CA3023788A1 - Particule virale pour le transfert d'arns, notamment dans les cellules impliquees dans la reponse immune - Google Patents

Particule virale pour le transfert d'arns, notamment dans les cellules impliquees dans la reponse immune Download PDF

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Christine DUTHOIT
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Flash Therapeutics
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Abstract

La présente invention se rapporte à une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins dédites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.

Description

PARTICULE VIRALE POUR LE TRANSFERT D'ARNS, NOTAMMENT DANS LES
CELLULES IMPLIQUEES DANS LA REPONSE IMMUNE
La présente invention concerne un système rétroviral de transfert d'ARN non viraux dans des cellules cibles et plus particulièrement une particule rétrovirale capable de délivrer de multiples ARN. L'invention concerne également des compositions comportant ces particules rétrovirales, des kits de production de celles-ci, les procédés de fabrication afférents ainsi que les utilisations des particules et des compositions.
Introduire des ARN multiples dans une cellule cible est en enjeu majeur en recherche et développement comme en thérapie génique.
L'utilisation de vecteurs dérivés de virus est devenue une méthode cruciale de transfert de gènes. Les vecteurs viraux se répartissent aujourd'hui en deux catégories principales:
- les vecteurs intégratifs, qui s'intègrent dans le génome receveur, et - les vecteurs non-intégratifs, qui forment habituellement un élément génétique extra-chromosomique.
Les vecteurs intégratifs tels que les vecteurs gamma-rétroviraux (RV) et vecteurs lentiviraux (LV) sont intégrés de façon stable. Les vecteurs non-intégratifs, tels que les vecteurs adénoviraux (ADV) et les vecteurs adéno-associés (AAV) sont rapidement éliminés des cellules qui se divisent rapidement. Certains facteurs influençant le choix d'un vecteur particulier, comprennent sa capacité
d'encapsidation, sa gamme de cellules cibles ou hôtes, son profil d'expression génique, son efficacité
de transduction et sa capacité à induire une réponse immunitaire, ce qui est particulièrement problématique si des transductions répétées sont nécessaires.

Certaines applications nécessitent l'utilisation de vecteurs non-intégratifs comme en thérapie génique ou dans de nombreuses applications in vitro, ex vivo et in vivo. A
titre d'exemples, on peut citer :
= l'induction de la reprogrammation de cellules spécialisées en cellules pluripotentes, ainsi que l'induction de la différenciation de cellules souches ou pluripotentes en cellules spécialisées, = l'expression d'antigènes ou de protéines (toxiques ou non) simultanément dans une cellule cible, = l'expression de systèmes d'ingénierie du génome comme par exemple la protéine CRE, TALEN ou le système CRISPR, ou de toute autre système nécessitant une expression de protéine ou d'ARN.
2 PCT/FR2017/051165 Un moyen d'introduire des ARN dans une cellule cible met en oeuvre des vecteurs viraux basé sur des virus appartenant à la famille des Retroviridae (également désignée sous l'appellation famille des Rétrovirus ou virus à ARN). En effet, durant son cycle de réplication, un virus de la famille des Retroviridae possède la capacité de convertir son génome, constitué d'ARN, en ADN double brin qui sera intégré
dans le génome de la cellule cible. Des exemples particuliers de cette famille de Rétrovirus sont les gamma-rétrovirus et les lentivirus.
Le cycle réplicatif d'un rétrovirus comporte une première phase de reconnaissance de la cellule cible (ou hôte) via la fixation à un récepteur membranaire.
Cette phase de reconnaissance aboutit, après fusion membranaire, à l'entrée du rétrovirus dans la cellule hôte. L'ARN rétroviral est alors copié en ADN double brin par la transcriptase inverse, codée par le rétrovirus, puis intégré au génome de la cellule hôte.
Ce génome viral est alors transcrit par la cellule hôte comme tous les autres gènes de la cellule. Ce génome code l'ensemble des protéines et des séquences permettant la fabrication d'autres virus.
Plus particulièrement, trois gènes sont communs à l'ensemble des rétrovirus :
gag, pot et env.
Gag est un gène codant pour une polyprotéine, les protéines issues de cette polyprotéine par clivage, étant des protéines de structure impliquées dans l'assemblage des virus lors de la réplication. Ces protéines de structure sont plus spécifiquement la protéine de matrice (MA), la protéine de capside (CA) et la protéine de nucléocapside (NC).
Pol est un gène codant pour les enzymes intégrase, transcriptase inverse et protéase.
Env est un gène codant pour des glycoprotéines d'enveloppe.
Ces trois gènes permettent donc de copier l'ARN rétroviral en ADN double brin, d'intégrer cet ADN au génome de la cellule hôte puis de générer la structure des rétrovirus néo-synthétisés : protéines d'enveloppe, de capside et de nucléocapside.
Toutefois, afin que les rétrovirus néo-synthétisés soient complets, il est nécessaire d'encapsider dans chacune de ces structures deux copies de l'ARN rétroviral.
Cette encapsidation de deux copies de l'ARN rétroviral dans la structure s'effectue par la reconnaissance par la protéine de nucléocapside, d'une séquence d'encapsidation appelée Psi (pour Packaging Signal ) portée par la copie de l'ARN
rétroviral.
Lorsqu'un vecteur viral dérivé d'un rétrovirus est utilisé à des fins de thérapie génique, au moins une partie des régions codantes de gag, pot et/ou env est dissociée
3 PCT/FR2017/051165 entre le système d'encapsidation et le système d'expression de la séquence d'intérêt.
Les séquences codantes gag et pot, par exemple, sont portées par le plasmide d'encapsidation apportant en trans les protéines nécessaires à la production de vecteurs viraux. La séquence d'encapsidation comme la séquence d'intérêt sont portée par des systèmes indépendants, afin de rendre le rétrovirus non réplicatif.
Toutefois, dans certains cas, l'intégration de la séquence d'ARN d'intérêt dans le génome de la cellule hôte de façon aléatoire peut interrompre une phase ouverte de lecture et bloquer l'expression de gènes importants. De plus, pour certaines applications, telles que la reprogrammation de cellules, l'édition des génomes ou la différenciation de cellules souches, il est recommandé que l'expression d'une séquence d'intérêt soit réalisée de manière transitoire.
La demande W02007/072056 décrit un système de vectorisation viral comprenant env, gag, optionnellement gag/pol ainsi qu'une séquence d'ARN contenant un signal d'encapsidation hétérologue qui est reconnu par un domaine de liaison à ARN
correspondant associé à gag ou à gag/poL Ce système est décrit dans la demande comme étant non intégratif et permettant une expression transitoire.
Toutefois, l'efficacité de tels systèmes reste limitée. En particulier, pour qu'une cellule cible exprime un ARN d'intérêt véhiculé par ces systèmes, il est généralement nécessaire d'introduire dans la cellule plusieurs copies de cet ARN d'intérêt et par conséquent, d'utiliser de fortes multiplicités d'infection ( multiplicity of infection ou MOI). La MOI correspond au ratio du nombre de systèmes de vectorisation introduit sur le nombre de cellules à infecter. Une forte MOI permet en effet d'introduire dans les cellules plusieurs copies de l'ARN d'intérêt en permettant qu'une même cellule subisse plusieurs infections. Or, si elle permet d'améliorer le niveau d'expression de l'ARN
d'intérêt véhiculé, l'utilisation de fortes MOI, du fait des multiples infections subies par la cellule, engendre également une certaine toxicité.
Ce type de système de transfert d'ARN présente également un intérêt pour l'immunothérapie, et notamment l'immunothérapie anti-tumorale L'immunothérapie anti-tumorale est une stratégie thérapeutique qui s'appuie sur le système immunitaire afin d'éradiquer les cellules tumorales. De nouvelles approches consistent à modifier génétiquement les cellules du patient pour induire une réponse immunitaire et améliorer le ciblage. Pour que ces nouvelles thérapies géniques puissant être utilisées en clinique, une méthode de transfert de gènes sécurisée et efficace est nécessaire. La transfection d'ARN et l'utilisation de vecteurs lentiviraux ont respectivement émergé comme des technologies adaptées pour transférer soit un
4 PCT/FR2017/051165 récepteur spécifique des lymphocytes T dans des lymphocytes soit un antigène dans des cellules dendritiques.
L'identification moléculaire d'antigènes spécifiques de cellules tumorales humaines est un élément clé du développement d'immunothérapie spécifique d'antigènes ciblés:
= Une des approches qualifiée d'immunothérapie passive consiste à amplifier des cellules T spécifiques d'antigènes ex vivo et à les réimplanter chez les patients (Cellules T TCR & CAR). Le transfert de gènes est ici utilisé pour introduire des récepteurs chimériques d'antigènes synthétiques (CARs) ou des nouveaux récepteurs de cellules T (TCRs) dans ces cellules T avant de les réimplanter par transfert adoptif pour le traitement de cancers. Ici, les vecteurs lentiviraux sont largement utilisés et des résultats très encourageants ont été obtenus au stade clinique.
= L'autre approche qualifiée d'immunothérapie active est la vaccination.
Les cellules dendritiques (DCs) sont des agents naturels de la présentation des antigènes. Les cellules dendritiques sont au centre de nombreuses stratégies thérapeutiques anti-tumorales du fait de leur capacité à stimuler des cellules T naïves. En effet, les cellules dendritiques sont les "détecteurs" de l'environnement et transmettent les informations récoltées aux cellules T et B du système immunitaire. Ces cellules sont donc des cibles essentielles pour générer une immunité thérapeutique anti-tumorale et sont, de ce fait, qualifiées de Cellules Présentatices d'Antigènes (CPAs) professionnelles. La finalité de la vaccination basée sur les cellules dendritiques est à la fois d'induire in vivo une réponse des cellules T
effectrices pour réduire la masse tumorale spécifiquement et également d'installer une réponse mémoire.
Ces deux approches thérapeutiques impliquent deux spécificités pour obtenir une réponse immunitaire anti-tumorale efficace et reproductible. Premièrement, l'expression de séquences exogènes telles que les antigènes, dans les cellules cibles doit être contrôlée pour obtenir une réponse immunitaire sans induire de toxicité. La co-expression de plusieurs antigènes au même moment est une bonne opportunité
pour augmenter la réponse anti-tumorale et éviter l'échappement de cellules tumorales.
Les CPA ont un rôle essentiel dans le système immunitaire et constituent un élément déterminant dans une stratégie d'immunothérapie. Les CPA ont pour mission de présenter les peptides antigéniques aux cellules du système immunitaire. Si le ou
5 PCT/FR2017/051165 les antigène(s) sont immunogènes, le système immunitaire va être spécifiquement activé afin d'éliminer les cellules le ou les exprimant. Cette réponse va donc être dirigée contre les CPA mais également contre toute cellule qui exprimera l'antigène, ce qui est le cas des cellules tumorales. Toute cellule présentatrice d'antigène (CPA) mise en contact avec un antigène étranger va le processer pour l'associer aux molécules du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) qui vont permettre la présentation de peptides antigéniques à sa surface. Cet ensemble va pouvoir générer une activation des lymphocytes avec lesquels les CPA vont entrer en contact dans les organes lymphoïdes secondaires. Une tumeur donnée exprime généralement plusieurs antigènes différents, contre lesquels il est clé d'éduquer les cellules du système immunitaire afin de les rendre efficaces contre la tumeur. Ces antigènes tumoraux peuvent également s'exprimer à différents niveaux selon les stades de développement d'une tumeur. Une manipulation de la réponse portant sur plusieurs antigènes peut donc se révéler cruciale dans l'efficacité du traitement par les cellules immunitaires modifiées.
Le second point est l'expression dans les cellules cibles d'agents immuno-modulateurs qui déclenchent la maturation ou l'activation des cellules immunitaires ainsi modifiées. Ces co-expressions multiples au sein des cellules immunitaires vont permettre de mimer les réponses immunes innées et adaptatives. Ainsi ces procédés vont d'une part fournir des cellules exprimant spécifiquement des antigènes et d'autre part induire leur maturation ou différenciation qui est essentielle à une réponse immunitaire complète et efficace. Cela signifie que la thérapie la plus efficace va résulter de l'administration de gènes multiples pour améliorer les résultats thérapeutiques, en combinant la spécificité de la réponse immunitaire contre plusieurs antigènes tumoraux avec des réponses stimulantes, de manière contrôlée et dépendantes du temps. Le fait de délivrer en même temps dans les cellules cibles ou dans le corps à la fois des antigènes et des immunomodulateurs et en une seule utilisation devrait fournir un avantage clinique.
Ces deux approches basées respectivement sur des cellules T et des cellules dendritiques (CPA) sont plus particulièrement ciblées par l'invention.
Il existe donc toujours un besoin pour des systèmes de vectorisation viraux plus efficaces, moins toxiques et plus spécifiquement adaptés à l'immunothérapie.
Le travail des inventeurs a permis de réaliser un système de vectorisation capable de délivrer plusieurs ARN d'intérêt dans une même cellule en une seule infection.
6 PCT/FR2017/051165 La présente invention se rapporte donc à une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins dédites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.
La particule rétrovirale selon l'invention permet d'introduire au moins deux ARN
non viraux, préférentiellement 3, dans une cellule par une seule infection.
L'introduction de telles particules dans les cellules peut être effectuée par un procédé in vivo, in vitro ou ex vivo.
Par protéine issue de la polyprotéine Gag , on entend toute protéine résultant du clivage de la polyprotéine Gag. Plus particulièrement, il s'agit d'une protéine de nucléocapside, d'une protéine de matrice (par exemple, dans des particules rétrovirales dérivées du virus murins de type MoMuLV) ou de la protéine p12, spécifique aux gammaretrovirus.
Par protéine d'enveloppe , on entend toute protéine d'enveloppe, y compris une protéine d'enveloppe de pseudotypage. A titre d'exemple, on peut citer la protéine d'enveloppe Ampho, la protéine d'enveloppe écotrope, la protéine d'enveloppe du virus Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d'enveloppe du virus de l'Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d'enveloppe du virus du sarcome murin d'Harvey (HaMuSV), la protéine d'enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la protéine d'enveloppe du virus du Sarcôme de Rous (RSV), la protéine d'enveloppe du virus de la rougeole (aussi MV pour meastes virus), la protéine d'enveloppe du virus de la leucémie du Gibbon (GalV), la protéine du virus endogène félin (RD114) ou la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G).
Plus particulièrement, la protéine d'enveloppe est la protéine d'enveloppe Ampho, la protéine d'enveloppe écotrope, la protéine d'enveloppe du virus Moloney de la leucémie murine (MoMuLV), la protéine d'enveloppe du virus de l'Immunodéficience Féline (FIV), la protéine d'enveloppe du virus du sarcome murin d'Harvey (HaMuSV), la protéine d'enveloppe du virus de la tumeur mammaire murine (MuMTV), la protéine d'enveloppe du virus du Sarcôme de Rous (RSV), la protéine d'enveloppe du virus de la rougeole (aussi MV pour meastes virus), la protéine d'enveloppe du virus de la
7 PCT/FR2017/051165 leucémie du Gibbon (GalV) ou la protéine d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G). La protéine d'enveloppe peut ainsi être modifiée pour cibler certains types cellulaires ou certaines applications (utilisation de récepteurs de surface comme protéine d'enveloppe).
Il est également possible de modifier la protéine d'enveloppe avec un anticorps, un glycolipide et/ou un ligand particulier afin de cibler un récepteur et/ou un type cellulaire particulier.
Préférentiellement, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G.
Par intégrase , on entend la protéine enzymatique codée par le gène pol, qui permet l'intégration de l'ADN rétroviral dans l'ADN de la cellule infectée par le rétrovirus lors de la réplication dudit rétrovirus.
Par séquence d'encapsidation , on désigne un motif (séquence et structure tridimensionnelle) ARN reconnu spécifiquement par un domaine de liaison.
Préférentiellement, la séquence d'encapsidation est un motif tige-boucle. Plus préférentiellement encore, la séquence d'encapsidation de la particule rétrovirale est le motif tige-boucle de l'ARN du bactériophage MS2 ou du phage PP7 tel que par exemple, celui résultant de la séquence ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ
ID
N 1) ou ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2) respectivement. Le motif tige-boucle et plus particulièrement le motif tige-boucle de l'ARN du bactériophage MS2 ou celui de l'ARN du phage PP7, peut être utilisé seul ou répété
plusieurs fois, de préférence de 2 à 25 fois, plus préférentiellement de 2 à
18 fois, par exemple de 6 à 18 fois.
Par domaine de liaison , on désigne tout ou partie d'une protéine se liant spécifiquement à la séquence d'encapsidation liée à la séquence d'ARN
d'intérêt. Plus particulièrement, il s'agit d'une protéine mutante ou non, définie par une structure tridimensionnelle, se liant spécifiquement à la séquence d'encapsidation.
Préférentiellement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, du phage PP7 ou du phage (26, la protéine nun du prophage HK022, la protéine ou encore la protéine hPum.
Plus préférentiellement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2 ou du phage PP7.
Plus préférentiellement encore, lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7, la séquence de celle-ci est déficiente pour l'auto-assemblage, grâce à
une délétion des acides aminés 67 à 75 (PCPAFG) (Chao et al. 2008).
8 PCT/FR2017/051165 Préférentiellement, la séquence de la protéine Coat du phage PP7 est codon-optimisée pour les cellules humaines, c'est-à-dire que les bases de l'ADN sont choisies pour coder pour des acides aminés préférentiellement présents dans l'espèce humaine.
Par chaque séquence , on entend que les séquences d'encapsidation peuvent être identiques ou différentes, selon que ces séquences d'encapsidation sont reconnues par un domaine de liaison identique ou différent. En effet, la particule rétrovirale selon l'invention peut comporter un ou plusieurs domaines de liaison.
Lorsque plusieurs domaines de liaison sont introduits, ceux-ci peuvent l'être dans la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase.
Le domaine de liaison permet non seulement la reconnaissance de la séquence d'encapsidation mais également l'encapsidation des ARN portant la séquence d'encapsidation dans la particule (ou dans le cas présent, d'un ARN non viral lié à une séquence d'encapsidation).
Par encapsidation , on entend l'empaquetage d'un ARN dans la capside virale d'une particule virale. On notera que dans la présente invention, l'encapsidation des ARN non viraux s'effectue par la reconnaissance d'un signal d'encapsidation non viral, en particulier autre que Psi.
Par séquence d'intérêt , on vise une séquence codant pour ou ayant une fonction présentant un intérêt pour l'utilisateur. Plus particulièrement, la séquence d'intérêt portée par chacun des deux ARN non viraux encapsidés peut être identique ou différente.
A l'aide des particules selon l'invention, il est possible de transférer dans des cellules cibles des ARN non viraux identiques ou différents.
Les ARN encapsidés étant non viraux, ces ARN ne présentent pas les sites de reconnaissance des protéines codées par le gène poL
En effet, ces ARN non viraux n'entrent pas dans les étapes précoces du cycle réplicatif des rétrovirus, à savoir :
- La copie de l'ARN viral simple brin en ADN double brin par la transcriptase inverse ;
- La maturation de l'ADN viral double brin par reconnaissance des extrémités LTR par l'intégrase et maturation du complexe de pré-intégration cytoplasmique en complexe de pré-intégration nucléaire.
Ces protéines virales (transcriptase inverse, intégrase), codées par le gène pol sont donc optionnelles dans la particule et le gène pol peut donc être soit présent, soit
9 PCT/FR2017/051165 délété partiellement ou totalement. Préférentiellement, le gène pol est soit présent, soit délété partiellement.
On notera que les particules rétrovirales selon l'invention comportent un matériel génétique à la fois viral et non viral :
- le gène gag, qui peut être viral ou chimérique. Plus particulièrement, le gène gag est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont introduit(s) dans celui-ci.
- Optionnellement, le gène pol, qui peut être viral ou chimérique. Le gène pol codant pour plusieurs enzymes, les séquences afférentes à ces enzymes peuvent être délétées totalement ou partiellement, présentes et non fonctionnelles, ou présentes et fonctionnelles. Plus particulièrement, le gène pol est chimérique lorsque le ou les domaine(s) de liaison est/sont introduit(s) dans l'intégrase.
- Au moins deux ARN non viraux, chaque ARN non viral étant porteur d'une séquence d'intérêt et d'une séquence d'encapsidation. Plus particulièrement, par "ARN non viral", on entend un ARN dépourvu de toute séquence rétrovirale (qui peut également être désigné par "ARN non rétroviral").
Plus spécifiquement, les particules rétrovirales selon l'invention permettent d'introduire dans des cellules cibles des ARN capables d'induire :
= Le transfert d'une ou plusieurs séquences d'intérêt codantes endogènes ou exogènes de la cellule cible, = Le transfert d'un ou plusieurs ARN non codants comme des ARN capables d'induire un effet sur l'expression génétique, par exemple par le biais de shRNA, miRNA, sgRNA, LncRNA ou circRNA.
= Le transfert d'ARN cellulaires, de type ARN messagers ou autres (miRNA...), des réplicons sous génomique de virus à ARN (VHC, etc...) ou de génomes complets de virus à ARN, = l'expression simultanée de séquences codantes ou non codantes endogènes, exogènes de la cellule cible.
Plus particulièrement, les particules virales selon l'invention permettent d'introduire dans des cellules cibles des acides nucléiques capables d'induire :
- L'expression d'un ou plusieurs épitope(s) et notamment d'un ou plusieurs antigène(s) dans des cellules impliquées dans la réponse immune (cellules dendritiques ou autres cellules présentatrices d'antigènes) ;
10 PCT/FR2017/051165 -L'activation des cellules transduites pour déclencher leur maturation ou leur activation ou celle de cellules avec lesquelles elles pourront interagir et contrecarrer par exemple les mécanismes d'immunosuppression induits par des mécanismes variés et complexes. Une telle activation peut être effectuée par des agents immuno-modulateurs. Ce type d'approche peut créer un micro-environnement favorable au déclenchement d'une réponse immune contre les cellules tumorales.
Il est à noter que cette méthode peut être appliquée à d'autres types de systèmes d'induction de réponse immunitaire.
Par épitope , on entend une structure qui peut être reconnue spécifiquement par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire.
Avantageusement, la séquence d'intérêt code pour plusieurs épitopes, notamment pour un antigène.
Par antigène , on entend une substance étrangère à l'organisme capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Ils peuvent être naturels ou synthétiques. Un antigène est généralement une macromolécule naturelle ou synthétique, généralement des protéines, des polysaccharides et leurs dérivés lipidiques. C'est la reconnaissance de l'antigène par les cellules immunocompétentes, directement ou via les cellules présentatrices d'antigène (CPA), qui active l'immunité
spécifique. Un même antigène peut comporter plusieurs épitopes (identiques ou différents) et ainsi induire une réponse immunitaire variée. La reconnaissance de l'antigène par les lymphocytes dépend de la nature de l'épitope. Les lymphocytes B se lient directement aux épitopes conformationnels grâce aux immunoglobulines de leur membrane. Les lymphocytes T reconnaissent les épitopes séquentiels, correspondant à une séquence d'acides aminés, présentés par les cellules présentatrices d'antigènes.
Préférentiellement, l'épitope ou l'antigène provient d'un agent pathogène, notamment d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite, d'une cellule tumorale, etc.
L'épitope ou l'antigène peut être déduit à partir des biomarqueurs identifiés comme exprimés en grande quantité sur les cellules tumorales ou à partir de virus ou de toxine. Sa taille peut être variable. En général, un criblage est réalisé pour sélectionner le meilleur épitope ou antigène. A partir de la séquence protéique de l'épitope ou de l'antigène, la séquence des acides désoxyribonucléiques et des acides ribonucléiques peut être déduite.
11 PCT/FR2017/051165 L'épitope est de préférence choisi parmi les peptides. Plus préférentiellement, l'épitope est un épitope peptidique comportant de 1 à 50 acides aminés (AA), de préférence moins de 30 AA, préférentiellement de 3 à 12 acides aminés.
L'antigène est de préférence choisi parmi les peptides, les protéines, les glycoprotéines. En effet, la machinerie cellulaire de la cellule (hôte) pouvant traduire l'ARN encapsidé, elle peut également réaliser une ou plusieurs étapes supplémentaires de modifications post traductionnelles telles qu'une glycosylation. En effet, lorsque la production de l'antigène a lieu dans des cellules dendritiques, l'antigène peut être maturé comme le biomarqueur qui a permis son obtention.
La particule selon l'invention permettant l'introduction d'ARN présentant une taille allant jusqu'à 10kb, il est possible d'introduire dans celle-ci des séquences antigéniques de taille conséquente. Toutefois, la taille de la séquence antigénique est variable. De façon générale, plus une molécule est de grande taille et plus elle est immunogène.
Par séquence antigénique , on vise une séquence d'ADN codant pour un épitope ou un antigène.
Avantageusement, l'épitope ou l'antigène est immunogène, c'est-à-dire qu'il peut initier une réponse immunitaire.
Par immunogène on entend le potentiel d'un antigène à un induire une réponse immune. Une substance peut être antigénique sans être immunogène. Ce potentiel dépend de l'espèce, du degré de similitude entre l'antigène et les molécules de l'hôte, des caractéristiques physico-chimiques de l'antigène (taille, forme, rigidité) et de la dose d'antigène reçue.
De préférence, l'épitope est choisi parmi la liste constituée par des molécules qui sont identifiées comme reconnues par la partie variable d'un anticorps ou d'un récepteur membranaire des lymphocytes T (TCR). Ces derniers sont identifiés et sélectionnés selon leur potentiel immunogène.
De préférence, l'antigène est un antigène tumoral c'est-à-dire une molécule spécifiquement présente à la surface des cellules tumorales, absente ou peu abondante sur les cellules normales environnantes. Plus préférentiellement, l'antigène est choisi parmi le groupe constitué par les antigènes du groupe cancer testis (Ex MAGE-Al2, MAGE-A3, MAGE-A1 0, MAGE-A2, MAGE-Ai, CT7/MAGE-C1 , CT1 0, SSX4, BRDT, NY-ES01 , SSX2, Xage1b, MAGE-A4...) qui sont exprimés spécifiquement par le tissu tumoral en dehors d'une expression ectopique par les cellules germinales ; les antigènes de différenciation qui sont exprimés dans un tissu
12 PCT/FR2017/051165 donné aussi bien par des cellules normales que par les cellules tumorales correspondantes ; les antigènes exprimés uniquement dans les cellules tumorales qui peuvent correspondre à des antigènes mutés (Alpha-actinin-4, NY-FC, P53, elongation factor 2, enzyme malic, EGF-R, Kras, Casp8, ACYN4, ALK-EML14...) ; les néoantigènes générés à la suite d'une translocation chromosomique (Bcr-Abl) ;
les antigènes exprimés par des cellules normales qui peuvent être surexprimés par la tumeur (WT1, ACE, Muc1, Survivin 2B, Telomerase ctalytic protein, Her2/neu, EGF-R, EGF, TGFalpha, cyclophillin B...) ; les antigènes dérivés d'agents pathogènes notamment des virus (papillomavirus et cancers du col de l'utérus ou des voies aérodigestives supérieures, virus des hépatites B et C et cancers du foie) ;
et les antigènes dérivés des bactéries (Helicobacter pylori et cancer de l'estomac) ou des parasites (schistosome et cancer de la vessie), notamment chez l'homme. En particulier, les antigènes tumoraux associés aux mélanomes ont été classés dans trois catégories selon qu'ils soient spécifiques de tissu (MART-1, tyrosinases TRP-1 et TRP-2, gp-100), spécifiques de tumeurs, pour ceux qui sont également exprimés par une grande variété de cancer (MAGE-1, NY-ESO-1), ou qu'ils soient des antigènes tumoraux uniques et mutés (8-catenin, CDC27).
Une particule rétrovirale selon l'invention comportant un ARN non viral encapsidé
dont la séquence d'intérêt comporte une partie codant pour au moins un épitope est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules présentatrices d'antigène, notamment les cellules dendritiques.
Par structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope ou paratope , on vise une structure capable d'établir une interaction spécifique avec un épitope, et notamment un antigène. Il s'agit généralement d'un immunorécepteur constitué par la partie variable d'un anticorps ou d'un récepteur membranaire des lymphocytes. De préférence, il s'agit d'immunorécepteur de type TCR (T cell receptor) ou de CAR (récepteur chimérique) présent à la surface d'un lymphocyte T.
De préférence, la structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope est choisie parmi le groupe constitué par les récepteurs des lymphocytes T
(TCR), natifs, modifiés ou chimériques ; les récepteurs des lymphocytes B, membranaires (BCR) ou secrétés (immunoglobulines) ; et les récepteurs d'autres cellules du système immunitaire intervenant dans la réponse immune, telles que les lymphocytes NK ou NKT.
Une particule rétrovirale selon l'invention comportant un ARN non viral encapsidé
dont la séquence d'intérêt comporte une partie codant pour au moins une structure
13 PCT/FR2017/051165 moléculaire reconnaissant spécifiquement un antigène est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules lymphocytaires.
Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention comporte une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Par protéine de nucléocapside , on entend la protéine de structure NC
codée par le gène gag. Lorsque le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, alors cette protéine est une protéine chimérique, issue d'un gène gag chimérique.
Lorsque le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, alors l'intégrase est une protéine chimérique, issue d'un gène pol chimérique.
Par protéine chimérique , on désigne une protéine recombinante comprenant plusieurs séquences protéiques différentes fusionnées.
Selon un premier mode de réalisation, dans la particule rétrovirale selon l'invention, le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside et les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN.
Ce premier mode de réalisation permet une expression précoce et transitoire des ARN d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le génome des cellules cibles.
En effet, lors de la mise en contact d'une particule selon ce premier mode de réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule rétrovirale et celle de la cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la particule dans la cellule cible. Les ARN sont alors libérés dans le cytoplasme et la machinerie cellulaire permet de traduire directement ces ARN en protéine(s), c'est-à-dire sans étapes supplémentaires comme la transcription inverse, la translocation dans le noyau ou l'intégration dans le génome de la cellule cible.
Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même séquence d'encapsidation. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN d'intérêt, c'est-à-dire que les séquences d'ARN d'intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes. Par différentes , on vise des séquences d'intérêt non identiques ou
14 PCT/FR2017/051165 présentant une différence ne résultant pas d'une mutation spontanée ou non intentionnellement choisie par le manipulateur.
Alternativement, les au moins deux ARN non viraux présentent deux séquences d'encapsidation différentes. Ces au moins deux séquences d'encapsidation sont alors reconnues par au moins deux domaines de liaison différents, au moins un de ces domaines étant introduit dans la protéine de nucléocapside. Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent comporter des séquences d'intérêt identiques ou différentes.
Il est possible d'encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement trois ARN non viraux.
Selon un mode de réalisation particulier du premier mode de réalisation, un second domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside de la particule rétrovirale selon l'invention.
A titre d'exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine Coat du bactériophage M52 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine Coat du phage PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2.
Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent uniquement par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence d'encapsidation identique ou différente. Lorsque la séquence d'encapsidation est différente, celle-ci peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la protéine de nucléocapside.
Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans la protéine de nucléocapside, il est également possible d'introduire un domaine de liaison dans l'intég rase.
15 PCT/FR2017/051165 L'intégrase est alors une protéine chimérique, issue d'un gène pol chimérique.
Préférentiellement, lorsque le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence du domaine de liaison. Plus préférentiellement encore, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire celle de la protéine Coat du bactériophage MS2 ou du phage PP7.
Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant aux domaines de liaison introduits dans la protéine de nucléocapside et dans l'intégrase respectivement.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison et se distinguent uniquement par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé portant une séquence d'encapsidation différente, correspondant à un second domaine de liaison introduit dans l'intégrase.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans l'intégrase.
Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention est une particule lentivirale.
Préférentiellement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV
appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2.
Avantageusement :
- La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
- La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement, de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par
16 PCT/FR2017/051165 exemple 12 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N 1).
Ou, préférentiellement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de PP7, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV
appartenant à la polyprotéine Gag, chimérique, la séquence de NC étant mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du phage PP7.
Avantageusement :
- La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
- La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. De préférence, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2).
Avantageusement, la SEQ ID N 2 peut être optimisée pour favoriser le repliement de la tige boucle. Notamment, il a été trouvé qu'il pouvait être intéressent d'insérer successivement et en alternance la SEQ ID N 2 et la SEQ ID N 3 (ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag).
Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, ou le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7.
Selon un second mode de réalisation, l'invention concerne une particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, préférentiellement une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans l'intégrase et, optionnellement par un domaine de liaison introduit dans une protéine issue de la polyprotéine Gag, préférentiellement une protéine de nucléocapside.
17 PCT/FR2017/051165 Ce second mode de réalisation permet une expression transitoire des ARN
d'intérêt, sans événement d'intégration associé dans le génome des cellules cibles.
Préférentiellement, dans ce second mode de réalisation, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence du domaine de liaison.
Avantageusement, le domaine de liaison est un domaine hétérologue. Plus particulièrement, le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, du phage PP7 ou du phage C213, la protéine nun du prophage HK022, la protéine UlA
ou encore la protéine hPum.
De préférence, la séquence de l'intégrase est mutée au niveau du domaine C-terminal de manière à introduire celle de la protéine Coat du bactériophage MS2 ou du phage PP7.
Les au moins deux ARN non viraux peuvent présenter ou non la même séquence d'encapsidation.
De même, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent présenter ou non la même séquence d'ARN d'intérêt.
Préférentiellement, les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN d'intérêt c'est-à-dire que les séquences d'ARN
d'intérêt comprises dans les deux ARN non viraux encapsidés sont différentes.
Plus particulièrement, les au moins deux ARN non viraux présentent la même séquence d'encapsidation, celle-ci étant reconnue par le domaine de liaison introduit dans l'intégrase.
Il est possible d'encapsider au moins deux ARN non viraux, préférentiellement trois ARN non viraux.
Selon un mode de réalisation particulier du second mode de réalisation, un second domaine de liaison est introduit dans l'intégrase de la particule rétrovirale selon l'invention.
A titre d'exemple, le second domaine de liaison peut être la protéine Coat du bactériophage M52 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7 ou le second domaine de liaison peut être la protéine Coat du phage PP7 lorsque le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2.
Dans ce cas, au moins deux ARN non viraux encapsidés portent des séquences d'encapsidations différentes, chaque séquence d'encapsidation
18 PCT/FR2017/051165 correspondant respectivement au premier et second domaine de liaison introduit dans l'intégrase.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison, ces deux ARN non viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé peut porter une séquence d'encapsidation identique ou différente. Lorsque la séquence d'encapsidation est différente, celle-ci peut correspondre à un second domaine de liaison introduit dans l'intégrase.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans l'intégrase.
Outre le ou les domaine(s) de liaison introduit(s) dans l'intégrase, il est également possible d'introduire un domaine de liaison dans la protéine de nucléocapside.
La protéine de nucléocapside est alors une protéine chimérique, issue d'un gène gag chimérique.
Dans ce cas, les au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent porter des séquences d'encapsidation différentes, chaque séquence d'encapsidation correspondant aux domaines de liaison introduits dans l'intégrase et dans la protéine de nucléocapside respectivement.
Plus particulièrement, lorsque trois ARN non viraux sont encapsidés :
- au moins deux des ARN non viraux encapsidés présentent la même séquence d'encapsidation correspondant au premier domaine de liaison introduit dans l'intégrase, ces ARN non viraux pouvant éventuellement se distinguer par leur séquence d'ARN d'intérêt, - le troisième ARN non viral encapsidé porte une séquence d'encapsidation différente, correspondant à un second domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside.
D'autres domaines de liaisons peuvent également être introduits dans la protéine de nucléocapside.
L'invention vise donc une particule rétrovirale comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence
19 PCT/FR2017/051165 d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Optionnellement, les séquences d'intérêt des au moins deux ARN non viraux encapsidés peuvent être identiques.
Alternativement et de préférence, les au moins deux ARN non viraux encapsidés dans la particule rétrovirale se distinguent par leur séquence d'ARN.
Dans ce cas, il est avantageux que la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé code soit pour un second épitope ou antigène, soit pour une protéine immunomodulatrice.
Dans le cas où la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé code pour un second épitope ou antigène, il est ainsi possible d'exprimer plusieurs épitopes et/ou antigène à la fois et de déclencher une réponse immunitaire combinée et coordonnée. A titre d'exemple dans le domaine de l'immunothérapie tumorale, les cellules tumorales deviennent la cible de plusieurs réponses immunitaires indépendantes.
Il existe de nombreux agents immunomodulateurs, c'est-à-dire des molécules pouvant être utilisées pour contrôler et orienter le système immunitaire.
L'introduction de ces agents immunomodulateurs par les particules selon l'invention peut donc concerner toutes les cellules du système immunitaire (lymphocytes, monocytes) dont il est souhaité de moduler la réponse spécifique, l'activation ou la différenciation. Dans le cas des cellules dendritiques, ces agents exercent deux fonctions principales.
A l'état immature, les cellules dendritiques capturent l'antigène au niveau des tissus ciblés ou infectés puis migrent vers l'organe lymphoïde secondaire le plus proche tout en se différenciant.
A l'état mature, les cellules dendritiques présentent l'antigène aux lymphocytes T afin de les activer spécifiquement.
Cette activation spécifique des cellules dendritiques conduit à la production de cytokines essentielles pour la mise en place et le maintien de la réponse immune. Ces cytokines permettent de lier le système inné au système adaptif par un mécanisme très complexe. C'est pourquoi, généralement l'activation des cellules in vitro ou ex vivo est provoquée par l'ajout de cytokines ou de facteurs dans le milieu de culture.
Le micro-environnement, mais aussi différents agents immunomodulateurs, peuvent induire ou contribuer à l'activation des cellules dendritiques. Par exemple, les PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern), les TLR (Toll-like Receptor), des molécules d'inflammation DAMP (Damage associated Molecular pattern Molecules)
20 PCT/FR2017/051165 peuvent conduire à l'activation des cellules dendritiques. Beaucoup de molécules sont capables d'activer des cellules dendritiques. Le MCM (Monocyte-Conditioned Medium), les cytokines (TNFa, IL-113, PGL6), la prostaglandine E2, le CD4OL ou des ligands des TLRs. L'ensemble des protéines capables d'agir sur la voie d'activation des cellules dendritiques est potentiellement capable d'avoir un effet modulateur sur leur maturation. De la même façon, des agents immunomodulateurs des Lymphocytes T
ou B peuvent être de puissants régulateurs de la production et de l'activité de ces cellules et stimuler ainsi les interactions entre les différents acteurs de la réponse immune et donc améliorer celle-ci.
Par "protéine immunomodulatrice", on entend un agent immunomodulateur se présentant sous la forme d'une protéine.
Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux lorsque des cellules présentatrices d'antigène et notamment les cellules dendritiques, ou des lymphocytes sont transduits pour exprimer directement ces agents immunomodulateurs et amplifier la réponse immunitaire.
Ainsi l'induction de la maturation des cellules présentatrices d'antigène, et notamment des cellules dendritiques, concomitante à l'expression d'un antigène est une stratégie particulièrement porteuse pour induire une réponse immune.
L'objectif est d'amorcer le système immunitaire pour répondre au mieux à (aux) l'antigène(s) cible(s). Une telle stratégie d'amorçage visant à pousser le système immunitaire est susceptible de conduire à un renforcement de la réponse immunitaire.
De préférence, la protéine immunomodulatrice est choisie parmi les cytokines telles que TNFa, IL-113, PGL6, les interleukines telles que IL-2, IL-4, IL-12, IL-15, des agents comme le GM-CSF, CD28, l'ICOS ( lnducible Costimulator ), 0X40, CD80, ICOSL ou OX4OL, et des protéines permettant de réguler les voies d'activation décrites telles que des ligands des TLR ou des NLR (Nod-like recepteurs) comme l'imiquimod ou les CpGs.
Avantageusement, la particule rétrovirale comporte un troisième ARN non viral encapsidé.
Le troisième ARN non viral encapsidé peut présenter une séquence d'intérêt identique à au moins l'une des séquences d'intérêt des deux premiers ARN non viraux encapsidés ou se distinguer de chacune des séquences d'intérêt des deux premiers ARN non viraux encapsidés.
En particulier, la particule rétrovirale peut comporter plus de trois ARN non viraux encapsidés.
21 PCT/FR2017/051165 Avantageusement, dans le cas où la particule selon l'invention comporte une protéine de nucléocapside, le domaine de liaison peut être introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Alternativement, dans la particule rétrovirale selon l'invention, le domaine de liaison peut être introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
Avantageusement, la particule rétrovirale selon l'invention est une particule lentivirale.
Lorsque la particule rétrovirale est une particule lentivirale, il est possible d'exprimer transitoirement des ARN d'intérêt, sans événement d'intégration associé
dans le génome des cellules cibles, en particulier des cellules quiescentes.
En effet, en dehors de son rôle dans la réaction d'intégration elle-même, l'intégrase (IN) participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus comme la morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l'import nucléaire du complexe de préintégration (PIC).
Plus particulièrement, chez les lentivirus, l'intégrase contient des séquences de localisation nucléaire (NLS) permettant sa localisation dans le noyau grâce au PIC. Par conséquent, lorsque l'encapsidation des ARN non viraux est effectuée par un domaine de liaison porté par une intégrase d'un lentivirus, les ARN non viraux encapsidés seront transportées dans le noyau de la cellule cible. En effet, lors de la mise en contact d'une particule lentivirale selon ce second mode de réalisation avec une cellule cible, la membrane de la particule et celle de la cellule cible vont fusionner et permettre la libération du contenu de la capside dans la cellule cible. Les ARN sont alors pris en charge par l'intégrase qui, via les PIC, va permettre l'import des ARN dans le noyau.
Cette prise en charge est particulièrement intéressante pour certaines applications, telles que l'expression dans des cellules quiescentes. Dans le cas de particules rétrovirales, autres que les lentivirus, l'intégrase ne contient pas ces NLS
et se trouve donc localisée dans le cytoplasme. Il est toutefois possible de rajouter dans ce type d'intégrase, les séquences NLS afin d'induire une localisation nucléaire de l'intégrase, et donc des ARN pris en charge par cette intégrase.
Cette prise en charge est également particulièrement utile pour un système CRISPR, qui fait appel à des guides ARN qui viennent s'hybrider spécifiquement au génome de la cellule cible. Une fois hybridés, ces guides ARN guident une
22 PCT/FR2017/051165 endonucléase (Cas9), qui va permettre la modification d'un locus spécifique du génome de la cellule cible.
Pour l'immunothérapie, le fait que la transduction soit réalisée en particulier par des particules lentivirales, permet une expression transitoire des ARN
transduits.
La particule selon l'invention est en conséquence capable de délivrer des ARNs multiples, optionnellement distincts génétiquement, sans événement d'intégration dans le génome des cellules hôtes afin d'exprimer, d'une part de multiples séquences antigéniques tumorales différentes par exemple, et d'autre part des protéines immuno-modulatrices capables de déclencher l'activation des cellules transduites dans le mécanisme de réponse immunitaire.
Plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, - l'intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2.
Ou, plus particulièrement, dans une telle particule lentivirale :
- le domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de PP7, - l'intégrase est une protéine enzymatique chimérique dont la séquence est mutée au niveau du domaine C-terminal afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du phage PP7.
Optionnellement, le second domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat du phage PP7 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du bactériophage MS2 ou le second domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat du bactériophage MS2 si le premier domaine de liaison est la protéine Coat du phage PP7.
En effet, l'intégrase (IN) est composée de 3 domaines fonctionnels distincts, chacun indispensable pour assurer une réaction d'intégration complète. Le domaine N-terminal contient un motif de type doigt de zinc qui stabilise la structure repliée de l'IN
et augmente l'activité catalytique de l'enzyme. Le domaine central de l'IN
contient le motif d'acides aminés DDE auquel est attribuée l'activité catalytique de l'enzyme. Ce domaine central est aussi impliqué dans la reconnaissance de la séquence
23 PCT/FR2017/051165 nucléotidique conservée à chaque extrémité de l'ADN rétroviral. Le domaine C-terminal est le moins conservé parmi la famille des rétrovirus. Il possède l'activité
de liaison à
l'ADN et est indispensable pour les réactions de maturation des extrémités 3' de transfert de brin. En dehors de son rôle dans la réaction d'intégration elle-même, IN
participe à différentes étapes du cycle réplicatif des rétrovirus comme la morphogénèse de la particule virale, la transcription inverse et l'import nucléaire du complexe de préintégration.
Comme décrit par Petit et al. (1999; J. Virol. P5079-5088), l'insertion d'une séquence exogène en C-terminal de l'IN ne perturbe pas les étapes de production et de transduction de cellules cibles alors qu'une même insertion en N-terminal ne permet pas la détection d'un événement de transduction.
La particule rétrovirale a donc été modifiée pour contenir la protéine Coat du bacteriophage MS2 en fusion avec la protéine de l'intégrase (Figure I) ou la protéine Coat du phage PP7 (Figure XXXVII). Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur du gène pol codant pour la protéine de l'intégrase, est modifié afin d'insérer la séquence codant la protéine Coat en C-terminal de l'intégrase par PCR
d'assemblage.
Le plasmide p8.74 est linéarisé par PCR puis la séquence Coat, préalablement amplifiée par PCR, est clonée au niveau C-terminal de l'intégrase, soit directement bout-à-bout soit avec l'ajout un linker.
Avantageusement :
- La protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
- La séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2 et/ou de PP7, selon le domaine de liaison introduit, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions, plus préférentiellement de 2 à 18 répétitions, tel que de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore pour la séquence tige-boucle de MS2, de 10 à 14, par exemple 12 répétitions.
- Préférentiellement, la séquence tige-boucle est la suivante :
ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N 1) lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat de MS2 et/ou la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2) et/ou la séquence tige-boucle SEQ ID N 2 en alternance avec la séquence tige-boucle SEQ ID N 3 lorsque le domaine de liaison est la protéine Coat de PP7.
24 PCT/FR2017/051165 Plusieurs exemples de particule lentivirale selon l'invention sont décrits ci-après, certains étant décrits de manière plus détaillée dans les exemples qui suivent :
- une particule RLP ou MS2RLP ou MS2 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, - une particule MS2 (IN)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l'intégrase, - une particule MS2 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l'intégrase, - une particule MS2 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans l'intégrase, - une particule PP7RLP ou PP7 (NC)-RLP 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7 (NC)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7 (NC)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par
25 PCT/FR2017/051165 encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside, - une particule PP7 (IN)-RLP 2X ou PP7 (IN)-RLP est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase, - une particule PP7 (IN)-RLP 6X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 6 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase, - une particule PP7 (IN)-RLP 12X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans l'intégrase, - une particule MS2/PP7RLP ou MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X est une particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs portant le motif tige boucle du bactériophage MS2, répété 12 fois, par l'insertion de la protéine Coat du bactériophage MS2 dans la nucléocapside, ou portant le motif tige boucle du phage PP7, répété 2 fois, par l'insertion de la protéine Coat du phage PP7 dans la nucléocapside.
Préférentiellement, la particule lentivirale formée par encapsidation d'ARNs porte un motif tige boucle du bactériophage MS2 ou du phage PP7, répété de 2 à

fois, préférentiellement encore 2, 6 ou 12 fois.
Plus préférentiellement encore, la particule selon l'invention est choisie parmi MS2 (NC)-RLP 12X, PP7 (NC)-RLP 6X, PP7 (NC)-RLP 2X, MS2 (IN)-RLP 12X, PP7 (IN)-RLP 6X et PP7 (IN)-RLP 2X.
L'invention concerne également des compositions comportant des particules selon l'invention.
Plus particulièrement, les compositions selon l'invention sont des compositions concentrées. Avantageusement, les compositions sont également purifiées. Ces compositions peuvent être concentrées et purifiées selon le procédé décrit dans la demande W02013/014537.
Typiquement, les compositions selon l'invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut. Plus particulièrement, les compositions selon l'invention comportent
26 PCT/FR2017/051165 moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.
Par surnageant brut , on vise le surnageant de culture(s) cellulaire(s), comportant des particules rétrovirales selon l'invention, après clarification.
Une telle étape de clarification est plus particulièrement décrite ci-après dans les procédés de fabrication des particules selon l'invention. Lorsque la récupération du surnageant est effectué en plusieurs fois, le surnageant brut correspond alors à l'ensemble des surnageants collectés, réunis (ou poolés ) puis clarifié.
Optionnellement, les compositions selon l'invention comportent moins de 1 %
de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.
L'invention se rapporte aussi à des kits de production de particules selon l'invention et aux procédés de fabrication de ces kits.
Plus particulièrement, l'invention concerne un kit de production de particules selon l'invention, comportant :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Un tel kit peut également comporter une notice d'utilisation des plasmides contenus dans le kit.
Plus spécifiquement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, ce kit comporte :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN
non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside
27 PCT/FR2017/051165 chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont différentes.
Un plasmide étant une structure d'ADN, il est bien entendu que par plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales , on vise un plasmide d'expression codant pour au moins deux séquences d'ARN non virales.
En effet, les plasmides d'expression des kits contiennent toutes les séquences d'ADN nécessaires à l'obtention d'au moins un ARN non viral par transcription.
Le plasmide d'expression contient au moins un promoteur, suivi d'une séquence ADN

d'intérêt (ADNc ou ADN qui sera transcrit en un ARN non viral) et une séquence d'encapsidation (un ADN codant par exemple pour des motifs répétés MS2 ou PP7) et optionnellement une séquence stabilisatrice de l'ARN.
Préférentiellement, le kit produisant des particules selon le premier mode de réalisation comporte :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation étant identiques, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Avantageusement, le kit produit des particules lentivirales.
Préférentiellement :
- Dans le plasmide d'expression, la séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de MS2, préférentiellement de 6 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 10 à 14, par exemple 12 répétitions. Avantageusement, la
28 PCT/FR2017/051165 séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID N 1).
- Dans le plasmide d'encapsidation, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2.
- Dans le plasmide d'enveloppe, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
Ou, préférentiellement :
- Dans le plasmide d'expression, la séquence d'encapsidation comporte de 2 à 25 répétitions de la séquence tige-boucle de PP7, préférentiellement, de 2 à 18 répétitions de la séquence tige-boucle, plus préférentiellement encore de 2 à 12, par exemple 6 répétitions. Avantageusement, la séquence tige-boucle est la suivante : ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID
N 2) et/ou la séquence tige-boucle SEQ ID N 2 en alternance avec la séquence tige-boucle SEQ ID N 3.
- Dans le plasmide d'encapsidation, la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du phage PP7.
-Dans le plasmide d'enveloppe, la protéine d'enveloppe est la protéine VSV-G codant pour la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire.
Optionnellement, le kit comporte un second plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation. Le second domaine de liaison peut être identique ou différent du domaine de liaison de la protéine de nucléocapside chimérique.
A titre d'exemple de domaines de liaison différents :
- le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat de MS2 et le domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat de PP7, ou - le domaine de liaison introduit dans la nucléocapside peut être la protéine Coat de PP7 et le domaine de liaison introduit dans l'intégrase peut être la protéine Coat de MS2.
29 PCT/FR2017/051165 Plusieurs domaines de liaison peuvent être introduits dans chacune des protéines chimériques.
Alternativement, lorsque le kit vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce kit comporte :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Avantageusement, les kits de production selon l'invention, peuvent comporter en outre un second plasmide d'encapsidation codant pour :
- une protéine issue de la polyprotéine Gag sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une protéine issue de la polyprotéine Gag chimérique, et/ou - une intégrase sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une intégrase chimérique.
Des procédés de fabrication des kits selon l'invention sont également proposés.
Typiquement, un procédé de fabrication d'un kit selon l'invention comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Plus spécifiquement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, il comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN non virales différentes, chaque séquence d'ARN
comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou
30 PCT/FR2017/051165 alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont différentes.
Préférentiellement, ce procédé comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement d'un premier et d'un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation étant identiques, (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
Alternativement, lorsque le procédé concerne un kit qui vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
31 PCT/FR2017/051165 L'invention se rapporte également à des procédés de fabrication des particules selon l'invention.
Un tel procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
Les cellules mises en oeuvre dans les procédés de fabrication de particules selon l'invention sont des cellules productrices, c'est-à-dire des cellules, qui une fois transfectées avec les plasmides portant le matériel génétique nécessaire à la formation des particules rétrovirales, permettent la formation desdites particules. A
titre d'exemple de cellules productrices, on peut citer HEK293T.
Par étape de co-transfection , on entend une étape de transfection lors de laquelle la transfection est effectuée par mise en contact des cellules productrices avec l'ensemble des plasmides du procédé de fabrication des particules.
Plus spécifiquement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des particules selon le premier mode de réalisation, il comporte une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN
non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
32 PCT/FR2017/051165 Les au moins deux séquences d'ARN non virales sont différentes parce que les séquences d'intérêt sont différentes et/ou les séquences d'encapsidation sont différentes.
Préférentiellement, ce procédé de fabrication de particules comporte une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'intérêt, pour lesquelles en amont ou en aval de chacune de ces séquences est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, les séquences d'intérêt étant différentes et les séquences d'encapsidation étant identiques, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
Alternativement, lorsque le procédé de fabrication vise à produire des particules selon le second mode de réalisation, ce procédé comporte une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
Préférentiellement, tous les procédés de fabrication de particules selon l'invention sont réalisés conformément aux procédés décrits dans la demande W02013/014537.
Plus particulièrement, ces procédés de fabrication de particules sont réalisés sur des cellules productrices cultivées en milieu sans sérum et aucune induction au sodium butyrate n'est effectuée.
33 PCT/FR2017/051165 Avantageusement, le surnageant est collecté en plusieurs fois, par exemple entre 3 et 6 fois, à des intervalles de temps spécifiques, tels qu'à des intervalles de temps de l'ordre de la demi vie des particules rétrovirales. Typiquement, la récupération du surnageant est effectuée en 4 à 5 fois, à des intervalles de temps de l'ordre de 6 à 18h, préférentiellement de 8 à 16h, tels que 8h, 12h et/ou 16h.
Préférentiellement, cette collecte est effectuée après changement du milieu de culture des cellules, ce changement étant effectué préférentiellement à 24h post-transfection.
Les procédés de fabrication de particules selon l'invention comportent également une étape dans laquelle le surnageant est clarifié.
Préférentiellement, la clarification du surnageant est effectuée par centrifugation.
Plus préférentiellement encore, ces procédés de fabrication de particules selon l'invention comportent en outre une étape dans laquelle le surnageant est concentré
et/ou purifié.
De préférence, la concentration et purification est effectuée par ultrafiltration frontale sur des unités de centrifugation.
Avantageusement, le surnageant subit une ou plusieurs étapes supplémentaires de purification. Ces étapes de purification sont effectuées de préférence par ultrafiltration tangentielle et/ou diafiltration. Plus préférentiellement encore, le surnageant subit une étape d'ultrafiltration tangentielle suivie d'une étape de diafiltration.
L'ultrafiltration tangentielle est avantageusement effectuée sur des cartouches de fibres creuses en polysulfone.
Optionnellement, la composition peut ensuite subir une étape de chromatographie par échange d'ions, en particulier une chromatographie par échange d'anions. L'éluât issu de cette étape de chromatographie est ensuite récupéré
puis concentré à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de centrifugation. Une composition résultant d'un tel procédé comporte moins de 1 % de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.
Dans le procédé de fabrication selon l'invention, l'étape de co-transfection peut en outre être réalisée avec un second plasmide d'encapsidation codant pour :
- une protéine issue de la polyprotéine Gag sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une protéine issue de la polyprotéine Gag chimérique, et/ou
34 PCT/FR2017/051165 - une intégrase sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une intégrase chimérique.
Avantageusement, le ratio du second plasmide d'encapsidation sur le premier plasmide d'encapsidation est dans la gamme allant de [10 :90] à [60 :40], préférentiellement, dans la gamme allant de [20 :80] à [50 :50].
Des avantages liés à l'utilisation d'un second plasmide d'encapsidation et plus particulièrement aux ratios définis ci-avant sont plus amplement décrits à
l'Exemple 8.
L'invention concerne également des compositions susceptibles d'être obtenues par l'un quelconque des procédés de fabrication de particules selon l'invention.
Typiquement, ces compositions comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 45% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.

Plus particulièrement, les compositions selon l'invention comportent moins de 30 % de contaminants ADN et moins de 2% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.
Optionnellement, les compositions selon l'invention comportent moins de 1 %
de contaminants ADN et moins de 1% de contaminants protéiques par rapport au surnageant brut.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'une particule selon l'invention, ou d'une composition selon l'invention pour transduire des cellules, et notamment des cellules impliquées dans la réponse immune.
L'utilisation des particules et des compositions selon l'invention est particulièrement avantageuse pour transduire des cellules primaires et des lignées immortalisées, afin de les modifier de façon transitoire. Les cellules peuvent être des cellules de mammifères ou d'autres eucaryotes. En particulier, la transduction de ces cellules peut être effectuée in vivo, in vitro ou ex vivo.
Les cellules impliquées dans la réponse immune sont notamment les cellules présentatrices d'antigène (CPA) et les cellules du système immunitaire. Plus particulièrement il s'agit des monocytes (les cellules dendritiques, les macrophages), les lymphocytes T ou B, les Natural Killers et les cellules souches hématopoïétiques.
Ces particules ou compositions peuvent être qualifiés de vaccins et ont pour but d'induire des cellules T effectrices spécifiques de cancer ou de virus pour diminuer la taille de tumeurs ou éradiquer un développement viral et aussi pour induire des cellules T mémoires qui pourront éviter la perte de contrôle sur la tumeur ou le virus.
35 PCT/FR2017/051165 Introduire des acides nucléiques multiples et hétérogènes dans une cellule cible est en enjeu majeur en recherche & développement comme en thérapie pour des applications in vitro, ex vivo et in vivo.
L'invention sera mieux comprise au vu des exemples qui suivent donnés à titre illustratif, avec référence aux Figures, qui représentent respectivement :
- La Figure I est un schéma de constructions de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, un rapporteur fluorescent, ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure II présente un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 dans lequel un domaine de liaison MS2 Coat a été introduit dans la séquence de nucléocapside, ce plasmide d'encapsidation étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure III est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'enveloppe ;
- La Figure IV présente trois schémas de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression lentiviral intégratif portant comme séquence d'intérêt la luciférase (IVa), un gène fluorescent (IVb) ou Cre (IVc) ;
- La Figure V est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'encapsidation p8.74 utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure Vla est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de lymphocytes humains avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Vlb est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de lymphocytes humains avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Vila est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de lymphocytes murins avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Vllb est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de lymphocytes murins avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Villa est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines immatures avec une particule selon l'invention ;
- La Figure VIllb est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de
36 PCT/FR2017/051165 cellules dendritiques humaines immatures avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure VIIIc illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen dans des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure VIlld illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen dans des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Ville est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure VIllf est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines immatures transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure IXa est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines matures avec une particule selon l'invention ;
- La Figure IXb est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de cellules dendritiques humaines matures avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure IXc est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines matures transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure IXd est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules dendritiques humaines matures transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Xa est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de cellules dendritiques issues de la moelle osseuse de souris (BMDC) avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Xb est un diagramme illustrant l'efficacité de la transduction de cellules BMDC avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Xc illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen dans des cellules BMDC transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Xd illustre la cinétique d'expression de la ZsGreen dans des cellules BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
37 PCT/FR2017/051165 - La Figure Xe est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec une particule selon l'invention ;
- La Figure Xf est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC
transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) ;
- La Figure Xla est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique complète codant pour l'antigène MAGE A3, ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xlb est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène MAGE A3 (PS-MageA3 ou PS-MAGEA3), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xlc est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène gp100 (PS-gp100 ou PS-GP100), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xld est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour la tyrosinase (PS-Tyr ou PS-TYR), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention ;
- La Figure Xlla est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique complète codant pour l'antigène MAGE A3, ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure Xllb est un schéma de construction de plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène MAGE A3 (PS-MageA3 ou PS-MAGEA3), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure XlIc est un schéma de construction de la cassette d'expression
38 PCT/FR2017/051165 issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour l'antigène gp100 (PS-gp100 ou PS-GP100), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure XIld est un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt, une séquence antigénique partielle codant pour la tyrosinase (PS-Tyr ou PS-TYR), ce plasmide d'expression étant utilisé pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ;
- La Figure XIlla est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec une particule selon l'invention comportant des ARN
codant pour l'antigène MAGE A3 ;
- La Figure XIllb est un diagramme illustrant le phénotypage des cellules BMDC transduites avec un vecteur lentiviral intégratif (ILV) comportant un ARN codant pour l'antigène MAGE A3;
- La Figure XIV est un diagramme illustrant le suivi de la croissance tumorale induite par des cellules Renca exprimant MAGE A3 chez la souris ;
- La Figure XV présente le schéma de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt la Luciférase utilisé pour la production de particules lentivirales PP7RLP, comprenant le motif tige-boucle PP7 répété 2 fois, selon l'invention ;
- La Figure XVI présente un schéma de la modification du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 afin d'insérer un domaine de liaison dans la séquence de l'Intégrase ;
- La Figure XVII présente un schéma de la cassette d'expression issue du plasmide d'encapsidation utilisé pour la production de particules lentivirales PP7 (IN)-RLP selon l'invention, obtenu par la modification du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 présenté Figure XVI ;
- La Figure XVIII présente les profils d'expression du marqueur CD8 murin et du CFSE sur les cellules issues de rates de souris BABL/c, sauvages ou ayant développé une tumeur, après tri magnétique sur l'expression de CD8 puis marquage CFSE;
- La Figure XIX présente les profils d'expression du marqueur CD8 murin et du CFSE obtenus avec des cellules CD8+ marquées au CFSE et cultivées seules pendant 5 jours (contrôle, en bas), ainsi que ceux obtenus avec des
39 PCT/FR2017/051165 cellules CD8+ issues de rates de souris BABUc sauvages (en haut) ou ayant développé une tumeur (au milieu), marquées au CFSE, puis co-cultivées pendant 5 jours avec des BMDC non transduites (à gauche) ou transduites (à droite) avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr ; les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules ayant proliféré ;
- La Figure XX est un diagramme illustrant la réponse proliférative relative des cellules CD8+ marquées au CFSE et co-cultivées avec les BMDC non transduites ou transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr ; les résultats de co-cultures au ratio 1 DC :2T et 1 DC :4T sont montrés ; les résultats sont donnés par le ratio du pourcentage de cellules proliférant en réponse au contact avec les BMDC transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr sur le pourcentage des cellules répondant de façon non spécifique face aux BMDC non transduites. (n=3 expériences) ;
- La Figure XXI est un diagramme illustrant les résultats d'une expérience de comparaison des réponses prolifératives relatives de cellules CD8+ co-cultivées au ratio 1 DC :2T avec des BMDC transduites par des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou bien transduites par les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr ;
- La Figure XXII est un diagramme illustrant la viabilité cellulaire et la dose-réponse d'expression de la ZsGreen1 de BMDC transduites avec RLP.ZsGreen1 ;
- La Figure XXIII le shéma de la cassette d'expression issue d'un plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt un rapporteur fluorescent, utilisé pour la production de particules lentivirales PP7 (NC)-RLP et PP7 (IN)-RLP selon l'invention ;
- La Figure XXIV est un diagramme illustrant la viabilité cellulaire et la cinétique d'expression de la ZsGreen1 de BMDC transduites avec PP7 (IN)-RLP.ZsGreen1 à une dose de 1 pg p24/cellule ;
- La Figure XXV est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour MAGEA3 dans des cellules U937 transduites avec le RLP MAGEA3, à 5h post-transduction et à 20h post-transduction ;
- La Figure XXVI est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans des cellules U937 transduites avec le RLP AATs (Antigène Associés à une
40 PCT/FR2017/051165 Tumeur ou antigène tumoral) (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), à 5h post-transduction ;
- La Figure XXVII est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans des cellules U937 transduites avec le RLP AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), à 20h post-transduction ;
- La Figure XXVIII est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour MAGEA3 dans des cellules hDC transduites avec le RLP MAGEA3, à 5h post-transduction et à 20h post-transduction ;
- La Figure XXIX est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans des cellules hDC transduites avec le RLP AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), à 5h post-transduction ;
- La Figure XXX est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour les 3 AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), dans des cellules hDC transduites avec le RLP AATs (PS-MAGEA3, PS-GP100, PS-TYR), à 20h post-transduction ;
- La Figure XXXI présente le schéma de la cassette d'expression issue du plasmide d'expression portant comme séquence d'ARN d'intérêt la protéine immunomodulatrice IL12, formée par les deux sous-unités IL12b (p40) et IL12a (p35), utilisé pour la production de particules lentivirales MS2RLP
selon l'invention ;
- La Figure XXXII est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules U937 transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 5h post-transduction ;
- La figure XXXIII est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules U937 transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 20h post-transduction ;
- La Figure XXXIV est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules hDC
transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 5h post-transduction ;
- La Figure XXXV est un diagramme illustrant la mise en évidence du transfert d'ARN codant pour MAGEA3 et IL12 dans des cellules hDC
transduites avec le RLP-IL-12/PSMAGEA3, à 20h post-transduction ;
41 PCT/FR2017/051165 - La Figure XXXVI est un diagramme illustrant la quantification de la protéine immunomodulatrice 1L12, sécrétée par les hDC transduites avec le RLP-IL12/MAGEA3 (48h post-transduction) ;
- La Figure XXXVII présente un schéma de construction de la cassette d'expression issue du plasmide d'encapsidation lentiviral p8.74 dans lequel un domaine de liaison PP7 Coat a été introduit dans la séquence de nucléocapside, ce plasmide d'encapsidation étant utilisé pour la production de particules lentivirales PP7RLP selon l'invention ;
- La Figure XXXVIII est un diagramme illustrant la viabilité cellulaire et la cinétique d'expression de la ZsGreen1 de BMDC transduites avec RLP-PP7(NC).ZsGreen1 à une dose de 1 pg p24/cellule ;
- La Figure XXXIX est un diagramme illustrant l'effet du précurseur GAG-POL sauvage pour la production de particules MS2RLP 12X sur le transfert d'ARN dans des cellules Jurkat à une dose de 2 pg p24/cellule ;
- La Figure XXXX est un diagramme illustrant l'effet du précurseur GAG-POL
sauvage pour la production de particules MS2RLP 12X sur le transfert d'ARN dans des cellules Jurkat à une dose de 10 pg p24/cellule ;
- La Figure XXXXI illustre l'analyse de la maturation des particules virales MS2RLP par Western blot anti-p24 au bout de 15 secondes (XXXXIb) et 1 minute (XXXXIa) ; et - La Figure XXXXII est un diagramme illustrant l'efficacité des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X pour le transfert d'ARN encapsidés par les séquences d'encapsidation MS2 et PP7 dans des cellules HCT116.
Dans les exemples qui suivent, l'ensemble des tests de transduction sont réalisés avec des vecteurs lentiviraux intégratifs (ILV) ou avec des particules lentivirales porteuses d'ARN (RLP) porteurs de matériel génétique codant pour une protéine fluorescente. Les particules RLP étant non intégratives, le titre des lots est déterminé en particules physiques par millilitre (PP/ml) alors que pour les vecteurs lentiviraux intégratifs le titre est classiquement exprimé en unités de transduction par millilitre (TU/ml). Ainsi la multiplicité d'infection (MOI) avec les particules RLP est exprimée en PP ou pg de protéine p24 par cellule et la MOI avec les vecteurs ILV est exprimée en TU/ml. Les tests de transduction sont réalisés pour chaque type de vecteurs en prenant soin de ne pas se placer dans des conditions saturantes et de privilégier des conditions permettant de visualiser un effet dose pour chaque type de particules. Il est important de rappeler que les deux types de produits RLP et ILV sont
42 PCT/FR2017/051165 produits sans sérum et de façon à minimiser la production de protéines toxiques dans le surnageant en privilégiant des récupérations séquentielles des virions. Une fois clarifiés les surnageants sont concentrés et purifiés par ultrafiltration tangentielle de façon à obtenir une grande pureté.
EXEMPLE 1 : Transduction de cellules du système immunitaire par la particule virale selon l'invention et comparaison de l'efficacité de transduction avec d'autres systèmes I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA
avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt peut être un ADN codant une protéine reportrice comme la luciférase Firefly native, une protéine fluorescente verte (ZsGreen1), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP) (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure l). La séquence d'intérêt peut être un ADNc codant une protéine, par exemple une protéine immunogène ou une protéine immunomodulatrice. La séquence d'intérêt peut également être celle d'un ADNc, d'un shRNA, d'un miRNA, d'un sgRNA, d'un LncRNA ou d'un circRNA.
= Plasmide d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour contenir au sein de la protéine de nucléocapside, en lieu et place du second domaine en doigt de Zn, la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2. Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des particules MS2RLP
est modifié
selon la stratégie suivante : ce plasmide p8.74 est utilisé pour générer, par PCR
43 PCT/FR2017/051165 d'assemblage, un plasmide dépourvu du second doigt de zinc de la protéine de nucléocapside p8.74.82F. Le second doigt de zinc est substitué par la protéine Coat du phage MS2 par clonage Hpal, pour générer le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II). La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT) ou l'intégrase (IN) sans altérer la fonction des MS2RLP.
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSV-G
codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt. La séquence du gène d'intérêt peut être par exemple celle de la luciférase (Figure IVa), d'un rapporteur fluorescent (Figure IVb) ou de la CRE recombinase (Figure IVc). Ce plasmide peut contenir d'autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS.
La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène.
= Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) est utilisé
pour la production des vecteurs lentiviraux intégratifs (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSVG
codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots Après la transfection des plasmides sur des cellules, les surnageants sont récoltés et utilisés bruts ou concentrés/purifiés selon le procédé décrit dans la demande WO 2013/014537.
44 PCT/FR2017/051165 2.1 Production des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales Les productions sont réalisées en CelISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning) avec des cellules HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par 1%
penicillin/streptomycin et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37 C en atmosphère humide à
5% CO2 Pour l'expérience d'étude de l'impact du sérum, le DMEM est supplémenté

avec 10% de SVF. En particulier, aucune induction au sodium butyrate n'est effectuée.
Pour chaque lot (MS2RLP et ILV), le mélange de transfection est composé des trois plasmides suivants :
- Un des plasmides d'expression décrit ci-avant, selon que l'on forme une particule (MS2RLP) ou un vecteur ILV, - p8.74AZF Coat (MS2RLP), p8.74 (ILV) et - pENV portant l'enveloppe VSV-G.
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les cellules sont incubées à 37 C / 5% 002. Après changement du milieu, le surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection). Chaque récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être microfiltrée sur filtre de 0,45pm (Stericup, Millipore). Toutes les récupérations sont alors mélangées pour composer le surnageant brut.
2.2 Concentration et purification des vecteurs lentiviraux et particules lentivirales Les vecteurs et particules sont concentrés et purifiés selon l'une des deux procédés ci-après :
= Le procédé P1 vise à réaliser une ultrafiltration frontale du surnageant sur des unités centrales de centrifugation.
= Le procédé P2 vise à réaliser une ultrafiltration tangentielle puis une diafiltration du surnageant. Le surnageant brut est concentré et purifié par ultrafiltration tangentielle via l'utilisation de cartouches de fibres creuses en polysulfone.
Le surnageant est traité par diafiltration pour 20 diavolumes en mode continu contre du tampon DMEM ou TSSM. Après la diafiltration, le rétentat est récupéré puis concentré
à nouveau par ultrafiltration frontale sur des unités centrales de centrifugation.
La production/concentration/purification des lots pour cet Exemple est réalisée
45 PCT/FR2017/051165 selon le procédé P2.
3. Titration 3.1 Titration des particules fonctionnelles par qPCR
Les cellules HCT116 (ATCC, COL-247) sont ensemencées en plaque 96 puits dans 100 L de DMEM supplémenté de 10% SVF, 100 pg/mL Stretomycin, 100 U/mL
Penicillin et 2mM L-Gln puis incubées 24h à 37 C / 5% 002. Six dilutions sériées sont réalisées pour chaque vecteur ainsi que pour un étalon interne. Les cellules sont transduites par ces dilutions sériées en présence de Polybrene 81..tg/mL
(Sigma) puis incubées trois jours à 37 C / 5% 002. Pour chaque série d'échantillons, un puits de cellules non transduites est rajouté en contrôle. Les cellules sont ensuite trypsinées et le titre (Unité de Transduction/mL) est déterminé par qPCR après extraction de l'ADN
génomique en utilisant le Nucleospin tissue gDNA extraction kit (Macherey-Nagel). Le titre obtenu (TU/mL) par qPCR est normalisé par l'étalon interne dont le titre a été
précédemment déterminé par FACS.
3.2 Quantification des particules physiques par test ELISA P24 La protéine de capside p24 est détectée directement sur le surnageant viral en utilisant et en suivant les recommandations du kit HIV-1 p24 ELISA kit (Perkin Elmer).
La protéine p24 capturée est complexée avec un anticorps polyclonal biotinylé, puis détectée par une streptavidine conjuguée à la péroxydase HRP. Le complexe résultant est détecté par spectrophotométrie après incubation avec le substrat ortho-phenylenediamine-HCI (OPD) produisant une coloration jaune qui est directement proportionnelle à la quantité de protéine p24 capturée. L'absorbance de chaque puits est quantifiée au lecteur de plaque Synergy H1 Hybrid (Biotek) et calibrée contre l'absorbance d'une gamme étalon de protéine p24. Le titre viral exprimé en particules physiques par mL est calculé à partir de la concentration de protéine p24 obtenue sachant que lpg de protéine p24 correspond à 104 particules physiques.
Il. Transduction de cellules du système immunitaire 1. Cellules lymphocytaires 1.1 Préparation des cellules lymphocytaires humaines
46 PCT/FR2017/051165 Les lymphocytes humains totaux sont préparés à partir de sang total humain par isolation des cellules mononucléaires périphériques ou PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) sur gradient de Ficoll. Le prélèvement de sang est récupéré
à
température ambiante et dilué au 1/2 avec du PBS 1X pH 7,4 dans un tube adéquat (15 ou 50 ml).
1 volume de solution de Ficoll (GE Healthcare) est déposé délicatement sous 2 volumes de sang dilué. Il est important d'obtenir 2 phases distinctes non mixées : Une phase inférieure correspondant au Ficoll et une phase supérieure correspondant au sang dilué. Le tube est centrifugé 30 minutes à 400g à température ambiante.
Le frein de la centrifugeuse est arrêté pour éviter de perturber les différentes phases obtenues après centrifugation.
La phase supérieure correspond au plasma, la phase inférieure correspond au Ficoll et un anneau s'est formé entre ces deux phases, qui contient la population d'intérêt (PBMC).
L'anneau de PBMC est pipeté délicatement et transféré dans un nouveau tube.
Les PBMC sont ensuite lavées 2 fois avec au moins 3 volumes de solution de PBS

pH 7,4. Les cellules sont centrifugées 10 minutes à 100g à température ambiante.
Une fois le surnageant retiré, les PBMC sont resuspendues dans un milieu de culture RPMI, 10 % Serum de Veau Foetal, 2mM L-Glutamine, 1%
Pénicilline/Streptomycine et numérées.
Les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.10e6 cellules par ml et sont déposées sur un support de culture en plastique pendant 2h à 37 C / 5%
002.
Cette étape permet aux cellules monocytaires d'adhérer au plastique alors que les lymphocytes restent en suspension et peuvent donc être récupérés dans le surnageant des cultures avant d'être ensemencés à 1,56.10e5 cellules par cm2 en prévision de la transduction.
1.2 Préparation des cellules lymphocytaires murines Les lymphocytes murins sont préparés à partir de rate. La rate d'une souris est récupérée après euthanasie de l'animal par dislocation cervicale. La rate est déposée dans un puits d'une plaque de culture 6 puits et gonflée par injection de 1 ml de solution de collagénase D (Roche diagnostics) à 2mg/m1 avec une seringue montée d'une aiguille 26G 1/2. La rate est émincée en petits morceaux dans le puits avec un scalpel stérile dans 1 ml de solution de collagénase D à 2 mg/ml. Les 2 ml de solution contenant les éminçâts de rate sont transférés dans un tube de 15 ml et incubés 30
47 PCT/FR2017/051165 minutes dans un bain-marie à +37 C. La digestion enzymatique est stoppée par ajout de 13 ml de Tampon MACS froid (PBS 1X pH 7.4, 0,5% SVF, 2mM EDTA) pour un volume final de 15 ml. La suspension cellulaire est filtrée sur un tamis cellulaire de 70 pm posé sur un tube de 50 ml. Le volume est complété à 30 ml avec du tampon MACS
froid. La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300g, à +4 C.
Un tri positif sur l'expression du marqueur CD8 est ensuite réalisé. Pour cela, le surnageant est éliminé par aspiration et le culot cellulaire est repris dans 90 pl de tampon MACS froid et 10 pl de billes anti-CD8 (Miltenyi Biotec) pour 10e7 cellules. Le mélange est incubé 15 minutes à +4 C. A la fin de l'incubation, un volume de tampon MACS qsp 15 ml est rajouté à la suspension. La suspension est centrifugée 10 minutes à 300 g, à +4 C. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est repris dans l'équivalent de 500 pl de tampon MACS froid pour 10e8 cellules. La suspension est déposée sur une colonne de type MS (Miltenyi Biotec) adaptée sur un aimant et préalablement équilibrée avec du tampon MACS froid. La colonne est lavée avec 3 x 5000 de tampon MACS froid. La fraction négative (environ 2 ml) est complétée à
5 ml avec du tampon MACS froid puis on réalise une numération cellulaire. La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300g, à +4 C et les cellules resuspendues dans une plaque 6 puits type TCT (Corning) à raison de 1.10e6 cellules par ml en milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour être transduites.
Après tri, les différentes fractions obtenues sont analysées par cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) avec des marquages anticorps anti-CD8 pour contrôler la pureté
des populations triées.
1.3 Transduction des lymphocytes (humains et murins) Le jour de la transduction, les lymphocytes sont resuspendus à raison de 0,5x106 cellules par ml dans une plaque 96 puits à fond plat, traitée pour la culture cellulaire, dans un volume de 500 par puits. Un milieu de transduction contenant 4pg/m1 final de Polybrene et les différents vecteurs aux MOI choisies (à savoir 10, 20 ou 30 pg p24 par cellule dans le cas du RLP et MOI 10, 20, 25 ou 50 dans le cas de l'ILV
pour les lymphocytes T humains ; 0,1, 0,5, 1, ou 5 pg p24/cellule dans le cas du RLP et MOI 5, 10, 25, 50 ou 75 dans le cas de l'ILV pour les lymphocytes T CD8+ murins) est préparé
et ajouté aux cellules dans un volume de 50 pl, pour un volume final de 100 pl par puits. La plaque est ensuite centrifugée pendant 75 minutes, à 1000g, à 30 C.
Le milieu de transduction est laissé sur les cellules pendant 4 h après l'étape de
48 PCT/FR2017/051165 centrifugation, à 37 C, 5% 002. Après cette incubation, 80% du milieu de transduction (800) est retiré et 180111 de milieu RPMI, 10% Serum de Veau Foetal, 2mM L-Glutamine, 1% Péniciline/Streptomycine est rajouté à chaque puits. Les cellules sont incubées à 37 C, 5% CO2 jusqu'à l'analyse.
2. Cellules dendritiques 2.1 Préparation des cellules dendritiques humaines 2.1.1 Isolation des cellules mononucléaires périphériques (PBMC) humaines à
partir de sang total humain Les cellules dendritiques humaines sont préparées à partir de sang total humain par isolation des PBMC sur gradient de Ficoll. Le prélèvement de sang est récupéré à température ambiante et dilué au 1/2 avec du PBS 1X pH 7,4 dans un tube adéquat (15 ou 50 ml).
1 volume de solution de Ficoll (GE Healthcare) est déposé délicatement sous 2 volumes de sang dilué. Il est important d'obtenir 2 phases distinctes non mixées : Une phase inférieure correspondant au Ficoll et une phase supérieure correspondant au sang dilué. Le tube est centrifugé 30 minutes à 400g à température ambiante.
Le frein de la centrifugeuse est arrêté pour éviter de perturber les différentes phases obtenues après centrifugation.
La phase supérieure correspond au plasma, la phase inférieure correspond au Ficoll, et un anneau s'est formé entre ces deux phases, qui contient la population d'intérêt (PBMC).
L'anneau de PBMC est pipeté délicatement et transféré dans un nouveau tube.
Les PBMC sont ensuite lavées 2 fois avec au moins 3 volumes de solution de PBS

pH 7,4. Les cellules sont centrifugées 10 minutes à 100g à température ambiante.
Une fois le surnageant retiré, les PBMC sont resuspendues dans un milieu de culture SFM, 2mM L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine et numérées.
Les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.10e6 cellules par ml (2,5.10e6 cellules par cm2) et sont déposés en plaque 48 puits type TCT
(Corning) pendant 2h à 37 C / 5% 002. Cette étape permet aux cellules monocytaires d'adhérer au plastique alors que les lymphocytes restent en suspension. Après 2h d'incubation la plaque est lavée avec du PBS1X afin de ne garder que les monocytes en culture, qui vont être transduits.
49 PCT/FR2017/051165 2.1.2 Différenciation de la population des monocytes en cellules dendritiques Les cellules dendritiques sont cultivées dans une plaque 48 puits type TCT
(Corning) à raison de 1.10e6 cellules par ml en milieu SFM supplémenté 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 200 nM IL4 humain et 50 mM GM-CSF
humain. Ces conditions de culture permettent d'obtenir des cellules dendritiques de phénotype immature (iDC). Les cellules dendritiques sont laissées en culture pendant 5 jours à 37 C / 5% CO2 avec un renouvellement du milieu de culture le troisième jour.
Pour obtenir des cellules dendritiques matures (mDC), au troisième jour de culture les cellules sont mises dans un milieu de maturation contenant 0,1 pg/m1 de LPS.
2.2 Préparation des cellules dendritiques murines Les cellules dendritiques (DC) murines sont préparées à partir de moelle osseuse issue des membres inférieurs (culture de BMDC). Les os longs que sont les fémurs et les tibias sont récupérés à partir de souris adultes et transférés dans un tube de 50 ml contenant du milieu RPMI 1640 supplémenté 1%
Pénicilline/Streptomycine.
Les os sont vidés de leur moelle à l'aide d'une seringue portant une aiguille 26G 1/2 et contenant du milieu RPMI 1640 supplémenté 1% Pénicilline/Streptomycine. La suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g, +4 C. Le surnageant est éliminé
et le culot est repris dans 1 ml de milieu RPMI 1640 supplémenté 1%
Pénicilline/Streptomycine + 3 ml de solution de Gey's (155 mM NH4CI, 1 mM
KHCO3).
La suspension est incubée 5 minutes à température ambiante afin de lyser des globules rouges contenus dans la suspension cellulaire. Après l'incubation, le volume est ajusté à 15 ml avec du milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour stopper la réaction et la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes 300 g, +4 C. Le surnageant est éliminé
et le culot est repris dans un volume de milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine. Cette suspension cellulaire est filtrée sur un tamis cellulaire de 70 lm posé sur un tube de 50 ml. Le tamis est rincé jusqu'à obtenir un volume final d'environ 30 ml. Les cellules sont comptées et la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes à 300 g. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans volume de milieu RPMI 1640 supplémenté
à 10%
de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50 M 2-MercaptoEthanol, 25 ng/ml IL4 murine et 25 ng/ml GM-CSF murine, permettant
50 PCT/FR2017/051165 d'obtenir une concentration cellulaire de 1.10e6 cellules par ml. Les cellules dendritiques sont mises en culture dans une plaque 6 puits type ULA (Corning) à
raison de 1.10e6 cellules par ml. Les cellules dendritiques sont laissées en culture pendant 5 jours à 37 C / 5% CO2 avec un renouvellement du milieu de culture tous les 2-3 jours. Le troisième jour, les BMDC sont remises en culture dans une nouvelle plaque 6 puits ULA afin de les séparer des cellules de type macrophages qui restent adhérées à la plaque ayant servi à la mise en culture.
2.3 Transduction des cellules dendritiques humaines Le jour correspondant à l'isolation des PBMC, les cellules sont transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreen1 aux MOI choisies (1, 2 ou 4 pg p24 par cellule dans le cas du RLP et MOI 25, 50 ou 75 dans le cas de l'ILV) en milieu de culture SFM, 2mM
L-Glutamine, 1% Pénicilline/Streptomycine avec les agents de transfection suivant :
Polybrene à 41..tg/mL (Sigma) et BX795 61.1M (lnvivogen) et incubées à +37 C
/ 5%
002. 4h après la transduction, le milieu de transduction est remplacé par le milieu de différenciation spécifique aux cellules dendritiques (SFM, 2mM L-Glutamine, 1%

Pénicilline/Streptomycine, 200 nM IL4 humaine et 50 mM GM-CSF humaine). Ce milieu permet la culture des cellules dendritiques immatures (iDC). Les cellules sont transduites 4h post-ensemencement par les différents vecteurs (RLP ou ILV) pour établir une mise au point de transduction sur la cassette EF1.ZsGreen1.
Les cellules transduites sont analysées à différents temps (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction).
Pour obtenir des cellules dendritiques matures (mDC), les cellules sont mises dans un milieu de maturation contenant 0,1 pg/m1 de LPS au troisième jour de culture et elles sont analysées au jour 4.
2.3.1 Transduction des cellules dendritiques humaines par RLP.ZsGreen1 Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.ZsGreen1 ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP
allant de 1 pg p24 à 4 pg p24 par cellule et à différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction pour les iDC et 4 jours post-transduction pour les mDC). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant les agents de transduction Polybrene à 41..tg/mL (Sigma) et BX795 61.1M (lnvivogen).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des
51 PCT/FR2017/051165 anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D209 DC SIGN, anti-0D86 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
2.3.2 Transduction des cellules dendritiques humaines par ILV.EF1.ZsGreen1 Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreen1 ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules lentivirales ILV allant d'une multiplicité de d'infection MOI de 25 à 75 et à différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction pour les iDC et 4è jour post-transduction .. pour les mDC). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement les agents de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma) et BX795 6pM (Invivogen).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D209 DC SIGN, anti-0D86 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
2.4 Transduction des cellules dendritiques murines (BMDC) 6 jours après la mise en culture, les cellules dendritiques sont récupérées et centrifugées 5 min à 300 g. Le surnageant est éliminé et les cellules sont lavées dans 1 ml de RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, et centrifugées 5 min à 300 g. Les cellules dendritiques sont ensemencées à 0,5.10e6 cellules/mi en plaque 96 puits ou 24 puits en RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50pM 2-MercaptoEthanol, 25 ng/ml .. murine et 25 ng/ml GM-CSF murine. Les cellules sont transduites 24h post-ensemencement par les différents vecteurs (RLP ou ILV) pour établir une mise au point de transduction grâce à l'expression de la fluorescence ZsGreen1. Les transductions se font en présence de Polybrene 4pg/mL (Sigma), suivi d'une spinoculation de la plaque à 1000 g pendant 75 minutes à +30 C. Le milieu de transduction est ensuite laissé pendant 4h à +37 C / 5% 002.
Après l'incubation 80% du milieu de transduction est éliminé par pipetage et remplacé par un volume équivalent de RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, 50pM 2-MercaptoEthanol, 25nM IL4 murine et 25 ng/ml GM-CSF murine préchauffé. Les cellules sont ensuite remises à 37 C / 5% 002.
52 PCT/FR2017/051165 2.4.1 Transduction des cellules dendritiques murines par RLP.ZsGreen1 Les cellules dendritiques transduites par le vecteur RLP.ZsGreen1 ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP
allant de 0,1 pg p24 à 5 pg p24 par cellule et à différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
2.4.2 Transduction des cellules dendritiques murines par ILV.EF1.ZsGreen1 Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV.EF1.ZsGreen1 ont fait .. l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules lentivirales ILV allant d'une multiplicité de d'infection MOI de 5 à 75 et à différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé
avec uniquement le milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à
4pg/mL
(Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
3. Phénotypage et caractérisation des cellules 3.1 Immunomarquaqe des cellules lymphocytaires Après tri ou bien aux différents temps d'analyse après transduction les lymphocytes sont récupérés des plaques de culture dans lesquels ils sont en suspension et les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH
7.4, 5%
SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
Les cellules lymphocytaires sont phénotypées par immunomarquage avec les .. anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD8, anti-CD4,
53 PCT/FR2017/051165 anti-CD3 ou anti-TCR (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d'anticorps sont réalisés et 50 pl par puits sont déposés sur les cellules.
Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 500 de PBS 1X pH

7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes.
Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 1000 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 1000 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.2 Immunomarquaqe des cellules dendritiques humaines A chaque temps d'analyse, les puits sont grattés avec un cône de pipette ou un grattoir, selon le format de la plaque de culture, et les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c, anti-0D209 DC SIGN, anti-0D86 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d'anticorps sont réalisés et 50 pl par puits sont déposés sur les cellules dendritiques récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 500 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à
300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 1000 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à
300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 1000 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.3 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7.4 et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
L'analyse de la viabilité des cellules dendritiques est réalisée par immunomarquage spécifique avec le marqueur de viabilité ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec). Pour cela, 1pl de ViobilityTM, en solution dans du DMSO, est appliqué
54 PCT/FR2017/051165 pour chaque puits de cellules, dans 100111 de PBS 1X pH7,4. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7.4, 5% SVF et à nouveau centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF pour être marquées avec des anticorps spécifiques comme décrit ci-après pour phénotypage.
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d'anticorps sont réalisés et 50 I par puits sont déposés sur les cellules dendritiques récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50111 de PBS
lx pH 7,4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100 I de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.4 Cytométrie en flux Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules marquées au ViobilityTM sont mortes ou en train de mourir, les cellules viables sont donc les cellules négatives (marquage par exclusion). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Résultats :
1.
Comparaison de l'efficacité de transduction de cellules immunitaires par RLP et ILV
1.1 Lymphocytes T
La transduction de lymphocytes T par les particules RLP ou les vecteurs ILV
montre une efficacité plus importante chez l'Homme (Figures Vla et Vlb) que chez la souris (Figures Vila et VIlb). En effet, les lymphocytes T humains naïfs sont transduits
55 PCT/FR2017/051165 avec une efficacité de 70% avec RLP de façon comparable à ce qui est obtenu avec des vecteurs ILV. De même, nous obtenons plus de 90% de cellules positives après activation avec RLP comme avec ILV. En revanche les lymphocytes T murins restent plus difficiles à transduire avec un résultat allant de 20% pour RLP à 70%
avec ILV
dans les conditions de multiplicité d'infection testées. En augmentant la multiplicité
d'infection (MOI), nous pourrions obtenir des efficacités plus fortes sur les lymphocytes T murins mais risquons d'induire une toxicité cellulaire.
1.2 Cellules dendritiques Les premiers tests de transduction de cellules dendritiques (DC) ont été
réalisés sur des cellules humaines préparées à partir de sang périphérique provenant de donneurs humains sains.
La transduction de cellules dendritiques humaines (DC) immatures par les particules lentivirales porteuses d'ARN (RLP) ou les vecteurs lentiviraux intégratifs .. (ILV) montre une efficacité comparable. Cette expression reste stable jusqu'à 4 jours post-transduction (Figure \Mb). La transduction des DC humaines par les particules RLP à une MOI de 4 pg p24/cellule (Figure Villa) conduit à 40% de cellules positives.
Cette même efficacité de 40% est obtenue avec des vecteurs ILV à MOI 75 (Figure VII1b). Du fait de l'intégration, l'expression résultant de la transduction par les vecteurs ILV reste stable au cours du temps (Figure VII1d). L'analyse de 4 bio-marqueurs caractéristiques des DC humaines sur les DC transduites montre que l'expression de ces bio marqueurs n'est pas significativement modifiée par la transduction par les particules RLP (Figure Ville) démontrant que la transduction ne modifie pas le phénotype des cellules cibles. Le même résultat est obtenu avec les vecteurs lentiviraux intégratifs avec seulement une légère hausse du marqueur CD209 (Figure VIllf). Ces résultats indiquent que la transduction par des vecteurs ILV et particules RLP ne vient pas perturber le phénotype immature des DC immatures et ne les engagent pas dans un processus ou une voie d'activation ou de différenciation.
En parallèle des tests de transductions ont été menés sur des cellules dendritiques maturées par l'ajout de LPS dans les cultures. Les résultats montrent une efficacité de transduction des DC matures de 30% avec les particules RLPs à
une MOI
de 4 pg p24/cellule (Figure IXa) et de 50% avec les vecteurs ILVs à une MOI de (Figure IXb). Comme précédemment, les transductions par les particules RLPs (Figure IXc) et par les vecteurs ILVs (Figure IXd) ne perturbent pas significativement l'expression des biomarqueurs caractéristiques des cellules dendritiques.
56 PCT/FR2017/051165 Les mêmes tests de transductions ont été réalisés sur des cellules dendritiques issues de la moelle osseuse de souris (BMDC). Les résultats obtenus montrent une transduction des BMDCs par les particules RLPs de 80% à une MOI de 5pg p24/cellule (Figure Xa) et de 90% par les vecteurs ILVs à une MOI de 75 (Figure Xb). Dans les deux cas, les transductions par les particules RLPs ou les vecteurs ILVs mettent en évidence un effet dose. La cinétique de transduction des BMDCs par les particules RLPs montre que la fluorescence reste stable à 4 jours post-transduction (Figure Xc).
La cinétique d'expression de la fluorescence dans les BMDC transduites par le vecteur ILV n'a été regardée que de façon classique pour un vecteur intégratif, à
partir du troisième jour (Figure Xd). En parallèle, l'expression des biomarqueurs spécifiques des DCs murines ne sont pas modifiés après transduction, que ce soit avec les particules RLP (Figure Xe) ou le vecteur ILV (Figure Xf).
2.
Analyse de la toxicité induite par des doses croissantes de RLP et ILV
dans les cellules dendritiques murines (BMDC) Les tests de transductions ont été réalisés sur des cellules dendritiques issues de la moelle osseuse de souris (BMDC) comme précédemment décrit, mais en incluant un marquage spécifique des cellules mortes afin d'évaluer si une toxicité était induite par la transduction à des doses croissantes d'ILV ou de RLP. Les BMDC transduites ont été analysées à J2 sur le pourcentage de cellules viables totales ainsi que sur le pourcentage de cellules exprimant la ZsGreen1 parmi les cellules exprimant le marqueur CD11c spécifique des cellules dendritiques. Les résultats obtenus (Figure XXII) montrent que, 48h après la transduction, l'analyse spécifique de l'expression de la ZsGreen1 dans les BMDC exprimant CD11c montre une transduction par les particules RLPs de 50% des BMDC CD11c+ à partir d'une MOI de 0,5 pg p24/cellule et de 75% par les vecteurs ILVs à une MOI de 75. On observe également un effet dose dans l'analyse de l'intensité de fluorescence exprimées par ces cellules, avec des niveaux équivalents pour les RLP utilisés à MOI 1 pour les ILV ou 5 pg p24/cellule pour les RLP. Enfin, quelle que soit la dose de particules RLP appliquées aux BMDC
(0,1 à
5 pg p24/cellule) on n'observe pas de toxicité significative (viabilité >80%).
Dans les deux cas, les transductions par les particules RLPs ou les vecteurs ILVs mettent donc en évidence la non-toxicité des particules lentivirales sur des cellules primaires et en particulier des CPA.
57 PCT/FR2017/051165 EXEMPLE 2: Efficacité de l'expression de récepteurs ou d'antigènes dans les cellules immunitaires I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA
avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt peut coder un antigène ou un épitope. La séquence d'intérêt peut être un ADNc codant une protéine, par exemple une protéine immunogène ou une protéine immunomodulatrice. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, la séquence utilisée pour exprimer l'antigène peut être entière (Figure Xla) ou partielle (Figure Xlb). D'autres séquences partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées comme celles de gp100 (Figure Xlc) ou de la tyrosinase (Figure Xld). Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV.
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XII). Ce plasmide peut contenir d'autres
58 PCT/FR2017/051165 éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène. Comme précédemment, la séquence d'intérêt peut coder une protéine antigénique entière, un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie.
Par exemple les séquences utilisées pour exprimer MAGEA3 peuvent être entières (Figure Xlla) ou partielles (Figure XI lb). D'autres séquences partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées comme celles de gp100 (Figure XlIc) ou de la tyrosinase (Figure XlId). Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots et titration La production des lots et la titration est effectuée selon le procédé P2, comme décrit à l'Exemple 1, en utilisant l'un des plasmides d'expression suivants :
- pcDNA-EF1.Gène Fluorescent.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure l).
- pILV-EF1.Gène Fluorescent.WPRE (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure IVb).
- pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xla).
- pILV.EF1.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XI la).
La titration des lots est réalisée selon un procédé identique à celui décrit à
l'Exemple 1.
Il. Transduction de cellules dendritiques murines (BMDC) La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1.
59 PCT/FR2017/051165 1. Transduction des cellules dendritiques murines avec un antigène tumoral simple, par un RLP-MAGE A3-IRES-GFP
Les cellules dendritiques transduites par la particule RLP.MAGE A3-IRES-GFP
ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules RLP allant de 0,1 pg p24 à 5 pg p24 et à différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé
avec le milieu contenant uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL
(Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
2. Transduction des cellules dendritiques murines avec un antigène tumoral simple, par un ILV-MAGE A3-IRES-GFP
Les cellules dendritiques transduites par le vecteur ILV-MAGE A3-IRES-GFP
ont fait l'objet d'une mise au point liée à la caractérisation de l'expression de la fluorescence analysée par cytométrie en flux selon une gamme croissante de particules lentivirales ILV allant d'une multiplicité de d'infection MOI de 5 à 75 et à
différents temps d'analyse (1, 2, 3 et 4 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
3. Phénotypage et caractérisation des cellules 3.1 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
Les cellules dendritiques sont phénotypées par immunomarquage avec les anticorps spécifiques suivants conjugués à des fluorochromes : anti-CD11c, anti-0D86,
60 PCT/FR2017/051165 anti-CD80 (Miltenyi Biotec). Pour cela, des mélanges de solution d'anticorps sont réalisés et 50 I par puits sont déposés sur les cellules dendritiques récupérées. Les cellules sont incubées 20 minutes à température ambiante dans le noir. 50111 de PBS
lx pH 7,4, 5% SVF sont ajoutés et les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF. Les cellules sont centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules sont reprises dans 100 I de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et analysées en cytométrie en flux.
3.2 Cytométrie en flux Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB
(Miltenyi Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Présentation du modèle d'étude 1. Modèle tumoral Renca Ce modèle utilise les cellules tumorales du cancer rénal murin (Balb/c) de type Renca. Ces cellules murines sont préalablement transduites avec le vecteur ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP (M01 100) de façon à exprimer l'antigène MAGE A3 qui est d'origine humaine. Le modèle consiste ensuite à réimplanter un nombre prédéfini de ces cellules (1.10e6 cellules) par voie sous cutané, dans le flanc de souris adultes syngéniques Balb/c. Une étude préliminaire a permis de déterminer le nombre de cellules à réimplanter pour générer une tumeur qui se développe chez tous les animaux, et sans atteindre de points limites (tumeur >2mm3, perte de poids des animaux >20% du poids au jour de l'implantation de la tumeur) trop rapidement.
Les animaux proviennent d'un éleveur agréé (Janvier Europe ou Charles River Labs) et le protocole mis en place pour l'ensemble de ces expérimentations a été soumis et approuvé par un comité d'éthique local (comité d'éthique CEEA-122).
2. Réimplantation des cellules dendritiques modifiées Les BMDC sont transduites comme décrit dans l'Exemple 1 (2.4) avec les particules de type RLP (Exemple 1, paragraphe 2.4.1) ou ILV (Exemple 1, paragraphe 2.4.2) et sont réimplantées le lendemain de la transduction chez les souris Balb/c, par
61 PCT/FR2017/051165 voie intra-dermique au niveau du ganglion inguinal situé du même côté que celui de la réimplantation tumorale. Différentes quantités de cellules peuvent être réimplantées pour évaluer leur pouvoir thérapeutique dans ce modèle.
3. Suivi du développement tumoral Tous les animaux sont surveillés quotidiennement pour leur état général. Trois fois par semaine ils sont pesés et on mesure le développement tumoral par mesure manuelle à l'aide d'un pied à coulisse. Le volume tumoral est donné en mm3 selon la formule suivante : V= a*(b2/2) où a=le plus grand diamètre et b=le plus petit diamètre.
Pour des raisons éthiques le développement tumoral est limité à un volume de 2 mm3, les animaux atteignant cette limite ou ayant perdu plus de 20% de leur poids initial (= au jour de la réimplantation des cellules tumorales) sont sacrifiés.
IV. Résultats: Comparaison de l'efficacité de l'expression d'un antigène par RLP et ILV
Une première expérience a été réalisée pour tester l'efficacité de présentation antigénique d'un antigène tumoral (MAGE A3) par des cellules dendritiques murines (BMDC). Des BMDC ont été transduites par des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP
ou un vecteur ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP dans les conditions optimales déterminées par les essais avec la fluorescence ZsGreen1. Une gamme de MOI a été
faite dans les deux cas et les cellules ont été phénotypées le troisième jour pour l'expression des marqueurs spécifiques des cellules dendritiques (Figure XIlla et X111b).
Comme précédemment, ces analyses montrent que le phénotype n'est pas altéré
par la transduction, quelle que soit la MOI appliquée.
Des BMDC transduites par des particules RLP.ZsGreen1 ou RLP.MAGE A3 ont été par ailleurs utilisées pour tester le développement de tumeurs exprimant in vivo, chez la souris Balb/c. Deux groupes de souris ont reçus des cellules tumorales syngéniques de type Renca (0,75x10e6 cellules), elles-mêmes préalablement modifiées pour exprimer l'antigène tumoral MAGE A3 d'origine humaine. Le même jour ces animaux ont reçu par voie intra-dermique, près du ganglion inguinal correspondant, une suspension de BMDC (1x10e5 cellules) modifiées par RLP-ZsGreen1 pour le groupe contrôle ou par RLP.MAGE A3 pour le groupe test. Le suivi du développement tumoral a ensuite montré que les animaux ayant reçu les
62 PCT/FR2017/051165 BMDC.MAGE A3 ne développaient pas de tumeur, à l'inverse des animaux du groupe contrôle (Figure XIV).
EXEMPLE 3 : Efficacité d'une particule lentivirale PP7 (IN)-RLP 2X par modification de l'intéqrase I.
Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA
(Figure XV
ou XXIII) avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 2 répétions du motif tige-boucle de l'ARN PP7 (ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID N 2 et ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID N 3) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur (Figure XV ou XXIII).
Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 (Figure XV ou XXIII) mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt peut être un ADN
codant une protéine reportrice comme la Luciferase Firefly native (Figure XV), une protéine fluorescente verte (ZsGreen1)(Figure XXIII), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP), ou un ADNc codant une protéine, par exemple la protéine CRE. Préférentiellement, l'ADNc code une protéine immunogène ou une protéine immunomodulatrice. La séquence d'intérêt peut également être celle d'un shRNA, d'un miRNA, d'un sgRNA, d'un LncRNA ou d'un circRNA.
= Plasmide d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour contenir au sein de l'intégrase, la séquence de la protéine Coat du bactériophage PP7. Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des particules PP7 (IN)-RLP 2X est modifié selon la stratégie illustrée par la Figure XVI : ce plasmide p8.74 est utilisé pour générer, par PCR d'assemblage, un plasmide sur lequel la protéine Coat du phage PP7 est fusionnée au domaine C terminal de l'intégrase. Cette fusion, obtenue par clonage Hpal, permet de générer le plasmide P8.74- POL-PP7 Coat.
On obtient ainsi la construction dont la cassette d'expression est illustrée en Figure XVII.
La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT).
63 PCT/FR2017/051165 = Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Production, concentration/purification et titration des particules lentivirales Les particules lentivirales sont produites comme décrit à l'Exemple 1, concentrées et purifiées selon le procédé P2. Les particules sont titrées comme décrit à l'Exemple 1.
Il. Transduction de cellules dendritiques murines (BMDC) La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un procédé
identique à celui décrit à l'Exemple 1.
1. Transduction des cellules dendritiques murines avec PP7 (IN)-RLP 2X
Les cellules dendritiques sont transduites par le vecteur PP7 (IN)-RLP.ZsGreen1 comme décrit dans l'exemple 1 (paragraphe 2.4), à une MOI de 1 pg p24 par cellule et analysées sur leur viabilité et l'expression de la fluorescence ZsGreen1 par cytométrie en flux à différents temps d'analyse (1, 2 et 3 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à 41..tg/mL (Sigma).
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée grâce à un immunomarquage spécifique ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) et analysée par cytométrie en flux.
2. Phénotypage et caractérisation des cellules 2.1 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7,4 et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée par immunomarquage spécifique avec le ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) selon un procédé
identique
64 PCT/FR2017/051165 à celui décrit dans l'Exemple 1.
2.2 Cytométrie en flux Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules marquées au ViobilityTM sont mortes, les cellules viables sont donc les cellules négatives (marquage par exclusion).
Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Résultats La Figure XXIV montre la mesure de la viabilité cellulaire et la cinétique d'expression de la ZsGreen1 de BMDC (CPA) transduites avec les particules PP7 (IN)-RLP.ZsGreen1 à une dose de 1pg p24 par cellule. La proportion de BMDC murines transduites avec les particules PP7 (IN)-RLP qui expriment la ZsGreen1 est de 70%, dès 24h post transduction et de façon stable jusqu'à 3 jours. Les cellules restent au même niveau de viabilité sur les 3 jours d'analyse, seule l'intensité
d'expression diminue dans le temps. Il est donc possible de véhiculer des ARN dans les particules lentivirales avec PP7-Coat dans l'intégrase. Préférentiellement, les particules PP7 (IN)-RLP sont utilisées pour véhiculer des ARN portant des séquences antigéniques dans des CPA, telles que les BMDC.
EXEMPLE 4: Mise en évidence du transfert d'ARN codant pour plusieurs antigènes par une particule RLP dans des cellules immunitaires I.
Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides = Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Les plasmides d'expression sont porteurs d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN
MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt
65 peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été
identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, la séquence utilisée pour exprimer l'antigène MAGEA3 peut être entière (Figure Xla) ou partielle (Figure Xlb).
D'autres séquences partielles de biomarqueurs peuvent être utilisées comme celles de gp100 (Figure Xlc) ou de la tyrosinase (Figure Xld). Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisés.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (Figure 11).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (Figure 111).
2. Productions des lots et titration La production des lots et la titration est effectuée selon le procédé P2 décrit à
l'Exemple 1, en utilisant l'un ou plusieurs des plasmides d'expression suivants :
- Lot RLP MAGEA3 :pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X (Figure Xla).
- Lot RLP AATs : pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMageA3.WPRE.MS2 12X
(Figure Xlb) + pcDNA.EF1long.PPRV.PS-Aggp100.WPRE.MS2 12X
(Figure Xlc) +pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X
(Figure Xld).
- Lot RLP.ZsGreen1 : pcDNA. EF1.Gène Fluorescent. MS2 12X (Figure 1).
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide d'expression ou des plasmides d'expression (dans le cas du RLP-AATs), 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
Il. Transduction de CPA
1. Lignée U937 (ATCC CRL-1593.2 Tm) La lignée cellulaire U937 est une lignée cellulaire établie à partir du lymphome histiocytique d'un homme de 37 ans et qui présente de nombreuses caractéristiques de monocytes. C'est un modèle très utilisé pour les études in vitro sur la différenciation des monocytes et des macrophages. Les cellules U937 sont cultivées dans des flasques de cultures Ultra Low Attachement (ULA) à 100 000 cellules par ml de milieu
66 PCT/FR2017/051165 RPMI 1640 en présence de 10% de Serum de Veau Foetal (SVF), 1%
Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-glutamine (=milieu RPMI complet).
1.1 Transduction des cellules U937 avec des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP
ou des particules contenant un mélange de 3 antigènes tumoraux (RLP-AATs) Le jour de la transduction, les cellules sont récupérées et comptées. Elles sont resuspendues pour obtenir une suspension cellulaire à 500 000 cellules/mi dans de milieu. Les ensemencements en prévision de la transduction sont réalisées en plaque 24 puits ULA, à raison de 5000 par puits et en triplicate.
Les cellules sont transduites en milieu de culture RPMI complet supplémenté
avec les agents de transfection suivants : Polybrene à 16pg/mL et BX795 1,2pM et incubées à
+37 C / 5% CO2 pendant 4 heures. 5000 des milieux de transduction sont ajoutés à
chaque puits correspondant, pour lesquels les agents de transfection se retrouvent à
une concentration finale de 8pg/mL de Polybrene et 0,6pM de BX795.
5 heures après la transduction, 8000 du milieu de transduction (80%) sont retirés et remplacés par 8000 de milieu de culture RPMI complet.
1.2 Récupération des cellules 5 heures et 20 heures post-transduction, les cellules sont resuspendues et prélevées en tube de 15 ml, puis centrifugées à 200g pendant 5 minutes pour les culoter. Le surnageant est rejeté et les cellules sont lavées dans 1 ml de PBS
1X avant d'être à nouveau centrifugées à 200g pendant 5 minutes. Le surnageant est rejeté et le culot cellulaire est resuspendu dans 1 ml de Trypsine 0,05%-0,53mM EDTA
(Corning).
Les cellules sont incubées 5 minutes à 37 C. A la fin de l'incubation, 2 ml de milieu de culture RPMI complet sont ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont centrifugées à 200g, pendant 5 minutes, puis le surnageant est rejeté et les cellules sont lavées avec 1 ml de PBS 1X avant d'être une dernière fois centrifugées à
200g, pendant 5 minutes. Le surnageant est rejeté et les cellules sont congelées immédiatement à -80 C sous forme de culots secs.
1.3 Extraction des ARN totaux Chaque culot sec est déposé sur la glace pour une décongélation lente. 1m1 de solution de Trizol est ajouté à chaque culot sec à température ambiante et les cellules sont incubées 5 minutes avant d'y ajouter 200p1 de Chloroforme. Les échantillons sont homogénéisés par 10 retournements et incubées 2-3 minutes à température ambiante.
67 PCT/FR2017/051165 Les échantillons sont centrifugés à 12000g, pendant 15 minutes, à +4 C. A la fin de la centrifugation, les échantillons sont déposés sur la glace. La phase supérieure est transférée dans un nouveau tube (500-600p1). Un volume équivalent d'éthanol à

est ajouté puis les échantillons sont homogénéisés à l'aide d'un vortex.
La purification des ARN totaux se fait selon le protocole du kit "RNA
purification mini kit" (Ambion). L'élution se fait dans 30p1 de solution d'eau purepar échantillon. Le dosage des ARNs des échantillons se fait par utilisation du Nanodrop puis les échantillons sont stockées à -80 C.
1.4 Retro-Transcription des ARNs La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée sur 500ng d'ARN de chaque échantillon par l'utilisation de l'enzyme "Maxima First Strand"
(ThermoFisher), en suivant les recommandations du fournisseur.
1.5 Amplification des ADNc par RT-qPCR
Les amplifications se font sur 5p1 d'ADNc dilué au 1/10ème dans de l'eau ultrapure, avec le mix de PCR en temps réel, SYBR@Premix Ex Taq (Takara ¨ cat RR420L), en présence de 200nM d'oligonucléotides sens et antisens dans un volume final de 200.
A chaque puits, on ajoute 5p1de cDNA dilué au 1/10ème.
La PCR en temps réel est réalisée avec un thermocycleur StepOnePlus (Applied Biosystems) avec la chimie SYBR Green selon le protocole suivant : 1 cycle de secondes à 95,0 C puis 40 cycles comprenant 5 secondes à 95,0 C et 30 secondes à
60,0 C.
Les oligonucléotides Sens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-S (GACAAGCTTCCCGTTCTCAG) (SEQ ID N 4) - Q-MAGEA3-F (CTGCCGACCACCATGAACTA) (SEQ ID N 5) - Q-PSMAGEDC-F (TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA) (SEQ ID N 6) - Q-PSTyrDC-F (ATGAGCCAGGTGCTTAACAACA) (SEQ ID N 7) - Q-PSGP100DC-F (TGGCGCCTCAGCACTCTT) (SEQ ID N 8) Les oligonucléotides AntiSens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-AS (GAGTCAACGGATTTGGTCGT) (SEQ ID N 9) - Q-MAGEA3-R (GGTTGCTGGAGTCCTCATAGGA) (SEQ ID N 10) - Q- PSMAGETyrDC-R (GGTAGGCAATGAGGACGATGA) (SEQ ID N 11) - Q-PSGP100DC-R (ACCTGGTCCATGATGGTGAAG) (SEQ ID N 12)
68 PCT/FR2017/051165 Les associations des couples d'oligonucléotides à utiliser sont les suivantes selon les cibles :
- Cible hGAPDH avec Q-hGAPDH-S et Q-hGAPDH-AS
- Cible MAGEA3 avec Q-MAGEA3-F et Q-MAGEA3-R
- Cible PS-MAGEDC avec Q-PSMAGEDC-F et Q-PSMAGETyrDC-R
- Cible PS-TyrDC avec Q-PSTyrDC-F et Q-PSMAGETyrDC-R
- Cible PS-Gp100DC avec Q-PSGP100DC-F et Q-PSGP100DC-R
Des expériences de validation de la spécificité des oligonucléotides ont été
menées préalablement.
2. Préparation des cellules dendritiques humaines immatures (iDC
également appelée hDC) La préparation des cellules dendritiques humaines immatures (hDC) est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1 (partie II, 2.1).
2.1. Transduction des cellules dendritiques humaines avec des particules RLP.ZsGreen1, RLP.MAGE A3 ou des particules contenant un mélange de 3 antigènes tumoraux (RLP-AATs) La transduction des hDC est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (partie II, paragraphe 2.3). Les cellules sont transduites avec 4 pg de p24/cellule et sont analysées à différents temps (5h, 20h post-transduction).
Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont analysées le jour de la transduction et aux différents temps d'analyse, par RT-qPCR sur les ARN issus de culots de cellules transduites.
2.2. Récupération des cellules 5 heures et 20 heures post-transduction, les surnageants de culture sont retirés des puits contenant les hDC qui sont adhérées au plastique de culture. Celles-ci sont lavées avec 0,5 ml de PBS 1X, qui est ensuite retiré. Les cellules reçoivent alors 0,25 ml de Trypsine 0,05 /0-0,53mM EDTA (Corning) et sont incubées 2 minutes à 37 C. A
la fin de l'incubation, 0,25 ml de milieu de culture RPMI complet sont ajoutés et les hDC sont récupérées par grattage du puits. Les cellules sont centrifugées à
200g pendant 5 minutes. Les puits sont lavés avec 0,5 ml de PBS 1X qui servent à
69 PCT/FR2017/051165 resuspendre les culots de hDC après centrifugation. La totalité des hDC ainsi récoltée est à nouveau centrifugée 5 minutes à 200g. Le surnageant est rejeté et les cellules sont lavées une dernière fois avec 0,5 ml de PBS 1X avant d'être centrifugées à 200g pendant 5 minutes. Le surnageant est rejeté et les cellules sont congelées immédiatement à -80 C sous forme de culots secs.
2.3. Extraction des ARN totaux La préparation des ARN est effectuée selon un procédé identique à celui décrit dans ce même exemple en 11.1.3 avec le kit "RNA purification mini kit"
d'Ambion.
L'élution se fait dans 30p1 de solution d'eau pure par échantillon. Le dosage des ARNs des échantillons se fait par utilisation du Nanodrop puis les échantillons sont stockées à -80 C.
2.4. Retro-Transcription des ARNs La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée sur 500ng d'ARN selon le procédé décrit dans ce même exemple en 11.1.4.
2.5. Amplification des ADNc par RT-qPCR
L'amplification des ADNc par RT-qPCR est réalisée selon le procédé décrit dans ce même exemple au paragraphe 11.1.5.
III. Résultats L'analyse spécifique par RT-qPCR permet de mettre en évidence le transfert d'ARN codant pour les 3 antigènes (PS-MAGEA3, PS-GP100 et PS-TYR) par des particules RLP dans des CPA, en particulier dans des cellules U937 et dans des cellules dendritiques humaines, à 5h et 20h post-transduction (respectivement Figures XXVI et XXVII, XXIX et XXX). Les résultats obtenus sont analysés et interprétés selon la présence ou non d'une amplification spécifique et significative au cours de la PCR
quantitative en temps réel (RT-qPCR).
Les résultats montrent que les différents ARNs contenus dans les particules, qu'ils soient d'un seul type comme c'est le cas pour les particules RLP-MAGE A3 (Figures XXV et XXVIII) ou de trois types différents, comme pour les particules RLP-AATs (figures XXVI, XXVII et XXIX, XXX), sont donc bien transférés dans les CPA par les
70 PCT/FR2017/051165 particules RLP. Dans le cas de la lignée cellulaire U937, les quantités relatives des différents ARNs sont significatives dès 5h post transduction (Figure XXVI) et elles augmentent à 20h post-transduction (Figure XXVII). Dans le cas des cellules primaires hDC, les niveaux d'ARN spécifiques relatifs sont significatifs à 20h (Figure XXX) même s'ils sont moins importants à 5h (Figure XXIX). Les particules RLP sont donc efficaces pour le transfert dans des CPA (lignées et cellules primaires) de molécules d'ARNs codant pour différents peptides antigéniques. Ceci constitue un avantage thérapeutique dans l'efficacité du traitement par les cellules immunitaires modifiées, en particulier des CPA. Les particules RLP s'inscrivent donc dans une stratégie d'immunothérapie, basée sur une modulation de la spécificité de la réponse immune.
EXEMPLE 5: Evaluation de l'efficacité d'une particule RLP pour l'expression d'antigènes multiples I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2RLP selon l'invention = Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Les plasmides d'expressions sont porteurs d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN, telles que décrites en Figures Xllb, XlIc et XlId. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été
identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
71 PCT/FR2017/051165 l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV
= Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide .. d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt. La séquence du gène d'intérêt peut être par exemple celle d'un rapporteur fluorescent (Figure IVb), ou bien celle d'un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, les séquences utilisées pour exprimer MAGEA3 peuvent être entières (Figure Xlla) ou partielles (Figure XlIb). D'autres séquences partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées comme celles de gp100 (Figure XlIc) ou de la tyrosinase (Figure XlId).
Beaucoup d'autres exemples de séquences complètes ou partielles de biomarqueurs tumoraux peuvent être utilisées. Ce plasmide peut contenir d'autres éléments comme la séquence native WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou encore la séquence cPPT/CTS. La pathogénicité virale est éliminée par la substitution de régions du génome viral requises pour la réplication rétrovirale par le transgène.
= Plasmide d'encapsidation : Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol) est utilisé
pour la production des vecteurs lentiviraux intégratifs (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être par exemple la séquence du gène VSV-G
codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots et titration La production des lots est effectuée selon le procédé P2, comme décrit à
l'Exemple 1, en utilisant l'un des plasmides d'expression suivants :
- Lot RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr, également appelé RLP-AATs :
pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xlb) +
pcDNA.EF1long.PPRV.PS-Aggp100.WPRE.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xlc) +
72 PCT/FR2017/051165 pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xld).
- Lot RLP. MAGEA3.IRES.GFP, également appelé RLP-MAGEA3 :pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X
(dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xla).
- Lot ILV.EF1.PS-MAGEA3/Gp100/Tyr, également appelé ILV-AATs :
pILV.EF1.PS-AgMAGEA3.WPRE (figure XlIb) + pILV.EF1.PS-Aggp100.WPRE (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XlIc) + pILV.EF1.PS-AgTyrosinase.WPRE (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XlId).
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% du plasmide d'expression ou des plasmides d'expression (dans le cas du RLP-AATs ou ILV-AATs), 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
La titration des lots est réalisée selon le procédé identique à celui décrit à
l'Exemple 1.
Il. Description des modèles utilisés 1. Modèles cellulaires 1.1 Modèle tumoral Renca Ce modèle est celui décrit dans l'Exemple 2, pour lequel on utilise les cellules tumorales Renca qui auront été préalablement transduites à MOI 100 avec le vecteur ILV.EF1.PS-MAGEA3/Gp100/Tyr contenant un mélange des 3 plasmides d'expression dont les cassettes d'expression sont telles que décrites aux Figures Xllb, c et d de façon à exprimer de façon stable les peptides antigéniques MAGE A3, gp100 et tyrosinase, tous les trois d'origine humaine. Le modèle consiste ensuite à
réimplanter 0,75.106 de ces cellules par voie sous cutané dans le flanc de souris adultes syngéniques de fond BALB/c. Les animaux proviennent d'un éleveur agrée (Janvier Europe) et le protocole mis en place pour l'ensemble de ces expérimentations a été
soumis et approuvé par un comité d'éthique local (comité d'éthique CEEA-122).
Tous les animaux sont surveillés quotidiennement pour leur état général. Deux fois par semaine, ils sont pesés et le développement tumoral est mesuré
manuellement à l'aide d'un Caliper. Le volume tumoral est donné en mm3 selon la formule suivante :
V= a*(b2/2) où a=le plus grand diamètre et b=le plus petit diamètre.
73 PCT/FR2017/051165 1.2 Préparation des cellules lymphocytaires murines Les lymphocytes murins sont préparés à partir de rate de souris BALB/c sauvage ou de souris ayant développé une tumeur de type Renca >1 mm3. La rate est récupérée après euthanasie de l'animal par dislocation cervicale. Elle est dissociée mécaniquement par écrasement sur un tamis cellulaire de 70 m. La suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes à 300 g, à +4 C. Le culot cellulaire est ensuite repris dans 10m1 de tampon MACS froid, la suspension filtrée sur un tamis cellulaire de 40 lm posé sur un tube de 50 ml puis une numération cellulaire est réalisée.
La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300 g, à +400 avant de procéder à
un tri positif sur l'expression du marqueur CD8 selon un procédé identique à
celui décrit à l'Exemple 1. La fraction positive est récupérée par un lavage de la colonne de tri hors de l'aimant, avec 1 ml de tampon MACS. Cette fraction est complétée à
5 ml avec du tampon MACS froid puis une numération cellulaire est réalisée. La suspension cellulaire est centrifugée 10 minutes à 300g, à +4 C et les cellules sont resuspendues à une concentration de 1.106 cellules par ml en PBS 1X.
1.3 Marquage CFSE des splénocytes murins CD8+ triés Les lymphocytes T CD8+ issus du tri des splénocytes murins sont marqués au Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CellTrace TM
CFSE dye, In Vitrogen/thermoFisher Scientific) selon le procédé suivant : une suspension cellulaire à
1.106 cellules par ml est préparée dans du PBS 1X. La solution stock de CFSE
est à
1mM dans du DMSO, et 2 1 de cette solution par ml de suspension cellulaire sont ajoutés de façon à obtenir des lymphocytes marqués à 2 M. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20mn à 37 C, à l'abri de la lumière. La réaction est arrêtée en diluant les cellules 5 fois dans du RPMI supplémenté à 1% de Sérum de Veau Foetal et en incubant à nouveau la suspension 5 mn. La suspension cellulaire est ensuite centrifugée 5 minutes à 300 g, à température ambiante et les cellules resuspendues à
une concentration de 1.6.106 cellules par ml en milieu RPMI 1640 supplémenté à
10%
de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine pour être co-cultivées à différents ratios avec des BMDC murines, dans une plaque 96 puits à
fonds plats type ULA (Corning). Après marquage, les lymphocytes T CD8+ ainsi obtenus sont analysés par cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) en présence d'un anticorps anti-CD8 pour contrôler la pureté de la population triée et le marquage CFSE
(Figure XVIII).
74 PCT/FR2017/051165 1.4 Préparation des cellules dendritiques murines La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1.
2. Transduction des cellules immunitaires et analyse de la réponse proliférative 2.1 Transduction des cellules dendritiques murines (BMDC) avec des particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou des particules RLP.AATs contenant un mélange de 3 antigènes tumoraux (RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr) Au 7eme jour de culture les cellules dendritiques BMDC sont transduites par les particules RLP.MAGE A3. I RES.G FP ou par les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr (mélange des 3 plasmides d'expression dont les cassettes d'expression sont telles que décrites aux Figures Xlb, c et d) à raison de 3 pg p24 par cellule. Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
Les cellules dendritiques sont phénotypées le jour de la transduction et 24h plus tard par immunomarquage avec des anticorps spécifiques anti-CD11c, anti-0D86, anti-CD80 (Miltenyi Biotec) et caractérisées par cytométrie en flux.
2.2 Co-culture des lymphocytes T CD8+ marqués CFSE avec les BMDC
synciéniques Les lymphocytes T CD8+ marqués CFSE, issus des souris BALB/c sauvage ou ayant développé une tumeur Renca, sont cultivées en présence de BMDC murines syngéniques transduites soit avec les particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP, soit avec les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr, ou bien avec des BMDC non transduites.
Deux ratios ont été testés dans le cas des co-cultures avec les BMDC
transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3./Gp100/Tyr: 1 BMDC pour 2 lymphocytes T CD8+
(1DC:2T) ou 1 BMDC pour 4 lymphocytes T CD8+ (1DC:4T).
Le ratio entre lymphocytes T CD8+ et les BMDC transduites avec les particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP est de 1 BMDC pour 2 lymphocytes T CD8+ (1DC:2T). Ces co-cultures sont faites dans un volume final de 200111 de milieu RPMI 1640 supplémenté à 10% de Sérum de Veau Foetal, 1% Pénicilline/Streptomycine, 2mM L-Glutamine, dans une plaque 96 puits à fonds plats de type ULA (Corning). Les BMDC
sont incubées à raison de 40 000 cellules par puits et le nombre de lymphocytes T
75 PCT/FR2017/051165 CD8+ varie donc de 80 000 à 160 000 cellules par puits.
2.3 Analyse de la réponse proliférative des lymphocytes T CD8+
Cinq jours après la mise en co-culture, les mélanges de cellules sont récupérés des plaques de culture pour être transférés dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique afin d'être marquées pour les analyses par cytométrie en flux. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7,4, 5% SVF et centrifugées à
300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement. Les cellules lymphocytaires sont analysée par immunomarquage avec un anticorps anti-CD8 conjugué à un fluorochrome (Miltenyi Biotec) selon le procédé décrit précédemment dans l'Exemple 1. Les cellules sont reprises dans 100111 de PBS 1X pH 7,4, 5%
SVF et analysées en cytométrie en flux, à la fois selon leur expression pour le marqueur CD8 (ce qui permet de les discriminer des BMDC toujours présentes dans les suspensions) et l'expression du CFSE, dont le niveau de fluorescence relative est divisé
par deux à
chaque division cellulaire, ce qui permet donc de quantifier la réponse proliférative des cellules.
La Figure XIX montre les profils d'expression du CFSE obtenus avec des lymphocytes T CD8+ cultivés seuls ainsi que ceux obtenus après les 5 jours de co-culture avec les BMDC non transduites ou transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr.
2.4 Cytométrie en flux Les cellules lymphocytaires immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec). Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB
(Miltenyi Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
Il. Résultats Dans ces expériences, des BMDC non transduites, transduites par les particules RLP.MAGE A3.IRES.GFP ou transduites par les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr ont été co-cultivées à différents ratios avec des lymphocytes T
triés en fonction de leur expression du marqueur CD8 spécifique des lymphocytes T
suppresseurs -impliqués dans la mise en place de la réponse tumorale- et préalablement marqués au CFSE. La Figure XVIII valide la pureté des cellules issues des rates des souris sauvages et tumorales (expression du marqueur CD8 dans toute
76 PCT/FR2017/051165 la population), ainsi que le marquage au CFSE à JO. La figure XIX montre que les lymphocytes T CD8+ marquées au CFSE co-cultivées pendant 5 jours avec des BMDC

(ratio DC:2T) répondent en proliférant. Ceci se traduit en cytométrie par une diminution de l'intensité de fluorescence du marquage CFSE vers la gauche, sur un ou plusieurs pics. L'analyse porte sur le pourcentage de cellules dans ces pics. Les profils montrés sont représentatifs de 3 expériences. La réponse des lymphocytes T CD8+
provenant d'une souris sauvage est similaire qu'elles soient en contact avec des BMDC
transduites ou non transduites. Ce phénomène s'explique par le fait que des lymphocytes naïfs mis en contact avec des cellules dendritiques sont capables de proliférer, même en l'absence d'antigène (Q. Ge et al. PNAS. 2002 99(5) : 2983-2988).
Au contraire, les lymphocytes T CD8+ issus d'une souris ayant développé une tumeur Renca exprimant les 3 antigènes tumoraux (MAGE A3/gp100/Tyr) répondent peu aux BMDC non transduites. Ils répondent de façon spécifique lorsqu'ils sont à
nouveau exposés aux antigènes exprimés par la tumeur, lors de la co-culture avec les BMDC
transduites par les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr (31,42% des cellules prolifèrent dans ce cas, contre 14,94% seulement face aux BMDC non transduites). Il a été montré que certains facteurs produits par la tumeur (IL-10, PGE2) peuvent conduire à la mise en place d'un phénomène d'anergie des lymphocytes T in vivo (M.
Ahmadi et al. Cancer Res. 2008 September 15; 68(18): 7520-7529). Ceci explique pourquoi ces lymphocytes T CD8+ prolifèrent beaucoup moins que les lymphocytes T
CD8+ naïfs lorsqu'ils sont exposés à des BMDC non transduites.
En contrôle, les lymphocytes T CD8+ marquées au CFSE cultivées seules pendant les 5 jours, sans être exposées à des cellules dendritiques, ne prolifèrent pas et leur profil d'expression du CFSE est alors similaire à celui observé à JO
(Figure XVIII). Les profils sont identiques quelle que soit l'origine des lymphocytes (souris sauvage ou tumorale).
La Figure XX montre l'analyse de la réponse proliférative des lymphocytes T
CD8+ co-cultivés avec des BMDC transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3 /Gp100/Tyr, par rapport à la réponse de ces mêmes lymphocytes T CD8+ co-cultivées avec des BMDC non transduites. Les analyses ont été faites sur 3 co-cultures différentes avec des lymphocytes T CD8+ issues de trois souris sauvages ou de trois souris ayant développée une tumeur Renca et des BMDC provenant également de 3 cultures différentes. Les réponses des lymphocytes T CD8+ ont été analysées à
partir de co-cultures à un ratio 1DC:2T ou à un ratio 1DC:4T. La réponse proliférative relative est donnée par le ratio du pourcentage de cellules proliférant en réponse aux BMDC
77 PCT/FR2017/051165 transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr par rapport au pourcentage des cellules répondant de façon non spécifique aux BMDC non transduites. Les résultats montrent que les lymphocytes T CD8+ issus des souris ayant développé une tumeur Renca exprimant les 3 antigènes associés aux tumeurs (AATs) humaines répondent spécifiquement à une nouvelle stimulation par ces AATs (2,67 pour les co-cultures 1DC:2T et 3.90 pour les co-cultures 1DC:4T) alors que les lymphocytes T CD8+ issus de souris naïves répondent de façon similaire aux BMDC
transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr (1.59 pour les co-cultures 1DC:2T et 1.78 pour les co-cultures 1DC:4T).
Enfin, la Figure XXI compare les réponses prolifératives relatives de lymphocytes T CD8+ co-cultivées dans la condition 1DC:2T avec des BMDC
transduites par des particules RLP.MAGEA3.IRES.GFP ou bien transduites par les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr. Comme présenté en figure XX, ces analyses montrent que les lymphocytes T CD8+ issues de de souris ayant développé une tumeur Renca portant les 3 AATs répondent de façon plus importante que les lymphocytes T CD8+ issues de souris sauvages aux BMDC transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr. De plus, elles répondent spécifiquement à
des BMDC transduites avec des particules portant un seul de ces antigènes (MAGE
A3).
L'ensemble de ces résultats montrent que les BMDC transduites avec les particules RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr sont donc bien capables de présenter les peptides antigéniques correspondant aux 3 AATs (MAGE A3, gp100 et tyrosinase).

Les molécules d'ARN correspondants aux 3 peptides sont donc pris en charge par la machinerie cellulaire spécifique aux cellules présentatrices d'antigènes qui présentent ces peptides en surface suffisamment longtemps et efficacement pour que les lymphocytes T CD8+ qui les rencontrent puissent être activés.
Les approches de vaccination par les cellules dendritiques transduites avec des particules d'ARN s'avèrent particulièrement intéressantes, une expression constante du ou des antigènes n'est pas nécessaire pour induire et maintenir une population de cellules T mémoires (MJ. Bevan and AW. Goldrath. Curret Biology. 2000, 10 :R338-R340).
EXEMPLE 6 : Mise en évidence du transfert d'ARN codant pour un antigène et une protéine immunomodulatrice par une particule RLP dans des cellules immunitaires et efficacité de la particule RLP
78 PCT/FR2017/051165 I.
Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides = Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression promoteur-séquence d'intérêt-polyA avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 12 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN
MS2 (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag, SEQ ID N 1) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur. Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 mais d'autres promoteurs peuvent être utilisés. La séquence d'intérêt peut coder un antigène ou un épitope. De nombreux biomarqueurs ont été
identifiés sur les cellules tumorales et leur séquence complète et/ou des séquences partielles sont utilisées en immunothérapie. Par exemple, la séquence utilisée pour exprimer l'antigène MAGEA3 peut être entière (Figure Xla) ou partielle (Figure Xlb). La séquence d'intérêt peut également coder pour une protéine immunomodulatrice, comme une cytokine ou une interleukine telle que l'IL-12 par exemple.
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots et titration La production des lots et la titration est effectuée selon le procédé P2, comme décrit à l'Exemple 1, en utilisant les plasmides d'expression suivants :
- Lot RLP-PS-MAGEA3/IL-12 . pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X linéaire (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure Xlb) et pcDNA.EF1.1L12b-linker-DeltalL12a.MS2 12X (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XXXI).
Les proportions respectives des plasmides sont les suivantes: 40% des plasmides d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV.
79 PCT/FR2017/051165 Il. Transduction de cellules du système immunitaire 1. Lignée U937 (ATCC CRL-1593.2 Tm) La lignée cellulaire U937 a été cultivée dans les conditions décrites dans l'exemple 4 (II.paragraphe 1).
1.1. Transduction des cellules U937 avec des particules contenant un mélange d'un antigène tumoral et d'une protéine immunomodulatrice (RLP-PS-MAGEA3/1L-12) Les transductions des cellules U937 sont réalisées selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.paragraphe 1.1).
1.2. Récupération des cellules 5 heures et 20 heures post-transduction, les cellules sont récupérées et traitées selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.paragraphe 1.2).
1.3. Extraction des ARN totaux Chaque culot sec est traité selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.
paragraphe 1.3) pour extraire et purifier les ARN totaux.
1.4. Retro-Transcription des ARNs La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II.paragraphe 1.4).
1.5. Amplification des ADNc par RT-qPCR
Les amplifications se font sur 5p1 d'ADNc dilué au 1/10eme dans de l'eau ultrapure, avec le mix de PCR en temps réel, SYBR@ Premix Ex Taq (Takara ¨ cat RR420L), en présence de 200nM d'oligonucléotide sens et antisens dans un volume final de 20111. A chaque puits, on ajoute 5p1d'ADNc dilué au 1/10ème.
La PCR en temps réel est réalisée avec un thermocycleur StepOnePlus (AppliedBiosystems) avec la chimie SYBR Green selon le protocole suivant : 1 cycle de 30 secondes à 95,0 C puis 40 cycles comprenant 5 secondes à 95,0 C et 30 secondes à 60,0 C.
Les oligonucléotides Sens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-S (GACAAGCTTCCCGTTCTCAG) (SEQ ID N 4)
80 PCT/FR2017/051165 - Q-PSMAGEDC-F (TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA) (SEQ ID N 6) - Q-IL12ap35-F (CGGATCTAGGGTCATTCCAGTCT) (SEQ ID N 13) Les oligonucléotides AntiSens utilisés sont :
- Q-hGAPDH-AS (GAGTCAACGGATTTGGTCGT) (SEQ ID N 9) - Q- PSMAGETyrDC-R (GGTAGGCAATGAGGACGATGA) (SEQ ID N 11) - Q- IL12ap35-R (GTTTTTCTCTGGCCGTCTTCA) (SEQ ID N 14) Les associations des couples d'oligonucléotides à utiliser sont les suivantes selon les cibles :
- Cible hGAPDH avec Q-hGAPDH-S et Q-hGAPDH-AS
- Cible PS-MAGEDC avec Q-PSMageDC-F et Q-PSMAGETyrDC-R
- Cible IL12ap35 avec Q- IL12ap35-F et Q- IL12ap35-R
Des expériences de validation de la spécificité des oligonucléotides ont été
menées préalablement.
2. Préparation des cellules dendritiques humaines immatures (hDC) La préparation des cellules dendritiques humaines immatures est effectuée selon un procédé identique à celui décrit à l'Exemple 1 (partie 11, paragraphe 2.1).
2.1 Transduction des cellules dendritiques humaines avec des particules contenant un mélange d'un antigène tumoral et d'une protéine immunomodulatrice (RLP-PS-MAGEA3/I L-12) La transduction des cellules dendritiques humaines est effectuée selon un procédé
identique à celui décrit à l'Exemple 1 (partie 11, paragraphe 2.3). Les cellules sont transduites avec 4 pg de p24/cellule et sont analysées à différents temps (5h, 20h post-transduction).
Un contrôle négatif de transduction est préparé avec le milieu contenant uniquement l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma). Les cellules dendritiques sont analysées le jour de la transduction et aux différents temps d'analyse, par RT-qPCR sur les ARN issus de culots de cellules transduites.
2.2. Récupération des cellules Pour l'analyse de l'expression en ARN, la récupération des cellules dendritiques humaines aux différents temps après transduction est réalisée selon le protocole décrit dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.2). Les cellules sont congelées à -80 C
sous forme de culots secs. Pour l'analyse de la sécrétion d'IL12, les surnageants de culture
81 PCT/FR2017/051165 cellulaire sont prélevés aux temps 20h et 48h post-transduction.
Les surnageants sont conservés à -20 C
2.3. Extraction des ARN totaux La préparation des ARN est effectuée selon un procédé identique à celui décrit dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.3).
2.4. Retro-Transcription des ARNs La retro-transcription des ARNs en ADN complémentaire est réalisée sur 500ng d'ARN selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.4).
2.5. Amplification des ADNc par RT-qPCR
L'amplification des ADNc par RT-qPCR est réalisée selon le procédé décrit dans l'Exemple 4 (II. paragraphe 2.5).
2.6. Test ELISA pour la sécrétion d'1 L12 Le test ELISA pour la quantification de la sécrétion d'IL12 dans les surnageants de culture cellulaire est réalisé selon le protocole fourni avec le kit Human Standard ABTS ELISA Development Kit (Peprotech).
III. Résultats :
L'analyse spécifique par RT-qPCR permet de mettre en évidence le transfert d'ARN codant pour un antigène et une protéine immunomodulatrice, par des particules RLP dans des CPA, en particulier dans des cellules U937 et dans des cellules dendritiques humaines immatures (hDC), à 5h et 20h post-transduction (respectivement Figures XXXII et XXXIII, XXXIV et XXXV). Les résultats obtenus sont analysés et interprétés selon la présence ou non d'une amplification spécifique et significative au cours de la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR). Les résultats sont normalisés par rapport aux valeurs obtenues pour les cellules contrôles non transduites (U937 NT et hDC NT). Ces contrôles expriment de l'ARN endogène codant pour l'IL12 (résultats non montrés). Il est connu que les cellules dendritiques produisent de l'1 L12, lequel joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T
in vivo.
Dans le cas de la lignée cellulaire U937, les quantités relatives des différents ARNs sont significatives à 5h post transduction (Figure XXXII) et à 20h post-transduction (Figure XXXIII).
82 PCT/FR2017/051165 Dans le cas des cellules primaires hDC, les niveaux d'ARN spécifiques relatifs sont significatifs à 20h (Figure XXXV) même s'ils sont moins importants à 5h (Figure XXXIV). Enfin, l'analyse des surnageants de culture par ELISA (Figure XXXVI) met en évidence une forte augmentation des niveaux d'IL12 sécrétés par les hDC, 48h après transduction par les particules RLP-PS-MAGEA3/IL-12.
Les particules RLP sont donc efficaces pour le transfert dans des CPA (lignées et cellules primaires) de différentes molécules d'ARNs codant pour un peptide antigénique et pour une protéine immuno-modulatrice comme l'IL-12. Les particules RLP s'inscrivent donc dans une stratégie d'immunothérapie, basée sur une modulation de la spécificité de la réponse immune, par le transfert dans des CPA d'ARNs codant pour des antigènes et pour des protéines immunomodulatrices .
Il est donc possible de moduler finement la réponse immmunitaire. D'une part au niveau de sa spécificité, via l'utilisation de particules RLP contenant des ARNs codant pour différents antigènes comme montré dans l'Exemple 4, et d'autre part en combinant cette stratégie à l'induction de réponses stimulantes par une protéine immunomodulatrice. Le fait de délivrer en même temps dans les cellules cibles ex vivo ou in vivo à la fois des antigènes et des immunomodulateurs en une seule intervention fournit donc un avantage clinique conséquent.
EXEMPLE 7 : Efficacité d'une particule lentivirale PP7 (NC)-RLP dans des cellules immunitaires I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Le plasmide d'expression est porteur d'une cassette d'expression telle que décrite en Figure XXIII avec ou non une séquence intronique ou stabilisatrice d'ARN. Afin de véhiculer les ARNm dans les particules lentivirales, 2 répétitions du motif tige-boucle de l'ARN PP7 :
séquence ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID N 2) suivie de la séquence ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag (SEQ ID N 3) ont été insérées au sein d'une cassette d'expression en aval du gène rapporteur (Figure XXIII).
Le promoteur utilisé peut être celui du CMV ou EF1 (Figure XXIII). La séquence d'intérêt peut être un ADN codant une protéine reportrice comme la Luciferase Firefly
83 PCT/FR2017/051165 native (Figure XV), une protéine fluorescente verte (ZsGreen1), rouge (mCherry) ou bleue (mtBFP), ou un ADNc codant une protéine, par exemple protéine CRE.
Préférentiellement, l'ADNc code une protéine immunogène ou une protéine immunomodulatrice. La séquence d'intérêt peut également être celle d'un shRNA, d'un miRNA, d'un sgRNA, d'un LncRNA ou d'un circRNA.
= Plasmide d'encapsidation : La particule lentivirale a été modifiée pour contenir au sein de la protéine de nucléocapside, en lieu et place du second domaine en doigt de Zn, la séquence de la protéine Coat du bactériophage PP7 (Figure XXXVII). Le plasmide d'encapsidation p8.74, porteur des gènes codant les protéines de structures et de fonction (Gag, Pol), utilisé pour la production des particules PP7RLP est modifié selon la stratégie suivante : ce plasmide p8.74 est utilisé
pour générer, par PCR d'assemblage, un plasmide dépourvu du second doigt de zinc de la protéine de nucléocapside p8.74.82F. Le second doigt de zinc est substitué par la protéine Coat du phage MS2 par clonage Hpal, pour générer le plasmide p8.74.82F-PP7-Coat. La séquence codant Pol peut être délétée ou mutée dans certains éléments de fonction comme par exemple la séquence codant la transcriptase inverse (RT) ou l'intégrase (IN) sans altérer la fonction des PP7RLP.
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Production, concentration/purification et titration des particules lentivi raies Les particules lentivirales sont produites comme décrit à l'Exemple 1, selon le procédé P2, en utilisant le plasmide d'expression pcDNA-EF1.RapporteurFluorescent.PP7 2X décrit en Figure XXIII.
Il. Transduction de cellules dendritiques murines (BMDC) La préparation des cellules dendritiques murines est effectuée selon un procédé
identique à celui décrit à l'Exemple 1.
1. Transduction des cellules dendritiques murines avec PP7 (NC)-RLP.ZsGreen1
84 PCT/FR2017/051165 Les cellules dendritiques sont transduites par le vecteur PP7 (NC)-RLP.ZsGreen1 comme décrit dans l'Exemple 1 (II, paragraphe 2.4), à une dose de pg p24 par cellule et analysées sur leur viabilité et l'expression de la fluorescence ZsGreen1 par cytométrie en flux à différents temps d'analyse (1, 2 et 3 jours post-transduction). Un contrôle négatif de transduction est préparé avec uniquement le milieu contenant l'agent de transduction Polybrene à 4pg/mL (Sigma).
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée grâce à un immunomarquage spécifique ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) et analysée par cytométrie en flux.
2. Phénotypage et caractérisation des cellules 2.1 Immunomarquaqe des cellules dendritiques murines A chaque temps d'analyse, les cellules sont transférées dans les puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique. Les cellules sont lavées avec une solution de PBS 1X pH 7,4 et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé par retournement.
La viabilité des cellules dendritiques est réalisée par immunomarquage spécifique avec le ViobilityTM 485/520 (Miltenyi Biotec) selon un procédé
identique à celui décrit dans l'exemple 1 au paragraphe 11.3.3.
2.2 Cytométrie en flux Les cellules dendritiques immunomarquées sont analysées en cytométrie en flux (Miltenyi Biotec) et analysées. Les échantillons ont été calibrés selon leur taille (SSC) et leur granulosité (FSC). Les cellules marquées au ViobilityTM sont mortes, les cellules viables sont donc les cellules négatives (marquage par exclusion).
Les cellules sont caractérisées sur le MacsQuantVYB (Miltenyi Biotec) et analysées avec le logiciel MacsQuant (Miltenyi Biotec).
III. Résultats: Cinétique d'expression de la ZsGreen1 et viabilité des BMDC
La Figure XXXVIII montre que les BMDC murines transduites avec 1pg p24/cellule de particules PP7 (NC)-RLP expriment la ZsGreen1 pour 50% d'entre elles dès 24h post transduction. Trois jours post transduction les BMDC sont moins viables, 20% seulement d'entre elles expriment la ZsGreen1 et à une intensité de fluorescence plus faible. Cela s'explique du fait que les particules PP7(NC)-RLP se produisent à des concentrations inférieures en comparaison avec les particules MS2RLP ou PP7 (IN)-
85 PCT/FR2017/051165 RLP et la transduction des BMDC à des doses équivalentes nécessite donc d'utiliser de plus gros volumes de suspension lentivirales lesquels diluent d'autant le milieu de culture contenant les nutriments vitaux aux cellules. Cela est encore plus notable pour la culture de cellules primaires sensibles comme le sont les BMDC murines. Il reste néanmoins possible de véhiculer des ARN dans les particules lentivirales modifiées avec PP7-Coat dans la nucléocapside.
EXEMPLE 8 : Impact du précurseur GAG-POL sauvage pour la production des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X en vue de l'optimisation des particules MS2RLP, PP7RLP et/ou PP7 (IN)-RLP
I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production d'une particule lentivirale MS2RLP selon l'invention = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est identique à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure l).
= Plasmides d'encapsidation : Ces plasmides sont identiques à ceux décrits à
l'Exemple 1 : p8.7432F-MS2-Coat (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure Il) et le plasmide p8.74 (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure V) = Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
1.2 Plasmides pour la production de vecteurs lentiviraux intégratifs ILV
= Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est identique à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure IVb).
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure V).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
2. Productions des lots 2.1 Production des particules lentivirales et des vecteurs lentiviraux
86 PCT/FR2017/051165 Les productions sont réalisées en CelISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning) avec des cellules de production HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par 1% pénicilline/streptomycine et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37 C en atmosphère humide à 5% CO2 La production des particules MS2RLP est réalisée par transfection des quatre plasmides suivants :
- Le plasmide d'expression décrit ci-avant, dont la cassette d'expression est illustrée en Figure I ;
- p8.74.82F-MS2-Coat (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure II) et le plasmide p8.74 (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure V), en utilisant quatre ratios différents des deux plasmides d'encapsidation, respectivement [100% - 0%] ; [90% - 10%] ; [80% - 20%] et [50% - 50%] ;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure III).
Les particules lentivirales MS2RLP-ZsGreen1 12X sont produites comme décrit à
l'Exemple 1, c'est-à-dire avec les proportions respectives des plasmides suivantes:
40% du plasmide d'expression, 30% du plasmide p8.74 (ou p8.74AZF), 30% du plasmide pENV (ratio [100% - 0%]).
- Plus particulièrement, les proportions respectives des plasmides sont les suivantes:
- - ratio [90% - 10%]
:40% du plasmide d'expression, 27% du plasmide p8.74AZF, 3% du plasmide p8.74, 30% du plasmide pENV;
- - ratio [80% - 20%] :
40% du plasmide d'expression, 24% du plasmide p8.74AZF, 6% du plasmide p8.74, 30% du plasmide pENV
- - ratio [50% - 50%] :
40% du plasmide d'expression, 15% du plasmide p8.74AZF, 15% du plasmide p8.74, 30% du plasmide pENV.
Dans le cas d'une production de particules lentivirales RLP-AATs, les proportions de plasmides décrites ci-avant restent inchangées.
24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les cellules de production sont incubées à 37 C / 5% 002. Après changement du milieu, le surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection).
Chaque récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être microfiltrée sur
87 PCT/FR2017/051165 filtre de 0,45 m (Stericup , Millipore). Toutes les récupérations sont alors mélangées pour composer le surnageant brut.
Les vecteurs lentiviraux intégratifs ILV-ZsGreen1 contenant la cassette d'expression EF1-ZsGreen1 sont produits en contrôle, tel que décrit à
l'Exemple 1.
2.2 Concentration et purification des particules lentivirales Les particules lentivirales et les vecteurs lentiviraux sont concentrés et purifiés selon le procédé P1 décrit à l'Exemple 1.
3. Titration Les particules lentivirales et les vecteurs lentiviraux sont titrés comme décrit dans l'Exemple 1.
Il. Transduction 1. Préparation des cellules cibles Jurkat et transduction par des particules lentivirales MS2RLP 12X selon l'invention Des cellules cibles Jurkat (ATCC TIB-152) sont ensemencées à 200000 cellules/mL en plaque 96 puits, transduites par les particules MS2RLP selon deux doses (2 et 10 pg p24/cellule), ou par des vecteurs lentiviraux contrôles ILV-ZsGreen1 à M0140, en présence de 41..tg/mL Polybrene puis incubées à 37 C / 5% CO2. Un inhibiteur des mécanismes de défense cellulaire, le BX795 (lnvivogen), est utilisé à une concentration de 6 1.1M dans le cas des particules MS2RLP. Le surnageant de transduction est éliminé 5 heures après et remplacé par du milieu de culture supplémenté frais. 24h post-transduction, les cellules cibles sont récupérées et le pourcentage de cellules exprimant la ZsGreen1 est quantifié par cytométrie (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
2. Analyse de la maturation des particules virales MS2RLP par Western blot anti-p24 48h après la transfection des cellules de production (HEK293T) avec les plasmides de production des particules MS2RLP, les surnageants de cultures sont récupérés puis concentrés selon le procédé Pi, tel que décrit à l'Exemple 1, et titrés par quantification de la protéine p24, tel que décrit à l'Exemple 1.
L'équivalent de 15ng de p24 sont chargés pour chaque condition de ratio des plasmides p8.74.82F-MS2-
88 PCT/FR2017/051165 Coat/p8.74 sur un gel dénaturant SDS-PAGE 4/12% puis migrés 1h à 200V en tampon MOPS1X. Après transfert sur membrane de nylon, les protéines sont hybridées avec un anticorps anti-p24 (clone 39/5.4A, Abcam). Le western blot est révélé à
l'aide du kit PierceTM Fast Western Blot Kit, ECL Substrate (Pierce). La visualisation des bandes est réalisée par chimioluminescence sur film d'autoradiographie.
III. Résultats Cet exemple vise à montrer qu'il est possible d'améliorer la fonctionnalité
des particules MS2RLP et PP7RLP pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et pour une protéine immunomodulatrice. Ceci passe par l'amélioration de la maturation du précurseur GAG
lors de la production des particules, démontré par la preuve de concept sur la production de particules MS2RLP. Le plasmide p8.74.82F-MS2 permet l'expression d'un précurseur GAG comportant la protéine Coat du bactériophage à la place du second doigt de Zinc de la protéine Nucléocapside. Cette protéine Coat est susceptible de perturber la maturation du précurseur GAG, lorsqu'il est clivé en trois protéines : la protéine de Matrice, la protéine de Capside et la protéine de Nucléocapside.
Ces trois protéines sont indispensables à la structure des particules virales.
L'apport du précurseur GAG sauvage, par le plasmide p8.74 en plus du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat lors de la production des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X pourrait permettre d'augmenter la maturation du précurseur GAG
lorsqu'il est exprimé grâce au plasmide p8.74.82F-MS2, et ainsi, augmenter la fonctionnalité des particules MS2RLP et PP7RLP.
L'objectif de cette expérience est d'évaluer l'impact du plasmide p8.74 lorsqu'il est co-transfecté, dans les cellules de production des particules MS2RLP et PP7RLP, en même temps que le plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat permettant d'améliorer la maturation du précurseur GAG, et ainsi rendre les particules finales plus fonctionnelles pour la transduction de cellules cibles.
Dans cet exemple, quatre ratios de plasmides d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat/p8.74 sont testés : 100/0; 90/10; 80/20 et 50/50. Un vecteur intégratif ILV
exprimant la ZsGreen1 est utilisé comme contrôle. Les cellules sont transduites selon deux quantités de p24/m1 : 2 pg p24/cellule (Figure XXXIX) et 10 pg p24/cellule (Figure XXXX).
Dans un premier temps, les résultats présentés sur la Figure XXXIX montrent
89 PCT/FR2017/051165 que pour les cellules non transduites, le pourcentage de cellules fluorescentes est très proche de 0, alors que les cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X sont fluorescentes à plus de 99% quelque soit le ratio de plasmides d'encapsidation utilisé. Il est important de noter que l'intensité de fluorescence de la ZsGreen1 augmente en fonction de l'augmentation de la quantité du plasmide p8.74.
Les cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X produites avec 50%
du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat et 50% du plasmide p8.74 présentent une intensité de fluorescence de 7,76 alors que celle des cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X produites uniquement avec le plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat est de 3,5.
La Figure XXXX montre le même résultat en termes de pourcentage de cellules transduites. Concernant l'intensité de fluorescence, plus la quantité de plasmide p8.74 augmente, et plus l'intensité de fluorescence augmente, comme montré en Figure XXXIX. Les cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X
produites avec 50% du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat et 50% du plasmide p8.74 présentent une intensité de fluorescence de 60,67 alors que celle des cellules transduites par les particules MS2RLP-ZsGreen1 12X produites uniquement avec le plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat est de 11,48.
Cela signifie qu'aux doses de 2pg et 10pg p24/cellule, la fluorescence obtenue est respectivement deux et cinq fois plus importante lorsque les particules sont produites avec 50% du plasmide d'encapsidation p8.74.82F-MS2-Coat et 50% du plasmide p8.74 que lorsqu'elles sont produites uniquement avec le plasmide p8.7432F-MS2-Coat.
L'utilisation du plasmide p8.74 lors de la production de particules MS2RLP, en co-transfection avec le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat, a donc apporté un gain sur l'amélioration de la fonctionnalité des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X, en vue d'une optimisation des particules MS2RLP pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et pour une protéine immunomodulatrice.
La Figure XXXXI montre la maturation des particules MS2RLP-ZsGreen1 12X
sur le plan biochimique, par recherche de la protéine p24 dans le surnageant de production contenant les particules. Elle correspond à une analyse des surnageants viraux par western blot anti-p24, selon deux temps d'exposition du film d'autoradiographie, une minute (Figure XXXXIa) et quinze secondes (Figure XXXXIb).
Dans le cas d'une particule lentivirale intégrative dérivée de HIV, produite
90 PCT/FR2017/051165 uniquement avec le plasmide p8.74 en tant que plasmide d'encapsidation, la protéine p24 est détectable à quatre niveaux :
- dans le précurseur protéique p160 (GAG-POL) - dans le précurseur protéique p55 (GAG), - à l'état de protéine mature (p24) - dans d'autres précurseurs protéiques intermédiaires en cours de maturation (entre p160 et p55, et entre p55 et p24).
Si la maturation se fait normalement, la protéine p24 doit être détectée en quantité plus importante à l'état mature (p24) qu'à l'état de précurseurs protéiques (p160, p55) ou de précurseurs protéiques intermédiaires. En effet, la maturation des particules virales se fait après la libération de la particule par la cellule de production.
Autrement dit, lors de leur production, les particules bourgeonnent à la surface de la cellule de production, puis sont libérées de la cellule à l'état de particules immatures.
Ce n'est qu'après la libération des particules dans le surnageant, que les précurseurs protéiques GAG-POL et GAG maturent en protéines définitives.
Dans le cas d'une particule MS2RLP ou PP7RLP dérivée de HIV, produite uniquement avec le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat en tant que plasmide d'encapsidation, la protéine p24 est détectable à quatre niveaux :
- dans le précurseur protéique p172 (GAG.82F-MS2-Coat-POL) - dans le précurseur protéique p67 (GAG.82F-MS2-Coat), - à l'état de protéine mature (p24) - dans d'autres précurseurs protéiques intermédiaires en cours de maturation (entre p172 et p67, et entre p67 et p24).
Dans cette particule MS2RLP-ZsGreen1 12X, chaque précurseur est plus lourd de 12kDa, ce qui correspond à la taille de la protéine Coat du bactériophage M52 insérée dans le second doigt de zinc de la protéine Nucléocapside.
La figure XXXXI montre, sur la piste ILV, les différentes formes de précurseurs protéiques, p160 (GAG-POL), p55 (GAG) ainsi que la protéine p24 parfaitement mature. Il y a une majorité de protéine p24 mature, comparée aux formes précurseurs protéiques. Sur la piste 100/0, correspondant à des particules MS2RLP-ZsGreen1 produites uniquement avec le plasmide p8.74.82F-MS2-Coat en tant que plasmide d'encapsidation, la proportion de précurseurs/protéine p24 mature augmente par rapport à l'ILV, montrant que l'insertion de la protéine Coat du bactériophage diminue la maturation des particules virales. Sur les pistes 90/10, 80/20 et 50/50, la proportion de précurseurs protéiques p172 et p67 diminue au profit respectivement des
91 PCT/FR2017/051165 précurseurs protéiques p160 et p55, pour arriver à un même niveau d'expression pour la piste 50/50. L'ajout du plasmide p8.74 au plasmide p8.7432F-MS2-Coat, en tant que plasmide d'encapsidation pour la production de particules a pour conséquence l'augmentation de la proportion de la protéine p24 mature (Figure XXXXIb, 15 secondes d'exposition). Ce résultat montre que pour favoriser la maturation des précurseurs protéiques dans les particules MS2RLP, il est possible de rajouter au moins 10% de plasmide p8.74 en plus du plasmide p8.7432F-MS2-Coat en tant que plasmide d'encapsidation pour la production de particules. La production des particules MS2RLP utilisant au moins 10% de plasmide p8.74 en plus du plasmide p8.74.82F-MS2-Coat en tant que plasmide d'encapsidation permet non seulement une augmentation de la maturation des précurseurs en protéines matures, mais en plus permet d'augmenter la fonctionnalité des particules après transduction de cellules cibles.
En conclusion, l'utilisation du plasmide p8.74 lors de la production de particules selon l'invention, en co-transfection avec le plasmide p8.7432F-MS2-Coat permet l'optimisation des particules selon l'invention pour le transfert d'ARN
codants pour des antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et pour une protéine immunomodulatrice.
EXEMPLE 9: Recrutement d'ARN non viraux dirigé par deux séquences d'encapsidation différentes (MS2 et PP7) en vue de l'optimisation du transfert efficace d'ARN codants pour des antigènes différents ou pour le transfert d'ARN
codants pour des antigènes et pour une protéine immunomodulatrice, par une particule RLP (modulation des types d'ARN encapsidés) I. Préparation de la particule virale selon l'invention et des systèmes comparatifs 1. Constructions des plasmides 1.1 Plasmides pour la production de particules lentivirales MS2/PP7-(NC) RLP
12X 2X selon l'invention = Plasmides d'expression d'une séquence d'intérêt : Ces plasmides sont identiques à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure I) et à l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XXIII).
= Plasmides d'encapsidation : Ces plasmides sont identiques à celui décrit à
92 PCT/FR2017/051165 l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II) et à
l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XXXVI I).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III).
Préférentiellement, ces plasmides sont utilisés pour la production de particules lentivirales MS2/PP7-RLP-mCherry 12X- ZsGreen1 2X.
1.2 Plasmides pour la production de particules lentivirales contrôles MS2-(NC) RLP 12X selon l'invention = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est identique à celui décrit à l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure l).
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure II).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 1 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure III).
Préférentiellement, ces plasmides sont utilisés pour la production de particules lentivirales MS2RLP-mCherry 12X.
1.3 Plasmides pour la production de particules lentivirales contrôles PP7-(NC) RLP
2X selon l'invention = Plasmide d'expression d'une séquence d'intérêt : Ce plasmide est identique à celui décrit à l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XXIII).
= Plasmide d'encapsidation : Ce plasmide est identique à celui décrit à
l'Exemple 7 (dont la cassette d'expression est telle que décrite en Figure XXXVI I).
= Plasmide de l'enveloppe (pENV) : Ce plasmide est porteur du gène codant une protéine d'enveloppe, qui peut être la VSV-G codant la protéine d'enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (Figure III).
Préférentiellement, ces plasmides sont utilisés pour la production de particules lentivirales PP7RLP-ZsGreen1 2X.
2. Productions des lots Après la transfection des plasmides sur des cellules de production, les
93 PCT/FR2017/051165 surnageants sont récoltés et utilisés bruts ou concentrés/purifiés selon l'un des procédés P1 ou P2 mentionnés précédemment et décrits dans la demande WO
2013/014537.
2.1 Production des particules lentivirales Les productions sont réalisées en CelISTACK 10 étages (6360 cm2, Corning) avec des cellules de production HEK293T (ATCC, CRL-11268), cultivées dans Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Paisley, UK) supplémenté par 1% pénicilline/stréptomycine et 1% d'ultraglutamine (PAA) à 37 C en atmosphère humide à 5% CO2 La production des particules lentivirales MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X, préférentiellement MS2/PP7-RLP-mCherry 12X- ZsGreen1 2X, est réalisée par transfection des cinq plasmides suivants :
- Les deux plasmides d'expression décrits ci-avant dont le plasmide pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure I) et le plasmide pcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure XXIII) utilisés en quantité simple ou double;
- p8.74.82F-PP7-Coat (50%) dont la cassette d'expression est illustrée en Figure XXXVII et p8.7432F-MS2-Coat (50%) dont la cassette d'expression est illustrée en Figure II;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G dont la cassette d'expression est illustrée en Figure III.
La production des particules lentivirales contrôles MS2-(NC) RLP 12X, préférentiellement MS2-RLP-mCherry 12X, est réalisée par transfection des trois plasmides suivants :
- Le plasmide d'expression décrit ci-avant pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X
(dont la cassette d'expression est illustrée en Figure I) ;
-p8.74.82F-MS2-Coat dont la cassette d'expression est illustrée en Figure II ;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G dont la cassette d'expression est illustrée en Figure III.
La production des particules lentivirales contrôles PP7-(NC) RLP 2X, préférentiellement PP7-RLP-ZsGreen1 2X, est réalisée par transfection des trois plasmides suivants :
- Le plasmide d'expression décrit ci-avant pcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X
94 PCT/FR2017/051165 (dont la cassette d'expression est illustrée en Figure XXIII);
- p8.74.82F-PP7-Coat dont la cassette d'expression est illustrée en Figure XXXVII ;
- pENV portant l'enveloppe VSV-G dont la cassette d'expression est illustrée en Figure III.
24 heures après transfection standard au phosphate de calcium, le surnageant de culture est remplacé par du milieu DMEM frais et non supplémenté. Les cellules de production sont incubées à 37 C / 5% 002. Après changement du milieu, le surnageant est collecté quatre fois (32h, 48h, 56h et 72h post transfection).
Chaque récupération est clarifiée par centrifugation 5min à 3000g avant d'être microfiltrée sur filtre de 0,45 m (Stericup , Millipore). Toutes les récupérations sont alors mélangées pour composer le surnageant brut.
2.2 Concentration et purification des particules lentivirales Les particules lentivirales sont concentrées et purifiées selon le procédé P1 décrit à l'Exemple 1.
3. Titration des lots de particules lentivirales Les particules lentivirales sont titrées comme décrit dans l'Exemple 1.
4. Transduction par des particules lentivirales MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X
selon l'invention Cet exemple est réalisé en utilisant des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X
permettant le transfert de plusieurs types d'ARNs et donc l'expression de plusieurs protéines différentes (ZsGreen1 + mCherry).
Des cellules cibles HCT116 (ATCC, COL-247) sont ensemencées en plaque 24 puits et incubées 24h à 37 C / 5% CO2 et ont été transduites par les particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X à une dose de 10pg p24/ce11u1e.
Les contrôles réalisés sont les suivants :
- Transduction avec les particules lentivirales MS2RLP-mCherry 12X et PP7RLP-ZsGreen1 2X, à une dose de 10pg p24/ce11u1e chacune ;
- Transduction avec les particules lentivirales MS2RLP-mCherry 12X
seul, à
une dose de 10pg p24/ce11u1e ;
-Transduction avec les particules lentivirales PP7RLP-ZsGreen1 2X seul, à
une dose de 10pg p24/ce11u1e.
95 PCT/FR2017/051165 La transduction par les particules lentivirales est réalisée en présence de 81..tg/mL de Polybrene . Un inhibiteur des mécanismes de défense cellulaire, le BX795 (Invivogen), est utilisé à une concentration de 6 1.1M dans le cas des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X, MS2RLP-mCherry 12X et PP7RLP-ZsGreen1 2X. Les cellules cibles sont récupérées à 48h post-transduction et le pourcentage de cellules exprimant la ZsGreen1 et la mCherry est quantifié par cytométrie (Macs Quant VYB, Miltenyi Biotec).
Il. Résultats La Figure XXXXII illustre l'efficacité des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X
pour le transfert d'ARN encapsidés par les séquences d'encapsidation provenant des bactériophages MS2 et PP7 dans des cellules cibles HCT116. La Figure montre que la proportion de cellules bifluorescentes est de 97% après transduction des particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X et de 98% après transduction des particules MS2RLP-mCherry 12X et PP7RLP-ZsGreen1 2X à 20pg p24/cellule. On observe donc le même ordre d'efficacité de transduction avec les particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X
2X, pour une dose deux fois moins importante de MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X.
Les cellules cibles transduites par les particules MS2RLP-mCherry 12X seules ou PP7RLP-ZsGreen1 2X seules présentent un pourcentage d'efficacité de transduction similaire au pourcentage obtenu après transduction des cellules cibles par les particules MS2/PP7-(NC) RLP 12X 2X pour une seule protéine fluorescente. Les résultats montrent donc que les particules RLP sont capables de transporter et de transférer au moins 2 types d'ARN encapsidés par deux systèmes différents (PP7 et MS2) en une seule transduction des cellules cibles.
La mise en évidence de la capacité de transfert de différents types d'ARN
dirigés par deux séquences d'encapsidation différentes, MS2 et PP7, en une seule transduction d'un même lot de RLP représente un gain significatif sur la modulation des types d'ARN encapsidés, en particulier pour le transfert efficace d'ARN
codants pour des antigènes différents ou pour le transfert d'ARN codants pour des antigènes et pour une protéine immunomodulatrice.

Claims (22)

REVENDICATIONS
1. Particule rétrovirale comportant une protéine issue de la polyprotéine Gag, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou dans l'intégrase, et l'une au moins dédites séquences d'intérêt des ARN non viraux encapsidés comporte une partie codant pour au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope.
2. Particule rétrovirale selon la revendication 1, comportant une protéine de nucléocapside, une protéine d'enveloppe, optionnellement une intégrase et au moins deux ARN non viraux encapsidés, les ARN non viraux encapsidés comportant chacun une séquence d'ARN d'intérêt liée à une séquence d'encapsidation, chaque séquence d'encapsidation étant reconnue par un domaine de liaison introduit dans la protéine de nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
3. Particule rétrovirale selon la revendication 2, dans laquelle les séquences d'intérêt des au moins deux ARN non viraux encapsidés sont identiques.
4. Particule rétrovirale selon la revendication 2, dans laquelle les au moins deux ARN non viraux encapsidés se distinguent par leur séquence d'ARN.
5. Particule selon la revendication 4, dans laquelle la séquence d'intérêt de l'autre ARN non viral encapsidé code pour une protéine immunomodulatrice.
6. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, comportant en outre un troisième ARN non viral encapsidé.
7. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le au moins un épitope et/ou au moins une structure moléculaire reconnaissant spécifiquement un épitope est immunogène.
8. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans la protéine de nucléocapside, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
9. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle le domaine de liaison est introduit dans l'intégrase, un second domaine de liaison pouvant être introduit dans la nucléocapside et/ou dans l'intégrase.
10. Particule rétrovirale selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, laquelle est une particule lentivirale.
11. Particule lentivirale selon la revendication 10, dans laquelle :
- le domaine de liaison est la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de MS2, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV
appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du bactériophage MS2.
12. Particule lentivirale selon la revendication 10, dans laquelle :
- le domaine de liaison est la séquence de la protéine Coat du phage PP7, - la séquence d'encapsidation des ARN non viraux est une séquence tige-boucle de PP7, - la protéine de nucléocapside est la protéine de nucléocapside (NC) de HIV
appartenant à la polyprotéine Gag, laquelle NC est mutée au niveau du second doigt de zinc afin d'insérer la séquence de la protéine Coat du bactériophage PP7.
13. Composition comportant des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Kit de production de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comportant :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase, chimérique, comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
15. Kit de production selon la revendication 14, comportant en outre un second plasmide d'encapsidation codant pour :

- une protéine issue de la polyprotéine Gag sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une protéine issue de la polyprotéine Gag chimérique, et/ou - une intégrase sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une intégrase chimérique.
16. Procédé de fabrication d'un kit selon la revendication 14, comportant :
(i) la préparation d'un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation (ii) la préparation d'un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et (iii) la préparation d'un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
17. Procédé de fabrication des particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comportant une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins une séquence d'intérêt, pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine issue de la polyprotéine Gag et/ou une intégrase chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître une séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe.
et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
18. Procédé de fabrication des particules selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, comportant une étape de co-transfection de cellules avec :
(i) un plasmide d'expression comportant au moins deux séquences d'ARN
non virales différentes, chaque séquence d'ARN comportant une séquence d'intérêt pour laquelle en amont ou en aval de cette séquence d'intérêt est insérée une séquence d'encapsidation, ou alternativement un premier et un second plasmide d'expression comportant chacun une séquence d'intérêt en amont ou en aval de laquelle est insérée une séquence d'encapsidation, (ii) un plasmide d'encapsidation codant pour une protéine de nucléocapside chimérique comportant un domaine de liaison permettant de reconnaître la séquence d'encapsidation, et, (iii) un plasmide d'enveloppe codant pour une protéine d'enveloppe, et la récupération du surnageant des cellules transfectées comportant les particules.
19. Procédé de fabrication selon la revendication 17 ou 18, dans lequel le surnageant est clarifié, puis éventuellement concentré et/ou purifié.
20. Procédé de fabrication selon l'une quelconque des revendications 17 à
19, dans lequel l'étape de co-transfection est réalisée en outre avec un second plasmide d'encapsidation codant pour :
- une protéine issue de la polyprotéine Gag sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une protéine issue de la polyprotéine Gag chimérique, et/ou - une intégrase sauvage, lorsque le premier plasmide d'encapsidation code pour une intégrase chimérique.
21. Composition susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 17 à 20.
22. Utilisation d'une particule selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ou d'une composition selon la revendication 13 ou 21 pour transduire des cellules du système immunitaire.
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