JP2024517832A - 肺癌の予防または治療用薬学組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したタンパク質およびその用途に関する。本発明のタンパク質は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合することにより、免疫チェックポイント抑制剤として使用できる。【選択図】図５

Description

本発明は、肺癌の予防または治療用薬学組成物に関する。
現代の医学技術の発展により、治療不可能な病気はほとんどなくなったが、癌は他の病気とは異なり、非常に複雑で難しい治療が求められている。現在、癌の治療に使用されている方法には、大きく分けて手術、放射線治療および化学的治療がある。癌が他の部位に転移せずに局所で増殖する場合では除去手術により癌の治療が可能である。しかし、癌患者の７０％以上において癌転移が発生するため、補助的な治療方法を並行しなければならない。
前記補助的な治療方法の一つとして、高エネルギー放射線を用いて癌細胞を殺す放射線治療法が行われている。前記放射線治療法は、癌細胞への放射線照射によって癌細胞の増殖を抑制し、新たな癌細胞の生成、癌細胞のさらなる分裂を防ぐ。しかし、この方法は、癌細胞だけでなく正常細胞にも影響を与えるという副作用が存在する問題がある。
化学的治療法は、手術後に薬物を使用して癌細胞を殺す補助治療法であり、目に見えない癌細胞を殺す目的で行われる。しかし、前記化学的治療法は嘔吐、下痢、脱毛などの副作用が伴う問題がある。
これらの副作用を最小限に抑えるために、最近では免疫治療法が注目されている。免疫治療法は、患者の免疫応答を利用して癌を治療する方法であり、癌の予防も図ることができる。癌免疫治療とは、ワクチンの原理のように、腫瘍形成の原因となる抗原を投与して癌に特異的な免疫細胞を活性化させた後、活性化した免疫細胞に体内で癌を特異的に攻撃させる治療法である。また、癌にかかっていないとしても、癌に特異的な抗原を体内に投与することにより、不活性化の免疫細胞を癌特異的な記憶免疫細胞に活性化し、癌が発症したときに癌細胞を特異的に攻撃させる。
癌免疫治療のためには、免疫細胞が密集しているリンパ節に癌特異的抗原（腫瘍関連抗原（Tumor－associated antigen；TAA）、腫瘍特異抗原（Tumor－specific antigen；TSA））を運ぶことが重要である。特に、腫瘍特異抗原の中でも、肺癌、腎臓癌などの様々な腫瘍種で発見され、主に肺癌および黒色腫で発見される新生抗原（neo－antigen）は、癌患者個人の潜在的遺伝子の活性またはＤＮＡ部分の変異によって新たに生成される抗原である。この抗原は、患者個人の遺伝情報に基づいて「カスタマイズ型癌ワクチン」を製造する上で非常に重要である。
しかし、癌特異的抗原自体のみをリンパ節に運ぶようとする従来の試みはあまり効果的ではなかった。腫瘍抗原自体だけでは腫瘍抗原の長さがやや短く、腫瘍抗原特異免疫細胞を増幅及び活性化するための腫瘍抗原提示効率が顕著に低く、腫瘍抗原特異免疫誘導効率も顕著に低かったためである（非特許文献１）。このような癌特異的抗原の体内送達体としては高分子が多用されている。癌特異的抗原の体内運搬のために高分子の表面に癌抗原を固定させる場合、粒子表面に癌特異的抗原を化学的結合によって露出しなければならない。しかし、粒子表面に癌特異的抗原を高密度で均一に露出させるには限界があるのが実情である。
癌免疫治療は従来の抗癌治療方法と比較して、患者の免疫システムを利用するため副作用が少なく、免疫記憶形成によって治療効果が長期間持続でき、腫瘍抗原特異的認識の原理によって一般細胞には影響力が少なくて副作用がほとんどない利点がある。また、最近では再発性または抗癌剤抵抗性を有する癌患者を対象とする臨床の成功事例により、癌免疫治療はサイエンス（Science）誌によってブレークスルー・オブ・ザ・イヤー（Breakthrough of the year）２０１３に選定されるほどの爆発的な注目を浴びている。
また、免疫チェックポイント因子であるＰＤ－１（Programmed cell death protein 1）／ＰＤ－Ｌ１（PD1 ligand）中和抗体治療剤の場合は、黒色腫および肺癌で反応率２０－３０％以上の臨床結果が導き出されており、癌免疫治療は、今後数年以内に癌の標準治療として臨床現場で使用される可能性が高い。しかし、免疫チェックポイント因子であるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ４特異的な免疫活性抑制遮断抗体は、免疫細胞の活性自体を根本的に増強できず、抗体の長い体内残留時間および抗体のＦｃドメイン部分のために発生する自己免疫疾患などの副作用が生じ、動物細胞系の抗体製造および精製による生産コストの増加に加えて、高い消耗量により抗体治療コストが高くなり、経済面での欠点も存在するのが実情である。
本発明は、免疫チェックポイント分子に結合できるタンパク質を含む肺癌の予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
本発明は、前記の組成物を使用する肺癌の治療方法を提供することを目的とする。
本発明は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質を含む肺癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
前記フェリチンタンパク質は、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してなる球状のタンパク質であってもよい。
前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のαヘリックスの少なくとも１つの内部、または隣接するαヘリックスの間の少なくとも１つに融合することができる。
前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＡヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、Ｄヘリックス、またはＥヘリックスの内部に融合することができる。
前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合することができる。
前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合することができる。
前記フェリチンタンパク質は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異したものであってもよい。
前記フェリチンタンパク質は、配列番号１の配列において、１５番、１６番、２３番、８２番、８４番、１１７番、１２０番または１２４番のアミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されたものであってもよい。
前記フェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式１を満たすことができる。
（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、前記フェリチンタンパク質と前記トランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態における前記フェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態における前記トランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態における前記フェリチンタンパク質と前記トランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）
前記トランスフェリン受容体への結合力は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。
前記免疫チェックポイント分子は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２からなる群より選択されるいずれかであってもよい。
前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、前記免疫チェックポイント分子に対して結合力を有するリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片であってもよい。
本発明において、フェリチンはヒトフェリチン重鎖であってもよい。
前記フェリチンタンパク質は、大腸菌生産システムにおいて４０％以上が水溶性分画として存在してもよい。
本発明のタンパク質は、免疫チェックポイント分子への結合力に優れる。
本発明のタンパク質は、免疫チェックポイント分子がＴ細胞を不活性化させることを防ぐことにより、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
本発明のタンパク質は、様々な免疫チェックポイント分子に結合する分子を融合することができる。
本発明のタンパク質は、様々な免疫チェックポイント分子に結合可能である。
本発明の癌の予防または治療用薬学組成物は、抗癌効果に優れる。
図１は、野生型（wild type）（native）のヒトフェリチン重鎖（ｈｕＨＦ）およびミュータント（mutant）ヒトフェリチン重鎖タンパク質を製造する基本ベクターの模式図である。 図２は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌを製造するベクターの模式図およびそのフェリチンタンパク質の製造を確認できる図である。 図３は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１を製造するベクターの模式図およびそのフェリチンタンパク質の製造を確認できる図である。 図４は、フェリチンタンパク質のマウス肺癌細胞株ＬＬＣ１に対する標的能の評価結果である。 図５は、フェリチンタンパク質のヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対する標的能の評価結果である。 図６は、フェリチンタンパク質のマウス肺癌細胞株ＬＬＣ１に対する標的能の評価結果である。 図７は、フェリチンタンパク質のヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対する標的能の評価結果である。 図８は、ｈｕＨＦ_ｎａｔｉｖｅ－ｈ_ｓｍＰＤ１のヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。 図９は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１のヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。 図１０は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌのヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。 図１１は、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌのヒトトランスフェリン受容体に対する結合力の評価結果である。 図１２は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価結果である。 図１３は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価結果である。 図１４は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価結果である。 図１５は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞の癌細胞死滅能の評価結果である。 図１６は、ＬＬＣ１肺癌動物モデルの製造および腫瘍抑制実験の概要図である。 図１７は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理による腫瘍成長抑制の評価結果である。 図１８は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理による腫瘍成長抑制の評価結果である。 図１９は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌの肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティ（avidity）の評価結果である。 図２０は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌの肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティ（avidity）の評価結果である。 図２１は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌの肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティ（avidity）の評価結果である。 図２２は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌまたはこれと抗癌剤の併用時のＬＬＣ１肺癌動物モデルにおける腫瘍成長抑制の評価結果である。 図２３は、ヘリックスの内部に外来ペプチドが融合したフェリチンタンパク質を製造するベクターの模式図およびタンパク質の産生結果を示すものである。 図２４は、ヘリックスの内部に外来ペプチドが融合したフェリチンタンパク質を製造するベクターの模式図およびタンパク質の産生結果を示すものである。
本発明は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質を含む、肺癌の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
フェリチン（Ferritin）は、ヒト、動物および微生物に由来するフェリチンであってもよい。
ヒトフェリチンは、重鎖（heavy chain、21kDa）と軽鎖（light chain、19kDa）で構成され、前記フェリチンを成している単量体の自己集合能によって球状のナノ粒子を形成する特性を示す。フェリチンは、２４個の単量体が集まって球状の立体構造を有する自己集合体を形成することができる。
ヒトフェリチンの場合は、外径が約１２ｎｍ、内径が約８ｎｍである。フェリチン単量体の構造は、５つのαヘリックス構造、すなわちＡヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、ＤヘリックスおよびＥヘリックスが順次連結された形態であり、ループ（loop）と呼ばれる各々のαヘリックス構造のポリペプチドを連結する非定型ポリペプチド部分を含む。
ループは、フェリチンにペプチドまたは小さいタンパク質抗原などが挿入されても構造的に壊れない領域（region）である。ここにペプチドを、クローニングを用いて融合させることにより、フェリチンの単量体にエピトープなどのペプチドが位置するペプチド－フェリチン融合タンパク質単量体を製造することができる。ＡヘリックスとＢヘリックスを連結するループをＡＢループ、ＢヘリックスとＣヘリックスを連結するループをＢＣループ、ＣヘリックスとＤヘリックスを連結するループをＣＤループ、ＤヘリックスとＥヘリックスを連結するループをＤＥループとする。
フェリチンの情報はＮＣＢＩに公知になっている（GenBank Accession No．NM_000146、NM_002032など）。
フェリチンはフェリチン重鎖であってもよく、具体的にはヒトフェリチン重鎖であってもよい。ヒトフェリチン重鎖は、ヒトに由来する配列番号１のアミノ酸配列で示されるタンパク質であってもよい。本明細書で前記フェリチンは「ヒトフェリチン重鎖」または「ｈｕＨＦ」と混用して用いられる。
フェリチンタンパク質はフェリチン単量体であってもよい。そのため、フェリチン重鎖単量体であってもよく、ヒトフェリチン重鎖単量体であってもよい。
フェリチンは、その単量体のいくつかが自己集合して、組織的な構造またはパターンを形成する。本発明のフェリチンタンパク質はナノスケールの粒子である。例えば、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合し、フェリチンタンパク質を形成することができる。
フェリチンタンパク質は球状であってもよい。球状の場合、例えばその粒径は８～５０ｎｍであってもよい。より具体的には、８ｎｍ～５０ｎｍ、８ｎｍ～４５ｎｍ、８ｎｍ～４０ｎｍ、８ｎｍ～３５ｎｍ、８ｎｍ～３０ｎｍ、８ｎｍ～２５ｎｍ、８ｎｍ～２０ｎｍ、８ｎｍ～１５ｎｍであってもよい。
フェリチンタンパク質は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したものである。フェリチンタンパク質の外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合していればよく、フェリチンタンパク質をなす全てのフェリチン単量体に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合している必要はない。
例えば、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してフェリチンタンパク質を形成するとき、２４個のフェリチン単量体のうちの少なくとも１個のフェリチン単量体に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合していればよい。フェリチンタンパク質の外表面の免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の密度を高めるために、２４個のフェリチン単量体のすべてに免疫チェックポイント分子と結合可能な分子を融合することができる。
フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体には、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子を１種または２種以上融合することができる。フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体は、互いに異なる免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合していてもよい。フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体は、同じ免疫チェックポイント分子と結合可能な互いに異なる分子が融合していてもよい。
免疫チェックポイント分子（Immune checkpoint molecule）は、Ｔ細胞に結合してＴ細胞を不活性化させる役割を果たす。この免疫チェックポイント分子は、例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２などであってもよい。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、免疫チェックポイント分子に対して結合力を有するリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片であってもよい。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチンタンパク質の外表面に露出することができれば、フェリチン単量体のどこに融合してもよい。免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体の自己集合を阻害しない位置に融合する。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子がフェリチン単量体の内部に融合し、フェリチンタンパク質の構造が変化し得る。フェリチン単量体の各構成部分のうち内側に入り込んだ部分は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の融合によって外側に突出することができ、逆に、フェリチン単量体の各構成部分のうち外側に突出していた部分は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の融合によって内側に入り込むことができる。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチンタンパク質のヒトトランスフェリン受容体との結合力を減少させるか、またはヒトトランスフェリン受容体との結合力を阻害する位置に融合することが好ましい。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、その構造、分子量およびアミノ酸の長さを特定の範囲に限定しない。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、例えば、そのアミノ酸の長さが２５ａａ以下のリガンド、抗体、またはこれらの断片であってもよい。より具体的には、アミノ酸の長さが２５ａａ以下、２４ａａ以下、２３ａａ以下、２２ａａ以下、２１ａａ以下、２０ａａ以下、１９ａａ以下、１８ａａ以下、１７ａａ以下、１６ａａ以下、１５ａａ以下、１４ａａ以下、１３ａａ以下、１２ａａ以下、１１ａａ以下、１０ａａ以下、９ａａ以下、８ａａ以下、７ａａ以下、６ａａ以下、５ａａ以下であってもよい。また、例えば、そのアミノ酸の長さが３ａａ以上、４ａａ以上、５ａａ以上、６ａａ以上、７ａａ以上、８ａａ以上、９ａａ以上、１０ａａ以上であってもよい。
免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の融合位置は、特定の位置に限定されず、例えば、フェリチン単量体のαヘリックスの内部（Ａヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、Ｄヘリックス、またはＥヘリックス）、隣接するαヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、ＥヘリックスとＣ末端の間、ヘリックスの内部などに融合することができる。
また、本発明のタンパク質は、フェリチン単量体のαヘリックスの内部（Ａヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、Ｄヘリックス、またはＥヘリックス）、隣接するαヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、ＥヘリックスとＣ末端の間、ヘリックスの内部などに融合した外来ペプチドをさらに含むことができる。外来ペプチドは、薬理活性ペプチドであってもよい。
フェリチンタンパク質は免疫チェックポイント分子と結合するように設計されているので、トランスフェリン受容体に対しては良好に結合しないことが好ましい。例えば、フェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体に対して下記数学式１を満たす。
（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、フェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態におけるトランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態におけるフェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）
前記結合力は、例えば、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。
数学式１のＫの値は、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、３０ｎＭ以上、４０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、６０ｎＭ以上、７０ｎＭ以上、８０ｎＭ以上、９０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、１１０ｎＭ以上、１２０ｎＭ以上、１２５ｎＭ以上、１２５ｎＭ超え、１５０ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、２１０ｎＭ以上、２２０ｎＭ以上、２３０ｎＭ以上、２４０ｎＭ以上、２５０ｎＭ以上、２６０ｎＭ以上、２７０ｎＭ以上、２８０ｎＭ以上、２９０ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、３５０ｎＭ以上、４００ｎＭ以上、４５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、５５０ｎＭ以上、６００ｎＭ以上、７００ｎＭ以上、８００ｎＭ以上、９００ｎＭ以上、１０００ｎＭ以上である。数学式１のＫの値が大きいほど、トランスフェリン受容体への結合力が減少する。その上限は、例えば、１０００００ｎＭ、９００００ｎＭ、８００００ｎＭ、７００００ｎＭ、６００００ｎＭ、５００００ｎＭ、１００００ｎＭ、９０００ｎＭ、８０００ｎＭ、７０００ｎＭ、６０００ｎＭ、５０００ｎＭなどであるが、これらに限定されるものではない。
トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）は、本発明のフェリチンタンパク質（Ａ）とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態で測定される。平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度（［Ｐ］）、トランスフェリン受容体の濃度（［Ｔ］）、および本発明のタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度（［ＰＴ］）は、公知の様々な方法で測定できる。
フェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体への結合力を低くするために、トランスフェリン受容体との結合に関与する部位に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子を融合させることができる。例えば、本発明のフェリチンタンパク質のＢＣループおよびＡヘリックスの部分に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が位置するように前記分子を融合させることができる。
フェリチンタンパク質は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異したものであってもよい。例えば、配列番号１の配列において、１５番、１６番、２３番、８２番、８４番、１１７番、１２０番または１２４番のアミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されたものであってもよい。
フェリチンタンパク質は、当該タンパク質をコードする配列を発現する微生物内で製造されるものであってもよい。
微生物は、当該分野で公知の微生物を制限なく使用することができる。例えば、大腸菌であってもよく、具体的にはＢＬ２１（ＤＥ３）であってもよいが、これに限定されるものではない。
微生物系でタンパク質を製造する場合には、得られるタンパク質が細胞質に溶解した状態で存在する場合に分離／精製が容易である。多くの場合、製造されたタンパク質が封入体（inclusion body）などで凝集した状態で存在する。本発明のフェリチンタンパク質は、微生物生産システムにおいて細胞質に溶解した割合が高く示される。そのため、分離／精製および活用が容易である。
フェリチンタンパク質は、例えば、それを製造する大腸菌システムにおいて、全タンパク質における水溶性分画の割合が４０％以上の状態で製造できる。具体的には、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上であってもよい。その上限は、例えば１００％、９９％、９８％、９７％、９６％などであってもよい。
本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を非常に刺激せず、投与成分の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。本発明における「薬学的に許容可能な担体」としては、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１成分又は１成分以上を混合して使用することができる。必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して、組織または臓器に注入するのに適した注射剤の形で製剤化することができる。また、等張性滅菌溶液、または場合によって滅菌水や生理食塩水を添加して注射可能な溶液となり得る乾燥剤（特に凍結乾燥剤）に製剤化することもできる。さらに、標的器官に特異的に作用できるように、標的器官特異的な抗体または他のリガンドを前記担体と結合して使用することができる。
また、本発明の組成物は、充填剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤をさらに含むことができる。さらに、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界で公知の方法を使用して製剤化することができる。
一実施形態では、前記薬学組成物は注射製剤であってもよく、静脈内投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の用語「有効量」とは、目的とする治療すべき特定の疾患の発症または進行を遅らせるか、または完全に増進するのに必要な量を意味する。
本発明において、組成物は薬学的有効量で投与することができる。前記薬学組成物の適切な１日総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で治療医によって決定され得ることは当業者にとって自明なことである。
本発明の目的のために、特定の患者に対する具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類および程度、場合によっては他の製剤が使用されるかどうかを含む具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食物、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用または同時使用される薬物を含む様々な因子および医薬分野でよく知られている類似因子によって異なるように適用することが好ましい。
本発明において、前記薬学組成物は、必要に応じて薬物の製造、使用および販売を管轄する行政機関によって指定された方式での、容器に付帯する注意書きを添付してもよい。前記注意書きは、組成物の形またはヒトもしくは獣医的な投与に関する私益機関による認可を示し、例えば処方薬に関する米国食品医薬品局により認可された表示でもよい。
本発明の薬学組成物は、抗癌剤をさらに含んでもよく、抗癌剤と併用投与してもよい。
抗癌剤は、抗癌活性を有する全ての物質を制限なく使用することができ、公知の抗癌剤も使用可能である。
例えば、抗癌剤は化学抗癌剤、標的抗癌剤、または免疫抗癌剤であってもよい。
化学抗癌剤は、これらに限定されるものではないが、アルキル化剤（alkylating agent）、微小管阻害剤（microtuble inhibitor）、代謝拮抗剤（antimetbolite）、またはトポイソメラーゼ阻害剤（topoisomerase inhibitor）であってもよい。
前記アルキル化剤は、メクロレタミン（mechlorethamine)、シクロホスファミド（cyclophosphamide)、イホスファミド（ifosfamide)、メルファラン（melphalan)、クロラムブシル（chlorambucil)、チオテパ（thiotepa)、アルトレタミン（altretamine)、プロカルバジン（procarbazine)、ブスルファン（busulfan)、ストレプトゾシン（streptozocin）、カルムスチン（carmustine）、イオムスチン（iomustine）、ダカルバジン（dacarbazine）、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記微小管阻害剤は、ドセタキセル（docetaxel）、ビンブラスチン（vinblastine）、オンコビン（Oncovin）、ビノレルビン（vinorelbine）であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記代謝拮抗剤は、フルオロウラシル（fluorouracil）、カペシタビン（capecitabine）、シタラビン（cytarabine）、ゲムシタビン（gemcitabine）、フルダラビン（fludarabine）、メトトレキサート（methotrexate）、ペメトレキセド（Pemetrexed）、メルカプトプリン（mercaptopurine）であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記トポイソメラーゼ阻害剤は、ハイカムチン（hycamtin）、カンプトサール（camptosar）、ベプシド（vepesid）、タキソール（taxol）、ブレオマイシン（bleomycin）、アドリアマイシン（adriamycin）、セルビジン（cerubidine）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
標的抗癌剤は、これらに限定されるものではないが、トラスツズマブ（trastuzumab）、ペルツズマブ（pertuzumab）、パニツムマブ（panitumumab）、セツキシマブ（cetuximab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、ラムシルマブ（ramucirumab）、アフリベルセプト（aflibercept）、リツキシマブ（rituximab）、オビヌツズマブ（obinutuzumab）、ダラツムマブ（daratumumab）、デノスマブ（denosumab）、イブルチニブ（ibrutinib）、ダサチニブ（dasatinib）、ニロチニブ（nilotinib）、イマチニブ（imatinib）、ボスチニブ（bosutinib）、オシメルチニブ（osimertinib）、エルロチニブ（erlotinib）、ゲフィチニブ（gefitinib）、ニンテダニブ（nintedanib）、スニチニブ（sunitinib）、ソラフェニブ（sorafenib）、カボザンチニブ（cabozantinib）、レンバチニブ（lenvatinib）、レゴラフェニブ（regorafenib）、アキシチニブ（axitinib）、パゾパニブ（pazopanib）、カボザンチニブ（cabozantinib）、トラメチニブ（trametinib）、ダブラフェニブ （dabrafenib）、アベマシクリブ（abemaciclib）、パルボシクリブ（palbociclib）、レナリドミド（lenalidomide）、ルキソリチニブ（ruxolitinib）、アレクチニブ（alectinib）、クリゾチニブ（crizotinib）、オラパリブ（olaparib）またはベネトクラクス（venetoclax）であってもよい。
免疫抗癌剤は、これらに限定されるものではないが、免疫チェックポイント抑制剤、免疫細胞治療剤（ＣＡＲ－Ｔ）、ＡＤＣ（antibody drug conjugate）、二重抗体、抗癌ウイルス、または抗癌ワクチンであってもよい。
前記免疫チェックポイント抑制剤は、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＴＩＭ３抗体、またはＬＡＧ３抗体であってもよい。前記ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（pembrolizumab）、ニボルマブ（nivolumab）、セミプリマブ（cemiplimab）であってよく、前記ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（atezolizumab）、アベルマブ（avelumab）、デュルバルマブ（durvalumab）であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（ipilimumab）、トレメリムマブ（tremelimumab）であってもよく、前記ＴＩＭ３抗体は、ＭＢＧ４５２であってもよく、ＬＡＧ３抗体は、ＢＭＳ－９８６０１６、ＬＡＧ５２５であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記免疫細胞治療剤は、チサゲンレクロイセル（tisagenlecleucel）、アキシカブタゲン・シロルユーセル（axicabtagene ciloleucel）であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記ＡＤＣは、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（gemtuzumab－ozogamicin）、ブレンツキシマブ・ベドチン（brentuximab vedotin）、トラスツズマブ・エムタンシン（trastuzumab emtansine）、イノツズマブ・オゾガマイシン（inotuzumab ozogamicin）、エリブリンメシル酸塩（eribulin mesylate）であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記二重抗体は、ブリナツモマブ（blinatumomab）であってもよく、前記抗癌ウイルスは、タリモジン・ラヘルパレプベク（talimogene laherparepvec）であってもよく、前記抗癌ワクチンは、シプリューセル－Ｔ（sipuleucel－T）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
抗癌剤は肺癌に対する抗癌剤であってもよい。
本発明の薬学組成物は、個別の治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用投与することができ、従来の抗癌剤と同時に、別々に、または順次に投与することができる。そして、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。
前記「同時に（simulataneously）」という用語は、他に特定しない限り同時に発生するかまたは行われることを意味する。また、「別々に（separately）」という用語は、他に特定しない限り互いに離れて維持されることを意味する。さらに、「順次に（sequentially）」という用語は、他に特定しない限り規則的なシーケンスまたは順序によって特徴付けられることを意味し、順次投薬療法は、射干抽出物を含む組成物の投与前、同時、または後に抗癌剤を含む組成物の投与を含むことができるが、両方の組成物はいずれも規則的なシーケンスまたは順序で投与される。順次投与は、本発明に記載されている組成物の一時的に分離された投与を指す。
本発明は、以上のフェリチンタンパク質を使用する肺癌の治療方法を提供する。以上のフェリチンタンパク質に関する全ての説明は、本発明の癌の治療方法の有効成分としてのフェリチンタンパク質にそのまま適用される。
本発明の治療方法は、肺癌に罹患した対象に本発明のフェリチンタンパク質を投与するステップを含む。
肺癌に罹患した個体は、肺癌に罹患した動物、具体的には肺癌に罹患した哺乳類であってもよく、より具体的には肺癌に罹患したヒトであってもよい。
タンパク質は治療上有効量で投与することができる。
本発明で用語「投与」とは、いかなる適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味する。本発明の組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる限り、経口または非経口の様々な経路を介して投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、または直腸内投与することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法は、前記個体に抗癌剤を投与するステップをさらに含むことができる。
抗癌剤としては、抗癌活性を有する全ての物質に制限なく用いることができ、例えば前述の抗癌剤を用いることができる。
抗癌剤は、前記フェリチンタンパク質と同時に、別々に、または順次に投与することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
実施例
１．タンパク質製造用発現ベクターの構成
ｈｕＨＦは、２４個の単量体で構成されている球状のタンパク質ナノ粒子（１２ｎｍ）であり、各単量体は合計５個のαヘリックスで構成されている。本発明者らは、遺伝子クローニングにより、ｈｕＨＦ単量体のトランスフェリン受容体と結合するアミノ酸配列に突然変異を誘導し、表１のｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１（Ｑ１５Ａ、Ｄ１６Ａ、Ｒ２３Ａ、Ｆ８２Ａ、Ｑ８４Ａ）、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ２（Ｑ１５Ａ、Ｄ１６Ａ、Ｒ２３Ａ、Ｆ８２Ａ、Ｑ８４Ａ、Ｅ１１７Ａ、Ｋ１２０Ａ、Ｄ１２４Ａ）を確保した。ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１と２のαヘリックスの間のループ（ＰＤＢ ３ＡＪＯシーケンスを基準にｈｕＨＦ ５Ｔ～１７６Ｇ中のＢＣループ；９２Ｄ／９３Ｗ）とＣ末端の中から選択される位置に抗体ＣＤＲ３ペプチドおよびドメインを遺伝子クローニングにより挿入して送達体を確保した。
下記表２の配列を使用し、下記図１～３、表３のベクター模式図に従ってＰＣＲを行い、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ（ＢＣループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌ（ＢＣループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１（Ｃ末端）を製造した。製造された全てのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシーケンシングによって配列を確認した。
２．タンパク質の生合成
大腸菌株ＢＬ２１［（ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］ｏｍｐＴｇａｌ［ｄｃｍ］ΔｈｓｄＳ）］を前記で製造された発現ベクターでそれぞれ形質転換し、カナマイシン－抵抗性形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を、５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇのＬ－１カナマイシンを含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ三角フラスコ（Erleｎｍeyer flasks）、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。培地の濁度（Ｏ．Ｄ６００）が約０．５～０．７に達したとき、ＩＰＴＧ（Isopropyl－β－Dthiogalactopyranosid）（１．０ｍＭ）を注入して組換え遺伝子の発現を誘導した。
２０℃で１６～１８時間培養した後、培養した大腸菌を４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体沈殿物を回収し、５ｍｌの破砕溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕機（Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT、USA）を用いて破砕した。破砕後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液と不溶性凝集体を分離した。分離した上澄み液を後の実験で使用した。
３．タンパク質の精製
前記実施例２で得られた上澄み液を３段階の過程を経て精製した。まず、１）組換えタンパク質に融合したヒスチジンとニッケルの結合を用いたＮｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを行った後、２）組換えタンパク質を濃縮し、バッファー交換によって蛍光物質を付着し、３）最後に、蛍光物質が付着した自己集合タンパク質ナノ粒子のみを分離するために、スクロース勾配超遠心分離（ultracentifugation）を行った。各段階の詳細は以下の通りである。
１）Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー
組換えタンパク質を精製するために、前記と同様の方法で培養された大腸菌を回収し、その細胞ペレットを５ｍＬのライシスバッファー（ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕した細胞液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をＮｉ２＋－ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてそれぞれ分離した（洗浄バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭイミダゾール／溶出バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール）。
２）濃縮とバッファー交換及び蛍光物質付着過程
ＦＡＣＳのために、ｈｕＨＦ_Ｎａｔｉｖｅ、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ粒子は、Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを経て溶出された３ｍｌの組換えタンパク質を、超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter、Amicon Ultra 100K、Millipore、Billerica、MA）に入れて、カラムの上に１ｍｌの溶液が残るまで５，０００ｇで遠心分離を行った。その後、蛍光物質であるＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアン酸塩）を付着するために、タンパク質粒子を重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）バッファーでバッファー交換を行い、常温で１２時間蛍光物質を付着した。
３）スクロース勾配超高速遠心分離
ＰＢＳ（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）バッファーにスクロースを濃度別にそれぞれ添加し、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％のスクロースを含む溶液をそれぞれ準備した。その後、超高速遠心分離用チューブ（ultraclear 13.2ml tube、Beckman）に各濃度別（４０～２０％）のスクロース溶液を濃度の高い溶液から２ｍｌずつ入れた後、準備した自己集合用バッファーに存在する組換えタンパク質溶液を１ｍｌ充填した後、３５，０００ｒｐｍにおいて４℃で１６時間超高速遠心分離を行った（Ultracentrifuge L－90k、Beckman）。遠心分離後、慎重にパイペットを用いて上層（２０－２５％スクロース溶液部分）を、前記２）に記載されているように超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter）とＰＢＳバッファーを用いて組換えタンパク質のバッファーを交換した。
４．タンパク質の水溶性分画の確認
ｐＣＭ（Tac promoter）ベースの様々な発現ベクターでＢＬ２１コンピテントセル（competent cell）を形質転換（transformation）した。単一コロニーをカナマイシン１００ｍｇ／Ｌが添加されたＬＢ液体培地（５０ｍＬ）に接種し、振とう培養器（shaking incubator）で３７℃、１３０ｒｐｍの条件で培養した。濁度（turbidity／optical density at 600nm）が０．５に達すると、ＩＰＴＧの１ｍＭを投与して標的タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で１２～１６時間培養した後、培養液中の細胞を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）によってスピンダウン（spun－down）し、細胞ペレットを回収して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）バッファーに再浮遊させた。再浮遊された細胞は、ブランソンのソニファイアー（Branson Sonifier、Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT）を用いて破裂した。音波処理後、溶解性タンパク質を含む上澄み液と不溶性タンパク質を含む凝集体は、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）で分離した。分離された溶解性、不溶性タンパク質分画のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって溶解度を確認した。
５．タンパク質の集合の検証
実施例３で製造した各タンパク質の精製された組換えタンパク質ナノ粒子の構造を分析するために、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で組換えタンパク質を撮影した。まず、染色していない精製タンパク質のサンプルを、カーボンコートされた銅電子顕微鏡グリッド（grids）に載せて自然乾燥した。タンパク質の染色された画像を得るために、自然乾燥したサンプルを含む電子顕微鏡グリッドを２％（ｗ／ｖ）水性ウラニルアセテート溶液と共に１０分間室温でインキュベートし、蒸留水で３～４回洗浄した。タンパク質の画像をフィリップスＴｅｃｈｎａｉ １２０ｋＶ電子顕微鏡を用いて観察したところ、各々の粒子が球状のナノ粒子を形成することを確認した。
６．製造されたタンパク質の肺癌細胞標的能の検証
実施例３で製造した蛍光物質が付着したｈｕＨＦ_Ｎａｔｉｖｅ、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌタンパク質の肺癌細胞標的能効率を比較した。
実施例３で製造した蛍光物質が付着したｈｕＨＦ_Ｎａｔｉｖｅ、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌタンパク質のＬＬＣ１マウス肺癌およびＡ５４９ヒト肺癌に対する標的能効率を比較するために、ＬＬＣ１マウス肺癌およびＡ５４９ヒト肺癌細胞に蛍光強度が１４００の濃度でタンパク質を２時間反応させた後、蛍光シグナルを比較して肺癌細胞標的能効率を確認した（図４、５）。抗体に比べて顕著に高い標的能効率を示すことを確認した。
実施例３で製造したｈｕＨＦ_Ｎａｔｉｖｅ、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｈ_ｓｍＰＤ１、ｈｕＨＦ_Ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌタンパク質のＬＬＣ１マウス肺癌およびＡ５４９ヒト肺癌に対する標的能効率を比較するために、ＬＬＣ１マウス肺癌およびＡ５４９ヒト肺癌細胞に一定濃度区間でタンパク質を２時間反応させた後、タンパク質のＨｉｓ ｔａｇと結合する蛍光抗体を１時間反応させて蛍光シグナルを比較することで標的能効率を確認した（図５、６）。５０％細胞フラクション（cell fraction）濃度をＫｄと見なすことができるが、抗体と比較して５０倍以上の良好な標的能を示すことを確認した（表４）。
７．タンパク質のトランスフェリン受容体への結合力の測定
前記実施例で製造したタンパク質のＮａｔｉｖｅ型とＭｕｔａｎｔとのヒトトランスフェリン受容体に対する結合力を比較した。
まず、ヒトトランスフェリン受容体－Ｆｃタグスタンダードを高結合（high－binding）９６ウェルプレートに２μｇ／ｍｌで１００μｌずつ４℃において一晩（オーバーナイト）付着した。
そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｃｏｋＴＭ（ＰＢＳ）ブロッキングバッファー（thermo cat#37515）を１００μｌずつ１時間常温でブロッキングプロセスを行った。
そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。前記実施例で製造したタンパク質を濃度区間別に１００μｌずつ４℃で一晩（オーバーナイト）処理した。
そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。ｈｅｘａ－Ｈｉｓタグに特異的に結合する抗体（mouse anti His tag antibody、Hisprobe）を１／１０００でＰＢＳＴに希釈し、それを１００μｌずつ１時間常温で処理した。
そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。マウス抗体に特異的に結合する抗体（goat anti mouse igG antibody－HRP）を１／１０００でＰＢＳＴに希釈し、それを１００μｌずつ１時間常温で処理した。
そして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ０．０５％）２００μｌで３回洗浄した。ＨＲＰと反応して発色反応を示すＴＭＢ溶液を１００μｌずつ１５分間常温で処理した。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を５０μｌずつ処理した後、ＴＥＣＡＮで波長４５０ｎｍにおける光学密度（optical density）を測定した。それをＬａｎｇｍｕｉｒ ｅｑｕａｔｉｏｎを用いて計算した（表５、図８～図１０）。
図１１は、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌとｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌのｈＴｆＲへの結合力を評価・比較したものである。ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ２－ｄｕａｌの場合は、濃度を１００００ｎＭまで増加させても飽和しないことから、ｈＴｆＲへの結合力がさらに減少したことを確認できる。予想飽和点を選定してその結合力Ｋｄの値を計算すれば、約４４００ｎＭとなる。
８．ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能の評価
蛍光物質であるＣＦＳＥでヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を標識した。１０６個の細胞にＣＦＳＥを５μＭの濃度で２０分間３７℃のインキュベーターで反応させた。それをＰＢＳで洗浄し、１０５細胞を２ｍｌのセルプレート（cell plate）に２ｍｌの培養培地（culture media）に希釈して１日間培養した。
その後、１０５個のＮＫ細胞をＣＦＳＥで染色されたＡ５４９細胞株と反応させた。
このとき、対照群としてＰＢＳの１０μｌを使用し、実験群としてＣｙ５．５蛍光染料が標識されたｈｕＨＦ＿ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ（dICB、dual immune checkpoint blocker）を３μＭ １０μｌ入れた。
インキュベーターで１０分間反応させた後、ＮＫ １．１ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＰＥ抗体を用いてＮＫ細胞を標識した。
４％ホルムアルデヒド（formaldehyde）でサンプルを固定し、蛍光顕微鏡（fluorescence microscopy）を用いて蛍光画像を確認した。
対照群（ＰＢＳ）と比較して、実験群（ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ）の蛍光画像において、ＮＫ細胞がＡ５４９細胞にさらに付着していることを確認した（図１２、１３）。
９．ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理によるＮＫ細胞と癌細胞との結合能およびＮＫ細胞の癌細胞死滅能の評価
蛍光物質であるＣＦＳＥでヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を標識した。１０６個の細胞にＣＦＳＥを５μＭの濃度で２０分間３７℃のインキュベーターで反応させた。それをＰＢＳで洗浄し、１０４細胞を９６ウェルプレートに２００μｌの培養培地（culture media）に希釈して１日間培養した。
その後、ＤＡＰＩで標識された１０４～１０５個のＮＫ細胞を、条件に従ってＣＦＳＥで染色されたＡ５４９細胞株と反応させた。
このとき、ＰＢＳ １０μｌ、Ａｂｓ（Tecentriq＋mAb－mTIGIT（Bio X Cell, #BE0274）併用投与群）３μＭ １０μｌ（それぞれ３μＭ、合計６μＭ）、およびｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌを３μＭ １０μｌ入れた。
結合の測定は、前記反応液をインキュベーターで３０分間反応させた後、ＦＡＣＳ装置でＣＦＳＥ蛍光（fluorescence）とＤＡＰＩ蛍光（fluorescence）を同時に示す細胞の割合を分析した（図１４）。これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌ処理時にＮＫ細胞のＡ５４９細胞への結合能が増加することを確認できる。
これに関し、蛍光顕微鏡（Fluorescence microscopy）を用いて蛍光画像を確認した（図１４）。ＮＫ １．１ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＰＥ抗体でＮＫ細胞を標識した。
毒性の測定は、前記反応液をインキュベーター中で４８時間反応させた後、ＦＡＣＳ装置でサンプルによる毒性能力を検証した。７－ＡＡＤで細胞が死滅する程度を分析した。
ＣＦＳＥ蛍光（fluorescence）および７－ＡＡＤ蛍光（fluorescence）を同時に示す細胞の割合を分析し、ＮＫ細胞と癌細胞の割合およびサンプルによるＮＫ細胞の毒性能力を分析した（図１５）。これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ１－ｄｕａｌを処理した場合、ＮＫ細胞のＡ５４９細胞に対する死滅能が増加することを確認できる。
１０．癌細胞成長抑制能の評価
次のサンプル群（PBS、Tecentriq、Tecentriq＋mAb－mTIGIT、huHF_mutant－dual）に対して、各５匹ずつ、マウス肺癌細胞株であるＬＬＣ１に対する癌細胞成長抑制効果を検証した。テセントリク（Tecentriq）は、肺癌などの治療に使用されるＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体であり、ｍＡｂ－ｍＴＩＧＩＴは、ｍｕｒｉｎｅ ＴＩＧＩＴに結合するモノクローナル抗体である。
ＬＬＣ１を５×１０５個ずつＣ５７ＢＬ／６に皮下移植して腫瘍モデルを形成した。
７日後、個体ごとに腫瘍サイズを測定および分類し、各群ごとに同じサイズに調整した。
７日目からサンプルを３日ごとに尾静脈を介して静脈注射し、各個体の腫瘍サイズを測定して腫瘍成長抑制効果を比較した（図１６）。
図１７には各実験群における日付別の腫瘍サイズを示し、図１８には各実験群における２２日目の腫瘍サイズを示す。これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌの場合は、より少ない用量で処理したにもかかわらず腫瘍サイズが最も小さく、その効果が優れていることを確認できる。
１１．細胞アビディティ（Cell avidity）の評価
ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌおよびｍｕｔ－ｈｕＨＦのヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対するアビディティを分析した。
まず、標的細胞（immune cell、cancer cell）を培養して分注した。
（１×１０５個／１０μｌ、１ＦＡＣＳカラム（5ml polystyrene round－bottom tube、Falcon（352052）））。
その後、サンプル（薬物（drug）, 抗体（antibody）（抗マウスPD-L1抗体（anti－mouse PD－L1 antibody（BE0101））、抗マウスTIGIT抗体（anti－mouse TIGIT antibody（BE0274））、抗ヒトPD-L1（anti－human PD－L1（BE0285）））を１００μｌ／ＦＡＣＳカラム（column）処理し、対照群には、１００μｌのＦＡＣＳバッファー（0.1% BSA＋0.01% sodium azide in PBS）を処理した（3hr、室温（room temperature））。
ＦＡＣＳバッファーを各１ｍｌずつ前記ＦＡＣＳカラムに入れた後、１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する工程を３回繰り返した。
その後、蛍光抗体（Fluorescence antibody）（抗His Tag抗体－PE（anti his tag antibody－PE（SC－8036PE））、抗IgG抗体－PE（anti－IgG antibody－PE）（PE goat F（ab'）2 anti－rat（IgG）secondary antibody（ab7010）、PE F（ab'）2－goat anti－mouse IgG（H＋L）secondary antibody（12－4010－82）））を処理した（2hr, 室温（room temperature））。
ＦＡＣＳバッファーを各１ｍｌずつ前記ＦＡＣＳカラムに入れた後、１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する工程を３回繰り返した。
その後、各サンプルＦＡＣＳカラムにＦＡＣＳバッファーを１００ｕｌ入れた後、７－ＡＡＤ（BD Pharmigen（559925））の２μｌを５分間処理した。
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＡＣＳ装置により、各ＦＡＣＳカラムでのライブセルのうちＰＥ蛍光を示す標的細胞の割合を用いて分析した（図１９－２１）。
これにより、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌの方が、細胞当たりに結合するサンプルの数が多く、結合した細胞の数にも優れていることを検証した。
１２．腫瘍成長抑制能の評価
次のようなサンプル群（PBS、Ab－1、huHF_mutant－dual、huHF_mutant－dual＋Vac）に対して、各５匹ずつ、マウス肺癌細胞株であるＬＬＣ１に対する癌細胞成長抑制効果を検証した。Ａｂ－１はマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用し（Bio X Cell、＃BE0101）、ワクチン（Vac）としてはＬＬＣ－１ ｎｅｏ－ａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎｅ（配列番号１０）を使用した。
ＬＬＣ１を５×１０５個ずつＣ５７ＢＬ／６に皮下移植して腫瘍モデルを形成した。
７日目からサンプルを３日ごとに尾静脈を介して静脈注射し（Ｇ２群の場合は、６日ごとに注射）、各個体の腫瘍サイズを測定して腫瘍成長抑制効果を比較した（図２２）。
Ａｂ－１は３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌは３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、Ｖａｃは１０ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度で注射した。
これを参照すると、ｈｕＨＦ_ｍｕｔａｎｔ－ｄｕａｌ処理群の腫瘍成長抑制能に優れており、ワクチンとの併用時にさらに優れた効果を示すことを確認できる。
１３．ヘリックスの内部に外来ペプチドを融合したフェリチンタンパク質
図２３及び２４のベクター模式図を使用した以外は、実施例１と同様の方法でタンパク質製造用発現ベクターを構成し、実施例２及び３に示す方法でタンパク質を生合成して精製した。
これを参照すると、ｈｕＨＦのＡ－Ｅヘリックス間のループだけでなく、Ｄヘリックスの中間、Ｅヘリックスの中間に外来ペプチドを挿入（融合）してもｈｕＨＦ構造が円滑に形成されることを確認できる。
これは、ヘリックスの中間、特にＤヘリックスおよびＥヘリックスが、フェリチンの機能・構造維持面における重要度が相対的に低く、融合されたペプチドのサイズが大きくないことによると考えられる。
１４．タンパク質の水溶性分画の割合の測定
ｐＴ７－７ベースの様々な発現ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（competent cell）を形質転換（transformation）した。単一コロニーをアンピシリン１００ｍｇ／Ｌが添加されたＬＢ液体培地（５０ｍＬ）に接種し、振とう培養器（shaking incubator）で３７℃、１３０ｒｐｍの条件で培養した。濁度（turbidity／optical density at 600nm）が０．５に達すると、ＩＰＴＧの１ｍＭを投与して標的タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で１２～１６時間培養した後、培養液中の細胞を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）によってスピンダウン（spun－down）し、細胞ペレットを回収して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）バッファーに再浮遊させた。再浮遊された細胞は、ブランソンのソニファイアー（Branson Sonifier、Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT）を用いて破裂した。音波処理後、溶解性タンパク質を含む上澄み液と不溶性タンパク質を含む凝集体は、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）で分離した。分離された溶解性、不溶性タンパク質分画のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって溶解度を分析した。すなわち、クマシー（Coomassie）で染色された標的タンパク質バンドは、濃度計（densitometer、Duoscan T1200、Bio－Rad、Hercules、CA）でスキャンした後、水溶性分画の割合を定量化した。具体的には、スキャンしたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像を用いて、「Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ」プログラム「Ｖｏｌｕｍｅ Ｒｅｃｔ．Ｔｏｏｌ」でバンドの太さとバックグラウンドの値を設定した後、「Ｖｏｌｕｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ」を用いて、溶解性、不溶性タンパク質分画の合計を１００％に設定し、溶解度を定量化した。
結果を表６に示す。これを参照すると、外来ペプチドがＤヘリックスの内部またはＥヘリックスの内部に融合した場合でも水溶性の割合が高いことを確認できる。

Claims (16)

  1. 外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質を含む、肺癌の予防または治療用薬学組成物。
  2. 前記フェリチンタンパク質は、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してなる球状タンパク質である、請求項１に記載の薬学組成物。
  3. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体の隣接するαヘリックスの間の少なくとも１つに融合する、請求項１に記載の薬学組成物。
  4. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合する、請求項１に記載の薬学組成物。
  5. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合する、請求項１に記載の薬学組成物。
  6. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合する、請求項１に記載の薬学組成物。
  7. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のαヘリックスの内部に融合する、請求項１に記載の薬学組成物。
  8. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、フェリチン単量体のＡヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、ＤヘリックスまたはＥヘリックスの内部に融合する、請求項１に記載の薬学組成物。
  9. 前記フェリチンタンパク質は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異している、請求項１に記載の薬学組成物。
  10. 前記フェリチンタンパク質を構成するフェリチン単量体の少なくとも一つが、配列番号１の配列において、１５番、１６番、２３番、８２番、８４番、１１７番、１２０番、または１２４番のアミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されている、請求項１に記載の薬学組成物。
  11. トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式１を満たす、請求項１に記載の薬学組成物。
    Figure 2024517832000010
     （式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、前記フェリチンタンパク質と前記トランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態における前記フェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態における前記トランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態における前記フェリチンタンパク質と前記トランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）
  12. 前記トランスフェリン受容体は、ヒトトランスフェリン受容体である、請求項１０に記載の薬学組成物。
  13. 前記免疫チェックポイント分子は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の薬学組成物。
  14. 前記免疫チェックポイント分子と結合可能な前記分子は、前記免疫チェックポイント分子に対して結合力を有するリガンドまたはリガンドの断片、受容体または受容体の断片、抗体または抗原結合部位（ＣＤＲ）を含む抗体の断片である、請求項１に記載の薬学組成物。
  15. 前記フェリチンは、ヒトフェリチン重鎖である、請求項１に記載の薬学組成物。
  16. 抗癌剤をさらに含むか、または抗癌剤と併用投与される、請求項１に記載の薬学組成物。
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