CN101133163A

CN101133163A - 修饰的2，4-二氧四氢蝶啶合酶的分离的嵌合蛋白

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Publication number: CN101133163A
Application number: CNA200580026046XA
Authority: CN
Inventors: F·A·戈德鲍姆
Original assignee: Goldgene LLC
Current assignee: Goldgene LLC
Priority date: 2004-06-03
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2008-02-27
Anticipated expiration: 2025-06-03
Also published as: CN101133163B; EP1776456A2; BRPI0511793B8; US20090087435A1; ES2413159T3; US8685670B2; WO2005121330A2; EP1776456A4; EP1776456B1; WO2005121330A3; CA2569401A1; CA2569401C; BRPI0511793B1; AR044603A1; MXPA06013984A; BRPI0511793A; DK1776456T3

Abstract

包括插入布鲁氏菌属的2，4－二氧四氢蝶啶合酶氨基末端的达到十个拷贝的肽、多肽或蛋白结构域的分离的嵌合蛋白。编码该嵌合蛋白的分离的核苷酸序列。用于表达该蛋白的载体、质粒和转化细胞。由该嵌合蛋白诱导的单克隆和多克隆抗体。产生该单克隆抗体的杂交瘤。包括该嵌合蛋白、核苷酸序列和抗体的疫苗和药物化合物。一种在高等生物中诱导免疫反应的方法，包括给予有效量的疫苗和药物化合物。包括该嵌合蛋白的生物传感器。由该嵌合蛋白和配体通过共价和非共价键结合形成的蛋白缀合物。该嵌合蛋白、核苷酸序列、载体、质粒、转化细胞、抗体、杂交瘤、缀合物、生物传感器、疫苗和药物化合物的用途。该嵌合蛋白的四级结构。

Description

修饰的2，4-二氧四氢蝶啶合酶的分离的嵌合蛋白

发明技术说明

包括插入布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶氨基末端的达到十个拷贝的肽、多肽或蛋白结构域的分离的嵌合蛋白。编码该嵌合蛋白的分离的核苷酸序列。用于表达该蛋白的载体、质粒和转化细胞。由该嵌合蛋白产生的单克隆和多克隆抗体。产生单克隆抗体的杂交瘤。包含嵌合蛋白、核苷酸序列和抗体的疫苗和药物化合物。一种在高等生物中诱导免疫反应的方法，包括给予有效量的疫苗和药物化合物。包括该嵌合蛋白的生物传感器。由该嵌合蛋白和配体通过共价和非共价键结合形成的蛋白缀合物。该嵌合蛋白、核苷酸序列、载体、质粒、转化细胞、抗体、杂交瘤、缀合物、生物传感器、疫苗和药物化合物的用途。该嵌合蛋白的四级结构。

技术领域

本发明涉及由布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶与肽、多肽或蛋白结构域连接得到的经修饰蛋白形成的嵌合蛋白。嵌合蛋白具有在高等动物中诱导免疫反应和用于其他目的的用途。本发明还涉及包含与该经修饰蛋白结合的抗原或抗体、或抗原或抗体的片段的药物化合物。

背景技术

活减毒疫苗的大规模应用带来了若干经济和健康不便。例如，当活疫苗被减毒后，它们的免疫原性能力常常降低。参见Leclerc，etal.，Immunol.Today，19(7)：300-302，(1998)；Nieba，et al.，Mod.Asp.Immunobiol.，1(2)：36-39(2000)。另一个不便是减毒作用被逆转和微生物恢复其疾病诱导性能的可能性。参见Redfield，N.，N.Eng.J Med.，316：673-678(1998)。因此，在过去的几年里，趋势一直是基于从细菌或病毒分离的单独化合物配制非细胞疫苗。通常，这些单独的化合物，象微生物所特有的蛋白，具有低免疫原性。使用佐剂已经克服了这个限制。然而，有的蛋白甚至在佐剂存在下仍显示低免疫原性。已提出了几个蛋白质工程策略来克服这些困难。参见Leclerc，et al.，Immunol.Today，19(7)：300-302(1998)。

病毒壳体蛋白能够形成三维有序颗粒，称为“病毒样颗粒”。这些颗粒具有与完整病毒相同的大小和形状。然而，它们内部是空的并且没有遗传物质，致使它们没有产生感染的能力。它们的大尺寸和顺序为它们提供了显著的免疫原性。参见Bachmann，et al.，Science，262：1448-1451(1993)。市场上普遍合格的抗乙型肝炎的重组疫苗是基于这个概念。为了生产抗某些致病微生物的疫苗， “病毒样颗粒”已经用作插入这类病原体特征性的肽的载体。参见WO0032227(Renner，et al.)；WO 0185208(Bachmann，et al.)。为了给肽提供载体的辅佐性能，在免疫原性十足的载体中插入多拷贝的肽是有利策略。然而，这个方法遇到了许多困难：由于这些颗粒的尺寸巨大，在它的复合蛋白中肽的任何插入都妨碍它的正确折叠和，在很多情况下，降低它的稳定性。此外，只有少数蛋白位点能够接受肽插入，而不改变它们的一般结构。参见Nieba，et al.Mod.Asp.Immunobiol.，1(2)：36-39(2000)。

一些细菌蛋白已被假定作为开发嵌合疫苗的载体。参见Leclerc，et al.，Immunol.Today，19(7)：300-302(1998)。霍乱毒素的B亚单位是稳定的五聚蛋白，已用来从粘膜获得抗插入肽的免疫反应。由于这种毒素穿透胃粘膜的能力，这个策略已经成功。参见Arakawa，et al.Nature Biotech.，16：934-938(1998)。嗜热脂肪芽孢杆菌的二氢硫辛酸脱氢酶也已被假定作为蛋白载体，因为它形成复合物和非常稳定的聚合结构。参见Domingo，et al.，J Mol.Biol.，305：259-267(2001)；WO 0142439(Domingo，et al.)。

2，4-二氧四氢蝶啶合酶催化核黄素生物合成途径中的倒数第二步。参见Goldbaum，et al.，J Med Microbiol.，48：833-839(1999)。它的活性位点位于单体当中的中间相，使得这种蛋白具有很稳定的聚合次序。参见Ritsert，et al.J Mol.Biol.，253：151-167(1995)。这些次序在形成五聚和二十面体颗粒的蛋白之间有变化。参见Braden，et al.，J Mol.Biol.，297：1031-1036(2000)。枯草芽孢杆菌2，4-二氧四氢蝶啶合酶的二十面体结构已被假定作为插入肽和开发疫苗的载体。参见WO 0053229(Bacher，et al.).

布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶是一种非常稳定的蛋白。已经证明这种18-kDa蛋白是用于人和动物布鲁氏菌病的血清学诊断的有用标记。参见Goldbaum，et al.，J.Clin.Microbiol.，30：604-607(1992)；Goldbaum，et al.，JClin.Microbiol.，31：2141-2145(1993)；Baldi，et al.，Clin.Diag.Lab.Immunol.，3(4)：472-476(1996)。根据X-射线晶体衍射法分析的免疫化学、酶作用和三维结构，原始未经修饰蛋白当重组表达时，显示出与天然蛋白相同的折叠。参见Braden，et al.J Mol.Biol.，297：1031-1036(2000)；Goldbaum，et al.，J Med.Microbiol.，48：833-839(1999)；Goldbaum，et al.，J.Struct.Biol.，123：175-178(1998)。结构表明这种18-kDa蛋白在溶液中表现为180-kDa十聚体，变成2，4-二氧四氢蝶啶合酶的新型四元排列。参见Zylberman，et al.，J Biol.Chem.，279(9)：8093-8101(2004)。

已假定布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶的免疫原性主要源自于它的聚合特性。参见Baldi，etal.，Braz.J Med.Biol.R0es.，33：741-747(2000)。该结构也表明10个氨基酸的氨基末端既不参与一般折叠也不参与单体当中的联系。参见Braden，et al.J Mol.Biol.，297：1031-1036(2000)。布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶是一种能够在鼠模型中产生高体液和细胞免疫反应的强大免疫原。当用重组未经修饰蛋白和用编码该蛋白的质粒诱导免疫(基因治疗、DNA疫苗接种)时，已经证实了这个能力。参见Velikovsky，et al.，J.Immunol.Meth.，244(1-2)：1-7(2000)。通过改变免疫途径和使用的佐剂有可能调节该反应。参见Velikovsky，et al.，Infec.Immun.，70(5)：2507-11(2002)。尤其是，有可能建立强烈的T_H1型反应，其将是布鲁氏菌病中具有最高保护能力的反应。参见Velikovsky，et al.Infec.Immun.，70(5)：2507-11(2002)。

然而，本领域仍然需要通常可用于展示肽、多肽和蛋白，和特别是展示抗原或免疫反应诱导物的具有较小稳定结构的新载体。本领域尚未描述过2，4-二氧四氢蝶啶合酶十聚体结构作为这种类型载体的开发和应用。

微生物的保藏

pBLS-OMP 31质粒于2004年4月1日保藏在德国D-38124Braunschweig，Mascheroder Weg 1B的德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，保藏号为DSM 15546。

附图说明

图1显示了表达载体pET11a(Nova gen，USA)中的克隆BLS基因5′末端的核苷酸和氨基酸序列和所产生的盒。粗体部分显示了编码区。红色部分显示了盒中的突变碱基。用黄色突出显示的部分显示了新的限制性酶切位点。

图2显示了用于产生BLS-OMP 31嵌合体的寡核苷酸。它们的退火引起对应于Nsil(5′末端)和Af1II(3′末端)限制性内切酶的粘性位点的出现，嵌合体中插入的27个氨基酸的序列(在下面，以粗体显示)位于它们当中。也显示了产生的蛋白单体的理论分子量(19，977.5道尔顿)和所插入肽的理论等电点(pI＝6.00)。

图3显示：a)pET11a质粒方案，包含BLS-OMP 31嵌合体序列，显示了克隆时使用的限制性酶切位点，b)包括BLS-OMP 31嵌合体的pET11a质粒的完整核苷酸序列和c)BLS-OMP31嵌合体的开放读框。

图4描述了在17％丙烯酰胺中通过SDS-PAGE分析的BLS-OMP 31的表达。MW：以千道尔顿表示的分子量标记，1：纯化的BLS，2和3：两个BLS-OMP 31克隆的等份表达培养物。蛋白迁移如同20-KDa单体，因为凝胶是变性的。

图5描述了在17％丙烯酰胺中通过SDS-PAGE分析的BLS-OMP 31的表达。1：没有诱导的培养物，2：用1mM I PTG诱导的培养物，3：胞质部分，4：重悬于8M尿素中的包含体部分箭头显示相当于BLS-OMP 31的条带。(LMWM＝低分子量标记，以千道尔顿表示的重量)。

图6显示了相当于BLS-OMP 31在Superdex 200(Pharmacia，USA)柱中洗脱的色谱图。然后用凝胶分析峰并计数。参见图7。

图7显示了在17％丙烯酰胺中通过SDS-PAGE分析的BLS-OMP 31的纯化数据。1和2：以BLS-OPM31洗脱梯度通过Sepharose(Pharmacia，USA)柱获得的峰，4和5：与图6中的峰相关的峰数目。(LMWM＝低分子量标记，以千道尔顿表示的重量)。

图8显示了BLS和BLS-OMP 31嵌合体的圆二色性谱。用分光偏振计(Jasco，UK)监测190和260nm之间的1.0μM蛋白溶液的摩尔椭圆性(elipticity)。

图9描述了BLS-OMP31嵌合体相对于天然蛋白的稳定性的比较分析。该曲线显示了在浓度不断增加的变性盐酸胍化学试剂存在下对解叠的敏感性，用分光偏振计在222nm下的由蛋白产生的椭圆性来评价。

图10显示了ELISA测定的BLS-OMP 32的抗原性。1μg、0.25μg、0.1μg和20ng BLS-OMP 31和BLS用作抗原。抗BLS Mab(1/1000)和抗OMP 31Mab(1/1000)用作抗体。

图11显示了用ELISA分析的BLS-OMP 31的免疫原性。显示了来自用含有佐剂(“AF”)或无佐剂(“PBS”)的BLS-OMP 31免疫的小鼠的血清的1/100稀释物抗OMP 31的反应性。根据渐减的反应性，对每组的血清进行排序。免疫前血清(阴性对照)的反应性以点线图解。来自AF组的一只小鼠在选取之前死亡。

图12显示了来自抗BLS-OMP 31兔的血清的ELISA试验的滴定结果。测定了三个血清抗OMP 31的反应性。兔抗天然BLS血清的1/100稀释物用作阴性血清。这种血清的反应性以点线图解。

图13描述了抗BLS-OMP 31兔血清(4°剂量)抗平滑或粗糙的马耳他布鲁氏菌全菌的反应性。从所示的值减去相当于同时滴定的抗这两种抗原的兔抗天然BLS血清的反应性。误差相当于平均标准误差的总和。

图14显示了用100μg pCI-BLS-OMP 31通过肌内和真皮内途径在4个时机免疫的小鼠批组BALB/c(8只/组)中总抗OMP31 IgG抗体的动力学。每15天用ELISA分析抗体水平。该值表示8只动物的平均值±S.D.。箭头显示了免疫的时间。pCI小鼠(对照)的血清显示与“截止”标准相似或低于其的n个DO值。

图15描述了：a)用于获得BLS-KETc1嵌合体的寡核苷酸序列，b)包括BLS-KETc1嵌合体的pET11a质粒的全部核苷酸序列和c)BLS-KETc1嵌合体的开放读框及其氨基酸序列。

图16显示了产生混合嵌合体的一般战略性方案。

图17显示了在BLS-OMP31和BLS-KETc1嵌合体之间建立的混合嵌合体的纯化结果和分析。A：BLS-OMP31(峰3)和BLS-KETc1(峰1)再折叠嵌合体和二者的化学计量混合物(峰2)的MonoQ柱的阴离子交换色谱法分析，B1：通过阴离子交换色谱法中获得的峰1、2和3的SDS-PAGE的分析，B2：通过纯BLS-OMP31和BLS-KETc1嵌合体和相当于混合嵌合体的峰2的天然PAGE的分析。

图18显示了用ELISA分析的BLS-OMP31-KETc1混合嵌合体的免疫原性。来自用BLS-OMP31-KETc1(空棒)免疫的小鼠的血清的1/100稀释物抗BLS和抗OMP31和KETc1合成肽的反应性。抗相同抗原的免疫前血清(阴性对照)的反应性以灰色棒表示。

图19显示了通过用BLS-KETc1免疫诱导的脾细胞的体外增殖。它表明了体外刺激用乳化于皂苷中的KETc1肽或BLS-KETc1预先免疫的小鼠脾细胞后，滴定的(cpm计)胸苷掺入的平均值加1个标准偏差。*就用培养基孵育的脾细胞来说cpm计显著增加(P＜0.05)。

图20描述了BLS-RBD3嵌合体的核苷酸和氨基酸序列。以红色显示了鼠蛋白Staufen-1的结构域RBD3的编码序列。以黑色显示了其氨基末端的前8个残基的截短BLS的编码序列。

图21显示了BLS-RBD3嵌合体的结构(图A：侧视图，图B：俯视图)。用MacroModel程序设计结构，将鼠蛋白Staufen-1的结构域RBD3的理论结构(以蓝色显示)的C-末端与BLS晶体结构(蛋白数据库文件pdb：1DIO)N-末端(以红色显示)合并。鼠蛋白Staufen-1的结构域RBD3的理论结构是通过用Drosophila melaganoster的蛋白Staufen结构域RBD3结构(pdb：1EKZ)的同源建模的方式构建的。该图是用CHIMERA程序建立的。

图22显示：A：通过在15％聚丙烯酰胺凝胶(^P/v)中的SDS-PAGE分离BLS-RBD3嵌合体，各种分子量标记在右侧泳道中运行。B：远离BLS-RED3嵌合体的UV圆二色性谱。该图比较显示了实验测定的嵌合体谱(以实线表示)和它的理论谱(以虚线表示)，该理论谱由相当于在分离状态中的BLS蛋白和鼠蛋白Staufen-1的RBD3结构域的谱组合计算而来。该测定在50mM Tris/HCl、1.2M NaCl、pH8缓冲液、4℃进行。C：通过使用与分子滤柱出口和折光指数(RI)检测器串联连接的光散射检测器估计BLS-RBD3嵌合体的分子量。BLS-RBD 3在Superdex-200柱中运行并用50mM Tris/HCl、3M尿素、1M NaCl、pH8缓冲液，以0.5ml/min的流速洗脱。通过测定其在90度的光散射信号和光折射(LR)监测洗脱。通过比较其与用作参考模式的牛血清白蛋白样品(BSA分子量：66.5kDa)的光散射和折射信号的关系计算样品分子量。

图23显示了在492nm获得的分析的每个研究组每只小鼠血清的1/100稀释物的光密度。第二次免疫后30天时间间隔的结果作为代表性实例显示。水平线表示每组的平均值。

图24显示了抗OMP31 Mab ELI SA试验的结果。

图25显示了使用通过用BLS-OMP31嵌合蛋白衍生形成的生物传感器检测抗OMP31、AcMo 37F7单克隆抗体。

图26显示了在用BLS刺激的树突细胞中共刺激分子的表达。来源于骨髓的树突细胞用BSL(10μM BLS)或仅仅用培养基(对照)孵育18小时。显示了CD40在CD11c⁺细胞(A)和I-A^d在CD11c⁺(B)中的表达。该同种型对照在每个图的左边示出。

图27显示了用掺入经修饰的BLS蛋白的互补异源二聚肽与理论X抗原靶形成分子装配物所遵循的策略。参见Braden，et al.，见上文。使用Swisspdbviewer建模软件。

图28显示了在表达载体pET11a(Nova gen，USA)中克隆的肽BLS-RR₁₂EE₃₄₅L插入基因的核苷酸序列。红色部分显示了BLS-RR₁₂EE₃₄₅L插入肽的编码区。黑色部分显示了经修饰的BLS蛋白的编码区。

图29描述了BLS-RR₁₂EE₃₄₅L融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列。红色部分显示了RR₁₂EE₃₄₅L肽的编码区。黑色部分显示了经修饰的BLS蛋白的编码区。绿色部分显示了用丝氨酸置换的K₄₉残基的位置。

图30显示了通过在17％聚丙烯酰胺凝胶中的SDS-PAGE分离BLS-RR₁₂EE₃₄₅L融合蛋白。1：分子量标记；2：不相关样品；3：融合蛋白BLS-RR₁₂EE₃₄₅L。

图31显示了使用与分子滤柱出口和折光指数(RI)检测器串联连接的光散射检测器估计BLS-RR₁₂EE₃₄₅L嵌合体的分子量。BLS-RR₁₂EE₃₄₅L在Superdex-200柱中运行并用50mM Tris/HCI、3M尿素、0.1M NaCl、pH8缓冲液，以0.5ml/min的流速洗脱。通过测定其在90度的光散射信号和光折射(LR)监测洗脱。通过比较其与用作参考模式的牛血清白蛋白样品(BSA分子量：66.5kDa)的光散射和折射信号的关系计算样品分子量。

图32显示了在表达载体pGEX-4T1(Nova gen，USA)中克隆的肽EE₁₂RR₃₄₅L插入基因的核苷酸序列。该序列插在该载体的BamH1和EcoR1限制性酶切位点之间。黑色部分显示了GST蛋白的编码区。红色部分显示了EE₁₂RR₃₄₅L肽的编码区。

发明内容

本发明描述了通常可用于展示肽、多肽和蛋白的嵌合蛋白。在此显示的肽、多肽和蛋白可以诱导免疫反应或适于其他有用的目的。

本发明还描述了药物化合物和免疫原性值和功效高的疫苗。这些化合物和疫苗包括用布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶(BLS)作为免疫原性载体产生的嵌合蛋白。

本申请中描述的嵌合蛋白可以展示肽、多肽、蛋白或其他特殊的病原体和非病原体型的分子。

更具体而言，本申请中描述的嵌合蛋白可以有效治疗和预防人类疾病。这些实体可用于具有低或无免疫原性活性的抗原、毒素和蛋白结构域的接种。这些适应症的实例将是抗婴儿中的普通麻疹、风疹、肝炎、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、白喉、流行性腮腺炎、脑膜炎和狂犬病的疫苗接种。这些适应症的其他实例是抗成人中的甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎、流感、脑炎、狂犬病、伤寒、黄热病、单纯疱疹、水痘带状疱疹、登革热、人乳头瘤病毒、霍乱、疟疾、肺结核和流行性腮腺炎的疫苗接种。这些适应症的其他实例是对抵抗生物恐怖活动有用的疫苗，适合于下列病原体：肉毒毒素、炭疽芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、出血性结膜炎病毒(肠道病毒70)和轮状病毒。

这些实体还可以用于慢性病症的治疗，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏症和类风湿性关节炎或其他病症的治疗，如过敏和肿瘤。后者的实例可以由同时包括抗肿瘤标记或用于放疗的放射性元素的抗体或抗体片段的嵌合蛋白组成。根据本发明开发的嵌合蛋白，和来源于它们的抗体，还可以用于诊断生育力和妊娠，或诊断疾病如结肠、肺、乳房和前列腺癌。这些实体还可以用于监测和控制药物滥用或治疗法的发展。

本发明描述的嵌合蛋白还具有用于饲养家畜、农畜和鱼的多种用途。这些实体可以用来制备抗布鲁氏菌属-在牛中引起很多问题的细菌因子的疫苗，或抗鲑鱼立克次氏体的疫苗，该立克次氏体主要影响鲑鱼的商业饲养。此外，这些实体可用于将抗菌剂，如青霉素、羟氨苄青霉素或其他青霉素副产品，单独或与特异性抗体联合给予驯养动物，象猫和狗，或农畜，象牛。

本申请描述的嵌合蛋白的其他可能用途是抗猪肺炎枝原体-一种引起猪巨大损失的肺炎因子的疫苗的制备，和通常将杀寄生物药，象抗奥氏奥斯特他(氏)线虫的丙硫咪唑、苯硫咪唑和伊维菌素给予小牛和牛。还可能使用这些新实体将杀寄生物药，象abamectine和吡喹酮给予马，或用抗原表位或病毒蛋白结构域，象禽流感接种鸟。无论如何，嵌合蛋白可以同时含有杀寄生物药和抗有关寄生虫的特异性抗体。新实体的另外的治疗用途将是将抗炎剂，象卡洛芬给予驯养动物，象狗和猫。

根据本发明的嵌合蛋白还可以具有控制病原体的不同适应症。这些实体可用于调节某些激素的表达，在农畜中加快生长速率和增加乳汁产量，或使得它们的肉变得更瘦。这些非常规适应症的实例将是使用这些实体免疫阉割农畜，象猪。

本申请描述的嵌合蛋白还可以用于分子农业中疫苗和抗体的大规模生产。在这种方法中，疫苗或抗体将首先在合适的植物中表达。然后将从植物中提取疫苗或抗体并纯化来制备药物制剂。另一种可能性将是为了通过动物的摄食来免疫(可食用疫苗)，用以在此描述的实体转化的植物喂养它们。

本发明的特殊优点是在此描述的载体能够携带比本领域已知其他载体，如″病毒样颗粒″所携带的肽更大的肽。这个优点是由于它们的尺寸小和稳定性更高。在此描述的载体的这种抗原展示系统具有另外的优点：展示重复和按空间顺序插入的肽、多肽和蛋白，增加它们的稳定性和半衰期。载体蛋白(BLS)对所插入的肽、多肽和蛋白还具有相当大的辅佐作用，因此提高免疫反应有效性。

本发明的另一个优点是载体蛋白BLS在没有另外的佐剂存在下，单独诱导免疫反应。这个特征促进在有或无佐剂的情况下通过各种给药途径(例如静脉内、经鼻、口、无针)给予根据本发明制备的疫苗。

本申请描述的药物化合物和疫苗的特征是它们在室温下的高稳定性。这个特征将很可能保存化合物或疫苗，而不必保持严格的冷藏环节。

含插入载体蛋白BLS不同末端的多种肽的混合嵌合体的产生还对设计多价疫苗或针对不同免疫反应途径的疫苗有用。目前本领域中普遍的观点是疫苗不应该含有10种以上免疫反应诱导物。疫苗应该含有5种或更少的诱导物以达到最佳效果也是本领域中普遍的观点。

本申请描述的嵌合蛋白具有生产抗体的用途。这些抗体和它们的相关实体可以用于诊断。使用上面提及的抗体和相关实体开发用于诊断疾病的试剂盒也是可能的。

根据本发明开发的这些实体中的几个也可以用于展示肽和建立蛋白文库及其相关应用(例如应用于鉴定开发药物的分子或鉴定用于纳米生物应用的优选结合无机化合物的多肽序列的组合生物学)。这些新实体中的一些还可以用于生产和装配纳米技术装置或用于纳米技术方法的实施。

根据本发明的嵌合蛋白可用于构建和开发应用于分析检测几种物质和分子(例如检测水、土壤或空气中的污染物或毒素、检测食品中的药物、除草剂和杀虫剂残留物)的生物传感器。

本申请描述的实体的另一个优点是它的生产容易和低成本。从来自熟知操作和培养的微生物大肠杆菌的转化菌株模型获得了高产量的本申请描述的嵌合蛋白。根据这种方法获得的感兴趣蛋白容易从培养基中纯化。

在本发明的一个方案中，在此要求保护的分离的嵌合蛋白是由与从布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶突变的蛋白连接的肽、多肽或蛋白形成的，其编码核苷酸序列在其N-末端的前8个残基已被修饰以允许它被限制性内切酶切割，当然该酶不切割布鲁氏菌属的天然2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白的编码核苷酸序列。优选，突变的布鲁氏菌属蛋白2，4-二氧四氢蝶啶合酶在其N-末端前8个残基已被修饰以便允许用NsiI和Af1II限制性内切酶切割该酶。更优选，根据本发明使用的突变的2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白具有SEQ ID NO：1a、SEQ ID NO：2a、SEQ ID NO：3a、SEQ ID NO：4a、SEQ ID NO：5a、SEQ ID NO：6a或SEQ ID NO：7a的氨基酸序列。连接的肽、多肽或蛋白可以是同源的或异源的。在本发明的一个方案中，与突变蛋白连接的肽是异源二聚结构域。优选，这个异源二聚结构域是“亮氨酸拉链”结构域。由此获得的嵌合蛋白包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO：8a，且优选用于蛋白结构域、完整蛋白或其他非蛋白实体的偶联。在本发明的另一个方案中，也要求保护本申请描述的分离的嵌合蛋白的组合。也要求保护这些分离的嵌合蛋白和它们的组合的用途。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护本申请描述的分离的编码嵌合蛋白的核苷酸序列。这些序列可以是RNA、基因组DNA或拷贝DNA的序列。在本发明的另一个实施方案中，连接的肽、多肽或蛋白的编码序列位于编码突变的布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白的核苷酸序列的5′区。在本发明的另一个实施方案中，连接的肽、多肽或蛋白的编码序列与编码突变的布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白的核苷酸序列的5′区可操作连接。优选，使用的下列DNA序列是：SEQ ID NO：1b、SEQ ID NO：2b、SEQ ID NO：3b、SEQ ID NO：4b、SEQ ID NO：5b、SEQ ID NO：6b、SEQ ID NO：7b或SEQ ID NO：8b。本发明中使用的突变蛋白序列的具体例子包括但不限于框架核苷酸序列：a)BLS-OMP 31b)BLS-KETc1和c)BLS-RBD3，分别在实施例1、5和8中使用。在本发明的另一个实施方案中，要求保护本申请描述的分离的核苷酸序列的组合。也要求保护这些分离的核苷酸序列和它们的组合的用途。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护本申请描述的分离的嵌合蛋白的组合和分离的核苷酸序列的组合。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护包括在此描述的嵌合蛋白的编码序列的载体。这些载体可以是细菌、病毒或其他来源，且能够表达本申请描述的嵌合蛋白或促进该表达。这些载体的具体例子是pBLS-OMP 31、pBLS-KETc1和pBLS-RBD3质粒，分别在实施例1、5和8中使用。优选，使用pBLS-OMP31、DSM 15546质粒作为载体和作为产生表达本申请描述的嵌合蛋白的质粒的前体。也要求保护这些载体的用途。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护用本申请描述的载体转化的细胞或微生物。这些微生物可以是原核、真核或其他来源的微生物。可以用本发明描述的载体转化的细胞的具体例子包括但不限于昆虫细胞，细菌如大肠杆菌，和哺乳动物细胞如CHO、COS、BHK、Namalwa和HeLa。更优选，使用感受态大肠杆菌菌株进行这类转化。也要求保护这些细胞的用途。

在本发明的方案中，在此描述的分离的嵌合蛋白能够在真核生物中诱导免疫反应。这些嵌合蛋白可以在所治疗的生物中诱导细胞或体液反应。在这些情况下，该反应可以对抗相同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物或对抗不同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物。根据本发明使用的抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物可以是细菌、寄生虫、病毒或其他来源的，并且能够诱导免疫反应。这些诱导物的具体例子包括但不限于：a)马尔他布鲁氏菌OMP31蛋白的27个氨基酸的序列，b)猪肉绦虫KETc1蛋白的14个氨基酸的序列和c)鼠蛋白StaufenRBD3结构域的75个氨基酸的序列，它们分别在实施例1、5和8中使用。通常，所治疗的真核生物是鸟、鱼或哺乳动物。优选，这些生物来自鼠、兔或人来源。更优选，该生物是人来源的。也要求保护能够诱导免疫反应的这些嵌合蛋白的用途。

在本发明的方案中，编码在此描述的分离的嵌合蛋白的核苷酸序列能够在真核生物中诱导免疫反应。这些核苷酸序列可以在所治疗生物中诱导细胞或体液反应。在这些情况下，该反应可以对抗相同抗原，毒素，蛋白结构域或诱导物或对抗不同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物。根据本发明使用的抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物可以是细菌、寄生虫、病毒或其他来源的，并且能够诱导免疫反应。这些诱导物的具体例子包括但不限于，编码下列蛋白的核苷酸序列：a)马尔他布鲁氏菌OMP31蛋白的27个氨基酸，b)猪肉绦虫KETc1蛋白的14个氨基酸和c)鼠蛋白Staufen RBD3结构域的75个氨基酸，它们分别在实施例1，5和8中使用。通常，所治疗的真核生物是鸟、鱼或哺乳动物。优选，这些生物来自鼠、兔或人来源。更优选，该生物是人来源的。也要求保护能够诱导免疫反应的这些核苷酸序列的用途。

在本发明的方案中，要求保护包括下列成分的药物化合物或疫苗：1)至少一种类型的本申请描述的嵌合蛋白、2)至少一种类型的编码本申请描述的嵌合蛋白的核苷酸序列或3)1)和2)的组合。

本申请要求保护的药物制剂或疫苗可以是液态的或者是本领域中已知的任何其他药物形式，如可注射乳剂。本发明中描述的药物化合物或疫苗还可以是用于口服的片剂、液体溶液、悬浮液或酏剂，或无菌液体如溶液或悬浮液。优选使用惰性介质，如盐水介质、磷酸盐缓冲液和任何其他介质，在其中嵌合蛋白、核苷酸序列或其片段具有适当的溶解度。

本发明要求保护的药物化合物或疫苗的活性物质以有效的生理剂量存在。这些活性物质可以单独给予，或与可接受药物赋形剂，如为了增加抗体产生的佐剂联合给予。

根据本发明使用的药物化合物或疫苗包括但不限于几种油性制剂，如弗氏佐剂、酪氨酸硬脂酸盐、MDP二肽、皂苷、氢氧化铝(明矾)、淋巴细胞因子，布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白和在此描述的由布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶突变的蛋白。参见US4,258,029(Moloney，et al.)；US 5,057,540(Kensil，et al.)。优选，就人而言使用酪氨酸硬脂酸盐、氢氧化铝、布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白和在此描述的突变蛋白。弗氏佐剂尽管有效，但在人中通常不使用。还可以利用缓释机制，如脂质体给予药物化合物或疫苗。参见US 4,235,877(Fullerton，W.)。在高等生物中使用的疫苗和药物化合物的制备是本领域中已知的。参见Remington，et al.，Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCo.，Easton，Pennsylvania，1980；Voller，et al.，Eds.，NewTrends and Developments in Vaccines，University Park Press，Baltimore，Maryland，1978。

在本发明的方案中，要求保护一种在真核生物中诱导免疫反应的方法。该方法包括给这种生物施用有效量的药物化合物或疫苗，包括：1)至少一种类型的本申请描述的嵌合蛋白，2)至少一种类型的编码本申请描述的嵌合蛋白的核苷酸序列或3)1)和2)的组合。在本发明的方案中，诱导了体液反应。在本发明的另一个实施方案中，诱导了细胞反应。在本发明的另一个实施方案中，同时或顺序诱导了体液或细胞反应。在这些情况下，该反应可以对抗相同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物或对抗不同抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物。根据本发明使用的抗原、毒素、蛋白结构域或诱导物可以是细菌、寄生虫、病毒或其他来源的，并且能够诱导免疫反应。这些诱导物的具体例子包括但不限于，编码下列蛋白的核苷酸序列：a)马尔他布鲁氏菌OMP31蛋白的27个氨基酸，b)猪肉绦虫KETc1蛋白的14个氨基酸和c)鼠蛋白Staufen RBD3结构域的75个氨基酸，它们分别在实施例1，5和8中使用。可以用本申请描述的疫苗和药物化合物治疗的生物实例是鸟、鱼或哺乳动物。优选，这些生物来自鼠、兔或人来源。更优选，该生物是人来源的。本发明描述的疫苗或药物化合物可以一剂或多个剂量给予。优选，仅以一剂进行给药。还可以通过皮下、静脉内、肌内、经口、鼻或无针途径进行给药。优选，通过皮下或肌内途径进行给药。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护应答用在此描述的嵌合蛋白和核苷酸序列免疫而产生的单克隆和多克隆抗体。还要求保护为表达和产生本申请描述的抗体而开发的杂交瘤。要求保护这些抗体用于预防、治疗、诊断和其他目的的用途。还要求保护包括在此描述的抗体的药物化合物和它们的用途。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护在此描述的嵌合蛋白和至少一个配体之间形成的蛋白缀合物。在本发明的方案中，嵌合蛋白和配体之间的连接是共价的。在这些情况下，优选该连接是肽键。在本发明的另一个实施方案中，嵌合蛋白和配体之间的连接是非共价的。还要求保护这些蛋白缀合物的用途。

在本发明的另一个实施方案中，要求保护在此描述的嵌合蛋白的典型四级结构。

在此使用的术语“活性物质”被定义为：1)编码本申请描述的嵌合蛋白或其片段的基因组DNA、拷贝DNA、信使RNA或其片段和2)本申请描述的嵌合蛋白或其片段，3)1)和2)的组合或4)在此描述的嵌合蛋白和其它实体之间形成的蛋白缀合物、其片段。

在此使用的术语“有效量”被定义为足以产生一种或多种下列结果的量：1)诱导适当的免疫反应，无论是体液的还是细胞的，包括生产抗诱导物的抗体；2)抑制与诱导物相关的细胞或微生物的生长、发育、大小或运动性。当诱导物是肿瘤时，“有效量”将是足以减小肿瘤大小、阻止肿瘤生长、抑制转移或肿瘤生长，或减轻由这种肿瘤引起的不适或延长罹患这种肿瘤的个体的生命的量。

在此使用的，术语“哺乳动物”被定义为用其乳腺的分泌的乳汁来喂养其后代的热血脊椎动物。术语“哺乳动物”包括但不限于大鼠、小鼠、兔、狗、猫、山羊、母牛、绵羊、猪、灵长类动物和人。

在此使用的术语“药物化合物或疫苗”被定义为与活性物质共同给予的稀释剂、佐剂或赋形剂。它包括每种溶剂、分散介质、水溶液和气体溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂或催化剂或类似物质。活性药物物质给药中使用这类介质和试剂是本领域中已知的。除非用该介质导致活性物质无效，否则这类常规介质与活性物质一起使用是必要的。补充的有效成分也可以合并到本发明描述的活性物质中。术语“药物化合物或疫苗”包括但不限于惰性溶剂或赋形剂、无菌水溶液和几种无毒有机溶剂。“药物化合物或疫苗”既不应该与活性物质反应，也不应该另外降低活性物质的功效或稳定性。可接受的药物载体包括但不限于水、乙醇、聚乙二醇、矿物油、矿脂、丙二醇、羊毛脂和类似物质。注射使用的“药物化合物或疫苗”包括无菌水溶液(当可溶于水时)或无菌分散液和制备无菌注射分散液或溶液的粉剂。在每种情况下，该制剂都应该是无菌的和为了使它能够通过注射器给予，优选为液体。它还应该在制备和贮藏条件下稳定并且应该得到保护免受微生物如细菌、病毒和真菌的污染作用。

在此使用的术语“预防应用”被定义为诱导和产生抗一种或多种抗原、毒素、蛋白结构域或其他诱导物或其片段的免疫反应的能力。

在此使用的术语“顺序给药”意思是：1)同一活性物质以连续的时段，在一个以上的时机给予或2)两种或多种活性物质以连续的时段，在一个以上的时机交替给予。当“顺序”给药时，活性物质给药之间的时间差可以是数分钟、数小时、数天、数周或数月，取决于用途是预防还是治疗和所治疗生物的自然状态。

在此使用的术语“单次或同时给药”意思是在相同时机同时给予一种或多种活性物质。

在此使用的术语“治疗应用”被定义是指高等生物，包括人，为了直接或间接改善这种生物的病症或抗病性的目的，接受医疗护理的每一过程、应用、疗法或类似行为。

具体实施方式

实施例1

BLS-OMP31嵌合基因的构建

这个实施例描述了用于将相当于马尔他布鲁氏菌OMP 31蛋白的多肽序列第48至74位氨基酸的序列插入形成布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶十聚体的10个氨基末端的策略。

1.突变和克隆

通过下列方案构建pBLS-OMP31质粒，SEQ ID NO：9c：

a)为了克隆布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的编码基因(BLS)，通过用特异性引物从流产布鲁氏菌基因组DNA进行PCR扩增获得BLS序列并在pET11a载体(Novagen，USA)中克隆。用BamHI和Xba1限制性内切酶进一步消化包括布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶开放读框的pET11-BLS质粒。获得的插入物在pALter-Ex1载体(Promega，USA)中亚克隆。

b)对编码布鲁氏菌属(BLS)2，4-二氧四氢蝶啶合酶开放读框的序列进行定点诱变。使用ALTERED sitesll试剂盒(Promega，USA)将这个序列在pALter-Ex1载体(Promega，USA)中克隆。为了产生该盒，将两个新限制位点插入BLS基因的5′区：Nsi位点插入BLS天然氨基酸序列5′末端的前两个密码子中，而一个AFL II位点插入包含BLS天然氨基酸序列的8和9个残基的两个密码子中。要考虑到这些限制位点在天然BLS基因或pET11a载体中不存在。参见图1。

c)然后通过测序检查突变。包括突变BLS序列(SEQ ID NO：16)的盒在pET11a载体(Novagen，USA)中亚克隆以获得以下称作pBSLm的质粒。

d)为了插入相当于OMP31质粒的序列，设计两个寡核苷酸以便它们形成双链DNA并包括马尔他布鲁氏菌OMP31蛋白第48-74位氨基酸的编码序列，其在退火时被Nsi I和Af1 II限制性内切酶特有的粘性末端所保护。图2显示了为构建pBLS-OMP31而设计的寡核苷酸和由这些寡核苷酸形成的合成插入物。

e)用Nsi I和Af1 II限制性内切酶消化pBLSm质粒。除去相当于BLS前8个残基的编码序列。在这种情况下，原始的BLS序列被变为插入的OMP31肽的核苷酸序列。

f)上述步骤d)的合成插入物与步骤e)中获得的开放pBLSm盒通过用DNA T4连接酶在16℃孵育过夜而连接。通过测序证实该插入。从而，获得了具有SEQ ID NO：9b序列的基因。序列分析表明布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的前8个氨基酸被来自马尔他布鲁氏菌OMP31蛋白的第48-74位序列的27个氨基酸替代。这个开放读框称作BLS-OMP31嵌合体，由SEQ ID NO：9b组成。它的相应质粒称作pBLS-OMP-31，由SEQ ID-NO：9c组成。参见图3b和c。

使用突变BLS的DNA序列SEQ ID NO：2b、SEQ ID NO：3b、SEQ IDNO：4b、SEQ ID NO：5b、SEQ ID NO：6b和SEQ ID NO：7b重复这个实验。获得了类似结果。

2.转化

用根据上述方案获得的pBLS-OMP31质粒通过热休克转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株。然后，在包括LB-琼脂/氨苄青霉素的琼脂平板中培养细菌以选择用该质粒转化的细菌。将2ml LB/氨苄青霉素培养基接种到从琼脂平板提取的菌落中进行小规模表达试验。摇动该菌落并在37℃孵育。用2μl 1M IPTG诱导饱和的培养物。三小时后，移出100μl培养物并离心。将产生的沉淀重悬于25μl样品缓冲液1X，通过SDS-PAGE 17％进行分析。参见图4.

3.BLS-OMP31嵌合蛋白的表达和纯化

根据上述步骤用500ml LB/氨苄青霉素培养5-ml转化菌株的预培养物至饱和。孵育该培养物并在37℃摇动。用0.5ml IPTG(1M)诱导以达到600nm下0.6-0.8的光密度。三小时后移出培养物并以4,000g离心20分钟。将沉淀悬浮于15ml悬浮液(50mM Tris、5mMEDTA、1％Triton X-100，pH8.0)中。

以每分钟1分钟的时间间隔超声处理悬浮液5分钟并以20,000g离心30分钟。将沉淀重悬于无Triton X-100的15ml悬浮溶液中并重复超声处理过程。第三次重复该步骤。细胞质中表达的嵌合体包含在三次超声处理的上清液中，而包含体包含在沉淀中。参见图5。

将包含体重悬于含8M尿素的PBS缓冲液中并在室温下放置过夜。对着PBS透析重悬液两天，更换缓冲液。将样品离心并对着缓冲液A(50mM Tris/HCl、pH8.5)透析上清液。通过在FPLC设备(Pharmacia，USA)中的MonoQ或Q-Sepharose(Pharmacia，USA)柱中的阴离子交换色谱法进行第一个纯化步骤。将样品注射到用缓冲液A平衡的柱中并通过直至50％缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)的线性梯度洗脱。

通过在Superdex 200(Amersham，UK)分子排阻柱中的色谱法进行第二个纯化步骤。参见图6和7。为此，将嵌合体峰集中在Centriprep(Millipore，USA)管中并注射到柱中，用PBS洗脱。用SDS-PAGE估计峰中嵌合蛋白的存在。

使用本领域已知的分子生物学技术进行BLS-OMP 31嵌合基因的构建。参见Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，New York，1989；Brown，Gene Cloning，Chapman & Hall，London，England，1995；Watson，et al.，Recombinant DNA，2nd Ed.，Scientific AmericanBooks，New York，New York，1992and Davis et al.，Basic Methodsin Molecular Biology，Elsevier Science Publishing Co.，New York，New York，1986，Alberts，et al.，Molecular Biology of the Cell，4th Ed.，Garland Science，New York，New York，2002。

实施例2

BLS-OMP31嵌合体稳定性

通过光散射技术获得了BLS-OMP31嵌合蛋白采取十聚体折叠的第一个证据。这个步骤用来计算在溶解状态中该蛋白的分子大小。为进行这些测定，将分子排阻柱与光散射检测器相连。随蛋白从柱中洗脱，它的分子量被测定。

根据这种方法，计算的BLS分子量是163kDa，而BLS-OMP31嵌合体的分子量是215kDa。天然BLS和BLS-OMP31十聚体的理论分子量分别是174.4和197.8kDa。考虑到这种方法准确性是90％，这个结果提示BLS-OMP31嵌合体形成非常类似于天然BLS蛋白的十聚体。

通过圆二色性研究了嵌合蛋白的折叠。在J-810分光偏振计(Jasco，UK)中进行圆二色性测定，设置100nm/min的阅读速度、4s的响应时间和1nm的带宽。使用1、2或5mm的石英盘(Hellma)。在50mM pH7磷酸盐缓冲液中测定样品。BLS-OMP31嵌合体和天然BLS的圆二色性谱的覆盖图表明这两种蛋白的一般折叠非常类似。参见图8。因此，证实了该正确折叠的嵌合蛋白和十聚体一样，具有与天然蛋白相似的二级结构。

接下来，研究了在该嵌合蛋白N末端的置换是否影响它们的稳定性。为此，通过圆二色性研究了通过盐酸胍(Gdm-HCl)和温度诱导的嵌合体变性。

从变性-平衡曲线，有可能获得几个热力学参数，如与解叠相关的自由能的变化。用这个参数，估计蛋白所特有的构象稳定性。参见Pace，et al，Methods Enzymol.，131：266-80(1986)。为评价与每种蛋白解叠相关的自由能变化，调整研究数据以适合理论描述性曲线。这个图描述了嵌合蛋白的折叠和解叠期之间的平衡常数和变性剂的变化浓度的相关性。

为进行这些实验，将相同量的蛋白(0.1M十聚体)与浓度渐增的变性剂一起孵育。由6M胍-HCl(ICN，超高纯)、50mM磷酸盐，pH7的基质溶液制备曲线上每个点的溶液。样品在室温下孵育三小时并在测定前离心。在5mm盘中25℃进行圆二色性测定。由此证明了用胍使BLS天然蛋白和BLS-OMP31嵌合蛋白变性的可逆性。

调整变性-平衡曲线以适合两步解离模式。根据这个模式，十聚体首先分离为两个相等的五聚体。在变性的第二步中，这些五聚体的每一个进一步解离为五个解叠单体。描述这个转变的公式源自于已经对于单体蛋白提出的公式。参见Zylberman，et al，J Biol.Chem.，279(9)：8093-8101(2004)。

由天然BLS和BLS-OMP31获得的热力学数值表明BLS N末端的替代不影响十聚体稳定性。参见图9。因此，证实了BLS嵌合体形成正确折叠的十聚体，而且它们的稳定性类似于天然BLS的稳定性。

实施例3

BLS-OMP31嵌合体抗原性和免疫原性

通过测定BLS-OMP31与抗插入肽的特异性单克隆抗体(A59/10F09/G10单克隆抗体)和抗天然BLS蛋白的特异性单克隆抗体(BI24单克隆抗体)结合的能力研究了它的抗原性。参见Vizcaino，etal.，Infect.Immun.，69(11)：7020-28，(2001)；Goldbaum，et al.，J Clin.Microbiol.，31：2141-2145(1993)。这个步骤允许测定插入物和蛋白核心的抗原性。用ELISA测定抗原性。参见图10。

用抗天然BLS的单克隆抗体和抗插入肽的单克隆抗体鉴定了BLS-OMP31。正如所料，天然BLS仅由第一个抗体识别。这个结果表明插入肽当被嵌合体展示时保留了其抗原性能。此外，还表明了嵌合体的折叠不影响抗BLS抗体与蛋白核心的亲合力。这两个抗体检测达到每孔20ng嵌合体。

然后，评价BLS-OMP31诱导抗插入肽的特异性体液免疫反应的能力。在有和没有佐剂辅助下，在小鼠中分析了这种能力。以每组五只小鼠的两个组进行实验。“AF”组通过腹膜内途径以0、20和40天间隔接受三个剂量的含弗氏佐剂的乳剂中的25μg蛋白。第一剂量与弗氏完全佐剂一起给予。其余剂量与弗氏不完全佐剂一起给予。“PBS”组得到相同处理，但是在无佐剂情况下注射嵌合蛋白。第三次免疫后7天抽取血液并用ELISA测定抗OMP31膜蛋白的血清反应性。参见图11。

在用嵌合体和佐剂免疫的小鼠中获得了抗OMP31的强烈反应。从用嵌合蛋白有和没有佐剂免疫的小鼠获得的血清学反应也是相应的。这些结果表明用BLS-OMP31嵌合体有或没有佐剂免疫的小鼠具有抗插入肽的特异性免疫反应。

根据下列方案用BLS-OMP31嵌合体与佐剂注入兔：

第一剂量，第0天：含200μg BLS-OMP31的1ml PBS+1ml弗氏完全佐剂，通过肌内注射。

第二剂量，第22天：含200μg BLS-OMP31的1ml PBS+1ml弗氏不完全佐剂(IFA)，通过皮下注射。

第三剂量，第45天：含200μg BLS-OMP31的1ml PBS+1ml IFA，通过肌内注射。

第四剂量，第155天：含200μg BLS-OMP31的1ml PBS+1ml IFA，通过皮下注射。

在第31、52和180天抽取血液样品。将样品离心并冷冻血清。

用ELISA滴定注射第二、第三和第四剂量的抗原后收集的抗OMP31膜蛋白的抗血清。参见图12。对于相当于第二、第三和第四剂量的血清，测定的抗血清滴度分别是3,200、12,800和25,600。将基线定义为能够鉴定出阴性血清中抗原的最大稀释度。经免疫的兔显示出抗OMP31的强烈特异性免疫反应。由于抗天然BLS的血清不能鉴定OMP31，因此这种高反应性是由于特异性抗体抗插入嵌合体的肽的反应。参见图13，阴性对照。

在大肠杆菌中重组产生ELISA试验中使用的OMP31蛋白。由于这个分子是膜蛋白，它不能保持在水溶液中，因此在变性条件下获得。在进行的试验中，没有证实抗血清能够鉴定作为细菌膜蛋白的呈天然构象的OMP31嵌合体。这个性能对评价嵌合体作为能够提供抗布鲁氏菌属的体液免疫的免疫原的潜在有效性很重要。为评估这个性能，使用马耳他布鲁氏菌H38的平滑和粗糙菌株作为抗原进行ELISA试验。参见图13。由于使用的抗原的复杂性，通常难以评价血清抗全菌的反应性。然而，该试验表明抗BLS-OMP31血清特异性识别插入粗糙菌株膜的OMP31。这种血清抗光滑菌株的反应性不同于由抗天然BLS血清显示的反应性。这个结果与对于A59/10F09/G10单克隆抗体所公开的数据完全一致。参见Vizcaino，et al.，见上文。对包含在BLS-OMP31嵌合体中的插入物特异性的这种抗体与马耳他布鲁氏菌株H38的粗糙而不是光滑菌株具有强烈的反应性。

实施例4

BLS-OMP31DNA疫苗

将BLS-Omp31的编码序列亚克隆入载体pCI-neo(Promega，USA)，包含引物5′末端(符合读框)的限制位点和Kozak共有序列(带下划线)。因此，构建了下列寡核苷酸：

BLS-OMP31“有义”：

5′TAAGAA GAATCC ACCACCATG CAT ACC GCC GGT TA 3′.

BLS-OMP31“反义”：

5′TGT CCA CCA GTC AT GCTAGCT CAG ACA AGC GCG ATG C 3′。

使用pET-BLS-OMP31质粒作为模板通过PCR扩增该序列。用相应的限制性内切酶消化PCR产物和载体，然后进行连接反应。通过测序核查获得的构建体。在大肠杆菌JM109细胞中扩增pCI-BLS-OMP31质粒并用“mega prep”柱(Quiagen，UK)进一步纯化。在260/280nm下用分光光度测定法估计DNA纯度和浓度。用鲎变形细胞溶胞产物分析试剂盒(Sigma，USA)测得，质粒制剂含有每100μg DNA少于0.05单位的内毒素。

在第0、2、4和6周，通过肌内(im)和皮内(id)途径给Balb/c小鼠组接种含100μg pCI-BLSOMP31质粒和无插入物的对照质粒(pCI)的生理溶液。在第一次免疫后第0、15、30、45、60和75天，通过眶后途径抽取动物血液。将血清保存在-20℃用于特异性抗体的检测。

通过使用重组OMP31蛋白作为抗原的间接ELISA分析经BLS-OMP31 DNA疫苗(pCI-BLSOMP31)免疫诱导的抗OMP31体液反应。免疫后，所有动物产生体液免疫反应。观察到产生的特异性抗Omp31蛋白的高水平IgG同种型。参见图14。

使用分子生物学技术和本领域已知的药物化合物的制备和给药方法进行pCI-BLS-OMP31质粒的制备、扩增、纯化和作为DNA疫苗的使用。参见Schleef，M，Ed，Plasmids for Therapy and Vaccination，Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，Germany，2001。

实施例5

BLS嵌合体的混合物

当用高浓度氯化胍处理时，布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶可逆解离的事实用来构建混合嵌合体。参见Zylberman，et al.，J Biol.Chem.279(9)：8093-8101(2004)。构建了插入物大小和等电点具有显著差异的两个嵌合体。为了更容易地区别由混合嵌合体形成的十聚体，遵循这个策略。

为此，除了已经描述的OMP31肽，使用图15所示的KETcl肽。KETcl肽来源于猪肉绦虫蛋白并且已被描述对抗鼠和猪神经囊尾幼虫病具有高保护性。参见Huerta，et al.，Vaccine 20：62-266(2001)；Toledo，et al.，Infect.Immun.，69：1766-1773(2001)。

根据下列方案获得BLS-KETc1嵌合蛋白：

1.克隆

a)用Nsi I和Af1 II限制性内切酶消化pBLS-OMP31质粒以除去相当于OMP31蛋白第48-74位序列的27个氨基酸的编码序列。提取OMP31蛋白编码序列。

b)将KETc1肽的14个氨基酸的编码序列与a)中的开放盒连接，其通过pBLS-OMP31^-OMP31质粒的开放盒与DNA T4连接酶在16℃孵育过夜来进行。由此获得了BLS-KETc1读框。经读框测序证实了该插入。这个读框称作BLS-KETc1嵌合体，具有SEQ ID NO：10b，和表达质粒，pBLS-KETc1。

还可以遵循实施例1的步骤1)中指出的方案进行这个步骤，其通过用Nsi和Af1 I限制性内切酶切割BLSm盒(SEQ ID NO：1b)和它与KETc1插入物进一步连接来进行。由此，也获得了BLS-KETc1读框和pBLS-KETc1质粒。

使用突变BLS的DNA序列SEQ ID NO：2b、SEQ ID NO：3b、SEQ IDNO：4b、SEQ ID NO：5b、SEQ ID NO：6b和SEQ ID NO：7b重复这个实验。得到相似结果。

2.转化

用根据上述方案获得的pBLS-KETc1质粒通过热休克转化感受态大肠杆菌BL21菌株(DE3)。然后，在包含LB-琼脂/氨苄青霉素的琼脂平板中培养细菌以选择用该质粒转化的细菌。

3.BLS-KETc1嵌合蛋白的表达和纯化

将2ml LB/氨苄青霉素培养基接种到从琼脂平板提取的菌落中进行小规模表达试验。摇动该菌落并在37℃孵育。用2μl 1M IPTG诱导饱和的培养物。三小时后，移出100μl培养物并离心。产生的沉淀重悬于25μl样品缓冲液1X，用SDS-PAGE 17％进行分析。

根据上述步骤用500ml LB/氨苄青霉素培养5-ml转化菌株的预培养物至饱和。孵育该培养物并在37℃摇动。用0.5ml 1M IPTG诱导以达到600nm下0.6-0.8的光密度。三小时后移出培养物并以4,000g离心20分钟。沉淀重悬于15ml悬浮溶液(50mM Tris、5mM EDTA、1％Triton X-100，pH8.0)中。

以每分钟1分钟的时间间隔超声处理悬浮液5分钟并以20,000g离心30分钟。沉淀重悬于无Triton X-100的15ml悬浮溶液并重复超声处理过程。第三次重复该步骤。细胞质中表达的嵌合体包含在三次超声处理的上清液中，而包含体包含在沉淀中。

包含体重悬于含8M尿素的PBS缓冲液中并在室温下放置过夜。对着PBS透析重悬液两天，更换缓冲液。将样品离心并对着缓冲液A(50mM Tris/HCl、pH8.5)透析上清液。通过在FPLC设备(Pharmacia，USA)中的MonoQ或Q-Sepharose(Pharmacia，USA)柱中阴离子交换色谱法进行第一个纯化步骤。将样品注射到用缓冲液A平衡的柱中并通过直至50％缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)的线性梯度洗脱。

通过在Superdex 200(Amersham，UK)分子排阻柱中的色谱法进行第二个纯化步骤。为此，将嵌合体峰集中在Centriprep(Millipore，USA)管中并注射到柱中，用PBS洗脱。用SDS-PAGE估计峰中嵌合蛋白的存在。

使用本领域已知的分子生物学技术进行BLS-KETc1嵌合基因的构建。参见Sambrook，et al.，见上文；Brown，见上文；Watson，et al.，见上文；Davis et al.，见上文，Alberts，et al.，见上文。

BLS-OMP31和BLS-KETc1嵌合体在2M氯化胍中解叠，以等摩尔浓度混合并通过透析重聚。添加2M胍，使十聚体分离，由此产生保留它们的二级结构的五聚体。当通过透析除去胍时，五聚体重聚再次形成十聚体。参见Zylberman，et al.，J Biol.Chem.，279(9)：8093-8101(2004)。用这种方式，产生了BLS嵌合体的混合物。参见图16。

通过在MonoQ(Amersham，UK)阴离子交换柱中的交换色谱法纯化重聚产物。根据下列方案将结果与每个单独的嵌合体(没有解离的样品)的洗脱分布图相比：以16.8％缓冲液B洗脱BLS-KETc1嵌合体(由于插入物理论等电点，估计这个颗粒碱性最大)和以35.8％的相同缓冲液洗脱BLS-OMP31嵌合体。重聚样品分离产生三个不同的峰，第一个峰相当于纯BLS-KETc1嵌合体；第二个最大的峰相当于混合嵌合体而最后一个峰相当于纯BLS-OMP31嵌合体。参见图17A。

用SDS-PAGE和天然PAGE分析相当于第二个峰的样品。结果表明相当于由在一个五聚体的五个氨基末端展示的KETc1肽和由在另一个五聚体的五个氨基末端展示的OMP31肽形成的嵌合体混合物的样品。参见图17B1和B2。

这个结果表明提出的分离、混合和重聚经修饰蛋白的策略可有效产生嵌合体的混合物，其中由BLS十聚体结构展示五个拷贝的两种不同的肽。参见图16。该混合物可能具有不同的特性，这取决于插入物的性质(例如一种插入物可能针对特定的细胞运输，而另一种可能诱导特定的免疫反应)。

实施例6

用BLS嵌合体的混合物免疫

将BLS-OMP31-KETc1嵌合体的混合物与佐剂一起给予小鼠以估计它诱导特异性体液免疫反应的能力。以每组五只小鼠进行实验。该组在0、20和40天通过腹膜内途径接受三个剂量的含弗氏佐剂的乳剂中的25Hg蛋白。第一剂量与完全佐剂一起应用。第二和第三剂量与不完全佐剂一起应用。第三次免疫后7天抽取血液并用ELISA测定抗OMP31和KETc1合成肽的血清反应性。参见图18。

在用嵌合体的混合物与佐剂一起免疫的小鼠中获得了抗这两种肽的强烈反应。这证明了用BLS-OMP31-KETc1嵌合体的混合物免疫的小鼠同时产生了抗这两种插入物的特异性免疫反应。

实施例7

抗BLS嵌合体的细胞免疫反应

用乳化于皂苷中的50μg/小鼠的BLS-KETc1嵌合体和用乳化于皂苷中的10μg/小鼠的KETc1合成肽免疫每组五只BALB/c小鼠的组，以评估由BLS-KETc1嵌合体诱导的抗插入肽的特异性细胞免疫反应。在10天间隔内通过皮下途径免疫小鼠两次。

最后一次免疫后三天无菌摘除两组的脾。脾细胞重悬于补充了L-谷氨酰胺(0.2mM)、2-巯基乙醇(0.05mM)、非必需氨基酸(0.01mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和胎牛血清10％(FBS)的RPMI1640Gibco(InVitrogen Corp.，USA)培养基中。将培养基、KETc1肽或BLS-KETc1嵌合体(10μg/ml)添加至不同的细胞培养物中。将细胞以每200μl终体积2×10⁵个细胞的浓度悬于平底培养微板中。将它们保持在5％CO₂，37℃的湿润环境中。

72小时后，向每个培养物添加1μCi[甲基-³H]胸苷(AmershamBiosciences，UK)。接种细胞和在1205 betaplate^TM液体闪烁计数器(Wallac Oy，FI)中测定滴定的胸苷掺入水平。所有试验一式三份进行。

该试验表明用BLS-KETc1嵌合体免疫的小鼠脾细胞在肽和嵌合体都存在下在培养物中增殖。这个结果清楚地表明BLS-KETc1嵌合体能够诱导抗插入BLS的KETc1肽的特异性细胞免疫反应。参见图19。

实施例8

用BLS嵌合体多次展示蛋白结构域

BLS可以被修饰，不仅展示肽，而且在它的十个氨基末端展示完整蛋白结构域。为了证明这个交替的用途，通过将修饰的BLS编码序列与鼠蛋白Staufen-1的RBD3蛋白结构域的编码序列连接而构建BLS-RBD3嵌合体。参见图20和21。

根据下列方案获得BLS-KETc1嵌合蛋白：

1.克隆

b)将鼠蛋白Staufen的RBD3结构域的75个氨基酸的编码序列与a)中的开放盒连接，其通过pBLS-OMP31^-OMP31质粒的开放盒与DNA T4连接酶在16℃孵育来进行。由此获得了BLS-RBD3读框。经读框测序证实了该插入。这个读框称作BLS-RBD3嵌合体，具有SEQ ID NO：11b，和表达质粒，pBLS-RBD3。

还可以遵循实施例1的步骤1)中指出的方案进行这个步骤，其通过用Nsi和Af1 I限制性内切酶切割BLSm盒(SEQ ID NO：1b)和它与RBD3插入物进一步连接来进行。由此，也获得了BLS-RBD3读框和pBLS-RBD3质粒。

2.转化

用根据上述方案获得的pBLS-KETc1质粒通过热休克转化感受态大肠杆菌BL21菌株(DE3)。然后，在有氨苄青霉素存在的LB培养基中接种菌株。用IPTG 1mM在28℃诱导基因表达4小时。

3.BLS-RD3嵌合蛋白的表达和纯化

该蛋白以包含体表达，用4和6M尿素溶液洗涤并通过在4℃磁力搅拌16小时溶于缓冲液Tris/HCl 50mM、尿素8M、EDTA 5mM、β-ME 5mM、PMSF 1mM、pH8。溶解蛋白在变性条件下，在Q-Sepharose离子交换柱中纯化，应用在缓冲液Tris/HCl 50mM、8M尿素、pH8.5中0至1M NaCl的线性梯度。洗脱蛋白通过对着PBS缓冲液透析再折叠并用肝素Hyper D柱纯化。对于洗脱，使用缓冲液Tris/HCl 50mM、NaCl 1.2M、pH8。

图22显示了通过如上所述方法获得的BLS-RBD3嵌合体的SDS-PAGE、圆二色性和光散射分析。

SDS-PAGE分析显示获得的BLS-RBD3嵌合体纯度很高。在电泳迁移中观察到的微小异常归因于RBD3结构域正电荷的高密度。通过BLS和分离的鼠蛋白Staufen-1的RBD3结构域的谱组合计算的BLS-RBD3圆二色性谱与其理论谱的相似性表明该嵌合体很好折叠。由嵌合体在与光散射检测器和折光指数检测器串联连接的分子滤柱中运行计算的嵌合体分子量(257kDa)表明BLS-RBD3嵌合体呈现十聚体结构。

使用本领域已知的分子生物学技术进行BLS-RBD3嵌合基因的构建。参见Sambrook，et al.，见上文；Brown，见上文；Watson，etal.，见上文；Daviset al.，见上文，Alberts，et al.，见上文。

实施例9

用BLS嵌合体免疫产生宽谱抗体

使用BLS-Staufen嵌合体作为免疫原以获得抗Staufen RBD3结构域的抗体。给5只Balb/c小鼠接种含80μg BLS-RBD3嵌合体的缓冲液200μl HCl 50mM、NaCl 1.2M、50mM磷酸盐、pH8，不含佐剂，通过腹膜内途径以14天的间隔接种两次。作为对照，用BLS蛋白和Staufen RBD3结构域的混合物免疫同一品系的5只小鼠，包含的嵌合体质量相同。最后一次免疫后十五天通过眶后穿刺抽取小鼠血液。通过以1000xg离心10分钟制备血清。在具有谷胱甘肽S-转移酶-RBD3(GST-RBD3)融合蛋白的96孔板中通过ELISA测定抗RBD3的血清反应性。与羊过氧化物酶(DakoCytomation，USA)缀合的小鼠抗免疫球蛋白用作第二抗体。用orthophenildyamin(OPD)引发反应，并用4N硫酸中止。用ELISA读数器在492nm处测定光密度。

图23显示了由两组产生的体液免疫反应的代表性实例。观察到，用BLS-RBD3嵌合体免疫引起强烈的抗RBD3抗体反应。在用BLS和RBD3混合物接种的小鼠中没有观察到抗该肽的反应性。

实施例10

通过用BLS嵌合体免疫产生单克隆抗体

评估用BLS-OMP31嵌合体免疫的小鼠脾细胞产生抗OMP31肽的特异性单克隆抗体的能力。以每组五只小鼠进行实验。该组以0、20和40天间隔通过腹膜内途径接受三个剂量的含弗氏佐剂的25μg蛋白的乳剂。在第60天，通过腹膜途径给显示抗OMP31肽的较好反应的小鼠接种溶于PBS的25μg BLS-OMP31。取出这种小鼠的脾并将脾细胞与NSO骨髓瘤细胞融合。在HAT培养基中选择所产生的杂交瘤，并且测定它们的培养物上清液，通过ELISA测定抗OMP31肽的反应性。通过有限稀释克隆显示较高反应性的杂交瘤。图24显示了抗OMP31肽和完整OMP31蛋白的AcMo 37F7反应性。获得了抗二者的强烈反应。这证明了用BLS-OMP31嵌合体免疫的小鼠产生了抗插入肽的特异性免疫反应。这个经验也表明使用BLS嵌合体可以产生特异性单克隆抗体。

实施例11

BLS嵌合体作为生物传感器的用途

生物传感器允许检测大分子当中的特异性相互作用，其通过增加与反应表面上的质量累积成比例的信号显现。使用BLS-OMP31经修饰蛋白研究BLS嵌合体作为用于开发生物传感器的肽和蛋白结构域载体的应用。为此目的，进一步分析了上述实施例中描述的BLS-OMP31和AcMo 37F7之间的反应。

BLS-OMP31嵌合体用来衍生葡聚糖羧甲基(dextrancarboximethyl)平板(IAsys Affinity Sensors，Thermo，USA)。为了该目的，包含80μg/ml BLS-OMP31的10mM乙酸钠pH5.5缓冲液在用EDC/NHS试剂预先衍生的平板中孵育。使相当于800弧秒的信号(等于5ng的抗原)固定后，用二乙胺封闭反应表面。衍生后，研究抗-OMP31 AcMo 37F7反应性，为此将50μl的培养物上清液在预先活化的平板中孵育。

如在图25中所观察到的，AcMo 37F7发生强烈反应，产生了大约300弧秒的信号。在分离阶段，洗涤和添加缓冲液PBS+Tween，观察对应于固相AcMo分离的信号下降。这个实施例清楚显示了该嵌合体能够检测针对生物传感器中肽的抗体。

实施例12

通过BLS活化树突细胞

分析BLS活化树突细胞的能力。为此，在这些细胞与BLS孵育18小时后，研究它们中不同标记的活化水平。来自Balb/c小鼠的骨髓细胞在含RPMI培养基的培养平板中，在5％CO₂环境下37℃的培养箱中培养，RPMI培养基含2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μM 2-巯基乙醇和10％胎牛血清(培养基R10)，补充了小鼠粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)。在第3、6和8天更换培养基。在第9天，取出非贴壁细胞并以300xg离心8分钟。然后将细胞以2×10⁶个细胞/ml的浓度在R10培养基中孵育18小时(n＝4)，终体积1ml，有BLS(1，5或10μm)或没有BLS。然后，将每200μl终体积4×10⁵个细胞离心并与和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的下列单克隆抗体(Pharmingen)：抗-CD40、抗-CD80、抗I-A^d或抗-CD86，和与同藻红蛋白(PE)缀合的抗-CD11c单克隆抗体孵育。进行三次洗涤并用FACScan细胞计数器(Becton Dickinson，USA)提取细胞。用Cell Quest(Becton Dickinson，USA)软件分析获得的数据。

在与BLS孵育的细胞中，在CD11c⁺亚群(75-80％)内，观察到表达CD40、CD80、I-A^d和CD86的细胞的百分比和平均荧光显著增加。实验进行三次，获得相似的结果。图26显示了在有或没有BLS时处理的CD11c⁺细胞中，CD40表达(A)和I-A^d(B)的代表性直方图。

在C3H/He J小鼠(对LPS无应答者)的树突细胞中或当BLS蛋白与多粘菌素B预先孵育以便除去大肠杆菌的LPS时，观察到由BLS引起的类似活化。

这些结果证明BLS能够活化树突细胞。

实施例13

通过与BLS嵌合体连接的接头肽与蛋白结构域形成的分子装配物的产生

BLS蛋白可以在它的氨基末端被修饰以展示完整的蛋白结构域。这可以伴随分子装配物的形成。在这些簇中，互补异源二聚肽与修饰的BLS蛋白和靶合并。然后，异源二聚体之间的高亲合力将靶分子和修饰的BLS蛋白连接起来。高亲合力异源二聚体的使用对避免影响载体蛋白的正确折叠有用。为证明BLS嵌合体的这个应用，使用本领域已知的两种异源二聚肽RR₁₂EE₃₄₅L和EE₁₂RR₃₄₅L。参见Moll，et al.，MProtein Sci.，10：649-655(2001)。参见图27。这个策略允许分子装配物的构建，包括十个拷贝的与BLS结合的结构域。体外进行装配，使得可能控制该过程的化学计量。这个系统也能够在不同于BLS的重组系统中表达抗原。参见图28。

1.融合蛋白BLS-RR₁₂EE₃₄₅L的构建

在BLS的N-末端克隆肽RR₁₂EE₃₄₅L。参见图28和29。位于BLS和RR₁₂EE₃₄₅L接头区的K₄₉残基替代丝氨酸。BLS-RR₁₂EE₃₄₅L嵌合基因在pET 11a载体中克隆。用所产生的载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细菌菌株。然后，将该细菌在LB-琼脂/氨苄青霉素培养基中培养。用1M IPTG在37℃诱导基因表达16小时。该蛋白以包含体表达。

用缓冲液50mMTris/HCI、5mM EDTA、5mM β-ME、1mM PMSF，pH8洗涤包含体。用缓冲液50mMTris/HCl、8M尿素、5mM EDTA、5mMβ-ME、1mM PMSF、pH8处理溶解的蛋白并在4℃磁力搅拌16小时。在变性条件下通过在Q-Sepharose(Pharmacia，USA)柱中的阴离子交换色谱法纯化所产生的BLS-RR₁₂EE₃₄₅L嵌合体。使用缓冲液50mMTris/HCl、8M尿素、pH8.5在0至1M NaCl线性梯度下洗脱样品。用SDS-PAGE和光散射分析测定该融合蛋白。参见图30和31。

SDS-PAGE分析表明该融合蛋白BLS-RR₁₂EE₃₄₅L具有高水平的纯度。用光散射技术测得，该蛋白分子量是224kDa。此外，该蛋白在远距离紫外光谱中显示出高质量的CD信号。这些结果提示该融合蛋白很好地折叠并观察到在8M尿素存在下与天然BLS蛋白相似的十聚体结构。当尿素浓度降低时，BLS结构在室温下变形。这大概是由于RR₁₂EE₃₄₅L与其本身的结合。

2.肽EE₁₂RR₃₄₅L的构建

在谷胱甘肽S-转移酶(GST)蛋白的C-末端克隆肽EE₁₂RR₃₄₅L。这个肽与由BLS融合蛋白展示的RR₁₂EE₃₄₅L肽互补。参见图32。

EE₁₂RR₃₄₅L肽基因在pGEX-4T1载体中克隆。用所产生的载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细菌菌株。然后，将该细菌在LB-琼脂/氨苄青霉素培养基中37℃培养。用1mM IPTG在37℃诱导基因表达16小时。然后超声处理该细菌。

使用谷胱甘肽/琼脂糖基质纯化所产生的EE₁₂RR₃₄₅L肽，作为GST融合蛋白。将偶联的复合物装入柱并用缓冲液50mMTris，pH8洗涤，直到洗脱液中没有肽。然后，将基质与凝血酶在室温下孵育16小时以从GST融合蛋白中切下EE₁₂RR₃₄₅L。然后用缓冲液50mM Tris，pH8洗脱该肽以进一步纯化它。产生的EE₁₂RR₃₄₅L肽具有高水平的纯度。

3.融合蛋白BLS-RR₁₂EE₃₄₅L和肽EE₁₂RR₃₄₅L之间分子装配物的形成

将一份融合蛋白BLS-RR₁₂EE₃₄₅L与8M尿素、50mM Tris、0.5MNaCl，pH8在30℃预先孵育15分钟。将四份肽EE₁₂RR₃₄₅L在缓冲液50mM Tris、0.1M NaCl、pH8中，30℃预先孵育15分钟。将该融合蛋白和肽混合并在30℃孵育15分钟。孵育后该混合物保持可溶。

通过光散射分析测定产生的分子装配物并计算它的理论分子量(MW：222.1kDa)。参见图34。这个分析表明大约10个EE₁₂RR₃₄₅L肽(MW：5.6kDa)与BLS-RR₁₂EE₃₄₅L十聚体(MW：222.1kDa)连接在一起。参见图35。

此外，该装配物在远距离紫外光谱中显示出高质量的CD信号。这些结果提示使用这种技术产生与修饰的BLS蛋白形成的分子装配物是可行的。

已经相当详细地描述并举例说明了本发明以便于对它的理解和重现。本领域任何技术人员都可以进行形式和细节方面的某些改变，而不背离本发明权利要求的真实目的和范围。在此引用方面的全部出版物完全引入作为本发明说明书的参考文献。

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序列表

SEQ ID NO：1a：

MHSNQSCPLK TSFKIAFIQA RWHADIVDEA RKSFVAELAA KTGGSVEVEI FDVPGAYEIP 60

LHAKTLARTG RYAAIVGAAF VIDGGIYDHD FVATAVINGM MQVQLETEVP VLSVVLTPHH 120

FHESKEHHDF FHAHFKVKGV EAAHAALQIV SERSRIAALV 160

SEQ ID NO：2a：

MHSNQSCLKT SFKIAFIQAR WHADIVDEAR KSFVAELAAK TGGSVEVEIF DVPGAYEIPL 60

HAKTLARTGR YAAIVGAAFV IDGGIYDHDF VATAVINGMM QVQLETEVPV LSVVLTPHHF 120

HESKEHHDFF HAHFKVKGVE AAHAALQIVS ERSRIAALV 159

SEQ ID NO：3a：

MHSNQSLKTS FKIAFIQARW HADIVDEARK SFVAELAAKT GGSVEVEIFD VPGAYEIPLH 60

AKTLARTGRY AAIVGAAFVI DGGIYDHDFV ATAVINGMMQ VQLETEVPVL SVVLTPHHFH 120

ESKEHHDFFH AHFKVKGVEA AHAALQIVSE RSRIAALV 158

SEQ ID NO：4a：

MHSNQLKTSF KIAFIQARWH ADIVDEARKS FVAELAAKTG GSVEVEIFDV PGAYEIPLHA 60

KTLARTGRYA AIVGAAFVID GGIYDHDFVA TAVINGMMQV QLETEVPVLS VVLTPHHFHE 120

SKEHHDFFHA HFKVKGVEAA HAALQIVSER SRIAALV 157

SEQ ID NO：5a：

MHSNLKTSFK IAFIQARWHA DIVDEARKSF VAELAAKTGG SVEVEIFDVP GAYEIPLHAK 60

TLARTGRYAA IVGAAFVIDG GIYDHDFVAT AVINGMMQVQ LETEVPVLSV VLTPHHFHES 120

KEHHDFFHAH FKVKGVEAAH AALQIVSERS RIAALV 156

SEQ ID NO：6a：

MHSLKTSFKI AFIQARWHAD IVDEARKSFV AELAAKTGGS VEVEIFDVPG AYEIPLHAKT 60

LARTGRYAAI VGAAFVIDGG IYDHDFVATA VINGMMQVQL ETEVPVLSVV LTPHHFHESK 120

EHHDFFHAHF KVKGVEAAHA ALQIVSERSR IAALV 155

SEQ ID NO：7a：

MHLKTSFKIA FIQARWHADI VDEARKSFVA ELAAKTGGSV EVEIFDVPGA YEIPLHAKTL 60

ARTGRYAAIV GAAFVIDGGI YDHDFVATAV INGMMQVQLE TEVPVLSVVL TPHHFHESKE 120

HHDFFHAHFK VKGVEAAHAA LQIVSERSRI AALV 154

SEQ ID NO：8a：

MHLEIRAAFL RQRNTALRTE VAELEQEVQR LENEVSQYET RYGPLGGGKL KTSFKIAFIQ 60

ARWHADIVDE ARKSFVAELA AKTGGSVEVE IFDVPGAYEI PLHAKTLART GRYAAIVGAA 120

FVIDGGIYDH DFVATAVING MMQVQLETEV PVLSVVLTPH HFHESKEHHD FFHAHFKVKG 180

VEAAHAALQI VSERSRIAAL V 201

SEQ ID NO：9a：

MHNAGYAGGK FKHPFSSFDK EDNEQVSGSL KTSFKIAFIQ ARWHADIVDE ARKSFVAELA 60

AKTGGSVEVE IFDVPGAYEI PLHAKTLART GRYAAIVGAA FVIDGGIYDH DFVATAVING 120

MMQVQLETEV PVLSVVLTPH HFHESKEHHD FFHAHFKVKG VEAAHAALQI VSERSRIAAL 180

V 181

SEQ ID NO：10a：

MHAPMSTPSA TSVRGSLKTS FKIAFIQARW HADIVDEARK SFVAELAAKT GGSVEVEIFD 60

VPGAYEIPLH AKTLARTGRY AAIVGAAFVI DGGIYDHDFV ATAVINGMMQ VQLETEVPVL 120

SVVLTPHHFH ESKEHHDFFH AHFKVKGVEA AHAALQIVSE RSRIAALV 168

SEQ ID NO：11a：

MHENLNKSEI SQVFEIALKR NLPVNFEVAR ESGPPHMKNF VTRVSVGEFV GEGEGKSKKI 60

SKKNAARAVL EQLRRLPLKT SFKIAFIQAR WHADIVDEAR KSFVAELAAK TGGSVEVEIF 120

DVPGAYEIPL HAKTLARTGR YAAIVGAAFV IDGGIYDHDF VATAVINGMM QVQLETEVPV 180

LSVVLTPHHF HESKEHHDFF HAHFKVKGVE AAHAALQIVS ERSRIAALV 229

SEQ ID NO：1b：

atgcatagca accaaagctg tccgcttaag acatccttta aaatcgcatt cattcaggcc 60

cgctggcacg ccgacatcgt tgacgaagcg cgcaaaagct ttgtcgccga actggccgca 120

aagacgggtg gcagcgtcga ggtagagata ttcgacgtgc cgggtgcata tgaaattccc 180

cttcacgcca agacattggc cagaaccggg cgctatgcag ccatcgtcgg tgcggccttc 240

gtgatcgacg gcggcatcta tcgtcatgat ttcgtggcga cggccgttat caacggcatg 300

atgcaggtgc agcttgaaac ggaagtgccg gtgctgagcg tcgtgctgac gccgcaccat 360

ttccatgaaa gcaaggagca tcacgacttc ttccatgctc atttcaaggt gaagggcgtg 420

gaagcggccc atgccgcctt gcagatcgtg agcgagcgca gccgcatcgc gcttgtctga 480

SEQ ID NO：2b：

atgcatagca accaaagctg tcttaagaca tcctttaaaa tcgcattcat tcaggcccgc 60

tggcacgccg acatcgttga cgaagcgcgc aaaagctttg tcgccgaact ggccgcaaag 120

acgggtggca gcgtcgaggt agagatattc gacgtgccgg gtgcatatga aattcccctt 180

cacgccaaga cattggccag aaccgggcgc tatgcagcca tcgtcggtgc ggccttcgtg 240

atcgacggcg gcatctatcg tcatgatttc gtggcgacgg ccgttatcaa cggcatgatg 300

caggtgcagc ttgaaacgga agtgccggtg ctgagcgtcg tgctgacgcc gcaccatttc 360

catgaaagca aggagcatca cgacttcttc catgctcatt tcaaggtgaa gggcgtggaa 420

gcggcccatg ccgccttgca gatcgtgagc gagcgcagcc gcatcgcgct tgtctga 477

SEQ ID NO：3b：

atgcatagca accaaagcct taagacatcc tttaaaatcg cattcattca ggcccgctgg 60

cacgccgaca tcgttgacga agcgcgcaaa agctttgtcg ccgaactggc cgcaaagacg 120

ggtggcagcg tcgaggtaga gatattcgac gtgccgggtg catatgaaat tccccttcac 180

gccaagacat tggccagaac cgggcgctat gcagccatcg tcggtgcggc cttcgtgatc 240

gacggcggca tctatcgtca tgatttcgtg gcgacggccg ttatcaacgg catgatgcag 300

gtgcagcttg aaacggaagt gccggtgctg agcgtcgtgc tgacgccgca ccatttccat 360

gaaagcaagg agcatcacga cttcttccat gctcatttca aggtgaaggg cgtggaagcg 420

gcccatgccg ccttgcagat cgtgagcgag cgcagccgca tcgcgcttgt ctga 474

SEQ ID NO：4b：

atgcatagca accaacttaa gacatccttt aaaatcgcat tcattcaggc ccgctggcac 60

gccgacatcg ttgacgaagc gcgcaaaagc tttgtcgccg aactggccgc aaagacgggt 120

ggcagcgtcg aggtagagat attcgacgtg ccgggtgcat atgaaattcc ccttcacgcc 180

aagacattgg ccagaaccgg gcgctatgca gccatcgtcg gtgcggcctt cgtgatcgac 240

ggcggcatct atcgtcatga tttcgtggcg acggccgtta tcaacggcat gatgcaggtg 300

cagcttgaaa cggaagtgcc ggtgctgagc gtcgtgctga cgccgcacca tttccatgaa 360

agcaaggagc atcaegactt cttccatgct catttcaagg tgaagggcgt ggaagcggcc 420

catgccgcct tgcagatcgt gagcgagcgc agccgcatcg cgcttgtctg a 471

SEQ ID NO：5b：

atgcatagca accttaagac atcctttaaa atcgcattca ttcaggcccg ctggcacgcc 60

gacatcgttg acgaagcgcg caaaagcttt gtcgccgaac tggccgcaaa gacgggtggc 120

agcgtcgagg tagagatatt cgacgtgccg ggtgcatatg aaattcccct tcacgccaag 180

acattggcca gaaccgggcg ctatgcagcc atcgtcggtg cggccttcgt gatcgacggc 240

ggcatctatc gtcatgattt cgtggcgacg gccgttatca acggcatgat gcaggtgcag 300

cttgaaacgg aagtgccggt gctgagcgtc gtgctgacgc cgcaccattt ccatgaaagc 360

aaggagcatc acgacttctt ccatgctcat ttcaaggtga agggcgtgga agcggcccat 420

gccgccttgc agatcgtgag cgagcgcagc cgcatcgcgc ttgtctga 468

SEQ ID NO：6b：

atgcatagcc ttaagacatc ctttaaaatc gcattcattc aggcccgctg gcacgccgac 60

atcgttgacg aagcgcgcaa aagctttgtc gccgaactgg ccgcaaagac gggtggcagc 120

gtcgaggtag agatattcga cgtgccgggt gcatatgaaa ttccccttca cgccaagaca 180

ttggccagaa ccgggcgcta tgcagccatc gtcggtgcgg ccttcgtgat cgacggcggc 240

atctatcgtc atgatttcgt ggcgacggcc gttatcaacg gcatgatgca ggtgcagctt 300

gaaacggaag tgccggtgct gagcgtcgtg ctgacgccgc accatttcca tgaaagcaag 360

gagcatcacg acttcttcca tgctcatttc aaggtgaagg gcgtggaagc ggcccatgcc 420

gccttgcaga tcgtgagcga gcgcagccgc atcgcgcttg tctga 465

SEQ ID NO：7b：

atgcatctta agacatcctt taaaatcgca ttcattcagg cccgctggca cgccgacatc 60

gttgacgaag cgcgcaaaag ctttgtcgcc gaactggccg caaagacggg tggcagcgtc 120

gaggtagaga tattcgacgt gccgggtgca tatgaaattc cccttcacgc caagacattg 180

gccagaaccg ggcgctatgc agccatcgtc ggtgcggcct tcgtgatcga cggcggcatc 240

tatcgtcatg atttcgtggc gacggccgtt atcaacggca tgatgcaggt gcagcttgaa 300

acggaagtgc cggtgctgag cgtcgtgctg acgccgcacc atttccatga aagcaaggag 360

catcacgact tcttccatgc tcatttcaag gtgaagggcg tggaagcggc ccatgccgcc 420

ttgcagatcg tgagcgagcg cagccgcatc gcgcttgtct ga 462

SEQ ID NO：8b：

atgcatctgg aaatccgtgc ggcgttcctg cgtcagcgta acaccgcgct gcgtaccgaa 60

gttgcggaac tggaacagga agttcagcgt ctggaaaacg aagtttctca gtacgaaacc 120

cgttacggtc cgctgggtgg tggttctctt aagacatcct ttaaaatcgc attcattcag 180

gcccgctggc acgccgacat cgttgacgaa gcgcgcaaaa gctttgtcgc cgaactggcc 240

gcaaagacgg gtggcagcgt cgaggtagag atattcgacg tgccgggtgc atatgaaatt 300

ccccttcacg ccaagacatt ggccagaacc gggcgctatg cagccatcgt cggtgcggcc 360

ttcgtgatcg acggcggcat ctatcgtcat gatttcgtgg cgacggccgt tatcaacggc 420

atgatgcagg tgcagcttga aacggaagtg ccggtgctga gcgtcgtgct gacgccgcac 480

catttccatg aaagcaagga gcatcacgac ttcttccatg ctcatttcaa ggtgaagggc 540

gtggaagcgg cccatgccgc cttgcagatc gtgagcgagc gcagccgcat cgcgcttgtc 600

tga 603

SEQ ID NO：9b：

atgcataacg ccggttacgc aggcggcaag ttcaagcatc cattttctag ctttgacaag 60

gaagacaacg aacaggtttc cggttcgctt aagacatcct ttaaaatcgc attcattcag 120

gcccgctggc acgccgacat cgttgacgaa gcgcgcaaaa gctttgtcgc cgaactggcc 180

gcaaagacgg gtggcagcgt cgaggtagag atattcgacg tgccgggtgc atatgaaatt 240

ccccttcacg ccaagacatt ggccagaacc gggcgctatg cagccatcgt cggtgcggcc 300

ttcgtgatcg acggcggcat ctatcgtcat gatttcgtgg cgacggccgt tatcaacggc 360

atgatgcagg tgcagcttga aacggaagtg ccggtgctga gcgtcgtgct gacgccgcac 420

catttccatg aaagcaagga gcatcacgac ttcttccatg ctcatttcaa ggtgaagggc 480

gtggaagcgg cccatgccgc cttgcagatc gtgagcgagc gcagccgcat cgcgcttgtc 540

tga 543

SEQ ID NO：10b：

atgcatgccc cgatgagcac gccgagcgcc acgagcgtcc gcggtagcct taagacatcc 60

tttaaaatcg cattcattca ggcccgctgg cacgccgaca tcgttgacga agcgcgcaaa 120

agctttgtcg ccgaactggc cgcaaagacg ggtggcagcg tcgaggtaga gatattcgac 180

gtgccgggtg catatgaaat tccccttcac gccaagacat tggccagaac cgggcgctat 240

gcagccatcg tcggtgcggc cttcgtgatc gacggcggca tctatcgtca tgatttcgtg 300

gcgacggccg ttatcaacgg catgatgcag gtgcagcttg aaacggaagt gccggtgctg 360

agcgtcgtgc tgacgccgca ccatttccat gaaagcaagg agcatcacga cttcttccat 420

gctcatttca aggtgaaggg cgtggaagcg gcccatgccg ccttgcagat cgtgagcgag 480

cgcagccgca tcgcgcttgt ctga 504

SEQ ID NO：11b：

atgcatgaaa acctcaataa atcggaaata agccaagtgt ttgaaattgc gctgaagcgg 60

aatttgcctg tgaattttga ggtggcccgg gagagtggcc caccacacat gaagaacttt 120

gtgaccaggg tttcagttgg ggaatttgta ggggaaggag aagggaaaag caagaagatc 180

tccaagaaga atgcggccag ggctgttctg gagcagctta ggaggctgcc acttaagaca 240

tcctttaaaa tcgcattcat tcaggcccgc tggcacgccg acatcgttga cgaagcgcgc 300

aaaagctttg tcgccgaact ggccgcaaag acgggtggca gcgtcgaggt agagatattc 360

gacgtgccgg gtgcatatga aattcccctt cacgccaaga cattggccag aaccgggcgc 420

tatgcagcca tcgtcggtgc ggccttcgtg atcgacggcg gcatctatcg tcatgatttc 480

gtggcgacgg ccgttatcaa cggcatgatg caggtgcagc ttgaaacgga agtgccggtg 540

ctgagcgtcg tgctgacgcc gcaccatttc catgaaagca aggagcatca cgacttcttc 600

catgctcatt tcaaggtgaa gggcgtggaa gcggcccatg ccgccttgca gatcgtgagc 660

gagcgcagcc gcatcgcgct tgtctga 687

SEQ ID NO：9c：

ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 60

aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 120

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 180

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 240

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 300

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 360

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 420

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 480

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 540

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 600

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 660

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 720

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 780

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 840

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 900

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 960

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1020

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1080

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1140

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1200

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1260

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1320

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1380

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1440

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1500

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1560

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1620

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1680

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 1740

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 1800

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 1860

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 1920

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 1980

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2040

tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 2100

gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 2160

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 2220

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 2280

cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga 2340

tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc 2400

ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg 2460

tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca 2520

cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac 2580

tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg 2640

ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga 2700

acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga 2760

agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc 2820

gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg 2880

tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga 2940

tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg 3000

tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc 3060

cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 3120

acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt 3180

ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt 3240

taggctggta agagccgcga gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg 3300

cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat 3360

aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc 3420

ggccgccatg ccggcgataa tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt 3480

gacgaaggct tgagcgaggg cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat 3540

cgtcgcgctc cagcgaaagc ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg 3600

tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg 3660

cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg 3720

tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3780

gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3840

gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc 3900

ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca 3960

ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat 4020

cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc 4080

gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct 4140

cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt 4200

ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac 4260

gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga 4320

ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg 4380

gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag 4440

caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga 4500

gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca 4560

ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg 4620

cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt 4680

gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc 4740

gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga 4800

caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt 4860

gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt 4920

ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg 4980

ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac 5040

agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg 5100

aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca 5160

cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatctcgatc 5220

ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5280

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg cataacgccg gttacgcagg 5340

cggcaagttc aagcatccat tttctagctt tgacaaggaa gacaacgaac aggtttccgg 5400

ttcgcttaag acatccttta aaatcgcatt cattcaggcc cgctggcacg ccgacatcgt 5460

tgacgaagcg cgcaaaagct ttgtcgccga actggccgca aagacgggtg gcagcgtcga 5520

ggtagagata ttcgacgtgc cgggtgcata tgaaattccc cttcacgcca agacattggc 5580

cagaaccggg cgctatgcag ccatcgtcgg tgcggccttc gtgatcgacg gcggcatcta 5640

tcgtcatgat ttcgtggcga cggccgttat caacggcatg atgcaggtgc agcttgaaac 5700

ggaagtgccg gtgctgagcg tcgtgctgac gccgcaccat ttccatgaaa gcaaggagca 5760

tcacgacttc ttccatgctc atttcaaggt gaagggcgtg gaagcggccc atgccgcctt 5820

gcagatcgtg agcgagcgca gccgcatcgc gcttgtctga gctagcatga ctggtggaca 5880

gcaaatgggt cgcggatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg 5940

ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 6000

ttttgctgaa aggaggaact atatccggat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat 6060

aaccaagcct atgcctacag catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt 6120

gttagatttc atacacggtg cctgactgcg ttagcaattt aactgt 6166

PCT/R0/134表

关于保藏的微生物或其他生物材料的说明

(PCT Rule 13bis)

Form PCT/RO/134(July1998；reprint January 2004)

国际表格

Fundecioa Iosimto Lelolr

Instituto do Investigacioncs

Bioquimicas Buenos Aires 在本页底部标示的国际保藏单位

CONICET

Av.Patricias Argcntinas 435 依据细则10.2出具的存活报告

Buenos Aires(1405)，Argentina

Iodlcate Han dxc of origicel dcposlt or，ufac a ocw dcpsit or a uaostex bx made，Chs and occnt ccicantdate(dnto of the new drpnd or date

of the nensfel

In the ocae trsenf to in Ride 10.2(2)(a)and(iii)，refer to rhco rectnl winlity test

Merk wea a ccoss are rpplieshle box.

Fill to if the infocntion fax boon toqosstod if the rosts of the ocst wcrc ocgitwe.

Form DSMi-BPis(toie page)12/2001

Claims

1.分离的嵌合蛋白，包含与修饰的2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域，其中编码该经修饰蛋白的前8个N-末端残基的核苷酸序列已被改变以允许其被限制性内切酶切割，该酶不切割编码天然存在的2，4-二氧四氢蝶啶合酶蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中编码经修饰蛋白N-末端前8个残基的核苷酸序列包含酶Nsi I和Af1 II的限制性酶切位点。

3.根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白来源于布鲁氏菌属的2，4-二氧四氢蝶啶合酶。

4.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1a。

5.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2a。

6.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3a。

7.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4a。

8.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5a。

9.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6a。

10.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：7a。

11.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：8a。

12.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：9a。

13.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：10a。

14.根据权利要求2的分离的嵌合蛋白，其中经修饰蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：11a。

15.分离的核苷酸序列，包含根据权利要求1至1 4的嵌合和经修饰蛋白的编码序列。

16.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：1b。

17.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：2b。

18.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：3b。

19.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：4b。

20.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：5b。

21.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：6b。

22.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：7b。

23.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：8b。

24.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：9b。

25.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：10b。

26.根据权利要求15的分离的DNA序列，包含SEQ ID NO：11b。

27.用来运载根据权利要求15至26的核苷酸序列的载体。

28.根据权利要求27的载体，其中该载体是病毒性的。

29.根据权利要求27的载体，其中该载体是质粒性的。

30.SEQ ID NO：9c的质粒。

31.质粒pBLS-OMP 31，保藏号DSM 15546。

32.用根据权利要求2 7至31的载体转化的细胞。

33.根据权利要求32转化的真核细胞。

34.根据权利要求32转化的原核细胞。

35.根据权利要求34转化的大肠杆菌细胞。

36.根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是同源的。

37.根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是异源的。

38.根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是抗原、毒素、物质或其片段，能够在真核生物中诱导免疫反应。

39.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是细菌来源的抗原、毒素、物质或其片段。

40.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是病毒来源的抗原、毒素、物质或其片段。

41.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是寄生虫来源的抗原、毒素、物质或其片段。

42.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中该抗原是BLS-OMP31或其片段。

43.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中该抗原是BLS-KETc1或其片段。

44.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中该抗原是BLS-RD3或其片段。

45.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是体液的。

46.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是细胞的。

47.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中真核生物包括鸟、鱼或哺乳动物样本。

48.根据权利要求47的分离的嵌合蛋白，其中真核生物是哺乳动物样本。

49.根据权利要求47的分离的嵌合蛋白，其中哺乳动物样本包括鼠、兔或人样本。

50.根据权利要求49的分离的嵌合蛋白，其中哺乳动物样本是人。

51.根据权利要求38的分离的嵌合蛋白，其中连接的肽、多肽或蛋白结构域是在体外或体内诱导免疫反应的抗原、毒素、物质或其片段。

52.根据权利要求51的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是在体外引发的。

53.根据权利要求51的分离的嵌合蛋白，其中免疫反应是在体内引发的。

54.根据权利要求1的两种或多种分离的嵌合蛋白的组合，其中与每个经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域是不同的。

55.根据权利要求1的两种或多种分离的嵌合蛋白的组合，其中与每个经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域是相同的。

56.根据权利要求15的两种或多种分离的核苷酸序列的组合，其中编码与经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域的核苷酸序列是不同的。

57.根据权利要求15的两种或多种分离的核苷酸序列的组合，其中编码与经修饰蛋白连接的肽、多肽或蛋白结构域的核苷酸序列是相同的。

58.根据权利要求1的一种或多种分离的嵌合蛋白和根据权利要求15的一种或多种分离的核苷酸序列的组合。

59.一种药物化合物，包含至少一种根据权利要求1至14的分离的嵌合蛋白。

60.根据权利要求59的药物化合物，包含药物可接受赋形剂。

61.根据权利要求60的药物化合物，其中药物可接受赋形剂是佐剂。

62.根据权利要求61的药物化合物，其中佐剂包括弗氏佐剂、MDP二肽或皂苷。

63.根据权利要求61的药物化合物，其中佐剂包括酪氨酸硬脂酸盐、氢氧化铝、淋巴细胞因子、布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白或布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。

64.根据权利要求63的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白。

65.根据权利要求63的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。

66.一种药物化合物，包含至少一种根据权利要求15至26的分离的核苷酸序列。

67.根据权利要求66的药物化合物，包含药物可接受赋形剂。

68.根据权利要求67的药物化合物，其中药物可接受赋形剂是佐剂。

69.根据权利要求68的药物化合物，其中佐剂包括弗氏佐剂、MDP二肽或皂苷。

70.根据权利要求68的药物化合物，其中佐剂包括酪氨酸硬脂酸盐、氢氧化铝、淋巴细胞因子、布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白或布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。

71.根据权利要求70的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白。

72.根据权利要求70的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。

73.一种药物化合物，包含至少一种根据权利要求1至14的分离的嵌合蛋白和至少一个根据权利要求15至26的分离的核苷酸序列。

74.根据权利要求73的药物化合物，包含药物可接受赋形剂。

75.根据权利要求74的药物化合物，其中药物可接受赋形剂是佐剂。

76.根据权利要求75的药物化合物，其中佐剂包括弗氏佐剂、MDP二肽或皂苷。

77.根据权利要求75的药物化合物，其中佐剂包括酪氨酸硬脂酸盐、氢氧化铝、淋巴细胞因子、布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白或布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。

78.根据权利要求77的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的天然蛋白。

79.根据权利要求77的药物化合物，其中佐剂是布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白。

80.一种在真核生物中诱导免疫反应的方法，包括给该生物施用有效量的根据权利要求59、66或73制备的药物化合物。

81.根据权利要求80的方法，其中免疫反应是体液的。

82.根据权利要求80的方法，其中免疫反应是细胞的。

83.根据权利要求80的方法，其中药物化合物是同时给予的。

84.根据权利要求80的方法，其中药物化合物是顺序给予的。

85.根据权利要求80的方法，其中真核生物包括鸟、鱼或哺乳动物样本。

86.根据权利要求85的方法，其中真核生物是哺乳动物样本。

87.根据权利要求86的方法，其中哺乳动物样本包括鼠、兔或人样本。

88.根据权利要求87的方法，其中哺乳动物样本是人。

89.根据权利要求80的方法，其中药物化合物通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、经口或鼻途径或通过无针注射系统给予。

90.根据权利要求89的方法，其中药物化合物通过皮下、腹膜内或肌内途径给予。

91.单克隆和多克隆抗体，其中该抗体与由根据权利要求15的核苷酸序列所编码的肽、多肽和蛋白结构域或其片段起反应。

92.单克隆和多克隆抗体，其中该抗体与包含根据权利要求1的氨基酸序列或其片段的肽、多肽和蛋白结构域或其片段起反应。

93.包含根据权利要求91和92的单克隆和多克隆抗体的药物化合物。

94.表达根据权利要求91和92的单克隆抗体的杂交瘤。

95.一种生物传感器，包括：(a)基底，其固定了至少一种根据权利要求1的分离的嵌合蛋白和(b)所述基底与能够测定配体是否附着于分离的嵌合蛋白或与其起反应的测量单元连接。

96.根据权利要求95的生物传感器，其中配体是抗体。

97.蛋白缀合物，包含与肽、多肽或蛋白结构域连接的配体，该肽、多肽或蛋白结构域与根据权利要求1的布鲁氏菌属2，4-二氧四氢蝶啶合酶的经修饰蛋白连接。

98.根据权利要求97的蛋白缀合物，其中连接是共价键。

99.根据权利要求98的蛋白缀合物，其中共价键是肽键。

100.根据权利要求97的蛋白缀合物，其中连接是非共价的。

101.根据权利要求97的蛋白缀合物，其中配体和嵌合蛋白通过异源二聚体结构域的连接序列而连接。

102.根据权利要求101的蛋白缀合物，其中异源二聚体结构域的连接序列编码亮氨酸拉链。

103.根据权利要求1的分离的嵌合蛋白，其中它们的四级结构是五聚二聚体。