JP6228922B2 - Hpvキメラ粒子 - Google Patents
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Description
本発明は、約30nmの直径を有するキメラヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)ならびに本発明のキメラHPV VLPの投与によるHPV感染および/または子宮頸癌の処置および/または予防の方法に関する。
本発明の第1の局面において、約30nmの直径のサイズを有するキメラヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)であって、該キメラHPV VLPは、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるキメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドを含み、該キメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドは、HPV 16 L1ポリペプチドの残基414から挿入された約13アミノ酸から約26アミノ酸のHPV L2ペプチドを含むHPV L1ポリペプチドをさらに含み、そして、該挿入されたHPV L2ペプチドのアミノ酸は、HPV 16 L1ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する、キメラヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)を提供する。
(i)キメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドをコードするキメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する工程、ここで、該キメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドは、キメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドの残基414から挿入された約13アミノ酸から約26アミノ酸のHPV L2ペプチドを有するHPV 16 L1ポリペプチドを含み、そして、該挿入されたHPV L2ペプチドのアミノ酸は、HPV 16 L1ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する;
(ii)キメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を植物においてポリペプチドを発現することに適している発現ベクターにクローニングする工程;
(iii)植物細胞を工程(ii)の発現ベクターで形質転換するか、または植物細胞に工程(ii)の発現ベクターを浸潤する工程;
(iv)発現されたキメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドが均一状態および約30nmの直径を有するキメラHPV VLPに集合するように、工程(iii)の植物細胞においてキメラHPV 16 L1/L2ポリペプチドを発現する工程;および
(v)該植物細胞から該キメラHPV VLPを回収する工程
を含む方法を提供する。
本発明は、本発明の全ての態様ではないが、いくつかの態様が示されている図面を基準にして、以下により完全に記載されている。
方法および材料
植物発現ベクター
3種のバイナリーアグロバクテリウム植物発現ベクターを使用して、HPVキメラ発現を最適化した:pTRAcおよびpTRAkc−rbcs1−cTP(Prof. Rainer Fischer;Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Germanyによって提供された)およびマメ黄萎ジェミニウイルス(BeYDV)ベクターpRIC3(Richard Halley−Stottによって作製された)。2種は、発現されたタンパク質を、細胞質(pTRAc)または葉緑体(pTRAkc−rbcs1−cTP)のいずれかに標的化する非複製性ベクターであり(Macleanら, 2007)、第3のものは、自己複製性細胞質標的化ベクター(pRIC3)である。pRIC3ベクターは、サイズが小さくされ、植物において導入遺伝子発現の同様の増幅を示した、第3世代のpRICベクターである(Regnardら, 2010)。
この研究に使用された4種のHPV−16 L1/L2キメラは、表1に記載されている。キメラは、南アフリカのHPV−16 L1分離株遺伝子配列(SALI:GenBank受託番号AY177679)およびアミノ酸414(「F−位置」と表される)のh4ヘリックス中に位置するL2エピトープからなる。これらのキメラ遺伝子は、Dr Inga Hitzeroth (Plant Vaccine Group, UCT)によって、ハイスループット遺伝子アセンブリーを使用するGENEART AG(Regensburg, Germany)によってコンピュータで設計され、ヒトコドン最適化され、合成された。合成されたL2エピトープ配列は、F位置中のL1配列を置換し、L1タンパク質中に簡単には挿入されなかった。
HPV−16 L1/L2、キメラ配列を、キメラ遺伝子に隣接する3’XhoIと、5’BspHI、MluIまたはHindIII制限酵素(RE)部位のいずれかを使用してpGA4ベクターから切り出した(図1C)。HPV遺伝子を、pTRAcについてはAflIIIおよびXhoI(図1B)、pTRAkc−rbcs1−cTPについてはMluIおよびXhoI(図1A)ならびにpRIC3についてはHindIIIおよびXhoI(図1D)を使用して植物発現ベクターに指向的にサブクローニングした。DH5−α化学的にコンピテントな大腸菌(E. coli)細胞(E.cloni(商標)、Lucigen)を、キメラプラスミド構築物で形質転換し、アンピシリン耐性(100μg/ml)を使用して組換え体を選択した。pTRAc HPV−16 L1/L2キメラ構築物L1/L2(108−120)、L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)は、Mark Whitehead(Plant Vaccine Group, UCT)によって提供された。この研究に使用されたプラスミド構築物は、表2に要約されている。
L1キメラ組換えクローンを、異なるL2エピトープと結合する、pTRAcベクター特異的プライマーおよびキメラ特異的プライマーを使用して、コロニーPCRによってスクリーニングした(表3)。PCRは、3mMの最終MgCl2濃度中、1μMの各プライマーを使用し、GoTaq Flexi DNAポリメラーゼキット(Promega)を製造業者の使用説明書のとおりに使用して実施した。
pTRAcベクター特異的プライマー(Mark Whiteheadによって設計された)は、遺伝子挿入を検出するために多重クローニング部位(MCS)の上流および下流と結合する。PCRプロフィールは、95℃で3分間の初期変性工程と、それに続く95℃で30秒、59℃で30秒および72℃で3分間の25サイクルと、72℃で3分間の最後の伸長工程からなるものとした。PCR産物は、0.8% TBEアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを使用して検出した。
HPV L2エピトープ特異的プライマー(Marieta Burgerによって設計された)を使用して、組換えpTRAkc−rbcs1−cTPおよびpRIC3クローン中の正しいキメラ挿入断片を確認した。PCRプロフィールは、95℃で2分間の初期変性工程と、それに続く95℃で30秒間、55℃(L1/L2キメラ)で20秒間および72℃で30秒間の25サイクルと、72℃で3分間の最後の伸長工程からなるものとした。PCR産物は、1.2% TBEアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを使用して検出した。
組換え体は、1.5kbのキメラ遺伝子挿入断片の両側に隣接するRE部位(pTRAkc−rbcs1−cTPクローンのEcoRI/XhoIまたはpRIC3クローンのHindIII/XhoI)を使用する制限酵素消化によって確認した。組換えDNA(〜500μg)を、製造業者の使用説明書(Roche/Fermentas)のとおり反応あたり1Uの酵素を使用して37℃で1−2時間消化した。消化されたDNAを、0.8% TBEアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。
pTRAkc−rbcs1−cTP組換え体中のHPVキメラ遺伝子挿入断片を、pTRAcベクター特異的プライマーを使用して配列決定した。配列を、DNAMANマルチプルアラインメントソフトウェアを使用してHPVキメラ配列とアラインした。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)GV3101::pMP90RK細胞を、ShenおよびForde(1989)によって記載された方法を使用してエレクトロコンピテントにした。アグロバクテリウムの形質転換は、Macleanら(2007)によって記載されるように実施し、組換えクローンを、抗生物質選択(50μg/mlカルベニシリン、50μg/mlリファンピシンおよび30μg/mlカナマイシン)によってスクリーニングした。形質転換の成功は、コロニーPCRおよび制限酵素消化(上記のとおり)によって確認した。
Macleanら(2007)に記載されるような浸潤のために、A.ツメファシエンス組換えキメラ培養物ならびにトマト黄化壊疽病ウイルス(TSWV)NSsサイレンシングサプレッサーをコードするpBIN−NSs プラスミドを含むA.ツメファシエンスLBA4404培養物(Takedaら, 2002)を調製した。アグロバクテリウム細胞を、浸潤培地(水中、10mM MgCl2、10mM MES、3%スクロースおよび150μM アセトシリンゴン、pH5.6)に希釈し、個々のアグロバクテリウムキメラ株について0.25の最終OD600を得、A.ツメファシエンスLBA4404(pBIN−NSs)と共浸潤される構築物の0.5のOD600と組み合わせた。株を、22℃で2時間インキュベートして、浸潤に先立ってvir遺伝子を発現させた。
アグロインフィルトレーションした葉から、エッペンドルフチューブのキャップを使用して切断したリーフディスクを回収し(ディスクあたり〜10mg、構築物あたり3ディスク)、液体窒素中で砕いた。リーフ物質を、ディスクあたり250μlの、プロテアーゼ阻害剤(EDTA不含完全プロテアーゼ阻害剤;Roche)を含む1.5M NaCl高塩PBS(HS PBS)抽出バッファーに再懸濁した。粗植物抽出物を、13,000rpmで5分間の遠心分離によって2回浄化し、上清を−20℃で保存した。
植物抽出物を、ローディングバッファー(Sambrookら, 1989)中、95℃で5分間インキュベートし、10% SDS−PAGEゲルで分離し、セミドライエレクトロブロッティングによってニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンを、ブロッキングバッファー(1×PBS、pH7.6中、5% スキムミルク、0.1% Tween−20)中、室温で30分間ブロッキングし、ブロッキングバッファーで希釈した抗L1一次抗体中、4℃で一晩インキュベートした。HPV−16 L1タンパク質を、アミノ酸230−236に位置するL1線形エピトープGFGAMDF(McLeanら, 1990)と結合するマウスモノクローナル(MAb)CamVir1(1:10000;Abcam,UK)またはL1タンパク質のFGループ内のアミノ酸261−280に位置する線形エピトープ(Christensenら, 1996)と結合するH16.J4(1:2500)のいずれかを用いて検出した。両結合部位は、L2エピトープ挿入によって破壊されない。
ベンサミアナタバコから抽出したL1キメラを、改変ポリビニルアルコール(PVA)ブロッキングELISA法(Studentsovら, 2002)を使用する捕獲ELISAによって定量化した。手短には、96ウェルMaxisorpマイクロタイタープレートを、1:2000マウス抗HPV−16 L1 MAb(CamVir1またはH16.J4のいずれか)を用い、4℃で一晩コーティングし、PVAを用いてブロッキングした。ウェルに植物抽出物を添加し、37℃で1時間インキュベートした。これに、洗浄工程およびウサギ抗HPV−16ポリクローナル血清(1:1000)の添加を続けた。プレートを4℃で一晩インキュベートし、HPV−16 L1タンパク質を、ブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(1:5000;DAKO)および1.2−フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質(OPD;DAKO;Denmark)を用いて検出した。
異なる植物発現ベクターを使用するキメラ発現における統計的有意差を、ANOVAおよびFischer LSD Post Hoc試験を使用して決定した。有意差は、p<0.01で統計的に有意で報告された。
HPVタンパク質の高次免疫原性構造への集合を、上記のH16.J4およびH16.V5捕獲ELISAを使用して評価した。H16.J4 MAbは、アミノ酸261−280を含むL1線形エピトープ(Christensenら, 1996)と結合し、従って、植物抽出物中に存在する総HPVタンパク質が得られる。H16.V5は、必須アミノ酸260−290を含み、L1残基Phe−50、Ala−266およびSer−282(Whiteら, 1999)と特異的に結合する立体構造L1エピトープ(Christensenら, 1996, 2001)と結合し、従って、集合したHPVタンパク質の検出に使用される。異なるベクターを使用して発現されたキメラの集合を比較するために、集合したHPVタンパク質の量を、総HPVタンパク質のパーセンテージとして表した。
L1キメラクローンの確認
L1キメラ(表1)を、pTRAkc−rbcs1−cTPおよびpRIC3植物発現ベクターに成功裏にクローニングし、大腸菌およびアグロバクテリウムGV3101に形質転換した。
NSsサイレンシングサプレッサーとの共発現
ベンサミアナタバコ葉緑体に標的化されるHPV−16 L1/L2発現を、浸潤1−9日後(dpi)タイムトライアルにおいて調べた。キメラを、NSsサイレンシングサプレッサータンパク質とともに(+)またはそれを伴わずに(−)のいずれかで発現させて、キメラ発現に対するその効果を調べた。発現を、抗L1 MAb CamVir1を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。すべてのL1/L2キメラが、予測された〜56kDaのL1バンドを有すると検出されたが(図2)、L1/L2(108−120)は、その他のキメラよりも高く流れた。
葉緑体へのHPVタンパク質の標的化は、植物発現収率を大幅に改善し得る(Macleanら, 2007)。葉緑体標的化の重要性を調べるために、pTRAc(細胞質標的化)およびpTRAkc−rbcs1−cTP(葉緑体標的化)L1/L2キメラ構築物を、3−9dpiライムトライアルにおいてベンサミアナタバコにpBIN−NSsと共浸潤した。L1/L2 BPV(1−88)キメラは、その他のL1/L2キメラと比較した場合にベンサミアナタバコにおいては極めて低い発現しか示さないのでこの研究には含まれなかった。
特に、低発現性L1/L2 BPV(1−88)について、キメラ収率を改善しようとして、NSsの存在下で3−9dpiタイムトライアルにおいて、植物発現ベクターpRIC3(自己複製性細胞質標的化ベクター)をpTRAkc−rbcs1−cTP(非複製性葉緑体標的化ベクター)と比較した。
3種の高発現L1/L2キメラを、マウス免疫原性研究のためのワクチン抗原として選択した:L1/L2(108−120)、L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)。3種の生物学的リピートを含む最終発現研究を実施してL1/L2結果を確認し、統計的に妥当なデータを得た。3種のベクター(pTRAc、pTRAkc−rbcs1−cTPおよびpRIC3)すべてを、各L1/L2ワクチン抗原の発現について直接比較し、HPV−16 L1をポジティブコントロールとして含め(pTRAcおよびpTRAkc−rbcs1−cTP構築物が利用可能であった)、NSsが浸潤された植物は、ネガティブコントロールとして働いた。キメラをNSsと共発現させ、5dpiで抽出した。
5dpiでの抽出の前の浸潤された葉の検査によって、自己複製性pRIC3ベクターは、植物の健康に対して有害作用を有することが示唆された。pRIC3を用いて浸潤された葉は、黄/茶色であり、浸潤された領域で葉組織の壊死が見られた。これは、同様にキメラを植物細胞質に標的化したpTRAc葉では、より少ない程度で観察された。pTRAkc−rbcs−cTP葉は、最も健康であると思われ、NSsが浸潤されたネガティブコントロールの葉と浸潤されていない葉は似ており、これは、葉緑体におけるキメラの蓄積が、植物の健康に対してあまり影響を与えないことを示唆する(示されていない結果)。NSsが浸潤された葉が、浸潤されていない葉と同様に見えたので(シリンジ注射マーキングを除いて)、浸潤は、植物の健康に対して観察可能な効果を有さないと思われる。これらの結果は、すべてのタイムトライアルについて一貫して観察された。
HPVタンパク質を、抗L1ウエスタンブロッティングによって検出した(図3a)。NSsが浸潤された植物抽出物(ネガティブコントロール)は、検出されず、植物によって誘導されたHPV−16 L1(ポジティブコントロール)は、葉緑体に標的化するベクターを使用して検出された。種々のベクターを使用する発現を、最高発現収率を一貫して与えるpTRAkc−rbcs1−cTPと、続いて、pRIC3、次いで、pTRAcと直接比較した。
捕獲ELISAを使用し、CamVir1を使用してHPVキメラを定量化した。L1/L2キメラおよびHPV−16 L1収率は、図3bに示されている。ANOVAおよびFischer LSD Post Hoc試験を使用して、3種の植物発現ベクターを使用するキメラ発現における統計的有意差を調べた。有意差は、p<0.01で統計的に有意で報告された。
カプソメアまたはVLPなどの高次構造へのキメラ集合を、H16.J4(線形エピトープ特異的MAb)およびH16.V5(立体構造エピトープ特異的MAb)捕獲ELISAを使用して評価した。各ベクター構築物について、V5によって検出された立体構造HPVタンパク質の量を、J4によって検出された総HPVタンパク質のパーセンテージとしてとして表した(図4)。
植物におけるL1キメラ一時的発現の最適化
アグロバクテリウム媒介性の一時的な系を使用して植物において、L1キメラのすべてが成功裏に発現された(図2)。NSsサイレンシングサプレッサーの使用、アグロインフィルトレーションによって送達される自己複製性ウイルスベクターの使用および発現されたタンパク質の葉緑体への標的化を含めた、いくつかの方法を使用して植物におけるキメラ発現を最適化した。
アグロバクテリウム媒介性の一時的発現は、通常、浸潤後60−72時間(〜3日)でピークとなり、次いで、宿主植物において転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を引き起こした結果として急速に減少する(Voinnet, 2001)。PTGSは、外来RNA分子が、配列特異的に認識され、分解される適応抗ウイルス植物防御機構である(Meins, 2000;SijenおよびKooter, 2000)。対抗防御戦略として、多数の植物ウイルスは、この機構の種々の工程を抑制する進化したタンパク質を有する(Voinnet, 2001)。PTGS応答は、植物細胞質における導入遺伝子mRNA蓄積を低減し、アグロバクテリウム媒介性の一時的発現の効率を制限するが(de Carvalhoら, 1992;Van Bloklandら, 1994)、ウイルスサイレンシングサプレッサーとのタンパク質の共発現は、PTGS応答を抑制し、高レベルの一時的発現を可能にし、導入遺伝子のより高い収率(場合によっては、50倍)および長期発現をもたらすことが示されている(Voinnetら, 2003)。
細胞質HPV−16 L1収率は、自己複製性pRICベクターを使用することによって50%改善した(Regnardら, 2010)。結果として、第3世代pRIC3ベクターをキメラ収率を改善するための可能性のある戦略として調べた。3種のL1/L2キメラを調べた:L1/L2(108−120)、L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)。すべてのキメラが、pRIC3(自己複製性ベクター)を使用すると、pTRAc(非複製性ベクター)と比較してより高い発現レベルを実証し、これは、導入遺伝子増幅が、植物細胞質におけるL1/L2収率を改善することを示唆する(図3aおよびb)。しかし、葉緑体標的化は、L1/L2キメラの高レベル蓄積においてより効率的であり(図3b)、pRIC3が浸潤された葉では、葉組織の眼に見える壊死が観察され、これは、ベクターの自己複製が、植物の健康に負に影響を及ぼすことを示唆する。
L1キメラは、pTRAkc−rbcs1−cTPベクターを使用すると葉緑体に標的化された。葉緑体トランジットペプチド(cTP)は、発現されるキメラと融合され、オルガネラへの侵入の際に葉緑体ストロマプロセシングペプチダーゼ(SPP)によって切断される(RobinsonおよびEllis, 1984)。葉緑体におけるタンパク質の高レベル蓄積に関与するいくつかの因子がある:(a)細胞プロテアーゼからの保護、(b)プラスチドにおける異なるタンパク質加水分解機構および(c)L1の正しいフォールディングを補助し、従って、タンパク質安定性を改善する保護的プラスミド特異的シャペロン(Fernandez-San Millanら, 2008)。この研究では、葉緑体標的化は高度に有効であり、L1/L2キメラ収率を、細胞質に標的化されるキメラと比較して40−80倍増大させた(図3a)。
2つの戦略が、植物によって発現されるL1収率を最大530−550mg/kgに増大させた(i)タンパク質を葉緑体に標的化すること(Macleanら, 2007)または(ii)アグロインフィルトレーションによって送達される自己複製性BeYDV由来発現ベクターの使用(Regnardら, 2010)。これは、L1ベースのキメラを使用してこれらの戦略を直接比較した最初の研究であった。植物発現ベクターpRIC3(自己複製性、細胞質標的化ベクター)を使用するキメラ発現レベルを、pTRAkc−rbcs1−cTPと直接比較した。比較目的でpTRAc(非複製性、細胞質標的化ベクター)を使用する発現を含め、HPV−16 L1をポジティブコントロールとして使用した(図3aおよびb)。
HPV−16 L2エピトープを含む高度に発現されるL1/L2キメラ
L1/L2(108−120)、L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)キメラは高度に発現され、収率は、その他のキメラより最大20倍高かった(表4)。結果として、これらの3種のL1/L2キメラを、マウス免疫原性研究のためのワクチン抗原として選択した。
L1/L2 BPV(1−88)キメラは、HPV−16 L2エピトープを含むキメラと比較して低い発現レベルを有していた(図2)。L1/L2 BPV(1−88)は、H16.J4 MAbを用いてプロービングされたウエスタンブロットで検出され、40mg/植物組織1kgの低い収率を示したが(図2、示されていないELISAデータ)、ELISA定量化によって推定された発現レベルは、NSsネガティブコントロールと同様であった。さらに、葉緑体に標的化されたL1/L2 BPV(1−88)は部分分解されたが(図2D)、これは、いくつかのHPV L1発現研究においてこれまでに記載されている(Hagenseeら, 1993;Sasagawaら, 1995;Liら, 1997;Kohlら, 2007)。
方法および材料
抗原の大規模一時的発現および抽出
ベンサミアナタバコ植物(2−4週齢)を、Macleanら(2007)によって記載されるようにNSsサイレンシングサプレッサータンパク質をコードするA.ツメファシエンスLBA4404(pBIN−NSs)およびHPV−16 L1またはL1/L2キメラをコードするアグロバクテリウムGV3101株を用いて真空浸潤した。植物を22℃、16時間明、8時間暗で5日間成長させた。
植物によって発現されたL1ワクチン抗原の精製のために、いくつかの方法を調べた。クロスフロー精密濾過ならびにスクロースおよび塩化セシウム密度勾配を使用する超遠心などのサイズに基づく方法、ならびにL1およびL1ベースのキメラの迅速精製のための、一段階陽イオン交換およびヘパリンクロマトグラフィーを試験した。0.5M NaClを含むPBSで抽出されたL1タンパク質を、クロマトグラフィーに先立って低塩PBS(LS PBS:10mM NaCl PBS、pH7.4)で10×希釈して、カラムとのL1結合を可能にした。マウス免疫原性研究における下流適用のために、限外濾過を利用して、抗原を濃縮し、クロマトグラフィー画分を脱塩した。
サンプル調製
ベンサミアナタバコにおいてHPV−16 L1およびL1ベースのキメラを発現させ、抽出バッファーとしてLS PBSを使用して実施例1において上記のように抽出した。L1/L2(108−120)、L1/L2(56−81)、L1/L2(17−36)、HPV−16 L1およびNSsが浸潤された植物抽出物の二重浄化した粗上清(それぞれ、ワクチン1−5)を、クロマトグラフィーに先立って0.22μmのMilliporeフィルターを通して濾過して、あらゆる細片を除去した。
AKTA Explorer System 10を使用してクロマトグラフィーを実施した。手順は、GE Healthcareカラム使用説明書マニュアルにおいて推奨されるとおりにたどり、0.5ml/分の流速を維持した。カラムを、10カラム容量(cv)の低塩洗浄バッファー(LS PBS:10mM NaCl PBS)を用いて平衡化し、その後、サンプルをロードした。予めパッケージングされた1mlのHiTrapヘパリン陽イオン交換カラム(GE Healthcare, Amersham Biosciences AB, Sweden)に粗抽出物(10−20ml)をロードし、10cvのLS PBS洗浄バッファーを用いてカラムを洗浄した。10cvの0−100%の、1.5M NaClを含む高塩PBS(HS PBS)溶出バッファーがカラムに適用される直線イオン強度勾配を使用するパイロット実験において、各HPV抗原の溶出プロフィールを最適化した。ひとたび、<50% HS PBSがカラムに適用された時点で、すべての抗原が溶出したことが確立されると、ワクチン抗原の精製に50%段階溶出勾配(0.75M NaCl)を適用した。段階溶出勾配は、10cvの50% HS PBSと、それに続く、10cvの100% HS PBSとした。カラムを、5cvの蒸留水および5cvの20%エタノールを用いて最後に洗浄した。画分(1ml)を集め、ウエスタンドットブロットによって分析した。
ドットブロットは、実施例1において上記のように実施した。CamVir1(1:10000)を使用して、L1を検出し、Cervarixをポジティブコントロールとして使用した。高濃度の精製抗原を含む溶出画分をプールし、−70℃で保存した。NSsが浸潤された植物抽出物(V5:ネガティブコントロール)について、溶出タンパク質ピークに対応した画分をプールし、L1ポジティブコントロールワクチン(V4)ドットブロットで試験して、L1を含まないことを確認した。
50% HS PBS溶出バッファー(0.75M NaCl)中の精製抗原を、マウスワクチン接種に先立って脱塩した。10kDa MWCOフィルター(Macrosep(登録商標)Centrifugal Devices, 10K Omega, PALL Life Sciences)を備えた限外濾過スピンチューブを使用してサンプルを7000gで15−30分間遠心分離することによって、精製L1画分を迅速に濃縮、脱塩した。L1抗原を含む保持液をLS PBSで希釈し、サンプルが市販のPBSに見られるものと同様のNaCl濃度(〜0.15M NaCl)を含むまで、限外濾過によって製造業者の使用説明書のとおりに数回再濃縮した。保持液および濾液画分の両方を調べた。
精製を評価するためのHPV抗原のクマシー染色およびウエスタンブロット検出
各ワクチン抗原の粗抽出物および精製サンプルを、クマシー染色およびウエスタンブロット解析によって比較した。サンプルを上記の実施例1に記載のとおりに調製し、2つの10% SDS−PAGEタンパク質ゲルに等容量をロードした。一方のゲルは、クマシー溶液を用い、室温で一晩染色し、37℃で2×2時間脱染した。もう一方のゲルは、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、CamVir1を用いてプロービングした。
ネガティブコントロールワクチン(V5:NSsが浸潤された植物抽出物)は、抗L1ウエスタンブロッティングによって定量化できなかった。結果として、Bioradローリータンパク質アッセイを使用して(先に実施例1において記載された)各ワクチン抗原の総可溶性タンパク質(TSP)の量を決定して、TSPがすべてのワクチンについて同様であることを確認した。
線形エピトープ特異的モノクローナル抗体(MAb)H16.J4を使用して、捕獲ELISAを実施例1に記載のとおりに実施した。粗サンプルおよび精製サンプルの両方において、ELISAによって決定されたHPV抗原収率を、対応するTSP収率と比較して、抗原濃縮を調べた。
ワクチンCervarix(40μg/mlの昆虫細胞によって生産されたHPV−16 L1を含有する)の希釈系列を使用して、植物によって生産されたHPV抗原(V1−4)を定量化した。抗原のいくつかの希釈物を分析して、標準曲線の直線範囲内に生じる定量化を確実にした。等容積の精製抗原およびCervarix希釈物を、10% SDS−PAGEゲルにロードし、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにブロットし、CamVir1(1:10000)を用いてHPV抗原を検出した。
キメラHPV L1/L2タンパク質が、葉緑体とは対照的に細胞質に標的化される場合に、小さいウイルス様粒子も形成されるかどうかを確立するために、ベンサミアナタバコ植物を、サイレンシングサプレッサーNSsと一緒にpRIC L1/L2(108−120);L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)を有する組換えアグロバクテリウムを用い、上記の方法を使用して浸潤した。3−5日後、浸潤された葉を採取し、挽き砕き、遠心分離によって細胞細片を除去した。
精製ワクチン抗原のアリコートを、マウスワクチン接種のために調製されているかのように前処理した。抗原を4℃で一晩解凍し、必要な濃度にPBSに再懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。
植物によって発現されたHPV抗原の精製
浄化された抽出物中のHPV抗原の検出
L1およびL1/L2キメラの浄化上清への局在がウエスタンブロット解析によって確認された。クマシー染色されたタンパク質ゲルは、上清中のRubiscoの多量の存在およびペレット中に存在するいくつかの夾雑タンパク質の除去を示した(データは示さず)。
L1/L2キメラは、L1とは対照的に種々の構造に集合するようであるので、サイズに基づく技術を使用する精製は、大部分は不成功であり、ワクチン抗原間で再現性がない。さらに、タンパク質分解が検出され、従って、代替法としてクロマトグラフィーを使用する精製を調べた。
ワクチン抗原を、HPV抗原の溶出のために高NaCl勾配を使用するヘパリンクロマトグラフィーによって、浄化した粗植物上清から精製した。段階溶出勾配は、直線0−100% 1.5M NaCl勾配を使用して各HPV抗原のために最適化した。すべてのHPV抗原は、0.45−0.75M NaClの間で溶出した(データは示さず)。結果として、マウス免疫原性研究に向けて、50%(0.75M NaCl)段階勾配を使用して、ワクチン抗原を精製した。溶出液画分中の精製HPV抗原の検出を、CamVir1ドットブロットを使用して調べた。
精製サンプルを粗植物抽出物と比較することによってワクチン抗原の純度を調べた。これは、サンプル中に存在する総タンパク質を示すためにクマシー染色を(図5A)、HPV抗原を検出し、抗原収率の減少を示すためにウエスタンブロット解析を(図5B)使用して行った。L1/L2(108−120)キメラ(V1)は、その他のL1/L2キメラ(V2−3)およびL1コントロール(V4)よりも高く流れることは留意されたい。
(a)NSsネガティブコントロール(HPV抗原と共精製された植物タンパク質を含有する)のTSPが、その他のワクチン抗原と比較して同様であったことを確実にするために、(b)精製後のHPV抗原富化を調べるために精製抗原のTSPを決定した。精製HPVワクチン抗原(V1−4)のTSPは、同様であったが、NSs植物抽出物ネガティブコントロール(V5)のTSPは、恐らくは、より多い溶出液画分がプールされたことまたはより大きな限外濾過濃縮(データは示さず)の結果として、ほぼ2倍高かった。結果として、1×PBSでそれに応じて希釈された。
HPV抗原は、デンシトメトリーおよび市販のワクチンCervarixを標準として使用してウエスタンブロッティングによって定量化した(データは示さず)。精製抗原バッチの一部において、特に、何回かの凍結−解凍サイクルの後に、〜45kDaのバンドとして見ることができる、いくらかのL1タンパク質分解が検出された。しかし、マウス免疫原性研究に向けて調製されたサンプルでは、全長56kDa L1バンドのみを定量化した。
粗サンプルおよび精製サンプルの両方において植物の葉緑体(choloroplasts)において生産されたL1およびL1/L2キメラの構造的集合物を免疫捕獲透過型電子顕微鏡によって分析した(図7)。粗サンプルから、細胞質において生産されたL1/L2キメラの構造的集合物を、免疫捕獲透過型電子顕微鏡によって分析した(図8)。抗原精製は、特に、L1/L2(108−120)およびネガティブコントロール(それぞれ、図7AおよびE)について夾雑バックグラウンドタンパク質の除去をもたらした。ネガティブコントロール(NSsが浸潤された植物抽出物)と比較して、すべてのHPV抗原は、二次HPV構造、カプソメア(〜10nm)、カプソメア凝集物、小さいVLP(〜30nm)またはフルサイズのVLP(55nm)のいずれかを含むようであった。
L1の安定性は、複数の精製工程によって負に影響を受けるが、ストリンジェント精製は、ワクチンの商業的生産にとって必要である。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーが、集合されたL1を選択的に精製するために利用され得、一段階クロマトグラフィー法を使用する精製戦略が、HPVワクチンの迅速な費用効率の高い生産にとって理想的であろう。この研究は、マウスにおけるその後の免疫原性研究に向けた、植物によって発現されたHPV−16 L1および3種のL1/L2キメラのヘパリンクロマトグラフィーを使用する精製を報告する。
HPV−16 L1およびL1ベースのキメラは、粗抽出物上清に局在しており、種々の方法を使用して精製した。サイズに依存する精製方法を使用して、植物によって発現されたHPV L1を精製したが(Biemeltら, 2003;Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008)、これらの方法は、L1/L2キメラ精製には効果的ではなく、抗原間で再現性がなかった。L1ベースのキメラは、スクロースおよびCsCl密度勾配超遠心の両方を使用して、いくつかの画分において広く検出され、これは、L1/L2キメラが、カプソメア、凝集物およびVLPなどの異種高次構造に集合したことを示す。さらに、集合の程度は、キメラおよびL1ポジティブコントロールの間で異なると思われた。これは、透過型電子顕微鏡によって確認され(図7)、これは、種々のL1/L2キメラとL1コントロール間の個別の相違を示した。
その後のマウスにおける免疫原性研究に向けて、ヘパリンクロマトグラフィーを使用してワクチン抗原を精製した(Joyceら, 1999によって記載された;Bazanら, 2009;Johnsonら, 2009;Kimら, 2009, 2010)。ヘパリンは、L1およびL1/L2キメラの両方と、同様の方法で可逆的に結合し(データは示さず)、すべての抗原が0.75M NaClを用いて溶出した。これは、ヘパリンによって結合されたHPV−16 L1が、0.5−1.2M NaClの間で溶出した他の研究と比較できる(Bazanら, 2009;Kimら, 2010;Baekら, 2011)。
精製された抗原を、デンシトメトリーを使用するウエスタンブロット解析(Heidebrechtら, 2009によって論じられた)によって定量化し、CamVir1によって検出されたL1バンドおよびHPV−16 L1標準としての市販のワクチンCervarixの強度を測定した(データは示さず)。
植物細胞の葉緑体において生産された植物に由来するHPV−16 L1およびL1/L2キメラの集合を、免疫捕獲電子顕微鏡を使用して分析した(図7)。精製は、一部のバックグラウンドタンパク質を除去すると思われ、すべての植物によって発現されたL1/L2キメラおよびL1ポジティブコントロールは、カプソメア、凝集物およびVLPなどの高次構造に集合した。
においても発現されており、CsClによって精製されたキメラは、直径〜30nmの個別のcVLPではなく、無定形VLPおよびカプソメア凝集物に集合することが示された(Varsaniら, 2003a)。
この研究では、マウスを、植物由来のL1および交差中和性L2エピトープアミノ酸108−120、56−81および17−36を含む3種のL1/L2キメラ候補ワクチンを用いて免疫処置した。キメラの免疫原性を、キメラ集合に関して分析し、相同HPV−16および異種HPV−18、45および52PsVsに対する抗L1、抗L2および保護的NAbを引き起こすその能力を調査した。
マウスの免疫処置
South African Vaccine Producers Animal Unit(Johannesburg, South Africa)から得た雌のC57/BL6マウスを、ケープタウン大学、健康科学学部(Health Science Faculty, University of Cape Town)における動物ユニット(Animal Unit)中で、Biosafty Level 2(BSL−2)条件下で維持した。この研究の許可は、研究倫理委員会、ケープタウン大学(Research Ethics Committee, University of Cape Town)によって与えられた(AEC 008/037)。
昆虫細胞によって生産されたHPV−16 L1の調製
昆虫細胞によって生産されたHPV−16 L1を、マウス血清中の抗L1抗体を検出するためのELISA抗原として使用した。夾雑植物タンパク質に対する抗体のバックグラウンド検出を避けるために、植物によって発現されたL1の代わりに昆虫細胞によって発現されたL1を使用した。27℃でSF90011血清不含培地(Gibco)中で振盪しながらヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(Sf−9)細胞を増殖させ、1.0の多重感染度(MOI)および1×106個細胞/mlの細胞密度で感染させた。96時間後に細胞を遠心分離(1000×gで5分間)によって回収し、ペレットをDPBSで洗浄し、−70℃で保存した。
抗L1抗体力価を直接ELISAによって決定した。96ウェルMaxisorpマイクロタイタープレート(Nunc)を、1×PBSで希釈した100μl/ウェル(30ng)の昆虫細胞によって生産されたHPV−16 L1抗原を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、ブロッキングバッファー(1×PBS中、1%スキムミルク;200μl/ウェル)を用いて室温で2時間ブロッキングし、次いで、PBSを用いて4回洗浄した。
両側、対応のないt検定を使用して、ネガティブコントロールワクチンと比較して最終出血抗L1応答の統計的有意性を算出した(p=0.01)。一元配置分散分析法(ANOVA)を使用して、ワクチンおよびFisher LSD、シチメンチョウHSDを比較し、ボンフェローニ試験を使用して、有意性を決定した(p=0.01)。
大腸菌によって生産されたHPV−16 L2の調製
大腸菌(David Mutepfaによって提供された)においてpProEX htbベクターを使用して生産されたHisタグをつけたHPV−16 L2タンパク質を、マウス血清中の抗L2抗体のウエスタンブロット検出に使用した。大腸菌培養物を、0.6のOD600に37℃で振盪しながら増殖させ、次いで、0.6mMイソ−プロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)の添加によって誘導した。3時間後、細胞を遠心分離(4℃、3800gで15分)によって回収し、ペレットを保持し、秤量した。
大腸菌によって生産されたHPV−16 L2抗原を、5×ローディングバッファー中、95℃で5分間インキュベートし、10% SDS−PAGEゲルにロードした。10ウェルコームを使用する代わりに、2ウェルコーム;タンパク質マーカーのための小さいウェルおよび一緒に融合した9ウェルからなり、従って、タンパク質が幅一杯に均一に広がることを可能にした単一の広いウェルをもたらす大きいウェルを使用した。
中和アッセイのための調製
HPV偽ビリオン(PsV)中和アッセイのために使用したプロトコールは、Cellular Oncology技術ファイルのDr John Schillerの研究室から採用し、HPV L1/L2 pSheLLプラスミドおよびpYSEAPリポータープラスミドは、親切にもDr John Schillerによって提供された。
HEK293TT細胞系統は親切にも、Dr John Schillerによって提供された。HPV PsVsは、2010年6月に改訂された「パピローマウイルスベクター(偽ウイルス)の生産」プロトコールに記載されるとおりに生産した。
偽ビリオンを、トランスフェクションの40−48時間後に回収した。細胞を、0.05%トリプシン−EDTA(Gibco)を用いるトリプシン処理によって集め、cDMEMの添加によって不活化した。細胞を円錐底のポリスチレンのSterilinチューブに移し(偽ビリオンが、ポリプロピレンチューブに非特異的に吸着するので)、カウントし、1200rpmで8分間遠心分離した。ペレットを、0.5mlのDPBS(Invitrogen)を用いて洗浄し、1.5ペレット容積のDPBS−Mg(さらなる9.5mM MgCl2を有するDPBS)に再懸濁して、>100×106個細胞/mlの高い細胞密度を達成した。
PsVは、Optiprep密度勾配遠心分離によって精製する。Optiprep(60% w/v イオジキサノール溶液;Sigma)を、DPBSで46%(w/v)Optiprep保存溶液に希釈し、0.625M NaClを0.8M NaCl、CaCl2を0.9mM、MgCl2を0.5mMおよびKClを2.1mMの終濃度に補充した。高塩DPBS(0.8M NaCl)を使用して、保存溶液を27%、33%および39% Optiprepに希釈し、薄壁5mlポリアロマー超遠心機チューブ(Beckman)中に1.5mlの段階で、Optiprep希釈物(27−39%)を下に重ねることによって3段階勾配を調製した。勾配を、室温で4時間拡散させた。二重浄化した細胞上清を、直線化されたOptiprep勾配上に層にし、Beckman SW55tiローター中、16℃、50,000rpm(234,000×g)で3.5時間遠心分離した。チューブの底にシリンジニードルを刺し、画分を白キャップポリスチレンチューブ中に集めた。第1の画分は、〜0.75ml、画分2−11は、各〜0.25mlであり、画分12は勾配の残部を含んでいた。
精製されたHPV PsVを、電子顕微鏡を使用して分析した。PsV(1:1000)を、グロー放電炭素コーティング銅グリッドに捕獲し、2%酢酸ウラニルを用いて染色し、Zeiss EM 912 CRYO EFTEMを使用して観察した。
PsV力価測定および中和アッセイは、力価測定にNAbが含まれなかった点を除いて、「パピローマウイルス中和アッセイ」プロトコールに基づいていた。SEAPアッセイにおける頑強なシグナルに必要なPsVの最小量を決定するための中和アッセイに先立って、PsV保存液を力価測定した。
インビトロ(in vitro)中和アッセイを使用して、マウス血清におけるHPV特異的抗体応答を検出し、エンドポイント中和力価を決定した。
(a)細胞コントロール(ネガティブ感染コントロール): 細胞培養上清のバックグラウンド読み取り値を得るために、細胞を中和培地のみ(血清または偽ビリオンなし)とともにインキュベートした。このコントロールと関連している発光値は、0% PsV中和に相当した。
HPV−16 L1に対する体液性免疫応答
HPV−16 L1に対して引き起こされた抗体の検出を、昆虫細胞によって発現されたHPV−16 L1をコーティング抗原として使用して直接ELISAによって行った(図9)。抗L1力価は、1:50の対応する事前出血血清のものよりも高い吸光度読み取り値を含む最大血清希釈の逆数として表した。
大腸菌によって生産されたHisタグをつけたHPV−16 L2タンパク質に対する抗L2応答を、ウエスタンブロッティングを使用して調べた。各ワクチンのために個々のマウス血清をプールし、抗L2応答について分析した(図10)。
プラスミド分析
制限酵素消化および配列決定を使用して、pYSEAPおよびHPV−16、18、45および52 L1/L2 pSheLLプラスミドの同一性を確認した(データは示さず)。
27−39%のOptiprep直線勾配での密度勾配超遠心によって、HPV PsVを、浄化した細胞上清から精製した。勾配から上に3分の1に明るい灰色のバンドがかすかに見え、チューブの底から画分を集めた。
プールしたPsVサンプルを、透過型電子顕微鏡によって調べ、その集合、形態学および精製を決定した(データは示さず)。すべてのHPVタイプは、球状PsV(55nm)に集合した。HPV−45 PsVは、もっぱら、十分に集合したPsV粒子として存在するようであった。HPV−16および18 PsVは、一部のカプソメアおよび凝集物が見られたが、主に集合した。HPV−52 PsVは、恐らくは、HEK293TT細胞における低いHPV−52 L1およびL2発現の結果として、大きな割合のカプソメア凝集物および部分的なPsVを含んでいた。
精製されたPsVを力価測定して、中和アッセイに使用されるべきPsV希釈を決定した。使用された希釈は、力価測定曲線の直線範囲内に頑強なシグナルを示すPsVの最小量とした。
NAbポジティブコントロールを、中和アッセイに先立って、その中和能力をチェックし、適した希釈範囲を決定するためにマウス抗血清を用いて試験した。すべてのポジティブコントロール抗体は中和し、試験された希釈範囲内で直線関係を示した(表9)。
植物によって生産されたHPV−16 L1およびL1/L2キメラを用いて免疫処置されたマウスから得た血清を、HPV−16 PsVの相同中和およびHPV−18、45および52 PsVに対する異種交差防御について試験した(図10−13)。すべてのポジティブコントロールNAbは、HPV−16、18、45および52 PsVを成功裏に中和し(図10−13F)、これは、中和アッセイ結果が妥当であったことを実証する。中和力価は、血清を用いて処理されなかったコントロールサンプルと比較して、SEAP活性を>50%低下させる血清の最高希釈として定義した。
HPV−16 PsV中和アッセイから得られた結果が、図11に示されている。植物由来HPV−16 L1血清(V4;図11D)は、H16.V5ポジティブコントロール(図11F)を摸倣し、HPV−16 PsVを強力に中和し、同様の中和曲線を有するL1/L2(108−120)が続いた(V1;図11A)。ネガティブコントロール(V5;図11E)と同様の中和曲線を有するL1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)は両方とも、HPV−16 NAbを引き起こさないと思われた(V2−3;図11B−C)。
すべてのワクチンから得た抗血清は、HPV−18 PsVを中和しなかった(図12)。L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)キメラ(V2−3、図12B−C)は、タイプ特異的HPV−16 L1ワクチンおよびネガティブコントロール(V4−5、図12D−E)と同様の中和曲線を生じた。L1/L2(108−120)は、幾分かの中和活性を有すると思われ、<800の逆数血清希釈が、発光読み取り値を、事前出血および中和されていないHPV−18 PsVコントロール(V1;図12A)のものよりも低く低下させた。しかし、キメラは、SEAPレベルを>50%低下させなかった。
HPV−45 PsV中和アッセイから得られた結果(図13)は、L1/L2キメラワクチン(V1、V2およびV3;図13A−C)のうちいずれも、相当な力価のHPV−45 NAbを引き起こさず、HPV−16 L1およびネガティブワクチンコントロール(V4−5;図13D−E)と同様の中和曲線を有していたことを示唆する。
HPV−52 PsV中和アッセイ(図14)は、L1/L2(56−81)血清が、HPV−16 L1およびネガティブコントロール血清(V4−5;図14D−E)について見られるように、HPV−52(L2;図14C)を中和しなかったという証拠を提供する。L1/L2(108−120)およびL1/L2(17−36)キメラワクチンは、低逆数希釈(reciprocal dilution)(50−200)で幾分かの中和活性を有すると思われ、中和されていないHPV−52 PsVコントロール(V1およびV3;図14AおよびC)と比較して、SEAPレベルを>50%低下させた。
構造的集合(上記の実施例2を参照のこと)、抗L1およびL2体液性応答およびL1/L2キメラ抗血清において検出されたHPVタイプNAbが表11にまとめられている。VLPへの集合は、より高い抗L1およびHPV−16 PsV中和力価と関連していると思われ、これは、集合がL1免疫原性と関連していることを示唆する。
植物由来HPV−16 L1(Macleanら, 2007;Fernandez-San Millanら, 2008)およびL1ベースのキメラ(Paz De la Rosaら, 2009)は、免疫原性VLPに集合し、中和抗体(NAb)の生産を引き起こす。この研究では、HPV−16 L1のh4領域中に、交差中和HPV−16 L2アミノ酸108−120、56−81または17−36エピトープを含む3種の植物由来L1/L2キメラの免疫原性を分析した。マウスを、フロイントの不完全アジュバント中、10μgの植物由来抗原を用いて皮下に免疫処置し、7週間以内に4回のブースターワクチン接種を施した。
この研究では、植物由来L1/L2キメラによって引き起こされた体液性抗L1およびL2応答を分析して、L2ペプチドが提示される場合に、L2挿入がL1免疫原性を損なうかどうかを決定した。
L2エピトープアミノ酸108−120、56−81および17−36を含むL1/L2キメラを、HPV−16、18、45および52 PsVを中和する抗体を引き起こすその能力について調べた。この研究において分析されたL2エピトープのすべてが、相同HPV−16を中和し、HPV−52を交差中和する(Kawanaら, 2003;Slupetzkyら, 2007;Kondoら, 2007, 2008;Gambhiraら, 2007;Schellenbacherら, 2009)抗体を引き起こすことが示されている。さらに、L2アミノ酸56−81は、HPV−18を交差中和し、L2アミノ酸17−36は、HPV−18および45の両方を交差中和する(Gambhiraら, 2007;Kondoら, 2007, 2008;Alphsら, 2008;Schellenbacherら, 2009;Rubioら, 2009)。
植物由来L1/L2(56−81)およびL1/L2(17−36)は、検出可能なHPV−16 NAb力価を引き起こさず、事前出血およびNSsが浸潤された植物抽出物と同様の結果を示した(図11)。これまでの研究は、BPV−1またはHPV−16 L1が引き起こしたHPV−16 NAbの表面領域に局在するHPV−16 L2ペプチドアミノ酸17−36、18−38、56−75または69−81を含むL1/L2キメラを示した(Slupetzkeyら, 2007;Kondoら, 2008;Schellenbacherら, 2009)。しかし、挿入部位は、この研究において使用したものとは異なっており、キメラはcVLPに集合した。さらに、HPV−16 L2アミノ酸73−84に対するMAbは、この研究においてL1/L2(56−81)キメラについて得られた結果と同様に、非中和性であるとわかり、HPV−16 PsVを中和しなかった(Gambhiraら, 2007)。
系統学的に関連するHPV−18および45 PsVに対する中和活性は、すべてのHPVワクチンについて検出されなかった(図12−13)。同様に、L1/L2(56−81)抗血清は、HPV−52 PsVを中和しなかった(図14)。L1/L2(108−120)およびL1/L2(17−36)は、低HPV−52 NAb力価(50−200)を引き起こすと思われたが、恐らくは、部分集合したPsVの精製のために、アッセイにおいて、はるかに多い変動があり、アッセイは、結果を確認するために反復されなければならない。
Claims (24)
- 約30nmの直径を有するキメラヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)を生産し、回収する方法であって、
(i)キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドをコードするキメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する工程、ここで、該キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドは、キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドの残基414から挿入された13アミノ酸から26アミノ酸のHPV L2ペプチドを有するHPV 16 L1ポリペプチドを含み、そして、該挿入されたHPV L2ペプチドのアミノ酸は、HPV 16 L1ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する;
(ii)キメラヒトコドン最適化ヌクレオチド配列を植物においてポリペプチドを発現することに適している発現ベクターにクローニングする工程;
(iii)植物細胞を工程(ii)の発現ベクターで形質転換するか、または植物細胞に工程(ii)の発現ベクターを浸潤する工程;
(iv)発現されたキメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドが約30nmの直径を有するキメラHPV VLPに集合するように、工程(iii)の植物細胞においてキメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドを発現する工程;および
(v)1.5MのNaCl濃度を有する高塩抽出バッファーを使用して、該植物細胞から該キメラHPV VLPを回収する工程
を含む方法。 - 工程(ii)の発現ベクターが、細胞質から植物の葉緑体細胞へ発現されたキメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドを指向するためのポリペプチドをコードする標的化配列をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 発現ベクターが、発現ベクターのコード配列に作動可能に連結したプロモーターおよび他のレギュレーターなどを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 植物における転写後遺伝子サイレンシングを阻害することに適しているサプレッサータンパク質での植物細胞の共浸潤(co-infiltration)または共形質転換(co-trans形成)の工程をさらに含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- サプレッサータンパク質が、トマトスポッテッドウイルトウイルス(tomato spotted wilt virus)のNSsタンパク質またはトマトブッシースタントウイルス(tomato bushy stunt virus)のp19である、請求項4に記載の方法。
- 挿入されたHPV L2ペプチドが、
(i)配列番号:7のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:3の13アミノ酸ペプチド;
(ii)配列番号:9のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:5の20アミノ酸ペプチド;および
(iii)配列番号:8のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:4の26アミノ酸ペプチド
からなる群から選択される、請求項1から5のいずれかに記載の方法。 - 請求項1から6のいずれかに記載の方法によって生産される約30nmの直径を有するキメラヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)であって、該キメラHPV VLPは、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるキメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドを含み、該キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドは、HPV 16 L1ポリペプチドの残基414から挿入された13アミノ酸から26アミノ酸のHPV L2ペプチドを含むHPV 16 L1ポリペプチドをさらに含み、そして、該挿入されたHPV L2ペプチドのアミノ酸は、HPV 16 L1ポリペプチドの対応するアミノ酸を置換する、キメラヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)。
- 挿入されたHPV L2ペプチドが、
(i)配列番号:7のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:3の13アミノ酸ペプチド;
(ii)配列番号:9のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:5の20アミノ酸ペプチド;および
(iii)配列番号:8のヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:4の26アミノ酸ペプチド
からなる群から選択される、請求項7に記載のキメラHPV VLP。 - キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドをコードするヒトコドン最適化ヌクレオチド配列が、核局在化シグナルを不足させるように修飾されている、請求項7または8に記載のキメラHPV VLP。
- キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドが、配列番号:22、配列番号:23および配列番号:24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項7から9のいずれかに記載のキメラHPV VLP。
- キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドが、配列番号:26、配列番号:27および配列番号:28からなる群から選択されるヒトコドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされる、請求項10に記載のキメラHPV VLP。
- キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドが、植物において発現され、植物から回収される、請求項7から11のいずれかに記載のキメラHPV VLP。
- キメラHPV 16 L1/HPV 16 L2ポリペプチドが、植物の葉緑体に標的化される、請求項12に記載のキメラHPV VLP。
- 対象におけるHPV感染または子宮頸癌を予防または処置する方法における使用のための請求項7から13のいずれかに記載のキメラHPV VLPであって、該方法は、治療有効量の該キメラHPV VLPを該対象に投与することを含む、キメラHPV VLP。
- 方法が、対象における免疫応答を引き起こす工程をさらに含む、請求項14に記載のキメラHPV VLP。
- 免疫応答が、中和抗体応答または細胞毒性Tリンパ球応答である、請求項15に記載のキメラHPV VLP。
- 免疫応答が、対象に存在する複数のHPVタイプに対する交差防御免疫応答である、請求項15に記載のキメラHPV VLP。
- 対象がヒトである、請求項14から17のいずれかに記載のキメラHPV VLP。
- 対象におけるHPV感染または子宮頸癌を予防または処置する方法における使用のための医薬の製造における請求項7から13のいずれかに記載のキメラHPV VLPの使用であって、該方法は、治療有効量の該医薬を該対象に投与することを含む、使用。
- 方法が、対象における免疫応答を引き起こす工程をさらに含む、請求項19に記載の使用。
- 免疫応答が、中和抗体応答または細胞毒性Tリンパ球応答である、請求項20に記載の使用。
- 免疫応答が、対象に存在する複数のHPVタイプに対する交差防御免疫応答である、請求項20に記載の使用。
- 対象がヒトである、請求項19から22のいずれかに記載の使用。
- 請求項7から13のいずれかに記載のキメラHPV VLPおよび薬学的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物。
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