KR102001289B1 - 산화아연 결합 펩티드 서열, 이를 포함하는 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산화아연 결합 펩티드 서열, 이를 포함하는 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 하기 식 1의 아미노산 서열을 포함하는 산화아연 결합 펩티드 서열, 이를 포함하는 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다:
<식 1>
X1X2X3X4L5
상기 식 1 중,
X1은 F, W, G 또는 A이고,
X2는 P, Q, V, F 또는 Y이며,
X3는 Y, F, I 또는 L이고,
X4는 P 또는 D이고,
L5는 링커 아미노산 서열이다.
본 발명에 따르면, 산화아연으로 구성된 물질에 대해서 높은 친화성을 나타내는 펩티드 서열을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩티드는 그 결합력이 기존에 보고된 펩티드들에 비해서 상대적으로 높은 수치를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드를 활용하면 단백질을 포함하는 다양한 생체 분자들을 산화아연으로 구성된 물질과 용이하게 결합시킬 수 있고, 이를 통해서 산화아연으로 구성된 물질의 기능성을 높임으로써 다양한 분야에 활용할 수 있다. 특히, 최근 산화아연의 활용가능성이 증가하고 있는 소재, 나노 기술 및 영상, 진단, 신약 개발 관련 의약학 분야에 광범위하게 적용될 수 있다.

Description

산화아연 결합 펩티드 서열, 이를 포함하는 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 약학 조성물 {Zinc oxide binding peptide, complex comprising the peptide, and pharmaceutical composition comprising the complex}
본 발명은 산화아연 나노입자에 대해서 우수한 결합력을 나타내는 펩티드 및 그 응용에 관한 것이다.
생체적합성 나노물질들은 면역계에 면역 조절 효과를 발휘하며, 이에 가공된 나노물질들이 감염 및 암에 대한 백신을 개발하는데 있어서 유망한 아쥬반트 (adjuvant) 및/또는 캐리어 (carrier) 시스템으로 여겨지고 있다. 그 중에서도, 산화아연 (Zinc oxide, ZnO) 나노입자들 (ZNPs)은 생체적합성이 우수하고 제조비용이 저렴하기 때문에 식품 첨가제, UV-차단제, 및 항미생물 물질 등의 용도로 널리 적용되어 왔다. 더 나아가, ZNPs는 생체 영상화 및 약물 전달 등과 같은 생의학적 적용에 있어서도 유망한 가능성을 보여준다.
이에, ZNPs의 적용가능성을 확대하기 위해서, 무기 물질의 표면에 결합이 가능한 펩타이드들의 특성에 대한 연구가 다양하게 이루어져 왔으며, 이에 따라 ZNPs에 대해서 높은 친화도를 나타내는 몇몇 종류의 펩타이드들이 보고된 바도 있다 (비특허문헌 1 내지 5). 공유결합성 링커 표면 개질과는 달리, 펩타이드들은 나노물질들과 결합함에 있어서 고친화성 비공유결합을 활용하며, 따라서 ZNPs의 관능화를 위한 과정이 간단해질 수 있다.
한편, 최근에는, 무기 나노입자들에 전신적 노출이 이루어진 이후에는, 면역 세포들 및 기관들이 주된 축적 위치임이 밝혀진 바 있으며, 축적된 나노입자들은 내생적 및 적응적 면역 세포들에 대해서 염증성 또는 면역 조절성 효과들을 중개하는 것으로 알려진 바 있다. 또한, 최근에 발표된 본 발명자들에 의한 연구에서도 (비특허문헌 6), 산화철 (Fe3O4)-산화아연 (ZnO) 코어-쉘 나노입자들이 피하주사된 마우스들에서도 대식세포 침윤의 형태로 외부 신체 반응이 야기되지만, 200 mg kg-1까지는 어떠한 전신적 분포 또는 독성도 나타나지 않음이 보고된 바 있다.
그럼에도 불구하고, ZNPs 노출은 주사 부위에서 강한 국부적 염증을 야기할 수 있으며, 이러한 사실이, 특이적 단백질 항원과 조합되는 경우, T 세포 반응뿐만 아니라 항체들을 포함하는 항원-특이적 적응적 면역 반응들이 발생되는 점과 관련될 수 있다. 비록, ZNPs가 어떻게 면역계를 자극하는지, 또한 공동-투여된 항원에 대해서 특이적 면역성을 발생시키는데 어떻게 기여하는지에 대한 상세한 면역 메카니즘에 대해서는 아직 연구의 여지가 남아 있지만, ZNPs의 주사에 의해서 유도된 염증 반응들이 항원-특이적 적응 면역성에 의해서 보충되는 사항과 연결된다는 점은 흥미로운 사실이다.
관련해서, 단백질 또는 펩티드의 조절 방출을 위해서, 생분해 가능한 중합체 매트릭스에 산화아연 등의 난용성 생체 적합 인자와 단백질을 분산시켜 운반체로 사용하는 기술로서, 산화아연 나노입자의 생체내 활용을 통해서 약물 담체 또는 생체 영상화 등의 용도로 사용하고자 한 기술이 개시된 바 있다 (특허문헌 1).
이에, 산화아연에 대해서 우수한 결합력을 가짐으로써 산화아연을 이용한 약물전달, 진단, 센서 및 면역 보강제 개발 등의 용도를 위해서 신규 펩티드 서열의 개발이 요구되고 있다.
특허문헌 1: 미국특허공개공보 US2002/0015737A1
비특허문헌 1: Golec P, Karczewska-Golec J, Los M, Wegrzyn G. Novel ZnO-binding peptides obtained by the screening of a phage display peptide library. J Nanopart Res. 2012;14(11):1218. 비특허문헌 2: Thai CK, Dai H, Sastry MS, Sarikaya M, Schwartz DT, Baneyx F. Identification and characterization of Cu(2)O- and ZnO-binding polypeptides by Escherichia coli cell surface display: toward an understanding of metal oxide binding. Biotechnol Bioeng. 2004;87(2):129-37. 비특허문헌 3: Okochi M, Ogawa M, Kaga C, Sugita T, Tomita Y, Kato R, et al. Screening of peptides with a high affinity for ZnO using spot-synthesized peptide arrays and computational analysis. Acta Biomater. 2010;6(6):2301-6. 비특허문헌 4: Kjaergaard K, Sorensen JK, Schembri MA, Klemm P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl Environ Microbiol. 2000;66(1):10-4. 비특허문헌 5: Yokoo N, Togashi T, Umetsu M, Tsumoto K, Hattori T, Nakanishi T, et al. Direct and selective immobilization of proteins by means of an inorganic material-binding peptide: discussion on functionalization in the elongation to material-binding peptide. J Phys Chem B. 2010;114(1):480-6. 비특허문헌 6: Yun JW, Yoon JH, Kang BC, Cho NH, Seok SH, Min SK, et al. The toxicity and distribution of iron oxide-zinc oxide core-shell nanoparticles in C57BL/6 mice after repeated subcutaneous administration. J Appl Toxicol. 2015;35(6):593-602.
본 발명에서는 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자, 산화아연에 대해서 높은 친화도를 나타내는 펩티드 서열을 개발하기 위해서, 랜덤 펩티드 라이브러리를 활용 및 분석하여 최적의 펩티드 서열을 제공하고자 하였으며, 제조된 펩티드 서열을 사용하여 산화아연 및 생체 물질과 복합체를 제조함으로써, 약물 전달 복합체, 질병 진단 및 영상화제, 및 백신 등으로 적용이 가능한 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 하기 식 1의 아미노산 서열을 포함하는 산화아연 결합 펩티드 서열을 제공한다:
<식 1>
X1X2X3X4L5
상기 식 1 중,
X1은 F, W, G 또는 A이고,
X2는 P, Q, V, F 또는 Y이며,
X3는 Y, F, I 또는 L이고,
X4는 P 또는 D이고,
L5는 링커 아미노산 서열이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산화아연 결합 펩티드 서열은 8개 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 링커 서열은 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다:
<서열번호 1>
GGDA.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 산화아연 결합 펩티드 서열은 하기 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 서열일 수 있다:
<서열번호 2>
FPYPGGDA
<서열번호 3>
FPYDGGDA.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 식 1의 산화아연 결합 펩티드 서열은 2 내지 10회 반복될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 식 1의 산화아연 결합 펩티드 서열에는 화학적 또는 유전공학적으로 융합 (fusion) 또는 접합 (conjugation)된 유기물 또는 무기물이 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 식 1의 산화아연 결합 펩티드 서열 중 C-말단에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)가 결합될 수 있다.
본 발명은 상기 다른 과제를 해결하기 위해서,
산화아연 나노입자; 및
상기 산화아연 나노입자의 표면에 결합된 상기 산화아연 결합 펩티드 서열을 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산화아연 결합 펩티드는 상기 산화아연 나노입자의 표면에 비공유결합을 통해서 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 산화아연 나노입자의 평균 직경은 5.48 ± 0.75 nm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 산화아연 나노입자와 상기 산화아연 결합 펩티드의 결합 친화도 (K a 수치)는 2.26 × 106 M-1 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 또 다른 과제를 해결하기 위해서,
상기 복합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 단백질, DNA, RNA, 의약 화합물, 질병 진단 및 영상화제, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 약물은 상기 복합체 중 상기 산화아연 결합 펩티드 서열과 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 항원은 ScaA 항원일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물은 약물 전달 복합체 조성물, 질병 진단 및 영상화제 조성물, 또는 백신 조성물일 수 있다.
본 발명에 따르면, 산화아연으로 구성된 물질에 대해서 높은 친화성을 나타내는 펩티드 서열을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩티드는 그 결합력이 기존에 보고된 펩티드들에 비해서 상대적으로 높은 수치를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드를 활용하면 단백질을 포함하는 다양한 생체 분자들을 산화아연으로 구성된 물질과 용이하게 결합시킬 수 있고, 이를 통해서 산화아연으로 구성된 물질의 기능성을 높임으로써 다양한 분야에 활용할 수 있다. 특히, 최근 산화아연의 활용가능성이 증가하고 있는 소재, 나노 기술 및 영상, 진단, 신약 개발 관련 의약학 분야에 광범위하게 적용될 수 있다.
도 1은 산화아연 나노입자 (ZNP)를 특성화한 결과를 도시한 도면으로서, 단분산된 구형 ZNPs의 TEM 영상 (1a), ZNPs의 가우시안 크기 분포 (1b), 및 UV 및 가시 발광을 나타내는 ZNPs의 발광 스펙트럼 (1c)을 도시한 도면이다.
도 2는 고친화성 ZNP-결합 펩티드에 대한 스크리닝 및 특성화를 도시한 도면으로서, 질량 스펙트로메트리에 의해서 ZNP에 결합된 펩티드들의 표시된 위치들 (P1 ~ P4)에서 아미노산 서열들을 도시한 그래프 (2a), FITC로 표지된 선택된 펩티드들의 상대적 친화도를 ZNP-펩티드 복합체들의 형광 강도를 측정함으로써 분석한 결과를 나타낸 그래프 (2b) (오차 막대, 평균 ± 표준편차), 및 등온 적정 열량곡선 (ITC)에 의해서 ZBP인 FPYDGGDA 서열과 ZNP와의 상호작용을 검출한 그래프 (2c)이다.
도 3은 ZNP/ZBP의 복합체 형성과 수지상 세포로의 전달을 도시한 도면으로서, ZNP-펩티드 복합체의 형광 강도를 측정함으로써 1 x ZBP 및 3 x ZBP의 상대적 친화도를 분석한 그래프 (3a) (50 ㎍의 ZNPs를 지시된 펩티드 양과 함께 배양하고, 복합체의 형광 강도를 PBS로 세척한 다음에 측정), 3 x ZBP와의 융합 또는 미융합 조건 하에서 ZNPs 및 ScaA와 함께 배양한 후, ZNP-결합 (P, 펠렛) 또는 미결합 (S, 상등액)된 상대적 분율을 도시한 겔 전기영동 데이터 (3b) (단백질 밴드들 (P 및 S)의 상대적 강도는 하단에 표시), 및 DC2.4 세포들을 ZNP 및 3 x ZBP-FITC 복합체와 함께 배양한 후, 형광 현미경에 의해서 ZNP/ZBP 복합체가 수지상 세포 내로 전달되는 것을 분석한 그래프이다 (3c) (리소좀 (적색)은 항-LAMP2 항체로 염색, DIC (differential interference contrast)는 차등 간섭 대비를 의미).
도 4는 ScaA 특이적 면역 반응의 유도를 도시한 도면으로서, 면역화된 마우스들에서 항체 반응들을 관찰한 그래프 (4a) (마우스들은 ZNP, ZBP-ScaA, ZNP/ScaA, NP/ZBP-ScaA, 또는 Alum/ZBP-ScaA (n = 3/군)로 2회 면역화시켰으며, 혈청 중 항-ScaA IgG1 및 IgG2C의 수준을 면역화 이후 1주일 경과 시점에서 ELISA로 측정. 항체 역가는 102,400까지 분석), 도 4a에서와 같이 2차 면역화 이후 1주일 경과 시점에서 ScaA 항원으로 자극된 지라세포들에서 IFN-γ-양성 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들을 검출한 도면 (4b) (FACS 분석에 의해서 얻어진 대표 점 얼룩들을 도시), 및 면역화된 마우스들로부터의 지라세포들 중 IFN-γ-양성 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들에 대한 3회의 독립적인 실험들의 평균 백분율을 도시한 도면이다 (오차 막대, 평균 ± 표준편차).
도 5는 ZNP/ZBP-ScaA 면역화된 마우스들의 증가된 생존률을 도시한 그래프이다 (마우스들 (n = 5/군)은 ZNP, ZBP-ScaA, ZNP/ScaA, ZNP/ZBP-ScaA, 및 Alum/ZBP-ScaA를 사용하여 2주 간격으로 3회 면역화하였다. 마지막 면역화 이후 1주일 경과 시점에서, 마우스들에 100 x LD50의 O. tsutsugamushi로 감염시켰다. 생존률은 모든 생존 마우스들이 질병으로부터 회복될 때까지 모니터링하였다. *, p < 0.05; **, p < 0.01).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라서 본 발명에 따른 산화아연 나노입자, 산화아연 나노입자 결합 펩티드 서열, 및 그 복합체를 제조한 다음, 쯔쯔가무시 백신을 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명에서는 산화아연에 대해서 높은 친화성을 나타내는 펩티드 서열을 개발한 다음, 상기 펩티드 서열을 산화아연 나노입자와 복합체를 형성하여 이를 의약적으로 이용하는 기술을 제공하고자 하였다. 본 발명에 따라서 개발된 펩티드 서열은 기존 문헌에 보고된 펩티드들에 비해서 산화아연 나노입자에 대해서 높은 친화도를 나타내고, 상기 펩티드와 산화아연과의 복합체를 항원 등의 생체 물질과 결합하여 약학 조성물을 제조하는 경우, 더욱 강력한 항체 반응과 같은 약학적 효과를 거둘 수 있었다.
이에, 본 발명에서는 하기 식 1의 아미노산 서열을 포함하는 산화아연 결합 펩티드 서열을 제공한다:
<식 1>
X1X2X3X4L5
상기 식 1 중,
X1은 F, W, G 또는 A이고,
X2는 P, Q, V, F 또는 Y이며,
X3는 Y, F, I 또는 L이고,
X4는 P 또는 D이고,
L5는 링커 아미노산 서열이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산화아연 결합 펩티드 서열은 8개 아미노산으로 구성된 8-mer 펩티드 서열일 수 있으며, 산화아연에 높은 친화도를 나타내는 X1X2X3X4, 4개의 아미노산으로 이루어진 서열에 링커 서열로서 L5가 연결된 구조를 갖는다. 이때, 상기 링커 서열은 본 발명에 따른 펩티드 서열에 유연성 (flexibility)을 부여할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용가능하며 예를 들어 하기 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다:
<서열번호 1>
GGDA.
일 예로서, 본 발명에 따른 산화아연 결합 펩티드 서열은 하기 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 8-mer 펩티드 서열일 수 있다:
<서열번호 2>
FPYPGGDA
<서열번호 3>
FPYDGGDA.
또한, 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 1회 포함하는 펩티드에 비해서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 복수회 포함하는 펩티드 서열이 산화아연에 대해서 더욱 우수한 친화도를 나타내는 바, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 2 내지 10회 반복될 수 있다.
한편, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 C-말단 또는 N-말단에는 화학적 또는 유전공학적으로 융합 (fusion) 또는 접합 (conjugation)된 유기물 또는 무기물이 포함될 수 있으며, 예를 들어 C-말단에 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)를 결합시키는 경우, 형광 강도 측정을 통한 펩티드의 정량이 가능하다.
또한, 본 발명은,
산화아연 나노입자; 및
상기 산화아연 나노입자의 표면에 결합된 상기 산화아연 결합 펩티드 서열을 포함하는 복합체를 제공한다.
상기 본 발명에 따른 복합체는 다양한 생체 물질, 약물, 화합물 등의 표적 물질을 생체 내 표적 부위로 전달하는 유용한 캐리어로 기능할 수 있으며, 이때 상기 산화아연 결합 펩티드는 상기 산화아연 나노입자의 표면에 비공유결합을 통해서 결합될 수 있고, 복합체 중 산화아연 나노입자의 평균 직경은 5.48 ± 0.75 nm일 수 있다. 후술하는 바와 같이, 본 발명에 따른 복합체를 구성하는 상기 산화아연 나노입자와 상기 산화아연 결합 펩티드는 매우 우수한 친화도를 가지고 결합하는 바, 예를 들어 그 결합 친화도 (K a 수치)는 2.26 × 106 M-1 이상으로서, 이는 기존에 보고된 산화아연 결합 펩티드들의 해당 수치보다 매우 높은 수치이다.
따라서, 본 발명에서는 상기 복합체를, 다양한 생체 물질, 약물, 화합물 등의 표적 물질을 생체 내 표적 부위로 전달하는 용도로 적용할 수 있는바,
본 발명에서는, 상기 복합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물 중 상기 복합체를 통해서 생체 내로 전달되는 표적 물질로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질, DNA, RNA, 의약 화합물, 질병 진단 및 영상화제, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 다양한 약물이 포함될 수 있고, 이러한 약물은 상기 복합체 중 상기 산화아연 결합 펩티드 서열과 결합하게 된다. 예를 들어, 하기 실시예에 서술된 바와 같이 상기 약물로서 ScaA 항원을 사용하게 되는 경우, 우수한 효능을 갖는 쯔쯔가무시 백신 조성물을 제공할 수 있다. 그러나, 이러한 백신 조성물로서의 응용 이외에도, 본 발명에 따른 조성물은 다양한 약물 전달 복합체 조성물, 질병 진단 및 영상화제 조성물로서도 적용이 가능하다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 도 6에는 하기 실시예의 개략적인 과정을 도시하였으며, 특히, 하기 실시예에서는 산화아연 나노입자를 제조하고, 이를 산화아연 결합 펩티드 서열과 결합시켜 복합체를 형성한 다음, 쯔쯔가무시 백신을 제조하는 실험을 예로 들어 설명하였으나, 본 발명의 범위가 이러한 쯔쯔가무시 백신 제조에만 국한되는 것은 아니며, 전술한 바와 같이 산화아연 나노입자의 다양한 적용범위를 고려할 때, 본 발명에 따른 산화아연 결합 펩티드 서열 및 산화아연 나노입자와 상기 펩티드 서열의 복합체를 활용하여 다양한 약물 전달 복합체 조성물, 질병 진단 및 영상화제 조성물, 또는 쯔쯔가무시 백신 이외의 다른 백신 조성물을 제조할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 지닌 자라면 용이하게 파악할 수 있을 것이다.
실험
하기 모든 동물 실험들은 서울대학교 병원 기관 동물 보호 및 사용 위원회에 의해서 승인을 받았으며 (SNUH IACUC No.12-0331-C1A03), 실험실 동물들의 보호 및 사용을 위한 국립 가이드라인에 따른 권고사항을 엄격하게 준수하며 수행하였다.
산화아연 나노입자의 합성
산화아연 나노입자들 (ZNPs)은 50 mM의 Zn(NO3)·6H2O 및 12 mM의 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)를 함유하는 에탄올 용액을 사용하여 합성하였다. 1 시간 동안 교반한 후에, 에탄올 중 0.1 M NaOH 용액을 동일 부피로 주사하였다. 다시 한번 1 시간 동안 교반한 후에, 혼합 용액을 초음파처리기 및 원심분리기를 사용하여 에탄올로 수차례 세척하였다. 결과물인 ZNPs를 에탄올 중에 분산시켰다.
산화아연 결합 펩티드의 스크리닝
랜덤 8-mer 펩티드들은 펩티드 합성 기관에 의뢰하여 합성하였다 (Peptron). 실온에서 100 ㎍의 펩티드를 1 mg의 ZNPs와 함께 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 펩티드-ZNP 복합체들을 인산완충식염수 (PBS)로 5회 세척하고, 결합된 펩티드들을 25% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해서 분리하였다. 겔 상의 펩티드 서열들은 Procise 494 automated protein sequencer (Applied Biosystems)를 사용하여 Edman sequencing에 의해서 분석하였다.
ZBP 결합 분석
ZNPs에 대한 ZBPs의 상대 친화도를 측정하기 위해서, 카르복실 말단에 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지된 펩티드들을 사용하였다. 다른 농도의 FITC-태그된 1 × 또는 3 ×ZBPs를 50 ㎍의 ZNPs와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. ZBP-ZNP 복합체들은 PBS 중에서 5회 세척하고, 100 μl의 PBS 중에 재현탁시킨 다음, 96웰 블랙 플레이트로 옮겨서 Infinite®M200 PRO (Taken Switzerland)를 사용하여 형광 강도 측정을 수행하였다. ZBP-ScaA 결합 분석의 경우, 정제된 3×ZBP-ScaA 또는 ScaA 단백질들을 ZNPs와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. ZNPs 상에 결합된 단백질들을 원심분리에 의해서 수집하고, SDS-PAGE 이후에 쿠마시 블루 염색에 의해서 정량하였다.
등온 적정 열량측정법
ZBP와 ZNPs 사이의 친화도는 등온 적정 열량측정법 (isothermal titration calorimetry, ITC)에 의해서 측정하였다. ITC는 Origin 소프트웨어 및 VPViewer2000을 구비한 MicroCal VP-ITC Microcalorimeter (MicroCal Inc.)를 사용하여 수행하였다. 적정은 30개 연속적인 10 μl의 ZBP 펩타이드 (0.2 mM) 분획을, 나노입자들 (1 μM)을 함유하는 ITC 세포 (부피 = 1.4301 ml) 내로 주사함으로써 수행하였다. 적정 실험들은 25 ℃에서 수행함으로써 나노입자에 대한 ZBPs의 결합 상수를 측정하였다. ITC 데이터는 ZBPs 10 μl를 나노입자가 존재하지 않는 용액에 주사한 혼합 엔탈피를 차감함으로써 적정액의 희석 열에 대한 보정을 수행하였다. 결합 화학양론, 엔탈피, 엔트로피 및 평형 결합 상수는 보정된 데이터를 생분자 (결합 사이트의 일 타입) 상호반응 모델 (Microcal Origin software version 7.0)에 대해서 수정함으로써 측정하였다.
재조합 ScaA 항원의 제조
기존 문헌에 보고된 바와 같이, ScaA88 - 3000 단백질 (GenBank accession no. AM494475.1)을 E. coli로부터 정제하였다 (Ha NY, Sharma P, Kim G, Kim Y, Min CK, Choi MS, et al. Immunization with an Autotransporter Protein of Orientia tsutsugamushi Provides Protective Immunity against Scrub Typhus. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9(3):e0003585). 재조합 ZBP-ScaA 단백질을 제조하기 위해서, 3 ×ZBP (FPYDGGDAFPYDGGDAFPYDGGDA)를 암호화하는 어닐링된 이중 가닥 DNA (5'- GATCCTTTCCGTATGATGGCGGCGATGCGTTTCCG TATGATGGCG GCGATGCGTTTCCGTATGATGGCGGCGATGCGG-3`, BamHI 및 EcoRI 부위는 밑줄로 표시)를, BamHI 및 EcoRI로 절단한 후, pET28a-ScaA 플라스미드 (Ha NY, Sharma P, Kim G, Kim Y, Min CK, Choi MS, et al. Immunization with an Autotransporter Protein of Orientia tsutsugamushi Provides Protective Immunity against Scrub Typhus. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9(3):e0003585) 내로 클로닝하였다. 재조합 단백질은 또한 기존에 보고된 방법에 따라서 E. coli로부터 제조 및 정제하였다. 상기 정제된 단백질은 사용 이전에 엔도톡신 제거 컬럼 (Pierce)으로 처리하였다. 정제된 단백질들이 엔도톡신으로 오염되어 있는지 여부는 QCI-1000® End-Point Chromogenic Endotoxin Detection kit (Lonza)를 사용하여 검사하였으며, 20 E.U./ml 미만이었다.
오리엔티아 쯔쯔가무시 ( Orientia tsutsugamushi )의 제조
O. tsutsugamushi Boryong 균주를 변형된 Percoll 농도 구배 정제 방법을 사용하여 정제하였다 (Ha NY, Cho NH, Kim YS, Choi MS, Kim IS. An autotransporter protein from Orientia tsutsugamushi mediates adherence to nonphagocytic host cells. Infect immun. 2011;79(4):1718-27). O . tsutsugamushi를 L929 세포 중에서 증식하였다. 감염 후 3 내지 4일 시점에서, 간접 면역형광 분석법을 사용하여 감염도를 측정하였다. 감염율이 > 90%에 도달하였을 때, 세포들을 6,000 ×g로 20분 동안 원심분리하여 수득하였다. 세포 펠렛을 Tris-sucrose (TS) 완충용액 (33 mM Tris-Cl (pH 7.4) 및 0.25 M sucrose)에 재현탁시키고, Polytron 균질기 (Wheaton Inc.) 100 스트로크를 사용하여 균질화한 다음, 200 ×g로 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 TS 완충용액 중의 40% Percoll (Pharmacia Fine Chemicals)과 혼합하고, 25,000 ×g로 60분 동안 원심분리하였다. 박테리아 밴드를 수집하고, 77,000 ×g로 30분 동안 원심분리하였다. 박테리아 펠렛을 TS 완충용액 중에서 3회 세척하고, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 중에 재현탁시킨 다음, 사용하기 전까지 액체 질소 중에 보관하였다. 접종물의 감염 역가는 기존에 보고된 바에 따라서 측정하였다 (Ha NY, Cho NH, Kim YS, Choi MS, Kim IS. An autotransporter protein from Orientia tsutsugamushi mediates adherence to nonphagocytic host cells. Infect immun. 2011;79(4):1718-27).
마우스 면역화 및 발병
6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (Orient Bio Inc)를, 2주 간격으로 피하주사를 통해서 면역화 (n = 5/group)시켰다. 면역화 이전에 20 μg의 ScaA 또는 ZBP-ScaA 단백질을 실온에서 1 시간 동안 100 μg의 ZNPs와 함께 접종하였다. 대조군 면역화는 ScaA 단독 또는 2% Alhydrogel 아쥬반트 (Invitrogen)를 사용하여 아쥬반트:단백질 용액 부피 비율이 1:1이 되도록 하여 수행하였다. 혈액 샘플들을 각 주사 후 일주일 경과 시점에서 레트로-오비탈 주사 (retro-orbital puncture)를 사용하여 수집하고, 혈장 항체 역가를 측정하기 위해서 사용하였다. 최종 면역화 일주일 후에, 마우스들을 복강내 주사로 10 × LD50의 O. tsutsugamushi Boryong 균주로 감염시켰다.
통계적 분석
데이터는 Graph Pad Prism 5.01 software (GraphPad Software) 및 SigmaPlot (Jandel)을 사용하여 분석하였다. 통계적 분석은 95% 신뢰 구간으로 양방 Student's t-test를 사용하거나, 또는 One-way ANOVA를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 생존률에 대한 통계적 분석은 Mantel-Cox Log Rank 테스트를 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 p-수치를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
결과
ZnO 나노입자의 제조
제조된 ZNPs의 모폴로지 및 입자 크기는 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해서 관찰하였다 (도 1a). ZNPs는 거의 구형의 모양을 나타내었다. ZNPs의 크기는 가우시안 분포를 나타내었고, 평균 및 표준편차가 5.48 ± 0.75 nm였다 (도 1b). 여기 파장 330 nm 하에서 ZNPs의 발광 스펙트럼은 ~380 nm에서 주된 피크를 나타내었는 바, 이는 ZnO 밴드갭 (3.3 eV)의 예상된 발광 파장이며, 470 nm에서 부가적인 넓은 가시 발광을 나타내었는 바, 이는 표면 및 결함 발광과 관련된 것이다 (도 1c).
신규 ZnO -결합 펩티드의 선정
ZNP를 항원 캐리어로서 사용하기 위해서, 본 발명에서는 먼저 랜덤 8-mer 펩티드 라이브러리로부터 ZBPs를 스크리닝하였고, ZNP에 대한 그 친화도를 검사하였다. 3회의 스크리닝 이후에, 선택된 ZBPs의 아미노산 서열을 질량 스펙트로메트리에 의해서 결정하고, 아미노 말단들로부터 각 위치에서 (P1 ~ P4) 아미노산들의 검출 빈도를 도 2a에 도시하였다. 상기 검출 빈도 데이터를 기반으로, 본 발명에서는 ZNP에 대한 친화도를 측정하기 위해서 추가 분석을 위한 8개 펩티드 후보 물질들을 합성하였다. 상기 합성된 펩티드들은 선택된 아미노산들 및 유연성을 부여하기 위한 링커 (GGDA)로 구성된다 (하기 표 1 참조).
Figure 112016099282696-pat00001
선택된 펩티드들의 ZNPs에 대한 상대적 친화도는 FITC-표지된 펩티드들을 사용한 결합 분석법 이후에 488 nm에서의 형광 강도를 측정함으로써 비교하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 검사된 8개 펩티드들 중에서도 FPYPGGDA 및 FPYDGGDA 서열을 갖는 두 가지 펩티드들이 ZnO 나노입자들에 대해서 가장 높은 친화도를 나타내었다. 등온 적정 열량측정에 의해서 측정된 ZBP, FPYDGGDA의 ZNP에 대한 친화도는 2.26 × 106 M-1의 K a 수치를 나타내었다 (도 2c 참조). 이러한 수치는 기존에 보고된 바 있는 RPHRKGGDA (K a = 6.9 × 105 M-1) 보다 높은 것이며 (Cho NH, Cheong TC, Min JH, Wu JH, Lee SJ, Kim D, et al. A multifunctional core-shell nanoparticle for dendritic cell-based cancer immunotherapy. Nat Nanotechnol. 2011;6(10):675-82), EAHVMHKVAPRP (K a ≤ 5.9 × 106 M- 1)의 수치에 필적하는 것이다 (Yokoo N, Togashi T, Umetsu M, Tsumoto K, Hattori T, Nakanishi T, et al. Direct and selective immobilization of proteins by means of an inorganic material-binding peptide: discussion on functionalization in the elongation to material-binding peptide. J Phys Chem B. 2010;114(1):480-6).
이러한 신규 ZBP의 결합 상수는 강한 무기 결합체들의 수치와 비교할 만한 것으로서, 이러한 무기 결합체들은 1 × 104 내지 1 × 108 M-1의 K a 수치들을 갖는다 (Seker UO, Demir HV. Material binding peptides for nanotechnology. Molecules. 2011;16(2):1426-51). 펩티드의 ZnO에 대한 결합 친화도를 더욱 향상시키기 위해서, 본 발명에서는 펩티드의 삼중 탠덤 반복을 제조하였다 (3×ZBP). 상기 3×ZBP는 1×ZBP에 비해서 ZNP에 대해서 향상된 결합 특성을 나타내었다 (도 3a). 각각 펩티드의 결합은 50 ㎍의 ZNPs에 대해서, 1×ZBP의 경우 ~ 16 nmol에서 포화되었고, 3×ZBP의 경우 ~ 32 nmol에서 포화되었으며, 나노입자 1 ㎍ 당 0.32 ~ 0.64 nmol의 펩티드가 결합하였다. 다음으로, 본 발명에서는 쯔쯔가무시 백신 연구를 위해서 3×ZBP와 융합된 ScaA 항원을 제조하였다. 예상한 대로, 3×ZBP를 재조합 단백질에 부가함으로써 3×ZBP가 없는 ScaA에 비해서 ZNPs에 대한 ScaA의 결합이 ~ 2.5배 증가하였다 (도 3b). 마지막으로, FITC로 표지된 3×ZBP로 코팅된 ZNP의 세포내 전달을 조사하였다. 그 결과, 본 발명자들의 이전 연구와 부합되게 (Cho NH, Cheong TC, Min JH, Wu JH, Lee SJ, Kim D, et al. A multifunctional core-shell nanoparticle for dendritic cell-based cancer immunotherapy. Nat Nanotechnol. 2011;6(10):675-82), ZNPs 상에 고정된 3×ZBP가 DC2.4 세포들의 세포질 내로 효과적으로 전달되었으며, 주로 리소좀에 위치하는 펩티드 응집체를 형성하였으며 (도 3c), 이는 펩티드-ZNP 복합체들이 식세포작용을 통해서 내부로 포함되었다는 것을 의미한다.
O. tsutsugamushi 감염에 대한 보호성 면역 반응
오브알부민 (OVA) 항원과 복합체화된 ZNPs에 전신적으로 노출되는 경우, OVA-특이적 항체 및 T 세포를 포함하는 항원-특이적 면역 반응이 강화될 수 있기 때문에 (Roy R, Kumar S, Verma AK, Sharma A, Chaudhari BP, Tripathi A, et al. Zinc oxide nanoparticles provide an adjuvant effect to ovalbumin via a Th2 response in Balb/c mice. Int Immunol. 2014;26(3):159-72), 본 발명에서는 ZNPs 상에 고정된 ScaA 항원으로 면역화된 마우스에서 체액성 면역 반응들을 측정하였다. 일차 및 이차 면역화 후 일주일 경과 시점에서, ScaA-특이적 항체들을 검사하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, ZNP 또는 ZBP-ScaA-처리된 마우스에 비해서, ZNP/ZBP-ScaA로 면역화된 마우스에서 혈청 중 항-ScaA IgG1 및 IgG2C 항체들이 현저하게 증가하였다. 또한, ZNP/ScaA 군에 비해서 ZNP/ZBP-ScaA 마우스 군의 항체 반응들이 현저하게 증가하였다는 점을 주목할 필요가 있는 바, 이는 ZBP를 통해서 ZBP-ScaA가 ZNPs에 대한 결합이 월등하게 증가함으로써, 항원-특이적 체액성 면역 반응을 증가시킨다는 것을 의미한다. 더 나아가, ZNP/ZBP-ScaA 마우스 군의 ScaA-특이적 항체들의 수준은 통상적인 아쥬반트인 Alum (Alum/ZBP-ScaA)로 면역화된 마우스들의 수준에 필적하는 것이었다. ZNP/ZBP-ScaA 복합체의 면역화가 세포-매개 면역반응을 유도할 수 있는지도 조사하기 위해서, 항원-의존적 방식으로 IFN-γ의 생산을 측정함으로써 T 세포 반응들을 조사하였다 (도 4b 및 4c). NP/ZBP-ScaA-면역화된 마우스의 비장에서 IFN-γ-분비 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들의 빈도는, 비면역화된 군 (ZNP)과 비교할 때, 각각 대략 6배 또는 4배 정도로 현저하게 증가하였다. 이와는 대조적으로, 다른 대조군들 (ZBP-ScaA 또는 ZNP/ScaA)의 비장으로부터 CD4+ 또는 CD8+ T 세포들에서는 항원 자극에 의해서도 IFN-γ 분비가 그다지 증가하지 않았다. ZNP/ScaA 군으로부터의 CD4+ T 세포들에 의한 IFN-γ 생산에 있어서 약간의 증가 (약 2배)가 관찰될 뿐이었다. 비록 ZNP/ZBP-ScaA 면역화된 마우스들에서 IFN-γ-분비 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 반응들의 상대 빈도가 Alum/ZBP-ScaA 군의 그것보다 더 낮았지만, 이러한 결과들은 ZNP/ZBP-ScaA의 면역화가 인 비보에서 항원-특이적 T 세포 면역 및 체액성 반응들을 유도할 수 있다는 것을 분명히 보여주는 것이다. 마지막으로, O. tsutsugamushi 감염에 대한 ZNP/ZBP-ScaA 면역화의 보호 효과를, 3차 면역화 이후 일주일 경과 시점에서 100 × LD50의 O. tsutsugamushi로 마우스를 감염시킴으로써 인 비보에서 조사하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, Alum/ZBP-ScaA 면역화된 군에서 뿐만 아니라 ZNP/ZBP-ScaA 면역화된 군에서도 박테리아 감염에 대한 보호가 현저한 수준으로 증가하였다. 이와는 대조적으로, ZNP/ScaA 또는 ZBP-ScaA 단독으로 면역화된 마우스에서는 유의미한 보호 특성이 관찰되지 않았다. 따라서, NP와 복합체화된 ZBP-ScaA를 투여함으로써, 아쥬반트계 면역화 (Alum/ZBP-ScaA)에서와 마찬가지로 O. tsutsugamushi 감염에 대한 효과적인 보호 면역 특성을 부여할 수 있다.
검토
가용성 펩티드 및 단백질 항원은 항원-제공 세포들 (antigen-presenting cells, APCs)로 효과적으로 전달이 되지 않고, 낮은 면역 자극 특성으로 인해서 그 단독으로는 일반적으로 면역원성이 약하다. 가용성 항원을 입자화함으로써 항원이 수지상 세포 및 대식세포와 같은 APCs로 전달되는 것을 용이하게 할 수 있고, 그 면역원성을 향상시킬 수 있다. 또한, 효과적인 적응성 면역 반응들을 발생시키기 위해서는 항원들이 APCs로 전달될 때 공동자극성 신호들이 함께 유도되어야 한다.
본 발명에서는, 가용성 항원의 입자화를 위해서 ZBP를 활용함으로써 ZNP의 백신 아쥬반트로서의 적용가능성을 타진해 보았다. 또한, 항원의 ZNPs에 대한 친화도가 향상됨으로써, 복합체로서 전달될 때 더 강한 적응성 면역반응을 유도할 수 있는지 여부를 조사해 보았다.
먼저, 그 표면들에 단백질들을 선택적으로 흡착할 수 있는 나노입자들의 물리적 특성들을 조사함으로써, 가용성 항원들의 입자화된 형태들을 제조하였다. 이전에, ZNP를 포함하는 금속 산화물 나노입자들이 알부민, 면역글로불린, 및 피브리노겐과 같은 복수의 플라즈마 단백질들과 결합한다는 사실이 알려진 바 있다 (Deng ZJ, Mortimer G, Schiller T, Musumeci A, Martin D, Minchin RF. Differential plasma protein binding to metal oxide nanoparticles. Nanotechnol. 2009;20(45):455101). 천연 또는 폴리에틸렌이민-변형된 ZNP에 대한 알부민의 결합 상수 (K a )는 2.6 × 104 내지 7.9 × 104 M-1이다 (Chakraborti S, Joshi P, Chakravarty D, Shanker V, Ansari ZA, Singh SP, et al. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir. 2012;28(30):11142-52). 한편, 본 발명에 따른 신규 ZBP는, 혈청 알부민과 비교할 때, ZNP에 대해서 거의 백배 가까운 향상된 친화도 (K a = 2.3 × 106 M-1)를 나타내었으며, 이러한 친화도는 ZBP 서열에 대한 탠덤 반복서열을 사용함으로써 더욱 증가될 수 있었다 (도 2 및 3 참조). 본 발명자들 역시 기존에 종양 항원을 고친화성 ZBP와 접합시키게 되면, Fe3O4-ZnO 코어-쉘 나노입자들과 복합체를 형성한 이후에, 수지상 세포들 내부로 항원의 세포내 전달이 현저하게 증가될 수 있다는 점을 보고한 바 있다 (Cho NH, Cheong TC, Min JH, Wu JH, Lee SJ, Kim D, et al. A multifunctional core-shell nanoparticle for dendritic cell-based cancer immunotherapy. Nat Nanotechnol. 2011;6(10):675-82). 상기 복합체들은 주로 리소좀 내로 전달되어, 항원들이 APCs에 의해서 T 세포들로 제공될 수 있도록 가공될 수 있다. ZNPs와 복합체를 형성한 ZBP-ScaA 항원들의 수지상 세포주의 리소좀 내로의 세포내 전달 또한 본 발명에서 확인되었다 (도 2c 참조). 본 발명에서 규명된 신규 ZBP 서열 (FPYDGGDA)은 이전에 보고된 ZBP 서열 (RPHRKGGDA)과 비교할 때 더욱 강력하게 ZNPs와 결합하는바, 이를 통해서 ZBP 접합된 항원들이 ZNPs와 복합체를 형성할 때 APCs 내부로 더욱 효과적으로 전달될 수 있다는 점을 예상할 수 있다.
두 번째로, ZNP 자체로서도 APCs에 대해서 면역조절 및/또는 염증 효과를 나타냄으로써, 특이적 면역 반응들을 촉진시킬 수 있다 (Roy R, Das M, Dwivedi PD. Toxicological mode of action of ZnO nanoparticles: Impact on immune cells. Mol Immunol. 2015;63(2):184-92; Saptarshi SR, Duschl A, Lopata AL. Biological reactivity of zinc oxide nanoparticles with mammalian test systems: an overview. Nanomedicine. 2015;10(13):2075-92). ZNP는 APCs에서 활성 산소종 (ROSs), 염증성 시토카인 및 케모카인 (IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α, CXCL-5, CXCL-9, 및 CXCL-10), 및 표면 활성화 마커들 (MHCII, CD1d, CD11c, CD40, CD80, and CD86)을 유도할 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 이러한 내생적 면역 반응들의 유도는 ZNPs가 Toll 유사 수용체 (Toll-like receptors) (TLR4 또는 TLR6)에 의해서 직접적으로 인식됨으로써 초래되거나 (Chen JK, Ho CC, Chang H, Lin JF, Yang CS, Tsai MH, et al. Particulate nature of inhaled zinc oxide nanoparticles determines systemic effects and mechanisms of pulmonary inflammation in mice. Nanotoxicol. 2015;9(1):43-53; Roy R, Singh SK, Das M, Tripathi A, Dwivedi PD. Toll-like receptor 6 mediated inflammatory and functional responses of zinc oxide nanoparticles primed macrophages. Immunol. 2014;142(3):453-64), 또는 붕괴된 세포 아연 항상성으로부터 초래되는 세포내 ROS 발생에 의해서 간접적으로 초래될 수 있다 (Roy R, Das M, Dwivedi PD. Toxicological mode of action of ZnO nanoparticles: Impact on immune cells. Mol Immunol. 2015;63(2):184-92; Saptarshi SR, Duschl A, Lopata AL. Biological reactivity of zinc oxide nanoparticles with mammalian test systems: an overview. Nanomedicine. 2015;10(13):2075-92). 최근에는, 입자상 ZNPs가, 호흡기에 노출되는 경우 TLR4-의존적 방식으로 전신적 염증을 유발하는데 기여할 수 있다는 사실도 보고된 바 있다 (Chen JK, Ho CC, Chang H, Lin JF, Yang CS, Tsai MH, et al. Particulate nature of inhaled zinc oxide nanoparticles determines systemic effects and mechanisms of pulmonary inflammation in mice. Nanotoxicol. 2015;9(1):43-53).
흥미롭게도, 몇몇 무기 NPs 중에서도 (TiO2, TiO2-실리카, 단일벽 탄소나노튜브, 다중벽 탄소나노튜브, 및 ZNPs), ZNP가 가장 급격한 면역학적 효과를 나타내었으며, 이로 인해서 APCs 중에서 IL-1β 및 CXCL-9가 고발현되었다 (Palomaki J, Karisola P, Pylkkanen L, Savolainen K, Alenius H. Engineered nanomaterials cause cytotoxicity and activation on mouse antigen presenting cells. Toxicol . 2010;267(1-3):125-31). 통상적 알럼 아쥬반트들의 경우, 인플라마좀 (inflammasome)의 활성화로 인한 IL-1β의 분비 및 부상 세포들로부터의 위험-연관성 분자 패턴들의 방출에 의해서 강한 염증성 반응들을 유도하는 것으로 알려져 있다는 점을 고려할 때 (Hogenesch H. Mechanism of immunopotentiation and safety of aluminum adjuvants. Front immunol. 2012;3:406), ZNPs가 염증성 및 세포독성을 나타내는 것이 면역-아쥬반트로서 기능하는데 있어서 기초가 될 수 있다. 기존에, ZNP와 함께 OVA 항원을 복막 투여함으로써, 부스트 면역화 이후에 OVA 단독으로 감작된 것들 비해서, 혈청에서 OVA-특이적 IgG1 및 IgE 반응이 현저하게 강화될 수 있다는 점이 보고된 바 있다 (Roy R, Kumar S, Verma AK, Sharma A, Chaudhari BP, Tripathi A, et al. Zinc oxide nanoparticles provide an adjuvant effect to ovalbumin via a Th2 response in Balb/c mice. Int Immunol. 2014;26(3):159-72). 항원 자극에 따른 림프구들의 번식 뿐만 아니라, 부스트 면역화 이후 강화된 항체 반응들은, ZNPs가 적응성 면역 반응의 유도를 위한 아쥬반트 효과를 갖는다는 점을 의미한다. 또한, ZNP의 아쥬반트 효과가 IgG1 및 IgE 반응들의 증가 및 OVA 자극에 다른 면역 지라세포 중 IL-4 및 IL-5의 분비에 의해서 측정되는 바와 같이, TH2 반응에 대한 OVA-특이적 면역 반응들을 유도한다고 주장되기도 한다 (Roy R, Kumar S, Verma AK, Sharma A, Chaudhari BP, Tripathi A, et al. Zinc oxide nanoparticles provide an adjuvant effect to ovalbumin via a Th2 response in Balb/c mice. Int Immunol. 2014;26(3):159-72).
본 발명에서는, 각각 TH2 및 TH1 반응들을 나타내는, Scaa 항원에 대한 IgG1 및 IgG2C 반응들이, ScaA 또는 ZNP/ScaA 면역화된 실험군들에 비해서, ZBP-ScaA 항원과 복합체를 형성한 ZNP의 피하 면역화에 의해서 현저하게 강화된다는 사실을 밝혔으며 (도 5a), 이는 ZNP에 대한 관련 항원의 친화도가 더 강해짐에 따라서 TH2 및 TH1 반응들 모두에 대한 ZNP의 아쥬반트 효율이 더욱 향상된다는 것을 의미한다. 또한, 항원 자극에 따라서 IFN-γ-양성 T 세포 반응들이 증가한다는 사실은 TH1 반응을 발생시킴에 있어서 ZNP/ScaA 보다는 ZNP/ZBP-ScaA 복합체가 더욱 효능이 있다는 사실을 뒷받침한다 (도 5a 및 5c).
마지막으로, 본 발명에서는, ZNP/ZBP-ScaA 복합체가 O. tsutsugamushi를 사용한 치사량 감염으로부터 면역화된 마우스를 현저하게 보호할 수 있음에 반해서, ZNP/ScaA는 그렇지 않다는 사실을 밝혔다 (도 6). 체액성 및 세포 매개성 면역 반응들이 박테리아 감염에 대해서 효과적인 보호를 필요로 한다는 점을 감안하면, ZNP/ZBP-ScaA를 사용한 면역화에 의해서 유도된 ScaA에 대한 항체 및 T 세포 반응 수준이 마우스를 보호하기에 충분한 수준이라는 결론을 내릴 수 있다. 따라서, ZNP에 대한 항원의 향상된 친화도는 이러한 항원이 ZNP와 함께 전달되는 경우에 더욱 강한 적응성 면역 반응들을 발생시키는데 기여할 수 있다.
비록 미국 식품의약국에서 ZNPs를 식품 첨가제 및 선스크린 성분으로서 사용하는 것을 승인한 바 있지만, 그 인 비보 독성에 대한 안전성 문제는 여전히 제기되고 있다. 관련해서, ZNPs를 피부, 구강, 및 흡입 경로를 통해서 노출시킨 이후, 동물 모델들에서 ZNPs의 인 비보 독성에 관한 광범위한 연구들이 수행된 바 있으며, 이는 Zn2 + 수준의 전신적 증가 뿐만 아니라, 간, 신장, 및 폐와 같은 필수 장기들에서 ZNP의 축적을 야기할 수 있다 (Saptarshi SR, Duschl A, Lopata AL. Biological reactivity of zinc oxide nanoparticles with mammalian test systems: an overview. Nanomedicine. 2015;10(13):2075-92; Sruthi S, Mohanan PV. Engineered zinc oxide nanoparticles; biological interactions at the organ level. Curr Med Chem. 2016). 상기 경로들을 통해서 수 백 mg/kg 정도의 과량의 ZNPs를 투여하게 되는 경우, 감염된 장기들에서 임시 독성 및 염증이 유도될 수 있는 바, 이는 아마도 ZNPs의 용해 및 ROS의 발생으로 인한 것이며, 과량의 ZNPs는 잔류하지 않고 궁극적으로는 체내에서 제거된다. ZNPs 또는 ZnO-함유 나노입자들을 비경구 투여한 이후의 전신적 독성에 대한 몇몇 연구들에서, 국소적 염증 뿐만 아니라 나노입자들의 임시 축적이, 몇몇 내부 장기들 또는 주사 부위에서 관찰된 바가 있다 (Yun JW, Yoon JH, Kang BC, Cho NH, Seok SH, Min SK, et al. The toxicity and distribution of iron oxide-zinc oxide core-shell nanoparticles in C57BL/6 mice after repeated subcutaneous administration. J Appl Toxicol. 2015;35(6):593-602; Choi J, Kim H, Kim P, Jo E, Kim HM, Lee MY, et al. Toxicity of zinc oxide nanoparticles in rats treated by two different routes: single intravenous injection and single oral administration. J Toxicol Environ Health A. 2015;78(4):226-43). 그러나, 투여된 나노입자들은 체내로부터 점차적으로 제거되었고, 동물들은 어떠한 유의미한 전신적 염증 또는 검출가능한 병증을 나타내지 않았다. 본 발명에서도, ZNPs를 피하 주사한 이후에, 병증, 체중, 및 음식 섭취 면에서 어떠한 유의미한 변화를 관찰할 수 없었다. 따라서, ZNPs는, 비록 부스트 면역화를 위해서 반복 주사를 하는 경우에 장기적 독성에 대한 위험성을 배제하기 위해서 장시간의 모니터링이 필요할지는 몰라도, 비경구 투여 이후에 백신 아쥬반트로서 사용되기에 충분히 안전하다고 판단된다.
종합하면, 본 발명에 따른 ZNPs는 ZNPs에 대한 높은 친화도를 갖는 항원과 조합되는 경우, 백신 캐리어로서 훌륭한 아쥬반트로서의 가능성을 보유한다. ZNPs가 복합체 형성을 통해서 가용성 항원을 입자화할 수 있을 뿐만 아니라 면역 조절 효과를 갖는다는 점은, 이를 항원 제공 세포들로 효과적으로 전달하는데 기여하고, 동시에 항원 특이적 적응성 면역 반응들을 향상시키는데 기여할 것이다. 더 나아가, 나노입자들은 높은 표면적을 갖기 때문에, 백신 항원용으로서 투여량 절감 효과를 나타낼 수 있다. 실제로, ZBP-ScaA 항원과 복합체를 형성한 ZNPs는 O. tsutsugamushi에 의한 치사량 감염에 대해서 보호 면역성 뿐만 아니라 강한 항체 반응들을 유도할 수 있다. 따라서, 특정 가용성 항원과 조합된 ZNPs를 사용함으로써 신규 백신 캐리어 시스템을 위한 유망한 전략을 수립하는 것이 가능하다.
<110> Korea University Research and Business Foundation Seoul National University R&DB Foundation <120> Zinc oxide binding peptide <130> JKP-0604 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> linker sequence <400> 1 Gly Gly Asp Ala 1 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 2 Phe Pro Tyr Pro Gly Gly Asp Ala 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 3 Phe Pro Tyr Asp Gly Gly Asp Ala 1 5

Claims (14)

  1. 하기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 산화아연 결합 펩티드:
    <서열번호 3>
    FPYDGGDA.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 2 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는 산화아연 결합 펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 산화아연 결합 펩티드에 화학적 또는 유전공학적으로 융합 (fusion) 또는 접합 (conjugation)된 유기물 또는 무기물이 결합되는 것을 특징으로 하는 산화아연 결합 펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단에는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)가 결합되는 것을 특징으로 하는 산화아연 결합 펩티드.
  6. 산화아연 나노입자; 및
    상기 산화아연 나노입자의 표면에 결합된 산화아연 결합 펩티드를 포함하고,
    상기 산화아연 결합 펩티드는 하기 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 복합체:
    <서열번호 2>
    FPYPGGDA
    <서열번호 3>
    FPYDGGDA.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 산화아연 결합 펩티드는 상기 산화아연 나노입자의 표면에 비공유결합을 통해서 결합하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 산화아연 나노입자의 평균 직경은 5.48 ± 0.75 nm인 것을 특징으로 하는 복합체.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 산화아연 나노입자와 상기 산화아연 결합 펩티드의 결합 친화도 (K a 수치)는 2.26 × 106 M-1 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
  10. 제6항에 따른 복합체를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 단백질, DNA, RNA, 의약 화합물, 질병 진단 및 영상화제, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 약물은 상기 복합체 중 상기 산화아연 결합 펩티드와 결합하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 항원은 ScaA 항원인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 제10항에 있어서,
    약물 전달 복합체 조성물, 질병 진단 및 영상화제 조성물, 또는 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
KR1020160132779A 2016-10-13 2016-10-13 산화아연 결합 펩티드 서열, 이를 포함하는 복합체, 및 상기 복합체를 포함하는 약학 조성물 KR102001289B1 (ko)

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