TW202146444A

TW202146444A - 三特異性結合分子

Info

Publication number: TW202146444A
Application number: TW110105418A
Authority: TW
Inventors: 亞當Ｓ雪方; 峰董; 艾德華 B 賴里; 珍妮佛Ｄ史東; 麥可Ｋ懷特; 豪葛威斯克; 瑞克奧司丁; 布萊恩雷蒙
Original assignee: 百慕達商艾伯維生物技術有限責任公司; 美商艾伯維有限公司
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2021-02-17
Publication date: 2021-12-16
Also published as: WO2021163364A1

Abstract

本揭示案提供結合至人類存活素、人類CD3及人類血清白蛋白之新穎三特異性分子，以及其製備及使用方法。

Description

三特異性結合分子

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2020年2月12日申請之美國臨時申請案第62/975,396號及2020年2月13日申請之美國臨時申請案第62/976,138號之權益，其中每一申請案之內容以引用的方式併入本文中。

本申請案尤其關於結合至人類存活素及人類CD3之新穎三特異性分子、包括三特異性分子之組合物、編碼三特異性多肽之核酸以及其製備及使用方法。序列表

名稱為「AVR-54125_ST25」之序列表以全文引用之方式併入本文中，該序列表包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 51，其包含本文所揭示之胺基酸序列。因此，序列表已以ASCII正文格式經由EFS提交。序列表首次創建於2021年2月11日，且大小為111,326位元組。

癌症療法包括廣泛範圍的治療方法，包含手術、輻射及化學療法。許多現有治療劑具有缺點，諸如缺乏靶向癌細胞而非健康細胞之選擇性，以及癌症對治療產生抗性。

相比於諸如輻射治療的非靶向療法，基於靶向療法之最近方法（其優先影響癌細胞超過正常細胞）已產生副作用較少的化學治療方案。

癌症免疫療法，包含已知增強患者T細胞殺傷癌細胞之藥劑，已成為一種有前景的治療方法。不同於抗體，T細胞受體已進化為識別處理成小肽之細胞內蛋白，該等蛋白與細胞表面上之主要組織相容性複合物（major histocompatibility complex；MHC）分子（亦稱為人類白血球抗原（human leukocyte antigen；HLA）複合物）複合且由其呈現。

可溶性T細胞受體（sTCR）代表一個新穎類別之治療劑，其具有靶向血液學及實體腫瘤兩者中之腫瘤-選擇性抗原的潛力，該等血液學及實體腫瘤當前無法使用基於傳統抗體的治療劑來治療。然而，若干挑戰會阻礙治療性sTCR之發展，包含難以表現可溶性、穩定及高親和力TCR。存活素為在多種實體及血液癌中過度表現，潛在地可藉由sTCR接近之有吸引力的細胞內目標。因此，需要開發靶向存活素之基於sTCR之新的免疫治療方法。

本文描述了結合至人類存活素及人類CD3之三特異性分子。

本發明之一個態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

本發明之一個態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括： i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L1包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括： i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L1包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

本發明之一個態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L2包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L2包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。

本發明之一個態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L3包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括： i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L3包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。

本發明之一個態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L4包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子，其中L4包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子，其中L3包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括： a）包括單鏈T細胞受體（sTCR）之第一域（T），該sTCR包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列； b）包括V_HH 域之第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括單鏈可變片段（scFv）之第三域（C），該scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子，其中L4包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

本發明之另一態樣關於一種結合至人類存活素、CD3及白蛋白之三特異性分子，其中該三特異性分子包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。

本文描述了新穎三特異性分子，其包括抗CD3結合域、白蛋白結合域及對存活素具有高結合親和力之可溶性單鏈T細胞受體。此等三特異性分子展現若干出人意料的特性，包含例如針對與HLA-A2複合之存活素衍生的肽的顯著較高特異性，及T細胞活化及增殖之強力誘導。

縮寫

在多個實施例中，本文所描述之三特異性結合分子及多核苷酸藉助於其各別多肽或多核苷酸序列來描述。除非另外指明，否則多肽序列以N端至C端取向提供，且多核苷酸序列以5'→3'取向提供。對於多肽序列而言，使用基因編碼的胺基酸之習知三個字母或一個字母縮寫。

縮寫	術語
MACS	磁活化細胞分選
PBS	磷酸鹽緩衝鹽水
BSA	牛血清白蛋白
EDTA	乙二胺四乙酸
DMSO	二甲亞碸
FACS	螢光活化細胞分選
Tris	參(羥甲基)胺基甲烷
SEC	尺寸排阻層析
SDS-PAGE	十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳
PBMC	周邊血液單核細胞
FBS	胎牛血清
MABEL	最小預期生物效應水準
PBMC	周邊血液單核細胞
MeCN	乙腈
TFA	三氟乙酸
NMR	核磁共振
DMSO	二甲亞碸
LC/MS或LCMS	液相層析-質譜法
MeOH	甲醇
t BME	甲基三級丁基醚
min	分鐘
mL	毫升
µL	微升
g	公克
mg	毫克
mmol	毫莫耳
HPLC	高壓液相層析
ppm	百萬分率
µm	微米

實施例

本文描述了三特異性分子，其能夠結合至存活素以及CD3並且具有半衰期延長域，諸如結合至人類白蛋白（ALB）之域。

如本文所用，術語「人類CD3」涉及在UniProt P07766（CD3E-HUMAN）下所描述之人類分化叢集3蛋白（CD3）。

如本文所用，術語「人類存活素」或「存活素」涉及在UniProt O15392（BIRC5_Human）下所描述之凋亡抑制蛋白（IAP），其為在人類癌症細胞中表現之腫瘤相關抗原。

「結合至CD3或人類存活素」係指能夠以足夠親和力結合CD3或人類存活素使得分子可用作靶向CD3或人類存活素之治療劑的分子。

在一個態樣中，本發明之三特異性分子包括（1）存活素結合部分、（2）CD3結合部分及（3）半衰期延長部分。

存活素結合部分

在一個態樣中，本發明之三特異性分子包括存活素結合部分。

在一個實施例中，本發明之三特異性分子的存活素結合部分包括單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）。

如本文所用，術語「T細胞受體（TCR）」為抗原特異性分子，其負責識別在抗原呈現細胞（APC）或任何有核細胞（例如，體內所有人類細胞，除紅細胞以外）表面上之主要組織相容性複合物（MHC）的產物之情況下所呈現之抗原肽。

在一個實施例中，本發明之sTCR為經修飾之TCR，該TCR包括源自野生型T細胞受體之可變α區（V_α ）及可變β區（V_β ），其中V_α 、V_β 或兩者相對於野生型T細胞受體在一或多個互補決定區（CDR）均包括至少一個突變，其中經修飾之T細胞受體結合至存活素肽，較佳存活素肽LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）與主要組織相容性複合物（MHC）I類分子HLA-A2之複合物。

在一個實施例中，本發明之sTCR包括V_β 及V_α ，其中sTCR結合至包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的肽與HLA-A2分子之複合物。

在一個實施例中，本發明之sTCR包括V_β 及V_α ，其中sTCR結合至與HLA-A2複合的源自人類存活素之肽（SEQ ID NO: 51）。

在一個實施例中，本發明之sTCR之V_α 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）。在另一實施例中，本發明之sTCR之V_α 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）。

在一個實施例中，本發明之sTCR之V_α 包括選自由SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9組成之群組的胺基酸序列。

在一個較佳實施例中，本發明之sTCR之V_α 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之sTCR之V_α 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之sTCR之V_β 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）。

在一個實施例中，本發明之sTCR之V_β 包括選自由SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7組成之群組的胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之sTCR之V_β 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之sTCR之V_β 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之sTCR之V_β 包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。

在一個實施例中，sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ）經由第一肽連接子（L1）連接。可選擇連接子以增加本發明之三特異性分子的表現、溶解性、穩定性（例如，如藉由較低聚集水準、較低聚集速率、較高解鏈溫度及/或較長血漿半衰期所量測）及/或效價。

在一個實施例中，sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ）經由包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的第一肽連接子（L1）連接。

在一個實施例中，sTCR可變β區（V_β ）經由二硫鍵與sTCR可變α區（V_α ）連接。舉例而言，且在不受任何特定理論約束之情況下，在一些實施例中，sTCR鏈之一個或多個半胱胺酸可以形成連接V_α 及V_β 域之二硫鍵，例如，sTCR鏈之半胱胺酸43及235。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括選自由以下組成之群組的胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ）：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7，及（2）包括選自由以下組成之群組的胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ）：SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 9，其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

一個實施例關於本發明之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR），其結合至肽存活素之複合物，其中該複合物包括SEQ ID NO: 51之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括：（1）包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及（2）包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接。

在一個實施例中，本發明之第一肽連接子（L1）包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之sTCR包括選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16。在另一實施例中，本發明之sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之sTCR包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之sTCR包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。

CD3 結合部分

在一個態樣中，本發明之三特異性分子包括CD3結合部分。

在一個實施例中，本發明之三特異性分子之CD3結合部分包括結合至人類CD3之抗CD3結合域。

在一些實施例中，抗CD3結合域包括對人類CD3具有特異性之人類化或人類輕鏈可變區，其中對CD3具有特異性之輕鏈可變區包括人類輕鏈框架區中之人類或非人類輕鏈CDR。在某些情況下，輕鏈框架區為λ輕鏈框架。在其他情況下，輕鏈框架區為κ輕鏈框架。

在一些實施例中，抗CD3結合域包括對CD3具有特異性之人類化或人類重鏈可變區，其中對CD3具有特異性之重鏈可變區包括人類重鏈框架區中之人類或非人類重鏈CDR。

在一個實施例中，抗CD3結合域為包括本文所提供之胺基酸序列之輕鏈可變域及重鏈可變域的單鏈可變片段（scFv）。

如本文所用，「單鏈可變片段」或「scFv」係指包括輕鏈可變區之抗體片段及包括重鏈可變區之至少一個抗體片段，其中輕鏈及重鏈可變區經由短可撓性多肽連接子連續地連接，且能夠以單個多肽鏈形式表現，並且其中scFv保持其所源自之完整抗體的特異性。

如本文所用，如本文所用之「可變域」（輕鏈（V_L ）可變域、重鏈（V_H ）可變區）指示輕鏈及重鏈對中之每一者，其直接參與抗體與目標之結合。可變人類輕鏈及重鏈之域具有相同通式結構且各域包括至少一個互補決定區（CDR），較佳三個CDR，其在根據本發明之抗體之結合特異性/親和力中起重要作用且因此提供本發明之另一目的。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv包括本文所提供之胺基酸序列之輕鏈可變域（V_L ）及重鏈可變域（V_H ）。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv之V_H 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv之V_H 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv之V_L 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv之V_L 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv包括：（1）包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變（V_H ）；以及（2）包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變（V_L ）；其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。

在一個實施例中，本發明之抗CD3-Fab包括：（1）包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變（V_H ）；以及（2）包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變（V_L ）；其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。

在一個實施例中，第二肽連接子（L2）包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明之抗CD3 scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。

半衰期延長域

本發明之三特異性分子進一步包括半衰期延長域。本文考慮了延長抗原結合域半衰期之域。

在一個實施例中，本發明之三特異性分子包括半衰期延長域，例如結合至人類白蛋白（ALB）之域。

在一些實施例中，ALB結合域包括結合至人類血清白蛋白（HSA）之單一重鏈域（V_HH ）。

在一些實施例中，抗HSA V_HH 域包括：包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的CDR2及包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列的CDR3。

在一些實施例中，抗HSA V_HH 域包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列。

三特異性分子之形式

在一些實施例中，本發明之三特異性分子包括：包括結合至肽存活素之複合物的單鏈可溶性TCR之域（T）；結合至HSA之域（A）；以及結合至CD3之域（C）。三特異性分子中之三個域可以任何次序排列。

因此，預期三特異性分子之域次序為： H2N-(T)-(C)-(A)-COOH， H2N-(T)-(A)-(C)-COOH， H2N-(C)-(T)-(A)-COOH， H2N-(C)-(A)-(T)-COOH， H2N-(A)-(C)-(T)-COOH，及/或 H2N-(A)-(T)-(C)-COOH。

在一些實施例中，三特異性分子具有H2N-(T)-(C)-(A)-COOH之域次序。在一些實施例中，三特異性分子具有H2N-(T)-(A)-(C)-COOH之域次序。在一些實施例中，三特異性分子具有H2N-(C)-(T)-(A)-COOH之域次序。在一些實施例中，三特異性分子具有H2N-(C)-(A)-(T)-COOH之域次序。在一些實施例中，三特異性分子具有H2N-(A)-(C)-(T)-COOH之域次序。在一些實施例中，三特異性分子具有H2N-(A)-(T)-(C)-COOH之域次序。

三特異性分子之六個例示性實施例說明於圖1A-1F中且描述如下。

參考圖1A，三特異性分子之一個例示性實施例包括（1）包括結合至存活素肽與HLAA2分子之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T）；（2）包括結合至人類血清白蛋白之單一重鏈域（V_HH ）（抗HSA V_HH ）的第二域（A）；以及（3）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）（抗CD3 scFv）的第三域（C），其中三個域以H2N-(T)-(C)-(A)-COOH之次序連接。sTCR包括sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ），其中V_β 及V_α 經由第一肽連接子（L1）連接。抗CD3 scFv包括重鏈可變（V_H ）及輕鏈可變（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。sTCR及抗CD3 scFv經由連接sTCR之V_α 與抗CD3 scFv之V_H 的第三肽連接子（L3）連接。抗CD3 scFv及抗HSA V_HH 之V_L 經由第四肽連接子（L4）連接。因此，自N端至C端，三特異性分子呈V_β -L1-V_α -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_HH 形式。

參考圖1B，三特異性分子之一個例示性實施例包括（1）包括結合至存活素肽與HLAA2分子之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T）；（2）包括結合至人類血清白蛋白之單一重鏈域（V_HH ）（抗HSA V_HH ）的第二域（A）；以及（3）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）（抗CD3 scFv）的第三域（C），其中三個域以H2N-(T)-(A)-(C)-COOH之次序連接。sTCR包括sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ），其中V_β 及V_α 經由第一肽連接子（L1）連接。抗CD3 scFv包括重鏈可變（V_H ）及輕鏈可變（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。sTCR及抗HSA V_HH 經由連接sTCR之V_α 與V_HH 之第三肽連接子（L3）連接。抗CD3 scFv及抗HSA V_HH 經由連接抗CD3 scFv之V_H 與V_HH 之第四肽連接子（L4）連接。因此，自N端至C端，三特異性分子呈V_β -L1-V_α -L3-V_HH -L4-V_H -L2-V_L 形式。

參考圖1C，三特異性分子之一個例示性實施例包括（1）包括結合至存活素肽與HLAA2分子之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T）；（2）包括結合至人類血清白蛋白之單一重鏈域（V_HH ）（抗HSA V_HH ）的第二域（A）；以及（3）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）（抗CD3 scFv）的第三域（C），其中三個域以H2N-(C)-(T)-(A)-COOH之次序連接。sTCR包括sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ），其中V_β 及V_α 經由第一肽連接子（L1）連接。抗CD3 scFv包括重鏈可變（V_H ）及輕鏈可變（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。抗CD3 scFv及sTCR經由連接抗CD3 scFv之V_L 與sTCR之V_β 的第三肽連接子（L3）連接。sTCR及抗HSA V_HH 經由連接sTCR之V_α 與V_HH 之第四連接子（L4）連接。因此，自N端至C端，三特異性分子呈V_H -L2-V_L -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_HH 形式。

參考圖1D，三特異性分子之一個例示性實施例包括（1）包括結合至存活素肽與HLAA2分子之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T）；（2）包括結合至人類血清白蛋白之單一重鏈域（V_HH ）（抗HSA V_HH ）的第二域（A）；以及（3）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）（抗CD3 scFv）的第三域（C），其中三個域以H2N-(C)-(A)-(T)-COOH之次序連接。sTCR包括sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ），其中V_β 及V_α 經由第一肽連接子（L1）連接。抗CD3 scFv包括重鏈可變（V_H ）及輕鏈可變（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。抗CD3 scFv及抗HSA V_HH 經由連接抗CD3 scFv之V_L 與V_HH 之第三肽連接子（L3）連接。抗HSA V_HH 及sTCR經由連接V_HH 與sTCR之V_β 之第四連接子（L4）連接。因此，自N端至C端，三特異性分子呈V_H -L2-V_L -L3-V_HH -L4-V_β -L1-V_α 形式。

參考圖1E，三特異性分子之一個例示性實施例包括（1）包括結合至存活素肽與HLAA2分子之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T）；（2）包括結合至人類血清白蛋白之單一重鏈域（V_HH ）（抗HSA V_HH ）的第二域（A）；以及（3）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）（抗CD3 scFv）的第三域（C），其中三個域以H2N-(A)-(C)-(T)-COOH之次序連接。sTCR包括sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ），其中V_β 及V_α 經由第一肽連接子（L1）連接。抗CD3 scFv包括重鏈可變（V_H ）及輕鏈可變（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。抗HSA V_HH 及抗CD3 scFv經由連接V_HH 與抗CD3 scFv之V_H 之第三肽連接子（L3）連接。抗CD3 scFv及sTCR經由連接抗CD3 scFv之V_L 與sTCR之V_β 的第四連接子（L4）連接。因此，自N端至C端，三特異性分子呈V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α 形式。

參考圖1F，三特異性分子之一個例示性實施例包括（1）包括結合至存活素肽與HLAA2分子之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T）；（2）包括結合至人類血清白蛋白之單一重鏈域（V_HH ）（抗HSA V_HH ）的第二域（A）；以及（3）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）（抗CD3 scFv）的第三域（C），其中三個域以H2N-(A)-(T)-(C)-COOH之次序連接。sTCR包括sTCR可變β區（V_β ）及sTCR可變α區（V_α ），其中V_β 及V_α 經由第一肽連接子（L1）連接。抗CD3 scFv包括重鏈可變（V_H ）及輕鏈可變（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接。抗HSA V_HH 及sTCR經由連接V_HH 與sTCR之V_β 之第三肽連接子（L3）連接。sTCR及抗CD3 scFv經由連接sTCR之V_α 與抗CD3 scFv之V_H 的第四連接子（L4）連接。因此，自N端至C端，三特異性分子呈V_HH -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_H -L2-V_L 形式。

列舉以下本發明之特定實施例：

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以按以下次序形成三特異性分子： H₂ N-(T)-L3-(C)-L4-(A)-COOH， H₂ N-(T)-L3-(A)-L4-(C)-COOH， H₂ N-(C)-L3-(T)-L4-(A)-COOH， H₂ N-(C)-L3-(A)-L4-(T)-COOH， H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH，或 H₂ N-(A)-L3-(T)-L4-(C)-COOH。

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(T)-L3-(C)-L4-(A)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）結合至人類CD3之第三域（C），其中第三域包括單鏈可變片段（scFv），該scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，第一肽連接子（L1）包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

在一個實施例中，第三肽連接子（L3）包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在另一實施例中，第三肽連接子（L3）包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在另一實施例中，第三肽連接子（L3）包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

在一個實施例中，第四肽連接子（L4）包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在另一實施例中，第四肽連接子（L4）包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在另一實施例中，第四肽連接子（L4）包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(T)-L3-(C)-L4-(A)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(T)-L3-(C)-L4-(A)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(T)-L3-(A)-L4-(C)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_HH -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_HH -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_HH -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(T)-L3-(A)-L4-(C)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_HH -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_β -L1-V_α -L3-V_HH -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(T)-L3-(A)-L4-(C)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(C)-L3-(T)-L4-(A)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(C)-L3-(T)-L4-(A)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_HH -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(C)-L3-(T)-L4-(A)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(C)-L3-(A)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_HH -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_HH -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_HH -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(C)-L3-(A)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_HH -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_H -L2-V_L -L3-V_HH -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(C)-L3-(A)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一些實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(T)-L4-(C)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. sTCR可變β區（V_β ），及 ii. sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括重鏈可變區（V_H ）及輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(T)-L4-(C)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 49（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的sTCR可變β區（V_β ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的sTCR可變α區（V_α ），其中sTCR之V_β 及V_α 區經由第一肽連接子（L1）連接； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）之第三域，其中scFv包括 i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的重鏈可變區（V_H ），及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的輕鏈可變區（V_L ），其中V_H 及V_L 經由第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_β -L1-V_α -L4-V_H -L2-V_L -COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，三特異性分子包括： a）包括結合至肽存活素之複合物之單鏈可溶性T細胞受體（sTCR）的第一域（T），其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及HLA-A2分子，其中sTCR包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列； b）包括結合至白蛋白之V_HH 域的第二域（A），其中V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括結合至人類CD3之單鏈可變片段（scFv）的第三域（C），其中scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之域經由第三連接子（L3）及第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(T)-L4-(C)-COOH次序之三特異性分子。

在一個實施例中，一種三特異性分子，其結合至（i）人類CD3、（ii）人類血清白蛋白及（iii）肽存活素之複合物，其中複合物包括LTLGEFLKL（SEQ ID NO: 51）之胺基酸序列及包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的HLA-A2分子。

在另一態樣中，本揭示案關於一種醫藥組合物，其包括本發明之三特異性分子。

在另一態樣中，本揭示案關於一種治療大腸直腸癌或前列腺癌之方法，其包括向有需要之患者投與本發明之三特異性分子或其醫藥組合物。

在另一態樣中，本揭示案關於編碼本發明之三特異性分子的核酸分子以及編碼表1中所列之胺基酸序列的多核苷酸。

在另一態樣中，本揭示案關於包括編碼本發明之三特異性分子之核酸分子的載體以及包括編碼表1中所列之胺基酸序列的多核苷酸的載體。

在另一態樣中，本揭示案關於能夠產生本發明之三特異性分子的宿主細胞。實例

以下實例係出於說明而非限制之目的提供。

TCR-CD3 三特異性分子產生

產生三特異性分子。三特異性分子之各組分的多肽序列列於表1中。此類多肽內之CDR加下劃線並且分別鑑別其序列。表 1

分子	組分	胺基酸序列
1a5EP-wt::aALB::aCD3	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
V_α -V_HH 連接子	SEQ ID NO: 2 GGGGSGGGS
V_HH -V_H 連接子	SEQ ID NO: 2
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3 GGGGSGGGGSGGGGS
V_β	SEQ ID NO: 5 SQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVE GTSNPN LYWYRQAAGR （CDR1，SEQ ID NO: 37） CLELLFY SVGIG QISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSG （CDR2，SEQ ID NO: 38） FYLC AWSIGAEMF FGPGTRLTVLEDLKN （CDR3，SEQ ID NO: 39）
V_α	SEQ ID NO: 8 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYS DRYAQN FFWYRQYPGKS （CDR1，SEQ ID NO: 34） PELIMS IYSNGD KEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATY （CDR2，SEQ ID NO: 35） LC AVSKGYKVF GCGTQLVVKPN （CDR3，SEQ ID NO: 36）
V_H	SEQ ID NO: 10 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFTFNKYAIN WVRQAPG （CDR1，SEQ ID NO: 40） KGLEWVA RIRSKYNNYATYYADQVKD RFTISRDDSKNTAYL （CDR2，SEQ ID NO: 41） QMNNLKTEDTAVYYCVR HANFGNSYISYWAY WGQGTLVTVS （CDR3，SEQ ID NO: 42） S
V_L	SEQ ID NO: 11 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC ASSTGAVTSGNYPN WVQQKP （CDR1，SEQ ID NO: 43） GQAPRGLIG GTKFLVP GTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDE （CDR2，SEQ ID NO: 44） AEYYC TLWYSNRWV FGGGTKLTVL （CDR3，SEQ ID NO: 45）
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAAS GFTFSKFGMS WVRQAPG （CDR1，SEQ ID NO: 46） KGLEWVS SISGSGRDTLYADSVKG RFTISRDNAKTTLYLQMN （CDR2，SEQ ID NO: 47） SLRPEDTAVYYCTI GGSLSVSS QGTLVTVSS （CDR3，SEQ ID NO: 48）
V_β -V_α 完全（T）	SEQ ID NO: 13 SQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPN
V_H -V_L 完全（C）	SEQ ID NO: 17 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
完全序列	SEQ ID NO: 18 SQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPNGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
1a5EP-wt::aCD3::aALB	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3
V_α -V_H 連接子	SEQ ID NO: 2
V_L -V_HH 連接子	SEQ ID NO: 2
V_β	SEQ ID NO: 5
V_α	SEQ ID NO: 8
V_H	SEQ ID NO: 10
V_L	SEQ ID NO: 11
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12
V_β -V_α 完全（T）	SEQ ID NO: 13
V_H -V_L 完全（C）	SEQ ID NO: 17
完全序列	SEQ ID NO: 19 SQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPNGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS
aALB::1a5EP-wt::aCD3	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3
V_α -V_H 連接子	SEQ ID NO: 2
V_HH -V_β 連接子	SEQ ID NO: 2
V_β	SEQ ID NO: 5
V_α	SEQ ID NO: 8
V_H	SEQ ID NO: 10
V_L	SEQ ID NO: 11
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12
V_β -V_α 完全（T）	SEQ ID NO: 13
V_H -V_L 完全（C）	SEQ ID NO: 17
完全序列	SEQ ID NO: 20 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPNGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVL
aCD3::1a5EP-wt::aALB	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3
V_α -V_HH 連接子	SEQ ID NO: 2
V_H -V_β 連接子	SEQ ID NO: 2
V_β	SEQ ID NO: 5
V_α	SEQ ID NO: 8
V_H	SEQ ID NO: 10
V_L	SEQ ID NO: 11
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12
V_β -V_α 完全（T）	SEQ ID NO: 13
V_H -V_L 完全（C）	SEQ ID NO: 17
完全序列	SEQ ID NO: 21 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGSSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPNGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSS
aALB::aCD3::1a5EP-wt	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3
V_HH -V_H 連接子	SEQ ID NO: 2
V_H -V_β 連接子	SEQ ID NO: 2
V_β	SEQ ID NO: 5
V_α	SEQ ID NO: 8
V_H	SEQ ID NO: 10
V_L	SEQ ID NO: 11
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12
V_β -V_α 完全（T）	SEQ ID NO: 13
V_H -V_L 完全（C）	SEQ ID NO: 17
完全序列	SEQ ID NO: 22 EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGSSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPN
aCD3::aALB::1a5EP-wt	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3
V_L -V_HH 連接子	SEQ ID NO: 2
V_HH -V_β 連接子	SEQ ID NO: 2
V_β	SEQ ID NO: 5
V_α	SEQ ID NO: 8
V_H	SEQ ID NO: 10
V_L	SEQ ID NO: 11
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12
V_β -V_α 完全（T）	SEQ ID NO: 13
V_H -V_L 完全（C）	SEQ ID NO: 17
完全序列	SEQ ID NO: 23 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAINWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADQVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHANFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLVPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCTLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSKFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGRDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSVSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRCLELLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSIGAEMFFGPGTRLTVLEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRYAQNFFWYRQYPGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVSKGYKVFGCGTQLVVKPN
1a5EP-aY29G::aALB::aCD3	V_β -V_α 連接子	SEQ ID NO: 1
V_H -V_L 連接子	SEQ ID NO: 3
V_α -V_HH 連接子	SEQ ID NO: 2
V_HH -V_H 連接子	SEQ ID NO: 2
V_β	SEQ ID NO: 5
V_α	SEQ ID NO: 9 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYS DRGAQN FFWYRQYPGKS （CDR1，SEQ ID NO: 49） PELIMS IYSNGD KEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATY （CDR2，SEQ ID NO: 35） LC AVSKGYKV FGCGTQLVVKPN （CDR3，SEQ ID NO: 36）
V_H	SEQ ID NO: 10
V_L	SEQ ID NO: 11
V_HH （A）	SEQ ID NO: 12
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實例 1

將靶向存活素之兩個可溶性T細胞受體（sTCR）序列1a5EP-wt及1a5EP-Y29Ga（SEQ ID NO 13及14）選殖至TriTAC表現構築體中。各TriTAC含有在此情況下靶向存活素之sTCR的目標域（T）、呈抗CD3-scFv（SEQ ID NO 17）形式之CD3結合域（C）及呈抗白蛋白單域抗體（SEQ ID NO 12）形式之白蛋白結合域（A）。對於各TriTAC，三個域可以六種不同組態進行配置（圖 1 ）：T:A:C、T:C:A、A:T:C、C:T:A、A:C:T及C:A:T。因此，對於兩個sTCR序列中之每一者，產生六種表現構築體（SEQ ID NO 18到29）。各構築體含有自哺乳動物細胞分泌表現之信號域。連接各域的為GGGGSGGGS胺基酸連接子（SEQ ID NO.2）。各構築體之C端含有HHHHHH胺基酸序列（SEQ ID NO.50）。在較佳實施例中，C端HHHHHH胺基酸序列不存在於最終三特異性分子產物中。

將靶向存活素之TriTAC構築體轉染至Expi293細胞或CHO-EBNA細胞（生命技術公司（Life Technologies））中，以用於分泌蛋白質表現。此等靶向存活素之TriTAC蛋白經蛋白A結合位點工程改造，且使用具有與靶向存活素之TriTAC蛋白類似分子量之TriTAC蛋白作為標準，使用藉由使用Octet儀器與蛋白A尖頭定量來自經傳染之Expi293或CHO-EBNA細胞之條件培養基中的TriTAC蛋白之量。

在T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）分析中測試條件培養基，以確認靶向存活素之TriTAC引導T細胞殺傷具有MHC呈遞存活素肽的癌細胞（Nazarian AA, Archibeque IL, Nguyen YH, Wang P, Sinclair AM, Powers DA.2015. 《生物分子篩選期刊（J Biomol Screen.）》20:519-27）。在此分析中，將螢光素酶標記之HCT116細胞與來自兩個不同的健康人類供體之經純化人類T細胞組合且滴定靶向存活素之TriTAC蛋白。T細胞供體係健康的匿名個體且稱為供體02（D02）及供體35（D35）。滴定係基於前述段落中所描述之定量。若靶向存活素之TriTAC蛋白引導T細胞殺傷HCT116細胞，則藉由在開始實驗之後96小時執行螢光素酶分析測定之HCT116細胞之生存力應降低。由於TriTAC分子含有抗白蛋白域，因此在存在15 mg/mL人類血清白蛋白（HSA）之情況下平行進行另一分析，以評估靶向存活素之TriTAC與HSA結合時之活性。將來自TDCC分析之生存力結果相對於所添加之TriTAC濃度繪製於圖 2 中。（在圖式中，所繪製的為平均生存力數據±平均值之標準誤差，n=2）。細胞殺傷之EC₅₀ 值列於表 2 中。圖式展示在所測試之TriTAC之最高濃度下，在1a5EP-wt或1a5EP-Y29Ga序列下及在不存在或存在HSA下，在分析結束時，C:T:A組態具有最少的保持存活之HCT116細胞。另外，C:T:A組態在不存在或存在HSA下具有最強力的殺傷（表 2 ）。在HSA存在下，A:C:T組態具有第二最高量之HCT116細胞殺傷及第二最高效力。T:A:C組態靶向GFP之陰性對照TriTAC未引導殺傷HCT116細胞，除了在HSA存在下測試之最高濃度下的輕微活性以外。表 2 靶向存活素之TriTAC在HCT116細胞中之活性.

		TDCC EC₅₀ （ pM ）
sTCR	TriTAC 組態	D02	具有 HSA 之 D02	D35	具有 HSA 之 D35
1a5EP-wt	T:A:C	48	168	21	116
T:C:A	115	308	28	262
A:T:C	167	330	29	271
C:T:A	31	121	10	115
A:C:T	145	294	23	191
C:A:T	61	682	20	175
1a5EP-Y29Ga	T:A:C	190	487	69	316
T:C:A	490	1006	101	852
A:T:C	1048	1094	84	768
C:T:A	113	424	28	349
A:C:T	410	773	50	625
C:A:T	221	1638	58	661

實例 2

為證實HCT116細胞之結果可擴展至額外的細胞株，用T2細胞及PC3細胞在TDCC分析中測試存在於條件培養基中之靶向存活素之TriTAC（SEQ ID NO 18到29）。由於T2細胞並不內源性地在MHC上呈現存活素肽，因此存活素肽包含於T2細胞及T細胞之共培養物中。PC3細胞經工程改造以表現HLAα2/β2M（縮寫為PC3-α2/β2M）。否則，與HCT116分析（實例1）相同地進行分析，不同之處在於在48小時時量測T2或PC3-α2/β2M細胞之生存力，且僅用來自供體35之T細胞測試PC3-α2/β2M。T2細胞生存力相對於添加的TriTAC濃度繪製於圖 3 中，且細胞殺傷之EC50值列於表 3 中。PC3-α2/β2M細胞生存力相對於添加的TriTAC濃度繪製於圖 4 中，且細胞殺傷之EC50值列於表 4 中。T2及PC3-α2/β2M細胞之結果與HCT116細胞之結果在兩個方面有所不同。首先，不同於HCT116細胞，所有的T2及PC3-α2/β2M細胞在殺傷分析中被殺傷。第二，與HCT116細胞相比，T2及PC3-α2/β2M細胞存在更強力的殺傷，如藉由在T2細胞之情況下具有更低的EC50值而顯而易見（比較表 2 、3 及4 中之結果）。如用HCT116細胞所觀測到，在來自兩個供體之T細胞情況下且在不存在或存在白蛋白下，C:T:A及A:C:T組態中之TriTAC通常具有比其他組態更強力的定向細胞殺傷活性。表 3 靶向存活素之TriTAC在T2細胞與存活素肽下的活性.

		TDCC EC₅₀ （pM）
sTCR	TriTAC組態	D02	具有HSA之D02	D35	具有HSA之D35
1a5EP-wt	T:A:C	1	1.5	0.2	0.7
T:C:A	0.4	2.2	0.1	1.1
A:T:C	1	2.7	0.3	1.4
C:T:A	0.2	1	0.03	0.5
A:C:T	0.7	2	0.8	1.3
C:A:T	1.6	7.3	0.4	1.8
1a5EP-Y29Ga	T:A:C	57	93	20	41
T:C:A	55	193	20	107
A:T:C	104	219	40	113
C:T:A	10	43	5.1	24
A:C:T	49	91	19	53
C:A:T	59	273	22	120

表 4 靶向存活素的TriTAC在PC3-α2/β2M下之活性.

sTCR	TriTAC組態	TDCC EC₅₀ （pM）
D35	具有HSA之D35
1a5EP-wt	T:A:C	3.5	6.8
T:C:A	4.1	22
A:T:C	5.4	24
C:T:A	2.6	7.9
A:C:T	15	19
C:A:T	5.1	30
1a5EP-Y29Ga	T:A:C	19	41
T:C:A	22	60
A:T:C	14	90
C:T:A	4.3	26
A:C:T	12	46
C:A:T	14	64

實例 3

為了評估TriTAC之組態是否影響與人類血清白蛋白（HSA）之結合，使用Octet儀器進行量測。儀器尖頭含有抗生蛋白鏈菌素，且首先將其裝載有生物素標記之白蛋白。隨後，將尖頭與含有50 nM各靶向存活素之TriTAC的條件培養基一起培育。由於K_D 量測係使用單一50 nM濃度之TriTAC蛋白進行，因此結果提供了分級排序效能，但並不提供確定的K_D 值。此等所量測之相對親和力列於表 5 中。所有序列均與HSA結合，且K_D 值在1.5 nM至12.5 nM範圍內，其中K_D 值在N端上之白蛋白結合域之組態（A:T:C及A:C:T）中最小。表 5 藉由靶向存活素之TriTAC之HSA結合

sTCR	組態	K_on （1/Ms）	K_off （1/s）	K_D （nM）
1a5EP-wt	T:A:C	2.93E+05	1.32E-03	4.5
T:C:A	2.07E+05	2.07E-03	10.0
A:T:C	4.47E+05	7.38E-04	1.6
C:T:A	2.46E+05	1.81E-03	7.3
A:C:T	4.58E+05	7.03E-04	1.5
C:A:T	2.22E+05	2.13E-03	9.6
1a5EP-Y29Ga	T:A:C	2.73E+05	1.35E-03	5.0
T:C:A	2.35E+05	2.14E-03	9.1
A:T:C	4.28E+05	7.59E-04	1.8
C:T:A	2.57E+05	1.94E-03	7.5
A:C:T	4.57E+05	7.83E-04	1.7
C:A:T	2.40E+05	2.11E-03	8.8
T:A:C	2.85E+05	3.45E-03	12.1

實例 4

為了測試連接子選擇對靶向存活素之TriAC之活性的影響，測試不同的連接子。以C:T:A及A:C:T組態中之TriAC開始且含有1a5EP-wt序列，將不同的連接子序列插入結合域之間。此等連接子序列為GGGGS（G4S）（SEQ ID NO.4）及GGGGSGGGS（G4SG3S）（SEQ ID NO.2）。對於兩種組態，測試不同的連接子組合。對於C:T:A組態，將SEQ ID NO: 21（aCD3::1a5EP-wt::aALB）與SEQ ID NO: 32（aCD3:1a5EP-wt::aALB-2）進行比較。對於A:C:T組態，將SEQ ID NO: 22（aALB::aCD3::1a5EP-wt）與SEQ ID NO: 33（aALB::aCD3:1a5EP-wt-3）進行比較。在使用兩個不同的T細胞供體之如實例2中所描述進行之TDCC分析中用PC3-α2/β2M細胞，測試此等分子。亦在使用來自一個供體之T細胞如實例1中所描述進行之TDCC分析中，用HCT116細胞測試此等分子。如表 6 中所示，改變連接子之長度對TriTAC分子之活性（諸如引導T細胞之能力）具有極小影響或無影響。表 6 對具有不同連接子之TriTAC進行之TDCC分析

		PC3-α2/β2M	HCT116
EC₅₀ （pM）	HSA移位	EC₅₀ （pM）	HSA移位
BSA	HSA	BSA	HSA
aCD3::G4SG3S ::1a5EP-wt::G4SG3S ::aALB（C:T:A）	供體47	0.2	9.5	39	4.2	431	104
供體81	0.5	35	67	16	約3400	約216
aCD3::G4S ::1a5EP-wt::G4SG3S ::aALB（C:T:A）	供體47	0.3	9.4	34	6.4	400	62
供體81	0.6	36	60	16	約3400	約216
aALB::G4SG3S ::aCD3::G4SG3S ::1a5EP-wt（A:C:T）	供體47	0.7	18	36	19	957	50
供體81	1.7	58	35	19	約10000	約526
aALB::G4SG3S ::aCD3::G4S ::1a5EP-wt（A:C:T）	供體47	0.7	21	31	20	846	42
供體81	1.4	66	47	25	約10000	約400

實例 5

選擇四個靶向存活素之TriTAC（SEQ ID NOS 21、22、32及33）用於大規模表現及蛋白質純化。將質體DNA轉染至Expi293或CHO-EBNA細胞（生命技術公司）中，並使用蛋白A親和層析及混合模式離子交換層析進行純化。舉例而言，且不受任何特定方法的束縛，在室溫下，使用聚乙烯亞胺Max（PEI Max，Polysciences Inc），將每公升細胞培養物1 mg DNA以6:1之PEI:DNA比率轉染至密度為5×10⁶ 個細胞/毫升的CHO-EBNA細胞中。CHO-EBNA細胞在5% CO₂ 、37℃下在帶擋板搖瓶（140 RPM）中的化學成分明確的培養基中懸浮培養。轉染後1、4、6及8天添加化學成分明確的進料。轉染後第14天，經轉染的細胞培養物藉由離心清除，隨後經由0.2 µm PES過濾器（Millipore）過濾。將無細胞的收集物加載至用20 mM乙酸鹽、22 mM Tris，pH 7.2平衡的MabSelect™管柱（Cytiva）上。管柱用20 mM乙酸鈉、22 mM Tris、500 mM氯化鈉，pH 7.2洗滌，且結合的蛋白用50 mM乙酸，pH 3.0溶離。蛋白A溶離液之pH使用0.5 M磷酸降低至3.5，並在室溫下在此pH下保持30至60分鐘。接著使用1.0 M Tris將pH升高至6.5。中和的蛋白質藉由用20 mM乙酸鹽、22 mM Tris，pH 6.5平衡且運作的Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow（high sub）管柱（Cytiva）進一步純化。將含有蛋白質之溶離份合併，並藉由280 nm下之吸光度量測濃度，且樣品藉由毛細管電泳（CE）-SDS及質譜分析。將最終材料以等分試樣的形式儲存在-80℃下。經純化蛋白質之代表性SDS-PAGE提供在圖 5 中，且表明了蛋白質之純度。蛋白質亦藉由尺寸排阻層析法（SEC）分析，以評估其在非變性條件下的純度。對SEC數據（表7）的分析表明，藉由本文所述方法純化的蛋白質具有94.4%至97.3%的單體SURIVIN-TriTAC蛋白。另外，為了減輕脫醯胺作用及可能的異構化，藉由在aALB::aCD3::1a5EP-wt（SEQ ID NO: 22）之sTCR的V_β 可變鏈的C端處插入Ala來製備aALB::aCD3::1a5EP-wt-1（SEQ ID NO: 30）；且藉由用Asp置換aALB::aCD3::1a5EP-wt（SEQ ID NO: 22）之C端處的Asn來製備aALB::aCD3::1a5EP-wt-2（SEQ ID NO: 31）。表 7 藉由尺寸排阻層析純化之靶向存活素之TriAC的純度

靶向存活素之TriTAC	高分子量（二聚體）%	主峰（單體）%	低分子量%
aCD3::1a5EP-wt::aALB（C:T:A）	4.3	94.4	1.3
aALB::aCD3::1a5EP-wt（A:C:T）	3.1	95.9	0.9
aALB::aCD3::1a5EP-wt-3（A:C:T）	2.7	97.3	0
aCD3:1a5EP-wt::aALB-2（C:T:A）	5.5	93.4	1.1

量測靶向存活素之TriAC對活體外結合至CD3ε及HSA蛋白的親和力。使用具有裝載有生物素標記之CD3ε或生物素標記之白蛋白蛋白質之抗生蛋白鏈菌素尖頭的Octet儀器，藉由在含有9 nM、27 nM或81 nM純化之TriTAC蛋白質溶液之溶液中培育此等尖頭得到親和力量測值。對於CD3ε結合量測，TriTAC溶液亦含有15 mg/mL HSA。此等親和力量測之結果列於表 8 中。TriTAC與CD3ε具有類似的親和力，K_D 值在2.7 nM至4.6 nM範圍內。A:C:T組態中之TriTAC之K_D 值小於C:T:A組態中之值（2.5 nM至2.7 nM相對於13 nM至15 nM）。表 8 經純化之靶向存活素之TriTAC與人類CD3ε及HSA蛋白之結合親和力

靶向存活素之TriTAC	K_D 人類CD3ε（nM）	K_D HSA（nM）
aCD3::1a5EP-wt::aALB（C:T:A）	3.7	13
aALB::aCD3::1a5EP-wt（A:C:T）	2.7	2.6
aALB::aCD3::1a5EP-wt-3（A:C:T）	2.5	2.6
aCD3:1a5EP-wt::aALB-2（C:T:A）	4.6	15

除採用來自匿名供體47之T細胞以外，在TDCC分析中用PC3-α2/β2M、T2及HCT116細胞如實例1及2中所描述地測試靶向存活素之TriTAC，並且用牛血清白蛋白（BSA）相對於HSA運作分析，而非在存在或不存在HSA下運作分析。靶向存活素之TriTAC中之抗白蛋白域並不可量測地結合至BSA（資料未示出）。此等TDCC分析之結果繪製於圖 6 中且定向T細胞殺傷之EC50值列於表 9 中。所有三種細胞株均觀測到T細胞定向殺傷。HSA降低殺傷效力，且相對於PC3-α2/β2M及T2細胞，HCT116細胞之殺傷效力較低。表 9 在PC-α2/β2M、T2及HCT116細胞下經純化之靶向存活素的TriTAC之TDCC活性

靶向存活素之TriTAC	EC₅₀ （pM） PC3-α2/β2M	EC₅₀ （pM） T2	EC₅₀ （pM） HCT116
BSA	HSA	BSA	HSA	BSA	HSA
aCD3::1a5EP-wt::aALB（C:T:A）	0.2	9.5	0.1	5.9	4.2	431
aALB::aCD3::1a5EP-wt（A:C:T）	0.7	18	0.3	10	19	957
aALB::aCD3::1a5EP-wt-3（A:C:T）	0.7	21	0.3	7.8	20	846
aCD3:1a5EP-wt::aALB-2（C:T:A）	0.3	9.4	0.2	5.8	6.4	400

如所展示，C:T:A構築體及A:C:T構築體均展現類似的活體外活性，且兩種構築體在C端含有His標籤。未選擇C:T:A構築體進行進一步開發，因為據推測，由於白蛋白結合域之C端可能具有免疫原性，His標籤之去除可能會對該構築體之功效產生負面影響。但是，此特徵與A:C:T構築體不一樣，因為可以自構築體上除去His標籤而沒有負面影響，亦即，在此類構築體中不暴露白蛋白結合域之C端。因此，選擇A:C:T構築體以用於進一步研發。

實例 6

靶向存活素之TriTAC使用各種急性骨髓性白血病（AML）細胞株在功能分析中進行測試。簡言之，細胞株OCI-AML2（ACC-99）、OCI-AML3（ACC-582）及OCI-Ly19（ACC-528）係購自Leibniz-Institute DSMZ（德國微生物菌種保藏中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH）），且在補充有20% FBS之α-MEM中培養，且在37℃及5% CO₂ 下培育，用作目標細胞。在與T細胞（例如，效應T細胞）共培養之前，目標細胞用CellVue™勃艮第酒紅（英傑）染色。使目標細胞沈澱且用PBS洗滌一次。按照製造商說明書將細胞再懸浮於稀釋液C中，且與最終濃度為2 µM的勃艮第酒紅CellVue™染料在室溫下於黑暗中一起培育5分鐘。藉由添加等體積之FBS（Sigma）終止反應。用細胞株專用完全培養基將樣本洗滌3次。對細胞進行計數且藉由FACS檢查標記之效率，隨後接種至功能分析中。使用APC-Cy7通道偵測CellVue™勃艮第酒紅訊號。

如下製備用於功能分析之效應T細胞。藉由使用T細胞分離套組（Miltenyi）在LS管柱（Miltenyi）上進行負向選擇，自供體PBMC儲備液中分離效應T細胞。MACS™緩衝液（補充有0.1% BSA及2 mM EDTA之PBS）用於分離CD3⁺ T細胞。經分離之CD3⁺ T細胞在補充有5% AB血清之AIM V™培養基中培養，且在37℃及5% CO₂ 下培育隔夜。第二天，對細胞進行計數且用CellTrace™紫蘿蘭色（英傑）標記。使效應細胞沈澱且用PBS洗滌一次。將效應細胞等分成每50 mL管的10 mL PBS中10⁷ 個。CellTrace™儲備溶液在即將使用之前藉由將20 µL體積之DMSO（組分B）添加至一個小瓶之CellTrace™試劑（組分A）中且充分混合來製備。將十微升CellTrace™試劑添加至每個含有效應細胞的50 mL管中。將效應細胞在37℃及5% CO₂ 下染色20分鐘，且偶爾振盪以確保高效染色。為了終止反應，將補充有10% FBS之40 mL的AIM V™添加至每個50 mL試管中。在室溫下於黑暗中反應封閉進行了5分鐘；使細胞沈澱且用補充有5% AB血清之AIM V™培養基再懸浮。對細胞進行計數且藉由FACS檢查標記之效率，隨後接種至功能分析。使用Pacific Blue通道偵測CellTrace™紫蘿蘭色訊號。

靶向存活素之TriTAC的功能分析包括重定向之T細胞細胞毒性及活化分析。將經CellVue™勃艮第酒紅標記之目標細胞以每孔20,000個細胞以每孔50 µl體積接種至圓底96孔盤（BD）中。將CellTrace™紫羅蘭色標記之效應T細胞以每孔200,000個細胞以50 µl體積添加至適當的孔中（一式兩份），使效應T細胞/目標細胞比率（E:T）大約為10:1。將連續稀釋之TriTAC以50 µl體積添加至適當的孔中，且在9個孔中以3倍稀釋度調定（一式兩份）。將混合培養物在37℃及5% CO₂ 下放置48小時。發現目標細胞毒性及T細胞活化參數在48小時為最佳。在採集時，收集培養上清液用於細胞介素釋放分析，同時使細胞沈澱且用FACS抗體染色以偵測目標細胞毒性、T細胞活化及T細胞增殖。簡言之，將含有樣本之96孔盤放置在托盤上，且用FACS緩衝液（補充有0.5% BSA及2 mM EDTA之PBS）洗滌兩次。將針對T細胞活化標記物CD25-PE（百進生技（Biolegend））、CD69-APC（百進生技）及CD3-PE-Cy7（百進生技）之抗體在7.5 µl/ml FACS緩衝液中混合，且每孔添加25 µl。將樣本於黑暗中在4℃下培育25分鐘。樣本用FACS緩衝液洗滌兩次。將活度染料Annexin-FITC（百進生技）及7AAD（百進生技）在Annexin V結合緩衝液（百進生技）中分別以7.5 µl/ml及15 µl/ml混合，且在室溫下於黑暗中以25 µl/孔添加至孔中後持續15分鐘。在培育結束時，將75 µl Annexin V結合緩衝液添加至每個孔中。在FACSCanto II™上獲取資料，且使用FlowJo™ V10分析軟體進行分析。使用非線性回歸將目標細胞毒性、T細胞活化及T細胞增殖之劑量反應資料擬合為S形曲線，且藉助於GraphPad 5.0軟體計算EC₅₀ 值。

如圖 7 所示，A:C:T構築體aALB::aCD3::1a5EP-wt-1（SEQ ID NO: 30）能夠在4個健康CD3⁺ T細胞供體中誘導CD3⁺ T細胞針對HLA-A2、存活素陽性AML細胞株OCI-AML2及OCI-AML3進行有效的重定向殺傷，而陰性對照（無關的TriTAC）未觀察到活性。但是，在HLA-A2陰性、存活素陽性AML細胞株OCI-Ly19中未觀察到此類細胞死亡，歸因於此細胞株缺乏HLA-A2表現。（參見圖 7 ，頂部的一行。）

同樣，aALB::aCD3::1a5EP-wt-1在4個健康的CD3⁺ T細胞供體中誘導CD3⁺ T細胞針對HLA-A2、存活素陽性AML細胞株OCI-AML2及OCI-AML3的有效活化（在無關TriTAC的情況下未觀察到活性），但是僅觀察到針對HLA-A2陰性、存活素陽性AML細胞株OCI-Ly19的最低程度的活化，如藉由CD69表現所量測。（參見圖 7 ，底部的一行。）

實例 7

在有或沒有供體來源的（RV228）CD3⁺ T細胞之情況下用848-1處理後，對PC3M A2/B2M的腫瘤生長抑制。簡而言之，前列腺癌細胞株PC3M被轉導以表現HLA-A2及B2M基因。藉由工程化PC3M來表現HLA-A2，有可能變得容易被aALB::aCD3::1a5EP-wt-1靶向。細胞藉由組織培養生長，接著將其轉移至免疫缺乏的C.B-17 SCID小鼠。將腫瘤細胞及T細胞以1:1的比率共注射至0.1mL Matrigel懸浮液中，從而確保腫瘤細胞及T細胞保持緊密的距離，並且不會自注射部位（右後側腹）擴散至整個動物中。如圖 8 所示，在CD3⁺ T細胞存在下施用靶向存活素之TriTAC抑制了小鼠中的腫瘤生長。

本申請案中所引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他文獻均出於所有目的特此以全文引用之方式併入，引用之程度就如同個別地指示將各個別公開案、專利、專利申請案及其他文獻出於所有目的以引用之方式併入一樣。

雖然已說明及描述各種特定實施例，但應瞭解，可在不偏離本發明之精神及範疇的情況下做出各種改變。

無

圖 1A-1F 展示本發明之三特異性結合蛋白之圖示。

圖 2A-2H 展示在靶向存活素的TriTAC的情況下來自兩個不同供體之T細胞對HCT116細胞的直接殺傷。

圖 3A-3H 展示在靶向存活素的TriTAC的情況下來自兩個不同供體之T細胞對T2細胞的直接殺傷。

圖 4A-4D 展示在靶向存活素的TriTAC的情況下T細胞對PC3-α2/β2M細胞的直接殺傷。

圖 5 展示經純化之靶向存活素的TriTAC蛋白之SDS-PAGE。分子量標準之大小藉由凝膠右側之線條及數值指示。

圖 6 展示在PC3-α2/β2M、T2及HCT116細胞之情況下經純化之靶向存活素的TriTAC蛋白的TDCC活性。

圖 7 頂部一行顯示CD3 T細胞對HLA-A2、存活素陽性AML細胞株（OCI-AML2及OCI-AML3）而非對HLA-A2陰性、存活素陽性AML細胞株OCI-Ly19的定向殺傷。底部一行顯示CD3⁺ T細胞對HLA-A2、存活素陽性AML細胞株（OCI-AML2及OCI-AML3）而非對HLA-A2陰性、存活素陽性AML細胞株OCI-Ly19之活化。

圖 8 顯示aALB::aCD3::1a5EP-wt及aALB::aCD3::1a5EP-wt-1在T細胞存在下誘導的腫瘤生長控制。圖中之每一點表示10個腫瘤之平均值。誤差條描述了平均值之標準誤差。

Claims

一種三特異性分子，其結合至人類存活素、CD3及白蛋白，其中該三特異性分子包括： a）包括sTCR之一第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 37（CDR1）、SEQ ID NO: 38（CDR2）及SEQ ID NO: 39（CDR3）之V_β ，及 ii. 包括SEQ ID NO: 34（CDR1）、SEQ ID NO: 35（CDR2）及SEQ ID NO: 36（CDR3）之V_α ，其中該sTCR之該V_β 及該V_α 區經由一第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 之一第二域（A），該V_HH 包括SEQ ID NO: 46（CDR1）、SEQ ID NO: 47（CDR2）及SEQ ID NO: 48（CDR3）；以及 c）包括scFv之一第三域（C），該scFv包括： i. 包括SEQ ID NO: 40（CDR1）、SEQ ID NO: 41（CDR2）及SEQ ID NO: 42（CDR3）之V_H ，及 ii. 包括SEQ ID NO: 43（CDR1）、SEQ ID NO: 44（CDR2）及SEQ ID NO: 45（CDR3）之V_L ，其中V_H 及V_L 經由一第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之該等域經由一第三連接子（L3）及一第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之該三特異性分子。
一種三特異性分子，其結合至人類存活素、CD3及白蛋白，其中該三特異性分子包括： a）包括sTCR之一第一域（T），該sTCR包括： i. 包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的V_β ，及 ii. 包括SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的V_α ，其中該sTCR之該V_β 及該V_α 區經由一第一肽連接子（L1）連接； b）包括V_HH 之一第二域（A），該V_HH 包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括scFv之一第三域（C），該scFv包括： i. 包括SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的V_H ，及 ii. 包括SEQ ID NO: 11之胺基酸序列的V_L ，其中V_H 及V_L 經由一第二肽連接子（L2）連接，其中T、A及C之該等域經由一第三連接子（L3）及一第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-V_HH -L3-V_H -L2-V_L -L4-V_β -L1-V_α -COOH次序之三特異性分子。
如請求項1或2之三特異性分子，其中該L1包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。
如請求項1或2之三特異性分子，其中該L2包括SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
如請求項1或2之三特異性分子，其中該L3包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
如請求項1或2之三特異性分子，其中該L4包括SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
一種三特異性分子，其結合至人類存活素、CD3及白蛋白，其中該三特異性分子包括： a）包括sTCR之一第一域（T），該sTCR包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列； b）包括V_HH 域之一第二域（A），該V_HH 域包括SEQ ID NO: 12之胺基酸序列；以及 c）包括scFv之一第三域（C），該scFv包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中T、A及C之該等域經由一第三連接子（L3）及一第四連接子（L4）連接以形成呈H₂ N-(A)-L3-(C)-L4-(T)-COOH次序之三特異性分子。
如請求項7之三特異性分子，其中該L3包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
如請求項7之三特異性分子，其中該L4包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
一種三特異性分子，其結合至人類存活素、CD3及白蛋白，其中該三特異性分子包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。