KR101630858B1 - 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체를 포함하는 나노입자, 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질, 상기 융합단백질을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 벡터로 형질전환된 세포 및 상기 나노입자를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물{Antigen peptide-ferritin fused protein and vaccine composition comprising the same}
본 발명은 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체를 포함하는 나노입자, 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질, 상기 융합단백질을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 벡터로 형질전환된 세포, 나노입자의 제조방법 및 상기 나노입자를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
페리틴은 철을 저장하는 단백질로써 원핵생물과 진핵생물에 널리 존재하고 있다. 페리틴의 분자량은 약 500,000Da으로, 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)로 구성되어 있고, 자가 조립 능력이 있어 구형 입자를 형성하는 독특한 특성을 나타낸다. 페리틴은 24개의 단량체(중쇄 혹은 경쇄 중 하나로 구성된 단일 단량체 혹은 이종 단량체)가 모여서 거대한 구 형태의 삼차구조를 형성한 단백질로써, 인간 페리틴의 경우 외경은 약 12 nm이고 내경은 약 8 nm이다. 페리틴은 pH 조건에 따라 단량체로 흩어지기도 하고 24개의 단량체가 결합한 나노입자를 형성하기도 하는데 이러한 특성을 이용하면 페리틴 내에 다양한 물질을 포집할 수 있다.
예를 들어, 은과 결합하는 펩타이드를 이용하여 은을 포집한 페리틴을 합성한 사례가 보고되어 있으며(Kramer, R. M.; Li,C.; Carter, D. C.; Stone, M. O.; and Naik, R. R., (2004) J. Am. Chem. Soc., 126(13): 282), MRI 조영제인 Gd-HPDOTA(gadolinium-[10-(2-hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid]를 포집시킨 페리틴도 보고된 바 있다(Aime, S.; Frullano, L.; and Crich, S. G., (2002) Angew. Chem. Int. Ed., 41: 1017).
상기 보고된 바와 같이, 금속과 결합시킨 페리틴을 이용한 바 있으나, 항원 펩타이드와 융합하여 백신 조성물로 이용하는 것에 대해서는 보고된 바 없다.
한편, 백신이란 감염증의 예방을 위하여 동물을 능동적으로 면역하기 위하여 쓰이는 항원(antigen), 또는 항원을 유효성분으로 함유한 생물학적 제제로서 프랑스의 미생물학자 L.파스퇴르에 의하여 제창되었다. 특히 생물학 제제로서의 백신은 감염성 질병 예방을 목적으로 동물에게 투여되어 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 지칭한다. 통상 백신을 투여하면 생체에서는 해당 항체가 만들어져 면역이 획득되며, 일단 생성된 항체는 비교적 오랫동안 생체 안에 남아있게 되어, 해당 질병의 원인균에 의한 감염이 발생하더라도 이에 대한 방어가 가능하여 결과적으로 질병을 예방할 수 있는 것이다.
통상적으로 백신제제에는 세균을 사멸시켜 사용하는 사균백신(killed vaccine), 불활성 백신(inactivated vaccine), 살아있는 세균을 그대로 사용하는 생균백신(live vaccine), 생균을 약화시킨 약독균주 (attenuated strain)를 사용하는 약독화 백신 (attenuated vaccine), 세균의 톡소이드(toxoid) 또는 이것의 유도체 등 다양한 종류가 존재하며, 효과적인 백신 개발을 위해서는 질병을 일으키는 원인체에 대해 항체의 형성을 원활하게 하여 생체 내 면역반응이 적절히 유도되도록 해야 하기 때문에, 가능한 질병 원인체에 유사한 형태로 개발되는 것이 바람직하다. 이 때문에 아무 처리도 하지 않고 생균을 그대로 사용하는 생균백신이 백신으로서는 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있다. 하지만, 생균백신의 경우 질병을 야기하는 질병 원인체를 살아 있는 채로 이용하는 것이기 때문에, 향후 독성이 있는 균주로 전환되어 오히려 질병을 유발할 수 있는 위험성을 가지고 있어 극히 일부 감염성 질환에 있어서만 사용되고 있는 실정이다. 이런 단점을 극복하기 위한 대안으로 생균을 약독화시킨 약독화백신이 개발되어 사용되어지고 있지만, 이 경우 일반적으로 항원성이 생균백신에 비해 약화되어 백신으로서의 효과가 떨어지고, 또한 여전히 안전하다고도 할 수 없는 문제점을 가지고 있다. 사용상 안전성 때문에 개발된 사균백신은 비록 상기의 안전성 관점에서의 문제점을 해결할 수는 있지만 항원성이 생균백신이나 약독백신에 비해 크게 떨어지는 것이 일반적이다. 이에 따라, 사균백신처럼 사용상 안전하면서도 생균백신처럼 항원성이 뛰어난 이상적인 새로운 백신제제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
종래부터 요청되어온 기술의 개발을 통하여, 세균에 원인한 감염성 질환을 효과적으로 예방할 수 있는 안전한 백신제제의 개발은 매우 중대한 문제라 할 수 있다. 특히 생균백신처럼 생체 내 면역반응을 효과적으로 유도시킬 수 있으면서도 향후 독성이 있는 균주로 전환되지 아니하여 사용상 위험성이 없는 백신제제의 개발은 항상 요구되어 왔으며 이것에 관련된 기술의 개발은 사회적 및 경제적으로 파급효과가 매우 크다고 할 수 있다.
본 발명의 목적은 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항원 펩타이드가 페리틴 단백질의 C 말단에 융합되거나, 항원 펩타이드가 페리틴의 루프(loop) 지역 내 146번 위치에 융합된, 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제작하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개가 자가조립되어 형성된 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노입자를 포함하는, 면역 증강용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일구현예로서, 본 발명은 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에서, 페리틴은 생물 유래 나노구조체로 사용될 수 있으며, 24개의 페리틴 단량체가 자가조립(self- assembly)을 통하여 나노입자를 형성할 수 있다. 상기 페리틴에는 항원 펩타이드 또는 작은 단백질 항원 등이 삽입되더라도 구조적으로 망가지지 않는 지역(region)이 있으며, 여기에 항원 펩타이드를 클로닝을 이용하여 융합시킴으로써 에피토프 등의 항원 펩타이드가 페리틴 단량체에 함께 위치하는 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체를 제조할 수 있다.
또한, 상기 항원 펩타이드는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 구성하는 일부 펩타이드를 의미하며, 특히 항원결정기인 에피토프(epitope)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 아미노산 외에도 아미노산 모방체 또는 유사물과 같은 아미노산 유도체를 포함할 수 있다. 상기 모방체 또는 유사물은 적절한 공간적 배향에서 이에 상응하는 아미노산 또는 펩타이드가 나타내는 크기, 전하 또는 소수성 등의 유사한 물리적 특성을 나타내는 물질로서 정의된다. 구체적인 예로서, 펩타이드 모방 화합물은 하나 또는 그 이상의 아미노산 사이에 존재하는 아미드 결합이 탄소-탄소 결합 또는 당업계에 공지된 다른 결합으로 치환된 화합물일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일구현예는 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질은 항원 펩타이드가 나노입자의 내부 또는 외부 표면에 위치한 것인, 나노입자에 관한 것이다.
또한, 보다 구체적인 양태로서, 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질은 항원 펩타이드가 페리틴 단백질의 C 말단에 융합되거나, 항원 펩타이드가 페리틴의 루프(loop) 지역 내 146번 위치에 융합된 나노입자일 수 있다. 또한, 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질은 항원 펩타이드 및 페리틴 사이에 링커를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명에서 링커란, 항원 펩타이드 및 페리틴을 연결하여 융합 단백질을 만드는 경우 이들 단백질의 구조적 유연성을 증가시키거나 각 단백질의 활성이 증진될 수 있도록, 단백질과 단백질 사이에 삽입하는 펩타이드일 수 있다. 링커는 융합되는 각 단백질의 활성을 저해하지 않으면서 불필요한 면역반응을 일으키지 않는 것이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 아미노산 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 아미노산 1개 내지 5개로 구성된 펩타이드 링커일 수 있다.
또한, 보다 구체적인 양태로서, 각 융합단백질 단량체에 포함된 페리틴은 서로 동종 또는 이종일 수 있으며, 특히 파이로코크스 퓨리오수스(pyrococcus furiosus) 유래일 수 있다.
또한, 보다 구체적인 양태로서, 상기 항원 펩타이드는 난알부민(Ovalbumin) 단백질의 OT-1 펩타이드 또는 OT-2 펩타이드일 수 있으며, 이외에도 피부암의 gp100 펩타이드, 흑색종 항원(melanoma-associated antigen, MAGE), 티로시나아제(tyrosinase), 유방암의 MUC-1(Mucin 1), HER2(human epidermal receptor 2), 상피성 종양 항원(epithelial tumor antigen, ETA)등을 포함할 수 있다. 난알부민(Ovalbumin) 단백질은 면역반응을 유발하기 위한 모델 항원으로 사용된 것으로서, 본 발명에서 항원은 상기 난알부민(Ovalbumin) 단백질 뿐 아니라, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이면 제한없이 페리틴과 융합될 수 있다. 난알부민의 OT-1 또는 OT-2 펩타이드는 모델 항원으로 사용된 난알부민 단백질의 항원특이성을 결정하는 항원결정기인 에피토프로서, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원에 대한 에피토프라면 제한없이 페리틴과 융합하여 사용할 수 있다.
더욱 구체적으로 상기 OT-1 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, OT-2 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
또한, 보다 구체적인 양태로서, 본 발명의 나노입자는 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개의 자가조립에 의해 형성된 것일 수 있다.
또 다른 일구현예로서, 본 발명은 항원 펩타이드가 페리틴 단백질의 C 말단에 융합되거나, 항원 펩타이드가 페리틴의 루프(loop) 지역 내 146번 위치에 융합된, 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질은 항원 펩타이드 및 페리틴 사이에 링커를 더욱 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 융합 단백질 내의 항원 펩타이드는 난알부민(Ovalbumin) 단백질의 OT-1 펩타이드 또는 OT-2 펩타이드일 수 있으나, 난알부민(Ovalbumin) 단백질은 면역반응을 유발하기 위한 모델 항원으로 사용된 것으로서, 본 발명에서 항원은 상기 난알부민(Ovalbumin) 단백질 뿐 아니라, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이면 제한없이 페리틴과 융합될 수 있다. 또한, 난알부민의 OT-1 또는 OT-2 펩타이드는 모델 항원으로 사용된 난알부민 단백질의 항원특이성을 결정하는 항원결정기인 에피토프로서, 면역 반응을 유도할 수 있는 항원에 대한 에피토프라면 제한없이 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로 상기 OT-1 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, OT-2 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
또 다른 일구현예로서, 본 발명은 상기 기재된 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
또 다른 일구현예로서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
또 다른 일구현예로서, 본 발명은 상기 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
또 다른 일구현예로서, 본 발명은,
상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제작하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개가 자가조립되어 형성된 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 항원 펩타이드는 난알부민(Ovalbumin) 단백질의 OT-1 펩타이드 또는 OT-2 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이, 본 발명자들은 분자생물학적 방법 및 페리틴의 구조적 특성을 이용하여 항원 펩타이드를 페리틴에 도입하여, 새로운 기능을 가진 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 포함하는 나노입자를 개발하였으며, 상기 나노입자가 수지상 세포 매개의 면역반응을 유도하여, 백신 조성물로 사용될 수 있음을 실시예 4 내지 7을 통하여 확인하였다.
실시예 4를 통하여 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자인 FPCN(ferritin protein cage nanoparticles)이 효과적으로 식세포작용에 의해 수지상 세포에 내재화되는 것을 확인하였으며(도 11), 실시예 5 및 6을 통하여 in vitro 및 in vivo에서 FPCNs에 의해 전달된 항원 펩타이드 특이적인 T 세포의 증식 및 T 세포의 분화가 효과적으로 이루어지는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 일구현예는 상기 나노입자를 포함하는, 면역 증강용 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 나노입자를 포함함으로써, 본 발명은 기존의 생균백신의 독성에 관한 문제 및 항원성이 떨어지는 사균백신의 문제를 모두 해결하여 부작용이 없으면서도 효과가 뛰어난 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들을 더욱 포함할 수 있고, 면역학적 효과량으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 용어, "면역학적 효과량"이란 면역 증강 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며 면역반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.
담체는 당 분야에 공지의 것으로 안정화제, 희석제, 완충액을 포함할 수 있다. 적절한 안정화제는 솔비톨, 락토즈, 만니톨, 전분, 당, 덱스트란 및 포도당 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인 같은 단백질 등을 포함할 수 있다. 적절한 희석제에는 염, Hanks 균형 염, 링거액 등을 포함할 수 있다. 적절한 완충액에는 알칼리 금속 인산염, 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 토금속 탄산염 등을 포함한다. 또한 백신에는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 면역 아쥬반트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 적절한 면역 아쥬반트에는 아쥬번트의 예는 알루미늄 히드록시드, 프로이드 완전 또는 불완전 아쥬반트, DEAE 덱스트란, 레바미솔, PCG 및 poly I:C 또는 poly A:U를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 공지의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 방법에는 경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 이용할 수 있지만 이에 국한되지는 않으며, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 항원 펩타이드의 서열을 페리틴에 도입함으로써 융합단백질을 제조하고, 이를 이용하여 수지상 세포 매개의 면역반응을 유도할 수 있으므로 이를 포함하는 면역 증강용 백신 개발에 활용할 수 있으며, 백신 개발에 있어 균을 직접 이용하는 것이 아니므로 독성이 없는 백신을 제공할 수 있다.
도 1은 항원 특이적 T 세포 증식 및 OT 펩타이드를 전달하는 ferritin protein cage nanoparticles (FPCNs)에 의해 유도된 면역반응을 나타낸 것이다.
도 2는 FPCN-C(왼쪽) 및 FPCN-L(오른쪽)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 OT-1-FPCN-C (calc, 21,270.4 Da; obs, 21,270.0 Da, 아래) 및 OT-2-FPCN-C (calc, 22,081.1 Da; obs, 22,080.5 Da, 위) 의 분리된 단량체의 분자질량측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 OT-1-FPCN-L (calc, 21,239.2 Da; obs, 21,239.5 Da, 아래) 및 OT-2-FPCN-L(calc, 22,239.2 Da; obs, 22,239.5 Da, 위)의 분리된 단량체의 분자질량측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 WT-FPCN (아래), OT-1- FPCN-C (중간) 및 OT-2-FPCN-C (위)의 사이즈배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 의 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 WT-FPCN (아래), OT-1- FPCN-L (중간) 및 OT-2-FPCN- L (위)의 사이즈배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)의 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 TEM(transmission electron microscope)을 이용하여 구형을 이루고 있는 OT-1-FPCN-C (왼쪽) 및 OT-2-FPCN-C (오른쪽) 형태를 나타낸 것이다.
도 8은 TEM(transmission electron microscope)을 이용하여 구형을 이루고 있는 OT-1-FPCN-L (왼쪽) 및 OT-2-FPCN-L (오른쪽) 형태를 나타낸 것이다.
도 9는 야생형 및 OT 펩타이드가 삽입된 FPCN의 제타포텐셜을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 야생형 및 OT 펩타이드가 삽입된 FPCN의 나노입자분석(Dynamic light scattering, DLS) 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 식세포작용에 의해 다양한 FPCN들을 흡수한 수지상 세포들을 나타낸 것으로서, 4 ℃ 또는 37 ℃ 에서 pHrodo로 표지된 단백질과 2시간 동안 배양 후 유세포분석기로 분석한 것으로, 각 그래프 내에 기재된 수치는 양성 형광을 나타내는 세포의 비율(%)을 나타낸 것이다.
도 12는 in vitro에서 FPCN에 의해 전달된 OVA 항원이 OVA-특이적인 T 세포 증식을 유도한 것을 유세포분석기를 이용하여 측정한 것이다. A는 OT-1 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포의 증식을 나타낸 것이며, B는 OT-2 펩타이드에 대한 CD4+ T 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 13은 in vitro에서 FPCN에 의해 전달된 OVA 항원이 OVA-특이적인 T 세포 증식을 유도한 것을 유세포분석기를 이용하여 측정한 것으로, FPCN의 농도 차이에 따른 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 OT-2 펩타이드 중 하나의 아미노산을 제거한 OT-2’펩타이드를 페리틴 단백질의 C 말단에 더하여 제조한 OT-2'-FPCN-C 및 OT-2’펩타이드를 페리틴 단백질의 루프(loop) 지역 내에 삽입하여 제조한 OT-2'-FPCN-L을 나타낸 것이다.
도 15는 OT-2'-FPCN-C (calc, 22,010.1 Da; obs, 22,010.5 Da, 위) 및 OT-2'-FPCN-L(calc, 22,168.3 Da; obs, 22,169.0 Da, 아래)의 분리된 단량체의 분자질량측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 WT-FPCN (아래), OT-2'- FPCN-L (중간) 및 OT-2'-FPCN-C(위)의 사이즈배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 의 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 OT-2'-FPCN-C 및 OT-2'-FPCN-L의 TEM(transmission electron microscope) 이미지를 나타낸 것이다.
도 18은 in vitro에서 OT-2'-FPCN-C 및 OT-2'-FPCN-L은 OVA-특이적 T 세포의 증식을 유도하지 못하는 것을 CFSE-dilution assay 를 이용하여 나타낸 것이다.
도 19는 in vivo에서 FPCN에 의해 전달된 OVA 항원이 OVA-특이적인 T 세포 증식을 유도한 것을 유세포분석기를 이용하여 측정한 것이다. A는 OT-1 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포의 증식을 나타낸 것이며, B는 OT-2 펩타이드에 대한 CD4+ T 세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 20은 in vivo에서 FPCN에 의해 전달된 OVA 항원이 OVA-특이적인 T 세포 증식을 유도한 것을 유세포분석기를 이용하여 측정한 것으로, FPCN의 농도 차이에 따른 결과를 나타낸 것이다. (A)는 항원 펩타이드로 OT-1 펩타이드를 사용한 경우이고, (B)는 항원 펩타이드로 OT-2 펩타이드를 사용한 경우를 나타낸 것이다.
도 21은 50 μg의 WT-FPCN, OT-1-FPCN-C, 또는 OT-1-FPCN-L로 면역화한 경우의 기능적 effector T 세포로의 분화를 유세포분석기로 측정하여 나타낸 것이다.
도 22는 500 μg의 WT-FPCN, OT-1-FPCN-C, 또는 OT-1-FPCN-L로 면역화한 경우의 기능적 effector T 세포로의 분화를 유세포분석기로 측정하여 나타낸 것이다.
도 23은 사이토카인(Cytokine) assay를 이용하여 IFN- γ , IL-2, IL-10 및 IL-13 사이토카인 생산량을 측정하여 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질 제조
모델정립 단계에서는 기존에 보유하고 있는 미생물 파이로코크스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus ) 유래의 페리틴(서열번호 1)을 이용하였다. 미생물 유래의 페리틴 유전자를 프라이머 P1(서열번호 2; 5'-aaaacatatgttgagcgaaagaatgctcaaggc-3') 및 P2(서열번호 3; 5'-aaaaaggatccttactctcctccctgc-3')로 증폭시킨 다음 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 벡터pET 30b 에 클로닝하였다. 클로닝된 페리틴 유전자는 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
모델 항원으로 난알부민(Ovalbumin, OVA)를 이용하였으며, 항원 펩타이드로 난알부민(Ovalbumin, OVA)의 OT-1 펩타이드 또는 OT-2 펩타이드를 이용하였다.
항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자 자체는 FPCN(ferritin protein cage nanoparticles)으로 명명하였으며, 구체적으로, 페리틴 단백질의 C 말단에 PCR을 통해 항원 펩타이드인 OT-1 펩타이드(서열번호 4; SIINFEKL) 또는 OT-2 펩타이드(서열번호 5; ISQAVHAAHAEINEAGR)를 더하였으며, 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자를 FPCN(ferritin protein cage nanoparticles)-C로 명명하였다. 보다 구체적으로, OT-1 펩타이드가 페리틴 단백질의 C 말단에 더해진 경우, OT-1-FPCN-C (서열번호 6; 핵산 염기서열, 서열번호 7; 아미노산 서열)로 명명하였으며, OT-2 펩타이드가 페리틴 단백질의 C 말단에 더해진 경우, OT-2-FPCN-C(서열번호 8; 핵산 염기서열, 서열번호 9; 아미노산 서열)로 명명하였다.
또한, 페리틴 단백질의 루프(loop) 지역 내에 있는 146번 위치에 PCR을 통해항원 펩타이드인 OT-1 펩타이드 또는 OT-2 펩타이드를 삽입하였으며, 상기 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자를 FPCN(ferritin protein cage nanoparticles)-L로 명명하였다. 보다 구체적으로, OT-1 펩타이드가 페리틴 단백질의 루프(loop) 지역 내에 있는 146번 위치에 삽입된 경우 OT-1-FPCN-L(서열번호 10; 핵산 염기서열, 서열번호 11; 아미노산 서열)로 명명하였으며, OT-2 펩타이드가 페리틴 단백질의 루프(loop) 지역 내에 있는 146번 위치에 삽입된 경우 OT-2-FPCN-L(서열번호 12; 핵산 염기서열, 서열번호 13; 아미노산 서열로 명명하였다.
상기 OT-1 펩타이드 또는 OT-2 펩타이드를 C 말단에 더하거나, 루프(loop) 지역 내에 있는 146번 위치에 삽입하기 위하여, FPCN을 코딩하는 유전자를 주형으로하는 pET-30b 플라스미드에 대한 프라이머를 이용하여, PCR을 통해 증폭하였다.
OT-1 펩타이드를 C 말단에 더하는 경우, 사용한 Forward 프라이머의 서열은 5'-aggatccgaattcgagctccgtcg -3'(서열번호 14)이고, Reverse 프라이머 서열은 5'-aggatccttacagtttctcaaagttaataatgctctctcctccctgcattaagagccc-3’(서열번호 15)이었다.
OT-2 펩타이드를 C 말단에 더하는 경우, 사용한 Forward 프라이머의 서열은 5'-aggatccgaattcgagctccgtcg-3' (서열번호 16)이고, Reverse 프라이머 서열은 5'-aggatccttagcgtcctgcctcatttatctcatgcgccgcatggaccgcctgacttatctctcctccctgcattaagagccc- 3’(서열번호 17) 이었다.
OT-1 펩타이드를 루프(loop) 지역 내에 있는 146번 위치에 삽입시 사용한 Forward 프라이머의 서열은 5'- agctagcgacagtcctcaaatattgttcatgcttgataagg- 3'(서열번호 18)이고, Reverse 프라이머 서열은 5'-agctagccagtttctcaaagttaataat gctcttggcaaactttaacttgtccagtattttctttacg- 3'(서열번호 19) 이었다.
OT-2 펩타이드를 루프(loop) 지역 내에 있는 146번 위치에 삽입시 사용한 Forward 프라이머의 서열은 5'- agctagcgacagtcctcaaatattgttcatgcttgataagg- 3'(서열번호 20) 이고, Reverse 프라이머 서열은 5'-agctagcgcgtcctgcctcatttatc tcatgcgccgcatggaccgcctgacttatcttggcaaactttaacttgtccagtattttctttacg -3’(서열번호 21)이었다.
상기 증폭된 DNA를 이용하여 대장균(Escherichia coli) BL21 (DE) 세포를 형질전환시켜, OT-1 또는 OT-2를 포함하는 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질을 발현하는 대장균(Escherichia coli)을 제조하였다. 상기와 같은 방법으로 제조된 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개가 자가조립(self assembly)를 통하여 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자(FPCN)을 형성하였다. 융합된 항원 펩타이드는 FPCN 의 내부에 위치하게 되거나, 외부 표면에 위치하였다.
실시예 2. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질의 정제
상기 실시예 1에서의 항원 펩타이드-페리틴 융합단백질이 발현된 대장균을 Kang YJ, Uchida M, Shin HH, Douglas T, Kang S. Biomimetic FePt nanoparticle synthesis within Pyrococcus furiosus ferritins and their layer-by-layer formation. Soft Matter 2011;7:11078-81 에 기재된 방법을 이용하여 정제하였다.
Triton X-114 (Sigma; St.Louis, MO)로 엔도톡신을 제거한 후, 샘플의 엔도톡신 수준(level)을 Limulus Amebocyte Lysate assay(Genescript, Piscataway, NJ)를 이용하여 정량하였으며, 0.15 EU/ml 이하로 나타났다. 단백질 농도는 Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.
실시예 3. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질을 포함하는 나노입자( FPCN )의 특성 분석
3-1. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질을 포함하는 나노입자( FPCN )의 질량 분석
상기 펩타이드가 삽입되었는지 여부를 OT 펩타이드가 삽입된 FPCN-C (OT-1-FPCN-C 또는 OT-2-FPCN-C) 및 FPCN-L(OT-1-FPCN- L 또는 OT-2-FPCN- L)의 분리된 단량체의 질량분석을 통해 확인하였다(도 3 및 도 4).
상기 질량분석을 위하여, WT-FPCN 및 FPCN 유사체들을 Waters UPLC 및 오토샘플러(autosampler)와 맞닿아있는 ESI-TOF mass spectrometer (Xevo G2 TOF,Waters)를 이용하여 분석하였다. 샘플들을 MassPREPTM Micro desalting column (Waters)으로 로딩하고, 0.1% 포름산을 포함하는 5-95% (v/v)의 아세토나이트릴 용액으로 300 μl/min의 유속으로 희석하였다. 상기 ESI(Electrospray ionization)는 일반적으로 다중하전된 이온 및 전하를 생산한다. 다중하전된 이온 및 전하들은 일반적으로 가우시안 강도 분배(Gaussian intensity distribution) 및 전하와 관찰된 mass-to-charge (m/z) 비율값으로부터 정해지는 각 종(species)의 분자질량을 가지는 연속적인 시리즈로 분배된다. 질량분석결과는 m/z 500-3,000의 범위에서 얻었으며, MassLynx version 4.1의 MaxEnt 1 및 MaxEnt 3을 이용하여 디컨볼루션(deconvolution)하였다. 보다 명확히 하기 위하여, 도 3 및 도 4에는 디컨볼루션(deconvolution)한 질량만을 기재하였다.
3-2. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질을 포함하는 나노입자( FPCN )의 사이즈배제 크로마토그래피( size exclusion chromatography ) 분석
각 샘플들을 50 mM 인산과 100 mM NaCl (pH 6.5)로 사전-평형화된(pre-equilibrated ) 10 X 300 mm superpose 6 size exclusion column 상에서 로딩하였고, 그 후 유속 0.5 mL/min로 같은 버퍼를 이용하여 용출(elution)시켜, 사이즈배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하였다.
OT-1-FPCN-C 및 OT-2-FPCN-C는 사이즈배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)상 OT 펩타이드의 삽입이 없는 야생형 FPCN(wild-type FPCN, WT-FPCN)과 같은 위치에서 분리되었으며(도 5), OT-1-FPCN-L 및 OT-2-FPCN-L 역시 야생형 FPCN(wild-type FPCN, WT-FPCN)과 같은 위치에서 분리되는 것을 확인하였다(도 6).
3-3. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질을 포함하는 나노입자( FPCN )의 TEM(Transmission electron micrographic ) 이미지 분석
각 샘플들을 2% 아세트산우라닐(uranyl acetate)로 염색하여 TEM(Transmission electron micrographic) 이미지를 통해 FPCN의 형태를 확인하였다. 음성염색된 OT-FPCN-C의 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 이미지로부터 FPCN이 균일한 사이즈 분포를 가지는 함몰된 구형 구조임을 알 수 있었다(도 7). OT-FPCN-L 또한 WT-FPCN 및 OT-FPCN-C과 거의 동일한 cage 구조를 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
3-4. 항원 펩타이드 -페리틴 융합단백질을 포함하는 나노입자( FPCN )의 제타포텐셜 및 DLS ( dynamic light scattering ) 분석
본 발명의 OT-FPCN-C 및 OT-FPCN-L의 표면 전하 특성을 알아보기 위하여, 영국 Malven사의 제타포텐셜 측정 시스템을 이용하여 수용액상에서 제타포텐셜(zeta potential)을 측정하였다. 제타포텐셜 측정 결과, OT-펩타이드가 삽입된 FPCNs가 야생형 FPCNs(-19.4 mV)보다 더 약간 낮은 음성 표면 전하 (-21 ~ -28 mV)를 나타내었다. 구체적으로, WT, FPCN, OT-1-FPCN-L, OT-2-FPCN-L, OT-1-FPCN-C, 및 OT-2-FPCN-C 각각에 대한 제타포텐셜 값은 -19.4, -20.9, -28.6, -25.4, 및 -28.0 mV을 나타내었다(도 9).
또한, 야생형 및 OT-펩타이드가 삽입된 FPCNs의 유체역학적 직경 (hydrodynamic diameter)을 Brookhaven instrument사의 나노입자분석기(dynamic light scattering, DLS)를 이용하여 수용액 상에서 측정하였다. 상기 측정을 통해 펩타이드의 삽입과 상관없이 13.2 ± 0.4 nm의 균일한 유체역학적 직경을 나타냄을 알 수 있었다. 구체적으로, WT FPCN, OT-1-FPCN-L, OT-2-FPCN-L, OT-1-FPCN-C, 및 OT-2-FPCN-C의 평균지름(Mean diameters)은 13.1, 12.8, 13.5, 13.6, 및 13.1 nm 이었다(도 10).
상기 결과들로부터, FPCN cage 구조 자체는 T-펩타이드 시리즈의 삽입에 의해 구조의 온전성 등이 변하지 않음을 알 수 있으며, 이에 따라 본 발명에 개시된 OT 펩타이드 외에도 다른 항원 펩타이드의 삽입 역시 가능하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 수지상 세포로의 FPCNs 의 항원 펩타이드 전달 및 수지상 세포에서의 식세포작용 확인
항원-특이적 T 세포 반응을 유도하기 위하여, 단백질 항원이 수지상 세포에 의해 처음 내재화되고, 엔도솜(endosome) 내에서 프로세스되어, 펩타이드:MHC 복합체의 표면에 제시되어야 한다. 야생형-FPCN 및 FPCN 유도체들이 수지상 세포에 의해 흡수되는 것을 확인하기 위하여, 각 FPCN 유도체들 및 OVA 단백질을 낮은 pH에서 형광이 증가하여 식세포작용의 표지가 되는 pHrodo dye로 염색하였다. 그 후 단백질들을 수지상 세포와 함께 배양하고, 식세포 작용으로 인한 형광의 변화를 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, naive C57BL/6 마우스로부터 수지상 세포를 수확하여, 각각의 FPCN을 pH에 민감한 pHrodo dye로 표지하고, 부착되지 않은 dye를 투석 버퍼를 여러 번 교체하는 방법으로 제거하였다. 상기 염색약으로 표지된 단백질들을 수지상 세포와 함께 4 ℃ 또는 37 ℃에서 2시간 동안 배양하고, 이후 수지상세포를 완전히 씻어내고 식세포작용에 의한 pHrodo의 형광강도를 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하여 측정하였다. 양성 형광을 나타내는 세포의 비율(%)은 각 그래프에 나타내었다. pHrodo-표지된 FPCN의 형광 강도는 37℃에서 급격히 증가하였으며, OT 펩타이드의 삽입 또는 FPCN의 형태에 관계없이 모든 FPCN이 대조군인 용해성 있는 OVA 단백질만큼 효과적으로 식세포작용에 의해 내재화되는 것을 알 수 있었다(도 11).
실시예 5. FPCNs 에 의해 전달된 항원 펩타이드에 특이적인 수지상 세포 매개의 면역반응 확인
5-1. in vitro 에서 FPCNs 에 의해 전달된 항원 펩타이드 특이적인 T 세포의 증식 확인
FPCN에 의해 전달된 OT 펩타이드가 프로세스되고, MHC-제한적인 OT 펩타이드 특이적 CD8+ 또는 CD4+ T 세포에 제시되어 그들의 항원-특이적 T 세포 증식을 in vitro에서 유도하는지 알아보았다. OT-1 또는 OT-2 T 세포를 1 × 107 cells/ml 에 0.5 μM CFSE (Invitrogen)로 37℃에서 10분간 염색시키고, naive C57BL/6 마우스로부터 수지상 세포를 수확하여, OT-1-FPCNs (OT-1-FPCN-C or OT-1-FPCN-L) 또는 OT-2-FPCNs (OT-2-FPCN-C or OT-2-FPCN-L)로 3시간동안 pulse를 주었다. 프로세스된 항원만 제시되도록 하기 위하여 세척하였다. 그 후, 수지상 세포를 carboxy fluoresceinsuccinimidyl ester (CFSE)-표지된 OT-1 또는 OT-2 T 세포와 1:3(수지상 세포: T 세포, DC, 1 × 105: T cell, 3 × 105)의 비율로 하여 37 ℃, 96-well U-bottom plate에서 4일 동안 공동배양하였다. 그 후 세포들을 모아서 Vβ 5.1/5.2 (Biolegend), Vα 2 및 CD8 또는 CD4 (BD)를 염색하고, OT-1 펩타이드 특이적인 CD8+ T 세포 또는 OT-2 펩타이드 특이적인 CD4+ T 세포의 증식을 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.
상기 측정 결과, PBS로 자극된 수지상 세포 또는 야생형 FPCN과 공동배양한 OT T 세포의 CFSE 신호는 변화가 없었으나, 양성 대조군으로서의 OVA 단백질 또는 OT-FPCN으로 자극된 수지상 세포와 공동배양한 T 세포는 낮은 CFSE 형광 강도의 피크(peak)들을 나타내었으며, 이는 in vitro에서 FPCN에 의해 수지상 세포로 전달된 OT 항원 펩타이드가 효과적으로 항원-특이적 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 증식을 자극하였음을 나타내는 것이다(도 12).
나아가 본 발명자들은 FPCNs의 농도에 따른 OT 펩타이드 특이적인 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 증식을 조사하였다. OT-FPCN의 농도가 감소함에 따라, 증식 역시 감소하였으며, 이로부터 증식반응의 특이성을 확인하였다. 그러나, in vitro에서 OTs-FPCN-C 및 OTs-FPCN-L 형태에 따른 T 세포의 증식차이는 나타나지 않았다(도 13).
5-2. in vitro 에서 FPCNs 에 의해 전달된 변형된 OT -2 펩타이드( OT -2'에 대한 특이적인 T 세포의 증식여부 관찰
OT-2 펩타이드 중 하나의 아미노산을 삭제((ISQAVHAAHAEINEAGR, 밑줄친 아미노산 삭제)하고, 상기 변형된 OT-2 펩타이드를 FPCN을 통해 전달하였을 때의 T 세포의 증식여부를 관찰하였다. 상기 변형된 OT-2 펩타이드는 OT-2’펩타이드로 명명하였다. 상기 실시예 1에서 FPCN을 제조한 것과 동일한 방식으로 OT-2’펩타이드를 페리틴 단백질의 C 말단에 더하여 OT-2’-FPCN-C를 제조하고, 페리틴 단백질의 루프(loop) 지역 내에 삽입하여 OT-2’-FPCN-L을 제조하였다. 이의 구조 모식도는 도 14에 나타내었다. 또한, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 OT-2’-FPCN-C (calc, 22,010.1 Da; obs, 22,010.5 Da, 위) 및 OT-2’-FPCN-L(calc, 22,168.3 Da; obs, 22,169.0 Da, 아래)의 분리된 단량체의 분자질량을 측정하였으며, 이 결과는 도 15에 나타내었다. 또한 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 사이즈배제 크로마토그래피를 수행하여 WT-FPCN (아래), OT-2’- FPCN-L (중간) 및 OT-2’-FPCN-C(위)의 결과를 도 16에 나타내었다.
상기 실시예 3-3과 동일한 방법으로 OT-2’-FPCN-C 및 OT-2’-FPCN-L의 TEM(transmission electron microscope) 이미지를 도 17에 나타내었다.
OT-2’-FPCN-C 및 OT-2’-FPCN-L을 이용하여 변형된 OT-2 펩타이드인 OT-2’펩타이드를 FPCN을 통해 전달하였을 때, in vitro에서 T 세포의 증식이 유도되지 않았으며, 이로부터 T 세포 증식이 OT-2 펩타이드에 특이적인 것임을 확인하였다(도 18).
5-3. in vivo 에서 FPCNs 에 의해 전달된 항원 펩타이드 특이적인 T 세포의 증식 확인
in vivo에서 FPCN의 항원전달에 의해 유도된 항원 특이적 T 세포의 증식여부를 관찰하였다.
Naive 마우스에 CFSE-표지된 OT-1 또는 OT-2 T 세포를 정맥주사로 이식하고, OT-1-FPCNs, OT-2-FPCNs 또는 애쥬번트(adjuvant)로서 polyinosinic-poly cytidylic acid (poly (I:C)) 존재 하에서의 야생형-FPCN으로 면역화하였다. 마우스 한 마리당 100-500 μg의 OVA 단백질을 양성 대조군으로 사용하여, OVA 단백질의 OT 펩타이드 및 FPCN의 OT 펩타이드의 프로세스 및 효능을 직접적으로 비교하였다.
구체적으로, Naive C57BL/6 마우스에 CFSE-표지된 OT-1 특이적인 T 세포를 이식 후 다음날, 애쥬번트(adjuvant)로서 polyinosinic-polycytidylic acid (poly (I:C)) 50 μg 존재 하에서 PBS, 100 μg의 OVA 단백질, 50 μg의 WT-FPCN, OT-1-FPCN-C 또는 OT-1-FPCN-L로 면역화하였다. 3일 후, 단세포 현탁액을 림프절로부터 얻어내고, OVA-특이적인 T 세포(V β 5.1/5.2+V α 2+CD8+) 에 대해 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. OT-1 특이적인 T 세포의 증식은 도 19의 A에 나타내었다.
CFSE-표지된 OT-2 특이적인 T 세포의 증식여부를 확인하기 위하여, Naive C57BL/6 마우스에 CFSE-표지된 OT-2 특이적인 T 세포를 이식 후 다음날, 애쥬번트 (adjuvant)로서 polyinosinic-polycytidylic acid (poly (I:C)) 50 μg 존재 하에서 PBS, 500 μg의 OVA 단백질, 250 μg의 OT-2-FPCN-C 또는 OT-2-FPCN-L로 면역화하였다. 3일 후, 단세포 현탁액을 림프절로부터 얻어내고, OVA-특이적인 T 세포(V β 5.1/5.2+V α 2+CD4+) 에 대해 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. OT-1 특이적인 T 세포의 증식은 도 19의 B에 나타내었다.
in vitro에서의 OT 펩타이드 특이적인 T 세포 증식 결과와 유사하게, OVA 단백질(양성 대조군) 또는 OT 펩타이드 특이적인 T 세포의 CFSE 신호가 나타났으며, 이로부터 FPCN에 의해 수지상 세포로 전달된 OT 항원 펩타이드가 in vivo에서 효과적으로 항원 특이적 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 증식을 유도하는 것을 알 수 있었다.
또한, 50μg, 5μg, 0.5μg의 다양한 용량을 주입하고 OT 펩타이드 특이적인 T 세포 증식을 관찰하였을 때, CFSE의 형광 강도가 감소함에 따라 순차적으로 희석된(diluted) 피크가 나타났다(도 20). 이로부터 FPCN에 의해 수지상 세포로 전달된 OT 항원 펩타이드가 in vivo에서 효과적으로 항원 특이적 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 증식을 유도하는 것을 다시 확인할 수 있었다. 또한, 상기 결과들로부터 in vitro 및 in vivo 모두에서 FPCN에 의해 수지상 세포로 전달된 항원의 포식, 프로세스 및 제시가 성공임을 알 수 있었다.
항원-특이적 T 세포 증식이 형태 의존적인지 여부와 관련하여, 본 발명자들은 식에 있어서, 50μg 및 5μg의 용량을 주입한 경우에는 형태-의존적인 다양성을 관찰할 수 없었다. 그러나, 훨씬 낮은 용량인 0.5μg을 주입한 경우, 본 발명자들은 항원-특이적 CD4+ T 세포 증식이 in vivo에서 FPCN 형태에 따라 유의한 차이가 나타나는 것을 확인하였다. 구체적으로, OT-FPCN-C와 비교할 때, OT-FPCN-L에 의해 전달된 항원에 의한 증식 반응이 훨씬 적게 나타났다. 이는 OT 펩타이드가 삽입된 루프(loop)지역이 FPCN의 표면에 위치하더라도, 이는 단백질 서여의 중간에 위치하게 되므로, in vivo상 OT-FPCN-L에 의해 전달된 에피토프의 루프(loop) 구조는 C 말단에 위치한 에피토프만큼 수지상 세포에 의해 효과적으로 프로세스되지 않아, 항원-특이적 T 세포의 증식의 감소를 나타내는 것으로 판단되었다.
실시예 6. FPCNs 에 의해 전달된 OT -1 펩타이드에 의한 CD8 + T 세포의 기능적 effector T 세포로의 분화 확인
본 발명자들은 활성화 된 T 세포가 후천성 면역반응(adaptive immune responses)에 필수적인, 기능적 effector T 세포로 분화할 수 있는지 여부를 조사하였다. 항원 특이적 T 세포의 effector 기능을 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 사이토카인 생산에 대한 세포독성 T 임파구 분석(cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay)을 통해 측정하였다.
Naive 마우스에 애쥬번트(adjuvant)로서 polyinosinic-polycytidylic acid (poly (I:C)) 50 μg 존재 하에서 PBS, 100μg의 OVA 단백질, 50 μg의 WT-FPCN, OT-1-FPCN-C, 또는 OT-1-FPCN-L을 피하주입하여 면역화하였다. 14 일 째, OT-1 펩타이드-pulsed (antigen-specific target cells, 5 μM CFSE-labeled, CFSEhi) 및 unpulsed (irrelevant cells, 0.5 μM CFSE-labeled, CFSElow) 지라세포를 각각 7 × 106 씩, 1:1로 혼합하여 마우스 피하에 주입하였다. 14~16시간 후, 각 그룹의 림프절로부터 단세포 현탁액을 준비하여 유세포분석기를 이용하여 항원-특이적 CTL 활성을 측정하였다.
도 21에 나타난 바와 같이, PBS 및 WT-FPCN 처리 그룹에서는 CFSEhi 로 표지된 OT-1 펩타이드-pulsed 지라세포의 세포수 감소가 나타나지 않았다. 이와 대조적으로, OVA 단백질, OT-1-FPCN-C, 또는 OT-1-FPCN-L로 면역화된 그룹에서는 CFSEhi 로 표지된 OT-1 펩타이드-pulsed 지라세포의 수가 현저히 감소하였으며, 이는 CTL에 의한 목표세포의 용균이 항원-특이적인 것임을 의미한다.
또한, 상기와 동일한 방식으로, Naive 마우스에 애쥬번트(adjuvant)로서 polyinosinic-polycytidylic acid (poly (I:C)) 50 μg 존재 하에서 PBS, 100μg의 OVA 단백질, 500 μg의 WT-FPCN, OT-1-FPCN-C, 또는 OT-1-FPCN-L을 피하주입하여 면역화 한 후 동일한 방법으로 유세포분석기를 이용하여 항원-특이적 CTL 활성을 측정하였다.
도 22에 나타난 바와 같이, 항원이 접합된(conjugated) FPCNs의 농도가 증가함에 따라, 더 많은 목표 세포들이 용균(lysis)되는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터 in vivo 에서 FPCN에 의해 전달되는 OT-1 펩타이드들은 항원-특이적인 CD8+ T 세포를 기능적 effector 세포독성 T 세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 이로부터 목표 세포의 선택적 살상을 야기할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. FPCNs 에 의해 전달된 OT -2 펩타이드에 의한 CD4 + T 세포의 기능적 헬퍼 T 세포( Th )로의 분화 확인
수지상 세포는 CD4+ T 세포를 세포 표면 분자(cell surface molecules)의 발현, 전사인자, 사이토카인 분비 등 다른 면역세포에 제공하는 기능적 효과에 따라 분류되는 다양한 헬퍼 T 세포(Th)로의 분화 및 증식을 유도하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, CD4+ Th1 세포는 인터루킨-2 (IL-2) 및 인터페론(IFN)- γ를 분비하여 대식세포의 활성화, 염증반응 및 CD8+ T 세포의 활성을 유도하는 반면, CD4+ Th2 세포는 IL-4, IL-10 및 IL-13을 분비하여 B 세포 분화 및 항체반응을 유도한다.
OT-2-FPCN을 통해 전달된 항원에 따른 수지상 세포에 의해 증식된 OT-2 CD4+ T 세포가 기능적 CD4+ T 세포로 분화할 수 있는지 알아보기 위하여, 이들의 사이토카인 생산량을 측정하였다. OVA 단백질, WT-FPCN, OT-2-FPCN-C 또는 OT-2-FPCN-L로 3시간 동안 Naive 수지상 세포에 펄스(pulse) 후 세척하고 OT-2 T 세포와 공동배양하였다. 48-72시간 후, 상층액에 있는 사이토카인을 CBA flex sets (BD Bioscience) 및 유세포분석기를 이용하여 정량하였다.
구체적으로, 2 mg/ml의 WT-FPCN, OT-2-FPCN-C, OT-2-FPCN-L 또는 1 mg/ml의 OVA 단백질로 3시간 동안 펄스된 naive C57BL/6 마우스로부터 수지상 세포를 수확하였다. 상기 수지상 세포를 세척하고 OT-2 T 세포와 1:3의 비율로 48-72시간동안 공동배양하였다. 사이토카인(Cytokine) assay로 IFN-γ, IL-2, IL-10 및 IL-13의 생산을 유세포분석기로 측정하고, 데이터는 FCAP Array software를 이용하여 분석하였다(*P < 0.05, **P b 0.01, ***P b 0.001.).
OT-2-FPCN-C 또는 OT-2-FPCN-L 펄스된(pulsed) 수지상 세포의 공동배양 상층액에서 IL-10 및 IL-13와 같은 Th2 사이토카인 뿐만 아니라 IFN- γ 및 IL-2와 같은 많은 양의 Th1 사이토카인이 관찰되었으며, 이는 용해성 있는 OVA 단백질에 의해 유도된 것과 비슷한 수준이었다. 그러나 WT- FPCN 펄스된(pulsed) 수지상 세포의 상층액에서는 사이토카인이 거의 없거나 없었다(도 23). 상기 결과로부터 FPCN에 의해 수지상 세포로 전달된 OT-2 펩타이드는 항원 특이적인 CD4+ T 세포를 Th1 및 Th2 세포와 같은 기능적 effector CD4+ T 세포로 분화하여 다양한 사이토카인이 분비될 수 있도록 하는 것을 알 수 있었다.
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amplication of Pyrococcus furiosus-derived ferritin <400> 2 aaaacatatg ttgagcgaaa gaatgctcaa ggc 33 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P2 for amplication of Pyrocuccus furiosus-derived ferritin <400> 3 aaaaaggatc cttactctcc tccctgc 27 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OT-1 peptide of ovalbumin <400> 4 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OT-2 peptide of ovalbumin <400> 5 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 6 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of OT-1-FPCN-C fuded protein <400> 6 atgttgagcg aaagaatgct caaggcttta aatgaccagc taaacaggga gctttattct 60 gcatatctat actttgccat ggctgcctac tttgaagatc ttggccttga aggtttcgcc 120 aactggatga aggctcaggc tgaagaagag attgggcatg cactgaggtt ctacaactac 180 atctacgatc gcaatggtag ggttgagctt gatgaaattc caaagcctcc aaaggagtgg 240 gagagcccat taaaagcttt tgaagctgct tacgagcatg agaaattcat ctgcaagtcc 300 atatatgaat tggcagcttt agcagaggag gaaaaagatt actcgacgag ggcattctta 360 gagtggttta tcaacgagca ggttgaggaa gaggccagcg taaagaaaat actggacaag 420 ttaaagtttg ccaaggacag tcctcaaata ttgttcatgc ttgataagga gttgagtgcg 480 agagctccaa agctcccagg gctcttaatg cagggaggag agagcattat taactttgag 540 aaactg 546 <210> 7 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of OT-1-FPCN-C fused protein <400> 7 Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu 20 25 30 Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu 35 40 45 Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg 50 55 60 Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp 65 70 75 80 Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe 85 90 95 Ile Cys Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys 100 105 110 Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val 115 120 125 Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala 130 135 140 Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala 145 150 155 160 Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu Ser Ile 165 170 175 Ile Asn Phe Glu Lys Leu 180 <210> 8 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of OT-2-FPCN-C fused protein <400> 8 atgttgagcg aaagaatgct caaggcttta aatgaccagc taaacaggga gctttattct 60 gcatatctat actttgccat ggctgcctac tttgaagatc ttggccttga aggtttcgcc 120 aactggatga aggctcaggc tgaagaagag attgggcatg cactgaggtt ctacaactac 180 atctacgatc gcaatggtag ggttgagctt gatgaaattc caaagcctcc aaaggagtgg 240 gagagcccat taaaagcttt tgaagctgct tacgagcatg agaaattcat atgcaagtcc 300 atatatgaat tggcagcttt agcagaggag gaaaaagatt actcgacgag ggcattctta 360 gagtggttta tcaacgagca ggttgaggaa gaggccagcg taaagaaaat actggacaag 420 ttaaagtttg ccaaggacag tcctcaaata ttgttcatgc ttgataagga gttgagtgcg 480 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Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu Ile Ser 165 170 175 Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg 180 185 190 <210> 10 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of OT-1-FPCN-L fused protein <400> 10 atgttgagcg aaagaatgct caaggcttta aatgaccagc taaacaggga gctttattct 60 gcatatctat actttgccat ggctgcctac tttgaagatc ttggccttga aggtttcgcc 120 aactggatga aggctcaggc tgaagaagag attgggcatg cactgaggtt ctacaactac 180 atctacgatc gcaatggtag ggttgagctt gatgaaattc caaagcctcc aaaggagtgg 240 gagagcccat taaaagcttt tgaagctgct tacgagcatg agaaattcat atgcaagtcc 300 atatatgaat tggcagcttt agcagaggag gaaaaagatt actcgacgag ggcattctta 360 gagtggttta tcaacgagca ggttgaggaa gaggccagcg taaagaaaat actggacaag 420 ttaaagtttg ccaagagcat tattaacttt gagaaactgg ctagcgacag tcctcaaata 480 ttgttcatgc ttgataagga gttgagtgcg agagctccaa agctcccagg gctcttaatg 540 cagggaggag ag 552 <210> 11 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of OT-1-FPCN-L fused protein <400> 11 Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu 20 25 30 Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu 35 40 45 Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg 50 55 60 Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp 65 70 75 80 Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe 85 90 95 Ile Cys Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys 100 105 110 Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val 115 120 125 Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala 130 135 140 Lys Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ala Ser Asp Ser Pro Gln Ile 145 150 155 160 Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala Arg Ala Pro Lys Leu Pro 165 170 175 Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu 180 <210> 12 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of OT-2-FPCN-L fused protein <400> 12 atgttgagcg aaagaatgct caaggcttta aatgaccagc taaacaggga gctttattct 60 gcatatctat actttgccat ggctgcctac tttgaagatc ttggccttga aggtttcgcc 120 aactggatga aggctcaggc tgaagaagag attgggcatg cactgaggtt ctacaactac 180 atctacgatc gcaatggtag ggttgagctt gatgaaattc caaagcctcc aaaggagtgg 240 gagagcccat taaaagcttt tgaagctgct tacgagcatg agaaattcat atgcaagtcc 300 atatatgaat tggcagcttt agcagaggag gaaaaagatt actcgacgag ggcattctta 360 gagtggttta tcaacgagca ggttgaggaa gaggccagcg taaagaaaat actggacaag 420 ttaaagtttg ccaagataag tcaggcggtc catgcggcgc atgcggagat aaatgaggca 480 ggacgcgcta gcgacagtcc tcaaatattg ttcatgcttg ataaggagtt gagtgcgaga 540 gctccaaagc tcccagggct cttaatgcag ggaggagag 579 <210> 13 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of OT-2-FPCN-L fused proteiin <400> 13 Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu 20 25 30 Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu 35 40 45 Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg 50 55 60 Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp 65 70 75 80 Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe 85 90 95 Ile Cys Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys 100 105 110 Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val 115 120 125 Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala 130 135 140 Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 145 150 155 160 Gly Arg Ala Ser Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu 165 170 175 Leu Ser Ala Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly 180 185 190 Glu <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for addition of OT-1 peptide to ferritin C-terminus <400> 14 aggatccgaa ttcgagctcc gtcg 24 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for addition of OT-1 peptide to ferritin C-terminus <400> 15 aggatcctta cagtttctca aagttaataa tgctctctcc tccctgcatt aagagccc 58 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for addition of OT-2 peptide to ferritin C-terminus <400> 16 aggatccgaa ttcgagctcc gtcg 24 <210> 17 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for addition of OT-2 peptide to ferritin C-terminus <400> 17 aggatcctta gcgtcctgcc tcatttatct catgcgccgc atggaccgcc tgacttatct 60 ctcctccctg cattaagagc cc 82 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for insertion of OT-1 peptide to loop of ferritin <400> 18 agctagcgac agtcctcaaa tattgttcat gcttgataag g 41 <210> 19 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for insertion of OT-1 peptide to loop of ferritin <400> 19 agctagccag tttctcaaag ttaataatgc tcttggcaaa ctttaacttg tccagtattt 60 tctttacg 68 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for insertion of OT-2 peptide to loop of ferritin <400> 20 agctagcgac agtcctcaaa tattgttcat gcttgataag g 41 <210> 21 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for insertion of OT-2 peptide to loop of ferritin <400> 21 agctagcgcg tcctgcctca tttatctcat gcgccgcatg gaccgcctga cttatcttgg 60 caaactttaa cttgtccagt attttcttta cg 92

Claims (20)

  1. 항원 펩타이드로서 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 난알부민(ovalbumin) 단백질의 OT-1 펩타이드 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 난알부민(ovalbumin) 단백질의 OT-2 펩타이드; 및 페리틴이 융합된 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 OT-1 또는 OT-2 펩타이드가 나노입자의 내부 또는 외부 표면에 위치하는 것인, 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 7, 9, 11 또는 13의 아미노산 서열로 이루어진 융합단백질인, 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 항원 펩타이드 및 페리틴 사이에 링커를 더욱 포함하는 것인, 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 각 융합단백질 단량체에 포함된 페리틴은 서로 동종 또는 이종인 것인, 나노입자.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 상기 융합단백질 단량체 24개의 자가조립에 의해 형성된 것인, 나노입자.
  10. 항원 펩타이드로서 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 난알부민(ovalbumin) 단백질의 OT-1 펩타이드 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 난알부민(ovalbumin) 단백질의 OT-2 펩타이드; 및 페리틴이 융합된 융합단백질로서,
    상기 융합단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 융합단백질은 항원 펩타이드 및 페리틴 사이에 링커를 더욱 포함하는 것인, 융합단백질.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합단백질을 암호화하는 핵산.
  16. 제15항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  17. 제15항의 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
  18. 제15항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제작하는 단계; 및 상기 형질전환체로부터 융합단백질을 발현시키는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 단량체 24개가 자가조립되어 형성되는, 나노입자를 제조하는 방법으로서,
    상기 융합단백질은
    항원 펩타이드로서 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 난알부민(ovalbumin) 단백질의 OT-1 펩타이드 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 난알부민(ovalbumin) 단백질의 OT-2 펩타이드; 및 페리틴이 융합된 융합단백질로서, 상기 융합단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것인,
    나노입자를 제조하는 방법.
  19. 삭제
  20. 제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는, 면역 증강용 백신 조성물.
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