CN112574954B

CN112574954B - 一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN112574954B
Application number: CN202011561248.7A
Authority: CN
Inventors: 崔大祥; 梁辉; 倪健; 田静; 李雪玲; 沈琦; 高昂
Original assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112574954A

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种Treg细胞快速扩增的新方法。本发明还包括一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法。本发明提供了一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，该细胞膜表面表达IL‑15和CD40L蛋白；所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。本发明中使用的膜材料无菌无毒，可以直接用于Treg细胞，乃至将培养获得的Treg细胞植入体内。本发明制备的细胞膜可降解，为后续处理提供了便捷，降低了污染的概率。本发明为在短时间内获得大量的Treg细胞提供了新的途径和方法。

Description

一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种Treg细胞（调节性T 细胞，T Regulatory 细胞)快速扩增的新方法。本发明还包括一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法，和应用。

背景技术

调节性T细胞 (T Regulatory 细胞，Treg细胞)，是一类与机体免疫平衡相关的细胞亚群，它们可以主动抑制普通 T 细胞的功能，维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态。Treg细胞主要分布于人体的胸腺、外周血、淋巴器官及脐静脉血中，以表达Foxp3、CD25、CD4 为细胞表型特征，在过去20 年内的研究已经证实了类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮（SLE）、Ⅰ型糖尿病（T1D）等自身免疫疾病是由于自身的Treg细胞和效应T细胞（Teff）的失衡引起的。临床试验的数据表明，特别是由于 nTreg 细胞缺乏所致的器官特异性免疫病，可以通过重构Foxp3+nTreg 细胞而达到治疗效果。临床实验证明小剂量 IL-2 的输注可使 Treg 细胞增殖而不引起效应 T 细胞扩增，临床上为了预防 GvHD，通常通过体外扩增被供体者外周血单核细胞刺激过得 Treg 细胞，然后把这些 Treg 细胞和造血干细胞一同输入患者体内。

Treg按其来源可分为天然产生的自然调节性T细胞（nTreg）和诱导产生的适应性调节性T细胞(aTreg或iTreg)。其中自然调节性T细胞主要为CD4+CD127lo/−CD25+的Treg细胞,约占外周血及脾脏CD4+T细胞的5%～10%,除表达CD4分子和CD25分子外，其特征标志为其高表达转录因子Foxp3；适应性调节性T细胞包括Tr1，Th3等细胞，是在小剂量抗原或免疫抑制性细胞因子诱导下由外周幼稚T细胞发育而成的，主要分泌IL-10和TGF-β发挥免疫负调控作用。

在人体的外周血淋巴细胞中Treg占比1%至2%，由于Treg 细胞的数量较少，并且体外扩增Treg 细胞的效率一直很低，这对临床中使用Treg 细胞治疗就带来了极大的不便和困难，因此开发一种可以快速高效的扩增Treg细胞的方法对于推广该疗法用于临床非常重要。

发明内容

本发明目的在于：提供一种在体外快速扩增Treg细胞，为一种细胞膜。

本发明再一目的在于：提供上述细胞膜的制备方法。

本发明的又一目的在于：提供一种所述细胞膜的使用方法，通过上述实验材料和方法实现Treg细胞的体外快速扩增，并且扩增获得的细胞能够正常、健康的持续生长。。

本发明提供了一种Treg细胞快速扩增的方法，制备了一种细胞膜结构，可以表达在膜表面，营造了体内细胞扩增的三维环境，有利于Treg细胞的快速扩增。

一方面, 本发明提供了一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，所述的细胞膜表面表达IL-15和CD40L蛋白。

所述的细胞膜源自具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。例如，在本发明的一个优选实施例中，所述的细胞膜源自人K562细胞。

所述的IL-15蛋白与跨膜蛋白连接，含有IL-15、连接物（linker）和跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。

较好的，所述CD40L的氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。

另一方面，本发明提供了所述的细胞膜的制备方法，包括：

（1）制备IL-15和CD40L蛋白的表达质粒；

（2）IL-15和CD40L蛋白的表达质粒转染细胞；

（3）收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片。

较好的，所述的转染通过电转实现。

所述的IL-15和CD40L蛋白的表达质粒是表达独立的IL-15和CD40L蛋白的重组质粒。

再一方面，本发明还提供了所述的细胞膜的应用，所述的细胞膜作为骨架或者基质，促进Treg细胞的体外生长。

所述的应用包括以下步骤：

S1，制备IL-15和CD40L蛋白的表达质粒；

S2，IL-15和CD40L蛋白的表达质粒转染细胞；所述的细胞为具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，该恶性肿瘤细胞能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞；

S3，收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片；

S4，将步骤S3获得的细胞膜碎片、IL-15和CD40L蛋白、加入培养Treg细胞的介质或者容器；细胞膜与IL-15和CD40L蛋白比例为1：2-2：1，摩尔比；

S5，在上述容器或者介质中加入TREG细胞，TREG细胞的接种密度为10⁴-5*10⁶ 个/ml；换液，培养3-14天。

较好的，IL-15和CD40L蛋白的表达质粒通过下述方法制备：

获得编码IL-15和CD40L蛋白的核酸分子；

在IL-15序列和/或CD40L序列末端连接连接物；

将连接后的核酸分子构建入表达载体中；

编码IL-15、连接物、跨膜蛋白核酸分子的序列如SEQ ID NO 1所示,编码CD40L蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO 3所示。

IL-15和CD40L蛋白的表达质粒可以是分别表达IL-15和CD40L蛋白的两个质粒，也可以是在一个质粒中表达独立的IL-15和CD40L两个蛋白。

本发明制备出的可以在细胞膜表面高效表达的跨膜细胞因子的细胞膜材料，可以用于刺激Treg细胞的高效扩增。试验结果显示，K562细胞膜表达IL-15和CD40L蛋白的K562细胞膜扩增效率在7天内可以大于10⁹，扩增效率超过10000倍。本发明的方法操作简便，成本低廉，有利于Treg细胞的快速扩增。该方法中使用的材料均为无菌无毒，可以直接用于Treg细胞，乃至将培养获得的Treg细胞植入体内。本发明制备的细胞膜可降解，为后续处理提供了便捷，降低了污染的概率。本发明为在短时间内获得大量的Treg细胞提供了新的途径和方法。

附图说明

图1是K562细胞膜法扩增Treg细胞的细胞扩增效率比较结果；

可见，使用K562细胞膜后，Treg细胞的扩增效率提升了超过10000倍。

具体实施方式

本发明制备出的可以在细胞膜表面高效表达的跨膜细胞因子的细胞膜材料，可以用于刺激Treg细胞的高效扩增。

实施例1

IL-15和CD40L表达质粒的合成和构建,

CD40属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，广泛表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、Ｂ细胞、树突状细胞（DC）、巨噬细胞等免疫细胞及内皮细胞、血小板等非免疫细胞表面。其配体CD40L与CD40是一对互补的蛋白质分子，属于TNF超家族成员。CD40L与CD40相似，也广泛表达于许多免疫类细胞，提供Ｔ、Ｂ细胞活化所必需的协同刺激信号。CD40L与CD40分子结合后，能使膜CD40分子交联和配基化，继而使CD40分子多聚化，构成CD40信号传导的结构基础和始动因素。因此在本发明中选用CD40L分子作为扩增Treg细胞的元件。

IL-15 白介素15（IL-15）可以刺激T 细胞增殖，诱导多种类型的免疫细胞的激活扩增，并且激活的免疫细胞不容易凋亡，效果优于IL-2，近年来在细胞治疗中作为CAR-T扩增的组件对T细胞的增殖具有很好的效果，因此在本发明中选用IL-15分子作为扩增Treg细胞的元件。

从NCBI的数据库中获取IL-15和CD40L的核酸和氨基酸序列，采用全基因合成的方法分别合成IL-15和CD40L分子，然后将获得的IL-15序列和CD40L分子分别采用双酶切的方法构建入PCDNA3.1分子中，将获得转染阳性的菌种扩大培养，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取PCDNA3.1-IL-15和CD40L的质粒。

核酸序列:(Il-15+linker+跨膜蛋白)

gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTTGAGGCTCCTCCTCCTCCTCCGGCTCCTCCTCCTCCTGGGCCC TGGTGGCCGGCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCCGCCGCCTGCGCCGTGTTCCTG gcggccgc（SEQ ID NO1）。

氨基酸序列

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSSSSSGSSSSWALVAGLLLLLLLAAACAVFL（SEQ ID NO 2）。

CD40L序列如下：

核酸序列

gaattcgccgccaccATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCTGCGGCCACTGGACTGCCCATCAGCATGAAAATTTTTATGTATTTACTTACTGTTTTTCTTATCACCCAGATGATTGGGTCAGCACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTTCATGAAGATTTTGTATTCATGAAAACGATACAGAGATGCAACACAGGAGAAAGATCCTTATCCTTACTGAACTGTGAGGAGATTAAAAGCCAGTTTGAAGGCTTTGTGAAGGATATAATGTTAAACAAAGAGGAGACGAAGAAAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGGTGATCAGAATCCTCAAATTGCGGCACATGTCATAAGTGAGGCCAGCAGTAAAACAACATCTGTGTTACAGTGGGCTGAAAAAGGATACTACACCATGAGCAACAACTTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGTTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAGTCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTTCGAGTCAAGCTCCATTTATAGCCAGCCTCTGCCTAAAGTCCCCCGGTAGATTCGAGAGAATCTTACTCAGAGCTGCAAATACCCACAGTTCCGCCAAACCTTGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGGAGTATTTGAATTGCAACCAGGTGCTTCGGTGTTTGTCAATGTGACTGATCCAAGCCAAGTGAGCCATGGCACTGGCTTCACGTCCTTTGGCTTACTCAAACTCTAGgcggccgc（SEQ ID NO 3）。

对应的氨基酸序列

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL（SEQ ID NO 4）。

实施例2

K562细胞的培养的转染

K562细胞的复苏和培养：

K562的原始细胞是一种具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。培养条件： 1640培养基 10%FBS，传代方法：维持细胞密度在10⁵-10⁶/ml之间，每周换液2-3次。

电转染：

使用BIO-RAD的电转仪对PCDNA3.1-IL-15和CD40L的质粒进行电转，步骤如下：

0.2 cm电转杯，细胞密度为10x10^6 cells/ml，DNA用量为2μg，电转液体积为100μl，电压为130V，电容为950μF。电转后迅速加入1640培养基，将细胞转入培养瓶中恢复培养，流式方法分析CD40L和IL-15在细胞膜上的表达情况。

实施例3

Treg细胞扩增的细胞膜的制备

在K562细胞密度涨到10⁹-10¹⁰/ml的时候，收取细胞，使用PBS洗涤细胞，加入10mMtris盐酸溶液，放入4℃搅拌2小时，让细胞破碎，然后低温离心30分钟，收取沉淀，使用10mMtris盐酸溶液清洗3次，低温高速离心10分钟后，用PBS重悬沉淀后，获得K562细胞膜的材料。

实施例4

K562细胞膜扩增Treg细胞的效率

首先采用梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），利用CliniMACS分离CD4+CD127lo/−CD25+的Treg细胞，分别用等摩尔浓度的K562细胞膜和单独的IL-15和CD40L蛋白分子处理T25的细胞培养瓶，将10^5个/ml的Treg细胞加入T25培养瓶中培养，联系培养7天后，对Treg细胞计数，计算扩增效率。

试验结果显示，K562细胞膜表达IL-15和CD40L蛋白的K562细胞膜扩增效率在7天内可以大于10⁹，扩增效率超过10000倍。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

图1是K562细胞膜法扩增Treg细胞的细胞扩增效率比较结果，分别采用含有等摩尔浓度K562细胞膜制备的CD40L和IL-15的游离的CD40L和IL-15的培养基培养Treg细胞，计算不同方法对Treg细胞的扩增效率，可见，使用K562细胞膜后，Treg细胞的扩增效率提升了超过10000倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 一种用于Treg细胞高效扩增的可降解细胞膜及其制备方法、应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 664

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60

ggtgtgcagt gatgagaatt tcgaaaccac atttgagaag tatttccatc cagtgctact 120

tgtgtttact tctaaacagt cattttctaa ctgaagctgg cattcatgtc ttcattttgg 180

gctgtttcag tgcagggctt cctaaaacag aagccaactg ggtgaatgta ataagtgatt 240

tgaaaaaaat tgaagatctt attcaatcta tgcatattga tgctacttta tatacggaaa 300

gtgatgttca ccccagttgc aaagtaacag caatgaagtg ctttctcttg gagttacaag 360

ttatttcact tgagtccgga gatgcaagta ttcatgatac agtagaaaat ctgatcatcc 420

tagcaaacaa cagtttgtct tctaatggga atgtaacaga atctggatgc aaagaatgtg 480

aggaactgga ggaaaaaaat attaaagaat ttttgcagag ttttgtacat attgtccaaa 540

tgttcatcaa cacttcttga ggctcctcct cctcctccgg ctcctcctcc tcctgggccc 600

tggtggccgg cctgctgctg ctgctgctgc tggccgccgc ctgcgccgtg ttcctggcgg 660

ccgc 664

<210> 2

<211> 194

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Trp Ala Leu

165 170 175

Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val

180 185 190

Phe Leu

<210> 3

<211> 806

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gaattcgccg ccaccatcga aacatacaac caaacttctc cccgatctgc ggccactgga 60

ctgcccatca gcatgaaaat ttttatgtat ttacttactg tttttcttat cacccagatg 120

attgggtcag cactttttgc tgtgtatctt catagaaggt tggacaagat agaagatgaa 180

aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa 240

agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag 300

gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt 360

gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct 420

gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa 480

aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc 540

ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag 600

tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa 660

ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg 720

gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt 780

ggcttactca aactctaggc ggccgc 806

<210> 4

<211> 261

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

Claims

1.一种用于扩增Treg细胞的细胞膜，其特征在于，所述细胞膜的表面表达IL-15和CD40L蛋白；

所述的细胞膜为人K562细胞；

所述IL-15与跨膜蛋白连接；连接物和跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述CD40L的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.权利要求1所述的细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

（1）制备IL-15和CD40L蛋白的表达质粒；

（2）IL-15和CD40L蛋白的表达质粒转染细胞；

（3）收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片；所述的细胞膜为人K562细胞。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的转染通过电转实现。

4.权利要求1所述的细胞膜的应用，其特征在于，所述的细胞膜作为骨架或者基质，促进Treg细胞的体外生长。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：

S1，制备表达IL-15和CD40L蛋白的质粒；

S2，表达IL-15和CD40L蛋白的质粒转染细胞；所述的细胞膜为人K562细胞；

S3，收集并破碎转染成功的细胞，获得细胞膜碎片；

S4，将步骤S3获得的细胞膜碎片、IL-15和CD40L蛋白加入培养Treg细胞的介质或者容器；细胞膜与IL-15或者CD40L蛋白比例为1：2-2：1，摩尔比；

S5，在上述步骤S4的容器或者基质中加入Treg细胞，Treg细胞的接种密度为10⁴-5*10⁶个/ml。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，表达IL-15和CD40L蛋白的质粒通过下述方法制备：

获得编码IL-15和CD40L蛋白的核酸分子；

在IL-15序列和/或CD40L序列末端连接连接物；

将连接后的核酸分子构建入表达载体中；

编码IL-15、连接物、跨膜蛋白核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示,编码CD40L蛋白的核酸分子的序列如SEQ ID NO：3所示。