KR20220084272A - 세포 표적화 및 라벨링에 사용하기 위한 항-cd3 압타머 - Google Patents

세포 표적화 및 라벨링에 사용하기 위한 항-cd3 압타머 Download PDF

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KR20220084272A
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프레데릭 모울란
세실레 부쉐
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익사카 프랑스
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Abstract

세포 표면 상의 CD3 단백질 복합체를 인식하는 고친화도 압타머 서열이 제공된다. 압타머는 전달 비히클을 위한 표적화 모이어티로서 또는 면역요법, 면역진단을 위한 또는 대상체에서 CD3+ T 세포를 분리, 정제 또는 특성규명하기 위한 분자 성분으로서 사용될 수 있다.

Description

세포 표적화 및 라벨링에 사용하기 위한 항-CD3 압타머
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2019년 7월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/879,401호; 및 2019년 7월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/879,413호; 및 2019년 7월 26일에 출원된 PCT 출원 제PCT/IB2019/000890호에 대한 우선권을 주장한다. 앞서 언급한 각각의 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
분화 클러스터 3(CD3)은 1개의 γ 서브유닛, 1개의 δ 서브유닛과 2개의 ε 서브유닛을 함유하여 CD3γε 및 CD3δε 이종이량체를 형성하는 단백질 복합체로, 이는 T 세포 수용체(TCR)와 회합하고 TCR이 펩티드-MHC 복합체에 결합할 때 세포내 신호를 전달한다. CD3 서브유닛은 매우 상동성이고 각각은 작은 세포질 도메인 및 음으로 하전된 잔기를 함유하는 막횡단 도메인을 가지고 있으며, 이를 통해 TCR의 막횡단 영역 내의 양으로 하전된 잔기와 회합한다. TCR은 α, β, ζ 및 η 서브유닛을 함유하고 ζζ 동종이량체 또는 ζη 이종이량체와 회합된 αβ 이종이량체로서 존재한다. TCR은 결국 CD3γε 및 CD3δε 이종이량체와 회합된다.
압타머는 독특한 3차원 입체배치를 갖는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드이다. 항체와 마찬가지로, 압타머는 높은 특이성으로 표적에 결합하고 종종 표적의 생물학적 활성을 조절할 수 있다. 압타머는 면역원성의 결여, 잘 제어되는 저렴한 화학 합성, 높은 안정성 및 우수한 조직 침투를 포함하여 항체에 비해 많은 이점들을 제공한다. 압타머는 또한 표적화 모이어티(moiety)로서 사용하기 위해 나노입자, 약물, 영상화제 및 다른 핵산에 부착될 수 있다.
본 기술은 CD3에 결합하고 T 세포를 표적화하거나 표지하거나 분류하는 데 사용될 수 있는 DNA 및 RNA 압타머를 제공한다.
따라서, 일 측면에서, 본 기술은 CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ 단백질 복합체에 결합하는 압타머를 제공한다. 압타머는 본원에 설명된 여러 핵산 서열 중 임의의 것을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 CD3을 발현하는 세포를 표지하거나 정제하거나 분류하는 방법이다. 세포는 형광 표지 또는 방사성 동위원소와 같은 표지를 보유하는 항-CD3 압타머와 함께 항온배양된다.
본 기술의 또 다른 측면은 상기 항-CD3 압타머를 포함하는, T 세포를 시험관내 또는 생체내 표적화하기 위한 전달 비히클이다.
본 기술의 또 다른 측면은 대상체에서 전달 비히클을 T 세포로 표적화하는 방법이다. 상기 방법은 대상체에게 전달 비히클을 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 기술은 전술한 약물 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 기술은 다음의 특징 목록으로 추가 요약될 수 있다:
1. 서열 GX1X2TX3GX4X5X6X7X8X9GGX10CTGG[여기서, X1은 G 또는 A이고; X2 및 X6은 A, T, 또는 G이고; X3은 T 또는 G이고; X4 및 X9는 G 또는 C이고; X5는 C 또는 T이고; X7은 T, G 또는 C이고; X8 및 X10은 C, T 또는 A이다](서열번호 109) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
2. 서열 GGGX1TTGGCX2X3X4GGGX5CTGGC[여기서, X1 및 X2는 A, T, 또는 G이고; X3은 T, C 또는 G이고; X4 및 X5는 A, T, 또는 C이다](서열번호 110) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
3. 서열 GX1TTX2GX3X4X5X6CX7GGX8CTGGX9G[여기서, X1은 A 또는 G이고; X2는 T 또는 G이고; X3 및 X7, X9는 G 또는 C이고; X4는 T 또는 C이고; X5는 A 또는 T이고; X6은 T, C 또는 G이고; X8은 A 또는 C이다](서열번호 111) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
4. 서열 GGGTTTGGCAX1CGGGCCTGGC[여기서, X1은 G, C 또는 T이다](서열번호 112) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
5. 서열 GCAGCGAUUCUX1GUUU[여기서, X1은 U이거나 염기 부재이다](서열번호 113) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
6. 특징 1 내지 특징 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 압타머가 약 0.2 pM 내지 약 250 nM의 해리 상수로 인간 CD3 ε/γ 및/또는 CD3 ε/δ에 결합하는, 압타머.
7. 특징 1 내지 특징 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 압타머가 약 20 nM 내지 약 800 nM의 해리 상수로 CD3 ε/γ 및/또는 CD3 ε/δ의 비-인간 형태에 결합하는, 압타머.
8. 특징 1 내지 특징 7 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 서열번호 108로부터 선택된 서열을 포함하는 압타머.
9. 특징 1 내지 특징 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열의 변이체를 포함하고, 상기 염기 중 하나 이상이 비-천연 발생 염기로 치환되거나, 상기 염기 중 하나 이상이 생략되거나 상응하는 뉴클레오티드가 링커로 대체되는, 압타머.
10. 특징 9에 있어서, 하나 이상의 비-천연 발생 염기가 메틸이노신, 디하이드로우리딘, 메틸 구아노신 및 티오우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 압타머.
11. 특징 1 내지 특징 10 중 어느 하나에 있어서, CD3+ T 세포에 결합하지만 이를 활성화하지 않는, 압타머.
12. 제제, 염료, 공유 커플링을 위한 작용기 또는 생물학적 활성 제제를 T 세포에 전달하기 위한 비히클로서, 특징 1 내지 특징 11 중 어느 하나의 압타머를 포함하는 비히클.
13. 특징 11 또는 특징 12에 있어서, 중합체 나노입자를 포함하는 비히클.
14. 특징 13에 있어서, 중합체 나노입자가 폴리(베타 아미노 에스테르)(PBAE)를 포함하는, 비히클.
15. 특징 13 또는 특징 14에 있어서, 압타머가 중합체에 공유 결합되는, 비히클.
16. 특징 13 내지 특징 15 중 어느 하나에 있어서, 제제가 T 세포 조절제 또는 영상화제인, 비히클.
17. 특징 16에 있어서, T 세포 조절제가 전이유전자(transgene)를 운반하는 바이러스 벡터이고; 상기 바이러스 벡터가 중합체로 코팅되고; 압타머가 상기 중합체에 공유 결합되는, 비히클.
18. 특징 17에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 비히클.
19. 특징 17 또는 특징 18에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 비히클.
20. 특징 16에 있어서, T 세포 조절제가 다사티닙, MEK1/2 억제제, PI3K 억제제, HDAC 억제제, 키나제 억제제, 대사 억제제, GSK3 베타 억제제, MAO-B 억제제 및 Cdk5 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비히클.
21. 대상체에서 제제를 T 세포로 전달하는 방법으로서, 특징 16 내지 특징 20 중 어느 하나의 비히클을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
22. 특징 16 내지 특징 20 중 어느 하나의 비히클 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
23. 대상체로부터 T 세포를 단리하는 방법으로서, 특징 1 내지 특징 12 중 어느 하나의 비히클을 사용하여 T 세포를 대상체로부터 단리하는 것을 포함하는 방법.
도 1은 재조합 인간 CD3 ε/γ와 인간 CD3 ε/δ 단백질의 혼합물에 대해 SELEX를 수행함으로써 수득된 항-CD3 DNA 압타머(클러스터)의 처음 45개 핵산 서열(서열번호 1 내지 45, 위에서 아래로)을 도시한다. 각 복합체는 C-말단 Fc 융합체로서 제조되었다. hIgG1 Fc를 카운터 표적(counter target)으로 사용하였다. 클러스터들은 소정 라운드의 SELEX에서 발생 빈도가 감소하는 순서로 위에서 아래로 배열된다.
도 2a 내지 도 2e는 SELEX 절차(도 1)에 의해 수득된 압타머 클러스터_1(서열번호 1), 클러스터_1s(서열번호 46, 5' 및 3' 플랭킹 영역이 제거된 클러스터_1와 동등함), 클러스터_2(서열번호 2), 클러스터_3(서열번호 3) 및 클러스터_21(서열번호 21)이 저캣(Jurkat) 세포(인간 CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 비교를 위해, 라모스(Ramos) 세포(인간 CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 결합은 압타머의 3가지 농도: 3 nM, 10 nM, 30 nM에서 시험되었다.
도 3a 내지 도 3e는 SELEX 절차(도 1)에 의해 수득된 압타머 CELTIC_1(서열번호 1), CELTIC_1s(서열번호 46), CELTIC_2(서열번호 2), CELTIC_3(서열번호 3), 및 CELTIC_21(서열번호 21)이 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 비교를 위해, 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 결합은 다음의 압타머 농도에서 시험된다: 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 7.5 nM 및 10 nM.
도 4a 내지 도 4c는 Series Sensor SA 칩 상에 고정화된 비오틴화 압타머 CELTIC_1(서열번호 1), CELTIC_3(서열번호 3) 및 CELTIC_21(서열번호 21) 각각이 CD3 ε/γ(좌측 컬럼), CD3 ε/δ (중간 컬럼) 및 대조군 hIgG1 Fc(우측 컬럼)에 결합한 결과를 도시하는 센서그램이다. 결합은 단일 사이클 동역학 프로토콜을 사용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다. 3 nM, 10 nM, 30 nM, 50 nM 및 100 nM 농도에서 압타머의 연속 주사가 수행되었다.
도 5a 내지 도 5f는 각각의 압타머 CELTIC_2(서열번호 2), CELTIC_3(서열번호 3) 및 CELTIC_21(서열번호 21), 및 플랭킹(flanking) 영역 뉴클레오티드가 결여된 이들의 더 짧은 버전 CELTIC_2s(서열번호 47), CELTIC_3s(서열번호 48) 및 CELTIC_21s(서열번호 49)이 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 압타머 농도 3 nM, 10 nM 및 30 nM에서 측정되었다. 도 5a 및 도 5d는 각각 세포에 대한 CELTIC_2 및 CELTIC_2s의 결합을 도시한다. 도 5b 및 도 5e는 각각 세포에 대한 CELTIC_3 및 CELTIC_3s의 결합을 도시한다. 도 5c 및 도 5f는 세포에 대한 CELTIC_21 및 CELTIC_21s의 결합을 도시한다. 비교를 위해 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합이 도시된다.
도 6은 클러스터 1, 2, 3 및 21의 서열(각각 서열번호 1, 2, 3 및 21)의 정렬 및 상동성의 코어 영역을 보여주는 클러스터 1, 2 및 3의 서열의 정렬을 도시한다. 다중 서열 정렬은 ClustalW 알고리즘으로 수행되었다. 각 클러스터에 보존된 것으로 발견된 뉴클레오티드는 *로 표시되어 있다.
도 7a 및 도 7b는 SELEX 절차(도 1)에 의해 수득된 여러 추가 클러스터의 DNA 서열(도 7a의 위에서 아래로, 서열번호 11, 7, 5, 9, 22, 2, 17, 14, 15, 20, 18, 12, 1, 8, 13, 3, 4, 6, 19, 10 및 16, 도 7b의 위에서 아래로 서열번호 1 내지 22), 및 클러스터 21의 서열을 제외한 및 클러스터 21의 서열을 포함한 서열들의 정렬(각각, 도 7a 및 도 7b)을 도시한다. 다중 서열 정렬은 ClustalW 알고리즘으로 수행되었다. 각 클러스터에 보존된 것으로 발견된 뉴클레오티드는 *로 표시되어 있다. 도 7c는 SELEX 절차에 의해 수득된 처음 45개 클러스터 중에서 MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)에 의해 식별된 코어 서열(서열번호 57) 및 염기 분포를 도시한다.
도 8a 내지 도 8g는 결합 포화도 및 KD를 추정하기 위한, SELEX 절차(도 1)에 의해 수득된 압타머(5' 및 3' 플랭킹 영역 없음) CELTIC_4s(서열번호 50), CELTIC_5s(서열번호 51), CELTIC_6s(서열번호 52), CELTIC_9s(서열번호 53), CELTIC_11s(서열번호 54), CELTIC_19s(서열번호 55) 및 CELTIC_22s(서열번호 56)이 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 압타머의 3가지 농도: 3 nM, 10 nM, 30 nM에서 시험되었다. 비교를 위해, 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다.
도 9a 및 도 9b는 3 nM(도 9a) 및 10 nM(도 9b)의 농도에서 저캣 세포(CD3 양성 세포) 및 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 여러 선별된 압타머의 결합 결과를 비교한 막대 그래프이다. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 10a 내지 도 10d는 혈청의 존재 하의 압타머 CELTIC_1s(도 10a), CELTIC_4s(도 10b), CELTIC_11s(도 10c) 및 CELTIC_19s(도 10d)의 안정성을 도시한다. 압타머의 무결성은 37℃에서 혈청, 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액 또는 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30분, 10분 또는 0시간) 동안 압타머를 항온배양한 후 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었다.
도 11a 및 11b는 혈청의 존재 하의 압타머 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s, CELTIC_11s, CELTIC_19s 및 CELTIC_22s의 안정성을 도시하는 막대 그래프이다. 안정성은 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 0.5시간, 10분 또는 0시간) 동안 혈청 또는 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액에서 압타머를 항온배양한 후, 유세포측정에 의해 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 대한 압타머의 결합을 측정함으로써 결정되었다. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)은 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 12는 SELEX(도 1)에 의해 수득된 압타머 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s 및 CELTIC_19s가 건강한 공여자로부터 단리된 말초혈 단핵세포에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 다음의 압타머 농도에서 시험되었다: 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 13a 내지 13d는 결합 포화도 및 KD를 추정하기 위한, ELEX 절차(도 1)에 의해 수득된 압타머 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s 및 CELTIC_19s가 마우스 CD3-양성 EL4 세포에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 압타머의 3가지 농도에서 시험되었다: 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM. 비교를 위해, 인간 저캣 세포에 대한 300 nM 농도의 압타머 및 항-CD3 145-2C11 단클론 항체(32 nM)의 결합도 도시된다(회색 막대).
도 14a 내지 14l은 사이토카인의 분비에 의해 측정된, 1 ㎛ 농도에서 항-CD3 DNA 압타머에 의한 인간 림프구의 활성화를 도시하는 그래프이다. 분비된 사이토카인의 수준은 공동자극 항-CD28 항체의 존재 하에 37℃에서 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 상이한 기간(0시간, 3시간, 19시간, 27시간 또는 48시간) 동안 압타머를 항온배양한 후 ELISA에 의해 결정되었다. 도 14a, 14b 및 14c는 각각 압타머 CELTIC_1s에 의한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 도 14d, 14e 및 14f는 각각 압타머 CELTIC_4s에 의한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 도 14g, 14h 및 14i는 각각 압타머 CELTIC_11s에 의한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 도 14j, 14k 및 14l은 각각 압타머 CELTIC_19에 의한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 비교를 위해, 공동자극 항-CD28 항체의 존재 또는 부재 하의 항-CD3 단클론 항체의 활성화도 도시된다.
도 15a 내지 15c는 CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현에 의해 측정된, 1 ㎛ 농도에서 항-CD3 DNA 압타머에 의한 인간 림프구의 활성화를 도시하는 막대 그래프이다. CD4- 및 CD8-양성 T 림프구 상에서 CD25 및 CD69 표면 마커의 수준은 압타머를 공동자극 항-CD28 항체의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 48시간 동안 항온배양한 후 유세포측정에 의해 결정되었다. 도 15a는 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s 또는 CELTIC_19s 단독으로 처리된 세포로 수득된 발현 결과를 도시한다. 도 15b는 공동자극 항-CD28 항체와 혼합된 동일한 압타머로 처리된 세포로 수득된 발현 결과를 보여준다. 도 15c는 시약의 농도를 일정하게 유지하기 위해 3시간, 19시간 및 27시간 항온배양 후 배양 배지에 첨가된 항-CD28 항체와 혼합된 새로운 압타머 용액으로 처리된 세포로 수득된 발현 결과를 보여준다.
도 16a 내지 도 16c는 사이토카인의 분비에 의해 측정된, 1 ㎛ 농도에서 항-CD3 DNA 압타머에 의한 인간 림프구의 활성화를 보여주는 막대 그래프이다. 분비된 사이토카인의 수준은 압타머를 공동자극 항-CD28 항체의 존재 하에 37℃에서 10% 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 48시간 동안 항온배양한 후 인간 Th1/Th2 세포측정 비드 어레이로 결정되었다. 도 16a는 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s 또는 CELTIC_19s 단독으로 처리된 세포에 대한 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 도 16b는 공동자극 항-CD28 항체와 혼합된 동일한 압타머로 처리된 세포의 사이토카인 분비 프로파일을 도시한다. 도 16c는 시약의 농도를 일정하게 유지하기 위해 3시간, 19시간 및 27시간 항온배양 후 배양 배지에 첨가된 항-CD28 항체와 혼합된 새로운 압타머 용액으로 처리된 세포의 사이토카인 분비 프로파일을 도시한다.
도 17aa 내지 도 17cb는 압타머에 의해 인식되는 CD3의 영역을 맵핑하기 위해, SELEX 절차(도 1)에 의해 수득된 압타머 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s 및 CELTIC_19s 및 CD3 에피토프에 특이적인 항체가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 포화 농도의 경쟁자의 존재 하에 수행되었다. 도 17aa, 17ba 및 17ca에서, CD3에 특이적인 PE-표지된 단클론 OKT3, UCHT1 및 HIT3a 항체의 결합은 하나의 농도(OKT3 및 HIT3a의 경우 0.1nM 또는 UCHT1의 경우 1nM)에서 및 포화 농도의 비표지된 항체(OKT3 및 HIT3a의 경우 32 nM 또는 UCHT1의 경우 10 nM) 또는 비오틴화된 압타머(300 nM)의 부재 또는 존재 하에 시험되었다. 도 17ab, 17bb 및 17cb에서, 비오틴화된 압타머의 결합은 300 nM의 농도에서 포화 농도의 비표지된 항체(OKT3 및 HIT3a의 경우 32 nM 또는 UCHT1의 경우 10 nM)의 부재 또는 존재 하에 및 PE 표지된 스트렙타비딘의 존재 하에 시험되었다.
도 17d는 SELEX(도 7c) 동안 단리된 상위 45개 서열 패밀리 중에서 발견된 계산된 보존된 모티프에 상당하는 압타머 CELTIC_코어가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 비교를 위해, 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 결합은 다음의 압타머 농도에서 시험되었다: 3 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM 75 nM 및 100 nM. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 17e는 SELEX(도 7c) 동안 단리된 상위 45개 서열 패밀리 중에서 발견된 계산된 보존된 모티프에 상응하는 압타머 CELTIC_코어(상위 서열, 서열번호 57)의 상이한 변이체(1 내지 13)(각각 서열번호 58 내지 71)의 서열을 나열한다. 밑줄은 염기가 C3 스페이서로 대체되어 무염기 부위를 생성한 서열 내의 위치를 나타낸다. 원래 코어 서열에 도입된 돌연변이는 볼드체로 강조 표시되어 있다.
도 17fa 내지 도 17fn은 CELTIC_코어(도 17e)와 비교하여 변형을 보유하는 압타머 CELTIC_코어1, CELTIC_코어2, CELTIC_코어3, CELTIC_코어4, CELTIC_코어5, CELTIC_코어6, CELTIC_코어7, CELTIC_코어8, CELTIC_코어9, CELTIC_코어10, CELTIC_코어11, CELTIC_코어12, CELTIC_코어13 및 CELTIC_코어T가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 2가지 압타머 농도(50 nM 및 100 nM)에서 시험되었으며 CELTIC_코어(50 및 100 nM) 및 전장 CD3_CELTIC_1s(10 및 50 nM)로 수득된 세포 염색과 비교되었다. 비교를 위해, 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 18은 SELEX(도 7c) 동안 단리된 상위 45개 서열 패밀리 중에서 발견된 계산된 보존된 모티프에 상응하는 압타머 CELTIC_코어(상위 서열, 서열번호 57)의 상이한 변이체(1 내지 44, 서열번호 58 내지 102, 도 17e에 이미 설명되었고 도 17fa 내지 17fn에서 평가된 13개의 돌연변이체를 포함)의 서열을 나열한 것이다. 밑줄은 염기가 C3 스페이서로 대체되어 무염기 부위를 생성한 서열 내의 위치를 나타낸다. 원래 코어 서열에 도입된 돌연변이는 볼드체로 강조 표시되어 있다.
도 19a 내지 도 19d는 CELTIC_코어(도 17e)와 비교하여 변형을 보유하는 압타머 CELTIC_코어14 내지 CELTIC_코어44가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 2가지 압타머 농도: 50 nM(돌연변이체 14 내지 37의 경우 도 19a 및 돌연변이 38 내지 44의 경우 도 19c) 및 100 nM(돌연변이체 14 내지 37의 경우 도 19b 및 돌연변이체 38 내지 44의 경우 도 19d)에서 시험되고 CELTIC_코어(50 및 100 nM) 및 전장 CD3_CELTIC_1s 및 CD3_CELTIC_19s(10 및 50 nM)로 수득된 세포 염색과 비교되었다. 비교를 위해, 라모스 세포(CD3 음성 세포; 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 항-CD3 OKT3 및 항-CD19 단클론 항체(각각 32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 20은 CELTIC_코어(서열번호 57)(도 17e)와 비교하여 전술한 변형을 보유하는 압타머 CELTIC_코어1 내지 CELTIC_코어44(서열번호 58 내지 102)가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 요약한다.
도 21a 내지 도 21f는 압타머에 의해 인식되는 CD3 영역을 맵핑하기 위해 포화 농도의 경쟁자의 존재 하에 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 대한 압타머 CELTIC_코어12, CELTIC_코어40HEGt, CELTIC_코어42HEGt, 및 CD3 에피토프에 특이적인 항체의 결합 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 도 21a, 21c 및 21e에서, CD3에 특이적인 PE-표지된 단클론 OKT3, UCHT1 및 HIT3a 항체의 결합은 1가지 농도(OKT3 및 HIT3a의 경우 0.1 nM 또는 UCHT1의 경우 1 nM)에서 및 포화 농도의 비표지된 항체(OKT3 및 HIT3a의 경우 32 nM 또는 UCHT1의 경우 10 nM) 또는 비오틴화된 압타머(300 nM)의 부재 또는 존재 하에 시험하였다. 도 21b, 21d 및 21f에서 비오틴화된 압타머의 결합은 300 nM의 농도에서 포화 농도의 비표지된 항체(OKT3 및 HIT3a의 경우 32 nM 또는 UCHT1의 경우 10 nM)의 부재 또는 존재 하에 및 PE 표지된 스트렙타비딘의 존재 하에 시험되었다. 결과는 전장 CD3_CELTIC_1로 수득된 세포 염색과 비교된다.
도 22a 내지 도 22f는 혈청의 존재 하의 압타머 CELTIC_코어HEG (도 22a), CELTIC_코어12 (도 22b), CELTIC_코어24HEG (도 22c), CELTIC_코어29HEG (도 22d), CELTIC_코어40HEG (도 22e) 및 CELTIC_코어42HEG (도 22f)의 안정성을 도시한다. 압타머의 무결성은 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30분, 10분 또는 0시간) 동안 혈청, 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액 또는 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 압타머를 항온배양한 후 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정하였다.
도 23a 내지 도 23c는 혈청의 존재 하의 압타머 CELTIC_코어HEG, CELTIC_코어12(도 23a), CELTIC_코어24HEG, CELTIC_코어29HEG(도 23b), CELTIC_코어40HEG 및 CELTIC_코어42HEG(도 23c)의 안정성을 도시하는 막대 그래프이다. 안정성은 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 0.5시간, 10분 또는 0시간) 동안 혈청 또는 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액에서 압타머를 항온배양한 후, 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 대한 압타머의 결합을 유세포측정에 의해 측정함으로써 결정하였다. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 24a 내지 도 24d는 혈청의 존재 하에 압타머 CELTIC_코어40HEG(도 24a), CELTIC_코어40HEGt(도 24b), CELTIC_코어42HEG(도 24c) 및 CELTIC_코어42HEGt(도 24D)의 안정성을 도시한다. 압타머의 무결성은 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30시간, 10분 또는 0시간) 동안 혈청, 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액 또는 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 압타머를 항온배양한 후 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었다.
도 25a 내지 도 25b는 혈청의 존재 하에 압타머 CELTIC_코어40HEG, CELTIC_코어40HEGt(도 25a), CELTIC_코어42HEG 및 CELTIC_코어42HEGt(도 25b)의 안정성을 도시하는 막대 그래프이다. 안정성은 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 0.5시간, 10분 또는 0시간) 동안 혈청 또는 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액에서 압타머를 항온배양한 후, 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 대한 압타머의 결합을 유세포측정에 의해 측정함으로써 결정하였다. 항-CD3 OKT3 단클론 항체(32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 26은 극단에 화학적 변형을 보유한: 5' 말단에 테트라진 기 및 3' 말단에 비오틴을 보유한 압타머 CELTIC_코어42HEG가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 압타머 농도: 15nM, 25nM, 35nM, 50 nM 및 75nM에서 시험되었고 3' 또는 5' 말단에서 비오틴으로 변형된 압타머 CELTIC_코어42HEG로 수득된 세포 염색과 비교되었다. 비교를 위해, 라모스 세포(CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 항-CD3 OKT3 및 항-CD19 단클론 항체(각각 32 nM)는 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 27은 각각 C-말단 Fc 융합체로서 제조된 재조합 CD3 ε/γ 및 CD3 ε/δ 단백질의 혼합물에서 수행된 SELEX에 의해 수득된 항-CD3 RNA 압타머(클러스터)의 가장 빈번한 5개 핵산 서열의 핵산 서열 정렬(서열번호 103 내지 107, 위에서 아래로)을 도시한다. hIgG1 Fc는 카운터 표적으로서 사용되었다. 이러한 SELEX의 마지막 세 라운드는 표적으로서 저캣(CD3 양성) 세포에서 그리고 카운터 표적으로서 라모스(CD3 음성) 세포에서 수행되었다. 다중 서열 정렬은 ClustalW 알고리즘으로 수행되었다. 각 클러스터에 보존된 것으로 발견된 뉴클레오티드는 *로 표시되어 있다.
도 28은 SELEX 절차(도 27)에 의해 수득된 처음 5개의 클러스터 중에서 MEME(Multiple Em for Motif Elimination)에 의해 식별된 코어 서열(서열번호 108) 및 염기 분포를 도시한다.
도 29a 내지 도 29b는 ARACD3-0010209(서열번호 103), ARACD3-0270039(서열번호 105), ARACD3-2980001(서열번호 104), ARACD3-3130001(서열번호 106) 및 ARACD3-3700006(서열번호 107)의 서열 및 Mfold 예측된 2차 구조를 도시한다. 번호매김은 플랭킹 영역 뉴클레오티드가 결여된 압타머의 염기 번호를 나타낸다. SELEX에 의해 수득된 5개의 클러스터에서 발견된 코어 서열의 2차 구조도 도시된다. 각 압타머의 2차 구조 및 자유 에너지는 37℃, 1M Na+에서 Quikfold 3.0(Zuker et al. 2003)에 의해 계산되었다.
도 30a 내지 도 30e는 SELEX(도 27)에 의해 수득된 압타머 ARACD3-0010209, ARACD3-0270039, ARACD3-2980001, ARACD3-3130001 및 ARACD3-3700006가 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 비교를 위해, 라모스 세포(인간 CD3 음성 세포, 대조군)에 대한 압타머의 결합도 도시된다. 결합은 압타머의 3가지 농도: 3 nM, 10 nM, 30 nM에서 시험되었다.
도 31a 내지 도 31c는 Series Sensor SA 칩 상에 고정화된 비오틴화된 압타머 ARACD3-3700006, ARCD3-0010209 및 ARCD3-3130001이 CD3 ε/γ(좌측 컬럼), CD3 ε/δ(가운데 컬럼) 및 대조군 hIgG1(우측 컬럼)에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 단일 사이클 동역학 프로토콜을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되었다. 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM 농도에서 압타머의 연속 주사가 수행되었다.
도 32a 내지 도 32c는 혈청의 존재 하의 항-CD3 RNA 압타머 ARCD3-3700006 및 ARCD3-0010209의 안정성 및 무결성을 도시한다. 도 32a(그래프 막대)에서 안정성은 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30분, 10분 또는 0시간) 동안 혈청 또는 5% 혈청을 함유하는 DPBS에서 압타머를 항온배양한 후 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 대한 압타머의 결합을 유세포측정에 의해 측정함으로써 결정되었다. 도 32b 내지 도 32c는 37℃에서 상이한 기간(24시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30분, 10분 또는 0시간) 동안 혈청, 5% 혈청을 함유하는 DPBS 완충액 또는 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 압타머를 항온배양한 후 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정된 압타머의 무결성을 도시한다.
도 33은 SELEX 절차(도 27)에 의해 수득된 압타머 ARACD3-3700006 및 ARCD3-0010209가 건강한 공여자로부터 단리된 말초혈 단핵세포에 결합한 결과를 도시한다. 결합은 다음의 압타머 농도에서 시험되었다: 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM.
도 34a 내지 도 34b는 결합 포화도 및 KD를 추정하기 위한, SELEX(도 27)에 의해 수득된 압타머 ARACD3-3700006 및 ARCD3-0010209가 마우스 CD3-양성 EL4 세포에 결합한 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 결합은 다음의 압타머 농도에서 시험되었다: 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM. 비교를 위해, 인간 저캣 세포에 대한 300 nM 농도의 압타머 결합도 도시된다.
도 35a 내지 도 35f는 사이토카인의 분비에 의해 측정된, 1 ㎛ 농도에서 항-CD3 RNA 압타머에 의한 림프구의 활성화를 도시하는 그래프이다. 분비된 사이토카인의 수준은 37℃에서 상이한 기간(0시간, 16시간, 24시간 또는 48시간) 동안 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 공동자극 항-CD28 항체의 존재 하에 압타머를 항온배양한 후 ELISA에 의해 결정되었다. 도 35a, 35b 및 35c는 각각 압타머 ARCD3-3700006에 의한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 도 35d, 35e 및 35f는 각각 압타머 ARCD3-0010209에 의한 IFNγ, IL-2 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 비교를 위해, 공동자극 항-CD28 항체의 존재 또는 부재 하의 항-CD3 단클론 항체의 활성화도 도시된다.
도 36a 내지 도 36c는 CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현에 의해 측정된, 1 ㎛ 농도에서 항-CD3 RNA 압타머에 의한 인간 림프구의 활성화를 도시하는 막대 그래프이다. CD4- 및 CD8-양성 T 림프구 상의 CD25 및 CD69 표면 마커의 수준은 공동자극 항-CD28 항체의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 48시간 동안 10% 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 압타머를 항온배양한 후 유세포측정에 의해 결정되었다. 도 36a는 ARCD3-3700006 또는 ARCD3-0010209 단독으로 처리된 세포로 수득된 발현 결과를 도시한다. 도 36b는 공동자극 항-CD28 항체와 혼합된 동일한 압타머로 처리된 세포로 수득된 발현 결과를 도시한다. 도 36c는 시약의 농도를 일정하게 유지하기 위해, 3시간, 19시간 및 27시간 항온배양 후 배양 배지에 첨가된 항-CD28 항체와 혼합된 새로운 압타머 용액으로 처리된 세포로 수득된 발현 결과를 도시한다.
도 37a 내지 도 37c는 사이토카인의 분비에 의해 측정된, 1 ㎛ 농도에서 항-CD3 RNA 압타머에 의한 인간 림프구의 활성화를 도시하는 막대 그래프이다. 분비된 사이토카인의 수준은 공동자극 항-CD28 항체의 존재 하에 37℃에서 48시간 동안 10% 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 압타머를 항온배양한 후 인간 Th1/Th2 세포측정 비드 어레이로 결정되었다. 도 37a는 ARACD3-3700006 또는 ARACD3-0010209 단독으로 처리된 세포에 대한 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 및 TNF-α의 분비를 도시한다. 도 37b는 공동자극 항-CD28 항체와 혼합된 동일한 압타머로 처리된 세포의 사이토카인 분비 프로파일을 도시한다. 도 37c는 시약의 농도를 일정하게 유지하기 위해 3시간, 19시간 및 27시간 항온배양 후 배양 배지에 첨가된 항-CD28 항체와 혼합된 새로운 압타머 용액으로 처리된 세포의 사이토카인 분비 프로파일을 도시한다.
도 38a 내지 도 38f는 압타머에 의해 인식되는 CD3의 영역을 맵핑하기 위해, 포화 농도의 경쟁자의 존재 하에 저캣 세포(CD3 양성 세포)에 대한 SELEX 절차(도 27)에 의해 수득된 압타머 ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209, 및 CD3 에피토프에 특이적인 항체의 결합 결과를 도시하는 막대 그래프이다. 도 38a, 38c 및 38e에서, CD3에 특이적인 PE-표지된 단클론 OKT3, UCHT1 및 HIT3a 항체의 결합은 1가지 농도(OKT3 및 HIT3a의 경우 0.1nM 또는 UCHT1의 경우 1nM)에서 및 포화 농도의 비표지된 항체(OKT3 및 HIT3a의 경우 32 nM 또는 UCHT1의 경우 10 nM) 또는 비오틴화된 압타머(300 nM)의 부재 또는 존재 하에 시험되었다. 도 38b, 38d 및 38f에서, 비오틴화된 압타머의 결합은 300 nM의 농도에서 포화 농도의 비표지된 항체(OKT3 및 HIT3a의 경우 32 nM 또는 UCHT1의 경우 10 nM)의 부재 또는 존재 하에 및 PE 표지된 스트렙타비딘의 존재 하에 시험되었다.
본 기술은 항-CD3 압타머에 관한 것이다. CD3-특이적 압타머를 단리하는 방법뿐만 아니라, T 세포로 지시된 치료제를 위한 전달 비히클에 대한 표적화 모이어티로서 및 약학적 조성물의 성분으로서 포함하는 항-CD3 압타머의 다양한 용도가 개시된다.
본 기술의 항-CD3 압타머의 실시양태는 여러 컨센서스 서열을 사용하여 설명될 수 있다. DNA 압타머는 다음의 컨센서스 서열 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다:
1. GX1X2TX3GX4X5X6X7X8X9GGX10CTGG[여기서, X1은 G 또는 A이고; X2 및 X6은 A, T, 또는 G이고; X3은 T 또는 G이고; X4 및 X9는 G 또는 C이고; X5는 C 또는 T이고; X7은 T, G 또는 C이고; X8 및 X10은 C, T 또는 A이다](서열번호 109).
2. GGGX1TTGGCX2X3X4GGGX5CTGGC[여기서, X1 및 X2는 A, T, 또는 G이고; X3은 T, C 또는 G이고; X4 및 X5는 A, T, 또는 C이다](서열번호 110).
3. GX1TTX2GX3X4X5X6CX7GGX8CTGGX9G[여기서, X1은 A 또는 G이고; X2는 T 또는 G이고; X3 및 X7, X9는 G 또는 C이고; X4는 T 또는 C이고; X5는 A 또는 T이고; X6은 T, C 또는 G이고; X8은 A 또는 C이다](서열번호 111).
4. GGGTTTGGCAX1CGGGCCTGGCG[여기서, X1은 G, C 또는 T이다](서열번호 112).
5. GCAGCGAUUCUX1GUUU[여기서, X1은 U이거나 염기 부재이다](서열번호 113).
압타머는 표적 분자에 높은 친화도 및 특이적 결합을 부여하는 2차 및 3차 구조를 갖는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드이다. 분자 포획 기술을 사용한 압타머의 생성은 공지되어 있다(문헌[A. D. Ellington and J. W. Szostak. Nature 346: 818-822, 1990; and C. Tuerk and L. Gold. Science 249: 505-510, 1990] 참조). 압타머는 특정 표적 부위로 분자 제제를 전달하기 위한 표적화 장치로서 사용될 수 있다. 소정 종양은 특정 항원과 연관되며, 이에 기초하여 진단 또는 치료 목적을 위한 종양 표적화를 돕도록 종양-결합 압타머가 설계될 수 있다.
일반적으로, 압타머는 공지된 방법을 사용하여 핵산 서열의 풀로부터 식별되고 단리된다. 핵산 서열의 풀을 표적 분자와 함께 항온배양하고, 결합된 올리고뉴클레오티드를 선별하고, 다음 단계에서 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시킨다. 생성물은 표적 분자들로 구성된 친화도 컬럼을 사용하여 추가로 정제한다. 압타머는 DNA, RNA 또는 PNA를 포함할 수 있고, 염기는 천연 및 비천연일 수 있다. 천연 염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T), 이노신(I) 및 우라실(U)이다. 비천연 발생 염기는 예를 들어 메틸이노신, 디하이드로우리딘, 메틸구아노신, 티오우리딘, 2'-O-메틸 퓨린, 2'-플루오로 피리미딘 및 당업자에게 널리 공지된 많은 다른 것들을 포함한다. PNA 염기는 아미드(펩티드-유사 골격)에 부착된 천연 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. 핵산 서열의 백본은 PNA와 같은 아미드, 또는 DNA 또는 RNA에서와 같은 포스포디에스테르, 티오포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸렌 포스포로티오에이트 또는 이들 화학 구조의 변형일 수 있다.
압타머의 핵산 서열은 불변 영역과 가변 영역 둘 다를 포함할 수 있거나 가변 영역만을 포함할 수 있는 표적-결합 서열만을 포함할 수 있다. 불변 영역 서열은 서열의 결합, 증폭, 복제 또는 절단을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
압타머는 다양한 목적, 예를 들어, 검출, 영상화, 진단, 치료 또는 예방을 위해 표적 또는 표적 부위에 전달되는 제제에 커플링될 수 있다. 제제는 세포, 나노입자, 호르몬, 백신, 합텐, 독소, 효소, 면역계 조절제, 항산화제, 비타민, 조혈계의 기능성 제제, 단백질, 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 이들의 돌연변이, 금속 및 기타 무기 물질, 바이러스 입자, 항원, 예컨대 아미노산, 펩티드, 당류 및 다당류, 수용체, 상자성 및 형광성 표지, 약학적 화합물, 방사성 동위원소 및 방사성 핵종, 예컨대 93P, 95mTc, 99Tm, 186Re, 188Re, 189Re, 111In, 14C, 32P, 3H, 60C, 125I, 35S, 65Zn, 124I 및 226 Ra, 및 안정한 동위원소, 예컨대 3He, 6Li, 10B, 113Cd, 135Xe, 149Sm, 151Eu, 155Gd, 174Hf, 199Hg, 235U, 241Pu 및 242Am를 포함한다.
압타머에 커플링될 수 있는 약학적 화합물은 예를 들어, 통상적인 화학치료제, 항생제, 코르티코스테로이드, 돌연변이원(예를 들어, 니트로우레아), 항대사물질 및 호르몬 길항제를 포함한다.
압타머에 커플링될 수 있는 거대분자는 미토겐, 사이토카인 및 성장 인자를 포함한다. 잠재적으로 유용한 사이토카인은 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL-1, IL-2, IL-3 등), 인터페론 단백질, IFN IFN-α, INF-β 및 IFN-M, 글루코코르티코이드 호르몬을 포함하는 호르몬, 시토신 아라비노시드 및 항바이러스제, 예컨대 아시클로비르 및 간시클로비르를 포함한다.
압타머는 화학적 및 생물학적 기술을 포함하는 널리 공지된 방법을 사용하여 제제에 커플링될 수 있다. 공유 결합과 비공유 결합 둘 다가 생성될 수 있다(C.-P. D. Tu et al., Gene 10:177-83, 1980; A. S. Boutorine et al., Anal. Biochem. Bioconj. Chem. 1:350-56, 1990; S. L. Commerford Biochem, 10:1993-99, 1971; D. J. Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 36:2306-14, 1995). 공유 결합은, 예를 들어, 화학적 접합 반응, 킬레이터, 또는 포스포디에스테르 결합으로부터 형성된 결합을 사용하여 형성될 수 있다. 비공유 결합은 분자적 상호작용, 예컨대 스트렙타비딘과 비오틴 사이의 것들, 수소-결합 및 기타 형태의 이온성 상호작용을 포함한다. 예시적인 킬레이터는 DTPA, SHNH, 및 다좌 킬레이터, 예컨대 N2S2 및 N3S를 포함한다(A. R. Fritzberg et al., J. Nucl. Med. 23:592-98, 1982). 압타머는 또한 세포 표면 또는 나노입자에 결합되어 시험관내 또는 생체내에서 세포 또는 나노입자를 특정 위치로 가이드할 수 있다.
압타머는 지수적 농축에 의한 리간드의 선별적 진화(selective evolution of ligands by exponential enrichment: SELEX) 공정(Ellington et al., 1990; Tuerk et al., 1990)이라 지칭되는 접근법을 사용하여 선별된다. SELEX는 반복적인 시험관내 선별 및 증폭 과정을 통해 올리고뉴클레오티드의 매우 큰 조합적 라이브러리(combinatorial library)를 스크리닝하는 방법이다. 상기 방법은 후보들의 혼합물로부터 선별하고 동일한 일반 선별 주제를 사용하여 구조적 개선을 단계적으로 반복하여 임의의 원하는 결합 친화도 및 선별성 기준을 달성하는 것을 포함한다. 바람직하게는 무작위화된 서열의 세그먼트를 포함하는 핵산의 혼합물로부터 출발하여, 방법은 결합에 유리한 조건 하에 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계, 표적 분자에 결합된 핵산으로부터 비결합 핵산을 분할(즉, 분리)하는 단계, 핵산-표적 쌍을 해리시키는 단계, 핵산-표적 쌍으로부터 해리된 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드-농축된 혼합물을 생성하는 단계에 이어서 상기 결합, 분할, 해리 및 증폭 단계들을 원하는 대로 가능한 한 많은 사이클을 통해 반복하는 단계를 포함한다.
SELEX는 많은 수의 가능한 서열 및 구조를 함유하는 핵산 혼합물 내에서 소정의 표적에 대한 광범위한 결합 친화도가 있다는 통찰력에 기반한다. 예를 들어, 20-뉴클레오티드 무작위화된 세그먼트를 포함하는 핵산 혼합물은 420개의 후보 가능성을 가질 수 있다. 표적에 대한 더 높은 친화도 상수를 갖는 것들이 결합할 가능성이 가장 높다. 분할, 해리 및 증폭 후, 더 높은 결합 친화도 후보를 위해 농축된 제2 핵산 혼합물이 생성된다. 추가의 선별 라운드는 생성된 핵산 혼합물이 주로 단지 1개 또는 수 개의 서열로 구성될 때까지 최상의 리간드를 점진적으로 선호한다. 그 다음, 이들을 클로닝하고 시퀀싱하고 순수한 리간드로서의 결합 친화도에 대해 개별적으로 시험할 수 있다.
선별 및 증폭의 사이클은 원하는 목표가 달성될 때까지 반복된다. 가장 일반적인 경우에서, 선별/증폭은 사이클을 반복해도 결합 강도의 현저한 개선이 달성되지 않을 때까지 계속된다. 반복적인 선별/증폭 방법은 적어도 65,000개의 서열 변이체를 함유하는 혼합물에서 단일 서열 변이체를 단리할 수 있을 만큼 충분히 민감하다. 상기 방법은 심지어 1014개 서열을 함유하는 혼합물에서 적은 수의 고친화도 서열을 단리할 수 있다. 상기 방법은 원칙적으로 약 1018개만큼 많은 상이한 핵산 종을 샘플링하는 데 사용될 수 있다. 시험 혼합물의 핵산은 바람직하게는 무작위화된 서열 부분뿐만 아니라 효율적인 증폭에 필요한 보존된 서열을 포함한다. 핵산 서열 변이체는 무작위화된 핵산 서열의 합성 및 무작위로 절단된 세포 핵산으로부터의 크기 선별을 포함하는 수많은 방식으로 생산될 수 있다. 가변 서열 부분은 전체적으로 또는 부분적으로 무작위 서열을 함유할 수 있다; 이는 또한 무작위화된 서열이 혼입된 보존된 서열의 하위 부분을 함유할 수 있다. 시험 핵산 내의 서열 변이는 선별/증폭 반복 전 또는 동안 돌연변이유발에 의해 도입되거나 증가될 수 있다.
많은 경우에, 단일 핵산 리간드가 식별될 때까지 SELEX의 반복 단계를 수행하는 것이 반드시 바람직하지는 않다. 표적-특이적 핵산 리간드 용액은 다수의 보존된 서열, 및 표적에 대한 핵산 리간드의 친화도에 현저하게 영향을 미치지 않으면서 치환되거나 첨가될 수 있는 다수의 서열을 갖는 핵산 구조 또는 모티프의 패밀리를 포함할 수 있다. 완료 전에 SELEX 공정을 종료함으로써, 핵산 리간드 용액 패밀리의 다수의 구성원의 서열을 결정할 수 있으며, 이를 통해 핵산 리간드 용액에 대한 포괄적인 설명을 결정할 수 있다.
핵산 리간드 패밀리에 대한 설명이 SELEX에 의해 해결된 후, 특정 경우에 SELEX 실험 동안에 수신된 정보에 의해 맞춤화된 추가의 일련의 SELEX를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, SELEX의 제2 시리즈에서 핵산 리간드 패밀리의 보존된 영역은 고정될 수 있지만, 리간드 구조 내의 모든 다른 위치는 무작위화된다. 대안적인 실시양태에서, 핵산 리간드 패밀리의 가장 대표적인 구성원의 서열은 SELEX 공정의 기초로서 사용될 수 있으며, 여기서 핵산 서열의 원래 풀은 완전히 무작위화되지 않고 가장 잘 알려진 리간드에 대한 편향을 함유한다. 이러한 방법들에 의해, SELEX 공정을 최적화하여 가장 바람직한 핵산 리간드에 도달할 수 있다.
본 발명의 압타머는 임의의 원하는 길이를 가질 수 있다. 압타머는 적어도 약 15개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 압타머는 약 80개 이하의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
현대 기술은 원하는 평형 상수(KD)를 갖는 압타머를 식별하거나 생성할 수 있도록 한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 약 1 pM 내지 약 10.0 μM; 약 1 pM 내지 약 1.0 μM; 약 1 pM 내지 약 100 nM; 약 100 pM 내지 약 10.0 μM; 약 100 pM 내지 약 1.0 μM; 약 100 pM 내지 약 100 nM; 또는 약 1.0 nM 내지 약 10.0 μM; 약 1.0 nM 내지 약 1.0 μM; 약 1 nM 내지 약 200 nM; 약 1.0 nM 내지 약 100 nM; 약 500 nM 내지 약 10.0 μM; 또는 약 500 nM 내지 약 1.0 μM의 평형 상수(KD)를 포함한다.
표적 분자는 소분자, 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다. 본원에 설명된 압타머의 경우, 표적 분자는 CD3 ε/γ 및/또는 CD3 ε/δ 단백질이다.
본 발명의 압타머는 약제학적 조성물에서 사용될 수 있다.
정의
핵산은 DNA, RNA, XNA 단일가닥 또는 이중가닥 및 이들의 임의의 화학적 변형을 의미한다.
압타머(또는 리간드)는 다른 분자(표적)에 결합하는 핵산을 의미한다. 후보 핵산의 집단에서, 압타머는 대규모 집단의 것보다 더 큰 친화도로 결합하는 것이다. 복수의 후보 압타머 서열 중에는, 소정의 표적에 대해 하나 초과의 압타머가 존재할 수 있다. 압타머는 표적 분자에 대한 결합 친화도가 서로 상이할 수 있다.
압타머 서열과 같은 핵산 서열의 변이체는 BLAST 알고리즘과 같은 서열 동일성 알고리즘에 의해 결정 시 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 변이체는 또한, 임의로 뉴클레오티드의 링커 또는 결합에 의한 대체와 함께, 하나 이상의 염기의 비-천연 염기로의 치환 또는 하나 이상의 염기의 제거를 포함할 수 있다. 변이체는 또한 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 변형된 핵산 백본을 포함할 수 있다.
복수의 후보 압타머 서열은 원하는 압타머를 선별하기 위한 상이한 서열의 복수의 핵산이다. 후보 서열의 공급원은 천연-발생 핵산 또는 이의 단편, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 전술한 기술들의 조합에 의해 제조된 핵산일 수 있다.
표적 분자는 리간드가 요망되는 임의의 관심대상 화합물을 의미한다. 표적 분자는 비제한적으로 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 기질, 대사산물, 전이 상태 유사체, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자 등일 수 있다. 표적은 또한 압타머가 특이적으로 결합하고자 하는 원하는 단백질을 발현하는 세포일 수 있다. 세포를 이용한 압타머 선별은 세포-SELEX라 지칭될 수 있다(Chen C et al., npj Precision Oncology (2017) 1-37). 세포-SELEX는 표적으로서 살아있는 세포를 사용한다. 압타머는 살아있는 세포 막 단백질과 결합한다. 세포-SELEX의 절차는 양성 선별 및 음성 선별을 포함한다. 양성 선별을 위해, 단일 가닥 DNA 또는 RNA 라이브러리를 표적 세포와 함께 항온배양하고 결합된 서열을 수집한다. 결합된 서열은 음성 세포와 함께 항온배양하고, 미결합 서열은 수집하여 증폭, 시퀀싱 및 클로닝을 위해 사용한다. 압타머는 수 회의 교대 사이클 후에 수득된다. 본 개시내용은 표적으로서 살아있는 세포의 사용을 포함시킴에 의한 항-CD3 압타머의 선별을 포함한다. CD3 양성 저캣 세포 및 CD3 음성 라모스 세포가 각각 양성 및 음성 선별을 위해 사용되었다.
분리(또는 분할)는 본원에서 압타머-표적 쌍 또는 서열-표적 복합체로서 명명되는 표적 분자에 결합된 리간드가 표적 분자에 비결합 핵산으로부터 분리될 수 있는 임의의 과정을 의미한다. 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 핵산-단백질 쌍은 니트로셀룰로오스 필터에 결합될 수 있는 반면, 미결합 핵산은 결합되지 않는다. 서열-표적 복합체를 특이적으로 보유하는(또는 부착된 표적에 복합체화된 결합된 압타머를 특이적으로 보유하는) 컬럼이 분할을 위해 사용될 수 있다. 액체-액체 분할 뿐만 아니라, 여과 겔 지연 및 밀도 구배 원심분리도 사용될 수 있다. 분리 방법의 선택은 표적 및 서열-표적 복합체의 특성에 의존할 것이고 당업자에게 공지된 원리 및 특성에 따라 이루어질 수 있다.
증폭은 분자 또는 분자 부류의 카피의 양 또는 수를 증가시키는 임의의 공정 또는 공정 단계들의 조합을 의미한다. 개시된 실시예에서 RNA 분자의 증폭은 일련의 3가지 반응에 의해 수행되었다: 선별된 RNA의 cDNA 카피의 제조, 각 cDNA의 카피 수를 증가시키기 위한 폴리머라제 연쇄 반응의 사용 및 선별된 RNA로서 동일한 서열을 갖는 RNA 분자를 수득하기 위한 cDNA 카피의 전사. 당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이 직접적인 DNA 복제, 직접적인 RNA 증폭 등을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 반응 또는 반응들의 조합이 적절하게 사용될 수 있다. 증폭 방법은 초기 혼합물 중의 상이한 서열들의 비율을 본질적으로 대표하는 증폭된 혼합물의 비율이 생성되도록 해야 한다.
무작위화된은 원칙적으로 소정의 길이에 걸쳐 임의의 가능한 서열을 갖는 핵산의 세그먼트를 설명하는 데 사용되는 용어이다. 무작위화된 서열은 원하는 대로 약 8개 내지 100개 이상의 뉴클레오티드 범위의 다양한 길이를 가질 것이다. 무작위 서열 세그먼트가 제조되는 화학적 또는 효소적 반응은 존재할 수 있는 미지의 편향 또는 뉴클레오티드 선호도로 인해 수학적으로 무작위 서열을 산출하지 않을 수 있다. 용어 "무작위화된"은 비이상성으로부터의 이러한 이탈 가능성을 반영하기 위해 "무작위" 대신 사용된다. 현재 공지된 기술, 예를 들어 순차적 화학 합성에서는, 큰 이탈이 발생하는 것으로 알려져 있지 않다. 20개 이하의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 세그먼트의 경우, 존재할 수 있는 임의의 사소한 편향은 무시해도 될 정도의 결과를 초래할 것이다. 단일 합성의 서열이 길수록 임의의 편향의 효과가 더 커진다.
편향은 예를 들어 합성 반응의 전구체 뉴클레오시드(또는 데옥시뉴클레오시드) 트리포스페이트의 몰비를 변경함으로써, 무작위화된 서열 내로 의도적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 소정의 유기체에서 개별 염기의 비율을 근사화하거나 2차 구조에 영향을 미치거나 용융 pH 또는 pH 민감도에 영향을 미치기 위해, 의도적인 편향이 요망될 수 있다. 서열은 CG 염기쌍보다 더 높은 백분율의 AT를 함유하도록 편향되어 이의 용융 pH를 감소시킬 수 있다.
실시예
실시예 1: 항-CD3 DNA 압타머
라이브러리 및 프라이머
DNA 압타머 선별을 위해 설계된 단일가닥 DNA(ssDNA) 라이브러리는 트리링크 바이오테크놀로지스(TriLink Biotechnologies)에서 구입하였다. 라이브러리는 2개의 불변 영역이 플랭킹된 40-뉴클레오티드 무작위 영역(N40)으로 구성되었다: 5'-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-(N40)-TTGACTAGTACATGACCACTTGA-3'(서열번호 114), 이는 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용되었다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 다음과 같았다: 5'-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-3'(서열번호 115)(정방향 프라이머) 및 5'비오틴-TCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA-3'(서열번호 116)(역방향 프라이머). 선별 동안, 제조업체의 프로토콜에 따라 AmpliTaq Gold 360 폴리머라제 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 Eppendorf Mastercycler Nexus에서 라이브러리를 증폭시켰다. 다음의 조건을 사용하였다: 폴리머라제 활성화 및 95℃에서 10분 동안 초기 변성, 95℃에서 30초 동안 변성, 45℃에서 30초 동안 어닐링(각 PCR 사이클 동안 0.2℃씩 증가), 72℃에서 1.5분 동안 연장 및 72℃에서 7분 동안 최종 연장. 5' 말단에 비오틴을 갖는 역방향 프라이머의 변형은 스트렙타비딘-커플링된 자기 비드를 사용하여 증폭된 이중가닥 DNA(dsDNA)로부터 각각의 연속적인 선별 라운드 동안 ssDNA 라이브러리를 생성할 수 있게 하였다. 두 프라이머는 모두 HPLC 등급으로 정제하였으며 유로젠텍(Eurogentec)에서 구입하였다.
DNA 압타머 선별
SELEX 공정은 6개의 선별 라운드로 구성되었으며 인간 면역글로불린 G1의 불변 Fc 도메인과의 C-말단 융합체로서 구입한 CD3 엡실론/감마(CD3 ε/γ)와 CD3 엡실론/델타(CD3 ε/δ) 이량체로 구성된 CD3 단백질의 재조합 ε 사슬에서 수행하였다. 결과적으로, 인간 면역글로불린 G1(IgG1 Fc)의 Fc 단편을 음성 선별을 위해 사용하였다. 모든 단백질은 아크로바이오시스템즈(AcroBiosystems)에서 구입하였다. 각 선별 라운드는 다음의 단계들을 포함하였다: 카운터 선별(counter selection), 표적과 ssDNA 라이브러리의 항온배양, 표적을 인식하는 서열의 PCR 증폭 및 스트렙타비딘-변형된 자기 비드 상에서 dsDNA의 분리. 각 사이클 전에, ssDNA 라이브러리(초기 사이클의 경우 2.5 nmol)를 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 선별(SELEX) 완충액(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, pH 7.2, DNase 및 RNase 무함유, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입)에서 4℃에서 5분 동안 즉시 냉각시켰다. Fc 도메인 특이적 서열을 제거하기 위해, ssDNA 라이브러리를 서모사이클러(thermocycler)(Eppendorf Mastercycler Nexus)에서 37℃에서 90분 동안 IgG1-Fc 단백질(0.5 nmol, 1 μM)과 함께 항온배양하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 Millipore의 25mm 직경 지지 필터 홀더에 삽입하고 선별 완충액으로 세척된 니트로셀룰로오스 아세테이트 막(0.45 ㎛ HAWP 막, 25 mm 직경, Millipore)을 통해 여과하였다. 여과 전에, HAWP 막을 선별 완충액에 적어도 30분 동안 침지시켰다. 여과 후, 부착된 IgG1-Fc/ssDNA 복합체를 갖는 막 및 필터에 결합된 비특이적 ssDNA 서열을 폐기하였다. 미결합 서열을 함유하는 여액을 10kDa AMICON Ultra-15 MWCO 필터를 사용하여 농축시킨 후, 양성 표적과 함께 항온배양하였다. 제1 사이클에서, 압타머를 서모사이클러에서 37℃에서 120분 동안 500μL의 용적으로 재조합 CD3 ε/γ(0.15 nmol, 0.3 μM) 및 CD3 ε/δ(0.15 nmol, 0.3 μM) 도메인에 대해 선별하였다. 제2 라운드로부터는, CD3 ε/γ 및 CD3 ε/δ를 각 사이클에서 교대로 사용하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 니트로셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 여과하였다. 필터를 8 mL의 선별 완충액으로 세척하여 단백질에 부착된 모든 저-친화도 및 저-특이성 서열을 제거하였다. 필터에 잔류하는 단백질에 결합된 ssDNA는 75℃에서 5분 동안 1mL의 7 M 우레아에서 막을 2회 항온배양하여 용출하였다. 회수된 ssDNA 용액을 DNase 및 RNase 무함유 물(Invitrogen)에 2배 희석하고 10 kDa AMICON Ultra-4 MWCO 필터를 사용하여 농축시켰다. 서열을 물에 재희석하고 재농축시켰다. 수득된 용액을 Micro Bio-Spin P-6 컬럼(SSC 완충액 중에서, Bio-Rad)에서 정제하고 5 μL의 선형 폴리아크릴아미드(Invitrogen)의 존재 하에 에탄올(HPLC 등급, Fisher) 및 3 M의 아세트산나트륨 pH 5.2(ThermoScientific, 미국 매사추세츠 월섬)에 침전시켰다. -25℃에서 약 1시간 동안 항온배양한 후, 용출된 ssDNA를 4℃에서 20분 동안 21000g에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, ssDNA를 갖는 펠렛을 DNase 및 RNase 무함유 물 200μL에 희석하고 공기 중에서 20분 동안 정치시켜 에탄올을 증발시켰다. 선별된 ssDNA 서열을 비변형 정방향 프라이머 및 비오틴화된 역방향 프라이머의 존재 하에 PCR 반응(AmpliTaq Gold 360, Applied Biosystems)으로 증폭시켰다. 최적의 PCR 사이클 횟수는 각각의 선별 라운드마다 개별적으로 선택하였다. 이러한 목적을 위해, 증폭의 진행을 아가로스 겔(TBE 완충제, Invitrogen에서 SYBRSafe를 사용하여 3%)에서 다양한 횟수의 PCR 사이클 후에 수득된 dsDNA 샘플의 이동에 의해 추적하였다. dsDNA에 해당하는 밴드가 아가로스 겔에 나타나면 PCR 반응을 중단하였다. 그 다음, 증폭된 dsDNA를 갖는 PCR 혼합물을 수집하고 물에 희석하여 15 mL의 최종 용적을 수득하고 10 kDa AMICON Ultra-15 MWCO 막을 사용하여 농축시켰다. 농축된 샘플의 분취량을 시퀀싱 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다. 선별의 다음 사이클을 위한 ssDNA 사슬을 정제하고 생성하기 위해, 나머지 샘플을 증폭된 dsDNA에 존재하는 비오틴을 통해 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드(MyOne Streptavidin Dynabeads)에 결합시켰다. 항온배양은 제조업체의 프로토콜에 따라 결합 완충액(1 M NaCl, 5 mM Tris, 0.5 mM EDTA pH 8.0, DNase 및 RNase 무함유, 시그마-알드리치에서 구입)에서 18분 동안 실온에서 수행하였다. 3 mg의 자기 비드를 20 ㎍의 dsDNA를 위해 사용하였다. 그 후, dsDNA를 갖는 자기 비드를 용액으로부터 분리하고 결합 완충액(항온배양을 위해 사용된 2배 용적)으로 5회 세척하여 임의의 잔류하는 비특이적으로 결합된 라이브러리 종 및 PCR 반응 잔사를 제거하였다. 염기성 조건 하에 변성에 의해 발생하는 DNA 사슬의 분리는 50 mM NaOH(Sigma-Aldrich의 BioUltra) 용액에서 변형된 비드를 3분 동안 항온배양함으로써 수행하였다. 그 결과, 비오틴화된 DNA 사슬은 자기 비드에 부착된 채로 남아 있었고, 관심대상의 비변형 사슬은 용액으로 방출되어 회수되었다. 수득된 ssDNA를 물에 4 mL의 최종 용적으로 희석하고 10 kDa AMICON Ultra-4 MWCO를 사용하여 농축시켜 NaOH를 제거하였다. Micro Bio-Spin 컬럼(P-6; BioRad)을 사용하여 선별 완충액으로의 교환을 수행하였다. 회수된 ssDNA 라이브러리의 품질을 아가로스 겔(TBE 완충액 중 3%)에서의 이동에 의해 분석하고, 농도는 260 nm에서 흡광도를 측정하여 NanoDrop One(ThermoScientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 계산하였다.
SELEX 공정의 연속적인 라운드 동안, 선별의 엄격성을 점차 증가시켰다(표 1 참조). 예를 들어, 표적 및 ssDNA 라이브러리의 농도를 감소시키고, 단백질과의 항온배양 시간을 감소시키고, 선별 후 막 세척을 위한 완충액의 용적을 증가시켰으며, 마지막 선별 라운드 동안 비특이적 경쟁자(효모 총 RNA, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다.
Figure pct00001
각 SELEX 사이클 후에 수득된 PCR 분취량과 초기 ssDNA 라이브러리를 Illumina NextSeq MidOutput(150 사이클) 시스템을 사용하여 차세대 시퀀싱에 의해 분석하였다. 상기 분석은 뉴욕 대학교의 게놈 기술 센터(Genome Technology Center)에서 수행되었다. 고처리량 시퀀싱으로부터의 데이터를 Galaxy 프로젝트 웹 사이트를 사용하여 분석하였다. 시퀀싱 결과에 기초하여, 친화도 및 특이성 시험을 위한 압타머 후보를 선택하였다.
이들 압타머의 핵산 서열은 도 1, 6 및 7a 내지 7b에 도시한다. PCR 증폭에 사용된 플랭킹 영역을 갖거나 갖지 않는 DNA 압타머는 표준 고체상 포스포르아미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 단일 가닥 올리고로서 유로젠텍 카네카(Eurogentec Kaneka)(벨기에 리에주)로부터 입수하였다. 비오틴을 압타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 압타머의 5'-말단에 첨가하였다. 모든 압타머에 대해, 분자량, 순도 및 무결성을 제조업체에 의한 HPLC-MS로 검증하였다.
도 17e 및 도 18에 도시된 코어 서열 CELTIC_코어에 돌연변이를 도입하기 위해 동일한 합성 접근법을 뒤이어 수행하였다. 고체상 합성 동안 C3 스페이서 암을 혼입시켜 코어 서열을 따라 다양한 위치에서 무염기 부위를 생성하였다. 필요한 경우, 입체 장애를 최소화하기 위해 추가의 헥사에틸렌 글리콜(HEG) 링커를 5'-말단 변형 작용기와 5' 위치의 압타머의 제1 뉴클레오티드 사이에 삽입하였다. 코어 서열 변이체의 추가 변형은 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 향상시키기 위한 전략으로서 3'-3' 데옥시-티미딘을 첨가하는 것을 포함하였다.
마지막으로, 압타머의 5'-말단을 말단 포스페이트에 첨가된 C6 아미노 변형제를 통해 1급 아민으로 작용화하였다. 테트라진 작용기를 표준 NHS/EDC 화학을 통해 테트라진-PEG5-NHS 에스테르로서 첨가하여 압타머 서열과 테트라진 플래그 사이에 16-원자 혼합 극성 스페이서를 도입하였다.
실시예 2: 항-CD3 RNA 압타머
라이브러리 및 프라이머
초기 RNA 라이브러리 주형 및 프라이머는 ssDNA로서 IDT(미국 아이오와주 코랄빌)에 의해 합성되었다: 5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-(N20)-TTTCTGCAGCGATTCTTGTTT-(N10)-GGAGAATGAGGAACCCAGTGCAG-3', (서열번호 117), 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3', (서열번호 118) (정방향 프라이머), 5'-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3' (역방향 프라이머) (서열번호 119). 프라이머가 2차 구조에 미치는 영향을 최소화하기 위해 5'- 및 3'-불변 프라이머 영역에 상보적인 2개의 짧은 "차단" 서열(IDT에서 구입)을 합성하여 하였다: 5'-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3', (서열번호 120)(정방향 차단 서열), 5'-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3', (서열번호 121)(역방향 차단 서열). 라이브러리의 불변 중심 영역에 상보적인 추가의 비오틴화된 "포획" 서열도 IDT에 의해 합성되었다: 5'-비오틴-GTC-PEG-6 스페이서-CAAGAATCGCTGCAG-3'(서열번호 122). 모든 물질은 250 nmole 규모로 주문하였고 탈염 정제를 거쳤다.
RNA 압타머 선별을 위한 RNA 라이브러리를 최종 적용에서 더 큰 안정성을 위해 2'플루오로-(2'F-) 피리미딘으로 변형시켰다. T7 프라이머를 티타늄 Taq DNA 폴리머라제(Clontech; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용한 프라이머 연장을 위한 라이브러리 주형 서열과 조합하였다. 그 다음, 프라이머-연장된 물질을 Durascribe® T7 전사 키트(Epicentre; 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 전사시키고, American Bioanalytical(미국 매사추세츠주 나틱)에서 구입한 8 M 우레아(Sequel NE Reagent, 파트 A 및 파트 B)를 이용하여 변성 폴리아크릴아미드에서 정제하였다. 선별 동안, 라이브러리를 제조업체의 프로토콜에 따라 SuperScript IV 역전사효소(Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 역전사시키고 Clontech의 티타늄 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시켰다. 선별 동안, 라이브러리를 다음의 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭시켰다(95℃에서 10초, 60℃에서 30초와 95℃에서 60초의 초기 HotStart 활성화). 그 다음, Durascribe® T7 전사 키트를 사용하여 RNA 라이브러리를 전사시키고 폴리아크릴아미드 겔(PAGE)에서 정제하였다. 4℃ 밤새 정제 후 라이브러리 회수를 위한 겔 용출 완충액을 0.5 M NH4OAc, 1 mM EDTA(둘 다 테크노바(Teknova)에서 구입), 0.2% SDS(암레스코(Amresco)에서 구입), pH 7.4로 제조하였다.
RNA 압타머 선별
RNA 라이브러리 스크리닝은 용융(Melting-Off) 접근법을 사용하여 9라운드의 선별으로 수행하였다. 라운드 1 내지 6의 선별은 DNA 압타머 선별과 동일한 물질을 사용하여 표적으로서 CD3 단백질의 재조합 ε 사슬 및 카운터-표적으로서 IgG1 Fc 단편에 대해 수행하였다. 7번째 라운드부터, CD3 단백질을 발현하는 저캣 세포(급성 T 세포 백혈병 세포주 - ATCC TIB-152)에 대해 스크리닝을 수행하였고, 음성 선별 단계(세포-SELEX)를 위해서는 라모스 세포(버킷트 림프종 인간 세포주 - ATCC CRL-1596)를 이용하였다. 세포는 아메리칸 타입 셀 컬렉션(American Type Cell Collection)에서 입수하였으며 10% FBS(Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스텝토마이신(Gibco Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco Invitrogen)에서 배양하였다. 모든 선별은 10% 혈청 매트릭스가 보충된 1X RPMI 배지에서 수행하였으며, 각각의 SELEX 라운드는 다음의 단계들을 포함하였다: 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 상에서 RNA 라이브러리의 고정화, 카운터 선별, 표적과의 항온배양, 표적을 인식한 서열의 역전사, PCR 증폭 및 RNA로의 전사. 각 라운드 전에, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드(MyOne Streptavidin T1 Dynabeads™, 전형적으로 1 pmole의 비오틴화된 물질은 Dynabead™ 20㎍마다 사용되며, 양은 요구되는 엄격성에 따라 다르다)의 분취량을 200 μL PBS-T(0.01% Tween 20의 최종 농도, pH 7.4) 세척 완충액으로 3회 사전세척하였다. RNA 라이브러리를 혈청이 없는 1X RPMI 배지(90℃에서 1분 변성, 60℃에서 5분 어닐링, 그 다음 23℃에서 5분)에서 프라이머-차단 서열 및 포획 서열 둘 다의 라이브러리 몰량의 2배를 사용하여 재폴딩시켰다. 이는 불변 프라이머 영역이 압타머의 2차 구조에 미치는 영향을 최소화하여 라이브러리가 스트렙타비딘-비오틴 결합 상호작용을 통해 자기 비드에 의해 포획되게 하고 엑소뉴클레아제로부터 압타머 말단을 보호하기 위해 수행하였다. 재폴딩이 완료된 후, 라이브러리를 실온에서 15분 동안 항온배양하여 자기 비드에 포획하였다. 그 다음, 자기 비드를 용액으로부터 분리하고 37℃에서 200μL의 선별 완충액으로 3회 세척하여 잔류 PBS-T 및 비특이적으로 결합된 라이브러리 종을 제거하였다. 그 다음, 정화된 RNA 라이브러리를 갖는 자기 비드를 37℃에서 30분 동안 200 μL의 카운터-표적 제제 중에서 카운터 선별 항온배양을 거치게 하여 자기 비드로부터 비특이적 서열의 방출을 초래하였다. 그 다음, 비특이적 라이브러리 구성원을 폐기하고 자기 비드를 200μL의 선별 완충액으로 7분 동안 6회 세척하였다. 양성 선별은 37℃에서 30분 동안 200μL의 양성 제제와 자기 비드 RNA 라이브러리의 항온배양으로 구성되었다. 제1 사이클에서는, 압타머를 재조합 CD3 ε/γ 및 CD3 ε/δ 도메인(각각 0.1 μM)에 대해 선별하고, 제2 라운드부터는 CD3 ε/γ 및 CD3 ε/δ를 교대로 사용하였다. 제6 라운드에서는, 세포에 대한 선별 전에 라이브러리를 2가지 양성 조건(각각 CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 대해)으로 분할하여 두 재조합 단백질 모두에 대한 반응을 관찰할 수 있도록 보장하였다. 그 다음, 제6 라운드 양성 라이브러리를 회수 동안 함께 풀링한 후, 세포 선별을 수행하였다. 세포-SELEX 라운드의 경우, 표적 및 카운터-표적 세포를 해동하고 5,000 x g에서 원심분리하여 펠렛화하고, 200 μL의 선별 완충액에 현탁시키기 전에 선별 완충액으로 2회 세척하였다. 항온배양에 사용된 세포의 수는 카운터 선별의 경우 15x106개였고 양성 선별의 경우 1x106 내지 15x106개였다. 일단 양성 선별이 완료되면, 표적을 인식하는 서열을 함유하는 상청액을 자기 비드로부터 분리하여 회수하였다. 그 다음, 자기 비드가 완전히 제거되었는지 보장하기 위해 상청액을 제2 자기 분리를 거치게 하였다. 세포-SELEX 라운드의 경우, 표적화된 저캣 세포를 제2 자기 분리 후 5,000 x g에서 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛화된 세포를 200 μL의 선별 완충액으로 1회 세척하여 저-친화도 및 저-특이성 압타머 종을 제거하였다. 라이브러리를 70℃에서 열 변성에 의해 세포로부터 회수하였다. 모든 라운드에서 회수된 라이브러리는 MPC 시약(Lucigen Corp, 미국 위스콘신주 미들턴)을 이용한 단백질 침전, 에탄올 침전 및 샘플의 농축을 거쳤으며 8 M 우레아를 사용하여 10% 변성 PAGE로 정제하였다. 그 다음, 제조업체의 지침에 따라 SuperScript IV 역전사효소를 사용하여 라이브러리를 역전사시키고 Titanium® Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시키고 제조업체의 지침에 따라 Durascribe® T7 전사 키트를 사용하여 전사시켰다. 그 다음, 전사 생성물을 8M 우레아를 사용하여 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 정제하였다. 겔 조각을 절단하고 겔 용출 완충액에서 4℃에서 밤새 용출시키고, RNA 라이브러리의 농도를 NanoDrop-1000에서 260 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
SELEX 공정의 연속적인 라운드 동안, RNA 라이브러리의 농도를 점차적으로 감소시켰다. 추가의 병행 평가 및 "교차 적합성 시험"를 수행하여, 선별 후 생물정보학 분석 동안에 우수한 압타머 후보의 식별을 용이하게 하였다.
압타머 후보는 MiniSeq Mid Output(150 사이클) 시스템(Illumina)을 사용한 차세대 시퀀싱에 의해 선택하였다. 추가 시험를 위해 여러 압타머를 선별하였다. 이를 위해 2'-데옥시-2'-플루오로-티미딘-변형된 RNA 압타머를 Integrated DNA Technologies(IDT, 미국 코랄빌)에서 구입하였다. 비오틴을 압타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 압타머의 5'-말단에 첨가하였다. 분자량, 순도 및 무결성을 HPLC-MS에 의해 검증하였다. 이들 압타머의 핵산 서열은 도 27에 도시한다.
실시예 3: 세포에서 발현된 CD3 단백질에 대한 항-CD3 DNA 압타머의 친화도 및 특이성의 결정
세포에서 발현된 CD3 단백질에 대한 DNA 압타머 후보의 친화도 및 특이성을 유세포측정에 의해 평가하였다. 이들 연구는 5%의 FBS가 보충된 선별(SELEX) 완충액에서 비오틴화된 후보 압타머와 함께 항온배양함으로써 CD3 양성 저캣(급성 T 세포 백혈병 인간 세포주 - ATCC TIB-152), EL4(림프종 마우스 세포주 - ATCC CRL-2638) 및 CD3 음성 라모스(버킷 림프종 인간 세포주 - ATCC CRL-1596) 세포에서 수행하였다. 세포는 사용 전에 10% FBS(Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스텝토마이신(Gibco Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco Invitrogen)에서 배양하였다. 실험에 전에, 저캣, EL4 및 라모스 세포(2.5 x 105개 세포/웰)를 96웰 플레이트에 접종하고 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 펠렛화된 세포를 37℃에서 예열된 200 μL의 SELEX-5 % FBS 완충액으로 2회 세척하였다. 각각의 세척 단계에 이어서 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 후보 압타머는 95℃에서 5분 동안 변성시키고 즉시 4℃의 얼음 블록 상에 5분 동안 놓았다. 시험 샘플을 후속적으로 2가지 상이한 농도 범위: 3, 10, 30 nM 및 1, 2.5, 5, 7.5, 10 nM에서 희석한 후, 100 nM 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘(스트렙타비딘-PE, eBioscience)을 각각의 용액에 첨가하였다. EL4 세포와의 항온배양을 위해, 압타머를 추가적으로 100 및 300 nM으로 희석하였다. 저캣, EL4 및 라모스 세포를 DNA 희석액(100 μL/웰)에 재현탁하고 37℃에서 30분 동안 5% CO2 가습 대기에서 항온배양하였다. 대조군으로서, 세포를 CD3 단클론 항체(PE-표지됨, OKT3 인간 항-CD3, Invitrogen), PE-스트렙타비딘 또는 추가 시약이 없는 각각의 완충액과 함께 항온배양하였다. 항온배양 후, 세포를 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 미결합 서열을 갖는 상청액을 폐기하였다. 펠렛화된 세포를 SELEX-5% FBS 완충액(200 μL/웰)으로 세척하고, 약하고 비특이적으로 부착된 모든 서열을 제거하기 위해 2회 원심분리하였다. 그 다음, 세포를 5% CO2 가습 대기에서 37℃에서 1 mg/mL 연어 정자 DNA 용액(100 μL/웰)으로 세척하였다. 30분 후, 연어 정자 용액을 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 제거하고, 세포를 SELEX-5% 완충액(200 μL/웰)으로 2회 추가 세척한 후 원심분리하였다. 그 다음, 부착된 DNA 서열을 갖는 저캣, EL4 및 라모스 세포를 고정시키고(BD CellFIX 용액 #340181) 형광-양성 세포를 YL-1 채널 상에서 유세포측정(AttuneNXT; Invitrogen, Inc.)에 의해 계수하였다.
결합 연구의 결과는 도 2a 내지 도 2e에 도시한다. 5가지 압타머, CELTIC_1, CELTIC_1, CELTIC_2, CELTIC_3 및 CELTIC_21을 분석하였다. CELTIC_1s는 특정 플랭킹 영역 뉴클레오티드가 결여되어 있다는 점에서 CELTIC_1과 상이하다. 비교를 위해, CD3 음성 라모스 세포(버킷 림프종 인간 세포주 - ATCC CRL-1596)에 대한 압타머의 결합을 또한 측정하였다. 모든 압타머는 CD3 양성 세포에 대한 우선적인 결합을 나타낸다. CELTIC_3은 10 nM에서 포화 결합을 나타냈다. 그것은 훨씬 더 큰 특이성으로 3 nM에서 현저한 결합을 나타냈다. 이러한 결과들에 기초하여, 저캣 세포에 대한 CELTIC_3의 결합의 겉보기 KD는 3 nM 내지 10 nM이다. 이들 압타머는 저캣 세포에 대한 결합에 대해 더 낮은 농도에서도 시험하였으며, 이는 저캣 세포에 대한 우선적 결합을 확인시켜 주었다. 도 3a 내지 도 3e를 참조한다. 다른 세포 결합 분석에서, 압타머 CELTIC_2, CELTIC_3 및 CELTIC_21의 세포에 대한 결합을 세포에 대한 더 짧은 버전 CELTIC_2, CELTIC_3 및 CELTIC_21의 결합과 비교하였다. 플랭킹 영역이 제거되었을 때 압타머의 특이성이 개선되는 것이 관찰되었다. 도 5a 내지 도 5f를 참조한다. 또 다른 세포 결합 분석에서, 라모스 세포보다 저캣에 대한 더 높은 특이성을 나타내는, 세포에 대한 압타머 CELTIC_4s, CELTIC_5s, CELTIC_6s, CELTIC_9s, CELTIC_11s, CELTIC_19s 및 CELTIC_21s의 결합이 측정되었다. 결합은 압타머 농도 3 nM, 10 nM 및 30 nM에서 시험하였다. 도 8a 내지 도 8g를 참조한다. 3 nM 및 10 nM 농도에서 저캣 및 라모스 세포에 대한 모든 압타머의 결합 결과들의 비교는 각각 도 9a 및 도 9b에 도시한다. 추가의 세포 결합 분석에서, 마우스 EL4 세포에 대한 압타머 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s 및 CELTIC_19s의 결합을 평가하였다. 결합 연구의 결과는 도 13a 내지 도 13d에 도시한다. 상기 분석에서 수득된 세포의 용량-의존적 염색은 이들 압타머가 교차-특이적이며 인간과 뮤린 CD3 단백질 둘 다를 인식한다는 것을 시사한다.
동일한 실험 설정을 사용하여 SELEX 동안 단리된 상위 45개 서열 패밀리 중에서 발견된 계산된 보존된 모티프에 해당하는 압타머 CELTIC_코어의 결합 친화도 및 특이성을 평가하였다(도 7c). 도 17d에 도시된 바와 같이, 압타머를 엄격하게 보존된 21개 뉴클레오티드로 단축하면 CD3 수용체에 대한 인식 특이성이 크게 개선되었다. 시험된 각 농도에 대해, CD3-양성 저캣 세포 상의 신호는 CD3-음성 라모스 세포에서 무시해도 될 정도일 때 측정되었다. CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s 및 CELTIC_19s와 같은 모 서열이 10 nM 이상의 신호 포화에 도달했을 때 본 실험에서 관찰된 겉보기 KD는 50 nM 이상이었기 때문에, 이러한 특이성의 획득은 친화도를 희생하여 달성되었다.
이러한 보존된 모티프는 소위 "G-쿼드러플렉스(G-quadruplex)" 조직화를 정의하는 GGG/C 반복부를 나타내기 때문에, 본 발명자들은 결합 특이성 및 친화도에 관련된 핵심 위치를 식별하고 압타머 특성을 개선할 수 있는 돌연변이를 도입하기 위해, 예측된 입체구조에서 G 잔기의 중요성을 최종적으로 확인하기 위한 돌연변이의 세트를 설계하였다. 여러 서열 변이체 CELTIC_코어_1 내지 CELTIC_코어_13(도 17e)을 합성하고 이미 설명한 바와 같이 저캣 및 라모스 세포에서 50 및 100 nM 농도에서 시험하였다. 비교로서, 비변형된 코어 서열 CELTIC_코어(50 및 100 nM) 및 전장 CD3_CELTIC_1s(10 및 50 nM)를 이들 분석에 포함시켰다. 도 17fa 내지 도 17fn에 개시된 결과는 각 변형이 압타머의 생물학적 활성에 현저하고 예측할 수 없는 영향을 미쳤음을 나타낸다: 보존된 모티프(CELTIC_코어_1 또는 CELTIC_코어_4)의 3' 말단에 GC 또는 G를 추가하는 것은 특이성의 상실을 초래하였다. 일부 돌연변이는 CD3 수용체와의 상호작용을 방해하였다(CELTIC_코어_2, CELTIC_코어_5, CELTIC_코어_6 및 CELTIC_코어_13). 일부 위치의 G/C 뉴클레오티드가 무염기 부위(CELTIC_코어_7 내지 CELTIC_코어_11)로 대체되었을 때도 결합의 상실이 발생하였지만, 16번 위치에서의 무염기 부위의 생성은 친화도는 더 높지만 특이성이 감소된 압타머를 산출하였다.
5'-말단에 TTT 트리플릿(triplet)를 첨가하는 것(CELTIC_코어_T)은 코어 서열의 결합 특성에 영향을 미치지 않았으며, 이는 임의의 입체 장애 없이 비오틴 표지와 압타머 사이에 일부 공간을 도입할 수 있음을 나타낸다. 이러한 관찰은 본 발명자들로 하여금, 모두 더 긴 C18 스페이서를 도입하는 HEG 링커를 5'-말단에 보유하는 서열 변이체를 추가 평가하도록 촉구하였다. 서열 변이체 CELTIC_코어_14 내지 CELTIC_코어_44를 합성하고(도 18) 이미 설명한 바와 같이 50 및 100 nM 농도에서 저캣 및 라모스 세포에서 시험하였다(도 19a 내지 도 19d). 비교로서, 비변형 코어 서열 CELTIC_코어(50 및 100 nM) 및 전장 CD3_CELTIC_1s 및 CD3_CELTIC_19s(10 및 50 nM)를 이들 분석에 포함시켰다. 대부분의 위치의 경우, 무염기 부위 또는 염기 치환은 저캣 세포의 표면에서 발현되는 CD3 수용체에 대한 결합을 방해하였다. 위치 10 및 12에서 뉴클레오시드의 제거는 친화도를 감소시켰고(CELTIC_코어_23 및 CELTIC_코어_25), 반면에 "G-쿼드러플렉스" 아키텍처를 정의하는 GGG/C 트리플렛의 일부분이 아닌 위치 11(CELTIC_코어_24) 또는 16(CELTIC_코어_29)에서의 동일한 변형은 각각 동일하거나 개선된 친화도 및 특이성을 갖는 압타머를 산출하였다. 예상외로, A가 영향을 미치지 않고(CELTIC_코어_38) T가 개선된 친화도 및 특이성으로 번역될 때(CELTIC_코어_40) 위치 16의 원래 C의 G로의 치환은 압타머의 친화도를 감소시켰다(CELTIC_코어_39). 위치 11 및 16의 동시 변형은 친화도 및 특이성의 획득(CELTIC_코어_42) 또는 친화도 손실(CELTIC_코어_44)을 유발하였다. 모두 종합해 보면, 도 20에 요약된 입체구조-기능 연구로부터의 이러한 결과들은 코어 서열의 개선된 버전이 "G-쿼드러플렉스" 구조를 형성하는 GGG/C 트리플렛의 외부에 위치한 위치들에서 무염기 부위를 치환하고 도입함으로써 경험적으로 조작될 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 세포에서 발현된 CD3 단백질에 대한 항-CD3 RNA 압타머의 친화도 및 특이성의 측정
항-CD3 RNA 압타머를 저캣 및 EL4 세포에 대한 결합에 대해 평가하여 이들의 겉보기 결합 KD를 결정하였다. SELEX 완충액 대신 DPBS를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3에 일반적으로 설명된 바와 같이 결합을 수행하였다. 압타머는 3가지 농도, 30 nM, 100 nM 및 300 nM에서 사용하였다. EL4 세포와의 항온배양을 위해, 압타머를 또한 3 nM 및 10 nM으로 희석하였다. 결합 연구의 결과는 도 30a 내지 도 30e에 도시한다. 5가지 압타머, ARCD3-3700006, ARCD3-0010209, ARCD3-3130001, ARCD3-2980001 및 ARCD3-0270039를 분석하였다. 압타머의 특이성을 평가하기 위해 CD3 음성 라모스 세포(대조군)에 대한 압타머의 결합을 또한 측정하였다. 또 다른 세포 결합 분석에서, 마우스 EL4 세포에 대한 압타머 ARCD3-3700006 및 ARCD3-0010209의 결합을 평가하였다. 결합 연구의 결과는 도 34a 내지 도 34b에 도시한다. 상기 분석에서 수득된 세포의 용량-의존적 염색은 이들 압타머가 교차-특이적이며 인간과 뮤린 CD3 단백질 둘 다를 인식한다는 것을 시사한다.
실시예 5: 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 항-CD3 DNA 압타머의 결합
결합 친화도 측정은 BIAcore T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 압타머와 CD3 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위해, 비오틴화된 압타머의 1000 공명 단위를 제조업체의 지침(GE Healthcare)에 따라 Series S 센서 칩 SA(GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. SELEX 완충액은 실행 완충액으로서 사용하였다. 상호작용은 상이한 농도의 인간 CD3 ε/γ, CD3 ε/δ, IgG1 Fc 및 마우스 CD3 ε/δ(Sino Biological)를 주입함으로써 30 μl/분의 유속에서 "단일 동역학 사이클" 모드에서 측정하였다. 사용된 최고 단백질 농도는 100 nM이었다. 다른 농도는 3배 희석하여 수득하였다. 상호작용의 모든 동역학 데이터는 BIAcore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 이러한 측정들로부터 수득된 결합 프로파일의 예는 도 4a 내지 도 4c에 도시한다. 하기 표 3은 표면 플라즈몬 공명 측정으로부터 수득된 KD 값의 요약을 제공한다.
Figure pct00002
인간 및 뮤린 CD3 ε/δ에 대한 결합의 KD 값의 비교는 압타머가 뮤린 CD3 ε/δ에도 결합하지만 더 적은 친화도로 결합한다는 것을 보여준다. 또한, 압타머 CELTIC_1(표 1의 CD3-1)과 비교해, CELTIC_1s(CD3-1s)가 CD3 단백질에 더 강하게 결합한 것으로 관찰하였다. 하기 표 4는 표면 플라즈몬 공명 측정의 다른 세트로부터 수득된 KD 값의 요약을 제공한다. 이는 플랭킹 영역을 갖거나 갖지 않는 처음 5가지 압타머의 KD 값을 포함한다.
Figure pct00003
하기 표 5 및 6은 몇 가지 더 많은 압타머의 KD 값의 요약을 제공한다. 표 4 및 5에 나열된 KD 값은 정상 상태 분석 모드에서 측정을 수행하여 수득한 반면, 표 3 및 6의 KD 값은 동역학 분석 모드에서 수행된 측정에 의해 수득되었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
"*" 표지가 있는 항목은 센서그램의 최적이 아닌 핏팅(fitting)으로 인해 과대평가된 값을 의미한다. NA = 상호작용이 관찰되지 않았기 때문에 적용할 수 없음.
실시예 6: 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 항-CD3 RNA 압타머의 결합
각각의 정제된 재조합 인간 CD3 ε/γ 및 CD3 ε/δ 단백질에 대한 항-CD3 RNA 압타머의 결합을 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정하였다. SELEX 완충액이 DPBS로 대체된 것을 제외하고는 실시예 5에서 일반적으로 설명된 바와 같이 결합 연구를 수행하였다. 사용된 최고 단백질 농도는 300 nM이었다. 다른 농도는 3배 희석하여 수득하였다. hIgG1 Fc에 대한 결합을 대조군으로서 사용하였다. 뮤린 CD3 ε/δ(mCD3 ε/δ)에 대한 결합을 또한 측정하였다. 이들 연구의 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
Figure pct00006
ND = 결정되지 않음.
압타머 ARACD3-3700006, ARCD3-0010209 및 ARCD3-3130001의 결합 프로파일은 도 31a 내지 도 32c에 도시한다.
실시예 7: 항-CD3 DNA 압타머에 의한 T 세포 활성화
항-CD3 DNA 압타머에 의한 T 세포 활성화를 측정하기 위해, 압타머는 T 세포의 CD28 동시자극과 함께 1 μM 농도에서 사용하였다. 활성화에 반응하여 세포에 의해 분비되는 사이토카인은 ELISA 및 인간 Th1/Th2 세포계측 비드 어레이(CBA)에 의해 측정하였다. T 세포의 표면에서 CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현을 유세포측정에 의해 측정하였다. 수득된 결과는 각각 도 14a 내지 도 14l, 도 15a 내지 도 15c 및 도 16a 내지 도 16c에 도시한다.
T 세포 활성화 분석은 말초혈 단핵세포(PBMC)에 대해 수행하였다. 새로이 준비된 PBMC를 건강한 공여자로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다(Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes). 혈액을 DPBS로 희석한 후, PBMC를 FICOLL 밀도 구배(FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.084 GE Healthcare)로 분리하고, DPBS로 2회 세척하고, 원하는 세포 밀도를 수득하기 위해 재현탁하고, 37℃, 5% CO2에서 10% FBS(Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스텝토마이신(Gibco Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco Invitrogen)에서 배양하였다.
T 세포 활성화 특성을 평가하기 전에, SELEX 완충액을 10% FBS 및 1% 페니실린/스텝토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지로 대체한 것을 제외하고는 실시예 3에 설명된 바와 같이 인간 PBMC에 대한 항-CD3 DNA 압타머의 결합을 먼저 유세포측정에 의해 검증하였다. 4가지 압타머 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s 및 CELTIC_19s를 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM의 농도에서 사용하였다. 결합 연구의 결과는 도 12에 도시한다.
PBMC 활성화 분석은 항-CD28 단클론 항체(Invitrogen)를 공동자극제로서 사용하거나 사용하지 않으면서 4가지 압타머, CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s 및 CELTIC_19s에 대해 수행하였다. 시약의 농도를 일정하게 유지하기 위해 3시간, 19시간 및 27시간 후 항-CD28 mAb 존재 하에 새로운 압타머 용액을 첨가하는 제3 조건을 포함시켰다. 실험 전에, PBMC를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 400 μL의 RPMI 배지에서 웰당 2.5 x 105개 세포의 밀도로 24웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 항온배양하였다. 후보 압타머를 95℃에서 5분 동안 변성시키고 즉시 4℃의 얼음 블록 상에 5분 동안 놓았다. 100μL의 상청액(사이토카인 기저 수준 조건)을 샘플링한 후, RPMI에 희석된 1 μM DNA 압타머 및 0.5 ㎍/mL CD28 mAb를 함유하는 100μL의 자극 용액을 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 16시간, 24시간 또는 48시간 동안 항온배양하였다. 대안적으로, PBMC를 2 ㎍/mL CD3 mAb 및 5 ㎍/mL CD28 mAb(Invitrogen)를 함유하는 100 μL의 혼합물, 2㎍/mL CD3 mAb를 함유하는 용액 또는 시약이 없는 RPMI 배지(음성 대조군)와 함께 항온배양하였다. 그 다음, 샘플을 320 g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 회수하였다. PBMC 활성화는 상이한 간격으로 수집된 배양 상청액 중에서 분비된 인터루킨 2(IL-2), 종양 괴사 인자 알파(TNF-a) 및 인터페론 감마(IFN-g)의 수준을 측정하여 평가하였다. 샌드위치 ELISA(DUOSET ELISA R&D Systems)를 측정을 위해 사용하였다. 100 μL의 비희석된 샘플 또는 사이토카인 표준을 포획 항체로 미리 밤새 코팅된 각 웰에 첨가하였다. IL-2, TNF-α 또는 IFN-g 사이토카인 결합을 스트렙타비딘-HRP 접합체 및 TMB 기질로 밝혀진 비오틴화된 검출 항체로 검출하였다. 정지 용액을 첨가한 후, ELISA 플레이트를 VARIOSCAN LUX 플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독하고, 사이토카인 수준을 참조 표준 곡선에 대해 결정하였다. 수득된 결과는 도 14a 내지 도 14l에 도시한다. 48시간 후에 수집된 배양 상청액 중의 분비된 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 인터루킨 10(IL-10), 종양 괴사 인자 알파(TNF-a) 및 인터페론 감마(IFN-g)의 수준을 제조업체의 지침에 따라 인간 Th1/Th2 세포계측 비드 어레이(CBA)(Becton Dickinson Biosciences)를 사용하여 측정하였다. 수득된 결과는 도 16a 내지 도 16c에 도시한다.
마지막으로, CD4- 및 CD8-양성 T 세포 표면에서 CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현을 분석하여 PBMC의 활성화를 평가하였다. 상이한 시험 조건 하에 48시간 항온배양하고 ELISA 및 CBA 분석을 위해 배양 상청액을 수집한 후, PBMC를 96웰 플레이트로 옮기고 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 펠렛화된 세포를 200 μL의 DPBS-0.2% BSA로 2회 세척하였다. 각각의 세척 단계에 이어서 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 세포를 DPBS-0.2% BSA(1 ㎕/시험)에 희석된 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25 및 항-CD69 단클론 항체(Miltenyi)와 함께 항온배양하였다. 4℃에서 10분 동안 항온배양한 후, 세포를 2500 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 DPBS-0.2% BSA(200μL/웰)로 2회 세척하였다. 세포를 CellFix 용액(BD Biosciences)으로 고정하고 형광-양성 세포를 BL3(항-CD4-PerCP-Vio700), YL1(CD69-PE), YL2( CD8-PE-Vio-615) 및 YL4(CD25-PE-Vio770) 채널 상에서 유세포측정(AttuneNXT; Invitrogen, Inc.)에 의해 계수하였다. 수득된 결과는 도 15a 내지 15c에 도시한다.
항-CD28 단클론 항체와 조합되거나 조합되지 않은 항-CD3 단클론 항체로 처리된 세포는 IL-5를 제외한 모든 측정된 사이토카인의 분비 증가와 CD25 및 CD69 활성화 마커의 표면 발현의 상향조절을 나타냈다. 시험된 압타머 중 어느 것도 공동자극 항-CD28 항체와 조합된 경우에도 표면 마커 발현의 사이토카인 분비를 활성화할 수 없었다. 혈청에서의 분해를 보완하기 위해 반복적인 방식으로 새로운 용액을 첨가하여 압타머 농도를 일정하게 유지하는 것은 더욱 지속적인 활성화 프로파일을 초래하지 않았다.
실시예 8: 항-CD3 RNA 압타머에 의한 T 세포 활성화
항-CD3 RNA 압타머에 의한 T 세포 활성화는 실시예 7에 설명된 절차를 사용하여 CD28 공동자극과 함께 세포를 1 μM 농도의 압타머와 항온배양함으로써 측정하였다. 활성화에 반응하여 세포에 의해 분비되는 사이토카인은 ELISA 및 인간 Th1/Th2 세포 측정 비드 어레이에 의해 측정하였다. T 세포의 표면에서 CD25 및 CD69 활성화 마커의 발현은 유세포측정에 의해 측정하였다. 수득된 결과는 각각 도 35a 내지 35f, 도 37a 내지 37c 및 도 36a 내지 36c에 도시한다.
실시예 7에서 이미 관찰된 바와 같이, 항-CD28 단클론 항체와 조합되거나 조합되지 않은 항-CD3 단클론 항체로 처리된 세포는 IL-5를 제외한 모든 측정된 사이토카인의 분비 증가와 CD25 및 CD69 활성화 마커의 표면 발현의 상향 조절을 나타냈다. 시험된 압타머 중 어느 것도 공동자극 항-CD28 항체와 조합된 경우에도 표면 마커 발현의 사이토카인 분비를 활성화할 수 없었다. 혈청에서의 분해를 보완하기 위해 반복적인 방식으로 새로운 용액을 첨가하여 압타머 농도를 일정하게 유지하는 것은 더욱 지속적인 활성화 프로파일을 초래하지 않았다.
실시예 9: 항-CD3 DNA 압타머의 기능적 안정성
항-CD3 DNA 압타머(CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_9s, CELTIC_11s, CELTIC_19s 및 CELTIC_22s)의 안정성은 5% FBS를 포함하는 SELEX 완충액 또는 단독의 FBS에서 측정하였다. 비오틴화된 압타머를 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 즉시 얼음 블록 상에서 4℃로 5분 동안 냉각시켰다. 그 다음, 서열을 5%의 FBS가 보충된 SELEX 완충액 또는 순수한 FBS에서 2μM의 최종 농도로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 항온배양하였다; 대조군 샘플은 37℃에서 항온배양되지 않은 새로이 제조된 압타머를 함유하였다. 그 다음, 100 nM 스트렙타비딘-PE를 각 용액에 첨가하고 압타머를 이전에 설명한 바와 같이 양성 CD3 저캣 세포와 함께 항온배양하였다. 그 다음, 5% FBS를 함유하는 SELEX 완충액 또는 순수한 FBS 중의 압타머의 반감기를 37℃에서의 항온배양 시간의 함수로서 형광-양성 세포 수의 변동에 기초하여, YL-1 채널 상에서 유세포측정을 사용하여 결정하였다. 측정 결과는 도 11a 및 11b에 도시한다. 5% 혈청을 함유하는 SELEX 완충액에서 항온배양된 모든 압타머는 24시간 동안 항온배양된 경우에도 안정적이었다. 순수한 FBS에 DNA 압타머를 희석하는 것은 37℃에서 2시간 항온배양으로 인한 서열의 점진적 분해를 나타낸다.
실시예 10: 항-CD3 RNA 압타머의 기능적 안정성
압타머 ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209의 안정성은 5% FBS를 함유하는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트-완충된 염수(DPBS) 또는 단독의 FBS에서 측정하였다. 85℃에서 변성을 수행한 것을 제외하고는 실시예 9에 설명된 절차를 사용하였다. 측정 결과는 도 32a에 도시한다. 5% 혈청을 함유하는 DPBS에서 항온배양된 두 압타머 모두는 24시간 동안 항온배양된 경우에도 안정적이었다. 순수한 혈청에서 항온배양한 경우, 30분 후에 결합 활성의 절반이 손실되었다.
실시예 11: 겔 전기영동을 이용한 항-CD3 DNA 압타머의 혈청 안정성
항-CD3 DNA 압타머(CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s, CELTIC_19s)의 안정성은 5% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 선별(SELEX) 완충액, 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 또는 순수한 FBS에서 연구하였다. 압타머를 95℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 즉시 얼음 블록 상에서 5분 동안 4℃로 냉각하였다. 그 다음, 서열을 5% FBS가 보충된 SELEX 완충액, 10% FBS가 보충된 RPMI 배지 또는 순수한 FBS 혈청에서 2μM의 최종 농도로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 항온배양하였다; 대조군 샘플은 37℃에서 항온배양되지 않은 새로이 제조된 압타머를 함유하였다. 그 다음, 각각의 완충액 중의 압타머의 반감기를 다음과 같이 전기영동 방법을 사용하여 아가로스 겔 상에서의 이동에 의해 결정하였다: 상이한 항온배양 시간으로부터의 압타머 샘플을 로딩 완충액(ThermoScientific, 미국 매사추세츠 월섬)과 혼합하고 15 μL의 각 샘플을 DNA 염색 마커로서 SYBRsafe(Invitrogen)를 함유하는 새로이 제조된 3% 아가로스 겔 상에 놓았다. 아가로스 겔 상에서의 DNA 압타머의 이동은 20분 동안 100 V를 적용하여 1X TBE 완충액(Invitrogen)에서 수행하였다. 겔은 Bio-Rad 영상화 시스템을 사용하여 시각화하였으며, 결과는 도 10a 내지 10d에 도시한다. 시험된 모든 압타머는 SELEX-5% FBS 완충액에서 적어도 24시간 동안 안정적이었다. 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서의 항온배양은 37℃에서 24시간 후 CELTIC_4s 및 CELTIC_11s의 분해를 초래하였다. 그러나, 순수한 혈청에 DNA 압타머를 희석하는 것은 1시간의 항온배양 후 강도의 감소를 초래하였다. 이러한 결과들은 실시예 9에서 유세포측정으로 보고된 안정성과 완벽하게 일치한다.
실시예 12: 겔 전기영동을 이용한 항-CD3 RNA 압타머의 혈청 안정성
항-CD3 RNA 압타머(ARACD3-3700006 및 ARCD3-0010209)의 안정성은 5% FBS를 함유하는 DPBS 완충액, 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 또는 순수한 FBS에서 연구하였다. 압타머를 85℃에서 5분 동안 변성시킨 다음, 즉시 얼음 블록 상에서 5분 동안 4℃로 냉각하였다. 그 다음, 서열을 5% FBS가 보충된 DPBS 완충액, 10% FBS가 보충된 RPMI 배지 또는 순수한 FBS 혈청에 2μM의 최종 농도로 희석하였다. 샘플을 37℃에서 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 항온배양하였다; 대조군 샘플은 37℃에서 항온배양되지 않은 갓 제조된 압타머를 함유하였다. 그 다음, 각각의 완충액 중의 압타머의 반감기를 다음과 같이 전기영동 방법을 사용하여 아가로스 겔 상에서의 이동에 의해 결정하였다: 상이한 항온배양 시간으로부터의 압타머 샘플을 포름아미드-함유 로딩 완충액(ThermoScientific, 미국 매사추세츠 월섬)과 혼합하고 15 μL의 각 샘플을 RNA 염색 마커로서 SYBRsafe(Invitrogen)를 함유하는 새로이 제조된 3% 아가로스 겔 상에 놓았다. 아가로스 겔 상에서의 RNA 압타머의 이동은 20분 동안 100 V를 적용하여 1X TBE 완충액(Invitrogen)에서 수행하였다. 겔은 Bio-Rad 영상화 시스템을 사용하여 시각화하였으며, 결과는 도 32b 내지 32c에 도시한다. 두 압타머 모두는 DPBS-5% FBS 및 RPMI-10% FBS에서 적어도 4시간 동안 안정적이었다. 순수한 혈청에서의 RNA 압타머의 항온배양은 30분 후에 강도의 감소를 초래하였다. 이러한 결과들은 실시예 10에서 유세포측정으로 보고된 안정성과 완벽하게 일치한다.
실시예 13: 항-CD3 단클론 항체를 이용한 경쟁 결합 분석에 의한 항-CD3 DNA 압타머의 에피토프 맵핑
CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s, CELTIC_19s 압타머에 의해 인식되는 영역에 대한 더 많은 정보를 수집하기 위해, 참조 단클론 항체와의 경쟁 결합 분석을 다음의 변경사항이 있는 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 3에 이미 설명된 바와 같이 CD3-양성 저캣 세포에 대해 수행하였다:
저캣 세포를 과량의 다양한 경쟁자(비표지된 OKT3 - 32 nM, 비표지된 UCHT1 - 10 nM, 비표지된 HIT3a - 32 nM - 모두 서모사이언티픽(ThermoScientific)(미국 매사추세츠 월섬)에서 구입 및 압타머 -300 nM)의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 PE-표지된 단클론 항체(OKT3-PE - 0.1 nM; UCHT1-PE - 1 nM 또는 HIT3a-PE - 0.1 nM - 모두 서모사이언티픽(미국 매사추세츠 월섬)에서 구입)와 함께 항온배양하였다. 그 다음, 세포 상의 표지된 항-CD3 단클론 항체의 결합을 유세포측정에 의해 평가하였다.
역 실험 설정에서, 저캣 세포를 포화 농도의 비표지된 단클론 항체(OKT3 - 32 nM; UCHT1 - 10 nM; 비표지된 HIT3a - 32 nM)의 존재 또는 부재 하에 CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s, CELTIC_19s DNA 압타머(고정 농도 300 nM)와 함께 항온배양하였다. 그 다음, 세포 상의 비오틴화된 압타머의 결합을 스트렙타비딘-PE로 검출한 후 유세포측정에 의해 평가하였다.
포화 농도의 경쟁자의 존재 또는 부재 하에 PE-표지된 항-CD3 단클론 항체의 결합 결과는 도 17aa, 17ba 및 17ca에 도시한다. 시험된 각 항체에 대해, 과량의 이의 비표지된 형태를 사용하는 것은 실험 조건을 검증한 이의 PE-표지된 버전의 결합을 억제하거나 완전히 소실시켰다. 최대 신호는 압타머가 경쟁자로서 사용되었을 때 측정되었으며, 이는 시험된 후보가 3가지 참조 항체의 결합을 방해하지 못했음을 시사한다.
포화 농도의 단클론 항체의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 압타머의 결합 결과는 도 17ab, 17bb 및 17cb에 도시한다. 유사한 신호는 압타머를 경쟁자와 함께 또는 경쟁자 없이 항온배양하였을 때 측정되었으며, 이는 항체가 시험된 서열의 결합을 방해하지 못했음을 시사한다.
항-CD3 압타머와 시험된 참조 단클론 항체 사이에서 보여진 경쟁 결여는 압타머에 의해 표적화된 인간 CD3 수용체의 영역이 OKT3, HIT3a 및 UCHT1 에피토프와 상이하다는 것을 시사한다. OKT3 및 UCHT1 항체는 결합 시 T 림프구를 활성화하는 것으로 보고되었다. CELTIC_1s, CELTIC_4s, CELTIC_11s, CELTIC_19s에 의한 대안적 CD3 에피토프의 인식은 실시예 7에서 인간 PBMC에 대해 관찰된 활성화 특성의 부재와 일치한다.
실시예 14: 항-CD3 단클론 항체와의 경쟁 결합 검정에 의한 항-CD3 RNA 압타머의 에피토프 맵핑
ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209 압타머에 의해 인식되는 영역에 대한 더 많은 정보를 수집하기 위해, 참조 단클론 항체와의 경쟁 결합 분석을, SELEX-5% FCS가 DPBS-5% FCS 대신 사용된 것을 제외하고는 본질적으로 실시예 13에 이미 설명된 바와 같이 CD3-양성 저캣 세포에서 수행하였다:
포화 농도의 경쟁자의 존재 또는 부재 하의 PE-표지된 항-CD3 단클론 항체의 결합 결과는 도 38-a, 38-c 및 38-e에 도시한다.
시험된 각 항체에 대해, 과량의 이의 비표지된 형태를 사용하는 것은 실험 조건을 검증한 이의 PE-표지된 버전의 결합을 억제하거나 완전히 소실시켰다. 최대 신호는 압타머가 경쟁자로서 사용되었을 때 측정되었으며, 이는 시험된 후보가 3가지 참조 항체의 결합을 방해하지 못했음을 시사한다.
포화 농도의 단클론 항체의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 압타머의 결합 결과는 도 38.b, 38-d 및 38-f에 도시한다. 유사한 신호는 압타머를 경쟁자와 함께 또는 경쟁자 없이 항온배양하였을 때 측정되었으며, 이는 항체가 시험된 서열의 결합을 방해하지 못했음을 시사한다.
항-CD3 압타머와 시험된 참조 단클론 항체 사이에서 보여진 경쟁 결여는 압타머에 의해 표적화된 인간 CD3 수용체의 영역이 OKT3, HIT3a 및 UCHT1 에피토프와 상이하다는 것을 시사한다. OKT3 및 UCHT1 항체는 결합 시 T 림프구를 활성화하는 것으로 보고되었다. ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209에 의한 대안적 CD3 에피토프의 인식은 실시예 8에서 인간 PBMC에 대해 관찰된 활성화 특성의 부재와 일치한다.
실시예 15: 코어 서열로부터 유래된 안정성-개선된 항-CD3 DNA 압타머의 조작
혈청에서의 안정성을 추가로 조사하기 위해, CD3-양성 및 CD3-음성 세포에 대해 수행되고 실시예 3에 설명된 결합 연구에서 수득된 결과에 기초하여 코어 서열로부터 유래된, 겉보기 친화도 및 표적 특이성이 개선된 서열-최적화된 항-CD3 압타머의 짧은 목록을 선별하였다. 이들 분석은 5% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 선별(SELEX) 완충액, 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 또는 순수한 FBS에서 항온배양된 압타머 CELTIC_코어, CELTIC_코어_12 및 5'-말단 HEG 변형된 CELTIC_코어_24, CELTIC_코어_29, CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42를 사용하여 수행하였다. 다양한 항온배양 시간 후, 분해되지 않은 압타머의 분획을 각각 실시예 11 및 13에 이미 설명된 바와 같이 유세포측정 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 정량화하였다.
도 22a 내지 22f 및 도 23a 내지 23c에 도시된 바와 같이, 압타머 CELTIC_코어, CELTIC_코어_24 및 CELTIC_코어_29는 SELEX-5 % FBS에서 4시간 항온배양 또는 순수한 혈청에서 30분 항온배양 후에 무결한/기능적 압타머가 남지 않은 시험된 각 혈청 조건에서 매우 불안정한 것으로 나타났다. 실시예 11 및 13에서 이미 관찰된 바와 같이, 두 방법 모두에서 수득된 결과에 완벽한 일치성이 있었다. 비교로서, 모 전장 CELTIC_1s 및 CELTIC_19s 서열은 SELEX-5 % FBS에서 24시간 안정적이었고 순수한 혈청에서 적어도 1시간 동안 안정적이었다. 반면에, CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42는 두 안정성 판독값 모두에서 훨씬 더 우수한 성능을 보였다. CELTIC_코어_12는 SELEX-5% FBS 및 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 24시간 항온배양 후 완전히 분해되지 않은 월등하게 가장 안정한 압타머였다.순수한 혈청에서는, 단지 4시간 후에 이의 분해가 일어나기 시작하였다. CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42는 비변형 CELTIC_코어 서열보다 더 안정하지만 4시간 항온배양 후 순수한 혈청에서 완전히 분해되는 중간 사례였다. CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_29 및 CELTIC_코어_42는 위치 11에서 하나의 뉴클레오티드만이 상이하지만 이들이 완전히 상이한 안정성 특성을 나타낸다는 점은 주목할 만하다. 더욱이, CELTIC_코어_42를 초래한, 위치 16에서 CELTIC_코어_29에 제2 무염기 부위를 도입하는 것은 서열을 안정화하는 전략인 것으로 보였다.
HEG-변형된 CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42의 안정성을 개선하기 위한 또 다른 시도로서, 3'-3' 데옥시-티미딘 첨가의 이익을 조사하였다. 3'-말단에서 이러한 유형의 변형은 뉴클레아제 분해에 대한 뉴클레오티드 서열의 내성을 향상시키는 것으로 보고되었다. 도 32.1 A 내지 32.1 D 및 도 32.2 A 내지 32.2 B에 도시되고 CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42와 비교된 바와 같이 3'-말단에 3'-3' 데옥시-티미딘을 갖는 압타머는 안정성이 현저하게 향상되었다. CELTIC_코어를 능가하지는 않았지만, 이들 변이체는 SELEX-5 % FBS에서 24시간 동안 안정적이고 순수한 혈청에서 적어도 2시간 동안 안정적이었다. 통상적으로 뉴클레아제-민감성 부위인 것으로 여겨지는 2개의 무염기 부위의 존재에도 불구하고 CELTIC_코어_42가 CELTIC_코어_40보다 더 안정적이라는 점은 언급할 가치가 있다.
실시예 16: 가장 안정하고 서열-최적화된 항-CD3 코어 DNA 서열 유도체는 교차-특이적으로 유지된다
코어 서열로부터 유래된 가장 흥미로운 항-CD3 압타머를 이용한 결합 친화도 측정을 실시예 4에서 이미 설명한 바와 같이 BIAcore T200 기기(GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 압타머와 CD3 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위해, 비오틴화된 압타머를 제조업체의 지침(GE Healthcare)에 따라 실시예 4에서보다 더 낮은 밀도(100 내지 500 RU)로 Series S 센서 칩 SA(GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. 마우스 및 시노몰구스(Cynomolgus) CD3 ε/δ는 아크로바이오시스템즈에서 구입하였다. 인간 단백질의 경우, 사용된 최고 농도는 마우스 및 시노몰구스 항원의 경우 100 nM 및 1 μM이었다. 다른 농도는 3배 희석에 의해 수득하였다.
하기 표 8은 표면 플라즈몬 공명 측정으로부터 수득된 KD 값의 요약을 제공한다. 이러한 결과들은 모 서열 CELTIC_CD3_1s 및 CELTIC_CD3_19s와 비교하여 코어 서열을 사용한 세포 결합 분석에서 관찰된 친화력 저하를 확인시켜준다. 세포 결합 분석에서 식별된 코어 서열의 변이체(CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_24, CELTIC_코어_29, CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42)는 모두 인간 CD3 ε/γ를 갖는 비변형 압타머보다 더 우수한 친화도를 갖는 것으로 확인되었다. 실시예 4에서 이미 관찰된 바와 같이, 친화도는 일반적으로 CD3 ε/δ를 갖는 것보다 약간 더 낮았으며 이는 CD3 ε/γ 아이소폼(isoform)에서 더 많은 라운드를 포함한 SELEX 전략의 결과이다. 이들 서열 중 어느 것도 인간 IgG1의 Fc 영역에 결합하지 않았다. CELTIC_코어_24, CELTIC_코어_40 및 CELTIC_코어_42의 3'-말단에 3'-3' 데옥시-티미딘을 첨가하는 것은 KD 값을 현저하게 변화시키지 않았다.
Figure pct00007
하기 표 9는 인간 CD3 ε/γ와 마우스 및 사이노몰구스 CD3 ε/δ로 수행된 표면 플라즈몬 공명 측정으로부터 수득된 KD 값의 요약을 제공한다. 이러한 새로운 실험 설정에서, 서열 변이체 CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_24, CELTIC_코어_29, CELTIC_코어_40, CELTIC_코어_42가 개선된 친화도를 나타냈을 때, CELTIC_코어는 모 서열 CELTIC_코어_1s 및 CELTIC_코어_19s에 비해 인간 CD3 ε/γ에 대한 더 낮은 친화도를 다시 나타냈다. 이러한 조건들에서, 최근의 4가지 압타머의 3'-3' 데옥시-티미딘-변형된 버전들은 동등하게 우수한 성능을 보였다. 이들 모든 시퀀싱-최적화된 압타머는 뮤린 및 시노몰구스 CD3 ε/δ 아이소폼에 결합할 수 있었으며, 이는 실시예 3 및 5에서 이미 관찰된 CD3 압타머의 교차-특이성을 확인시켜 준다. CELTIC_코어, CELTIC_1s 또는 CELTIC_19s와 대조적으로, 마우스 및 시노몰구스 CD3 ε/δ 아이소폼과의 상호작용에 대해 보고된 KD 값은 인간 CD3 단백질과 동일한 범위에 있었으며, 이는 측정된 상호작용이 실제였음을 시사한다. 이러한 결과들에 기초하여, 항-CD3 서열-최적화된 압타머는 이들이 인간 수용체에 대해 선별되었음에도 불구하고 교차-특이성을 유지하고 마우스, 시노몰구스에 결합한다.
Figure pct00008
실시예 17: 가장 안정하고 서열 최적화된 항-CD3 코어 DNA 서열 유도체는 참조 항체와 상이한 에피토프를 여전히 인식한다
CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_40t 및 CELTIC_42t 압타머에 의해 인식되는 영역에 대한 더 많은 정보를 수집하기 위해, 참조 단클론 항체와의 경쟁 결합 분석을 본질적으로 실시예 13에 이미 설명된 바와 같이 CD3-양성 저캣 세포에서 수행하였다. 비교로서, 전장 CD3_CELTIC_1s를 이들 분석에 포함시켰다.
포화 농도의 경쟁자의 존재 또는 부재 하에 PE-표지된 항-CD3 OKT3, UCHT1 및 HIT3a 단클론 항체의 결합 결과는 도 21-.a, 21-c 및 21-e에 도시한다. 시험된 각 항체에 대해, 과량의 이의 비표지된 형태를 사용하는 것은 실험 조건을 검증한 이의 PE-표지된 버전의 결합을 억제하거나 완전히 소실시켰다. 최대 신호는 압타머가 경쟁자로서 사용되었을 때 측정되었으며, 이는 시험된 후보가 3가지 참조 항체의 결합을 방해하지 못했음을 시사한다.
포화 농도의 단클론 항체의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 압타머의 결합 결과는 도 21-b, 21-d 및 21-e에 도시한다. 유사한 신호는 압타머를 경쟁자와 함께 또는 경쟁자 없이 항온배양할 때 측정되었고, 이는 항체가 시험된 서열의 결합을 방해하지 못했음을 시사한다.
항-CD3 압타머와 시험된 참조 단클론 항체 사이에서 보여진 경쟁 결여는 압타머에 의해 표적화된 인간 CD3 수용체의 영역이 OKT3, HIT3a 및 UCHT1 에피토프와 상이하다는 것을 시사한다. 모두 종합해 보면, 이러한 결과들은 서열-최적화된 CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_40t 및 CELTIC_42t 압타머는 뉴클레오티드 조성의 변동 및 5' 및 3' 말단의 화학적 변형에도 불구하고 에피토프 특이성의 측면에서 모 서열과 상이하지 않음을 시사한다. 결합 시 T 림프구를 활성화하는 것으로 알려진 OKT3 및 UCHT1 에피토프에 대안적인 CD3 영역에 대한 결합은 CELTIC_코어_12, CELTIC_코어_40t 및 CELTIC_42t 압타머가 활성화 특성을 나타내지 않을 수 있음을 시사한다.
실시예 18: 공유 화학에 의한 후속 그래프팅을 위한 서열-최적화된 항-CD3 코어 DNA 서열 유도체의 작용화는 생물학적 특성을 변형시키지 않는다
본 발명자들은 마침내 소정의 항-CD3 압타머의 생물학적 특성에 미치는 3' 및 5' 말단에서의 변형의 영향을 평가하기 시작하였다. 이 문제는 운반체, 중합체 또는 표면에 대한 작용화된 압타머의 공유 커플링을 고려할 때 특히 관련이 있다. 그렇게 하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들이 CELTIC_코어_42의 5'- 또는 3'-말단에서 TEG-비오틴과 커플링시키거나 이미 실시예 1에서 설명한 바와 같이 고체상 합성에 의해 CELTIC_코어_42의 5'-말단에 테트라진-PEG5 그룹을 도입시킨 HEG-변형된 CELTIC_코어_42를 선별하였다. 이러한 작용기는 각각 친화도 상호작용(1015 M의 KD로 현재까지 보고된 가장 강력한 상호작용)을 통한 압타머와 비오틴의 커플링 또는 클릭 화학에 의한 노르보르넨/알켄/알킨-변형된 파트너에 대한 친화도 상호작용(역 전자 요구 디엘스-앨더(Inverse Electron Demand Diels-Alder))을 가능하게 한다.
동일한 압타머의 이들 3가지 버전과 저캣 세포에서 발현된 CD3 수용체의 상호작용을 실시예 3에 이미 설명된 바와 같이 조사하였다. CD3-음성 라모스 세포는 도입된 화학적 변형에 의해 매개된 비특이적 상호작용을 모니터링하기 위해 음성 대조군으로서 포함시켰다. 도 33에 요약된 결과는 소정의 압타머의 양쪽 말단이 겉보기 친화도(KD<50 nM) 및 특이성에 어떠한 영향도 미치지 않으면서 비오틴으로 변형될 수 있음을 보여준다. 5'-말단에 테트라진 작용기의 도입은 CD3 표적에 대한 어떠한 특이성의 손실도 없이 약간 개선된 친화도(겉보기 KD<25 nM)를 초래하였다.
모두 종합해 보면, 이러한 결과들은 후속 커플링을 위한 항-CD3 압타머의 작용화가 이들의 생물학적 특성을 현저하게 방해하지 않고 수행될 수 있음을 시사한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
클러스터 1 내지 45의 경우, 5'-및 3'-말단에 존재하고 서열번호 114에 기재된 플랭킹 영역(각각, TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT 및 TTGACTAGTACATGACCACTTGA)이 존재하지만, 제시하지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 ~로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계의 포함을 허용한다. 특히 조성물의 성분의 설명 또는 장치의 요소의 설명에서 "포함하는"이라는 용어의 임의의 인용은 "본질적으로 ~로 이루어진" 또는 "~로 이루어진"으로 교환될 수 있다.
본 발명이 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 당업자는 전술한 명세서를 읽은 후 본원에 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변경, 균등물의 치환 및 기타 변경을 수행할 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> aratinga.bio ACI <120> Anti-CD3 Aptamers for Use in Cell Targeting and Labeling <130> 12267-0502 <140> PCT/IB2020/000635 <141> 2020-07-27 <150> US 62/879413 <151> 2019-07-26 <150> US 62/879401 <151> 2019-07-26 <150> PCT/IB2019/000890 <151> 2019-07-26 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 1 aptamer <400> 1 ccgggtgggg gtttggcacc gggcctggcg cagggattcg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 2 aptamer <400> 2 gaggggtttg gcatcgggcc tggcgccatt caagctatgc 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 3 aptamer <400> 3 gcgtaagggt ttggcagcgg gcctggcgga acgcgtgtat 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 4 aptamer <400> 4 ggagtggagt attccgggtt tggcatcggg cctggcgaag 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 5 aptamer <400> 5 cggcaggggt ttggctccgg gtctggcgaa ctggctgaga 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 6 aptamer <400> 6 aagggattgg cgtcgggcct ggcgtaagga ggctatgctc 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 7 aptamer <400> 7 gggattggcg ctgggcctgg caaggaatct tctcgttgta 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 8 <400> 8 gggattggct tcgggcctgg cgagtattgt tttcctggag 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 9 aptamer <400> 9 gcatcgaaat ggggttggca ccgggcctgg cgaattggat 40 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 10 aptamer <400> 10 gagactagag ggattggctt cgggcctggc gtac 34 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 11 aptamer <400> 11 gatggagggt ttggcggtgg gcctggcaag ttatctcata 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 12 aptamer <400> 12 tacggctagg gtttggcgtt gggcctggca ggaccgtaag 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 13 aptamer <400> 13 atatgggagg gtgagggttt ggctgcgggc ctggcgggag 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 14 aptamer <400> 14 tgcggcacat gtacgcggag ggattggcat agggtctggc 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 15 aptamer <400> 15 ggggttggct ttgggcctgg cagtcatttg tgaatcctta 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 16 aptamer <400> 16 tccgacaaaa gggattggct tcgggcctgg cggggttgcc 40 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 17 aptamer <400> 17 ggtcggggtt tggcatcggg actggcgtta tacaatcgt 39 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 18 aptamer <400> 18 gatggggttt ggcgtcgggc ctggcgaata catctaaaag 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 19 aptamer <400> 19 taccgcgggg attggctccg ggcctggcgt cgtaatctga 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 20 aptamer <400> 20 ggggtttggc tgcgggcctg gcgcatgatt caacgagaca 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 21 aptamer <400> 21 ggtcgggtgc tactgagcga ttggctttcc ggactgggga 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 22 aptamer <400> 22 cgaccacagg ggtttggctt cgggactggc ggtgggcact 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 23 aptamer <400> 23 cgaccacagg ggtttggctt cgggactggc ggtgggcact 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 24 aptamer <400> 24 tatgggtttg gcatcgggcc tggcggaatg gaaaatgtta 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 25 aptamer <400> 25 agacgggttt ggctgcgggc ctggcggtcg tcattcctct 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 26 aptamer <400> 26 gaggggattg gcatttgggc ctggcaaatt catctattct 40 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 27 aptamer <400> 27 aggggtttgg cgtcgggcct ggcgcagctc ttcttgtgtt t 41 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 28 aptamer <400> 28 gggattggct tcgggcctgg cgtatctttt acattacc 38 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 29 aptamer <400> 29 ggtggacggt atacaggggc tgctcaggat tgcggatgat 40 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 30 aptamer <400> 30 ccgtttgaag cgttagggtt tggcatcggg cctggcgcac 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 31 aptamer <400> 31 agggtttggc tacgggcctg gcgagctgtt tccgctactc 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 32 aptamer <400> 32 gtgttatgat actatgcgta tggattgcaa agggctgctg 40 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 33 aptamer <400> 33 gaagggtttg gcattgggcc tggcaagata atttgcaagt 40 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 34 aptamer <400> 34 cggcgaagtg gcagggtttg gcttcgggtc tggcggaaca 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 35 aptamer <400> 35 gagggtttgg cagtgggcct ggcatcaatt ctttgttttc 40 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 36 aptamer <400> 36 tactgagggt ttggcattgg gcctggcata ttggtattt 39 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 37 aptamer <400> 37 atgggtttgg caccgggtct ggcggattcg ataggtggtt 40 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 38 aptamer <400> 38 gggggtttgg ctctgggcct ggcataacga accttcggag 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 39 aptamer <400> 39 tgcccgagag gactgcttag gcttgcgagt agggaacgct 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 40 aptamer <400> 40 agtgggattg gcttcgggcc tggcgttcgc aacatgttta 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 41 aptamer <400> 41 ggggattggc actgggactg gcaccttttt aacatgtatg 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 42 aptamer <400> 42 gcaattaagg gattggctcc gggcctggcg ccacgcatgg 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 43 aptamer <400> 43 tggggtttgg cagcgggtct ggcgatcata atggtgtgcg 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 44 aptamer <400> 44 acgggggatt ggctttgggc ctggcaatta atttactgtt 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 45 aptamer <400> 45 gagcgcttgg cagccggtct ggggacatca gaggtgatgg 40 <210> 46 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_1s aptamer <400> 46 tttccgggtg ggggtttggc accgggcctg gcgcagggat tcg 43 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_2s aptamer <400> 47 gaggggtttg gcatcgggcc tggcgccatt caagctatgc 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_3s aptamer <400> 48 gcgtaagggt ttggcagcgg gcctggcgga acgcgtgtat 40 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_21s aptamer <400> 49 ggtcgggtgc tactgagcga ttggctttcc ggactgggga 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_4s aptamer <400> 50 ggagtggagt attccgggtt tggcatcggg cctggcgaag 40 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_5s aptamer <400> 51 cggcaggggt ttggctccgg gtctggcgaa ctggctgaga 40 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_6s sequence <400> 52 aagggattgg cgtcgggcct ggcgtaagga ggctatgctc 40 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_9s aptamer <400> 53 gcatcgaaat ggggttggca ccgggcctgg cgaattggat 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_11s aptamer <400> 54 gatggagggt ttggcggtgg gcctggcaag ttatctcata 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_19s aptamer <400> 55 taccgcgggg attggctccg ggcctggcgt cgtaatctga 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_22s aptamer <400> 56 cgaccacagg ggtttggctt cgggactggc ggtgggcact 40 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 gggnttggcn nngggnctgg c 21 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_1 aptamer <400> 58 gggtttggca ccgggcctgg cgc 23 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_2 aptamer <400> 59 gggtttggca ccgggcctgg c 21 <210> 60 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_3 aptamer <400> 60 ccgggcctgg cc 12 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_4 aptamer <400> 61 gggtttggca tcgggcctgg cg 22 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_5 aptamer <400> 62 gggtttggcg gtgggcctgg c 21 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_6 aptamer <400> 63 tttgggtttg gcaccgggcc tggc 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_T aptamer <400> 64 tttgggtttg gcatcgggcc tggc 24 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_7 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 gggtttngca ccgggcctgg c 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_8 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 gggtttgnca ccgggcctgg c 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_9 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 gggtttggna ccgggcctgg c 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_10 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 gggtttggca ccnggcctgg c 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_11 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 gggtttggca ccggncctgg c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_12 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 70 gggtttggca ccgggnctgg c 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_13 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 gggtttggca ccgggcntgg c 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_14 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 nggtttggca tcgggcctgg c 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_15 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <400> 73 gngtttggca tcgggcctgg c 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_16 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 ggntttggca tcgggcctgg c 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_17 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 75 gggnttggca tcgggcctgg c 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_18 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 gggtntggca tcgggcctgg c 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_19 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <400> 77 gggttnggca tcgggcctgg c 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_20 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 gggtttngca tcgggcctgg c 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_21 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 gggtttgnca tcgggcctgg c 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_22 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 80 gggtttggna tcgggcctgg c 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_23 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 81 gggtttggcn tcgggcctgg c 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_24 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 gggtttggca ncgggcctgg c 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_25 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <400> 83 gggtttggca tngggcctgg c 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_26 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 84 gggtttggca tcnggcctgg c 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_27 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 85 gggtttggca tcgngcctgg c 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_28 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 86 gggtttggca tcggncctgg c 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_29 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 87 gggtttggca tcgggnctgg c 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_30 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 88 gggtttggca tcgggcntgg c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_31 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 89 gggtttggca tcgggccngg c 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_32 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 90 gggtttggca tcgggcctng c 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_33 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 91 gggtttggca tcgggcctgn c 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_34 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 92 gggtttggca tcgggcctgg n 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_35 aptamer <400> 93 gggtttggga tcgggcctgg c 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_36 aptamer <400> 94 gggtttggca tcgggcctgg g 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_37 aptamer <400> 95 gggtttggga tcgggcctgg g 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_38 aptamer <400> 96 gggtttggca tcgggactgg c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_39 aptamer <400> 97 gggtttggca tcggggctgg c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_40 aptamer <400> 98 gggtttggca tcgggtctgg c 21 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_41 aptamer <400> 99 gggtttggca tcgggctggc 20 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_42 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 100 gggtttggca ncgggnctgg c 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_43 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 101 gggtttggca gcgggnctgg c 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_44 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 102 gggtttggca acgggnctgg c 21 <210> 103 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-0010209 aptamer <400> 103 ucuaagcaau auuguuugcu uuugcagcga uucuguuucg auauauua 48 <210> 104 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-2980001 aptamer <400> 104 uucaagauaa uguaauuauu uuugcagcga uucuuguuuu guucgauuu 49 <210> 105 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-0270039 aptamer <400> 105 caaaguucaa gauugagcuu uuugcagcga uucuuguuuu aucaaacga 49 <210> 106 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-3130001 aptamer <400> 106 gaugauaucu uuaauaucaa uugcagcgau ucuuguuuga gaauaaac 48 <210> 107 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-3700006 aotamer <400> 107 uauagacuuu aaugucucau uuucgcagcg auucuuguuu auuuaacaua 50 <210> 108 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core sequence RNA aptamer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or u <400> 108 ungcagcgau ucunnuu 17 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-1 aptamer <400> 109 grdtkgsydb hsgghctgg 19 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-2 aptamer <400> 110 gggrttggcr bhggghctgg c 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-3 aptamer <400> 111 gdttdgsywb csggmctggs g 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-4 aptamer <400> 112 gggtttggca bcgggcctgg c 21 <210> 113 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-5 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or u <400> 113 gcagcgauuc unguuu 16 <210> 114 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer library <220> <221> misc_feature <222> (24)..(63) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 tagggaagag aaggacatat gatnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnttgacta gtacatgacc acttga 86 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DNA SELEX <400> 115 tagggaagag aaggacatat gat 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DNA SELEX <400> 116 tcaagtggtc atgtactagt caa 23 <210> 117 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer library <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (65)..(74) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 cctctctatg ggcagtcggt gatnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntttctgc agcgattctt 60 gtttnnnnnn nnnnggagaa tgaggaaccc agtgcag 97 <210> 118 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for RNA SELEX <400> 118 taatacgact cactataggg cctctctatg ggcagtcggt gat 43 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for RNA SELEX <400> 119 ctgcactggg ttcctcattc tcc 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward blocking sequence for RNA SELEX <400> 120 atcaccgact gcccatagag agg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse blocking sequence for RNA SELEX <400> 121 ctgcactggg ttcctcattc tcc 23 <210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture sequence for RNA SELEX <400> 122 caagaatcgc tgcag 15

Claims (23)

  1. 서열 GX1X2TX3GX4X5X6X7X8X9GGX10CTGG[여기서, X1은 G 또는 A이고; X2 및 X6은 A, T, 또는 G이고; X3은 T 또는 G이고; X4 및 X9는 G 또는 C이고; X5는 C 또는 T이고; X7은 T, G 또는 C이고; X8 및 X10은 C, T 또는 A이다](서열번호 109) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
  2. 서열 GGGX1TTGGCX2X3X4GGGX5CTGGC[여기서, X1 및 X2는 A, T, 또는 G이고; X3은 T, C 또는 G이고; X4 및 X5는 A, T, 또는 C이다](서열번호 110) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
  3. 서열 GX1TTX2GX3X4X5X6CX7GGX8CTGGX9G[여기서, X1은 A 또는 G이고; X2는 T 또는 G이고; X3 및 X7, X9는 G 또는 C이고; X4는 T 또는 C이고; X5는 A 또는 T이고; X6은 T, C 또는 G이고; X8은 A 또는 C이다](서열번호 111) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
  4. 서열 GGGTTTGGCAX1CGGGCCTGGC[여기서, X1은 G, C 또는 T이다](서열번호 112) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
  5. 서열 GCAGCGAUUCUX1GUUU[여기서, X1은 U이거나 염기 부재이다](서열번호 113) 또는 이의 변이체를 포함하는 압타머로서, CD3 ε/γ 또는 CD3 ε/δ에 결합하는 압타머.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머가 약 0.2 pM 내지 약 250 nM의 해리 상수로 인간 CD3 ε/γ 및/또는 CD3 ε/δ에 결합하는, 압타머.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머가 약 20 nM 내지 약 800 nM의 해리 상수로 CD3 ε/γ 및/또는 CD3 ε/δ의 비-인간 형태에 결합하는, 압타머.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 108로부터 선택된 서열을 포함하는 압타머.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열의 변이체를 포함하고, 상기 염기 중 하나 이상이 비-천연 발생 염기로 치환되거나, 상기 염기 중 하나 이상이 생략되거나 상응하는 뉴클레오티드가 링커로 대체되는, 압타머.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 비-천연 발생 염기가 메틸이노신, 디하이드로우리딘, 메틸 구아노신 및 티오우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 압타머.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD3+ T 세포에 결합하지만 이를 활성화하지 않는 압타머.
  12. 제제, 염료, 공유 커플링을 위한 작용기 또는 생물학적 활성 제제를 T 세포에 전달하기 위한 비히클로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 압타머를 포함하는 비히클.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 중합체 나노입자를 포함하는 비히클.
  14. 제13항에 있어서, 중합체 나노입자가 폴리(베타 아미노 에스테르)(PBAE)를 포함하는, 비히클.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 압타머가 중합체에 공유 결합되는, 비히클.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 T 세포 조절제 또는 영상화제인, 비히클.
  17. 제16항에 있어서, T 세포 조절제가 전이유전자(transgene)를 운반하는 바이러스 벡터이고; 상기 바이러스 벡터가 중합체로 코팅되고; 압타머가 상기 중합체에 공유 결합되는, 비히클.
  18. 제17항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 비히클.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 전이유전자가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 비히클.
  20. 제16항에 있어서, T 세포 조절제가 다사티닙, MEK1/2 억제제, PI3K 억제제, HDAC 억제제, 키나제 억제제, 대사 억제제, GSK3 베타 억제제, MAO-B 억제제 및 Cdk5 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비히클.
  21. 대상체에서 제제를 T 세포로 전달하는 방법으로서, 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 비히클을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 비히클 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  23. 대상체로부터 T 세포를 단리하는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 비히클을 사용하여 대상체로부터 T 세포를 단리하는 것을 포함하는 방법.
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