CN112480272A - 一种新型重组免疫细胞因子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型重组免疫细胞因子的制备。本发明的重组免疫细胞因子同时表达IL‑2和靶向PD‑L1的单链抗体。本发明还提供了该新型的重组免疫细胞因子及其应用。重组免疫细胞因子IL‑2‑PD‑L1 SCFV能特异性靶向肿瘤区域，避免IL‑2造成的非特异性结合导致的非靶向的细胞毒性；同时阻断PD‑1/PD‑L1结合，使机体的适应性免疫协同特异性免疫，激活T细胞，B细胞等多种淋巴细胞，共同杀伤肿瘤细胞。本发明的方法较操作简便、成本较低，可以解决目前免疫细胞的扩增效率问题，同时克服了免疫抑制的肿瘤微环境，有利于免疫细胞发挥活性。

Description

一种新型重组免疫细胞因子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种新型重组免疫细胞因子的制备。本发明还提供了该新型的重组免疫细胞因子及其应用。
背景技术
肿瘤发生和发展都伴随着对免疫系统的入侵，免疫功能不全的个体常常有较高的癌症发生率和较差的愈后。因此研究者都投入大量的时间精力提高癌症患者的免疫功能，包括给予免疫刺激性的细胞因子治疗，如IFN-gamma、IL-2等；利用树突细胞（DC cell）为基础的疫苗来激活免疫系统以提高内源性免疫反应；利用自体癌症特异性细胞毒性T细胞（CTLs）激活和扩增的过继细胞转移治疗；或者改造T细胞使其表达嵌合抗原受体用以识别肿瘤细胞特异性抗原等。
细胞表面的PD-1受体与其配体PD-L1和PD-L2结合，可以抑制T细胞增殖和细胞因子的生成。部分肿瘤细胞的PD-1配体上调，通过这个通路信号传导可抑制激活的T细胞对肿瘤的免疫监视。白细胞介素-2 (IL-2)是免疫系统中一种细胞因子信号分子,蛋白分子量为15.5-16KDa。IL-2主要来源于活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞，可通过与淋巴细胞表面的IL-2受体结合来调节其作用。IL-2通过对T细胞的直接作用，影响免疫系统的关键功能。T细胞在胸腺发育成熟的过程，IL-2可促进某些未成熟的T细胞分化为调节性T细胞来预防自身免疫性疾病；当最初的T细胞受抗原刺激时，IL-2还能促进T细胞分化为效应T细胞和记忆细胞，发挥免疫反应。
发明内容
本发明的目的是制备出一种可以靶向PD-L1的单链抗体与IL-2分子融合细胞因子，可以促进多种免疫细胞的快速扩增，克服免疫抑制。
本发明的另一个目的是提供上述融合细胞因子的应用。
本发明采用基因工程技术，将靶向PD-L1的单链抗体（SCFV）与IL-2细胞分子融合表达，构建出了一种新型的重组免疫细胞因子IL-2-PD-L1。目的是使重组免疫细胞因子IL-2-PD-L1能特异性靶向肿瘤区域，避免非特异性结合导致的血管毒性；同时阻断PD-1/PD-L1结合，使机体的适应性免疫协同特异性免疫，激活T细胞，B细胞等多种淋巴细胞，释放IL-2细胞因子，以期达到对抗原表达量低、单用抗体效果不明显肿瘤的更好治疗效果，同时制备的新型的细胞因子可以促进不同类型的免疫细胞的快速扩增，并且克服了免疫抑制。
本发明提供了一种重组免疫细胞因子，该重组免疫细胞因子同时表达IL-2和识别PD-L1的抗体。
所述的IL-2和识别PD-L1的抗体的序列可以从本领域熟知的数据库或者网站中获知，然后通过人工合成或者基因工程方法制备相应的生物分子。
较好的，所述的识别PD-L1的抗体为PD-L1-SCFV，PD-L1-SCFV的氨基酸序列如SEQID NO 4所示。
所述的含有IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
在本发明的一个优选实施例中，将该重组细胞因子简称为IL-2-PD-L1。含有IL-2的核酸编码序列如SEQ ID NO 1所示，其中除了IL-2，还有linker（连接物）和酶切位点的核酸编码序列。PD-L1-SCFV的核酸序列如SEQ ID NO 3所示，其中除了SCFV还有酶切位点的序列。
另一方面，本发明提供了所述的重组免疫细胞因子的制备方法，将表达IL-2和PD-L1-SCFV的核酸编码序列同时装入表达载体，表达获得靶向PD-L1的单链抗体与IL-2分子的融合细胞因子。
本发明经过反复优化序列和实验步骤，获得了具有双功能的活性较好的重组免疫细胞因子。
具体的，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）制备含有IL-2编码序列的核酸分子；
（2）制备含有PD-L1-SCFV编码序列的核酸分子；
（3）将步骤（1）获得的含有IL-2编码序列的核酸分子和（2）获得的含有SCFV编码序列的核酸分子同时装入表达载体；
（4）将步骤（3）获得的表达载体转入宿主细胞，进行表达；
（5）收集蛋白；
（6）分离获得表达产物；
（7）筛选阳性克隆，获得靶向PD-L1的单链抗体与IL-2分子的融合细胞因子。
上述步骤不一定按照上述顺序，可以按照实际情况调整。
其中，含有IL-2编码序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO 1所示；含有SCFV编码序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO 3所示。
再一方面，本发明还提供了重组免疫细胞因子的应用，所述的重组免疫细胞因子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的细胞因子也可以与其他治疗肿瘤的药物或者药学上可接受的辅料组合、联用，增强对肿瘤细胞的作用。
重组免疫细胞因子IL-2-PD-L1能特异性靶向肿瘤区域，避免非特异性结合导致的细胞毒性；同时阻断PD-1/PD-L1结合，使机体的适应性免疫协同特异性免疫，激活多种淋巴细胞，提高免疫系统对肿瘤细胞的识别敏感性，同时制备的新型的细胞因子可以促进不同类型的免疫细胞的快速扩增，并且获得的免疫细胞克服了免疫抑制。
较好的，所述的重组免疫细胞因子靶向PD-L1的单链抗体与IL-2分子融合细胞因子。
在本发明的一个优选实施例中，所述的重组免疫细胞因子促进免疫细胞的体外增殖，包括NK细胞，TIL细胞，CD4+T，CD8+T细胞。尤其是对于后两种细胞，促进免疫细胞增殖的效果更加明显。
本发明中采用基因工程技术，将靶向PD-L1的SCFV与IL-2分子融合，构建新型重组免疫细胞因子IL-2-PD-L1-SCFV。重组细胞因子的表达不仅与细胞因子的编码序列相关，与开放阅读框之外的各种转录因子、连接物以及载体的序列也息息相关，本发明经过反复调整序列，优化制备方法，终于获得了具有较好效果的重组细胞因子。本发明的方法较简便，成本较低，可以解决目前免疫细胞的扩增效率问题，同时克服了免疫抑制的肿瘤微环境，有利于免疫细胞发挥杀伤肿瘤细胞的活性和潜能。
附图说明
图1 不同浓度的重组免疫细胞因子IL-2-PD-L1-SCFV对不同类型的免疫细胞免疫激活和扩增的效果；
图2为IL-2核酸分子的结构设计；
图3是PD-L1-SCFV的核酸序列结构设计。
具体实施方式
实施例1
IL-2和PL-1 单链抗体（PD-L1-SCFV）表达质粒的合成和构建
从NCBI的数据库中获取IL-2和PD-L1-SCFV的核酸和氨基酸序列，采用全基因合成的方法分别合成IL-2和PD-L1-SCFV分子，然后将获得的IL-2和PD-L1-SCFV分子分别通过双酶切的方法构建入PCDNA3.1分子中，将获得转染阳性的菌种扩大培养，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取PCDNA3.1-IL-2-PD-L1-SCFV分子的质粒。不同浓度的重组免疫细胞因子IL-2-PD-L1-SCFV对不同类型的免疫细胞免疫激活和扩增的效果图1。
其中，每一种细胞从左到右均采用0.1μg/mL、1.0μg/mL和10μg/mL三种浓度的细胞因子处理。
对CD4+T细胞而言，细胞因子10μg/mL组细胞增殖速度显著大于细胞因子1.0μg/mL组。
对CD8+T细胞而言，细胞因子10μg/mL组细胞增殖速度显著大于细胞因子1.0μg/mL组，细胞因子1.0μg/mL组细胞增殖速度显著大于细胞因子0.1μg/m L组。细胞因子0.1μg/mL组与不加细胞因子的差别不显著。
经过优化和筛选，本发明采用的具体IL-2-PD-L1-SCFV的序列如下：
核酸序列:(酶切位点+IL-2+linker)，SEQ ID NO 1,
GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGATGGCGGCCCCTGCTCTGTCCTGGCGTCTGCCCCTCCTCATCCTCCTCCTGCCCCTGGCTACCTCTTGGGCATCTGCAGCGGTGAATGGCACTTCCCAGTTCACATGCTTCTACAACTCGAGAGCCAACATCTCCTGTGTCTGGAGCCAAGATGGGGCTCTGCAGGACACTTCCTGCCAAGTCCATGCCTGGCCGGACAGACGGCGGTGGAACCAAACCTGTGAGCTGCTCCCCGTGAGTCAAGCATCCTGGGCCTGCAACCTGATCCTCGGAGCCCCAGATTCTCAGAAACTGACCACAGTTGACATCGTCACCCTGAGGGTGCTGTGCCGTGAGGGGGTGCGATGGAGGGTGATGGCCATCCAGGACTTCAAGCCCTTTGAGAACCTTCGCCTGATGGCCCCCATCTCCCTCCAAGTTGTCCACGTGGAGACCCACAGATGCAACATAAGCTGGGAAATCTCCCAAGCCTCCCACTACTTTGAAAGACACCTGGAGTTCGAGGCCCGGACGCTGTCCCCAGGCCACACCTGGGAGGAGGCCCCCCTGCTGACTCTCAAGCAGAAGCAGGAATGGATCTGCCTGGAGACGCTCACCCCAGACACCCAGTATGAGTTTCAGGTGCGGGTCAAGCCTCTGCAAGGCGAGTTCACGACCTGGAGCCCCTGGAGCCAGCCCCTGGCCTTCAGGACAAAGCCTGCAGCCCTTGGGAAGGACACCATTCCGTGGCTCGGCCACCTCCTCGTGGGCCTCAGCGGGGCTTTTGGCTTCATCATCTTAGTGTACTTGCTGATCAACTGCAGGAACACCGGGCCATGGCTGAAGAAGGTCCTGAAGTGTAACACCCCAGACCCCTCGAAGTTCTTTTCCCAGCTGAGCTCAGAGCATGGAGGAGACGTCCAGAAGTGGCTCTCTTCGCCCTTCCCCTCATCGTCCTTCAGCCCTGGCGGCCTGGCACCTGAGATCTCGCCACTAGAAGTGCTGGAGAGGGACAAGGTGACGCAGCTGCTCCTGCAGCAGGACAAGGTGCCTGAGCCCGCATCCTTAAGCAGCAACCACTCGCTGACCAGCTGCTTCACCAACCAGGGTTACTTCTTCTTCCACCTCCCGGATGCCTTGGAGATAGAGGCCTGCCAGGTGTACTTTACTTACGACCCCTACTCAGAGGAAGACCCTGATGAGGGTGTGGCCGGGGCACCCACAGGGTCTTCCCCCCAACCCCTGCAGCCTCTGTCAGGGGAGGACGACGCCTACTGCACCTTCCCCTCCAGGGATGACCTGCTGCTCTTCTCCCCCAGTCTCCTCGGTGGCCCCAGCCCCCCAAGCACTGCCCCTGGGGGCAGTGGGGCCGGTGAAGAGAGGATGCCCCCTTCTTTGCAAGAAAGAGTCCCCAGAGACTGGGACCCCCAGCCCCTGGGGCCTCCCACCCCAGGAGTCCCAGACCTGGTGGATTTTCAGCCACCCCCTGAGCTGGTGCTGCGAGAGGCTGGGGAGGAGGTCCCTGACGCTGGCCCCAGGGAGGGAGTCAGTTTCCCCTGGTCCAGGCCTCCTGGGCAGGGGGAGTTCAGGGCCCTTAATGCTCGCCTGCCCCTGAACACTGATGCCTACTTGTCCCTCCAAGAACTCCAGGGTCAGGACCCAACTCACTTGGTGTAGGGCTCCTCCTCCTCCTCCGGCTCCTCCTCCTCCTGGGCCCTGGTGGCCGGCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCCGCCGCCTGCGCCGTGTTCCTG。
IL-2核酸分子的结构设计见图2，单下划线是酶切位点，双下划线且斜体部分是linker，两者之间为IL-2。
对应的氨基酸序列,SEQ ID NO 2,
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGSSSSSGSSSS。
PD-L1-SCFV序列如下：（PD-L1-SCFV+酶切位点）
核酸序列,SEQ ID NO 3,
ATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCCCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGAGACCGTGAAGATCTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACGGCATGAACTGGGTGAAGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGCTGAACACCTACACCGGCGAGTCCATCTACCCCGACGACTTCAAGGGCCGCTTCGCCTTCTCCTCCGAGACCTCCGCCTCCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGAACGAGGACATGGCCACCTACTTCTGCGCCCGCGGCGACTACGGCTACGACGACCCCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCTCCGTGACCGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGACATCGTGATGACCCAGGCCGCCCCCTCCGTGCCCGTGACCCCCGGCGAGTCCGTGTCCATCTCCTGCCGCTCCTCCAAGTCCCTGCTGCACACCAACGGCAACACCTACCTGCACTGGTTCCTGCAGCGCCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACCGCATGTCCGTGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGACCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGCCTTCACCCTGTCCATCTCCCGCGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTTCTACTGCATGCAGCACCTGGAGTACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAAGGGCGGCGGCTCCAAGGGCCCCCACCACCACCACCACCACGAGGTGTCCGCCCTGGAGAAGGAGGTGTCCGCCCTGGAGAAGGAGGTGTCCGCCCTGGAGAAGGAGGTGTCCGCCCTGGAGAAGGAGGTGTCCGCCCTGGAGAAGGCCTGAGCGGCCGC。
PD-L1-SCFV的核酸序列结构设计见图3，下划线部分为酶切位点。
对应的氨基酸序列, SEQ ID NO 4,
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWLNTYTGESIYPDDFKGRFAFSSETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGDYGYDDPLDYWGQGTSVTVSSGGGGS GGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHTNGNTYLHWFLQRPGQSPQLLIYRMSVLASGVPDRFSGSGSGTAFTLSISRVEAEDVGVFYCMQHLEYPLTFGAGTKLELKGGGSKGPHHHHHH。
实施例2
PCDNA3.1-IL-2-PD-L1-SCFV的质粒的瞬时转染表达和IL-2-PD-L1-SCFV蛋白的纯化
1）293细胞的复苏和培养：
复苏293细胞，加入1640培养液+10%FBS，用50ml培养瓶培养，在细胞汇合度70%～80%时进行传代培养。
2）质粒的电转染：
待细胞汇合度生长到70%～80%时，使用BIO-RAD的电转仪对PCDNA3.1-IL-2-PD-L1-SCFV的质粒电转，步骤如下：0.2 cm电转杯，细胞密度为10x10^6 cells/ml，DNA用量为2μg，电转液的体积为100μl，电压为130V，电容为950μF。电转后迅速加入1640培养基+10%FBS，将细胞转入培养瓶中恢复培养，24小时后取样检测IL-2-PD-L1-SCFV的表达情况。
3）IL-2-PD-L1-SCFV蛋白的纯化
培养3天后收取细胞上清，使用亲和层析的方法对IL-2-PD-L1-SCFV进行纯化,获得高纯度的蛋白，检测蛋白的浓度为5mg/ml，纯度95%。
实施例3．
IL-2-PD-L1-SCFV对不同类型的免疫细胞的扩增效果
首先采用梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），采用流式分选的方法从PBMC中分别分选NK细胞，TIL细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，把不同浓度的IL-2-PD-L1-SCFV分别加入到不同类型的免疫细胞中，在T25培养瓶中培养，培养7天后，对不同类型的免疫细胞计数，计算扩增效率。
试验结果显示, IL-2-PD-L1-SCFV可以促进不同类型的免疫细胞的快速扩增。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种新型重组免疫细胞因子及其制备方法和应用
<130> 20201228
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1800
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
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ccggacagac ggcggtggaa ccaaacctgt gagctgctcc ccgtgagtca agcatcctgg 300
gcctgcaacc tgatcctcgg agccccagat tctcagaaac tgaccacagt tgacatcgtc 360
accctgaggg tgctgtgccg tgagggggtg cgatggaggg tgatggccat ccaggacttc 420
aagccctttg agaaccttcg cctgatggcc cccatctccc tccaagttgt ccacgtggag 480
acccacagat gcaacataag ctgggaaatc tcccaagcct cccactactt tgaaagacac 540
ctggagttcg aggcccggac gctgtcccca ggccacacct gggaggaggc ccccctgctg 600
actctcaagc agaagcagga atggatctgc ctggagacgc tcaccccaga cacccagtat 660
gagtttcagg tgcgggtcaa gcctctgcaa ggcgagttca cgacctggag cccctggagc 720
cagcccctgg ccttcaggac aaagcctgca gcccttggga aggacaccat tccgtggctc 780
ggccacctcc tcgtgggcct cagcggggct tttggcttca tcatcttagt gtacttgctg 840
atcaactgca ggaacaccgg gccatggctg aagaaggtcc tgaagtgtaa caccccagac 900
ccctcgaagt tcttttccca gctgagctca gagcatggag gagacgtcca gaagtggctc 960
tcttcgccct tcccctcatc gtccttcagc cctggcggcc tggcacctga gatctcgcca 1020
ctagaagtgc tggagaggga caaggtgacg cagctgctcc tgcagcagga caaggtgcct 1080
gagcccgcat ccttaagcag caaccactcg ctgaccagct gcttcaccaa ccagggttac 1140
ttcttcttcc acctcccgga tgccttggag atagaggcct gccaggtgta ctttacttac 1200
gacccctact cagaggaaga ccctgatgag ggtgtggccg gggcacccac agggtcttcc 1260
ccccaacccc tgcagcctct gtcaggggag gacgacgcct actgcacctt cccctccagg 1320
gatgacctgc tgctcttctc ccccagtctc ctcggtggcc ccagcccccc aagcactgcc 1380
cctgggggca gtggggccgg tgaagagagg atgccccctt ctttgcaaga aagagtcccc 1440
agagactggg acccccagcc cctggggcct cccaccccag gagtcccaga cctggtggat 1500
tttcagccac cccctgagct ggtgctgcga gaggctgggg aggaggtccc tgacgctggc 1560
cccagggagg gagtcagttt cccctggtcc aggcctcctg ggcaggggga gttcagggcc 1620
cttaatgctc gcctgcccct gaacactgat gcctacttgt ccctccaaga actccagggt 1680
caggacccaa ctcacttggt gtagggctcc tcctcctcct ccggctcctc ctcctcctgg 1740
gccctggtgg ccggcctgct gctgctgctg ctgctggccg ccgcctgcgc cgtgttcctg 1800
<210> 2
<211> 562
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp
35 40 45
Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp
50 55 60
Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser
65 70 75 80
Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln
85 90 95
Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu
100 105 110
Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu
115 120 125
Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu
130 135 140
Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr
145 150 155 160
Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His
165 170 175
Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp
180 185 190
Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val
195 200 205
Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser
210 215 220
Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr
225 230 235 240
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
245 250 255
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro
260 265 270
Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe
275 280 285
Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu
290 295 300
Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro
305 310 315 320
Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu
325 330 335
Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn
340 345 350
His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His
355 360 365
Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro
385 390 395 400
Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp
405 410 415
Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro
420 425 430
Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro
450 455 460
Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro
465 470 475 480
Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala
485 490 495
Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
500 505 510
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg
515 520 525
Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly
530 535 540
Gln Asp Pro Thr His Leu Val Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser
545 550 555 560
Ser Ser
<210> 3
<211> 956
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
atggagttcg gactcagttg gctgttcctg gtggccatcc tgaagggtgt gcagtgtgag 60
gtgcagctgc agcagtccgg ccccgagctg aagaagcccg gcgagaccgt gaagatctcc 120
tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacggcatga actgggtgaa gcaggccccc 180
ggcaagggcc tgaagtggat gggctggctg aacacctaca ccggcgagtc catctacccc 240
gacgacttca agggccgctt cgccttctcc tccgagacct ccgcctccac cgcctacctg 300
cagatcaaca acctgaagaa cgaggacatg gccacctact tctgcgcccg cggcgactac 360
ggctacgacg accccctgga ctactggggc cagggcacct ccgtgaccgt gtcctccggc 420
ggcggcggct ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggct ccgacatcgt gatgacccag 480
gccgccccct ccgtgcccgt gacccccggc gagtccgtgt ccatctcctg ccgctcctcc 540
aagtccctgc tgcacaccaa cggcaacacc tacctgcact ggttcctgca gcgccccggc 600
cagtcccccc agctgctgat ctaccgcatg tccgtgctgg cctccggcgt gcccgaccgc 660
ttctccggct ccggctccgg caccgccttc accctgtcca tctcccgcgt ggaggccgag 720
gacgtgggcg tgttctactg catgcagcac ctggagtacc ccctgacctt cggcgccggc 780
accaagctgg agctgaaggg cggcggctcc aagggccccc accaccacca ccaccacgag 840
gtgtccgccc tggagaagga ggtgtccgcc ctggagaagg aggtgtccgc cctggagaag 900
gaggtgtccg ccctggagaa ggaggtgtcc gccctggaga aggcctgagc ggccgc 956
<210> 4
<211> 279
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Leu Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Ser Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Asp Asp Pro Leu Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser
165 170 175
Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
180 185 190
His Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Arg Met Ser Val Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Ser Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
225 230 235 240
Asp Val Gly Val Phe Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
245 250 255
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Lys Gly
260 265 270
Pro His His His His His His
275

Claims (10)

1.一种重组免疫细胞因子，其特征在于，该重组免疫细胞因子同时表达IL-2和靶向PD-L1的抗体，含有IL-2和连接物的核酸编码序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的重组免疫细胞因子，其特征在于，所述的靶向PD-L1的抗体为PD-L1-SCFV，PD-L1-SCFV的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
3.根据权利要求1所述的重组免疫细胞因子，其特征在于，所述的IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.根据权利要求2所述的重组免疫细胞因子，其特征在于，PD-L1-SCFV的核酸序列如SEQ ID NO 3所示。
5.权利要求1所述的重组免疫细胞因子的制备方法，其特征在于，将表达IL-2和PD-L1-SCFV的核酸编码序列同时装入表达载体，表达靶向PD-L1单链抗体与IL-2分子融合的细胞因子。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
（1）制备含有IL-2编码序列的核酸分子；
（2）制备含有PD-L1-SCFV编码序列的核酸分子；
（3）将步骤（1）获得的含有IL-2编码序列的核酸分子和步骤（2）获得的含有PD-L1-SCFV编码序列的核酸分子同时装入表达载体；
（4）将步骤（3）获得的重组表达载体转入宿主细胞，进行表达；
（5）分离获得表达产物，收集蛋白；
（6）筛选阳性克隆，获得靶向PD-L1的单链抗体与IL-2分子的融合细胞因子。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，含有IL-2编码序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO 1所示；含有SCFV编码序列的核酸分子的序列如SEQ ID NO 3所示。
8.权利要求1所述的重组免疫细胞因子的应用，其特征在于，所述的重组免疫细胞因子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的重组免疫细胞因子表达PD-L1的单链抗体与IL-2分子融合细胞因子。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的重组免疫细胞因子促进免疫细胞的体外增殖。
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