CN110922488A - 一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒及制备方法和应用 - Google Patents

一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒的及制备方法和应用。本发明将EB病毒的gp350蛋白和与二氧四氢蝶啶合成酶融合表达，通过自组装形成纳米颗粒，并且EB病毒的gp350蛋白展示在纳米颗粒表面，该纳米颗粒可以显著提高EB病毒gp350蛋白的免疫原性，具有成为EB病毒预防性疫苗的潜力，对于EB病毒感染相关疾病的预防和控制具有重要的现实和理论意义及应用前景。

Description

一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒的及制备方法和应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)又名人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus4，HHV-4)，是疱疹病毒科γ亚科中唯一能引起人类感染的病毒，也是第一个被发现的肿瘤病毒。EBV感染与多种人类的恶性肿瘤的发生有密切的关系，如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤等，研究发现平滑肌瘤、肝肉瘤、胸腺癌和胆管癌也能检测到EBV。因此，研发EBV疫苗具有极其重要意义。
EBV疫苗的研究主要集中在EBV的糖蛋白，包括gp350/220，gp85，gp25等。EB病毒gp350是EBV外膜蛋白中含量最高的蛋白，也是EBV的主要表面抗原，在EBV侵入CD21阳性细胞(如B淋巴细胞)时起着重要的作用。EBV通过gp350与B淋巴细胞表面受体CD21相互作用介导EBV进入细胞内。许多研究成果已经证明gp350可作为潜在的预防EBV的疫苗。
由于EBV潜在的致癌特性，灭活或减毒疫苗是不可行的。而且基于从该病毒分离的单一抗原具有较低的免疫原性，因此如何得到高免疫原性的EBV疫苗成为目前的研究重点。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒的制备及其应用。
因此，本发明的目的之一在于提供一种融合蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的又一目的在于提供一种包含上述核苷酸序列的重组载体。
本发明的又一目的在于提供一种转化上述重组载体的转化体。
本发明的又一目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法。
本发明的又一目的在于提供上述融合蛋白的用途。
本发明的又一目的在于提供一种疫苗组合物。
本发明所采用的技术方案如下文所述。
本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括抗原肽和载体蛋白，其中，所述抗原肽为EB病毒的gp350蛋白。优选地，所述抗原肽展示在所述载体蛋白表面。
EB病毒gp350是EBV的主要表面抗原，将其与载体蛋白融合，可以显著提高抗原肽的免疫原性。
进一步地，所述抗原肽通过连接肽与所述载体蛋白的N端连接形成融合蛋白。
抗原肽与所述载体蛋白的N端连接形成的融合蛋白在表达后可以时抗原肽展示在载体蛋白的表面，从而增强其免疫原性。而抗原肽与所述载体蛋白的C端连接形成的融合蛋白在表达后会将抗原肽包在所述载体蛋白内部，使抗原决定簇不能很好的暴露，导致刺激免疫反应减弱。
进一步地，所述连接肽自身不会影响被所连接蛋白各自的功能，可以为本领域经常使用的任何连接氨基酸链。
更进一步地，所述连接肽的氨基酸序列可以为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6)。
进一步地，所述抗原肽为为EB病毒gp350蛋白的胞外结构域，或为EB病毒gp350蛋白的胞外第1、2和3结构域；优选地，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQID NO:2所示。
SEQ ID NO:1为EB病毒gp350的胞外域N端的前三个结构域(第1、2和3段结构域)的氨基酸序列。SEQ ID NO:2为EB病毒gp350的胞外域的全长氨基酸序列。
进一步地，所述载体蛋白为自组装纳米颗粒蛋白；优选地，所述载体蛋白为二氧四氢蝶啶合成酶；更优选地，所述载体蛋白为来自风产液菌(Aquifex aeolicus)的二氧四氢蝶啶合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
如SEQ ID NO:3所示的载体蛋白为来自嗜热细菌风产液菌(Aquifex aeolicus)的二氧四氢蝶啶合成酶(Lumazine synthase，LS)二十面体自组装纳米颗粒的全长氨基酸序列。更进一步地，所述载体蛋白为来自风产液菌(Aquifex aeolicus)的的二十面体结构蛋白。
自组装纳米颗粒蛋白能够在细胞内自发装配成三维有序结构，来自风产液菌(Aquifex aeolicus)的二氧四氢蝶啶合成酶能形成复合物和非常稳定的聚合结构，经过发明人的大量实验研究发现其作为EB病毒gp350的载体显著提高了其免疫原性。
进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:4为EB病毒gp350的胞外域N端的前三个结构域的氨基酸通过一段连接肽[(G4S)3]融合在风产液菌(Aquifex aeolicus)的二氧四氢蝶啶合成酶(Lumazinesynthase，LS)二十面体自组装纳米颗粒的N端的氨基酸序列。SEQ ID NO:5为EB病毒gp350胞外域的全长氨基酸通过一段连接肽[(G4S)3]融合在风产液菌(Aquifex aeolicus)的二氧四氢蝶啶合成酶(Lumazine synthase，LS)二十面体自组装纳米颗粒的N端的氨基酸序列。
本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如上所述的融合蛋白。
本发明还提供一种重组载体，所述重组载体编码如上所述的核苷酸序列。
本发明还提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒由如上所述的融合蛋白自组装得到，所述抗原肽展示在所述纳米颗粒的表面上。
本发明还提供一种使用如上所述的核苷酸序列或如上所述的重组载体转化的转化体。
进一步地，所述转化体可以为真核细胞或原核细胞。
进一步地，所述转化体可以为大肠杆菌、酵母、来源于昆虫及哺乳动物的真核细胞株。
进一步地，所述真核细胞株可以为BHK-21、CHO、293F、293T、Vero或SF9细胞。
本发明还提供如上所述的融合蛋白在制备治疗或预防与EB病毒相关疾病的药物中的用途。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的融合蛋白。
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步地，所述药物组合物为疫苗组合物。
本发明还提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括如上所述的融合蛋白。
进一步地，所述疫苗组合物还包括免疫学上可接受的载体和/或辅料。
进一步地，所述疫苗组合物还包括佐剂。
进一步地，所述佐剂可以选自角鲨烷和角鲨烯(或其他动物源性油)；嵌段共聚物；清洁剂如吐温80；Quil，矿物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；棒状杆菌衍生佐剂，如短棒状杆菌，牛分枝杆菌(卡介苗，卡介苗或卡介苗)；白细胞介素如白细胞介素-2和白细胞介素12；单核细胞介素如白细胞介素1，肿瘤坏死因子；干扰素如γ干扰；表面活性物质如十六烷胺，十八烷胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂和多元醇；油乳剂；和矿物质如磷酸铝，氢氧化铝或明矾凝胶中的一种或多种。
进一步地，所述佐剂还可以选自Imject Al、Innovax-4和MF59中的一种或多种。
进一步地，所述疫苗组合物的剂型可以为皮下注射剂型。
本发明还提供一种如上所述的融合蛋白的制备方法，包括将所述抗原肽的编码序列通过连接肽连接在所述载体蛋白的编码序列的N端，并通过蛋白表达系统进行表达的步骤。
进一步地，所述蛋白表达系统为原核表达系统或真核表达系统。
本发明首次研究发现将EB病毒gp350融合在二十面体自组装纳米颗粒(即来自风产液菌的二氧四氢蝶啶合成酶)N端，在昆虫细胞表达和纯化，将其制成纳米颗粒疫苗并对小鼠和食蟹猴皮下免疫，实验结果表明免疫纳米颗粒疫苗的血清总抗滴度和血清的体外中和阻断效率均显著高于佐剂、纳米颗粒单体以及EB病毒gp350对照组，因此具有成为EB病毒预防性疫苗的潜力，对于EB病毒感染相关疾病的预防和控制具有重要的现实和理论意义及应用前景。
附图说明
图1示出了本发明的融合蛋白的连接示意图。
图2示出了重组的纳米颗粒蛋白的SDS-PAGE图。
图3示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫共沉淀的SDS-PAGE图。
图4示出了重组的纳米颗粒蛋白的斑点印迹(Dot blotting)图。
图5示出了重组的纳米颗粒蛋白的ELISA分析结果图。
图6示出了重组的纳米颗粒蛋白的透射电镜负染结果图。
图7示出了重组的纳米颗粒蛋白的水合粒径大小和分布。
图8示出了重组的纳米颗粒蛋白的热稳定性。
图9示出了重组的纳米颗粒蛋白对BALB/C小鼠的免疫原性；其中，图9A示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫BALB/C小鼠的程序；图9B示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum佐剂混合免疫小鼠收集的血清的抗体滴度；图9C示出了重组的纳米颗粒蛋白和MF59佐剂混合免疫小鼠收集的血清的抗体滴度；图9D示出了重组的纳米颗粒蛋白和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠收集的血清的抗体滴度。
图10示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫BALB/C小鼠诱导了高的IgM和IgG。
图11示出了免疫后BALB/C小鼠的血清在细胞水平阻断EB病毒感染的效率；其中，图11A示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum、MF59和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠第二周收集的血清阻断EB病毒的感染效率；图11B示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum、MF59和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠第五周收集的血清阻断EB病毒的感染效率；图11C示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum、MF59和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠第八周收集的血清阻断EB病毒的感染效率。
图12示出了重组的纳米颗粒蛋白对食蟹猴的免疫原性；其中，图12A示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫食蟹猴的程序；图12B示出了重组的纳米颗粒蛋白和MF佐剂混合免疫食蟹猴收集的血清的抗体滴度。
图13示出了免疫后食蟹猴的血清在细胞水平阻断EB病毒感染的效率。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1.重组载体的构建及蛋白的表达
1、实验材料
(1)载体与构建重组载体所需菌株：供体载体pFastBacDual，大肠杆菌表达载体PET-28a+，大肠杆菌感受态DH5a、Rossita和Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的携带Bacmid含有父本杆粒bMON14272、辅助质粒pMON7124的DH10BAC菌株。
(2)杆状病毒包装和蛋白表达细胞株：昆虫sf9细胞和HighFive细胞。
(3)试剂与耗材：PCR酶和重组酶(购自诺唯赞有限公司)，内切酶(购自NEB)，细胞转染试剂Cellfectin II、昆虫细胞培养基SF 900III SFM(购自Thermo Scientific)，组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(购自GE公司)，其他常规试剂和耗材均商品化。
(4)基因：风产液菌的二氧四氢蝶啶合成酶(以下简称LS)和EB病毒(M81毒株)的gp350基因都通过南京金斯瑞生物有限公司OptimumGeneTM密码子平台优化和合成。
2、步骤
(1)通过PCR扩增、酶切重组方法分别将EB病毒(M81毒株)gp350基因胞外域第1、2和3段gp350D123(SEQ ID NO:1)和胞外域全长gp350Ectodomain(SEQ ID NO:2)连接在供体载体pFastBacDual。
gp350D123和gp350Ectodomain分别通过一段连接肽(SEQ ID NO:6)连接在LS基因(SEQ ID NO:3)的N端，同时在EB病毒(M81毒株)gp350基因的N端连接一段分泌蛋白的信号肽(gp64)基因(其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)，然后连接至供体载体pFastBacDual。对于单个LS基因，连接在原核表达载体PET28a+。
如图1所示，为本发明的融合蛋白的连接示意图。本实施例按照该设计思路一共构建了如下5个重组载体：pFastBacDual-gp350D123、pFastBacDual-gp350Ectodomain、pFastBacDual-gp350D123-LS、pFastBacDual-gp350Ectodomain-LS和PET-28a-LS。
(2)将得到的重组载体pFastBacDual-gp350D123、pFastBacDual-gp350Ectodomain、pFastBacDual-gp350D123-LS和pFastBacDual-gp350Ectodomain-LS分别转入DH10BAC感受态细胞中，同时通过蓝白斑筛选和菌液PCR鉴定阳性克隆，并提取重组bacmid杆粒。
将重组bacmid杆粒转染进入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的包装细胞系sf9细胞，通过Western blotting和Dot blotting检测重组蛋白是否表达，同时收获病毒液进行蚀斑纯化病毒。
用纯化的病毒(P1代)感染sf9细胞，进行两轮扩增，得到P2代和P3代病毒。
将P3代杆状病毒感染HighFive细胞，在感染后72h收集细胞上清，离心取上清并于0.22μm过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白，即重组的纳米颗粒蛋白。
(3)将重组载体PET-28a-LS转化至大肠杆菌感受态Rossita中，抗性筛选阳性克隆和在37℃扩大培养目的细菌之后，在18℃加入0.2mM化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，经过20h诱导，收集菌体，高压破碎，离心取上清和0.22μm过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白，即重组的纳米颗粒蛋白。
(4)将上述表达纯化后的纳米颗粒蛋白分别浓缩至浓度为20mg/mL，同时改变蛋白保存缓冲液为1M NaCl，50mM HEPES，PH7.5的高盐高蛋白浓度中，放置37℃恒温培养箱中组装5天，随后通过分子筛纯化得到高纯度目的蛋白。
3、结果
如图2所示，为重组的纳米颗粒蛋白的SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色的结果。可以看出，重组载体全部构建成功，能得到高纯度目的蛋白。
实施例2.体外检测重组的纳米颗粒蛋白的免疫源性
1、实验材料
(1)试剂与耗材：蛋白A、蛋白G、ELISA板、EL-TMB显色试剂盒等均为商品化常用试剂与耗材。
(2)抗体：EB病毒gp350鼠源特异性抗体2L10为商品化抗体(MERCK,目录货号：MAB8183)；EB病毒gp350鼠源特异性抗体72A1为ATCC库中杂交瘤细胞株HB168分泌；EB病毒gp350人源化抗体S54为通过酵母展示库制备的单抗。羊抗鼠和羊抗人IgG H&L为商品化抗体。
2、实验步骤
2.1免疫沉淀(IP)
(1)将实施例1制备得到的EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)和含有EB病毒gp350的融合蛋白(gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS)各5μg分别与5μg鼠源抗体(72A1)和2L10和人源化抗体(S54)在常温摇晃孵育1h，加入30μl蛋白A/G beads，4℃缓慢摇晃孵育过夜。
(2)免疫沉淀反应后，将蛋白A/G-珠以3,000g速度在4℃离心3min至管底，小心吸去上清，蛋白A/G-珠用1ml PBS溶液洗3次；最后加入30μL的2×SDS加样缓冲液，沸水煮7分钟；
(3)将得到的样品进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色。
2.2Dot bloting
(1)稀释EB病毒gp350单体蛋白和含有EB病毒gp350的融合蛋白浓度为0.25mg/mL，然后以5倍为倍比稀释5个梯度至5-5，将2μL蛋白样品分别加入到1cm*1cm的硝酸纤维素膜上，室温风干。
(2)5％的脱脂奶室温封闭硝酸纤维素膜1h，然后与鼠源抗体(72A1和2L10)和人源化抗体(S54)4℃孵育过夜，然后分别与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(Proteintech，货号：SA00001-1)、羊抗人二抗(Proteintech，货号：SA00001-17)孵育，最后通过辣根过氧化物酶的底物进行显色。
2.3ELISA
(1)将EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)和含有EB病毒gp350的融合蛋白(gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS)、单体颗粒LS以及对照组BSA分别包被ELISA板，每孔包被量为100ng，总体积为100μL，4℃包被过夜，随后进行4℃封闭处理。
(2)配置2μg/mL鼠源抗体(72A1和2L10)和人源化抗体(S54)，并对抗体以5倍为倍比稀释5个梯度至5-7，共8个梯度。将稀释好的抗体溶液以100μL/孔加入到已经封闭好的ELISA板中，然后分别加入鼠源和人源HRP标记二抗显色，测定OD450和OD630的吸光值，绘制抗原和抗体的亲和曲线。
3、结果
(1)如图3所示，为重组纳米颗粒蛋白免疫共沉淀的SDS-PAGE分析结果。IP结果表明EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)和含有EB病毒gp350的融合蛋白(gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS)与鼠源抗体(72A1和2L10)和人源化抗体(S54)都具有非常相似的免疫原性。
(2)如图4所示，为重组纳米颗粒蛋白的Dot blotting结果，结果表明EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)具有相似的的免疫反应，然后含有EB病毒gp350的融合蛋白(gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS)相对于EB病毒gp350单体蛋白和鼠源抗体(72A1和2L10)和人源化抗体(S54)具有更强的免疫反应。
(3)如图5所示，为重组纳米颗粒蛋白的ELISA结果。如表1所示，为重组纳米颗粒蛋白与EBV gp350特异性抗体结合EC50值。从图5和表1的结果可以看出，EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)和含有EB病毒gp350的融合蛋白(gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS)与鼠源抗体(72A1和2L10)和人源化抗体(S54)都具有非常相似的免疫原性。
表1重组纳米颗粒蛋白与EBV gp350特异性抗体结合EC50值(μg/ml)
Figure BDA0002266210410000051
实施例3重组纳米颗粒蛋白的表征
1、实验材料
(1)试剂与耗材：均为商品化常用试剂与耗材。
(2)仪器设备：120KV透射电镜(FEI，USA)和Zetasizer Ultra(Malvern,UK)。
2、实验步骤
2.1负染透射电镜
(1)稀释重组纳米颗粒蛋白浓度为0.02-0.2mg/mL，将蛋白孵育在碳涂层铜网格上，然后与2％乙酸铀孵育染色2min，风干。。
(2)染色后进行透射电镜观察颗粒的大小和形态。
2.2通过Zetasizer Ultra检测颗粒的粒径
(1)稀释重组纳米颗粒蛋白浓度为0.5mg/mL，加入200μL样品至12mm方形聚笨乙烯样品池，静置5min。
(2)使用马尔文公司Zetasizer Ultra仪器检测纳米颗粒的粒径。
3、实验结果
如图6所示，为重组纳米颗粒蛋白的透射电镜图，结果表明所有重组纳米颗粒蛋白均形成了均一的颗粒，其中LS、gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS粒径大小大约分别为14nm、26nm和32nm；如图7所示，为重组纳米颗粒蛋白的水合粒径的大小和分布。动态光散射结果表明，重组纳米颗粒蛋白由于外面包着一层水，使重组纳米颗粒蛋白的水合半径相对于透射电镜结果于轻微增大。
实施例4重组纳米颗粒蛋白的热稳定性
1、实验材料
(1)试剂与耗材：均为商品化常用试剂与耗材。
(2)仪器：MICROCAL PEAQ-DSC
2、实验步骤
(1)稀释EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)浓度为0.5mg/mL，稀释含有EB病毒gp350的融合蛋白与单体蛋白LS浓度为2.0mg/mL。
(2)加入250μL目的蛋白和蛋白缓冲液于样品池，然后在大于30的大气压下以1℃/min扫描速率进行扫描。
(3)经过缓冲液校正、归一化和基线减除后得到目的蛋白的Tm值和△H值。
3、实验结果
如图8所示，为重组纳米颗粒蛋白的热稳定性图。可以看出，LS单体蛋白Tm值大于100℃，证明颗粒非常稳定。对于EB病毒gp350(gp350D123和gp350Ectodomain)，它们的Tm相近。对于gp350D123-LS纳米颗粒，它具有三种Tm值，分别为54.82℃，91.72℃和102.26℃，表明这种纳米颗粒蛋白具有gp350D123和LS两种蛋白的物理特性。对于gp350Ectodomain-LS纳米颗粒，它也具有两种Tm值，分别为50.27℃和105.64℃，表明该纳米颗粒具有更好的热稳定。
实施例5重组纳米颗粒蛋白对BALB/C小鼠的免疫原性
1、实验材料
(1)小鼠：雌性6～8周的BalB/C小鼠。
(2)佐剂：商品化Imject Al佐剂(Thermo Scientific)、Innovax-4(厦门万泰生物有限公司)和MF59佐剂{0.5％(v/v)Tween 80，0.5％(v/v)Span 85，4.3％(v/v)Squalene，10nM Na–Citrate buffer}。
(3)其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。
2、实验步骤
(1)将10μg的EB病毒gp350单体蛋白(gp350D123和gp350Ectodomain)、含有EB病毒gp350的融合蛋白(gp350D123-LS和gp350Ectodomain-LS)和单体蛋白LS分别与上述3种佐剂等体积混合，经皮下免疫的方式免疫小鼠。
(2)在免疫之后第三周和第六周，分别再加强免疫，在免疫之后第2、5、8、11、14、20、25和第30周采集小鼠眼眶血分离收集血清，通过间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清gp350的总抗滴度,。
(3)利用间接酶联免疫吸附试验检测免疫之后第八周小鼠血清的IgA、IgM、IgG1IgG2a、IgG2b和IgG3抗体滴度。
3、实验结果
图9示出了重组的纳米颗粒蛋白对BALB/C小鼠的免疫原性；其中，图9A示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫BALB/C小鼠的程序；图9B示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum佐剂混合免疫小鼠收集的血清的抗体滴度；图9C示出了重组的纳米颗粒蛋白和MF59佐剂混合免疫小鼠收集的血清的抗体滴度；图9D示出了重组的纳米颗粒蛋白和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠收集的血清的抗体滴度。结果表明：使用Imject Al佐剂与gp350D123-LS混合免疫小鼠的总抗滴度相对于gp350D123和gp350Ectodomain大于1.5-3.5Log值，然而免疫gp350Ectodomain-LS颗粒的总抗滴度轻微大于免疫gp350D123和gp350Ectodomain。同样地，使用MF59和Innovax-4两种佐剂，如图9C和9D所示，免疫gp350D123-LS纳米颗粒的总抗滴度更加高，表明gp350D123-LS在小鼠体内的免疫源性更好。为了调查含有EB病毒gp350的融合蛋白在BABL/C小鼠的免疫源性的持续性，我们在免疫三次之后，采集了第11、14、20、25和30周的血并分离血清检测gp350总抗滴度，如图9E所示，gp350D123-LS颗粒免疫小鼠的总抗滴度仍然要高于gp350D123和gp350Ectodomain免疫组，并且持续时间更长。
为了探究免疫原哪种IgA、IgM和IgG亚型抗体占据主导作用，我们检测了第八周血清的IgA、IgM和IgG亚型滴度。图10示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫BALB/C小鼠诱导了高的IgM和IgG。研究发现IgG占主要作用，同时IgG1滴度最高，并且IgG1/IgG2a比值大于1，表明纳米粒子疫苗免疫小鼠引起体液免疫大于细胞免疫，同时结果表明gp350D123-LS的纳米颗粒蛋白产生的IgA、IgM滴度和gp350蛋白相似，然而诱导的IgG亚型滴度相对于gp350蛋白更高。
实施例6小鼠免疫血清对病毒感染效率的影响
1、实验材料
(1)试剂与耗材：均为商品化常用试剂与耗材。
(2)细胞株：CNE2-EBV，AKATA-neg。
(3)病毒：CNE2-EBV-GFP由细胞株CNE2-EBV诱导产生。
2、实验步骤
(1)利用化学诱导剂佛波酯和丁酸钠诱导细胞株CNE2-EBV生产EB病毒CNE2-EBV-GFP；
(2)将第2、5、8周采集的小鼠血清以10倍和50倍稀释，然后与预先稀释好的(30倍稀释)EB病毒混匀，置于37度孵育2小时；
(3)然后将血清与病毒的混合物加入到被感染的细胞AKATA-neg(10000个)中，置于37℃二氧化碳培养箱孵育3小时；
(4)3小时后将细胞离心去除病毒和血清上清，然后用完全培养基重悬后转移到96孔板中培养，48小时后利用流式细胞仪检测病毒的感染效率；定义所检测到的GFP阳性细胞数占总检测细胞数的比例为病毒的感染效率。
3、实验结果
图11示出了免疫后BALB/C小鼠的血清在细胞水平阻断EB病毒感染的效率；其中，图11A示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum、MF59和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠第二周收集的血清阻断EB病毒的感染效率；图11B示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum、MF59和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠第五周收集的血清阻断EB病毒的感染效率；图11C示出了重组的纳米颗粒蛋白和Alum、MF59和Innovax-4佐剂混合免疫小鼠第八周收集的血清阻断EB病毒的感染效率。结果表明gp350D123-LS的纳米颗粒蛋白与Imject Al佐剂、Innovax-4和MF59佐剂混合之后免疫小鼠在第2、5和8周采集的血清能够非常好地在细胞水平阻断EB病毒感染，并且阻断效率都在95％以上，有希望能够作为EB病毒候选疫苗之一。
实施例7重组纳米颗粒蛋白对食蟹猴的免疫原性
1、实验材料
(1)食蟹猴：5只EB病毒阴性断奶雄猴和1只EB病毒阴性断奶雌猴。
(2)佐剂：MF59佐剂{0.5％(v/v)Tween 80，0.5％(v/v)Span 85，4.3％(v/v)Squalene,10nM Na–Citrate buffer}。
(3)其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。
2、实验步骤
(1)将50μg gp350D123和25μg gp350D123-LS分别与MF59佐剂等体积混合，经肌肉免疫的方式免疫食蟹猴，免疫等体积MF59佐剂作为对照，每组2只食蟹猴。
(2)在免疫之后第4周、第12周和16周，分别再加强免疫，在免疫之后每周采集食蟹猴静脉血，分离和收集血清，通过间接酶联免疫吸附试验检测食蟹猴血清gp350的总抗滴度。同时在免疫之后第19周接种EB病毒，观察食蟹猴能否感染EB病毒。
(3)对免疫之后每周采集的血清检测对EB病毒感染效率的影响
3、实验结果
图12示出了重组的纳米颗粒蛋白对食蟹猴的免疫原性；其中，图12A示出了重组的纳米颗粒蛋白免疫食蟹猴的程序；图12B示出了重组的纳米颗粒蛋白和MF佐剂混合免疫食蟹猴收集的血清的抗体滴度。可以看出，使用MF佐剂与gp350D123-LS颗粒混合免疫小鼠的总抗滴度相对于gp350D123大于0.5-2.0Log值。
图13示出了免疫后食蟹猴的血清在细胞水平阻断EB病毒感染的效率。表明：gp350D123-LS的纳米颗粒蛋白与MF59佐剂混合之后免疫食蟹猴在每周采集的血清能够非常好地在细胞水平阻断EB病毒感染。另外我们观察到接种EB病毒之后，6只食蟹猴gp350总抗滴度升高，MF59对照组升高尤其明显(图12B)，同时我们也观察到接种病毒之后采集的六只食蟹猴的血清都能很好的的阻断EB病毒感染宿主细胞。因此以上结果表明纳米颗粒疫苗有希望能够作为EB病毒候选疫苗之一。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
<120> 一种含EB病毒gp350的自组装纳米颗粒及制备方法和应用
<130> 111
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 425
<212> PRT
<213> EB病毒（Epstein-Barr virus）
<400> 1
Met Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu
20 25 30
Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val
35 40 45
Thr Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gln Leu Asp Leu Asp
50 55 60
Phe Gly Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gln Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ala Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Leu Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro
100 105 110
Ile Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Val
115 120 125
Asp Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala
130 135 140
Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala
165 170 175
Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gln
180 185 190
Asp Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Gln Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp
195 200 205
Ile Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly
210 215 220
Asp Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro
245 250 255
Gly Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser
260 265 270
Arg Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn
275 280 285
Gly Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val
290 295 300
Phe Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gln Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr
305 310 315 320
Asp Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val
325 330 335
Thr Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp
340 345 350
Ala Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala
370 375 380
Ser Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro
385 390 395 400
Lys Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr
405 410 415
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420 425
<210> 2
<211> 808
<212> PRT
<213> EB病毒（Epstein-Barr virus）
<400> 2
Met Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu
20 25 30
Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val
35 40 45
Thr Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gln Leu Asp Leu Asp
50 55 60
Phe Gly Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gln Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ala Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Leu Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro
100 105 110
Ile Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Val
115 120 125
Asp Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala
130 135 140
Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala
165 170 175
Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gln
180 185 190
Asp Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Gln Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp
195 200 205
Ile Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly
210 215 220
Asp Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro
245 250 255
Gly Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser
260 265 270
Arg Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn
275 280 285
Gly Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val
290 295 300
Phe Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gln Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr
305 310 315 320
Asp Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val
325 330 335
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355 360 365
Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala
370 375 380
Ser Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Gly Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly
465 470 475 480
Thr Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Arg Asp
485 490 495
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565 570 575
Thr Ser Pro Gln Ala Asn Ala Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser
580 585 590
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610 615 620
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645 650 655
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675 680 685
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Ser Gln Pro Arg Phe Ser Asn Leu
805
<210> 3
<211> 154
<212> PRT
<213> 风产液菌（Aquifex aeolicus）
<400> 3
Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly Leu Arg Phe Gly
1 5 10 15
Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp Arg Leu Val Glu
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35 40 45
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<210> 4
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
Met Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu
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Asp Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala
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Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala
165 170 175
Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gln
180 185 190
Asp Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Gln Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp
195 200 205
Ile Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly
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Asp Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro
245 250 255
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Arg Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn
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Gly Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val
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Asp Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val
325 330 335
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Ala Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala
370 375 380
Ser Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro
385 390 395 400
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405 410 415
His Lys Val Ile Phe Ser Lys Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
420 425 430
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu
435 440 445
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485 490 495
Trp Glu Ile Pro Val Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile
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Asp Ala Val Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His
515 520 525
Phe Asp Tyr Ile Ala Ser Glu Val Ser Lys Gly Leu Ala Asp Leu Ser
530 535 540
Leu Glu Leu Arg Lys Pro Ile Thr Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr
545 550 555 560
Leu Glu Gln Ala Ile Glu Arg Ala Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly
565 570 575
Trp Glu Ala Ala Leu Ser Ala Ile Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser
580 585 590
Leu Arg
<210> 5
<211> 977
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
Met Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gln Tyr Thr Ile Gln Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu Ile Pro Glu
20 25 30
Phe Pro Phe Tyr Pro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val
35 40 45
Thr Ile Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Gln Leu Asp Leu Asp
50 55 60
Phe Gly Gln Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gln Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ala Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Leu Gly Ala Gly Glu Leu Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys Lys Leu Pro
100 105 110
Ile Asn Val Thr Thr Gly Glu Glu Gln Gln Val Ser Leu Glu Ser Val
115 120 125
Asp Val Tyr Phe Gln Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala
130 135 140
Glu Met Gln Asn Pro Val Tyr Leu Ile Pro Glu Thr Val Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Lys Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn Ile Thr Ala Val Val Arg Ala
165 170 175
Gln Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gln
180 185 190
Asp Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Gln Met Leu Gly Asn Glu Ile Asp
195 200 205
Ile Glu Cys Ile Met Glu Asp Gly Glu Ile Ser Gln Val Leu Pro Gly
210 215 220
Asp Asn Lys Phe Asn Ile Thr Cys Ser Gly Tyr Glu Ser His Val Pro
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ile Leu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro Ile Pro
245 250 255
Gly Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser
260 265 270
Arg Phe Leu Gly Asn Asn Ser Ile Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn
275 280 285
Gly Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys Ile Gln Ser Asn Ile Val
290 295 300
Phe Ser Asp Glu Ile Pro Ala Ser Gln Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr
305 310 315 320
Asp Ile Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val Pro Met Val
325 330 335
Thr Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro Asn Val Thr Val Thr Ala Phe Trp
340 345 350
Ala Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu
355 360 365
Thr Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn Ile Ser Gly Ala Phe Ala
370 375 380
Ser Asn Arg Thr Phe Asp Ile Thr Val Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro
385 390 395 400
Lys Thr Leu Ile Ile Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr
405 410 415
His Lys Val Ile Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro
420 425 430
Thr Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly Leu
435 440 445
Pro Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr
450 455 460
Gly Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly
465 470 475 480
Thr Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Arg Asp
485 490 495
Asn Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Pro Thr Ser Ala
500 505 510
Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Gly Thr Ser Pro Thr Pro Ala Met Thr
515 520 525
Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro
530 535 540
Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro
545 550 555 560
Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Val Gly Glu
565 570 575
Thr Ser Pro Gln Ala Asn Ala Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser
580 585 590
Pro Thr Pro Val Val Thr Ser Pro Pro Lys Asn Ala Thr Ser Asp Val
595 600 605
Thr Thr Gly Gln His Asn Arg Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser
610 615 620
Leu Arg Pro Ser Ser Ile Pro Glu Thr Thr Ser His Met Pro Leu Leu
625 630 635 640
Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn Ile Thr Gln Val Thr Pro
645 650 655
Ala Ser Ile Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro Ala Pro Arg
660 665 670
Pro Gly Thr Thr Ser Gln Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser Ser Thr Ser
675 680 685
Thr Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro Pro Lys Asn
690 695 700
Ala Thr Ser Pro Gln Ala Pro Ser Gly Gln Lys Thr Ala Val Pro Thr
705 710 715 720
Val Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly Gly Lys His
725 730 735
Thr Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr
740 745 750
Gly Asp Asp Ser Thr Thr Pro Arg Pro Arg Tyr Asn Ala Thr Thr Tyr
755 760 765
Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser Lys Leu Arg Pro Arg Trp Thr Phe Thr
770 775 780
Ser Pro Pro Val Thr Thr Ala Gln Ala Thr Val Pro Val Pro Pro Thr
785 790 795 800
Ser Gln Pro Arg Phe Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
805 810 815
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr
820 825 830
Ala Glu Gly Leu Arg Phe Gly Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala
835 840 845
Leu Val Asp Arg Leu Val Glu Gly Ala Ile Asp Ala Ile Val Arg His
850 855 860
Gly Gly Arg Glu Glu Asp Ile Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp
865 870 875 880
Glu Ile Pro Val Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp
885 890 895
Ala Val Ile Ala Ile Gly Val Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe
900 905 910
Asp Tyr Ile Ala Ser Glu Val Ser Lys Gly Leu Ala Asp Leu Ser Leu
915 920 925
Glu Leu Arg Lys Pro Ile Thr Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu
930 935 940
Glu Gln Ala Ile Glu Arg Ala Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp
945 950 955 960
Glu Ala Ala Leu Ser Ala Ile Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu
965 970 975
Arg
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
Ala Thr Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala His Ser Ala Phe Ala
20

Claims (9)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括抗原肽和载体蛋白，其中，所述抗原肽为EB病毒的gp350蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原肽为EB病毒gp350蛋白的胞外结构域，或为EB病毒gp350蛋白的胞外第1、2和3结构域；优选地，所述抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述载体蛋白为自组装纳米颗粒蛋白；优选地，所述载体蛋白为二氧四氢蝶啶合成酶；更优选地，所述载体蛋白为来自风产液菌(Aquifex aeolicus)的二氧四氢蝶啶合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
5.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述的融合蛋白。
6.一种纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒由如权利要求1～4所述的融合蛋白自组装得到，所述抗原肽展示在所述纳米颗粒的表面上。
7.一种使用如权利要求5所述的核苷酸序列转化的转化体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1～4中任一项所述的融合蛋白；优选地，所述药物组合物为疫苗组合物。
9.如权利要求1～4中任一项所述的融合蛋白在制备治疗或预防与EB病毒相关疾病的药物中的用途。
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