KR20220083667A

KR20220083667A - 압타머 기반의 다중특이 치료제

Info

Publication number: KR20220083667A
Application number: KR1020227006665A
Authority: KR
Inventors: 안나 미오덱; 프레데릭 모울란; 세실레 부쉐; 레나우드 베일란트; 필리프 비숍
Original assignee: 익사카 프랑스
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2022-06-20
Also published as: MX2022001033A; JP2022542198A; AU2020321673A1; WO2021019297A1; WO2021019301A3; WO2021019301A2; MX2022001032A; EP4004208A1; CN114630908A; CN114630907A; CA3148792A1; JP2022544337A; US20220403391A1; US20220251562A1; AU2020320420A1; EP4004209A2; CA3148799A1; KR20220084272A

Abstract

링커에 의해 결합된 2개 이상의 상이한 앱타머 모이어티를 함유하는 조작된 다중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 항원 결합 분자는 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하고 면역 세포 및 암 세포와 같은 상이한 세포 타입을 브릿징할 수 있다. 연결된 앱타머는 면역 기능을 조절 및 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

Description

압타머 기반의 다중특이 치료제

관련 출원에 대한 상호 참조문헌

본 출원은 2019년 7월 26일에 출원된 미국가출원 제62/879,413호; 및 2019년 7월 26일에 출원된 미국가출원 제62/879,401호; 및 2019년 7월 26일에 출원된 PCT 출원 PCT/IB2019/000890호; 및 2020년 7월 27일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2020/43778호를 우선권으로 주장한다. 상기 출원들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

앱타머(aptamer)는 특정 2차 및 3차 구조를 형성하는 합성 단일 가닥(ss) DNA 또는 RNA 분자이다. 이러한 것은 높은 친화성 및 특이성으로 천연 폴딩된 단백질, 독소 또는 다른 세포 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 것은 비-면역원성이지만, 항체와 같이, 앱타머는 수용체 기능을 활성화 또는 억제할 수 있다. 이의 작은 크기, 안정성, 비용-효율적이고, 고도로 제어된 화학적 합성은 앱타머를 매력적인 치료제로 만든다. 이와 같이, 앱타머는 진단 및 치료 목적 둘 모두를 위한 단일클론 항체에 대한 유망한 합성 대안으로서 간주된다.

다중특이적 앱타머는 높은 친화성 및 특이성으로 상이한 에피토프와 특이적으로 결합하도록 함께 연결되고 설계된 2개 이상의 앱타머이다. 멀티머 특이성은 세포를 다른 세포 타입으로 (예를 들어, T-세포 또는 NK 세포를 종양 세포로) 리디렉팅(redirect)하고, 상이한 질환 매개자의 이중 표적화인 2개의 상이한 신호전달 경로를 동시에 차단하고, 페이로드(payload)를 특정 세포로 전달하는 것을 포함하는, 광범위한 연구, 진단, 및 임상 적용을 가능하게 한다. 이러한 사용에서, 정밀한 표적화 및 일부 경우에, 특정 세포 기능에 영향을 미치는 능력은 성공적인 연구, 진단 및 치료 용도의 중요한 결정인자이다.

본원에는 함께 연결되고 하나 이상의 암 세포 항원 및 하나 이상의 면역 이펙터 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 상이한 앱타머 모이어티를 포함하는, 조작된 항원 결합 분자가 제공된다.

본 발명의 양태는 고려되는 앱타머를 함께 연결하는 방법이다. 일부 실시형태에서, 이는 클릭 화학을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커의 길이, 링커의 유연성 또는 이동성은 표적화 모이어티에 부여할 뿐만 아니라, 링커의 타입은 면역 이펙터 세포 기능에 영향을 미치거나, 친화성, 특이성, 및/또는 형태에 영향을 미치는 표적화 앱타머 모이어티를 방해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커의 선택은 다중특이적 앱타머의 약동학적 및 약력학적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커의 선택은 활성 및 안전성(예를 들어, 면역원성)에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머의 항원 결합 모이어티는 높은 친화성 및 특이성으로 특정 항원을 인식할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상이한 표적 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 연결된 앱타머를 함유한 다중특이적 항원 분자이다. 일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 표적화된 항원을 발현하는 근접 세포과 결합하고, 그 안으로 들어오게 할 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 면역 이펙터 세포를 암 세포로 리디렉팅할 수 있게 한다. 또한, 개개 표적화된 에피토프에 대한 조작된 다중특이적 앱타머의 결합은 면역 이펙터 세포를 활성화되게 하고 이의 항암 사멸 기능을 그대로 발휘할 수 있게 한다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머의 항원 결합 모이어티는 CD3, CD8, CD4, 또는 다른 T-세포 특이적 항원을 발현하는 면역 이펙터 T-세포를 CD19, 상피 세포 부착 분자, CD20, CD22, CD123, BCMA, B7H3, CEA, PSMA, Her2, CD33, CD38, DLL3, EGF-R, MHC 클래스 I-관련된 단백질 MR1 또는 메소텔린과 같은 고려되는 다른 세포 표적으로 리디렉팅할 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머의 항원 결합 모이어티는 면역 이펙터 NK 세포를, 예를 들어, CD16A, NKG2D, 또는 다른 NK-세포 특이적 항원을 통해, 고려되는 다른 세포 표적, 예를 들어, CD30, CD19, 상피 세포 부착 분자, CD20, CD22, CD123, BCMA, B7H3, CEA, PSMA, Her2, CD33, CD38, DLL3, EGF-R, MHC 클래스 I-관련된 단백질 MR1 또는 메소텔린으로 리디렉팅할 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 2개의 면역조절 표적의 동시 표적화에 의해 조건부 동시자극 또는 면역 관문에 관여하여, 억제 표적의 차단, 억제 세포의 고갈, 또는 이펙터 세포(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA04, Lag-3, TIM-3, 또는 OX40과 같은 표적을 포함함) 및 종양 미세환경(TME) 조절자, 예를 들어, CD47 또는 VEGF의 활성화를 초래할 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 하나 이상의 종양 관련 항원, 예를 들어, PRAME, NY-ESO-1, MAGE A4, MAGE A3/A6, MAGE A10, AFP를 표적화할 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 염증성 또는 자가면역 질환, 심장대사 질환, 호흡기 질환, 안구 질환, 신경 질환, 또는 감염성 질환에 관여된 항원을 표적화할 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 특이적 표적화된 항원을 발현하는 세포를 사멸시키기 위해 면역 이펙터 세포를 활성화 및 자극시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 면역 이펙터 세포와 같은, 이러한 것이 결합하는 표적 세포에 결합하지만, 이러한 표적 세포를 활성화시키지 않고, 단지, 면역 이펙터 세포와 암 세포 사이에서와 같이 2개의 표적 사이에서 브릿지로서 역할을 한다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 증식성 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염성 질환, 바이러스 질환, 알레르기 반응, 기생충 반응, 이를 필요로 하는 대상체에서의 이식편대숙주 질환 또는 숙주대이식편 질환, 대사 질환, 신경 질환, 안구 질환의 예방, 치료 또는 완화에서 사용되는 의약품일 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 전달 시스템(예를 들어, 유전자 요법 적용)일 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 진단 적용에서 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 정제 시스템에서 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이적 앱타머는 세포 선택 또는 농축 적용에서 사용될 수 있다.

본 기술은 또한, 하기 특징 목록에서 요약될 수 있다.

1. 1) 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 표적 결합 앱타머 영역, 및 2) 앱타머 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함하는 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

2. 특징 1에 있어서, 링커가 공유 결합, 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 자가-조립 상보적 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고당, 다당류, 합성 폴리머, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 트리아졸, 나노입자, 마이셀, 리포솜, 세포, 클릭 화학 생성물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커 모이어티를 포함하거나 이로 이루어진, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

3. 특징 1 또는 특징 2에 있어서, 인간 세포, 면역 세포, 암 세포, 유전적으로 변형된 세포, 박테리아, 또는 바이러스 중 하나 이상 상의 특이적 표적에 결합할 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

4. 상기 특징들 중 어느 하나에 있어서, 하나의 표적 세포에서 다른 표적 세포로의 하나의 세포 타입의 결합을 리디렉팅(redirect)할 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

5. 상기 특징들 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포와 암 세포 사이에 브릿지(bridge)를 형성할 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

6. 상기 특징들 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포를 자극 및 활성화시킬 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

7. 특징 6에 있어서, 면역 세포가 T-세포, NK-세포, 또는 대식 세포이며, 상기 결합이 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자의 표적 결합 앱타머에 결합된 표적 세포의 파괴에 이르게 하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

8. 상기 특징들 중 어느 하나에 있어서, 분자가 CD3, CD8, CD4, CD19, 상피 세포 부착 분자, CD20, CD22, CD123, BCMA, B7H3, CEA, PSMA, Her2, CD33, CD38, DLL3, EGF-R, NKG2D 리간드, MHC 클래스 I-관련된 단백질 MR1, 메소텔린, PD-1, PD-L1, CTLA04, Lag-3, TIM-3, OX40, CD47, VEGF, PRAME, NY-ESO-1, MAGE A4, MAGE A3/A6, MAGE A10, 및 AFP로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

9. 특징 3에 있어서, 분자가 CD3 항원을 발현하는 면역 세포에 결합하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

10. 특징 1에 있어서, 분자가 암 세포 상의 PSMA 항원과 결합하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

11. 특징 1에 있어서, T-세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 CD3 항원 결합 영역, 및 PSMA 발현 세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 PSMA 항원 결합 영역을 포함하며, CD3 항원 결합 영역 및 PMSA 항원 결합 영역은 하나 이상의 링커에 의해 연결되는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

12. 전립선암을 포함하는 PSMA 발현 암의 치료에서의 특징 11의 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자의 용도.

도 1은 본 기술의 다중특이적 앱타머의 여러 실시형태의 개략적 예시를 도시한 것이다.
도 2는 앱타머를 연결하는 클릭 화학 반응을 위한 도식을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 개개 항원을 발현하거나 발현하지 않는 세포에 대한 항-PSMA(3a) 및 항-CD3(3b) 앱타머의 결합을 도시한 것이다.
도 4a 및 도 4b는 모노머 및 다이머(이중특이적) 앱타머의 아가로스 겔을 도시한 것이다.
도 5는 혈청에서 RNA 앱타머의 시간 과정(반감기)을 도시한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 PSMA-양성 및 음성 세포에 대한 이중특이적 앱타머의 결합 친화력을 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 CD3-양성 및 음성 세포에 대한 이중특이적 앱타머의 결합 친화력을 도시한다.
도 8은 PSMA-양성 세포에 대한 이중특이적 앱타머의 세포독성을 도시한다.

앱타머 기반 멀티머 결합 분자의 연결 모이어티는 단순하게 개개 앱타머들 사이에 하나 이상의 공유 결합일 수 있거나, 합성 또는 천연 발생 폴리머, 예를 들어, 탄화수소, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 트리아졸, 핵산, 펩타이드, 탄수화물, 또는 지질일 수 있다. 특정 실시형태에서, 연결 모이어티는 펩타이드가 아니다. 특정 실시형태에서, 앱타머-기반 다중특이적 분자는 펩타이드가 부재이고, 폴리펩타이드 및 단백질이 부재이다. 연결 모이어티는 또한, 나노스케일 구조(예를 들어, 폴리머, 단백질, 나노입자, 나노튜브, 나노결정, 나노와이어, 나노리본, 나노결정, 마이셀, 또는 리포좀), 또는 마이크로스케일 구조(예를 들어, 마이크로비드 또는 세포), 또는 보다 큰 구조(예를 들어, 고체 지지체)의 형태를 취할 수 있다. 바람직하게는, 연결 모이어티는 생분해성 폴리머이다. 연결 모이어티는 선형, 분지된, 사이클릭 또는 이들 구조의 조합인 폴리머일 수 있다. 연결 모이어티는 또한 덴드리머 구조, 또는 허브 또는 성상형 구조(예를 들어, 2개 이상의 앱타머가 결합된 코어 구조)를 위한 골격으로서 작용할 수 있다. 비-공유 회합을 위해, 2개 이상의 개개 앱타머는 앱타머 간에 직접적으로 또는 연결 모이어티와의 상호 작용을 통한 비-공유 상호작용을 통해 결합될 수 있다. 비-공유 상호작용은 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합, 이온 결합, 소수성 결합, 반데르 발스 상호작용 또는 이들의 조합일 수 있다. 고친화성 결합 쌍, 예를 들어, 스트렙타비딘-비오틴은 앱타머 기반 멀티머 결합 분자에서 앱타머를 비공유적으로 연결하기 위해 사용될 수 있다.

링커 또는 연결 모이어티는 공유적으로 또는 비공유적으로 모노머 앱타머 유닛을 함께 연결하는 임의의 화학적 모이어티일 수 있다. 링커는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 탄수화물을 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있다. 링커는 세포 수용체, 리간드 또는 지질을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 링커는 치환된 또는 비치환된 알킬 사슬 또는 고리 구조와 같은 탄화수소 사슬 또는 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 또는 변형되거나 비변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있다. 링커는 단일 공유 결합일 수 있거나, 하나 이상의 이온 결합, 수소 결합, 소수성 결합 또는 반데르 발스 상호작용을 포함할 수 있다. 링커는 디설파이드-브릿지, 헤파린 또는 헤파란 설페이트-유도된 올리고당(글리코소아미노글리칸), 화학 가교-링커, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르 또는 트리아졸을 포함할 수 있다. 링커는 효소에 의해 절단될 수 있어 개개 앱타머의 방출 및/또는 앱타머-기반 다중특이적 분자에 의한 상호작용에 의한 표적-표적 상호작용의 종결을 가능하게 한다. 링커는 순 양성, 음성 또는 중성 전하를 가질 수 있다. 링커는 멀티머 작제물에서 개개 모노머 앱타머 유닛의 기능성 특성의 보존을 보장하고 제1 표적 및 제2 표적으로의 결합을 촉진시키거나 이들의 상호작용을 촉진시키기 위해 요구되는 바와 같이 가요성이거나 강성일 수 있다. 링커는 5 내지 20개 글라이신 및/또는 세린 잔기의 폴리머와 같은 가요성 부분을 포함할 수 있다. 링커는 또한 글루타메이트, 알라닌, 라이신 및/또는 류신의 폴리머와 같은 강성의 한정된 구조를 함유할 수 있다. 링커는 힌지 부분 또는 스페이서 부분을 포함할 수 있다. 링커는 치환된 또는 비치환된 C2-C50 사슬 또는 고리 구조, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머(예를 들어, 헥사에틸렌글리콜), 또는 변형되거나 비변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 링커는 헤파린 또는 헤파란 설페이트-유도 올리고당(글리코소아미노글리칸), 화학적 가교-링커, 펩타이드, 폴리펩타이드, 하이드라존, 티오에테르 또는 에스테르를 포함할 수 있다.

C2-C50 링커는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 유닛 -O-(CH2CH2O)-; 하나 이상의 1,3-프로판 디올 유닛; 아민, 아미드; 또는 티오에테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 에테르 연결(예를 들어, 하나 이상의 알킬렌 글리콜 유닛)을 선택적으로 함유하는 2 내지 50개 탄소 원자(포화되거나 불포화된, 직쇄, 분지된 또는 사이클릭), 0 내지 10개 아릴 기, 0 내지 10개 헤테로아릴 기 및 0 내지 10개 헤테로사이클릭 기의 골격을 포함할 수 있다. 각 골격 탄소 원자는 독립적으로 비치환될 수 있거나(즉, 단지 -H 치환체를 포함함), C1 내지 C3 알킬, -OH, -NH2, -SH, -O-(C1 내지 C6 알킬), -S-(C1 내지 C6 알킬), 할로겐, -OC(O)(C1 내지 C6 알킬), 및 -NH-(C1 내지 C6 알킬)로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 C2-C20 링커, C2-C10 링커, C2-C8 링커, C2-C6 링커, C2-C5 링커, C2-C4 링커, 또는 C3 링커이며, 여기서, 각 탄소는 상기된 바와 같이 독립적으로 치환될 수 있다.

특정 실시형태에서, 개개 앱타머를 연결하는 임의의 중재 연결 모이어티 없이, 예를 들어, 이온 결합, 수소 결합, 소수성 결합, 반데르 발스 상호작용 또는 이의 혼합을 통해 매개되는 앱타머먼 간에 비-공유 결합이 있다. 단일 멀티머 앱타머 작제물은 또한 특정 앱타머를 연결하는 중재 링커 모이어티를 통한 공유 결합, 및 앱타머 간에 다른 결합 부위에서 중재 링커 모이어티가 없는 비-공유 결합의 혼합을 사용할 수 있다.

링커는 선택적으로 하나 이상의 작용성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 링커는 온도 및/또는 pH에 민감성이며, 이는 링커가 형태를 변화시키거나 온도 및/또는 pH의 예비-설계된 범위에서 절단됨을 의미한다.

표적에 대한 앱타머를 제조 또는 선택하기 위한 임의의 적합한 방법은 앱타머-기반 다중특이적 분자의 성분 앱타머를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 대수적 농축에 의한 리간드의 시스템적 전개(SELEX)에 의해 식별될 수 있다. SELEX는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국특허 제5,270,163호에 기술되어 있다. 간략하게, SELEX는 표적과 접촉된 다양한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 다수의 핵산(즉, 후보 앱타머 서열)으로 개시한다. 미결합된 핵산은 앱타머-표적 복합체를 형성하는 것들로부터 분리된다. 앱타머-표적 복합체는 이후에 해리되며, 핵산은 증폭되며, 결합, 분리, 해리 및 증폭 단계는 원하는 정도로 많은 사이클을 통해 반복하여 표적에 대해 점진적으로 보다 높은 친화성의 앱타머 집단을 수득한다. 선택 및 증폭 사이클은 결합 친화성에서 어떠한 유의적 개선이 사이클의 추가의 반복에 대해 성취되지 않을 때까지 반복될 수 있다.

선택 및 증폭 사이클은 단일 앱타머가 식별되기 전에 중단될 수 있다. 이러한 경우에, 앱타머 집단은 식별되며, 이는 앱타머와 표적의 결합을 가능하게 하는 서열, 구조 또는 모티프에 관한 유의미한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 후보 앱타머의 집단은 또한 앱타머의 어느 부분이 표적 결합을 위해 중요하지 않음을 알려줄 수 있다. 이러한 정보는 이후에 동일한 표적으로의 다른 앱타머의 생성을 가이드할 수 있다. 이에 따라 생성된 앱타머는 새로운 라운드의 SELEX에 대한 인풋 (input)으로서 사용되어, 잠재적으로 보다 양호한 결합 친화성 또는 고려되는 다른 특징을 갖는 앱타머를 수득할 수 있다.

일부 실시형태에서, 후보 앱타머-기반 다중특이적 분자와 같은 멀티머 앱타머 작제물을 함유하는 후보 앱타머 서열이 생성되며, 이는 이후에 멀티머 작제물로서 추가 라운드의 선택에 적용된다. 멀티머 후보 앱타머 작제물은 연결 모이어티와 함께 개개 후보 앱타머 모이어티를 연결하고, 선택적으로, 하나 이상의 라운드의 SELEX에 대한 인풋으로서 이러한 작제물을 사용함에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개개 앱타머는 독립적으로 하나 이상의 라운드의 SELEX를 통해 선택되고, 최종적으로 연결 모이어티와 함께 연결된다. 이에 따라, 멀티머 앱타머 작제물뿐만 아니라 모노머 앱타머의 멀티머화는 SELEX 과정들 전, 과정들 동안에 또는 과정들 후 수행될 수 있다.

본 발명의 기술은 세포 리디렉팅 앱타머(예를 들어, 다가 앱타머)를 추가로 제공하고, 이는 세포의 생체내 또는 생체외 유전자 변형을 위해서 뿐만 아니라 앱타머-기반 CAR 면역요법 시스템에서 앱타머 브릿지로서 사용될 수 있다. 본 발명의 기술의 앱타머 브릿지, 세포, 키트 및 방법은 암(예를 들어, 혈액 또는 비혈액, 개개 세포 또는 고형 종양), 자가면역 질환(예를 들어, 관절염, 중증근무력증, 천포창), 신경염증 질환, 안과 질환, 신경변성 질환(예를 들어, ALS, 헌팅톤병, 알츠하이머병), 신경근육 질환(듀켄 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), SMA을 포함함), 감염성 질환(예를 들어, HIV, HSV, HPV, HBV, 에볼라, 결핵, 크립토코커스), 및 대사 질환(예를 들어, 1형 진성당뇨병)의 치료를 위한 면역요법으로서의 용도를 포함하는 광범위한 용도에 사용될 수 있다. 이러한 것은 또한 이미지화, 세포 트래픽킹의 분석 및 새로운 면역요법의 연구 및 개발을 포함하는, 이러한 면역요법에 사용하기 위한 진단제, 키트 및 방법을 제공할 뿐만 아니라 줄기 세포 요법(예를 들어, HSCT)과 조합되는 경우 예방을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 "키메라 항원 수용체 세포" 또는 "CAR 세포"는 유전학적으로 변형된 세포(예를 들어, T-세포, NK-세포, 단핵구 등)이며, 이들은 스톡(stalk) 또는 막관통 도메인을 통해 수용체(예를 들어, CD3-TCR)의 세포내 도메인에 융합된 단쇄 가변 도메인(scFv) 항체를 발현하도록 생체외 또는 생체내 조작되어 세포에게 하나 이상의 특이적 항원을 인지하고 이에 결합하고 세포 면역 반응을 활성화시키는 능력(예를 들어, 암 세포를 사멸시키거나 바이러스-감염된 세포를 파괴함)을 부여한다.

본원에 사용되는 "항원성 상실" 또는 "항원성 회피"는 종양 항원의 하향조절 또는 억제성 리간드(예를 들어, PD-L1, TIM3, LAG3)의 상향조절과 같은 면역요법에 대한 내성 또는 조정의 임의의 여러 메커니즘을 지칭할 수 있으며, 이는 CAR-T 세포 부전, CAR 세포의 이의 표적(예를 들어, 표적 부위)으로의 도달 실패, CAR의 항체 부분에 대한 면역력(예를 들어, 특히 이것이 완전히 인간화되지 않은 경우 scFv에 대한 T-세포 반응), CAR-T 세포 적합성(즉, 기억 자가-재생을 위한 감소된 잠재력 및 증가된 탈진 경향), 또는 항원 스플라이싱 또는 돌연변이에 기여한다.

본 발명의 기술의 멀티머 앱타머 또는 연결된 앱타머는 연결 모이어티에 의해 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 2개 이상의 앱타머를 함유한다. 본 발명의 기술의 실시형태에 따르면, 2개 이상의 앱타머는 이들 각각이 하나 이상의 앱타머를 함유하는 CAR-결합 부분 및 표적-결합 부분을 형성할 수 있다. CAR-결합 앱타머는 면역 세포, 예를 들어, T 세포에 발현되는 CAR에 결합하고, 일부 실시형태에서, 면역 세포를 활성화시키지만, 다른 실시형태에서 (예를 들어, "킬(kill)" 스위치로서 작용할 때) 면역 세포를 활성화시키지 않는다. 표적은 면역요법의 의도된 표적, 즉, 제거를 위해 의도된 세포이다. 이에 따라, CAR-발현 세포 및 앱타머 브릿지는 면역요법, 예를 들어, CAR-T 세포 요법에서 시스템으로서 함께 사용하기 위해 의도된다. 앱타머 브릿지의 CAR뿐만 아니라 표적으로의 결합은 바람직하게는, 고친화성 결합이다. 표적은 단백질(예를 들어, 세포-표면 수용체 단백질), 세포, 소분자 또는 핵산일 수 있다. 표적은 바람직하게는, 표적 세포, 예를 들어, 암 세포의 표면 상에 위치되고, 대상체의 다른 세포(정상 세포) 상에서 발견될 수 있거나 발견되지 않을 수 있다.

일부 실시형태에서, 표적은 종양 항원, 예를 들어, CD19, CD20, CD22, CD30, CD123, BCMA, NY-ESO-1, 메소텔린, MHC 클래스 I-관련된 단백질 MR1, PSA, PSMA, MART-1, MART-2, Gp100, 티로시나제, p53, ras, Ftt3, NKG2D 리강스(Ligangs), 루이스(Lewis)-Y, MUC1, SAP-1, 수르비빈(survivin), CEA, Ep-CAM, Her2, Her3, EGFRvIII, BRCA1/2, CD70, CD73, CD16A, CD40, VEGF-α, VEGF, TGF-β, CD32B, CD79B, cMet, PCSK9, IL-4RA, IL-17, IL-23, 4-1BB, LAG-3, CTLA-4, PD-L1, PD-1, OX-40, 또는 돌연변이된 SOD이다. 앱타머 브릿지의 성분 앱타머는 또한 이러한 표적의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 감염성 제제의 항원, 예를 들어, gag, 역전사효소, tat, HIV-1 외피 단백질, 포자소체(circumsporozoite) 단백질, HCV 비구조적 단백질, 헤마글루티닌이며; 앱타머 브릿지는 또한 이러한 표적의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, CAR-결합 앱타머 또는 앱타머들은 펩타이드 네오-에피토프(PNE), 즉, 항-PNE CAR에 대해 친화성을 갖는 CAR의 세포외 도메인으로의 특이적 결합을 위해 선택된다. PNE가 대상체의 신체 내에 존재하지 않는 에피토프이기 때문에, 항-PNE CAR을 발현하는 면역 세포는 내인성 생분자에 의해 활성화되지 않지만, 면역 세포에 대한 "가동(on)" 스위치로서 작용하고 원하는 항원(들) 또는 항원(들)을 보유하는 세포 타입(들)을 향해 CAR-발현 세포를 표적화하는 앱타머 브릿지의 대상체로의 투여를 대기한다. CAR 발현 면역 세포의 면역 활성화 및 생체내 확장은 PNE를 함유하는 펩타이드 또는 모노머 형태의 브릿지의 CAR-결합 앱타머 또는 표적-결합 앱타머(이 중 어느 하나는 표적에 의한 CAR-발현 면역 세포의 활성화를 종결시킴)의 대상체로의 투여에 의해 중단될 수 있다.

PNE는 숙주의 프로테옴에서 발견되지 않는(예를 들어, 인간 프로테옴에서 발견되지 않는) 임의의 펩타이드 에피토프일 수 있고, 이에 대한 항-PNE CAR이 수득될 수 있다. 바람직한 PNE의 예는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 GCN4 전사 인자의 펩타이드 단편(NYHLENEVARLKKL, 서열번호 1)이다. 고친화성(K_d = 52 pM)을 갖고 52SR4 단쇄 항체를 포함하는 CAR 결합 GCN4는 로저스(Rodgers) 등에 의해 기술된다. 추가로, CAR 및 상응하는 앱타머 브릿지와 함께 사용하기에 적합한 PNE는 다음을 포함한다: (i) 이에 결합하고 문헌(Clin Vaccine Immunol 17(11): 1708-1717)에 기재된 항체와 쌍을 형성하는, 스타필로코커스 장독소 B의 N-말단 15-량체 펩타이드 ESQPDPKPDELHKSS(서열번호 2); (ii) 이에 결합하고 문헌(Protein Expr Purif 35(1): 84-92)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 이. 콜리 마이코톡신인 데옥시니발레놀; (iii) 문헌(Biomed Res Int 2018; 2018: 5809028)에 기재된, 이에 대한 항체와 쌍을 형성하는, HPV-16 단백질 E5; (iv) 이에 결합하고 문헌(Protein Expression and Purification 86 (2012) 75-81)에 기재된 랍비 바이러스 단백질 및 scFv; (v) 이에 결합하고 문헌(Bioconjugate Chem 2010, 21, 1134-1141)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 인플루엔자 A 매트릭스 단백질; (vi) 이에 결합하고 문헌(Viral Immunol 2018 May 30)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, HBV의 전구-S2 단백질의 아미노산 134-145(PRVRGLYFPAGG, 서열번호 3); (vii) 문헌(J of Virological Methods 257 (2018) 73-78)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 오리 간염 바이러스 1형의 VP3 펩타이드; (viii) 문헌(Appl Microbiol Biotechnol 2017 Dec;101(23-24):8331-8344)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 소 헤르페스 1의 당단백질 D로부터의 펩타이드(MEESKGYEPP, 서열번호 4); (ix) 이에 결합하고 문헌(Virus Research 167 (2012) 370-379)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 사우쓰 아프리칸 테리토리스 2(SAT2) 구제역 바이러스의 VP1 단백질의 아미노산 159를 포함하는 펩타이드; (x) 이에 결합하고 문헌(Veterinary Microbiology 147 (2011) 162-169)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터의 OmpD의 펩타이드(DRTNNQVKA, 서열번호 5); (xi) 이에 결합하고 문헌(Journal of Biotechnology 102 (2003) 177/189)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 이. 콜리 기원의 이소페리틴의 펩타이드; (xii) 이에 결합하고 문헌(Arch Virol (2008) 153:1075-1084)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 그라페빈 리프롤(grapevine leafroll)-연관된 바이러스 3 코트 단백질의 N 말단에 위치한 펩타이드(AQEPPRQ, 서열번호 6); (xiii) 이에 결합하고 문헌(Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004, 36(8): 541-547)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, SARS-CoV의 N 단백질의 펩타이드(PTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ, 서열번호 7); (xiv) 이에 결합하고 문헌(J Virol 2004 Apr; 78(7): 3792-3796)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, HIV Tat 단백질의 아미노산 1 내지 15를 함유하는 펩타이드; 및 (xv) 이에 결합하고 문헌(J Hepatology 37 (2002) 660-668, J Virol 1994;68:4829-4836, 및 Arch Virol 1997;142:601-610)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, HCV NS3의 헬리카제 도메인의 아미노산 1363 내지 1454로부터의 펩타이드.

본 발명의 기술의 앱타머 브릿지와 쌍을 형성할 수 있는 범용 CAR의 다른 예는 문헌(J Autoimmun 2013 May 42 :105-16; Blood Cancer J 2016 Aug, 6(8): e458; Oncotarget 2017 Dec 12, 8(65): 108584-108603; Oncotarget 2017 May 9, 8(19): 31368-31385; Oncotarget 2018 Jan 26, 9(7): 7487-7500; 및 WO2016030414호)에 기술되어 있다.

A10 RNA 앱타머(서열번호 8)는 인간 전립선-특이적 막 항원(PSMA)에 대해 선택되고 siRNA에 대한 전립선 특이적 전달 제제로서 사용되는 39 뉴클레오타이드-길이의 서열이다(McNamara et al 2006 - Dassie et al 2009)

인간 CD3에 대한 높은 친화성 결합을 갖는 다수의 DNA 앱타머(서열번호 9 내지 110) 및 RNA 앱타머(서열번호 111 내지 116)가 개발되었다. CELTIC_1s, CELTIC_19s 및 CELTIC_코어는 DNA 앱타머(서열번호 54, 63 및 65)이며, ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209는 RNA 앱타머(서열번호 115 및 111)이며, 이들 모두는 인간 CD3에 대해 선택된 것이다. 이러한 DNA 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-티미딘-변형된 RNA(2'F-RNA) 앱타머는 baseclick(Neuried, Germany)으로부터, 표준 고체상 포스포라미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 단일 가닥 올리고스(oligos)로서 구매하였다. 항-CD3 앱타머는 동시자극 항-CD28 항체와 조합할 때에도 그리고 항-CD3 단일클론 항체와는 달리, 시토카인 분비 또는 표면 마커 발현을 활성화하지 않았다.

항-CD3 앱타머에 대한 여러 공통 서열이 개발되었다. 이러한 공통 서열에 따르면, 인간 CD3에 대한 높은 친화성을 갖는 DNA 및 RNA 앱타머는 하기 공통 서열 또는 이의 변형체를 포함할 수 있다:

1. GX₁X₂TX₃GX₄X₅X₆X₇X₈X₉GGX₁₀CTGG, 여기서, X₁은 G 또는 A이며; X₂ 및 X₆은 A, T, 또는 G이며; X₃은 T, 또는 G이며; X₄ 및 X₉는 G 또는 C이며; X₅는 C 또는 T이며; X₇은T, G, 또는 C이며; X₈및 X₁₀은 C, T, 또는 A임(서열번호 117).

2. GGGX₁TTGGCX₂X₃X₄GGGX₅CTGGC, 여기서, X₁ 및 X₂는 A, T, 또는 G이며; X₃은T, C, 또는 G이며; X₄및 X₅는 A, T, 또는 C임(서열번호 118).

3. GX₁TTX₂GX₃X₄X₅X₆CX₇GGX₈CTGGX₉G, 여기서, X₁은 A 또는 G이며; X₂는 T 또는 G이며; X₃ 및 X₇, X₉는 G 또는 C이며; X₄는 T 또는 C이며; X₅는 A 또는 T이며; X₆은 T, C, 또는 G이며; X₈은 A 또는 C임(서열번호 119).

4. GGGTTTGGCAX₁CGGGCCTGGC, 여기서, X₁은 G, C, 또는 T임(서열번호 120).

5. GCAGCGAUUCUX₁GUUU, 여기서, X₁은 U이거나 염기가 없음(서열번호 121).

실시예

실시예 1. PSMA 및 CD3에 대해 특이적인 이중특이적 아타머의 제조

A10 RNA 앱타머(서열번호 8)는 인간 전립선-특이적 막 항원(PSMA)에 대해 선택되고 siRNA에 대한 전립선 특이적 전달 제제로서 사용되는 39 뉴클레오타이드-길이의 서열이다(McNamara et al 2006 - Dassie et al 2009).

CELTIC_1s, CELTIC_19s 및 CELTIC_코어는 DNA 앱타머(서열번호 54, 63 및 65)이고, ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209는 RNA 앱타머(서열번호 115 및 111)이며, 이들 모두는 인간 CD3에 대해 사전에 선택된 것이다.

이러한 DNA 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-티미딘-변형된 RNA(2'F-RNA) 앱타머는 표준 고체상 포스포라미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 단일 가닥 올리고스로서 baseclick(Neuried, Germany)으로부터 구입하였다. 항-CD3 앱타머는 동시자극 항-CD28 항체와 조합되는 경우에도 및 항-CD3 단일클론 항체와 달리 사이토킨 분비 또는 표면 마커 발현을 활성화시키지 않았다(데이터는 미도시됨).

A10 앱타머를 후속 트리아졸 뉴클레오타이드간 다이머화를 위해 이의 3'-말단에서 아지드 기로 변형하였다. 비오틴을 앱타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합된 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 A10 앱타머의 5'-말단에 첨가하였다. Cy5-표지된 버젼의 A10을 또한 합성하였다. CELTIC_1s, CELTIC_19s, CELTIC_코어, ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209를 후속적 트리아졸 뉴클레오타이드간 다이머화를 위한 이의 5' 말단에서 알킨 기로 변형하였다. 분자량, 순도 및 통합성은 HPLC-MS로 입증하였다. A10 항-PSMA RNA 앱타머의 친화성 및 특이성을 PSMA 양성 및 PSMA 음성 세포에 대해 평가하였다(도 3a). 항-CD3 앱타머의 친화성 및 특이성을 CD3 양성 및 CD3 음성 세포에 대해 평가하였다(도 3b).

항-PSMA A10 및 항-CD3 앱타머를 제조업자의 지침에 따라 Oligo2-Click 키트 L(baseclick, Neuried, Germany)을 사용하여 45℃에서 60분 동안 수행된 구리-촉매화된 클릭 반응에 의해 헤테로다이머화하였다. 반응 생성물을 30분 동안에 100 V에서 1X TBE 완충액(Invitrogen)에서 이동된 3% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔을 Bio-Rad 이미지화 시스템을 사용하여 가시화하였고 결과는 도 4a 및 4b에 도시된다. 다이머 앱타머에 상응하는 겔 슬라이스를 겔로부터 절단 제거하고, 핵산을 25 mM NaCl-TE 완충액에서 수동 용출에 의해 8℃에서 72시간 동안 추출하였다. 이중특이적 앱타머 다이머를 표준 나트륨 아세테이트 침전에 의해 회수하고, 멸균수에 재현탁하고 사용때까지 -20 ℃에서 저장하였다.

실시예 2. PSMA에 대해 특이적인 앱타머 A10의 기능적 안정성.

A10 RNA 앱타머의 안정성을 FBS 단독 또는 5% FBS를 함유하는 둘베코 포스페이트-완충 식염수(DPBS)에서 측정하였다. 비오티닐화된 앱타머를 85℃에서 5분 동안 변성시키고, 이후에, 즉시 얼음 블록 상에서 5분 동안 4℃까지 냉각시켰다. 이후에, 앱타머를 5%의 FBS가 보충된 DPBS에서 또는 순수 FBS에서 2 μM의 최종 농도로 희석하였다. 샘플을 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고; 대조군 샘플은 37℃에서 인큐베이션 없이 새롭게 제조된 앱타머를 함유하였다. 이후에, 100 nM 스트렙타비딘-PE를 각 용액에 첨가하고, 앱타머를 PSMA-양성 LNCaP 세포(인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1740)와 함께 인큐베이션하였다. 5% FBS를 함유하는 DPBS 완충액에서 또는 순수 FBS에서 앱타머 A10의 반감기를 이후에, 37℃에서 인큐베이션 시간의 함수로서 형광성-양성 세포수의 변화를 기초로 하여, YL-1 채널 상에서 유동 세포측정을 이용하여 결정하였다. 측정 결과는 도 5에 도시된다. 5% 혈청을 함유한 DPBS 완충액에서 인큐베이션된 앱타머 A10은 24시간에 걸쳐 안정하였다. 순수 혈청에서 시험되는 경우, 결합 활성의 절반은 최초 2시간의 인큐베이션 이내에 상실되었다.

실시예 3 항-PSMA x 항-CD3 이중특이적 앱타머의 세포 상에 발현된 표적에 대한 친화성 및 특이성의 결정.

항-PSMA x 항-CD3 이중특이적 앱타머의 세포 상에 발현된 표적 단백질에 대한 친화성 및 특이성을 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 이러한 연구를 SELEX 완충액에서 비오티닐화된 RNA/DNA 앱타머 또는 5%의 FBS가 보충된 DPBS 완충액에서 RNA/RNA 앱타머로 인큐베이션함에 의해 CD3-양성 Jurkat(급성 T 세포 백혈병 인간 세포주 - ATCC TIB-152), CD3-음성 Ramos(버킷(Burkitt) 림프종 인간 세포주 - ATCC CRL-1596), PSMA-양성 LNCaP(인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1740) 및 PSMA-음성 PC-3(인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1435) 세포에 대해 수행하였다. 세포를 사용전에 10% FBS(Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지(Gibco Invitrogen)에서 배양하였다. 실험 전에, Jurkat, Ramos, LNCaP 및 PC-3 세포(2.5×10⁵ 세포/웰)는 96웰 플레이트에 시딩하고 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛화된 세포는 37℃에서 예비 가열된 200 ㎕의 SELEX 또는 DPBS-5% FBS 완충액으로 2회 세척하였다. 각 세척 단계에 이어서 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였다. 앱타머는 5분 동안 85℃에서 변성시키고 즉시 5분 동안 4℃의 얼음 블록 상에 위치시켰다. 시험 샘플을 후속적으로 2개의 상이한 농도 범위: 3, 10, 30, 100 및 300 nM(CD3 결합 검정) 및 30, 100 및 300 nM PSMA 결합 검정)에서 희석시킴에 이어서 각 용액에 100 nM 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘(스트렙타비딘-PE, eBioscience)을 각각의 용액에 첨가하였다. Jurkat, Ramos, LNCaP 및 PC-3 세포를 앱타머 희석물(100 ㎕/웰) 중에 재현탁시키고 5% CO₂ 습화된 대기에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 세포를 CD3 단일클론 항체(PE-표지된, OKT3 인간 항-CD3, Invitrogen), PSMA 단일클론 항체(Alexa Fluor 488-표지된, GCP-05 인간 항-PSMA, Invitrogen), PE-스트렙타비딘, 모노머 앱타머 또는 추가의 시약이 없는 각각의 완충액과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하고, 미결합된 서열을 갖는 상청액을 제거하였다. 펠렛화된 세포를 SELEX 또는 DPBS-5% FBS 완충액(200 ㎕/웰)으로 세척하고, 2회 원심분리하여 모두 약하게 및 비-특이적으로 부착된 서열을 제거하였다. 세포를 이후에 5% CO₂ 습화된 대기에서 37℃에서 1 mg/mL 연어 정자 DNA 용액(100 ㎕/웰)으로 세척하였다. 30분 후, 연어 정자 용액을 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하여 제거하고, 세포를 추가로 SELEX 또는 DPBS-5% 완충액(200 ㎕/웰)으로 2회 세척함에 이어서 원심분리하였다. 부착된 DNA 또는 RNA 서열을 갖는 Jurkat, Ramos, LNCaP 및 PC-3 세포를 이후에 고정화 (BD CellFIX 용액 #340181)시키고, 형광성-양성 세포를 YL-1 채널 상에서 유동 세포측정(AttuneNXT; Invitrogen, Inc)에 의해 카운팅하였다.

PSMA 양성 세포에 대한 결합 연구의 결과는 도 6a 및 6b에 도시된다. 3개의 RNA/DNA 앱타머(A10 x CELTIC_1s, A10 x CELTIC_19s, A10 x CELTIC_코어) 및 2개의 RNA/RNA 앱타머(A10 x ARACD3-3700006 및 A10 x ARACD3-0010209)를 A10 모노머 앱타머와 함께 분석하였다. 비교를 위해, 시험된 시약의 PSMA-음성 PC-3 세포로의 결합을 또한 측정하였다. PSMA-양성 LNCaP 세포의 용량-의존성 결합을 최고 시험된 농도에서 신호의 포화에 도달하는 것 없이 A10으로 관찰하였다. 신호의 강도는 항체 대조군에 대한 것만큼 강하였다. A10 모노머의 PC-3 세포로의 잔여 결합은 단지 최고 시험된 농도에서 관찰되었다. 모든 이중특이적 PSMA x CD3 앱타머는 A10 모노머에 대해 유사한 결합 특성을 나타냈지만, PSMA 음성 세포에 대한 잔여 결합이 감소됨으로써 표적-양성 세포에 대해 개선된 특이성을 갖는다. 각 시험된 농도에 대해, 이중특이적 앱타머의 신호 강도는 A10 모노머에 대해 측정된 것 보다 우수하였고, 이는 헤테로다이머화가 친화성을 개선시킴을 시사한다.

또 다른 실험에서, 동일한 앱타머의 CD3-양성 Jurkat 및 CD-3 음성 Ramos 세포로의 결합을 조사하였다(도 7a 및 도 7b 참조). 예상된 바와 같이, A10 앱타머는 이들 2개의 세포주에 결합하지 않았다. 항-CD3 모노머의 Ramos 세포로의 잔여 결합은 단지 최고 시험된 농도에서 관찰되었다. 모든 이중특이적 PSMA x CD3 앱타머는 유사한 용량-의존성 결합을 나타냈지만, CD3-음성 세포로의 잔여 결합이 강하게 감소됨으로 표적-양성 세포에 대해 보다 우수한 특이성을 가졌다. 각 시험된 농도에 대해, 이중특이적 앱타머의 신호 강도는 항-CD3 모노머에 대해 측정된 것 보다 우수하였고, 이는 헤테로다이머화가 친화성을 저하시킴을 시사한다.

종합해 보면, 이러한 결과는 헤테로다이머화 후, 상이한 표적에 대해 선택된 앱타머의 결합 성질이 별도로 평가되는 경우 입체 장애로 인해 파괴되지 않음을 시사한다. 선택된 파트너에 따라, 각각의 표적에 대한 특이성 및 친화성은 심지어 다이머화 시에도 개선될 수 있다.

실시예 4. 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 PSMA 및 CD3을 표적화하는 이중특이적 앱타머의 결합.

결합 친화성 측정을 BIAcore T200 장비(GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 앱타머와 CD3 및 PSMA 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위해, 비오티닐화된 앱타머의 300 공명 유닛을 제조업자의 지침(GE Healthcare)에 따라 시리즈 S 센서 칩(GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. DPBS 완충액을 전개 완충액으로서 사용하였다. 상호작용을 30 ㎕/분의 유량으로 "단일 동력학 사이클" 방식으로 및 상이한 농도의 인간 CD3 ε/γ, CD3 ε/δ, IgG1 Fc 및 PSMA(Acro Biosystems)를 주사함에 의해 측정하였다. 사용된 최고 앱타머 농도는 300 nM이었다. 다른 농도를 3배 희석에 의해 수득하였다. 상호작용의 모든 동력학 데이터를 BIAcore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.

모노머 및 이중특이적 앱타머에 대한 K_D 값의 비교는 다이머화가 이의 특정 표적에 대해 각각의 서브유닛의 결합 특성을 붕괴시키지 않음을 나타낼 것으로 예상된다. PSMA 및 CD3 ε/γ의 동시 결합은 또한 10 ㎕/분의 유량으로 수동 주사 방식으로 및 포화 농도에서 제1 표적의 용액에 이어서 포화 농도에서 제2 표적의 용액을 주사함에 의해 기록할 수 있다. 역위 서열을 갖는 제2 주사를 수행하였다. 서열 둘 모두에서, 동일한 강도의 반응을 유도하는 각각의 주사는 이중특이적 앱타머의 아암 둘 모두가 제2 표적에 결합할 수 있고 제1 항원에 대한 결합 부위가 점유됨을 나타낸다. 표적 용액의 주사 둘 모두에 응답하는 데 실패한 모노머는 이중특이적 앱타머가 동시에 표적 둘 모두에 결합할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5. PSMA 및 CD3에 특이적인 이중특이적 앱타머의 생활성.

세포독성 검정은 비자극된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 상에서 수행하였다. 새롭게 제조된 PBMC를 건강한 공여자로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다(Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes). 혈액을 DPBS로 희석시킨 후, PBMC는 FICOLL 밀도 구배(FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.077 GE Healthcare)로 분리하고, DPBS로 2회 세척하였고, RPMI-1640 배지(Gibco Invitrogen)에 재현탁시켜 5×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도를 수득하였다. 이러한 PBMC를 이펙터 세포로서 사용하였다.

LNCaP 표적 세포를 세포 배양 배지에서 37℃에서 30분 동안 2 μM 칼세인 AM(Trevigen Inc, Gaithersburg, MD, USA)으로 표지하였다. 칼세인 AM 플루오로크롬은 생존 LNCaP 세포 내부에 포집되고 리디렉팅된 용해시에만 방출되는 염료이다. 세포 배양 배지에서 2회 세척 후, 5×10⁵ 세포/ml의 세포 밀도는 RPMI-1640 배지에서 조정하고 50,000개의 세포의 100 ㎕ 분취액을 검정 반응 당 사용하였다. 37℃/5% CO₂에서 표준 반응은 4시간 동안 지속하였고, 200 ㎕의 총 용적에서 5×10⁴ 세포 칼세인 AM-표지된 표적 세포, 5×10⁵ PBMC(1:10의 E/T 비율) 및 1 μM에서 20 ㎕의 이중특이적 앱타머 용액을 사용하였다. 세포독성 반응 후, 인큐베이션 배지에서 방출된 염료는 형광성 판독기(VarioSkan Lux, ThermoFisher, Waltham, MA, USA)로 정량하였고, 세포독성 화합물이 부재인 대조군 반응 및 형광성 신호가 전체 용해된 세포에 대해 결정된 반응(여기서, 앱타머는 제조원(Chemometec, Allerod, Denmark)으로부터 구입된 A100 시약으로 대체되었다)으로부터의 형광 신호와 비교하였다. 이러한 판독을 기준으로, 특이적 세포독성은 하기의 수학식에 따라 계산하였다: [형광성(샘플) - 형광성(대조군)]/[형광성(총 용해) - 형광성(대조군)] × 100.

10:1의 단일 E:T 비율로 앱타머 100 nM의 존재 하에 4시간 인큐베이션 후 수득된 세포독성 검정의 결과는 도 8에 나타낸다. 부재 내지 약한 특이적 세포 사멸 활성 (<10%)은 PSMAxCD3 이중특이적 RNA/DNA 앱타머로 관찰되었다. 보다 우수한 특이적 세포독성은 LNCaP 세포의 40 내지 50%의 사멸을 유도한 RNA/RNA 앱타머 A10 x ARACD3-3700006 및 A10 x ARACD3-0010209로 측정하였다. CD3 결합 모이어티가 없는 대조군 모노머 A10은 임의의 세포독성을 유도하지 않았다.

이러한 결과는 조작된 앱타머 스위치가 이의 세포용해 기구를 리디렉팅하고 특정 세포 집단을 제거하도록 이펙터 T 림프구를 표적 세포로 동원할 수 있음을 시사한다.

실시예 6. 항-CD3 x 항-PSMA 앱타머로 전임상 모델에서의 암의 치료

마우스에서 모노머 앱타머와 비교하여 상이한 멀티머 앱타머 작제물의 생체내 효능 및 독성을 평가하였다. PSMA 양성 종양을 함유하는 성체 마우스에 상이한 그룹의 마우스에서 CD3 및 PSMA에 특이적으로 결합하는 앱타머를 투여하였고 상기 앱타머는 모노머 형태 또는 멀티머 형태로 존재한다. 효능을 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 종양 크기, 종양 성장 및 속도, 및 생존률을 측정함에 의해 평가하였다. 독성을 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 역반응의 발생률에 의해 평가하였다.

실시예 7. 항-CD3 x 항-PSMA 앱타머로 전임상 모델에서의 암의 치료

마우스에서 모노머 앱타머와 비교하여 상이한 멀티머 앱타머 작제물의 생체내 효능 및 독성을 평가하였다. PSMA 양성 종양을 함유하는 성체 마우스에 상이한 그룹의 마우스에서 CD3 및 PSMA에 특이적으로 결합하는 앱타머를 투여하였고, 상기 앱타머는 모노머 형태 또는 멀티머 형태로 존재한다. 효능을 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 종양 크기, 종양 성장 및 속도, 및 생존률을 측정함에 의해 평가하였다. 독성을 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 역반응의 발생률에 의해 평가하였다.

실시예 8. PSMA 및 CAR-PNE에 특이적인 이중특이적 앱타머의 제조.

ARAA-00100001 및 ARAA-01700001 앱타머를 표준 고체상 포스포라미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 2'-F RNA 올리고스로서 baseclick(Neuried, Germany)로부터 구입하였다.

A10 2'F-RNA 앱타머를 후속 트리아졸 뉴클레오타이드 간 다이머화를 위해 이의 3'-말단에서 아지드 기로 변형시켰다. 비오틴을 앱타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합된 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 A10 앱타머의 5'-말단에 첨가하였다. ARAA-00100001 및 ARAA-01700001을 후속 트리아졸 뉴클레오타이드 간 다이머화를 위해 이의 5' 말단에 알킨 기로 변형시켰다. 분자량, 순도 및 통합성을 HPLC-MS로 입증하였다.

실시예 1에 기술된 절차를 사용하여 이중특이적 항-PSMA A10 및 항-CAR PNE 앱타머를 제조하였다. 겔을 Bio-Rad 이미지화 시스템을 사용하여 시각화하였으며, 결과는 도 4a에 도시된다. 다이머 앱타머에 상응하는 겔 슬라이스를 겔로부터 절단 제거하고, 핵산을 25 mM NaCl-TE 완충액에서 수동 용출에 의해 8℃에서 72시간 동안 추출하였다. 이중특이적 앱타머 다이머를 표준 나트륨 아세테이트 침전에 의해 회수하고, 멸균수에 재현탁하고 사용때까지 -20℃에서 저장하였다.

실시예 9. 항-PSMA x 항-CAR PNE 이중특이적 앱타머의 세포 상에 발현된 표적에 대한 친화성 및 특이성의 결정.

항-PSMA x 항-CAR PNE 앱타머의 세포 상에 발현된 표적 단백질에 대한 친화성 및 특이성을 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 이러한 연구를 실시예 3에 기재된 바와 같이 5% FBS를 함유하는 DPBS 완충액에서 PSMA-양성 LNCaP(인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1740) 및 PSMA-음성 PC-3(인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1435)에 대해 수행하였다. 앱타머를 단일 농도 범위: 30, 100 및 300 nM 내에서 시험하였다.

PSMA-양성 세포에 대한 결합 연구의 결과는 도 6a에 나타낸다. 2개의 RNA/RNA 앱타머인, A10 x ARAA-00100001 및 A10 x ARAA-01700001은 A10 모노머 앱타머와 함께 분석하였다. 비교를 위해, 시험된 시약의 PSMA-음성 PC-3 세포로의 결합을 또한 측정하였다.

PSMA-양성 LNCaP 세포의 용량-의존성 결합을 최고 시험된 농도에서 신호의 포화에 도달하는 것 없이 A10으로 관찰하였다. 신호의 강도는 항체 대조군에 대한 것 만큼 강하였다. A10 모노머의 PC-3 세포로의 잔여 결합은 단지 최고 시험된 농도에서 관찰하였다. 이중특이적 PSMA x CAR PNE 앱타머 둘 모두는 A10 모노머로의 유사한 결합 성질을 나타냈지만, PSMA 음성 세포에 대한 잔여 결합이 감소됨으로써 표적-양성 세포에 대해 개선된 특이성을 갖는다. 각각의 시험된 농도에 대해, 이중특이적 앱타머의 신호 강도는 A10 모노머에 대해 측정된 것 보다 우수하였고, 이는 헤테로다이머가 친화성을 개선시킴을 시사한다.

실시예 9로부터의 결과를 종합해 보면 상이한 표적에 대해 선택된 앱타머의 헤테로다이머화가 별도로 평가되는 경우 각각의 모이어티의 결합 특성에 유의적으로 영향을 미치지 않음을 시사한다.

실시예 10. CAR-PNE 및 PSMA에 특이적인 이중특이적 앱타머의 생활성.

세포독성 검정을 비자극된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대해 수행하였다. 새롭게 제조된 PBMC는 건강한 공여자로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다(Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes). 혈액을 DPBS로 희석시킨 후, PBMC를 FICOLL 밀도 구배(FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.077 GE Healthcare)로 분리하고, DPBS로 2회 세척하였고, RPMI-1640 배지(Gibco Invitrogen)에 재현탁시켜 5×10⁶ 세포/ml의 세포 밀도를 수득하였다. 이러한 PBMC에 CAR-PNE 수용체를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하였다. 이러한 PBMC-CAR-PNE는 이펙터 세포로서 사용하였다.

LNCaP 표적 세포를 세포 배양 배지에서 37℃에서 30분 동안 2 μM 칼세인 AM(Trevigen Inc, Gaithersburg, MD, USA)으로 표지시켰다. 칼세인 AM 플루오로크롬은 생존 LNCaP 세포 내부에 포집되고 리디렉팅된 용해시에만 방출되는 염료이다. 세포 배양 배지에서 2회 세척 후, 5×10⁵ 세포/ml의 세포 밀도는 RPMI-1640 배지에서 조정하고 50,000개의 세포의 100 ㎕ 분취액을 검정 반응 당 사용하였다. 37℃/5% CO₂에서 표준 반응을 4시간 동안 지속하였고 200 ㎕의 총 용적에서 5×10⁴ 세포 칼세인 AM-표지된 표적 세포, 5×10⁵ PBMC-CAR-PNE(1:10의 E/T 비율) 및 1 μM에서 20 ㎕의 이중특이적 앱타머 용액을 사용하였다. 세포독성 반응 후, 인큐베이션 배지에서 방출된 염료는 형광성 판독기(VarioSkan Lux, ThermoFisher, Waltham, MA, USA)에서 정량하였고 세포독성 화합물이 부재인 대조군 반응 및 형광성 신호가 전체 용해된 세포에 대해 결정된 반응(여기서, 앱타머는 제조원(Chemometec, Allerod, Denmark)으로부터 구입된 A100 시약으로 대체되었다)으로부터의 형광 신호와 비교하였다. 이러한 판독을 기준으로, 특이적 세포독성은 하기의 수학식에 따라 계산하였다: [형광성(샘플) - 형광성(대조군)]/[형광성(총 용해) - 형광성(대조군)] × 100.

10:1의 단일 E:T 비율로 앱타머 100 nM의 존재 하에 4시간 인큐베이션 후 수득된 세포독성 검정의 결과를 획득하였다. 특이적 세포독성을 30% 초과의 LNCaP 세포의 사멸을 유도하는 RNA/RNA 앱타머 A10 x PNE로 측정하였다. CAR PNE 결합 모이어티가 부재인 대조군 모노머 A10은 또한 세포독성에 대해 체크된다.

조작된 앱타머 스위치는 이의 세포용해 기구를 리디렉팅하고 특정 세포 집단을 제거하도록 이펙터 T 림프구를 표적 세포로 동원할 수 있어야 한다.

실시예 11. CAR-T 앱타머 스위치를 갖는 임상전 모델에서 암의 치료.

마우스에서 모노머 앱타머와 비교하여 스위치 앱타머 작제물의 생체내 효능 및 독성을 평가하였다. 멀티머 앱타머를 CAR-T 세포 기반 치료제의 활성을 가동시키는 스위치로서 제조하였다. 종양을 함유하는 성체 마우스에 먼저 CAR PNE로 형질도입된 T 세포를 주사하고, PSMA, 또는 HER2, 또는 CD19, 또는 CD20 또는 CD22 종양 관련 표적에 융합된 항-CAR PNE 앱타머로 구성된 멀티머 앱타머를 주입하였다. 효능을 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 종양 크기, 종양 성장 및 속도, 및 생존률을 측정함에 의해 평가하였다. 독성을 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 역반응의 발생률에 의해 평가하였다.

표 1: 서열의 요약

본원에 사용되는 "...를 본질적으로 포함하는"은 청구범위의 기본 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 포함할 수 있다. 특히 조성물의 성분의 설명에서, 또는 디바이스 요소의 설명에서 용어 "포함하는"의 본원에서의 임의의 언급은 "...를 본질적으로 포함하는" 또는 "...로 이루어진"과 교환될 수 있다.

본 발명이 특정의 바람직한 실시형태와 함께 기술되었지만, 당업자는, 상기 명세서를 읽은 후, 본원에 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변화, 등가물의 치환 및 다른 변경을 수행할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> aratinga.bio TNP <120> Aptamer-Bseed Multispecific Therapeutic Agents <130> 12269-0102 <140> PCT/IB2020/000623 <141> 2020-07-27 <150> US 62/879413 <151> 2019-07-26 <150> US 62/879401 <151> 2019-07-26 <150> PCT/IB2019/000890 <151> 2019-07-26 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Bovine herpesvirus 1 <400> 4 Met Glu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Pro Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 5 Asp Arg Thr Asn Asn Gln Val Lys Ala 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> grapevine leafroll-associated virus 3 <400> 6 Ala Gln Glu Pro Pro Arg Gln 1 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Artificial Sequence <220> <223> Cluster 27 aptamer <400> 35 aggggtttgg cgtcgggcct ggcgcagctc ttcttgtgtt t 41 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 28 aptamer <400> 36 gggattggct tcgggcctgg cgtatctttt acattacc 38 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 29 aptamer <400> 37 ggtggacggt atacaggggc tgctcaggat tgcggatgat 40 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 30 aptamer <400> 38 ccgtttgaag cgttagggtt tggcatcggg cctggcgcac 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 31 aptamer <400> 39 agggtttggc tacgggcctg gcgagctgtt tccgctactc 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 32 aptamer <400> 40 gtgttatgat actatgcgta tggattgcaa agggctgctg 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 33 aptamer <400> 41 gaagggtttg gcattgggcc tggcaagata atttgcaagt 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 34 aptamer <400> 42 cggcgaagtg gcagggtttg gcttcgggtc tggcggaaca 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 35 aptamer <400> 43 gagggtttgg cagtgggcct ggcatcaatt ctttgttttc 40 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 36 aptamer <400> 44 tactgagggt ttggcattgg gcctggcata ttggtattt 39 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 37 aptamer <400> 45 atgggtttgg caccgggtct ggcggattcg ataggtggtt 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 38 aptamer <400> 46 gggggtttgg ctctgggcct ggcataacga accttcggag 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 39 aptamer <400> 47 tgcccgagag gactgcttag gcttgcgagt agggaacgct 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 40 aptamer <400> 48 agtgggattg gcttcgggcc tggcgttcgc aacatgttta 40 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 41 aptamer <400> 49 ggggattggc actgggactg gcaccttttt aacatgtatg 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 42 aptamer <400> 50 gcaattaagg gattggctcc gggcctggcg ccacgcatgg 40 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 43 aptamer <400> 51 tggggtttgg cagcgggtct ggcgatcata atggtgtgcg 40 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 44 aptamer <400> 52 acgggggatt ggctttgggc ctggcaatta atttactgtt 40 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cluster 45 aptamer <400> 53 gagcgcttgg cagccggtct ggggacatca gaggtgatgg 40 <210> 54 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_1s aptamer <400> 54 tttccgggtg ggggtttggc accgggcctg gcgcagggat tcg 43 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_2s aptamer <400> 55 gaggggtttg gcatcgggcc tggcgccatt caagctatgc 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_3s aptamer <400> 56 gcgtaagggt ttggcagcgg gcctggcgga acgcgtgtat 40 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_21s aptamer <400> 57 ggtcgggtgc tactgagcga ttggctttcc ggactgggga 40 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_4s aptamer <400> 58 ggagtggagt attccgggtt tggcatcggg cctggcgaag 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_5s aptamer <400> 59 cggcaggggt ttggctccgg gtctggcgaa ctggctgaga 40 <210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_6s sequence <400> 60 aagggattgg cgtcgggcct ggcgtaagga ggctatgctc 40 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_9s aptamer <400> 61 gcatcgaaat ggggttggca ccgggcctgg cgaattggat 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_11s aptamer <400> 62 gatggagggt ttggcggtgg gcctggcaag ttatctcata 40 <210> 63 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_19s aptamer <400> 63 taccgcgggg attggctccg ggcctggcgt cgtaatctga 40 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC_22s aptamer <400> 64 cgaccacagg ggtttggctt cgggactggc ggtgggcact 40 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 gggnttggcn nngggnctgg c 21 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_1 aptamer <400> 66 gggtttggca ccgggcctgg cgc 23 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_2 aptamer <400> 67 gggtttggca ccgggcctgg c 21 <210> 68 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_3 aptamer <400> 68 ccgggcctgg cc 12 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_4 aptamer <400> 69 gggtttggca tcgggcctgg cg 22 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_5 aptamer <400> 70 gggtttggcg gtgggcctgg c 21 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_6 aptamer <400> 71 tttgggtttg gcaccgggcc tggc 24 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_T aptamer <400> 72 tttgggtttg gcatcgggcc tggc 24 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_7 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 73 gggtttngca ccgggcctgg c 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_8 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 gggtttgnca ccgggcctgg c 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_9 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 75 gggtttggna ccgggcctgg c 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_10 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 gggtttggca ccnggcctgg c 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_11 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 77 gggtttggca ccggncctgg c 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_12 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 gggtttggca ccgggnctgg c 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_13 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 gggtttggca ccgggcntgg c 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_14 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <400> 80 nggtttggca tcgggcctgg c 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_15 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or t <400> 81 gngtttggca tcgggcctgg c 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_16 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <400> 82 ggntttggca tcgggcctgg c 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_17 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 83 gggnttggca tcgggcctgg c 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_18 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 84 gggtntggca tcgggcctgg c 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_19 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <400> 85 gggttnggca tcgggcctgg c 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_20 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 86 gggtttngca tcgggcctgg c 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_21 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 87 gggtttgnca tcgggcctgg c 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_22 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 88 gggtttggna tcgggcctgg c 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_23 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 89 gggtttggcn tcgggcctgg c 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_24 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 90 gggtttggca ncgggcctgg c 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_25 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <400> 91 gggtttggca tngggcctgg c 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_26 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 92 gggtttggca tcnggcctgg c 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_27 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 93 gggtttggca tcgngcctgg c 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_28 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 94 gggtttggca tcggncctgg c 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_29 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 95 gggtttggca tcgggnctgg c 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_30 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 96 gggtttggca tcgggcntgg c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_31 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 97 gggtttggca tcgggccngg c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_32 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 98 gggtttggca tcgggcctng c 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_33 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 99 gggtttggca tcgggcctgn c 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_34 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 100 gggtttggca tcgggcctgg n 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_35 aptamer <400> 101 gggtttggga tcgggcctgg c 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_36 aptamer <400> 102 gggtttggca tcgggcctgg g 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_37 aptamer <400> 103 gggtttggga tcgggcctgg g 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_38 aptamer <400> 104 gggtttggca tcgggactgg c 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_39 aptamer <400> 105 gggtttggca tcggggctgg c 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_40 aptamer <400> 106 gggtttggca tcgggtctgg c 21 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_41 aptamer <400> 107 gggtttggca tcgggctggc 20 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_42 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 108 gggtttggca ncgggnctgg c 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_43 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 109 gggtttggca gcgggnctgg c 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CELTIC core_44 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 110 gggtttggca acgggnctgg c 21 <210> 111 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-0010209 aptamer <400> 111 ucuaagcaau auuguuugcu uuugcagcga uucuguuucg auauauua 48 <210> 112 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-2980001 aptamer <400> 112 uucaagauaa uguaauuauu uuugcagcga uucuuguuuu guucgauuu 49 <210> 113 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-0270039 aptamer <400> 113 caaaguucaa gauugagcuu uuugcagcga uucuuguuuu aucaaacga 49 <210> 114 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-3130001 aptamer <400> 114 gaugauaucu uuaauaucaa uugcagcgau ucuuguuuga gaauaaac 48 <210> 115 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARACD3-3700006 aotamer <400> 115 uauagacuuu aaugucucau uuucgcagcg auucuuguuu auuuaacaua 50 <210> 116 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Core sequence RNA aptamer <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or u <400> 116 ungcagcgau ucunnuu 17 <210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-1 aptamer <400> 117 grdtkgsydb hsgghctgg 19 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-2 aptamer <400> 118 gggrttggcr bhggghctgg c 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-3 aptamer <400> 119 gdttdgsywb csggmctggs g 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-4 aptamer <400> 120 gggtttggca bcgggcctgg c 21 <210> 121 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus-5 aptamer <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or u <400> 121 gcagcgauuc unguuu 16 <210> 122 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer library <220> <221> misc_feature <222> (24)..(63) <223> n is a, c, g, or t <400> 122 tagggaagag aaggacatat gatnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnttgacta gtacatgacc acttga 86 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DNA SELEX <400> 123 tagggaagag aaggacatat gat 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DNA SELEX <400> 124 tcaagtggtc atgtactagt caa 23 <210> 125 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA aptamer library <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (65)..(74) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 cctctctatg ggcagtcggt gatnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntttctgc agcgattctt 60 gtttnnnnnn nnnnggagaa tgaggaaccc agtgcag 97 <210> 126 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for RNA SELEX <400> 126 taatacgact cactataggg cctctctatg ggcagtcggt gat 43 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for RNA SELEX <400> 127 ctgcactggg ttcctcattc tcc 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward blocking sequence for RNA SELEX <400> 128 atcaccgact gcccatagag agg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse blocking sequence for RNA SELEX <400> 129 ctgcactggg ttcctcattc tcc 23 <210> 130 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture sequence for RNA SELEX <400> 130 caagaatcgc tgcag 15

Claims

1) 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 표적 결합 앱타머 영역, 및 2) 앱타머 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함하는 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항에 있어서, 링커가 공유 결합, 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 자가-조립 상보적 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고당, 다당류, 합성 폴리머, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 트리아졸, 나노입자, 마이셀, 리포솜, 세포, 클릭 화학 생성물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커 모이어티를 포함하거나 이로 이루어진, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제2항에 있어서, 링커가 클릭 화학 생성물을 포함하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포, 면역 세포, 암 세포, 유전적으로 변형된 세포, 박테리아, 또는 바이러스 중 하나 이상 상의 특이적 표적에 결합할 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 표적 세포에서 다른 표적 세포로의 하나의 세포 타입의 결합을 리디렉팅(redirect)할 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포와 암 세포 사이에 브릿지(bridge)를 형성할 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 자극 및 활성화시킬 수 있는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제7항에 있어서, 면역 세포가 T-세포, NK-세포, 또는 대식 세포이며, 상기 결합이 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자의 표적 결합 앱타머에 결합된 표적 세포의 파괴에 이르게 하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 CD3, CD8, CD4, CD19, 상피 세포 부착 분자, CD20, CD22, CD123, BCMA, B7H3, CEA, PSMA, Her2, CD33, CD38, DLL3, EGF-R, NKG2D 리간드, MHC 클래스 I-관련된 단백질 MR1, 메소텔린, PD-1, PD-L1, CTLA04, Lag-3, TIM-3, OX40, CD47, VEGF, PRAME, NY-ESO-1, MAGE A4, MAGE A3/A6, MAGE A10, 및 AFP로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제3항에 있어서, 분자가 CD3 항원을 발현하는 면역 세포에 결합하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항에 있어서, 분자가 암 세포 상의 PSMA 항원과 결합하는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

제1항에 있어서, T-세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 CD3 항원 결합 영역, 및 PSMA 발현 세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 PSMA 항원 결합 영역을 포함하며, CD3 항원 결합 영역 및 PMSA 항원 결합 영역은 하나 이상의 링커에 의해 연결되는, 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자.

전립선암을 포함하는 PSMA 발현 암의 치료에서의 제12항의 앱타머-기반 다중특이적 항원 결합 분자의 용도.