CN112458054A

CN112458054A - 一种快速扩增体外nk细胞的方法

Info

Publication number: CN112458054A
Application number: CN202011563172.1A
Authority: CN
Inventors: 崔大祥; 梁辉; 倪健; 田静; 李雪玲; 沈琦; 高昂
Original assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112458054B

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种NK细胞快速扩增的方法。所述的方法包括：分离纯化NK细胞；制备IL‑15和4‑1BBL蛋白分子；构建含有I53‑50A和I53‑50B蛋白的纳米颗粒；将IL‑15、4‑1BBL蛋白分子和含有I53‑50A和I53‑50B蛋白的纳米颗粒加入NK细胞的培养基质。本发明制备出可以高效刺激NK细胞扩增的纳米级别的细胞因子颗粒，可以在较短的时间内完成NK细胞的快速高效的扩增，操作简单、成本低廉、无污染，所获得的NK细胞分离提纯时也快速简便。

Description

一种快速扩增体外NK细胞的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种NK细胞快速扩增的方法。

背景技术

NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，也会参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。一般认为，NK细胞直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。小鼠和人的体外实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC 5-0%，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。

由于NK细胞具有部分T细胞分化抗原，如80%NK细胞表达CD2+，20%NK细胞C表达D3+(表达CD3ζ链)，30%NK细胞表达CD8+(α/α)和75%NK细胞表达CD38+，而且NK细胞具有IL-2中亲和性受体，在IL-2刺激下可发生增殖反应，活化NK细胞可产生IFN-γ，因此一般认为NK细胞与T细胞在发育上关系更为密切。

目前NK细胞的抗肿瘤效果在多种血液病恶性肿瘤的临床治疗中已获得了良好的治疗效果。如何有效的获得NK细胞并且快速扩增是利用NK细胞进行细胞治疗的关键。

目前用于细胞治疗的临床级NK细胞主要来源于自体分离的NK细胞，在体外通过细胞因子（IL-15，4-1BBL）和饲养层细胞促使NK细胞在2周左右快速扩增，获得纯度较高的NK细胞。当前的做法大部分是采用细胞因子铺板或者是磁珠的方法刺激NK细胞的扩增，但是这些方法的弊端是扩增效率不高，或者是磁珠分离后总会有残留，影响后续的产品的纯度。

前期研究表明，I53-50a和I53-50B分子是天然存在的一对蛋白，可以自组装成20-40nm的纳米颗粒（Science，22 Jul 2016:Vol. 353, Issue 629）。

发明内容

本发明目的是提供一种体外快速而特异的扩增NK细胞的方法。

本发明再一目的在于：提供一种构建扩增NK细胞所用的纳米颗粒。

本发明的又一目的在于：提供一种构建扩增NK细胞所用的试剂。

本发明通过调整I53-50a和I53-50B以及细胞因子的种类和数量，优化自组装蛋白的纳米颗粒结构，可实现多种细胞因子组装形成三维立体的纳米颗粒结构，从而建立一套NK细胞的分离和扩增的方法，包括从PBMC（或以磁珠分离的NK细胞）为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异扩增的方法，获得NK细胞，并且建立基于细胞因子的NK细胞的快速扩增技术。

本发明提供了一种NK细胞快速扩增的方法，制备了一对自组装肽的结构，实现了多种细胞因子组装成了三维的纳米颗粒结构，营造了体内细胞扩增的三维环境，有利于NK细胞的快速扩增。

一方面，本发明提供了一种扩增NK细胞的方法，所述的方法包括：

分离纯化ＮＫ细胞；

制备IL-15和4-1BBL蛋白分子；

构建含有I53-50A和I53-50B蛋白的纳米颗粒；和

将IL-15、4-1BBL蛋白分子和含有I53-50A和I53-50B蛋白的纳米颗粒加入NK细胞的培养基质。

所述的NK细胞分离自外周血，为CD16+、CD56+、CD3-细胞。

所述的纳米颗粒含有IL-15或者4-1BBL。

较好的，构建含有I53-50A和I53-50B蛋白的纳米颗粒包括如下步骤：

S1，获得I53-50A、I53-50B、IL-15和/或4-1BBL的基因表达产物；

S2，将I53-50A与IL-15和/或4-1BBL连接，I53-50B与IL-15和/或4-1BBL连接，使IL-15与I53-50A、I53-50B中任意一个连接，4-1BBL与I53-50A、I53-50B中的另一个连接，连接使用连接物；

S3，将与IL-15和/或4-1BBL连接的I53-50A、I53-50B混合，待其自组装形成纳米颗粒。

较好的，加入NK细胞的培养基质的纳米颗粒和单独的IL-15、4-1BBL蛋白分子的比例为1：2-2：1，摩尔比。

另一方面，本发明提供了一种纳米颗粒，所述的纳米颗粒含有I53-50A、I53-50B基因表达产物和/或IL-15蛋白、4-1BBL蛋白；

纳米颗粒由I53-50A和I53-50B蛋白自组装获得。

较好的，所述的纳米颗粒中含有NK细胞。

较好的，所述的纳米颗粒中还含有细胞因子，用于促进NK细胞生长；或者含有磁珠，有助于NK细胞或者相应物质的分离。

另一方面，本发明提供了一种扩增NK细胞的试剂，所述的试剂中含有：

I53-50A、I53-50B、IL-15、4-1BBL蛋白；或者

I53-50A、I53-50B、IL-15、4-1BBL蛋白的核酸编码序列。

再一方面，本发明还提供了上述试剂的用途，即用于体外扩增NK细胞；包括以下步骤：

（1）获得IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白，IL-15-I53-50A、I53-50B-4-1BBL蛋白，或者I53-50A-4-1BBL、IL-15-I53-50B蛋白；

（2）将步骤（1）获得的蛋白混合后，充分混匀或者搅拌，使含有I53-50A和I53-50B蛋白的物质自组装形成纳米颗粒;

（3）通过分子筛、过滤去除未偶联的蛋白；

（4）将纳米颗粒和/或单独的IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白加入NK细胞的培养基质；单独的IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白浓度一致，纳米颗粒与单独的IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白的浓度比为1：2-2：1，摩尔比；NK细胞的接种密度为104-5*106 个/ml；

（5） NK细胞培养时间为3-14天。

其中，步骤（1）的IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白，IL-15-I53-50A、I53-50B-4-1BBL蛋白，或者I53-50A-4-1BBL、IL-15-I53-50B蛋白可以通过生物工程方法获得，包括基因表达；

所述的生物工程的方法包括：

制备IL-15，4-1BBL，I53-50A和I53-50B的核酸分子；

分别在获得的IL-15序列和4-1BBL序列末端连接连接物(linker)，并连接I53-50A或者I53-50B的核酸分子；

将连接后的核酸分子构建入表达载体中，将转染阳性的菌种扩大培养，抽提阳性表达质粒；

将上述表达质粒转入细胞，表达获得IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白；

分离纯化所获得IL-15、4-1BBL、I53-50A、I53-50B的蛋白。

免疫细胞在体外扩增难度较大，尤其是NK细胞的体外培养和扩增是目前的一个技术难点，纠其原因是因为免疫细胞扩增过程中需要的信号分子必须是多重的，并且需要一定的三维构象结构才能发挥细胞因子的活性和高效的传递信号功能。本发明将4-1BBL和IL-15的末端融合天然可以自装的蛋白分子，获得重组蛋白分子后，等比例组合后就可以根据所需的浓度组装成具有三维结构的纳米颗粒，应用于NK细胞的体外扩增。本发明制备出可以在高效刺激NK细胞的纳米细胞因子颗粒，用于NK细胞的高效扩增。本发明可以在较短的时间内获得大量性质均一的NK细胞，操作简单、成本低廉、无污染，所获得NK细胞分离提纯也快速简便。本发明对NK细胞的扩增效率在7天内可以达到10⁹，扩增效率可以达到10000倍。

附图说明

图1是细胞因子的纳米粒子模式图；

图2是NK细胞采用不同的材料刺激的扩增效率比较。

具体实施方式

实施例1

基因的合成和构建

从NCBI的数据库中获取IL-15，4-1BBL，I53-50a和I53-50B的核酸和氨基酸序列，采用全基因合成的方法分别合成IL-15和4-1BBL分子，然后将获得的IL-15序列和4-1BBL序列分别在末端通过linker连接I53-50a和I53-50B序列，采用双酶切的方法构建入PCDNA3.1分子中，将转染阳性的菌种扩大培养，采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取PCDNA3.1-IL-15-I53-50a和PCDNA3.1- I53-50b-4-1BBL的质粒。

核酸序列:(IL-15+linker+ I53-50a)

信号肽：

gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTGAA（SEQ ID NO 1）

IL-15+linker

GAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAAGATCTTATTCAATCTATGCATATTGATGCTACTTTATATACGGAAAGTGATGTTCACCCCAGTTGCAAAGTAACAGCAATGAAGTGCTTTCTCTTGGAGTTACAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAGATGCAAGTATTCATGATACAGTAGAAAATCTGATCATCCTAGCAAACAACAGTTTGTCTTCTAATGGGAATGTAACAGAATCTGGATGCAAAGAATGTGAGGAACTGGAGGAAAAAAATATTAAAGAATTTTTGCAGAGTTTTGTACATATTGTCCAAATGTTCATCAACACTTCTT（SEQ ID NO 2 ）

I53-50a

AAGGCCGCCAAGGCCGAGGAGGCCGCCCGCAAGATGGAGGAGCTGTTCAAGAAGCACAAGATCGTGGCCGTGCTGCGCGCCAACTCCGTGGAGGAGGCCATCGAGAAGGCCGTGGCCGTGTTCGCCGGCGGCGTGCACCTGATCGAGATCACCTTCACCGTGCCCGACGCCGACACCGTGATCAAGGCCCTGTCCGTGCTGAAGGAGAAGGGCGCCATCATCGGCGCCGGCACCGTGACCTCCGTGGAGCAGGCCCGCAAGGCCGTGGAGTCCGGCGCCGAGTTCATCGTGTCCCCCCACCTGGACGAGGAGATCTCCCAGTTCGCCAAGGAGAAGGGCGTGTTCTACATGCCCGGCGTGATGACCCCCACCGAGCTGGTGAAGGCCATGAAGCTGGGCCACACCATCCTGAAGCTGTTCCCCGGCGAGGTGGTGGGCCCCCAGTTCGTGAAGGCCATGAAGGGCCCCTTCCCCAACGTGAAGTTCGTGCCCACCGGCGGCGTGAACCTGGACAACGTGGCCGAGTGGTTCAAGGCCGGCGTGCTGGCCGTGGGCGTGGGCTCCGCCCTGGTGAAGGGCACCCCCGACGAGGTGCGCGAGAAGGCCAAGGCCTTCGTGGAGAAGATCCGCGGCGCCACCGAGGGCGGCTCCCACCACCACCACCACCACCACCACTGAgc ggccgc（SEQ ID NO 3）

氨基酸序列

IL-15+linker+ I53-50a

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSSSSSGSSSSKAAKAEEAARKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAIEKAVAVFAGGVHLIEITFTVPDADTVIKALSVLKEKGAIIGAGTVTSVEQARKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFAKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVAEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPDEVREKAKAFVEKIRGATEGGSHHHHHHHH（SEQ ID NO 4）

(I53-50B+Linker+4-1BBL)序列如下：

核酸序列

信号肽分子

gaattcgccgccaccATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTGAA（SEQ ID NO 5）

I53-50B+Linker：

ATGAACCAGCACTCCCACAAGGACCACGAGACCGTGCGCATCGCCGTGGTGCGCGCCCGCTGGCACGCCGAGATCGTGGACGCCTGCGTGTCCGCCTTCGAGGCCGCCATGCGCGACATCGGCGGCGACCGCTTCGCCGTGGACGTGTTCGACGTGCCCGGCGCCTACGAGATCCCCCTGCACGCCCGCACCCTGGCCGAGACCGGCCGCTACGGCGCCGTGCTGGGCACCGCCTTCGTGGTGAACGGCGGCATCTACCGCCACGAGTTCGTGGCCTCCGCCGTGATCAACGGCATGATGAACGTGCAGCTGAACACCGGCGTGCCCGTGCTGTCCGCCGTGCTGACCCCCCACAACTACGACAAGTCCAAGGCCCACACCCTGCTGTTCCTGGCCCTGTTCGCCGTGAAGGGCATGGAGGCCGCCCGCGCCTGCGTGGAGATCCTGGCCGCCCGCGGCTCCGGCTCCGGCGGCTCCGGCGGCTCCGGCTCC（SEQ ID NO 6）

4-1BBL：

TACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAATAAgcggccgc（SEQ ID NO 7）

对应的氨基酸序列

I53-50B+ Linker+4-1BBL

MNQHSHKDHETVRIAVVRARWHAEIVDACVSAFEAAMRDIGGDRFAVDVFDVPGAYEIPLHARTLAETGRYGAVLGTAFVVNGGIYRHEFVASAVINGMMNVQLNTGVPVLSAVLTPHNYDKSKAHTLLFLALFAVKGMEAARACVEILAAR （SEQ ID NO 8）

GSGSGGSGGSGSEKIAAMEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE（SEQ ID NO 9）

实施例2

PCDNA3.1-IL-15-I53-50a和PCDNA3.1- I53-50b-4-1BBL的质粒的瞬时转染蛋白的纯化：

293细胞的复苏和培养：

复苏293细胞，用50ml培养瓶培养，在细胞汇合度70%～80%时进行传代培养。

质粒的电转染：

待细胞汇合度70%～80%时，使用BIO-RAD的电转仪对PCDNA3.1-IL-15-I53-50a和PCDNA3.1- I53-50b-4-1BBL的质粒电转，步骤如下：

0.2 cm电转杯，细胞密度为10x10^6 cells/ml，DNA用量为2μg，电转液体积为100μl，电压为130V，电容为950μF。电转后迅速加入1640培养基，将细胞转入培养瓶中恢复培养。培养3天后收取细胞上清，使用亲和层析的方法对IL-15-I53-50a和I53-50b-4-1BBL进行纯化。获得高纯度的蛋白。

实施例3

细胞因子纳米颗粒的制备：

将等摩尔浓度的IL-15-I53-50a和I53-50b-4-1BBL分子混合后，采用磁力搅拌的方式4摄氏度搅拌4小时，IL-15-I53-50a和I53-50b-4-1BBL通过自组装即获得。通过分子筛的方法去除未偶联的蛋白。

实施例4

IL-15-I53-50a和I53-50b-4-1BBL纳米颗粒用于NK细胞的扩增

首先采用梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），NK细胞为CD16+、CD56+、CD3-细胞。采用流式分选的方法从PBMC中分选NK细胞，分把采用等摩尔浓度的纳米颗粒和单独的IL-15和4-1BBL蛋白分子，磁珠包被的IL-15和4-1BB加入到10⁵/ml的NK细胞中，在T25培养瓶中培养，培养7天后，对NK细胞计数，计算扩增效率。

试验结果显示包含IL-15-I53-50a和I53-50b-4-1BBL纳米颗粒和磁珠包被的细胞因子组扩增效率在7天内可以达到10⁹，扩增效率可以达到10000倍。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 一种快速扩增体外NK细胞的方法

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60

ggtgtgcagt gtgaa 75

<210> 2

<211> 540

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

gagttcggac tcagttggct gttcctggtg gccatcctga agggtgtgca gtgatgagaa 60

tttcgaaacc acatttgaga agtatttcca tccagtgcta cttgtgttta cttctaaaca 120

gtcattttct aactgaagct ggcattcatg tcttcatttt gggctgtttc agtgcagggc 180

ttcctaaaac agaagccaac tgggtgaatg taataagtga tttgaaaaaa attgaagatc 240

ttattcaatc tatgcatatt gatgctactt tatatacgga aagtgatgtt caccccagtt 300

gcaaagtaac agcaatgaag tgctttctct tggagttaca agttatttca cttgagtccg 360

gagatgcaag tattcatgat acagtagaaa atctgatcat cctagcaaac aacagtttgt 420

cttctaatgg gaatgtaaca gaatctggat gcaaagaatg tgaggaactg gaggaaaaaa 480

atattaaaga atttttgcag agttttgtac atattgtcca aatgttcatc aacacttctt 540

<210> 3

<211> 686

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

aaggccgcca aggccgagga ggccgcccgc aagatggagg agctgttcaa gaagcacaag 60

atcgtggccg tgctgcgcgc caactccgtg gaggaggcca tcgagaaggc cgtggccgtg 120

ttcgccggcg gcgtgcacct gatcgagatc accttcaccg tgcccgacgc cgacaccgtg 180

atcaaggccc tgtccgtgct gaaggagaag ggcgccatca tcggcgccgg caccgtgacc 240

tccgtggagc aggcccgcaa ggccgtggag tccggcgccg agttcatcgt gtccccccac 300

ctggacgagg agatctccca gttcgccaag gagaagggcg tgttctacat gcccggcgtg 360

atgaccccca ccgagctggt gaaggccatg aagctgggcc acaccatcct gaagctgttc 420

cccggcgagg tggtgggccc ccagttcgtg aaggccatga agggcccctt ccccaacgtg 480

aagttcgtgc ccaccggcgg cgtgaacctg gacaacgtgg ccgagtggtt caaggccggc 540

gtgctggccg tgggcgtggg ctccgccctg gtgaagggca cccccgacga ggtgcgcgag 600

aaggccaagg ccttcgtgga gaagatccgc ggcgccaccg agggcggctc ccaccaccac 660

caccaccacc accactgagc ggccgc 686

<210> 4

<211> 398

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Lys Ala Ala

165 170 175

Lys Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His

180 185 190

Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu

195 200 205

Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr

210 215 220

Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu

225 230 235 240

Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu

245 250 255

Gln Ala Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro

260 265 270

His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe

275 280 285

Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys

290 295 300

Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro

305 310 315 320

Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val

325 330 335

Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Ala Glu Trp Phe Lys Ala

340 345 350

Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro

355 360 365

Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly

370 375 380

Ala Thr Glu Gly Gly Ser His His His His His His His His

385 390 395

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60

ggtgtgcagt gtgaa 75

<210> 6

<211> 492

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

atgaaccagc actcccacaa ggaccacgag accgtgcgca tcgccgtggt gcgcgcccgc 60

tggcacgccg agatcgtgga cgcctgcgtg tccgccttcg aggccgccat gcgcgacatc 120

ggcggcgacc gcttcgccgt ggacgtgttc gacgtgcccg gcgcctacga gatccccctg 180

cacgcccgca ccctggccga gaccggccgc tacggcgccg tgctgggcac cgccttcgtg 240

gtgaacggcg gcatctaccg ccacgagttc gtggcctccg ccgtgatcaa cggcatgatg 300

aacgtgcagc tgaacaccgg cgtgcccgtg ctgtccgccg tgctgacccc ccacaactac 360

gacaagtcca aggcccacac cctgctgttc ctggccctgt tcgccgtgaa gggcatggag 420

gccgcccgcg cctgcgtgga gatcctggcc gcccgcggct ccggctccgg cggctccggc 480

ggctccggct cc 492

<210> 7

<211> 767

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

tacgcctctg acgcttcact ggaccccgaa gccccgtggc ctcccgcgcc ccgcgctcgc 60

gcctgccgcg tactgccttg ggccctggtc gcggggctgc tgctgctgct gctgctcgct 120

gccgcctgcg ccgtcttcct cgcctgcccc tgggccgtgt ccggggctcg cgcctcgccc 180

ggctccgcgg ccagcccgag actccgcgag ggtcccgagc tttcgcccga cgatcccgcc 240

ggcctcttgg acctgcggca gggcatgttt gcgcagctgg tggcccaaaa tgttctgctg 300

atcgatgggc ccctgagctg gtacagtgac ccaggcctgg caggcgtgtc cctgacgggg 360

ggcctgagct acaaagagga cacgaaggag ctggtggtgg ccaaggctgg agtctactat 420

gtcttctttc aactagagct gcggcgcgtg gtggccggcg agggctcagg ctccgtttca 480

cttgcgctgc acctgcagcc actgcgctct gctgctgggg ccgccgccct ggctttgacc 540

gtggacctgc cacccgcctc ctccgaggct cggaactcgg ccttcggttt ccagggccgc 600

ttgctgcacc tgagtgccgg ccagcgcctg ggcgtccatc ttcacactga ggccagggca 660

cgccatgcct ggcagcttac ccagggcgcc acagtcttgg gactcttccg ggtgaccccc 720

gaaatcccag ccggactccc ttcaccgagg tcggaataag cggccgc 767

<210> 8

<211> 152

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg

145 150

<210> 9

<211> 271

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Lys Ile Ala

1 5 10 15

Ala Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp

20 25 30

Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu

35 40 45

Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val

50 55 60

Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly

65 70 75 80

Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp

85 90 95

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

100 105 110

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

115 120 125

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

130 135 140

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

145 150 155 160

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

165 170 175

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

180 185 190

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

195 200 205

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

210 215 220

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

225 230 235 240

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

245 250 255

Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

260 265 270

Claims

1.一种扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括：

分离纯化NK细胞；

制备IL-15和4-1BBL蛋白分子；

构建含有I53-50a和I53-50B蛋白的纳米颗粒；和

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NK细胞分离自外周血，为CD16+、CD56+、CD3-细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纳米颗粒含有IL-15或者4-1BBL蛋白分子。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加入NK细胞的培养基质的纳米颗粒和单独的IL-15、4-1BBL蛋白分子的比例为1：2-2：1，摩尔比。

5.一种构建如权利要求1或3或4所述纳米颗粒的方法，其特征在于，构建含有IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B蛋白的纳米颗粒包括如下步骤：

S1，获得I53-50a、I53-50B、IL-15和/或4-1BBL的基因表达产物；

S2，将I53-50a与IL-15和/或4-1BBL连接，I53-50B与4-1BBL和/或IL-15连接，使IL-15与I53-50a、I53-50B中任意一个连接，4-1BBL与I53-50a、I53-50B中的另一个连接，连接使用连接物；

6.一种纳米颗粒，根据权利要求5所述构建方法得到，所述的纳米颗粒含有I53-50a、I53-50B基因表达产物和/或IL-15蛋白、4-1BBL蛋白；

纳米颗粒由I53-50a和I53-50B蛋白自组装获得。

7.如权利要求6所述的纳米颗粒，其特征在于，所述的纳米颗粒中含有扩增NK细胞。

8.一种扩增NK细胞的试剂，其特征在于，所述的试剂中含有：

I53-50a、I53-50B、IL-15、4-1BBL蛋白；或者

I53-50a、I53-50B、IL-15、4-1BBL蛋白的核酸编码序列。

9.权利要求8所述的试剂的应用，其特征在于，所述的试剂用于NK细胞的体外扩增，包括以下步骤：

（1）获得下列组合中的任意一种：

IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白，

IL-15-I53-50A、I53-50B-4-1BBL蛋白，

I53-50A-4-1BBL、IL-15-I53-50B蛋白；

（2）将步骤（1）获得的蛋白组合混合后，充分混匀或者搅拌，使含有I53-50A和I53-50B蛋白的物质自组装形成纳米颗粒;

（3）去除未偶联的蛋白；

（4）将纳米颗粒和/或单独的IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白加入NK细胞的培养基质；单独的IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白摩尔浓度一致，纳米颗粒与单独的IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白的摩尔浓度比为1：2-2：1，；NK细胞的接种密度为10⁴-5*10⁶ 个/ml；

（5）NK细胞的培养时间为3-14天。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤（1）的IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白，IL-15-I53-50A、I53-50B-4-1BBL蛋白，或者I53-50A-4-1BBL、IL-15-I53-50B蛋白通过基因表达获得；

所述的基因表达的方法包括：

制备IL-15，4-1BBL，I53-50a和I53-50B的核酸分子；

分别在获得的IL-15序列和4-1BBL序列末端连接连接物，并连接I53-50a或者I53-50B的核酸分子；

将上述表达质粒转入CHO细胞，表达获得IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白；

分离纯化所获得IL-15、4-1BBL、I53-50a、I53-50B的蛋白。