JP3143740B2 - ＨＩＶのＴａｔタンパク質に高い親和性を持つＲＮＡ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト免疫不全ウイ
ルスのトランス活性化タンパク質に対して高い親和性を
持つＲＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−
１）によってコードされる遺伝子の発現は、細胞性因子
と、ＨＩＶ−１の長末端反復（ＬＴＲ）に特定の調節要
素を有するウイルスのトランス活性化因子タンパク質Ｔ
ａｔとの相互作用によって調節される（Gaynor, 199
2)。ＨＩＶ−１の調節タンパク質Ｔａｔは、トランス活
性化応答領域（ＴＡＲ）と呼ばれる、ＬＴＲ領域の調節
要素の１つと結合する（Rosen ら，1985; Daytonら，19
86; Fisherら，1986)。この領域は、全てのウイルス転
写物の５’末端で転写開始部位のすぐ下流に位置してい
る(Berkhoutら，1989)。これ（ＴＡＲ）は、５９ヌクレ
オチド（ｎｔ）からなるＲＮＡ要素であり、これはＴａ
ｔのin vivo結合を可能とする安定したヘアピン構造を
形成するに足る最少モチーフである（Rosenら，1985; F
engおよびHolland, 1988; Jakobovitsら，1988)。ＴＡ
Ｒ ＲＮＡに結合した後、Ｔａｔは効果的に転写を刺激
する（Cullen, 1986; Peterlineら，1986; RiceおよびM
athews, 1988)。ＴＡＲ ＲＮＡの欠失研究は、いわゆ
るバルジ(bulge)残基がＴａｔへの特異的結合およびト
ランス活性化の両方にとって必須であること、他方ルー
プ配列はトランス活性化に必要であるがＴａｔのin viv
o結合には必須ではないこと、を明らかにした（Fengお
よびHolland, 1988; BerkhoutおよびJeang, 1989; Ding
wellら，1989; Cordinglyら，1990; Royら, 1990; Week
sら, 1990)。

【０００３】Ｔａｔは86アミノ酸からなる小さい、シス
テインに富んだ核タンパク質である。これは２つの主要
なドメイン、すなわちシステインに富んだ領域および高
度に塩基性の領域を持つ（Aryaら，1985; Sodroskiら，
1985)。システインに富んだ領域はこのタンパク質の機
能にとって必須であり（Garciaら，1988; Kubotaら，19
88)、そしてこの領域はＴａｔの金属結合二量体化を恐
らく媒介する金属結合ドメインを有する(Frankelら，19
88)。塩基性領域は、ＴＡＲ ＲＮＡへの特異的結合（W
eeksら，1990) および核の局在化(Dang およびLee, 198
9; Endoら，1989)に関与する。Ｔａｔは、それぞれの同
族体ＲＮＡを認識するためのアルギニンに富んだモチー
フを含むＲＮＡ結合タンパク質のファミリーに属する(L
azinskiら，1989)。アルギニンに富んだ領域を含む短い
ペプチドは、完全なタンパク質の特異性と類似の特異性
でＴＡＲ ＲＮＡに結合する(Weeksら，1990; Calnan
ら，1991a)。ｔａｔ遺伝子産物はＨＩＶ−１遺伝子のト
ランス活性化において重要な役割を果たすばかりでな
く、宿主細胞の増殖および代謝に種々の作用を及ぼす
（Ensoliら，1990, 1993)。さらに、Ｔａｔは現在ＨＩ
Ｖ−１の効率的な逆転写にとって重要であることが知ら
れている(Harrishら，1997)。

【０００４】ＴａｔによるＨＩＶゲノム発現のトランス
活性化の刺激に関する幾つかの研究にもかかわらず、Ｔ
ａｔが働く正確な分子作用機構はいまだにはっきりして
いない。哺乳動物細胞中でＴａｔによって誘導されるウ
イルスｍＲＮＡおよびタンパク質の合成速度は、対照速
度よりも100倍高いと推定された(HauberおよびCullen,
1988)。Ｔａｔは抗ターミネーターとして、転写におけ
る延長因子として、および転写開始のエンハンサーとし
て機能することが報告されている（総論については、Va
ishavおよびWong-Staal, 1991; Cullen, 1992; Jeang
ら，1993参照)。Ｔａｔの正確な機能については議論の
余地があるとしても、ＴａｔはＴＡＲ ＲＮＡに結合
後、転写複合体を改変するプロモーター特異的延長因子
として機能する、という合意に達したように思われる。
幾つかの初期の研究は、Ｔａｔによる転写の刺激には細
胞性転写因子とＴＡＲ ＲＮＡ配列の完全性の両方が必
須であると示した（総論については、Gaynor, 1992; Jo
nesおよびPeterlin, 1994参照）。しかし、転写複合体
の構成要素の組み立て(assembly)の順序は最近になるま
で不明であった。Ｔａｔが先ず転写因子に結合して、そ
の後ＴＡＲ ＲＮＡに結合するのか、またはＴａｔが最
初にＴＡＲ ＲＮＡに結合してその後転写因子に結合す
るのか、が初めは不明であった。Garcia-Martinezら(19
97)は、Ｔａｔタンパク質はプレ開始（preinitiation)
複合体においてＲＮＡポリメラーゼＩＩと会合し、次に
動けなくなったＲＮＡポリメラーゼＩＩがＴＡＲ ＲＮ
Ａを通過する間に複合体化ＴａｔはＴＡＲ ＲＮＡと結
合する、と示唆した。

【０００５】ＲＮＡ−タンパク質相互作用の最も興味を
そそるもののうちに、Ｔａｔ結合後のＴＡＲ ＲＮＡに
おけるコンホメーションの変化がある。コンホメーショ
ンの変更は、円二色性（ＣＤ）およびＮＭＲ研究によっ
て明確に観察された（TanおよびFrankel, 1992; Puglis
iら, 1992; Aboul-elaら，1995, 1996)。ＴＡＲＲＮＡ
のコンホメーションにおける類似の変化は、Ｔａｔペプ
チドを用いた場合ばかりでなく、アルギニン単独によっ
ても達成された。しかし、リジンを用いた場合、または
Ｔａｔに結合できなくしたＴＡＲの変異体を用いた場
合、コンホメーションの変化は何ら観察されなかった。
アルギニンの役割を知るために設計された試験におい
て、Ｔａｔ由来のペプチドおよびＴＡＲ ＲＮＡに特異
的に結合するアルギニンのホモポリマー、並びに中央に
１個のアルギニン残基を含むペプチドは、野性型トラン
ス活性化を再現するのに十分であった（Calnanら, 1991
a,b)。ＴＡＲ−アルギニン複合体に関するさらなるＮＭ
Ｒ研究は、ＴＡＲはアルギニンのための特異的結合部位
を有することを示唆した（Puglisiら，1992)。アルギニ
ンは１つの構造を誘導するように思われる。この構造に
おいては、三塩基バルジにおける重要な残基Ｕ２３が、
隣接するステム(stem)のＡ・Ｕ塩基対とフーグスティー
ン相互作用を行なう。このモデルは、ＴＡＲにおけるＵ
・Ａ・Ｕ結合を同形のＣ・Ｇ・Ｃ結合に置き換えること
によって支持される（Puglisiら，1993)。最近の修飾お
よび突然変異誘発実験もまた、フーグスティーン相互作
用がＴＡＲの構造にとって重大であるモデルを支持する
(Taoら，1997)。２つの異なる研究所由来の、（塩基対
とは別個の）塩基トリプル（triple)の形成に関するＴ
ＡＲ ＲＮＡのＮＭＲ研究の結果における食い違いにも
かかわらず、ＴＡＲ ＲＮＡの構造に関する一般的な意
見は、主溝におけるバルジＵのおおよその位置およびＴ
ＡＲ ＲＮＡにおける官能基の配向について一致してい
る。

【０００６】Ｔａｔタンパク質はＨＩＶ−１のライフサ
イクルおよびウイルス増殖において種々の機能を持つた
め、このタンパク質はＨＩＶに対する武器を開発する上
で重要かつ魅力的な標的である。過去において幾つかの
遺伝子的戦略が、ＨＩＶの増殖を抑制する試みにおいて
試験された。トランス優性タンパク質、一本鎖抗体、ア
ンチセンス分子、リボザイム、デコイ（decoy）（総論
については、Yuら，1994参照）、および誘導可能で毒性
の遺伝子産物を産生するためのＨＩＶのＬＴＲの使用の
全てがＨＩＶに感染した細胞において試験された（Harr
isonら，1992)。これらの戦略の組み合わせ（例えば、
リボザイムとデコイ）もまた検討された（Yuyamaら，19
94; Yamadaら，1996)。このような治療的分子の発現お
よび調節はin vivoでは可能であるかもしれないが、そ
れらの構成性発現は細胞毒性または宿主による操作され
た細胞への免疫応答をもたらしうる。この問題は、毒素
および自殺遺伝子の場合に特に重大である。ＨＩＶ感染
に対するＲＮＡに基づく種々の方法のうち、デコイ戦略
は短いアンチセンスＲＮＡおよびリボザイム等の他のＲ
ＮＡインヒビターの使用に較べ可能性として有利な点を
持っている。なぜなら、逸脱突然変異体（escape mutan
t)の発生はより頻度が低いかもしれない；デコイへの結
合を阻止するＴａｔまたはＲｅｖ（ＨＩＶ−１タンパク
質）における変更もまた、天然の要素（例えばＲＲＥ、
すなわちＲｅｖ応答性要素、およびＴＡＲ配列）への結
合を阻止すると考えられるからである。ＲＲＥおよびＴ
ＡＲＲＮＡの両方がデコイとして利用され、そしてこれ
らのデコイは細胞培養物中でＨＩＶの複製を８０％〜９
７％阻害した（GrahamおよびMaio, 1990; Sullengerら,
1990; Lisziewiczら，1993)。

【０００７】デコイは他の分子（アンチセンスＲＮＡお
よびリボザイム等）よりもはるかに効率的なインヒビタ
ーとして作用するかもしれないが（ナノモル範囲以下の
Ｋ_i値の可能性を持って）、もしデコイが細胞性因子を
封鎖するものであるならば、特に、デコイＲＮＡがたま
たま細胞性タンパク質と相互作用できる領域を含む場合
は、デコイは細胞に対して毒性でありうる。幾つかの以
前の研究が、ＴＲＰ−１８５（Wu-Bearら，1995)、Ｔａ
ｔ−ＳＦ１（ZhouおよびSharp, 1996)、ポリメラーゼＩ
Ｉ（Wu-Bearら，1995, 1996) およびその他(Sheline
ら，1991; RounsevilleおよびKumar, 1992; Gatignol
ら，1991) 等の細胞性因子がＴＡＲ ＲＮＡに効率的に
結合することを示した。これらの研究にもかかわらず、
宿主細胞の細胞機能に及ぼすＴＡＲ ＲＮＡの効果は、
in vitroにおいてもin vivoにおいても詳しく分析され
ていない。また、これらの天然のTAR RNAよりも、HIV-1
のTatタンパク質に対する親和性および特異性が高いデ
コイ配列は知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、HI
VのTatタンパク質に対して、特異的にかつ高い親和性で
結合することができるRNAを提供することを目的とす
る。また、本発明は、そのようなRNAの利用方法を提供
することも目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明者らは、鋭意努力した結果、HIVのTatタン
パク質に対して、特異的にかつ高い親和性で結合するこ
とができるRNAを合成することに成功し、本発明を完成
させるに至った。すなわち、本発明は、下記の二次構造
(I)を持つヌクレオチド配列を含み、HIVのTatタンパク
質と結合することができるRNAを提供する。

【００１０】 （構造中、N^1aおよびN^1bは相補的塩基対形成が可能な少
なくとも２対の核酸塩基であり、N^2aおよびN^2bは相補的
塩基対形成が可能な１対の核酸塩基であり、N³およびN⁴
はそれぞれ独立に１または２個の任意の核酸塩基であ
り、N^5aおよびN^5bは相補的塩基対形成が可能な１対の核
酸塩基であり、N^6aおよびN^6bは相補的塩基対形成が可能
な少なくとも１対の核酸塩基であり、N⁷は１〜５個の任
意の核酸塩基であるか、あるいは、N⁷は存在しなくとも
よく、N⁷が存在しないときには、このRNAは二本鎖とな
り、N^6aおよびN^6bは相補的塩基対形成が可能な少なくと
も２対の核酸塩基であり、実線は核酸塩基間の水素結合
を表す。）

【００１１】ここで、「相補的塩基対形成」とは、核酸
の塩基がアデニンとウラシル、グアニンとシトシンの間
で水素結合により対合することをいう。相補的塩基対形
成が可能な核酸塩基対としては、アデニンとウラシル、
グアニンとシトシンの組み合わせを挙げることができ
る。HIV としては、HIV-1 およびHIV-2 が知られている
が、本発明のRNAは特にHIV-1とよく結合する。本発明の
RNAは、下記の二次構造(II)を持つヌクレオチド配列か
らなる天然のTAR RNAよりも高い親和性および／または
特異性で、HIVのTatタンパク質と結合することができる
とよい。

【００１２】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）な
お、HIVのTatタンパク質との親和性および特異性は、そ
れぞれ、後述のGel-shift competitive binding assay
およびTranscription assay で測定することができる。
本発明のRNAの一例として、下記の二次構造(III)を持つ
ヌクレオチド配列を含むRNAを挙げることができる。

【００１３】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）本発
明のRNAの別の一例として、下記の二次構造(IV)を持つ
二本鎖のヌクレオチド配列を含むRNAを挙げることがで
きる。

【００１４】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）本発
明のRNAのまた別の一例として、下記の二次構造(V)を持
つヌクレオチド配列からなる請求項１記載のRNAを挙げ
ることができる。

【００１５】 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）

【００１６】また、本発明は、上記のRNAを含む医薬組
成物を提供する。この医薬組成物により、ヒト免疫不全
ウイルスの転写を阻害することができる。従って、この
医薬組成物をヒト免疫不全ウイルスに対する抗ウイルス
剤として用い、ヒト免疫不全ウイルスが関与する疾病を
予防および／または治療することができる。また、本発
明の医薬組成物を用いてヒト免疫不全ウイルスが関与す
る疾病を診断することもできる。さらにまた、本発明
は、上記のRNAを用いて、ヒト免疫不全ウイルスの転写
を阻害する方法を提供する。この方法を実施するにあた
っては、ヒト免疫不全ウイルスを含む細胞に上記のRNA
を導入すればよい。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のRNAは、上記の二次構造(I) を持つヌクレオチ
ド配列を含む。このようなRNAは、図１に概略を示した
以下の方法で作製することができる。プライマー１とプ
ライマー２の結合部位にはさまれ、かつ120ヌクレオチ
ドの長さのランダムな配列を持つRNAプールとTatタンパ
ク質を試験管内で混合する。これをニトロセルロース膜
で濾過し、膜上に残ったTatタンパク質とRNAの複合体を
回収する。複合体からRNAを溶離後、逆転写反応によりc
DNAを合成する。さらにPCRでcDNAを増幅し、続いて試験
管内転写反応によりRNAを作る。以上の操作を５〜10回
繰り返すことで、Tatタンパク質に特異的に強く結合す
るRNAのみを得ることができる。

【００１８】上記のようにして得られたRNAとHIV(例え
ば、HIV-1)のTatタンパク質との結合活性は、以下のよ
うにして測定することができる。³²P標識したRNAとTat
タンパク質を１対１の割合で試験管内で混ぜた後、ニト
ロセルロース膜で濾過後、膜をよく洗浄後、膜上に残っ
た³²P量を測定する。残存RNA量／使用RNA量（％）を結
合活性（％）とする。本発明のRNAは、上記の二次構造
(II)を持つヌクレオチド配列からなる天然のTAR RNAよ
りも、HIV(例えば、HIV-1)のTatタンパク質に対する高
い結合親和性を有するが、HIV-1 のTatタンパク質に対
する結合親和性は、以下のようにして測定することがで
きる。

【００１９】³²P標識したRNA（III)（又はRNA(IV))と標
識していない天然TAR RNA(II) を１対１で混ぜる。そこ
へ、RNA(III)（又はRNA(IV))とTAR RNAの濃度比１：１
から１：200 までの種々の混液を加える。更にTatタン
パク質の結合領域に相当するペプチド(RE)を一定量加
え、30℃ 12時間保温後ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で、RNAとRNAペプチド複合体を分離し、複合体の割合
を出す。タテ軸にこの複合体の割合をヨコ軸にTAR RNA
／RNA(III)の比率をとったグラフを描き、50％複合体を
形成する時の比率から特異性を算出する。

【００２０】さらに、本発明のRNAは、上記の二次構造
(II)を持つヌクレオチド配列からなる天然のTAR RNAよ
りも、HIV(例えば、HIV-1)のTatタンパク質に対する特
異性が高いが、HIV-1 のTatタンパク質に対する特異性
は、以下のようにして測定することができる。HeLa細胞
核抽出物中で、サイトメガロウイルス(CMV)DNAを鋳型に
CMVプロモーターからの転写を行う（364 ヌクレオチ
ド）。この時同時に、TAR RNA又はRNA（III)（又はRNA
(IV))を添加し、転写産物の量を比較する。本発明のRNA
はHIV(例えば、HIV-1)の転写阻害活性を有するが、HIV-
1の転写阻害活性は以下のようにして測定することがで
きる。HIV-1 LTRをゲノム中に組み込んだHeLa細胞に、
プロモーター下流に本RNA遺伝子を持つプラスミド１とT
atタンパク質を発現するプラスミド２を同時にトランス
フェクトし、LTRの下流に組み込んであるルシフェレー
スの発現量を測定することにより、転写阻害活性を測定
する。

【００２１】HIVを含む細胞に本発明のRNAを導入するこ
とにより、該細胞中のHIVの転写を阻害することができ
る。例えば、本発明のRNAをリポソームに封入し、これ
を生体に投与して、HIVを含む細胞内に取り込ませるこ
とにより、HIVの転写を阻害することができる。このよ
うな方法については、"Lipidic vector systems for ge
ne transfer"(1997) R. J. Lee and L. Huang Crit. R
ev. Ther. Drug CarrierSyst 14, 173-206.に記載され
ている。また、本発明のRNAをコードするDNAをウイルス
などのベクターに組み込んで、HIVを含む細胞内に導入
し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のRNA
を産生させることにより、HIVの転写を阻害することも
できる。このような方法については、"Viral vectors i
n gene therapy"(1997) A. E. Smith Annu. Rev. Mic
robiol 49, 807-838. に記載されている。これらの方法
の詳細およびこれらの方法に用いられる材料は、遺伝子
治療の分野で知られており、それらを本発明においても
用いることができる。

【００２２】HIVの転写を阻害することにより、HIVが関
与する疾病を予防および／または治療することができ
る。HIVが関与する疾病としては、後天性免疫不全症候
群(AIDS)を挙げることができる。投与は、疾病の状態の
重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認めら
れるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの
期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよ
い。また、本発明のRNAを用いて、HIVが関与する疾病を
診断することができる。本発明のRNAを抗体の代わりに
利用することができる。本発明のRNAを蛍光などで標識
しておき、HIVに感染している細胞の抽出液又は細胞を
つぶした物と混ぜ、ニトロセルロース膜で濾過する。HI
V由来のTatタンパク質が細胞内に存在すれば、膜上にト
ラップされ、検出できる。

【００２３】

〔実施例１〕

Ｔａｔタンパク質に高い親和性を持つＲＮＡアプタマー
(aptamer)の単離（図１） ＨＩＶ−１のＴＡＲ ＲＮＡは細胞中で幾つかの細胞性
因子と結合する。上に観察されるような非関連遺伝子の
転写に及ぼすその阻害効果を考えると、真のＴＡＲ Ｒ
ＮＡはＴａｔの最も適切なアンタゴニストおよび特異的
インヒビターではないかもしれない。Ｔａｔに特異的
に、かつ高い親和性で結合するＲＮＡモチーフを単離す
るため、本発明者らは120 nt (120 N)の大きいランダム
コア配列を有するＲＮＡ分子のプールを用いた、in vit
ro遺伝子選択のための戦略を利用した。

【００２４】第１の選択サイクルでは、約10¹⁴個のＲＮ
Ａ配列をＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質に、タンパク質
のＲＮＡに対するモル比を１：１０として、結合緩衝液
中で結合させた。以後のサイクルにおいては、選択のス
トリンジェンシーを増大させるため、ＴａｔとＲＮＡ
〔上記120 N プール、特異的競合体（ＴＡＲ ＲＮＡ、
またはＴａｔへの約５％の結合能を有する、12〜18 nt
のランダムコア領域を持つ選択されたプールＲＮＡ）お
よび非特異的競合体、すなわちｔＲＮＡ〕のモル比を操
作した（表１）。２サイクルの各セットの選択が済むた
びに、Ｔａｔへの結合を調べるフィルター結合アッセイ
によりＲＮＡプールを分析した。サイクルが進むにつ
れ、Ｔａｔに結合した特異的ＲＮＡアプタマーのレベル
はプール中で１％から９％に増加した。120 N プール中
の10¹⁴個の変異体は、可能性のある変異体（10⁷²）の全
範囲を包含することはできなかったので、第９サイクル
の後に突然変異誘発ＰＣＲを導入して機能性分子の多様
性を増大させた。しかし、突然変異誘発ＰＣＲの導入に
より、プール中の結合種の数は恐らく重要な残基の突然
変異の数として減少した。したがって、本発明者らは配
列分析のため第９および第11サイクル由来の産物をクロ
ーン化した。

【００２５】全部で、第９および第11サイクル由来の37
クローンを配列決定し、第11サイクル由来の配列を４ク
ラスに分けた。配列の２つの主要クラス（２つの代表的
配列である１１Ｇ−２２および１１Ｇ−３１を図２に示
す）は、多くの配列が非関連性であった第９サイクルに
較べ、第11サイクルのＲＮＡプールに由来していた。こ
れらのＲＮＡ配列をMulfold プログラム(Zuker, 1989)
により折り畳んだ時、プール中の集団の約40% に相当す
る15クローンがそれらのランダム化領域にＴＡＲ様モチ
ーフ（全てのコア要素を含む）を持っていた。しかし、
これらクローンの幾つかは２つのＴＡＲ様モチーフ、例
えば１１Ｇ−３１を持つ（図２参照）。ＴＡＲコア要素
のコンビナトリアル分析は、各2.16 x 10⁵ヌクレオチド
について少なくとも１つの配列が見いだされるはずであ
ると予測している（Ferbeyreら，1997)。ＴＡＲコア要
素の分布のこのように低い確率にもかかわらず、本発明
者らはランダムプールからＴＡＲ様の要素を、そして二
重ＴＡＲ要素までも、単離することができた。これは恐
らく全選択手順を通して選択圧が維持されたためであ
る。上記２つの主要クラスに属していた主な選択された
アプタマーは、ＨＩＶ−１のＴＡＲが３つのバルジ残基
を含むのに対し、２つのバルジ残基（ＵＣまたはＵＵ）
を含んでいたが、人工変異による分析は少なくとも２つ
のバルジ残基がＴａｔの認識に必要であることを明らか
にした（WeeksおよびCrothers, 1991)。さらに、ＨＩＶ
−２のＴＡＲ ＲＮＡもまた、ＨＩＶ−１ Ｔａｔペプ
チドへの効率的な結合を可能とする２つの（２個のＴＡ
Ｒモチーフ中にＵＵまたはＵＡ）バルジ残基を含む（Ch
angおよびJeang, 1992)。30 nt のランダムコアを有す
るＲＮＡプールを用いた同様の選択手順は、別の構造形
の単離をもたらした(TuerkおよびMacDougal-Waugh, 199
3)。この場合、選択は固定配列（増幅のための）にかか
る短いランダムコア領域によって妨げられたかもしれな
い。

【００２６】

【表１】

【００２７】^a Ｔａｔタンパク質の存在下（Ｐ）または
不在下（ＮＰ）で結合アッセイを実施した。Ｔａｔおよ
び異なるサイクル由来の個別に標識したＲＮＡプールの
両方を共にインキュベートし、次に10倍過剰の非特異的
競合体（ｔＲＮＡ）の存在下で100 μlの結合緩衝液[50
mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM KCl]中でのin vitro選
択の際に用いたのと類似の条件下で濾過した。^# 特異的
ＲＮＡ競合体（実験手順参照）。

【００２８】〔実施例２〕ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡは
Ｔａｔ由来ペプチドと効率的に結合する。アルギニンに
富む領域を含む短いペプチドは、完全なタンパク質の特
異性に類似した特異性でＴＡＲ ＲＮＡに結合するので
（Weeksら, 1990; Calnanら，1991a)、本発明者らは以
後の試験においてＣＱ（アミノ酸37〜72）およびＲＥ
（アミノ酸49〜86）ペプチドの両方を用いた。これらの
ペプチドは化学的に合成し、均質（純度 >95%)になるま
で逆相ＨＰＬＣにより精製した。

【００２９】最初に、各クラス由来の代表的クローン
を、Ｔａｔ由来ペプチド（ＣＱまたはＲＥ；実験手順参
照）および真のＴＡＲ ＲＮＡの存在下で競合結合アッ
セイにかけた。ＴＡＲ様モチーフを２個持つＲＮＡモチ
ーフ（１１Ｇ−３１ ＲＮＡ等）のみが、Ｔａｔペプチ
ドへの結合についてＴＡＲと競合するように思われた
（データは本明細書には示していない）。１１Ｇ−３１
ＲＮＡ（Ｔａｔペプチドに高い親和性を持つＲＮＡ分
子の１つ）における結合領域を突き止めるため、本発明
者らはＴＡＲ様モチーフを２個有する最小ＲＮＡ（ミニ
１１Ｇ−３１；３７量体）を化学的に合成し、天然のゲ
ルを用いてＴａｔペプチドへのその結合を分析した。Ｃ
ＱおよびＲＥの両ペプチドはミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ
に効率的に結合した（図３ＡおよびＢ参照）。

【００３０】アプタマー、ミニ１１Ｇ−３１およびＴＡ
Ｒ ＲＮＡのＣＱおよびＲＥペプチドとの結合親和性を
比較するため、本発明者らは結合アッセイを実施した。
このアッセイでは、標識したＲＮＡを種々の濃度のＣＱ
またはＲＥペプチドと共にインキュベートし、次に20%
の非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて複合体化ＲＮ
Ａおよび遊離のＲＮＡを分離した（図３Ａ参照）。形成
された各複合体の量をゲル上のバンドの強度から直接計
算した。真のＴＡＲ ＲＮＡは、56 nM ＣＱペプチドの
存在下で約50% のレベルで複合体を形成した（図３Ａ−
１参照）。他方、ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡは、ＣＱペ
プチドの濃度が14 nMでも同じ量の複合体を効率的に形
成した（図３Ａ−３参照）。ＲＥペプチドを用いて同様
の分析を行なった時、真のＴＡＲ ＲＮＡは23 nM ＲＥ
ペプチドの存在下で約50% のレベルで複合体を形成した
（図３Ａ−２参照）。他方、ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ
は、ＲＥペプチドの濃度が3 nMでも同じ量の複合体を形
成した（図３Ａ−４参照）。これらの結果は、選択され
たアプタマーがＴａｔペプチドに高い親和性を有してい
たことを示唆する。

【００３１】バルジ残基の重要性を評価するため、本発
明者らはミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡにおいてバルジ残基
を欠くＲＮＡを合成し、ＣＱおよびＲＥペプチドを用い
たゲルシフトアッセイによってこのＲＮＡの結合を分析
した。ＣＱペプチドの高濃度においても（200 nM)、複
合体は全く形成されなかった（図３Ｂ−１参照）。しか
し、ＲＥペプチドの高濃度において（>80 nM)、少量の
複合体が形成された（図３Ｂ−２参照）。真のＴＡＲ
ＲＮＡおよびバルジ突然変異ＲＮＡを用いて同様の実験
を実施し、ＲＥおよびＣＱペプチドへの結合を調べた。
そして、本発明者らはＲＥペプチドに較べてＣＱペプチ
ドは効率的にバルジ変異体を区別することを観察した。
この結果は以前の観察と一致していた（Churcherら，19
93)。これらの試験から、ミニ１１Ｇ−３１におけるバ
ルジ残基はＴａｔペプチドの認識にとって重要であるよ
うに思われる。

【００３２】本発明者らの種々の試験は、ＴＡＲ ＲＮ
Ａのコア要素が２つの主要クラスに属する単離されたア
プタマー中に良く保存されていることを示し、このこと
は保存された残基の重要性を示唆していた。選択された
ＲＮＡの配列、すなわち一重または二重ＴＡＲモチーフ
を含む配列は、真のＴＡＲ ＲＮＡのＴａｔとの結合に
必要であると以前に同定されたコア要素全ての詳細を確
認する。ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡからのバルジ残基の
削除は、Ｔａｔタンパク質の結合を完全に廃止した。さ
らに、バルジＵ残基が一重および二重ＴＡＲモチーフ中
に見いだされた。このモチーフは恐らく、（ワトソン−
クリック型に結合した）Ａ−Ｕ残基と共にフーグスティ
ーン型塩基対を形成して、アルギニンまたはＴａｔペプ
チドおよびＴＡＲ ＲＮＡの複合体として提案されてい
る塩基トリプルＵ・Ａ・Ｕを形成する。これらを考え合
わせると、Tao ら(1997)の最近の突然変異による結果、
および本発明者らのこの度の結果は、ＴＡＲのアルギニ
ン結合モチーフは５’ＵＸｎＧＡ（ここで、Ｕ残基はＡ
残基とフーグスティーン相互作用をなすと予想され、Ｘ
ｎは塩基対を形成していない少なくとも１個のヌクレオ
チドを示し、Ｇ残基はアルギニンの結合のためのポケッ
トを形成する）と要約できることを示唆する。

【００３３】〔実施例３〕Ｔａｔペプチドに対するＴＡ
Ｒおよびミニ１１Ｇ−３１の相対的親和性の比較真のＴ
ＡＲ ＲＮＡおよびミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡを種々の
量のＴａｔペプチドで力価測定した場合、アプタマーが
効率的にＴａｔペプチドに結合するのが観察された。次
に、本発明者らは真のＴＡＲ ＲＮＡおよびミニ１１Ｇ
−３１ＲＮＡの親和性を直接比較するために競合結合ア
ッセイを実施した。標識化アプタマーおよびＴＡＲ Ｒ
ＮＡを１：１の比で種々のモル比（40〜8,000 nMの範
囲）の非標識アプタマーおよびＴＡＲ ＲＮＡと共に、
80 nM のＲＥペプチドの存在下でインキュベートした。
反応混合物を30℃で12時間平衡化させ、20% の非変性ポ
リアクリルアミドゲル上で分析した。アプタマーとＲＥ
ペプチドによって形成された複合体の量を種々の比につ
いて計算し、その結果、本発明者らはモル比が１対８
（ミニ１１Ｇ−３１：ＴＡＲ＝ 40 nM : 3,200 nM)の
時、アプタマー−ペプチド複合体の量が50% 減少するこ
とを見いだした。これらの結果は、アプタマーのＲＥペ
プチドに対する親和性が、真のＴＡＲ ＲＮＡの親和性
よりも80倍高い（D1/2≒ 3.2μM ）かもしれないことを
示唆していた。対照的に、非標識アプタマーの非標識Ｔ
ＡＲ ＲＮＡに対するモル比が１：１の場合、ＴＡＲ−
ペプチド複合体は全く検出されなかった。より初期の研
究においては、ＨＩＶ−１のアルギニンに富んだ領域に
由来するペプチドは、16 pM から40 nM の濃度で真のＴ
ＡＲ ＲＮＡに結合するように思われた(Churcherら, 1
993; LongおよびCrothers, 1995)。Ｔａｔペプチドの力
価測定、および競合結合アッセイの両方の結果は、単離
されたアプタマーはＴａｔ／ＴＡＲ相互作用を妨げたば
かりでなく、ナノモル以下の濃度でＴａｔペプチドを効
率的にトラップしたことを示唆している。この特性は、
ウイルスタンパク質の効果的なデコイにとって明らかに
望ましい。

【００３４】〔実施例４〕二重ＴＡＲ様ＲＮＡモチーフ
はＴａｔペプチドへの親和性を増強した。Ｔａｔペプチ
ドとの効率的な結合における二重ＴＡＲ様ＲＮＡモチー
フの重要性を明確に規定するため、本発明者らは二本の
鎖を分離し、ループ配列を削除した（図５参照）。化学
的に合成した２つの５’および３’オリゴマー（20量
体）をアニーリングすることにより、ミニ１１Ｇ−３１
ＲＮＡを模倣することができる二本鎖ＲＮＡ Ｉを調
製した。３’△ＵＣおよび５’ＲＮＡオリゴマーをアニ
ーリングすることにより、二本鎖ＲＮＡ II（３’バル
ジ残基ＵおよびＣが欠失している）を調製した。３’お
よび５’△ＵＵオリゴマーをアニーリングすることによ
り、二本鎖ＲＮＡ III（５’バルジ残基ＵＵが欠失し
ている）を調製した。二本鎖ＲＮＡ IV（バルジ残基の
両方の対が欠失している）を調製するため、３’△ＵＣ
および５’△ＵＵオリゴマーの両方をアニーリングし
た。各二本鎖のオリゴマーの５’末端を標識した後、各
二本鎖を用いてＣＱペプチド（40 nM)を結合緩衝液中で
30℃で1 時間平衡化した。生成物を非変性ポリアクリル
アミドゲル上で分析し（図６参照）、各複合体の量を上
記のように計算した。両方のバルジを含む二本鎖構造物
（二本鎖ＲＮＡ Ｉ）は、40 nM の濃度で約80% のレベ
ルで複合体を形成し、またミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡは
類似した量の複合体を形成した。３’末端バルジ残基Ｕ
Ｕ（二本鎖ＲＮＡ II）（図６、レーン８）または５’
末端バルジ残基ＵＣ（二本鎖ＲＮＡ III）（図６、レー
ン10）の削除は、ＣＱペプチドとの間に形成される複合
体の量を約50% 減少させた。二本鎖中のバルジ残基の両
方の対を削除する（二本鎖ＲＮＡ IV）と、ＣＱペプチ
ドの存在下で複合体は全く形成されなかった（図６、レ
ーン４）。得られた結果は、複合体におけるペプチドに
対するアプタマーの比は１対１であったこと、およびバ
ルジ残基の両方の対がＣＱペプチドとの効果的な結合に
おいて実際に重要な役割を果たしたこと、を示唆する。

【００３５】〔実施例５〕 無細胞転写アッセイにおけるミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ
の効果 関係のない鋳型の転写に及ぼす単離したアプタマー（ミ
ニ１１Ｇ−３１）の効果を調べるため、本発明者らはHe
La細胞核の抽出物を用いて転写アッセイを実施した（図
７参照）。外因性の真のＴＡＲ ＲＮＡ（100 pmole)の
添加は、ＣＭＶに由来する鋳型の転写を約50〜60% 阻害
した（図７、レーン３および４）（Yamamotoら，199
7)。100 pmole のｔＲＮＡ（酵母由来の全ｔＲＮＡ）の
不在下（図７、レーン１）または存在下（図７、レーン
２）、および100 pmole のミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡの
存在下（図７、レーン５）におけるＣＭＶプロモーター
からの転写は、影響を受けなかったか、あるいはわずか
に影響されたのみであった。３つの独立した転写実験の
結果を定量化したところ、ＴＡＲ ＲＮＡのみが有意義
な程度まで転写を阻害したことが明らかになった（図８
参照）。このように、単離されたアプタマーは、真のＴ
ＡＲ ＲＮＡに較べて高い親和性でＴａｔペプチドに結
合した。そして該アプタマーは、in vitroにおける転写
結果から判断されるように、関係のない遺伝子の転写に
何らネガティブな影響を及ぼさなかった。したがって、
ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡはＴａｔ特異的デコイとして
非常に有用であると思われる。

【００３６】結論 in vitro遺伝子選択という戦略を用いて、本発明者らは
ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質に高い親和性を持つＲＮ
Ａアプタマー１１Ｇ−３１を単離した。全長１１Ｇ−３
１ ＲＮＡおよびミニ１１Ｇ−３１の両方が、類似した
効率でＴａｔペプチドと結合するようである。単離され
たアプタマーは、互いに向かい合った、２つのＴＡＲ様
ＲＮＡモチーフを持っており、これらのモチーフはアプ
タマーとＴａｔペプチドとの高親和性結合を助けること
が判明した。真のＴＡＲ ＲＮＡは転写を阻害するのに
対して、アプタマーは転写への阻害作用がないことか
ら、ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡはＨＩＶ−１感染におけ
る可能性のあるＴａｔデコイとしてのさらなる分析にか
きたてる魅力的な分子であると言える。上記の実施例に
おいて行った種々の実験の手順を以下に示す。

【００３７】〔ＴＡＲおよび突然変異体ＴＡＲ ＲＮＡ
の調製〕ＤＮＡ合成装置（392A型、Applied Biosystem
s, USA)を用いて、Ｔ７プロモーターおよび図１に示す
ＲＮＡに対応する配列を含むオリゴデオキシリボヌクレ
オチド鋳型を合成した。リバースプライマー 5'-GGGTTC
CCTAGTTAGCCAGA-3'(配列番号５) の存在下で、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Nippon Gene, Japan)により一本
鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを二本鎖ＤＮＡに変換し
た。各反応は、10 mM Tris-HCl (pH 8.8)、50 mM KCl、
1.5 mM MgCl₂、0.1% Triton X-100、0.2 mM dNTPs、100
pmole のリバーズプライマー、78 pmoleのＤＮＡオリ
ゴヌクレオチド、および2.5 単位のＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼ(Takara, Japan) を含む100μlの混合物中で実
施した。この反応混合物を、所望のサイズの産物が得ら
れるまで、94℃で１分間、45℃で１分間、および68℃で
２分間からなるサイクルにかけた。得られたdsＤＮＡ鋳
型をエタノール中で沈殿させ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼによって転写させてＴＡＲ ＲＮＡまたは突然変異体
ＴＡＲ ＲＮＡを生成させた。in vitroにおける転写
は、T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies, US
A)を用いた37℃で２時間のインキュベーションの間に完
了した。ＲＮＡを合成し、ＤＮアーゼＩで処理した後、
10% 変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）によって反応混合物を分画した。エタノール沈
殿の後、ＲＮＡをゲルから抽出し、回収した。

【００３８】〔ＴＡＲ ＲＮＡおよびミニ１１Ｇ−３１
ＲＮＡの存在下におけるin vitro転写アッセイ〕転写
レベルにおけるＴＡＲ ＲＮＡの細胞機能に及ぼす効果
を調べるため、本発明者らはエンハンサー要素を含む、
または欠くサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期
プロモーター(immediate early promoter) を用いた。
本発明者らは、鋳型のＬＴＲ非依存性転写に及ぼすＴＡ
Ｒ ＲＮＡの効果を評価するための鋳型として、１例と
してＣＭＶ ＤＮＡを選んだ。特異的プライマー[5'-TT
AGTCATCGCTATTACCATGG-3'(配列番号６) および 5'-AGGC
CT GGATTCACAGGACGGGTG-3'(配列番号７)]を用いて、Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼにより、ＰＣＲ（94℃３分
間、50℃ 1.15分、および72℃３分間；30サイクル）に
よって、ＣＭＶ初期プロモーター領域（nt -238から36
4)を増幅した。得られたＰＣＲ産物（602 nt) をエタノ
ール沈殿により回収し、転写アッセイに使用した。[α-
³²P]CTPの存在下で、HeLa細胞核の抽出物 (Promega, US
A) を用いて転写反応を実施した。先ず13単位の核抽出
物、3 mM MgCl₂、0.4 mMの各ATP、GTPおよびUTP、およ
び16μM CTP、並びに10μCi[α-³²P]CTP (3,000 Ci/mmo
le; Amersham, U.K.)を緩衝液[20 mMHEPES (pH 7.9)、1
00 mM KCl、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTTおよび20% グリセ
リン] 中で混合し、これを100 pmole のＴＡＲ ＲＮ
Ａ、ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ、または酵母由来の全ｔ
ＲＮＡ（Boehringer Mannheim, Germany) と混合し、30
℃で15分間平衡化させた。この反応混合物にＰＣＲのた
めの鋳型ＤＮＡ 100 ngを補充し、最終反応容量を25μl
とし、30℃でさらに45分間インキュベーションを継続
した。175 μlの停止溶液〔0.3 M Tris-HCl (pH 7.4)、
0.3 M 酢酸ナトリウム、0.5% SDS、2 mM EDTA および3
mg/ml のｔＲＮＡ〕を添加して反応を停止させ、エタノ
ール中で沈殿させる前に反応産物をいったんフェノール
およびクロロホルムで抽出した。新たに合成されたＲＮ
Ａをローディング緩衝液〔25 mM EDTAおよび4.5 M 尿
素〕中で90℃で５分間変性させ、7 M 尿素を含有する6%
ポリアクリルアミドゲルにのせ、電気泳動によって分画
した。イメージアナライザー(BAS 2000; Fuji Film, Ja
pan)を用いてゲル上のバンドを定量した。

【００３９】〔Ｔａｔ由来ペプチドの合成およびゲルシ
フトアッセイ〕Ｔａｔタンパク質のアルギニンに富んだ
領域にまたがる２個のＴａｔ由来ペプチドを化学的に合
成した。すなわち、ＣＱ（アミノ酸37〜72、CFTTKALGIS
YGR KKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ(配列番号８) 、36量体）
およびＲＥ（アミノ酸49〜86、RKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLS
KQPTSQSRGDPTGPKE (配列番号９) 、38量体）である。こ
れらのペプチドをＨＰＬＣにより精製し、加水分解の
後、逆相ＨＰＬＣによりそれらの組成を確認した。

【００４０】ＣＱペプチドを、8 μl の結合反応液〔10
mM Tris-HCl (pH 8.0)、70 mM NaCl、2 mM EDTA、40 n
M 酵母由来全ｔＲＮＡ(Boehringer)および0.01% Nonide
t P-40 (Shell Chemicals, USA)]中で５’標識化ＴＡＲ
または変異体に対して力価測定した。最初に、各標識化
ＴＡＲ ＲＮＡを94℃で２分間変性させ、種々の濃度の
ペプチドと混合する前に室温で10分間平衡化させた。混
合物を30℃で1 時間インキュベートし、15% 非変性ゲル
を用いてＰＡＧＥによって複合体と遊離のＲＮＡを分離
した。イメージアナライザーを用いてゲル上の各複合体
の量を定量した。

【００４１】〔Ｔａｔタンパク質およびＲＮＡプール〕
本発明者らが選択のために用いたＨＩＶ−１のＴａｔタ
ンパク質は、RepliGen(USA)から購入した。最初に、HeL
a細胞核抽出物を用いた無細胞転写アッセイにおいて、
このＴａｔタンパク質のＬＴＲ依存性トランス活性化を
試験した。その結果、上記調製物は効率的にトランス活
性化を支持することが示された。また、ＴＡＲとの効率
的な結合についても上記調製物を分析した。その特性よ
り、本発明者らは上記調製物は高純度の（>90%) 活性Ｔ
ａｔタンパク質を含んでいると推論した。

【００４２】プール中のＲＮＡは、増幅のための２つの
定常領域に挟まれた120 nt (N)のランダムコア領域を以
下のように含んでいた（Ellington およびSzostak, 199
2):5'--GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUU--120N--CAUAUG UGCG
UCUACAUGGAUCCUCA--3'(配列番号１０) 。プールの増幅
に用いたプライマーは、5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGA
ATTCCGACCAGAAG-3'(39.169と称する; 配列番号11) およ
び5'-TGAGGATCCATGTAGACGCACATA-3'(24.169 と称する;
配列番号12) であった。選択サイクルにおいては、非特
異的競合体として酵母ｔＲＮＡ（Boehringer Mannheim)
を用いた。

【００４３】〔in vitro選択〕in vitro選択のため本発
明者らが従ったプロトコールは、Urvilら(1997)によっ
て報告されたものにほぼ同じである。第１の選択サイク
ルは、5.0 μM(最終濃度) のＲＮＡ（約4 x 10¹³個のＲ
ＮＡ配列に相当する) および0.5 μM Ｔａｔタンパク質
（ＨＩＶ−１）を含有する結合緩衝液中で実施した。Ｔ
ａｔタンパク質とプールＲＮＡを混合する前に、最初に
プール中のＲＮＡを結合緩衝液中で90℃で２分間変性さ
せ、次に室温で10分間冷却して異なる構造異性体の平衡
化を促進した。文献に記述されているように(Urvilら，
1997) 反応混合物を１時間インキュベートして濾過し
た。次の５サイクルの各々が終わる度に、プールＲＮＡ
の濃度を操作し、徐々に濃度を上げた非特異的ＲＮＡ
（大腸菌ｔＲＮＡ）および特異的競合体ＲＮＡ（+18 か
ら+44 までのヌクレオチドを含むＴＡＲ ＲＮＡ）の存
在下で60サイクルまでプールＲＮＡをＴａｔとの結合に
ついて競合させた。第７から第11サイクルで、プールＲ
ＮＡをさらに別の競合体ＲＮＡの特異的プール〔選択さ
れたプール（12〜18 Nプール、約5%のＴａｔ結合能を有
する)]と競合させた。最後の２サイクルでは、Ｔａｔタ
ンパク質の濃度を有意に低下させた。結合緩衝液は、50
mM Tris-HCl (pH 7.8) および50 mM KCl からなってい
た。プール０ ＲＮＡを、"Pop-top"フィルターホールダ
ー(Nucleopore, USA)に装着した、あらかじめ湿らせた
ニトロセルロースアセテートフィルター(HAWP フィルタ
ー、0.45μm、直径 13.0 mm; Millipore, USA)を用いて
前濾過し、選択的にフィルターと結合したＲＮＡを選択
した。この前濾過は、各付加的サイクルの後で実施し
た。1 mlの結合緩衝液を用いて洗浄することにより、各
選択サイクル後、Ｔａｔ−ＲＮＡ複合体をフィルター上
に集めた。0.4 M 酢酸ナトリウム、5 mM EDTAおよび7 M
尿素(pH 5.5)を90℃で５分にわたって用いて、結合し
たＲＮＡをフィルターから溶離した。エタノール沈殿の
後、ＡＭＶ逆転写酵素（Seikagaku, Japan) およびＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Nippon Gene)をそれぞれ用い
て、逆転写およびＰＣＲによる増幅を文献に記述されて
いるように実施した(Urvilら，1997)。

【００４４】さらに、第９、10および11サイクルでは突
然変異誘発性ＰＣＲプロトコール（Leungら，1989)も採
用した。これらのサイクルでは、ｃＤＮＡ反応混合物の
半分を先に記述したように増幅し、残りの半分は100 μ
lのＰＣＲ反応混合物〔67 mMTris-HCl (pH 8.8)、16.6
mM (NH₄)₂SO₄、6.1 mM MgCl₂、6.7 mM EDTA (pH 8.0)、
0.17 mg/ml BSA、10 mM β-メルカプトエタノール、1%
DMSO、0.2 mM dATP、各1 mMのdCTP、dGTPおよびdTTP、
0.5 mM MnCl₂、5 UのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよ
び0.4 mMの各プライマーを含む〕中で増幅した。反応混
合物を、適切なサイズの産物バンドが生成されるのに必
要なサイクル数だけ、94℃で1.15分間、50℃で1.15分間
および72℃で2.15分間からなる増幅サイクルにかけた。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写に先立って、こ
のＰＣＲによる産物（約0.25μg)を標準的ＰＣＲの産物
（約1.0 μg)と混合した。

【００４５】第11選択サイクルの後、ＰＣＲの産物をIn
vitrogenによって提供されたプロトコールに従って直接
pCRIIベクター(Invitrogen, USA)に連結した。アルカ
リ溶解法によって各クローンからＤＮＡを単離し、Dye
Terminator Sequencing Kit[Applied Biosystems Inc.
(ABI)] を用いてＤＮＡシークエンサー（373A型; ABI)
により配列を決定した。

【００４６】〔フィルター結合アッセイ〕異なる選択サ
イクルからのプールＲＮＡの結合活性および各アプタマ
ーの結合活性を評価するため、0.5 μCi/ml [α-³²P]CT
Pを用いて内部標識されたＲＮＡを調製した。結合およ
びin vitro転写の条件は、ＲＮＡのＴａｔに対するモル
比を１：１（330 nM:330 nM)とした以外は、選択に用い
た条件と同じであった。1mlの結合緩衝液を用いてフィ
ルターを洗浄し、空気乾燥し、イメージアナライザー(B
AS2000)を用いてフィルター上の放射能を定量した。結
合が特異的なことを確実にするために、10倍モル過剰の
ｔＲＮＡを非特異的競合体として各結合反応に添加し
た。

【００４７】〔ゲルシフト競合結合アッセイ〕５’末端
標識化ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡおよびＴＡＲ ＲＮＡ
を最初１：１のモル比で混合した。非標識ミニ１１Ｇ−
３１ ＲＮＡおよびＴＡＲ ＲＮＡを用いて濃度を調製
した後、ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ対ＴＡＲの種々の比
（１：１から１：200 の範囲）を準備した（40 nM ミニ
１１Ｇ−３１および40〜8,000nMまで徐々に増大する濃
度のＴＡＲ ＲＮＡ)。両方のＲＮＡを94℃で2 分間変
性させ、次に周囲温度で平衡化させた。次にＲＮＡサン
プルを30℃で12時間80 nM ＲＥペプチドと結合させ、平
衡点におけるＲＮＡ−タンパク質複合体の定量を可能と
した。反応生成物を非変性ゲル上で分離し、２つのＲＮ
Ａによって形成された複合体の量を分析した。第11選択
サイクルからの各アプタマーを特徴づけるため、本発明
者らは同様の競合結合アッセイを実施した。このアッセ
イでは、各ＲＮＡ(10 〜100 nM)を100nM ＣＱペプチド
の存在下で真のＴＡＲと競合させた。

【００４８】〔ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ二本鎖の合
成〕Ｔａｔ由来ペプチド（ＣＱ）との効率的結合のため
の１１Ｇ−３１の二重ＴＡＲ様モチーフの重要性を確立
するために、オリゴリボヌクレオチドの４本の鎖を化学
的に合成し、ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡからループ配列
を削除した後、４つの二本鎖ＲＮＡを調製した。それら
の配列は以下の通りである：５’ＲＮＡオリゴ（5'-ACG
AAGCUUGAUCCCGAGAC-3' (配列番号３））、３’ＲＮＡオ
リゴ (5'-GUCUCGGUCGAUCGCUUCGU-3' (配列番号１
３））、５’△ＵＵ ＲＮＡオリゴ（5'-ACGAAGCGAUCCC
GAGAC-3' (配列番号１４））、および３’△ＵＣ ＲＮ
Ａオリゴ（5'-GUCUCGGGAUCGCUUCGU-3' (配列番号１
５））。これらのオリゴの官能基を確立されたプロトコ
ール(ABIマニュアル）により脱保護し、20% ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて精製した。

【００４９】

【発明の効果】本発明により、HIV-1のTatタンパク質に
対して、特異的にかつ高い親和性で結合することができ
るRNAが提供された。このRNAは、HIV-1の転写阻害に利
用することができる。

【００５０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムRNA 配列： GGGUCUCUCU GGUUAGACCA GAUUUGAGCC UGGGAGCUCU CUGGCUAACU AGGGAACCC 59

【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： ACGAAGCUUG AUCCCGUUUG CCGGUCGAUC GCUUCGA 37

【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列の特徴： 存在位置：8..9 他の情報：相補鎖が存在しない 存在位置：13..14 他の情報：相補鎖は3'→5'方向にこの位置からのびる一
本鎖RNA「3'-CU-5'」を有する 配列： ACGAAGCUUG AUCCCGAGAC 20

【００５３】配列番号：４ 配列の長さ：１６５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： GGGAGAAUUC CGACCAGAAG CUUGAUCCCG UUUGCCGGUC GAUCGCUGUA UGUAUCGUUU 60 AAACGAACCU GGAUGUUCCU GUCUUUGCUU UAUGCGUCGU GUUGACCCGA GACUGGGGAA 120 UUCUUUAAUU UCGUGUAGUC AUAUGUGCGU CUACAUGGAU CCUCA

【００５４】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GGGTTCCCTA GTTAGCCAGA 20

【００５５】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TTAGTCATCG CTATTACCAT GG 22

【００５６】配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGGCCTGGAT TCACAGGACG GGTG 24

【００５７】配列番号：８ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Cys Phe Thr Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 16 Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser 32 Leu Ser Lys Gln 36

【００５８】配列番号：９ 配列の長さ：３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr 16 His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp 32 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 38

【００５９】配列番号：１０ 配列の長さ：１６９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：unsure 存在位置：24..143 配列： GGGAGAAUUC CGACCAGAAG CUUNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 120 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNCAUAUGU GCGUCUACAU GGAUCCUCA 169

【００６０】配列番号：１１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGTAATACGA CTCACTATAG GGAGAATTCC GACCAGAAG 39

【００６１】配列番号：１２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGAGGATCCA TGTAGACGCA CATA 24

【００６２】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： GUCUCGGUCG AUCGCUUCGU 20

【００６３】配列番号：１４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： ACGAAGCGAU CCCGAGAC 18

【００６４】配列番号：１５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成RNA 配列： GUCUCGGGAU CGCUUCGU 18

【００６５】参考文献 Aboul-ela, F., Karn, J., and Varani, G. (1995). Th
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uester trans-activator proteins such as Tat and Re
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【図面の簡単な説明】

【図１】in vitro遺伝子選択のスキーム。

【図２】ＲＮＡの各クラスの代表的配列および二次構
造。

【図３】ＡはＴａｔ由来ペプチド（ＣＱおよびＲＥ）と
ＴＡＲ ＲＮＡまたはミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡとの複
合体の形成。結合反応液は、５’末端標識化ＲＮＡ（1
5,000 cpm) および5、10、20、40、60、80または100 nM
のＴａｔ由来ペプチドを含んでいた。複合体は、20% 非
変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって
未結合ＲＮＡから分離した。（Ａ−１）ＴＡＲ ＲＮＡ
およびＣＱペプチド；（Ａ−２）ＴＡＲ ＲＮＡおよび
ＲＥペプチド；（Ａ−３）ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡお
よびＣＱペプチド；（Ａ−４）ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮ
ＡおよびＲＥペプチド。Ｂは、バルジ欠失変異体、すな
わちミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡにおいてバルジ残基を欠
くＲＮＡ、とＴａｔ由来ペプチド（ＣＱおよびＲＥ）の
間の複合体の形成。（Ｂ−１）ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮ
Ａにおいてバルジ残基を欠くＲＮＡおよびＣＱペプチ
ド；（Ｂ−２）ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡにおいてバル
ジ残基を欠くＲＮＡおよびＲＥペプチド。

【図４】競合結合アッセイの結果。５’末端標識化ミニ
１１Ｇ−３１ ＲＮＡ（20,000cpm) 、非標識化ミニ１
１Ｇ−３１ ＲＮＡ(40 nM) および非標識の真のＴＡＲ
ＲＮＡの種々の濃度（40から8,000 nM）の混合物をＲＥ
ペプチド（80 nM)と30℃で12時間結合させた場合の複合
体の形成。上記混合物を、図３の説明文に述べたよう
に、非変性ゲル上で分画した。

【図５】合成ミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡ二本鎖。二本鎖
のミニ１１Ｇ−３１ ＲＮＡから削除された塩基を四角
で示す。

【図６】Ｔａｔ由来ペプチドＣＱと、二本鎖ＲＮＡ Ｉ
（ミニ１１Ｇ−３１）、二本鎖ＲＮＡ II、二本鎖ＲＮ
Ａ III、または二本鎖ＲＮＡ IV との複合体の形成。反
応混合物は、二重鎖１本またはＲＮＡ（１個の標識化Ｒ
ＮＡ、通常は５’末端標識化オリゴマーおよび非標識化
第２鎖）単独を含んでいるか、または40 nM のＣＱペプ
チドの存在下にあった。複合体は、20% 非変性ポリアク
リルアミドゲルを用いた電気泳動によって未結合ＲＮＡ
から分離した。３’△ＵＣ ＲＮＡオリゴ単独（レーン
１）またはＣＱペプチド（40 nM)の存在下（レーン
２）；二本鎖ＲＮＡ IV単独（レーン３）またはＣＱの
存在下（レーン４）；３’ＲＮＡオリゴ単独（レーン
５）またはＣＱの存在下（レーン６）；二本鎖ＲＮＡ I
II単独（レーン７）またはＣＱの存在下（レーン８）；
二本鎖ＲＮＡ II単独（レーン９）またはＣＱの存在下
（レーン10）；二本鎖ＲＮＡ Ｉ単独（レーン11）また
はＣＱの存在下（レーン12）。大小の矢じりは、二本鎖
ＲＮＡとＣＱペプチドの複合体、および二本鎖ＲＮＡを
それぞれ示す。

【図７】HeLa細胞核抽出物における、ミニ１１Ｇ−３１
および真のＴＡＲ ＲＮＡによる、ＣＭＶ初期プロモー
ターによって駆動される鋳型からの転写の阻害。ＣＭＶ
の初期プロモーターを含む鋳型を、100 pmole のＴＡＲ
ＲＮＡの不在下（レーン１）および存在下（レーン３
および４）、100 pmole のｔＲＮＡの存在下（酵母由来
の全ｔＲＮＡ；レーン２）、または100 pmole のミニ１
１Ｇ−３１の存在下で転写した。一本鎖ＤＮＡマーカー
をレーンＭにのせた。新しく合成された転写物を矢印で
示す。

【図８】in vitroで合成された転写物（364 nt)の相対
的レベルを、３つの独立した実験で定量した（実験の偏
差を誤差バーで示す）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (56)参考文献 特表 平８−501943（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．137，Ｎｏ．１ （1993）ｐ．33−39 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍ ｐ．Ｓｅｒ．，Ｎｏ．34（1995）ｐ. 145−146 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．25，Ｎｏ．17（1997．Ｓ ｅｐ．）ｐ．3445−3450 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/11 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化
   タンパク質と結合することができ、かつ下記の二次構造
   (I)によって表されるヌクレオチド配列を含むリボ核
   酸。 （構造中、N^1aおよびN^1bは相補的塩基対形成が可能な少
   なくとも２対の核酸塩基であり、N^2aおよびN^2bは相補的
   塩基対形成が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、
   N³およびN⁴はそれぞれ独立に１または２個の核酸塩基で
   あり、N^5aおよびN^5bは相補的塩基対形成が可能な少なく
   とも１対の核酸塩基であり、N^6aおよびN^6bは相補的塩基
   対形成が可能な少なくとも１対の核酸塩基であり、N⁷は
   ０〜５個の核酸塩基であり、N⁷が存在しないときには、
   このリボ核酸は二本鎖となり、N^6aおよびN^6bは相補的塩
   基対形成が可能な少なくとも２対の核酸塩基であり、そ
   して実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
2. 【請求項２】 下記の二次構造(II)によって表されるヌ
   クレオチド配列からなる天然のトランス活性化応答領域
   リボ核酸よりも高い親和性で、ヒト免疫不全ウイルスの
   トランス活性化タンパク質と結合することができる、請
   求項１記載のリボ核酸。 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
3. 【請求項３】 下記の二次構造(II)によって表されるヌ
   クレオチド配列からなる天然のトランス活性化応答領域
   リボ核酸よりも高い特異性で、ヒト免疫不全ウイルスの
   トランス活性化タンパク質と結合することができる、請
   求項１または２記載のリボ核酸。 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
4. 【請求項４】 下記の二次構造(III)によって表される
   ヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のリボ核酸。 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
5. 【請求項５】 下記の二次構造(IV)によって表される二
   本鎖のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のリボ核
   酸。 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
6. 【請求項６】 下記の二次構造(V)によって表されるヌ
   クレオチド配列からなる、請求項１記載のリボ核酸。 （構造中、実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
7. 【請求項７】 請求項１記載のリボ核酸を用いて、in v
   itroにおけるヒト免疫不全ウイルスの転写を阻害する方
   法。
8. 【請求項８】ヒト免疫不全ウイルスを含む細胞に請求項
   １記載のリボ核酸を導入することを含む、請求項７記載
   の方法。