ES2897793T3 - Vacuna inmunorreguladora - Google Patents

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Abstract

Vacuna inmunorreguladora que comprende - un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando de TLR9 y una primera hélice alfa peptídica, en donde el resto anti-CD32 es una proteína o péptido que se une específicamente a CD32, y en donde el ligando de TLR9 es un oligodesoxinucleótido CpG ; y - un inmunógeno con al menos un epítopo y una segunda hélice alfa peptídica enrollada en la primera hélice alfa, en donde la hélice enrollada es una heterohélice de dos hélices coincidentes diferentes, que difieren en al menos un aminoácido en la secuencia de repetición de la hélice y en donde cada una de dichas primera y segunda hélices alfa comprende 3-5 repeticiones de aminoácidos de un resto de aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna inmunorreguladora
La invención se refiere a una vacuna inmunorreguladora que comprende un inmunógeno y un adyuvante dirigido unido al mismo, modulando así la respuesta inmune frente al inmunógeno. La invención se refiere además a una vacuna que comprende una composición inmunogénica que comprende
- un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando TLR9, y
- un inmunógeno, que está unido al adyuvante dirigido;
para su uso en el tratamiento de un sujeto para incitar una respuesta inmune de IgG transitoria dirigida al inmunógeno.
Antecedentes
Para las enfermedades inmunes, incluyendo alergia, cáncer y enfermedades autoinmunes, la regulación del equilibrio inmune regulado por las células Th1/Th2/Th17/Treg es fundamental y su aplicación al desarrollo de nuevas terapias inmunes.
Las células Th1 (células T auxiliares de tipo 1) se caracterizan por la producción de citocinas proinflamatorias como IFN-y, IL-2 y TNF-p. Las células Th1 están implicadas en la inmunidad mediada por células. Las citocinas producidas por las células Th1 estimulan la fagocitosis y la destrucción de patógenos microbianos. Varias enfermedades inflamatorias crónicas se han descrito como enfermedades dominantes de Th1, es decir, esclerosis múltiple, diabetes y artritis reumatoide.
Las células Th2 (células T auxiliares de tipo 2) se caracterizan por la producción de IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13. Se cree que las células Th2 desempeñan un papel en las respuestas alérgicas. Las citocinas como IL-4 generalmente estimulan la producción de anticuerpos. La IL-5 estimula las respuestas de los eosinófilos, que también forma parte de la respuesta inmune. Se cree que la atopia y la alergia son afecciones dominantes de Th2.
El desequilibrio de la inmunidad Th1/Th2 o Th17/Treg se convierte en la causa de diversas enfermedades inmunes.
Se considera que la alergia es una reacción de hipersensibilidad a las proteínas del entorno. Los alérgenos son antígenos a los que los pacientes atópicos responden con respuestas de anticuerpos IgE que conducen posteriormente a reacciones alérgicas. Los antígenos en los complejos o proteínas de fusión pueden ser alérgenos ambientales (p. ej., ácaros del polvo doméstico, polen de abedul, polen de hierba, antígenos de gato, antígenos de cucarachas) o alérgenos alimentarios (p. ej., leche de vaca, cacahuete, camarones, soja) o una combinación de ambos. Las moléculas de IgE son importantes debido a su papel en la activación de las células efectoras (mastocitos, basófilos y eosinófilos). En general, se acepta que la IgE también desempeña un papel importante en la fase de inducción de las enfermedades alérgicas, regulando al alza el potencial de captura de antígenos de las células B y las células dendríticas (DC), tanto a través de receptores de baja afinidad (CD23) como de alta afinidad (FcsRI). Las funciones negativas de los anticuerpos IgE pueden contrarrestarse mediante anticuerpos IgG específicos de alérgenos, p.ej., porque dirigen la respuesta inmune lejos de las células B hacia los monocitos y las DC y son capaces de regular a la baja la activación de las células efectoras mediada por el receptor de IgE mediante la co-reticulación del FcsRI con FcyRIIb (CD32b) en estas células. Además, compiten con las moléculas de IgE por los sitios de unión al alérgeno. Por lo tanto, las alergias pueden tratarse, curarse y prevenirse mediante la inducción de moléculas de IgG específicas de alérgenos, especialmente IgG1.
Las moléculas de IgG tienen una semivida en suero de aproximadamente 3 semanas en comparación con aproximadamente 3 días para las moléculas de IgE. Las moléculas de IgE son inducidas por la interacción entre células B (vírgenes) y células Th2 que proporcionan IL-4 e IL-13 junto con la expresión de CD40L necesaria para inducir un cambio de clase a IgE en las células B de memoria y las células plasmáticas. Por el contrario, las células Th1, que producen IFN-y e IL-2, inducen un cambio de clase a IgG. Por lo tanto, la inducción de Th1, en lugar de las respuestas de las células T auxiliares Th2 frente a los alérgenos, es beneficiosa para la prevención, el tratamiento y la cura de las enfermedades alérgicas.
Hasta la fecha, se usan varias formas de vacunación activa que usan alérgenos. La más común es la denominada "inmunoterapia", que depende de inmunizaciones frecuentes con concentraciones relativamente altas de alérgenos. Esta técnica es sólo moderadamente efectiva en una minoría de enfermedades alérgicas tales como la alergia al veneno de abeja y en algunos casos de rinitis y conjuntivitis, y recientemente algunos informes han mostrado su eficacia en formas más leves de asma y dermatitis atópica. Más recientemente, la inmunoterapia rápida, en la que se inyectan cantidades crecientes de alérgeno en un marco de tiempo bastante corto, se ha aplicado con resultados ligeramente mejores. Por lo general, se usa la vía subcutánea para la administración de los alérgenos, pero recientemente esta vía se ha comparado con la aplicación oral o incluso con la aplicación local, los resultados son generalmente positivos, pero no siempre consistentes. Una técnica diferente para la inmunoterapia es la descrita por Saint-Remy (EP0178085 y EP0287361), que usa anticuerpos IgG autólogos que forman complejos in vitro con los alérgenos relevantes. Esta técnica permite aplicar cantidades mucho más pequeñas de alérgenos con menos efectos secundarios.
El mecanismo detrás de estas terapias no está claro. En la terapia clásica parece haber un efecto beneficioso si la terapia induce un aumento de anticuerpos IgG específicos, aunque no todo aumento significativo de IgG específica se correlaciona con una inmunoterapia exitosa. Un posible argumento de por qué este es el caso es la afinidad relativamente baja de los anticuerpos IgG por CD32 en las células B, monocitos y mastocitos. El enfoque de Saint-Remy selecciona los anticuerpos IgG específicos del paciente, que posteriormente se mezclan con alérgenos relevantes in vitro. De esta manera, aseguran que el alérgeno no pueda reaccionar libremente con células u otros isotipos de anticuerpos en las células tal como IgE en mastocitos. Además, reivindican que se generan anticuerpos antiidiotípicos frente a las moléculas de IgG específicas, que en el futuro prevendrán la alergia.
En WO 97/07218 se describen proteínas de fusión alérgeno-anti-CD32. En esta publicación se evitan los problemas con el aislamiento de moléculas de IgG específicas y la baja afinidad de estos anticuerpos IgG por CD32 y se reducen los factores de riesgo de la inmunoterapia clásica, que usa alérgenos de "unión a IgE" completos. Sin embargo, la inducción reivindicada de respuestas de memoria Th1 debida a dirigir únicamente la vacuna que contiene anti-CD32 a las células dendríticas no está corroborada.
WO2007098934A1 describe moléculas capaces de unirse a TLR9 y a CD32 que comprenden al menos un epítopo de al menos un antígeno, su producción y su uso como medicamento, especialmente para el tratamiento de alergias.
La inmunorregulación puede funcionar no solo en el caso de enfermedades alérgicas, sino también en una serie de otras enfermedades.
El aumento de la respuesta inmune a agentes infecciosos, tales como patógenos microbianos, es el objetivo de la inmunoterapia antiinfecciosa profiláctica o terapéutica.
La inmunocontracepción es revisada por McLaughlin et al., que abordan el progreso en la caracterización molecular de los antígenos de fertilidad, la construcción de vacunas y la administración de productos (McLaughlin et al., Molecular and Cellular Endocrinology 2011,335(1): 78-88).
En las inmunoterapias tumorales también existe el objetivo de usar células T auxiliares de tipo 1 (Th1) específicas de antígeno tumoral además de linfocitos T citotóxicos (CTL).
El cáncer, conocido médicamente como neoplasma maligno, es un grupo amplio de diversas enfermedades, todas relacionadas con el crecimiento celular no regulado. En el cáncer, las células se dividen y crecen sin control, formando tumores malignos e invaden partes cercanas del cuerpo. El cáncer también se puede diseminar a partes más distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. No todos los tumores son cancerosos. Los tumores benignos no crecen sin control, no invaden los tejidos vecinos y no se diseminan por todo el cuerpo. Hay más de 200 cánceres diferentes conocidos que afligen a los seres humanos.
Determinar qué causa el cáncer es complejo. Se sabe que muchas cosas aumentan el riesgo de cáncer, incluyendo el consumo de tabaco, ciertas infecciones, la radiación, la falta de actividad física, la obesidad y los contaminantes ambientales. Estos pueden dañar directamente los genes o combinarse con fallas genéticas existentes dentro de las células para causar la enfermedad. Aproximadamente del cinco al diez por ciento de los cánceres son completamente hereditarios.
El cáncer se puede detectar de varias maneras, incluyendo la presencia de ciertos signos y síntomas, ensayos de cribado o imagenología médica. Una vez que se detecta un posible cáncer, se diagnostica mediante el examen microscópico de una muestra de tejido. El cáncer generalmente se trata con quimioterapia, radioterapia y cirugía. Las posibilidades de sobrevivir a la enfermedad varían mucho según el tipo y la localización del cáncer y la extensión de la enfermedad al inicio del tratamiento. Si bien el cáncer puede afectar a personas de todas las edades y algunos tipos de cáncer son más comunes en los niños, el riesgo de desarrollar cáncer generalmente aumenta con la edad. En 2007, el cáncer causó aproximadamente el 13 % de todas las muertes humanas en todo el mundo (7,9 millones). Las tasas están aumentando a medida que más personas viven hasta una edad avanzada y a medida que se producen cambios masivos en el estilo de vida en el mundo en desarrollo.
Dado que el sistema inmune responde a los factores ambientales que encuentra sobre la base de la discriminación entre lo propio y lo no propio, muchos tipos de células tumorales que surgen como resultado de la aparición del cáncer son más o menos toleradas por el propio sistema inmune del paciente, ya que las células tumorales son esencialmente las propias células del paciente que crecen, se dividen y se diseminan sin un control regulador adecuado.
La inmunotolerancia o tolerancia inmunológica es el proceso por el cual el sistema inmunológico no ataca un antígeno. En la tolerancia natural o propia, el cuerpo no genera una respuesta inmune frente a los autoantígenos. Se presenta en tres formas: tolerancia central, tolerancia periférica y tolerancia adquirida.
Tolerancia central1:
La tolerancia central ocurre durante el desarrollo de los linfocitos y opera en el timo y la médula ósea. Aquí, los linfocitos T y B que reconocen los autoantígenos se eliminan antes de que se desarrollen en células completamente inmunocompetentes, lo que previene la autoinmunidad. Este proceso es más activo en la vida fetal, pero continúa durante toda la vida a medida que se generan linfocitos inmaduros.
Tolerancia periférica2:
La tolerancia periférica es la tolerancia inmunológica que se desarrolla después de que las células T y B maduran y entran en la periferia. Las células T que abandonan el timo son relativamente, pero no completamente, seguras. Algunas tendrán receptores (TCR) que pueden responder a autoantígenos que están presentes en concentraciones tan altas que pueden unirse a receptores "débiles" que las células T no encontraron en el timo (tales como moléculas específicas de tejido como las de los islotes de Langerhans, cerebro o médula espinal). Aquellas células T autorreactivas que escapan a la selección negativa intratímica en el timo pueden infligir daño celular a menos que sean eliminadas o efectivamente amordazadas en el tejido periférico. Se sabe que existen varios mecanismos de retroalimentación para silenciar tales células T potencialmente autorreactivas. Incluyen los siguientes: Anergia, Muerte celular inducida por activación, Supresión periférica
Tolerancia adquirida o inducida3:
La tolerancia adquirida o inducida se refiere a la adaptación del sistema inmune a antígenos externos caracterizada por una ausencia de reactividad específica de los tejidos linfoides a un antígeno dado que en otras circunstancias probablemente induciría inmunidad humoral o mediada por células. Uno de los tipos naturales más importantes de tolerancia adquirida es la tolerancia inmune durante el embarazo, donde el feto y la placenta deben ser tolerados por el sistema inmune materno.
Inmunoterapia dirigida a antígenos asociados a tumores:
La inmunoterapia contra el cáncer es el uso del sistema inmune para rechazar el cáncer. La premisa principal es estimular el sistema inmune del paciente para que ataque las células tumorales malignas que son responsables de la enfermedad. Esto se puede hacer mediante la inmunización activa del paciente (p. ej., administrando una vacuna contra el cáncer celular, tal como Provenge, Dendreon, Seattle, Washington, EE. UU.)4, en cuyo caso el propio sistema inmune del paciente se entrena para reconocer las células tumorales como dianas a destruir, o mediante la administración de anticuerpos terapéuticos como fármacos, en cuyo caso se recluta el sistema inmune del paciente para destruir las células tumorales mediante los anticuerpos terapéuticos. Otro enfoque para activar el sistema inmune del paciente frente a los tumores es usar los llamados antígenos asociados a tumores (TAA), que son autoproteínas que se expresan en cierta medida en las células normales sanas, pero que se sobreexpresan en las células tumorales o forman parte de hormonas/factores de crecimiento celulares con los que proliferan las células tumorales5. Estos TAA se formulan y se presentan al cuerpo de una manera inmunogénica de modo que el sistema inmune genere una respuesta a pesar del hecho de que estas proteínas son propias. Obviamente, este enfoque solo será útil para los TAA frente a los cuales el paciente ha desarrollado tolerancia periférica o adquirida. Cuando las células T y B que reconocen el TAA se han eliminado del repertorio inmunológico, la inmunoterapia activa frente al cáncer no es una opción.
Gastrina:
Un ejemplo de un autoantígeno (hormona/factor de crecimiento) que puede usarse como diana para el tratamiento de cánceres gastrointestinales tales como el cáncer de páncreas es la gastrina pequeña (G17)6-9. Además, la neutralización de G17 también puede ser beneficiosa en cualquier afección de enfermedad relacionada con la gastrina, incluidas las úlceras gástricas, la enfermedad por reflujo gastroesofágico (GERD)10, ya que el pH del estómago está regulado por la gastrina, y para la insuficiencia renal en etapa terminal (ESRF)11, ya que la gastrina circula a concentraciones más altas de lo normal en pacientes con ESRF.
US5023077 describe composiciones inmunogénicas y métodos para el tratamiento y prevención de la enfermedad ulcerosa gástrica y duodenal, cuyas composiciones inmunogénicas están basadas en péptidos de gastrina, que se acoplan a un vehículo inmunogénico, tal como toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemocianina de lapa californiana o albúmina de suero bovino.
La gastrina tiene varias funciones importantes en el tracto gastrointestinal, siendo las dos más importantes la estimulación de la secreción de ácido y la estimulación del crecimiento de células en el tracto gastrointestinal. La hormona existe en al menos dos formas moleculares, heptadecagastrina, la llamada gastrina pequeña ("G17") y tetratriacontagastrina ("G34") nombradas de acuerdo con el número de residuos de aminoácidos ("AA") en cada molécula, en donde la G17 constituye los 17 residuos amino terminales ("N-terminales") de G34.
US5609870 describe la preparación de un inmunógeno anti-G17 que genera anticuerpos en un mamífero frente a su propia G17 que no reaccionan con G34 que comprende conjugar un péptido que consiste en una secuencia correspondiente a un fragmento de la secuencia de aminoácidos N-terminal de G17 hasta el residuo de aminoácido número 12 por su extremo C-terminal a un péptido espaciador que está conjugado con un vehículo inmunogénico, tal como toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemocianina de lapa californiana y albúmina de suero bovino.
Equilibrio inmune:
El equilibrio inmune regulado por las células Th1/Th2/Th17/Treg desempeña un papel significativo en el desarrollo de las terapias inmunes.
En las enfermedades autoinmunes existe la necesidad de regular el desequilibrio Th1/Th2/Th17/Treg, es decir, en condiciones en las que el sistema inmune ataca el tejido propio.
El papel de TLR9:
Los receptores semejantes a Toll (TLR) son una clase de proteínas que desempeñan un papel clave en el sistema inmune innato. Son receptores únicos, no catalíticos, que se extienden por la membrana, que generalmente se expresan en la superficie celular y en el compartimento endocítico de las células centinela, tales como los macrófagos y las células dendríticas. Los TLR reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), moléculas conservadas estructuralmente, derivadas de microbios e inician la señalización para inducir la producción de citocinas necesarias para la inmunidad innata y la subsiguiente inmunidad adaptativa.
Los diversos TLR exhiben diferentes patrones de expresión. Este gen se expresa preferentemente en tejidos ricos en células inmunes, tales como el bazo, los ganglios linfáticos, la médula ósea y los leucocitos de sangre periférica.
Se han identificado trece TLR (llamados simplemente TLR1 a TLR13) en seres humanos y ratones conjuntamente, y se han encontrado formas equivalentes de muchos de estos en otras especies de mamíferos. Sin embargo, no todos los receptores TLR en ratones también se encuentran en los seres humanos o viceversa. Además, no se conoce el ligando ni la función de cada receptor TLR, p. ej., TLR10 es un receptor huérfano con función desconocida.
La activación de los receptores TLR se ha usado para el tratamiento de diversas enfermedades, p. ej., se ha mostrado que la activación de TLR9 por productos farmacéuticos es beneficiosa en el tratamiento de la alergia y la oncología. Los estudios en ratones y seres humanos indican que los ligandos naturales de TLR9 son secuencias CpG no metiladas en moléculas de ADN. Los sitios CpG son relativamente raros (~1 %) en los genomas de vertebrados en comparación con los genomas bacterianos o el ADN viral. TLR9 es expresado por numerosas células del sistema inmune, tales como las células dendríticas, los linfocitos B, los monocitos y las células asesinas naturales (NK). Sin embargo, en los seres humanos sanos, la expresión de TLR9 está restringida a células dendríticas plasmacitoides (pDC) y células B. La expresión es intracelularmente, dentro de los compartimentos endosomales y funciona para alertar al sistema inmune de infecciones virales y bacterianas al unirse al ADN rico en restos CpG. Sin embargo, en condiciones patológicas, la expresión de TLR9 también se ha informado en la superficie celular de las células12-14.
Hurtado et al. describen que LL-37, un péptido antimicrobiano catiónico derivado de neutrófilos y queratinocitos, promueve la detección rápida y eficiente de restos CpG en el ADN bacteriano por linfocitos B humanos y células dendríticas plasmacitoides (pDC) en medios que contienen suero y en sangre completa (Hurtado et al., Journal of Immunology 2010, 184(3): 1425-1435).
Se han reportado muchas moléculas agonistas de TLR9 sintéticas diferentes. Los ligandos agonistas (activadores de TLR9) se han clasificado en tres grupos:
El grupo que consiste en CpG clase A, en particular oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG-A (D)15, también conocidos como ODN de tipo "D". Dichos agonistas de TLR9 inducen una fuerte inducción de IFNa y una maduración mínima de las células dendríticas, y en la presente memoria se denominan ligando de TLR9 del "grupo 1". Un ejemplo es ODN221616:
GGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID 48)
El grupo que consiste en CpG clase B, en particular oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG-B (K)17, también conocidos como ODN de tipo "K". Dichos agonistas de TLR9 inducen una inducción débil de IFNa y la maduración de las células dendríticas y se denominan en la presente memoria ligando de TLR9 del "grupo 2". Un ejemplo es ODN200618;19:
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID 49)
El grupo que consiste en CpG clase C, también conocido como oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG-C20. Dichos agonistas de TLR9 inducen IFNa y la maduración de células dendríticas inmaduras, y se denominan en la presente memoria ligando de TLR9 del "grupo 3". Un ejemplo es ODNM36221 :
TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT (SEQ ID 69)
Todos los ligandos para TLR9 descritos hasta la fecha se basan en nucleótidos. Aunque se han reportado y usado anticuerpos específicos para TLR9 para demostrar la presencia y localización del receptor, estas moléculas no se han descrito como ligandos para TLR9, no se reportó ninguna actividad activadora o inhibidora de TLR9.
El papel de CD32:
CD32 se expresa fuertemente en monocitos/células dendríticas y células B y, por lo tanto, dichas moléculas están diseñadas para dirigir la respuesta inmune a estas importantes células inmunológicas, con la intención de prevenir la presentación de antígenos por las células B, mientras se promueve la presentación de antígenos por células dendríticas (DC) especialmente, esto último conduce a la inducción de respuestas Th1 frente al antígeno, cuando se estimula suficientemente. Existen al menos dos tipos de DC: células dendríticas mieloides (mDC) y plasmacitoides (pDC), lo que ha llevado al nuevo concepto de células DC1 y DC2. En este concepto, las células DC1 promueven la inducción del desarrollo de células Th1 después de la estimulación específica de antígeno y las células DC2 apoyan el desarrollo de las células Th2. Las DC derivadas de monocitos (o mDC) generalmente se consideran de tipo DC1, mientras que las pDC se consideran de tipo DC2. Ambos tipos de DC expresan CD32a e inducirán una respuesta de células T específica de antígeno; sin embargo, no se garantiza que el resultado sea de tipo Th1. De hecho, en los donantes alérgicos las respuestas Th2 son más probables. Es importante destacar que las pDC expresan el receptor TLR9, que se une a CpG-ODN (oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen restos CpG no metilados). La activación de este receptor en la pDC conduce a una producción muy fuerte de IFN-alfa e IL-12, lo que promueve la inducción de Th1 y, por tanto, transforma las células DC2 potenciales en DC1.
Por tanto, dichas moléculas pueden combinar la activación del receptor TLR9 en pDC con la estimulación e inducción específicas de células Th1 específicas de antígeno.
En las inmunoterapias tumorales existe el objetivo particular de usar células T auxiliares de tipo 1 (Th1) específicas de antígeno tumoral además de linfocitos T citotóxicos (CTL).
Hélices enrolladas:
Las hélices enrolladas están formadas por restos estructurales en proteínas, en las que se enrollan conjuntamente 2­ 7 hélices alfa como las hebras de una cuerda; los dímeros y trímeros son los tipos más comunes. Las hélices helicoidales enrolladas se han usado para estabilizar fragmentos de anticuerpo Fv dando como resultado dominios heterodiméricos de hélices enrolladas22.
EP2397547A1 describe un vehículo de administración de fármacos, p. ej., una vacuna basada en una proteína multimérica que tiene una estructura de hélice enrollada y un ligando para un receptor de una célula inmune. La hélice enrollada de EP2397547A1 está formada por la multimerización (oligomerización) de proteínas monoméricas idénticas.
Kaiser-Schulz et al. describen microesferas de vacunación de ADN que coencapsulan CpG-ODN y PrP en tándem (tPrP), una versión dimérica recombinante de la proteína priónica celular principalmente a-helicoidal (PrP) (Kaiser-Schulz et al, Journal of Immunology 2007, 179(5): 2797-2807).
La estabilidad y estructura plegada de moléculas proteínicas complejas es crucial al diseñar inmunógenos. Por tanto, el objeto de la invención es proporcionar una vacuna con estabilidad y estructura mejoradas para regular la respuesta inmune a inmunógenos específicos.
Existe además una necesidad de proporcionar inmunoterapias mejoradas dirigidas a la gastrina y las afecciones de enfermedades dependientes de gastrina. Por tanto, el objeto de la invención es proporcionar una vacuna con inmunogenicidad, estabilidad y estructura mejoradas para regular la respuesta inmune frente a epítopos de gastrina específicos.
Resumen de la invención
El objeto se resuelve por el tema en cuestión como se reivindica.
Según la invención se proporciona una vacuna inmunorreguladora que comprende
- un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando TLR9 y una primera hélice alfa peptídica, en donde el resto anti-CD32 es una proteína o péptido que se une específicamente a CD32, y en donde el ligando de TLR9 es un oligodesoxinucleótido CpG; y
- un inmunógeno con al menos un epítopo y una segunda hélice alfa peptídica enrollada en la primera hélice alfa,
en donde la hélice enrollada es una heterohélice de dos hélices coincidentes diferentes, que difieren en al menos un aminoácido en la secuencia de repetición de hélice y en donde cada una de dichas primera y segunda hélices alfa comprende 3-5 repeticiones de aminoácidos de un resto de aminoácido.
Específicamente, dichas primera y segunda hélices alfa se unen específicamente entre sí con una Kd de menos de 10-6 M.
Específicamente, dicho resto anti-CD32 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD32 y un fragmento de anticuerpo.
Específicamente, dicho ligando de TLR9 es un agonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en oligodesoxinucleótidos CpG de clase A, B y C.
Específicamente, dicho inmunógeno se deriva de un antígeno asociado a un tumor, un patógeno o un alérgeno.
Específicamente, dicho resto anti-CD32 está dirigido a CD32a.
También se proporciona en la presente memoria la vacuna descrita en la presente memoria para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un alérgeno. Según una realización específica, el resto anti-CD32 de la vacuna proporcionada para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas se dirige a CD32a y CD32b.
También se proporciona en la presente memoria la vacuna descrita en la presente memoria para su uso en la inmunoterapia de enfermedades cancerosas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un antígeno asociado a un tumor. También se proporciona en la presente memoria la vacuna descrita en la presente memoria para su uso en la inmunoterapia de enfermedades infecciosas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un patógeno.
Según una realización específica de la vacuna proporcionada en la presente memoria, el ligando de TLR9 es un antagonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en ODN inhibidores.
Según una realización específica de dicha vacuna, el ligando de TLR9 es un antagonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en ODN inhibidores.
Según una realización específica de dicha vacuna, el inmunógeno se deriva de un alérgeno o de un autoantígeno humano.
Según una realización específica de dicha vacuna, el inmunógeno se deriva de un alérgeno o un autoantígeno humano, y el resto anti-CD32 se dirige a CD32b, o CD32a y CD32b.
Específicamente, la vacuna proporcionada en la presente memoria comprende
- un adyuvante dirigido que está compuesto por el resto anti-CD32 unido a la primera hélice alfa que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID 70, que está acoplado al ligando de TLR9 de la SEQ ID 69; y
- un inmunógeno que comprende o consiste en el inmunógeno de la SEQ ID 30 unido a la segunda hélice alfa; en donde el adyuvante dirigido y el inmunógeno están unidos entre sí por la estructura de hélice enrollada de la primera y segunda hélices alfa.
Específicamente, el inmunógeno comprende o consiste en la SEQ ID 75.
Específicamente, el inmunógeno comprende o consiste en la SEQ ID 30 unida a la segunda hélice alfa, en donde se elimina Cys379.
Específicamente, el adyuvante dirigido está compuesto por el resto anti-CD32 unido a la primera hélice alfa que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID 70, que está acoplada al ligando de TLR9 SEQ ID 69 en una proporción de 1:1-18 (molécula por molécula).
En la presente memoria se proporciona además una vacuna como se describe en la presente memoria, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un alérgeno. Específicamente, el resto anti-CD32 de la vacuna para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas como se describe en la presente memoria, se dirige a CD32a y CD32b.
En la presente memoria se proporciona además una vacuna como se describe en la presente memoria, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades autoinmunes, en donde dicho inmunógeno se deriva de un autoantígeno humano. En la presente memoria se proporciona además un kit para preparar la vacuna proporcionada en la presente memoria, que comprende los siguientes componentes:
el adyuvante dirigido que comprende al menos el resto anti-CD32 unido al ligando de TLR9 y la primera hélice alfa peptídica, y
el inmunógeno con al menos un epítopo de células T y la segunda hélice alfa peptídica coincidente con la primera hélice alfa.
Específicamente, la vacuna inmunorreguladora proporcionada en la presente memoria se caracteriza por comprender - un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando de TLR9 y una primera hélice alfa peptídica, y
- un inmunógeno con al menos un epítopo y una segunda hélice alfa peptídica enrollada en la primera hélice alfa. Específicamente, el epítopo es un epítopo de células T y/o células B.
Según un aspecto específico, cada una de dicha primera y segunda hélices alfa comprende 3-5 repeticiones de aminoácidos de un resto de aminoácidos, uniéndose específicamente entre sí con una Kd de menos de 10-6 M, preferiblemente con una Kd de menos de 10-7 M, más preferido menos de 10-8 M o 10-9 M.
Según un aspecto específico adicional, dicho resto anti-CD32 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD32 y un fragmento de anticuerpo, preferiblemente dirigido a CD32a. El fragmento de anticuerpo específicamente puede ser, p. ej., un fragmento Fab, Fv, scFv, dAb, F(ab)2 o Fcab, o cualquier otra entidad de unión posible, siempre que se una específicamente al receptor y se internalice después de la unión.
Según otro aspecto, el ligando de TLR9 es un agonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en CpG clase A, en particular oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG-A (D)23, también conocidos como ODN de tipo "D". Dichos agonistas de TLR9 inducen una fuerte inducción de IFNa y una maduración mínima de las células dendríticas, y en la presente memoria se denominan ligando de TLR9 del "grupo 1".
Según otro aspecto, el ligando de TLR9 es un agonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en CpG clase B, en particular oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG-B (K)24, también conocidos como ODN de tipo "K". Dichos agonistas de TLR9 inducen una inducción débil de IFNa y la maduración de las células dendríticas y se denominan en la presente memoria ligando de TLR9 del "grupo 2".
Según otro aspecto, dicho ligando de TLR9 específicamente es un agonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en CpG clase C, también conocido como oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG-C25;26. Dichos agonistas de TLR9 inducen IFNa y la maduración de células dendríticas inmaduras, y se denominan en la presente memoria ligando de TLR9 del "grupo 3".
Según otro aspecto, dicho ligando de TLR9 es específicamente un péptido inmunoestimulador que mimetiza cualquiera de los oligodesoxinucleótidos CpG de clase A, B o C, es decir, un péptido que se une específicamente a TLR9 con función agonista activadora.
Según otro aspecto, el ligando de TLR9 es un antagonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en oligodesoxinucleótidos ODN inhibidores2728 (a veces llamados CPG inhibidores), p. ej., aquellos que contienen el resto inhibidor que consiste en CCx(no C)(no C)xxGGG (x = cualquier base)29. Se ha demostrado que los ODN inhibidores específicos no inducen IFNa y no inducen la maduración de las células dendríticas, bloqueando también la activación a través de un agonista de TLR9.
Dicho agonista o antagonista de TLR9 se puede determinar en un ensayo basado en células adecuado, que mide la expresión estable de IFNa, o al menos uno de los marcadores CD80, CD83 y CD86, que reflejan la maduración de las células dendríticas (DC) inmaduras. Para este propósito, las células dendríticas plasmacitoides (pDC) se purifican a partir de sangre de un donante sano como describen Tel et al30 y posteriormente se incuban con la concentración apropiada del ligando de TLR9. Después de 24 h, se mide el IFNa en el sobrenadante usando protocolos estándar de ELISA. Para la determinación del estado de maduración de las células, las pDC se tiñen para detectar la expresión de CD80, CD83 o CD86 usando procedimientos estándar de FACS con anticuerpos específicos disponibles comercialmente antes y después de la incubación con el ligando de TLR9.
La inducción de IFNa puede determinarse por el nivel de expresión de IFNa y el aumento respectivo con respecto a un nivel de referencia. El aumento relativo en relación con las células no estimuladas, se puede comparar con los niveles de inducción inducidos por las referencias establecidas para cada tipo de CpG como se define por el ligando de TLR9 del grupo 1,2 o 3 y es típicamente entre el 30 % y el 300 % de la referencia respectiva, preferiblemente al menos el 100 %, más preferiblemente al menos el 120 %, al menos el 150 %, al menos el 200 % o al menos el 250 %.
La maduración de las células dendríticas inmaduras puede determinarse por el nivel de expresión de cualquiera de los marcadores CD80, CD83 y CD86. El aumento respectivo en relación con las células no estimuladas, se puede comparar con los niveles de inducción inducidos por las referencias establecidas para cada tipo de CpG como se define por el ligando de TLR9 del grupo 1, 2 o 3 y es típicamente entre el 30 % y el 300 % de la referencia respectiva. preferiblemente al menos el 100 %, más preferiblemente al menos el 120 %, al menos el 150 %, al menos el 200 % o al menos el 250 %.
Específicamente, el agonista de TLR9 del grupo 1 y 3 daría como resultado un aumento de la expresión de IFNa y un agonista de TRL9 del grupo 2 y 3 conduciría a un aumento de la expresión de cualquiera de los factores de maduración de DC CD80, CD83 y CD86. El antagonista de TLR9 daría como resultado una expresión reducida de IFNa y una expresión reducida de cualquiera de los factores de maduración de DC CD80, CD83 y CD86, incluso en presencia de un agonista de TLR9 de cualquiera de los grupos 1 -3.
Según una realización específica, el inmunógeno se deriva de
- un antígeno asociado a un tumor, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades cancerosas, o
- un patógeno, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades infecciosas, o
- un alérgeno, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas.
Dicha vacuna es típicamente una vacuna inmunoestimuladora, p. ej., que estimula la respuesta inmune humoral y de células T (Th1).
Esta realización de una vacuna inmunoestimuladora emplea específicamente un ligando de TLR9 que es un agonista de TLR9. En este caso, la vacuna induce predominantemente respuestas Th1 frente al inmunógeno.
Específicamente, dicho resto anti-CD32 se dirige a CD32a, preferiblemente con una alta afinidad de Kd < 10-6 M, más preferido menos de 10-7 M o menos de 10-8 M.
Más específicamente, dicho resto anti-CD32 es un agente de unión a CD32a específico o selectivo, es decir, que no se dirige a CD32b o se dirige a CD32b con una afinidad baja de Kd > 10-6 M, preferiblemente superior a 10-5 M, más preferido superior a 10-4 M. La afinidad diferencial de unión a CD32a y CD32b es preferiblemente al menos 1 log, más preferiblemente al menos 2 log o al menos 3 log, o una diferencia mayor en el valor de Kd.
La afinidad alta o la afinidad diferencial alta específicamente preferida del resto anti-CD32 para unirse a CD32a en lugar de a CD32b se usa típicamente en una vacuna inmunoestimuladora que emplea además el agonista de TLR9. Se prefiere además que dicha vacuna emplee un inmunógeno seleccionado de una serie de dianas oncológicas o dianas patógenas, donde una respuesta Th1 y anticuerpos IgG específicos son necesarios para combatir eficazmente las enfermedades.
Según una realización alternativa, dicho resto anti-CD32 se dirige tanto a CD32a como a CD32b, con una alta afinidad de Kd < 10-6 M, preferiblemente una afinidad mayor de 10-7 M, más preferida una afinidad mayor de 10-8 M. La alta afinidad específicamente preferida del resto anti-CD32 para unirse tanto a CD32a como a CD32b, se usa típicamente en una vacuna que emplea además el agonista de TLR9. Se prefiere además que dicha vacuna emplee un inmunógeno seleccionado de una serie de dianas de alergia, donde se obtiene una redirección de una respuesta Th2 para obtener una respuesta Th1. Típicamente, no se prefieren los anticuerpos frente a la propia vacuna. Además, se prefiere una vacuna específica que se una a CD32b con aproximadamente la misma afinidad que a CD32a.
La afinidad de unión del resto anti-CD32 que se dirige específicamente a cualquiera de CD32a o CD32b, o ambos, CD32a y CD32b, se puede determinar en un ensayo adecuado tal como un ELISA típico usando formas recombinantes etiquetadas con HIS disponibles comercialmente de CD32a y CD32b, usadas para recubrir placas de ELISA Ni-NTA, p. ej., placas Ni-NTA HisSorb (Qiagen, Austria). Los restos anti-CD32 pueden biotinilarse y, como tales, pueden detectarse usando estreptavidina-HRP o estreptavidina AP y los sustratos apropiados. Alternativamente, los restos se pueden ensayar en un ensayo FACS usando células U937 (p. ej., ATCC: CRL 1593) que expresan CD32a pero no CD32b y células B transformadas con EBV, p. ej., CFB4:2 según lo descrito por van Reijsen et al31, que expresan CD32b y no CD32a.
Según una realización adicional, el inmunógeno se deriva de
- un alérgeno, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas, o
- un autoantígeno humano, para uso en la inmunoterapia de enfermedades autoinmunes
Dicha vacuna para su uso en enfermedades autoinmunes es típicamente una vacuna de inmunotolerancia, p. ej., que induce la tolerancia de las células T frente al inmunógeno por las células T reguladoras y modula a la baja la respuesta inmune humoral.
Esta realización de una inmunotolerancia emplea específicamente un ligando de TLR9 que es un agonista de TLR9 del grupo 1 o es un antagonista de TLR9. En este caso, la vacuna regularía predominantemente a la baja las respuestas Th1/2/17 frente al inmunógeno, pero activaría las células Treg.
Dicha vacuna para uso en alergias puede ser:
- una vacuna de inmunotolerancia, p. ej., que induce la tolerancia de las células T frente al inmunógeno por las células T reguladoras y modula a la baja la respuesta inmune humoral, empleando un ligando de TLR9 que es un agonista de TLR9 del grupo 1 o es un antagonista de TLR9. En este caso, la vacuna regularía predominantemente a la baja las respuestas Th1/2/17 frente al inmunógeno, pero activaría las células Treg; o
- una vacuna inmunoestimuladora que induce respuestas Th1 frente al inmunógeno mientras previene la respuesta inmune humoral frente a la vacuna, empleando un ligando de TLR9 que es un agonista de TLR9 del grupo 3.
Según esta realización de una vacuna de inmunotolerancia, dicho resto anti-CD32 se dirige específicamente a CD32b o ambos, CD32a y CD32b, con una alta afinidad de Kd < 10-6 M, preferiblemente una mayor afinidad con una Kd <10-7 M, más preferido Kd <10-8 M. Se prefiere que el resto anti-CD32 se dirija específicamente tanto a CD32a como a CD32b.
También para la vacuna inmunoestimuladora para su uso en alergias, dicho resto anti-CD32 se dirige específicamente a CD32a y CD32b, con una alta afinidad de Kd < 10-6 M, preferiblemente con una mayor afinidad, p. ej., una Kd < 10-7 M, más preferido Kd <10-8 M. Se prefiere que el resto anti-CD32 se dirija específicamente tanto a CD32a como a CD32b.
Específicamente, se proporciona una vacuna, en donde dicho inmunógeno se deriva de un alérgeno, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas y en donde dicho resto anti-CD32 se dirige a CD32a y CD32b.
Las realizaciones específicas de la vacuna descritas en la presente memoria se pueden representar en la siguiente tabla, que indica la selección del resto anti-CD32 según su especificidad y afinidad de unión a CD32a y/o CD32b, el tipo de ligando de TLR9 y el tipo de inmunógeno.
Tabla 1: Realizaciones específicas:
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Las columnas 2 y 3 se refieren a la selectividad y/o afinidad de la unión del resto anti-CD32 a CD32a y CD32b: CD32a >> CD32b que significa una unión selectiva a CD32a (diferencia en la afinidad de unión/Kd de al menos 1 log); CD32b = CD32a, que significa una unión tanto a CD32a como a CD32b aproximadamente en el mismo grado (diferencia en la afinidad de unión/Kd de menos de 1 log).
Particularmente, cuando se proporciona una vacuna antialérgica, es decir, una vacuna de inmunotolerancia para el tratamiento de afecciones de enfermedades alérgicas, o una vacuna frente a una enfermedad autoinmune, es decir, una vacuna de inmunotolerancia para el tratamiento de afecciones de enfermedades autoinmunes, el resto anti-CD32 se dirige específicamente a ambos CD32a y CD32b con una afinidad aproximadamente igualmente alta, p. ej., una afinidad diferencial de unión a cada una de las dianas CD32a y CD32b de menos de 2 log, preferiblemente menos de 1 log de diferencia en los valores de Kd.
Específicamente, se proporciona además una composición inmunogénica que comprende
a. un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando de TLR9 y una primera hélice alfa peptídica; y
b. un inmunógeno peptídico de gastrina-17 unido a una segunda hélice alfa peptídica enrollada en la primera hélice alfa, inmunógeno peptídico que es cualquiera de
(i) gastrina-17 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 78, o un fragmento de la misma que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 79, o al menos los 4 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID 79; (ii) un análogo de (i), preferiblemente de origen de mono rhesus o murino; y/o
(iii) una variante funcionalmente activa de cualquiera de (i) o (ii), con una, dos, tres o cuatro mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 79.
Específicamente, dicho inmunógeno peptídico es un péptido lineal que comprende o consiste en
(i) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 80, preferiblemente la SEQ ID 81;
(ii) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 82, preferiblemente la SEQ ID 83;
(iii) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 84, preferiblemente la SEQ ID 85; o
(iii) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 79 u 86.
Se prefiere que la composición inmunogénica descrita en la presente memoria comprenda al menos dos de los inmunógenos peptídicos unidos a la segunda hélice alfa peptídica, preferiblemente 2, 3 o 4 de los inmunógenos peptídicos.
Cuando más de un inmunógeno peptídico se une a la segunda hélice alfa, los inmunógenos peptídicos pueden, p. ej., conjugarse con la hélice alfa consecutivamente, es decir, uniendo los inmunógenos peptídicos en una fila, p. ej., uniendo el extremo C-terminal de un primer inmunógeno peptídico a un extremo N de un segundo inmunógeno peptídico, siendo el primer y segundo inmunógeno peptídico idénticos o diferentes entre sí.
Alternativamente, o además, se pueden incorporar inmunógenos peptídicos adicionales en la composición inmunogénica descrita en la presente memoria mediante reticulación, p. ej., dos o más inmunógenos peptídicos, que son idénticos o diferentes entre sí, se unen a la misma hélice alfa mediante una reacción química, tal como la reticulación química que permite el establecimiento de reticulaciones intermoleculares, p. ej., con reactivos homobifuncionales tales como adipimidato de dimetilo (DMA), suberimidato de dimetilo (DMS) o glutaraldehído. Por ejemplo, dicha reticulación puede realizarse empleando reticulación de glutaraldehído por grupos lisina libres de la hélice alfa o un espaciador/enlazador, respectivamente. Por lo tanto, dos o más inmunógenos peptídicos, como se usa como se describe en la presente memoria, se acoplan a la hélice alfa en paralelo o uno al lado del otro.
Según un aspecto específico adicional, la composición inmunogénica comprende una o más secuencias enlazadoras, preferiblemente compuestas por residuos de glicina y/o serina y/o lisina, preferiblemente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 89 o 90. Las secuencias enlazadoras pueden ser lineales o ramificadas, p. ej., para proporcionar enlace o reticulación entre dos o más entidades peptídicas o polipeptídicas.
Según un aspecto específico adicional, la composición inmunogénica comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SeQ ID 87 o SEQ ID 88.
Específicamente, se proporciona además una vacuna que comprende la composición inmunogénica descrita en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicha vacuna es típicamente una vacuna inmunoestimuladora, p. ej., que estimula la respuesta inmune humoral y de células T (Th1).
Según una realización preferida, la respuesta inmune humoral y de células T (Th1) es transitoria, p. ej., con una titulación máxima de IgG específica inducida tras la vacunación que se logra típicamente en un período de 2 a 8 semanas tras la vacunación, seguido de una reducción de la titulación de al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o hasta un 100 %, en los 6 meses posteriores a la vacunación, preferiblemente en los 5 meses, o en los 4 meses, o en los 3 meses, o en los 2 meses. Dicha titulación reducida puede incrementarse de nuevo con una inyección de refuerzo. En una serie de vacunaciones, la respuesta inmune transitoria posiblemente se determina con la última inyección de la composición inmunogénica o vacuna. La respuesta inmune transitoria tiene la ventaja de un tratamiento controlado, p. ej., con la posibilidad de interrumpir o suspender el tratamiento según sea necesario.
En la presente memoria se proporciona en particular una vacuna que comprende una composición inmunogénica que comprende
- un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando de TLR9, y
- un inmunógeno, que se une al adyuvante dirigido, preferiblemente mediante enlace o unión por afinidad; p. ej., fusión mediante tecnologías de ADN recombinante o conjugado químicamente.
para su uso en el tratamiento de un sujeto para incitar una respuesta inmune IgG dirigida al inmunógeno que es transitoria, preferiblemente con una titulación máxima de IgG específica inducida tras la vacunación que se logra típicamente en de un período de 2 a 8 semanas después de la vacunación, seguido de una reducción de la titulación en al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, o al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, o al menos un 90 %, o hasta un 100 %, en 6 meses después de la vacunación, p. ej., tras la última vacunación de una serie de vacunaciones.
Dicha vacuna se usa preferiblemente con un inmunógeno que es o comprende un antígeno o epítopo de un autoantígeno, p. ej., seleccionado del grupo que consiste en un antígeno asociado a tumor (TAA), preferiblemente un receptor de superficie de la célula tumoral o un antígeno soluble producido por la célula tumoral, tal como Her2/neu, gastrina, interferón alfa (INFa), factor de crecimiento epidérmico (EGF), receptor de EGF (EGF-R), molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), MUC-1 o LewisY, prehormonas y hormonas, tales como cualquiera de las hormonas digestivas, incluyendo la secretina o la insulina , hormonas tiroideas u hormonas sexuales.
El autoantígeno es particularmente de origen humano cuando se trata a un sujeto humano.
Por la respuesta inmune Th1 transitoria inducida con este tipo de vacuna, no hay una respuesta autoinmune irreversible, sino una respuesta reversible, que está indicada por el nivel de IgG circulante específica, p. ej., que es menor de, un 50 %, preferiblemente menor de un 60 %, preferiblemente menor de un 70 %, preferiblemente menor de un 80 % o menor de un 90 %, incluso hasta un 100 % de reducción de IgG circulante, después de que se ha inducido la IgG. La inducción de IgG está seguida, típicamente, de la reducción de IgG dentro de un período de tiempo específico, p. ej., en 1 año después de la última inmunización, o en 6 meses, o en 3 meses.
A este respecto, en la presente memoria se proporciona además un método para tratar a un sujeto que necesita una reducción transitoria de antígenos propios o autoantígenos administrando una cantidad eficaz de la vacuna al sujeto, p. ej., en una o más dosis, en donde al menos la última dosis proporciona el efecto transitorio.
Específicamente, se proporciona además un kit para preparar la composición inmunogénica descrita en la presente memoria, que comprende los siguientes componentes
a. un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando de TLR9 y una primera hélice alfa peptídica; y
b. un inmunógeno peptídico de gastrina-17 unido a una segunda hélice alfa peptídica que coincide con la primera hélice alfa, inmunógeno peptídico que es cualquiera de
(i) gastrina-17 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 78, o un fragmento de la misma que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 79, o al menos los 4 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID 79;
(ii) un análogo de (i), preferiblemente de origen de mono rhesus o murino; y/o
(iii) una variante funcionalmente activa de cualquiera de (i) o (ii), con una, dos, tres o cuatro mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 79.
El kit puede usarse específicamente para facilitar la producción de la vacuna usando el componente adyuvante dirigido preformado para la combinación con un inmunógeno que puede proporcionarse según la necesidad de un grupo de sujetos o del sujeto individual.
Específicamente, se proporciona además la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece de enfermedades o afecciones de enfermedades dependientes de gastrina. Dicha enfermedad o afección de enfermedad está causada principalmente por o está asociada con la producción o sobreproducción endógena de gastrina en el sujeto. Las enfermedades o afecciones de enfermedades dependientes de gastrina incluyen específicamente tumores dependientes de gastrina o cáncer dependiente de gastrina, tal como cáncer de páncreas, o cánceres gastrointestinales, úlcera gástrica, enfermedad por reflujo gastroesofágico (GERD), insuficiencia renal en estadio terminal (ESRF) u obesidad.
Por tanto, en la presente memoria se proporciona específicamente un método para tratar a un sujeto que padece de enfermedades dependientes de gastrina, tales como tumores dependientes de gastrina o cáncer dependiente de gastrina, tal como cáncer de páncreas, o cánceres gastrointestinales, úlcera gástrica, enfermedad por reflujo gastroesofágico (GERD), insuficiencia renal en estadio terminal (ESRF) u obesidad, administrando al sujeto una cantidad eficaz de la composición inmunogénica o la vacuna descrita en la presente memoria, ya sea profilácticamente, p. ej., para prevenir el brote de una enfermedad o afección de enfermedad o el progreso de una enfermedad, o terapéuticamente, p. ej., para mejorar una enfermedad o afección de enfermedad.
Específicamente, la composición se administra al sujeto en una cantidad eficaz empleando una estrategia de cebadorefuerzo.
Específicamente, la cantidad eficaz varía entre 0,0001 y 2 mg por administración, preferiblemente entre 0,001 y 2 mg por dosis.
Según una realización específica, el sujeto se trata adicionalmente mediante quimioterapia, p. ej., en el curso del tratamiento de un cáncer dependiente de gastrina.
Específicamente, la composición inmunogénica descrita en la presente memoria desencadena una respuesta inmune protectora en el sujeto, preferiblemente con una titulación de IgG en suero frente a la gastrina-17 humana de al menos 1/1.000, preferiblemente al menos 1/104, preferiblemente al menos 1/105, preferiblemente al menos 1/106, o menor, por lo tanto, detectable a una mayor dilución.
Figuras
La Figura 1 muestra la interacción de alta afinidad de la hélice enrollada utilizada en la presente memoria (Ejemplo 4).
El inmunógeno con hélice-K se usa para recubrir un chip BIACore y la carga útil con la hélice-E está en el tampón de flujo. Cada hélice comprende una hélice alfa de repetición de 5 veces de heptada
• Los datos confirman la extrema afinidad de las dos hélices entre sí (visualizada por una baja tasa de disociación)32.
• La unión de la hélice de inmunógeno a la hélice de la carga útil es específica y puede bloquearse mediante la preincubación con inmunógeno.
La Figura 2 muestra la reactividad de las células T inducida por el inmunógeno 3 (Ejemplo 6).
Se cultivaron PBMC de monos rhesus sensibilizados con Der p1 (macaca mulatta) en triplicado con Der p1 o inmunógeno 3. La proliferación se ensayó mediante la incorporación de [3H]-timidina. Los resultados se muestran como cuentas por minuto. Además, los sobrenadantes se ensayaron para determinar los niveles de IL-10 y GM-CSF, cada uno indicado como pg/ml.
• No hay una diferencia significativa entre la respuesta a Der p1 o al inmunógeno 3, ni en la proliferación ni en la producción de citocinas, lo que indica que los epítopos de las células T en el inmunógeno 3, que se seleccionaron sobre la base de la expresión de HLA de clase II humana, están igualmente bien presentados, por las moléculas de clase II de mono rhesus e inducen respuestas de células T igualmente fuertes
La Figura 3 muestra: Presentación de antígeno mejorada mediada por cargas útiles (Ejemplo 7)
Proliferación de células T a 24 h (ensayada mediante la incorporación de [3H]-timidina) del mono Rhesus (macaca mulatta) después de la preincubación durante 30' en hielo con carga útil y Der p1 respectivamente o carga útil e inmunógeno 3. Después de cada preincubación, las células se lavaron. (bdl = por debajo del límite de detección).
• Solo cuando el inmunógeno pudo interactuar con la carga útil a través de su hélice (inmunógeno 3), se pudo ver la proliferación de células T de una manera dependiente de la dosis. Der p1 no mostró una respuesta cuando se preincubó con la carga útil. Como control positivo, Der p1 se muestra reactivo después de la incubación durante la noche (sin lavado).
• La captación de antígenos mediada por cargas útiles es más eficaz que la captación a través de pinocitosis
La Figura 4 muestra la respuesta autoinmune inducida por un autoantígeno acoplado a CpG (Ejemplo 8)
Se cultivaron PBMC de monos rhesus (macaca mulatta) y PBMC humanas normales durante 24 h con CpG o CpG-biot o aCD32-biot CpG. Los sobrenadantes se recogieron y ensayaron para detectar IL-4 e IFNg s (cada uno indicado como pg/ml)
• En el caso en el que CpG se acopló a biot (CpG-biot), se indujo una IL-4 fuerte (PBMC de mono rhesus y humanas) en comparación con CpG sin biot. Las PBMC humanas también mostraron una fuerte respuesta de IFNg frente a CpG-biot. Cuando no se acoplaron biot y CpG (aCD32-biot CpG), no se observó un aumento de la respuesta en comparación con CpG en PBMC humanas o de monos rhesus
La Figura 5 muestra la reactividad de las células T inducida por el inmunógeno 5 (Ejemplo 10)
Se cultivaron PBMC de donantes humanos sanos durante 24 h en triplicado con Der p1 o inmunógeno 5. Los sobrenadantes se recogieron y ensayaron para detectar los niveles de IL-10 y GM-CSF (cada uno indicado como pg/ml; BDL = por debajo del límite de detección)
• Las células T humanas responden igualmente bien al inmunógeno 5 que a Der p1, medido por la inducción de IL-10 e IFNg.
La Figura 6 muestra la inducción de la respuesta autoinmune por la carga útil SG100. La inmunización con la carga útil indujo una fuerte respuesta de IgG1 e IgG2a frente a la hélice ScFV-1, así como frente al mAb IV.3 el día 28. Se observó una respuesta positiva independiente de la presencia de Alumbre. La inmunización con la hélice ScFV-1 solo indujo una respuesta de IgG 1 frente a la hélice ScFV-1 y solo en presencia de Alumbre, no se indujo respuesta de IgG2a.
Figura 7 (ejemplo 12.8)
Se midieron respuestas de IgG fuertes frente a la carga útil y al inmunógeno de SG100, pero no se detectaron anticuerpos frente a Der p1, Der p2, Der p5 o Der p7, lo que indica que los animales no habían estado expuestos a los alérgenos HDM ensayados y que SG100 no contiene epítopos de células B, que reaccionan de forma cruzada con los alérgenos HDM ensayados.
Figura 8 (ejemplo 12.8)
Los animales mostraron una fuerte proliferación cuando se estimularon in vitro con la carga útil, inmo5, Der p1, Der p2, Der p7, pero no frente a Der p5. Der p5 no es parte del inmo5.
Figura 9 (ejemplo 12.8)
Los animales produjeron IFNy pero no IL-4 después de la estimulación con la carga útil, inmo5, Der p1, Der p2, Der p7, pero no con Der p5. Der p5 no es parte del inmo5
La Figura 10 muestra el anticuerpo (inducción de IgG) en monos cynomolgus. Curva de tiempo de inducción de IgG anti G17, después de tres inyecciones con la vacuna (TYG100_2RM) los días d0, d14 y d28.
• Se observó una inducción de IgG significativa frente a ScFV-hélice1 y G17RM y G17H. No se observó respuesta frente a un péptido de control de peso molecular similar o cuando los animales se inmunizaron con G17RM_2 sin la presencia de la carga útil. Todas las titulaciones de IgG específicas disminuyen 4 semanas después de la última inmunización, lo que indica que las inyecciones de refuerzo son necesarias para mantener los niveles de IgG. Además, la presencia de G17RM natural no refuerza la respuesta y dado que la disminución de IgG frente a G17RM es significativamente mayor que la de ScFV-hélice1, se puede concluir que la respuesta inmune inducida es reversible. La Figura 11 muestra la pérdida de peso tras la inmunización anti-gastrina.
• Cuatro de los 6 animales mostraron una pérdida de peso significativa dependiente del tiempo después de la inmunización con TYG100_2RM. Los cuidadores de los animales observaron que estos animales perdían el apetito por el refrigerio vespertino, sin perder el interés por la comida diaria normal. Dichas observaciones nunca se hicieron con otras vacunas, por lo tanto, la vacuna anti-gastrina descrita en la presente memoria puede usarse para controlar la obesidad.
La Figura 12 muestra la información de secuencia de
SEQ ID 78: gastrina pequeña humana, G17;
SEQ ID 79: péptido de gastrina humana, primeros 12 AA (aminoácidos) (N-terminales) de la gastrina pequeña, G12; SEQ ID 80: epítopo N-terminal de la gastrina pequeña, primeros 4 AA (N-terminales), que incluyen variantes específicas funcionalmente activas con mutaciones puntuales;
SEQ ID 81: epítopo N-terminal de la gastrina pequeña, primeros 4 AA (N-terminales), que incluyen variantes funcionalmente activas más específicas con mutaciones puntuales;
SEQ ID 82: epítopo N-terminal de la gastrina pequeña, primeros 12 AA (N-terminales), que incluyen variantes específicas funcionalmente activas con mutaciones puntuales;
SEQ ID 83: epítopo N-terminal de la gastrina pequeña, primeros 12 AA (N-terminales), que incluyen variantes funcionalmente activas más específicas con mutaciones puntuales;
SEQ ID 84: epítopo N-terminal de la gastrina pequeña, primeros 13 AA (N-terminales), que incluyen variantes específicas funcionalmente activas con mutaciones puntuales;
SEQ ID 85: epítopo N-terminal de la gastrina pequeña, primeros 13 AA (N-terminales), que incluyen variantes funcionalmente activas más específicas con mutaciones puntuales;
SEQ ID 86: péptido de gastrina humana, primeros 13 AA (aminoácidos) (N-terminales) de la gastrina pequeña, G13; SEQ ID 87: componente inmunógeno de TYG100_1H: parte de una composición inmunogénica descrita en la presente memoria, que comprende un péptido de gastrina humana de la SEQ ID 86, una secuencia enlazadora y un péptido hélice alfa (TYG100_1H). Esta parte se puede unir al adyuvante dirigido adecuado mediante un enlace de hélice enrollada.
• negrita es el péptido inmunógeno, cursiva es enlazador, subrayado es hélice
SEQ ID 88: componente inmunógeno de TYG100_2H: parte de una composición inmunogénica descrita en la presente memoria, que comprende dos péptidos de gastrina humana de la SEQ ID 86, una secuencia enlazadora ramificada y un péptido hélice alfa (TYG100_2H). Esta parte se puede unir al adyuvante dirigido adecuado mediante un enlace de hélice enrollada.
• negrita es el péptido inmunógeno, cursiva es enlazador, subrayado es hélice
SEQ ID 89: secuencia de enlazador lineal;
SEQ ID 90: secuencia de enlazador ramificado.
Descripción detallada de la invención
Los términos específicos que se usan a lo largo de la memoria descriptiva tienen el siguiente significado.
El término "adyuvante", tal y como se usa en la presente memoria, significará un componente integrado o coadministrado de una vacuna, que:
- aumenta la respuesta inmune a un inmunógeno específico, p. ej., un antígeno o un hapteno. La respuesta inmune es típicamente mayor que la respuesta inmune incitada por una cantidad equivalente de la composición inmunogénica administrada sin el adyuvante, y/o
- el adyuvante se usa para dirigir un tipo o clase particular de respuesta inmune frente al inmunógeno, p. ej., un tipo de respuesta inmune Th1 o Treg, entendido en la presente memoria como "adyuvante dirigido".
Una "cantidad eficaz" de un adyuvante como se describe en la presente memoria específicamente es una cantidad que aumenta una respuesta inmunológica al inmunógeno de manera que, por ejemplo, se requieren dosis más bajas o menos de la composición inmunogénica para generar una respuesta inmune eficaz de la clase pretendida.
El adyuvante dirigido como se describe en la presente memoria no solo media la respuesta inmune eficaz, sino también la regulación de la respuesta inmune de la forma deseada. Dirigiendo el inmunógeno a las células inmunes apropiadas para su internalización y procesamiento posterior, se induce la respuesta inmune Th1 en lugar de la respuesta inmune Th2, en particular cuando se emplea un ligando de TLR9 que es un agonista de TLR9 del grupo 3. Si se usa un antagonista de TLR9 en la composición de la vacuna, la respectiva respuesta inmune se modula a la baja, en cualquier caso. Si un agonista de TLR9 del grupo 1 se combina con un resto anti-CD32 que se une a CD32b, normalmente se anticipa la inducción de las células Treg.
Una "cantidad eficaz" de un adyuvante descrito en la presente memoria específicamente es una cantidad que aumenta una respuesta inmunológica al inmunógeno de manera que, por ejemplo, se requieren dosis más bajas o menos de la composición inmunogénica para generar una respuesta inmunitaria eficaz de la clase pretendida.
El adyuvante dirigido como se describe en la presente memoria no solo media la respuesta inmune eficaz, sino también la regulación de la respuesta inmune de la forma deseada. Dirigiendo el inmunógeno a las células inmunes apropiadas para su internalización y procesamiento posterior, se induce la respuesta inmune Th1 en lugar de la respuesta inmune Th2, en particular cuando se emplea un ligando de TLR9 que es un agonista de TLR9 del grupo 3. Si un agonista de TLR9 del grupo 1 se combina con un resto anti-CD32 que se une a CD32b, normalmente se anticipa la inducción de las células Treg.
Una "cantidad eficaz" de una composición inmunogénica, p. ej., como se usa en una vacuna proporcionada en la presente memoria se refiere a una cantidad suficiente para mostrar un beneficio significativo en un sujeto que está siendo tratado, cuando se administra como parte de un régimen de dosificación de vacunación. Los expertos en la técnica apreciarán que, en algunas realizaciones, se puede considerar que una composición particular contiene una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz si contiene una cantidad apropiada para una forma de dosificación unitaria administrada en un régimen de dosificación específico, aunque dicha cantidad puede ser insuficiente para lograr un beneficio significativo si se administra como una sola dosis unitaria. Los expertos en la técnica apreciarán además que una cantidad eficaz de una composición inmunogénica puede diferir para diferentes sujetos que reciben la composición, por ejemplo, dependiendo de factores tales como el punto final biológico deseado, la naturaleza de la composición, la vía de administración, la salud, tamaño y/o edad del sujeto que está siendo tratado, etc. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es aquella que se ha correlacionado con un efecto beneficioso cuando se administra como parte de un régimen de dosificación particular, p. ej., una sola administración o una serie de administraciones, tal como en un régimen de "refuerzo".
El término "hélice alfa peptídica" tal y como se usa en la presente memoria significará un resto estructural enrollado basado en una secuencia de péptidos que comprende varias repeticiones, también llamadas repeticiones enrolladas. Dicha hélice alfa es capaz de unirse a otra contraparte, también llamada hélice alfa coincidente del mismo tipo para formar un dímero, un trímero u otro oligómero, también llamado hélice enrollada.
Una hélice enrollada es un resto estructural en polipéptidos o péptidos, en el que de dos a siete hélices alfa se enrollan juntas como las hebras de una cuerda. En algunas realizaciones, la hélice enrollada de la vacuna es una con dos hélices alfa enrolladas juntas. Es probable que dichas regiones helicoidales alfa formen estructuras de hélices enrolladas y pueden estar implicadas en la oligomerización de las repeticiones enrolladas como se mide en un ensayo de unión de interacción de hélices enrolladas adecuado.
Específicamente, se puede formar un dímero de hélices alfa poniendo en contacto los dos monómeros, de manera que el dímero se forma a través de una interacción con los dos dominios de las hélices enrolladas de la hélice alfa. En algunas realizaciones, las hélices comprenden un péptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 2 (hélice y anti-hélice), que incluyen repeticiones x.
EVSAL (SEQ ID 97)
E5: EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK-NH2 (SEQ ID 1)
KVSAL (SEQ ID 98)
K5: KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE-NH2 (SEQ ID 2)
Alternativamente, pueden usarse cualquiera de las secuencias descritas por Chao et al33 o Litowsky et al34 o equivalentes funcionales, que generan el tipo de enlace específico de hélice enrollada:
Figure imgf000016_0001
Para el propósito de la presente descripción, el tipo preferido de una hélice enrollada es un dímero, ya sea un heterodímero (heterohélice) de dos hélices diferentes, pero coincidentes, que difieren en al menos un aminoácido en la secuencia repetida enrollada, o bien un homodímero. de dos hélices coincidentes idénticas, es decir, las que comprenden las secuencias de repetición enrolladas coincidentes (las "hélices").
El número preferido de repeticiones enrolladas es 3-5, preferiblemente cualquiera de las combinaciones 3+3, 3+4, 3+5, 4+4, 4+5, 5+5, 4+3, 5+3 o 5+4.
Como alternativa a las repeticiones de heptada (repeticiones de una secuencia de aminoácidos que consiste en 7 aminoácidos, 7-mer), se pueden usar 6-mer, 8-mer o 9-mer.
En el caso de una hélice enrollada homodimérica, el número típico de repeticiones enrolladas es específicamente no más de 5, para evitar desajustes no deseados de la estructura. En el caso de una hélice enrollada heterodimérica, típicamente es deseable emplear una longitud de la secuencia peptídica con al menos 3 hélices. Por lo tanto, la unión de los componentes de la vacuna, es decir, el adyuvante dirigido y los componentes inmunógenos, entre sí se logra típicamente con una alta afinidad preferida de una Kd de menos de 10-7 M, más preferido menos de 10-8 M o 10-9 M. Sin embargo, aunque más repeticiones aumentan la afinidad, esto puede ser a costa de una mayor homodimerización
Los componentes de la composición inmunogénica descrita en la presente memoria también pueden comprender un espaciador peptídico para unir el resto anti-CD32 y/o el ligando de TLR9, y opcionalmente también el epítopo (p. ej., del péptido inmunógeno) con las repeticiones enrolladas, respectivamente. Por ejemplo, el espaciador peptídico puede estar en uno o ambos extremos de una hélice enrollada. Cada uno de los espaciadores peptídicos se puede unir a un único dominio de hélice enrollada de hélice alfa de la hélice enrollada.
El espaciador peptídico puede ser, por ejemplo, un péptido de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos o más, ya sean lineales o ramificados, p. ej., para proporcionar dos, tres, cuatro o más ramificaciones. El número de aminoácidos en el espaciador peptídico puede ser, en algunas realizaciones, 20 aminoácidos o hasta 10 aminoácidos más o menos, dependiendo de las secuencias particulares y la longitud de la hélice.
El término "resto anti-CD32", tal y como se usa en la presente memoria, significará un ligando que se une específicamente al CD32 diana celular, ya sea CD32a, CD32b o ambos, CD32a y CD32b. El resto puede ser cualquier estructura de unión, tal como un derivado de proteínas, polipéptidos o péptidos, incluidos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos o moléculas compuestas con una parte de unión. La parte de unión de las moléculas o del complejo de moléculas descritas en la presente memoria puede estar compuesta por proteínas tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fv, dímero VH/VL, scFv, dAb, F(ab)2, minicuerpo, dominios de inmunoglobulina mutados pequeños, Fcab, Mab2 u otros agentes de unión biológicos, tales como el receptor soluble de células T, Darpins, etc. Pueden generarse y seleccionarse anticuerpos y fragmentos y derivados de anticuerpos para unirse a CD32 de acuerdo con métodos conocidos tales como tecnología de hibridomas, clonación de células B, presentación en fagos, presentación en levaduras, presentación en ribosomas o presentación en la superficie celular de bibliotecas de anticuerpos, cribado de matrices de anticuerpos variantes. Los ejemplos de restos anti-CD32 son scFv derivados del anticuerpo monoclonal anti-CD32 AT-1035, IV.336, 2E637 o cualquier otro anticuerpo monoclonal frente a aCD32
La unión específica se puede determinar en un ensayo de unión adecuado, tal como inmunoensayos convencionales.
Existen numerosos métodos conocidos en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo. Se pueden usar varios inmunoensayos conocidos en la técnica, incluidos sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, transferencia Western, BIAcore, etc.
El término "reactividad cruzada" con respecto a antígenos o anticuerpos tal y como se usa en la presente memoria se referirá a epítopos compartidos entre antígenos de diferente origen, p. ej., de origen humano, mono rhesus o ratón. Se encontró que el epítopo N-terminal que consiste en o comprende los primeros 4 AA de G17 tiene reactividad cruzada en péptidos de diversos orígenes, epítopo que desencadena una respuesta inmune y anticuerpos IgG que reaccionan de manera cruzada con los epítopos.
La composición inmunogénica descrita en la presente memoria es específicamente útil para tratar enfermedades dependientes de gastrina o afecciones de enfermedad que están asociadas con el exceso de gastrina, p. ej., tumores dependientes de gastrina o cáncer dependiente de gastrina, tales como cáncer de páncreas, úlcera gástrica, enfermedad por reflujo gastroesofágico (GERD), insuficiencia renal en estadio terminal (ESRF) u obesidad.
El término "tumor dependiente de gastrina" o "cáncer dependiente de gastrina", tal y como se usa en la presente memoria, se referirá a tumores o enfermedad o afecciones de enfermedad asociadas con los mismos, de p. ej., adenocarcinoma colorrectal dependiente de gastrina y otros cánceres dependientes de gastrina tales como de estómago, hígado, páncreas y carcinoma de pulmón de células pequeñas. El término se usa específicamente en la presente memoria con respecto al tratamiento del tumor para prevenir la progresión de la enfermedad tumoral, para una respuesta tumoral positiva o para el encogimiento del tumor. El término también se aplica a la enfermedad residual mínima, que se trataría con éxito, p. ej., tomando como diana las células tumorales circulantes para reducir su número por debajo de un cierto umbral, p. ej., por debajo del límite de detección.
La enfermedad de úlcera gástrica puede estar causada por un aumento de la acidez del estómago y una ruptura de las complejas defensas del estómago que normalmente protegen la mucosa gástrica del daño causado por los ácidos. Aunque las dos afecciones tienen etiologías diferentes, ambas se benefician de una reducción en la secreción de ácido gástrico. El ácido gástrico se produce en una célula del estómago especializada, la célula parietal. Las células parietales pueden estimularse para que secreten ácido mediante acetilcolina, histamina y gastrina, tras la unión de cada uno de estos compuestos con receptores específicos en la superficie de la célula. De estos, el estimulador más potente de la secreción de ácido es la hormona peptídica gastrina. La terapia de inmunoterapia anti-gastrina como se describe en la presente memoria mejoraría las afecciones de enfermedad de úlcera gástrica.
El término "péptido gastrina-17" o "péptido G17" o "G17", tal y como se usa en la presente memoria, se referirá a la gastrina pequeña G17, que consiste en los 17 AA N-terminales de la gastrina. El péptido G17 puede ser de origen humano u otro origen de mamífero, incluido el mono rhesus o el ratón, por tanto, tiene una secuencia humana o de otro mamífero, o puede ser una construcción artificial, para incorporar secuencias artificiales, p. ej., obtenida cambiando el tipo y/o secuencia de residuos de aminoácidos en la secuencia de G17 nativa (de origen natural). El término incluirá específicamente variantes de G17 humano, con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 78, o fragmentos de la misma, pero difiere de su secuencia peptídica en que se deriva de una secuencia homóloga de una especie diferente. Estos se denominan variantes o análogos de origen natural. El término "análogos" también se referirá a construcciones quiméricas que se originan a partir de dos o más orígenes, en donde al menos una parte es de origen natural, p. ej., que constituye la mayor parte (al menos el 50 %) del inmunógeno peptídico, y otra parte es diferente del mismo, ya sea de origen natural o sintético (artificial).
El término incluirá específicamente fragmentos o variantes funcionalmente activas de G17, p. ej., los que comprenden una o más mutaciones puntuales, o también péptidos o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos adicionales además del G17, p. ej., extendiendo el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal con uno o más residuos o secuencias de aminoácidos adicionales. Una extensión del extremo C se prefiere, p. ej., con repeticiones de secuencias G17, idénticas o no, o con secuencias de aminoácidos adicionales de gastrina.
El término incluirá específicamente los péptidos con uno o más residuos de aminoácidos modificados. Las modificaciones comunes incluyen fosforilación, metilación, acetilación, amidación, formación de ácido pirrolidona carboxílico, isomerización, hidroxilación, sulfatación, unión a flavina, oxidación de cisteína y nitrosilación. La modificación ilustrativo como se describe en la presente memoria es la modificación del ácido glutámico N-terminal de G17, es decir, el piroGlu en la posición 1, que también se conoce como "ácido pirrolidona carboxílico (Glu)" o pGlu o pE.
El término "variantes funcionalmente activas" tal y como se usa en la presente memoria con respecto al inmunógeno peptídico descrito en la presente memoria, significará una secuencia resultante de la modificación de esta secuencia (una secuencia parental), p. ej., por inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos, tal como por técnicas de recombinación o derivatización química de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, o nucleótidos dentro de la secuencia de nucleótidos codificante, o en uno o ambos de los extremos distales de la secuencia, y cuya modificación no afecta (en particular, perjudica) la actividad de esta secuencia. En el caso de que un inmunógeno peptídico incite una determinada respuesta inmune frente a la gastrina diana, la variante funcionalmente activa del inmunógeno peptídico aún incorporaría el determinante antigénico o epítopo, aunque esto podría cambiarse, p. ej., para aumentar la inmunogenicidad. Específicamente, las variantes funcionalmente activas del inmunógeno peptídico G17, o un fragmento del mismo, tal como el fragmento G12 o G13, tienen la potencia de incitar anticuerpos IgG anti-gastrina en un sujeto tratado, anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con la gastrina endógena del sujeto.
Pueden obtenerse variantes funcionalmente activas, p. ej., cambiando la secuencia de un péptido parental, p. ej., el péptido G17 humano, de mono rhesus o murino, o un fragmento del mismo, p. ej., el péptido G12 o G13, mediante la introducción de una o más modificaciones que no deterioran sustancialmente los epítopos de reacción cruzada, para obtener una molécula con sustancialmente la misma inmunogenicidad. El término "sustancialmente la misma inmunogenicidad" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la cantidad de una respuesta inmune o anticuerpos IgG anti-gastrina inducidos en un sujeto tratado con la composición inmunogénica, cantidad que es preferiblemente al menos un 20 % al menos un 30 % al menos un 40 %, al menos un 50 % al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o incluso al menos un 100 % o al menos un 110 %, o al menos un 120 %, o al menos un 130 %, o al menos un 140 %, o al menos un 150 %, o al menos un 160 %, o al menos un 170 %, o al menos un 180 %, o al menos un 190 %, p. ej., hasta un 200 % de la cantidad determinada para el péptido parental.
En una realización preferida, la variante funcionalmente activa de un péptido parental
a) deriva del péptido mediante al menos una sustitución, inserción (adición) y/o deleción de aminoácidos, p. ej., que comprende una o más mutaciones puntuales en donde la variante funcionalmente activa tiene una identidad de secuencia específica con la molécula parental, tal como al menos un 50 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 60 %, más preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 80 %, aún más preferiblemente al menos un 90 %; y/o
b) consiste en el péptido y adicionalmente al menos un aminoácido heterólogo al péptido.
Pueden obtenerse variantes funcionalmente activas mediante alteraciones de secuencia en la secuencia del péptido, p. ej., por una o más mutaciones puntuales, en donde las alteraciones de secuencia retienen sustancialmente una función de la secuencia peptídica inalterada, cuando se usa como se describe en la presente memoria. Dichas alteraciones de secuencia o mutaciones puntuales pueden incluir, pero no se limitan a, sustituciones (conservativas), adiciones, deleciones, mutaciones e inserciones, p. ej., la alteración de 1,2, 3 o 4 aminoácidos, o mediante la adición o inserción de uno a varios aminoácidos, p. ej., 1,2, 3 o 4 aminoácidos, o mediante una derivatización química de uno a varios aminoácidos, p. ej., 1, 2, 3 o 4, o una combinación de los mismos, preferiblemente mediante mutaciones puntuales que no son contiguas. Las sustituciones en los residuos de aminoácidos pueden ser sustituciones conservativas, por ejemplo, sustituyendo un aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófobo alternativo.
Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Los ejemplos de dichas familias son los aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas no polares, con cadenas laterales aromáticas no polares, con cadenas laterales polares sin carga, con cadenas laterales pequeñas, con cadenas laterales grandes, etc.
Las mutaciones puntuales preferidas se refieren al intercambio de aminoácidos de la misma polaridad y/o carga. A este respecto, los aminoácidos se refieren a veinte aminoácidos de origen natural codificados por sesenta y cuatro codones de tripletes. Estos 20 aminoácidos se pueden dividir en aquellos que tienen cargas neutras, cargas positivas y cargas negativas:
Los aminoácidos "neutros" se muestran a continuación junto con sus respectivos códigos de tres letras y de una sola letra y polaridad:
Alanina: (Ala, A) no polar, neutra;
Asparagina: (Asn, N) polar, neutra;
Cisteína: (Cys, C) no polar, neutra;
Glutamina: (Gin, Q) polar, neutra;
Glicina: (Gly, G) no polar, neutra;
Isoleucina: (Ile, I) no polar, neutra;
Leucina: (Leu, L) no polar, neutra;
Metionina: (Met, M) no polar, neutra;
Fenilalanina: (Phe, F) no polar, neutra;
Prolina: (Pro, P) no polar, neutra;
Serina: (Ser, S) polar, neutra;
Treonina: (Thr, T) polar, neutra;
Triptófano: (Trp, W) no polar, neutro;
Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutra;
Valina: (Val, V) no polar, neutra; e
Histidina: (His, H) polar, positiva (10 %) neutra (90 %).
Los aminoácidos cargados "positivamente" son:
Arginina: (Arg, R) polar, positiva; y
Lisina: (Lys, K) polar, positiva.
Los aminoácidos cargados "negativamente" son:
Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativo; y
Ácido glutámico: (Glu, E) polar, negativo.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de péptidos descritas en la presente memoria se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia peptídica específica, después de alinear la secuencia e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan.
Pueden obtenerse variantes funcionalmente activas mediante cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, incluidas mutaciones puntuales en las posiciones deseadas, p. ej., obtenidas mediante técnicas de aleatorización. En algunos casos, las posiciones se eligen al azar, p. ej., con cualquiera de los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para aleatorizar las secuencias de péptidos. A este respecto, el término "mutagénesis" se refiere a cualquier técnica reconocida en la técnica para alterar una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos. El término "inmunógeno" tal y como se usa en la presente memoria significará uno o más antígenos que desencadenan una respuesta inmune en un sujeto. El término "antígeno" tal y como se usa en la presente memoria se referirá en particular a cualquier determinante antigénico, que posiblemente pueda ser reconocido por un sitio de unión de un anticuerpo o que sea capaz de unirse al surco peptídico de moléculas HLA de clase I o clase II y, como tal, puede servir como estimulador para células T específicas. El antígeno diana se reconoce como una molécula diana completa o como un fragmento de dicha molécula, especialmente subestructuras, p. ej., una estructura de polipéptidos o carbohidratos de dianas, generalmente denominados "epítopos", p. ej., epítopos de células B, epítopo de células T), que son inmunológicamente relevantes, es decir, también son reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales. En la presente memoria se prefiere el uso de epítopos de células T, p. ej., para proporcionar vacunas para la alergia. El término "inmunógeno peptídico" tal y como se usa en la presente memoria significará un antígeno o inmunógeno de estructura peptídica, en particular un inmunógeno que comprende o consiste en un péptido de una secuencia de aminoácidos específica, que se proporciona como un péptido lineal o péptido ramificado, que comprende residuos de aminoácidos naturales o modificados, p. ej., un derivado obtenido por modificación o derivatización química, tal como por fosforilación, metilación, acetilación, amidación, formación de ácido pirrolidona carboxílico, isomerización, hidroxilación, sulfatación, unión a flavina, oxidación de cisteína y nitrosilación.
El inmunógeno peptídico está diseñado específicamente para desencadenar una respuesta inmune en un sujeto, e incluye particularmente uno o más determinantes antigénicos, que posiblemente pueden ser reconocidos por un sitio de unión de un anticuerpo o pueden unirse al surco peptídico de moléculas de HLA de clase I o de clase II u otras moléculas presentadoras de antígenos tales como CD1 y, como tales, pueden servir como estimulador para células T específicas. El antígeno diana se reconoce como una molécula diana completa o como un fragmento de dicha molécula, especialmente subestructuras, p. ej., una estructura de polipéptidos o carbohidratos de dianas, generalmente denominados "epítopos", p. ej., epítopos de células B, epítopo de células T, que son inmunológicamente relevantes, es decir, también son reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales. En la presente memoria, se prefiere el uso de epítopos de células B para proporcionar p. ej., vacunas oncológicas.
El término "epítopo" tal y como se usa en la presente memoria se referirá en particular a una estructura molecular que puede constituir completamente una pareja de unión específica o ser parte de una pareja de unión específica a un sitio de unión de un anticuerpo modular como se describe en la presente memoria. El término epítopo también puede referirse a haptenos. Químicamente, un epítopo puede estar compuesto por un carbohidrato, un péptido, un ácido graso, una sustancia orgánica, bioquímica o inorgánica o derivados de los mismos y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo es un polipéptido, normalmente incluirá al menos 3 aminoácidos, preferiblemente al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 aminoácidos. No existe un límite superior crítico para la longitud del péptido, que podría comprender casi la longitud completa de una secuencia polipeptídica de una proteína. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o conformacionales. Un epítopo lineal está compuesto por un único segmento de una secuencia primaria de una cadena de polipéptido o carbohidrato. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o estar superpuestos. Los epítopos conformacionales están compuestos por aminoácidos o carbohidratos reunidos por plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal. Específicamente, los epítopos son al menos parte de moléculas relevantes para el diagnóstico, es decir, la ausencia o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona cualitativa o cuantitativamente con una enfermedad o con el estado de salud de un paciente o con un estado de proceso en la fabricación o con estado ambiental y alimentario. Los epítopos también pueden ser al menos parte de moléculas terapéuticamente relevantes, es decir, moléculas que pueden ser tomadas como diana por el dominio de unión específico que cambia el curso de la enfermedad.
Se pueden usar uno o más epítopos del mismo antígeno o diferentes antígenos como se describe en la presente memoria, que pueden incluir antígenos de todos los antígenos propios, patógenos, alérgenos o autoantígenos para los que se desea la regulación de la respuesta inmune, p. ej., frente al que se desea la inducción de una respuesta sustancial de tipo Th1 o una respuesta Treg (dependiendo del tipo de vacuna) en el huésped.
En la enfermedad del cáncer, es deseable una respuesta inmune a un autoantígeno. El término "autoantígeno", tal y como se usa en la presente memoria, significa cualquier antígeno, específicamente polipéptido o péptido producido por un sujeto sano normal que no incita una respuesta inmune como tal. Estos autoantígenos pueden producirse a niveles aberrantes o altos en ciertos estados de enfermedad, incluida la enfermedad del cáncer, los denominados antígenos asociados a tumores (TAA). En la presente memoria, la gastrina humana o G17 humana se entiende como un autoantígeno en sujetos humanos, y específicamente como un TAA en sujetos que padecen de un tumor dependiente de gastrina. Los antígenos propios que están asociados con enfermedades autoinmunes se denominan en la presente memoria autoantígenos.
Se entiende que los autoantígenos pueden producirse de forma natural, recombinante o sintética. También se entiende que los autoantígenos no necesitan ser idénticos al antígeno producido naturalmente, sino que pueden incluir variaciones del mismo que tengan ciertas identidades, similitudes u homologías de secuencia.
La elección del autoantígeno para su uso en la terapia del cáncer depende del tipo y estadio de la enfermedad del cáncer y, en particular, del patrón de expresión de una célula cancerosa, tal como la derivada de un tumor o metástasis. Los ejemplos específicos de antígenos asociados a tumores seleccionados posiblemente usados en una vacuna descrita en la presente memoria son la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), Lewis Y, alfafetoproteína (AFP) y antígeno carcinoembrionario (CEA), HER2/Neu, MUC-1, etc.
La elección de un antígeno propio para su uso en la terapia de enfermedades autoinmunes depende del tipo de la enfermedad autoinmune. Los ejemplos específicos de antígenos asociados a enfermedades autoinmunes seleccionados posiblemente usados en una vacuna descrita en la presente memoria son C1 q, ADAMTS13, Desmogelina 3, queratina, gangliósidos (p. ej., GM1, GD1a, GQ1b), colágeno tipo IV, IgM, cardiolipina, anexina A5, etc.
En algunas realizaciones, el inmunógeno comprende uno o más alérgenos específicos. Un "alérgeno" es un antígeno que puede iniciar un estado de hipersensibilidad o que puede provocar una reacción de hipersensibilidad inmediata en un sujeto ya sensibilizado con el alérgeno. Los alérgenos son comúnmente proteínas o productos químicos unidos a proteínas que tienen la propiedad de ser alergénicos. Sin embargo, los alérgenos también pueden incluir materiales orgánicos o inorgánicos derivados de una variedad de fuentes sintéticas o naturales tales como materiales vegetales, metales, ingredientes en cosméticos o detergentes, látex o similares.
La elección de un alérgeno para su uso en la terapia antialérgica depende del tipo y la gravedad de la alergia. Los ejemplos específicos de antígenos asociados a alergias seleccionados posiblemente usados en una vacuna descrita en la presente memoria son cualquier alérgeno usado convencionalmente como inmunógeno, específicamente alérgenos de ácaros del polvo doméstico (p. ej., Der p1, Der p2, Der p3/Der p23, Der f1, Der f2, Derf3/Der f23), caspa de gato, polen de césped o árbol, alérgenos de cucarachas, etc.
La elección de un antígeno que induce específicamente una respuesta inmune frente a un patógeno para su uso en la profilaxis o terapia de enfermedades infecciosas depende del tipo de patógeno, p. ej., un agente infeccioso microbiano o viral. Los ejemplos específicos de antígenos derivados de patógenos seleccionados posiblemente usados en una vacuna descrita en la presente memoria son hepatitis B, hepatitis C, cólera, VIH, tos ferina, Influenza, tifoidea, etc.
El inmunógeno peptídico o la composición inmunogénica usada en la vacuna descrita en la presente memoria está normalmente contenido en una vacuna en una cantidad eficaz, que en la presente memoria se entiende específicamente como "cantidad inmunológicamente eficaz". Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esa cantidad a un sujeto, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie de dosis, es eficaz sobre la base de los objetivos terapéuticos o profilácticos. Esta cantidad variará dependiendo de la salud y la condición física del sujeto a tratar, la edad, la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos, el grado de respuesta inmune deseado, la formulación de la vacuna y otras condiciones.
En la presente memoria se proporciona además un método para tratar a un sujeto o generar una respuesta inmune en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una cantidad inmunológicamente eficaz del inmunógeno peptídico, la composición inmunogénica o la vacuna descrita en la presente memoria.
Una cantidad o dosificación eficaz puede variar de 0,0001 a 2 mg, p. ej., entre 0,001 y 2 mg, de la composición inmunogénica administrada al sujeto que la necesita, p. ej., un sujeto humano adulto. La dosificación eficaz de la composición inmunogénica es capaz de incitar una respuesta inmune en un paciente de niveles eficaces de titulación de anticuerpos para unirse y neutralizar el G17 precursor y maduro endógeno, p. ej., durante 1-3 meses después de la inmunización. La eficacia de la terapia puede ensayarse mediante las titulaciones de anticuerpos anti-gastrina en muestras de sangre extraídas del sujeto.
El término "ligando de TLR9" tal y como se usa en la presente memoria se entiende de la siguiente manera.
El receptor semejante a Toll 9 (TLR9) reconoce el ADN CpG bacteriano no metilado e inicia una cascada de señalización que conduce a la producción de citocinas proinflamatorias. Existen numerosas estructuras o secuencias que se ha mostrado que actúan como ligando de TLR9, es decir, se unen a este receptor y, por lo tanto, activan (estimulan, regulan al alza, agonista de TLR9) o desactivan (regulan a la baja, antagonista de TLR9) TLR9. Por ejemplo, el ADN microbiano o ADN sintético, p. ej., ODN CpG sintético puede estimular TLR9 con variaciones en el número y localización de los dímeros CpG, así como las secuencias de bases precisas que flanquean los dímeros CpG. Los ODN CpG sintéticos se diferencian del ADN microbiano en que tienen un esqueleto parcial o completamente fosforotioado en lugar del esqueleto típico de fosfodiéster y pueden tener o no una cola poli G en el extremo 3', extremo 5', o ambos.
El término "agonista" junto con el ligando de TLR9 tal y como se usa en la presente memoria se referirá específicamente a la unión y activación de TLR9 en un ensayo basado en células.
El ligando de TLR9 que está compuesto por una secuencia de nucleótidos se acopla típicamente al componente adyuvante dirigido de la presente composición inmunogénica mediante acoplamiento químico, p. ej., usando el KIT disponible comercialmente de Solulink. Un ligando de TLR9 peptídico se puede acoplar usando química de péptidos estándar o se puede integrar usando tecnología de ADN recombinante.
Los ligandos de TLR9 ilustrativos son ODN 221638 (grupo 1), ODN 2006/ODN 200739 (grupo2) y CpG-M36240 (grupo 3).
Otros ligandos de TLR9 ilustrativos pueden ser péptidos que mimetizan la acción de un agonista de TLR9 de CpG, p. ej., identificados por u obtenidos a partir de una biblioteca de péptidos, que se seleccionan por la afinidad para unirse al TLR9 y la actividad agonista probada, o ligandos proteicos, incluidos los anticuerpos específicos.
Los ligandos de TLR9 específicos son péptidos inmunoestimuladores, p. ej., aquellos que mimetizan cualquiera de las clases de CpG, tales como péptidos seleccionados de una biblioteca de péptidos adecuada. Los péptidos inmunoestimuladores ilustrativos se seleccionan del grupo que consiste en ESWDKFLSHYLP (SEQ ID 50), TDWSWFY (SEQ ID 51), YPVYWPW (SEQ ID 52), EWWFYWP (SEQ ID 53), WFPIEWW (SEQ ID 54), DQVDIGY (SEQ ID 55), THQVYIS (SEQ ID 56), WFPIEWWFYWP (SEQ ID 57), DSWQAFLTKFVL (SEQ ID 58), HDIQWFWQHWNS (SEQ ID 59), WSWWDHTFNYML (SEQ ID 60), TTQQTWNVRYPY (SEQ ID 61), DHTMPWTRNAKN (SEQ ID 62), SWDPYWPFPWFS (SEQ ID 63), AIYYVPSPMFTV (SEQ ID 64), ETTLLKMWLAQM (SEQ ID 65), YPWLDVVVSLY (SEQ ID 66), VPGWHYLATLRA (SEQ ID 67) y FDPLGSRDIKGS (SEQ ID 68), y variantes funcionalmente activas de los mismos, que son fragmentos, mutantes o híbridos de los mismos.
Más específicamente, la variante funcionalmente activa estimula las pDC, induciendo así un nivel aumentado de IL-6 y TNFalfa en comparación con un control negativo.
Específicamente, la variante funcionalmente activa
a) tiene al menos un 60 % de homología con cualquiera de los péptidos de la SEQ ID 50-68;
b) es un mutante de cualquiera de los péptidos de la SEQ ID 50-68, obtenible modificando la secuencia de aminoácidos parental mediante inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos en la secuencia o en uno o ambos de los extremos distales de la secuencia; o
c) es un fragmento de cualquiera de los péptidos de la SEQ ID 50-68 que comprende al menos 5 aminoácidos.
Los péptidos inmunoestimuladores específicos comprenden un resto seleccionado del grupo que consiste en EWWFYWP (SEQ ID 53), EWW (SEQ ID 125), WFY (SEQ ID 126), YWP (SEQ ID 127) y QVxl, siendo x cualquier aminoácido (SEQ ID 128).
La función de un ligando o agonista o antagonista de TLR9 puede determinarse en un ensayo adecuado, p. ej., de la siguiente manera: las pDC se purifican a partir de la sangre de un donante sano como describen Tel et al41 y posteriormente se incubaron con la concentración apropiada del ligando de TLR9. Después de 24 h, se mide el IFNa en el sobrenadante usando protocolos estándar de ELISA. Para la determinación del estado de maduración de las células, las pDC se tiñen para detectar la expresión de CD80, CD83 o CD86 usando procedimientos estándar de FACS con anticuerpos específicos disponibles comercialmente antes y después de la incubación con el ligando de TLR9.
El número de células T reactivas que se activan tras la exposición a la vacuna descrita en la presente memoria puede determinarse mediante varios métodos que incluyen ELISPOT, análisis FACS, liberación de citocinas o ensayos de proliferación de células T.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "especificidad" o "unión específica" se refiere a una reacción de unión que es determinante del ligando afín de interés en una población heterogénea de moléculas. Por tanto, en condiciones designadas (p. ej., condiciones de inmunoensayo), uno o más antígenos se unen específicamente al o a los respectivos sitios de unión de un agente de unión, que no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra. La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad o avidez de unión alta, media o baja, según se seleccione. La unión selectiva se logra normalmente, si la constante de unión o la dinámica de unión es al menos 10 veces diferente, preferiblemente la diferencia es al menos 100 veces, y más preferiblemente al menos 1.000 veces. Se entiende bien que el término también se referirá a agentes de unión multiespecíficos o de reactividad cruzada que reconocen específicamente uno o más antígenos diferentes.
El término "tratamiento", tal y como se usa en la presente memoria, siempre se referirá al tratamiento de sujetos con fines profilácticos (es decir, para prevenir la infección y/o el estado de la enfermedad) o terapéuticos (es decir, para tratar enfermedades independientemente de su patogénesis). El tratamiento de un sujeto será típicamente terapéutico en los casos de afecciones de enfermedades alérgicas, autoinmunes o de cáncer, o profiláctico en el tratamiento de afecciones de enfermedades infecciosas. El tratamiento de un sujeto será típicamente terapéutico en los casos de afecciones de enfermedades cancerosas, que incluyen tumores dependientes de gastrina o cáncer dependiente de gastrina. Sin embargo, en el caso de pacientes que padecen de una enfermedad primaria, que tienen riesgo de progresión de la enfermedad o riesgo de desarrollar una afección de enfermedad secundaria o una reacción secundaria, p. ej., que depende de la producción endógena de gastrina de los efectos de la gastrina, el tratamiento puede ser profiláctico.
También en el caso de pacientes alérgicos con riesgo de desarrollar la enfermedad, p. ej., debido a un historial familiar de alergia, el tratamiento puede ser profiláctico.
Dicho tratamiento puede efectuarse con la vacuna descrita en la presente memoria como el único agente profiláctico o terapéutico o también en combinación con cualquier medio adecuado, p. ej., incluida la quimioterapia o el uso de antiácidos.
El término "combinación" tal y como se usa a este respecto, p. ej., con respecto a la combinación de compuestos o tratamientos se refiere específicamente al tratamiento concomitante, simultáneo, paralelo o consecutivo de un sujeto.
Se tratan las siguientes enfermedades alérgicas específicas: rinoconjuntivitis alérgica (fiebre del heno), asma alérgico, eccema alérgico, tal como eccema atópico o dermatitis atópica.
Para la terapia de la alergia, las medidas terapéuticas adicionales particulares incluyen la aplicación de corticosteroides (inhalados) combinados con broncodilatadores en el asma alérgico, cremas que contienen esteroides (eccema atópico) y en formas más leves de alergia (p. ej., fiebre del heno), antihistamínicos e inmunoterapias específicas.
La alergia, en la que las respuestas Th2 polarizadas, la secreción abundante de IL-4/IL-13 y la respuesta de anticuerpos IgE son inapropiadas y perjudiciales, es solo un ejemplo de una respuesta inmune fallida. Otros ejemplos se caracterizan por afecciones mediadas por Th1 relacionadas con enfermedades autoinmunes sistémicas.
El tratamiento de las enfermedades autoinmunes con la vacuna descrita en la presente memoria puede referirse específicamente, entre otros ejemplos, a diabetes, síndrome de Guillain Barre, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple o trombocitopenia.
La profilaxis o terapia de enfermedades infecciosas empleando la vacuna descrita en la presente memoria se refiere específicamente a afecciones patológicas, tales como infecciones microbianas, es decir, afecciones causadas por patógenos bacterianos, virales, fúngicos, protozoarios o helmínticos. Para los propósitos de la presente descripción, el término "patógeno" se usa en un sentido amplio para hacer referencia a un agente causante específico de una enfermedad o afección, e incluye cualquier agente que incita una respuesta inmune. Los patógenos incluyen virus, bacterias, hongos, protozoos, parásitos y similares. Típicamente, el inmunógeno se deriva de uno o más antígenos peptídicos, polipeptídicos, proteicos o de carbohidratos producidos por un patógeno. Los métodos para identificar antígenos adecuados, obtener y preparar dichas moléculas, son bien conocidos en la técnica.
El tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por patógenos se refiere específicamente a, p. ej., hepatitis B, hepatitis C, cólera, VIH, tos ferina, influenza o tifoidea.
Los métodos inmunoterapéuticos para tratar tumores como se describen en la presente memoria se refieren específicamente a métodos y vacunas descritos en la presente memoria para tratar cánceres de cuello uterino, mama, colorrectal, próstata, pulmón y melanomas.
En la terapia del cáncer, los tratamientos terapéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, resección quirúrgica, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, vacunas antitumorales, terapias basadas en anticuerpos, irradiación de cuerpo entero, trasplante de médula ósea, trasplante de células madre de sangre periférica y la administración de agentes quimioterapéuticos.
Para el tratamiento, la composición inmunogénica o la vacuna descrita en la presente memoria se puede administrar de una vez, o se puede dividir en los componentes individuales y/o varias dosis más pequeñas para administrar a intervalos de tiempo. La vacuna se administra típicamente a una concentración de 0,1 a 500 pg/ml, p. ej., ya sea por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, oral, por inhalación o intranasal, con o sin un adyuvante adicional tal como Alumbre. Se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad que se está tratando y puede determinarse empíricamente usando protocolos de ensayo conocidos o por extrapolación de datos de ensayo in vivo o in vitro.
La composición inmunogénica o la vacuna descrita en la presente memoria puede administrarse por cualquier medio adecuado y las respectivas formulaciones para incluir, pero no limitarse a, por ejemplo, cualquiera de las inyecciones parenterales (incluidas subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) o inyección local en el sitio afectado, tal como articulaciones o dentro o alrededor del tumor. En una realización preferida, la vacuna se proporciona en una formulación para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica.
En la presente memoria también se proporciona un dispositivo de administración, p. ej., una jeringa, precargada con la vacuna descrita en la presente memoria.
Típicamente, después de cebar a un sujeto mediante una primera inyección de una vacuna descrita en la presente memoria, se pueden realizar una o más inyecciones de refuerzo durante un período de tiempo mediante la misma o diferentes vías de administración. Cuando se usan múltiples inyecciones, se pueden realizar inyecciones posteriores, p. ej., en 1 a 52 semanas de la inyección previa, o incluso más.
La vacuna típicamente puede contener diluyentes, tales como agua, disolución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes entre los excipientes, como sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y similares. Típicamente, la vacuna descrita en la presente memoria se prepara como un inyectable, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas, o formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la administración. Las preparaciones también se pueden emulsionar o encapsular en liposomas.
La administración de la vacuna descrita en la presente memoria puede combinarse de manera adecuada y adicional con cualquiera de los agonistas o antagonistas de TLR9 y/o medidas adyuvantes adicionales para aumentar el efecto inmunorregulador o la respuesta inmune. Una respuesta inmune aumentada puede incluir una o más de una respuesta inmune Th1, respuesta inmune Th2, respuesta inmune Th17 o respuesta inmune Treg aumentada.
Una respuesta inmune Th1 aumentada puede incluir un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmune Th1 (tal como IFNy) y un aumento en macrófagos activados.
Una respuesta inmune Th1 aumentada puede incluir uno o más de un aumento de anticuerpos IgG específicos de antígeno, especialmente anticuerpos IgG1.
Por ejemplo, la composición inmunogénica o la vacuna descrita en la presente memoria puede estar asociada (p. ej., unida química o recombinantemente, unida por unión por afinidad o una mezcla de componentes separados) con uno o más adyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. La vacuna descrita en la presente memoria puede incluir uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, disolución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y similares. Los adyuvantes se pueden usar específicamente para aumentar la eficacia de la vacuna. Los adyuvantes pueden añadirse directamente a las composiciones de vacuna o pueden administrarse por separado, al mismo tiempo o poco después de la administración de la vacuna.
Los adyuvantes adecuados incluyen citocinas y compuestos similares que ayudan a orquestar una respuesta inmune frente al inmunógeno. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "citocina" se usa como un nombre genérico para un grupo diverso de proteínas y péptidos solubles que actúan como reguladores humorales en concentraciones nano a picomolares y que, ya sea en condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de las células y tejidos individuales. Estas proteínas también median las interacciones entre las células directamente y regulan los procesos que tienen lugar en el entorno extracelular.
Los ejemplos de citocinas incluyen IL-1, IL-4, TNFa, IFNa, INFy, GM-CSF, G-CSF
Los oligonucleótidos CpG también se pueden usar como adyuvantes junto con la presentación de los epítopos respectivos. Otros adyuvantes incluyen alumbre, adyuvante (in)completo de Freund, B. pertussis o su toxina, IC31, etc.
Los componentes de la composición inmunogénica, es decir, el componente adyuvante dirigido, p. ej., el resto anti-CD32 unido al ligando de TLR9 y la primera hélice alfa peptídica, y el componente inmunógeno, p. ej., que comprende el inmunógeno peptídico unido a la segunda hélice alfa peptídica que coincide con la primera, así como la composición inmunogénica o la vacuna, o cualquiera de sus restos de unión o ligandos y el inmunógeno con o sin las repeticiones de la hélice se pueden obtener mediante varios métodos conocidos en la técnica, p. ej., por purificación o aislamiento de cultivo celular, tecnología recombinante o por síntesis química.
Según una realización específica, la composición inmunogénica y/o el componente adyuvante dirigido y/o el componente inmunógeno del mismo, se produce como un polipéptido recombinante, tal como mediante tecnología de ADN recombinante. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "recombinante" se refiere a una molécula o construcción que no se encuentra naturalmente en una célula huésped. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinante contienen dos o más secuencias de origen natural que están unidas entre sí de una manera que no ocurre de forma natural. Una proteína recombinante se refiere a una proteína que está codificada y/o se expresa por un ácido nucleico recombinante. En algunas realizaciones, las "células recombinantes" expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (es decir, no recombinante) de la célula y/o expresan genes nativos que de otra manera están sobreexpresados anormalmente, subexpresados y/o no expresados en absoluto debido a la intervención humana deliberada. Las células recombinantes contienen al menos un polinucleótido o polipéptido recombinante. La "recombinación", "recombinar" y la generación de un ácido nucleico "recombinado" generalmente abarcan el ensamblaje de al menos dos fragmentos de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, las proteínas recombinantes y los ácidos nucleicos recombinantes permanecen funcionales, es decir, retienen su actividad o exhiben una actividad aumentada en la célula huésped.
Por lo tanto, en la presente memoria también se proporciona la producción de la composición inmunogénica o los componentes de la misma, y los medios recombinantes para dicha producción, incluido un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, un casete de expresión, un vector o plásmido que comprende el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que se va a expresar, y una célula huésped que comprende cualquiera de dichos medios. Las técnicas de ADN recombinante estándar adecuadas se conocen en la técnica y se describen inter alia en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989), 2a Edición (Cold Spring Harbor Laboratory press).
El término "vacuna sensibilizante" se entiende en la presente memoria de la siguiente manera. Un sujeto puede someterse a una sensibilización específica a los componentes de la vacuna además del inmunógeno, para inducir la respuesta inmune humoral específica. Según la presente descripción, un sujeto, p. ej., se sensibiliza por tratamiento con la vacuna sensibilizante descrita en la presente memoria, que comprende el adyuvante dirigido y la hélice alfa peptídica, preferiblemente la hélice enrollada o doble hélice para estabilizar la molécula. Por tanto, el inmunógeno tal y como se usa en la vacuna inmunorreguladora descrita en la presente memoria no se emplea específicamente en dicha vacuna sensibilizante. Al administrar dicha vacuna sensibilizante a un sujeto, el sujeto puede desarrollar la respuesta inmune frente a los epítopos de la vacuna sensibilizante. El tratamiento adicional del mismo sujeto con la vacuna inmunorreguladora descrita en la presente memoria inducirá entonces la respuesta inmune específica frente al inmunógeno que se necesita para el tratamiento o la prevención de la enfermedad. Gracias a la sensibilización, la memoria inmune existente potencialmente dañina frente a partes del inmunógeno, p. ej., en el caso de pacientes alérgicos, no inducirá reacciones inmunes no deseadas frente a aquellas partes de la vacuna a las que el paciente no ha estado expuesto antes de la inmunización.
En la presente memoria, se entiende que el término "sujeto" comprende sujetos humanos o mamíferos, incluidos animales de ganado, animales de compañía y animales de laboratorio, en particular seres humanos, que son pacientes que padecen de una enfermedad específica o sujetos sanos.
En la presente memoria también se proporciona un kit de componentes para preparar la composición inmunogénica descrita en la presente memoria, p. ej., un kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de los componentes. Los kits se pueden usar en los métodos descritos anteriormente. En una realización particular, el kit comprende además instrucciones para usar los componentes de la composición inmunogénica o la composición inmunogénica o vacuna preparada descrita en la presente memoria.
Los componentes de la vacuna, es decir, el componente adyuvante dirigido y el componente inmunógeno, así como la vacuna, o cualquiera de sus restos de unión o ligandos y el inmunógeno con o sin las repeticiones helicoidales pueden obtenerse mediante varios métodos conocidos en la técnica, p. ej., por purificación o aislamiento de cultivo celular, tecnología recombinante o por síntesis química.
Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona una vacuna única y sus respectivas aplicaciones.
Según un ejemplo específico, la vacuna descrita en la presente memoria comprende un polipéptido recombinante de SEQ ID 19:
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYT GESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQ
GNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAEDVGV FYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSALEKEVSALEKEVSALE KEVSALEKEVSALEK
N-terminal subrayado: secuencia de ScFV que se une específicamente a CD32a;
Cursiva: Enlazador; se puede usar cualquier enlazador alternativo comúnmente usado en preparaciones de scFv. Negrita: StrepTag II para purificación, se puede usar cualquier etiqueta alternativa, p. ej., etiqueta flag o etiqueta HIS. C-terminal doble subrayado: hélice alfa de repetición de heptada (pepE) para formar la hélice enrollada con la contra hélice alfa de repetición de heptada en el inmunógeno (pepK).
En este ejemplo (SEQ ID 19) se usan 5 repeticiones; más repeticiones pueden causar autoagregación y menos repeticiones pueden reducir la afinidad. El número funcional mínimo preferido de repeticiones para las hélices usado es 3 y el número funcional máximo preferido es 542-44 pero son factibles más repeticiones dependiendo del tipo de hélice alfa que se use. La limitación sería el número de repeticiones que comienzan a inducir la homodimerización. Por tanto, se excluye específicamente la homodimerización.
Los polipéptidos similares pueden comprender una secuencia líder, la secuencia de aminoácidos de un resto anti-CD32 específico, que es p. ej., un scFv recombinante, un enlazador, una etiqueta con fines de purificación y la secuencia de la hélice alfa peptídica pepE. Esta construcción con o sin el ligando de TLR9 también se denomina "carga útil", que luego puede usarse para construir una vacuna mediante combinación con un inmunógeno unido a la contra hélice alfa pepK.
Según otro ejemplo específico, el resto anti-CD32 es un péptido anti-CD32a con la secuencia de la SEQ ID 20: ADGAWAWVWLTETAVGAA45 usado como una alternativa al ScFv.
Según un ejemplo adicional, se prepara una hélice que contiene inmunógeno que comprende alérgeno, tal como epítopos de células T Der P1 y Der P2. La hélice alfa peptídica está adecuadamente unida al inmunógeno mediante un enlazador para permitir flexibilidad.
Según un ejemplo adicional, se establece una hélice enrollada estable entre el scFv de la carga útil y el inmunógeno. Según otro ejemplo, se prepara la hélice que contiene inmunógeno que comprende aproximadamente 29 epítopos de células T diferentes de un alérgeno.
En un ejemplo adicional, se podría mostrar que la carga útil mediaba una presentación aumentada de antígenos. Las células T se estimularon eficazmente cuando el inmunógeno con la hélice (la hélice pepK) interaccionó con la carga útil que contenía la hélice contraparte (la hélice pepE).
En un ejemplo adicional, se ha demostrado que el agonista de TLR9 CpG mediaba la activación de las células T autoinmunes reactivas.
Sin embargo, en otro ejemplo, se describe el tratamiento de la alergia, usando una carga útil que emplea el péptido anti-CD32 scFv o anti-CD32a unido por la hélice enrollada al inmunógeno específico del alérgeno.
Según un ejemplo adicional, se establece una hélice enrollada estable entre el scFv de la carga útil y el inmunógeno. Se ha demostrado que las PBMC podrían estimularse eficazmente con dicho inmunógeno o vacuna.
En un ejemplo adicional, se podría mostrar que la carga útil mediaba una presentación aumentada de antígenos. Las células T se estimularon eficazmente cuando el inmunógeno con la hélice (la hélice pepK) interaccionó con la carga útil que contenía la hélice contraparte (la hélice pepE).
En ejemplos adicionales, se describe el tratamiento del cáncer de páncreas en un modelo de ratón y en un modelo de mono rhesus, usando una carga útil que emplea el scFv anti-CD32 o el péptido anti-CD32a unido por la hélice enrollada al inmunógeno peptídico G13. La reducción del apetito y el control del apetito se describen en el modelo del mono rhesus. Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona una composición inmunogénica y una vacuna únicas, y sus respectivas aplicaciones.
La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, dichos ejemplos son meramente representativos de métodos para poner en práctica una o más realizaciones de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: carga útil ScFV que contiene hélice
Secuencia de aminoácidos 1. (SEQ ID 21)
1 10 20 30 40 50
MELGLSWIFL LAILKGVQCE VQLQQSGPEL KKPGETVKIS CKASGYTFTN
51 60 70 80 90 100
YNWVKQAPGK GLKWMGWLNT YTGESIYPDD FKGRFAFSSE TSASTAYLQI
101 110 120 130 140 150
NNLKGMNEDM ATYFCARGDY GYDDPLDYWG QGTSVTVSSG GGGSGGGGSG
151 160 170 180 190 200
SGGGDIVMTO AAPSVPVTPG ESVSISCRSS KSLLHTNGNT YLHWFLORPG
201 210 220 230 240 250
OSPOLLIYRM SVLASGVPDR FSGSGSGTAF TLSISRVEAE DVGVFYCMOH
251 260 270 280 290 300
LEYPLTFGAG TKLELKGSIS AWSHPQFEKG PEVSALEKEV SALEKEVSAL
301 310 316
EKEVSALEKE VSALEK AA 1 -19: secuencia líder (para secretar el producto)
Secuencia IAA 20-271 de ScFV (el dominio VH está subrayado, VI está doblemente subrayado) el orden de los dominios VH y VL puede intercambiarse)
El enlazador IAA140-154 se puede cambiar a cualquier enlazador usado en la preparación de ScFV
AA 272-279: StrepTag II para la purificación puede intercambiarse por cualquier tipo de etiqueta, p. ej., etiqueta flag o etiqueta HIS.
AA280-281: enlazador corto (puede ser más largo)
AA282-316: hélice alfa de repetición de heptada (pepE) para formar la hélice enrollada con la contra hélice alfa de repetición de heptada en el inmunógeno (pepK). En el ejemplo, se usan 5 repeticiones, más repeticiones pueden causar autoagregación y menos repeticiones reducirán la afinidad, sin embargo, 4 repeticiones siguen siendo funcionales. El número funcional mínimo de repeticiones para las hélices usado es 3 y 546-48
Un agonista de TRL9 tal como CpG puede acoplarse a la carga útil usando un acoplamiento químico, p. ej., usando el KIT de acoplamiento anticuerpo-oligo de Solulink. Puede acoplarse un agonista peptídico de TRL9 usando química de péptidos estándar.
Ejemplo 2: carga útil peptídica que contiene hélice enrollada
Secuencia de aminoácidos 2 (SEQ ID 22):
1 10 20 30 40 50
ADGAWAWVWL TETAVGAAKG GGSWSHPQFE KGPEVSALEK EVSALEKEVS
51 60 68
ALEKEVSALE KEVSALEK
Secuencia AA1 -19 del péptido aCD32a publicada por Berntzen et al45
IAA20-24 y AA32-33: Los enlazadores se pueden cambiar a cualquier enlazador, también enlazadores más largos para permitir flexibilidad entre las dos secuencias conectadas.
AA24-31: StrepTag II para la purificación puede intercambiarse por cualquier tipo de etiqueta, p. ej., etiqueta flag o etiqueta HIS.
AA34-68: hélice alfa de repetición de heptada (pepE) para formar la hélice enrollada con la contra hélice alfa de repetición de heptada en el inmunógeno (pepK). En el ejemplo, se usan 5 repeticiones, más repeticiones pueden causar autoagregación y menos repeticiones reducirán la afinidad, sin embargo, 4 repeticiones siguen siendo funcionales. El número funcional mínimo de repeticiones para las hélices usado es 3 y 549-51.
Un agonista de TRL9 tal como CpG puede acoplarse a la carga útil usando acoplamiento químico, p. ej., usando el KIT de acoplamiento anticuerpo-oligo de Solulink. Puede acoplarse un agonista peptídico de TRL9 usando química de péptidos estándar.
Ejemplo 3: inmunógeno 3 que contiene hélice (epítopos de células T Der P1 y Der P2 basados en la expresión de Clase II humana)
Secuencia de aminoácidos 3 (SEQ ID 23):
10 20 30 40 50
HHHHHHYYRY VAREQSCRRP NAQRFGISNY CQIYPPNVNK IREALAQTHS
60 70 80 90 100
AIAVDLRQMR TVTPIRMQGG CGSCWAFSGV AATESAYLQQ YDIKYTWNVP
110 120 130 140 150
KIAPKSENVV VTVKVMGDDG VLACAIATHA KIRDDAFRHY DGRTIIQRDN
160 170 180 190 200
GYQPNYHAVN IVGYSNAQGV DYWIVRNSWD TNWHEIKKVL VPGCHGSEPC
210 220 230 240 250
IIHRGKPFGG GSGGGSCGGK VSALKEKVSA LKEKVSALKE KVSALKEKVS
2 54
ALKE
La etiqueta AA1-6 His para la purificación puede intercambiarse por cualquier tipo de etiqueta, p. ej., etiqueta flag o StrepTag II. La etiqueta también se puede colocar entre el enlazador y la hélice alfa (véase el ejemplo 4). No se prefiere el extremo C, ya que esto puede interferir con la funcionalidad de las hélices enrolladas.
AA208-219: enlazador entre péptidos alergénicos y enlazador (puede intercambiarse por cualquier otro enlazador para permitir flexibilidad entre las dos secuencias conectadas. La cisteína subrayada puede eliminarse de la secuencia. AA220-254: hélice alfa de repetición de heptada (pepK) para formar la hélice enrollada con la contra hélice alfa de repetición de heptada en la carga útil (pepE). En el ejemplo, se usan 5 repeticiones, más repeticiones pueden causar autoagregación y menos repeticiones reducirán la afinidad, sin embargo, 4 repeticiones siguen siendo funcionales. El número funcional mínimo de repeticiones para las hélices usado es 3 y 552-54.
AA6-54: epítopos de células T de Der p1 (AA181-220 de la proteína nativa):
YYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKfREALAQTHSAIAV (SEQ ID 24)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
AA55-88: epítopos de células T de Der p1 (95-128):
DLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYL (SEQ ID 25)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
AA89-108: epítopos de células T de Der p2: (AA85-104 de la proteína nativa):
QQYDKYTWNVPKIAPKSEN (SEQ ID 26)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
AA109-134: epítopos de células T de Der p2: (AA105-130 de la proteína nativa):
VWTVKVMGD D G VLACAIATHAKIRD (SEQ ID 27)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
AA135-183: epítopos de células T de Der p1 (AA228-276 de la proteína nativa):
DAFRHYDGRTIIQRDNG YQPNYHAVN IVGYSNAQG VDYWIVRNSWDTNW (SEQ ID 28)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
AA184-208: Epítopos de células T de DerP2: (AA11-45 de la proteína nativa):
HEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPF (SEQ ID 29)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
Ejemplo 4: Formación de una hélice enrollada estable entre la carga útil ScFV y el inmunógeno 3.
El inmunógeno 3 se inmovilizó en un BIACore CM5 en el chip de la celda de flujo 1, 2, 3 usando procedimientos estándar que dieron como resultado ~700 unidades de respuesta, posteriormente se inyectó la carga útil (10 pg/ml en PBS) en la celda de flujo 1 y se midió un aumento de masa dependiente del tiempo. (en velocidad), después de ~ 160 segundos, el tampón se cambió a PBS solamente. La tasa de disociación indica la estabilidad de la unión entre la carga útil y la celda de inmunógeno se inyectó solo con PBS. Cuando se preincubó la carga útil con la hélice pepK y posteriormente se inyectó en la celda de flujo 2, no se observó unión de la carga útil al chip. De manera similar, cuando el chip se preincubó con pep E (celda de flujo 3) antes de la inyección con la carga útil, no se observó unión de la carga útil al inmunógeno. (Véase la Figura 1)
Ejemplo 5: Hélice que contiene inmunógeno 5-12 (~29 epítopos de células T de Der p1, Der p2, Der p3, Der p4, Der p7, Der p9, Der p10, Der p11, Der p14, Der p15, basados en la expresión de Clase II humana)
Secuencia de aminoácidos 3 (SEQ ID 30):
Inmunógeno 5-12:
10 20 30 40 30
GVLACAIATH AKIREQERLV KLETVKKSLE QEVRTLHVRI EEVEANALAG
60 70 80 90 100
GDLRQMRTVT PIRMQGGCGS CWEAHEQQIR IMTTKLKEAE ARQQYDIKYT
110 120 130 140 150
WNVPKIAVNI VGYSNAQGVD YWIVRNSWDT NWYHNPHFIG NRSVITHLME
160 170 180 190 200
DLKGELDMRN IQVRGLKQMK RVGDANVKSE DDAFRHYDGR TIIQRDNGYQ
210 220 230 240 250
PNYLDEYWIL TAAHCVDGQT VSKLIRSKVL GEKISYYRYV AREQSCRRPN
260 270 280 2 90 300
AQRFGISNYC VVVTVKVMGD DELHTYFNVN YTMHYYLNNG ATRDILDEYW
310 320 330 340 350
ILTAAHCVAG QTASKLSIRY NSLKHSLFKY RPFKVNELNL EGEFGRELQH
360 370 380 390 400
KFRLMRNSQM EVEEGGGSHH HHHHGGGSCG GKVSALKEKV SALKEKVSAL
410 416
KEKVSALKEK VSALKE
La etiqueta His AA1369-274 para la purificación puede intercambiarse por cualquier tipo de etiqueta, p. ej., etiqueta flag o StrepTag II. La etiqueta también se puede colocar entre el enlazador y la hélice alfa (véase el ejemplo 4). No se prefiere el extremo C, ya que esto puede interferir con la funcionalidad de las hélices enrolladas.
AA365-368 y 375-381: enlazadores entre péptidos alergénicos etiqueta HIS y pepK. Los enlazadores (pueden intercambiarse por cualquier otro enlazador para permitir flexibilidad entre las dos secuencias conectadas. La cisteína subrayada (Cys379) se elimina preferiblemente de la secuencia.
AA382-416: hélice alfa de repetición de heptada (pepK) para formar la hélice enrollada con la contra hélice alfa de repetición de heptada en la carga útil (pepE). En el ejemplo, se usan 5 repeticiones, más repeticiones pueden causar autoagregación y menos repeticiones reducirán la afinidad, sin embargo, 4 repeticiones siguen siendo funcionales. El número funcional mínimo de repeticiones para las hélices usado es 3 y 555-57.
La carga útil (basada en ScFVhélice1 IV.3 ODNM362) se mezcla con Inmunógeno 5-12 en una proporción que indica que del 10 % al 100 % de la carga útil está unida al inmunógeno por la estructura de la hélice enrollada, preferiblemente en donde no hay inmunógeno libre o hay menos del 50 % de inmunógeno libre, y se formula en Alumbre.
A modo de ejemplo y como se describe adicionalmente a continuación, de acuerdo con una realización preferida, la invención proporciona una vacuna en donde la vacuna inmunorreguladora de la invención comprende
- un adyuvante dirigido que está compuesto por el resto anti-CD32 unido a la primera hélice alfa que comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID 70, que está acoplado al ligando de TLR9 de la SEQ ID 69, p. ej., en una proporción de 1:1-18 (molécula por molécula); y
- un inmunógeno que comprende o consiste en el inmunógeno de la SEQ ID 30 unido a la segunda hélice alfa, preferiblemente SEQ ID 75, o una variante funcionalmente activa de la misma, preferiblemente una variante, en donde se elimina Cys379, o en donde se cambia el orden de los péptidos derivados de alérgeno, en donde el adyuvante dirigido y el inmunógeno están unidos entre sí por la estructura de hélice enrollada formada por la primera y segunda hélices alfa.
Epítopos de células T (hay 15 péptidos derivados de alérgenos en inmo5-12: 1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15) El orden de los péptidos derivados de alérgenos HDM se optimizó para la solubilidad, pero también será posible cualquier otro orden.
1) AA: 1-14 Der p2 (AA116-129 de la proteína nativa)
G VLACAIATH AKIR (SEQ ID 31)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
2) AA: 15-51 Der p11 (AA697-733 de la proteína nativa) EQERLVKLETVKKSLEQEVRTLHVRIEEVEANALAGG (SEQ ID 32)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
3) AA: 52-72 Der p1 (AA95-115 de la proteína nativa)
DLRQMRTVTPIRMQGGCGSCW
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
4) AA: 73-92 Der p10 (AA219-238 de la proteína nativa)
EAHEQQIRIMTTKLKEAEAR (SEQ ID 34)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
5) AA: 93-106 Der p2: (AA85-98 de la proteína nativa)
QQYDIKYTWNVPKI (SEQ ID 35)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
6) AA: 107-132 Der p1 (AA251-276 de la proteína nativa)
AVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNW (SEQ ID 104)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
7) AA: 133-150 Der p4 (AA2-19 de la proteína nativa):
YHNPHFIGNRSVITHLME(SEQ ID 105)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
8) AA: 151.181 Der p7 (AA66-96 de la proteína nativa):
DLKGELDMRNIQVRGLKQMKRVGDANVKSED (SEQ ID 36)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
9) AA: 182-203 Der p1 (AA228-252 de la proteína nativa)
DAFRHYDGRTIIQRDNG YQPNY (SEQ ID 37)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
10) AA: 204-235 Der p9 (AA54-85 de la proteína nativa):
LDEYWILTAAHCVDGQT VSKLIRSKVL GEKIS (SEQ ID 38)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
11) AA: 236-260 Der p1 (AA181 -205 de la proteína nativa)
Y YRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYC (SEQ ID 39)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
12) AA: 261 -271 Der p2 (AA105-115 de la proteína nativa)
VVVTVKVMGD D (SEQ ID 40)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
13) AA: 272-294 Der p15 (AA251 -273 de la proteína nativa)
ELHTYFNVNYTMHYYLNNGATRD (SEQ ID 41)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
14) AA: 295-327 Der p3 (AA58-90 de la proteína nativa)
ILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSL (SEQ ID 42)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
15) AA: 328-364 Der p14 (AA1061-1097 de la proteína nativa) FK YRPFKVNELN LEGEFGRELQHKFRLMRNSQMEVEE (SEQ ID 43)
Negrita y cursiva son epítopos de células T predichos presentados por clase HLA
Ejemplo 6: Estimulación de PBMC de mono con inmunógeno 3
Se cultivaron PBMC (100.000/pocillo) de monos rhesus sensibilizados con Der p1 (macaca mulatta) en triplicado con medio, 3 Der p1 o 3 y 5 pg/ml de inmunógeno 3 a 37 °C/ 5 % CO2, en presencia de 20 U/ml de IL-2. La proliferación se ensayó mediante la incorporación de [3H]-timidina (0,5 pCi/pocillo) durante las últimas 18 horas de un cultivo de 2 días. Las células se recogieron para el recuento por centelleo p (Topcount NXT, Packard, Ramsey, MN, EE. UU.). Los resultados se muestran como cuentas por minuto. Además de los cultivos paralelos, los sobrenadantes se ensayaron en duplicado para determinar los niveles de IL-10 y GM-CSF usando un kit de ELISA disponible comercialmente (U-Cytech, Utrecht, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Véase la Figura 2.
No existe una diferencia significativa entre la respuesta a Der p1 o al inmunógeno 3 ni en la proliferación ni en la producción de citocinas, lo que indica que los epítopos de las células T en el inmunógeno 3, que se seleccionaron sobre la base de la expresión de HLA de clase II humana, están igualmente bien presentados por las moléculas de clase II de mono rhesus.
Ejemplo 7: Presentación de antígenos aumentada mediada por WH
Se preincubaron PBMC (100.000/pocillo) de monos rhesus sensibilizados con Der p1 (macaca mulatta) (30 min en hielo) con 1 pg/ml de carga útil ScFV y se lavaron 3 veces con PBS o se preincubaron solo con PBS y se lavaron tres veces. Posteriormente, estas células se incubaron (30 min en hielo) con diferentes concentraciones de Inmunógeno 3 o Der p1 a 3 pg/ml y se lavaron 3 veces con PBS después de lo cual las células se cultivaron a 37 °C/5 % CO2 en presencia de 20 U/ml de IL-2 durante 48 horas. Como control positivo, las PBMC (sin preincubación con carga útil) se incubaron con 3 pg/ml de Der P1 sin lavar y se cultivaron a 37 °C/5 % de CO2 en presencia de 20 U/ml de IL-2. La proliferación se ensayó mediante la incorporación de [3H]-timidina (0,5 pCi/pocillo) durante las últimas 18 horas de un cultivo de 2 días. Las células se recogieron para el recuento de centelleo p (Topcount NXT, Packard, Ramsey, MN, EE. UU.). Los resultados se muestran como cuentas por minuto. Véase la Figura 3.
Con el fin de estimular las células T, el antígeno debe ser internalizado y procesado por las células presentadoras de antígeno. Esto se puede lograr cultivando las células T y APC en presencia de antígeno o dirigiendo el antígeno a un receptor de la superficie celular capaz de internalizarse y reubicarse en lisosomas58-62. De acuerdo con la bibliografía, la estimulación de PBMC con inmunógeno preincubado en ausencia de la carga útil no condujo a la proliferación (datos no mostrados). Además, la preincubación con Der p1 en presencia de la carga útil no condujo a la proliferación. Sin embargo, cuando las PBMC se preincubaron con 1 pg/ml de carga útil ScFV, se lavaron y posteriormente se incubaron con diferentes concentraciones de inmunógeno 3 y se lavaron, se observó una estimulación dependiente de la dosis, que fue incluso mayor que el control positivo en el que las PBMC se cultivaron 48 h en presencia de 3 pg/ml de Der p1 sin lavar. Entonces, solo cuando el inmunógeno (que contiene la hélice pepK) pudo interaccionar con la carga útil (que contiene la hélice pepE) de modo que se formó una hélice enrollada estable, se observó una estimulación. La carga útil con en combinación con Der P1 no provocó estimulación ya que Der P1 carece de hélice y no se une a las PBMC.
Ejemplo 8. Activación mediada por CpG de células T autoinmunes reactivas
Se incubaron PBMC (100.000/pocillo) de monos rhesus (macaca mulatta) o donantes humanos normales en triplicado con CpG o CpG-biot 50 pM. En paralelo, se preincubaron PBMC (30 min en hielo) 1 pg/ml de ScFV de carga útil biotinilada, se lavaron 3x y posteriormente se incubaron con CpG 50 pM. Los sobrenadantes se ensayaron en duplicado para determinar los niveles de IL-4 e IFN gamma usando un kit de ELISA disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Véase la Figura 4.
El CpG no indujo una respuesta de células T específica en células de mono o humanas (barras de la izquierda) ni aumentó o indujo una respuesta de células T frente a la proteína biotinilada que se coadministró (barras de la derecha). Solo cuando el CpG y la biotina se unieron físicamente (barras verdes) se indujo una respuesta específica frente a la biotina. Dado que la biotina (también llamada vitamina b7, vitamina H o vitamina B8) es una molécula propia, no debería producirse una respuesta inmune. Sin embargo, cuando la biotina es presentada por TLR9, la tolerancia de las células T APC activadas se interrumpe, lo que indica que la unión física de un agonista de TLR9 a una proteína propia conducirá a una respuesta inmune que, en el caso de que la proteína propia sea un antígeno asociado a tumores (TAA), se puede usar para tratar el cáncer. La unión física significa ya sea directamente acoplado al TAA o indirectamente usando la carga útil y un TAA acoplado (o que contiene) una hélice que interacciona con la hélice de la carga útil. Se prefiere esto último. También se puede usar cualquier otra forma de complejo entre el agonista de TRL9 y el TAA, siempre que se asegure que la misma APC capta el agonista de TLR9 y el TAA.
Ejemplo 9: tratamiento del cáncer
A diferencia del tratamiento de la alergia, la carga útil que se usa para el tratamiento del cáncer debe unirse predominantemente a CD32a y no a CD32b. Se prefieren las cargas útiles de los ejemplos 1 y 2 para su uso en el tratamiento del cáncer.
Ejemplo 10: estimulación de PBMC humanas con inmunógeno 5-12
Se cultivaron PBMC (100.000/pocillo) de donantes normales sensibilizados con Der p1 en triplicado con medio, 3 pg/ml de Der p1 o 5, 1 o 0,5 pg/ml de inmunógeno 5-12 (Inmo5-12) a 37 °C/5 % CO2 durante 24h. Los sobrenadantes se ensayaron en duplicado para determinar los niveles de IL-10 e IFNg usando kits de ELISA disponibles comercialmente (eBioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Véase la Figura 5.
Ejemplo 11: tratamiento de enfermedades autoinmunes
Una vacuna que comprende una carga útil que reconoce CD32a y CD32b, una hélice enrollada y un antagonista de TLR9 o un agonista que induce la señalización inhibidora de TLR9 (referencias) combinada con un autoantígeno. Dicha vacuna no inducirá nuevos anticuerpos frente a ninguna parte de la vacuna, incluido el autoantígeno y, por lo tanto, es segura para su uso en dichos pacientes. El uso de un CpG inhibidor (ODN inhibidor) en esta vacuna inducirá las células T reg frente a la vacuna, incluido el autoantígeno. Lo mismo ocurrirá cuando se use un agonista de CpG del grupo 1 o 2. No se prefiere un agonista de TLR9 del grupo 3, ya que esto conducirá a la inducción de más autoinmunidad véase la figura 4.
Ejemplo 12: Agentes de unión ilustrativos
12.1. Región de unión a CD32, en la presente memoria también denominada resto anti-CD32 o agente de unión a CD32
Agentes de unión a CD32a:
Anticuerpo que se une específicamente a CD32a: mAb IV.3 (Stuart et al. (1987) J. Exp. Medicina. 166: 1668)
ScFV derivado de mAb IV.3 (VH-enlazador-VL): (SEQ ID 44)
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDY WGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSK SLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISR VEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSI
Subrayado: dominio VH
Negrita: dominio HL
Tipografía normal. Enlazador flexible (puede ser cualquier enlazador)
Péptido anti-CD32a: Berntzen et al. (J. Biol. Chem. (2009) 284: 1126-1135.): (SEQ ID 45) ADGAWAWVWLTET AVGAAK
Agentes de unión del grupo CD32a+b:
Anticuerpo que se une específicamente a CD32a y CD32b: mAb AT-10 (AbD Serotec) ScFV derivado de mAb AT-10 (VH-enlazador-VL): (SEQ ID 46) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLK SNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRAEDTGIYYCNRRDEYYAMDY WGQGTSVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRASE SVDNFGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHP VEEDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKGSI
Subrayado: dominio VH
Negrita: dominio HL
Tipografía normal. Enlazador flexible (puede ser cualquier enlazador)
Fragmento Fc de IgG1 (dominio CH2-CH3): (SEQ ID 47) (PKSCDKTHTCPPCP)PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
Entre () se puede omitir la región de la bisagra
Subrayado: dominio CH2
Negrita: dominio CH3
12.2 Región o resto de unión a TLR9, en la presente memoria también denominada agente de unión a TLR9 o ligando de TLR9
CpG clase A
Grupo CpG-A:
ODN2216: (SEQ ID 48)
GGGGGACGATCGTCGGGGGG
CpG clase B
Grupo CpG-B:
Ligandos naturales:
ODN2006: (SEQ ID 49)
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT
Ligandos peptídicos (péptidos inmunoestimuladores):
Figure imgf000033_0001
Dichos péptidos inmunoestimuladores pueden usarse preferiblemente como un mimético de CpG. Asimismo, pueden usarse variantes funcionalmente activas de los mismos, que son fragmentos, mutantes o híbridos, incluyendo combinaciones de los mismos.
Las variantes funcionalmente activas se caracterizan específicamente porque estimulan las pDC, induciendo así un nivel aumentado de IL-6 y/o TNFalfa y/o IFNalfa, en comparación con un control negativo.
Las variantes funcionalmente activas de los péptidos de unión a TLR9 inmunoestimuladores específicamente a) tienen al menos un 60 % de homología o identidad de secuencia con cualquiera de los péptidos de las SEQ ID 73­ 91, preferiblemente al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 %;
b) son mutantes de cualquiera de los péptidos de las SEQ ID 50-68, que se pueden obtener mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos parental mediante la inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia o en uno o ambos de los extremos distales de la secuencia, preferiblemente menos de 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones puntuales; o
c) son fragmentos de cualquiera de los péptidos de las SEQ ID 50-68 que comprenden al menos el 50 % de la secuencia parental, o al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 %; o al menos 5 aminoácidos, preferiblemente al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o al menos 11 aminoácidos. CpG clase C
Grupo CpG-C
ODNM362: (SEQ ID 69)
TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT
12.3 Productos de unión a CD32 ilustrativos con hélices
ScFV-hélice 1 (IV.3): (SEQ ID 70) EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDY WGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSK SLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISR VEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAI/I/S/-/PQF£KGP£\/SAL£K£\/
S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K
Subrayado: dominio VH
Negrita: dominio HL
Tipografía normal. Enlazador flexible (puede ser cualquier enlazador)
En cursiva: hélice pepE más la secuencia C' StrepTag II y el enlazador "GP" pueden ser cualquier enlazador flexible (StrepTag II puede eliminarse o reemplazarse por una etiqueta HIS o cualquier otra etiqueta)
ScFV-hélice 2 (AT10): (SEQ ID 71) EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSYYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLK SNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKNNVYLQMNNLRAEDTGIYYCNRRDEYYAMDY WGQGTSVSVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPGSLAVSLGQRATISCRASE SVDNFGISFMNWFQQKPGQPPRLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHP VEEDDAAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKGSISAI/I/S/-/PQ££KGP£\/SAL£K£\/
S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K
Subrayado: dominio VH
Negrita: dominio HL
Tipografía normal. Enlazador flexible (puede ser cualquier enlazador)
En cursiva: la hélice pepE más la secuencia C' StrepTag II y el enlazador "GP" puede ser cualquier enlazador flexible (StrepTag II puede eliminarse o reemplazarse por la etiqueta HIS o cualquier otra etiqueta)
Péptido-hélice: (SEQ ID 72)
A D G A \N A \N V \N L J E J A V G A A K G P E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E
K
En cursiva: la hélice pepE más el enlazador "GP" puede ser cualquier enlazador flexible
Fragmento Fc de IgG1 -hélice: (SEQ ID 73) (PKSCDKTHTCPPCP)PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK G P E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K
Entre () se puede omitir la región de la bisagra
Subrayado: dominio CH2
Dominio CH3 en negrita
En cursiva: la hélice pepE más el enlazador "GP" puede ser cualquier enlazador flexible
12.4. Productos de unión a TLR9 ilustrativos con grupo SH para la reticulación química con el agente de unión a CD32 Grupo CpG-A:
ODN2216_SH: (SEQ ID 48)
GGGGGACGATCGTCGGGGGG-SH
En negrita enlazador flexible con grupo SH para la reticulación química a ScFV-hélice (puede ser cualquier enlazador y grupo químicamente reactivo, p. ej., NH2 adecuado para reticulación química)
Grupo CpG-B:
Ligandos naturales:
ODN2006_SH: (SEQ ID 49)
TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-SH
Ligandos peptídicos_SH:
Figure imgf000035_0001
En negrita, enlazador flexible con grupo SH para reticulación química a la hélice ScFV (puede ser cualquier enlazador y grupo químicamente reactivo, p. ej., NH2 adecuado para reticulación química)
Grupo CpG-C
ODNM362_SH: (SEQ ID 69)
TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-SH
En negrita, enlazador flexible con grupo SH para reticulación química a la hélice ScFV (puede ser cualquier enlazador y grupo químicamente reactivo, p. ej., NH2 adecuado para reticulación química)
12.5 Carga útil ilustrativo, es decir, una estructura que comprende un agente de unión a CD32 y un agente de unión a TLR9
Cualquier representante del grupo de agentes de unión a CD32 unidos químicamente por cualquier método con cualquier representante del grupo de agentes de unión a TLR9, donde preferiblemente los agentes de unión a TLR9 se acoplan a lisinas (K) disponibles en los agentes de unión a CD32, p. ej. También se pueden acoplar mezclas de diferentes agentes de unión a TLR9, p. ej., agentes de unión naturales o peptídicos a CpG-B.
ScFV-hélice1 (IV.3) (SEQ ID 70)
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLD YWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSS KSLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISR VEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSAL£K£\/S
A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K
Se prefieren las lisinas en la estructura de la hélice (cursiva)
o
Péptido-hélice: (SEQ ID 72)
ADGAWAWVWLTETAVGAAKGPEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSAL EK
Se prefieren las lisinas en la estructura de la hélice (cursiva)
12.6. Inmunógeno ilustrativo, también denominado en la presente memoria antígeno
Inmunógeno 3 que contiene hélice (epítopos de células T Der P1 y Der P2 basados en la expresión de Clase II humana) (SEQ ID 74)
HHHHHHYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVDL RQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLQQYDIKYTWNVPKIAPKSENW VTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRDDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSN AQGVDYWIVRNSWDTNWHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFGGGSGGGSGGKV S A L K E K V S A L K E K V S A L K E K V S A L K E K V S A L K E
Subrayado: etiqueta HIS (se puede quitar)
En negrita: un enlazador (puede ser cualquier enlazador)
En cursiva: la hélice pepK para la interacción con la carga útil
Inmunógeno 5-12 que contiene hélice (~29 epítopos de células T de Der p1, Der p2, Der p3, Der p4, Der p7, Der p9, Der p10, Der p11, Der p14, Der p15, basado en la expresión de Clase II humana)
(SEQ ID 75)
GVLACAIATHAKIREQERLVKLETVKKSLEQEVRTLHVRIEEVEANALAGGDLRQM RTVTPIRMQGGCGSCWEAHEQQIRIMTTKLKEAEARQQYDIKYTWNVPKIAVNIVG YSNAQGVDYWIVRNSWDTNWYHNPHFIGNRSVITHLMEDLKGELDMRNIQVRGLK QMKRVGDANVKSEDDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYLDEYWILTAAHCVDGQTV SKLIRSKVLGEKISYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCWVTVKVMGDDELHTYF NVNYTMHYYLNNGATRDILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSLFKYRPF KVNELNLEGEFGRELQHKFRLMRNSQMEVEEGGGSHHHHHHGGGSCGGKVSAL K E K V S A L K E K V S A L K E K V S A L K E K V S A L K E
Subrayado: etiqueta HIS (se puede quitar)
En negrita: un enlazador (puede ser cualquier enlazador)
En cursiva: la hélice pepK para la interacción con la carga útil
12.7 Vacuna para la alergia ilustrativo SG100 frente a los ácaros del polvo doméstico (HDM)
El complejo molecular ilustrativo está formado por unión química, fusión y/o unión por afinidad, en particular por una estructura de hélice enrollada.
La carga útil (basada en ScFVhélice1 IV.3 ODNM362) se mezcla con el inmunógeno 5-12 en una proporción que indica que el 90 % de la carga útil está formando un complejo con el inmunógeno, sin inmunógeno libre (proporción molar de ~ 1:1,5) y formulada en alumbre.
12.8 Eficacia de SG100 en monos rhesus:
Métodos:
Se inmunizaron 3x 5 monos rhesus sanos sin exposición previa a ácaros del polvo doméstico (HDM) con SG100 (100 pg/inyección) absorbidos en Alumbre) los días d0, d14 y d28. Se tomaron muestras de sangre los días d0 y d49 para determinar la activación de las células T y la producción de anticuerpos.
Respuesta inmune de anticuerpos:
Las muestras de suero se ensayaron en ELISA estándar para detectar anticuerpos IgG frente a carga útil, inmo 5-12 (Inmo5), Der p1, Der p2, Der p5 y Der p7. Los antígenos se usaron para recubrir placas maxisorb (1 pg/ml de I PBS) durante la noche a 4 °C, se lavaron dos veces, se bloquearon con PBS BSA al 1 %, se lavaron dos veces, se incubaron con los sueros en una dilución 1:1.000 durante 1 hora a 4 °C, se lavaron dos veces y posteriormente se detectaron con anti-IgG humana-PO (reactividad cruzada con IgG de mono rhesus).
Respuesta inmune celular:
Proliferación: se cultivaron PBMC (105/pocillo) durante 4 días (37 °C/5 % CO2/99 % de humedad) en 8 plex con medio, carga útil (2 pg/ml), inmunógeno (2 pg/ml), Der p1 (2 pg/ml), Der p2 (2 pg/ml), Der p5 (2 pg/ml) y Der p7 (2 pg/ml). Como control positivo se usó Con A (Concanavalina A, Sigma). La proliferación se midió mediante [3H]-timidina (0,5 pCi/pocillo) durante las últimas 18 horas de un cultivo de 4 días. Las células se recogieron para el recuento de centelleo p (Topcount NXT, Packerd, Ramsey, MN, EE. UU.). Las cuentas netas por minuto se calcularon restando las cuentas del medio de control de las cuentas inducidas por los diferentes antígenos.
Producción de citocinas:
De cada pocillo de las estimulaciones 8plex del experimento de proliferación, se tomaron 50 pl de sobrenadante después de 24 horas y se combinaron. Los sobrenadantes combinados se ensayaron para determinar la presencia de IFNy e IL-4 usando kits de ELISA disponibles comercialmente de U-Cytech, Utrecht, Países Bajos).
Resultados:
Respuestas de anticuerpos:
Se midieron respuestas fuertes de IgG frente a la carga útil y el inmunógeno de SG100, pero no se detectaron anticuerpos frente a Der p1, Der p2, Der p5 o Der p7 (Figura 7), lo que indica que los animales no habían estado expuestos a los alérgenos HDM ensayados y que SG100 no contiene epítopos de células B, que reaccionan de forma cruzada con los alérgenos HDM ensayados.
Respuesta de las células T:
En la Figura 8 se puede ver que los animales mostraron una proliferación fuerte cuando se estimularon in vitro con la carga útil, inmo5, Der p1, Der p2, Der p7, pero no frente a Der p5. También se midió IFNy pero no IL-4 en los sobrenadantes de cultivos in vitro con la carga útil, inmo5, Der p1, Der p2, Der p7 pero no frente a Der p5. (Figura 9). Se observó IL-4 después de la estimulación con Con A (datos no mostrados).
Conclusión:
La inmunización con SG100 induce una respuesta de memoria de tipo Th1 frente a la vacuna, como lo indica la presencia de anticuerpos IgG, así como la inducción de células T que producen IFNy pero no IL-4 cuando son estimuladas por carga útil o Inmo5. Como era de esperar, no se indujo IgG (= memoria de células B) frente a Der p1, Der p2, Der p5 o Der p7 porque la vacuna no contiene epítopos de células B de estos alérgenos. Sin embargo, se indujo memoria de tipo Th1 frente a los epítopos de células T de los alérgenos de los ácaros del polvo doméstico que están presentes en la vacuna Der p1, Der p2, Der p7. No se induce memoria de tipo Th1 frente a Der p5, que no está incluido en la vacuna.
Esto confirma el concepto de SG100.
12.9 Vacuna ilustrativo, carga útil para uso en oncología
ScFV-hélice 1 (IV.3): (SEQ ID 70) EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDY WGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSK SLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISR VEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAI/1/SHPQF£KGP£\/SAL£K£\/
S A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K
Subrayado: dominio VH
Negrita: dominio HL
Tipografía normal. Enlazador flexible (puede ser cualquier enlazador)
En cursiva: la hélice pepE más la secuencia C' StrepTag II y el enlazador "GP" puede ser cualquier enlazador flexible (StrepTag II puede eliminarse o reemplazarse por la etiqueta HIS o cualquier otra etiqueta)
Carga útil con ODNM362:
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNT YTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLD YWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSS KSLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISR VEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGSISAWSHPQFEKGPEVSAL£K£\/S
A L E K E V S A L E K E V S A L E K E V S A L E K ODNM362_SH (SEQ ID 69)
TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT-SH
ODN-M362 se puede acoplar a cualquiera de las lisinas disponibles en ScFV-1-hélice
Carga útil (SG100):
ScFV-1 -hélice químicamente unido con ODN-M362-SH. La preparación es una mezcla de ScFV-1 -hélice unida con 1 a 18 moléculas de ODN-M362. Se prefiere una mezcla con 1-6 moléculas de ODN-M362 acopladas a ScFV-1-hélice. Todas estas mezclas pueden denominarse carga útil o ScFv-1-hélice-M362.
Antecedentes:
Las dianas oncológicas para la inmunoterapia activa son casi por definición autoantígenos que se sobreexpresan en las células tumorales. Estos antígenos se denominan antígenos asociados a tumores (TAA) y el sistema inmune no es capaz de responder frente a estos antígenos porque se reconocen como propios. Una formulación de vacuna que permita al sistema inmune generar un anticuerpo específico y/o una respuesta inmune celular frente a un autoantígeno es potencialmente adecuada para su uso como vacunación antitumoral.
La carga útil de SG100 permite una respuesta autoinmune:
Se inmunizaron 24 ratones (6/grupo) s.c. 2x con 35 gg en 150 gl de ScFV-1 -hélice o con la carga útil (ScFV-1 -hélice-M362) ya sea formulado en Alumbre o diluido en PBS. Las inmunizaciones se realizaron el d0 y el d14, los sueros se tomaron el d0 (antes de la inmunización) y el d28 y se analizaron para determinar IgG 1 e IgG2a frente a ScFV-1 -hélice (indicado como ScFV) y mAb IV.3 mediante ELISA estándar. Véase la Figura 6.
Como puede verse en la figura 6, la inmunización con la carga útil indujo una respuesta fuerte de IgG1 e IgG2a al ScFV-1-hélice, así como al mAb IV.3 el día 28. Se observó una respuesta positiva independiente de la presencia de Alumbre. La inmunización con ScFV-1-hélice solo indujo una respuesta de IgG1 frente a ScFV-1-hélice y solo en presencia de Alumbre, no se indujo respuesta de IgG2a. Estos datos encajan con el concepto de que CpG (M362) induce una respuesta de tipo Th1 (IgG2a) y el Alumbre induce una respuesta de tipo TH2 (IgG1). La respuesta frente a ScFV-1-hélice indica que esta proteína es inmunogénica en el ratón, de hecho, tanto StrepTagll (secuencia de aminoácidos "SAWSHPQFEK" (SEQ ID 76)) como pepE (secuencia de aminoácidos "EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK" SEQ ID 77) fueron diana de las respuestas de IgG (datos no mostrados). Sin embargo, ScFV-1-hélice también contiene "auto-secuencias de ratón" porque el ScFV contiene los dominios VH y VL del mAb IV.3 de ratón. Por tanto, una respuesta inmune frente a IV.3 indica la presencia de anticuerpos autoinmunes. De hecho, solo la carga útil con o sin Alumbre pudo inducir este tipo de respuesta inmune. Por tanto, la presencia de M362 en ScFV-1 -hélice es capaz de romper la tolerancia frente a los autoantígenos dominio VH y VL del anticuerpo parental. Combinando un autoantígeno, p. ej., un TAA, a través de la interacción de alta afinidad con pepE de la carga útil, la carga útil podrá inducir la respuesta autoinmune necesaria frente al TAA. El complejo de la carga útil (ScFV-1-hélice-M362) con el TAA forma una vacuna potente para el tratamiento del cáncer con sobreexpresión del TAA en la vacuna. Dicha vacuna se puede formular con cualquier adyuvante, p. ej., en Alumbre. Ejemplo 13: Utilización de la plataforma tecnológica en oncología, inmunógeno G17.
Carga útil basada en ScFV-hélice1 (IV.3) ODNM362 e inmunógeno G17 de mono rhesus y cynomolgus (G17RM). En lo sucesivo, pE se entiende como piroGlu.
Secuencia de inmunógeno humano gastrina pequeña (G17H, 1os 13 AA, SEQ ID 86):
pEGPWLEEEE EAYG
Secuencia de inmunógeno de gastrina pequeña de mono rhesus y cynomolgus (G17RM, 1os 13 AA, SEQ ID 99: pEGPWMEEEE AAYG
Secuencia de inmunógeno de ratón gastrina pequeña (G17M, 1os 13 AA, SEQ ID 100):
pERPRMEEEE EAYG
diferencias con G17RM en negrita
Producto final inmunógeno G17RM de 1 hélice y G17H de 1 hélice:
G17RM_1-hélice, SEQ ID 101:
pEGPWMEEEEAAYGGGSG G KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE
G17H_1-hélice, SEQ ID 102
pEGPWLEEEEEAYGGGSGG KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE
en negrita: un enlazador (puede ser cualquier enlazador)
En cursiva: la hélice pepK para la interacción con la carga útil
Listo para usar (producto final) TYG100 1RM y TYG100 1H
La carga útil como se describe anteriormente (basada en ScFV-hélice1 IV.3) se mezcla con G17RM_1-hélice o G17H_1 -hélice en una proporción que indica que el 100 % de la carga útil está formando un complejo con G17RM_1 -hélice o G17H_1-hélice, sin que esté presente el inmunógeno libre G17 (proporción molar de ~ 1:1) y formulado en alumbre. De este modo, se producen TYG100_1 RM y TYG100_1 H.
Ejemplo 14: TYG100 1 RM para el tratamiento del cáncer dependiente de gastrina, p. ej., cáncer de páncreas:
Se inmunizaron 6 ratones Balb/c 3 veces el día 0, el día 14 y el día 35 con TYG100_1 RM o G17_1 RM (sin carga útil) que contenía G17 de mono rhesus (58,4 pg/inyección en 0,5 ml). Dos semanas después de la última inmunización, se extrajo suero y se analizó para determinar la presencia de anticuerpos IgG frente a G17RM, G17H y G17M (= G17 del ratón)
Tabla 2
Figure imgf000040_0002
La Tabla 2 muestra que todos los ratones respondieron con IgG frente a los 2 componentes de la vacuna (carga útil y G17RM). Es importante destacar que todos los ratones produjeron IgG que reaccionó de forma cruzada con G17 humano y, en menor medida, con G17 de ratón (G17M). Esto último es notable porque los primeros 13 inmunoácidos del G17 de ratón (pERPRMEEEEEAYG, SEQ ID 86) son diferentes en 3 AA de G17RM (las diferencias se indican en negrita y subrayado) y G17M es un autoantígeno para el ratón. Los anticuerpos que reconocen G17M son, por tanto, autoanticuerpos, lo que indica que TYG100_1 RM ha podido romper la tolerancia natural frente al autoantígeno G17M. No hubo respuesta frente a G17 cuando el péptido G17 se inmunizó sin la carga útil.
La capacidad de una vacuna para inducir una respuesta autoinmune es un requisito previo para una vacuna anticancerosa, donde todos los antígenos asociados a tumores (TAA) son autoantígenos que se sobreexpresan, p. ej., se sobreexpresan en las células tumorales. Por tanto, una vacuna compuesta por la carga útil de TYG100_1 RM combinada con G17 humano como inmunógeno se puede usar como vacuna para el tratamiento de tumores dependientes de gastrina tal como el cáncer de páncreas.
Ejemplo 15: productos ilustrativos que incluyen un dímero del inmunógeno peptídico
Producto final inmunógeno G17RM de 2-hélices y G17H de 2-hélices:
Se sintetizó químicamente un dímero de G17RM (1os 13 AA de gastrina pequeña) usando un enlazador flexible especial que conecta los 2 péptidos a una hélice pepK.
G17RM 2-hélices: (SEQ ID 103: Parte de una composición inmunogénica de la invención, que comprende dos péptidos de gastrina de mono rhesus de la SEQ ID 99, una secuencia enlazadora ramificada y una hélice alfa de péptido (TYG100_2RM). Esta parte puede estar unida al adyuvante dirigido adecuado por un enlace de hélice enrollada)
Figure imgf000040_0001
en negrita un enlazador flexible especial (puede ser cualquier enlazador que conecte tres péptidos) En cursiva la hélice pepK para la interacción con la carga útil
G17H 2-hélices: (SEQ ID 88: Parte de una composición inmunogénica de la invención, que comprende dos péptidos de gastrina humana de la SEQ ID 86, una secuencia enlazadora ramificada y una hélice alfa de péptido (TYG100_2H). Esta parte puede estar unida al adyuvante dirigido adecuado por un enlace de hélice enrollada)
en negrita un enlazador flexible especial (puede ser cualquier enlazador que conecte tres péptidos) En cursiva la hélice pepK para la interacción con la carga útil
Producto final TYG1002RM y TYG1002H
La carga útil como se describió anteriormente (basada en ScFV-hélice1; IV.3) se mezcla con G17RM_2-hélices o G17H_2-hélices en una proporción que indica que el 100 % de la carga útil está formando un complejo con el inmunógeno G17RM_2-hélices o G17H_2-hélices, sin estar presente inmunógeno libre G17 (proporción molar de ~ 1:1) y formulado en Alumbre. De este modo, se producen t Yg 100_2RM y TYG100_2H.
Ejemplo 16: TYG100 2RM para el tratamiento del cáncer dependiente de gastrina, p. ej., cáncer de páncreas:
Se inmunizaron 6 ratones Balb/c 3 veces el día 0, el día 14 y el día 35 con TYG100_2RM que contenía los primeros 13 inmunoácidos de G17 de mono rhesus (66,8 pg/inyección en 0,5 ml). Dos semanas después de la última inmunización, se extrajo suero y se analizó para determinar la presencia de anticuerpos IgG frente a G17RM, G17H y G17M (= G17 del ratón)
Tabla 3
Figure imgf000041_0001
La Tabla 3 muestra que todos los ratones respondieron con IgG frente a los 2 componentes de la vacuna (carga útil y G17RM). Es importante destacar que todos los ratones produjeron IgG que reaccionó de forma cruzada con G17 humano y, en menor medida, con G17 de ratón (G17M). Esto último es notable porque los primeros 13 inmunoácidos del G17 de ratón (pERPRMEEEEEAYG. SEQ iD 86) es diferente en 3 AA de G17RM (las diferencias se indican en negrita y subrayado) y G17M es un autoantígeno para el ratón. Los anticuerpos que reconocen G17M son, por tanto, autoanticuerpos, lo que indica que TYG100_2RM ha podido romper la tolerancia natural frente al autoantígeno G17M. No hubo respuesta frente a G17 cuando el péptido G17 se inmunizó sin la carga útil.
La capacidad de una vacuna para inducir una respuesta autoinmune es un requisito previo para una vacuna anticancerosa, donde todos los antígenos asociados a tumores (TAA) son autoantígenos que se sobreexpresan en las células tumorales. Por lo tanto, una vacuna compuesta por la carga útil de TYG100_2RM combinada con G17 humano como inmunógeno puede usarse como vacuna para el tratamiento de tumores dependientes de gastrina tal como el cáncer de páncreas. Las respuestas frente a los 3 tipos de G17 inducidas por TYG100_2RM fueron más fuertes que las inducidas por TYG100_1 RM (tabla 2), lo que indica que se prefiere el dímero en la vacuna.
Ejemplo 17: TYG100 2RM para el tratamiento del cáncer dependiente de gastrina, p. ej., cáncer de páncreas:
Se inmunizaron 6 monos cynomolgus con TYG100_2RM y 6 se inmunizaron con G17RM_2-hélices en d0, d14 y d28. Los días d0, d14, d28, 42 y d56 se analizó el suero para determinar la presencia de anticuerpos IgG frente a la gastrina pequeña autóloga (G17RM), la gastrina pequeña de seres humanos (G17H), un péptido de control irrelevante de PM similar a la gastrina (péptido de control) o frente a la carga útil (ScFV-hélice1) usando el sistema de ELISA multiplex de Meso Scale Discovery (MSD) de acuerdo con el manual de MSD.
En la figura 10, se puede ver que los 6 animales mostraron una respuesta fuerte de IgG dependiente del tiempo a la carga útil (ScFV-hélice1), así como a G17RM y G17H, no se observó respuesta frente al péptido de control. La respuesta frente a G17RM después de tres inmunizaciones fue el 75 % de la respuesta frente a ScFV-hélice1. Esto es notable ya que G17RM es una proteína 100 % autóloga de sólo ~ 1,2 kDa mientras que ScFV-hélice1 es una proteína 100 % alogénica de > 30 kDa. Los anticuerpos anti G17RM reaccionaron de forma cruzada fuertemente con G17H. No hubo respuesta frente a G17RM cuando se usó el péptido en hélice G17RM_2 sin la carga útil. La disminución de la titulación de IgG entre el d42 y 56 fue más fuerte para G17RM que para ScFV, lo que indica que parte de los anticuerpos IgG fueron neutralizados por G17 endógeno. Es importante destacar que la presencia de G17 endógeno no reforzó la respuesta a G17RM.
Los datos de la figura 10 muestran que la vacuna fue capaz de inducir una respuesta de autoanticuerpos real que es reversible. Este es un requisito previo para las vacunas anticancerosas, ya que los antígenos asociados a tumores (TAA) son autoantígenos que están sobreexpresados, p. ej., sobreexpresados en células tumorales, pero también están presentes en niveles de expresión más bajos en células sanas normales. Por tanto, se puede usar una vacuna tal como TYG100_2RM o TYG100_2H para el tratamiento de tumores dependientes de gastrina tal como el cáncer de páncreas. Una vez que el cáncer se ha curado por completo, se puede interrumpir el tratamiento y los anticuerpos anti G17 inducidos se eliminarán de la circulación. Con el fin de mantener un estado estacionario (durante el tratamiento), la respuesta autoinmune necesita ser reforzada por inyecciones repetidas con la vacuna. Con este tipo de vacuna no se induce ninguna enfermedad autoinmune irreversible.
Ejemplo 18: TYG1002RM para el tratamiento de la obesidad:
Se controló el apetito de los animales del Ejemplo 14 y se midió el peso corporal los días d0, d14, d28, d42 y d56. Después de dos inyecciones con TYG100_2RM, 4 de cada 6 animales perdieron interés en sus refrigerios diarios (galletas), mientras que la ingesta básica de alimentos se mantuvo normal. Esto estuvo acompañado de una pérdida de peso significativa (figura 11), pero no se documentaron efectos secundarios no deseados. Hasta ahora, dichas observaciones nunca se hicieron con otra vacunación con vacunas que se basaban en interacciones entre cargas útiles y hélices enrolladas, tales como inmunógenos dirigidos distintos de inmunógenos de gastrina (datos no mostrados)
Estos datos indican que TYG100_2RM reduce el antojo de refrigerios (entre comidas) sin influir en la ingesta básica de alimentos necesarios para una vida saludable. Los animales estaban normalmente activos y felices. Por lo tanto, TYG100_2RM puede usarse para el tratamiento de la obesidad.
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Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Vacuna inmunorreguladora que comprende
- un adyuvante dirigido que comprende al menos un resto anti-CD32 unido a un ligando de TLR9 y una primera hélice alfa peptídica, en donde el resto anti-CD32 es una proteína o péptido que se une específicamente a CD32, y en donde el ligando de TLR9 es un oligodesoxinucleótido CpG ; y
- un inmunógeno con al menos un epítopo y una segunda hélice alfa peptídica enrollada en la primera hélice alfa, en donde la hélice enrollada es una heterohélice de dos hélices coincidentes diferentes, que difieren en al menos un aminoácido en la secuencia de repetición de la hélice y en donde cada una de dichas primera y segunda hélices alfa comprende 3-5 repeticiones de aminoácidos de un resto de aminoácidos.
2. Vacuna según la reivindicación 1, en donde dichas primera y segunda hélices alfa se unen específicamente entre sí con una Kd inferior a 10-6 M.
3. Vacuna según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho resto anti-CD32 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD32 y un fragmento de anticuerpo.
4. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ligando de TLR9 es un agonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en oligodesoxinucleótidos CpG de clase A, B y C.
5. Vacuna según la reivindicación 4, en donde dicho inmunógeno se deriva de un antígeno asociado a un tumor, un patógeno o un alérgeno.
6. Vacuna según la reivindicación 4, en donde dicho resto anti-CD32 se dirige a CD32a.
7. Vacuna según la reivindicación 4 o 5, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un alérgeno.
8. Vacuna para su uso según la reivindicación 7, en donde dicho resto anti-CD32 se dirige a CD32a y CD32b.
9. Vacuna según la reivindicación 4 o 5, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades cancerosas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un antígeno asociado a un tumor.
10. Vacuna según la reivindicación 4 o 5, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades infecciosas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un patógeno.
11. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ligando de TLR9 es un antagonista de TLR9 seleccionado del grupo que consiste en ODN inhibidores.
12. Vacuna según la reivindicación 11, en donde dicho inmunógeno se deriva de un alérgeno o un autoantígeno humano.
13. Vacuna según la reivindicación 12, en donde dicho resto anti-CD32 se dirige a CD32b o CD32a y CD32b.
14. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende
- un adyuvante dirigido que está compuesto por el resto anti-CD32 unido a la primera hélice alfa que comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID 70, que está acoplado al ligando de TLR9 de la SEQ ID 69; y
- un inmunógeno que comprende o consiste en el inmunógeno de la SEQ ID 30 unido a la segunda hélice alfa; en donde el adyuvante dirigido y el inmunógeno están unidos entre sí por la estructura de hélice enrollada de la primera y segunda hélices alfa.
15. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el inmunógeno comprende o consiste en la SEQ ID 75.
16. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde el inmunógeno comprende o consiste en la SEQ ID 30 unida a la segunda hélice alfa, en donde se elimina Cys379.
17. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde el adyuvante dirigido está compuesto por el resto anti-CD32 unido a la primera hélice alfa que comprende o consiste en la secuencia SEQ ID 70, que está acoplada al ligando de TLR9 de la SEQ ID 69 en una proporción de 1:1-18 (molécula por molécula).
18. Vacuna según la reivindicación 11 o 12, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades alérgicas, en donde dicho inmunógeno se deriva de un alérgeno.
19. Vacuna para su uso según la reivindicación 18, en donde dicho resto anti-CD32 se dirige a CD32a y CD32b.
20. Vacuna según la reivindicación 11 o 12, para su uso en la inmunoterapia de enfermedades autoinmunes, en donde dicho inmunógeno se deriva de un autoantígeno humano.
21. Kit para preparar una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 11 a 17, que comprende los siguientes componentes:
el adyuvante dirigido que comprende al menos el resto anti-CD32 unido al ligando de TLR9 y la primera hélice alfa peptídica, y
el inmunógeno con al menos un epítopo de células T y la segunda hélice alfa peptídica concordante con la primera hélice alfa.
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