimensão das moléculas de PEG, para que a clivagem de C5 fosse completamente inibida (Figuras 35b e 35d).

Em resumo, os dados do estudo FC/FD em macacos cynomolgus demonstram que (a) como antecipado, foi necessário um excesso molar de aptâmero de pelo menos 30 vezes (cerca de 15 μΜ de concentração plasmática de aptâmero) para inibir a clivagem de C5 in vivo no macaco cynomolgus, independentemente da dimensão do grupo PEG, (b) os aptâmeros que bloqueiam C5 não causaram toxicidade declarada nesta espécie, e (c) quando os animais receberam doses em niveis relativamente elevados (excesso molar de 50 vezes), os niveis plasmáticos de aptâmero estavam bem dentro da gama de ensaio apropriada durante o período de amostragem para permitir o cálculo de parâmetros farmacocinéticos

Exemplo 5F: Farmacocinética e farmacodinâmica dos inibidores de C5, ARC658 e ARC187, no macaco cynomolgus após administração intravenosa - estudo 2 0 estudo 2 foi de desenho similar ao estudo 1 descrito acima, com as seguintes excepções a) apenas dois compostos foram avaliados (ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5); b) o número de animais foi aumentado para quatro por grupo; e c) a amostra de plasma de 1 minuto foi eliminada e substituída por uma amostra de 144 horas para assegurar que o cálculo da semivida terminal era baseado em mais pontos de dados. A formulação e a dosagem destes dois aptâmeros, as técnicas de amostragem de sangue e isolamento do plasma foram idênticas aos métodos descritos acima no estudo 1. O desenho do estudo 2 está resumido na Figura 44.

Depois de completo o estudo 2, analisaram-se alíquotas de plasma como descrito no estudo 1 para determinar a) a concentração de aptâmero no plasma em vários pontos de tempo após administração intravenosa, e b) a eficácia do bloqueio de C5. A concentração plasmática de aptâmero foi representada em função do tempo (Figura 45) e os dados primários para ARC658 SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) estão apresentados em 114 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ forma tabular nas Figuras 39 e 40, respectivamente. O aptâmero ARC187 com PEG de 40 kDa (SEQ ID NO: 5) persistiu no plasma durante o período de tempo mais longo. A inspecção da Figura 45 indicou que os dados se ajustariam melhor a um modelo de dois compartimentos. Assim, as estimativas dos parâmetros farmacocinéticos reportadas na Figura 46 foram derivadas a partir do modelo de dois compartimentos utilizando WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).

Comparando os parâmetros farmacocinéticos gerados durante os estudos FC/FD, estudo 1 e estudo 2 anteriores, os dados para ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) foram similares com a excepção da medição de ti/2 (oí) para ARC187. Embora não desejando uma ligação a qualquer teoria, a discrepância nas medições de ti/2 (a) para ARC187 entre os dois estudos é provavelmente devida à pequena dimensão da amostra no estudo piloto.

Como demonstrado na Figura 4 6, os valores de Cmax foram similares para ARC658 (SEQ ID NO:62) e ARC187 (SEQ ID NO:5) . Pelo contrário, a exposição ao fármaco (AUC) foi significativamente superior em animais tratados com ARC187 (SEQ ID NO:5). Também, o ARC187 tinha valores de ti/2 (oí) e ti/2 (β) prolongados comparativamente com o ARC658 (SEQ ID NO:62). Estes dados, juntamente com os dados gerados durante o estudo 1 FC/FD indicam que os aptâmeros ARC187 que bloqueiam C5 podem proporcionar o bloqueio de C5 mais eficaz in vivo para uma determinada dose.

Alíquotas adicionais das amostras de plasma recolhidas durante o estudo farmacocinético foram subsequentemente analisadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio de C5 de primata. Como anteriormente, o ensaio de activação com zimosano foi realizado para determinar a quantidade de C5b-9 e C5a de primata, respectivamente, geradas. Os dados foram representados em gráfico como concentração de C5b-9 versus concentração de aptâmero (Figura 47) e concentração de C5a versus concentração de aptâmero (Figura 48) . Como demonstrado previamente durante o estudo 1 FC/FD, a concentração de aptâmero que bloqueia C5 tem que exceder um excesso molar de 30 vezes (concentração de aptâmero para C5 no plasma) , ou aproximadamente 15 μΜ, independentemente da dimensão da 115 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ molécula de PEG, para que a clivagem de C5 de primata seja completamente inibida (Figuras 41 e 42).

Inspeccionando os dados nas tabelas das Figuras 39 e 40, é evidente que após um bolus I.V. de 30-mg/kg, o ARC658 (SEQ ID NO:62) permanece acima de 15 μΜ durante aproximadamente 4 horas enquanto o ARC187 permanece acima de 15 μΜ durante aproximadamente 8 horas. Assim, dada uma dose similar de fármaco, o aptâmero ARC187 40 K proporciona eficácia clinica durante aproximadamente o dobro do tempo que o aptâmero ARC658 30K (SEQ ID NO:62).

Em resumo, os macacos cynomolgus têm que ser tratados com pelo menos um excesso molar de 30 vezes de aptâmero vs C5 plasmática para bloquear a conversão de C5 ín vivo. Estes dados são consistentes com estudos prévios in vitro (hemólise) e ex-vivo (coração de ratinho isolado e perfundido) que sugeriram que os aptâmeros que se ligam a C5 tinham uma menor afinidade para com C5 de primata versus C5 humana. Foi mostrado que os aptâmeros que bloqueiam C5 podem ser entregues com segurança sob a forma de um bolus intravenoso numa dose até 30 mg/kg, que é igual a aproximadamente um excesso molar de 50 vezes de concentração aptâmero vs de C5.

Exemplo 5G: Farmacocinética e farmacodinâmica do inibidor de C5, ARC187, no macaco cynomolgus, após administração de bolus e infusão IV

Os perfis farmacocinético (FC) e farmacodinâmico (FD) de ARC187 (SEQ ID NO:5) foram também avaliados em macacos cynomolgus após um bolus de carga intravenoso seguido imediatamente pela iniciação de uma infusão intravenosa. O desenho deste estudo está mostrado na Figura 49. A dose de bolus de carga e a taxa de infusão necessárias para atingir a concentração plasmática alvo em estado estacionário de 1 uM foram calculadas utilizando os parâmetros farmacocinéticos derivados do estudo de apenas bolus IV listados na Figura 50.

Um total de três macacos cynomolgus receberam a administração de um bolus IV de ARC187 a 1 mg/kg, seguida 116 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ imediatamente pela iniciação de uma infusão IV a uma taxa de 0,0013 mg/kg/min durante um período de 48 h. Amostras de sangue completo foram colhidas de 0 a 192 horas após o tratamento, armazenadas em gelo húmido, processadas para obter o plasma, e depois armazenadas congeladas a -80 C. A concentração de ARC187 nas amostras de plasma foi determinada utilizando um ensaio de coloração de ácido nucleico fluorescente (descrito no Exemplo 5B) e um ensaio de cromatografia líquida de alta resolução validada por BPL (em inglês GLP) (HPLC). O método de ensaio da HPLC para a determinação de ARC187 em plasma de macaco foi validado por ClinTrials Bio-Research (Montreal, Canadá). O estudo de validação cumpria os regulamentos de United States Food and Drug Administration (FDA) Good Laboratory Practice (GLP) (21 CFR §58) . O método de ensaio da HPLC foi validado em relação a: selectividade, linearidade, limite inferior de quantificação (LLOQ), redundância, precisão e exactidão intra-ensaio, precisão e exactidão inter-ensaios, estabilidade de soluções-mãe, estabilidade do meio de injecção, estabilidade da matriz de curto prazo, estabilidade na congelação-descongelação, estabilidade da matriz de longo prazo e integridade na diluição. A gama de concentrações de ensaio dinâmicas lineares utilizáveis foi determinada como sendo de 0,080 a 50,0 μΜ. O perfil FC medido de ARC187 sob estas condições estava em boa conformidade com o perfil calculado gerado utilizando os parâmetros FC de apenas bolus IV (veja-se a Figura 51) . A concentração plasmática alvo de 1 uM foi estabelecida em < 5 min após a dose e mantida durante toda a duração da infusão. Após cessação da infusão, o aptâmero apresentou uma semivida terminal de depuração, ti/2(P) ~ 40-60 h.

A actividade farmacodinâmica de ARC187 (SEQ ID NO:5) no macaco cynomolgus foi avaliada ex-vivo utilizando amostras de plasma recolhidas durante o estudo FC no ensaio de activação com zimosano previamente descrito com a modificação de que a amostra de plasma de cynomolgus foi diluída 10 vezes em plasma humano a 10% e depois foi tratada com 5 mg/mL de zimosano. A activação de C5, reflectida pelo surgimento do produto de clivagem C5a, foi medida por ELISA específico para C5a humana (kit ELISA para C5a, BD Biosciences, San Diego, CA). A 117 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ concentração de ARC187 activo em cada amostra foi então quantificada por comparação com uma curva padrão derivada dos ensaios com zimosano utilizando amostras preparadas com niveis conhecidos de ARC187 (veja-se a Figura 52). Este estudo indica que o ARC187 mantém a sua actividade anti-complemento ao longo de toda a duração de, e após, a infusão, em niveis substancialmente consistentes com o perfil farmacocinético descrito acima.

Exemplo 5H: Previsão da Necessidade de Dosagem Humana

As necessidades de dosagem humana para prevenção, melhoria ou tratamento de complicações relacionadas com cirurgia CABG são baseadas nos seguintes pressupostos: primeiro, os pacientes de CABG receberão administração de uma única dose de bolus intravenoso do aptâmero anti-C5 antes do inicio da cirurgia, seguida por infusão continua para estabelecer e manter uma concentração plasmática em estado estacionário de 1,5 μΜ durante 24-48 horas após a cirurgia CABG. As estimativas para a dose de bolus e para a taxa de infusão são baseadas em cálculos utilizando os parâmetros farmacocinéticos derivados dos estudos previamente descritos com apenas bolus IV e bolus mais infusão em macacos cynomolgus. A dose de bolus estimada de ARC187 é de 1 mg/kg, e a taxa de infusão associada é de 0,0013 mg/kg/min. Para este regime de bolus mais 48 h de infusão, as necessidades totais antecipadas de fármaco são de 0,4 g para o ARC187, onde a massa se refere a peso de oligonucleótido apenas (veja-se a coluna 7 na tabela da Figura 53) . A coluna 2 da tabela mostrada na Figura 53 refere-se ao peso do grupo PEG conjugado à porção oligonucleotidica de ARC187, a coluna três refere-se ao peso molecular da porção oligonucleotidica de ARC187 (e será o mesmo para todos os aptâmeros que compreendem ARC186 (SEQ ID NO:4) como sua sequência de oligonucleótidos), a coluna 4 refere-se ao peso molecular de PEG de 40 kDa conjugado a ARC186 (SEQ ID NO: 4) através de quimica de amina reactiva como descrito no Exemplo 3C acima, a coluna 5 refere-se à semivida na fase α de ARC187 num modelo de dois compartimentos, e a coluna seis refere-se à semivida na fase β de ARC187 num modelo de dois compartimentos. 118 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ EXEMPLO 6

Aptâmeros anti-C5 e Interacção Heparina/Protamina

Uma aplicação antecipada para o aptâmero anti-C5 é como profiláctico para utilização na prevenção ou mitigação de efeitos secundários inflamatórios associados a cirurgia de enxerto de bypass da artéria coronária (CABG). Elevadas concentrações do anticoagulante heparina (3-5 unidades/ml ou 1-2 μΜ) são tipicamente administradas durante a CABG para prevenir a trombose e manter o desimpedimento no interior dos componentes da bomba de bypass; a reversão do efeito da heparina após o procedimento, e o restabelecimento da hemóstase normal, são conseguidos pela administração de concentrações similarmente elevadas de protamina (~5 μΜ). Dados os potenciais perigos para os pacientes de gualguer interferência na eficácia de qualguer destes fármacos, foi necessário demonstrar que os aptâmeros anti-C5 (1) não alteram as actividades de nenhum dos fármacos e (2) não exibem efeitos inerentes sobre a hemóstase que possam complicar o tratamento de anticoagulação do paciente. A heparina é um polissacárido sulfatado com uma carga global negativa e uma massa molecular média de aproximadamente 15 kDa, que exerce um efeito inibitório sobre várias proteases na cascata da coagulação promovendo interacções com antitrombina. A protamina, um polipéptido altamente carregado positivamente, é capaz de bloquear a actividade da heparina por via de uma interacção pouco caracterizada que é, pelo menos parcialmente, de natureza electrostática. 0 núcleo funcional de ARC187 (SEQ ID N0:5), como a heparina, é altamente aniónico. Assim, é concebível que o ARC187 possa ligar-se não especificamente a locais de ligação da heparina ou protamina e interfira com as actividades destas moléculas. Os estudos seguintes investigaram as propriedades anticoagulantes inerentes (i.e., semelhantes a heparina) do ARC187, os efeitos do ARC187 sobre a função da heparina, os efeitos do ARC187 sobre a neutralização da heparina pela protamina, e os efeitos da protamina sobre as propriedades de inibição do complemento do ARC187. 119 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Exemplo 6Α: Efeitos in vitro de ARC187 sobre a coagulação

Os efeitos inerentes de ARC187 (SEQ ID NO:5) sobre a coagulabilidade do plasma foram investigados utilizando ensaios clínicos padrão dos braços extrínseco e intrínseco da cascata da coagulação, o tempo de protrombina (PT) e o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), respectivamente. Como mostrado na Figura 54, a titulação de plasma humano citrado com concentrações em grande excesso de doses projectadas (até 20 μΜ) não resultou em alteração no PT, e apenas resultou em apenas uma ligeira elevação no aPTT.

Para avaliar os efeitos in vitro de ARC187 sobre as funções da heparina e da protamina, colheu-se sangue de 3 indivíduos para 4-5 unidades/ml de heparina, doses associadas a níveis de heparina utilizados em cirurgia CABG. A coagulabilidade destas amostras foi avaliada utilizando o teste do tempo de coagulação activada (ACT), um teste de coagulação de sangue completo utilizado rotineiramente para monitorizar a actividade da heparina durante a cirurgia. Nestas concentrações de heparina, na ausência de outros aditivos, o ACT foi significativamente prolongado desde um valor de base de -150 segundos para -500 segundos na presença de 4 U/mL de heparina ou -800 segundos na presença de 5 U/mL de heparina. A adição de ARC187 10 μΜ a estas amostras teve pouco efeito sobre o tempo de coagulação, demonstrando que o ARC187 não interfere com a actividade anticoagulante da heparina. O efeito anticoagulante da heparina foi prontamente neutralizado por titulação com protamina até 6-8 μΜ (4 U/mL de heparina) ou 12 μΜ (5 U/mL de heparina) . Os valores de ACT na presença de heparina e as concentrações neutralizantes de protamina eram essencialmente indistinguíveis da linha de base. Como o núcleo de ácido nucleico de ARC187 (12 kDa) tem maior peso molecular do que a protamina (5 kDa), poderia esperar-se que concentrações equimolares de ARC187 adicionado à protamina pudessem ser suficientes para inverter completamente a actividade neutralizante da protamina.

Contudo, a pré-incubação de protamina com concentrações aproximadamente equivalentes de ARC187 teve pouco efeito sobre o ACT. As amostras de sangue contendo concentrações 120 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ neutralizantes de protamina exibiram valores de ACT similares na presença ou na ausência de ARC187 10 μΜ, indicando que o ARC187 tem apenas um efeito ligeiro, se algum, sobre a actividade pro-coagulante da protamina. Estes resultados estão resumidos na Figura 55.

Exemplo 6B: Efeitos in vivo de ARC187 sobre a coagulação

As interacções entre a função da heparina e da protamina durante a administração simultânea de aptâmero anti-C5 ARC187 (SEQ ID NO:5), para doses clinicas de heparina e doses clinicas/subclínicas/superclínicas de protamina, foram investigadas para determinar se a presença de concentrações plasmáticas subclinicas/superclinicas de ARC187 poderiam interferir com a inversão da anticoagulação da heparina pela protamina. Os resultados do estudo estão resumidos na Figura 56. Resumidamente, os valores de ACT na linha de base não foram afectados por 10 uM (i.e., excesso molar de 10 vezes a dose clinica) de ARC187 para todas as doses testadas de heparina. Similarmente, a extensão da anticoagulação por heparina não foi afectada por ARC187 10 uM. Na ausência de ARC187, a dose mínima eficaz de protamina era ~30% (dose clínica = 100%). Adicionalmente, a inversão da anticoagulação da heparina por protamina a 30% não foi afectada por um excesso molar de 10 vezes a dose clínica (i.e., 10 uM) de ARC187. Assim, a utilização de ARC187 para inibição do complemento num cenário clinico (e.g., CABG) não deverá ser afectada pela utilização simultânea de heparina e protamina em doses típicas.

Exemplo 6C: Efeito de heparina e protamina sobre a função anti-complemento do ARC187

Os efeitos da heparina e da protamina sobre a actividade anti-complemento do ARC187 (SEQ ID NO:5) foram examinados em amostras de sangue completo citrado activado com zimosano, como descrito no Exemplo 1. Imediatamente antes da activação com zimosano, o ARC187 foi titulado em amostras de sangue citrado tratado sob quatro condições: 1) sem tratamento (sem heparina nem protamina); 2) heparina a 4 U/mL; 3) protamina 6 μΜ; 4) heparina a 4 U/mL + protamina 6 μΜ. Após a activação com zimosano, a activação de C5 foi quantificada por medição 121 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ em ELISA da sC5b-9 no plasma (kit ELISA para C5b-9, Quidel, San Diego, CA) . Para cada condição, os resultados, expressos como percentagem de inibição da activação de C5 versus a concentração de ARC187, foram indistinguíveis dentro do erro (veja-se a Figura 57). Em todos os casos foi atingida a inibição completa com 1-2 μΜ de ARC187. Assim, a heparina e a protamina, separadamente ou combinadas em concentrações relevantes para a sua utilização em cirurgia CABG, não parecem afectar a actividade anti-complemento do ARC187.

Tendo a invenção sido agora descrita a titulo de descrição e exemplo, os peritos na especialidade reconhecerão que a invenção pode ser colocada em prática em variadas concretizações e que a descrição e os exemplos acima são para fins de ilustração e não de limitação das reivindicações que se seguem.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Archemix Corp., et al. <120> Aptâmeros Terapêuticos Úteis No Tratamento de Desordens Relacionadas Com o Complemento <130> 23239-576-061 <140> US2005/004606 <141> 2005-02-14 <150> 60/608,048 <151> 2004-09-07 <150> 60/581,685 <151> 2004-06-21 <150> 60/547,747 <151> 2004-02-25 <150> 60/544,542 <151> 2004-02-12 <160> 102 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <223> citosina nas posições 3, 4, 6 e 37 são 2'-fluoro 122 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc feature <223> uridina nas posições 9, 30 e 31 são 2'-fluoro <220> <221> misc feature <222> (D ." Γ (i) <223> n na posição 1 é citidina 2 f _ fluoro ou citidina 2'-O-metilo <220> <221> misc feature <222> (2) Γ(2) <223> n na posição 2 é guanosina 2' -OH ou guanosina 2' -O-metilo <220> <221> misc feature <222> (7) Γ(7) <223> n na posição 7 é guanosina 2' -OH ou guanosina 2' -O-metilo <220> <221> misc feature <222> (8) • (8) <223> n na posição 8 é guanosina 2' -OH ou guanosina 2' -O-metilo <220> <221> misc feature <222> (10)" • · (10) <223> n na posição 10 é citosina 2 ' -fluoro ou citidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (11)" • · dl) <223> n na posição 11 é uridina 2 f _ fluoro ou timidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (12)" • · (12) <223> n na posição 12 é citosina 2' -fluoro ou citidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (13)" • · (13) <223> n na posição 13 é adenosina 2 '-OH ou adenosina 2 '-O-metilo <220> <221> misc feature <222> (14)" • · (14) <223> n na posição 14 é guanosina 2 '-OH ou guanosina 2 '-O-metilo <220> <221> misc feature <222> (15)" • · (15) <223> n na posição 15 é guanosina 2 '-OH ou guanosina 2 '-O-metilo <220> <221> misc feature <222> (16)" • · (16) <223> n na posição 16 é citosina 2' -fluoro ou citidina desoxi 123 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc feature <222> (18)" • · (18) <223> η na posição 18 é citosina 2 '-fluoro ou citosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (19)" • · (19) <223> η na posição 19 é uridina 2' -fluoro ou uridina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (20)" .. (20) <223> η na posição 20 é guanosina 2'-OH ou guanosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (21)" • · (21) <223> n na posição 21 é adenosina 2'-OH ou adenosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (22)" .. (22) <223> n na posição 22 é guanosina 2'-OH ou guanosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (23)" .. (23) <223> n na posição 23 é uridina 2' -fluoro ou timidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (24)" • · (24) <223> n na posição 24 é citosina 2 '-fluoro ou citidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (25)" .. (25) <223> n na posição 25 é uridina 2' -fluoro ou timidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (26)" . . (26) <223> n na posição 26 é guanosina 2'-OH ou guanosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (27)" • · (27) <223> n na posição 27 é adenosina 2'-OH ou adenosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (28)" .. (28) <223> n na posição 28 é guanosina 2'-OH ou guanosina 2'-0-metilo <220> <221> misc feature <222> (29)" • · (29) <223> n na posição 29 é uridina 2' -fluoro ou timidina desoxi 124 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> mi sc feature <222> (32)" (32) <223> n na posição 32 <220> <221> mi sc feature <222> (33)" (33) <223> n na posição 33 <220> <221> misc feature <222> (34)" Γ. (34) . <223> n na posição 34 <220> <221> misc feature <222> (35)" Γ. (35) <223> n na posição 35 <220> <221> misc feature <222> (36)" Γ. (36) <223> n na posição 36 <220> <221> misc feature <222> (38)” Γ. (38) <223> n na posição 38 <400> 1 nnccgcnnun nnnnnngnnn é guanosina 2'-OH ou nnnnnnnnnu unnnnncn é adenosina 2'-OH ou adenosina 2'-0-metilo é citosina 2'-fluoro ou citidina desoxi é citosina 2'-fluoro ou citidina desoxi é uridina 2'-fluoro ou timidina desoxi é guanosina 2'-OH ou guanosina 2'-0-metilo guanosina 2'-0-metilo 38

<210> 2 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi, e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <400> 2 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 125 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<210> 3 <211> 42 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 3 gacgaugcgg ucucaugcgu cgagugugag uuuaccuucg uc 42

<210> 4 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 4 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 5 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 é uma modificada por um PEG ramificado de 40 kDa (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4'-butamida)) ligado ao nucleótido através de um ligante amina 126 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 5 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 6 <211> 44 <212> ARN <213> sequência . artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> mi sc feature <222> (D .7 (44) <223> todas as pirimidinas <400> 6 44 aggacgaugc ggucucaugc gucgagugug aguuuaccuu cguc

<210> 7 <211> 40 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 2, 7 e 19, em que a guanosina é 2'-OH, e nas posições 1 e 34, em que a adenosina é 2'-OH <400> 7 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 127 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <210> 8 <211> 40 <212> ARN <213> sequência . artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> mi sc feature <222> (D · · (40) <223> todas as pirimidinas <400> 8 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40

<210> 9 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16, 24, 33 e 34, em que a citidina é desoxi, e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 9 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39

<210> 10 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo, excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH 128 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro, excepto nas posições 10, 12, 16, 24, 33 e 34, em que a citidina é desoxi; nas posições I, 3, e 37, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições II, 23, e 25, que são timidina desoxi <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 10 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39

<210> 11 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo, excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 1, 3, 10, 12, 16, 24 e 37, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 11 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 12 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH 129 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 1, 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi, e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 12 cqccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 13 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 3, 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 13 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16, 24 e 37, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 14 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 130 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<210> 15 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16, e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 3, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 15 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 16 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 37, em que a citosina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 16 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 17 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 131 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 1, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 17 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 18 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; nas posições 1, 3 e 37, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 18 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH 132 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 4, 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 19 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 20 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 6, 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 20 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 21 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 4, 6, 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 21 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 133 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<210> 22 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16, 18 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 22 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 23 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 19, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 23 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 24 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 134 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas 12, 16, 18 e 24, em que a citidina é desoxi; e 11, 19, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 24 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 25 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas 23, 25 e 29, que são timidina desoxi <400> 25 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtu uaccugcg 38 <210> 26 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição adenosina é 2'-OH posições 5 e 32, em que a posições 10, nas posições posições 5 e 32, em que a posições 10, posições 11, posições 5 e 32, em que a 135 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ < 2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25 e 30, que são timidina desoxi <400> 26 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagut uaccugcg 38

<210> 27 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25 e 31, que são timidina desoxi <400> 27 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu taccugcg 38

<210> 28 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25, 29, 30 e 31, que são timidina desoxi <400> 28 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtt taccugcg 38 136 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<210> 29 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético < 2 2 0 > <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23, 25 e 35, que são timidina desoxi <400> 29 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uacctgcg 38

<210> 30 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16, 24, 33 e 34, em que a citidina é desoxi; na posição 9, em que a uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 30 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg

<210> 31 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 38 137 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 4, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 31 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 32 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 6, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 32 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 33 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH 138 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 4 e 6, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23, e 25, que são timidina desoxi <400> 33 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 34 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e na posição 18, em que a citosina é 2'-0-metilo <400> 34 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38

<210> 35 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e na posição 19, em que a uridina é 2'-O-metilo <400> 35 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 139 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<210> 36 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 18, em que a citosina é 2'-0-metilo; e na posição 19, em que a uridina é 2'-O-metilo <400> 36 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38

<210> 37 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 29, em que a uridina é 2'-O-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 37 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 38 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 140 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 30, em que a uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 38 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 39 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 31, em que a uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 39 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 40 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH 141 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; nas posições 29, 30 e 31, em que a uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 40 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 41 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; na posição 35, em que a uridina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 41 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 42 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto na posição 5, em que a guanosina é desoxi; na posição 17, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi 142 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <4 Ο Ο > 42 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 43 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto na posição 5, em que a guanosina é 2'-OH; na posição 17, em que a guanosina é desoxi; e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 43 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 44 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 32, em que a adenosina é desoxi <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 44 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38

<210> 45 <211> 40 <212> ADN <213> sequência artificial 143 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(40)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 6 e 18, em que a guanosina é 2'-OH; e posição 33, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 11, 13, 17 e 25, em que a citidina é desoxi; na posição 40, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 12, 24 e 26, que são timidina desoxi <400> 45 gcgucgcggu ctcagqcgcu gagtctgagu uuaccuacgc 40

<210> 46 <211> 38 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 32, em que a adenosina é desoxi <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 10, 12, 16 e 24, em que a citidina é desoxi; nas posições 36, 37 e 38 em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 11, 23 e 25, que são timidina desoxi <400> 46 gggcgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccuccc

<210> 47 <211> 40 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 38 144 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 6 e 18, em que a guanosina é 2'-OH; e posição 33, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 11, 13, 17 e 25, em que a citidina é desoxi; na posição 40, em que a citosina é 2'-0-metilo; e nas posições 12, 24 e 26, que são timidina desoxi <400> 47 gcgccgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccugcgc 40

<210> 48 <211> 45 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(44)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 8 e 20, em que a guanosina é 2'-OH; e posição 35 em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> timidina na posição 45 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 48 ggacgccgcg gucucaggcg cugagucuga guuuaccugc gucut 45

<210> 49 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 145 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 7 e

19, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 12, 14, 18, 26, 35 e 36, que são citidina desoxi; e nas posições 20, 41 e 42, em que a citosina é 2'-0-metilo <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as uridinas são 2'-fluoro; excepto na posição 21, em que a uridina é 2'-O-metilo; e nas posições 13, 25, 27, 31 e 37, que são timidina desoxi <400> 49 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tuuacctgcg cc 42

<210> 50 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 7 e 19, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 12, 14, 18, 26, 35, 36 e 39, que são citidina desoxi; e nas posições 3, 20, 41 e 42, em que a citosina é 2'-O-metilo <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridina na posição 11 é 2'-fluoro; uridina na posição 21 é 2' -O-metilo; as posições 13, 25, 27, 31, 32, 33 e 37 são timidina desoxi <400> 50 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42

<210> 51 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial 146 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(42)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 7 e 19, em que a guanosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(42) <223> citosina nas posições 5, 6, 8, 12, 14, 18, 26, 35, 36 e 39 são citidina desoxi; e a citosina nas posições 3, 20, 41 e 42 são 2'-O-metilo <220> <221> misc feature <222> (1).7(42) <223> uridina na posição 21 é 2'-0-metilo; as posições 11, 13, 25, 27, 31, 32, 33 e 37 são timidina desoxi <400> 51 ggcgccgcgg tctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42

<210> 52 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(42)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 7 e 19, em que a guanosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(42) <223> uridina nas posições 13, 21, 25 e 27 são 2'-0-metilo; as posições 11, 31, 32, 33 e 37 são timidina desoxi <220> <221> misc feature <222> (1).7(42) <223> citosina nas posições 5, 6, 8, 12, 18, 35, 36 e 39 são citidina desoxi; e a citosina nas posições 3, 14, 20, 26, 41 e 42 são 2'-O-metilo <400> 52 ggcgccgcgg tcucaggcgc ugagucugag tttacctgcg cc 42

<210> 53 <211> 40 <212> ARN <213> sequência artificial 147 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <2 2 Ο > <223> aptâmero sintético <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> adenosina na posição 1 tem biotina conjugada à extremidade 5' <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 3, 8 e 20, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 2, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 53 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40

<210> 54 <211> 42 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 7 e 19, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 12, 14, 18 e 26, que são citidina desoxi; e nas posições 41 e 42, em que a citosina é 2'-0-metilo <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as uridinas são 2'-fluoro; posições 13, 25, e 27 são timidina desoxi <400> 54 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag uuuaccugcg cc 42

<210> 55 <211> 42 <212> ARN <213> sequência artificial 148 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 7 e 19, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 34, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as citosinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 12, 14, 18, 26, 41 e 42, em que a citosina é 2'-O-metilo <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> todas as uridinas são 2'-fluoro; excepto nas posições 13, 25, e 27, em que a uridina é 2'-O-metilo <400> 55 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg cc 42

<210> 56 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)7. (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 56 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 57 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 149 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto na posição 18, em que a citosina é 2'-0-metilo; e na posição 19 em que a uridina é 2'-O-metilo <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (39)7. (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 57 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 58 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto na posição 29, que é timidina desoxi <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH; e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 58 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39

<210> 59 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 150 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto na posição 18, em que a citosina é 2'-0-metilo; e posição 19, em que a uridina é 2'-O-metilo <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 59 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 60 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-O-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro; excepto na posição 18, em que a citosina é 2'-O-metilo; na posição 19, em que a uridina é 2'-O-metilo; e na posição 29, que é timidina desoxi <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 60 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39

<210> 61 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 151 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <2 2 Ο > <223> aptâmero sintético <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um PEG de 20 kDa ligado ao nucleótido através de um ligante amina <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 61 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 62 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um PEG de 30 kDa ligado ao nucleótido através de um ligante amina <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1).7(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') 152 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <4Ο0> 62 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 63 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um ligante amina a 5' <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 63 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 64 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um PEG de 10 kDa ligado ao nucleótido através de um ligante amina <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro 153 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 64 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39

<210> 65 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um PEG de 40 kDa linear ligado ao nucleótido através de um ligante amina <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') <400> 65 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt

<210> 66 <211> 38 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 39 154 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc feature <222> (1).7(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um PEG de 20 kDa ligado ao nucleótido através de um ligante amina <220> <221> misc feature <222> (1).7(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> guanosina na posição 38 está modificada por um PEG de 20 kDa ligado ao nucleótido através de um ligante amina <400> 66 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38

<210> 67 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(1) <223> citosina na posição 1 está modificada por um PEG de 40 kDa ramificado (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoílo) ligado ao nucleótido através de um ligante amina <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> todas as pirimidinas são 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> todas as purinas são 2'-0-metilo; excepto nas posições 5 e 17, em que a guanosina é 2'-OH, e na posição 32, em que a adenosina é 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> timidina na posição 39 é uma timidina desoxi invertida em 3' (ligada 3'-3') 155 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <4Ο0> 67 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> <211> <212> <213> 68 46 ARN sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> <222> <223> misc feature (D .7(46) todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 68 ggcgauuacu gggacggacu cgcgauguga gcccagacga cucgcc 46 <210> <211> <212> <213> 69 40 ARN sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> <222> <223> misc feature (D .7(40) todas as pirimidinas são 2'-fluoro <400> 69 ggcuucugaa gauuauuucg cgaugugaac uccagacccc 40 <210> <211> <212> <213> 70 92 ADN sequência artificial <220> <223> molde sintético <220> <221> <222> <223> misc feature (40)7. (69) n pode ser qualquer nucleótido (a, c, g, ou t) <400> 70

Caatacgact cactataggg agaggagaga acgttctacn nnnnrmnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng gtcgatcgat cgatcatcga tg 92 <210> <211> <212> <213> 71 39 ADN sequência artificial <220> <223> iniciador sintético 156 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <4Ο0> 71 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39

<210> 72 <211> 23 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 72 catcgatgat cgatcgatcg acc 23

<210> 73 <211> 22 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> região fixa sintética <400> 73 gggagaggag agaacguucu ac 22

<210> 74 <211> 23 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> região fixa sintética <400> 74 ggucgaucga ucgaucaucg aug 23

<210> 75 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(75) pirimidinas 60 75 <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as são 2'-0-metilo <400> 75 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc gaucgaucau cgaug

<210> 76 <211> 32 <212> ADN <213> sequência artificial 157 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <2 2 Ο > <223> aptâmero sintético <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 76 ccuugguuug gcacaggcau acauacgcag gg 32

<210> 77 <211> 32 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 77 ccuugguuug gcacaggcau acaaacgcag gg 32

<210> 78 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 78 ggguuuggca caggcauaca uaccc 25

<210> 79 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo 158 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <4Ο0> 79 ggguuuggca caggcauaca aaccc 25

<210> 80 <211> 32 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(32) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 80 ggcggcacag gcauacauac gcaggggucg cc 32

<210> 81 <211> 47 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(47) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 81 cguucuaccu ugguuuggca caggcauaca uacgcagggg ucgaucg 47

<210> 82 <211> 88 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> molde sintético <220> <221> misc feature <222> (40)7.(69) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <400> 82 taataegact cactataggg agaggagaga acgttctacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng ttacgactag catcgatg 88

<210> 83 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial 159 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <223> molde sintético <400> 83 cttggtttgg cacaggcata catacgcagg ggtcgatcg 39

<210> 84 <211> 39 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 84 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39

<210> 85 <211> 19 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> iniciador sintético <400> 85 catcgatgct agtcgtaac 19

<210> 86 <211> 22 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> região fixa sintética <400> 8 6 gggagaggag agaacguucu ac 22

<210> 87 <211> 19 <212> ARN <213> sequência artificial <220> <223> região fixa sintética <400> 87 guuacgacua gcaucgaug 19

<210> 88 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético 160 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 88 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug_80

<210> 89 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 89 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggugucgauc 60 uguuacgacu agcaucgaug 80

<210> 90 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 90_ gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uaaauacgca gggcucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80

<210> 91 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo 161 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ < 4 Ο Ο > 91_ gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcccaggca aauauacgca gggauugauc 60 cguuacgacu agcaucgaug 80

<210> 92 <211> 78 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(78) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 92 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcgcaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 uuacgacuag caucgaug_78^

<210> 93 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 93 gggagaggag agaacguucu accuuguugu ggcacagcca acccuacgca cggaucgccc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80

<210> 94 <211> 69 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(69) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 94 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 69 uuacgacua 162 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

<210> 95 <211> 79 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(79) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 95_ gggagaggag agaacguucu accuuagguu cgcacuguca uacauacaca cgggcaaucg 60 guuacgacua gcaucgaug 79

<210> 96 <211> 75 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(75) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, u, c, ou g) <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, u, c, ou g) <400> 96 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcncaggca uanauacgca cgggucgauc 60 gguuacgacu agcau 75

<210> 97 <211> 80 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo 163 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ <4 Ο Ο> 97_ gggagaggag agaacguucu accuuucucu gccacaagca uaccuucgcg ggguucuauu 60 gguuacgacu agcaucgaug 80

<210> 98 <211> 79 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> aptâmero sintético <220> <221> misc feature <222> (1).7(79) <223> em que todas as purinas são desoxi, e todas as pirimidinas são 2'-0-metilo <400> 98 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uaaauacgca gggucgaucc_60 guuacgacua geaucgaug_79

<210> 99 <211> 93 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> molde sintético <220> <221> misc_feature <222> (25)7.(54) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <400> 99 60 93 60 92 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta <210> 100 <211> 92 <212> ADN <213> artificial <220> <223> molde sintético <220> <221> misc_feature <222> (24)7.(53) <223> n pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <400> 100 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 164 <210 > 101 <211> 92 <212> ADN <213> artificial <220> <223> molde sintético <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> η pode ser qualquer nucleótido (a, t, c, ou g) <400> 101 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 |gttçtctcct ctecctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 102 <211> 1676 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C5 sintética <400> 102

Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gin Glu Gin Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Vai Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gin Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Vai His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gin 65 70 75 80 Asn Ser Ala lie Leu Thr Ile Gin Pro Lys Gin Leu Pro Gly Gly Gin 85 90 95 Asn Pr o Vai Ser Tyr Vai Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Vai Tyr Thr Pro Asp Gin Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Vai Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr val 145 150 155 160 165 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Vai Asp Met Vai Glu Glu 165 170 175

Ile Asp His Ile Gly He Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190

Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205

Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Vai Lys Glu Tyr Vai Leu 210 215 220

Pro His Phe Ser Vai Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240

Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr He Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255

Asn Lys Vai Vai Thr Glu Ala Asp Vai Tyr He Thr Phe Gly He Arg 260 265 270

Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gin Lys Glu Met Met Gin Thr Ala Met Gin 275 280 285

Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly He Ala Gin Vai Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300

Thr Ala Vai Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320

Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Vai Thr Vai Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335

Ser Glu Glu Ala Glu He Pro Gly Ile Lys Tyr Vai Leu Ser Pro Tyr 340 345 350

Lys Leu Asn Leu Vai Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365

Tyr Pro He Lys Vai Gin Vai Lys Asp Ser Leu Asp Gin Leu Vai Gly 370 375 380

Gly Vai Pro Vai Thr Leu Asn Ala Gin Thr Ile Asp Vai Asn Gin Glu 385 390 395 400

Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Vai Thr Arg Vai Asp Asp Gly 405 410 415

Vai Ala Ser Phe Vai Leu Asn Leu Pro Ser Gly Vai Thr Vai Leu Glu 420 425 430 166 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Phe Asn val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gin Ala 4 35 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gin Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 4 65 470 475 480 His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe SOO 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gin Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro val Thr Gin Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gin Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gin Leu Gin Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gin Thr Val Ser Leu Asn Met 580 S8S 590 Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Vai Tyr Gly Val Gin Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gin Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 64 5 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gin Glu Asn Asp GlU Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gin Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685 167 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Lys Tyr Lys His Ser Vai Vai Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 695 700 Vai Asn Asn ASp Glu Thr Cys Glu Gin Arg Ala Ala Arg ile Ser Leu 705 710 715 720 Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser 725 730 735 Gin Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg Leu 740 745 750 His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765 Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val HiS Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780 Gin Leu Gin Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gin 785 790 795 800 Glv Vai Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cvs Val Ala Asp Thr val Lvs 805 810 815 Ala Lys Vai Phe Lys Asp Vai Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830 Vai Vai Arg Gly Glu Gin Ile Gin Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845 Arg Thr Ser Gly Met Gin Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860 Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp Hts Gin Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880 Ser Lys Cys Vai Arg Gin Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895 Thr Phe Thr Vai Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910 Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925 168

ΕΡ 1 727 567/PT

Vai Vai Pro Glu Gly val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Vai Lys Gly Leu Leu val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990

Ser Gin Glu Gly Ile Asn He Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005

Glu Ala 1010 Glu Leu Met Ser Val 1015 Val Pro Val Phe Tyr 1020 Val Phe His Tyr Leu 1025 Glu Thr Gly Asn His 1030 Trp Asn Ile Phe His 1035 Ser Asp Pro Leu Ile 1040 Glu Lys Gin Lys Leu 1045 Lys Lys Lys Leu Lys 1050 Glu Gly Met Leu Ser 1055 Ile Met Ser Tyr Arg 1060 Asn Ala Asp Tyr Ser 1065 Tyr Ser Val Trp Lys 1070 Gly Gly Ser Ala Ser 1075 Thr Trp Leu Thr Ala 1080 Phe Ala Leu Arg Val 1085 Leu Gly Gin Val Asn 1090 Lys Tyr Val Glu Gin 1095 Asn Gin Asn Ser Ile 1100 Cys Asn Ser Leu Leu 1105 Trp Leu Val Glu Asn 1110 Tyr Gin Leu Asp Asn 1115 Gly Ser Phe Lys Glu 1120 Asn Ser Gin Tyr Gin 1125 Pro Ile Lys Leu Gin 1130 Gly Thr Leu Pro Val 1135 Glu Ala Arg Glu Asn 1140 Ser Leu Tyr Leu Thr 1145 Ala Phe Thr Val Ile 1150 Gly Ile Arg Lys Ala 1155 Phe Asp Ile 169 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Cys Pro 1160 Leu Vai Lys Ile Asp 1165 Thr Ala Leu Ile Lys 1170 Ala Asp Asn Phe Leu 1175 Leu Glu Asn Thr Leu 1180 Pro Ala Gin Ser Thr 1185 Phe Thr Leu Ala Ile 1190 Ser Ala Tyr Ala Leu 1195 Ser Leu Gly Asp Lys 1200 Thr His Pro Gin Phe 1205 Arg Ser Ile Val Ser 1210 Ala Leu Lys Arg Glu 1215 Ala Leu Val Lys Gly 1220 Asn Pro Pro Ile Tyr 1225 Arg Phe Trp Lys Asp 1230 Asn Leu Gin His Lys 1235 Asp Ser Ser Val Pro 1240 Asn Thr Gly Thr Ala 1245 Arg Met val Glu Thr 1250 Thr Ala Tyr Ala Leu 1255 Leu Thr Ser Leu Asn 1260 Leu Lys Asp Ile Asn 1265 Tyr Vai Asn Pro Val 1270 Ile Lys Trp Leu Ser 1275 Glu Glu Gin Arg Tyr 1280 Gly Gly Gly Phe Tyr 1285 Ser Thr Gin Asp Thr 1290 Ile Asn Ala Ile Glu 1295 Gly Leu Thr Glu Tyr 1300 Ser Leu Leu val Lys 1305 Gin Leu Arg Leu Ser 1310 Met Asp Ile Asp Val 1315 Ser Tyr Lys His Lys 1320 Gly Ala Leu His Asn 1325 Tyr Lys Met Thr Asp 1330 Lys Asn Phe Leu Gly 1335 Arg Pro Val Glu Vai 1340 Leu Leu Asn Asp Asp 1345 Leu Ile Val Ser Thr 1350 Gly Phe Gly ser Gly 1355 Leu Ala Thr Val HÍS 1360 Val Thr Thr val Val 1365 His Lys Thr Ser Thr 1370 Ser Glu Glu Val Cys 1375 Ser Phe Tyr Leu Lys 1380 Ile Asp Thr Gin Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395 Tyr Lys 1400 Arg Ile Vai Ala Cys 1405 Ala Ser Tyr Lys Pro 1410 Ser Arg Glu Glu Ser 1415 Ser Ser Gly Ser Ser 1420 His Ala Val Met Asp 1425 Ile Ser Leu 170 ΕΡ 1 727 567/ΡΤ

Pro Thr 1430 Gly Ile Ser Ala Asn 1435 Glu Glu Asp Leu Lys 1440 Ala Leu Vai Glu Gly 1445 Vai Asp Gin Leu Phe 1450 Thr Asp Tyr Gin Ile 1455 Lys Asp Gly His Vai 1460 Ile Leu Gin Leu Asn 1465 Ser Ue Pro Ser Ser 1470 Asp Phe Leu Cys Vai 1475 Arg Phe Arg Ile Phe 1480 Glu Leu Phe Glu Vai 1485 Gly Phe Leu Ser Pro 1490 Ala Thr Phe Thr Vai 1495 Tyr Glu Tyr His Arg 1500 Pro Asp Lys Gin Cys 1505 Thr Met Phe Tyr Ser 1510 Thr Ser Asn Ile Lys 1515 Ile Gin Lys Vai Cys 1520 Glu Gly Ala Ala Cys 1525 Lys Cys Vai Glu Ala 1530 Asp Cys Gly Gin Met 1535 Gin Glu Glu Leu Asp 1540 Leu Thr Ue Ser Ala 1545 Glu Thr Arg Lys Gin 1550 Thr Ala Cys Lys Pro 1555 Glu Ile Ala Tyr Ala 1560 Tyr Lys Vai Ser Ile 1565 Thr Ser Ile Thr Vai 1570 Glu Asn Vai Phe Vai 1575 Lys Tyr Lys Ala Thr 1580 Leu Leu Asp Ile Tyr 1585 Lys Thr Gly Glu Ala 1590 Vai Ala Glu Lys Asp 1595 Ser Glu Ue Thr Phe 1600 Ile Lys Lys Vai Thr 1605 Cys Thr Asn Ala Glu 1610 Leu Vai Lys Gly Arg 1615 Gin Tyr Leu Ile Met 1620 Gly Lys Glu Ala Leu 1625 Gin Ile Lys Tyr Asn 1630 Phe Ser Phe Arg Tyr 1635 Ile Tyr Pro Leu Asp 1640 Ser Leu Thr Trp Ile 1645 Glu Tyr Trp Pro Arg 1650 Asp Thr Thr Cys Ser 1655 Ser Cys Gin Ala Phe 1660 Leu Ala Asn Leu Asp 1665 Glu Phe Ala Glu Asp 1670 Ile Phe Leu Asn Gly 1675 Cys

Lisboa 2013-10-03

Claims

ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado aptâmero/PEG possuindo a estrutura estabelecida adiante: O II H 20 kDa mPEG— 20 kDa mPEG—

O—c ΝΛΛΛΛΛ* 5’Aptâmero 3’ onde, j'wuvw indica um ligante Aptâmero= fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUrnGmAmGfUfU fUAfCfCfUmGfCmG-3T,_ em que fC e fU nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA= nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH.
2. Conjugado aptâmero/PEG da reivindicação 1, em que o ligante é um ligante alquilo que compreende 6 grupos CH2 consecutivos, um ligante alquilo compreendendo entre 2 e 18 grupos CH2 consecutivos, um ligante alquilo compreendendo entre 2 e 12 grupos CH2 consecutivos, ou um ligante alquilo compreendendo entre 3 e 6 grupos CH2 consecutivos.
3. Conjugado aptâmero/PEG da reivindicação 2, em que o conjugado aptâmero/PEG possui a estrutura estabelecida adiante: 20 kDa mPEG— 20 kDa mPEG—

O IIO—C-NH - q^O“5’Aptâmero 3’ onde Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCrnAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfU fU AfCfCfUmG fCmG-3T, em que fC e fU nucleótidos 2'-fluoro, e mG e mA= nucleótidos 2'-OMe e todos os outros nucleótidos são 2'-OH.
4. Composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado aptâmero/PEG de qualquer ΕΡ 1 727 567/PT 2/4 uma das reivindicações 1 a 3 ou um seu sal e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
5. Utilização do conjugado aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 no fabrico de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteina do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamifero.
6. Conjugado aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteina do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamifero.
7. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteina do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamifero, da reivindicação 6, em que o mamifero é um ser humano.
8. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteina do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero, da reivindicação 6, em que a doença é uma doença isquémica aguda, uma doença inflamatória aguda, ou uma doença inflamatória crónica ou imuno-mediada.
9. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero, da reivindicação 6, em que a doença é enfarte do miocárdio, icto, lesão por isquemia/reperfusão, doença infecciosa, septicemia, choque, rejeição de transplante agudo/hiperagudo, alergia, asma, artrite reumatóide ou outra doença reumatológica, esclerose múltipla ou outra doença neurológica, psoríase ou outra doença dermatológica, miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico (LES), rejeição de transplante subagudo/crónico ou glomerulonefrite ou outra doença renal.
10. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 3/4 prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero, da reivindicação 6, em que a doença é lesão do miocárdio relacionada com cirurgia de bypass da artéria coronária (CABG), lesão do miocárdio relacionada com angioplastia de balão ou lesão do miocárdio relacionada com restenose.
11. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero, da reivindicação 6, em que a doença a tratar é uma complicação mediada proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9, relacionada com cirurgia CABG.
12. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero, da reivindicação 6, em que o conjugado aptâmero/PEG é administrado peri-operatoriamente.
13. Utilização da reivindicação 5, ou conjugado aptâmero/PEG para utilização num método de tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença mediada por proteína do complemento C5, C5a e/ou C5b-9 num mamífero, da reivindicação 6, em que o conjugado aptâmero/PEG é administrado intravenosamente.
14. Método de diagnóstico compreendendo o contacto do conjugado aptâmero/PEG de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 com uma composição que se suspeita compreender proteína do complemento C5 ou uma sua variante, e a detecção da presença ou da ausência de proteína do complemento C5 ou de uma sua variante.
15. Método de diagnóstico da reivindicação 14, em que a proteína do complemento C5, ou sua variante, é uma proteína do complemento C5 humana ou sua variante. ΕΡ 1 727 567/ΡΤ 4/4
16. Conjugado aptâmero/PEG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização como diagnóstico in vitro.
17. Conjugado aptâmero/PEG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização como diagnóstico in vivo.
18. Conjugado aptâmero/PEG de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização no tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença in vivo. Lisboa, 2013-10-03