JP6185932B2

JP6185932B2 - 免疫原性のｈｐｖのｌ２を含むｖｌｐ並びに関連する組成物及び方法

Info

Publication number: JP6185932B2
Application number: JP2014552287A
Authority: JP
Inventors: ブライスチャカリアン，; デイヴィッドピーボディ，; エベネーザータブマン，
Original assignee: STC UNM
Current assignee: UNM Rainforest Innovations
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2017-08-23
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: EP2802349B1; BR112014017242A2; JP2015504897A; CA2861021A1; EP2802349A1; AU2013207962B2; HK1203837A1; CN104159606A; WO2013106525A1; EP2802349A4; AU2013207962A1; BR112014017242A8

Description

関連出願及び政府の権利
本願は、２０１２年１月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／５８５，８３９号「免疫原性のＨＰＶのＬ２を含むＶＬＰ並びに関連する組成物、構築物、及び治療法」（Immunogenic HPV L2-Containing VLPs and Related Compositions, Constructs and Therapeutic Methods）の優先権の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。

本願は、ＮＩＡＩＤの補助金第Ｕ１９ＡＩ０８４０８１号によって支援された。政府は本発明に一定の権利を有する。

一態様においては、本発明は、免疫原性のＨＰＶのＬ２を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。関連する組成物（例えばワクチン）及び治療法も提供される。

一部の態様においては、ＶＬＰはバクテリオファージＰＰ７又はＭＳ２のコートポリペプチドからなり、そのコート蛋白質はＨＰＶのＬ２に由来するペプチド抗原の挿入によって改変され、そのＨＰＶのＬ２ペプチドはＶＬＰ上に提示される。具体的には、本発明のＶＬＰは、Ｌ２ペプチドをバクテリオファージのコート蛋白質のＮ末端において提示する。驚くべきことに、それらのＬ２を提示するＶＬＰは、同じペプチドがＡＢループにおいて提示された場合よりも幅広い中和抗体応答を誘導する。

本発明の免疫原性のＶＬＰ及び関連する組成物は、ＨＰＶのＬ２に対する高力価の抗体応答を誘導し、インビボでのＨＰＶ擬似ウイルスの攻撃を防御する。

近年の組み換えＤＮＡ技術の進歩によって、動物及びヒトの両方において有効な防御免疫を可能にするための十分な量のタンパク質が得られるように、免疫原性タンパク質が特定され、クローニングされ、適切な宿主中で発現されたワクチンの導入がもたらされた。ほとんどの有効なワクチンの多くは、ビリオン表面が中和抗体を誘導する強力な能力に基づく。これらとしては、防御抗体の応答を効果的に誘導する、ポリオ、インフルエンザ及び狂犬病などの認可された不活化ウイルスワクチン又は弱毒化ウイルスワクチンが挙げられる。さらに最近では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の構造タンパク質の自己組織化に基づくサブユニットワクチンが、食品医薬品局によって承認された。これらのウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づくワクチンは、強い抗体応答を誘導し、ＨＰＶ及びＨＢＶの感染を防御するのに非常に有効である。

ＶＬＰは単独のワクチンとして用いられ得るのみならず、異種抗原の多価での免疫原性の提示のためのプラットフォームとしても用いられ得る。一本鎖ＲＮＡバクテリオファージのファミリーは、それらの異種エピトープを提示するための多用途なプラットフォームである。ＭＳ２及びＰＰ７のコート蛋白質の一本鎖二量体は、ペプチド挿入物に対して非常に寛容性であり、ペプチド挿入物をＶＬＰ表面に高密度反復配列として提示する、正しく集合したＶＬＰを作る。それらのＶＬＰは高度に免疫原性であって、それらの表面上に提示された異種ペプチドに、この高度な免疫原性を与える。

現行のＨＰＶワクチンは、ウイルスのメジャーカプシド蛋白質Ｌ１からなるＶＬＰに基づいている。Ｌ１−ＶＬＰワクチンは非常に有効であるものの、型特異的である。これは、現行のＨＰＶワクチンが、発癌性の１５〜１８種類のＨＰＶの型を含むヒトに感染するＨＰＶの１００種類を超える型のごく一部に対して防御を提供するのみであるということを意味している。対照的に、ＨＰＶのマイナーカプシド蛋白質Ｌ２は、幅広い交差中和エピトープを含んでいる。Ｌ２内のこれらの高度に保存されたエピトープに対して特異的な抗体は、様々なＨＰＶの型による感染を中和することができる。従って、Ｌ２を標的とするワクチンは、種々のＨＰＶの型による感染に対してより包括的な防御を提供し得る。しかしながら、Ｌ１と異なって、Ｌ２蛋白質はそれ自体で集合してＶＬＰとなることが無く、従ってあまり免疫原性ではない。このことは、それに対する高力価の抗体を誘導することが困難であることを意味している。

本発明者は以前に、２種類のＲＮＡバクテリオファージ、即ちＭＳ２及びＰＰ７のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の、ペプチド提示のための使用を記載している（（１０）参照）。上述のように、ＭＳ２及びＰＰ７のコート蛋白質の一本鎖二量体は、ペプチド挿入物に対して非常に寛容性であり、ペプチド挿入物をＶＬＰ表面に高密度反復配列として提示する、正しく集合したＶＬＰを作る。それらのＶＬＰは高度に免疫原性であって、それらの表面上に提示された異種ペプチドに、この高度な免疫原性を与える。ペプチドは、バクテリオファージカプシド蛋白質の２種類の部位、即ち所謂ＡＢループ及びＮ末端の何れにも提示され得る。

本発明者は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のマイナーカプシド蛋白質Ｌ２に由来するペプチド抗原をＡＢループにおいて提示するＶＬＰも、以前に記載している。そのような組み換えＶＬＰは、種々のＨＰＶ株による感染を防ぐ予防ワクチンとして役立つ可能性があり、動物モデルにおいてＨＰＶ擬似ウイルス粒子による感染を防ぐのに効果的である。例えば、２０１１年２月８日に出願され（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２４０３０）、２０１１年８月１８日に公開された特許文献１「免疫原性のＨＰＶのＬ２を含むＶＬＰ並びに関連する組成物、構築物、及び治療法（Immunogenic HPV L2-Containing VLPs and Related Compositions, Constructs and Therapeutic Methods）」を参照されたい。その全体は、参照により本明細書に援用される。

本明細書では、Ｌ２ペプチドをバクテリオファージコート蛋白質のＮ末端において提示するＶＬＰの構築を記載する。驚くべきことに、それらのＬ２を提示するＶＬＰは、同じペプチドがＡＢループにおいて提示された場合よりも幅広い中和抗体応答を誘導する。従って、Ｌ２ペプチドを提示する単一の組み換えＶＬＰが、ＨＰＶ感染に対して幅広い防御を提供できる。

国際公開第ＷＯ２０１１／１００２３４号明細書

本発明は、免疫療法用及び予防用のバクテリオファージウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。それらは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染及び関連する疾患、例えばＨＰＶに関係する子宮頸癌及び持続感染の予防に有用である。関連する組成物（例えばワクチン）、核酸構築物、及び治療法も提供される。本発明のＶＬＰ及び関連する組成物は、ＨＰＶのＬ２に対する高力価の抗体応答を誘導し、ＨＰＶ擬似ウイルスのインビボでの攻撃を防御する。本発明のＶＬＰ、ＶＬＰを含む組成物、及び治療法は、ＨＰＶ感染に対する免疫原性反応を誘導し、ＨＰＶ感染に対する免疫を付与し、ＨＰＶ感染を防御し、ＨＰＶ感染による感染症の可能性を低減する。

Ｌ２内の高度に保存されたエピトープに対して特異的な抗体は、様々なＨＰＶの型による感染を中和できるので、本発明のＨＰＶのＬ２を標的とするＶＬＰ及び関連する組成物（例えばワクチン）は、種々のＨＰＶの型による感染に対してより包括的な防御を提供する。

一態様においては、本発明は、バクテリオファージの一本鎖のコートポリペプチド二量体とＨＰＶのＬ２ペプチドとを含むＶＬＰを提供し、ＨＰＶのＬ２ペプチドはＶＬＰ上に提示され、このＶＬＰを用いるワクチン接種は、ＨＰＶによって誘発される疾患を予防する。

別の態様においては、本発明は、バクテリオファージの一本鎖のコートポリペプチド二量体とＨＰＶのＬ２ペプチドとを含むＶＬＰを含む組成物を提供し、ＨＰＶのＬ２ペプチドはＶＬＰ上に提示され、この組成物はＨＰＶによって誘発される疾患を予防する。

さらに具体的には、本発明は、ＶＬＰ、又はＶＬＰを含む組成物を提供し、このＶＬＰは、次の（１）、（２）のいずれか一方を含む核酸構築物で原核生物を形質転換することによって作られる。
（１）（ａ）バクテリオファージＰＰ７の一本鎖のコートポリペプチド二量体のコード配列が作動可能に会合している細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、コートポリペプチド二量体のコード配列は、（ｉ）コートポリペプチド二量体のコード配列の下流部分に存在し、コートポリペプチド二量体のＮ末端を規定する配列の５’に位置する又はその配列中に配置される第１の制限部位を規定するため、かつ（ｉｉ）ＨＰＶのＬ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むため、に改変されるプロモーターと、（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列の３’に位置する第２の制限部位と、（ｃ）プロモーターに作動可能に会合する抗生物質耐性遺伝子と、（ｄ）原核細胞内での複製のための複製起点。
（２）（ａ）バクテリオファージＭＳ２の一本鎖のコートポリペプチド二量体のコード配列が作動可能に会合している細菌又はバクテリオファージのプロモーターであって、コートポリペプチド二量体のコード配列は、（ｉ）コートポリペプチド二量体のＮ末端を規定する配列の部分の５’に位置するコドン配列を規定するため、かつ（ｉｉ）ＨＰＶのＬ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むため、に改変されるプロモーターと、（ｂ）コートポリペプチド二量体のコード配列の３’に位置する制限部位と、（ｃ）第２の制限部位の３’に位置するＰＣＲプライマーと、（ｄ）作動可能にプロモーターが会合している、第１の抗生物質に対する耐性のリプレッサーと、（ｅ）第２の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含むように改変されたヘルパーファージ遺伝子と、（ｆ）原核細胞内での複製のための複製起点。

一部の態様においては、本発明は、本明細書に記載のＨＰＶのＬ２ペプチド配列を含む構築物で原核生物を形質転換することによって作られるＶＬＰを提供する。別の態様においては、本発明のＶＬＰ及びＶＬＰを含む組成物（例えばワクチン）は、複数の異なるＨＰＶの型に由来するＨＰＶのＬ２ペプチドを含むＶＬＰからなる。別の態様においては、本発明のＶＬＰ及びＶＬＰを含む組成物は、複数種類のＨＰＶのＬ２配列を提示する混成のＶＬＰを含む。

一部の態様においては、本発明は、ＨＰＶに関連する疾患を発症する恐れがある対象に予防接種する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＨＰＶのＬ２を含むＶＬＰを含む組成物の１回用量以上を、その対象に投与することを含む。

本発明のこれら及び他の態様は、発明を実施するための形態において更に説明される。

記載された配列をＭＳ２コート中にクローニングするためのフォワードプライマー（５’から３’に向かって示される）、及びそれらのプライマーによってコードされるアミノ酸配列の一覧である。ＮｃｏＩの制限部位は下線を付された斜体で示されており、ペプチド挿入物は太字で示されており、リンカー配列は斜体で示されている。ＭＳ２コート蛋白質の配列は下線を付されている。野生型及び組み換えのＭＳ２ＶＬＰの透過電子顕微鏡写真である。野生型ＭＳ２ＶＬＰ（対照）、又はＬ２ペプチド（２０−２９）、（１７−３１）若しくは（１４−４０）を提示するＭＳ２ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスの各群でのＩｇＧ抗体応答を示す。力価は、ストレプトアビジンに連結された、ＨＰＶ１６のＬ２由来のアミノ酸１４−４０のペプチドに対して計算された。結果は、初回のワクチン接種の１週間後（赤色）又は追加接種の１週間後（黒色）に得られた血清からのものである。各データポイントは、個々のマウスの抗体力価を表す。棒線は各群の幾何平均力価を表す。示されているように、マウスは、筋肉内での外因性アジュバント無しの５μｇのＶＬＰにより免疫性を与えられた。示されているのは、１回又は２回の免疫付与後の、ＨＰＶ１６のＬ２（１４−４０）ペプチドに対するエンドポイント希釈法によるＥＬＩＳＡ力価である。ＭＳ２コート蛋白質のＮ末端又はＰＰ７のＡＢループにおいて提示された１６Ｌ２（１７−３１）による免疫付与によって誘導された、血清の交差反応性を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、ストレプトアビジンに連結された、ＨＰＶ１、５、６、１６、及び１８のＬ２ペプチドでコーティングしてから、マウス血清の１：２５６０希釈物と反応させた。示されているのは、各群における３匹の個々のマウス由来の血清での光学密度（ＯＤ₄₀₅）値の平均である。エラーバーはＳＥＭを表す。示されるように、ＨＰＶ１６のＬ２配列をＮ末端において提示するＶＬＰは、より幅広い交差反応性の抗体応答を誘導する。ＭＳ２コート蛋白質のＮ末端において提示された１６Ｌ２（１７−３１）で免疫性を与えられたマウスは、１６Ｌ２（１７−３１）−ＡＢループ−ＰＰ７ＶＬＰで免疫性を与えられたものと比較して、様々なＨＰＶのＰｓＶ型による感染に対してより幅広い防御を見せることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスが、５μｇの１６Ｌ２（１７−３１）−Ｎ末端−ＭＳ２ＶＬＰ、又は１６Ｌ２（１７−３１）−ＡＢループ−ＰＰ７ＶＬＰ、又はＨＰＶ１６のＬ１Ｌ２−ＶＬＰ、又はＭＳ２／ＰＰ７ＶＬＰの混合物を用いて、２週間の間隔で２回免疫を与えられた（筋肉内）。最終の免疫付与の３〜５週間後に、マウスは、Ａ）ＰｓＶ１６、並びにＢ）ＰｓＶ５、６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５３、及びＰｓＶ５８で攻撃された。ＰｓＶ５を除いて全ての攻撃は膣内に行われ、ＰｓＶ５は経皮で行われた。攻撃の４８時間後に、０．４ｍｇのルシフェリンが、ＰｓＶによる攻撃に用いられた同じ経路で投与され、平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ²／ｓｒ）の値が各マウスについてＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ３．２ソフトウェアを用いて測定された。黒線の白丸は、ＭＳ２／ＰＰ７ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスを表し、黒丸はＨＰＶ１６のＬ１Ｌ２−ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスを表し、青丸は１６Ｌ２（１７−３１）−ＡＢループ−ＰＰ７ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスを表し、赤丸は１６Ｌ２（１７−３１）−Ｎ末端−ＭＳ２ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスを表す。黒色の実線は、平均放射輝度の幾何平均を表す。ｐＤＳＰ６２プラスミドを示す。プラスミドｐＤＳＰ１を示す。異型のＨＰＶのＰｓＶによる攻撃に対する防御に、劇的な差が存在したことを示す。Ｌ２−ＰＰ７ＶＬＰによる免疫付与は、異型のＰｓＶに対して僅かな防御をもたらしたか、又は防御をもたらさなかった。対照的に、本発明のＮ末端において提示されたＬ２−ＭＳ２ＶＬＰによる免疫付与は、９種類の異型による膣内への攻撃及びＨＰＶ５のＰｓＶによる経皮での攻撃に対してかなりの防御をもたらした。本発明者は、試験された１０種類の異なるＰｓＶ型のうちの９種類による感染に対して非常に強い（約８０〜７，１９０倍のシグナル低下）防御を観察した。これは予期せぬ結果であった。この防御は、ＡＢループにおいて提示されたＬ２で免疫性を与えられたマウスで観察されたものよりも、実質的に強力であった。同型による攻撃に対して本発明のＶＬＰを用いる防御は、抗原性のＬ２ペプチドがＡＢループにおいて提示された場合のＶＬＰよりも、ほとんどの場合で少なくとも約５〜１０倍優れていた。異型の攻撃に対する防御は、Ｎ末端のＶＬＰ構築物を用いると、１０〜２５倍（ＨＰＶ５、３１、及び３９）、４０〜１００倍（ＨＰＶ４５、５１、５３、及び５８）、又は１４０〜１０００倍（ＨＰＶ６、３３、及び３５）良好であった。

本発明においては、当分野の技能の範囲内における従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡの技術が用いられ得る。このような技術は、文献中で詳細に説明される。例えば、Sambrookら、２００１年、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」; Ausubel編集、１９９４年、「Current Protocols in Molecular Biology」第I〜III巻; Celis編集、１９９４年、「Cell Biology: A Laboratory Handbook」第I〜III巻; Coligan編集、１９９４年、「Current Protocols in Immunology」第I〜III巻; Gait編集、１９８４年、「Oligonucleotide Synthesis」; Hames & Higgins編集、１９８５年、「Nucleic Acid Hybridization」; Hames & Higgins編集、１９８４年、「Transcription And Translation」; Freshney編集、１９８６年、「Animal Cell Culture」; IRL Press、１９８６年、「Immobilized Cellｓ And Enzymes」; Perbal、１９８４年、「A Practical Guide To Molecular Cloning」を参照のこと。

ある範囲の値が示される場合、その範囲の上限と下限との間の、その状況が他を明確に示すのでない場合における下限の単位の十分の一までのそれぞれのその間の値、及びいずれかの他の言及された範囲における言及された値又はその間の値は、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してそのより小さい範囲内に含まれることができ、そしてその言及された範囲でいずれかの特に除外される限界が付されたより小さい範囲もまた、本発明の範囲内に包含される。その言及される範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。

別段規定しない限り、本明細書において用いられるすべての技術及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は等価の任意の方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験において用いられ得るが、好ましい方法及び材料がここに記載される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形（a、an及びthe）は、その状況が明らかに他を示すのでない限り、複数形の言及を包含する。

さらに、次の用語は、下記の定義を有するものとする。

本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語は、多量体形の任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかを指し、そして二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡの両方を包含する。ポリヌクレオチドは、例えばコード領域及び調節性配列（例えば、プロモーター又は転写ターミネーター）などの非コード領域のような、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から直接得られてもよいし、又は組み換え技術、酵素技術若しくは化学技術の補助によって調製されてもよい。ポリヌクレオチドは、直線状であっても又は位相幾何学における環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター若しくはクローニングベクターなどのベクターの一部、又はフラグメントであってもよい。

本明細書において、「ポリペプチド」という用語は広義には、ペプチド結合によって一緒に連結される２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語はまた、ジスルフィド結合によって結合された２つ以上のポリペプチドを含む分子、又は多量体（例えば、二量体、四量体）として共有結合若しくは非共有結合的に結合されるポリペプチドの複合体を包含する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質という用語は、すべてがポリペプチドの定義内に包含され、そしてこれらの用語は交換可能に用いられる。これらの用語は、アミノ酸のポリマーの特定の長さを暗示するものでも、ポリペプチドが組み換え技術、化学的若しくは酵素的な合成を用いて生成されるか、又は天然に存在するかを暗示したり識別したりすることを意図するものでもないことが理解されるべきである。

本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、「Ｄ」異性体型の残基は、そのポリペプチドによって所望の機能が保持される限り、いずれのＬアミノ酸残基とも代えることができる。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシル基を指す。

「コード配列」の用語は、本明細書では、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列の部分として規定される。コード配列の範囲は、ｍＲＮＡの５’末端でオープンリーディングフレームの直ぐ上流に位置するリボソーム結合部位（原核生物）又はＡＴＧ開始コドン（真核生物）と、ｍＲＮＡの３’末端でオープンリーディングフレームの直ぐ下流に位置する転写終結配列とによって通常は定まる。限定するものではないが、コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組み換え核酸配列などを挙げることができる。

組み換え細胞の「異種」領域とは、より大きい分子と関連して見られることが全く無い、より大きい核酸分子内で特定可能な核酸のセグメントである。

「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。

「プロモーター配列」とは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にするために、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で境界とされ、上流（５’方向）に及んで、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター配列中には、転写開始領域及びＲＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合領域（共通配列）が見られる。真核生物のプロモーターは、常にではないが、多くの場合に「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、−１０及び−３５の共通配列に加えてシャイン・ダルガノ配列を含む。

「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御並びに調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡ（これは、次にコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される）に転写する場合、細胞中で転写及び翻訳制御配列の「制御下」にある。転写及び翻訳制御配列とは、宿主細胞中でコード配列の発現をもたらす、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節性配列である。

細胞は、外因性又は異種のＤＮＡが細胞の内側に取り込まれた場合に、このようなＤＮＡによって「形質転換される」。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され）ることも、又は組み込まれないこともある。例えば原核生物、酵母及び哺乳動物細胞では、形質転換するＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームエレメント上で維持され得る。

本明細書に開示される配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが本明細書に開示される核酸に対して縮重している、本発明のポリペプチド（単数又は複数）をコードする核酸配列もまた本発明の範囲内であることが理解されるべきである。「縮重」とは、異なる３文字コドンを用いて特定のアミノ酸を明示することを意味する。

本明細書において、「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに特有の空間的高次構造中に３個のアミノ酸を含み得る。一般的には、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなり、さらに一般的には、少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的高次構造を決定する方法は、当該分野で公知であり、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。

本明細書において、「コートタンパク質（単数又は複数）」という用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのカプシド集合内に組み込まれることができる、このバクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質（単数又は複数）を指す。

本明細書において、「コートポリペプチド」とは、コートタンパク質の機能を保有し、さらに全長のコートタンパク質及び／又はその一本鎖改変体を包含する、コートタンパク質のポリペプチドフラグメントとして本明細書において規定される。

本明細書において、「免疫応答」という用語は、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化若しくは増殖をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。しかし、ある場合には、免疫応答は、低い強度であって、本発明による少なくとも１つの物質を用いる場合にのみ検出可能になることがある。「免疫原性」とは、生きている生物体の免疫系を刺激するために用いられる作用物であり、それによりその免疫系の１つ以上の機能が増大されて、免疫原に向けられる。「免疫原性ポリペプチド」とは、上述したように細胞性及び／又は体液性の免疫応答を引き出すポリペプチドであり、アジュバントの有無にかかわらず、単独か又は担体に対して連結されている。好ましくは、抗原提示細胞は活性化され得る。

本明細書において、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含みかつ動物に投与されることができる形態である処方物を指す。

本明細書において、「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、バクテリオファージの構造を模倣し、非複製的及び非感染性であり、バクテリオファージの複製機構をコードする１又は複数の遺伝子を少なくとも欠き、通常はまた、宿主に対するウイルスの結合又は進入を担う１又は複数のタンパク質をコードする１又は複数の遺伝子を欠いているウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。

しかしながら、この定義はまた、前述の遺伝子が依然として存在しているが不活性であり、従ってやはりバクテリオファージの非複製的及び非感染性のウイルス様粒子をもたらす、バクテリオファージのウイルス様粒子も包含する。

ＲＮＡバクテリオファージコート蛋白質のＶＬＰ
ＲＮＡバクテリオファージのコート蛋白質の１つ以上のサブユニットの自己組織化によって形成され、かつ任意で宿主ＲＮＡを含むカプシド構造は、「ＲＮＡバクテリオファージコート蛋白質のＶＬＰ」と呼ばれる。一部の実施形態においては、カプシド構造は、９０個のコート蛋白質の一本鎖二量体又は１８０個のコート蛋白質の一量体の自己組織化によって作られる。

核酸分子は、発現制御配列が核酸配列の転写及び翻訳を制御及び調節する場合、その発現制御配列に対して「作動可能に連結される」か、又は「作動可能に会合される」。「作動可能に連結される」という用語は、発現されるべき核酸配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ)を有すること、並びに発現制御配列の制御下で核酸配列の発現及びこの核酸配列によってコードされる所望の生成物の産生を可能にするために正確なリーディングフレームを維持することを包含する。組み換えＤＮＡ分子に挿入することが望ましい遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルを遺伝子の前に挿入してもよい。

ＨＰＶによって誘発される疾患、免疫原性、及び予防効果
「ＨＰＶによって誘発される疾患」又は「ＨＰＶに関連する疾患」は、この項で特定される疾患を含むが、それらに限定されない。免疫原性及び予防効果（例えば、所与の組成物がＨＰＶによって誘発される疾患を予防するかどうか）は、この項に記載の技術及び基準、又は当業者に周知の他の方法によって評価され得る。

１００種類を超えるＨＰＶの型が同定されており、番号によって呼称される。１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、及び５９型は、「高リスクな」性的に伝染するＨＰＶの一群であり、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、膣癌、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、及び／又は肛門上皮内腫瘍（ΑＩΝ）の発症を引き起こすことがある。ＨＰＶのいくつかの型、特に１６型は、中咽頭扁平上皮癌という頭頸部癌の一種に関係していることが見いだされている。ＨＰＶ（例えばＨＰＶ６及び１１）は陰部疣贅を引き起こし、ＨＰＶ６及び１１は再発性呼吸器乳頭腫症を引き起こし得る。ＨＰＶは、免疫障害を持つ個体において疣贅状表皮発育異常症を引き起こすことがある。

従って、高リスクなヒトの頸部上皮のＨＰＶ感染は、子宮頸癌の発生と必然的につながっている。Durstら、米国科学アカデミー紀要（PNAS）第８０巻、３８１２〜３８１５、１９８３年; Gissmannら、Journal of Investigative Dermatology、第８３巻、２６５〜２８５、１９８４年を参照されたい（ＨＰＶ１６は、尿生殖器管の前癌性及び癌性の疾患、特に子宮頸部の癌腫に関連している）。パピローマウイルスの予防ワクチンは、基底細胞を感染から守る中和抗体の誘導のために全身性免疫系を標的とする。

免疫原性（例えば、所与の組成物がＨＰＶのＬ２に対して高力価の抗体応答を誘導したかどうか）を評価するためには、ＨＰＶ１６のＬ２の抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）が、ＥＬＩＳＡによって、例えば数週間の処理（例えば３又は４週間）後及び数回分の投与量の投与（例えば３回又は４回）後に測定され得る。数週間の処理（例えば３又は４週間）後及び数回分の投与量の投与（例えば３回又は４回）後にＨＰＶ１６についてセロコンバージョンした対象の割合も、免疫原性を評価するために測定されることができる。

予防効果を明らかにするために、攻撃後の種々のエンドポイントにおいて、依然としてＨＰＶ１６について血清反応陰性かつＨＰＶ感染についてＰＣＲ陰性（スワブ及び生検）である対象について、免疫原性の分析が行われることができる。

ＨＰＶのＬ２
「ＨＰＶのＬ２」は、本明細書において用いられる場合には、全てのヒトパピローマウイルスのＬ２カプシド蛋白質を含む。

ウイルス様粒子の生成
本発明は、ウイルス様ファージ粒子、並びにこれらの粒子をインビボ及びインビトロで生成するための方法に関する。本明細書において、ビリオンを「インビトロで」生成するとは、細胞の外側で、例えば無細胞系で、ビリオンを生成する工程を指し、一方でビリオンを「インビボで」生成するとは、細胞、例えば大腸菌又は緑膿菌細胞の内側でビリオンを生成する工程を指す。

バクテリオファージ
本明細書に記載されるＶＬＰは、一本鎖ＲＮＡバクテリオファージの複数のコート蛋白質の集合からなる（The BacteriophagesでのRNA Bacteriophages、Calendar, RL編集、Oxford University Press、２００５年）。この群の公知のウイルスは、大腸菌、緑膿菌及びアシネトバクターなどの多様な細菌を攻撃する。それぞれ、極めて類似のゲノム構成、複製ストラテジー及びビリオン構造を保有している。特に、バクテリオファージは、一本鎖の（＋）−センスＲＮＡゲノムを含み、マチュラーゼ、コート及びレプリカーゼの遺伝子を含み、かつ小型（３００オングストローム未満）の正２０面体のカプシドを有する。これらとしては、限定するものではないが、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑｂ、Ｒ１７、ＳＰ、ＰＰ７、ＧＡ、Ｍ１１、ＭＸ１、ｆ４、Ｃｂ５、Ｃｂ１２ｒ、Ｃｂ２３ｒ、７ｓ及びｆ２のＲＮＡバクテリオファージが挙げられる。

バクテリオファージのこのファミリーでの正２０面体カプシドのシェルの集合に必要な情報は、コートタンパク質自体の中に完全に含まれる。例えば、精製されたコートタンパク質は、ＲＮＡの存在によって刺激されるプロセスにおいてインビトロでカプシドを形成し得る（Beckettら、１９８８年、J. Mol Bio 第２０４巻、９３９〜４７）。さらに、細胞中でプラスミドから発現されるコートタンパク質は、インビボでウイルス様粒子に集合する（Peabody, D.S.、１９９０年、J Biol Chem ２６５、５６８４〜５６８９）。

ＰＰ７コートポリペプチドの例としては、限定するものではないが、ＲＮＡヘアピンを有する複合体でのＰＰ７コートタンパク質二量体の種々の鎖が挙げられる（例えば、ジーンバンク・アクセッション番号２ＱＵＸＲ；２ＱＵＸＯ；２ＱＵＸ＿Ｌ；２ＱＵＸ＿Ｉ；２ＱＵＸ＿Ｆ；及び２ＱＵＸ＿Ｃ）。また、本明細書の実施例１、及びPeabodyら、RNA recognition site of PP７ coat protein、Nucleic Acids Research、２００２年、第３０巻、第１９号、４１３８〜４１４４も参照のこと。

ＲＮＡバクテリオファージコートポリペプチド
本発明において有用なコートポリペプチドとしてはまた、上記で開示されたコートポリペプチドの１つ以上と類似性を有するポリペプチドが挙げられる。この類似性は、構造的類似性と見なされる。構造的類似性は、２つのアミノ酸配列（すなわち、候補アミノ酸配列及びアミノ酸配列）の残基を整列させて、それらの配列の長さに沿った同一のアミノ酸の数を最大限に利用することによって決定され得る；いずれか又は両方の配列におけるギャップは、同一のアミノ酸の数を最大限に利用するために整列させることにおいて許されるが、それぞれの配列におけるアミノ酸は、それにかかわらずその適切な順序のままでなければならない。候補アミノ酸配列は、一本鎖ＲＮＡウイルスから単離されることも、組み換え技術を用いて産生されることも、又は化学的若しくは酵素的に合成されることもできる。好ましくは、２つのアミノ酸配列は、Tatusovaら（FEMS Microbial Lett １９９９年、１７４：２４７〜２５０）に記載され、そしてhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.で入手可能である、ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２、ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）でのＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズム、又はＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを用いて比較される。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ２サーチパラメーターのデフォールト値を用い、これはマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティー＝１１、エクステンションギャップペナルティー＝１、ギャップｘドロップオフ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝３、及び任意でフィルターオンを含む。ＢＬＡＳＴサーチアルゴリズムを用いる２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、「同一性」と呼ばれる。また好ましくは、コートポリペプチドとしては、上記で開示されるアミノ酸配列の１つ以上に対して、少なくとも８０％のアミノ酸同一性、少なくとも８５％のアミノ酸同一性、少なくとも９０％のアミノ酸同一性、又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、コートポリペプチドは活性である。コートポリペプチドが活性であるか否かは、カプシドを形成して一本鎖ＲＮＡ分子をパッケージングするポリペプチドの能力を評価することによって決定されることができる。このような評価は、インビボ又はインビトロの系を用いて行われることができ、このような方法は当該分野及び通常作業において公知である。あるいは、ポリペプチドは、挙げられたコートポリペプチドと類似の３次元構造を有する場合及び／又は類似の機能的活性を有する場合に、構造的に類似であるとみなされることができる。

ＨＰＶのＬ２ペプチド
本明細書に記載されるように、ＨＰＶのＬ２ペプチド配列は、コートポリペプチドのＮ末端に存在することができる。好ましくは、ＨＰＶのＬ２ペプチド配列は、カプシドの外表面に下記の例に従って発現されることができる。

ＨＰＶのＬ２ペプチド配列は、限定でないが、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のマイナーカプシドタンパク質Ｌ２由来のアミノ酸配列を含む。

構造的に類似のコートポリペプチドにおいて対応する位置を決定するために、この構造的に類似のコートポリペプチドのアミノ酸配列を、上記で特定されたような名前を挙げられたコートポリペプチドの配列と整列させる。

特定の実施形態では、コートポリペプチドは、上流及び下流のサブユニットを含む一本鎖二量体である。それぞれのサブユニットは、機能的なコートポリペプチド配列を含む。ＨＰＶのＬ２ペプチド配列は、本明細書において上述された部位で上流及び／又は下流のサブユニットに挿入されることができ、例えば、下流サブユニットのＮ末端に挿入されることができる。特定の実施形態では、このコートポリペプチドは、ＭＳ２コートポリペプチドの一本鎖二量体である。

転写単位の調製
本発明の転写単位は、発現調節性領域（例えばプロモーター）、コートポリペプチドをコードする配列、及び転写ターミネーターを含む。ＲＮＡポリヌクレオチドは、任意でコート認識部位（「パッケージングシグナル」、「翻訳オペレーター配列」、「コート認識部位」とも呼ばれる）を含んでもよい。あるいは、転写単位は、翻訳オペレーター配列を含まなくてもよい。プロモーター、コード領域、転写ターミネーター、及び存在する場合はコート認識部位は、一般的に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」又は「〜と作動可能に会合される」とは、そのように記載された構成要素が、それらの意図する方法で機能することを可能にする関係にある並列状態を指す。調節性配列は、コード領域の発現が、調節性配列と両立する条件下で達成されるような方法で連結される場合に、そのコード領域と「作動可能に連結される」か、又は「作動可能に会合される」。コート認識部位は、存在する場合、それが意図する方法で機能するならば、ＲＮＡポリヌクレオチド内の任意の位置でよい。

本発明は、いずれかの特定のプロモーターの使用に限定されず、広範な種々のプロモーターが公知である。本発明で用いられるプロモーターは、構成的プロモーターであっても、誘導プロモーターであってもよい。好ましいプロモーターは、コートポリペプチドをコードするコード領域によってコードされた高レベルのＲＮＡを駆動することができる。このようなプロモーターの例は、当該分野で公知であり、例えばｌａｃプロモーターＴ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。

本明細書に記載されるコートポリペプチドをコードするコード領域のヌクレオチド配列は、容易に決定される。これらの分類のヌクレオチド配列は、大型だが有限であり、この分類のそれぞれのメンバーのヌクレオチド配列は、標準的な遺伝子コードを参照して当業者によって容易に決定され得る。さらに、ＲＮＡバクテリオファージ一本鎖コートポリペプチドのコード配列は、ＨＰＶのＬ２ペプチドをコードする配列の挿入のための部位を含む。特定の実施形態では、ＨＰＶのＬ２ペプチドをコードする配列の挿入のための部位は、制限酵素部位である。別の実施形態では、ＨＰＶのＬ２ペプチドをコードする配列は、標準的な技術を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて挿入される。

特定の実施形態では、コード領域は、コートポリペプチドの一本鎖二量体をコードする。最も特殊な実施形態では、コード領域は、改変された一本鎖コートポリペプチド二量体をコードし、ここでこの改変は、挿入部位に少なくとも４個のアミノ酸のコード配列の挿入を含む。転写単位は、ｌａｃプロモーターのような細菌のプロモーターを含んでもよく、又はＴ７プロモーターのようなバクテリオファージプロモーターを含んでもよい。

合成
本発明のＶＬＰは、特に転写単位が細菌のプロモーターを含むならば、転写単位を細菌に取り込むことによってインビボで生成され得る。あるいは、それは、カップリングされた無細胞の転写／翻訳システムにおいてインビトロで合成されることができる。

異種の物質をカプシドで包むＶＬＰの集合
上記のように、本発明のＶＬＰは、ＨＰＶのＬ２ペプチドをコードする配列をカプシドで包む。それらのＶＬＰは、別の物質、例えばアジュバントと組み合わせても集合し得る。具体的には、精製されたコート蛋白質サブユニットは、変性剤（通常は酢酸）で解離されたＶＬＰから得られる。アジュバントはコート蛋白質と混合された後に、その存在下において再集合する。特定の実施形態では、その物質は、ＶＬＰの内部に対してある程度の親和性を有し、好ましくは負に荷電されている。

別の実施形態では、アジュバントは、ＶＬＰ表面に自然に存在する細孔を通じてＶＬＰ中に受動的に拡散される。特定の実施形態では、その物質はこれらの細孔を通過するのに十分小さく、かつＶＬＰの内部に高い親和性を有する。

本発明は、本発明の例示として示される以下の非限定的な例を参照することによってさらによく理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに詳細に例示するために示されるが、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。参考文献番号に対応する参考文献は、実施例の後に一覧にされる。

バクテリオファージＰＰ７及びＭＳ２並びに関連するプラスミド
以前に、本発明者は、ペプチド提示のためのバクテリオファージＭＳ２のウイルス様粒子の使用について記載した。本発明者は、ＭＳ２コート蛋白質の一本鎖二量体が、ペプチド挿入物に対して非常に寛容性であること、及びそれらの合成をコードするｍＲＮＡを特異的にカプシドで包む正しく集合したＶＬＰを作ること、を立証した（Peabody, D.S., Manifold-Wheeler, B., Medford, A., Jordan, S.K., do Carmo Caldeira, J., 及びChackerian, B.（２００８年）Journal of Molecular Biology、第３８０巻、２５２〜２６３）。上記のように、ＭＳ２は、例えばＰＰ７バクテリオファージなどの各メンバーが同様の分子生物学を共有する１つの大きなウイルスファミリーの、１つのメンバーに過ぎない。

実験の概要
上記のように、本発明者は、ペプチド提示のための２種類のＲＮＡバクテリオファージ、即ちＭＳ２及びＰＰ７のＶＬＰの使用を以前に記載している。ＭＳ２及びＰＰ７のコート蛋白質の一本鎖二量体は、ペプチド挿入物に対して非常に寛容性であり、ペプチド挿入物をＶＬＰ表面に高密度反復配列として提示する、正しく集合したＶＬＰを作る。それらのＶＬＰは高度に免疫原性であって、この高度な免疫原性をそれらの表面上に提示された異種ペプチドに付与する。本明細書では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のマイナーカプシド蛋白質Ｌ２に由来するペプチド抗原を提示するＶＬＰも説明する。そのような組み換えＶＬＰは、様々なＨＰＶ株による感染を防ぐための予防ワクチンとして役立つ。下記のワクチンは、Ｌ２に対する高力価の抗体応答を誘導し、マウスを種々のＨＰＶ擬似ウイルスによる感染から守った。

＜実施例１＞
上記のように、現行のＨＰＶワクチンは、ウイルスのメジャーカプシド蛋白質Ｌ１からなるＶＬＰに基づいている。Ｌ１−ＶＬＰワクチンは非常に有効であるものの、型特異的である。これは、現行のＨＰＶワクチンが、発癌性の１５〜１８種類のＨＰＶの型を含むヒトに感染するＨＰＶの１００種類を超える型のごく一部に対して防御を提供するのみであるということを意味している。対照的に、ＨＰＶのマイナーカプシド蛋白質Ｌ２は、幅広い交差中和エピトープを含んでいる。Ｌ２内のこれらの高度に保存されたエピトープに対して特異的な抗体は、様々なＨＰＶの型による感染を中和することができる（７）。従って、Ｌ２を標的とするワクチンは、種々のＨＰＶの型による感染に対するより包括的な防御を提供し得る。Ｌ１と異なって、Ｌ２蛋白質はそれ自体で集合してＶＬＰになることが無く、従ってあまり免疫原性ではない。このことは、それに対する高力価の抗体を誘導することが困難であることを意味している。

本発明者は、ＨＰＶのＬ２蛋白質を標的とするＶＬＰに基づいたワクチンを構築し、その有用性を立証した。下記のデータは、Ｌ２ペプチドを提示する組み換えＭＳ２ＶＬＰの構築を説明している。これらのワクチンは、Ｌ２に対する高力価の抗体応答を誘導し、感染症のマウスモデルにおいてＨＰＶによる攻撃を防御する。同様の技術は、Ｌ２ペプチドを提示するＰＰ７ＶＬＰを構築するのにも用いられることができる。

Ｌ２を提示するＶＬＰの設計
上記のように、本発明者は、発現プラスミドｐＤＳＰ６２及びｐＤＳＰ１の構築を以前に記載している（３）（図６及び７）。このプラスミドは、２コピーのコート蛋白質が遺伝学的に融合されて１つの「一本鎖の」二量体となった、ＭＳ２コート蛋白質の一変形の発現をコードしている。これらのプラスミドは特有のＮｃｏＩ制限部位を含み、一本鎖二量体のＮ末端への配列の遺伝学的挿入を可能にしている。Ｌ２ペプチドを提示するＶＬＰを作り出すために、本発明者は、３種類のＨＰＶ１６のＬ２に由来する配列をコート蛋白質のＮ末端にクローニングすることを可能にするＰＣＲプライマーを設計した。それらの配列は、ＨＰＶ１６のＬ２アミノ酸２０−２９、１７−３１、及び１４−４０である。それらの構築物を作るために用いられたプライマー及びそれらの挿入物のアミノ酸配列は、図１に示されている。

組み換え配列を含む改変されたｐＤＳＰ６２が、組み換えＶＬＰを大腸菌内で発現するために用いられた。本発明者の標準的な発現及び精製の手順後に、組み換えＶＬＰは透過電子顕微鏡法によって可視化された。図２に示されているように、３種類の組み換えコート蛋白質の全てが、ＶＬＰを形成した。

ＭＳ２ＶＬＰによって提示されたＬ２ペプチドは免疫原性である
ＶＬＰの免疫原性を試験するために、マウスが、筋肉注射によって１６Ｌ２−ＶＬＰ又は野生型ＭＳ２ＶＬＰで免疫性を与えられた。３匹のマウスからなる各群が、外因性アジュバント無しの１０μｇのＶＬＰにより筋肉注射で免疫性を与えられた。全てのマウスは、２週間後に同量のＶＬＰで追加免疫された。血清が各接種の１週間後に採取された。マウスの血清は、エンドポイント希釈法のＥＬＩＳＡによって、１６Ｌ２ペプチドに特異的なＩｇＧ抗体について試験された（図３）。示されているように、３種類すべての１６Ｌ２−ＶＬＰにおいて、免疫性を与えられたマウスは、対応するペプチドに対して高力価（幾何平均力価＞１０⁴）のＩｇＧ応答を起こした。一方で対照マウスでは抗体は検出されなかった。従って、ＭＳ２の一本鎖二量体のＶＬＰ表面に提示されたＬ２ペプチドは、他のＶＬＰによって提示された抗原の特徴である高い免疫原性を示す。

ＨＰＶ１６のＬ２ペプチドを提示するＰＰ７ＶＬＰは、同型及び異型の陰部へのＨＰＶ擬似ウイルスによる攻撃からマウスを守る中和抗体を誘導できる
本発明者が設計した１６Ｌ２−ＶＬＰワクチンは、ＨＰＶ１６のＬ２、即ち１つ以上の高度な交差反応中和エピトープを含むことが示されている領域（１、５）のアミノ酸１７−３１を含んでいる。これは、１６Ｌ２−ＶＬＰが、別のＨＰＶ株由来のＬ２配列と幅広く交差反応する抗体を誘導することができ、ＨＰＶによる攻撃に対する防御の可能性を示唆している。先ず、本発明者は、ＨＰＶ１６のＬ２（１７−３１）をＮ末端において提示する組み換えＭＳ２ＶＬＰで免疫されたマウスの血清が、５種類のＨＰＶ株（ＨＰＶ１、５、６、１６、及び１８）由来のＬ２アミノ酸１４−４０のペプチドと交差反応できるかどうかを評価した。図４に示されているように、この血清は幅広く交差反応性であり、５種類全てのペプチドと反応した。意外なことに、同じＨＰＶ１６のＬ２ペプチドをＡＢループにおいて提示するＰＰ７ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスの血清は、それよりもかなり狭い交差反応性であった。

ＭＳ２コート蛋白質のＮ末端へのエピトープ１７−３１の挿入で観察されたより幅広い交差反応性が、防御と相関するかどうかを明らかにするために、マウスが、ＨＰＶ１６のＬ２エピトープをＭＳ２コート蛋白質のＮ末端（１６Ｌ２（１７−３１）−Ｎ末端−ＭＳ２ＶＬＰ）若しくはＰＰ７コート蛋白質（１６Ｌ２（１７−３１）−ＡＢループ−ＰＰ７ＶＬＰ）のＡＢループのいずれかにおいて提示するＶＬＰによって、又は対照のＶＬＰによって免疫性を与えられた。２回目の免疫付与の３〜５週間後に、一群のＨＰＶの擬似ウイルス（ＰｓＶ）（ＰｓＶ５、６、１６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５３、及び５８）によって攻撃された。予想されたように、１６Ｌ２（１７−３１）−Ｎ末端−ＭＳ２ＶＬＰ又は１６Ｌ２（１７−３１）−ＡＢループ−ＰＰ７ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスは、同型のＨＰＶ１６のＰｓＶによる高用量の膣内への攻撃に対して、ほぼ完全な防御を示した（図５Ａ）。防御は、ＨＰＶ１６のＬ１Ｌ２−ＶＬＰで免疫性を与えられたマウスと同様であった。ただし、異型のＨＰＶのＰｓＶによる攻撃に対する防御には、劇的な差が存在した（図５Ｂ）。Ｌ２−ＰＰ７ＶＬＰによる免疫付与は、異型のＰｓＶに対して僅かな防御をもたらしたか、又は防御をもたらさなかった。対照的に、Ｌ２−ＭＳ２ＶＬＰによる免疫付与は、９種類の異型による膣内への攻撃及びＨＰＶ５のＰｓＶによる経皮での攻撃に対してかなりの防御をもたらした。本発明者は、試験された１０種類の異なるＰｓＶ型のうちの９種類による感染に対して非常に強力な（８０〜７，１９０倍のシグナル低下）防御を観察した。ＨＰＶ３１のＰｓＶに対する防御はやや弱かったが（１７倍）、それでも統計的に有意であった（ｐ＜０．０１、片側ｔ検定）。従って、単一のＨＰＶ１６のＬ２ペプチドを提示するＭＳ２ＶＬＰによる免疫付与が、様々なＨＰＶ擬似ウイルス型に対する防御を提供した。

本発明者の実験は、異型のＨＰＶのＰｓＶによる攻撃に対する防御に劇的な差が存在したことを示した。図８を参照されたい。Ｌ２−ＰＰ７ＶＬＰによる免疫付与は、異型のＰｓＶに対する僅かな防御をもたらしたか、又は防御をもたらさなかった。対照的に、本発明のＮ末端において提示されたＬ２−ＭＳ２ＶＬＰによる免疫付与は、９種類の異型による膣内への攻撃及びＨＰＶ５のＰｓＶによる経皮での攻撃に対してかなりの防御をもたらした。本発明者は、試験された１０種類の異なるＰｓＶ型のうちの９種類による感染に対する非常に強い（約８０〜７，１９０倍のシグナル低下）防御を観察した。これは予期せぬ結果であった。この防御は、驚くべきことに、ＡＢループにおいて提示されたＬ２で免疫性を与えられたマウスで観察されたものよりも、実質的に強力であった。従って、本発明者の実験結果は、同型による攻撃に対して本発明のＶＬＰを用いる防御は、抗原性のＬ２ペプチドがＡＢループにおいて提示された場合のＶＬＰよりも、ほとんどの場合で少なくとも約５〜１０倍優れていることを証明した。特に、異型の攻撃に対する防御は、Ｎ末端−ＶＬＰ構築物を用いると、１０〜２５倍（ＨＰＶ５、３１、及び３９）、４０〜１００倍（ＨＰＶ４５、５１、５３、及び５８）、又は１４０〜１０００倍（ＨＰＶ６、３３、及び３５）良好であることが示された。

まとめ
ＰＰ７ＶＬＰ上におけるペプチドの遺伝学的な提示は、中和抗体の標的であることが公知の特異的なＢ細胞エピトープの厳密な標的化と良く一致している。インフルエンザ（４、１２）、Ｃ型肝炎ウイルス（８）、及びＨＩＶ（２）などの多くの病原体については、幅広い中和抗体の標的エピトープは、免疫原性が不十分である。これは、全長蛋白質が、ワクチン接種による抗体応答の誘導にとって不十分であることを意味している。一方で、ワクチンとしてのペプチドエピトープの使用は、それらの不十分な免疫原性ゆえに、担体蛋白質に連結されない限りは制限される。上記のＰＰ７ＶＬＰ及びＭＳ２ＶＬＰのプラットフォームは、大いに免疫原性の状態で、特異的なペプチドエピトープの標的を定めた摂取を可能にする。この実施例では、ＨＰＶ１６のＬ２蛋白質のＮ末端近傍での幅広い中和エピトープを標的とした。このエピトープは、ＨＰＶ中和モノクローナル抗体の標的であり（５）、対応する合成ペプチドが担体蛋白質に連結された場合には、ＨＰＶに対する交差中和抗体を誘導することができることが既に示されている（１）。本発明者は、Ｌ２エピトープをバクテリオファージコート蛋白質のＮ末端において提示するＭＳ２ＶＬＰが、高力価のペプチド特異的抗体を誘導することを示す。それらの抗体は十分に高い力価があり、同型（ＨＰＶ１６）及び異型（ＨＰＶ５、６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５３、及び５８）の擬似ウイルスによる陰部への攻撃に対して、マウスのほぼ完全な防御を提供した。従って、ＭＳ２ＶＬＰは、特異的なエピトープに対する抗体の標的を定めた誘導にとっての有用性を示す。

参考文献
1. Alphs, H. H., R. Gambhira, B. Karanam, J. N. Roberts, S. Jagu, J. T. Schiller, W. Zeng, D. C. Jackson, and R. B. Roden. 2008. Protection against heterologous human papillomavirus challenge by a synthetic lipopeptide vaccine containing a broadly cross-neutralizing epitope of L2. Proc Natl Acad Sci U S A 105:5850-5.
2. Burton, D. R., R. L. Stanfield, and I. A. Wilson. 2005. Antibody vs. HIV in a clash of evolutionary titans. Proc Natl Acad Sci U S A 102:14943-8.
3. Chackerian, B., C. Caldeira Jdo, J. Peabody, and D. S. Peabody. 2011. Peptide Epitope Identification by Affinity Selection on Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles. J Mol Biol 409:225-37.
4. Ekiert, D. C, G. Bhabha, M. A. Elsliger, R. H. Friesen, M. Jongeneelen, M. Throsby, J. Goudsmit, and I. A. Wilson. 2009. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science 324:246-51.
5. Gambhira, R., B. Karanam, S. Jagu, J. N. Roberts, C. B. Buck, I. Bossis, H. Alphs, T. Culp, N. D. Christensen, and R. B. Roden. 2007. A protective and broadly cross-neutralizing epitope of human papillomavirus L2. J Virol 81:13927-31.
6. Johnson, K. M., R. C. Kines, J. N. Roberts, D. R. Lowy, J. T. Schiller, and P. M. Day. 2009. Role of heparan sulfate in attachment to and infection of the murine female genital tract by human papillomavirus. J Virol 83:2067-74.
7. Karanam, B., S. Jagu, W. K. Huh, and R. B. Roden. 2009. Developing vaccines against minor capsid antigen L2 to prevent papillomavirus infection. Immunol Cell Biol 87:287-99.
8. Law, M., T. Maruyama, J. Lewis, E. Giang, A. W. Tarr, Z. Stamataki, P.
Gastaminza, F. V. Chisari, I. M. Jones, R. I. Fox, J. K. Ball, J. A. McKeating, N. M. Kneteman, and D. R. Burton. 2008. Broadly neutralizing antibodies protect against hepatitis C virus quasispecies challenge. Nat Med 14:25-7.
9. Lim, F., T. P. Downey, and D. S. Peabody. 2001. Translational repression and specific RNA binding by the coat protein of the Pseudomonas phage PP7. J Biol Chem 276:22507-13.
10. Peabody, D. S., B. Manifold-Wheeler, A. Medford, S. K. Jordan, J. do Carmo Caldeira, and B. Chackerian. 2008. Immunogenic display of diverse peptides on Virus-like Particles of RNA phage MS2. Journal of Molecular Biology doi:10.1016/j.jmb/2008.04.049.
11. Roberts, J. N., C. B. Buck, C. D. Thompson, R. Kines, M. Bernardo, P. L. Choyke, D. R. Lowy, and J. T. Schiller. 2007. Genital transmission of HPV in a mouse model is potentiated by nonoxynol-9 and inhibited by carrageenan. Nat Med 13:857-61.
12. Sui, J., W. C. Hwang, S. Perez, G. Wei, D. Aird, L. M. Chen, E. Santelli, B. Stec, G. Cadwell, M. Ali, H. Wan, A. Murakami, A. Yammanuru, T. Han, N. J. Cox, L. A. Bankston, R. O. Donis, R. C. Liddington, and W. A. Marasco. 2009. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16:265-73.

Claims

ＭＳ２のＲＮＡバクテリオファージウイルス様粒子であって、ＨＰＶ１６型のＬ２蛋白質のアミノ酸１７−３１に対応する少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＬ２蛋白質抗原を有する、ＭＳ２バクテリオファージの一本鎖のコートポリペプチド二量体を含み、前記抗原は、前記バクテリオファージの一本鎖のコートポリペプチド二量体のＮ末端において提示される、ウイルス様粒子。
前記ＨＰＶのＬ２蛋白質抗原は、ＨＰＶ１６型のＬ２ペプチド抗原である、請求項１に記載のウイルス様粒子。
前記ＨＰＶのＬ２蛋白質抗原は、ＨＰＶ１、５、６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、又は５９型のＬ２ペプチド抗原である、請求項１に記載のウイルス様粒子。
前記ＲＮＡバクテリオファージウイルス様粒子は、２つ以上のＨＰＶのＬ２蛋白質抗原を提示する、請求項１に記載のウイルス様粒子。
請求項１に記載のウイルス様粒子の集まり。
免疫学的に有効な量の請求項１に記載のウイルス様粒子を、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤と共に含むワクチン。
さらにアジュバントを含む、請求項６に記載のワクチン。