JP2019514413A - 特に免疫応答に関与する細胞への、rnaの転移のためのウイルス粒子 - Google Patents

特に免疫応答に関与する細胞への、rnaの転移のためのウイルス粒子 Download PDF

Info

Publication number
JP2019514413A
JP2019514413A JP2018559309A JP2018559309A JP2019514413A JP 2019514413 A JP2019514413 A JP 2019514413A JP 2018559309 A JP2018559309 A JP 2018559309A JP 2018559309 A JP2018559309 A JP 2018559309A JP 2019514413 A JP2019514413 A JP 2019514413A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
protein
cells
plasmid
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2018559309A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019514413A5 (ja
JP6916209B2 (ja
Inventor
ブイユ パスカル
ブイユ パスカル
デュトワ クリスティーヌ
デュトワ クリスティーヌ
ラムールー ルシール
ラムールー ルシール
Original Assignee
フラッシュ セラピューティクス
フラッシュ セラピューティクス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR1654333A external-priority patent/FR3051197B1/fr
Application filed by フラッシュ セラピューティクス, フラッシュ セラピューティクス filed Critical フラッシュ セラピューティクス
Publication of JP2019514413A publication Critical patent/JP2019514413A/ja
Publication of JP2019514413A5 publication Critical patent/JP2019514413A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6916209B2 publication Critical patent/JP6916209B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46Cellular immunotherapy
    • A61K39/461Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615Dendritic cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46Cellular immunotherapy
    • A61K39/462Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622Antigen presenting cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46Cellular immunotherapy
    • A61K39/464Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643Vertebrate antigens
    • A61K39/4644Cancer antigens
    • A61K39/464454Enzymes
    • A61K39/464456Tyrosinase or tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46Cellular immunotherapy
    • A61K39/464Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643Vertebrate antigens
    • A61K39/4644Cancer antigens
    • A61K39/464484Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464486MAGE
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46Cellular immunotherapy
    • A61K39/464Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643Vertebrate antigens
    • A61K39/4644Cancer antigens
    • A61K39/46449Melanoma antigens
    • A61K39/464492Glycoprotein 100 [Gp100]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08RNA viruses
    • C07K14/15Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/161HIV-1 ; HIV-2 gag-pol, e.g. p55, p24/25, p17/18, p7, p6, p66/68, p51/52, p31/34, p32, p40
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53DNA (RNA) vaccination
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/70Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/85Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16023Virus like particles [VLP]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00Bacteriophages
    • C12N2795/00011Details
    • C12N2795/18011Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111Leviviridae
    • C12N2795/18122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00Nucleic acids vectors
    • C12N2800/24Vectors characterised by the absence of particular element, e.g. selectable marker, viral origin of replication
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50Vectors for producing vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y207/00Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスRNAの前記目的の配列の少なくとも1つが、少なくとも1つのエピトープ及び/又はエピトープを特異的に認識する少なくとも1つの分子構造をコードする部分を含む、レトロウイルス粒子に関する。

Description

本発明は、標的細胞への非ウイルスRNAの転移のためのレトロウイルスシステム、及びより具体的には複数のRNAを送達することができるレトロウイルス粒子に関する。本発明はまた、これらレトロウイルス粒子を含有する組成物、レトロウイルスを生産するためのキット、関連する製造方法、並びに粒子及び組成物の使用に関する。
標的細胞への複数のRNAの導入は、遺伝子治療における研究開発の主要な課題である。
ウイルスに由来するベクターの使用は、遺伝子導入のための重要な方法となっている。現在、ウイルスベクターは、以下の2つの主要なカテゴリーに分類することができる:
−受容者のゲノム中に組み込む、組み込みベクター、並びに
−通常染色体外遺伝エレメントを形成する、非組み込みベクター。
組み込みベクター、例えばガンマ−レトロウイルスベクター(RV)及びレンチウイルスベクター(LV)は安定に組み込まれる。非組み込みベクター、例えばアデノウイルスベクター(ADV)及びアデノ随伴ベクター(AAV)は、急速に分裂する細胞から迅速に排除される。特定のベクターの選択に影響を与える特定の要因は、そのカプシド形成能力、その標的又は宿主細胞の範囲、その遺伝子発現プロファイル、その形質導入効率、及び反復した形質導入が必要である場合に特に問題となるその免疫応答を誘導するための能力を含む。
遺伝子治療又は多くのインビトロ、エクスビボ及びインビボ用途におけるような特定の用途は、非組み込みベクターの使用を必要とする。例として、以下のものが挙げられる:
・多能性細胞に特殊化した細胞の再プログラミングの誘導、並びに特殊化細胞への幹細胞又は多能性細胞の分化の誘導,
・標的細胞における同時の、抗原又はタンパク質(毒性又は非毒性)の発現、
・ゲノム工学システムの発現、例えば、CRE若しくはTALENタンパク質又はCRISPRシステム、あるいはタンパク質又はRNA発現を必要とする任意の他のシステムの発現。
標的細胞内にRNAを導入する1つの方法は、レトロウイルス科(Retroviridae)(レトロウイルスファミリー又はRNAウイルスとも称される)に属するウイルスに基づくウイルスベクターを用いる。実際に、その複製サイクル中に、レトロウイルス科のウイルスは、RNAによって構成されたそのゲノムを二本鎖DNAへと変換する能力を有し、この二本鎖DNAは、標的細胞のゲノムに組み込まれることになる。このレトロウイルスのファミリーの具体例は、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスである。
レトロウイルスの複製サイクルは、膜受容体への結合を介した標的(又は宿主)細胞の第1認識フェーズを含む。この認識フェーズは、膜融合後に、宿主細胞へのレトロウイルスの侵入をもたらす。次に、レトロウイルスRNAは、レトロウイルスによってコードされた逆転写酵素によって二本鎖DNAへとコピーされ、次に宿主細胞のゲノムに組み込まれる。次に、このウイルスゲノムは、細胞の他の全ての遺伝子と同様に、宿主細胞によって転写される。このゲノムは、他のウイルスの産生を可能にするタンパク質及び配列の全てをコードしている。
より具体的には、3つの遺伝子:gag、pol及びenv、が全てのレトロウイルスに共通している。
Gagはポリタンパク質をコードする遺伝子であり、切断によってこのポリタンパク質に由来するタンパク質は、複製時にウイルスの構築に関与する構造タンパク質である。これら構造タンパク質は、より具体的には、マトリックスタンパク質(MA)、カプシドタンパク質(CA)及びヌクレオカプシドタンパク質(NC)である。
Polは、酵素のインテグラーゼ、逆転写酵素及びプロテアーゼをコードする遺伝子である。
Envは、エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子である。
したがって、これら3つの遺伝子は、レトロウイルスRNAを二本鎖DNAへとコピーし、このDNAを宿主細胞のゲノムに組み込み、次に、新たに合成されたレトロウイルスの構造:エンベロープ、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質、を生成することを可能にする。しかしながら、新たに合成されたレトロウイルスが完全であるためには、これら構造のそれぞれにおいてレトロウイルスRNAの2つのコピーをカプシド形成することが必要である。この構造におけるレトロウイルスRNAの2つのコピーのカプシド形成は、レトロウイルスRNAのコピーによって運ばれるPsi(「パッケージングシグナル(Packaging Signal)」に関する)と呼ばれるカプシド形成配列のヌクレオカプシドタンパク質による認識によって行われる。
レトロウイルスに由来するウイルスベクターが遺伝子治療の目的で使用される場合、gag、pol及び/又はenvのコード領域の少なくとも1つの部分が、カプシド形成システムと目的の配列の発現システムとの間で解離する。コード配列gag及びpolは、例えば、ウイルスベクターの産生に必要なタンパク質をtransで提供するカプシド形成プラスミドによって運ばれる。カプシド形成配列及び目的の配列は、レトロウイルスを非複製にするために、独立したシステムによって運ばれる。
しかしながら、特定の場合には、宿主細胞のゲノムへのランダムな目的のRNA配列の組み込みは、オープンリーディングフレームを阻害し、かつ重要な遺伝子の発現をブロックし得る。また、特定の用途、例えば細胞の再プログラミング、ゲノム編集又は幹細胞分化のために、目的の配列の発現が一過性に行われることが推奨される。
国際公開第2007/072056号の出願は、ウイルスベクターシステムについて記載しており、斯かるウイルスベクターシステムは、env、gag、任意によりgag/pol並びに、gag又はgag/polと関連した対応するRNA結合ドメインによって認識される異種カプシド形成シグナルを含むRNA配列を含む。このシステムは、一過性発現を可能にする非組み込み型であるとして、当該出願に記載されている。
しかしながら、そのようなシステムの有効性は依然として限定されている。特に、標的細胞がこれらシステムによって運ばれる目的のRNAを発現するためには、一般に、細胞にこの目的のRNAのいくつかのコピーを導入し、その結果、高い感染多重度(multiplicities of infection)(MOI)を使用することが必要である。MOIは、導入されるベクターシステムの数と、感染されることになる細胞の数との比に対応する。高いMOIは実際に、細胞に目的のRNAのいくつかのコピーを導入することを可能にし、1つの同じ細胞がいくつかの感染を受けることを可能にする。現在、運ばれる目的のRNAの発現レベルを改善することは可能であるが、細胞が受ける複数の感染のために、高いMOIの使用はいくらかの毒性も生じる。
RNA転移のためのこのタイプのシステムはまた、免疫療法、特に抗腫瘍免疫療法に興味深い。
抗腫瘍免疫療法は、腫瘍細胞を根絶するための免疫系に基づく治療戦略である。新しいアプローチは、免疫応答を誘導し、標的化を改善するために患者の細胞を遺伝的に改変することからなる。これら新しい遺伝子療法が臨床診療で使用可能であるために、安全かつ有効である遺伝子導入の方法が必要とされている。RNAトランスフェクション及びレンチウイルスベクターの使用はそれぞれ、Tリンパ球の特異的受容体をリンパ球に、又は抗原を樹状細胞に転移させるための適切な技術として現れた。
ヒト腫瘍細胞の特異的抗原の分子同定は、標的抗原に特異的な免疫療法の開発において重要な要素である:
・1つのアプローチは、受動免疫療法として説明され、抗原の特異的T細胞をエクスビボで増幅し、それを患者に再移植することからなる(TCR&CAR T細胞)。癌の治療のための養子移入によって再移植する前に、これらT細胞に合成抗原のキメラ受容体(CAR)又は新しいT細胞受容体(TCR)を導入するために遺伝子導入が使用される。ここでは、レンチウイルスベクターが広く用いられ、非常に有望な結果が臨床段階で得られている。
・能動免疫療法として説明される他のアプローチは、ワクチン接種である。樹状細胞(DC)は天然の抗原提示物質である。樹状細胞は、ナイーブT細胞を刺激するそれらの能力のために、多くの抗腫瘍治療戦略の中心にある。実際に、樹状細胞は、環境の「検出器(detectors)」であり、集めた情報を免疫系のT細胞及びB細胞に伝える。従って、これら細胞は、抗腫瘍治療免疫を発生させるための必須の標的であり、従って専門的抗原提示細胞(APC)として説明される。樹状細胞に基づくワクチン接種の目的は、腫瘍塊を特的に減少させるためにエフェクターT細胞のインビボ応答を誘導すること、並びに記憶応答を導入することの両方である。
これら2つの治療アプローチは、効果的かつ再現可能な抗腫瘍免疫応答を得るための2つの独特の特徴を含む。第一に、毒性を誘発することなく免疫応答を得るために、外因性配列の発現、例えば標的細胞における抗原の発現が制御されなければならない。同時にいくつかの抗原を共発現することは、抗腫瘍応答を増大し、かつ腫瘍細胞が逃れることを避けるための好機である。
APCは、免疫系において本質的な役割を果たし、免疫療法戦略における決定的要素を構成する。APCは、抗原性ペプチドを免疫系の細胞に提示する役割を有する。抗原又は抗原(複数)が免疫原性である場合、それ又はそれらを発現する細胞を排除するために、免疫系が特異的に活性化されることになる。従って、この応答は、APCに対してだけでなく、抗原を発現することになる任意の細胞に対しても向けられることになり、これは腫瘍細胞の場合である。外来抗原と接触した任意の抗原提示細胞(APC)は、MHC(主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex))の分子と外来抗原とを組み合わせるために外来抗原を処理することになり、MHCはその表面における抗原性ペプチドの提示を可能にすることになる。この集合体は、APCが二次リンパ器官において接触することになるリンパ球の活性化を生じることを可能にするであろう。所与の腫瘍は一般に、いくつかの異なる抗原を発現し、腫瘍に対して免疫系の細胞を有効にするために、異なる抗原に対して免疫系の細胞を教育することが重要である。これらの腫瘍抗原はまた、腫瘍の発症の段階に応じて異なるレベルで発現され得る。従って、いくつかの抗原に対する応答を操作することは、改変された免疫細胞による治療の有効性にとって極めて重要であることを証明し得る。
第2のポイントは、このようにして改変された免疫細胞の成熟又は活性化を誘発する免疫調節剤の標的細胞における発現である。免疫細胞内でのこれら複数の共発現は、先天的かつ適応的免疫応答を模倣することを可能にするであろう。したがって、これら方法は、一方では、抗原を特異的に発現する細胞を供給し、他方では、完全かつ有効な免疫応答に必須なそれらの成熟又は分化を誘導することになる。これは、最も効果的な治療が、いくつかの腫瘍抗原に対する免疫応答の特異性と刺激応答とを制御された時間依存的方法で組み合わせることによって、治療結果を改善するための複数の遺伝子の投与から生じるであろうことを意味する。標的細胞内又は体内に抗原と免疫調節物質の両方を同時に送達することは、臨床上の利点を提供するはずである。
T細胞及び樹状細胞(APC)にそれぞれ基づくこれら2つのアプローチは、本発明によってより具体的に標的化される。
従って、より効率的で毒性が少なく、より具体的には免疫療法に適応したウイルスベクターシステムが依然として必要とされている。
本発明者らの研究は、いくつかの目的のRNAを1つの同じ細胞内に単一の感染で送達することができるベクターシステムを作成することを可能にした。
従って、本発明は、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスRNAの前記目的の配列の少なくとも1つが、少なくとも1つのエピトープ及び/又はエピトープを特異的に認識する少なくとも1つの分子構造をコードする部分を含む、レトロウイルス粒子に関する。
本発明に係るレトロウイルス粒子は、単一の感染により細胞に、少なくとも2つの非ウイルスRNA、好ましくは3つの非ウイルスRNAを導入することを可能にする。細胞へのそのような粒子の導入は、インビボ、インビトロ又はエクスビボの方法によって行われ得る。
「Gagポリタンパク質に由来するタンパク質」とは、Gagポリタンパク質の切断により生じる任意のタンパク質を意味する。より具体的には、それは、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリックスタンパク質(例えば、MoMuLVタイプのマウスウイルスに由来するレトロウイルス粒子における)又はガンマレトロウイルスに特異的なp12タンパク質由来である。
「エンベロープタンパク質」とは、シュードタイピング(pseudotyping)エンベロープタンパク質を含む、任意のエンベロープタンパク質を意味する。例として、両性(Ampho)エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス(MuMTV)のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma virus)(RSV)のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス(MV)のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルス(Gibbon ape leukaemia virus)のエンベロープタンパク質(GALV)、ネコ内在性ウイルス(feline endogenous virus)(RD114)のタンパク質、又は水胞性口炎ウイルス(VSV−G)のエンベロープタンパク質、が挙げられる。より具体的には、エンベロープタンパク質は、両性エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルスウイルス(MoMuLV)のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルスウイルス(FIV)のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルスウイルス(HaMuSV)のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス(MuMTV)のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス(MV)のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルスのエンベロープタンパク質(GALV)又は水胞性口炎ウイルス(VSV−G)のエンベロープタンパク質である。したがって、エンベロープタンパク質は、特定の細胞型又は特定の用途(エンベロープタンパク質としての表面受容体の使用)を標的とするために改変されてもよい。
受容体及び/又は特定の細胞型を標的化するために、抗体、糖脂質及び/又は特定のリガンドによりエンベロープタンパク質を修飾することもできる。
好ましくは、エンベロープタンパク質は、VSV−Gタンパク質である。
「インテグラーゼ」とは、pol遺伝子によってコードされた酵素タンパク質を意味し、これは、当該レトロウイルスの複製時にレトロウイルスによって感染した細胞のDNA内へのレトロウイルスDNAの組み込みを可能にする。
「カプシド形成配列」とは、結合ドメインによって特異的に認識されるRNAモチーフ(配列及び三次元構造)を意味する。好ましくは、カプシド形成配列はステム−ループモチーフである。さらにより好ましくは、レトロウイルス粒子のカプシド形成配列は、MS2バクテリオファージ又はPP7ファージのRNAのステム−ループモチーフ、例えば、それぞれ、配列ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)又はctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号2)から生じるステム−ループモチーフである。ステム−ループモチーフ、より具体的にはMS2バクテリオファージのRNAのステム−ループモチーフ、又はPP7ファージのRNAのステム−ループモチーフは、単独で、又は数回、好ましくは2〜25回、より好ましくは2〜18回、例えば6〜18回反復して使用され得る。
「結合ドメイン」とは、目的のRNA配列に連結されたカプシド形成配列に特異的に結合するタンパク質の全て又は一部を意味する。より具体的には、それは、カプシド形成配列に特異的に結合する三次元構造によって定義された、突然変異又は非突然変異タンパク質である。好ましくは、結合ドメインは、異種ドメインである。より好ましくは、結合ドメインは、MS2バクテリオファージ、PP7ファージ又はQβファージのコートタンパク質、プロファージHK022 Nunタンパク質、U1Aタンパク質、あるいはhPumタンパク質である。
より好ましくは、結合ドメインは、MS2バクテリオファージのコートタンパク質又はPP7ファージのコートタンパク質である。
さらにより好ましくは、結合ドメインがPP7ファージのコートタンパク質である場合、アミノ酸67から75の欠失のために、その配列は自己構築に不十分である(PCPΔFG)(Chaoら、2008)。好ましくは、PP7ファージのコートタンパク質の配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化されており、すなわち、DNAの塩基が、好ましくはヒト種に存在するアミノ酸をコードするために選択されている。
「各配列」とは、これらカプシド形成配列が、同一又は異なる結合ドメインによって認識されるかどうかに応じて、カプシド形成配列が同一又は異なってもよいことを意味する。実際に、本発明に係るレトロウイルス粒子は、1つ又は複数の結合ドメインを含み得る。いくつかの結合ドメインが導入される場合、それらは、Gagポリタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入され得る。
結合ドメインは、カプシド形成配列の認識を可能にするだけでなく、粒子中にカプシド形成配列を有するRNAの(又は本件の場合、カプシド形成配列に結合した非ウイルスRNAの)カプシド形成も可能にする。
「カプシド形成」とは、ウイルス粒子のウイルスカプシドにおけるRNAのパッケージングを意味する。本発明においては、非ウイルスRNAのカプシド形成は、特にPsi以外の、非ウイルスカプシド形成シグナルの認識によって行われることに留意すべきである。
「目的の配列」とは、ユーザーの目的の機能をコードするか有する配列を意味する。より具体的には、2つのカプシド形成された非ウイルスRNAのそれぞれによって運ばれる目的の配列は、同一又は異なっていてもよい。
本発明に係る粒子を用いることで、同一又は異なる非ウイルスRNAを標的細胞に転移させることができる。
カプシド形成されたRNAが非ウイルスである場合、これらRNAは、pol遺伝子によってコードされたタンパク質の認識部位を有さない。
実際に、これら非ウイルスRNAは、レトロウイルスの複製サイクルの初期段階に関与しない、すなわち、以下:
−逆転写酵素による二本鎖DNAへの一本鎖ウイルスRNAのコピー;
−インテグラーゼによるLTR末端の認識による二本鎖ウイルスDNAの成熟、及び、細胞質プレインテグレーション複合体(pre-integration complex)の核プレインテグレーション複合体への成熟、
に関与しない。
従って、pol遺伝子によってコードされたこれらウイルスタンパク質(逆転写酵素、インテグラーゼ)は、粒子において任意であり、従ってpol遺伝子は、存在するか、あるいは部分的又は完全に欠失しているかのいずれかであり得る。好ましくは、pol遺伝子は、存在するか、あるいは部分的に欠失しているかのいずれかである。
本発明に係るレトロウイルス粒子は、ウイルス及び非ウイルスの両方の遺伝物質を含むことに留意すべきである:
−gag遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。より具体的には、結合ドメイン(複数)が後者に導入される場合、gag遺伝子はキメラである。
−任意により、pol遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。pol遺伝子がいくつかの酵素をコードする場合、これら酵素に関連する配列は、完全に又は部分的に欠失しているか、存在しかつ非機能的であるか、あるいは存在しかつ機能的であり得る。より具体的には、結合ドメイン(複数)がインテグラーゼに導入される場合、pol遺伝子はキメラである。
−少なくとも2つの非ウイルスRNA、各非ウイルスRNAは、目的の配列及びカプシド形成配列を有する。より具体的には、「非ウイルスRNA」とは、レトロウイルス配列を欠いたRNAを意味する(「非レトロウイルスRNA」とも称される)。
より具体的には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、標的細胞に、以下を誘導することができるRNAを導入することを可能にする:
・標的細胞からの目的の1つ又は複数の内因性又は外因性コーディング配列の転移、
・例えばshRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA又はcircRNAによる、遺伝子発現に対する影響を誘導することができるRNAのような、1つ又は複数の非コーディングRNAの転移。
・細胞RNA、メッセンジャーRNAタイプ又はその他(miRNA等)、RNAウイルスのサブゲノムレプリコン(HCV等)あるいはRNAウイルスの完全なゲノムの転移
・標的細胞の内因性及び外因性コーディング又は非コーディング配列の同時発現。
より具体的には、本発明に係るウイルス粒子は、標的細胞に、以下を誘導することができる核酸を導入することを可能にする:
−免疫応答に関与する細胞(樹状細胞又は他の抗原提示細胞)における、1つ又は複数のエピトープ(複数)の、特に1つ又は複数の抗原(複数)の発現;
−それらの成熟又はそれらの活性化を誘発するように形質導入された細胞の活性化、あるいは、それらが相互作用しかつ対抗することができるようになる、例えば多様で複雑なメカニズムによって誘導される免疫抑制のメカニズムによる細胞の活性化。そのような活性化は免疫調節剤によって行うことができる。このタイプのアプローチは、腫瘍細胞に対する免疫応答の誘発に好ましい微小環境を作り出すことができる。
この方法は、免疫応答を誘導するための他のタイプのシステムに適用できることに留意すべきである。
「エピトープ」とは、抗体又はリンパ球受容体によって特異的に認識され得る構造を意味する。
有利には、目的の配列は、特に抗原についての、いくつかのエピトープをコードする。
「抗原」とは、生物にとって外来性であり、かつそれを排除することを目的として免疫応答を誘発することができる物質を意味する。それらは天然又は合成であってもよい。抗原は一般に、天然又は合成分子、一般にタンパク質、多糖及びそれらの脂質誘導体である。直接又は抗原提示細胞(APC)を介しての免疫適格細胞による抗原の認識は、特異的免疫を活性化する。1つの同じ抗原は、いくつかのエピトープ(これは同一でも異なってもよい)を含み、したがって様々な免疫応答を誘導し得る。リンパ球による抗原の認識は、エピトープの性質に依存する。Bリンパ球は、それらの膜の免疫グロブリンを介して立体構造エピトープに直接結合する。Tリンパ球は、抗原提示細胞によって提示されたアミノ酸配列に対応する配列エピトープを認識する。
好ましくは、エピトープ又は抗原は、病原体由来、特にウイルス、細菌、寄生虫、腫瘍細胞等由来である。
エピトープ又は抗原は、腫瘍細胞上で多量に発現されると同定されたバイオマーカーから、あるいはウイルス又は毒素から推定され得る。そのサイズは可変である。一般的に、最良のエピトープ又は抗原を選択するためにスクリーニングが行われる。デオキシリボ核酸及びリボ核酸の配列は、エピトープ又は抗原のタンパク質配列から推定され得る。
エピトープは、好ましくはペプチドから選択される。より好ましくは、エピトープは、1〜50アミノ酸(AA)、好ましくは30AA未満、好ましくは3〜12アミノ酸を含むペプチドエピトープである。
抗原は好ましくは、ペプチド、タンパク質、及び糖タンパク質から選択される。実際に、細胞(宿主)の細胞機構はカプシド形成されたRNAを翻訳することができるので、それは、グリコシル化のような翻訳後修飾の1つ又は複数の付加的なステップを行うこともできる。実際に、抗原の産生が樹状細胞で行われる場合、抗原は、それが得られることを可能にしたバイオマーカーのように成熟し得る。
RNAの導入を可能にする本発明に係る粒子は、最大で10kbのサイズを有するので、かなりのサイズの抗原配列をその中に導入することが可能である。しかしながら、抗原配列のサイズは可変である。一般に、分子が大きいほど、それはより免疫原性である。
「抗原配列」とは、エピトープ又は抗原をコードするDNA配列を意味する。
有利には、エピトープ又は抗原は免疫原性である、すなわち、それは免疫応答を開始することができる。
「免疫原性」とは、免疫応答を誘導する抗原の可能性を意味する。物質は免疫原性ではなく抗原性であり得る。この可能性は、種、抗原と宿主の分子との間の類似性の程度、抗原の物理化学的特徴(サイズ、形状、剛性)、及び受けた抗原の用量に依存する。
好ましくは、エピトープは、抗体又はTリンパ球の膜受容体(TCR)の可変部分によって認識されると同定されている分子によって構成されるリストから選択される。後者は、それらの免疫原性の可能性に従って同定及び選択される。
好ましくは、抗原は腫瘍抗原、すなわち、腫瘍細胞の表面上に特異的に存在するが、周囲の正常細胞には存在しないか又は存在量が少ない分子である。より好ましくは、抗原は、以下によって構成される群から選択される:「癌精巣」群の抗原(例えばMAGE−A12、MAGE−A3、MAGE−A10、MAGE−A2、MAGE−A1、CT7/MAGE−C1、CT10、SSX4、BRDT、NY−ESO1、SSX2、Xage1b、MAGE−A4等)、これらは、胚細胞による異所性発現とは別に腫瘍組織によって特異的に発現する;分化抗原、これは、正常細胞によって及び対応する腫瘍細胞によっての両方で所与の組織において発現される;腫瘍細胞でのみ発現される抗原、これは、突然変異抗原に対応し得る(アルファ−アクチニン−4、NY−FC、P53、伸長因子2、酵素リンゴ酸、EGF−R、Kras、Casp8、ACYN4、ALK−EML14等);染色体転座の結果として発生した新生抗原(Bcr−Abl);腫瘍によって過剰発現され得る正常細胞によって発現される抗原(WT1、ACE、Muc1、Survivin 2B、テロメラーゼ触媒タンパク質、Her2/neu、EGF−R、EGF、TGFalpha、シクロフィンB等); 病原体、特にウイルスに由来する抗原(パピローマウイルス及び子宮頸癌又は上気道及び消化管の癌、B型及びC型肝炎ウイルス及び肝臓癌);並びに、細菌に由来する抗原(ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)及び胃癌)又は、特にヒトにおける、寄生虫に由来する抗原(住血吸虫及び膀胱癌)。特に、メラノーマに関連する腫瘍抗原は、3つのカテゴリーに分類されており、斯かるカテゴリーは、組織特異的(MART−1、チロシナーゼTRP−1及びTRP−2、gp−100)、多種多様な癌によって発現されている抗原について腫瘍特異的(MAGE−1、NY−ESO−1)であるか、あるいはそれらが突然変異した独自の腫瘍抗原(β−catenin、CDC27)であるかに応じて分類される。
カプシド形成された非ウイルスRNAを含む本発明に係るレトロウイルス粒子であって、その目的の配列が少なくとも1つのエピトープをコードする部分を含む、レトロウイルス粒子は、抗原提示細胞、特に樹状細胞を形質導入するのに特に有利である。
「エピトープを特異的に認識する分子構造」又は「パラトープ」とは、エピトープ、及び特に抗原との特異的相互作用を確立することができる構造を意味する。一般にそれは、抗体の又はリンパ球の膜受容体の可変部分によって構成される免疫受容体である。好ましくは、それは、Tリンパ球の表面に存在するTCR(T細胞受容体)又はCAR(キメラ受容体)型の免疫受容体である。
好ましくは、エピトープを特異的に認識する分子構造は、以下:Tリンパ球受容体(TCR)、天然型、改変型又はキメラ型;Bリンパ球受容体、膜(BCR)又は分泌型(免疫グロブリン);及び免疫応答に関与する免疫系の他の細胞の受容体、例えばNK又はNKTリンパ球、からなる群から選択される。
カプシド形成された非ウイルスRNAを含む本発明に係るレトロウイルス粒子であって、 その目的の配列が抗原を特異的に認識する少なくとも1つの分子構造を含む、レトロウイルス粒子は、リンパ球を形質導入するのに特に有利である。
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含み、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。
「ヌクレオカプシドタンパク質」とは、gag遺伝子によってコードされた構造タンパク質NCを意味する。結合ドメインがヌクレオカプシドタンパク質に導入される場合、このタンパク質は、キメラgag遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼは、キメラpol遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
「キメラタンパク質」とは、いくつかの異なる融合タンパク質配列を含む組み換えタンパク質を意味する。
第1の実施形態によれば、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインはヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAはそれらのRNA配列によって異なる。
この第1の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のRNAの早期の一過性発現を可能にする。
実際に、この第1の実施形態に係る粒子と標的細胞とを接触させると、レトロウイルス粒子の膜と標的細胞の膜とが融合することになり、粒子の内容物が標的細胞中に放出される。次に、RNAが細胞質内に放出され、細胞機構によってこれらRNAが直接タンパク質(複数)に翻訳される、すなわち、例えば逆転写、核内への移行、又は標的細胞のゲノムへの組み込みなどの付加的なステップ無しに翻訳される。
より具体的には、少なくとも2つの非ウイルスRNAは、同じカプシド形成配列を有する。この場合、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、それらの目的のRNA配列によって異なる、すなわち、2つのカプシド形成された非ウイルスRNAに含まれる目的のRNA配列は異なっている。「異なる(different)」とは、同一ではないか、あるいは、自然突然変異から生じたものでないか、又は操作者によって意図的に選択されたものではない違いを有する、目的の配列を意味する。
あるいは、少なくとも2つの非ウイルスRNAは、2つの異なるカプシド形成配列を有する。次に、これら少なくとも2つのカプシド形成配列は、少なくとも2つの異なる結合ドメインによって認識され、これらドメインの少なくとも1つが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入される。この場合、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、同一又は異なる目的の配列を含んでもよい。
少なくとも2つの非ウイルスRNA、好ましくは3つの非ウイルスRNAをカプシド形成することが可能である。
第1の実施形態の特定の実施形態によれば、第2の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のヌクレオカプシドタンパク質に導入される。
例として、第1の結合ドメインがPP7ファージの「コート」タンパク質である場合、第2の結合ドメインはMS2バクテリオファージの「コート」タンパク質であり得る、あるいは、第1の結合ドメインがMS2バクテリオファージの「コート」タンパク質である場合、第2の結合ドメインはPP7ファージの「コート」タンパク質であり得る。
この場合、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第1及び第2の結合ドメインにそれぞれ対応する。
より具体的には、3つの非ウイルスRNAがカプシド形成される場合:
−カプシド形成された非ウイルスRNAの少なくとも2つが、第1の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつそれらの目的のRNA配列によってのみ異なり、
−第3のカプシド形成された非ウイルスRNAは、同一又は異なるカプシド形成配列を有し得る。カプシド形成配列が異なっている場合、それはヌクレオカプシドタンパク質に導入された第2の結合ドメインに対応し得る。
他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。
ヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメイン又はドメイン(複数)に加えて、結合ドメインをインテグラーゼに導入することも可能である。
次に、インテグラーゼは、キメラpol遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
好ましくは、結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼの配列は、結合ドメインの配列を挿入するために、C−末端ドメインのレベルで突然変異している。さらにより好ましくは、インテグラーゼの配列は、MS2バクテリオファージ又はPP7ファージの「コート」タンパク質の配列を導入するように、C−末端ドメインのレベルで突然変異している。
この場合、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、それぞれヌクレオカプシドタンパク質及びインテグラーゼに導入された結合ドメインに対応する。
より具体的には、3つの非ウイルスRNAがカプシド形成される場合:
−カプシド形成された非ウイルスRNAの少なくとも2つが、第1の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつそれらの目的のRNA配列によってのみ異なり
−第3のカプシド形成された非ウイルスRNAは、インテグラーゼに導入された第2の結合ドメインに対応する異なるカプシド形成配列を有する。
他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。
好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において:
−結合ドメインは、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスRNAのカプシド形成配列は、MS2のステム−ループ配列であり、
−ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラのGagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であり、NCの配列は、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
有利には:
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
−カプシド形成配列は、MS2ステム−ループ配列の2〜25回の反復、好ましくはステム−ループ配列の6〜18回の反復、さらにより好ましくは10〜14回、例えば12回の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は、以下のものである:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)。
あるいは、好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において:
−結合ドメインは、PP7ファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスRNAのカプシド形成配列は、PP7のステム−ループ配列であり、
−ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラのGagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であり、NCの配列は、PP7ファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
有利には:
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
−カプシド形成配列は、PP7のステム−ループ配列の2〜25回の反復、好ましくはステム−ループ配列の2〜18回の反復、さらにより好ましくは2〜12回、例えば6回の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は以下のものである:ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号2)。
有利には、配列番号2は、ステム−ループのフォールディングを促進するように最適化され得る。特に、配列番号2及び配列番号3(ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag)を連続して交互に挿入することが有利であり得ることが見出された。
任意により、第1の結合ドメインがMS2バクテリオファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第2の結合ドメインはPP7ファージのコートタンパク質であってもよく、あるいは、第1の結合ドメインがPP7ファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第2の結合ドメインはMS2バクテリオファージのコートタンパク質であってもよい。
第2の実施形態によれば、本発明は、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、インテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、インテグラーゼに導入された結合ドメインによって、及び任意によりGagポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインによって認識される、レトロウイルス粒子に関する。
この第2の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに目的のRNAの一過性発現を可能にする。
好ましくは、この第2の実施形態において、インテグラーゼの配列は、結合ドメインの配列を挿入するためにC−末端ドメインのレベルで突然変異している。
有利には、結合ドメインは異種ドメインである。より具体的には、結合ドメインは、MS2バクテリオファージ、PP7ファージ又はQβファージのコートタンパク質、プロファージHK022 Nunタンパク質、U1Aタンパク質、あるいはhPumタンパク質である。
好ましくは、インテグラーゼの配列は、MS2バクテリオファージ又はPP7ファージの「コート」タンパク質の配列を導入するように、C−末端ドメインのレベルで突然変異している。
少なくとも2つの非ウイルスRNAは、同じカプシド形成配列を有しても又は有さなくてもよい。
また、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、同じ目的のRNA配列を有しても又は有さなくてもよい。
好ましくは、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、それらの目的のRNA配列で異なり、すなわち2つのカプシド形成された非ウイルスRNAに含まれる目的のRNA配列は、異なっている。
より具体的には、少なくとも2つの非ウイルスRNAは同じカプシド形成配列を有し、後者はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。
少なくとも2つの非ウイルスRNA、好ましくは3つの非ウイルスRNAをカプシド形成することが可能である。
第2の実施形態の特定の実施形態によれば、第2の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のインテグラーゼに導入される。
例として、第1の結合ドメインがPP7ファージの「コート」タンパク質である場合、第2の結合ドメインはMS2バクテリオファージの「コート」タンパク質であり得る、あるいは、第1の結合ドメインがMS2バクテリオファージの「コート」タンパク質である場合、第2の結合ドメインはPP7ファージの「コート」タンパク質であり得る。
この場合、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、インテグラーゼに導入された第1及び第2の結合ドメインにそれぞれ対応する。
より具体的には、3つの非ウイルスRNAがカプシド形成される場合:
−カプシド形成された非ウイルスRNAの少なくとも2つが、第1の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、これら2つの非ウイルスRNAは、任意によりそれらの目的のRNA配列によって異なり得る、
−第3のカプシド形成された非ウイルスRNAは、同一又は異なるカプシド形成配列を有し得る。カプシド形成配列が異なっている場合、それは、インテグラーゼに導入された第2の結合ドメインに対応し得る。
他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。
インテグラーゼに導入された結合ドメイン又はドメイン(複数)に加えて、ヌクレオカプシドタンパク質に結合ドメインを導入することも可能である。
次に、ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラgag遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
この場合、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、それぞれインテグラーゼに及びヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインに対応する。
より具体的には、3つの非ウイルスRNAがカプシド形成される場合:
−カプシド形成された非ウイルスRNAの少なくとも2つが、インテグラーゼに導入された第1の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつこれら非ウイルスRNAは、任意により、それらの目的のRNA配列で異なり得る、
−第3のカプシド形成された非ウイルスRNAは、異なるカプシド形成配列を有し、斯かるカプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第2の結合ドメインに対応する。
他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。
従って、本発明は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される、レトロウイルス粒子に関する。
任意により、少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列は、同一であり得る。
代替的にかつ好ましくは、レトロウイルス粒子における少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAは、それらのRNA配列で異なる。
この場合、カプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列が、第2のエピトープ又は抗原、あるいは免疫調節タンパク質をコードすることが有利である。
他のカプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列が、第2のエピトープ又は抗原をコードする場合、したがって、いくつかのエピトープ及び/又は抗原を同時に発現し、組み合わされ協調した免疫応答を誘発することが可能である。例として、腫瘍免疫療法の分野において、腫瘍細胞はいくつかの独立した免疫応答の標的となる。
多数の免疫調節剤、すなわち免疫系を制御し配向するために使用され得る分子が存在する。従って、本発明に係る粒子によるこれら免疫調節剤の導入は、特異的応答、活性化又は分化を調節することが望まれる免疫系の全ての細胞(リンパ球、単球)に関係し得る。樹状細胞の場合、これらの剤は2つの主要な機能を果たす。
未熟状態では、樹状細胞は、標的組織又は感染組織のレベルで抗原を捕捉し、次に分化しながら最も近い二次リンパ器官に移動する。
成熟状態では、樹状細胞は、Tリンパ球を特異的に活性化するために、抗原をTリンパ球に提示する。
この樹状細胞の特異的活性化は、免疫応答を確立し維持するために不可欠であるサイトカインの産生をもたらす。これらサイトカインは、非常に複雑なメカニズムによって、先天性システムを適応システムに結び付けることを可能にする。これは、インビトロ又はエクスビボでの細胞の活性化が一般に、培地へのサイトカイン又は因子の添加によってもらされるためである。
微小環境だけでなく、種々の免疫調節剤もまた、樹状細胞の活性化を誘導するか又は活性化に寄与し得る。例えば、PAMP(病原体関連分子パターン(Pathogen Associated Molecular Patterns))、TLR(Toll様受容体)、DAMP(損傷関連分子パターン分子(Damage associated Molecular pattern Molecules))炎症分子は、樹状細胞の活性化をもたらし得る。多くの分子が樹状細胞を活性化することができる。MCM(単球馴化培地)、サイトカイン(TNFα、IL−1β、PGL6)、プロスタグランジンE2、CD40L又はTLRのリガンド。樹状細胞の活性化経路に作用することができるタンパク質の全てが、それらの成熟に対する調節効果を有する可能性がある。同様にして、T又はBリンパ球の免疫調節剤は、これら細胞の産生及び活性の強力な調節因子であり、従って免疫応答の種々の作用間の相互作用を刺激し、従って後者を改善し得る。
「免疫調節タンパク質」とは、タンパク質の形態である免疫調節剤を意味する。
この実施形態は、抗原提示細胞及び特に樹状細胞、又はリンパ球が形質導入されて、これら免疫調節剤を直接発現し、免疫応答を増幅する場合に特に有利である。
したがって、抗原の発現と同時に起こる、抗原提示細胞、特に樹状細胞の成熟の誘導は、免疫応答を誘導するための特に有望な戦略である。この目的は、標的抗原(複数)に最もよく反応するように免疫系を刺激することである。免疫系を活性化することを目的としたこのプライミング戦略は、免疫応答の強化につながる可能性がある。
好ましくは、免疫調節タンパク質は、サイトカイン、例えばTNFα、IL−1β、PGL6、インターロイキン、例えばIL−2、IL−4、IL−12、IL−15、薬剤、例えばGM−CSF、CD28、ICOS(「誘導性共刺激分子(Inducible Costimulator)」)、OX40、CD80、ICOSL又はOX40L、及び記載された活性化経路を調節するためのタンパク質、例えばTLRのリガンド又はNLRのリガンド(Nod様受容体)、例えばイミキモド(imiquimod)又はCpGs、から選択される。
有利には、レトロウイルス粒子は、第3のカプシド形成された非ウイルスRNAを含む。
第3のカプシド形成された非ウイルスRNAは、第1の2つのカプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列の少なくとも1つと同一の目的の配列を有してもよく、あるいは、第1の2つのカプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列のそれぞれと異なっていてもよい。
特に、レトロウイルス粒子は、3つを超えるカプシド形成された非ウイルスRNAを含み得る。
有利には、本発明に係る粒子がヌクレオカプシドタンパク質を含む場合、結合ドメインはヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよく、かつ、第2の結合ドメインは、ヌクレオカプシドに及び/又はインテグラーゼに導入されてもよい。
あるいは、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインはインテグラーゼに導入されてもよく、かつ、第2の結合ドメインは、ヌクレオカプシドに及び/又はインテグラーゼに導入されてもよい。
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。
レトロウイルス粒子がレンチウイルス粒子である場合、標的細胞、特に静止細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のRNAを一過的に発現することが可能である。
実際に、組み込み反応それ自体のその役割の他に、インテグラーゼ(IN)は、レトロウイルスの複製サイクルの様々な段階、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体(PIC)の核内輸送に関与する。
より具体的には、レンチウイルスにおいて、インテグラーゼは、PICによって核内にその局在を可能にする核局在配列(NLS)を含む。結果として、非ウイルスRNAのカプシド形成が、レンチウイルスのインテグラーゼが有する結合ドメインによって行われる場合、カプシド形成された非ウイルスRNAは、標的細胞の核内に輸送されることになる。実際に、第2の実施形態に係るレンチウイルス粒子と標的細胞とを接触させると、粒子の膜と標的細胞の膜とが融合することになり、標的細胞内へのカプシドの内容物の放出を可能にする。次に、RNAは、インテグラーゼによって引き受けられ、これはPICを介して、核内へのRNAの取り込みを可能にすることになる。この引き受けは特に特定の用途、例えば静止細胞における発現に有利である。レンチウイルス以外のレトロウイルス粒子の場合、インテグラーゼはこれらNLSを含まず、従って細胞質に局在することがわかる。しかしながら、インテグラーゼの核局在、結果としてこのインテグラーゼによって引き受けられるRNAの核局在を誘導するために、このタイプのインテグラーゼに、NLS配列を追加することが可能である。
この引き受けはまた、標的細胞のゲノムに特異的にハイブリダイズすることになるガイドRNAを使用する、CRISPRシステムに特に有用である。一度ハイブリダイズすると、これらガイドRNAはエンドヌクレアーゼ(Cas9)をガイドし、それは標的細胞ゲノムの特定の遺伝子座の改変を可能にすることになる。
免疫療法では、形質導入が特にレンチウイルス粒子によって行われるという事実が、形質導入されたRNAの一過性発現を可能にする。
結果として本発明に係る粒子は、一方では複数の異なる腫瘍抗原配列を発現し、例えば、他方では免疫応答メカニズムにおいて形質導入された細胞の活性化を誘発することができる免疫調節タンパク質を発現するために、宿主細胞のゲノムにおける組み込みイベントなしに、任意により遺伝的に異なる、複数のRNAを送達することができる。
より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において:
−結合ドメインは、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスRNAのカプシド形成配列は、MS2のステム−ループ配列であり、
−インテグラーゼは、酵素のキメラタンパク質であり、その配列は、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、C−末端ドメインのレベルで突然変異している。
あるいは、より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において:
−結合ドメインは、PP7ファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスRNAのカプシド形成配列は、PP7のステム−ループ配列であり、
−インテグラーゼは、酵素のキメラタンパク質であり、その配列は、PP7ファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、C−末端ドメインのレベルで突然変異している。
任意により、第1の結合ドメインがMS2バクテリオファージのコートタンパク質である場合、ヌクレオカプシドに導入された第2の結合ドメインは、PP7ファージのコートタンパク質であってもよく、あるいは、第1の結合ドメインがPP7ファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第2の結合ドメインは、MS2バクテリオファージのコートタンパク質であってもよい。
実際に、インテグラーゼ(IN)は、3つの別々の機能ドメインから構成され、それぞれが完全な組み込み反応を確実にするために不可欠である。N−末端ドメインは、ジンクフィンガー型のモチーフを含み、これはINのフォールディング構造を安定化し、かつ酵素の触媒活性を増加させる。INの中央ドメインは、DDEアミノ酸モチーフを含み、酵素の触媒活性はこれに起因する。この中央ドメインはまた、レトロウイルスDNAの各末端で保存されたヌクレオチド配列の認識にも関与する。C−末端ドメインは、レトロウイルスファミリーにおいて最も保存されていない。それは、DNA結合活性を有し、鎖転移のための3’末端の成熟反応に不可欠である。組み込み反応それ自体におけるその役割の他に、INは、レトロウイルスの複製サイクルの様々な段階、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体の核内輸送に関与する。
Petitらによって記載されたように(1999;J.Virol.P5079-5088)、INのC−末端における外因性配列の挿入は、標的細胞の産生及び形質導入のステップを妨げないが、N−末端における同じ挿入は、形質導入イベントの検出を可能にしない。
従ってレトロウイルス粒子は、インテグラーゼタンパク質と融合したMS2バクテリオファージの「コート」タンパク質(図I)又はPP7ファージの「コート」タンパク質(図XXXVII)を含むように改変された。p8.74カプシド形成プラスミドは、インテグラーゼタンパク質をコードするpol遺伝子を有し、斯かるプラスミドは、アセンブリPCRによってインテグラーゼのC−末端にコートタンパク質をコードする配列を挿入するために改変される。p8.74プラスミドはPCRによって線状化され、次にPCRによって増幅されたCoat配列が、末端から末端に直接、又はリンカーに加えてのいずれかで、インテグラーゼのC−末端レベルにクローニングされる。
有利には:
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
−カプシド形成配列は、導入される結合ドメインに応じて、MS2の及び/又はPP7のステム−ループ配列の2〜25回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の2〜18回の反復、より好ましくは2〜18回の反復、例えば6〜18回の反復、さらにより好ましくはMS2のステム−ループ配列について、10〜14回、例えば12回の反復を含む。
−好ましくは、結合ドメインがMS2のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)であり、及び/又は、結合ドメインがPP7のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号2)、及び/又はステム−ループ配列の配列番号3と交互のステム−ループ配列の配列番号2である。
本発明に係るレンチウイルス粒子のいくつかの例を以下に記載し、いくつかを以下に与えられた実施例でより詳細に説明する:
−RLP又はMS2RLP又はMS2(NC)−RLP 12X粒子は、ヌクレオカプシドへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−MS2(NC)−RLP 2X粒子は、ヌクレオカプシドへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−MS2(NC)−RLP 6X粒子は、ヌクレオカプシドへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−MS2(IN)−RLP 2X粒子は、インテグラーゼへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−MS2(IN)−RLP 6X粒子は、インテグラーゼへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−MS2(IN)−RLP 12X粒子は、インテグラーゼへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−PP7RLP又はPP7(NC)−RLP 2X粒子は、ヌクレオカプシドへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−PP7(NC)−RLP 6X粒子は、ヌクレオカプシドへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−PP7(NC)−RLP 12X粒子は、ヌクレオカプシドへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−PP7(IN)−RLP 2X又はPP7(IN)−RLP粒子は、インテグラーゼへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−PP7(IN)−RLP 6X粒子は、インテグラーゼへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、6回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−PP7(IN)−RLP 12X粒子は、インテグラーゼへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−MS2/PP7RLP又はMS2/PP7(NC)−RLP 12X 2X粒子は、ヌクレオカプシドへのMS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、12回反復した、MS2バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するRNA、あるいは、ヌクレオカプシドへのPP7ファージのコートタンパク質の挿入によって、2回反復した、PP7ファージのステム−ループモチーフを有するRNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子である。
好ましくは、RNAのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子は、2〜25回、より好ましくは2、6又は12回反復したMS2バクテリオファージの又はPP7ファージのステム−ループモチーフを有する。
さらにより好ましくは、本発明に係る粒子は、MS2(NC)−RLP 12X、PP7(NC)−RLP 6X、PP7(NC)−RLP 2X、MS2(IN)−RLP 12X、PP7(IN)−RLP 6X及びPP7(IN)−RLP 2X、から選択される。
本発明はまた、本発明に係る粒子を含有する組成物に関する。
より具体的には、本発明に係る組成物は、濃縮された組成物である。有利には、組成物はまた、精製される。これら組成物は、国際公開第2013/014537号の出願に記載の方法によって濃縮及び精製されてもよい。
典型的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、30%未満のDNA夾雑物及び45%未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、30%未満のDNA夾雑物及び2%未満のタンパク質夾雑物を含有する。
「粗上清」とは、清澄化後の、本発明に係るレトロウイルス粒子を含む細胞培養物(複数)の上清を意味する。そのような清澄化ステップは、より具体的には、以下の本発明に係る粒子を製造するための方法に記載される。上清の回収が数回行われる場合、粗上清は、回収され、合わされ(又は「プールされ」)、次に清澄化された上清の全てに対応する。
任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、1%未満のDNA夾雑物及び1%未満のタンパク質夾雑物を含有する。
本発明はまた、本発明に係る粒子を生産するためのキット、及びそれらキットの製造方法に関する。
より具体的には、本発明は、本発明に係る粒子を生産するためのキットであって、以下:
(i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、前記配列の上流又は下流に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むGagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キットに関する。
そのようなキットはまた、キットに含まれるプラスミドの使用のための指示書を含んでもよい。
より具体的には、キットが、第1の実施形態に係る粒子を生産するためのキットである場合、このキットは、以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、前記目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されているか、あるいは、第1及び第2の発現プラスミドがそれぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
目的の配列が異なる、及び/又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも2つの非ウイルスRNA配列は異なっている。
プラスミドはDNA構造であるので、「少なくとも2つの非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミド」とは、少なくとも2つの非ウイルスRNA配列をコードする発現プラスミドを意味することがよく知られている。
実際に、キットにおける発現プラスミドは、転写によって少なくとも1つの非ウイルスRNAを得るのに必要な全てのDNA配列を含む。発現プラスミドは、少なくとも1つのプロモーター、次いで目的のDNA配列(非ウイルスRNAに転写されることになるcDNA又はDNA)及びカプシド形成配列(例えばMS2又はPP7反復モチーフをコードするDNA)及び任意によりRNA安定化配列、を含む。
好ましくは、第1の実施形態に係る粒子を生産するためのキットは、以下:
(i)少なくとも2つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第1及び第2の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されており、当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列は同一である、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
有利には、キットは、レンチウイルス粒子を生産する。
好ましくは:
−発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、MS2のステム−ループ配列2〜25回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の6〜18回の反復、さらにより好ましくは10〜14回、例えば12回の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(配列番号1)である。
−カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であり、当該NCは、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
−エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
あるいは、好ましくは:
−発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、PP7のステム−ループ配列の2〜25回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の2〜18回の反復、さらにより好ましくは2〜12回、例えば6回の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下:ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号2)であり、及び/又は、ステム−ループ配列の配列番号3と交互のステム−ループ配列の配列番号2である。
−カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であり、当該NCは、PP7ファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
−エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gタンパク質である。
任意により、キットは、キメラインテグラーゼをコードする第2のカプシド形成プラスミドを含み、斯かるキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む。第2の結合ドメインは、キメラヌクレオカプシドタンパク質の結合ドメインと同一又は異なってもよい。
種々の結合ドメインの例として:
−ヌクレオカプシドに導入された結合ドメインは、MS2のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入された結合ドメインは、PP7のコートタンパク質であってもよい、あるいは
−ヌクレオカプシドに導入された結合ドメインは、PP7のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入された結合ドメインは、MS2のコートタンパク質であってもよい。
いくつかの結合ドメインが、キメラタンパク質のそれぞれに導入されてもよい。
あるいは、キットが、第2の実施形態に係る粒子を生産するためのキットである場合、このキットは、以下:
(i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
有利には、本発明に係る生産キットは、第2のカプシド形成プラスミドをさらに含んでもよく、斯かる第2のカプシド形成プラスミドは:
−第1のカプシド形成プラスミドが、キメラGagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Gagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び/又は
−第1のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする。
本発明に係るキットのための製造方法も提案される。典型的には、本発明に係るキットを製造するための方法は、以下:
(i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むGagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
より具体的には、方法が、第1の実施形態に係る粒子を生産するためのキットに関する場合、当該方法は、以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、この目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第1及び第2の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、を調製し、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
目的の配列が異なる、及び/又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも2つの非ウイルスRNA配列は異なっている。
好ましくは、当該方法は、以下:
(i)少なくとも2つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第1及び第2の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入され、当該目的の配列が異なり、かつ当該カプシド形成配列が同一である、発現プラスミド、を調製し、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
あるいは、方法が、第2の実施形態に係る粒子を生産するためのキットに関する場合、当該方法は、以下:
(i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
本発明はまた、本発明に係る粒子を製造するための方法に関する。
そのような方法は、以下:
(i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド,
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むGagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
本発明に係る粒子のための製造方法に利用される細胞は、プロデューサー細胞であり、すなわち、レトロウイルス粒子の形成に必要な遺伝物質を有するプラスミドで一度トランスフェクトされた細胞が、当該粒子の形成を可能にする。プロデューサー細胞の例として、HEK293Tが挙げられる。
「コトランスフェクションのステップ」とは、粒子を製造するための方法のプラスミドの全てとプロデューサー細胞とを接触させることによってトランスフェクションが行われる、トランスフェクションのステップを意味する。
より具体的には、製造方法の目的が、第1の実施形態に係る粒子を生産することである場合、当該方法は、以下:
(i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、この目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されているか、あるいは、第1及び第2の発現プラスミドがそれぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
目的の配列が異なる、及び/又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも2つの非ウイルスRNA配列は異なっている。
好ましくは、粒子のこの製造方法は、以下:
(i)少なくとも2つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第1及び第2の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入され、当該目的の配列が異なり、かつ当該カプシド形成配列が同一である、発現プラスミド
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
あるいは、製造方法の目的が、第2の実施形態に係る粒子を生産することである場合、この方法は、以下:
(i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
(ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
(iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
好ましくは、本発明に係る粒子を製造するための方法の全ては、国際公開第2013/014537号の出願に記載の方法によって行われる。
より具体的には、粒子のためのこれら製造方法は、血清を含まない培地で培養されたプロデューサー細胞に対して行われ、かつ酪酸ナトリウムによる誘導は行われない。
有利には、上清は数回、例えば3〜6回、特定の時間間隔で、例えばレトロウイルス粒子の半減期のオーダーの時間間隔で、回収される。典型的には、上清の回収は、4〜5回、6〜18時間、好ましくは8〜16時間、例えば8時間、12時間及び/又は16時間のオーダーの時間間隔で行われる。好ましくは、この回収は、細胞の培養培地の交換後に行われ、この交換は好ましくは、トランスフェクション後24時間で行われる。
本発明に係る粒子のための製造方法はまた、上清が清澄化されるステップを含む。
好ましくは、上清は、遠心分離によって清澄化される。
さらにより好ましくは、本発明に係る粒子のためのこれら製造方法はさらに、上清が濃縮及び/又は精製されるステップを含む。
好ましくは、濃縮及び精製は、遠心分離ユニットでの正面(frontal)限外濾過によって行われる。
有利には、上清は、1つ又は複数の付加的な精製ステップを受ける。これら精製ステップは好ましくは、接線(tangential)限外濾過及び/又は透析濾過によって行われる。さらにより好ましくは、上清は、接線限外濾過のステップに次いで、透析濾過のステップを受ける。
接線限外濾過は有利には、ポリスルホン中空カートリッジで行われる。
任意により、組成物は次に、イオン交換クロマトグラフィー、特にイオン交換クロマトグラフィーのステップを受けてもよい。このクロマトグラフィーステップからの溶出液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。そのような方法から得られた組成物は、粗上清に対して、1%未満のDNA夾雑物及び1%未満のタンパク質夾雑物を含有する。
本発明に係る製造方法において、コトランスフェクションステップは、さらに、第2のカプシド形成プラスミドにより行われてもよく、斯かる第2のカプシド形成プラスミドは:
−第1のカプシド形成プラスミドが、キメラGagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Gagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び/又は
−第1のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする。
有利には、第2のカプシド形成プラスミドと第1のカプシド形成プラスミドとの比は、[10:90]〜[60:40]の範囲、好ましくは[20:80]〜[50:50]の範囲である。
第2のカプシド形成プラスミドの使用に関する利点、及びより具体的には上記で定義した比に関する利点は、実施例8でより詳細に説明される。
本発明はまた、本発明に係る粒子のための製造方法のいずれか1つによって得られる組成物に関する。
典型的には、これら組成物は、粗上清に対して、30%未満のDNA夾雑物及び45%未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、30%未満のDNA夾雑物及び2%未満のタンパク質夾雑物を含有する。
任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、1%未満のDNA夾雑物及び1%未満のタンパク質夾雑物を含有する。
最後に、本発明は、細胞、特に免疫応答に関与する細胞の形質導入のための、本発明に係る粒子、又は本発明に係る組成物の使用に関する。
本発明に係る粒子及び組成物の使用は、それらを一過的に改変するために、初代細胞及び不死化株の形質導入に特に有利である。細胞は、哺乳動物細胞であるか又は他の真核生物の細胞であってもよい。特に、これら細胞の形質導入は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで行われ得る。
免疫応答に関与する細胞は、特に、抗原提示細胞(APC)及び免疫系の細胞である。より具体的には、それらは、単球(樹状細胞、マクロファージ)、T又はBリンパ球、ナチュラルキラー及び造血幹細胞である。
これら粒子又は組成物は、「ワクチン」と記載することができ、かつ、腫瘍のサイズを減少させるか又はウイルス発生を根絶するため、並びにメモリーT細胞を誘導するための癌又はウイルスに特異的なエフェクターT細胞を誘導することを目的とし、斯かるメモリーT細胞は、腫瘍又はウイルスの制御不能を防ぐことができるであろう。
標的細胞への複数の異種核酸の導入は、研究開発、並びにインビトロ、エクスビボ及びインビボでの適用のための治療における主要な課題である。
本発明は、以下にそれぞれ示す図面を参照して、例示により与えられた以下の実施例を踏まえて、よりよく理解されるであろう:
図Iは、目的のRNA配列として、蛍光レポーターを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子の生産のために使用される; 図IIは、p8.74レンチウイルスカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図を示し、ここでは、結合ドメインMS2 Coatはヌクレオカプシド配列に導入されており、このカプシド形成プラスミドは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子を生産するために使用される; 図IIIは、エンベローププラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である; 図IVは、目的の配列として、ルシフェラーゼ(IVa)、蛍光遺伝子(IVb)又はCre(IVc)を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の3つの模式図を示す; 図IVは、目的の配列として、ルシフェラーゼ(IVa)、蛍光遺伝子(IVb)又はCre(IVc)を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の3つの模式図を示す; 図IVは、目的の配列として、ルシフェラーゼ(IVa)、蛍光遺伝子(IVb)又はCre(IVc)を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の3つの模式図を示す; 図Vは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)を生産するために使用されるp8.74カプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である; 図VIaは、本発明に係る粒子によるヒトリンパ球の形質導入の有効性を示す図である; 図VIbは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)によるヒトリンパ球の形質導入の有効性を示す図である; 図VIIaは、本発明に係る粒子によるマウスリンパ球の形質導入の有効性を示す図である; 図VIIbは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)によるマウスリンパ球の形質導入の有効性を示す図である; 図VIIIaは、本発明に係る粒子による未熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である; 図VIIIbは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)による未熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である; 図VIIIcは、本発明に係る粒子により形質導入された未熟ヒト樹状細胞におけるZsGreenの発現動態を示す; 図VIIIdは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)により形質導入された未熟ヒト樹状細胞におけるZsGreenの発現動態を示す; 図VIIIeは、本発明に係る粒子により形質導入された未熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である; 図VIIIfは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)により形質導入された未熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である; 図IXaは、本発明に係る粒子による成熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である; 図IXbは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)による成熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である; 図IXcは、本発明に係る粒子により形質導入された成熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である; 図IXdは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)により形質導入された成熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である; 図Xaは、本発明に係る粒子によるマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)の形質導入の有効性を示す図である; 図Xbは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)によるBMDC細胞の形質導入の有効性を示す図である; 図Xcは、本発明に係る粒子により形質導入されたBMDC細胞におけるZsGreenの発現動態を示す; 図Xdは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)により形質導入されたBMDC細胞におけるZsGreenの発現動態を示す; 図Xeは、本発明に係る粒子により形質導入されたBMDC細胞の表現型を示す図である; 図Xfは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)により形質導入されたBMDC細胞の表現型を示す図である; 図XIaは、目的のRNA配列として、MAGE A3抗原をコードする完全な抗原配列を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子の生産のために使用される; 図XIbは、目的のRNA配列として、MAGE A3抗原をコードする部分抗原配列(PS−MageA3又はPS−MAGEA3)を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子の生産のために使用される; 図XIcは、目的のRNA配列として、gp100抗原をコードする部分抗原配列(PS−gp100又はPS−GP100)を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子の生産のために使用される; 図XIdは、目的のRNA配列として、チロシナーゼをコードする部分抗原配列(PS−Tyr又はPS−TYR)を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子の生産のために使用される; 図XIIaは、目的のRNA配列として、MAGE A3抗原をコードする完全な抗原配列を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)の生産に使用される; 図XIIbは、目的のRNA配列として、MAGE A3抗原をコードする部分抗原配列(PS−MageA3又はPS−MAGEA3)を有する発現プラスミドの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)の生産に使用される; 図XIIcは、目的のRNA配列として、gp100抗原をコードする部分抗原配列(PS−gp100又はPS−GP100)を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)の生産に使用される; 図XIIdは、目的のRNA配列として、チロシナーゼをコードする部分抗原配列(PS−Tyr又はPS−TYR)を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)の生産に使用される; 図XIIIaは、MAGE A3抗原をコードするRNAを含む本発明に係る粒子により形質導入されたBMDC細胞の表現型を示す図である; 図XIIIbは、MAGE A3抗原をコードするRNAを含む組み込みレンチウイルスベクター(ILV)により形質導入されたBMDC細胞の表現型を示す図である; 図XIVは、マウスにおけるMAGE A3を発現するRenca細胞によって誘導された腫瘍増殖のモニタリングを示す図である; 図XVは、本発明に係る、2回反復したPP7ステム−ループモチーフを含む、PP7RLP レンチウイルス粒子の生産のために使用される、目的のRNA配列としてルシフェラーゼを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す; 図XVIは、インテグラーゼの配列に結合ドメインを挿入するための、p8.74レンチウイルスカプシド形成プラスミドの改変の模式図を示す; 図XVIIは、図XVIに示されたp8.74レンチウイルスカプシド形成プラスミドを改変することによって得られた、本発明に係るPP7(IN)−RLPレンチウイルス粒子の生産に使用されるカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す; 図XVIIIは、CD8発現についての磁気選別及びその後のCFSE標識後の、野生型又は腫瘍を発症したBABL/cマウスの脾臓に由来する細胞に対するマウスCD8マーカーの、並びにCFSEの発現プロファイルを示す; 図XIXは、5日間単独で培養したCFSE標識CD8+細胞により得られたマウスCD8マーカーの及びCFSEの発現プロファイル(対照、下部)、並びに、野生型のBABL/cマウス(上部)、あるいは腫瘍を発症し(中央部)、CFSEで標識し、次いで、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子を用いて形質導入されていないBMDCと(左側)又は形質導入されたBMDCと(右側)5日間共培養したBABL/cマウスの脾臓に由来するCD8+細胞により得られた発現プロファイルを示す;結果は、増殖した細胞のパーセンテージとして表される; 図XXは、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子で形質導入されていないか又は形質導入されたBMDCと共培養したCFSE−標識CD8+細胞の相対増殖応答を示す図である;1DC:2T及び1DC:4Tの比での共培養物の結果を示す;結果は、非形質導入BMDCに非特異的に応答する細胞のパーセンテージに対する、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCとの接触に応答して増殖する細胞のパーセンテージの比として与えられる(n=3実験); 図XXIは、RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子によって形質導入されたか又はRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子によって形質導入されたBMDCと1DC:2Tの比で共培養されたCD8+細胞の相対増殖応答を比較する実験の結果を示す図である; 図XXIIは、RLP.ZsGreen1により形質導入されたBMDCの細胞生存率及びZsGreen1の発現の用量応答を示す図である; 図XXIIIは、本発明に係るPP7(NC)−RLP及びPP7(IN)−RLPレンチウイルス粒子の生産に使用される、目的のRNA配列として蛍光レポーターを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す; 図XXIVは、1pg p24/細胞の用量でのPP7(IN)−RLP.ZsGreen1 により形質導入されたBMDCの細胞生存率及びZsGreen1の発現動態を示す図である; 図XXVは、形質導入後5時間及び形質導入後20時間における、RLP MAGEA3により形質導入されたU937細胞へのMAGEA3をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXVIは、形質導入後5時間における、RLP TAAs(腫瘍関連抗原又は腫瘍抗原)(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)により形質導入されたU937細胞への、3つのTAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXVIIは、形質導入後20時間における、RLP TAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)により形質導入されたU937細胞への、3つのTAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXVIIIは、形質導入後5時間及び形質導入後20時間における、RLP MAGEA3により形質導入されたhDC細胞への、MAGEA3をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXIXは、形質導入後5時間における、RLP TAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)により形質導入されたhDC細胞への、3つのTAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXXは、形質導入後20時間における、RLP TAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)により形質導入されたhDC細胞への、3つのTAAs(PS−MAGEA3、PS−GP100、PS−TYR)をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXXIは、本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子の生産に使用される、2つのサブユニットIL12b(p40)及びIL12a(p35)によって形成された、目的のRNA配列として、免疫調節タンパク質IL12を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す; 図XXXIIは、形質導入後5時間に、RLP−IL−12/PSMAGEA3により形質導入されたU937細胞への、MAGEA3及びIL12をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXXIIIは、形質導入後20時間に、RLP−IL−12/PSMAGEA3により形質導入されたU937細胞への、MAGEA3及びIL12をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXXIVは、形質導入後5時間に、RLP−IL−12/PSMAGEA3により形質導入されたhDC細胞への、MAGEA3及びIL12をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXXVは、形質導入後20時間に、RLP−IT−12/PSMAGEA3により形質導入されたhDC細胞への、MAGEA3及びIL12をコードするRNAの転移の実証を示す図である; 図XXXVIは、RLP−IL12/MAGEA3で形質導入されたhDCによって分泌された免疫調節タンパク質IL12の定量化を示す図である(形質導入後48時間); 図XXXVIIは、p8.74レンチウイルスカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図を示し、ここでは、結合ドメインPP7 Coatはヌクレオカプシド配列に導入されており、このカプシド形成プラスミドは、本発明に係るPP7RLP レンチウイルス粒子の生産のために使用される; 図XXXVIIIは、1pg p24/細胞の用量でのRLP−PP7(NC).ZsGreen1により形質導入されたBMDCの細胞生存率及びZsGreen1の発現動態を示す図である; 図XXXIXは、2pg p24/細胞の用量でのJurkat細胞へのRNAの転移に対する、MS2RLP 12X粒子の生産のための野生型GAG−POL前駆体の影響を示す図である; 図XXXXは、10pg p24/細胞の用量でのJurkat細胞へのRNAの転移に対する、MS2RLP 12X粒子の生産のための野生型GAG−POL前駆体の影響を示す図である; 図XXXXIは、15秒後(XXXXIb)及び1分後(XXXXIa)の抗p24ウェスタンブロットによるMS2RLPウイルス粒子の成熟の分析を示す;並びに 図XXXXIは、15秒後(XXXXIb)及び1分後(XXXXIa)の抗p24ウェスタンブロットによるMS2RLPウイルス粒子の成熟の分析を示す;並びに 図XXXXIIは、HCT116細胞内に、MS2及びPP7カプシド形成配列によってカプシド形成されたRNAを転移させるための、MS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子の有効性を示す図である。
以下の実施例において、形質導入アッセイの全ては、組み込みレンチウイルスベクター(ILV)を用いて、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝物質を運ぶRNAを有するレンチウイルス粒子(RLP)を用いて行われる。RLP粒子が非組み込み型である場合、バッチの力価は、1ミリリットル当たりの物理的粒子(PP/ml)として決定されるが、組み込みレンチウイルスベクターについては、力価は従来どおりに、1ミリリットル当たりの形質導入ユニット(transduction units)(TU/ml)で表される。したがって、RLP粒子での感染多重度(multiplicity of infection)(MOI)は、PP又は細胞当たりのpgのp24タンパク質で表され、そして、ILVベクターでのMOIは、TU/mlで表される。形質導入アッセイは、飽和条件を回避するよう注意しながら、かつ粒子の各タイプについての用量効果を可視化することを可能にする条件を優先して、ベクターの各タイプについて行われる。ビリオンの逐次回収を優先することによって上清中の毒性タンパク質の産生を最小限に抑えるために、2つのタイプの産物RLP及びILVは、無血清産物であることを覚えておくことが重要である。
一度清澄化されると、高い純度を得るために、上清は、接線限外濾過によって濃縮及び精製される。
実施例1:本発明に係るウイルス粒子による免疫系の細胞の形質導入、及び他のシステムによる形質導入有効性の比較
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
1.1 本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−polyA発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフの12回の反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ、緑色(ZsGreen1)、赤色(mCherry)又は青色(mtBFP)蛍光タンパク質をコードするDNAであり得る(その発現カセットは図Iに記載されている)。目的の配列は、タンパク質、例えば免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするcDNAであり得る。目的の配列はまた、cDNA、shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA又はcircRNAの配列であり得る。
・カプシド形成プラスミド:レンチウイルス粒子を、第2のZn fingerドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にMS2バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を含むように改変した。MS2RLP粒子の生産のために使用された、構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子(Gag、Pol)を有するp8.74カプシド形成プラスミドを、以下の戦略に従って改変する:このp8.74プラスミドは、アセンブリPCRによって、p8.74ΔZFヌクレオカプシドタンパク質の第2のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第2のジンクフィンガーは、HpaIクローニングによってMS2ファージのコートタンパク質により置換されて、プラスミドp8.74ΔZF−MS2−Coatを生成する(その発現カセットは図IIに記載されている)。Polコーディング配列は、MS2RLPの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素(RT)又はインテグラーゼ(IN)をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは例えば、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−G 遺伝子の配列であり得る(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
1.2 組み込みレンチウイルスベクターILVを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列、の発現カセットを有する。目的の遺伝子の配列は、例えば、ルシフェラーゼ(図IVa)、蛍光レポーター(図IVb)又はCRE リコンビナーゼ(図IVc)の配列であり得る。このプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列WPRE(Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element)又は配列cPPT/CTSを含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。
・カプシド形成プラスミド:構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子(Gag、Pol)を有するp8.74カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターを生産するために使用される(その発現カセットは図Vに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは例えば、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSVG 遺伝子の配列であり得る(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.バッチの生産
細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、又は国際公開第2013/014537号の出願に記載の方法に従って濃縮/精製して使用した。
2.1 レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の生産
5%のCO2で湿潤雰囲気下、37℃で、1%のペニシリン/ストレプトマイシン及び1%のウルトラグルタミン(PAA)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco、Paisley、UK)で培養した、HEK293T細胞(ATCC、CRL−11268)を用いて10−スタックの細胞TACK(6360cm2、Corning)で、生産を行う。血清の影響を研究する実験のために、DMEMを10%のFCSで補充する。特に、酪酸ナトリウムによる誘導は行わない。各バッチ(MS2RLP及びILV)について、トランスフェクション混合物は以下の3つのプラスミドからなる:
−粒子(MS2RLP)又はベクターILVが形成されているかに応じて、上述の発現プラスミドの1つ、
−p8.74ΔZF Coat(MS2RLP)、p8.74(ILV)並びに
−エンベロープVSV−Gを有するpENV。
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである:40%の発現プラスミド、30%のp8.74(又はp8.74ΔZF)プラスミド、30%のpENVプラスミド。
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから24時間後に、培養上清を新鮮な未補充DMEM培地で交換する。細胞を37℃/5%CO2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を4回採取する(トランスフェクション後32時間、48時間、56時間及び72時間)。各収集物を、5分間の3000gでの遠心分離によって清澄化した後に、0.45μmのフィルター(Stericup(登録商標)、Millipore)で精密ろ過する。全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
2.2 レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の濃縮及び精製
ベクター及び粒子を、以下の2つの方法の1つに従って濃縮及び精製する:
・方法P1は、中央遠心分離ユニットでの上清の正面限外濾過を行うことを意図する。
・方法P2は、上清の接線限外濾過、次いで透析濾過を行うことを意図する。粗上清を、ポリスルホン中空繊維カートリッジを用いた接線限外濾過によって濃縮及び精製する。上清を、DMEM又はTSSM緩衝液に対して連続モードで20ダイアボリューム(diavolumes)での透析濾過によって処理する。透析濾過後に、保持液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。
本実施例についてのバッチの生産/濃縮/精製は、方法P2に従って行う。
3.滴定
3.1 qPCRによる機能的粒子の滴定
HCT116細胞(ATCC、CCL−247)を、10%のFCS、100μg/mLのストレプトマイシン、100U/mLのペニシリン及び2mMのL−Glnで補充した、100μLのDMEM中の96−ウェルプレートに播種し、次に、37℃/5%CO2で24時間インキュベートする。各ベクター並びに内部標準について六連希釈を行う。細胞を、Polybrene(登録商標) 8μg/mL(Sigma)の存在下でこれら連続希釈液により形質導入し、次に、37℃/5%CO2で3日間インキュベートする。一連の試料のそれぞれについて、非形質導入細胞の1つのウェルを対象として加える。次に、細胞をトリプシン処理し、Nucleospin tissue gDNA抽出キット(Macherey-Nagel)を用いてゲノムDNAを抽出した後に、力価(形質導入ユニット/mL)をqPCRによって決定する。qPCRによって得られた力価(TU/mL)を、その力価がFACSによって予め決定された内部標準によって正規化する。
3.2 ELISA P24アッセイによる物理的粒子の定量化
p24カプシドタンパク質は、HIV-1 p24 ELISA kit(Perkin Elmer)を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたp24タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合化され、次にストレプトアビジン−HRPペルオキシダーゼコンジュゲートにより検出される。得られた複合体は、捕捉されたp24タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−HCl(OPD)基質とのインキュベーション後に、分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybridプレートリーダー(Biotek)を用いて定量化し、標準範囲のp24タンパク質の吸光度に対して較正する。1pgのp24タンパク質が104個の物理的粒子に対応することを知ることによって、1mlあたりの物理的粒子として表されるウイルス力価を、得られたp24タンパク質の濃度から計算する。
II.免疫系の細胞の形質導入
1.リンパ球
1.1 ヒトリンパ球細胞の調製
全ヒトリンパ球を、Ficoll勾配で末梢単核細胞又はPBMC(末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell))を単離することによって、全ヒト血液から調製する。血液試料を室温で採取し、適切なチューブ(15又は50ml)中でPBS 1X pH 7.4で1/2に希釈する。
1容量のFicoll溶液(GE Healthcare)を、2容量の希釈血液の下に慎重に入れる。混合されない2つの分離相を得ることが重要である:下相はFicollに対応し、上相は希釈血液に対応する。チューブを、30分間400gで室温で遠心分離する。遠心分離後に得られる異なる相を乱すのを避けるために、遠心分離機のブレーキを停止する。
上相は血漿に対応し、下相はFicollに対応し、そして、これら2つの相の間に環が形成され、これは目的の集団(PBMC)を含む。
PBMCの環を注意深くピペットで取り、新しいチューブに移す。次に、PBMCを、少なくとも3容量のPBS 1X pH 7.4の溶液で2回洗浄する。細胞を10分間100gで室温で遠心分離する。
上清を除去したら、PBMCを、RPMI培養培地、10%ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンに再懸濁し、番号を付する。
細胞を1.106細胞/mlの濃度で再懸濁し、プラスチック培養支持体上に37℃/5%CO2で2時間置く。このステップは、単球がプラスチックに接着することを可能にし、一方で、リンパ球は懸濁液中に残り、従って、形質導入の準備として1.56×105細胞/cm2で播種される前の培養上清中に回収され得る。
1.2 マウスリンパ球細胞の調製
マウスリンパ球を脾臓から調製する。頸椎脱臼による動物の安楽死後に、脾臓をマウスから回収する。脾臓を、6−ウェル培養プレートのウェルに入れ、26G 1/2針を装着した注射器での2mg/mlのコラゲナーゼD(Roche diagnostics)の溶液の1mlの注入によって膨潤させる。脾臓を、2mg/mlのコラゲナーゼDの溶液の1ml中で滅菌メスを用いてウェル内で小片に切断する。脾臓の小片を含む2mlの溶液を、15−mlチューブに移し、+37℃の水浴中で30分間インキュベートする。15mlの最終容量に13mlの冷MACS緩衝液(PBS 1X pH 7.4、0.5%FCS、2mMのEDTA)を添加することによって、酵素消化を停止させる。細胞懸濁液を、50−mlチューブ上に置いた70−μm細胞篩で濾過する。容量を冷MACS緩衝液で30mlにする。細胞懸濁液を、10分間300gで、+4℃で遠心分離する。
次に、CD8マーカーの発現についてのポジティブソーティングを行う。このために、上清を吸引により除去し、細胞ペレットを、90μlの冷MACS緩衝液及び107細胞について10μlの抗CD8ビーズ(Miltenyi Biotec)に取る。 混合物を15分間+4℃でインキュベートする。インキュベーションの最後に、一定容量のMACS緩衝液q.s.15mlを懸濁液に加える。懸濁液を10分間300gで、+4℃で遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを、108細胞のための冷MACS緩衝液の500μlに取る。懸濁液を、磁石を取り付けて冷MACS緩衝液で予め平衡化したMS型のカラム(Miltenyi Biotec)に入れる。カラムを3x500μlの冷MACS緩衝液で洗浄する。ネガティブ画分(約2ml)を冷MACS緩衝液で5mlにし、次に細胞計数を実施する。細胞懸濁液を、10分間300gで、+4℃で遠心分離し、細胞を、タイプTCT 6−ウェルプレート(Corning)内で、1.106細胞/mlの割合で、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補充したRPMI 1640培地内中に再懸濁し、形質導入する。
ソーティング後に、得られた異なる画分を、選別された集団の純度をモニタリングするための抗CD8 抗体標識を用いたフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)によって分析する。
1.3 リンパ球(ヒト及びマウス)の形質導入
形質導入の日に、リンパ球を、1ウェル当たり50μlの容量で細胞培養用に処理された平底96−ウェルプレート中に0.5×106細胞/mlの割合で再懸濁しする。4μg/mlの最終Polybrene(登録商標)と、選択されたMOIでの様々なベクター(すなわちRLPの場合には10、20又は30pg p24/細胞、及びヒトTリンパ球のためのILVの場合にはMOI 10、20、25又は50;RLPの場合には0.1、0.5、1、又は 5pg p24/細胞、並びに、マウスCD8+Tリンパ球のためのILVの場合にはMOI 5、10、25、50又は75)とを含有する形質導入培地を調製し、100μl/ウェルの最終容量のために、50μlの容量で細胞に添加する。次にプレートを75分間1000gで、30℃で遠心分離する。形質導入培地を、遠心分離ステップの後に、37℃、5%CO2で4時間細胞上に放置する。このインキュベーション後に、80%の形質導入培地(80μl)を抜き取り、180μlのRPMI培地、10%ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを、各ウェルに添加する。細胞を37℃、5%CO2で分析までインキュベートする。
2.樹状細胞
2.1 ヒト樹状細胞の調製
2.1.1 ヒト全血からのヒト末梢単核細胞(peripheral mononuclear cell)(PBMC)の単離
ヒト樹状細胞を、Ficoll勾配でPBMCを単離することによって全ヒト血液から調製する。血液試料を室温で採取し、適切なチューブ(15又は50ml)内でPBS 1X pH 7.4で1/2に希釈する。
1容量のFicoll溶液(GE Healthcare)を、2容量の希釈血液の下に慎重に入れる。混合されない2つの分離相を得ることが重要である:下相はFicollに対応し、上相は希釈血液に対応する。チューブを、30分間400gで室温で遠心分離する。遠心分離後に得られる異なる相を乱すのを避けるために、遠心分離機のブレーキを停止する。
上相は血漿に対応し、下相はFicollに対応し、そして、これら2つの相間に環が形成され、これは目的の集団(PBMC)を含む。
PBMCの環を注意深くピペットで取り、新しいチューブに移す。次に、PBMCを、少なくとも3容量のPBS 1X pH 7.4の溶液で2回洗浄する。細胞を10分間100gで室温で遠心分離する。
上清を除去したら、PBMCを、SFM培養培地、2mMのL−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシンに再懸濁し、番号を付する。
細胞を1.106細胞/mlの濃度で再懸濁し(2.5×106細胞/cm2)、37℃/5%CO2で2時間、タイプTCT 48−ウェルプレート(Corning)に入れる。このステップは、単球がプラスチックに接着することを可能にし、一方で、リンパ球は懸濁液中に残る。2時間のインキュベーション後、単球のみが培養され続けるようにプレートをPBS1Xで洗浄し、これを形質導入することになる。
2.1.2 樹状細胞への単球の集団の分化
樹状細胞を、タイプTCT 48−ウェルプレート(Corning)内で、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、200nMのヒトIL4及び50mMのヒトGM−CSFで補充したSFM培地中に、1.106細胞/mlの割合で培養する。これら培養条件は、未熟表現型の樹状細胞(iDC)を得ることを可能にする。樹状細胞を、37℃/5%CO2で5日間培養し続け、3日目に培養培地を更新する。
成熟樹状細胞(mDC)を得るために、培養の3日目に、細胞を、0.1 μg/mlのLPSを含有する成熟培地に入れる。
2.2 マウス樹状細胞の調製
マウス樹状細胞(DC)を、後肢から得られた骨髄から調製する(BMDC培養)。長骨、大腿骨及び脛骨を成体マウスから回収し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地を含有する50−mlチューブに移す。26G 1/2針を装着し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補充したRPMI 1640培地を含有する注射器を用いて、骨から骨髄を取り除く。細胞懸濁液を、5分間300gで、+4℃で遠心分離する。上清を除去し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補充したRPMI 1640培地の1ml+Gey溶液(155mMのNH4Cl、1mMのKHCO3)の3mlに、ペレットを取る。細胞懸濁液に含まれる赤血球を溶解するために、懸濁液を5分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補充したRPMI 1640培地で、容量を15mlに調整し、反応を止め、細胞懸濁液を5分間300gで、+4℃で遠心分離する。上清を除去し、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補充したRPMI 1640培地の一定容量に、ペレットを取る。この細胞懸濁液を、50−ml チューブ上に置いた70−μm 細胞篩で濾過する。約30mlの最終容量が得られるまで、篩をすすぐ。細胞を計数し、細胞懸濁液を5分間300gで遠心分離する。上清を除去し、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、50μMの2−メルカプトエタノール、25ng/mlのマウスIL4及び25ng/mlのマウスGM−CSFで補充したRPMI 1640培地の一定容量に、ペレットを取り、1.106細胞/mlの細胞濃度を与える。樹状細胞を、タイプULA 6−ウェルプレート(Corning)内で1.106細胞/mlの割合で培養する。樹状細胞を37℃/5%CO2で5日間培養し続け、2〜3日毎に培養培地を交換する。3日目に、BMDCを、培養に使用したプレートに依然として接着しているマクロファージ型の細胞からそれらを分離するために、新しい6−ウェルULAプレートに戻す。
2.3 ヒト樹状細胞の形質導入
PBMCの単離に対応する日に、細胞を、選択されたMOI(RLPの場合には1、2又は4pg p24/細胞、及びILVの場合にはMOI 25、50又は75)でのILV.EF1.ZsGreen1ベクターによって、SFM培養培地、2mMのL−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン中で、以下のトランスフェクション剤:4μg/mLでのPolybrene(登録商標)(Sigma)及びBX795 6μM(Invivogen)と共に、形質導入し、そして+37℃/5%CO2でインキュベートする。形質導入から4時間後に、形質導入培地を、樹状細胞に特異的な分化培地(SFM、2mMのL−グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、200 nM ヒトIL4及び50mMのヒトGM−CSF)で交換する。この培地は、未熟樹状細胞(iDC)の培養を可能にする。EF1.ZsGreen1カセットでの形質導入を十分に行うために、細胞を播種後4時間に、種々のベクター(RLP又はILV)によって形質導入する。
形質導入された細胞を異なる時点で分析する(形質導入後1、2、3及び4日)。
成熟樹状細胞(mDC)を得るために、細胞を、培養の3日目に0.1 μg/mlのLPSを含有する成熟培地に入れ、それらを4日目に分析する。
2.3.1 RLP.ZsGreen1によるヒト樹状細胞の形質導入
RLP.ZsGreen1ベクターによって形質導入された樹状細胞は、1pg p24〜4pg p24/細胞のRLP粒子の増加する範囲に従って、かつ異なる分析時点での(iDCについて形質導入後1、2、3及び4日、並びにmDCについて形質導入後4日)、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)及びBX795 6μM(Invivogen)を含有する培地のみを用いて調製する。
樹状細胞は、抗CD11c、抗CD209 DC SIGN、抗CD86特異的抗体(Miltenyi Biotec)による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴付けられる。
2.3.2 ILV.EF1.ZsGreen1によるヒト樹状細胞の形質導入
ILV.EF1.ZsGreen1ベクターによって形質導入された樹状細胞は、感染多重度MOI 25〜75のILVレンチウイルス粒子の増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での(iDCについて形質導入後1、2、3及び4日、並びにmDCについて形質導入後4日)、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLでのPolybrene(登録商標)(Sigma)及びBX795 6μM(Invivogen)のみを含有する培地で調製する。
樹状細胞は、抗CD11c、抗CD209 DC SIGN、抗CD86特異的抗体(Miltenyi Biotec)による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
2.4 マウス樹状細胞(BMDC)の形質導入
培養開始から6日後に、樹状細胞を回収し、5分間300gで遠心分離する。上清を除去し、細胞を、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補充したRPMI 1640の1mlで洗浄し、5分間300gで遠心分離する。樹状細胞を、96−ウェル又は24−ウェルプレート内、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、50μM 2−メルカプトエタノール、25ng/mlのマウスIL4及び25ng/mlのマウスGM−CSFで補充したRPMI 1640中に、0.5×106細胞/mlで播種する。ZsGreen1蛍光の発現による形質導入を十分に行うために、細胞を播種後24時間に、種々のベクター(RLP又はILV)によって形質導入する。形質導入はPolybrene(登録商標) 4μg/mL(Sigma)の存在下で行い、1000gで75分間+30℃でのプレートの回転培養(spinoculation)に続く。次に、形質導入培地を4時間+37℃/5%CO2で放置する。
インキュベーション後、80%の形質導入培地をピペッティングにより除去し、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、50μM 2−メルカプトエタノール、25nM マウス IL4及び25ng/mlの予熱したマウスGM−CSFで補充した等量のRPMI 1640と交換する。次に、細胞を37℃/5%CO2に戻す。
2.4.1 RLP.ZsGreen1によるマウス樹状細胞の形質導入
RLP.ZsGreen1ベクターによって形質導入された樹状細胞は、0.1pg p24〜5pg p24/細胞のRLP粒子の増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での(形質導入後1、2、3及び4日)、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)を含有する培地のみで調製する。
樹状細胞は、抗CD11c、抗CD86、抗CD80特異的抗体(Miltenyi Biotec)による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
2.4.2 ILV.EF1.ZsGreen1によるマウス樹状細胞の形質導入
ILV.EF1.ZsGreen1ベクターによって形質導入された樹状細胞は、感染多重度MOI 5〜75のレンチウイルス粒子ILVの増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での(形質導入後1、2、3及び4日)、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)を含有する培地のみで調製する。
樹状細胞は、抗CD11c、抗CD86、抗CD80特異的抗体(Miltenyi Biotec)による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
3.細胞の表現型決定及び特徴づけ
3.1 リンパ球の免疫標識
ソーティング後に、又は形質導入後の異なる分析時点で、リンパ球を、それらが懸濁している培養プレートから回収し、細胞を円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、PBS 1X pH 7.4、5%FCSの溶液で洗浄し、300gで5分間遠心分離する。上清を反転によって除去する。
リンパ球を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する:抗CD8、抗CD4、抗CD3又は抗TCR(Miltenyi Biotec)。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり50μlを細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で20分間インキュベートする。50μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSを添加し、細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取る。細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
3.2 ヒト樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、ウェルを、培養プレートのフォーマットに応じてピペットコーン又はスクレーパーで掻き取り、細胞を円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞をPBS 1X pH 7.4、5%FCSの溶液で洗浄し、、300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
樹状細胞を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する:抗CD11c、抗CD209 DC SIGN、抗CD86(Miltenyi Biotec)。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり50μlを回収した樹状細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で20分間インキュベートする。50μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSを添加し、細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取る。細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
3.3 マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、PBS 1X pH 7.4の溶液で洗浄し、300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
樹状細胞の生存率を、「Viobility(商標)485/520」生存率マーカー(Miltenyi Biotec)での特異的免疫標識によって分析する。このために、DMSO溶液中のViobility(商標)の1μlを、100μlのPBS 1X pH7.4中の細胞の各ウェルに適用する。細胞を室温暗所で20分間インキュベートする。細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、再度300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、表現型について後述するように特異的抗体で標識する。
樹状細胞を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する:抗CD11c、抗CD86、抗CD80(Miltenyi Biotec)。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり50μlを回収した樹状細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で20分間インキュベートする。50μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSを添加し、細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取る。細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
3.4 フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ(SSC)及びそれらの粒度(FSC)に従って較正した。Viobility(商標)で標識された細胞は、死んでいるか死にかけている、従って生細胞は陰性細胞である(除外による標識)。細胞は、MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア(Miltenyi Biotec)で分析される。
III.結果:
1.RLP及びILVによる免疫細胞の形質導入有効性の比較
1.1 Tリンパ球
RLP粒子又はILVベクターによるTリンパ球の形質導入は、ヒト(図VIa及びVIb)においてマウス(図VIIa及びVIIb)よりも優れた有効性を示している。実際に、ナイーブヒトTリンパ球は、RLPにより70%の有効性で形質導入され、これはILVベクターにより得られる有効性に匹敵する。同様に、陽性細胞の90%超が、ILVによるように、RLPによる活性化後に得られる。しかしながら、マウスTリンパ球は形質導入することがさらに困難であり、結果は、試験された感染多重度の条件下でRLPについての20%からILVによる70%までの範囲である。感染多重度(MOI)を高めることにより、マウスTリンパ球に対してより高い有効性を得ることが可能であるが、細胞毒性を誘発する危険性がある。
1.2 樹状細胞
樹状細胞(DC)の第1の形質導入アッセイを、健康なヒトドナーからの末梢血から調製したヒト細胞に対して行った。
RNAを有するレンチウイルス粒子(RLP)又は組み込みレンチウイルスベクター(ILV)による未熟ヒト樹状細胞(DC)の形質導入は、同等の有効性を示す。発現は、形質導入後4日まで安定なままである(図VIIIc)。4pg p24/細胞のMOIでのRLP粒子によるヒトDCの形質導入は(図VIIIa)、40%の陽性細胞をもたらす。この同じ40%の有効性は、MOI 75でのILVベクターにより得られる(図VIIIb)。組み込みのために、ILVベクターによる形質導入から生じる発現は、経時的に安定なままである(図VIIId)。形質導入されたDCに対するヒトDCに特徴的な4つのバイオマーカーの分析は、これらバイオマーカーの発現がRLP粒子による形質導入によって有意に改変されないことを示し(図VIIIe)、形質導入が標的細胞の表現型を改変しないことを実証する。CD209マーカーのわずかな増加のみを伴って、同じ結果が組み込みレンチウイルスベクターにより得られている(図VIIIf)。これら結果は、ILVベクター及びRLP粒子による形質導入が、未熟DCの未熟表現型を乱すことなく、かつそれらを活性化又は分化プロセス又は経路に関与させないことを示している。
並行して、形質導入アッセイを、培養物にLPSを添加することによって、成熟した樹状細胞に対して行った。結果は、4pg p24/細胞のMOIでの粒子により30%の(図IXa)及び75のMOIでのILVベクターにより50%の(図IXb)成熟DCの形質導入の有効性を示す。前述のように、RLP粒子(図IXc)及びILVベクター(図IXd)による形質導入は、樹状細胞に特徴的なバイオマーカーの発現を有意に妨げない。
同じ形質導入アッセイを、マウス骨髄に由来する樹状細胞(BMDC)に対して行った。得られた結果は、5pg p24/細胞のMOIでのRLP粒子により80%の(図Xa)及び75のMOIでのILVベクターにより90%の(図Xb)BMDCの形質導入を示す。いずれの場合にも、RLP粒子又はILVベクターによる形質導入は、用量効果を示す。RLP粒子によるBMDCの形質導入動態は、蛍光が形質導入後4日で安定なままであることを示している(図Xc)。ILVベクターにより形質導入されたBMDCにおける蛍光発現の動態は、3日目から開始して組み込みベクターについて古典的にのみ見られた(図Xd)。並行して、マウスDCの特異的バイオマーカーの発現は、RLP粒子(図Xe)によるものであるか又はILVベクターによるものであっても(図Xf)、形質導入後に改変されない。
2.マウス樹状細胞(BMDC)におけるRLP及びILVの用量増加により誘導された毒性の分析
形質導入アッセイを、上述したマウス骨髄に由来する樹状細胞(BMDC)に対して行ったが、ILV又はRLPの増加用量での形質導入によって毒性が誘導されたかを評価するために、死細胞の特異的標識を含んだ形質導入されたBMDCを、全生細胞のパーセンテージ、並びに樹状細胞の特異的CD11cマーカーを発現する細胞のうちZsGreen1を発現する細胞のパーセンテージに基づいて、D2に分析した。得られた結果(図XXII)は、形質導入後48時間に、CD11cを発現するBMDCにおけるZsGreen1の発現の特異的分析が、0.5pg p24/細胞のMOIから始まるCD11c+BMDCの50%のRLP粒子により、及び75のMOIでのILVベクターによる75%の形質導入を示すことを示している。用量効果はまた、これら細胞によって発現された蛍光強度の分析において観察され、RLPについての同等のレベルは、ILVについてはMOI 1又はRLPについては5pg p24/細胞で使用される。最後に、BMDCに適用されたRLP粒子の用量に関わらず(0.1〜5pg p24/細胞)、有意な毒性は観察されない(生存率>80%)。いずれの場合にも、従って、RLP粒子による又はILVベクターによる形質導入は、初代細胞に対して、及び特にAPCに対してのレンチウイルス粒子の非毒性を実証する。
実施例2:免疫細胞における受容体又は 抗原の発現の有効性
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
1.1 本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−polyA発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフの12回の反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。目的の配列は、タンパク質、例えば免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするcDNAであり得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び/又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、MAGEA3抗原を発現するために使用される配列は、完全(図XIa)又は部分的(図XIb)であり得る。腫瘍バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばgp100(図XIc)又はチロシナーゼ(図XId)の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
1.2 組み込みレンチウイルスベクターILVを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列、の発現カセットを有する(その発現カセットは図XIIに記載されている)。このプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列WPRE(Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element)又は配列cPPT/CTSを含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。前述のように、目的の配列は、完全な抗原性タンパク質、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び/又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、MAGEA3を発現するために使用される配列は、完全(図XIIa)又は部分的(図XIIb)であり得る。腫瘍バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばgp100(図XIIc)又はチロシナーゼ(図XIId)の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図Vに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.バッチの生産及び滴定
バッチの生産及び滴定は、以下の発現プラスミドの1つを用いて、実施例1に記載したように方法P2に従って行われる:
−pcDNA−EF1.Fluorescent Gene.MS2 12X(その発現カセットは図Iに記載されている)。
−pILV−EF1.Fluorescent Gene.WPRE(その発現カセットは図IVbに記載されている)。
−pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X(その発現カセットは図XIaに記載されている)。
−pILV.EF1.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE(その発現カセットは図XIIaに記載されている)。
バッチの滴定は、実施例1に記載されたものと同一の方法によって行う。
II.マウス樹状細胞(BMDC)の形質導入
マウス樹状細胞を、実施例1に記載されたものと同一の方法によって調製する。
1.RLP−MAGE A3−IRES−GFPによる単一腫瘍抗原でのマウス樹状細胞の形質導入
RLP.MAGE A3−IRES−GFP粒子により形質導入された樹状細胞は、0.1pg p24〜5pg p24のRLP粒子の増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での(形質導入後1、2、3及び4日)、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)のみを含有する培地で調製する。
樹状細胞は、抗CD11c、抗CD86、抗CD80特異的抗体(Miltenyi Biotec)による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
2.ILV−MAGE A3−IRES−GFPによる単一腫瘍抗原でのマウス樹状細胞の形質導入
ILV−MAGE A3−IRES−GFPベクターによって形質導入された樹状細胞は、感染多重度MOI 5〜75のレンチウイルス粒子ILVの増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での(形質導入後1、2、3及び4日)、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)のみを含有する培地で調製する。
樹状細胞は、抗CD11c、抗CD86、抗CD80特異的抗体(Miltenyi Biotec)による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
3.細胞の表現型決定及び特徴づけ
3.1 マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、PBS 1X pH 7.4の溶液で洗浄し、5%FCS、300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
樹状細胞を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する:抗CD11c、抗CD86、抗CD80(Miltenyi Biotec)。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり50μlを回収した樹状細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で20分間インキュベートする。50μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSを添加し、細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取る。細胞を300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
3.2 フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ(SSC)及びそれらの粒度(FSC)に従って較正した。細胞は、MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア(Miltenyi Biotec)で分析される。
III.研究モデルの提示
1.Renca腫瘍モデル
このモデルは、Rencaタイプのマウス(Balb/c)腎臓癌の腫瘍細胞を使用する。これらマウス細胞は、ヒト起源のMAGE A3抗原を発現するようにILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFPベクター(MOI 100)により予め形質導入される。次に、このモデルは、成体の同系のBalb/cマウスの脇腹に、所定数のこれらの細胞(1.106細胞)を皮下に再移植することからなる。予備研究は、非常に早く限界点に達することなく、全ての動物で発達する腫瘍を発生させるための再移植する細胞の数を決定することを可能にする(腫瘍>2mm3、動物の体重減少>腫瘍の移植の日の体重の20%)。動物は、登録されたブリーダー(Janvier Europe又はCharles River Labs)から入手し、これら実験の全てについて詳述したプロトコルは、地域の倫理委員会(CEEA−122倫理委員会)に提出され、承認された。
2.改変された樹状細胞の再移植
BMDCを、実施例1(2.4)に記載されたように、RLPタイプ(実施例1、段落2.4.1)又はILVタイプ(実施例1、段落2.4.2)の粒子により形質導入し、Balb/cマウスにおける形質導入翌日に、腫瘍再移植と同じ側に位置する鼠径リンパ節のレベルで皮内に再移植する。異なる量の細胞を、このモデルにおける治療力を評価するために再移植することができる。
3.腫瘍発生のモニタリング
全ての動物をその全身状態について毎日チェックする。1週間に3回、それらを秤量し、腫瘍の発生をキャリパーゲージを用いて手動で測定する。腫瘍体積は、以下の式に従ってmm3で与えられる:V=a*(b2/2)、ここで、a=最大直径、及びb=最小直径。倫理的な理由から、腫瘍の発生は2000mm3の体積に制限され、この限界に達するか、又はその初期体重(=腫瘍細胞の再移植の日における)の20%超を失った動物は屠殺される。
IV.結果:RLP及びILVによる抗原の発現の有効性の比較
第1の実験は、マウス樹状細胞(BMDC)による腫瘍抗原(MAGE A3)の抗原提示の有効性を試験するために行った。BMDCを、ZsGreen1 蛍光を用いた試験で決定された最適条件下で、RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子又はILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFPベクターによって形質導入した。いずれの場合においても一定範囲のMOIを行い、細胞を樹状細胞の特異的マーカーの発現について3日目に表現型決定した(図XIIIa及びXIIIb)。前述のように、これらの分析は、どのMOIが適用されたとしても、形質導入により表現型は変更されないことを示している。
RLP.ZsGreen1又はRLP.MAGE A3粒子によって形質導入されたBMDCはまた、Balb/c マウスにおいて、インビボでMAGE A3を発現する腫瘍の発生を試験するために使用された。Rencaタイプの同系腫瘍細胞を受けたマウスの2つの群は(0.75×106細胞)、それ自体をヒト起源のMAGE A3 腫瘍抗原を発現するように予め改変した。同日に、これらの動物は、皮内に、対応する鼠径リンパ節の近くに、対照群についてはRLP−ZsGreen1により、又は試験群についてはRLP.MAGE A3により改変されたBMDCの懸濁液(1×105細胞)を受けた。次に、腫瘍の発生のモニタリングは、BMDC.MAGE A3を受けた動物が、対照群における動物とは対照的に、腫瘍を発生しなかったことを示している(図XIV)。
実施例3:インテグラーゼの改変によるPP7(IN)−RLP 2Xレンチウイルス粒子の有効性
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−polyA発現カセットを有する(図XV又はXXIII)。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、PP7 RNAのステム−ループモチーフの2回の反復(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号2及びctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag 配列番号3)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した(図XV又はXXIII)。
使用したプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得るが(図XV又はXXIII)、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ(図XV)、緑色(ZsGreen1)(図XXIII)、赤色(mCherry)又は青色(mtBFP)蛍光タンパク質をコードするDNA、あるいは、タンパク質、例えばタンパク質CREをコードするcDNAであり得る。好ましくは、cDNAは、免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする。目的の配列はまた、shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA又はcircRNAの配列であり得る。
・カプシド形成プラスミド:レンチウイルス粒子を、インテグラーゼ内に、PP7バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を含むように改変した。PP7(IN)−RLP 2X粒子を生産するために使用した構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子(Gag、Pol)を有するp8.74カプシド形成プラスミドを、図XVIに示された戦略に従って改変する:このp8.74プラスミドは、アセンブリPCRによって、PP7ファージのコートタンパク質がインテグラーゼのC−末端ドメインに融合したプラスミドを生成するために使用される。HpaIクローニングによって得られるこの融合は、P8.74− POL−PP7 Coatプラスミドを生成することを可能にする。これにより、その発現カセットが図XVIIに示されているコンストラクトが与えられる。Polコーディング配列は、例えば逆転写酵素(RT)をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gであり得る(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.レンチウイルス粒子の生産、濃縮/精製及び滴定
レンチウイルス粒子を、実施例1に記載されたように生産し、方法P2に従って濃縮及び精製する。粒子を実施例1に記載されたように滴定する。
II.マウス樹状細胞(BMDC)の形質導入
マウス樹状細胞を、実施例1に記載されたものと同一の方法によって調製する。
1.PP7(IN)−RLP 2Xでのマウス樹状細胞の形質導入
樹状細胞を、1pg p24/細胞のMOIで、実施例1(段落2.4)に記載したようにPP7(IN)−RLP.ZsGreen1ベクターにより形質導入し、異なる分析時点(形質導入後1、2及び3日)でのフローサイトメトリーによる生存率及びZsGreen1蛍光の発現について分析する。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)を含有する培地のみで調製する。
樹状細胞の生存率を、「Viobility(商標)485/520」(Miltenyi Biotec)での特異的免疫標識によって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。
2.細胞の表現型決定及び特徴づけ
2.1 マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、PBS 1X pH 7.4の溶液で洗浄し、300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
樹状細胞の生存率を、実施例1に記載されたものと同一の方法によって、「Viobility(商標)485/520」(Miltenyi Biotec)での特異的免疫標識によって決定する。
2.2 フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ(SSC)及びそれらの粒度(FSC)に従って較正した。Viobility(商標)で標識された細胞は死んでおり、従って生細胞は陰性細胞である(除外による標識)。細胞は、MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア(Miltenyi Biotec)で分析される。
III.結果
図XXIVは、1pg p24/細胞の用量でのPP7(IN)−RLP.ZsGreen1粒子により形質導入されたBMDC(APC)の細胞生存率及びZsGreen1の発現動態の測定を示す。形質導入後24時間から始まって安定して3日まで、ZsGreen1を発現するPP7(IN)−RLP粒子により形質導入されたマウスBMDCの割合は70%である。細胞は、3日間の分析にわたって同じ生存率のレベルを維持し;発現の強度のみが経時的に減少する。従って、インテグラーゼにPP7−Coatを有するレンチウイルス粒子内にRNAを輸送することが可能である。好ましくは、PP7(IN)−RLP粒子は、APC、例えばBMDC内に抗原配列を有するRNAを輸送するために使用される。
実施例4:免疫細胞内へのRLP粒子によるいくつかの抗原をコードするRNAの転移の実証
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−polyA発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフの12回の反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び/又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、MAGEA3抗原を発現するために使用される配列は、完全(図XIa)又は部分的(図XIb)であり得る。バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばgp100(図XIc)又はチロシナーゼ(図XId)の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(図II)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(図III)。
2.バッチの生産及び滴定
バッチの生産及び滴定は、以下の発現プラスミドの1つ又は複数を用いて、実施例1に記載したように方法P2に従って行われる:
−バッチRLP MAGEA3:pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X(図XIa)。
−バッチRLP TAAs:pcDNA.EF1long.PPRV.PS−AgMageA3.WPRE.MS2 12X(図XIb)+pcDNA.EF1long.PPRV.PS−Aggp100.WPRE.MS2 12X(図XIc)+pcDNA.EF1long.PPRV.PS−AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X(図XId)。
−バッチRLP.ZsGreen1:pcDNA.EF1.Fluorescent Gene.MS2 12X(図I)。
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである:40%の発現プラスミド又は発現プラスミド(RLP−TAAsの場合)、30%のp8.74(又はp8.74ΔZF)プラスミド、30%のpENVプラスミド。
II.APCの形質導入
1.U937株(ATCC(登録商標) CRL−1593.2(商標))
U937細胞株は、単球の多数の特徴を有する37歳の男性の組織球性リンパ腫から出発して確立された細胞株である。このモデルは、単球及びマクロファージの分化のインビトロ研究によく使用される。U937細胞を、超低接着表面(Ultra Low Attachment)(ULA)培養フラスコで、10%のウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンの存在下でのRPMI 1640培地(RPMI完全培地)の100 000細胞/mlで培養する。
1.1 RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子、又は3つの腫瘍抗原の混合物を含む粒子(RLP−TAAs)によるU937細胞の形質導入
形質導入の日に、細胞を回収し計数する。それらを、500μlの培地中に500 000細胞/mlでの細胞懸濁液を得るために、再懸濁する。形質導入の準備ができた播種を、24−ウェルULAプレートに、ウェル当たり500μlの割合で、かつ三連で実施する。
細胞を、以下のトランスフェクション剤:16μg/mLでのPolybrene(登録商標)、及びBX795 1.2μMで補充したRPMI完全培養培地内で形質導入し、+37℃/5%CO2で4時間インキュベートする。形質導入培地の500μlをそれぞれ対応するウェルに添加し、斯かるウェルには、トランスフェクション剤が、8μg/mLのPolybrene(登録商標)及び0.6μMのBX795の最終濃度で存在する。
形質導入から5時間後に、800μlの形質導入培地(80%)を抜き取り、800μlのRPMI完全培養培地と交換する。
1.2 細胞の回収
形質導入後5時間及び20時間に、細胞を再懸濁し、試料を15−mlチューブに入れ、次に200gで5分間遠心分離して、ペレットを得る。上清を捨て、細胞を1mlのPBS 1Xで洗浄した後に、再度200gで5分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを、1mlのトリプシン0.05%−0.53mMのEDTA(Corning)中に再懸濁する。細胞を5分間37℃でインキュベートする。インキュベーションの最後に、2mlのRPMI完全培養培地を細胞懸濁液に添加する。細胞を200gで5分間遠心分離し、次に上清を捨て、細胞を1mlのPBS 1Xで洗浄した後に、最後に一度200gで5分間遠心分離する。上清を捨て、細胞を乾燥ペレットの形態で−80℃ですぐに凍結する。
1.3 全RNAの抽出
各乾燥ペレットを氷上に置き、ゆっくり解凍する。1mlのTRIzol溶液を、各乾燥ペレットに室温で添加し、細胞を5分間インキュベートした後に、200μlのクロロホルムを添加する。試料を10回反転することによってホモジナイズし、2〜3分間室温でインキュベートする。試料を12000gで15分間、+4℃で遠心分離する。遠心分離の最後に、試料を氷上に置く。上相を新しいチューブ(500〜600μl)に移す。等量の70°エタノールを添加し、次に試料をボルテックスを用いてホモジナイズする。
全RNAを、「RNA精製ミニキット」(Ambion)のプロトコルに従って精製する。溶出を試料当たり30μlの純水溶液で行う。試料のRNAを、Nanodropを用いてアッセイし、次いで試料を−80℃で保存する。
1.4 RNAの逆転写
相補的DNAへのRNAの逆転写を、供給元の推奨に従って、「Maxima First Strand」酵素(ThermoFisher)を用いて各試料のRNAの500ngに対して行う。
1.5 RT−qPCRによるcDNAの増幅
増幅を、リアルタイムPCRミックス、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq(Takara - cat RR420L)を用いて、20μlの最終容量でのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの200nMの存在下で、超純粋で1/10希釈したcDNAの5μlに対して行う。
1/10希釈したcDNAの5μlを、各ウェルに添加する。
リアルタイムPCRを、以下のプロトコルに従ってSYBR(登録商標)Green化学を用いたStepOnePlusサーモサイクラー(Applied Biosystems)で行う:95.0℃での30秒の1サイクル、次いで95.0℃での5秒を含む40サイクル、及び60.0℃での30秒。
使用したセンスオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである:
−Q−hGAPDH−S(GACAAGCTTCCCGTTCTCAG)(配列番号4)
−Q−MAGEA3−F(CTGCCGACCACCATGAACTA)(配列番号5)
−Q−PSMAGEDC−F(TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA)(配列番号6)
−Q−PSTyrDC−F(ATGAGCCAGGTGCTTAACAACA)(配列番号7)
−Q−PSGP100DC−F(TGGCGCCTCAGCACTCTT)(配列番号8)
使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の通りである:
−Q−hGAPDH−AS(GAGTCAACGGATTTGGTCGT)(配列番号9)
−Q−MAGEA3−R(GGTTGCTGGAGTCCTCATAGGA)(配列番号10)
−Q− PSMAGETyrDC−R(GGTAGGCAATGAGGACGATGA)(配列番号11)
−Q−PSGP100DC−R(ACCTGGTCCATGATGGTGAAG)(配列番号12)
使用されることになるオリゴヌクレオチドの対の組み合わせは、標的に応じて、以下の通りである:
−Target hGAPDHと、Q−hGAPDH−S及びQ−hGAPDH−AS
−Target MAGEA3と、Q−MAGEA3−F及びQ−MAGEA3−R
−Target PS−MAGEDCと、Q−PSMAGEDC−F及びQ−PSMAGETyrDC−R
−Target PS−TyrDCと、Q−PSTyrDC−F及びQ−PSMAGETyrDC−R
−Target PS−Gp100DCと、Q−PSGP100DC−F及びQ−PSGP100DC−R
オリゴヌクレオチドの特異性の検証のための実験は、予め行われた。
2.未熟ヒト樹状細胞(iDC、hDCとも称する)の調製
未熟ヒト樹状細胞(hDC)を、実施例1に記載したものと同一の方法によって調製する(パートII、2.1)。
2.1 RLP.ZsGreen1粒子、RLP.MAGE A3粒子、又は3つの腫瘍抗原混合物を含む粒子(RLP−TAAs)によるヒト樹状細胞の形質導入
hDCの形質導入を、実施例1に記載したものと同一の方法によって行う(パートII、段落2.3)。細胞を4pgのp24/細胞で形質導入し、異なる時点で分析する(形質導入後5時間、20時間)。
形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)のみを含有する培地で調製する。
樹状細胞を、形質導入された細胞のペレットから得られたRNAに対してRT−qPCRによって、形質導入の日に及び異なる分析時点で分析する。
2.2 細胞の回収
形質導入後5時間及び20時間に、培養上清を、プラスチック培養プレートに接着したhDCを含むウェルから抜き取る。それらを、0.5mlのPBS 1Xで洗浄し、これを次に除去する。次に、細胞は、0.25mlのトリプシン0.05%−0.53mMのEDTA(Corning)を受け、2分間37℃でインキュベートする。インキュベーションの最後に、0.25mlのRPMI完全培養培地を添加し、ウェルをこすることによってhDCを回収する。細胞を200gで5分間遠心分離する。ウェルを0.5mlのPBS 1Xで洗浄し、これを遠心分離後のhDCのペレットを再懸濁するために使用する。このようにして回収したhDCの全てを、再度5分間200gで遠心分離する。上清を捨て、細胞を0.5mlのPBS 1Xで最後に一度洗浄した後に、200gで5分間遠心分離する。上清を捨て、細胞を、乾燥ペレットの形態で−80℃ですぐに凍結する。
2.3 全RNAの抽出
RNAを、AmbionのRNA 精製ミニキットを用いて、この同実施例のII.1.3に記載されたものと同一の方法によって調製する。試料当たり30μlの純水溶液で溶出を行う。試料のRNAのアッセイを、Nanodropを用いて行い、次に試料を−80℃で保存する。
2.4 RNAの逆転写
相補的DNAへのRNAの逆転写を、この同実施例のII.1.4に記載された方法によって、500ngのRNAに対して行う。
2.5 RT−qPCRによるcDNAの増幅
RT−qPCRによるcDNAの増幅を、この同実施例の段落II.1.5に記載された方法によって行う。
III.結果
RT−qPCRによる特異的分析は、形質導入後5時間及び20時間での、APCへの、特にU937細胞への及びヒト樹状細胞へのRLP粒子による、3つの抗原をコードするRNA(PS−MAGEA3、PS−GP100及びPS−TYR)の転移を実証することを可能にする(それぞれ図XXVI及びXXVII、XXIX及びXXX)。得られた結果を分析し、リアルタイム定量的PCR(RT−qPCR)中の有意な特異的増幅の存在又は非存在に従って解釈する。
結果は、粒子に含まれる異なるRNAが、それらがRLP−MAGE A3粒子の場合のように単一型であるか(図XXV及びXXVIII)あるいはRLP−TAAs粒子の場合のように3つの異なるタイプのものであるか(図XXVI、XXVII及びXXIX、XXX)に関わらず、従ってRLP粒子によってAPCに適切に転移されることを示している。U937細胞株の場合、異なるRNAの相対量は、形質導入後5時間から開始して有意であり(図XXVI)及びそれらは形質導入後20時間に増加する(図XXVII)。hDC初代細胞の場合、特異的RNAの相対量は、それらが5時間であまり顕著でなくても(図XXIX)、20時間で有意である(図XXX)。従って、RLP粒子は、APCに異なる抗原性ペプチドをコードするRNAの分子を転移させるために有効である(株及び初代細胞)。これは、改変された免疫細胞、及び特にAPCによる治療の有効性において治療上の利点を構成する。従って、RLP粒子は、免疫応答の特異性を調節することに基づいて、免疫療法戦略に含まれる。
実施例5:複数の抗原の発現のためのRLP粒子の有効性の評価
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
1.1 本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、図XIIb、XIIc及びXIIdに記載されたように、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−polyA発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフの12回の反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び/又は部分配列が免疫療法に使用される。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
1.2 組み込みレンチウイルスベクターILVを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列、の発現カセットを有する。目的の遺伝子の配列は、例えば蛍光レポーターの配列(図IVb)、あるいは抗原又はエピトープの配列であり得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び/又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、MAGEA3を発現するために使用される配列は完全(図XIIa)又は部分的(図XIIb)であり得る。腫瘍バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばgp100(図XIIc)又はチロシナーゼ(図XIId)の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。このプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列WPRE(Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element)又はcPPT/CTS配列を含み得る。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。
・カプシド形成プラスミド:構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子(Gag、Pol)を有するp8.74カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターを生産するために使用される(その発現カセットは図Vに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは例えば、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−G 遺伝子の配列であり得る(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.バッチの生産及び滴定
バッチの生産を、以下の発現プラスミドの1つを用いて、実施例1に記載されたように、方法P2に従って行う:
−バッチRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr、これはRLP−TAAsとも呼ばれる:pcDNA.EF1long.PPRV.PS−AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X(その発現カセットは図XIbに記載されている)+pcDNA.EF1long.PPRV.PS−Aggp100.WPRE.MS2 12X(その発現カセットは図XIcに記載されている)+pcDNA.EF1long.PPRV.PS−AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X(その発現カセットは図XIdに記載されている)。
−バッチRLP.MAGEA3.IRES.GFP、これはRLP−MAGEA3とも呼ばれる:pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X(その発現カセットは図XIaに記載されている)。
−バッチILV.EF1.PS−MAGEA3/Gp100/Tyr、これはILV−TAAsとも呼ばれる:pILV.EF1.PS−AgMAGEA3.WPRE(図XIIb)+pILV.EF1.PS−Aggp100.WPRE(その発現カセットは図XIIcに記載されている)+pILV.EF1.PS−AgTyrosinase.WPRE(その発現カセットは図XIIdに記載されている)。
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである:40%の発現プラスミド又は発現プラスミド(RLP−TAAs又はILV−TAAsの場合)、30%のp8.74(又はp8.74ΔZF)プラスミド、30%のpENVプラスミド。
バッチの滴定は、実施例1に記載されたものと同一の方法に従って行われる。
II.使用されたモデルの説明
1.細胞モデル
1.1 Renca腫瘍モデル
このモデルは、Renca腫瘍細胞が使用される実施例2に記載されたモデルであり、これは、3つの発現プラスミドの混合物を含むILV.EF1.PS−MAGEA3/Gp100/TyrベクターによりMOI 100で予め形質導入されており、斯かる発現プラスミドは、その発現カセットが、3つ全てがヒト起源の抗原性ペプチドMAGE A3、gp100及びチロシナーゼを安定して発現するように、図XIIb、c及びdに記載された発現カセットである。次に、このモデルは、成体同系BALB/cマウスの脇腹の皮下に0.75.106個のこれら細胞を再移植することからなる。動物は、登録されたブリーダー(Janvier Europe)から入手し、これら実験の全てについて詳述したプロトコルは、地域の倫理委員会(CEEA−122倫理委員会)に提出され、承認された。
全ての動物をその全身状態について毎日チェックする。1週間に2回、それらを秤量し、腫瘍の発生をキャリパーを用いて手動で測定する。腫瘍体積は、以下の式に従ってmm3で与えられる:V=a*(b2/2)、ここでa=最大直径、及びb=最小直径。
1.2 マウスリンパ球の調製
マウスリンパ球を、野生型BALB/cマウスの脾臓、あるいはRencaタイプの腫瘍>1mm3を発症したマウスの脾臓から調製する。脾臓は、頸椎脱臼による動物の安楽死後に回収する。それは、70μmの細胞篩で粉砕することにより機械的に解離される。細胞懸濁液を5分間300gで+4℃で遠心分離する。次に、細胞ペレットを10mlの冷MACS緩衝液に取り、懸濁液を50−mlチューブ上に置いた40−μm 細胞篩で濾過し、次に細胞計数を行う。細胞懸濁液を10分間300gで+4℃で遠心分離した後に、実施例1に記載されたものと同一の方法によるCD8マーカーの発現についてのポジティブソーティングに進む。ポジティブ画分を、磁石の使用ではなく、1mlのMACS緩衝液でソーティングカラムを洗浄することにより回収する。この画分を冷MACS緩衝液で5mlにし、次に細胞計数を行う。細胞懸濁液を、10分間300gで+4℃で遠心分離し、細胞をPBS 1X中に1.106細胞/mlの濃度で再懸濁する。
1.3 選別されたマウスCD8+脾細胞のCFSE標識
マウス脾細胞のソーティングから得られたCD8+Tリンパ球を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CellTrace(商標) CFSE dye、Invitrogen/thermoFisher Scientific)で、以下の方法によって標識する:1.106細胞/mlでの細胞懸濁液をPBS 1Xで調製する。CFSEのストック溶液は、DMSO中の1mMであり、細胞懸濁液の1ml当たりこの溶液の2μlを添加し、2μMで標識されたリンパ球を得る。次に、細胞を、20分間37℃で遮光してインキュベートする。1%のウシ胎児血清で補充したRPMIで細胞を5倍に希釈し、そして懸濁液を再度5分間インキュベートすることによって、反応を停止させる。次に、細胞懸濁液を5分間300gで室温で遠心分離し、細胞を、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補充したRPMI 1640培地中に1.6×106細胞/mlの濃度で再懸濁し、ULAタイプの平底96−ウェルプレート(Corning)内でマウスBMDCと異なる比で共培養する。標識後、このようにして得られたCD8+Tリンパ球を、選別された集団の純度及びCFSE標識をモニタリングするために抗CD8抗体の存在下でフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)により分析する(図XVIII)。
1.4 マウス樹状細胞の調製
マウス樹状細胞を、実施例1に記載されたものと同一の方法によって調製する。
2.免疫細胞の形質導入及び増殖応答の分析
2.1 RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子、又は3つの腫瘍抗原混合物を含むRLP.TAAs粒子(RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr)でのマウス樹状細胞(BMDC)の形質導入
培養の7日目に、BMDC 樹状細胞を、3pg p24/細胞の比率で、RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子により、又はRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子(その発現カセットが図XIb、c及びdに記載された発現カセットである、3つの発現プラスミドの混合物)により、形質導入する。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)のみを含有する培地で調製する。
樹状細胞を、形質導入の日、及び抗CD11c、抗CD86、抗CD80特異的抗体(Miltenyi Biotec)での免疫標識による24時間後に表現型決定し、フローサイトメトリーにより特徴づけた。
2.2 同系BMDCとのCFSE−標識CD8+Tリンパ球の共培養
野生型又はRenca 腫瘍を発症したBALB/cマウス由来のCFSE−標識CD8+Tリンパ球を、RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子、又はRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子のいずれかで形質導入した同系マウスBMDCの存在下で、あるいは非形質導入BMDCと共に培養する。RLP−PS−MAGEA3./Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCとの共培養の場合には、2つの比を試験した:1のBMDC、対、各2のCD8+Tリンパ球(1DC:2T)、又は1のBMDC、対、各4のCD8+Tリンパ球(1DC:4T)。
RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子により形質導入されたBMDCに対するCD8+Tリンパ球の比は、1 BMDC対各2 CD8+Tリンパ球(1DC:2T)である。これら共培養は、ULAタイプの平底96−ウェルプレート(Corning)内で、10%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−グルタミンで補充したRPMI 1640培地の200μlの最終容量で行う。BMDCを、40000細胞/ウェルの比でインキュベートし、従ってCD8+Tリンパ球の数は80000〜160000細胞/ウェルで変動する。
2.3 CD8+Tリンパ球の増殖応答の分析
培養開始から5日後、細胞の混合物を培養プレートから回収し、フローサイトメトリーによる分析用に標識するために円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、PBS 1X pH 7.4の溶液で洗浄し、5%FCS、300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。リンパ球を、実施例1に上記した方法による、蛍光色素コンジュゲート抗CD8 抗体(Miltenyi Biotec)での免疫標識によって分析する。細胞を、100μlのPBS 1X pH 7.4、5%FCSに取り、CD8マーカーについてのそれらの発現(懸濁液に依然として存在するBMDCからそれらを区別することを可能にする)及びCFSEの発現(その相対蛍光レベルは各細胞分裂で半分になり、従って細胞の増殖応答を定量化することを可能にする)の両方に従って、フローサイトメトリーによって分析する。
図XIXは、単独で培養されたCD8+Tリンパ球により得られたCFSEの発現プロファイル、並びに、非形質導入又はRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子で形質導入されたBMDCとの共培養の5日後に得られたCFSEの発現プロファイルを示す。
2.4 フローサイトメトリー
免疫標識されたリンパ球細胞をフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)により分析する。試料を、それらのサイズ(SSC)及びそれらの粒度(FSC)に従って較正した。細胞は、MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア(Miltenyi Biotec)で分析される。
II.結果
これら実験において、非形質導入のBMDC、RLP.MAGE A3.IRES.GFP粒子により形質導入された、又はRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCを、サプレッサーTリンパ球(腫瘍応答の発生に関与する)に特異的なCD8マーカーのそれらの発現の機能として選別されたTリンパ球と異なる比で共培養し、CFSEで予め標識した。図XVIIIは、野生型及び腫瘍マウス脾臓から得られた細胞の純度(全集団におけるCD8マーカーの発現)、並びにD0のCFSEによる標識を検証する。図XIXは、BMDCと5日間共培養されたCFSE−標識CD8+Tリンパ球(比率DC:2T)が増殖によって応答することを示す。これは、1つ又は複数のピークに、左に向かうCFSE標識の蛍光強度の減少によってサイトメトリーに反映されている。この分析は、これらピークにおける細胞のパーセンテージに関連する。示されたプロファイルは、3つの実験の代表である。野生型マウス由来のCD8+Tリンパ球の応答は、形質導入されたBMDC又は非形質導入BMDCと接触しているかどうかに関わらず、同様である。この現象は、樹状細胞と接触されたナイーブリンパ球が、抗原の非存在下であっても増殖することができるという事実によって説明される(Q.Geら、PNAS.2002 99(5):2983-2988)。対照的に、3つの腫瘍抗原(MAGE A3/gp100/Tyr)を発現するRenca腫瘍を発症したマウス由来のCD8+Tリンパ球は、非形質導入BMDCにほとんど応答を示さない。それらは、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子によって形質導入されたBMDCとの共培養中に、腫瘍により発現される抗原に対して曝露されている場合に特異的に応答する(この場合31.42%の細胞増殖に対して、非形質導入BMDCの存在下ではわずか14.94%)。腫瘍によって産生される特定の因子(IL−10、PGE2)が、インビボでのTリンパ球のアレルギー減少の発症をもたらし得ることが示された(M.Ahmadiら、Cancer Res.2008 September 15;68(18):7520-7529)。このことは、なぜこれらCD8+Tリンパ球が、非形質導入BMDCに曝露された場合に、ナイーブCD8+Tリンパ球よりもはるかに少なく増殖するかを説明する。
対照として、樹状細胞に曝露されることなく5日間単独で培養されたCFSE標識CD8+Tリンパ球は、増殖せず、かつそれらのCFSE 発現プロファイルはD0に観察されたものと同様である(図XVIII)。このプロファイルは、CD8 Tリンパ球の起源(野生型又は腫瘍マウス)に関係なく同一である。
図XXは、非形質導入BMDCと共培養されたこれら同じCD8+Tリンパ球の応答に対する、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCと共培養されたCD8+Tリンパ球の増殖応答の分析を示す。分析は3つの野生型マウスから、又はRenca 腫瘍を発症した3つのマウスから得られたCD8+Tリンパ球との 3つの異なる共培養物に対して行い、BMDCも3つの異なる培養物に由来した。CD8+Tリンパ球の応答を、1DC:2Tの比又は1DC:4Tの比での共培養物から分析した。相対増殖応答は、非形質導入BMDCに非特異的に応答する細胞のパーセンテージに対する、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCに対する応答における細胞増殖のパーセンテージの比によって与えられる。結果は、ヒト腫瘍に関連する3つの抗原(TAAs)を発現するRenca腫瘍を発症したマウスからのCD8+Tリンパ球が、これらTAAsによる新たな刺激に特異的に応答することを示すが(1DC:2T共培養物について2.67、及び1DC:4T共培養物について3.90)、一方で、ナイーブマウスからのCD8+Tリンパ球は、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCに対して同様に応答する(1DC:2T共培養物について1.59、及び1DC:4T共培養物について1.78)。
最後に、図XXIは、RLP.MAGEA3.IRES.GFP粒子によって形質導入されたBMDC又はRLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子によって形質導入されたBMDCと、条件1DC:2Tの下で共培養されたCD8+Tリンパ球の相対増殖応答を比較する。図XXに示されたように、これら分析は、3つのTAAsを有するRenca 腫瘍を発症したマウスから得られたCD8+Tリンパ球が、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDC野生型マウスから得られたCD8+Tリンパ球よりも顕著に応答することを示す。また、それらは、これら抗原のただ1つ(MAGE A3)を有する粒子により形質導入されたBMDCに特異的に応答する。
まとめると、これら結果は、RLP−PS−MAGEA3/Gp100/Tyr粒子により形質導入されたBMDCが従って、3つのTAAs(MAGE A3、gp100及びチロシナーゼ)に対応する抗原性ペプチドを確実に提示することができることを示す。従って、3つのペプチドに対応するRNA分子は、十分に長期間かつ有効に表面にこれらペプチドを提示する抗原提示細胞に特異的な細胞機構によって引き受けられ、従って、それらに遭遇するCD8+Tリンパ球が活性化され得る。
RNA粒子により形質導入された樹状細胞を用いたワクチン接種法は、特に有利であると証明され、抗原又は抗原(複数)の定常発現は、メモリーT細胞の集団を誘導及び維持するために必要でない(M.J.Bevan及びA.W.Goldrath.Current Biology.2000、10:R338-R340)。
実施例6:免疫細胞へのRLP粒子による抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAの転移、並びにRLP粒子の有効性の実証
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−polyA発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、MS2 RNAのステム−ループモチーフの12回の反復(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号1)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び/又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、MAGEA3抗原を発現するために使用される配列は、完全(図XIa)又は部分的(図XIb)であり得る。目的の配列はまた、免疫調節タンパク質、例えばサイトカイン又はインターロイキン、例えばIL−12をコードし得る。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.バッチの生産及び滴定
バッチの生産及び滴定は、以下の発現プラスミドを用いて、実施例1に記載したように方法P2に従って行われる:
バッチRLP−PS−MAGEA3/IL−12:線状pcDNA.EF1long.PPRV.PS−AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X(その発現カセットは図XIbに記載されている)及びpcDNA.EF1.IL12b−linker−DeltaIL12a.MS2 12X(その発現カセットは図XXXIに記載されている)。
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである:40%の発現プラスミド、30%のp8.74(又はp8.74ΔZF)プラスミド、30%のpENVプラスミド。
II.免疫系の細胞の形質導入
1.U937株(ATCC(登録商標) CRL−1593.2(商標))
U937細胞株を、実施例4(II.段落1)に記載の条件下で培養した。
1.1 腫瘍抗原及び免疫調節タンパク質の混合物を含む粒子(RLP−PS−MAGEA3/IL−12)でのU937細胞の形質導入
U937細胞の形質導入を、実施例4(II.段落1.1)に記載の方法によって行う。
1.2 細胞の回収
形質導入後5時間及び20時間に、細胞を回収し、実施例4(II.段落1.2)に記載の方法によって処理する。
1.3 全RNAの抽出
各乾燥ペレットを実施例4(II.段落1.3)に記載の方法によって処理して、全RNAを抽出及び精製する。
1.4 RNAの逆転写
相補的DNAへのRNAの逆転写を、実施例4(II.段落1.4)に記載の方法によって行う。
1.5 RT−qPCRによるcDNAの増幅
20μlの最終容量でセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの200nMの存在下で、リアルタイムPCRミックス、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq(Takara - cat RR420L)を用いて、超純水で1/10希釈したcDNAの5μlに対して、増幅を行う。1/10希釈したcDNAの5μlを各ウェルに添加する。
以下のプロトコルに従って、SYBR(登録商標)Green化学を用いたStepOnePlusサーモサイクラー(AppliedBiosystems)でリアルタイムPCRを行う:95.0℃で30秒の1サイクル、次いで95.0℃での5秒及び60.0℃での30秒を含む40サイクル。
使用されるセンスオリゴヌクレオチドは、以下の通りである:
−Q−hGAPDH−S(GACAAGCTTCCCGTTCTCAG)(配列番号4)
−Q−PSMAGEDC−F(TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA)(配列番号6)
−Q−IL12ap35−F(CGGATCTAGGGTCATTCCAGTCT)(配列番号13)
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の通りである:
−Q−hGAPDH−AS(GAGTCAACGGATTTGGTCGT)(配列番号9)
−Q− PSMAGETyrDC−R(GGTAGGCAATGAGGACGATGA)(配列番号11)
−Q− IL12ap35−R(GTTTTTCTCTGGCCGTCTTCA)(配列番号14)
使用されることになるオリゴヌクレオチドの対の組み合わせは、標的に応じて、以下のとおりである:
−Target hGAPDHと、Q−hGAPDH−S及びQ−hGAPDH−AS
−Target PS−MAGEDCと、Q−PSMageDC−F及びQ−PSMAGETyrDC−R
−Target IL12ap35と、Q− IL12ap35−F及びQ− IL12ap35−R
オリゴヌクレオチドの特異性の検証のための実験は予め行われていた。
2.未熟ヒト樹状細胞(hDC)の調製
未熟ヒト樹状細胞を、実施例1に記載したものと同一の方法によって調製する(パートII、段落2.1)。
2.1 腫瘍抗原及び免疫調節タンパク質の混合物を含む粒子(RLP−PS−MAGEA3/IL−12)でのヒト樹状細胞の形質導入
ヒト樹状細胞の形質導入を、実施例1(パートII、段落2.3)に記載されたものと同一の方法によって行う。細胞を、4pgのp24/細胞で形質導入し、異なる時点で分析する(形質導入後5時間、20時間)。
形質導入の陰性対照を、形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)のみを含有する培地で調製する。樹状細胞を、形質導入された細胞のペレットから得られたRNAに対するRT−qPCRによって、形質導入の日及び異なる分析時点で分析する。
2.2 細胞の回収
RNA発現の分析のために、ヒト樹状細胞を、実施例4(II.段落2.2)に記載のプロトコルに従って、形質導入後の異なる時点で回収する。細胞を、乾燥ペレットの形態で−80℃で凍結する。IL12の分泌の分析のために、細胞培養上清の試料を、形質導入後20時間及び48時間の時点で採取する。上清を−20℃で保存する。
2.3 全RNAの抽出
RNAを、実施例4(II.段落2.3)に記載のものと同一の方法によって調製する。
2.4 RNAの逆転写
相補的DNAへのRNAの逆転写を、実施例4(II.段落2.4)に記載の方法によって、500ngのRNAに対して行う。
2.5 RT−qPCRによるcDNAの増幅
RT−qPCRによるcDNAの増幅を、実施例4(II.段落2.5)に記載の方法によって行う。
2.6 IL12の分泌のためのELISAアッセイ
細胞培養上清におけるIL12の分泌を定量化するためのELISAアッセイを、「Human IL-12 Standard ABTS ELISA Development Kit」(Peprotech)を用いて供給されたプロトコルに従って行う。
III.結果:
RT−qPCRによる特異的分析は、形質導入後5時間及び20時間における、APCへの、特にU937細胞及び未熟ヒト樹状細胞(hDC)への、RLP粒子による抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAの転移を実証することを可能にする(それぞれ図XXXII及びXXXIII、XXXIV及びXXXV)。得られた結果は、リアルタイム定量的PCR(RT−qPCR)中の有意な特異的増幅の存在又は非存在に従って分析及び解釈される。結果は、非形質導入対照細胞(U937 NT及びhDC NT)について得られた値に対して正規化される。これら対照は、IL12をコードする内因性RNAを発現する(結果は示さず)。樹状細胞はIL12を産生し、これはインビボでTリンパ球の応答における役割を果たすことが知られている。
U937細胞株の場合、異なるRNAの相対量は、形質導入後5時間に(図XXXII)及び形質導入後20時間に(図XXXIII)有意である。
hDC初代細胞の場合、相対特異的RNAレベルは、5時間であまり顕著でなくとも(図XXXIV)、20時間で有意である(図XXXV)。最後に、ELISAによる培養上清の分析は(図XXXVI)、RLP−PS−MAGEA3/IL−12粒子による形質導入の48時間後に、hDCによって分泌されたIL12のレベルの大幅な増加を実証する。
従って、RLP粒子は、APC(株及び初代細胞)への、抗原性ペプチド並びに免疫調節タンパク質、例えばIL−12をコードする異なるRNA分子の転移に有効である。従って、RLP粒子は、APCに抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAを転移することによって免疫応答の特異性を調節することに基づく免疫療法戦略に含まれる。
従って、一方では、実施例4に示された異なる抗原をコードするRNAを含むRLP粒子を用いることによって、その特異性のレベルで免疫応答の微調整が可能であり、他方では、この戦略と、免疫調節タンパク質による刺激応答の誘導とを組み合わせることによって、免疫応答の微調整が可能である。従って、単一の介入でエクスビボ又はインビボで標的細胞に抗原と免疫調節剤との両方を同時に送達することは、かなりの臨床上の利点を提供する。
実施例7:免疫細胞におけるPP7(NC)−RLPレンチウイルス粒子の有効性
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド:発現プラスミドは、イントロン配列又はRNA安定化配列を含むか又は含まない、図XXIIIに記載された発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にmRNAを輸送するために、PP7 RNAのステム−ループモチーフの2回の反復:配列 ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(配列番号2)、次いで配列 ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag(配列番号3)を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した(図XXIII)。
使用されるプロモーターは、CMV又はEF1プロモーターであり得る(図XXIII)。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ(図XV)、緑色(ZsGreen1)、赤色(mCherry)又は青色(mtBFP)蛍光タンパク質をコードするDNA、あるいはタンパク質、例えばタンパク質CREをコードするcDNAであり得る。好ましくは、cDNAは、免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする。目的の配列はまた、shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA又はcircRNAの配列であり得る。
・カプシド形成プラスミド:レンチウイルス粒子を、第2のZn fingerドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内に、PP7バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を含むように改変した(図XXXVII)。PP7RLP粒子を産生するために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子(Gag、Pol)を有するp8.74カプシド形成プラスミドを、以下の戦略に従って改変する:このp8.74プラスミドを、アセンブリPCRによって、p8.74ΔZFヌクレオカプシドタンパク質の第2のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用する。第2のジンクフィンガーは、HpaIクローニングによってMS2ファージのコートタンパク質により置換されて、プラスミドp8.74ΔZF−PP7−Coatを生成する。Polコーディング配列は、PP7RLPsの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素(RT)又はインテグラーゼ(IN)をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gであり得る(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.レンチウイルス粒子の生産、濃縮/精製及び滴定
レンチウイルス粒子を、図XXIIIに記載のpcDNA−EF1.ReporterFluorescent.PP7 2X発現プラスミドを用いて、実施例1に記載されたように、方法P2に従って生産する。
II.マウス樹状細胞(BMDC)の形質導入
マウス樹状細胞を、実施例1に記載されたものと同一の方法によって調製する。
1.PP7(NC)−RLP.ZsGreen1でのマウス樹状細胞の形質導入
樹状細胞を、1pg p24/細胞の用量で、実施例1(II、段落2.4)に記載のようにPP7(NC)−RLP.ZsGreen1ベクターによって形質導入し、異なる分析時点でフローサイトメトリーによりそれらの生存率及びZsGreen1 蛍光の発現について分析する(形質導入後1、2及び3日)。形質導入の陰性対照を、 形質導入剤である4μg/mLのPolybrene(登録商標)(Sigma)を含有する培地のみで調製する。
樹状細胞の生存率を、「Viobility(商標)485/520」(Miltenyi Biotec)での特異的免疫標識によって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。
2.細胞の表現型決定及び特徴づけ
2.1 マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底96−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、PBS 1X pH 7.4の溶液で洗浄し、300gで5分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
樹状細胞の生存率を、実施例1の段落II.3.3に記載されたものと同一の方法によって、「Viobility(商標)485/520」(Miltenyi Biotec)での特異的免疫標識によって決定する。
2.2 フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー(Miltenyi Biotec)によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ(SSC)及びそれらの粒度(FSC)に従って較正した。Viobility(商標)で標識された細胞は死んでおり、従って生細胞は陰性細胞である(除外による標識)。細胞は、MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア(Miltenyi Biotec)で分析される。
III.結果:BMDCのZsGreen1の発現動態及び生存率
図XXXVIIIは、PP7(NC)−RLP粒子の1pg p24/細胞により形質導入されたマウスBMDCが、形質導入後24時間から開始してその50%についてZsGreen1を発現することを示す。形質導入後3日で、BMDCは生存率が低下し、その20%のみがより低い蛍光強度でZsGreen1を発現する。これについての説明は、PP7(NC)−RLP粒子が、MS2RLP又はPP7(IN)−RLP粒子と比較して低い濃度で生産され、従って、等用量でのBMDCの形質導入はより大量のレンチウイルス懸濁液の使用を必要とし、これは細胞にとって不可欠な栄養素を含有する培養培地をさらに希釈することである。これは、マウスBMDCのような敏感な初代細胞を培養するためにさらに注目すべきことである。それにも関わらず、ヌクレオカプシド内にPP7−Coatで改変されたレンチウイルス粒子にRNAを輸送することが依然として可能である。
実施例8:MS2RLP、PP7RLP及び/又はPP7(IN)−RLP粒子の最適化を目的としたMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子の生産のための野生型GAG−POL前駆体の影響
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
1.1 本発明に係るMS2RLPレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットが図Iに記載されている)。
・カプシド形成プラスミド:これらプラスミドは実施例1に記載されたものと同一である:p8.74ΔZF−MS2−Coat(その発現カセットは、図IIに示されている)及びp8.74プラスミド(その発現カセットは、図Vに示されている)
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
1.2 組み込みレンチウイルスベクターILVを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IVbに記載されている)。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図Vに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
2.バッチの生産
2.1 レンチウイルス粒子の生産及びレンチウイルスベクター
5%のCO2で湿潤雰囲気下、37℃で、1%のペニシリン/ストレプトマイシン及び1%のウルトラグルタミン(PAA)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco、Paisley、UK)で培養した、HEK293Tプロデューサー細胞(ATCC、CRL−11268)を用いて、10−スタックの細胞TACK(6360cm2、Corning)内で、生産を行う。
MS2RLP粒子を、以下の4つのプラスミドのトランスフェクションにより行う:
−上述の発現プラスミド、その発現カセットは図Iに示されている;
−p8.74ΔZF−MS2−Coat(その発現カセットは、図IIに示されている)及びp8.74プラスミド(その発現カセットは、図Vに示されている)、2つのカプシド形成プラスミドの4つの異なる比を用いる、それぞれ[100%−0%];[90%−10%];[80%−20%]及び[50%−50%];
−エンベロープVSV−Gを有するpENV(その発現カセットは、図IIIに示されている)。
MS2RLP−ZsGreen1 12Xレンチウイルス粒子を、実施例1に記載のように生産する、すなわちプラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである:40%の発現プラスミド、30%のp8.74(又はp8.74ΔZF)プラスミド、30%のpENVプラスミド(比[100%−0%])。
より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである:
−比[90%−10%]:40%の発現プラスミド、27%のp8.74ΔZFプラスミド、3%のp8.74プラスミド、30%のpENVプラスミド;
−比[80%−20%]:40%の発現プラスミド、24%のp8.74ΔZFプラスミド、6%のp8.74プラスミド、30%のpENVプラスミド
−比[50%−50%]:40%の発現プラスミド、15%のp8.74ΔZFプラスミド、15%のp8.74プラスミド、30%のpENVプラスミド。
RLP−TAAsレンチウイルス粒子の生産の場合、上記のプラスミドの割合は変更されないままである。
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから24時間後に、培養上清を新鮮な未補充DMEM培地で交換する。プロデューサー細胞を37℃/5%CO2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を4回採取する(トランスフェクション後32時間、48時間、56時間及び72時間)。各収集物を、5分間の3000gでの遠心分離によって清澄化した後に、0.45μmのフィルター(Stericup(登録商標)、Millipore)で精密ろ過する。全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
EF1−ZsGreen1発現カセットを含むILV−ZsGreen1組み込みレンチウイルスベクターを、実施例1に記載のように、対照として生産する。
2.2 レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例1に記載の方法P1に従って濃縮及び精製する。
3.滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例1に記載のように滴定する。
II.形質導入
1.Jurkat標的細胞の調製、及び本発明に係るS2RLP 12Xレンチウイルス粒子による形質導入
Jurkat標的細胞(ATCC TIB−152)を、96−ウェルプレートに200000細胞/mLで播種し、4μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で、2つの用量(2及び10pg p24/細胞)でのMS2RLP粒子によって、又はMOI40でのILV−ZsGreen1対照レンチウイルスベクターによって形質導入し、次に、37℃/5%CO2でインキュベートする。細胞防御機構阻害剤BX795(Invivogen)を、MS2RLP粒子の場合には6μMの濃度で使用する。形質導入上清を5時間後に除去し、新鮮な補充培養培地と交換する。形質導入後24時間に、標的細胞を回収し、ZsGreen1を発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー(Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec)によって定量する。
2.抗p24ウェスタンブロットによるMS2RLPウイルス粒子の成熟の分析
MS2RLP粒子を生産するためのプラスミドによるプロデューサー細胞(HEK293T)のトランスフェクションの48時間後に、培養上清を回収し、次に実施例1に記載したように方法P1に従って濃縮し、実施例1に記載のようにp24タンパク質の定量化によって滴定する。15ngのp24の当量を、変性ゲルSDS−PAGE 4/12%上にp8.74ΔZF−MS2−Coat/p8.74プラスミドの比の各条件について充填し、次に1時間200VでMOPS1X緩衝液中で移動させる。ナイロン膜上に移した後、タンパク質を抗p24抗体(clone 39/5.4A、Abcam)にハイブリダイズさせる。ウェスタンブロットをPierce(商標) Fast Western Blot Kit、ECL Substrate(Pierce)を用いて展開する。バンドをオートラジオグラフィーフィルム上での化学発光により可視化する。
III.結果
この実施例は、異なる抗原をコードするRNAを転移させるため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAを転移させるために、MS2RLP及びPP7RLP粒子の機能を改善することが可能であると示すことを目的とする。これは、粒子の生産中のGAG前駆体の成熟の改善を介して進行し、MS2RLP粒子の生産に関する概念の証明によって実証される。p8.74ΔZF−MS2プラスミドは、ヌクレオカプシドタンパク質の第2のジンクフィンガーの代わりに、バクテリオファージのコートタンパク質を含むGAG前駆体の発現を可能にする。このコートタンパク質は、3つのタンパク質:マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質、に切断される際に、GAG前駆体の成熟を妨げるようである。これら3つのタンパク質は、ウイルス粒子の構造に不可欠である。
MS2RLP−ZsGreen1 12X粒子の生産中のp8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミドに加えてp8.74プラスミドによる野生型GAG前駆体の供給は、それがp8.74ΔZF−MS2プラスミドに起因して発現される際に、GAG前駆体の成熟を増加することを可能にし、従ってMS2RLP及びPP7RLP粒子の機能性を増大させ得る。
この実験の目的は、p8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミドと同時に、MS2RLP及びPP7RLP粒子のプロデューサー細胞において、コトランスフェクトされた場合のp8.74プラスミドの影響を評価することであり、GAG前駆体の成熟を改善し、従って標的細胞の形質導入のためにより機能的な最終粒子を作成することを可能にすることである。
この実施例において、p8.74ΔZF−MS2−Coat/p8.74カプシド形成プラスミドの4つの比を試験する:100/0;90/10;80/20及び50/50。ZsGreen1を発現する組み込みベクターILVを対象として使用する。細胞を、2つの量のp24/mlで形質導入する:2pg p24/細胞(図XXXIX)及び10pg p24/細胞(図XXXX)。
第一に、図XXXIXに示された結果は、非形質導入細胞について、蛍光細胞のパーセンテージが非常に0に近く、一方でMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子によって形質導入された細胞は、どのカプシド形成プラスミドの比が使用されても、99%超が蛍光性であることを示している。p8.74プラスミドの量の増加の関数として、ZsGreen1の蛍光強度が増加することに注目することが重要である。50%のp8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミド及び50%のp8.74プラスミドで生産されたMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子により形質導入された細胞は、7.76の蛍光強度を有するが、一方で、p8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミドのみで生産されたMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子により形質導入された細胞の蛍光強度は3.5である。
図XXXXは、形質導入された細胞のパーセンテージに関して同じ結果を示している。蛍光強度に関して、図XXXIXに示されるように、p8.74プラスミドの量が増えるほど、蛍光強度が増加する。50%のp8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミド及び50%のp8.74プラスミドで生産されたMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子により形質導入された細胞は、60.67の蛍光強度を有し、一方で、p8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミドのみで生産されたMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子により形質導入された細胞の蛍光強度は、11.48である。
これは、2pg及び10pg p24/細胞の用量で、得られた蛍光は、粒子が50%のp8.74ΔZF−MS2−Coatカプシド形成プラスミド及び50%のp8.74プラスミドで生産されている場合に、p8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドのみで生産されている場合よりも、それぞれ2倍及び5倍大きいことを意味する。
従って、MS2RLP粒子の生産におけるp8.74プラスミドの使用は、異なる抗原をコードするRNAを転移するため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAを転移するためのMS2RLP粒子の最適化の観点から、p8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドでのコトランスフェクションにおいて、MS2RLP−ZsGreen1 12X粒子の機能性の改善の獲得を供給した。
図XXXXIは、粒子を含む生産上清におけるp24タンパク質を検出することによる、生化学的レベルでのMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子の成熟を示す。これは、オートラジオグラフィーフィルムの2つの曝露時間、1分(図XXXXIa)及び15秒(図XXXXIb)での、抗p24ウェスタンブロットによるウイルス上清に対応する。
カプシド形成プラスミドとしてp8.74プラスミドのみで生産されたHIVに由来する組み込みレンチウイルス粒子の場合、p24タンパク質は、以下の4つのレベルで検出可能である:
−p160タンパク質前駆体(GAG−POL)で
−p55タンパク質前駆体(GAG)で、
−成熟タンパク質の状態(p24)で、
−成熟の過程における他の中間タンパク質前駆体(p160とp55との間、及びp55とp24との間)で。
成熟が正常に行われる場合、p24タンパク質は、成熟状態(p24)で、タンパク質前駆体の状態(p160、p55)又はタンパク質前駆体の状態よりも、多量に検出されるはずである。実際に、ウイルス粒子の成熟は、プロデューサー細胞による粒子の放出後に起こる。換言すれば、それらの生産中に、粒子は、プロデューサー細胞の表面で出芽し、未熟粒子の状態で細胞から放出される。上清中の粒子の放出後にのみ、GAG−POL及びGAGタンパク質前駆体は最終的なタンパク質に成熟する。
カプシド形成プラスミドとしてp8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドのみで生産されたHIVに由来するMS2RLP又はPP7RLP粒子の場合、p24タンパク質は、以下の4つのレベルで検出可能である:
−p172タンパク質前駆体(GAGΔZF−MS2−Coat−POL)で
−p67タンパク質前駆体(GAGΔZF−MS2−Coat)で、
−成熟タンパク質の状態(p24)で、
−成熟の過程における他の中間タンパク質前駆体(p172とp67との間、及びp67とp24との間)で。
このMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子において、各前駆体は12kDaにより重く、これはヌクレオカプシドタンパク質の第2のジンクフィンガーに挿入されたMS2バクテリオファージのコートタンパク質のサイズに対応する。
図XXXXIは、ILVトラック上での、タンパク質前駆体の異なる形態、p160(GAG−POL)、p55(GAG)並びに完全成熟p24タンパク質を示す。タンパク質前駆体形態と比較して、成熟p24タンパク質の有意性がある。トラック100/0は、カプシド形成プラスミドとしてp8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドでのみ生産されたMS2RLP−ZsGreen1 12X粒子に対応し、前駆体/成熟p24タンパク質の割合は、ILVに対して増加し、MS2バクテリオファージのコートタンパク質の挿入が、ウイルス粒子の成熟を減少させることを示している。トラック90/10、80/20及び50/50上では、p172及びp67タンパク質前駆体の割合は、それぞれp160及びp55タンパク質前駆体の利益のために減少し、トラック50/50についての1つの同じ発現レベルに達する。粒子を生産するためのカプシド形成プラスミドとしてのp8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドへのp8.74プラスミドの追加は、成熟p24タンパク質の割合の増加につながる(図XXXXIb、15秒曝露)。この結果は、MS2RLP粒子におけるタンパク質前駆体の成熟を促進するために、粒子を生産するためのカプシド形成プラスミドとしてのp8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドに加えて、少なくとも10%のp8.74プラスミドを加えることが可能であることを示している。カプシド形成プラスミドとしてのp8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドに加えて少なくとも10%のp8.74プラスミドを用いたMS2RLP粒子の生産は、成熟タンパク質への前駆体の成熟を増加させることを可能にするだけでなく、さらに、標的細胞の形質導入後の粒子の機能性を増加させることも可能にする。
結露として、p8.74ΔZF−MS2−Coatプラスミドでのコトランスフェクションにおける、本発明に係る粒子の生産中のp8.74プラスミドの使用は、異なる抗原をコードするRNAを転移するため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAを転移するための本発明に係る粒子を最適化することを可能にする。
実施例9:RLP粒子による、異なる抗原をコードするRNAの有効な転移、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAの転移の最適化を目的とした、2つの異なるカプシド形成配列(MS2及びPP7)によって指向された非ウイルスRNAの動員(カプシド形成されたRNAのタイプの調節)
I.本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
1.プラスミド構築
1.1 本発明に係るMS2/PP7−(NC)RLP 12X 2Xレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:これらプラスミドは、実施例1(その発現カセットが図Iに記載されている)及び実施例7(その発現カセットは図XXIIIに記載されている)に記載されたものと同一である。
・カプシド形成プラスミド:これらプラスミドは、実施例1(その発現カセットは図IIに記載されている)及び実施例7(その発現カセットは図XXXVIIに記載されている)に記載されたものと同一である。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gであり得る(図III)。
好ましくは、これらプラスミドは、MS2/PP7−RLP−mCherry 12X− ZsGreen1 2Xレンチウイルス粒子を生産するために使用される。
1.2 本発明に係る対照MS2−(NC)RLP 12Xレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットが図Iに記載されている)。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、実施例1に記載されたものと同一である(その発現カセットは図IIIに記載されている)。
好ましくは、これらプラスミドは、MS2RLP−mCherry 12Xレンチウイルス粒子を生産するために使用される。
1.3 本発明に係る対照PP7−(NC)RLP 2Xレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド:このプラスミドは、実施例7に記載されたものと同一である(その発現カセットは図XXIIIに記載されている)。
・カプシド形成プラスミド:このプラスミドは、実施例7に記載されたものと同一である(その発現カセットは図XXXVIIに記載されている)。
・エンベローププラスミド(pENV):このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするVSV−Gであり得る(図III)。
好ましくは、これらプラスミドは、PP7RLP−ZsGreen1 2Xレンチウイルス粒子を生産するために使用される。
2.バッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは、国際出願第2013/014537号の出願に記載の前述の方法P1又はP2の1つに従って濃縮/精製する。
2.1 レンチウイルス粒子の生産
5%のCO2で湿潤雰囲気下、37℃で、1%のペニシリン/ストレプトマイシン及び1%のウルトラグルタミン(PAA)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco、Paisley、UK)で培養した、HEK293T プロデューサー細胞(ATCC、CRL−11268)を用いて、10−スタックの細胞TACK(6360cm2、Corning)内で、生産を行う。
レンチウイルス粒子MS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X、好ましくはMS2/PP7−RLP−mCherry 12X− ZsGreen1 2Xの生産を、以下の5つのプラスミドのトランスフェクションによって行う:
−上述した2つの発現プラスミド、pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12Xプラスミド(その発現カセットは、図Iに示されている)及びpcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2Xプラスミド(その発現カセットは、図XXIIIに示されている)を単量又は倍量で使用する;
−p8.74ΔZF−PP7−Coat(50%)、その発現カセットは図XXXVIIに示されている、及びp8.74ΔZF−MS2−Coat(50%)、その発現カセットは図IIに示されている;
−エンベロープVSV−Gを有するpENV、その発現カセットは図IIIに示されている。
対照レンチウイルス粒子MS2−(NC)RLP 12X、好ましくはMS2−RLP−mCherry 12X、を、以下の3つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する:
−上述したpcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X発現プラスミド(その発現カセットは、図Iに示されている);
−p8.74ΔZF−MS2−Coat、その発現カセットは図IIに示されている;
−エンベロープVSV−Gを有するpENV、その発現カセットは図IIIに示されている。
対照レンチウイルス粒子PP7−(NC)RLP 2X、好ましくはPP7−RLP−ZsGreen1 2Xを、以下の3つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する:
−上述したpcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X 発現プラスミド(その発現カセットは、図XXIIIに示されている);
−p8.74ΔZF−PP7−Coat、その発現カセットは図XXXVIIに示されている;
−エンベロープVSV−Gを有するpENV、その発現カセットは図IIIに示されている。
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから24時間後に、培養上清を新鮮な未補充DMEM培地で交換する。プロデューサー細胞を37℃/5%CO2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を4回採取する(トランスフェクション後32時間、48時間、56時間及び72時間)。各収集物を、5分間の3000gでの遠心分離によって清澄化した後に、0.45μmのフィルター(Stericup(登録商標)、Millipore)で精密濾過する。全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
2.2 レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
レンチウイルス粒子を、実施例1に記載された方法P1に従って濃縮及び精製する。
3.レンチウイルス粒子のバッチの滴定
レンチウイルス粒子を実施例1に記載のように滴定する。
4.本発明に係るMS2/PP7−(NC)RLP 12X 2Xレンチウイルス粒子による形質導入
この実施例は、いくつかのタイプのRNAの転移、従っていくつかの異なるタンパク質(ZsGreen1+mCherry)の発現を可能にするMS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子を用いて行う。
HCT116標的細胞(ATCC、CCL−247)を、24−ウェルプレートに播種し、24時間37℃/5%CO2でインキュベートし、10pg p24/細胞の用量でのMS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子により形質導入した。
以下のチェックを行う:
−それぞれ10pg p24/細胞の用量でのMS2RLP−mCherry 12X及びPP7RLP−ZsGreen1 2Xレンチウイルス粒子による形質導入;
−10pg p24/細胞の用量でのMS2RLP−mCherry 12Xレンチウイルス粒子単独による形質導入;
−10pg p24/細胞の用量でのPP7RLP−ZsGreen1 2Xレンチウイルス粒子単独による形質導入。
レンチウイルス粒子による形質導入を、8μg/mLのPolybrene(登録商標)の存在下で行う。細胞防御機構阻害剤BX795(Invivogen)を、MS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X、MS2RLP−mCherry 12X及びPP7RLP−ZsGreen1 2X粒子の場合には6μMの濃度で使用する。標的細胞を形質導入後48時間に回収し、ZsGreen1及びmCherryを発現する細胞のパーセンテージを、サイトメトリー(Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec)によって定量する。
II.結果
図XXXXIIは、HCT116標的細胞におけるMS2及びPP7バクテリオファージに由来するカプシド形成配列によってカプシド形成されたRNAを転移するためのMS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子の有効性を示す。この図は、二重蛍光細胞の割合が、MS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子の形質導入後に97%であり、20pg p24/細胞でのMS2RLP−mCherry 12X及びPP7RLP−ZsGreen1 2X粒子の形質導入後に98%であることを示す。従って、同程度の形質導入有効性が、MS2/PP7−(NC)RLP 12X 2Xの半分の用量について、MS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子で観察される。
MS2RLP−mCherry 12X粒子単独で又はPP7RLP−ZsGreen1 2X粒子単独で形質導入された標的細胞は、単一蛍光タンパク質についてMS2/PP7−(NC)RLP 12X 2X粒子による標的細胞の形質導入後に得られたパーセンテージと同様の形質導入有効性パーセンテージを有する。従って、この結果は、RLP粒子が、標的細胞の単一形質導入において2つの異なるシステム(PP7及びMS2)によってカプシド形成された少なくとも2つのタイプのRNAを輸送及び転移することができることを示す。
RLPの1つの同じバッチの単一形質導入において2つの異なるカプシド形成配列、MS2及びPP7によって指向された異なるタイプのRNAを転移する能力の実証は、特に異なる抗原をコードするRNAの有効な転移のため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするRNAを転移するめに、カプシド形成されたRNAのタイプの調節に対する顕著な利益を表す。

Claims (22)

  1. Gagポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスRNAの前記目的の配列の少なくとも1つが、少なくとも1つのエピトープ及び/又はエピトープを特異的に認識する少なくとも1つの分子構造をコードする部分を含む、レトロウイルス粒子。
  2. ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスRNAがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のRNA配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び/又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される、請求項1に記載のレトロウイルス粒子。
  3. 前記少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列が同一である、請求項2に記載のレトロウイルス粒子。
  4. 前記少なくとも2つのカプシド形成された非ウイルスRNAが、そのRNA配列で異なっている、請求項2に記載のレトロウイルス粒子。
  5. 他のカプシド形成された非ウイルスRNAの目的の配列が、免疫調節タンパク質をコードする、請求項4に記載の粒子。
  6. 第3のカプシド形成された非ウイルスRNAをさらに含む、請求項3から5のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
  7. 前記少なくとも1つのエピトープ及び/又はエピトープを特異的に認識する少なくとも1つの分子構造が、免疫原性である、請求項1から6のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
  8. 前記結合ドメインが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ、第2の結合ドメインが、ヌクレオカプシドに及び/又はインテグラーゼに導入され得る、請求項2から7のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
  9. 前記結合ドメインが、インテグラーゼに導入され、かつ、第2の結合ドメインが、ヌクレオカプシドに及び/又はインテグラーゼに導入され得る、請求項1から7のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
  10. レンチウイルス粒子である、請求項2から9のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
  11. −前記結合ドメインが、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質配列であり、
    −前記非ウイルスRNAのカプシド形成配列が、MS2のステム−ループ配列であり、
    −前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であり、前記NCが、MS2バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーで突然変異している、
    請求項10に記載のレンチウイルス粒子。
  12. −前記結合ドメインが、PP7ファージの「コート」タンパク質配列であり、
    −前記非ウイルスRNAのカプシド形成配列が、PP7のステム−ループ配列であり、
    −前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Gagポリタンパク質に属するHIVのヌクレオカプシドタンパク質(NC)であり、前記NCが、PP7バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第2のジンクフィンガーで突然変異している、
    請求項10に記載のレンチウイルス粒子。
  13. 請求項1から12のいずれか一項に記載の粒子を含有する組成物。
  14. 請求項1から12のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキットであって、以下:
    (i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、前記配列の上流又は下流に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
    (ii)カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
    (iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
    を含む、キット。
  15. 第2のカプシド形成プラスミドをさらに含む、請求項14に記載の生産キットであって、前記第2のカプシド形成プラスミドは:
    −第1のカプシド形成プラスミドが、キメラGagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Gagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び/又は
    −第1のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする、
    生産キット。
  16. 請求項14に記載のキットの製造方法であって、以下:
    (i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、前記配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
    (ii)カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
    (iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
    を含む、方法。
  17. 請求項1から12のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下:
    (i)少なくとも1つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
    (ii)カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、Gagポリタンパク質に由来するタンパク質及び/又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
    (iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
    により、細胞をコトランスフェクトする(co-transfecting)ステップ、並びに
    粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を回収するステップ、
    を含む、方法。
  18. 請求項4から12のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下:
    (i)少なくとも2つの異なる非ウイルスRNA配列を含む発現プラスミドであって、各RNA配列が目的の配列を含み、前記目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されているか、あるいは、第1及び第2の発現プラスミドがそれぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
    (ii)カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
    (iii)エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
    により、細胞をコトランスフェクトするステップ、並びに
    粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を回収するステップ、
    を含む、方法。
  19. 前記上清が、清澄化され、次いで任意により濃縮及び/又は精製される、請求項17又は18に記載の製造方法。
  20. 前記コトランスフェクトするステップが、さらに、第2のカプシド形成プラスミドによって行われ、前記第2のカプシド形成プラスミドは:
    −第1のカプシド形成プラスミドが、キメラGagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Gagポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び/又は
    −第1のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする、
    請求項17から19のいずれか一項に記載の製造方法。
  21. 請求項17から20のいずれか一項に記載の方法によって得られる組成物。
  22. 免疫系の細胞を形質導入するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の粒子、あるいは請求項13又は21に記載の組成物の使用。
JP2018559309A 2016-05-13 2017-05-12 特に免疫応答に関与する細胞への、rnaの転移のためのウイルス粒子 Active JP6916209B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1654333 2016-05-13
FR1654333A FR3051197B1 (fr) 2016-05-13 2016-05-13 Particule virale pour le transfert d'arns dans les cellules impliquees dans la reponse immune
FR1752819 2017-03-31
FR1752819 2017-03-31
PCT/FR2017/051165 WO2017194903A2 (fr) 2016-05-13 2017-05-12 Particule virale pour le transfert d'arns, notamment dans les cellules impliquées dans la réponse immune

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019514413A true JP2019514413A (ja) 2019-06-06
JP2019514413A5 JP2019514413A5 (ja) 2019-11-21
JP6916209B2 JP6916209B2 (ja) 2021-08-11

Family

ID=59070996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018559309A Active JP6916209B2 (ja) 2016-05-13 2017-05-12 特に免疫応答に関与する細胞への、rnaの転移のためのウイルス粒子

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11371059B2 (ja)
EP (1) EP3454889A2 (ja)
JP (1) JP6916209B2 (ja)
CN (1) CN109562150A (ja)
AU (1) AU2017263138B2 (ja)
CA (1) CA3023788A1 (ja)
IL (1) IL262944A (ja)
SG (1) SG11201810014UA (ja)
WO (1) WO2017194903A2 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3294756T3 (da) * 2015-05-15 2021-02-22 Flash Therapeutics Retroviral partikel, omfattende mindst to forskellige indkapslede, ikke-virale RNA'er
EP3696189A1 (en) * 2019-02-14 2020-08-19 European Molecular Biology Laboratory Means and methods for preparing engineered target proteins by genetic code expansion in a target protein selective manner
US20210129135A1 (en) * 2019-11-01 2021-05-06 Nicholas Crabtree Hourglass shaped blood fractionation tube and system

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072056A2 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vectors
JP2015504897A (ja) * 2012-01-12 2015-02-16 エスティーシー. ユーエヌエムStc.Unm 免疫原性のhpvのl2を含むvlp並びに関連する組成物及び方法
WO2016049258A2 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2726975T3 (es) 2011-07-27 2019-10-11 Flash Therapeutics Método para la producción de partículas retrovíricas útiles para transducir células eucariotas

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072056A2 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vectors
JP2015504897A (ja) * 2012-01-12 2015-02-16 エスティーシー. ユーエヌエムStc.Unm 免疫原性のhpvのl2を含むvlp並びに関連する組成物及び方法
WO2016049258A2 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNE PREL; ET AL: "HIGHLY EFFICIENT IN VITRO AND IN VIVO DELIVERY OF FUNCTIONAL RNAS USING NEW VERSATILE 以下備考", MOLECULAR THERAPY - METHODS & CLINICAL DEVELOPMENT, vol. 2, JPN5019004415, 21 October 2015 (2015-10-21), pages 15039 - 1, ISSN: 0004379322 *
PASCALE BOUILLE; ET AL: "TRANSIENT NON-VIRAL RNA DELIVERY MEDIATED BY A LENTIVIRAL PARTICLE", MOLECULAR THERAPY, vol. VOL:24, NR:S1, JPN5019004417, 4 May 2016 (2016-05-04), pages 215, ISSN: 0004379323 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11371059B2 (en) 2022-06-28
WO2017194903A3 (fr) 2018-01-25
IL262944A (en) 2018-12-31
AU2017263138A1 (en) 2019-01-03
US20190203228A1 (en) 2019-07-04
WO2017194903A2 (fr) 2017-11-16
CA3023788A1 (fr) 2017-11-16
AU2017263138B2 (en) 2022-08-25
WO2017194903A8 (fr) 2018-12-27
SG11201810014UA (en) 2018-12-28
EP3454889A2 (fr) 2019-03-20
CN109562150A (zh) 2019-04-02
JP6916209B2 (ja) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7568513B2 (ja) フソソーム組成物およびその使用
Breckpot et al. Lentiviral vectors for cancer immunotherapy: transforming infectious particles into therapeutics
US20140057354A1 (en) Antigen-specific regulatory t-cell induction
US20230407330A1 (en) Vector system for delivery of multiple polynucleotides and uses thereof
Zhou et al. Lentivirus-mediated gene transfer and expression in established human tumor antigen-specific cytotoxic T cells and primary unstimulated T cells
CN116096866A (zh) 靶向脂质颗粒及其组合物和用途
EP4025698A1 (en) Cd24-associated particles and related methods and uses thereof
JP6916209B2 (ja) 特に免疫応答に関与する細胞への、rnaの転移のためのウイルス粒子
KR20230044420A (ko) 바이러스 푸소좀을 생산하기 위한 방법 및 조성물
JP2024521811A (ja) 短縮型ヒヒ内在性レトロウイルス(BaEV)エンベロープ糖タンパク質を含む脂質粒子、ならびに関連する方法及び使用
WO2022019325A1 (ja) 栄養障害型表皮水疱症の治療薬
JP2024528981A (ja) Cd4標的化ウイルスベクターの使用
FR3051197A1 (fr) Particule virale pour le transfert d'arns dans les cellules impliquees dans la reponse immune
US20210388384A1 (en) Vectors
WO2024081820A1 (en) Viral particles targeting hematopoietic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200302

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20201021

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201110

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210209

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210510

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210615

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210715

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6916209

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250