CN103890177B - Hpv嵌合颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)，其具有约30nm的直径。本发明进一步涉及通过向受试者施用本发明的嵌合HPVVLP治疗和/或预防HPV感染和/或宫颈癌的方法。

Description

HPV嵌合颗粒
发明背景
本发明涉及具有约30nm的直径的嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)和通过施用本发明的嵌合HPVVLP治疗和/或预防HPV感染和/或宫颈癌的方法。
宫颈癌主要由HPV感染引起并且是世界范围内女性中第三大最常见的癌症(Ferlay等人，2010)。因此，HPV疫苗的开发对于预防性的癌症研究是优先的。L1主要衣壳蛋白是用于预防性疫苗的选择的抗原，因为它是免疫显性的并自组装在与真实病毒颗粒结构和免疫学相似的VLP中。用VLP接种在动物和人中都诱发高滴定度的中和抗体(NAb)，并且两种多价的基于HPVL1VLP的预防性疫苗已得到许可并且在预防疫苗类型HPV-16和18感染和相关疾病中高度有效(Schiller等人，2008)。
尽管现在基于L1VLP的HPV疫苗是高效的，但疫苗的类型特异性(Brown等人，2009；Wheeler等人，2009)，缺乏治疗有效性(FUTUREIIStudyGroup，2007；Hildersheim等人，2007)和高成本(Schiller等人，2008)已限制了其广泛应用，尤其在发展中国家，其具有宫颈癌负担的＞80％(Parkin和Bray，2006)。因此，有紧迫的对买得起的第二代HPV疫苗的需求，所述第二代HPV疫苗扩大保护到包含多种致癌的HPV类型，并改善治疗功效以清除已建立的HPV感染和癌性病变。
广谱的预防性HPV疫苗可以通过交叉中和L2表位进行开发。所述L2表位可以整合入L1的表面区域以产生L1/L2嵌合体，所述嵌合体在组装的L1表面展示L2肽(WO03/097673；Kawana等人，1999，2003；Slupetzky等人，2007；Kondo等人，2007，2008)。
使用植物表达系统大规模生产外源蛋白已被提议为是用于疫苗生产的划算的备选方案(Fischer等人，2004)，其具有确定的用于高水平蛋白表达和优化的瞬时表达的趋势(Rybicki，2009)。几个研究组已在植物中表达出了HPV-16L1(Biemelt等人，2003；WO2006/119516；Maclean等人，2007)。
植物系统的一个实际的局限性是重组蛋白的低产量，可能是由于蛋白不稳定或表达水平低(Fischer等人，2004；Obembe等人，2011)。据估计，植物表达重组蛋白的产量需要大于总可溶蛋白(TSP)的1％才是经济上可行的(Fischer等人，2004)。这对于使用核转化的转基因植物的重组蛋白的表达是尤其有问题的，因为这些系统经常与重组蛋白的低产量相关(Rybicki，2009)。
HPV-16L1已经转基因表达在核转化的马铃薯和烟草植物中，但始终报告HPV-16L1的低表达水平(＜1％TSP)并且诱发的免疫应答相对弱(Biemelt等人，2003；Varsani等人，2003b；Varsani等人，2006a)。
然而，L1基因的人密码子优化并靶向叶绿体在转基因的和农杆菌(Agrobacterium)介导的瞬时烟草表达系统已显著改善了HPV-16L1的表达至多达TSP的17％(Maclean等人，2007)。
一项最近源自植物的HPV疫苗的开发是在植物中首次表达HPV-16L1嵌合体。L1/E6/E7嵌合体由HPV-16L1通过C端融合于几个E6和E7表位组成并且在转基因番茄中表达(PazDelaRosa等人，2009)。然而，产量低(TSP的0.05-0.1％)，并且因此无法在商业上使用。
WO201I/077371描述了一种生产嵌合HPVL1多肽的方法，其具有相对于在昆虫、植物、或酵母表达系统中HPVL1蛋白增加的表达水平。尽管在植物中生产的从HPVL1和BPVL2(氨基酸1-88)的人密码子优化的L1/L2嵌合体形成约55nm的VLP，其它的HPVL1/L2嵌合体只能形成约17nm直径的壳粒。
尽管壳粒在室温稳定，但它们相比VLP只能诱导20到40倍较低的体液免疫应答(等人，2008)。因此开发一种在表达系统中具有商业可用水平的表达的包含L1和L2的嵌合VLP将是有益的。这种嵌合VLP将更易于纯化并且可能比嵌合壳粒更具有免疫原性。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供一种包含约30nm的直径的嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)，所述嵌合HPVVLP具有人密码子优化的核苷酸序列编码的嵌合HPV16L1/L2多肽，所述嵌合HPV16L1/L2多肽进一步包含含有约13个氨基酸到约26个氨基酸的HPVL2肽的HPVL1多肽，所述HPVL2肽从HPV16L1多肽的残基414插入，其中，插入的HPVL2肽的氨基酸替代HPV16L1多肽中相应的氨基酸。
例如，插入的HPVL2肽可以是如SEQIDNO：7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的13个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQIDNO：3)，或如SEQIDNO：9所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的20个氨基酸QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV的肽(SEQIDNO：5)，或如SEQIDNO：8所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的26个氨基酸GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT的肽(SEQIDNO：4)。
优选的，所述插入的HPVL2肽是如SEQIDNO：7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的13个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQIDNO：3)。
HPV类型16的L1蛋白可以进一步由修饰核苷酸序列编码以致核定位信号缺失。
优选的，所述HPV-16L1/L2多肽包含如SEQIDNO：22，SEQIDNO：23或SEQIDNO：24所示的氨基酸序列，或其变体或衍生物。
优选的，所述HPV-16L1多肽如SEQIDNO：1所示，并且所述HPV-16L1多肽如SEQIDNO：2所示的人密码子优化的HPV-16L1多核苷酸序列编码。
直径约30nm的嵌合HPVVLP可以是一种植物表达的嵌合HPVVLP，所述嵌合HPVVLP从植物表达系统中纯化。优选的，所述表达的嵌合VLP可以靶向植物的叶绿体。
根据本发明一个进一步的方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如本发明的直径为30nm的嵌合HPVVLP和药学上可接受的载体。
所述组合物还可以包含佐剂。
根据本发明一个进一步的方面，提供一种生产具有尺寸为直径约30nm的嵌合HPVVLP，所述方法包含以下步骤：
(i)提供编码嵌合HPV16L1/L2多肽的嵌合人密码子优化的核苷酸序列，所述嵌合HPV16L1/L2多肽包含具有约13个氨基酸到约26个氨基酸的HPVL2肽的HPV16L1多肽，所述HPVL2肽从嵌合HPV16L1/L2多肽的残基414插入，其中所述插入的HPVL2肽的氨基酸代替HPV16L1多肽的相应氨基酸；
(ii)将嵌合人密码子优化的核苷酸序列克隆入适于在植物中表达多肽的表达载体；
(iii)用步骤(ii)的表达载体转化或渗入植物细胞；
(iv)在步骤(iii)的植物细胞中表达所述嵌合HPV16L1/L2多肽，以至于表达的嵌合HPV16L1/L2多肽装配进入具有均一形状和约30nm的直径的嵌合HPVVLP；和
(v)从所述植物细胞中回收所述嵌合HPVVLP。
所述表达载体优选的包含启动子和其它调控序列或类似物，其可操作的连接于表达载体的编码序列。
优选的，步骤(ii)的表达载体适于靶向植物细胞的叶绿体，并且在步骤(iv)中所述表达的嵌合HPV蛋白靶向植物叶绿体。
步骤(iii)可以进一步包括向植物细胞引入适于抑制植物中转录后基因沉默的抑制蛋白。优选的，所述抑制蛋白是番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus)的NSs蛋白或番茄丛矮病毒(tomatobushystuntvirus)的p19。
例如插入的HPVL2肽可以是如SEQIDNO：7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的13个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQIDNO：3)，或如SEQIDNO：9所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的20个氨基酸QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV的肽(SEQIDNO：5)，或如SEQIDNO：8所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的26个氨基酸GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT的肽(SEQIDNO：4)。
优选的，所述插入的HPVL2肽是如SEQIDNO：7所示的人密码子优化的核苷酸序列编码的3个氨基酸LVEETSFIDAGAP的肽(SEQIDNO：3)。
根据本发明一个进一步的方面，提供一种根据本发明的直径为约30nm的嵌合HPVVLP，其用于在受试者中预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌的方法中。
更具体的，所述嵌合HPVVLP可以用于在受试者中诱发免疫应答(如中和抗体和/或CTL应答)的方法中。优选的，所述嵌合HPVVLP用于针对受试者中的多种HPV类型诱导交叉保护的免疫应答中。
根据本发明一个进一步的方面，提供根据本发明的规则形状的、直径约30nm的嵌合HPVVLP在制备用于在受试者中预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌方法的药物中的用途。
更具体的，所述药物可以用于在受试者中诱发免疫应答(如中和抗体和/或CTL应答)的方法中。优选的，所述药物用于针对受试者中的多种HPV类型诱导交叉保护免疫应答。
根据本发明一个进一步的方面，提供一种在受试者中预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌的方法，所述方法包括向受试者施用预防或治疗有效量的根据本发明的形状均一、直径约30nm的嵌合HPVVLP的步骤。
更具体的，所述方法可以包括诱发受试者中的免疫应答(如中和抗体和/或CTL应答)。优选的，所述方法针对受试者中的多利HPV类型诱导交叉保护的免疫应答。
受试者优选是人。
附图简要说明
图1显示用于产生HPV嵌合体植物表达构建体的质粒。C)源于pGA4构建体的HPV嵌合体直接亚克隆入农杆菌植物表达载体：A)pTRAkc-rbcsl-cTP，B)pTRAc和D)pRIC3。植物表达所需的载体元件在图中显示。P35SS：CaMV35S启动子，其含有重复的转录增强子，CHS：查耳酮合酶5’非翻译区，pA35S：用于外源基因表达的CaMV35S多聚腺苷酸信号，ColElori：大肠杆菌(E.coli)复制起点，RK2ori：农杆菌复制起点，bla：氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性基因，和LB/RB：T-DNA整合的左和右边界。pTRAc载体包含SAR：烟草表达盒侧翼的Rb7框架附着区。此外，pTRAkc-rbcsl-cTP载体含有nptII：卡那霉素抗性基因，Pnos/pAnos：胭脂碱合成酶基因的启动子/多聚腺苷酸化信号和rbcsl-cTP：核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基基因rbcSl的马铃薯(Solanumtuberosum)叶绿体-转移肽序列。pRIC3载体包含LIR：BeYDV长基因间区域，SIR：BeYDV短基因间区域和Rep/RepA：BeYDVrep基因。
图2显示在有(+)或没有(-)NSs沉默抑制子时，在本生烟草(N.benthamiana)中渗入后(dpi)1-9天叶绿体-靶向L1/L2嵌合体的表达计时测验。在叶粗提物中的L1/L2嵌合体A)L1/L2(108-120)，B)L1/L2(56-81)，C)L1/L2(17-36)和D)L1/L2BPV(1-88)用CamVirl蛋白质印迹分析进行检测。M＝用在左侧示出的kDa表示大小的蛋白质分子量标准。NSs负对照＝pBIN-NSs渗入的植物粗提物(5dpi)。正对照：本生烟草(+)＝源于植物的HPV-16L1。黑色箭头指示L1/L2嵌合体(～56kDa)的位置并且灰色箭头指示降解的蛋白。
图3a)显示使用3个植物表达载体pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3表达的L1/L2嵌合体的蛋白质印迹分析。嵌合体与NSs共表达，提取5dpi并用CamVirl检测。HPV-16L1作为pTRAc和pTRAkc-rbcsl-cTP(pRIC3构建体不可获得)的正表达对照进行表达，负表达对照为NSs-渗入的植物。M＝用在左侧示出的kDa表示大小的蛋白质分子量标准。黑色箭头指示L1/L2嵌合体或HPV-16L1(～56kDa)；和b)显示用3种植物表达载体：pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3表达的L1/L2嵌合体之间的比较。误差线指示标准差。
图4显示使用3种不同植物表达载体：pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3表达的L1/L2嵌合体的组装。蛋白与NSs沉默抑制子共表达并提取5dpi。嵌合体组装为高阶的结构如壳粒或VLP(由构象特异的H16.V5MAb检测)表示为占总嵌合体蛋白的百分比(由线性特异的H16.J4MAb检测)。HPV-16L1表达为正表达对照且负表达对照为NSs-渗入的植物。误差线指示标准差。
图5显示植物生产疫苗抗原的纯度。A)考马斯染色的蛋白胶。B)蛋白质印迹检测HPV抗原。M＝用在左侧示出的kDa表示大小的蛋白质分子量标准。C＝澄清的植物粗提物。P＝纯化的抗原。V1＝L1/L2(108-120)，V2＝L1/L2(56-81)，V3＝L1/L2(17-36)，V4(+)＝HPV-16L1和V5(-)＝NSs-渗入的植物提取物。黑色箭头指示HPV抗原且白色箭头指示植物蛋白Rubisco.
图6显示中未加工和纯化样品中可溶蛋白(TSP)和总HPV蛋白。TSP用Lowry测定法进行测定且HPV蛋白用H16.J4(线性表位特异)测定。V1：L1/L2(108-120)，V2：L1/L2(56-81)，V3：L1/L2(17-36)，V4：HPV-16L1(正对照)，V5：NSs植物提取物(负对照)。误差线指示标准差。
图7显示CamVirl-免疫捕获的未加工的和纯化的疫苗抗原的电子透射显微照片。A)V1：L1/L2(108-120)，B)V2：L1/L2(56-81)，C)V3：L1/L2(17-36)，D)V4：HPV-16L1(正对照)，E)V5：NSs植物提取物(负对照)。格子框出的是在Zeiss912OmegaCryoEFTEM中看到的。左侧比例尺＝50nm，右侧比例尺＝200nm。浅灰色箭头指示HPV-16壳粒(～10nm)，白色箭头表示壳粒聚集体或小的VLP(～30nm)深灰色箭头指示实际大小的VLP(～55nm)。
图8显示CamVirl免疫捕获的的未加工疫苗抗原L1/L2(56-81)。格子框出的是在Zeiss912OmegaCryoEFTEM中看到的。比例尺＝100nm。
图9显示使用昆虫细胞表达的HPV-16L1作为包被抗原的小鼠血清直接ELISA。V1＝L1/L2(108-120)，V2＝L1/L2(56-81)，V3＝L1/L2(17-36)，V4＝HPVL1(+疫苗对照)，V5＝植物提取物(-疫苗对照)。A)所有疫苗的小鼠抗血清滴定度。B)图标显示ELISA正对照MAbsH16.V5和CamVirl获得的值。C)1：50稀释后接种前取血吸光度值。标记表示三重样品的平均值且误差线指示标准差。
图10显示大肠杆菌表达的His标签的HPV-16L2用1：100稀释的小鼠血清进行的蛋白质印迹检测。M＝用kDa表示蛋白大小的蛋白质分子量标准。V1＝L1/L2(108-120)，V2＝L1/L2(56-81)，V3＝L1/L2(17-36)，V4＝HPVL1(+疫苗对照)，V5＝植物提取物(-疫苗对照)。PB＝预取血血清。FB＝最终的取血血清。用于蛋白质印迹分析对照：+ve＝小鼠抗-His(1：2000；Serotec)，-ve＝无主要抗体。黑色箭头指示L2(～80kDa).
图11显示HPV-16PsV中和试验。从用V1-V5接种的小鼠中采集的血清用于测试其中和HPV-16PsV的能力。A)V1＝L1/L2(108-120)，B)V2＝L1/L2(56-81)，C)V3＝L1/L2(17-36)，D)V4＝HPV-16L1(+ve疫苗对照)，E)V5＝NSs-渗入的植物提取物(-ve疫苗对照)。F)H16.V5＝+ve中和作用对照。细胞对照＝-ve感染/SEAP表达对照。PsV对照＝+ve感染/SEAP表达对照。样品以一式三份进行测试且误差线指示标准差。
图12显示HPV-18PsV中和试验。A)V1＝L1/L2(108-120)，B)V2＝L1/L2(56-81)，C)V3＝L1/L2(17-36)，D)V4＝HPV-16L1，E)V5＝NSs-渗入的植物提取物(-ve疫苗对照)。F)兔抗Cervarix血清＝+ve中和作用对照。
图13显示HPV-45PsV中和试验。A)V1＝L1/L2(108-120)，B)V2＝L1/L2(56-81)，C)V3＝L1/L2(17-36)，D)V4＝HPV-16L1，E)V5＝NSs-渗入的植物提取物(-ve疫苗对照)。F)H45.N5＝+ve中和作用对照。
图14显示HPV-52PsV中和试验。A)V1＝L1/L2(108-120)，B)V2＝L1/L2(56-81)，C)V3＝L1/L2(17-36)，D)V4＝HPV-16L1，E)V5＝NSs-渗入的植物提取物(-ve疫苗对照)。F)H52.C1＝+ve中和作用对照。
图15显示HPV-16L1的氨基酸序列(SEQIDNO：1)。
图16显示HPV-16L1的人密码子优化的核苷酸序列(SEQIDNO：2)。
图17显示插入到HPVL1序列中的L2(108-120)表位氨基酸序列(SEQIDNO：3)。
图18显示插入到HPVL1序列中的L2(56-81)表位氨基酸序列(SEQIDNO：4)。
图19显示插入到HPVL1序列中的L2(17-36)表位氨基酸序列(SEQIDNO：5)。
图20显示插入到HPVL1序列中的L2BPV(1-88)表位氨基酸序列(SEQIDNO：6)。
图21显示插入到HPVL1序列中的L2(108-120)的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：7)。
图22显示插入到HPVL1序列中的L2(56-81)人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：8)。
图23显示插入到HPVL1序列中的L2(17-36)人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：9)。
图24显示插入到HPVL1序列中的L2BPV(1-88)人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：10)。
图25显示HPV16L1/L2(108-120)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQIDNO：22)。
图26显示HPV16L1/L2(56-81)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQIDNO：23)。
图27显示HPV16L1/L2(17-36)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQIDNO：24)。
图28显示HPV16L1/L2BPV(1-88)嵌合多肽的氨基酸序列(SEQIDNO：25)。
图29显示编码HPV16L1/L2(108-120)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：26)。
图30显示编码HPV16L1/L2(56-81)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：27)。
图31显示编码HPV16L1/L2(17-36)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：28)。
图32显示编码HPVL1/L2BPV(1-88)嵌合多肽的人密码子优化的DNA核苷酸序列(SEQIDNO：29)。
发明详述
本发明将结合附图作为参考在下文进行更充分的描述，其中展示一些，但不是所有本发明实施方案。
所描述的发明不应该限制于公开的特定实施方案且其它实施方案意在包含在本发明的范围内。尽管本文用到特定术语，其仅用于普通的和描述性的理解且不是为了限制。
除非另有指示，本文所用的术语具有本领域承认的意义。
本发明提供一种具有规则形状的和尺寸为直径约30nm的嵌合人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)和一种通过施用本发明的嵌合HPVVLP预防和/或治疗HPV感染和/或宫颈癌的方法。尤其是，所述形状规则的直径为30nm的嵌合HPVVLP包含HPV类型16的L1蛋白，其中，人密码子优化的核苷酸序列编码的约13个氨基酸和26个氨基酸的HPVL2肽插入在氨基酸残基414，由此代替HPVL1中的相应氨基酸。
L1主要衣壳蛋白自然地自组装为病毒样颗粒(VLP)，所述病毒样颗粒形成当前HPV疫苗的基础(Schiller等人，2008)。重组VLP已在几种不同的宿主系统中表达，包括哺乳动物，昆虫，酵母，细菌和植物。
HPV-16L1C-端螺旋4(h4)在VLP组装中起作用，且位于残基414-426之间(Varsani等人，2003a)。移除这些基序导致壳粒形成，且防止进一步自组装为VLP(Bishop等人，2007)。此外，在高度保守的175和428半胱氨酸残基之间有二硫键，且这些半胱氨酸的突变导致形成壳粒而不是VLP(Li等人，1998；McCarthy等人，1998；Sapp等人，1998；Fligge等人，2001；Varsani等人，2006b)。然而，在本研究中显示，人密码子优化的核苷酸序列编码的约13个氨基酸到约26氨基酸的HPVL2肽的插入，当插入在氨基酸残基414以代替HPVL1中相应氨基酸时，能够成功组装为小的，形状规则的直径约为30nm的嵌合VLP。
商业化的HPV疫苗(目前表达在酵母和昆虫细胞中)是昂贵的(Schiller等人，2008)，尤其由于生产和纯化方案的成本高。此外，复杂的纯化方法和大范围的预处理可能影响其稳定性，且组装的L1蛋白的回收和变性的L1无法诱导中和抗体。因此，使用廉价的表达系统和简单的生产纯化工艺生产疫苗抗原在任何商业化蛋白生产系统中仍然具有高的优先级。
本发明用以下实施例进行描述，所述实施例不理解为对本发明的任伺限制。
实施例
实施例1：L1嵌合体的瞬时植物表达
方法和材料
植物表达载体
三种二元农杆菌植物表达载体用来优化HPV嵌合体的表达：pTRAc和pTRAkc-rbcsl-cTP(由RainerFischer教授提供；FraunhoferInstituteforMolecularBiologyandAppliedEcology，Germany)且豆黄矮双生病毒(Beanyellowdwarfgeminivirus，BeYDV)载体pRIC3(由RichardHalley-Stott构建)。两个是非复制型载体，其使表达的蛋白或者靶向细胞质(pTRAc)或者靶向叶绿体(pTRAkc-rbcsl-cTP)(Maclean等人，2007)，且第三种载体是一种自复制型细胞质靶向载体(pRIC3)。pRIC3载体是pRIC载体的第三代载体(Regnard等人，2010)，其减小了尺寸且显示出在植物中类似的对转基因表达的放大。
所述载体含有许多植物中蛋白表达所需的元件(图1)。pTRAkc-rbcsl-cTP载体(图1A)由pTRAc衍生(图1B)，且含有马铃薯rbcSl基因叶绿体-转移的肽序列。pRIC3(图1D)包含自复制所需的BeYDV复制相关蛋白(Regnard等人，2010)。
L1嵌合体的合成
用于本研究的四种HPV-16L1/L2嵌合体在表1中描述。所述嵌合体由一种南非HPV-16L1分离基因序列组成(SALI：GenBank登录号AY177679)，所述基因序列具有位于h4螺旋内在aa414处(指示“F-位置”)的L2表位。这些嵌合基因由IngaHitzeroth博士(PlantVaccineGroup，UCT)设计，由GENEARTAG(Regensburg，Germany)使用高通量基因装配进行人密码子优化和经电脑模拟(insilico)合成。合成的L2表位序列在F-位置代替L1序列而不是简单的插入L1蛋白。
表1：HPV-16L1嵌合构建体概述
L1嵌合体基因的亚克隆
HPV-16L1/L2嵌合体序列使用嵌合基因侧翼的3’XhoI和5’BspHI，MluI或HindIII任一的限制性内切酶(RE)位点从pGA4载体中切离(图1C)。HPV基因使用对于直接亚克隆入植物表达载体，对于pTRAc使用AflIII和XhoI(图1B)，对于pTRAkc-rbcsl-cTP使用MluI和XhoI(图1A)，和对于pRIC3使用HindIII和XhoI(图1D)。化学感受态的DH5-α大肠杆菌细胞(E.cloniTM，Lucigen)用嵌合体质粒构建体转化，然后重组子用氨苄青霉素(100μg/m1)抗性筛选。pTRAcHPV-16L1/L2嵌合体构建体L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)由MarkWhitehead(PlantVaccineGroup，UCT)提供。本发明使用的质粒构建体概括在表2中。
表2：本发明使用的农杆菌表达构建体
重组L1嵌合体的鉴定
L1嵌合体重组克隆使用pTRAc载体特异性引物和结合不同L2表位(表3)的嵌合体-特异引物通过菌落PCR筛选。PCR使用GoTaqFlexiDNAPolymerasekit(Promega)按照制造商的使用说明进行，最终MgCl2的浓度为3mM，每种引物使用1μM。
表3：PCR使用的和HPV嵌合体测序用引物
使用载体特异的引物进行菌落PCR
pTRAc载体特异引物(由MarkWhitehead设计)结合多克隆位点(MCS)的上游和下游以检测基因插入。PCR条件包括：初始变性步骤95℃3分钟，接着95℃30s，59℃30s和72℃3分钟的25个循环，和最终延伸步骤72℃3分钟。PCR产物在0.8％TBE琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭检测。
使用表位特异的引物进行菌落PCR
HPVL2表位特异的引物(由MarietaBurger设计)用于检验插入重组pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3克隆的正确的嵌合体。PCR条件包括：初始变性步骤95℃2分钟，接着95℃30s，55℃(L1/L2嵌合体)20s和72℃30s的25个循环，和最终延伸步骤72℃3分钟。PCR产物在1.2％TBE琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭检测。
限制性酶消化
重组子使用在1.5kb嵌合体插入片段侧面的RE位点通过限制性酶消化进行检测(EcoRI/XhoI用于pTRAkc-rbcsl-cTP克隆，或HindIII/XhoI用于pRIC3克隆)。重组DNA(～500μg)在37℃消化1-2小时，根据制造商的使用说明(Roche/Fermentas)每个反应使用1U的酶。消化的DNA在0.8％TBE琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色。
L1嵌合体的测序
pTRAkc-rbcsl-cTP重组子中的HPV嵌合体基因插入片段使用pTRAc载体特异引物测序。利用DNAMAN多重比对软件将序列于HPV嵌合体序列进行比对。
农杆菌转化
根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101：pMP90RK细胞用Shen和Forde(1989)描述的方法进行电穿孔。农杆菌的转化按Maclean等人(2007)描述的进行，并且重组克隆用抗生素选择方法(50μg/ml羧苄青霉素，50μg/ml利福平和30μg/ml卡那霉素)进行筛选。用菌落PCR和限制型酶消化确认成功的转化(如上描述的)。
本生烟草的农杆菌渗入法
如Maclean等人(2007)描述的制备根癌农杆菌重组嵌合体培养物和包含编码番茄斑萎病毒(TSWV)NSs沉默抑制子的pBIN-NSs质粒的根癌农杆菌LBA4404培养物(Takeda等人，2002)，用于渗入。所述农杆菌细胞用渗入培养基(10mMMgCl2，10mMMES，3％蔗糖和150μM丁香酮水溶液，pH5.6)，对于个体农杆菌嵌合体株给予终OD600为0.25，且对于用根癌农杆菌LBA4404(pBIN-NSs)共渗入的构建体给予组合的OD600为0.5。菌株在22℃孵育2小时以让vir基因在渗入前表达。
六周龄的本生烟草叶片通过注射菌悬液进入叶腹侧远轴的空处以进行农杆菌渗入(Maclean等人，2007)。植物在16小时光照，8小时黑暗，22℃条件下生长需要的时限。嵌合体表达计时测验在渗入后(dpi)1-9天进行，且嵌合体与NSs沉默抑制子或者共表达或者不共表。对于每个嵌合体使用分离的植物，且同一植物的分离的叶片用任一个pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP或pRIC3嵌合体构建体进行渗入，用于比较载体的表达。
从植物中的蛋白提取
用微量离心管帽切下以从农杆菌深入的叶片中收获的叶子圆片(～10mg每片，3片/构建体)并置于液氮中。叶材料以250μl每片悬浮于1.5MNaCl高盐PBS(HSPBS)提取缓冲液中，所述缓冲液含有蛋白酶抑制剂(EDTA-feeCompleteProteaseInhibitor；Roche)。粗植物提取物用离心法13，000rpm5分钟净化两次，且上清液储存在-20℃。
表达L1嵌合体的植物的蛋白质印迹检测
植物提取物在上样缓冲液中95℃孵育5分钟(Sambrook等人，1989)，用10％SDS-PAGE凝胶分离，并利用半干-电印记转移到硝酸纤维素膜。将膜用封闭缓冲液室温封闭30分钟(5％脱脂奶，0.1％Tween-20在1xPBS中，pH7.6)并在用封闭缓冲液稀释的抗L1的一抗4℃孵育过夜。HPV-16L1蛋白或者用小鼠单克隆(MAb)CamVirl(1：10000；Abcam，UK)检测，其结合L1位于aa230-236的线性表位GFGAMDF(McLeanetal，1990)，或用H16.J4(1：2500)检测，其结合位于在L1蛋白的FG环内的aa261-280的线性表位(Christensen等人，1996)。二者的结合位点均没有被L2表位插入而破坏。
膜用封闭液清洗4x15分钟，并用稀释在封闭缓冲液中的二抗缀合有碱性磷酸酶的羊抗小鼠抗体(1：10000；Sigma)室温孵育2小时。最后用洗涤缓冲液(0.1％Tween-20在1xPBS中，pH7.6)洗膜4x15分钟并用氯化四唑/5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐底物(NBT/BCIPsubstrate；Roche)显色。嵌合体的表达通过用GeneTools(SYNGENE)测量抗-L1蛋白质印迹检测的条带的密度进行比较。
通过捕获ELISA对嵌合体进行定量
从本生烟草提取的L1嵌合体使用改性聚乙烯醇(PVA)封闭ELISA方法通过捕获ELISA进行定量(Studentsov等人，2002)。简要的，96-孔Maxisorp微量滴定板用1：2000小鼠抗HPV-16L1MAb(CamVirl或H16.J4二者之一)4℃包被过夜，并用PVA封闭。植物提取物加入孔中，并在37℃孵育1小时。接着是清洗步骤和加入兔抗-HPV-16多克隆血清(1：1000)。板在4℃孵育过夜，然后HPV-16L1蛋白用缀合有辣根过氧化物酶(HR)的猪抗兔(1：5000；DAKO)和1.2-苯二胺二氢氯化物底物(OPD；DAKO；Denmark)检测。
商品化的HPV疫苗Cervarix用作正ELISA对照，且作为HPV-16L1VLP标准。每个样品做一式三份的分析，并用Cervarix标准曲线进行定量。存在于每个样品(mg)中的嵌合体蛋白的量用每公斤植物组织(mg/kg)中的嵌合体来表示。
每个叶粗提物的总可溶蛋白(TSP)根据每个制造商的使用说明，用牛血浆γ-球蛋白IgG蛋白标准(Bio-Rad)，使用Lowry蛋白测定法(BioradDCProteinAssay；MicroplateAssayProtoc0l)进行确定。计算相对的嵌合体产量，其中ELISA-定量的嵌合体蛋白(mg)用占TSP的百分数表示，用以说明叶组织重量和蛋白提取效率的不同。
嵌合体表达产量的统计分析
使用不同植物表达载体的嵌合体表达的统计学的不同使用ANOVA和FischerLSDPostHoc测试进行测定。在p＜0.01报道差别为统计学上显著的。
嵌合体组装
HPV蛋白组装成高阶的抗原结构用如上所述的H16.J4和H16.V5捕获ELISA进行评估。H16.J4MAb结合于L1的包含aa261-280的线性表位(Christensen等人，1996)并且因此给出植物提取物中的存在的总HPV蛋白。H16.V5结合构象的L1表位(Christensen等人，1996，2001)，所述表位包含基本的aa260-290和特异的结合L1残基Phe-50，Ala-266，和Ser-282(White等人，1999)，因此其用于检测组装的HPV蛋白。为了比较用不同载体表达的嵌合体的组装，组装的HPV蛋白的量以占总HPV蛋白的百分数表示。
结果
验证L1嵌合体克隆
L1嵌合体(表1)成功克隆入pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3植物表达载体并转化入大肠杆菌和农杆菌GV3101。
pTRAkc-rbcsl-cTP重组克隆用结合MCS上游和下游的pTRAc-特异性的引物或结合不同L2表位的嵌合体-特异的引物通过菌落PCR进行筛选。所有嵌合体产生如表3所预测的预期大小的片段。
克隆进一步用位于嵌合体基因插入片段侧面的EcoRI和XhoIRE位点通过限制性酶(RE)消化进行校验。如预期的，所有嵌合体包含1.5kb的基因插入片段。克隆进行测序并且个体嵌合体用DNAMAN多重序列比对软件进行确认。
pRIC3重组克隆类似的用嵌合体表位特异的引物的菌落PCR和HindIII/XhoI限制型酶消化进行校验。所有嵌合体产生如表3描述的0.2-0.6kb嵌合体-特异的PCR条带和在RE消化中的1.5kb基因片段。因此，所有HPV嵌合体成功亚克隆入pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3植物表达载体。
本生烟草中L1嵌合体表达的优化
与NSs沉默抑制子共表达
本生烟草中叶绿体-靶向的HPV-16L1/L2表达在渗入后计时测定(dpi)的1-9天进行检测。嵌合体或者与NSs沉默抑制蛋白(+)表达或者不与NSs沉默抑制蛋白(-)蛋白表达以检测其对于嵌合体表达的效果。表达使用抗-L1MAbCamVirl进行蛋白质印迹。所有L1/L2嵌合体检测出具有预测的～56kDaL1条带(图2)，尽管L1/L2(108-120)比其它嵌合体跑的更高。
当与沉默抑制蛋白NSs共渗入时，所有嵌合体显示持久的表达的增加(图2A-D)，提示其在植物中阻断翻译后基因沉默和增强蛋白积累方面是有效的。使用线性表位特异的MAbH16.J4的ELISA检测证实以下结果：L1/L2的产量增加多达16倍(数据未显示)。无NSs的嵌合体表达在1-3dpi检测出并在3-5dpi达到峰值，而含有NSs的嵌合体的共表达在3dpi检测出并在5-7dpi到达峰值。在5-9dpi之间表达有小的降低，提示在表达水平有缓慢的减退(ELISA结果，数据未显示)。因此，在进一步的实验中，所有嵌合体与NSs共表达。
对于L1/L2(17-36)嵌合体检测出几个高分子量的条带，提示叶绿体信号序列(cTP)可能未被切除或嵌合体可能被糖基化。然而，在随后的蛋白质印迹对L1/L2(17-36)的分析中，其并没有展示出这些高分子量条带，提示蛋白部分变性，如图2C。
包含BPVL2aa1-88表位的L1/L2嵌合体与包含HPV-16L2表位的嵌合体相比具有低的表达水平。L1/L2BPV(1-88)蛋白质印迹的条带仅在显色16小时后才能看到(图2D)，相比较，其它嵌合体需要15分钟显色时间(图2A-C)。ELISA定量估计L1/L2BPV(1-88)获得的最大产量为40mg/kg植物组织，而其它L1/L2嵌合体估计最大表达产量为1000-4600mg/kg(数据未显示)。此外，L1/L2BPV(1-88)植物提取物含有一个与L1降解相关的特征性的～45kDa条带(图2D)，提示L1/L2BPV(1-88)在表达系统中不稳定。这些结果通过几次不同计时测验的L1/L2BPV(1-88)蛋白质印迹证实。
叶绿体靶向对L1/L2嵌合体产量的影响
HPV蛋白靶向叶绿体能显著改善植物表达产量(Maclean等人，2007)。为了确定叶绿体-靶向的重要性，pTRAc(细胞质靶向)和pTRAkc-rbcsl-cTP(叶绿体-靶向)L1/L2嵌合体构建体与pBIN-NSs在计时测验的3-9dpi共渗入本生烟草。L1/L2BPV(1-88)嵌合体未包含在此研究中，因为其在与其它L1/L2嵌合体比较时显示出在本生烟草中很低的表达。
蛋白质印迹和ELISA数据一致证明细胞质靶向的L1/L2嵌合体的低表达，在3dpi具有嵌合体的最大表达，且产量为20-45mg/kg植物组织(数据未显示)。与在上样前3x稀释并作为正对照的叶绿体靶向的L1/L2(108-120)嵌合体相比，细胞质靶向的L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)的表达微弱的检测到。比较嵌合体的产量表明当靶向叶绿体时，L1/L2嵌合体表达增加40-80倍。考虑到这些结果，进一步的嵌合体表达研究使用pTRAkc-rbcsl-cTP载体完成。
使用自复制型的pRIC3植物表达载体进行优化
在改善嵌合体产量，尤其是低表达的L1/L2BPV(1-88)的尝试中，植物表达载体pRIC3(自复制型的，细胞质靶向载体)与pTRAkc-rbcsl-cTP(非复制型的叶绿体靶向载体)在NSs存在下在计时测试中的3-9dpi进行比较。
两种载体的最大嵌合体产量都在3-5dpi获得。相比自复制型的pRIC3载体，使用叶绿体靶向pTRAkc-rbcs-cTP载体的三种包含HPV-16L2表位aa108-120，56-81和17-36的L1/L2嵌合体表达得更好。L1/L2BPV(1-88)对于任一载体中表达都不高并两个构建体中都看到降解。
ELISA定量显示自复制型的pRIC3载体没有改善大多数嵌合体表达产量。使用pTRAkc-rbcsl-cTP载体，产量达到增高到三倍，提示叶绿体靶向比最终将表达的蛋白靶向到细胞质的pRIC3载体在嵌合体的高表达方面更有效。L1/L2BPV(1-88)表达水平与NSs负对照类似，提示植物不是生产L1/L2BPV(1-88)的可行系统并且L1/L2BPV(1-88)的表达不再进一步继续。
使用pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3载体表达优化的结果在表4中概括。L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)高表达。在最初的计时测验中，显示出增加表达的参数有：与NSs共表达，在5dpi提取，和使用pTRAkc-rbcs-cTP载体以将表达的L1/L2蛋白靶向叶绿体。
表4：L1嵌合体表达和优化的概要
L1/L2嵌合体的载体表达比较
三种高表达L1/L2嵌合体选作为疫苗抗原用于小鼠免疫原性研究：L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)。进行包含三个生物学重复的最终表达研究以确定L1/L2的结果，并获得统计学上的有效数据。所有三种载体(pTRAc，pTRAkc-rbcsl-cTP和pRIC3)直接比较每个中L1/L2疫苗抗原的表达，包含HPV-16L1作为正对照(pTRAc和pTRAkc-rbcsl-cTP构建体是有效的)，并且NSs-渗入的植物用作负对照。嵌合体与NSs共表达并在5dpi提取。
表达对植物的影响
在5dpi提取之前，对渗入的叶片进行检查，提示自复制型的pRIC3载体对于植物的健康有副作用。pRIC3渗入的叶片颜色为黄/褐色且在渗入区域可看到叶片组织的坏死。在同样是将嵌合体靶向植物细胞质的pTRAc叶片中，观察到较低程度的这种现象。pTRAkc-rbcs-cTP叶片似乎是最健康的，类似于NSs-渗入的叶片负对照和未渗入的叶片，提示在叶绿体中嵌合体的堆积对于植物健康具有较小的影响(结果未显示)。渗入似乎对植物健康没有看得见的影响，因为NSs-渗入的叶片看上去与未渗入的叶片相似(除注射器注射的印记之外)。这些结果在所有计时测验中一致的观察到。蛋白质印迹检测HPV蛋白
HPV蛋白用抗L1蛋白质印迹检测(图3a)。NSs-渗入的植物提取物(负对照)未检测到且源于植物的HPV-16L1(正对照)用叶绿体靶向载体检测到。使用不同载体的表达直接与一向给出最高表达产量的pTRAkc-rbcsl-cTP比较，然后用pRIC3，且之后pTRAc。
HPV蛋白的ELISA定量
使用CamVirl的捕获ELISA用于量化HPV嵌合体。L1/L2嵌合体和HPV-16L1产量显示于图3b。使用三种植物表达载体的嵌合体表达的统计学的差异用ANOVA和FischerLSDPostHoc检验进行确定。p＜0.01报告为差异是统计学显著的。
使用pTRAkc-rbcsl-cTP的L1/L2嵌合体和HPV-16L1的叶绿体靶向的表达产生比NSs-渗入的负对照(p＝0.000-0.002)和细胞质靶向pTRAc载体(p＝0.000-0.004)显著更高的产量。此外，pTRAkc-rbcsl-cTP相比pRIC3，显著改善L1/L2(56-81)的表达(p＝0.006)。pRIC3载体相比pTRAc没有统计学的改善任何嵌合体的表达。
与优化实验相比(图2，表4)，对比的计时测验证明了嵌合体表达中的类似的趋势。叶绿体靶向的L1/L2嵌合体产生最高的产量(1040-1310mg/kg；2-3％TSP)，与细胞质靶向载体pTRAc(50-260mg/kg；＜1％TSP)相比，嵌合体表达改善达28倍，与自复制型的载体pRIC3(190-660mg/kg；＜1％TSP)相比，嵌合体表达改善达7倍。
使用自复制型的载体pRIC3，与非复制型的pTRAc载体相比，细胞质靶向的嵌合体产量改善达4倍。这提示载体的自复制改善嵌合体表达，尽管靶向叶绿体似乎是增加植物中嵌合体表达的更好的策略。
尽管叶绿体靶向的HPV-16L1证明具有更高的平均产量(1710mg/kg，4％TSP)，L1/L2嵌合体和L1之间的差异不是具有统计学显著的，表明L2表位替代似乎不影响表达和叶绿体中重组蛋白的积累。然而，蛋白质印迹(3a)和ELISA表达数据(图3b)一致显示细胞质定位的L1/L2(108-120)和L1/L2(17-36)比L1/L2(56-81)更高的水平，提示具有更短L2序列替代(分别为13个和20个aa)的L1/L2(108-120)和L1/L2(17-36)嵌合体可能更好表达，且比含有26aa序列替代的L1/L2(56-81)具有更好的稳定性。
HPV蛋白的组装
嵌合体组装为高阶结构如壳粒或VLP，用H16.J4(线性表位-特异的MAb)和H16.V5(构象表位-特异的MAb)捕获ELISA评估。对于每个载体构建体，V5检测到的构象的HPV蛋白的量表示为J4-检测到的总HPV蛋白的百分数(图4)。
低百分数的表达嵌合体组装为H16.V5-检测到的高阶结构。作为负对照的NSs植物提取物，不结合H16.J4或H16.V5MAb(数据未显示)。低表达的pTRAc嵌合体似乎具有最高的组装蛋白的比例(11-18％)，然后是具有高表达的pTRAkc-rbcsl-cTP嵌合体(5-9％)。pRIC3嵌合体不包含高百分数的组装蛋白(＜2％)。尽管pTRAkc-rbcsl-cTP嵌合体不包含最高百分数的组装蛋白，但更高的达表达产量导致分别比pTRAc和pRIC3多达40倍和4倍的组装蛋白。这提供进一步的证据证明pTRAkc-rbcsl-cTP是用于生产产生免疫原性的L1/L2嵌合体的最好的载体。
讨论
植物中L1嵌合体瞬时表达的优化
所有的L1嵌合体成功使用农杆菌-介导的瞬时系统在植物中表达(图2)。几种方法用于优化植物中嵌合体表达；包括使用NSs沉默抑制子，使用农杆菌渗入-递送的自复制型的病毒载体和将表达蛋白靶向叶绿体。
与NSs沉默抑制子共表达
农杆菌-介导的瞬时表达典型的在在渗入后60-72小时(～3天)达到峰值，并且然后由于触发宿主植物中转录后基因沉默(PTGS)而快速下降(Voinnet，2001)。PTGS是一种适应的抗病毒植物防御机制，其中外源RNA分子被识别并以序列特异的方式降解(Meins，2000；Sijen和Kooter，2000)。作为一种反防御的策略，很多植物病毒具有进化的蛋白，其可以抑制该机制的不同步骤(Voinnet，2001)。尽管PTGS应答减少了在植物细胞质中的转基因mRNA积累并限制了农杆菌-介导的瞬时表达的效率(deCarvalho等人，1992；VanBlokland等人，1994)，与病毒沉默抑制子共表达蛋白已显示抑制PTGS应答并允许高水平的瞬时表达，产生更高的产量(在一些情况下50倍)和延长的转基因的表达(Voinnet等人，2003)。
与番茄斑萎病毒(TSWV)沉默抑制子NSs共渗入抑制PTGS并增加瞬时表达(Takeda等人，2002)。该效果在瞬时表达L1/L2嵌合体中类似的观察到(图2)。嵌合体典型的在不存在病毒沉默抑制子时，在3-5dpi展示出最高的表达水平。然而，与NSs共表达展示出在嵌合体表达中的延长的增加，由此，表达水平增长达16倍且在5-7dpi到达峰值。
自复制型的BeYDV载体的使用
使用自复制型的pRIC载体，细胞质的HPV-16L1产量改善50％(Regnard等人，2010)。因此，第三代pRIC3载体作为改善嵌合体产量的可能策略被检验。三种L1/L2嵌合体被检验：L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)。相比pTRAc(非复制型的载体)，使用pRIC3(自复制型的载体)，所有的嵌合体证明具有更高的表达水平，提示转基因的扩增改善植物细胞质中L1/L2产量(图3a和b)。然而，叶绿体靶向在高水平的L1/L2嵌合体积累方面更有效(图3b)并且叶片组织的坏死在pRIC3-渗入的叶片中观察到，提示载体的自复制消极的影响植物健康。
L1嵌合体的叶绿体靶向
L1嵌合体使用pTRAkc-rbcsl-cTP载体靶向叶绿体。叶绿体转移肽(cTP)融合于表达的嵌合体并在刚进入细胞器时就由叶绿体基质加工肽酶(SPP)切割(Robinson和Ellis，1984)。有几种因子负责叶绿体中蛋白的高水平积累：(a)细胞蛋白酶的保护，(b)在质体中不同的蛋白水解机制和(c)保护性的质粒特异的分子伴侣，其参与L1的正确折叠并因此改善蛋白稳定性(Fernández-SanMillán等人，2008)。在本研究中，叶绿体靶向是高度有效的，并且与靶向细胞质的嵌合体相比，L1/L2嵌合体产量增加40到80倍(图3a)。
在抗L1蛋白质印迹检测到的叶绿体靶向嵌合体产生～56kDa的条带(图2)，提示信号肽从积累的蛋白质中有效的移除。尽管L1/L2(108-120)比其它嵌合体在蛋白质印迹中跑得更高(图2)，该现象不是由于信号肽的不充分的切除，因为用pTRAc表达的细胞质-定位的L1/L2(108-120)，和昆虫细胞表达的L1/L2(108-120)的平行分析(数据未显示)，显示类似的带型。
对于L1/L2(17-36)嵌合体，检测出～65kDa的更高分子量的条带(图2)，可能由于嵌合体的糖基化或不充分的变性。产生于幼小仓鼠肾细胞(BHK)中的HPV-16L1的糖基化形式由McLean等人(1990)描述，由此，对于L1CamVirl检测出两个条带：一条56kDa的L1主带和和一条～64kDa的次带。当在N-糖基化抑制剂依霉素存在下感染，附加条带随后从细胞溶解产物中除去。尽管植物中的确存在糖基化通路(Rybicki，2009)，后续的蛋白质印迹显示单一的～56kDa条带，提示L1/L2(17-36)嵌合体在初始表达中是部分变性的，而不是糖基化的(图3a)。
植物表达载体的直接比较
两种策略已增加植物表达的L1产量到最大530-550mg/kg(i)将蛋白靶向叶绿体(Maclean等人，2007)或(ii)使用农杆菌渗入呈递的自复制型的BeYDV-derived表达载体(Regnard等人，2010)。这是利用基于L1的嵌合体直接比较这些策略的首次研究。利用植物表达载体pRIC3(自复制型的，细胞质靶向的载体)的嵌合体表达水平直接与pTRAkc-rbcsl-cTP比较。使用pTRAc（非复制型的，细胞质靶向载体)的表达用于比较的目的且HPV-16L1用于正对照(图3a和b)。
对于大多数嵌合体，叶绿体靶向产生最高的产量(图3a和b)并改善L1/L2嵌合体表达相对于pRIC3达7倍和相对于pTRAc达28倍，两者都将表达的蛋白靶向细胞质(图3b)。统计学分析显示叶绿体靶向的L1/L2产量显著高于细胞质靶向的L1/L2产量(p＜0.01)。然而，叶绿体靶向的嵌合体和用自复制型的pRIC3载体表达的嵌合体之间产量的差异仅对于L1/L2(56-81)是显著的。这些结果提供证据证明pTRAkc-rbcsl-cTP是用于HPV嵌合体的高水平生产的最好的载体。
L1/L2嵌合体的表达
高表达的包含HPV-16L2表位L1/L2嵌合体
L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)嵌合体是高表达的，产量比其它嵌合体高达20倍(表4)。因此，这三种L1/L2嵌合体选作疫苗抗原用于小鼠免疫原性研究。
叶绿体靶向的L1/L2嵌合体一贯被证明是具有最高的嵌合体产量，～1200mg/kg植物组织(2-3％TSP)。尽管HPV-16L1证明有比L1/L2嵌合体更高的产量，差异统计学上并不显著(图3b)。这表明L2表位不显著影响表达叶绿体中HPV蛋白的积累。此外，嵌合体产量比发表的用农杆菌-介导的烟草表达系统生产的HPV-16L1产量高～2倍(Maclean等人，2007；Regnard等人，2010)并且这些嵌合体的生产是商业上可行的(＞1％TSP；Fischer等人，2004)。
组装为高阶结构与更低的蛋白水解易感度相关(Chen等人，2000)并且据推测，高的L1/L2的积累可能由于组装导致。构象特异的H16.V5MAb结合组装的蛋白(Christensen等人，1996)并可以用于检测组装为高阶结构(Carter等人，2003；Wang等人2003；Ryding等人，2007)。所有植物表达的L1/L2嵌合体和HPV-16L1对照似乎包含低比例的组装蛋白(＜20％TSP)，提示多数蛋白以未组装的L1单体存在。然而L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)嵌合体都含有与L1C-端区域aa428-483重叠的，显示对于结合H16.V5重要的L2序列(Varsani等人，2006b)，提示该MAb可能不适于检测嵌合体组装并且不能用于类似的定量。
含有BPVL2aa1-88表位的L1/L2嵌合体的不稳定性
L1/L2BPV(1-88)嵌合体相比包含HPV-16L2表位的嵌合体具有低的表达水平(图2)。ELISA定量估计的表达水平与NSs负对照类似，尽管L1/L2BPV(1-88)在用H16.J4MAb探测的蛋白质印迹中检测到，且显示出40mg/kg植物组织低的低产量(图2，ELISA数据未显示)。此外，叶绿体靶向的L1/L2BPV(1-88)部分降解(图2D)，其已在之前的几个HPVL1表达研究中描述过(Hagensee等人，1993；Sasagawa等人，1995；Li等人，1997；Kohl等人，2007)。
这些结果提供证据表明L1/L2BPV(1-88)不良好表达，在本植物表达系统中也不稳定。L1/L2BPV(1-88)嵌合体包含最大的L2序列替代，且88个残基的表位替代了L1的整个C端区域(表1)。HPVL1C端区域在VLP组装中起作用(Zhou等人，1991b；Varsani等人，2006b；Bishop等人，2007)，且删除C端区域阻断组装为对降解更低易感度的高阶结构(Chen等人，2000)。L1C端区域用外源表位序列的序列替代不适一个有效的HPV嵌合体表达策略且植物L1/L2BPV(1-88)表达不是可行的系统。
实施例2：HPV抗原的纯化和组装
方法和材料
大规模瞬时表达和抗原提取
如Maclean等人(2007)所描述，本生烟草植物(2-4周龄)用编码NSs沉默抑制蛋白的根癌农杆菌LBA4404(pBIN-NSs)和编码HPV-16L1或L1/L2嵌合体的农杆菌GV3101株真空渗入。植物在16小时光照，8小时黑暗，22℃下培育五天。
收获渗入的叶片，称重并利用研杵置于液氮中。含有0.5MNaCl和蛋白酶抑制剂(RocheCompleteEDTA-free)的PBS提取缓冲液以1：4(w/v)的比例加入，并且样片在韦林氏搅切器(Waringblender)于冰上匀浆10分钟。匀浆在冰上以6x20s间隔超声并静止(Macrotipsonication；Level8；HeatSystems-Ultrasonics，Inc.SonicatorCellDisruptorModelW-225R)，溶胞产物通过双层Miracloth(CALBIOCHEM)过滤。粗提液通过13，000rpm10分钟离心两次使澄清。沉淀在1mlPBS中重悬并储存在-70℃。上清和沉淀用蛋白质印迹检测以确定HPV抗原相对上清的定位。
HPV抗原的预纯化
检验了几种纯化植物表达L1疫苗抗原的方法。检测了基于尺寸的方法如交叉流微量过滤和使用蔗糖和氯化铯密度梯度的超速离心法，以及单步阳离子交换和肝素层析用于快速纯化L1和基于L1嵌合体。层析前，在包含0.5MNaCl的PBS中提取的L1蛋白在低盐PBS(LSPBS：10mMNaClPBS，pH7.4)中10倍稀释以让L1结合于柱。使用超滤以浓缩抗原且脱盐层析的部分用于下游小鼠免疫原性研究的应用。
整体的，使用肝素层析和使用超滤离心管膜渗滤纯化是最好的获得部分纯化的L1和基于L1的嵌合体的方法，并且这些方法用于为后续的小鼠免疫原性试验制备疫苗抗原。
疫苗抗原的纯化
样品制备
HPV-16L1和基于L1的嵌合体在本生烟草中表达，且如以上实施例1中所描述的，使用LSPBS作为提取缓冲液提取。在层析前，两次澄清的L1/L2(108-120)，L1/L2(56-81)，L1/L2(17-36)，HPV-16L1和NSs-渗入的植物提取物的粗制上清(分别是疫苗1-5)用0.22μm微孔滤豁(Milliporefilter)过滤以除去碎片。
肝素层析
层析用进行。程序按照GEHealthcare柱使用说明手册中推荐的，维持0.5ml/min流速。上样前，柱用10个柱体积(cv)的低盐洗涤缓冲液(LSPBS：10mMNaClPBS)平衡。粗提液(10-20ml)装入预装的1mlHiTrap肝素阳离子交换柱(GEHealthcare，AmershamBiosciencesAB，Sweden)且柱用10cv的LSPBS洗涤缓冲液清洗。每种HPV抗原的洗脱条件在预试验中使用线性的离子强度梯度进行优，由此，10cv的0-100％的包含1.5MNaCl的高盐PBS(HSPBS)洗脱缓冲液应用于柱。一旦确定当＜50％HSPBS用于柱时，所有抗原被洗脱，那么50％分步洗脱梯度(0.75MNaCl)用于纯化疫苗抗原.分步洗脱梯度为10cv50％HSPBS，继之以10cv的100％的HSPBS。柱最终用5cv的蒸馏水和5cv20％的乙醇洗涤。收集级分(1m1)并用蛋白质斑点印迹进行分析。
纯化的HPV抗原的蛋白质斑点印迹检测
斑点印迹用以上实施例1中描述的进行。CamVirl(1：10000)用于探测L1和Cervarix用作正对照。包含高浓度纯化抗原的洗脱级分集合起来并储存于-70℃。对于NSs-渗入的植物提取物(V5：负对照)，与洗脱蛋白峰对应的级分集合起来并在L1正对照疫苗(V4)斑点印迹中测试，以确定其不含有L1。
通过超滤对纯化的抗原样品的脱盐
50％HSPBS洗脱缓冲液(0.75MNaCl)中的纯化的抗原在小鼠接种之前脱盐。具有10kDaMWCO过滤器的超滤离心管(CentrifugalDevices，10KOmega，PALLLifeSciences)通过将样品在7000g离心15-30分钟用于纯化的L1级分的浓缩和脱盐。根据制造商的使用说明，包含L1抗原的渗余LSPBS中稀释并通过超滤再浓缩几次，直到样品包含的NaCl的浓度与商业化的PBS(～0.15MNaCl)中得到的相似。渗余物和滤出液级分均检测。
抗原纯度分析
HPV抗原的考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹检测以评估纯化
每种疫苗抗原的粗提液和纯化样品通过考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹分析进行比较。样品用上述实施例1描述的进行制备，且相等体积上样到两块10％SDS-PAGE蛋白胶中。一块胶用考马斯亮蓝溶液染色室温过夜并在37℃脱色2x2小时。另一块胶印迹到硝酸纤维素膜上并用CamVirl探测。
总可溶蛋白定量
负对照疫苗(V5：NSs-渗入的植物提取物)不能用抗L1蛋白质印迹定量。因此，总可溶蛋白(TSP)的量使用BioradLowry蛋白测定法(以上实施例1描述的)检测每个疫苗抗原以确定对于所有疫苗TSP是相似的。
用捕获ELISA检测HPV抗原以确定相对于TSP的抗原的富集
捕获ELISA如实施例1描述的进行，使用线性表位-特异的单克隆抗体(MAb)H16.J4。通过ELISA确定的HPV抗原产量与在粗制和纯化的样品中相应的TSP产量比较以确定抗原的富集。
纯化的疫苗抗原的蛋白质印迹定量
疫苗Cervarix的系列稀释(含有40ug/ml昆虫细胞生产的HPV-16L1)用于定量植物生产的HPV抗原(V1-4)。分析抗原的几个稀释度以确保定俩个在标准曲线的线性范围内。相等体积纯化的抗原和Cervarix稀释液上样入10％SDS-PAGE胶中，蛋白印迹到硝酸纤维素膜上，且HPV抗原用CamVirl(1：10000)检测。
密度测定(GeneTools，Syngene，SynopticsLtd)用于定量抗原(如Aires等人，2006；Bazan等人，2009所做的)且存在于样品中HPV蛋白的量使用由Cervarix稀释系列产生的标准曲线确定。定量的HPV抗原储存在-70℃。
抗原的细胞质表达和提取
为了确定当嵌合HPVL1/L2蛋白靶向细胞质时是否小的病毒样颗粒也形成，与叶绿体相反，本生烟草植株用含有与沉默抑制子NSs一起的pRICL1/L2(108-120)；L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)的重组农杆菌，使用以上描述的方法渗入。3到5天后，收获渗入的叶片，碾碎且细胞碎片离心除去。
投射电子显微镜法的结构分析
如果它们制备用于小鼠接种，将纯化的疫苗抗原的等分试样预处理。抗原在4C解冻过夜，重悬在PBS到需要的浓度并在37℃孵育30分钟。
为了确定纯化的效果，每种抗原的预处理的纯化的抗原和粗制的植物提取物在PBS中10x稀释，用CamVirl(1：1000)(一种线性表位-特异的HPV-16L1抗体，其对L1单体和组装的L1蛋白都结合)免疫捕获(McLean等人，1990)，且捕获在辉光放电的碳包被的铜栅格上。蛋白用2％醋酸双氧铀负染，并在Zeiss912OmegaCryoEFTEM上观察。
结果
植物表达的HPV抗原的纯化
澄清的提取物中的HPV抗原的检测
对于澄清的上清中L1和L1/L2嵌合体的定位通过蛋白质印迹分析来确定。考马斯亮蓝-染色的蛋白胶显示上清中Rubisco的大量存在和沉淀中个别污染蛋白的移除(数据未显示)。
HPV抗原的预纯化
各疫苗抗原之间，使用基于大小的技术进行纯化基本上是不成功的和不可重复的，因为与L1相比，L1/L2嵌合体似乎组装为多种结构。此外，检测到蛋白降解，并且因此使用层析进行纯化被验证为备选的方法。
尽管使用HiTrapSPFF或POROS50HS柱的阳离子交换层析在纯化基于L1嵌合体时不成功，肝素亲和层析纯化了所有疫苗抗原。层析级分的浓缩和脱盐使用两种基于超滤的方法(用交叉流过滤或离心旋转柱(centrifugationspincolumn))验证。尽管交叉流超滤有效，但该方法相对时间代价高且检测到显著的蛋白降解，导致优先使用旋转柱。因此，肝素层析和离心超滤被认为是为后续小鼠免疫学实验纯化疫苗抗原的最好策略。
使用肝素层析纯化
通过肝素层析，使用高NaCl梯度用于洗脱HPV抗原，疫苗抗原从澄清的粗制植物上清中纯化。每个HPV抗原的分步洗脱梯度使用线性的0-100％1.5MNaCl梯度优化。所有HPV抗原在0.45-0.75MNaCl之间洗脱(数据未显示)。因此，使用50％(0.75MNaCl)分布梯度纯化疫苗抗原用于小鼠免疫原性研究。使用CamVirl斑点印迹确定洗脱级分中纯化的HPV抗原的检测。
当HSPBS洗脱缓冲液用于柱时，检测到吸收峰，且这些级分含有纯化的HPV抗原。对于其它疫苗抗原，层析图是类似的，包括对于NSs-渗入的植物提取物(负对照)的图。这表明HPV抗原与其它污染的植物蛋白共同纯化。
收集包含部分纯化HPV抗原(或用于负对照的共洗脱的植物蛋白)的级分并且然后用超滤离心柱脱盐。蛋白质斑点印迹显示HPV抗原成功保留和浓缩(数据未显示)。
疫苗抗原的纯度
通过将纯化的样品和粗制的植物提取物比较检验疫苗抗原的纯度。这使用考马斯亮蓝染色完成，以显示存在于样品中的总蛋白(图5A)，并且用以检测HPV抗原的蛋白质印迹分析显示抗原产量中的损失(图5B)。注意L1/L2(108-120)嵌合体(V1)比其它L1/L2嵌合体(V2-3)和L1对照(V4)跑得更高。
图5显示由于纯化工艺导致纯化的样品L1富集。考马斯亮蓝染色的胶显示纯化的样品中总蛋白的大量增加，而蛋白质印迹结果显示纯化后抗原产量中仅有小量的增加。在负对照中L1抗原未检测出(V5：NSs-渗入的植物提取物)。
样品仅部分纯化，因为在图5A中可以看到，对于纯化的抗原V1和V3(比V2和V4更浓缩的)，检测出额外的考马斯亮蓝染色的蛋白条带，因此证明纯化的样品包含个别污染植物蛋白。同样，尽管NSs负对照(V5)未在蛋白质印迹中检测出，在纯化的NSs样品中看到个别类似的考马斯亮蓝条带。
纯化的样品中HPV抗原的富集
测定纯化的抗原的TSP以：(a)确保与其它疫苗抗原相比，对于NSs负对照TSP(包含与HPV抗原共纯化的植物蛋白)是类似的，和(b)测定纯化后HPV抗原的富集。纯化的HPV疫苗抗原(V1-4)的TSP是相似的，然而NSs植物提取物负对照(V5)的TSP几乎高两倍，可能是由于收集了更多的洗脱级分或更强烈的超滤浓缩(数据未显示)。从而，其因此在1xPBS中稀释。
使用线性-特异性的H16.J4MAb的捕获ELISA，用于估计存在于粗制的和纯化的样品中HPV抗原的量。为了确定关于TSP的纯化和HPV抗原富集的效果，H16.J4-检测的HPV产量直接与粗制的和纯化的样品二者的TSP产量相比较(图6)。
图6证明植物提取物的纯化减少了TSP和总HPV蛋白，正如所料。然而，相对于TSP，在纯化的样品(V1-4)中，HPV抗原有达5倍的富集，提示肝素层析在移出大部分污染蛋白方面是有效的。NSs-渗入的植物提取物(V5)在纯化的TSP中显示类似的减少，并且，“纯化的”负对照中的TSP量位于获得的HPV疫苗抗原(V1-4)的水平之间.
纯化的HPV抗原的蛋白质印迹定量
HPV抗原通过蛋白质印迹，利用密度测定和使用商业化疫苗Cervarix作为标准进行定量(数据未显示)。在一些纯化的抗原组中检测到，尤其在几次冻融循环之后，一些L1蛋白降解，以～45kDa条带可看到。然而，在为小鼠免疫原性制备的样品中，仅定量全长56kDaL1条带。
纯化的疫苗抗原的结构分析
粗制的和纯化样品二者中的在植物叶绿体中产生的的L1和L1/L2嵌合体的结构组装体通过透射电子显微镜法分析(图7)。在细胞质中产生的L1/L2嵌合体的结构组装体通过免疫捕获透射电子显微镜法从粗制样品中分析(图8)。抗原纯化导致污染背景蛋白的移出，尤其对于L1/L2(108-120)和负对照(分别在图7A和E中)。与负对照(NSs-渗入的植物提取物)相比，所有的HPV抗原似乎都含有二级HPV结构，或者是壳粒(～10nm)，或者是壳粒聚集体，或者是小VLP(～30nm)或者是全尺寸VLP(55nm)。
纯化的L1/L2(108-120)组装为小的嵌合VLP(cVLP)，其为形状规则但大小不同(～30nm)，而L1/L2(56-81)似乎仅含有壳粒和一些聚集体，尽管在粗提液中可看到类VLP颗粒。与粗提液相比，纯化的L1/L2(17-36)含有无定形cVLP和高比例的壳粒聚集体的混合群体，提示纯化促使形成高阶结构。如在之前的研究中描述的(Biemelt等人，2003；Maclean等人，2007)，纯化的V4，HPV-L1正对照，组装为明显的VLP(～50nm)。
讨论
尽管L1的稳定性由多重纯化步骤负面影响，严格的纯化对于商业生产疫苗是有必要的。肝素亲和层析可以用于选择性纯化组装的L1，并且使用一步纯化层析方法的策略对于快速和划算的生产HPV疫苗将是理想的。本研究报道使用肝素层析植物表达的HPV-16L1和三种L1/L2嵌合体的纯化用于后续的小鼠中免疫原性研究。
L1/L2嵌合体纯化的优化
HPV-16L1和基于L1的嵌合体定位于粗提液上清并用各种方法纯化。尽管依赖大小的纯化方法已用于纯化植物表达的HPVL1(Biemelt等人，2003；Maclean等人，2007；Fernández-SanMillán等人，2008)，但这些方法对于L1/L2嵌合体纯化效率低且抗原之间不可重复。基于L1的嵌合体广泛的在几个使用蔗糖和CsCl二者的密度梯度超速离心方法的级分中检测到，指示L1/L2嵌合体组装为不同的高阶结构，如壳粒，聚集体和VLP。此外，嵌合体和L1正对照组装的程度似乎不同。这通过透射电子显微镜方法证实(图7)，其显示在L1/L2嵌合体和L1对照之间明显的差异。
层析是选择性纯化HPVL1的下一个策略；或者基于表面电荷，或者通过对蛋白多糖肝素的亲和力。为纯化酵母表达的HPVL1使用阳离子交换层析已使用P-11磷酸纤维素(Kim等人，2009，2010)或POROS50HS柱(Cook等人，1999)证实。相比之下，使用强阳离子交换HiTrapSPFF柱或POROS50HS柱之一没有有效纯化L1/L2嵌合体。多数L1/L2蛋白不结合两者之间任一个柱，尽管小比例的蛋白强烈不可逆结合于POROS50HS树脂。这一现象已由Cook等人(1999)描述，由此10％HPV-11L1不结合树脂并且45-65％在未使用0.5MNaOH洗脱POROS50HS柱的情况下不能被回收。
因此，阳离子交换层析不在进一步使用，尽管纯化L1/L2嵌合体的弱的纯化的原因不清楚。存在两个HPV-16L1碱性C端区域，其含有正电性残基：aa473-488和492-505(Zhou等人，1991b；Sun等人，1995，2010)。L2序列的插入不与L1的C端的主要碱性区域重叠，并且代替在aa414-439处的最多26个残基。可能的解释是L1全部的表面电荷或者由插入的L2表位氨基酸组成或由蛋白组装中的差异影响。此外，粗制植物提取物可能已含有个别污染蛋白，该污染蛋白更强烈的结合于柱并胜过HPVL1的结合。
疫苗抗原的纯化
疫苗抗原使用肝素层析纯化(描述于Joyce等人，1999；Bazan等人，2009；Johnson等人，2009；Kim等人，2009，2010)用于后续的小鼠中免疫原性研究。肝素以类似的方式可逆的结合L1和L1/L2嵌合体二者(数据未显示)，并且所有抗原用0.75MNaCl洗脱。这可与其它研究中的肝素结合的HPV-16L1在0.5-1.2MNaCl之间洗脱相比(Bazan等人，2009；Kim等人，2010；Baek等人，2011)。
肝素通过结合不位于L1C端的构象基序选择性的纯化组装的L1蛋白(Fleury等人，2009)并且不受L2序列置换影响。这对于疫苗生产是尤其有益的，因为，变性的L1不诱导中和抗体的产生(Kirnbauer等人，1992；Suzich等人，1995；Breitburd等人，1995)。此外，Kim等人(2010)证明使用肝素层析对HPV-16L1的纯化产生高的回收量(～60％)产生具有免疫原性的VLP(25-65nm直径)。
肝素纯化的样品的纯度用考马斯亮蓝染色和使用CamVirl对L1检测的蛋白质印迹检验(图5)。纯化的样品用L1或L1/L2嵌合体富集，因为当与粗制的样品相比，存在总蛋白的显著的增加和抗原产量相对的减少。这有H16.J4捕获ELISA和TSP测试法证实(图6)。
样品是部分纯化的并且含有个别污染植物(V1和V2，图5A)，同样存在于纯化的负对照中(V5，图5A)。在使用肝素层析纯化酵母表达的HPV-16L1中也观察到污染(Kim等人，2010)。因此，用肝素层析的单一步骤方法不足以获得高度纯化的HPVL1和L1/L2嵌合体。Kim等人(2010)证明，通过额外的阳离子交换和疏水作用层析步骤未完全移除源自酵母的共纯化的污染蛋白，提示很多污染物具有类似的等电点和对于L1的疏水性特征。此外，额外的层析步骤减少L1回收率到～10％。然而，在肝素层析之前，通过硫酸铵沉淀酵母表达的HPV-16L1获得纯的HPV-16L1，该方法，其应该在使用植物表达的HPV基于L1的蛋白的进一步纯化研究中检验。
抗原的蛋白质印迹定量
纯化的抗原用蛋白质印迹分析定量(由Heidebrecht等人，2009讨论)，所述蛋白质印迹分析定量使用密度测定以测量CamVirl检测的L1条带的强度并且商业化的疫苗Cervarix作为HPV-16L1标准(数据未显示)。
在一些纯化的抗原的组中，检测到L1的降解，尤其在几次冻融循环之后。这在高浓度的V1，V2和V4中看到。然而，多数抗原蛋白不降解且仅对全尺寸的56kDaL1条带定量以保证小鼠用相似剂量的全尺寸抗原免疫。其它组已报道在昆虫细胞(Kirnbauer等人，1992)，酵母(Cook等人，1999)和细菌(Zhang等人，1998)表达时有类似的HPV-16L1降解模式。对于未来纯化研究的考虑是提取和渗入缓冲液的盐浓度，因为VLP在低盐条件下出现解体(Murata等人，2009)。增加盐浓度到0.5或1MNaCl可以稳定VLP(Mach等人，2006)并且减少在纯化样品中观察到的降解。
疫苗抗原的组装
在植物细胞叶绿体中生产的源于植物的HPV-16L1和L1/L2嵌合体的组装用免疫捕获电镜方法分析(图7)。纯化似乎移除一些背景蛋白并且所有植物表达的L1/L2嵌合体和L1正对照组装为高阶结构如壳粒，聚集体和VLP。
植物表达的HPV-16L1VLP在定位于烟草叶绿体时，典型的为～55nm直径(Maclean等人，2007；Fernández-SanMillán等人，2008；Lenzi等人，2008)。在本研究中，HPV-16L1组装为全尺寸的VLP(～50nm，图7Dii)。
嵌合体组装为VLP似乎受L2表位长度的影响，所述表位具有分别含有13，20和26个残基的表位置换L1/L2(108-120)，L1/L2(17-36)和L1/L2(56-81)。植物表达的具有最短L2表位的L1/L2(108-120)成功组装为明显的约～30nm直径的cVLP，其比L1VLP更小(Chen等人，2000)图7A)。与此相反，L1/L2(17-36)主要形成壳粒聚集体，尽管存在更大的不规则无定形类VLP结构，提示可能存在小cVLP的部分组装(图7C)。最后，具有最长L2表位的L1/L2(56-81)主要组装为壳粒(图7B)。
L1/L2(108-120)也已表达于昆虫细胞中并且CsCl纯化的嵌合体显示组装为无定形的VLP和壳粒聚集体(Varsani等人，2003a)，而不是离散的直径为～30nm的cVLP。
由于使用pRIC表达载体渗入植物产生的靶向细胞质的嵌合体导致形成可检测的L1/L2(56-81)VLP(图8)。这表明本文描述的嵌合VLP也能在植物的细胞质中形成。
实施例3：L1/L2嵌合体的免疫原性
在本研究中，小鼠用源于植物的L1和含有交叉中和L2表位aa108-120，56-81和17-36的L1/L2嵌合体候选疫苗免疫。分析嵌合体相对于嵌合体组装体的免疫原性并且研究它们诱发抗L1，抗L2和抗同源HPV-16和异源HPV-18，45和52PsV的保护性NAb的能力。
方法和材料
小鼠的免疫
来自南非疫苗生产动物单位(SouthAfricanVaccineProducersAnimalUnit)(Johannesburg，SouthAfrica)的雌性C57/BL6小鼠在开普敦大学的HealthScienceFaculty的动物单位(AnimalUnit)中在生物安全水平(BiosaftyLevel)2(BSL-2)条件下维持。该研究的许可由开普敦大学研究伦理委员会(ResearchEthicsCommittee，UniversityofCapeTown)授予(AEC008/037)
免疫小鼠(7-8周龄)以检测对植物来源的HPV-16L1/L2候选疫苗的体液抗体应答。对照包括植物表达的HPV-16L1(正对照)和NSs-渗入的植物提取物(负对照)。L1/L2(108-120)嵌合体(公开为SAF；Varsani等人，2003a)已由我们实验室显示诱导抗L1应答并且因此用作额外的正对照。接种详细资料显示于表5。
表5：用于免疫原性研究的植物米源的疫苗抗原
*n＝小鼠的数量
TSP＝总可溶蛋白
纯化的疫苗抗原调整为在100μlDulbecco’sPBS(DPBS；Sigma)中含有10μg剂量。每种疫苗中总可溶蛋白(TSP)用如实施例1中讨论的Bradford蛋白测试法评估以确保与其它HPV疫苗相比负疫苗对照含有相似的TSP(表5)。疫苗通过使用注射器挤压技术在弗氏不完全佐剂(FIA)中以1：1体积比均化疫苗抗原制备疫苗(Koh等人，2006)。
小鼠分为每种疫苗5只小鼠的2组并且皮下注射入右侧腹，左侧腹或腹股沟位置。注射(第0天)前12天进行预抽血，并且小鼠在第13，27，41和48天加强免疫(约每2周，除了第48天决定加强免疫而不是获得测试取血)，之后在第62天获得最终取血(接种后～9周)。分离血清并储存在-70℃。
小鼠血清抗L1抗体的ELISA检测
昆虫细胞-生产的HPV-16L1的制备
昆虫细胞-生产的HPV-16L1用于ELISA抗原以检测小鼠血清中的抗L1抗体。昆虫细胞-表达的L1用于代替植物表达的L1以避免抗污染的植物蛋白的抗体的检测背景。草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf-9)细胞在SF90011无血清培养基(Gibco)中在27℃振荡培养并且在1.0的多重感染(MOI)和1x106细胞/ml的细胞密度下感染。96小时后通过离心(1000xg5分钟)收获细胞，并且沉淀用DPBS洗涤并储存于-70℃。
通过重悬细胞到在含有蛋白酶抑制剂(RocheCompleteEDTA-free)的高盐PBS(0.8MNaCl1xPBS)4x106细胞/ml来提取HPV-16L1并且在冰上超声降解5x20s间隔的超声和静止(Microtipsonication；Level5；HeatSystems-Ultrasonics，Inc.SonicatorCellDisruptorModelW-225R)。细胞溶解产物用离心(5000g5min)澄清以移除细胞碎片，并且使用上清重复离心步骤。商业化的疫苗Cervarix(20μgHPV-16L1)用作HPV-16L1蛋白质印迹定量的HPV-16L1标准(如上所描述)并且L1用CamVirl(1：10000；)检测。
抗L1抗体的ELISA检测
抗L1抗体滴定度用直接ELISA测定。96-孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)用100μl/孔(30ng)稀释于1xPBS的昆虫细胞-生产的HPV-16L1抗原包被，4℃孵育过夜。板用封闭缓冲液(1％脱脂奶于1xPBS中；200ul/孔)在室温封闭2小时并然后用PBS洗涤4次。
收集疫苗(10只小鼠/疫苗)的小鼠血清用于分析。最终取血的小鼠血清在封闭缓冲液中以一式三份4倍系列稀释，稀释度从1：50到1：51200。收集的预取血血清在1：50稀释度测试并用作负对照。稀释的血清加入孔中(100μl/孔)并在室温孵育2小时。正对照孔含有1：50稀释度的抗L1抗体；对线性和构象表位都结合的CamVirl()(McLean等人，1990)，和特异结合构象表位的H16.V5MAb(Christensen等人，1996)两者。没有抗体的空白孔用作背景对照。
4xPBS洗涤步骤后，稀释于封闭缓冲液中的羊抗小鼠辣根过氧化物酶(1：2000；Sigma)加入孔(100ul/孔)并在37℃孵育1小时。板用PBS(200μl/孔)洗涤4次，并且每孔加入100ulO-苯二胺二氢氯化物(OPD)(DAKO；Denmark)。板在暗室室温显色30分钟，用0.5MH2S04终止反应，并且检测490nm的吸光度。抗L1结合滴定度表示为产生比相应的预取血的稀释度在1：50的血清更高吸光度的最大血清稀释度的倒数。
统计分析
双尾的，非配对t-检验用于计算与负对照疫苗相比，最终取血的抗L1应答的统计学显著性(p＝0.01)。单因素方差分析(ANOVA)用于比较疫苗，并且FisherLSD，TurkeyHSD和Bonferroni检验用于确定显著性(p＝0.01)。
抗L2抗体蛋白质印迹检测
大肠杆菌-生产的HPV-16L2的制备
用pProEXhtb载体在大肠杆菌(由DavidMutepfa提供)中生产的His-标记的HPV-16L2蛋白用于小鼠血清种抗L2抗体的蛋白质印迹检测。大肠杆菌培养物在37℃振荡培养到OD600为0.6并且然后通过加入0.6mM异丙基p-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。3小时后，通过离心(在4℃3800g15分钟)收获细胞，保留沉淀并称重。
包涵体通过在4倍体积的溶解缓冲液(50mMTrispH8.5，5mMβ-巯基乙醇)中重悬细胞提取并且加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和溶菌酶(Roche)到终浓度分别为0.4mM和0.08μg/μl。细胞在冰上孵育20分钟，加入Triton-X到1％并且细胞在37℃再孵育20分钟直到溶液变粘。加入DNase和RNase分别到4μg/ml和40μg/ml并且细胞在孵育30分钟室温直到粘性清除。
包涵体通过在微型离心机中13，000rpm4℃离心15分钟收集，沉淀重悬在1ml溶解缓冲液(2.5mMTrispH8.0，3.125mMβ-巯基乙醇，0.2mMEDTA，0.0025％Triton-X)中，并在室温放置溶解10分钟。样品在13，000rpm4℃离心15分钟并且沉淀用洗涤4次。沉淀重悬在沉淀重量的1倍体积PBS中，通过考马斯亮蓝染色使用牛血清白蛋白(BSA)标准定量并储存在-20℃。
抗L2抗体的蛋白质印迹分析
大肠杆菌-生产的HPV-16L2抗原在5x上样缓冲液中95℃孵育5分钟并上样于10％SDS-PAGE胶中。使用2-孔的梳子而不使用10-孔的梳子：小孔用于蛋白标志且大孔由9孔融合在一起组成，因此产生单个的宽孔，其允许蛋白横跨宽度均等散布。
大肠杆菌-表达的His-标记HPV-16L2抗原(2.5mg)在10％SDS-PAGE胶上分离(Sambrook等人，1989)并如以上实施例1所述通过半干电印迹转移至硝酸纤维素膜。然后修改蛋白质印迹方案，由此，55-130kDa之间包含L2蛋白(～80kDa)的膜部分分为12个大小相似的条带以用不同的血清探测。膜条带转移至25-孔组织培养板中的单独的孔并在封闭缓冲液中于室温孵育4小时。
汇集单独的预取血和最终取血小鼠的血清(每种疫苗10只小鼠)且膜条带用正对照小鼠抗His抗体(1：2000，Serotech)或在1：100稀释于封闭缓冲液中的收集的小鼠血清探测。加血清至不同的孔并在室温振荡孵育过夜。条带然后用封闭缓冲液洗涤4x10分钟并用耦合有碱性磷酸酶(1：5000；Sigma)的第二羊抗小鼠IgG抗体在室温探测2小时。个体条带用洗涤缓冲液再洗涤4x10分钟且然后用NBT/BCIP(Roche)显色。
密度测定(GeneTools，Syngene，Synoptics，Ltd)用于测量每个L2条带的吸收强度。使用负对照疫苗相关值对非特异背景值标准化。具有吸收值＞2xHPV-16L1最终取血中观察值的L2条带的血清诱导抗L2应答。
HPV假病毒中和试验
中和试验的准备
用于HPV假病毒(PsV)中和试验的方案获自JohnSchiller博士的细胞肿瘤学实验室的技术文件，且HPVL1/L2pSheLL质粒和pYSEAP报告子质粒由JohnSchiller博士善意提供。
pYSEAP质粒用SalI和BamHI限制性内切酶消化核对(如以上实施例1中描述的)。HPVL1/L2pSheLL质粒在大小类似且具有类似的限制性内切酶位点，因此通过结合HPVL1和L2基因上游和下游的两组pSheLL载体特异引物(表6)测序质粒以确定其同一性。序列使用DNAMAN序列分析软件将序列与HPVL1/L2pSheLL质粒序列和HPVL1或L2基因序列进行比对。
表6：pSheLL载体-特异的测序引物
对于pYSEAP质粒和HPV-16，18，45和52pSheLL质粒二者，从在合适的抗生素选择下培养的大肠杆菌培养物中制备无内毒素质粒DNA(XtraMidiEF，Macherey-Nagel)(表7)且DNA储存于-70℃。
表7：用于本研究的HPVPsV中和试验质粒载体
HEK293TT细胞的转染
HEK293TT细胞系由JohnSchiller博士善意提供。HPVPsV如在于2010年6月修订的“乳头瘤病毒载体(假病毒)的生产”方案中描述的生产。
HEK293TT细胞在含有1％GlutaMAXTM(Gibco)和10％胎牛血清(Gibco)的完全高葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)(cDMEM)中培养。cDMEM培养及补充以1％非必需氨基酸(Gibco)，100单位/ml的青霉素(Gibco)，100μg/ml链霉素(Gibco)，10μg/l菌纤维素(Fungin)TM(InvivoGen)和250μg/ml潮霉素B(Roche)以选择TT抗原(cDMEM-Ab)。细胞的解冻和传代根据方案中描述的进行。
细胞预铺于在175cm2培养瓶cDMEM(无抗生素或潮霉素B)中第二天达到50-70％汇合。在转染当天，向细胞中加入新鲜的cDMEM且等量的无内毒素质粒DNA于冰上解冻。转染混合物制备如下：向白帽圆锥管(Sterilin)中的含有GlutaMAX(无血清培养基)的5.7mlDMEM中加入175ulFuGene6(Roche)并室温孵育5分钟。加入总计40ugDNA(每种质粒20ug)，混合物再在室温孵育30分钟并且然后逐滴加入细胞。培养瓶于37℃在5％CO2潮湿的培养箱中孵育40-48小时并在转染后(cDMEM)6小时更换培养基。
假病毒的提取
假病毒在转录后40-48小时收获。细胞通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)的胰蛋白酶消化作用收集细胞并通过加入cDMEM以阻止活性。细胞转移至锥形底的聚苯乙烯Sterilin管(因为假病毒非特异吸附于聚丙乙烯管)，计数并在1200rpm离心8分钟。沉淀用0.5mlDPBS(Invitrogen)洗涤并重悬于1.5倍沉淀体积的DPBS-Mg(具有额外的9.5mMMgCl2的DPBS)以获得＞100x106细胞/ml的高细胞密度。
向重悬的沉淀中加入10％Brij-58(Sigma)到终浓度0.5％(w/v)并加入Benzonase(Sigma)和Plasmid-SafeTMATP-依赖的DNase(Epicentre)二者分别到0.5％(v/v)和0.2％(v/v)。使用ChrisBuck的“HPV和多瘤病毒的改良成熟作用(ImprovedMaturationofHPVandPolyomavirus)”方案，无菌的硫酸铵(1M，pH9.0)加入至终浓度25mM以促使分子间L1二硫键的形成。混合物在37℃孵育15分钟以让细胞溶解并然后转移至对假病毒成熟优选的温度过夜(对于HPV-1625℃和18，对于HPV-45和5237℃)。
成熟的溶胞产物在冰上冷却5分钟其溶胞溶液的最终NaCl浓度调整到850mM并在冰上再孵育10分钟。溶胞产物通过在4℃3000xg离心10分钟澄清。收集上清且沉淀通过重悬在沉淀等体积的高盐DPBS(0.8MNaCl)和再离心再提取。汇集上清，再离心并转移至白帽聚苯乙烯管并保持于冰上。
假病毒的纯化
PsV通过Optiprep密度梯度离心纯化。Optiprep(60％w/v碘克沙醇溶液；Sigma)在DPBS中稀释至46％(w/v)Optiprep储液，并补充以0.625MNaCl至终浓度为0.8MNaCl，CaCl2至0.9mM，MgCl2至0.5mM和KCl至2.1mM。高盐DPBS(0.8MNaCl)用于稀释储液至27％，33％和39％Optiprep，并且3-阶梯度通过将Optiprep稀释液(27-39％)置于薄壁的5ml异质同晶聚合物超速离心管(Beckman)的1.5ml阶底部制备。梯度置于室温4小时以扩散。双澄清的细胞上清在线性化的分层于Optiprep梯度上并在BeckmanSW55ti转子在50，000rpm(234，000xg)16℃离心3.5小时。管底用注射器针头刺破且级分收集于白帽聚苯乙烯管中：第一级分为～0.75ml，第2-11级分为每个～0.25ml且第12级分包含梯度的残余物。
改良筛选级分的方案以用HPV类型-特异的抗L1斑点印迹检测HPVL1(存在于衣壳中的主要蛋白)的存在(Buck等人，2008)。每种组分点在硝酸纤维素膜上(0.5μl)且Cervarix(HPV-16L1)，大肠杆菌-生产的His-标记HPV-16L2，或最初上样于梯度的澄清的HPV-16，18，45或52上清用作正对照。
膜在封闭缓冲液中室温封闭30分钟并然后用稀释于封闭缓冲液中的合适的第一抗L1抗体室温探测过夜。使用CamVirl(1：5000；Abcam)检测HPV-16。此外，兔抗HPV-16L2血清是可用的并用于检测HPV-16级分中的L2(1：2000)。由NeilChristensen博士善意提供的H16.123，H45.N5，H52.C1和H52.D11MAb分别用于检测HPV-18，45和52(1：2000；Christensen等人，1996)。膜用L10，000第二抗体(偶联于碱性磷酸酶的羊抗小鼠IgG或羊抗兔碱性磷酸酶耦合物；Sigma)探测，如前描述的，洗涤和显色。汇集包含高浓度L1的峰组分于聚苯乙烯管并储存于-70℃用于滴定。
假病毒的电子显微镜检查方法
纯化的HPVPsV使用电子显微镜分析。PsV’s(1：1000)捕获于辉光放电的碳包被的铜栅隔，用2％醋酸双氧铀染色并使用ZeissEM912CRYOEFTEM观察。
假病毒滴定
PsV滴定和中和试验基于“乳头瘤病毒中和试验”方案，除了没有Nab包含在滴定中。PsV储液在中和试验前滴定以确定在SEAP测定法中对于强的信号所需要的PsV的最小量。
HEK293TT细胞在cDMEM-Ab中培养至70-80％汇合，如描述的收集，用DPBS洗涤并在中和培养基(含有HEPES和不含酚红或丙酮酸钠，补充以10％胎牛血清的高葡萄糖cDMEM；Gibco)中稀释到3.0x105细胞/ml。细胞预以100μl细胞悬液每内孔和150μl具有酚红的DMEM每外孔铺于96-孔组织培养处理的板中(CorningCostar)以避免从内孔的蒸发。细胞在加入PsV之前在37℃孵育3-4小时。
PsV的系列稀释(从1：250到1：64000的加倍稀释)在未处理的无菌96-孔聚苯乙烯板(Nunc)中的中和培养基中制备并以一式三份测试。如在Schiller方案中略述的，PsV稀释液加入预铺板的细胞(100μl/孔)，并且每个板包含6个无假病毒的负对照孔(细胞对照)。板于37℃在潮湿的CO2培养箱中孵育72小时。
SEAP活性用GreatEscAPeTMSEAP化学发光试剂盒2.0(ClontechLaboratories，Inc.)根据使用说明手册检测，除了体积调整到制造商的方案中给出的那些的0.6倍体积(如修订的Schiller方案中所做的)。上清(125μl)转移入无菌的未处理的96-孔聚苯乙烯板(Nunc)并1000xg离心5分钟。澄清的上清(15μl)转移至白色的96-孔Optiplate(96F白色最大吸收光度计板(whitemaxisorbluminometerplates)；Nunc)，45μl1x稀释缓冲液加入每孔且板在65℃孵育30分钟。板在冰上冷却5分钟，并然后每孔加入60μl底物并室温孵育20分钟。SEAP的产生使用微量板光度计(DigeneDML2000)检测。为中和试验选择的PsV稀释度是存在于滴定曲线线性范围内的使用最小量PsV的那个稀释度。因为HPV-52滴定度非常低，其从1：125到1：4000重新滴定。
假病毒中和试验
体外中和试验用于检测小鼠血清中的HPV-特异的抗体应答并确定中和滴定的终点。
对照包含：
(a)细胞对照(感染负对照)：细胞仅用中和培养基孵育(无血清或假病毒)以给出细胞培养上清的背景读数。与该对照相关的发光值表示0％PsV中和。
(b)PsV对照(PsV感染正对照)：在细胞感染前PsV在中和缓冲液中预孵育。与该对照相关的值表示100％PsV中和。
(c)已知的中和用于本测试的HPV类型PsV的MAb或抗血清(中和试验正对照)：PsV与6个横跨预测定的中和滴定度(0-100％中和)的稀释度预孵育。
(d)预取血：PsV与汇集的小鼠预取血预孵育(负对照)。
在测试血清中和试验前，滴定NAb正对照(表8)以确定用于PsV中和试验的中和稀释范围。HPV-16，45和52中和作用对照是H16.V5，H45.N5，H52.C1和H52.D11MAb。HPV-18对照是我们实验室的兔抗Cervarix血清。
表8：HPV类型特异的中和抗体
汇集用植物生产的HPV-16嵌合体候选疫苗免疫的小鼠的血清(10只小鼠/疫苗)并测试HPV-16，和HPV-18，45和52的中和作用。汇集的疫苗血清在1：50到1：12800范围内一式三份四倍稀释。也汇集预取血并在最低稀释度1：50一式三份测试作为负对照。血清的系列稀释在无菌的未处理96-孔组织培养板中制备(1：10至1：2560)。
PsV稀释于中和缓冲液中到滴定测试的预测定的浓度。在另一个未处理的96-孔板中，每孔加入100μl稀释的PsV并且加25μl稀释的血清(或对于PsV对照孔加入中和缓冲液)至一式三份的孔中，形成预稀释的血清的进一步的1：5稀释。PsV和血清在4℃孵育1小时以让感染性的PsV中和，并然后在预铺板的HEK-293TT板中每孔加入100μl(对于细胞对照孔加入中和缓冲液)。板于37℃在潮湿的CO2培养箱中再孵育72小时。
如上所描述的收获上清并测试SEAP的存在。中和滴定度陈述为与未与血清预孵育的对照样品相比至少以50％减少SEAP活性的最大血清稀释度的倒数。
结果
针对HPV-16L1的体液免疫应答
针对HPV-16L1诱导的抗体的检测通过直接ELISA使用昆虫细胞-表达的HPV-16L1作为包被抗原进行(图9)。抗L1的滴定度表达为含有比相应的预取血血清在1：50的吸光度读数更高的吸光度读数的最大血清稀释度的倒数。
对于Ll/L2(56-81)嵌合体和负对照疫苗(V2和V5；图9A)和接种前取血(图9C)未检测到抗L1的应答。比较起来，ELISAMAbs(H16.V5，CamVirl，图9B)和植物来源的L1正对照(V4，图9A)显示出好的应答并且植物来源的L1/L2(17-36)和L1/L2(108-120)嵌合体二者诱导抗L1滴定度分别为200和12800(V3和V1，图9A)。尽管HPV-16L1诱导最高的抗L1滴定度(12800-51200)，L1/L2(108-120)显示出类似的应答(分别为V4和V1，图9A)，提示与其它嵌合体相比，L2aa108-120表位的插入对L1免疫原性产生较小影响。此外，L1/L2(108-120)和HPV-16L1抗L1应答相对于其相应的预取血和NSs-渗入的植物提取物统计学显著(p＝0.01)。
针对HPV-16L2表位的体液免疫应答
针对大肠杆菌-生产的His-标记的HPV-16L2蛋白的抗L2应答使用蛋白质印迹分析测定。对于每种疫苗汇集个体小鼠血清并用于抗L2应答分析(图10)。
在本实验中用作额外的负L2对照的源自负疫苗对照(V5；植物提取物)和L1疫苗对照(V4；植物表达的HPV-16L1)的抗血清中都检测到类似于～80kDaL2条带的非特异条带(图10)。所有嵌合体疫苗(V1-3)似乎引起抗L2应答，因为使用嵌合体抗血清检测到强烈的L2条带(图10)。然而，仅L1/L2(108-120)和L1/L2(17-36)嵌合体(分别为V1和V3)引起确定的抗L2应答，具有＞2XHPV-16L1(V4)强度的L2条带。
中和试验
质粒分析
pYSEAP和HPV-16，18，45和52L1/L2pSheLL质粒的同-性用限制性内切酶消化和测序确定(数据未显示)。
Optiprep纯化和纯化的级分中HPVPsV的检测
HPVPsV从澄清的细胞上清中通过在27-39％Optiprep线性梯度中的密度梯度离心纯化。沿梯度向上三分之一处亮灰色条带略微可见且该级分从管底收集。
使用HPV类型-特异性的抗L1斑点印迹筛选级分中PsV的存在。CamVirl和抗HPV-16L2的兔抗血清用于检测HPV-16L1和L2，使用Cervarix和大肠杆菌-生产的His-标记的HPV-16L2作为对照。H16.123，H45.N5，H52.C1和H52.D11MAb分别用于检测HPV-18，45和52，使用最初澄清的细胞上清作为HPV类型特异的对照(数据未显示)。
HPV-16在第3-5级分用H16.V5检测到并用HPV-16L2抗血清微弱的检测到，因为L2蛋白在共组装的L1/L2VLP中位于L1衣壳表面内部(Buck等人，2008)。HPV-18，45和52L1分别在第5-7，4-6和6-10级分中强烈的检测到。汇集PsV级分，用电子显微镜检测并用于中和试验。
电子显微镜分析
汇集的PsV样品通过透射电子显微镜方法检测以确定其组装，形态和纯化(数据未显示)。所有HPV类型组装为球形PsV(55nm)。HPV-45PsV似乎专门以完全组装的PsV颗粒存在。HPV-16和18PsV主要组装，尽管可见一些壳粒和聚集体。HPV-52PsV含有大部分壳粒聚集体和部分PsV，可能由于在HEK293TT中低HPV-52L1和L2的表达。
HPVPsV滴定
滴定纯化的PsV以确定用于中和试验的PsV滴定度。使用的滴定度是在滴定曲线的线性范围内给出加强信号的PsV的最小量。
对于HPV-16和18PsV，滴定曲线的线性范围存在于稀释度1：250到1：1000之间(数据未显示)，并且因此选择1：500用于中和试验。HPV-45PsV具有最高的滴定度，具有线性范围在于稀释度1：500和1：2000之间因此选择1：1000用于进一步工作(数据未显示)。HPV-52PsV不得不使用更低的稀释度再滴定。线性范围介于稀释度1：125和1：250之间(数据未显示)，并且在HPV-52中和试验中使用1：200稀释度。
正对照中和抗体的滴定
在中和试验前，NAb正对照用小鼠抗血清测试，以检查其中和能力和以确定合适的稀释范围。所有正对照抗体中和并在测试的稀释范围内显示线性关系(表9)。
表9：正对照中和抗体的滴定
HPVPsV中和试验
测试源自用植物生产的HPV-16L1和L1/L2嵌合体免疫的小鼠的血清对HPV-16PsV的同源中和作用和对HPV-18，45和52PsV的异源交叉保护(图10-13)。所有正对照NAb成功中和HPV-16，18，45和52PsV(图10-13F)，证明中和试验结果是有效的。中和滴定度定义为与未用血清处理的对照样品相比，以＞50％减少SEAP活性的血清的最高稀释度。
HPV-16
从HPV-16PsV中和试验的结果显示于图11中。植物来源的HPV-16L1血清(V4；图11D)类似于H16.V5正对照(图11F)并强烈的中和HPV-16PsV，随后L1/L2(108-120)具有类似的中和曲线(V1；图11A)。L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)二者似乎都不引发HPV-16NAb(V2-3；图11B-C)，显示与负对照(V5；图11E)类似的中和曲线。
HPV-18
源自所有疫苗的抗血清不中和HPV-18PsV(图12)。L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)嵌合体(V2-3，图12B-C)产生类似于类型特异的HPV-16L1疫苗和负对照(V4-5，图12D-E)的中和曲线。L1/L2(108-120)似乎具有一些中和活性，其相应的减少发光值低于预取血和不中和的HPV-18PsV对照的发光值(V1；图12A)的血清稀释度为＜800。然而，嵌合体不以＞50％减少SEAP水平。
HPV-45
HPV-45PsV中和试验的结构(图13)提示L1/L2嵌合体疫苗s(V1，V2和V3；图13A-C)均不诱发显著的HPV-45Nab滴定度，中和曲线类似于HPV-16L1和负疫苗对照(V4-5；图13D-E)。
HPV-52
HPV-52PsV中和试验(图14)提供证据证明L1/L2(56-81)血清不中和HPV-52(L2；图14C)，如对HPV-16L1和负对照血清(V4-5；图14D-E)所看到的。L1/L2(108-120)和L1/L2(17-36)嵌合体疫苗似乎在低的相应的稀释度(50-200)是具有一些中和活性，与不中和的HPV-52PsV对照(V1和V3；图14A和C)相比以＞50％减少SEAP水平。
尽管实验是成功的，如H52.C1NAb对照(图14F)所显示，在一式三份的样品中存在大量更多的变化且趋势线难以确定。这可能归因于部分纯化和HPV-52PsV的低浓度，其可能放大重复测定中的小的差异。疫苗V1，V2和V4(图14A-B和D)之间HPV-52PsV感染对照的值的不同在与V3，V5和H52.C1(图14C和E-F)不同的板上分析。时间的限制阻止重复该实验。
表10概括了植物来源疫苗诱导的HPV-16，18，45和52PsV中和抗体滴定度。L1/L2(108-120)诱导同源的HPV-16NAb且抗血清交叉中和异源HPV-52PsV，提示该疫苗具有最大的潜能用于保护。L1/L2(17-36)嵌合体诱导低水平的交叉中和HPV-52NAb，但同源的HPV-16NAb未检测到，提示针对HPV-16L1的免疫原性可能受到损害。L1/L2(56-81)未诱导NAb。没有HPV疫苗针对系统发生相关的HPV类型18和45诱导交叉中和抗体。
表10：对于植物来源L1和Ll/L2嵌合体候选疫苗的中和滴定度的总结
疫苗免疫原性的综述
在L1/L2嵌合体抗血清中检测出的结构组装体(见上述实施例2)，抗L1和L2体液应答和HPV-类型Nab总结于表11。组装为VLP似乎与更高的抗L1和HPV-16PsV中和滴定度相关，提示组装体与L1免疫原性相关。
表11：对于L1和L1/L2嵌合疫苗的抗体应答
*TEM抗原组装：C＝壳粒，CA＝壳粒聚集体，VLP＝病毒样颗粒。
**抗L1抗体的ELISA检测。Y＝是，N＝否。
***抗L2抗体的蛋白质印迹检测。
讨论
植物来源的HPV-16L1(Maclean等人，2007；Fernández-SanMillán等人，2008)和基于L1的嵌合体(PazDelaRosa等人，2009)组装为产生免疫原性的VLP和诱导中和抗体(NAb)的产生。在本研究中，分析了三种包含HPV-16L1的h4区域内的交叉中和HPV-16L2aa108-120，56-81或17-36表位的植物来源的L1/L2嵌合体的免疫原性。小鼠用10μg的于弗氏不完全佐剂中的植物来源的抗原皮下免疫，并在7周内接受4次加强接种。
体液免疫应答
在本研究中分析由植物来源的L1/L2嵌合体诱导的体液抗L1和L2应答，以确定是否展示了L2肽和是否L2插入损害了L1免疫原性。
在小鼠抗血清中L1和L2抗体的检测分别通过直接ELISA(图9)和蛋白质印迹(图10)进行，使用昆虫细胞-表达的HPV-16L1或者大肠杆菌-表达的His-标记L2二者之一。植物来源的HPV-16L1在本研究中用作抗L1正对照并诱导最高的抗L1应答，具有滴定度为12800-51200(图9A)。这些结果与其它使用部分纯化的植物来源的HPV-16L1VLP的小鼠免疫原性研究类似(滴定度＝20000-40960；Maclean等人，2007；Fernández-SanMillán等人，2008)。
负对照疫苗(V5：NSs-渗入的植物提取物)和接种前取血(V1-5PB)未引发抗L1应答(图9)。然而，源自负对照的抗血清(V4-5，图10)的确检测到大肠杆菌-表达的His-标记的HPV-16L2抗原，因此证明在血清中非特异抗体的存在，其结合His-标记的L2蛋白。这可能由于抗原的纯化，其导致疫苗包含污染的植物蛋白。尽管如此，负对照条带比对于L1/L2(108-120)和L1/L2(17-36)嵌合体的条带更不清晰，提示这些L1/L2嵌合体诱导抗L2应答。
L1/L2(108-120)组装为独特的～30nmcVLP并且是最成功的嵌合体疫苗(表11)，诱导最高的抗L1应答，具有滴定度为～12800(图9A)和抗L2应答(图10)。此外，与预取血和NSs-渗入的植物提取物(负对照)相比，仅L1/L2(108-120)和HPV-16L1抗血清证明显著的抗L1应答(p＝0.01)。与植物来源的嵌合体相比，由Varsani等人(2003a)分析的昆虫细胞-表达的L1/L2(108-120)嵌合体诱导更高的抗L1滴定度(＞204800)，然而使用了10x高的剂量(100μg相对于10μg)。总之，有强大的证据证明L2aa108-120肽有效展示在L1cVLP的表面。
L1/L2(17-36)疫苗诱导相对弱的抗L1应答，具有滴定度为～200(图9A)，但诱导强的抗L2应答(图10)，提示L2肽展示在组装的L1表面。类似的，与其它由aa56-120组成的Trx-L2肽相比，融合L2aa20-38肽于硫氧还蛋白(Trx)诱导强的抗L2应答(Rubio等人，2009)并且直接针对HPV-16L2aa17-36肽的RG-1MAb已显示在蛋白质印迹和ELISA中用于检测L2(Gambhira等人，2007)。
L1/L2(56-81)壳粒疫苗在最低的血清稀释度1：50不诱导可检测的抗L1应答(图9A)且抗L2应答是不确定的(图10)，具有抗L1和L2应答二者都类似于接种前取血(V1-5PB)和负对照(图9-10)。因此，植物来源的L1/L2(56-81)似乎是不产生免疫原性的，不同于在BPV-1L1VLP的DE环中包含类似L2表位的大肠杆菌-表达的Trx-L2融合肽(Rubio等人，2009)和昆虫细胞-表达的L1/L2嵌合体(Slupetzkey等人，2007；Schellenbacher等人，2009)。
假病毒中和试验
检验包含L2表位aa108-120，56-81和17-36的L1/L2嵌合体诱导中和HPV-16，18，45和52PsV抗体的能力。本研究中分析的所有L2表位显示诱导中和同源的HPV-16和交叉中和HPV-52的抗体(Kawana等人，2003；Slupetzky等人，2007；Kondo等人，2007，2008；Gambhira等人，2007；Schellenbacher等人，2009)。此外，L2aa56-81交叉中和HPV-18并且L2aa17-36交叉中和HPV-18和45二者(Gambhira等人，2007；Kondo等人，2007，2008；Alphs等人，2008；Schellenbacher等人，2009；Rubio等人，2009)。
HPV-16选择为HPV-16L1是嵌合候选疫苗的主链且其引起大多数宫颈癌，继之以系统发生相关的HPV-18和HPV-45。HPV-16，18和45在非洲与48％，23％和10％的宫颈癌相关并且与世界范围内的61％，10％和6％的宫颈癌相关(deSanjosd等人，2010)。尽管HPV-52在非洲仅排名第5(3％)和在全世界排名第6(6％)，HPV-52已显示在南非妇女中低和高级宫颈病变中为高流行并且因此HPV-52交叉中和作用有局部的重要意义(Allan等人，2008)。
同源的HPV-16中和作用
植物来源的L1/L2(56-81)和L1/L2(17-36)不诱导可检测的HPV-16NAb滴定度，产生类似于预取血和NSs-渗入的植物提取物的结果(图11)。早先的工作已显示包含位于BPV-1或HPV-16L1表面区域的HPV-16L2肽aa17-36，18-38，56-75或69-81的L1/L2嵌合体诱导HPV-16NAb(Slupetzkey等人，2007；Kondo等人，2008；Schellenbacher等人，2009)；然而，插入位点不同于在本研究中使用的那些且嵌合体组装为cVLP。此外，发现直接针对HPV-16L2aa73-84的MAb为非中和的且不中和HPV-16PsV(Gambhira等人，2007)，类似于本发明中对L1/L2(56-81)嵌合体获得的结果。
在本研究中，仅L1/L2(108-120)和HPV-16L1以与H16.V5(正中和作用对照)类似的方式中和HPV-16PsV，产生滴定度分别为50-500和500-5000(表10)。这些结果与其它使用植物来源的HPVL1抗原小鼠免疫原性研究一致。使用血凝反应测定，类似或更高剂量的植物来源的HPV-16L1VLP诱导HPV-16NAb滴定度为400-1600(Maclean等人，2007；Fernández-SanMillán等人，2008)且植物来源的L1/E6/E7cVLP诱导HPV-16NAb滴定度为～400(PazDelaRosa等人，2009)。此外，用HPV-16L2aa108-120肽免疫人已显示诱导HPV-16NAb滴定度为100-1000(Kawana等人，2003)且源自包含L2表位aa108-120L1/L2(Slupetzkey等人，2007)或L2aa75-112和115-154(Schellenbacher等人，2009)的L1/L2嵌合体的小鼠抗血清以滴定度＜1000中和同源的HPV-16PsV。因此本研究中获得的滴定度在由其它表达系统中生产的L1/L2嵌合体疫苗报告的范围内。
异源的HPV-18，45和52中和作用
针对系统发生相关的HPV-18和45PsV的中和活性对于所有HPV疫苗均未检测出(图12-13)。类似的，L1/L2(56-81)抗血清不中和HPV-52PsV(图14)。尽管L1/L2(108-120)和L1/L2(17-36)似乎诱导低的HPV-52NAb滴定度(50-200)，在该测定中存在很多变化，可能由于部分组装的PsV的纯化，且该测定应该重复以确定结果。
早先的工作已证明包含L2aa56-81肽L1/L2的嵌合体交叉中和HPV-18和52二者(Kondo等人，2008)。然而，嵌合体组装为cVLP，不同于L1/L2(56-81)，提示VLP组装对于诱导高NAb滴定度的产生是重要的。此外，含有L2aa17-36或18-36的L1/L2嵌合体(Kondo等人，2008；Schellenbacher等人，2009)诱导针对HPV-18，45和52的NAb。然而，L2肽插入DE环(Schellenbacher等人，2009)且对于由Kondo等人(2008)进行的研究未陈述剂量。在本研究中，由植物来源的L1/L2(17-36)诱导的在小鼠中低HPV-52NAb滴定度是与由表达于昆虫细胞中的类似的L1/L2嵌合体诱导的滴定度(Schellenbacher等人，2009)可比的，提示表达系统不影响抗原交叉中和HPV-52的能力。
植物来源L1/L2(108-120)嵌合体似乎诱导HPV-52NAb且可能具有作为交叉保护HPV疫苗的潜力，由L2aa108-120肽己显示在人中诱导HPV-52NAb滴定度分别为50-1000(Kawana等人，2003)的证据支持。不存在HPV-16L2aa108-120交义中和HPV-45的证据，然而含有类似L2aa96-115或75-112表位的L1/L2嵌合体交叉中和系统发生相关的HPV-18(Kondo等人，2008；Schellenbacher等人，2009)。然而在本研究中报道的NAb滴定度低(＜100)且可能诱导的HPV-18NAb太低以至于不能在L1/L2(108-120)抗血清中检测。
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Claims (23)

1.一种嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其具有约30nm的直径，所述嵌合HPVVLP包含由人密码子优化的核苷酸序列编码的嵌合HPV16L1/L2多肽，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽选自由SEQIDNO：22，23和24组成的组。
2.权利要求1的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中插入的HPVL2肽选自由以下组成的组：
(i)由SEQIDNO：7的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQIDNO：3的13个氨基酸的肽；
(ii)由SEQIDNO：9的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQIDNO：5的20个氨基酸的肽；和
(iii)由SEQIDNO：8的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQIDNO：4的26个氨基酸的肽。
3.权利要求1或2的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中编码嵌合HPV16L1/L2多肽的人密码子优化的核苷酸序列被修饰为核定位信号缺失。
4.权利要求1的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽由选自由SEQIDNO：26，SEQIDNO：27和SEQIDNO：28组成的组的人密码子优化的核苷酸序列编码。
5.权利要求1到4任一项的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽在植物中表达和从植物中回收。
6.权利要求5的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽靶向植物的叶绿体。
7.一种产生具有约30nm直径的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供编码嵌合HPV16L1/L2多肽的嵌合人密码子优化的核苷酸序列，其中所述嵌合HPV16L1/L2多肽选自由SEQIDNO：22，23和24组成的组；
(ii)将所述嵌合人密码子优化的核苷酸序列克隆到适于在植物中表达多肽的表达载体中；
(iii)用步骤(ii)的表达载体转化或渗入植物细胞；
(iv)在步骤(iii)的植物细胞中表达所述嵌合HPV16L1/L2多肽，从而表达的嵌合HPV16L1/L2多肽装配进入具有约30nm的直径的嵌合HPVVLP；和
(v)从所述植物细胞回收所述嵌合HPVVLP。
8.权利要求7的方法，其中步骤(ii)的表达载体进一步包括靶向序列，所述靶向序列编码引导所表达的嵌合HPV16L1/L2多肽从植物细胞的细胞质到叶绿体的多肽。
9.权利要求7或8的方法，其中所述表达载体包含与表达载体的编码序列可操作连接的启动子和其它调节子。
10.权利要求7到9任一项的方法，进一步包括用适于抑制植物中转录后基因沉默的抑制蛋白共渗入或共转化植物细胞的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述抑制蛋白是番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄丛矮病毒的p19。
12.权利要求7到11任一项的方法，其中插入的HPVL2肽选自由以下组成的组：
(i)由SEQIDNO：7的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQIDNO：3的13个氨基酸的肽；
(ii)由SEQIDNO：9的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQIDNO：5的20个氨基酸的肽；和
(iii)由SEQIDNO：8的人密码子优化的核苷酸序列编码的SEQIDNO：4的26个氨基酸的肽。
13.权利要求1到6任一项的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其用于预防或治疗受试者中HPV感染或宫颈癌的方法中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的所述嵌合HPVVLP。
14.权利要求13的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，所述方法进一步包括在受试者中诱发免疫应答的步骤。
15.权利要求14的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中所述免疫应答是中和抗体应答或细胞毒T淋巴细胞应答。
16.权利要求14的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中所述免疫应答是对受试者中存在的多种HPV类型的交叉保护免疫应答。
17.权利要求13-16任一项的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)，其中所述受试者是人。
18.权利要求1到6任一项的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)在制备用于预防或治疗受试者中HPV感染或宫颈癌方法的药物中的用途，包括向受试者施用治疗有效量的所述药物。
19.权利要求18的用途，所述药物用于在受试者中诱发免疫应答。
20.权利要求19的用途，其中所述免疫应答是中和抗体应答或细胞毒T淋巴细胞应答。
21.权利要求19的用途，其中所述免疫应答是对受试者中存在的多种HPV类型的交叉保护免疫应答。
22.权利要求18到21任一项的用途，其中受试者是人。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1到6任一项的嵌合人乳头瘤病毒病毒样颗粒(HPVVLP)和药学上可接受的载体或佐剂。
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