CN115894716A

CN115894716A - 一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法

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Publication number: CN115894716A
Application number: CN202211470829.9A
Authority: CN
Inventors: 崔旻; 刘威
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-11-23
Filing date: 2022-11-23
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-11-23
Also published as: CN115894716B

Abstract

本发明公开了一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明还公开了重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法及其在制备抗FHV‑I疫苗中的应用，通过分子克隆技术将gD+Ls基因克隆到PfastbacⅠ穿梭载体后利用昆虫‑杆状病毒真核表达系统进行蛋白的表达，制备的纳米颗粒具有组装正确，粒径合适，大小分明且具有良好免疫原性，可以诱导机体产生较高的抗体水平。

Description

一种重组融合蛋白纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，本发明还涉及重组融合蛋白纳米颗粒的制备及其在制备抗FHV-I疫苗中的应用。

背景技术

猫传染性鼻支气管炎的病原体为猫疱疹病毒I型(FHV-I)，属于疱疹病科甲型疱疹病毒亚科，属于传染性极强的恶性传染病，以上呼吸道感染为主要临床症状，宿主为猫和猫科动物，未接种疫苗的幼猫感染后发病率为100％，成年猫感染后一般不致死，但愈后不良，重症病例可见角膜、鼻甲骨造成永久性损伤。

目前国内对于该疾病的预防还是依赖于注射美国辉瑞公司生产的“妙三多”宠物疫苗，而国内本土商业化的猫疱疹病毒疫苗目前还是空白，随着国内宠物猫FHV-1感染病例和分离出感染病毒株多样性的不断增加以及进口“妙三多”疫苗供不应求且不适应本地毒株出现的疫苗保护性下降的问题，着手研制一种可用于预防猫疱疹病毒感染的生物制剂就显得十分重要。

本发明将已经由国内外文献报道的具有病毒中和作用的猫疱疹病毒粒子表面囊膜糖蛋白gD与可以在体内自发组装成60聚体纳米颗粒的Lumazine合酶(LumazineSynthase，Ls)进行融合表达，制备成多聚体蛋白质纳米颗粒。本发明通过真核表达系统表达和纯化出的纳米颗粒具有蛋白表达产量高、生产周期短且操作简单易于放大生产的优点，经验证其蛋白结构折叠正确、具有生物活性，可以为猫疱疹病毒亚单位疫苗的研制提供一种全新且高效的选择方案。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述重组融合蛋白纳米颗粒的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明选择具有60个亚基的Ls作为载体，其抗原展示表位丰富，末端靠近对称轴可以稳定三聚体或五聚体抗原的呈递，以确保膜蛋白免疫原的充分暴露。又对病毒gD糖蛋白的氨基酸全长进行了序列分析与抗原性预测，去除了由SignalP 5.0算法预测的Sec/SPI信号肽段，保留了由DNAstar和.SVMTRIP-B、Karplus&Schulz FIexibility PredictionResults及BepiPred-2.0数据库对比筛选后的具有B细胞表位与T细胞表位的的膜外糖蛋白肽段，再将其用GS柔性Linker将其与Ls进行连接后进行了融合表达。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法，通过分子克隆技术将gD+Ls基因克隆到PfastbacⅠ穿梭载体后利用昆虫-杆状病毒真核表达系统进行蛋白的表达，具体包括如下步骤：

S1、设计引物，扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA片段；

S2、将得到的DNA片段连接到杆状病毒表达载体，构建重组杆粒；

S3、用重组杆粒转染昆虫细胞，经传代培养，蛋白表达后得到高表达目的蛋白的昆虫细胞；

S4、琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。

进一步地，所述引物序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

所述杆状病毒表达载体为PfastbacI。

所述昆虫细胞为SF9细胞。

S3中，将转染后的昆虫细胞传代培养至P₄代，用MOI＝10的病毒量感染昆虫细胞96h，得到高表达目的蛋白的昆虫细胞。

本发明利用了昆虫-杆状病毒真核表达系统来表达重组纳米颗粒，确保了自组装纳米颗粒所展示膜蛋白的正确修饰和自组装纳米颗粒的准确折叠，能够满足体外表达病毒囊膜糖蛋白时所需要的糖基化修饰，可以完整的在体外模拟出蛋白质的正确构象，更好地发挥蛋白质功能，这都是大肠杆菌等其他原核表达系统不能实现的。同时该真核表达系统具有低廉的培养成本、高密度培养方式和全程无血清的培养环境，更利于蛋白质的大量表达和后续的分离纯化。选择的具有Polyhedrin(PH)启动子的杆状病毒表达载体PfastbacI其相较于其他具有P10启动子的杆状病毒表达载体具有更高的蛋白质表达效率，相同时间内蛋白质的表达量更高。选择的SF9昆虫细胞系较其他昆虫细胞系具有转染容易，细胞内蛋白酶含量少，对表达出的蛋白质降解更小的优点。

本发明的第三个目的是提供所述重组融合蛋白纳米颗粒在制备抗FHV-I疫苗中的应用。将纯化后的自组装纳米颗粒通过透射电子显微镜拍照，动态光散射仪分析及gD糖蛋白单克隆抗体杂交实验后证实所表达的纳米颗粒具有组装正确，粒径合适，大小分明，具有抗体结合力。另外将其免疫动物验证了免疫原性，可以诱导机体产生中和抗体来中和病毒，并且具有较高的安全性。

更详尽的技术方案参见具体实施例。

附图说明

图1：gD+Ls扩增产物的凝胶电泳图。

图2：gD+Ls-PfastbacI穿梭质粒的双酶切验证图。

图3：转染SF9细胞的鉴定(A未转染正常培养的SF9细胞；B重组杆粒转染48h的SF9细胞)。

图4：gD+Ls蛋白在SF9细胞中的优化表达。

图5：gD+Ls纳米颗粒纯化产物的SDS-PAGE鉴定图。

图6：gD+Ls纳米颗粒纯化产物的WesternBlot鉴定图。

图7：100KV透射电子显微镜下对gD+Ls纳米颗粒的负染观察图。

图8：gD+Ls纳米颗粒的粒径统计图。

图9、图10：gD+Ls纳米颗粒免疫原性的鉴定图。

图10：免疫小鼠体重的监测。

图11：iELISA检测0、14、28、42day血清抗体IgG水平。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行下详细说明。

实施例1猫疱疹病毒表面糖蛋白纳米颗粒的制备

1.目的基因的克隆

根据NCBI已公布的FHV-I基因(NC_013590.2)的gD蛋白基因序列与Ls基因序列(AOO95275.1)设计PCR扩增引物并化学合成。

gD+Ls-F:GGATCCATGGTGAGCGCCATCGTG(SEQ ID NO：3)

gD+Ls-R:TCACCACCACCACCACTAAAAGCTT(SEQ ID NO：4)

以含目的基因的质粒(由上海生工生物公司合成序列并将其构建至pUC57克隆载体，转化TOP10感受态细胞后小提质粒获得)为模板构建如下的20μL PCR扩增体系：模板：1μL；F：2μL；R：2μL；2×PCRTaq酶：10μL；纯水：5μL。按如下程序在PCR仪中进行扩增：预变性：94℃,3分钟；变性：94℃,30秒；退火：70℃,30秒；延伸：72℃,1分钟；彻底延伸：72℃,10分钟；保存：4℃,10分钟。

将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳并切胶回收得到纯化后的目的基因DNA片段(图1)。

扩增产物gD+Ls蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

扩增产物gD+Ls的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)：

下划线为gD蛋白的核苷酸、氨基酸序列；波浪线

为Ls蛋白的核苷酸、氨基酸序列；双下划线

为GS连接Linker的核苷酸、氨基酸序列；虚线

为His的亲和纯化标签核苷酸、氨基酸序列。

2.gD+Ls-PfastbacI穿梭质粒的构建

扩增产物送武汉生工生物公司测序正确后取其10μL与含有相应酶切位点的PfastbacI表达载体按如下条件：目的基因5μL；载体10μL；T4DNA连接酶2μL在16℃金属浴中过夜进行DNA的连接。取连接后的产物1μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴静置30min后42℃热激50秒再冰浴3min后放入37℃的摇床中培育60min后得到活化的感受态菌液。取活化后的感受态菌液100μL用涂布棒均匀地涂在含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养12h后挑取单克隆菌落进行菌落PCR验证。将PCR呈阳性的单克隆菌落在30mL细菌培养瓶中进行扩大培养后得到含目的基因的阳性菌液，取5mL阳性菌液进行质粒的抽提从而得到含目的基因的重组表达载体质粒。接着用双酶切(BamhI/HindⅢ)的方法按如下操作对重组表达载体进行双酶切验证：取1μg抽提出的重组表达载体质粒在10×buffer缓冲液的环境中分别各加入1μL的BamHI和HindⅢ限制性内切酶在37℃水浴中反应30min后将酶切产物加入到3％的琼脂糖凝胶中电泳检测得到了含有载体和插入目的基因条带的凝胶图像(图2)，确保成功构建了表达载体。

将1μL gD+Ls-PfastbacI质粒加入到100μL的DH10Bac感受态细胞中，冰浴静置30min后42℃热激50秒后再迅速冰浴3min后放入37℃的摇床中培育5小时后得到活化的含表达载体菌液，将活化后的菌液涂布于含卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal的三抗平板上进行蓝白斑筛选，在37℃避光培养42h后再随机挑取一个最大最亮的白斑并用PCR法进行目的基因的鉴定，按此步骤连续筛选三轮为止。(为了避免假阳性，确保所插入的目的基因成功的转座到杆状病毒的毒基因组上)，将最后一轮鉴定为阳性的菌液扩大培养后用碧云天公司生产的杆粒小量提取试剂盒提取对应的杆粒准备转染SF9细胞。

3.SF9细胞的转染、传代及表达

(1)细胞转染

用高压灭菌过的ddH₂O将鉴定为阳性的重组杆粒稀释其浓度为1μg/μL后放入4℃冰箱待用。将提前培养好的SF9细胞(细胞活率≥99％，细胞代次≤10代)用新鲜的SFM培养基将细胞浓度稀释为0.5×10⁵cells/mL后吸取6mL细胞液铺入6孔细胞培养板中，每孔1mL，27℃静置培养2h后取出培养板并弃去孔内培养基后每孔再重新补充1mL新鲜培养基。取稀释好浓度的重组杆粒1μg与转染试剂按照体积比为1：10的比例混匀后加入到每孔细胞中，27℃温箱中静置培养4d后可看到转染组的SF9细胞与对照组的SF9细胞相比出现了较为明显的细胞病变(图3)，此时用移液器吸取细胞上清液后8000rpm离心10分钟即可得到P₀代重组杆状病毒液。

(2)重组病毒的传代培养

取状态良好且细胞密度为1.0×10⁶cells/mL的SF9细胞共10mL，将其离心后用10ml新鲜的SFM培养基重悬后按每孔100μL铺入96孔细胞培养板中，27℃温箱静置培养2h后待用。将收获的P₀代重组杆状病毒用新鲜的SFM培养基按照10倍倍比稀释后依次铺入待用96孔细胞培养板的每一列中，每孔100μL。将加入过病毒的96孔细胞培养板继续放回27℃温箱中静置培养1周后通过显微镜观察细胞病变的情况，并记录发生病变的孔与未发生病变孔的数量，根据Reed-Mench法计算该代病毒的滴度。后续各代病毒的滴度计算也按照该方法进行。在经过四轮滴定后确定了P₄代重组杆状病毒的滴度为3.2×10⁸PFU/mL。

(3)蛋白表达

为使蛋白表达的产量与病毒的使用剂量分别达到最优，事先准备密度为1.0×10⁷cells/mL的SF9细胞各100mL，按照如下计算公式：“需要的病毒液(mL)＝MOI×细胞数/病毒液的滴度”将MOI＝2，MOI＝5,MOI＝8,MOI＝10时所需要的病毒数量接入到准备好的细胞中感染细胞，并在48h,72h,96h时分别收获感染后的样品，将收获的样品加入到5×Loading Buffer中混匀再经100℃煮沸10min后进行WesternBlot鉴定，如图4所示：SF9细胞用MOI＝10的病毒感染96h时收获的gD+Ls蛋白表达量可达到最佳。

4.重组蛋白的纯化

将在最佳表达条件下培养的表达gD+Ls纳米颗粒的SF9细胞用离心瓶收集后7000rpm/min离心5min收集所有细胞沉淀后用100mLPBS重悬后在高压细胞破碎仪破碎15min，将破碎后的细胞悬液在4℃的环境中12000rpm/min离心30min后收集上清在低流速下用恒流蠕动泵完全通过提前平衡好的含有Ni离子的琼脂糖凝胶层析柱，在AKTA蛋白纯化仪上进行蛋白质的纯化，根据检测器显示的吸收光峰图收集含有目的蛋白组分的洗脱液，纯化后迅速向收集的组分中加入0.1mM的EDTA溶液以保护纳米颗粒的完整性。将收集到的每管含纳米颗粒的洗脱液进行SDS-PAGE检测后选择纯净度良好的洗脱部分用Millpore-10Kda的超滤管以8000rpm/min的速度离心浓缩至终体积为0.5mL，接着用1×HEPES(pH＝7.0)溶液对缓冲液进行置换后再分别用SDS-PAGE(图5)与WesternBlot(图6)方法检测浓缩后纳米颗粒的纯净度。将浓缩后的纳米颗粒添加蛋白保护剂后分装保存于-80℃待用。后经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度为0.75μg/mL。

实施例2纳米颗粒的性能分析

1.形态表征

将纯化后的gD+Ls纳米颗粒从-80℃中取出解冻后用高压灭菌的PBS溶液将纳米颗粒浓度稀释为0.1μg/mL待用。吸取一滴稀释后的纳米颗粒溶液滴于事先用1％磷钨酸溶液(pH＝7.0)负染过的铜网上固定5min后，用滤纸吸干多余液体后将其放入100KV的TEM样品杆中进行观察拍照，拍照过程中可以较为明显的观察到大量正确自主装的gD+Ls纳米颗粒(图7)。另外取10μL的gD+Ls自组装纳米颗粒放入提前开机预热的动态光散射仪的柱状显色杯中，按预设值的程序对gD+Ls纳米颗粒的粒径进行测量分析，分析结果显示gD+Ls纳米颗粒的直径为21nm，且溶液中的组分较为单一(图8)。说明自组装后的蛋白质纳米颗粒组装程度较好，粒径均一分散。

2.抗体结合力

为验证与Ls融合表达的gD糖蛋白能够正确的暴露在纳米颗粒的表面，能在免疫动物后产生相对应的免疫反应，故使用了实验室同期制备的gD蛋白单克隆抗体来验证抗原蛋白gD暴露在了gD+Ls纳米颗粒的外表面。

检测的具体操作方法为提前将纯化好的gD+Ls纳米颗粒用“棋盘法”滴定，得出其最佳包被浓度为1ng/μL。按滴定的最佳浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被12h后取出得到包被好的酶标板。将包被好gD+Ls纳米颗粒的酶标板取出后放置于室温1h后再放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。接着用多孔道移液器将提前配制好的封闭液(5％BSA+PBST)加入到洗好的酶标板的反应孔中，每孔100μL，37℃封闭1h后将酶标板放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。将倍比稀释后的gD蛋白单克隆抗体加入到每列孔中，每孔加入100μL，每个稀释度做3个复孔，37℃孵育2h后取出。将孵育完的酶标板放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。将HRP标记的二抗按1：3000稀释后加入到每个孔中，每孔100μL，37℃孵育2h后取出放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。将提前配制好的TMB双组分显色液加入到每个孔中后，37℃避光显色30min后取出立刻向每孔中加入50μL的显色终止液终止显色。在终止显色后的10分钟内利用酶标仪对每孔在OD_450nm处的吸光度进行检测可得知制备的gD+Ls纳米颗粒能够与gD蛋白单克隆抗体发生特异性的结合而Ls不与gD蛋白单克隆抗体发生特异性结合，并且随着抗体浓度的增加其纳米颗粒与抗体的亲和力也在逐渐增加(图9)。这说明抗原蛋白gD成功的展示在了gD+Ls纳米颗粒表面，确保了该纳米颗粒可以引起良好的免疫反应。

3.免疫原性

(1)疫苗的制备

将实施例1中制备的gD+Ls纳米颗粒经过超滤浓缩后作为抗原与法国Seppic公司生产的GEL02佐剂按照体积比为9:1的比例用小型搅拌器充分搅拌30min左右进行乳化，最终可获得终浓度为200μg/mL剂量的纳米颗粒疫苗。将乳化好的纳米颗粒疫苗封装好以后放置于室温环境中24h后观察到没有出现分层、析出、沉淀等现象，说明制备的纳米颗粒疫苗具有良好的稳定性，易于保存。

(2)动物免疫

为了评估用这种新型纳米颗粒制备成疫苗的安全性及免疫原性，订购6周龄的雌性BALB/c小鼠25只，随机分成5组，每组5只，均通过后肢肌肉注射的方式进行免疫。制备的纳米颗粒疫苗免疫剂量为每只小鼠40μg，用灭菌后的PBS作为阴性对照，美国辉瑞公司生产的商业化“妙三多”灭活疫苗作为阳性对照。

按照如下免疫程序进行免疫：

(3)安全性实验

将制备的纳米颗粒疫苗在免疫小鼠后48小时内每隔12小时观察小鼠的精神状况及食欲，并对其体温进行测量记录，通过检测发现在免疫后48小时内小鼠均未出现异常现象且体温无较大变动。同时在每次免疫和采血之前均对每只小鼠进行称重，记录其体重的变化，通过记录后发现在整个免疫期间每组均未出现疫苗导致小鼠发生死亡的情况，各组小鼠的体重均较免疫前体重有明显的增加(图10)。本发明所制备的新型纳米颗粒疫苗具有较好的生物安全性。

(4)免疫原性实验

分别对免疫后第0天，14天，28天，42天的小鼠通过眼下静脉丛采集血液并分离出血清，将分离到的血清分装后冻存于-80℃冰箱用于后续的特异性抗体检测。

提前将纯化好的gD蛋白包被至96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被12h后取出得到包被好的酶标板待用，并按照如下步骤使用iELISA法检测免疫小鼠血清中特异性IgG抗体水平。

a)复温：将包被好的酶标板取出后放置于室温1h。

b)洗板：将恢复室温的酶标板放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。

c)封闭：用多孔道移液器将提前配制好的封闭液(5％BSA+PBST)加入到洗好酶标板的反应孔中，每孔200μL，37℃封闭1h。

d)洗板：将封闭完的酶标板放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。

e)一抗孵育：将分离得到的阳性血清进行稀释后加入到每个孔中，每孔加入100μL，37℃孵育2h后取出。

f)洗板：将孵育完的酶标板放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。

g)二抗孵育：将HRP标记的二抗按1：5000稀释后加入到每个孔中，每孔100μL，37℃孵育1h后取出。

h)洗板：将孵育完的酶标板放入全自动洗板机中洗板3次，每次5min。

i)显色：将恢复室温的TMB双组分显色液加入到每个孔中后，37℃避光显色30min后取出。

j)终止显色：每孔中加入50μL的显色终止液终止显色。

k)测定参数：在终止显色后10分钟内利用酶标仪对每孔在OD_450nm处的吸光度进行检测并记录数据，取待测孔OD_450nm/阴性孔OD_450nm≥2.0的值定义为阳性值并分析数据。

结果如图11所示：可以看到Ls组与PBS组相比在0天～42天内的血清ELISA抗体水平基本没有显著的差异，除这两组外的其余免疫组在0天～42天内血清ELISA抗体水平呈现逐步上升的趋势，且在第42天时达到最高。在第28天和42天时候，gD+GEL02组、gD+Ls+GEL02组、商业疫苗组的血清抗体水平均相较于PBS组与Ls+GEL02组有极其显著的差异(P≤0.001)。尤其是由本发明表达的gD+Ls+GEL02组在整个免疫过程在都可引起最高的血清抗体水平，明显优于商业化疫苗组与gD单体组。这说明本发明表达的纳米颗粒蛋白可以较好的引起机体产生较高的抗体水平，具有优越的免疫原性。

(5)保护性实验

为了验证制备疫苗的保护效果，故采取病毒中和实验来检测免疫后采集的血清中是否含有可以抵御FHV感染的IgG抗体，故取实验室保存的高滴度FHV病毒将其稀释成200TCID₅₀的病毒待用。按照如下方式进行病毒中和实验的检测：在96孔板的A₁-H₄区域内每孔加入50μL的细胞生长液后再在A₁-A₄区域内各孔加入50μL的待检血清后依次竖向倍比稀释至H₁-H₄后使其血清稀释度达到1：256，接着将稀释好的200TCID₅₀病毒液每孔50μL加入A₁-H₄区域内左右轻轻混匀后将其放入细胞培养箱中孵育60min后取出，再向A₁-H₄每孔内加入FHV易感染的CRFK细胞悬液(猫肾上皮细胞)每孔100μL(10⁵/cells)继续置于37℃细胞培养箱中连续培养6天，通过每天观察细胞病变情况并做统计后得到结果见下表，通过计算可以得知采集得到血清的LgPD₅₀＝-1.3，故中和效价PD₅₀＝0.05＝1:20，说明收集的血清按1：20稀释后可以保护50％的CRFK细胞免受FHV病毒的感染，血清中的IgG具有中和病毒的能力，可以对FHV的感染进行保护。

血清稀释度	出现CPE孔数	无CPE孔数	累计CPE孔数	保护率％
					1:2	0	4	0	100
1:4	0	4	0	100
					1:8	1	3	1	87.5
1:16	1	3	2	66.7
					1:32	3	1	5	16.7
1:64	4	0	9	0
					1:128	4	0	13	0

Claims

1.一种猫疱疹病毒I型gD蛋白与Lumazine合酶重组融合蛋白纳米颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述重组融合蛋白纳米颗粒的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1或2所述重组融合蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、设计引物，扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA片段；

S4、琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述引物序列如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4所示。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述杆状病毒表达载体为PfastbacI。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述昆虫细胞为SF9细胞。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：S3中，将转染后的昆虫细胞传代培养至P₄代，用MOI＝10的病毒量感染昆虫细胞96h，得到高表达目的蛋白的昆虫细胞。

8.权利要求1所述的重组融合蛋白纳米颗粒在制备抗FHV-I疫苗中的应用，该疫苗具有免疫原性，可以诱导机体产生中和抗体。