CN109562150A - 用于将rna转移到尤其参与免疫应答的细胞中的病毒颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白,包膜蛋白,任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,所述衣壳化的非病毒RNA每种包含与衣壳化序列结合的目标RNA序列,每种衣壳化序列由被引入到来自Gag多蛋白的蛋白中和/或整合酶中的结合结构域识别;并且,衣壳化的非病毒RNA的至少一个目标序列包含编码至少一个表位的部分和/或至少一种特异性识别表位的分子结构。
Description
本发明涉及用于将非病毒RNA转移到靶细胞中的逆转录病毒系统,更特别地涉及能够递送多种RNA的逆转录病毒颗粒。本发明还涉及包含这些逆转录病毒颗粒的组合物,用于制备它们的试剂盒,相关的制造方法,以及该颗粒和组合物的用途。
将多种RNA引入靶细胞中是研究和开发中如基因治疗中的主要关键问题。
由病毒衍生的载体的使用已成为基因转移的关键方法。病毒载体现在分为两大类:
- 整合载体,其被整合到受体基因组中,和
- 非整合载体,其通常形成染色体外遗传元件。
整合载体如γ-逆转录病毒载体(RV)和慢病毒载体(LV)被稳定整合。非整合型载体,如腺病毒载体(ADV)和腺相关载体(AAV),可从快速分裂的细胞中被快速清除。某些影响特定载体选择的因素,包括其衣壳化能力,靶细胞或宿主细胞的范围,其基因表达谱,其转导有效性和引起免疫应答的能力,如果需要重复转导,这是特别有问题的。
一些应用需要使用非整合载体,如在基因治疗中或在许多体外,离体和体内应用中。举例来说,可以提及:
· 诱导专门细胞重新程序化为多能细胞,以及诱导干细胞或多能细胞分化成专门细胞,
· 同时在靶细胞中表达抗原或蛋白(无论是否有毒),
· 表达基因工程系统例如,如CRE或TALEN蛋白或CRISPR系统,或任意其它需要蛋白或RNA表达的系统。
一种用于将RNA引入靶细胞中的方式采用以属于逆转录病毒科(Retroviridae)(也命名为逆转录病毒科或RNA病毒)的病毒为基础的病毒载体。实际上,在它的复制周期过程中,逆转录病毒科的病毒具有将它的由RNA构成的基因组转化成双链DNA的能力,所述双链DNA将整合进靶细胞的基因组中。该逆转录病毒科的具体例子是γ-逆转录病毒和慢病毒。
逆转录病毒的复制周期包括通过结合膜受体而识别靶细胞(或宿主)的第一阶段。该识别阶段导致在与膜融合以后逆转录病毒进入宿主细胞中。逆转录病毒RNA然后通过逆转录病毒编码的逆转录酶复制成双链DNA,然后整合进宿主细胞的基因组中。该病毒基因组然后如同宿主细胞的所有其它基因一样被宿主细胞转录。该基因组编码能够产生其它病毒的所有蛋白和序列。
更特别地,三种基因是所有逆转录病毒共有的:gag、pol和env。
Gag是编码多蛋白的基因,通过切割从该多蛋白衍生出的蛋白是在复制后参与病毒组装的结构蛋白。这些结构蛋白更特别地是基质蛋白(MA)、外壳蛋白(CA)和核衣壳蛋白(NC)。
Pol是编码整合酶、逆转录酶和蛋白酶的基因。
Env是编码包膜糖蛋白的基因。
这三种基因因而允许将逆转录病毒RNA复制成双链DNA,将该DNA整合进宿主细胞的基因组中,然后产生新合成的逆转录病毒的结构:包膜、衣壳和核衣壳蛋白。但是,为了使新合成的逆转录病毒是完整的,必须将逆转录病毒RNA的两种拷贝衣壳化进这些结构中的每一种内。逆转录病毒RNA的两个拷贝向所述结构中的这种衣壳化,通过核衣壳蛋白对由逆转录病毒RNA的拷贝携带的被称作Psi(表示“包装信号”)的衣壳化序列的识别来完成。
当将从逆转录病毒衍生出的病毒载体用于基因治疗目的时,编码gag、pol和/或env的区域的至少一部分在衣壳化系统和用于表达目标序列的系统之间解离。例如,编码gag和pol的序列由衣壳化质粒携带,从而反向提供生产病毒载体所必需的蛋白。衣壳化序列如同目标序列一样由独立系统携带,以便使得逆转录病毒是非复制的。
但是,在某些情况下,目标RNA序列在宿主细胞的基因组中的随机整合可以中断开放阅读阶段并阻断重要基因的表达。此外,对于某些应用,如细胞的重新程序化,基因组编辑或干细胞的分化,推荐短暂地进行目标序列的表达。
申请WO2007/072056描述了一种病毒载体系统,其包含env、gag、任选的gag/pol以及含有异源衣壳化信号的RNA序列,所述异源衣壳化信号被与gag或与gag/pol结合的对应RNA结合结构域识别。该系统在所述申请中被描述为是非整合的和允许瞬时表达。
但是,这样的系统的有效性仍然是有限的。特别地,为了使靶细胞表达通过这些系统转移的目标RNA,通常必须在细胞中引入该目标RNA的多个拷贝且因此使用高MOI(代表“感染复数”)。MOI对应于引入的载体系统的数目与要感染的细胞的数目之比。高MOI实际上允许通过对相同细胞进行几次感染而将目标RNA的多个拷贝引入细胞中。然而,虽然它允许改善转移的目标RNA的表达水平,但是,高MOI的应用也导致一定的毒性,因为所述细胞遭受多次感染。
这种类型的RNA转移系统对于免疫疗法,尤其是抗肿瘤免疫疗法也是有意义的。
抗肿瘤免疫疗法是一种依赖免疫系统以根除肿瘤细胞的治疗策略。新方法在于对患者的细胞进行基因工程改造以诱导免疫应答并改善靶向性。为了可以在临床上使用这些新的基因疗法,需要安全有效的基因转移方法。RNA转染和慢病毒载体的使用已分别出现作为将T淋巴细胞的特异性受体转移到淋巴细胞中或将抗原转移到树突状细胞中的合适技术。
人类肿瘤细胞特异性抗原的分子鉴定是靶向抗原的特异性免疫疗法发展的关键因素:
· 被称为被动免疫疗法的方法之一在于离体扩增抗原特异性T细胞并将其重新植入患者体内(TCR和CAR T细胞)。这里使用基因以转移将合成抗原嵌合受体(CAR)或新T细胞受体(TCR)引入这些T细胞中,然后通过过继转移再植入它们以治疗癌症。这里,慢病毒载体被广泛使用,并且在临床阶段已经获得了非常令人鼓舞的结果;
· 被称为主动免疫疗法的另一种方法是接种疫苗。树突状细胞(DC)是抗原呈递中的天然物质。树突状细胞由于其刺激幼稚T细胞的能力而处于许多抗肿瘤治疗策略的中心。实际上,树突状细胞是环境的“检测器”,并将收集的信息传递给免疫系统的T和B细胞。因此,这些细胞是用于产生抗肿瘤治疗性免疫的必需靶标,因此被认为是专职的抗原呈递细胞(APC)。基于树突状细胞的疫苗接种的目的是在体内诱导有效T细胞应答以特异性地减少肿瘤质量并且还提供记忆应答。
这两种治疗方法涉及两种特异性,以获得有效且可重复的抗肿瘤免疫应答。首先,必须控制在靶细胞中外源序列如抗原的表达以获得免疫应答而不诱导毒性。同时共表达多种抗原是用于增加抗肿瘤应答和防止肿瘤细胞逃逸的好机会。
APC在免疫系统中发挥重要作用,并构成在免疫治疗策略中的关键要素。APC的使命是将抗原肽呈递给免疫系统的细胞。如果抗原是免疫原性的,则免疫系统将被特异性激活以除去表达它的细胞。因此,这种应答将针对APC,但也针对将表达抗原的任何细胞,这是肿瘤细胞的情况。与外来抗原接触的任何抗原呈递细胞(APC)将处理它以使其与MHC(主要组织相容性复合体)分子相关联,这将允许在其表面上呈递抗原肽。这种组合体将能够引起淋巴细胞的活化,APC将在次级淋巴器官中与该淋巴细胞接触。给定的肿瘤通常表达数种不同的抗原,对于这些抗原,必须教育免疫系统的细胞以使其有效对抗肿瘤。根据肿瘤发展的阶段,这些肿瘤抗原也可以以不同的水平表达。因此,因此,处理对多种抗原的反应在用改良的免疫细胞的治疗的有效性中可能是至关重要的。
第二点是免疫调节剂在靶细胞中的表达,其触发如此修饰的免疫细胞的成熟或活化。免疫细胞内的这些多种共表达将允许模拟先天和适应性免疫应答。因此,这些方法一方面将提供特异性表达抗原的细胞,另一方面,诱导其成熟或分化,这对于完全和有效的免疫应答是必需的。这意味着最有效的治疗来自于将通过多种基因的施用来改善治疗,通过将针对数种肿瘤抗原的免疫应答的特异性与刺激反应相结合(依赖于时间并受控的)。同时在靶细胞中或在体内同时在单次使用中递送抗原和免疫调节剂的事实应该提供临床益处。
分别基于T细胞和树突状细胞(APC)的这两种方法更特别地是本发明的目标。
因此,仍然需要更有效,毒性更低的,更特别地适用于免疫疗法的病毒载体系统。
本发明人的工作允许产生能够在单次感染中将数种目标RNA递送到相同细胞中的载体系统。
因此,本发明涉及逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白,包膜蛋白,任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列由被引入到Gag多蛋白衍生的蛋白中和/或整合酶中的结合结构域识别,并且至少一个所述衣壳化的非病毒RNA的目标序列包含编码至少一个表位和/或至少一个特异性识别表位的分子结构的部分。
根据本发明的逆转录病毒颗粒使得可以通过单次感染将至少两种,优选3种非病毒RNA引入细胞中。可以通过体内,体外或离体方法将这些颗粒引入细胞中。
“来自Gag多蛋白的蛋白”是指从Gag多蛋白的切割产生的任何蛋白。更特别地,它是核衣壳蛋白、基质蛋白(例如,在从MoMuLV型鼠病毒衍生出的逆转录病毒颗粒中)或对γ-逆转录病毒特异性的p12蛋白。
“包膜蛋白”是指任何包膜蛋白,包括假型化包膜蛋白。作为例子,可能举例Ampho包膜蛋白、嗜亲性包膜蛋白、鼠白血病的Moloney病毒(MoMuLV)包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)的包膜蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)的包膜蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)的包膜蛋白、麻疹病毒(MV)的包膜蛋白、Gibbon白血病病毒(GalV)的包膜蛋白、猫内源病毒(RD114)的蛋白或水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白。更特别地,所述包膜蛋白是Ampho包膜蛋白、嗜亲性包膜蛋白、鼠白血病的Moloney病毒(MoMuLV)的包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒(FIV)的包膜蛋白、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)的包膜蛋白、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)的包膜蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)的包膜蛋白、麻疹病毒(MV)的包膜蛋白、Gibbon白血病病毒(GalV)的包膜蛋白或水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白。因而可以将包膜蛋白修饰成靶向某些细胞类型或某些应用(表面受体作为包膜蛋白的用途)。
也可用抗体、糖脂和/或特定配体修饰包膜蛋白以便靶向特定受体和/或细胞类型。
优选地,所述包膜蛋白是VSV-G蛋白。
“整合酶”是指由pol基因编码的酶蛋白,其允许将逆转录病毒DNA整合进受所述逆转录病毒感染的细胞的DNA中(在逆转录病毒的复制期间)。
“衣壳化序列”是指被结合结构域特异性地识别的RNA基序(三维结构和序列)。优选地,所述衣壳化序列是茎-环基序。更优选地,逆转录病毒颗粒的衣壳化序列是细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的RNA茎-环基序,如,例如分别从序列ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID No. 1)或ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID No. 2)产生的序列。所述茎-环基序和更特别地细菌噬菌体MS2的RNA茎-环基序或噬菌体PP7的RNA茎-环基序,可以单独使用或重复数次,优选地2-25次,更优选地2-18次,例如6-18次。
“结合结构域”是指特异性地结合与目标RNA序列连接的衣壳化序列的蛋白的整体或部分。更特别地,它是特异性地结合衣壳化序列的、由三维结构限定的蛋白,无论是否是突变体。优选地,所述结合结构域是异源结构域。更优选地,所述结合结构域是细菌噬菌体MS2、噬菌体PP7或Qβ噬菌体的外壳蛋白,HK022原噬菌体的Nun蛋白,U1A蛋白,或hPum蛋白。
更优选地,所述结合结构域是细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的外壳蛋白。
更优选地,当所述结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白时,其序列是自装配缺陷的,这是由于氨基酸67-75的缺失(PCPΔFG)(Chao等人. 2008)。优选地,噬菌体PP7的外壳蛋白序列针对人细胞经过密码子优化,即选择DNA的碱基以编码优选地存在于人物种中的氨基酸。
“每种序列”是指,所述衣壳化序列可以是相同的或不同的,取决于那些衣壳化序列是否被相同或不同的结合结构域识别。实际上,根据本发明的逆转录病毒颗粒可以包含一个或几个结合结构域。当引入几个结合结构域时,这些可以是在Gag多蛋白中和/或在整合酶中。
所述结合结构域不仅允许识别衣壳化序列,而且能够实现在所述颗粒中带有衣壳化序列的RNA(或在本发明情况下,与衣壳化序列连接的非病毒RNA)的衣壳化。
“衣壳化”是指将RNA包装在病毒颗粒的病毒衣壳中。应当指出,在本发明中,非病毒RNA的衣壳化由衣壳化的非病毒信号(尤其是Psi以外)的识别完成。
“目标序列”表示编码呈现用户兴趣的功能的序列。更特别地,由两种衣壳化的非病毒RNA中的每一种携带的目标序列可以是相同的或不同的。
使用根据本发明的颗粒,可以将相同或不同的非病毒RNA转移进靶细胞中。
由于衣壳化的RNA是非病毒的,这些RNA不存在由pol基因编码的蛋白所识别的位点。
事实上,这些非病毒RNA不参与逆转录病毒的复制周期的早期步骤,即:
- 逆转录酶将单链病毒RNA复制成双链DNA;
- 通过整合酶对LTR末端的识别实现双链DNA成熟和细胞质整合前复合物成熟为细胞核整合前复合物。
因此,由pol基因编码的这些病毒蛋白(逆转录酶,整合酶)在颗粒中是任选的,因此pol基因可以是存在的或部分或完全缺失。优选地,pol基因是存在的或部分缺失。
应注意的是,根据本发明的逆转录病毒颗粒包含病毒和非病毒的遗传物质:
- gag基因,其可以是病毒的或嵌合的。更特别地,当将所述一个或多个结合结构域引入其中时,gag基因是嵌合的;
- 任选的pol基因,其可以是病毒的或嵌合的。由于pol基因编码多种酶,与那些酶有关的序列可以被完全地或部分地删除,是存在的和无功能的,或者是存在的和有功能的。更特别地,当向所述整合酶中引入一个或多个结合结构域时,pol基因是嵌合的;
- 至少两种非病毒RNA,每种非病毒RNA是目标序列和衣壳化序列的载体。更特别地,“非病毒RNA”理解为不含任何逆转录病毒序列的RNA(其也可称为“非逆转录病毒RNA”)。
更特别地,根据本发明的逆转录病毒颗粒允许在靶细胞中在靶细胞中引入能够诱导的RNA:
· 所述靶细胞的内源性的或外源性的一种或多种目标编码序列的转移;
· 一种或多种非编码RNA如能够诱导对基因表达的影响(例如通过shRNA、miRNA、sgRNA、LncRNA或circRNA)的RNA的转移;
· 信使RNA类型或其它类型(miRNA等)的细胞RNA、病毒RNA的亚基因组复制子(HCV等)或完整病毒RNA基因组的转移;
· 所述靶细胞的内源性的或外源性的编码或非编码序列的同时表达。
更特别地,根据本发明的病毒颗粒使得可以将能够诱导的核酸引入靶细胞中:
-在参与免疫应答的细胞中表达一种或多种表位,尤其是一种或多种抗原(树突状细胞或其它抗原呈递细胞);
-转导细胞的激活以触发它们的成熟或活化,或者它们可与之相互作用和对抗的细胞的激活例如由各种复杂机制诱导的免疫抑制机制。这种活化可以通过免疫调节剂实现。这种类型的方法可以产生有利的微环境以触发针对肿瘤细胞的免疫应答。
应该注意,这种方法可以应用于其它类型的免疫应答诱导系统。
“表位”是指可被抗体或淋巴细胞受体特异性识别的结构。
有利地,目标序列编码多个表位,特别是抗原。
“抗原”是指能够触发免疫反应以消除它的身体外来物质。它们可以是天然的或合成的。抗原通常是天然或合成的大分子,通常是蛋白,多糖及其脂质衍生物。免疫活性细胞直接或通过抗原呈递细胞(APC)识别该抗原,该抗原呈递细胞激活特异性免疫。相同的抗原可具有多个表位(相同或不同),从而诱导不同的免疫应答。淋巴细胞对抗原的识别取决于表位的性质。B淋巴细胞通过其膜中的免疫球蛋白直接结合构象表位。T淋巴细胞识别由抗原呈递细胞呈递的对应于氨基酸序列的连续表位。
优选地,表位或抗原来自病原体,特别是病毒,细菌,寄生虫,肿瘤细胞等。
表位或抗原可以从被鉴定为在肿瘤细胞上或从病毒或毒素中大量表达的生物标记物推导出。它的大小可以变化。通常,进行筛选以选择最佳表位或抗原。从表位或抗原的蛋白序列,可以推导出脱氧核糖核酸和核糖核酸的序列。
表位优选地选自肽。更优选地,表位是包含1至50个氨基酸(AA),优选少于30个AA,优选3至12个氨基酸的肽表位。
抗原优选地选自肽,蛋白和糖蛋白。实际上,细胞(宿主)的细胞机器可以翻译衣壳化的RNA,它还可以进行一个或多个附加的翻译后修饰步骤,例如糖基化。实际上,当抗原的产生发生在树突状细胞中时,抗原可以成熟为允许其获得的生物标记物。
由于根据本发明的颗粒允许引入尺寸高达10kb的RNA,因此可以在其中引入具有一致尺寸的抗原序列。然而,抗原序列的大小是可变的。通常,分子尺寸越大,其免疫原性越大。
“抗原序列”是指编码表位或抗原的DNA序列。
有利地,表位或抗原是免疫原性的,也就是说,它可以引发免疫应答。
“免疫原性的”是指抗原诱导免疫应答的可能性。物质可以是抗原性的而不是免疫原性的。这种潜力取决于物种,在抗原与宿主分子之间的相似程度,抗原的物理化学特征(大小,形状,刚性)和接受的抗原剂量。
优选地,表位选自如由抗体或T淋巴细胞膜受体(TCR)的可变部分识别的分子组成的列表。后者根据其免疫原性潜力进行鉴定和选择。
优选地,抗原是肿瘤抗原,即特异性存在于肿瘤细胞表面上的分子,在周围的正常细胞上不存在或缺乏。更优选地,抗原选自“癌症睾丸”组的抗原(例如MAGE-A12,MAGE-A3,MAGE-A10,MAGE-A2,MAGE-A1,CT7/MAGE-C1,CT10,SSX4,BRDT,NY-ES01,SSX2,Xage1b,MAGE-A4......),其由通过生殖细胞的异位表达之外的肿瘤组织特异性表达;在给定组织中表达的分化抗原以及由相应肿瘤细胞在正常细胞中表达的分化抗原;仅在肿瘤细胞中表达的抗原,其可以对应于突变的抗原(α-辅肌动蛋白-4,NY-FC,P53,延伸因子2,苹果酸酶,EGF-R,Kras,Casp8,ACYN4,ALK-EML 14......);由染色体易位(Bcr-Abl)产生的新抗原;由肿瘤过表达的正常细胞表达的抗原(WT 1,ACE,Muc 1,Survivin 2B,端粒酶-溶解蛋白,Her2/neu,EGF-R,EGF,TGFα,亲环蛋白B......);来自病原体,特别是病毒(乳头瘤病毒和宫颈癌或上呼吸消化道癌症,乙型和丙型肝炎病毒和肝癌)的抗原;和来自细菌(幽门螺杆菌和胃癌)或寄生虫(血吸虫和膀胱癌)的抗原,尤其在人类中。特别地,与黑素瘤相关的肿瘤抗原根据它们是否是组织特异性(MART-1,酪氨酸酶TRP-1和TRP-2,gp-100)、肿瘤特异性(对于也由多种癌症表达的那些(MAGE-1,NY-ESO-1)),或根据它们是否是独特的突变肿瘤抗原(β-连环蛋白,CDC27)而被分为三类。
根据本发明的逆转录病毒颗粒包含衣壳化的非病毒RNA,其目标序列包含编码至少一个表位的部分,特别有利于转导抗原呈递细胞,特别是树突状细胞。
“特异性识别表位的分子结构”或“抗体结合部位”是指能够与表位,尤其抗原,建立特异性相互作用的结构。它通常是由抗体的可变部分或淋巴细胞的膜受体组成的免疫受体。优选地,它是存在于T淋巴细胞表面的TCR(T细胞受体)或CAR(嵌合受体)型免疫受体。
优选地,特异性识别表位的分子结构选自:天然,修饰或嵌合T淋巴细胞受体(TCR);B淋巴细胞受体,膜(BCR)或分泌(免疫球蛋白)的受体;和参与免疫应答的其它免疫系统细胞的受体,如NK或NKT淋巴细胞。
根据本发明的逆转录病毒颗粒包含衣壳化的非病毒RNA(其目标序列包含编码至少一种特异性识别抗原的分子结构的部分),对于转导淋巴细胞特别有利。
有利地,根据本发明的逆转录病毒颗粒包含核衣壳蛋白,包膜蛋白,任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列通过被引入到核衣壳蛋白和/或整合酶中的结合结构域识别。
“核衣壳蛋白”是指由gag基因编码的NC结构蛋白。当将结合结构域被引入到核衣壳蛋白中时,这时这种蛋白是衍生自嵌合gag基因的嵌合蛋白。
当结合结构域被引入到整合酶中时,这时整合酶是嵌合蛋白,衍生自嵌合pol基因。
“嵌合蛋白”是指包含数种不同融合的蛋白序列的重组蛋白。
根据第一种实施方案,在根据本发明的逆转录病毒颗粒中,将结合结构域引入核衣壳蛋白中,并且所述至少两种衣壳化的非病毒RNA通过其RNA序列进行区分。
该第一实施方案允许目标RNA的早期和瞬时表达,而在靶细胞的基因组中没有相关的整合事件。
实际上,在根据该第一种实施方案的颗粒与靶细胞接触期间,逆转录病毒颗粒的膜和靶细胞的膜将融合并允许颗粒内容物在目标细胞中的释放。然后RNA被释放到细胞质中,并且细胞机器允许将这些RNA直接翻译成蛋白,也就是说没有额外的步骤,例如逆转录,易位到细胞核中或整合到目标细胞的基因组中。
更特别地,所述至少两种非病毒RNA具有相同的衣壳化序列。在这种情况下,所述至少两种衣壳化的非病毒RNA通过其目标RNA序列进行区分,也就是说包含在两种衣壳化的非病毒RNA中的目标RNA序列是不同的。“不同”是指不相同的或具有不是由自发突变引起的或由操纵者非有意选择的差异的目标序列。
或者,所述至少两种非病毒RNA具有两种不同的衣壳化序列。这至少两种衣壳化序列这时被至少两个不同的结合结构域识别,其中将这些结构域中的至少一个引入核衣壳蛋白中。在这种情况下,所述至少两种衣壳化的非病毒RNA可包含相同或不同的目标序列。
可以衣壳化至少两种非病毒RNA,优选三种非病毒RNA。
根据第一种实施方案的具体实施方式,将第二结合结构域引入到根据本发明的逆转录病毒颗粒的核衣壳蛋白中。
举例来说,当第一结合结构域是噬菌体PP7的“外壳”蛋白时,第二结合结构域可以是细菌噬菌体MS2“外壳”蛋白,或当第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白时,第二结合结构域可以是噬菌体PP7的“外壳”蛋白。
在这种情况下,至少两种衣壳化的非病毒RNA携带不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入到核衣壳蛋白中的第一和第二结合结构域。
更特别地说,当衣壳化三种非病毒RNA时:
-至少两种衣壳化的非病毒RNA具有与第一结合结构域相对应的相同衣壳化序列,并且仅通过它们目标RNA序列进行区分,
-第三种衣壳化的非病毒RNA可以携带相同或不同的衣壳化序列。当衣壳化序列不同时,其可以对应于引入到核衣壳蛋白中的第二结合结构域。
也可以将其它结合结构域引入到核衣壳蛋白中。
除了引入到核衣壳蛋白中的结合结构域之外,还可以将结合结构域引入整合酶中。
这时,整合酶是来自嵌合pol基因的嵌合蛋白。
优选地,当将结合结构域引入整合酶中时,整合酶的序列在C末端结构域位置突变以插入结合结构域的序列。更优选地,整合酶序列在C末端结构域位置突变,以便引入细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的“外壳”蛋白。
在这种情况下,所述至少两种衣壳化的非病毒RNA可以携带不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入到核衣壳蛋白中和整合酶中的结合结构域。
更特别地说,当衣壳化三种非病毒RNA时:
-至少两种衣壳化的非病毒RNA具有与第一结合结构域相对应的相同衣壳化序列,并且仅通过它们目标RNA序列进行区分,
-第三种衣壳化的非病毒RNA携带不同的衣壳化序列,对应于引入到整合酶中的第二个结合结构域。
其它结合结构域也可以被引入整合酶中。
有利地,根据本发明的逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
优选地,在这种慢病毒颗粒中:
-结合结构域是细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白,
-非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎环序列,
-核衣壳蛋白是属于嵌合Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),NC序列在第二个锌指处突变,以插入细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白的序列。
有利地:
-包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G蛋白;
- 衣壳化序列包含MS2茎-环序列的2-25次重复,优选地所述茎-环序列的6-18次重复,更优选地10-14个、例如12次重复。优选地,所述茎-环序列是以下的:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.1)。
或者,优选地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 结合结构域是噬菌体PP7的“外壳”蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列,
- 核衣壳蛋白是属于嵌合Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC序列在第二个锌指处突变以便插入PP7细菌噬菌体的“外壳”蛋白序列。
有利地:
- 包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白;
- 衣壳化序列包含PP7茎-环序列的2-25次重复,优选地所述茎-环序列的2-18次重复,更优选地2-12个、例如6次重复。优选地,所述茎-环序列是以下的:ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID No. 2)。
有利地,可以优化SEQ ID No.2以促进茎-环的折叠。特别地,已经发现连续和交替插入SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag)可能是有益的。
任选地,如果第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,则引入到整合酶中的第二结合结构域可以是噬菌体PP7的外壳蛋白,或如果第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白,则引入到整合酶中的第二结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白。
根据第二个实施方案,本发明涉及逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白,优选核衣壳蛋白,包膜蛋白,整合酶和至少两种衣壳化非病毒RNA,所述衣壳化非病毒RNA每个包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列通过被引入到整合酶的结合结构域识别,并且任选地,通过引入到来自Gag多蛋白的蛋白中的结合结构域识别,优选核衣壳蛋白。
该第二实施方案允许目标RNA的瞬时表达,而在靶细胞的基因组中没有相关的整合事件。
优选地,在该第二实施方案中,整合酶的序列在C末端结构域处突变以插入结合结构域的序列。
有利地,结合结构域是异源结构域。更特别地,结合结构域是MS2噬菌体,PP7噬菌体或Qβ噬菌体的外壳蛋白,HK022原噬菌体的神经蛋白,U1A蛋白或hPum蛋白。
优选地,整合酶的序列在C末端结构域处突变,以便引入MS2噬菌体或PP7噬菌体的“外壳”蛋白的序列。
所述至少两种非病毒RNA可以具有或不具有相同的衣壳化序列。
类似地,至少两种衣壳化的非病毒RNA可以具有或不具有相同的目标RNA序列。
优选地,所述至少两种衣壳化的非病毒RNA通过其目标RNA序列区分,也就是说包含在两种衣壳化的非病毒RNA中的目标RNA序列是不同的。
更特别地,所述至少两种非病毒RNA具有相同的衣壳化序列,其被引入到整合酶中的结合结构域识别。
可以衣壳化至少两种非病毒RNA,优选三种非病毒RNA。
根据第二实施方案的具体实施方案,将第二结合结构域引入到根据本发明的逆转录病毒颗粒的整合酶中。
举例来说,当第一结合结构域是噬菌体PP7的“外壳”蛋白时,第二结合结构域可以是细菌噬菌体MS2“外壳”蛋白,或当第一个结合结构域是细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白时,第二结合结构域可以是PP7噬菌体的“外壳”蛋白。
在这种情况下,至少两种衣壳化的非病毒RNA携带不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于被引入到整合酶中的第一和第二结合结构域。
更特别地说,当衣壳化三种非病毒RNA时:
-至少两种衣壳化的非病毒RNA具有与第一结合结构域相对应的相同衣壳化序列,这些非病毒RNA可任选地通过其目标RNA序列区分,
-第三种衣壳化的非病毒RNA可以携带相同或不同的衣壳化序列。当衣壳化序列不同时,它可以对应于引入到整合酶中的第二结合结构域。
其它结合结构域也可以引入到整合酶中。
除了引入到整合酶中的结合结构域之外,还可以将结合结构域引入到核衣壳蛋白中。
核衣壳蛋白这时是衍生自嵌合gag基因的嵌合蛋白。
在这种情况下,至少两种衣壳化的非病毒RNA可以携带不同的衣壳化序列,每种衣壳化序列分别对应于引入到整合酶和核衣壳蛋白中的结合结构域。
更特别地,当衣壳化三种非病毒RNA时:
-至少两种衣壳化的非病毒RNA具有与被引入到整合酶中的第一结合结构域相对应的衣壳化序列,这些非病毒RNA可任选地通过其目标RNA序列区分,
-第三个衣壳化的非病毒RNA携带不同的衣壳化序列,对应于被引入到核衣壳蛋白中的第二个结合结构域。
也可以将其它结合结构域引入到核衣壳蛋白中。
因此,本发明涉及一种逆转录病毒颗粒,其包含核衣壳蛋白,包膜蛋白,任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,所述衣壳化的非病毒RNA每个包含与衣壳化序列连接的目标RNA序列,每种衣壳化序列通过被引入到核衣壳蛋白和/或整合酶中的结合结构域识别。
任选地,至少两种衣壳化的非病毒RNA的目标序列可以是相同的。
替换地和优选地,在逆转录病毒颗粒中的至少两种衣壳化的非病毒RNA的特征在于它们的RNA序列。
在这种情况下,有利的是其它衣壳化的非病毒RNA的目标序列编码第二表位或抗原,或编码免疫调节蛋白。
在其它衣壳化的非病毒RNA的目标序列编码第二表位或抗原的情况下,因此可以同时表达多个表位和/或抗原并触发组合和协调的免疫应答。作为在肿瘤免疫疗法领域的一个例子,肿瘤细胞成为数种独立免疫应答的靶标。
存在许多免疫调节剂,即可用于控制和引导免疫系统的分子。因此,通过根据本发明的颗粒引入这些免疫调节剂可以涉及免疫系统(希望调节其特异性应答、活化或分化)的所有细胞(淋巴细胞,单核细胞)。在树突状细胞的情况下,这些免疫调节剂具有两个主要功能。
在未成熟状态下,树突状细胞从靶向或感染的组织中捕获抗原,然后在其分化同时时迁移到最近的次级淋巴器官。
在成熟状态下,树突状细胞将抗原呈递给淋巴细胞T以特异性激活它们。
树突状细胞的这种特异性活化导致产生对建立和维持免疫应答必不可少的细胞因子。这些细胞因子允许通过非常复杂的机制将先天系统结合到自适应系统。因此,通常在体外或离体的细胞活化是通过在培养基中添加细胞因子或因子引起的。
微环境以及不同的免疫调节剂可以诱导或促成树突状细胞的活化。例如,PAMP(病原体相关分子模式),TLR(Toll样受体),DAMP(损伤相关分子模式分子)炎症分子可引起树突状细胞的活化。许多分子能够激活树突状细胞。MCM(Monocyte-Conditioned Médium),细胞因子(TNFα,IL-1β,PGL6),前列腺素E2,CD40L或TLR配体。能够作用于树突状细胞活化途径的所有蛋白可对其成熟具有调节作用。以相同的方式,T或B淋巴细胞的免疫调节剂可以是这些细胞的产生和活性的强有力的调节剂,因此刺激免疫应答的各种参与者之间的相互作用并因此改善它。
“免疫调节蛋白”是指以蛋白形式存在的免疫调节剂。
当抗原呈递细胞,特别是树突状细胞或淋巴细胞进行转导以直接表达这些免疫调节剂并扩增免疫应答时,这种实施方案是特别有利的。
因此,诱导抗原呈递细胞,特别是树突状细胞的成熟(伴随抗原的表达)是诱导免疫应答的特别有前途的策略。目标是使免疫系统最佳地响应目标抗原。这种旨在推动免疫系统的启动策略可引起免疫反应的加强。
优选地,免疫调节蛋白选自细胞因子,例如TNFα,IL-1β,PGL6,淋巴因子,例如IL-2,IL-4,IL-12,IL-15,试剂,例如GM-CSF,CD28,I'ICOS(“诱导型共刺激分子“),OX40,CD80,ICOSL或OX40L,以及允许调节所描述活化途径的蛋白,例如TLR配体或NLR(Nod样受体),例如咪喹莫特或CpG。
有利地,逆转录病毒颗粒包含第三衣壳化的非病毒RNA。
第三衣壳化的非病毒RNA可以具有与两种第一衣壳化的非病毒RNA的至少一种目标序列相同的目标序列,或者可以与两种第一种衣壳化的非病毒RNA每一种目标序列区分开。
特别地,逆转录病毒颗粒可包含多于三种衣壳化的非病毒RNA。
有利地,在根据本发明的颗粒包含核衣壳蛋白的情况下,可以将结合结构域引入到核衣壳蛋白中,第二结合结构域可以被引入到核衣壳和/或整合酶中。
或者,在根据本发明的逆转录病毒颗粒中,可以将结合结构域引入到整合酶中,可以将第二结合结构域引入到核衣壳和/或整合酶中。
有利地,根据本发明的逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
当逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒时,可以瞬时表达目标RNA,而在靶细胞(特别是静止细胞)的基因组中没有相关的整合事件。
事实上,除了其在整合反应本身中的作用外,整合酶(IN)参与逆转录病毒复制循环的不同阶段,例如病毒颗粒的形态发生、逆转录和整合前复合物的入核转运。
更特别地,在慢病毒中,整合酶含有允许其在细胞核中定位(凭借PIC)的核定位序列(NLS)。因此,当通过慢病毒的整合酶携带的结合结构域进行非病毒RNA的衣壳化时,衣壳化的非病毒RNA将被转运到靶细胞的细胞核中。实际上,在根据该第二实施方案的慢病毒颗粒与靶细胞接触期间,颗粒的膜和靶细胞的膜将融合并允许衣壳内容物在靶细胞中的释放。RNA这时通过整合酶负责,整合酶通过PIC将允许RNA进入细胞核。这种负责对于某些应用特别有意义,例如在静态细胞中的表达。在逆转录病毒颗粒的情况下,除慢病毒外,整合酶不含这些NLS,因此定位于细胞质中。然而,可以在这种类型的整合酶中加入NLS序列以诱导整合酶的核定位,并因此诱导该整合酶负责的RNA的核定位。
这种负责对于CRISPR系统而言也是特别有用的,所述CRISPR系统需要RNA向导,所述RNA向导变得与靶细胞的基因组特异性地杂交。一旦杂交,这些RNA向导会引导内切核酸酶(Cas9),所述内切核酸酶将允许靶细胞基因组的特定基因座的修饰。
对于免疫疗法,特别是通过慢病毒颗粒进行转导的事实允许转导的RNA的瞬时表达。
因此,根据本发明的颗粒能够在宿主细胞的基因组中递送多个任选在遗传上不同的RNA而没有整合事件,以便一方面表达多种不同的抗原性肿瘤序列,例如,和另一方面,表达能够在免疫应答机制中触发转导细胞的激活的免疫调节蛋白。
更特别地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 所述结合结构域是细菌噬菌体MS2的”外壳”蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列,
- 整合酶是嵌合酶蛋白,其序列已经在C-端结构域处突变以便插入细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白序列。
或者,更特别地,在这样的慢病毒颗粒中:
- 所述结合结构域是噬菌体PP7的“外壳”蛋白,
- 所述非病毒RNA的衣壳化序列是PP7的茎-环序列,
- 整合酶是嵌合酶蛋白,其序列已经在C-端结构域处突变以便插入噬菌体PP7的“外壳”蛋白序列。
任选地,如果第一结合结构域是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白,则引入核衣壳中的第二结合结构域可以是噬菌体PP7的蛋白外壳,或如果第一结合结构域是噬菌体PP7的外壳蛋白,则被引入整合酶中的第二结合结构域可以是细菌噬菌体MS2的外壳蛋白。
实际上,整合酶(IN)由三个不同的功能结构域组成,每个对于确保完全整合反应是必不可少的。N-端结构域含有锌指型基序,其稳定IN的折叠结构并增加该酶的催化活性。IN的中央结构域含有该酶的催化活性所属的DDE氨基酸基序。该中央结构域也参与在逆转录病毒DNA的每个末端处保守的核苷酸序列的识别。C-端结构域在逆转录病毒科中是最低保留的。它具有结合DNA的活性,且是3'末端的成熟反应(为了链转移)所必不可少的。除了它在整合反应本身中的作用以外,IN参与逆转录病毒的复制周期的不同步骤,如病毒颗粒的形态发生、逆转录和整合前复合物的入核转运。
如Petit等人(1999; J. Virol. P5079-5088)所描述,外源序列在IN的C-端中的插入不会扰乱靶细胞的生产和转导步骤,而在N-端中的相同插入不允许实现转导事件的检测。
因而已经将逆转录病毒颗粒修饰以含有与整合酶蛋白融合的细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白(图I)或噬菌体PP7的“外壳”蛋白(图XXXVII)。修饰p8.74衣壳化质粒(编码整合酶蛋白的pol基因的载体)以便通过组装PCR在整合酶的C-端中插入编码外壳蛋白的序列。将p8.74质粒通过PCR线性化,然后将通过PCR预先扩增的外壳序列直接端对端地或通过添加接头克隆在整合酶的C-端。
有利地:
- 包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G蛋白。
- 衣壳化序列包含MS2和/或PP7的茎-环序列的2-25次重复(根据引入的结合结构域),优选地所述茎-环序列的2-18次重复, 更优选地2-18次重复,如6-18次重复,更优选地,对于MS2的茎-环序列,10-14个、例如12次重复。
- 优选地,当所述结合结构域是MS2的外壳蛋白时,所述茎-环序列是以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag (SEQ ID No.1),和/或当所述结合结构域是PP7的外壳蛋白时,所述茎-环序列是以下的:ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(SEQ IDNo.2)和/或与茎环序列SEQ ID No.3交替的茎环序列SEQ ID No.2。
根据本发明的慢病毒颗粒的多个例子在后面进行描述,某些在下述例子中更详细地进行描述:
-RLP或MS2RLP或MS2(NC)-RLP 12X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入到核衣壳中,通过对携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复12次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-MS2 (NC)-RLP 2X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中,通过将携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复两次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-MS2 (NC)-RLP 6X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入核衣壳中,通过对携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复6次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-MS2 (IN)-RLP 2X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中,通过对携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复两次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-MS2 (IN)-RLP 6X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中,通过对携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复6次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-MS2 (IN)-RLP 12X颗粒是通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入整合酶中,通过对携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复12次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-PP7RLP或PP7(NC)-RLP 2X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中,通过对携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复两次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-PP7(NC)-RLP 6X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中,通过对携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复6次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-PP7(NC)-RLP 12X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入核衣壳中,通过将携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复12次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-PP7(IN)-RLP 2X或PP7(IN)-RLP颗粒是通过噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中,通过将携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复两次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-PP7(IN)-RLP 6X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中,通过将携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复6次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-PP7(IN)-RLP 12X颗粒是通过将噬菌体PP7的外壳蛋白插入整合酶中,通过将携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复12次)的RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,
-MS2/PP7RLP或MS2/PP7(NC)-RLP 12X 2X颗粒是通过对RNA进行衣壳化而形成的慢病毒颗粒,该RNA通过将细菌噬菌体MS2的外壳蛋白插入在核衣壳中而携带细菌噬菌体MS2的茎-环基序(重复12次),或通过噬菌体PP7的外壳蛋白插入在核衣壳中而携带噬菌体PP7的茎-环基序(重复2次)。
优选地,通过RNA的衣壳化形成的慢病毒颗粒携带细菌噬菌体MS2或噬菌体PP7的茎-环基序,重复2至25次,更优选2次或6次或12次。
更优选地,根据本发明的颗粒选自MS2 (NC)-RLP 12X,PP7 (NC)-RLP 6X,PP7(NC)-RLP 2X,MS2 (IN)-RLP 12X,PP7 (IN)-RLP 6X和PP7 (IN)-RLP 2X。
本发明还涉及包含根据本发明的颗粒的组合物。
更特别地,根据本发明的组合物是浓缩组合物。有利地,组合物也是纯化的。这些组合物可以根据在申请WO2013/014537中描述的方法进行浓缩和纯化。
通常,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含少于30%的DNA污染物和少于45%的蛋白污染物。更特别地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含少于30%的DNA污染物和少于2%的蛋白污染物。
术语“粗制上清液”意指在澄清后包含根据本发明的逆转录病毒颗粒的细胞培养物的上清液。这种澄清步骤在下文中在制造根据本发明的颗粒的方法中更特别地进行描述。当上清液的回收分数次进行时,粗制上清液这时对应于收集,合并然后澄清的所有上清液。
任选地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含少于1%的DNA污染物和少于1%的蛋白污染物。
本发明还涉及用于制备根据本发明的颗粒的试剂盒和这些试剂盒的制备方法。
更特别地,本发明涉及用于制备根据本发明的颗粒的试剂盒,其包含:
(i)包含至少一个目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii)编码来自Gag多蛋白和/或嵌合整合酶的蛋白的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii)编码包膜蛋白的包膜质粒。
这样的试剂盒还可以包含在试剂盒中包含的质粒的使用说明书。
更特别地,当试剂盒旨在生产根据第一实施方案的颗粒时,该试剂盒包含:
(i) 包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒,其各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的,因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
由于质粒是DNA结构,应理解的是,“包含至少两种非病毒RNA序列的表达质粒”用于指编码至少两种非病毒RNA序列的表达质粒。
实际上,试剂盒的表达质粒含有通过转录获得至少一种非病毒RNA所必需的所有DNA序列。表达质粒含有至少一个启动子,接着是目标DNA序列(将转录成非病毒RNA的cDNA或DNA)和衣壳化序列(编码例如MS2或PP7重复基序的DNA)和任选的RNA稳定序列。
优选地,制备根据第一实施方案的颗粒的试剂盒包括:
(i) 包含至少两种目标序列的表达质粒,其中在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒,其各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
有利地,所述试剂盒生产慢病毒颗粒。
优选地:
- 在表达质粒中,衣壳化序列包含MS2茎-环序列的2-25次重复,优选地茎-环序列的6-18次重复,更优选地10-14个、例如12次重复。有利地,所述茎-环序列是以下:ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag(SEQ ID No.1)。
- 在衣壳化质粒中,所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以便插入细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白的序列。
- 在包膜质粒中,所述包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的蛋白VSV-G。
或优选地:
- 在表达质粒中,衣壳化序列包含PP7茎-环序列的2-25次重复,优选地所述茎-环序列的2-18次重复,更优选地2-12个、例如6次重复。有利地,所述茎-环序列是以下:ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag(SEQ ID No.2)和/或与茎环序列SEQ ID No.3交替的茎环序列SEQ ID No.2。
- 在衣壳化质粒中,所述核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以便插入噬菌体PP7的外壳蛋白的序列。
- 在包膜质粒中,所述包膜蛋白是编码水疱性口炎病毒的包膜蛋白的蛋白VSV-G。
任选地,所述试剂盒包含编码嵌合整合酶的第二个衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含允许识别衣壳化序列的结合结构域。第二个结合结构域可以与嵌合核衣壳蛋白的结合结构域相同或不同。
作为不同结合结构域的示例:
- 引入核衣壳中的结合结构域可以是MS2的外壳蛋白,且引入整合酶中的结合结构域可以是PP7的外壳蛋白,或者
- 引入核衣壳中的结合结构域可以是PP7的外壳蛋白,且引入整合酶中的结合结构域可以是MS2的外壳蛋白。
可以将多个结合结构域引入每个嵌合蛋白中。
可替换地,当试剂盒用于生产根据第二个实施方案的颗粒时,该试剂盒包含:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合整合酶的衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
有利地,根据本发明的生产试剂盒可以进一步包含编码以下的第二种衣壳化质粒:
-当第一种衣壳化质粒编码来源于嵌合Gag多蛋白的蛋白时,来自野生型Gag多蛋白的蛋白,和/或
-当第一种衣壳化质粒编码嵌合整合酶时,野生型整合酶。
还提供了用于制备根据本发明试剂盒的方法。通常,用于制备根据本发明试剂盒的方法包括:
(i) 制备包含至少一种目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列
(ii) 制备编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或嵌合整合酶的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
更具体地,当所述方法涉及用于生产根据第一个实施方案的颗粒的试剂盒时,它包括:
(i) 制备包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,其中在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的,因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地,该方法包括:
(i) 制备包含至少两种目标序列的表达质粒,在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 制备编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
可替换地,当所述方法涉及用于生产根据第二个实施方案的颗粒的试剂盒时,该方法包括:
(i) 制备包含至少一种目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 制备编码嵌合整合酶的衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
本发明也涉及用于制备根据本发明的颗粒的方法。
这样的方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或嵌合整合酶的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒;
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
在制备根据本发明的颗粒的方法中采用的细胞是生产细胞,即这样的细胞:其一旦用带有形成逆转录病毒颗粒所必需的遗传物质的质粒转染,允许形成所述颗粒。作为生产细胞的示例,可以举例HEK293T。
“共转染步骤”是指这样的转染步骤:在该步骤期间通过使生产细胞与制备颗粒的方法的所有质粒接触来进行转染。
更具体地,当制备方法用于生产根据第一个实施方案的颗粒时,它包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种不同非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,其中在该目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
所述至少两种非病毒RNA序列是不同的,因为所述目标序列是不同的和/或所述衣壳化序列是不同的。
优选地,这种制备颗粒的方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种目标序列的表达质粒,其中在这些序列中的每一种的上游或下游插入衣壳化序列,或可替换地,第一种和第二种表达质粒,其各自包含目标序列,在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
所述目标序列是不同的且所述衣壳化序列是相同的,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,所述嵌合核衣壳蛋白包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
可替换地,当制备方法用于生产根据第二个实施方案的颗粒时,该方法包括用以下质粒共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少一种目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合整合酶的衣壳化质粒,所述嵌合整合酶包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和,
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
和回收转染的包含所述颗粒的细胞的上清液。
优选地,根据在申请WO2013/014537中描述的方法完成所有用于制备根据本发明的颗粒的方法。
更具体地,这些用于制备颗粒的方法在无血清培养基中培养的生产细胞上进行,且不进行丁酸钠诱导。
有利地,在特定的时间间隔,如逆转录病毒颗粒的半衰期量级的时间间隔,分数次收集上清液,例如3-6次。通常,以6-18h的量级的时间间隔,优选地8-16h,如8h、12h和/或16h的时间间隔,分4-5次进行上清液的收获。优选地,该收获在更换细胞的培养基以后进行,该更换优选地在转染后24h进行。
用于制备根据本发明的颗粒的方法也包括在其中使上清液澄清的步骤。
优选地,通过离心完成上清液的澄清。
更优选地,这些制备根据本发明的颗粒的方法还包括其中将上清液浓缩和/或纯化的步骤。
优选地,通过在离心单元上的正面超滤完成浓缩和纯化。
有利地,上清液经历一个或多个额外纯化步骤。这些纯化步骤优选地通过切向超滤和/或通过渗滤进行实施。更优选地,上清液经历切向超滤步骤和随后的渗滤步骤。
切向超滤有利地在用聚砜制成的中空纤维筒上进行实施。
任选地,所述组合物然后可以经历离子交换色谱法、特别是阴离子交换色谱法的步骤。然后将由该色谱法步骤产生的洗脱液收集,然后通过中央离心单元上的正面超滤再次浓缩。相对于粗制上清液,从这样的方法产生的组合物包含小于1%的DNA污染物和小于1%的蛋白污染物。
在根据本发明的制造方法中,共转染步骤也可以用第二种衣壳化质粒进行实施,该第二种衣壳化质粒编码:
-来源于野生型Gag多蛋白的蛋白,当第一种衣壳化质粒编码嵌合Gag多蛋白的蛋白时,和/或
-来源于野生型整合酶,当第一种衣壳化质粒编码嵌合整合酶时。
有利地,第二种衣壳化质粒与第一种衣壳化质粒的比例在[10:90]至[60:40]的范围内,优选在[20:80]至[50:50]的范围内。
与使用第二种衣壳化质粒有关的优点,更特别地与上述定义的比例有关的优点在实施例8中更全面地进行了描述。
本发明还涉及可通过制造根据本发明的颗粒的任何方法获得的组合物。
通常,这些组合物具有少于30%的DNA污染物和少于45%的蛋白污染物,相对于粗制上清液。更特别地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含少于30%的DNA污染物和少于2%的蛋白污染物。
任选地,相对于粗制上清液,根据本发明的组合物包含少于1%的DNA污染物和少于1%的蛋白污染物。
最后,本发明涉及根据本发明的颗粒或根据本发明的组合物用于转导细胞,特别是参与免疫应答的细胞的用途。
根据本发明的颗粒和组合物的使用对于转导原代细胞和永生化细胞系以便短暂修饰它们是特别有利的。细胞可以是哺乳动物或其它真核生物的细胞。特别地,这些细胞的转导可以在体内,体外或离体进行。
参与免疫应答的细胞尤其是抗原呈递细胞(APC)和免疫系统细胞。更特别地,它是单核细胞(树突状细胞,巨噬细胞),T或B淋巴细胞,天然杀伤细胞和造血干细胞。
这些颗粒或组合物可以被定性为“疫苗”,并且旨在诱导癌症或病毒特异性效应T淋巴细胞以减小肿瘤的尺寸或根除病毒发展并且还诱导可以避免失去对肿瘤或病毒的控制的记忆T淋巴细胞。
将多种异源核酸引入靶细胞中是研究和开发中以及体外,离体和体内应用的治疗中的主要问题。
本发明通过举例说明给出的以下实施例同时参考附图将得到更好地理解,附图分别代表:
-图I是来自表达质粒的表达盒的构建方案,该表达质粒携带荧光报道分子作为目标RNA序列,该表达质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP;
-图II显示了来自慢病毒衣壳化质粒p8.74的表达盒的构建方案,其中将MS2外壳结合结构域引入到核衣壳序列中,该衣壳化质粒用于生产本发明的慢病毒颗粒MS2RLP。
-图III是来自包膜质粒的表达盒的构建方案;
-图IV显示来自携带荧光素酶(IVa),荧光基因(IVb)或Cre(IVc)作为目标序列的整合慢病毒表达质粒的表达盒的三种构建方案;
-图V是来自用于生产整合慢病毒(ILV)载体的衣壳化质粒p8.74的表达盒的构建方案;
-图VIa是说明用本发明的颗粒转导人淋巴细胞的有效性的图;
-图VIb是说明用整合型慢病毒载体(ILV)进行人淋巴细胞转导的有效性的图;
-图VIIa是说明用本发明的颗粒进行鼠淋巴细胞转导的有效性的图;
-图VIIb是说明用整合型慢病毒载体(ILV)进行鼠淋巴细胞转导的有效性的图;
-图VIIIa是说明用本发明的颗粒转导未成熟人树突状细胞的有效性的图;
-图VIIIb是说明用整合型慢病毒载体(ILV)转导未成熟人树突状细胞的有效性的图;
-图VIIIc说明了在用根据本发明的颗粒转导的未成熟人树突状细胞中的ZsGreen的表达动力学;
-图VIIId说明了在用整合型慢病毒载体(ILV)转导的未成熟人树突状细胞中的ZsGreen的表达动力学;
-图VIIIe是说明用根据本发明的颗粒转导的未成熟人树突状细胞的表型的图;
-图VIIIf是说明用整合型慢病毒载体(ILV)转导的未成熟人树突状细胞的表型分析的图;
-图IXa是说明用本发明的颗粒转导成熟人树突状细胞的有效性的图;
-图IXb是说明用整合型慢病毒载体(ILV)转导成熟人树突状细胞的有效性的图;
-图IXc是说明用根据本发明的颗粒转导的成熟人树突状细胞的表型分析的图;
-图IXd是说明用整合型慢病毒载体(ILV)转导的成熟人树突状细胞的表型分析的图;
-图Xa是说明用根据本发明的颗粒转导来自小鼠骨髓的树突状细胞(BMDC)的有效性的图;
-图Xb是说明用整合型慢病毒载体(ILV)进行BMDC细胞转导的有效性的图;
-图Xc说明了在用根据本发明的颗粒转导的BMDC细胞中的ZsGreen的表达动力学;
-图Xd说明了在用整合型慢病毒载体(ILV)转导的BMDC细胞中的ZsGreen的表达动力学。
-图Xe是说明用根据本发明的颗粒转导的BMDC细胞的表型分析的图;
-图Xf是说明用整合型慢病毒载体(ILV)转导的BMDC细胞的表型分析的图;
-图XIa是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,该表达质粒带有编码MAGE A3抗原的完整抗原序列作为目标RNA序列,该表达质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP;
-图XIb是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,该表达质粒带有编码MAGE A3抗原(PS-MageA3或PS-MAGE A3)的部分抗原序列作为目标RNA序列,该表达质粒用于生产本发明的慢病毒颗粒MS2RLP;
-图XIc是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,所述表达质粒带有编码gp100抗原的部分抗原序列(PS-gp100或PS-GP100)作为目标RNA序列的表达质粒,该表达质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP;
-图XId是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,所述表达质粒带有编码酪氨酸酶的部分抗原序列(PS-Tyr或PS-TYR)作为目标RNA序列,该表达质粒用于生产根据本发明的慢病毒MS2RLP颗粒;
-图XIIa是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,该表达质粒带有编码MAGE A3抗原的完整抗原序列作为目标RNA序列,该表达质粒用于生产整合型慢病毒载体(ILV);
-图XIIb是表达质粒的构建方案,表达质粒携带编码MAGE A3抗原(PS-MageA3或PS-MAGE A3)的部分抗原序列作为目标RNA序列,该表达质粒用于产生整合型慢病毒载体(ILV);
-图IIc是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,该表达质粒携带编码gp100抗原的部分抗原序列(PS-gp100或PS-GP100)作为目标RNA序列,该表达质粒用于产生整合型慢病毒载体(ILV);
-图XIId是产生自表达质粒的表达盒的构建方案,该表达质粒携带编码酪氨酸酶的部分抗原序列(PS-Tyr或PS-TYR)作为目标RNA序列的表达盒,该表达质粒用于产生整合型慢病毒载体(ILV);
-图XIIIa是说明用根据本发明的颗粒转导的BMDC细胞的表型分析的图,所述颗粒包含编码MAGE A3抗原的RNA;
-图XIIIb是说明用包含编码MAGE A3抗原的RNA的整合慢病毒载体(ILV)转导的BMDC细胞的表型分析的图;
-图XIV是说明在小鼠中监测由表达MAGE A3的Renca细胞诱导的肿瘤生长的图;
-图XV显示了产生自携带荧光素酶作为目标RNA序列的表达质粒的表达盒的简图,根据本发明,该表达质粒用于生产PP7RLP慢病毒颗粒,包括重复两次的PP7茎-环基序;
-图XVI显示了p8.74慢病毒衣壳化质粒的修饰(以在整合酶序列中插入结合结构域)示意图;
-图XVII显示了产生自用于产生根据本发明的慢病毒PP7(IN)-RLP颗粒的衣壳化质粒的表达盒的图,该衣壳化质粒通过修饰图XVI所示的慢病毒衣壳化质粒p8.74获得;
-图XVIII显示了在CD8表达磁性分选然后CFSE标记后,来自BABL/c雌性小鼠(野生或肿瘤发育)的细胞上鼠CD8标记和CFSE的表达谱。
-图XIX显示了用单独生长5天的CFSE标记的CD8+细胞(对照,基底)获得的鼠CD8标记和CFSE的表达谱,以及用来自小鼠(野生(上方)或已经肿瘤发育(中间))BABL/c脾的CD8+细胞获得的那些,所述细胞用CFSE标记,然后与未转导(在左边)或转导(在右边)BMDC与RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒共培养5天;结果表示为增殖细胞的百分比;
-图XX是说明与未转导或转导的BMDC与RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒共培养的CFSE标记的CD8+细胞的相对增殖反应的图;显示了以1DC:2T和1DC:4T比例的共培养结果;结果由响应于与用RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC接触而增殖的细胞百分比与非转导BMDC非特异性应答的细胞百分比之比给出(n=3次实验);
-图XXI是说明比较以1DC:2T比例共培养的CD8+细胞的相对增殖反应与通过PLP.MAGEA3.IRES.GFP颗粒转导的BMDC或通过RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC的相对增殖反应的比较实验结果的图;
-图XXII是说明用RLP.ZsGreen1转导的BMDC的ZsGreen1的细胞活力和剂量-表达反应的图。
-图XXIII是产生自表达质粒的表达盒的图,所述表达质粒携带荧光报道分子作为目标RNA序列,用于产生根据本发明的慢病毒颗粒PP7(NC)-RLP和PP7(IN)-RLP;
-图XXIV是说明以1pg p24/细胞的剂量用PP7(IN)-RLP.ZsGreen1转导的BMDC的ZsGreen1的细胞活力和表达动力学的图;
-图XXV是描述证实在转导后5小时和转导后20小时,将编码MAGE A3的RNA转移到用RLPMAGE A3转导的U937细胞中的示意图;
-图XXVI是描述证实在转导后5小时将编码3种AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)的RNA转移到用RLP AAT(与肿瘤或肿瘤抗原相关的抗原)(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR))转导的U937细胞中的示意图;
-图XXVII是说明在转导后20小时将编码3种AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)的RNA转移到用RLP AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)转导的U937细胞中的示意图;
-图XXVIII是描述证实在转导后5小时和转导后20小时,将编码MAGE A3的RNA转移到用RLP MAGE A3转导的hDC细胞中的示意图。
-图XXIX是描述证实在转导后5小时将编码3种AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)的RNA转移到用RLP AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)转导的hDC细胞中的示意图;
-图XXX是描述证实在转导后20小时,将编码3种AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)的RNA转移到用RLP AAT(PS-MAGE A3,PS-GP100,PS-TYR)转导的hDC细胞中的示意图;
-图XXXI显示了产生自携带IL12免疫调节蛋白作为目标RNA序列的表达质粒的表达盒的方案,该蛋白由两个亚基IL 12b(p40)和IL 12a(p35)形成,表达质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP;
-图XXXII是描述证实在转导后5小时,将编码MAGE A3和IL12的RNA转移到用RLP-IL-12/PSMAGE A3转导的U937细胞中的示意图。
-图XXXIII是描述证实,在转导后20小时,将编码MAGE A3和IL12的RNA转移到用RLP-IL-12/PSMAGE A3转导的U937细胞中的图。
-图XXXIV是描述证实,在转导后5小时,将编码MAGE A3和IL12的RNA转移到用RLP-IL-12/PSMAGE A3转导的hDC细胞中的图。
-图XXXV是描述证实,在转导后20小时,将编码MAGE A3和IL12的RNA转移到用RLP-IL-12/PSMAGE A3转导的hDC细胞中的图;
-图XXXVI是描述由用RLP-IL12/MAGE A3转导的hDC分泌的IL12免疫调节蛋白的定量的图(在转导后48小时);
-图XXXVII显示了来自慢病毒衣壳化质粒p8.74的表达盒的构建方案,其中PP7外壳结合结构域被引入核衣壳序列中,该衣壳化质粒用于生产根据本发明的慢病毒颗粒PP7RLP;
-图XXXVIII是描述以1pg p24/细胞的剂量用RLP-PP7(NC).ZsGreen1转导的BMDC的ZsGreen1的细胞活力和表达动力学的图;
-图XXXIX是说明用于产生MS2RLP 12X颗粒的野生型GAG-POL前体在2pg p24/细胞的剂量时在Jurkat细胞中对RNA转移影响的图。
-图XXXX是说明用于产生MS2RLP 12X颗粒的野生型GAG-POL前体在10pg p24/细胞的剂量时对将RNA转移到Jurkat细胞中的影响的图。
-图XXXXI说明在15秒(XXXXIb)和1分钟(XXXXIa)后通过抗p24 Western blot使MS2RLP病毒颗粒成熟的分析;和
-图XXXXII是说明MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X颗粒对于在HCT116细胞中通过MS2和PP7衣壳化序列进行衣壳化的RNA的转移的有效性的图。
在下面的实施例中,所有的转导试验用整合型慢病毒载体(ILV)或携带带有编码荧光蛋白的遗传物质的RNA(RLP)的慢病毒颗粒进行。由于RLP颗粒是非整合的,批次的滴度以物理颗粒/毫升(PP/ml)进行确定,而对于整合型慢病毒载体,滴度通常以转导单位/毫升(TU/ml)表示。因此,用RLP颗粒的感染复数(MOI)以每个细胞的p24蛋白的PP或pg表示,而ILV载体的MOI以TU/ml表示。对每种类型的载体进行转导测试,注意不要置于饱和条件下,并且优先选择允许观察每种类型颗粒的剂量效应的条件。重要的是要记住,两种类型的RLP和ILV产品都是无血清时产生的,以便通过有利于病毒粒子的随后回收来使在上清液中毒性蛋白的产生最小化。一旦澄清后,将上清液通过切向超滤进行浓缩并纯化以获得高纯度。
实施例1:通过根据本发明的病毒颗粒转导免疫系统细胞并将转导有效性与其它
系统进行比较
I.根据本发明的病毒颗粒和比较系统的制备
1.质粒构建
1.1 用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP的质粒
·目标序列的表达质粒:表达质粒携带启动子-目标序列-polyA表达盒,有或没有RNA稳定化或内含子序列。为了将mRNA转运到慢病毒颗粒中,将MS2 RNA的茎-环基序(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag,SEQ ID No.1)的12次重复插入报告基因的下游的表达盒中。使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子,但也可以使用其它启动子。目标序列可以是编码报道蛋白,如天然萤火虫荧光素酶,绿色荧光蛋白(ZsGreen1),红色荧光蛋白(mCherry)或蓝色荧光蛋白(mtBFP)(其表达盒如图1所述)的DNA。目标序列可以是编码蛋白,如免疫原性蛋白或免疫调节蛋白的cDNA。目标序列也可以是cDNA,shRNA,miRNA,sgRNA,LncRNA或circRNA的序列。
·衣壳化质粒:将慢病毒颗粒进行饰以在核衣壳蛋白内,而不是第二个Zn指结构域,包含细菌噬菌体MS2的“外壳”蛋白的序列。携带编码用于生产MS2RLP颗粒的结构和功能蛋白(Gag,Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74根据以下策略进行修饰:该质粒p8.74用于通过PCR组装生产,缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二个锌指的质粒。通过HpaI克隆将第二个锌指用细菌噬菌体MS2的外壳蛋白取代,以生产质粒p8.74ΔZF-MS2-外壳(其表达盒如图II中所述)。编码Pol的序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列,而不改变MS2RLP的功能。
·包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是例如编码水泡性口炎病毒的外壳蛋白的VSV-G基因的序列(其表达盒如图III所示)。
1.2 用于生产整合型慢病毒载体ILV的质粒
· 目标序列的表达质粒:所述表达质粒携带启动子-目标序列表达盒。目标基因的序列可以是例如荧光素酶(图IVa),荧光报道分子(图IVb)或CRE重组酶(图IVc)的序列。该质粒可能含有其它元件,如WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件)天然序列或cPPT/CTS序列。通过用转基因置换逆转录病毒复制所需的病毒基因组的区域来消除病毒的致病性。
· 衣壳化质粒:将携带编码结构蛋白和功能蛋白(Gag, Pol)的基因的p8.74衣壳化质粒用于生产整合型慢病毒载体(其表达盒如图V所示)。
· 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,该包膜蛋白可以是例如编码水泡性口炎病毒的包膜蛋白的VSVG基因序列(其盒表达如图III所述)。
2.批次生产
将质粒转染进细胞中以后,将上清液收获并原样使用,或根据在申请WO 2013/014537中描述的方法浓缩/纯化。
2.1慢病毒载体和慢病毒颗粒的生产
用HEK293T细胞(ATCC, CRL-11268)在10层CellSTACK (6360 cm²,Corning)中进行生产,所述细胞在补充了1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM, Gibco, Paisley, UK)中在含有5% CO2的湿润气氛下在37℃培养。对于血清影响研究实验,给DMEM补充10%FCS。具体地,不进行丁酸钠诱导。对于每个批次(MS2RLP和ILV),转染混合物由以下三种质粒组成:
- 上述的表达质粒之一,取决于形成颗粒(MS2RLP)或载体ILV,
- p8.74ΔZF外壳(MS2RLP)、p8.74 (ILV),和
- 带有包膜VSV-G的pENV。
质粒的各自比例为如下:40%的表达质粒,30%的质粒p8.74(或p8.74ΔZF),30%的pENV质粒。
用磷酸钙标准转染以后24小时,将培养物上清液用未补充的新鲜DMEM培养基替换。将细胞在37℃/5% CO2温育。更换培养基以后,将上清液收获4次(转染后32h、48h、56h和72h)。每次收集物通过在3000g离心5min进行澄清,然后在0.45µm过滤器(Stericup®,Millipore)上微滤。然后将所有收集物混合以组成粗制上清液。
2.2慢病毒载体和慢病毒颗粒的浓缩和纯化
将载体和颗粒根据以下两种方法之一进行浓缩和纯化:
· 方法P1目的在于在离心中央单元上进行上清液的正面超滤;
· 方法P2目的在于进行切向超滤,然后渗滤上清液。将粗制上清液通过使用由聚砜制成的中空纤维筒的切向超滤进行浓缩和纯化。将上清液通过以连续模式在DMEM或TSSM缓冲液中渗滤处理20个透析体积(diavolume)。渗滤以后,将渗余物收集,然后通过在中央离心单元上正面超滤再次浓缩。
用于本实施例的批次生产/浓缩/纯化根据方法P2进行。
3. 滴定
3.1通过qPCR滴定功能颗粒
将HCT116细胞(ATCC, CCL-247)接种在96-孔平板内的100µL补充了10%FCS、100µg/mL链霉素、100 U/mL青霉素和2mM L-Gln的DMEM中,然后在37℃/5% CO2温育24h。为每种载体以及为内部校准参照物进行6次系列稀释。将细胞通过在有Polybrene®8µg/mL (Sigma)存在下这些系列稀释进行转导,然后在37℃/5% CO2温育3天。对于每个系列样品,加入未转导的细胞的一个孔作为对照。接下来将细胞用胰蛋白酶处理,并在使用Nucleospin组织gDNA提取试剂盒(Macherey-Nagel)提取基因组DNA以后通过qPCR确定滴度(转导单位/mL)。将通过qPCR得到的滴度(TU/mL)用内部校准参照物进行归一化,内部校准参照物的滴度预先通过FACS进行确定。
3.2通过P24 Elisa试验定量物理颗粒
使用并遵循关于HIV-1 p24 ELISA试剂盒(Perkin Elmer)的推荐,在病毒上清液中直接检测p24衣壳蛋白。使捕获的p24蛋白与生物素化的多克隆抗体形成复合物,然后通过抗生蛋白链菌素-HRP过氧化物酶缀合物检测。将得到的复合物与底物邻-苯二胺-HCl (OPD)一起温育以后通过分光光度法检测,所述底物产生与捕获的p24的量直接成比例的黄色。使用微量培养板读数器Synergy H1 Hybrid (Biotek)定量每个孔的吸光度,并相对于p24蛋白校准参照范围的吸光度进行校准。从已知1pg p24蛋白对应于104个物理颗粒得到的p24蛋白浓度,计算以物理颗粒/mL表达的病毒滴度。
II. 免疫系统细胞的转导
1. 淋巴细胞
1.1人淋巴细胞的制备
总人淋巴细胞通过在Ficoll梯度上分离外周单核细胞或PBMC(外周血单核细胞),从人全血进行制备。在室温下收集血液样品,并在合适的管(15或50ml)中用PBS 1X pH7.4稀释至1/2。
将1体积Ficoll溶液(GE Healthcare)小心地沉积在2体积的稀释血液下方。重要的是获得2个不同的未混合相:对应于Ficoll的下部相和对应于稀释血的上部相。将管在室温下以400g离心30分钟。停止离心机的制动以避免干扰在离心后获得的不同相。
上部相对应于血浆,下部相对应于Ficoll,并且在这两个相之间形成环,其包含目标群(PBMC)。
轻轻移取PBMC环并转移到新管中。然后用至少3体积的PBS 1X pH7.4溶液洗涤PBMC两次。将细胞在室温下以100g离心10分钟。
除去上清液后,将PBMC重悬于RPMI培养基,10%胎牛血清,2mM L-谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素中并编号。
将细胞以1x106个细胞/ml的浓度重新悬浮,并在2小时期间在37℃/5% CO2下沉积在塑料培养载体上。该步骤允许单核细胞粘附到塑料上,而淋巴细胞保持悬浮,因此可以在培养上清液中回收,然后以每平方厘米1.56×105个细胞接种以准备转导。
1.2鼠淋巴细胞的制备
从脾脏制备鼠淋巴细胞。通过颈脱位使动物安乐死后回收鼠的脾脏。将脾脏沉积在6孔培养板的孔中,并通过用安装有26G 1/2针的注射器以2mg/ml注射1ml胶原酶溶液D(Rochediagnostics)进行膨胀。在1ml的2mg/ml的胶原酶D溶液中在孔中用无菌手术刀将脾切碎成小块。将含有脾脏切块的2ml溶液转移到15ml管中,在+37℃水浴中温育30分钟。通过加入13ml冷MACS缓冲液(PBS 1X pH7.4, 0.5%FCS,2mM EDTA)终止酶促消化,最终体积为15ml。将细胞悬浮液通过置于50ml管上的70μm细胞筛过滤。用冷MACS缓冲液将体积调至30ml。将细胞悬浮液在+4℃下以300g离心10分钟。
然后进行CD8标记表达的阳性分选。为此目的,通过抽吸除去上清液,并将细胞沉淀置于90μl冷MACS缓冲液和10μl抗CD8珠(Miltenyi Biotec)中(对于107个细胞)。将混合物在+4°温育15分钟。在温育结束时,向悬浮液中加入一定体积的MACS缓冲液至15ml。将悬浮液在+4℃下以300g离心10分钟。除去上清液,将细胞沉淀物置于500μl冷MACS缓冲液的等价物中(对于108个细胞)。将悬浮液沉积在安装在磁体上的MS型(Miltenyi Biotec)柱上,该柱并预先用冷MACS缓冲液平衡。用3×500μl冷MACS缓冲液洗涤柱。用冷MACS缓冲液将阴性部分(约2ml)补足至5ml,然后进行细胞计数。将细胞悬浮液在300g,+4℃下离心10分钟,并将细胞以1x106个细胞/ml RPMI 1640培养基的比率重悬于TCT型6孔板(Corning)中用于进行转导,该培养基补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺。
分选后,通过流式细胞计数(Miltenyi Biotec)使用抗CD8抗体标记分析获得的不同级分,以控制分选群体的纯度。
1.3淋巴细胞的转录(人和鼠)
在转导当天,将淋巴细胞以0.5×106个细胞/ml的速率重悬于平底96孔板(进行处理以细胞培养)中,在每孔50μl体积中。制备含有4μg/mL最终Polybrene®的转导培养基和选择的MOI的不同载体(即,在RLP的情况下,每个细胞10,20或30pg p24,和在用于人T淋巴细胞的ILV的情况下,MOI 10,20,25或50:在RLP的情况下为0.1,0.5,1或5pg p24/细胞,和在用于鼠T CD8+淋巴细胞的ILV的情况下,为MOI 5,10,25,50或75)并加入到细胞的体积为50μl,在最终体积为每孔100μl时。然后将板在30℃下以1000g离心75分钟。在离心步骤后,在37℃,5% CO2下将转导培养基留在细胞上4小时。在该温育后,去除80%的转导培养基(80μl)并向每个孔中加入180μl RPMI培养基,10%胎牛血清,2mM L-谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素。将细胞在37℃,5% CO2下温育直至分析。
2. 树突状细胞
2.1 人树突状细胞的制备
2.1.1 从人全血中分离人外周单核细胞(PBMC)
通过在Ficoll梯度上分离PBMC从人全血制备人树突状细胞。在室温下收集血液提取物,并在合适的管(15或50ml)中用PBS 1X pH7.4稀释至1/2。
将1体积Ficoll溶液(GE Healthcare)小心地沉积在2体积的稀释血液下方。重要的是获得2个不同的未混合相:对应于Ficoll的下部相和对应于稀释血的上部相。将管在室温下以400g离心30分钟。停止离心机的制动以避免干扰在离心后获得的不同相。
上部相对应于血浆,下部相对应于Ficoll,并且在这两个相之间形成环,其包含目标群落(PBMC)。
小心地移取PBMC环并转移到新管中。然后用至少3体积的PBS 1X pH7.4洗涤PBMC两次。将细胞在室温下以100g离心10分钟。
除去上清液后,将PBMC重悬于SFM培养基,2mM L-谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素中并编号。
将细胞以每毫升1x106个细胞的浓度重悬浮(每平方厘米2.5x106个细胞)并在37℃/5% CO2下在TCT(Corning)48孔板中沉积2小时。该步骤允许单核细胞粘附到塑料上,而淋巴细胞保持悬浮状态。温育2小时后,用PBS1X洗涤该板,以便仅保留培养物中的单核细胞,其将被转导。
2.1.2 单核细胞群体分化为树突状细胞
树突状细胞在TCT型48孔板(Corning)中以1x106个细胞/ml SFM培养基(补充有1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,200nM人IL4和50mM人GM-CSF)的比率进行培养。这些培养条件使得可以获得未成熟表型的树突状细胞(iDC)。将树突状细胞在37℃/5% CO2下培养5天,并在第3天更新培养基。
为了获得成熟的树突状细胞(mDC),在培养的第三天,将细胞置于含有0.1μg/mLLPS的成熟培养基中。
2.2 鼠树突状细胞的制备
从来自下肢的骨髓(BMDC培养物)制备鼠树突状细胞(DC)。从成年小鼠回收为股骨和胫骨的长骨,并转移到含有补充有1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基的50ml管中。这些骨通过使用携带26G 1/2针并含有补充有1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基的注射器被清空骨髓。将细胞悬浮液在300g,+4℃离心5分钟。除去上清液,将沉淀物置于1ml补充有1%青霉素/链霉素+3ml Gey溶液(155mM NH4Cl,1mM KHCO3)的RPMI 1640培养基中。将悬浮液在室温下温育5分钟,以裂解在细胞悬浮液中含有的红细胞。温育后,用补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基将体积调节至15ml以终止反应,并将细胞悬浮液在300g,+4℃离心5分钟。取出上清液,将沉淀物置于一定体积的RPMI 1640培养基中,该培养基补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺。将该细胞悬浮液在置于50ml管上的70μm细胞筛上过滤。将该筛冲洗直至获得约30ml的最终体积。计数细胞,将细胞悬浮液以300g离心5分钟。除去上清液,将沉淀物置于补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,50μM 2-巯基乙醇,25ng/ml鼠IL4和25ng/ml小鼠GM-CSF的RPMI 1640培养基体积中,允许获得每毫升1x106个细胞的细胞浓度。树突状细胞在ULA型6孔板(Corning)中以1x106个细胞/ml的比率进行培养。将树突状细胞在37℃/5% CO2下培养5天,每2-3天更新培养基。在第三天,将BMDC在新的ULA 6孔板中再培养,以将它们与保持粘附于用于培养的板的巨噬细胞型细胞分离。
2.3 人树突状细胞的转导
在对应于PBMC分离的那天,细胞通过ILV.EF1.ZsGreen1载体被转导在选定的MOI中(在RLP的情况下为每个细胞1,2或4pg p24,和在ILV的情况下为MOI 25,50或75)在培养基SFM,2mM L-谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素中,具有以下转染剂:4μg/mL的Polybrene®(Sigma)和6μM的BX795(Invivogen);在+37°C/5% CO2下温育。在转导后4小时,转导培养基被树突状细胞特异性分化培养基(SFM,2mM L-谷氨酰胺,1%青霉素/链霉素,200nM人IL4和50mM人GM-CSF)取代。该培养基允许培养未成熟的树突状细胞(iDC)。通过不同载体(RLP或ILV)在接种后4小时转导细胞,以在EF1.ZsGreen1盒上建立转导发育。
在不同时间(转导后1,2,3和4天)分析转导的细胞。
为了获得成熟的树突状细胞(mDC),在培养的第三天将细胞置于含有0.1μg/mlLPS的成熟培养基中,并在第4天进行分析。
2.3.1 RLP.ZsGreen1对人树突状细胞的转导
由RLP.ZsGreen1载体转导的树突状细胞是与通过流式细胞术进行分析的荧光表达的表征有关的发育的主体(根据每个细胞1 pg p24至4 pg p24和不同分析时间(对于iDC在转导后1、2、3和4天,对于mDC在转导后4天)的RLP颗粒的增加范围)。仅使用含有4μg/mL的Polybrene®(Sigma)和BX795 6μM(Invivogen)转导剂的培养基制备阴性转导对照。
通过用特异性抗CD11c,抗CD209 DC SIGN,抗CD86(Miltenyi Biotec)抗体免疫染色对树突状细胞进行表型分型,并通过流式细胞术表征。
2.3.2 ILV.EF1.ZsGreen1对人树突状细胞的转导。
由ILV.EF1.ZsGreen1载体转导的树突状细胞是与通过流式细胞术进行分析的荧光表达的表征有关的发育的主体(根据ILV慢病毒颗粒的增长范围,范围从25到75的MOI感染复数(对于iDC在转导后1、2、3和4天,对于mDC在转导后4天))。用仅含有4μg/mL的Polybrene®(Sigma)和6μM的BX795(Invivogen)的转导剂的培养基制备阴性转导对照。
通过用特异性抗CD11c,抗CD209 DC SIGN,抗CD86(Miltenyi Biotec)抗体免疫染色对树突状细胞进行表型分型,并通过流式细胞术表征。
2.4 鼠树突状细胞的转导(BMDC)
在培养6天后,回收树突状细胞并以300g离心5分钟。除去上清液,将细胞在1ml补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中洗涤,并以300g离心5分钟。将树突状细胞以0.5×106细胞/ml接种于96孔板中或24孔板中接种于RPMI 1640中,其补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,50μM 2-巯基乙醇,25ng/ml鼠IL4和25ng/ml鼠GM-CSF。通过不同载体(RLP或ILV)在接种后24小时转导细胞,以通过ZsGreen1荧光的表达建立转导发育。转导在Polybrene®4μg-1(Sigma)存在下进行,然后在+30℃下以1000g离心培养75分钟。然后将转导培养基在+37℃/5% CO2下放置4小时。
在温育后,通过移液去除80%的转导培养基,并用等体积的补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,50μM 2-巯基乙醇,25nM小鼠IL4和25ng/ml预热的小鼠GM-CSF的RPMI 1640替换。然后将细胞恢复至37℃/5% CO2。
2.4.1 通过RLP.ZsGreen1转导鼠树突状细胞
由RLP.ZsGreen1载体转导的树突状细胞是与流式细胞仪分析的荧光表达的表征相关的发育的主体(按照从每个细胞0.1pg p24至5pg p24的RLP颗粒的增长范围和不同的分析时间(在转导后1天、2天,3天和4天))。仅使用含有4μg/mL Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
树突状细胞通过用特异性抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)抗体免疫染色进行表型分型,并通过流式细胞术表征。
2.4.2 通过ILV.EF1.ZsGreen1对鼠树突状细胞的转导
由ILV.EF1.ZsGreen1载体转导的树突状细胞是与流式细胞仪分析的荧光表达的表征相关的发育的主体(根据从5到75的MOI感染复数的慢性病毒ILV颗粒的增长范围,并且在不同的分析时间(在转导后1,2,3和4天))。仅使用含有4μg/mL Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
通过用特异性抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)抗体免疫染色对树突状细胞进行表型分型,并通过流式细胞术表征。
3.细胞的表型和表征
3.1 淋巴细胞的免疫标记
在分选后或在转导后的不同分析时间,从淋巴细胞悬浮在其中的培养板中回收淋巴细胞,并将细胞转移到锥形底96孔培养板的孔中。用PBS 1X pH7.4溶液,5%FCS洗涤细胞,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。
通过用以下与荧光染料缀合的特异性抗体进行免疫染色来表型分型淋巴细胞:抗-CD8,抗-CD4,抗-CD3或抗-TCR(Miltenyi Biotec)。为此,制备抗体溶液的混合物,并将每孔50μl沉积在细胞上。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。加入50μl PBS 1X pH7.4,5%FCS,将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞置于100μl PBS 1X pH7.4,5%FCS中。将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞置于100μl PBS 1XpH7.4,5%FCS中并通过流式细胞术分析。
3.2 人树突状细胞的免疫标记
在每个分析时间,取决于培养板的形式,用移液管锥或刮刀刮取所述孔,并将细胞转移到锥形底96孔培养板的孔中。用PBS 1X pH7.4溶液,5%FCS洗涤细胞,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。
通过用以下与荧光染料缀合的特异性抗体进行免疫染色来表型对树突状细胞进行表型分型:抗CD11c,抗CD209 DC SIGN,抗CD86(Miltenyi Biotec)。为此,制备抗体溶液的混合物,并将其以每孔50μl沉积在回收的树突状细胞上。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。加入50μl PBS 1X pH7.4,5%FCS,将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞再置于在100μl PBS 1X pH7.4,5%FCS中。将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞再置于在100μl PBS 1X pH7.4,5%FCS中并通过流式细胞术分析。
3.3 鼠树突状细胞的免疫标记
在每个分析时间,将细胞转移到具有锥形底部的96孔培养板的孔中。用PBS 1X pH7.4溶液洗涤细胞,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。
通过用“ViobilityTM 485/520”活力标记物(Miltenyi Biotec)进行特异性免疫标记来进行树突状细胞活力的分析。为此,对于每个细胞孔在100μl的PBS 1X pH7.4中施用1μl的ViobilityTM(溶在DMSO中)。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。以300g离心5分钟,翻转去除上清液,将细胞再置于100μl PBS 1X pH7.4,5%FCS中,再以300g离心5分钟,翻转去除上清液。将其再置于在PBS 1X pH7.4,5%FCS中,以用如下所述的特异性抗体标记用于表型分型。
通过用以下与荧光染料缀合的特异性抗体进行免疫染色来对树突状细胞进行表型分型:抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)。为此,制备抗体溶液的混合物,并将其以每孔50μl沉积在回收的树突状细胞上。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。加入50μl PBS 1X pH7.4,5%FCS,将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞再置于100μl PBS 1X pH7.4,5%FCS中。将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞再置于100μl PBS 1X pH7.4,5%FCS中并通过流式细胞术分析。
3.4流式细胞术
通过流式细胞术(Miltenyi Biotec)分析免疫标记的树突状细胞并进行分析。样品根据它们的尺寸(SSC)和粒度(FSC)进行了校准。用Viobility™标记的细胞死亡或正在死亡,因此活细胞是阴性细胞(通过排除标记)。细胞在MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)上表征,并用MacsQuant软件(Miltenyi Biotec)分析。
III. 结果:
1. 通过RLP和ILV的免疫细胞转导有效性的比较
1.1 T淋巴细胞
RLP颗粒或ILV载体的T淋巴细胞转导在人体中(图VIa和VIb)显示出比在小鼠中(图VIIa和VIIb)更高的有效性。事实上,以与用ILV载体获得的方式相当的方式,用RLP以70%的有效性转导幼稚的人T淋巴细胞。类似地,使用RLP激活后获得超过90%的阳性细胞,如同使用ILV一样。另一方面,在测试的感染复数条件下,鼠T淋巴细胞仍然更难以转导,结果从对于RLP的20%到对于ILV的70%。通过增加感染复数(MOI),可以获得在鼠T淋巴细胞上更高的有效性,但具有诱导细胞毒性的风险。
1.2 树突状细胞
对由来自健康人供体的外周血制备的人细胞进行第一次树突状细胞(DC)转导测定。
通过携带RNA(RLP)的慢病毒颗粒或整合型慢病毒载体(ILV)转导未成熟的人树突状细胞(DC)显示出相当的有效性。这种表达直至转导后4天保持稳定(图VIIIc)。通过RLP颗粒以4pg p24/细胞(图4)的MOI转导人DC导致40%阳性细胞。使用MOI 75的ILV载体获得40%的相同有效性(图VIIIb)。由于整合,通过ILV载体的转导产生的表达随时间保持稳定(图Vllld)。对在转导的DC上人DC的4种生物标记物的分析表明,这些生物标记物的表达没有通过RLP颗粒的转导得到显著改变(图VIIIe),证明转导不会改变靶细胞的表型。使用整合型慢病毒载体获得相同的结果,CD209标记物仅略微增加(图VIIIf)。这些结果表明通过ILV载体和RLP颗粒的转导不会破坏未成熟DC的未成熟表型,并且不会使它们参与到活化或分化过程或途径中。
平行地,对通过在培养物中加入LPS而对成熟的树突状细胞进行转导试验。结果显示,使用RLP颗粒在为4pg p24/细胞的MOI时具有30%成熟DC的转导有效性(图IXa),而使用ILV载体在为75的MOI时则具有50%的成熟DC的转导有效性(图IXb)。如前所述,通过颗粒RLP(图IXc)和通过ILV载体(图IXd)的转导不会显著干扰树突状细胞的特征性生物标记物的表达。
对来自小鼠骨髓的树突状细胞(BMDC)进行相同的转导测试。获得的结果显示通过RLP颗粒在5pg p24/细胞的MOI下转导80%的BMDC(图Xa),而在MOI为75时通过ILV载体转导90%(图Xb)。在两种情况下,通过RLP颗粒或通过ILV载体的转导证实了剂量效应。通过RLP颗粒对BMDC的转导动力学表明荧光在转导后4天保持稳定(图Xc)。在通过ILV载体转导的BMDC中的荧光表达的动力学仅通常对整合型载体从第三天开始才观察到(图Xd)。平行地,无论用RLP颗粒(图Xe)或用ILV载体(图Xf),在转导后,不改变鼠DC的特异性生物标记物的表达。
2.增加剂量的RLP和ILV诱导鼠树突状细胞(BMDC)的毒性分析
如前所述,对来自小鼠骨髓的树突状细胞(BMDC)进行转导测定,但包括死细胞的特异性标记以评估毒性是否由使用增加剂量的ILV或RLP的转导诱导。对转染的BMDC在第二天(J2)分析总活细胞的百分比以及在表达树突状细胞特异性CD11c标记物的细胞中表达ZsGreen1的细胞的百分比。获得的结果(图XXII)显示,在转导后48小时,在表达CD11c的BMDC中的ZsGreen1表达的特异性分析显示从0.5pg p24/细胞的MOI通过颗粒RLP的转导50%BMDC CD11c+和在MOI为75时,通过ILV载体转导75%。在由这些细胞表达的荧光强度分析中也观察到剂量效应,对于ILV在MOI 1时,或对于RLP在5pg p24/细胞,使用的RLP具有相同的水平。最后,无论施用于BMDC的RLP颗粒的剂量(0.1至5pg p24/细胞)如何,均未观察到明显的毒性(存活力>80%)。在两种情况下,通过颗粒RLP或ILV载体的转导因此证实了慢病毒颗粒对原代细胞,特别是APC的无毒性。
实施例2:在免疫细胞中受体或抗原表达的功效
I. 根据本发明的病毒颗粒和比较系统的制备
1. 质粒的构建
1.1 用于生产根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP的质粒
· 用于表达目标序列的质粒:表达质粒携带启动子-目标序列-polyA表达盒,有或没有内含子或RNA稳定序列。为了转运在慢病毒颗粒中的mRNA,将MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag,SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复序列插入报告基因下游的表达盒中。使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子,但也可以使用其它启动子。目标序列可以编码抗原或表位。目标序列可以是编码蛋白的cDNA,例如免疫原性蛋白或免疫调节蛋白。已经在肿瘤细胞上鉴定了许多生物标记物,并且它们的完整序列和/或部分序列用于免疫疗法。例如,用于表达MAGE A3抗原的序列可以是完整的(图XIa)或部分的(图XIb)。可以使用肿瘤生物标记物的其它部分序列,例如gp100(图XIc)或酪氨酸酶(图XId)的那些。可以使用肿瘤生物标记物的完整或部分序列的许多其它实例。
· 衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的相同(其表达盒如图II中所述)。
· 包膜的质粒(pENV):该质粒与实施例1中描述的相同(其表达盒如图III中所述)。
1.2 用于生产整合型慢病毒载体ILV的质粒
· 用于表达目标序列的质粒:表达质粒带有启动子-目标序列表达盒(其表达盒如图XII所述)。该质粒可含有其它元件,如天然WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)或cPPT/CTS序列。病毒致病性通过取代通过转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域进行消除。如前所述,目标序列可以编码完整的抗原蛋白,抗原或表位。已经在肿瘤细胞上鉴定了许多生物标记物,并且它们的完整序列和/或部分序列用于免疫疗法。例如,用于表达MAGEA3的序列可以是完全的(图XIIa)或部分的(图XIIb)。可以使用肿瘤生物标记物的其它部分序列,例如gp100(图XIIc)或酪氨酸酶(图XIId)的那些。可以使用肿瘤生物标记物的完整或部分序列的许多其它实例。
· 衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的相同(其表达盒如图V中所述)。
· 包膜质粒(pENV):该质粒与实施例1中描述的相同(其表达盒如图III中所述)。
2. 批次的生产和滴定
如实施例1中所述,通过使用以下表达质粒之一,根据方法P2进行批次生产和滴定:
-pcDNA-EF1.荧光基因.MS2 12X(其表达盒如图I中所述);
-plLV-EF1.荧光基因.WPRE(其表达盒如图IVb所述);
-pcDNA.EF1.PPRV.MAGE A3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X(其表达盒如图XIa中所述);
-pILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP.WPRE(其表达盒如图XIIa中所述);
根据与实施例1中描述的方法相同的方法进行所述批次的滴定。
II. 鼠树突状细胞(BMDC)的转导
根据与实施例1中描述的方法相同的方法进行鼠树突状细胞的制备.
1. 通过RLP-MAGE A3-IRES-GFP用单个肿瘤抗原转导鼠树突状细胞
由RLP.MAGE A3-IRES-GFP颗粒转导的树突状细胞已经作为通过流式细胞术分析的荧光表达的表征的表征相关的发育的主体(根据RLP颗粒的增长范围从0.1pg p24到5pg p24并且在不同分析时间(转导后1,2,3和4天))。使用仅含有4μg/mL的Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
树突状细胞通过用特异性抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)体抗免疫染色进行表型分型,并通过流式细胞术表征。
2. 通过ILV-MAGE A3-IRES-GFP转染单个肿瘤抗原的鼠树突状细胞
通过ILV-MAGE A3-IRES-GFP载体转导的树突状细胞是通过流式细胞术分析的荧光表达的表征相关的发育的主体(按照从5到75的MOI感染复数的在慢病毒ILV颗粒的增长范围内和不同的分析时间(转导后1,2,3和4天))。用仅含有4μg/mL的Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
树突状细胞通过用特异性抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)体抗免疫染色进行表型分型,并通过流式细胞术表征。
3. 细胞的表型和表征
3.1鼠树突状细胞的免疫标记
在每个分析时间,将细胞转移到具有锥形底部的96孔培养板的孔中。细胞用PBS 1XpH7.4,5%FCS洗涤,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。
树突状细胞通过用以下与荧光染料缀合的特异性抗体进行免疫染色进行表型分型:抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)。为此,制备抗体溶液的混合物,并将每孔50μl沉积在回收的树突状细胞上。将细胞在室温下在黑暗中温育20分钟。加入50μl PBS 1XpH7.4,5%FCS,将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞再置于100μl PBS 1XpH7.4,5%FCS中。将细胞以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。将细胞再置于100μl PBS1X pH7.4,5%FCS中并通过流式细胞术分析。
3.2 流式细胞仪
免疫标记的树突状细胞通过流式细胞术(Miltenyi Biotec)分析并进行分析。样品根据它的尺寸(SSC)和它的粒度(FSC)进行了校准。细胞在MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)上表征,并用MacsQuant软件(Miltenyi Biotec)分析。
III. 研究模型的介绍
1. Renca肿瘤模型
该模型使用Renca型鼠肾癌(Balb/c)的肿瘤细胞。这些鼠细胞预先用ILV.EF1.MAGEA3.IRES.GFP(MOI 100)载体转导以表达为人来源的MAGE A3抗原。该模型然后在于将预定数量的这些细胞(1x106个细胞)通过皮下途径重新植入成年Balb/c同系小鼠的侧腹。初步研究允许确定了重新植入的细胞数量,以产生在所有动物中发育的肿瘤,并且不过快地达到极限点(肿瘤>2mm3,动物体重减轻>在植入肿瘤当天的体重的20%)。这些动物来自经过批准的饲养员(Janvier Europe或者Charles River Labs),对于所有这些实验所施用的试验方案都提交当地伦理委员会(EAEC-122伦理委员会)并由其批准。
2. 修饰的树突状细胞的再植入
BMDC如实施例1(2.4)所述用RLP型颗粒(实施例1,2.4.1部分)或ILV(实施例1,2.4.2部分)转导,并在转导后第二天通过皮内途径在与肿瘤再植入同侧的腹股沟淋巴节位置被再植入Balb/c小鼠中。不同量的细胞可以被再植入以评估其在该模型中的治疗效力。
3.肿瘤发展的监测
每天监测所有动物的一般状况。它们每周三次进行称重,并使用游标卡尺通过手动测量来测量肿瘤发展。肿瘤体积根据下式以mm3给出:V=a*(b2/2),其中a=最大直径,b=最小直径。出于伦理原因,肿瘤发展限于2000mm3的体积,动物在达到该极限或其初始体重(=在肿瘤细胞再植入当天)超过20%的损失时被处死。
IV. 结果:通过RLP和ILV表达抗原的有效性的比较
进行第一个实验以测试通过鼠树突状细胞(BMDC)对肿瘤抗原(MAGE A3)的抗原呈递有效性。BMDC在通过使用ZsGreen1荧光测定法的测试确定的最佳条件下通过RLP.MAGEA3.IRES.GFP颗粒或ILV.EF1.MAGE A3.IRES.GFP载体转导。在两种情况下都制备了一系列MOI,并且在第三天对细胞进行表型分型以表达对树突状细胞特异的标记物(图XIIIa和XIIIb)。如前所述,这些分析表明,无论应用的MOI为如何,表型都不会被转导而改变。
用RLP.ZsGreen1或RLP.MAGE A3颗粒转导的BMDC也用于测试Balb/c小鼠的体内表达MAGE A3的肿瘤的发展。两组小鼠接受Renca型同源肿瘤细胞(0.75×106个细胞),它们自身预先被修饰以表达人源MAGE A3肿瘤抗原。在同一天,这些动物在相应的腹股沟淋巴结附近通过皮内途径接受了由RLP-ZsGreen1修饰的BMDC悬浮液(1×105个细胞)用于对照组或通过RLP.MAGE A3修饰的BMDC悬浮液(1×105个细胞)用于测试组。随后肿瘤发展的监测显示,与对照组中的动物不同,接受BMDC.MAGE A3的动物未发生肿瘤(图XIV)。
实施例3:通过整合酶的修饰使慢病毒颗粒PP7 (IN)-RLP 2X的有效性
I. 制备根据本发明的病毒颗粒和比较系统
1. 质粒的构建
· 目标序列的表达质粒:表达质粒携带目标启动子-目标序列-polyA表达盒(图XV或XXIII),有或没有内含子序列或RNA稳定序列。为了转运慢病毒颗粒中的mRNA,将PP7 RNA的茎-环基序的2次重复(ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag SEQ ID No.2和ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag SEQ ID No.3)插入表达盒中在报道基因的下游(图XV或XXIII)。
使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子(图XV或XXIII),但也可以使用其它启动子。目标序列可以是编码报道蛋白的DNA,例如天然萤火虫荧光素酶(图XV),绿色荧光蛋白(ZsGreen1)(图XXIII),红色荧光蛋白(mCherry)或蓝色荧光蛋白(mtBFP),或编码蛋白的cDNA。例如CRE蛋白。优选地,cDNA编码免疫原性蛋白或免疫调节蛋白。目标序列也可以是shRNA,miRNA,sgRNA,LncRNA或circRNA的序列。
· 衣壳化质粒:慢病毒颗粒经过修饰以在整合酶中含有噬菌体PP7的“外壳”蛋白的序列。携带用于生产PP7(IN)-RLP 2X颗粒的编码结构和功能蛋白(Gag,Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74根据由图XVI所示的策略进行修饰:该质粒p8.74用于通过装配PCR产生质粒,在该质粒上噬菌体PP7的外壳蛋白与整合酶的末端C结构域融合。通过HpaI克隆获得的这种融合使得可以产生质粒P8.74-POL-PP7-外壳。由此获得结构(表达盒的结构如图XVII所示)。编码Pol的序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如编码逆转录酶(RT)的序列。
· 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水泡性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G(其表达盒如图III所述)。
2. 慢病毒颗粒的制备、浓缩/纯化和滴定
如实施例1所述制备慢病毒颗粒,根据方法P2浓缩和纯化。颗粒如实施例1中所述进行滴定。
II. 鼠树突状细胞(BMDC)的转导
根据与实施例1中所述相同的方法进行鼠树突状细胞的制备。
1. 用PP7(IN)-RLP2X转导鼠树突状细胞
如实施例1(第2.4段)所述,树突状细胞通过PP7(IN)-RLP.ZsGreen1载体进行转导(以1pg p24/细胞的MOI)并通过流式细胞术在不同的分析时间(转导后1,2和3天)进行分析它们的存活力和ZsGreen1荧光的表达。仅使用含有4μg/mL的Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
通过特异性免疫标记“ViobilityTM 485/520”(Miltenyi Biotec)实现树突状细胞的存活力,并通过流式细胞术进行分析。
2. 细胞的表型和表征
2.1 鼠树突状细胞的免疫标记
在每个分析时间,将细胞转移到具有锥形底部的96孔培养板的孔中。细胞用PBS 1XpH7.4的溶液进行洗涤,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。
根据与实施例1中描述的方法相同的方法,树突状细胞的活力通过用“ViobilityTM485/520”(Miltenyi Biotec)的特异性免疫标记来实现。
2.2 流式细胞术
免疫标记的树突状细胞通过流式细胞术(Miltenyi Biotec)分析并进行分析。样品根据它的尺寸(SSC)和它的粒度(FSC)进行了校准。用Viobility™标记的细胞已死亡,因此活细胞是阴性细胞(排除标记)。细胞在MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)上进行表征,并用MacsQuant软件(Miltenyi Biotec)分析。
III. 结果
图XXIV显示了细胞活力的测量和用PP7(IN)-RLP.ZsGreen1颗粒以每个细胞1pg p24的剂量转导的BMDC的ZsGreen1(APC)的表达动力学。用表达ZsGreen1的PP7(IN)-RLP颗粒转导的鼠BMDC的比例为70%(自在转导后24小时并且稳定地直至3天)。在3天的分析中细胞保持相同的生存力水平,只有表达强度随时间降低。因此,可以在整合酶中转运具有PP7-外壳的慢病毒颗粒中的RNA。优选地,PP7(IN)-RLP颗粒用于在APC中转运携带抗原序列的RNA,例如BMDC。
实施例4:通过免疫细胞中的RLP颗粒转移编码多种抗原的RNA的证实
I. 根据本发明的病毒颗粒和比较系统的制备
1. 质粒的构建
· 用于表达目标序列的质粒:表达质粒携带启动子-目标序列-polyA表达盒,有或没有内含子或RNA稳定序列。为了转运在慢病毒颗粒中的mRNA,将MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag,SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复序列插入在报告基因下游的表达盒中。使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子,但也可以使用其它启动子。目标序列可以编码抗原或表位。已经在肿瘤细胞上鉴定了许多生物标记物,并且它们的完整序列和/或部分序列用于免疫疗法。例如,用于表达MAGE A3抗原的序列可以是完整的(图XIa)或部分的(图XIb)。可以使用生物标记物的其它部分序列,例如gp100(图XIc)或酪氨酸酶(图XId)的那些。可以使用肿瘤生物标记物的完整或部分序列的许多其它实例。
· 衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒相同(图II)。
· 包膜质粒(pENV):该质粒与实施例1(图III)中描述的质粒相同。
2. 批次生产和滴定
根据在实施例1中描述的方法P2,通过使用一种或多种以下表达质粒进行批次生产和滴定:
- 批次 RLP MAGE A3: pcDNA.EF1.PPRV.MAGE A3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X (图XIa).
- 批次 RLP TAAs: pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMageA3.WPRE.MS2 12X (图 XIb) +pcDNA.EF1long.PPRV.PS-Aggp100.WPRE.MS2 12X (图 XIc) + pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X (图 XId).
- 批次 RLP.ZsGreen1: pcDNA. EF1.Fluorescent Gene. MS2 12X (图 I).
-质粒的各自比例如下:40%的一种或多种表达质粒(在RLP-AAT的情况下),30%的质粒p8.74(或p8.74ΔZF)),30%的质粒pENV。
II. APC的转导
1. U937系(ATCC® CRL-1593.2™)
U937细胞系是由37岁男性的组织细胞性淋巴瘤(具有许多单核细胞特征)建立的细胞系。它是用于体外研究单核细胞和巨噬细胞分化的广泛使用的模型。在10%胎牛血清(FCS),1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺(=完全RPMI培养基)存在下,在超低附着(ULA)培养瓶中培养U937细胞,每毫升RPMI 1640培养基100000个细胞。
1.1 用RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒或含有3种肿瘤抗原(RLP-AAT)混合物的颗粒 转导U937细胞
在转导当天,回收并计数细胞。将它们重新悬浮以在500μl培养基中获得500000细胞/ml的细胞悬浮液。准备用于转导的接种在ULA 24孔板中以500μl/孔并一式三份进行。
细胞在补充有以下转染剂的完全RPMI培养基中转导:16μg/mL的Polybrene®和1.2μM的BX795,并在+37℃/5% CO2下温育4小时。向每个相应的孔中加入500μl转导培养基,其中转染剂的终浓度为8μg/mL的Polybrene®和0.6μM的BX795。
转导后5小时,取出800μl转导培养基(80%)并用800μl完全RPMI培养基替换。
1.2 细胞的回收
转导后5小时和20小时,将细胞重新悬浮并抽取到15ml管中,然后以200g离心5分钟以使其沉淀。弃去上清液,将细胞在1ml PBS 1X中洗涤,然后再以200g离心5分钟。弃去上清液,将细胞沉淀物重悬于1ml 0.05%胰蛋白酶-0.53mM EDTA(Corning)中。将细胞在37℃温育5分钟。在温育结束时,将2ml完全RPMI培养基加入细胞悬浮液中。将细胞以200g离心5分钟,然后弃去上清液,用1ml PBS 1X洗涤细胞,最后以200g离心5分钟。弃去上清液,将细胞立即在-80℃下冷冻为干燥沉积物形式。
1.3 总RNA的提取
将每个干燥的沉淀物沉积在冰上以缓慢解冻。在室温下向每个干燥沉淀物中加入1mlTrizol溶液,将细胞温育5分钟,然后加入200μl氯仿。将样品通过10次翻转进行均匀化并在室温下温育2-3分钟。将样品在+4℃下以12000g离心15分钟。在离心结束时,将样品沉积在冰上。将上层相转移至新管(500-600μl)中。加入等体积的70°乙醇,然后使用涡旋来使样品均匀化。
根据试剂盒“RNA纯化小试剂盒”(Ambion)的方案进行总RNA的纯化。每个样品在30μl纯水溶液中进行洗脱。样品的RNA定量通过使用Nanodrop进行,并将样品储存在-80℃。
1.4 RNA的逆转录
,通过使用“Maxima First Strand”酶(ThermoFisher),通过根据提供者的建议,对每个样品的500ng RNA进行将RNA逆转录成互补DNA。
1.5 通过RT-qPCR扩增cDNA
使用实时PCR混合物SYBR®Premix Ex Taq(Takara-cat RR420L),在存在200nM有义和反义寡核苷酸的情况下,对在超纯水中稀释至1/10的5μl DNA进行扩增,终体积为20μl。
向每个孔中加入5μl稀释至1/10的cDNA。
实时PCR使用具有SYBR®Green化学的StepOnePlus热循环仪(AppliedBiosystems)根据以下方案进行:1个循环:在95.0℃下30秒,然后40个循环:包括在95.0℃下5秒和在60.0℃下30秒。
使用的有义寡核苷酸是:
- Q-hGAPDH-S (GACAAGCTTCCCGTTCTCAG) (SEQ ID No.4)
- Q-MAGE A3-F (CTGCCGACCACCATGAACTA) (SEQ ID No.5)
- Q-PSMAGEDC-F (TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA) (SEQ ID No.6)
- Q-PSTyrDC-F (ATGAGCCAGGTGCTTAACAACA) (SEQ ID No.7)
- Q-PSGP100DC-F (TGGCGCCTCAGCACTCTT) (SEQ ID No.8)。
使用的反义寡核苷酸是:
- Q-hGAPDH-AS (GAGTCAACGGATTTGGTCGT) (SEQ ID No.9)
- Q-MAGE A3-R (GGTTGCTGGAGTCCTCATAGGA) (SEQ ID No.10)
- Q- PSMAGETyrDC-R (GGTAGGCAATGAGGACGATGA) (SEQ ID No.11)
- Q-PSGP100DC-R (ACCTGGTCCATGATGGTGAAG) (SEQ ID No.12)。
根据靶,要使用的寡核苷酸对的关联为如下:
- 靶hGAPDH与Q-hGAPDH-S和Q-hGAPDH-AS
- 靶MAGE A3与Q-MAGE A3-F和Q-MAGE A3-R
- 靶PS-MAGEDC与Q-PSMAGEDC-F和Q-PSMAGETyrDC-R
- 靶PS-TyrDC与Q-PSTyrDC-F和Q-PSMAGETyrDC-R
- 靶PS-Gp100DC与Q-PSGP100DC-F和Q-PSGP100DC-R。
预先进行了寡核苷酸的特异性的验证实验。
2. 未成熟人树突状细胞(iDC也称为hDC)的制备
未成熟人树突状细胞(hDC)的制备根据与实施例1(部分II,2.1)中所述方法相同的方法进行。
2.1. 用RLP.ZsGreen1颗粒,RLP.MAGE A3或含有3种肿瘤抗原(RLP-AATs)的混合 物的颗粒转导人树突状细胞
hDC的转导根据与实施例1(第II部分,第2.3节)中描述的方法相同的方法进行。细胞用4pg p24/细胞进行转导,并在不同时间(转导后5小时,20小时)分析。
使用仅含有4μg/mL的Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
在转导当天和在不同的分析时间分析树突状细胞,通过RT-qPCR分析来自转导细胞沉淀物的RNA。
2.2. 细胞的回收
转导后5小时和20小时,从含有粘附于培养塑料的hDC的孔中除去培养物上清液。用0.5ml PBS 1X洗涤,然后被取出。然后细胞接受0.25ml 0.05%胰蛋白酶-0.53mM EDTA(Corning)并在37℃温育2分钟。在温育结束时,加入0.25ml完全RPMI培养基并通过刮孔回收hDC。将细胞以200g离心5分钟。孔用0.5ml PBS 1X(用于在离心后重悬hDC沉淀物)进行洗涤。将如此收获的所有hDC再次以200g离心5分钟。弃去上清液,最后一次用0.5ml PBS 1X洗涤细胞,然后以200g离心5分钟。弃去上清液,将细胞立即在-80℃下冷冻为干沉淀物的形式。
2.3. 总RNA的提取
RNA的制备根据与II.1.3中的该相同实施例中描述的方法相同的方法,使用Ambion的试剂盒“RNA纯化小试剂盒”进行。每个样品在30μl纯水溶液中进行洗脱。使用Nanodrop进行样品的RNA定量,然后将样品储存在-80℃。
2.4. RNA的逆转录
根据在II.1.4中相同实施例中描述的方法,对500ng RNA进行将RNA转录成互补DNA。
2.5. 通过RT-qPCR扩增cDNA
通过RT-qPCR扩增cDNA根据与II.1.5段中相同实施例中描述的方法进行实施。
III. 结果
RT-qPCR的特异性分析允许证明通过RLC颗粒在转导后5小时和20小时转移编码3种抗原(PS-MAGEA3,PS-GP100和PS-TYR)的RNA到APC中(特别是在细胞U937和人类树突中)(分别为图XXVI和XXVII,XXIX和XXX)。根据在实时定量PCR(RT-qPCR)期间是否存在特异性和显著的扩增来分析和解释获得的结果。
结果表明,颗粒中含有的不同RNA,无论是单一类型,如对于颗粒RLP-MAGE A3(图XXV和XXVIII)的情况,或三种不同类型,如对于RLP-AAT颗粒(图XXVI,XXVII和XXIX,XXX),因此通过颗粒RLP很好地转移到APC中。在U937细胞系的情况下,不同RNA的相对量在转导后5小时是显著的(图XXVI),并且它们在转导后20小时增加(图XXVII)。在原代hDC细胞的情况下,相对特异性RNA水平在20小时是显著的(图XXX),即使它们在5小时不太显著(图XXIX)。因此,RLP颗粒对于将编码不同抗原肽的RNA分子的转移到APC(细胞系和原代细胞)中是有效的。这构成了用经修饰的免疫细胞,特别是APC的治疗的有效性中的治疗优势。因此,RLP颗粒是在基于免疫应答特异性的调节的免疫治疗策略中的一部分。
实施例5:评估RLP颗粒对多种抗原表达的有效性
I. 根据本发明的病毒颗粒和比较系统的制备
1. 质粒的构建
1.1 用于生产根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒的质粒
· 用于表达目标序列的质粒:表达质粒携带启动子-目标序列-polyA表达盒,具有或不具有内含子或RNA稳定序列,如图XIIb,XIIc和XIId中所述。为了转运在慢病毒颗粒中的mRNA,将MS2 RNA(ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag,SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复序列插入到在报告基因下游的表达盒中。使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子,但也可以使用其它启动子。目标序列可以编码抗原或表位。已经在肿瘤细胞上鉴定了许多生物标记物,并且它们的完整序列和/或部分序列用于免疫疗法。可以使用肿瘤生物标记物的完整或部分序列的许多其它实例。
· 衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的相同(其表达盒如图II中所述)。
· 包膜质粒(pENV):该质粒与实施例1中描述的相同(其表达盒如图III所述)。
1.2 用于产生ILV整合型慢病毒载体的质粒
· 目标序列的表达质粒:表达质粒携带启动子-目标序列表达盒。目标基因的序列可以是例如荧光报告基因(图IVb)的序列,或抗原或表位的序列。已经在肿瘤细胞上鉴定了许多生物标记物,并且它们的完整序列和/或部分序列用于免疫疗法。例如,用于表达MAGEA3的序列可以是完整的(图XIIa)或部分的(图XIIb)。可以使用肿瘤生物标记物的其它部分序列,例如gp100(图XIIc)或酪氨酸酶(图XIId)的那些。可以使用肿瘤生物标记物的完整或部分序列的许多其它实例。该质粒可含有其它元件,如天然WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)序列或cPPT/CTS序列。通过取代对于通过转基因逆转录病毒复制所需的病毒基因组区域来消除病毒致病性。
· 衣壳化质粒:携带编码结构和功能蛋白(Gag,Pol)的基因的衣壳化质粒p8.74用于产生整合型慢病毒载体(其表达盒如图V所述)。
· 包膜质粒(pENV):该质粒带有编码包膜蛋白的基因,该基因可以是例如编码水泡性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G基因的序列(其表达盒如在图III所述)。
2. 批次的生产和滴定
根据方法P2,如实施例1中所述,通过使用以下表达质粒之一进行批次的生产:
-批次RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr,也称为RLP-AAT:pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMAGEA3.WPRE.MS2 12X(其表达盒如图XIb中所述) + pcDNA.EF1long.PPRV.PS-Aggp100.WPRE.MS2 12X(其表达盒如图XIc所述) + pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgTyrosinase.WPRE.MS2 12X(其表达盒如图XId中所述);
-批次RLP.MAGE A3.IRES.GFP,也称为RLP-MAGE A3:pcDNA.EF1.PPRV.MAGEA3.IRES.GFP.WPRE.MS2 12X(其表达盒如图XIa中所述);
-批次ILV.EF1.PS-MAGE A3/Gp100/Tyr,也称为ILV-AAT:plLV.EF1.PS-AgMAGEA3.WPRE(图XIIb) + plLV.EF1.PS-Aggp100.WPRE(其表达盒如图XIIc中所述) +plLV.EF1.PS-AgTyrosinase.WPRE(其表达盒如图XIId中所述)。
质粒的各自比例如下:40%的一种或多种表达质粒(在RLP-AAT或ILV-AAT的情况下),30%的质粒p8.74(或p8.74ΔZF),30%质粒pENV。
根据与实施例1中所述相同的方法进行批次的滴定。
II. 所用模型的描述
1. 细胞模型
1.1 Renca肿瘤模型
该模型是在实施例2中描述的模型,其中使用预先已用含有3种表达质粒(其表达盒如在图XIIb,c和d中所述,以便稳定地表达抗原肽MAGE A3,gp100和酪氨酸酶,所有三种都是人来源的)的混合物的ILV.EF1.PS-MAGEA3/Gp100/Tyr载体以MOI 100转导的Renca肿瘤细胞。然后该模型在于将0.75×106个这些细胞通过皮下途径再植入BALB/c成年同系背景小鼠的侧腹。这些动物来自经批准的育种者(Janvier Europe),并且所有这些实验方案都提交并由当地伦理委员会(EAEC-122伦理委员会)批准。
每天监测所有动物的一般状况。每周两次,称重它们,并使用Caliper手动测量肿瘤发展。肿瘤体积以mm3根据下式给出:V=a*(b2/2)其中a=最大直径,b=最小直径。
1.2 鼠淋巴细胞的制备
鼠淋巴细胞由来自野生型BALB/c小鼠的脾或来自已形成>1mm3的Renca型肿瘤的小鼠的脾进行制备。通过颈脱位使动物安乐死后收获脾脏。通过在70μm细胞筛上通过压碎进行机械解离。将细胞悬浮液在+4℃下以300g离心5分钟。然后将细胞沉淀物再置于10ml冷MACS缓冲液中,将悬浮液在置于50ml管上的40μm细胞筛上过滤,然后进行细胞计数。将细胞悬浮液在+4℃以300g离心10分钟,然后通过与实施例1中描述的方法相同的方法对CD8标记物的表达进行阳性分选。通过用1ml MACS缓冲液洗涤分选柱而不是使用磁体来回收阳性部分。用冷MACS缓冲液将该部分补足至5ml,然后进行细胞计数。将细胞悬浮液在+4℃下以300g离心10分钟,并将细胞以1×106个细胞/ml的浓度重悬于PBS 1X中。
1.3 分类CD8+鼠脾细胞的CFSE标记
根据以下方法,用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CelITraceTM CFSE染料,In Vitrogen/Thermofisher Scientific)标记来自小鼠脾细胞分选的CD8+ T淋巴细胞:每毫升1×106个细胞的细胞悬浮液是在PBS 1X中进行制备。CFSE的储备溶液在DMSO中为1mM,并且每ml细胞悬浮液加入2μl该溶液以获得以2μM标记的淋巴细胞。然后将细胞在37℃下温育20分钟,避光。通过在补充有1%胎牛血清的RPMI中稀释细胞5次并再次温育悬浮液5分钟来终止反应。然后将细胞悬浮液在室温下以300g离心5分钟,并将细胞以每毫升1.6×106个细胞的浓度重新悬浮于补充有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中,以在ULA型平底96孔板(Corning)中以不同比例与鼠BMDC共培养。在标记后,通过流式细胞术(Miltenyi Biotec)在抗CD8抗体存在下分析如此获得的CD8+ T淋巴细胞,以控制分选群体的纯度和CFSE标记(图XVIII)。
1.4 鼠树突状细胞的制备
根据与实施例1中描述的方法相同的方法进行鼠树突状细胞的制备。
2. 免疫细胞的转导和增殖反应的分析
2.1用含有3种肿瘤抗原混合物的RLP.TAAs颗粒或RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒转导鼠 树突状细胞(BMDC)
在培养的第7天,树突状细胞BMDC通过RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒或通过RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr颗粒(3种表达质粒的混合物,其表达盒如图XIb、c和d所述)以每个细胞3pgp24的比率进行转导。使用仅含有4μg/mL的Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。
树突状细胞在转导当天进行表型,并在24小时后用特异性抗CD11c,抗CD86,抗CD80(Miltenyi Biotec)抗体免疫染色,并通过流式细胞术表征。
2.2 CFSE标记的CD8+ T淋巴细胞与同基因BMDC的共培养
来自野生型BALB/c小鼠或已经发育Renca肿瘤的小鼠的CFSE标记的CD8+ T淋巴细胞在用RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒或用RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr颗粒转导的同系鼠BMDC存在下或使用非转导的BMDC进行培养。在与用RLP-PS-MAGEA3./Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC的共培养物的情况下,测试两种比例:1个BMDC用于2个CD8+ T淋巴细胞(1DC:2T)或1个BMDC用于4个CD8+ T淋巴细胞(1DC:4T)。
在CD8+ T淋巴细胞与用RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒转导的BMDC之间的比例是1个BMDC用于2个CD8+ T淋巴细胞的(1DC:2T)。这些共培养物在最终体积为200μl的RPMI 1640培养基中,培养基补充有10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,2mM L-谷氨酰胺,在ULA型平底96孔板中(Corning)。BMDC以每孔40000个细胞的比率进行温育,因此CD8+ T淋巴细胞的数量从每孔80000至160000个细胞变化。
2.3 CD8+ T淋巴细胞增殖反应的分析
共培养5天后,从培养板中回收细胞混合物,以将其转移到锥形底96孔培养板的孔中,以进行标记用于流式细胞术分析。细胞用PBS 1X pH7.4,5%FCS溶液洗涤,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。根据上文在实施例1中描述的方法,通过用缀合荧光染料(Miltenyi Biotec)的抗CD8抗体进行免疫染色来分析淋巴细胞。将细胞再置于100μl PBS1X pH7.4,5%FCS中并通过流式细胞术进行分析,同时根据它们对CD8标记物的表达(这使得可以将它们与仍然存在于细胞中的BMDC区分开)和CFSE的表达,其相对荧光水平在每个细胞分裂时减半,因此其可以量化细胞的增殖反应。
图XIX显示了用单独的培养的CD8+ T淋巴细胞获得的CFSE的表达谱以及与未转导或用RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC共培养5天后获得的CFSE的表达谱。
2.4 流式细胞术
免疫标记的淋巴细胞通过流式细胞术(Miltenyi Biotec)进行分析。样品根据它的尺寸(SSC)和它的粒度(FSC)进行了校准。细胞在MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)上进行表征,并用MacsQuant软件(Miltenyi Biotec)进行分析。
II. 结果
在这些实验中,非转导的、用RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒转导的或用RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC已经以不同比例与T淋巴细胞进行了共培养,T淋巴细胞根据它们的抑制性T淋巴细胞(其在肿瘤反应发展中被涉及并预先用CFSE标记)的特异性CD8标记物的表达进行分类。图XVIII验证了来自野生和肿瘤小鼠脾脏的细胞纯度(整个群体中CD8标记物的表达),以及在第0天的CFSE标记。图XIX显示用BMDC(比率DC:2T)共培养5天的CFSE标记的CD8+ T淋巴细胞通过增殖作出响应。这通过在一个或多个峰上向左侧的CFSE标记的荧光强度的降低反映在细胞计数中。该分析侧重于在这些峰中细胞的百分比。所示的曲线代表3个实验。来自野生型小鼠的CD8+ T淋巴细胞的响应是相似的,无论它们与转导的或未转导的BMDC接触。这种现象可通过以下事实解释:即使在不存在抗原的情况下,与树突状细胞接触的幼稚淋巴细胞也能够增殖(Q.Ge等,PNAS.2002 99(5):2983-2988)。相反,来自已发育了表达3种肿瘤抗原(MAGE A3/gp100/Tyr)的Renca肿瘤的小鼠的CD8+ T淋巴细胞对未转导的BMDC反应较差。在与由RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC共培养期间,当它们再次暴露于通过肿瘤表达的抗原时,它们会特异地反应(在这种情况下31.42%的细胞增殖,与之相比,面对非转导BMDC时仅为14.94%)。已经表明,由肿瘤产生的某些因子(IL-10,PGE2)可导致体内T淋巴细胞无能为力现象的产生(M.Ahmadi等,Cancer Res. 2008年9月15日;68(18):7520-7529)。这解释了为什么当它们暴露于未转导的BMDC时,这些CD8+ T淋巴细胞比幼稚CD8+ T淋巴细胞增殖少得多。
作为对照,单独培养5天而未暴露于树突状细胞的CFSE标记的CD8+ T淋巴细胞不增殖,并且其CFSE表达谱这时与第0天观察到的相似(图XVIII)。无论CD8 T淋巴细胞的起源如何(野生型或肿瘤小鼠),所述表达谱均相同。
图XX显示了与用RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC共培养的CD8+ T淋巴细胞的增殖反应的分析,与这些与未转导的BMDC的共培养的相同CD8+ T淋巴细胞的反应相比较。对来自3只野生小鼠或3只已发育Renca肿瘤的小鼠的CD8+ T淋巴细胞的不同共培养物和还来自3种不同培养物的BMDC进行了分析。从共培养物中以1DC:2T的比例或1DC:4T的比例分析了CD8+ T淋巴细胞应答。相对增殖反应由响应于用RLP-PS-MAGEA3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC增殖的细胞百分比相对于非特异性响应于未转导的BMDC的细胞百分比的比率给出。结果显示来自已发育了表达3种与人肿瘤相关抗原(AAT)的Renca肿瘤的小鼠的CD8+ T淋巴细胞特异性地响应于由这些AAT的新刺激(对于1DC:2T共培养物为2.67,对于1DC:4T共培养物为3.90)而来自幼稚小鼠的CD8+ T淋巴细胞以与用RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC相似方式应答(对于共培养物1DC:2T为1.59和对于共培养物1DC:4T为1.78)。
最后,图XXI比较了在条件1DC:2T中与由RLP.MAGE A3.IRES.GFP颗粒转导或由RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC共培养的CD8+ T淋巴细胞的相对增殖反应。如图XX所示,这些分析表明,来自已经发育出携带3种AAT的Renca肿瘤的小鼠的CD8+ T淋巴细胞比来自野生小鼠的CD8+ T淋巴细胞对用RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC的反应更多。此外,它们特异性地响应于仅携带这些抗原之一(MAGE A3)的颗粒转导的BMDC。
总而言之,所有这些结果表明,用RLP-PS-MAGE A3/Gp100/Tyr颗粒转导的BMDC因此能够很好地呈递对应于3种AAT(MAGE A3,gp100和酪氨酸酶)的抗原肽。因此,对应于3种肽的RNA分子由对抗原呈递细胞特异的细胞机器负责,所述抗原呈递细胞足够长时间且有效地呈递这些表面肽,从而可以激活与它们相遇的CD8+ T淋巴细胞。
用RNA颗粒转导的树突状细胞的免疫方法经证明是特别有利的,并且不需要所述一种或多种抗原的恒定表达来诱导和维持记忆T淋巴细胞群(M.J. Bevan和A.W.Goldrath.Curret Biology. 2000,10:R338-R340)。
实施例6:通过RLP颗粒将编码抗原和免疫调节蛋白的RNA转移到免疫细胞中的的
证实和RLPI颗粒的有效性
I. 根据本发明的病毒颗粒和对比系统的制备
1. 质粒的构建
· 目标序列的表达质粒:表达质粒携带启动子-目标序列-polyA表达盒,具有或不具有内含子或RNA稳定序列。为了将mRNA转运到慢病毒颗粒中,将MS2 RNA (ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag,SEQ ID No.1)的茎-环基序的12次重复插入在报告基因下游的表达盒中。使用的启动子可以是CMV或EF1的启动子,但也可以使用其它启动子。目标序列可以编码抗原或表位。已经在肿瘤细胞上鉴定了许多生物标记物,并且它们的完整序列和/或部分序列用于免疫疗法。例如,用于表达MAGE A3抗原的序列可以是完整的(图XIa)或部分的(图XIb)。目标序列还可以编码免疫调节蛋白,例如细胞因子或白细胞介素,例如IL-12。
· 衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒(其表达盒如图II中所述)相同。
· 包膜质粒(pENV):该质粒与在实施例1中描述的质粒(其表达盒如图III中所述)相同。
2. 批次的生产和滴定
如实施例1中所述,通过使用以下表达质粒,根据方法P2进行批次的生产和滴定:
-批次RLP-PS-MAGE A3/IL-12: 线性pcDNA.EF1long.PPRV.PS-AgMAGE A3. WPRE.MS212X(其表达盒如图XIb中所述)和pcDNA.EF1.IL12b-linker-DeltaIL12a.MS2 12X(其表达盒如图XXXI中所述)。
质粒的各自比例如下:40%的表达质粒,30%的质粒p8.74(或p8.74ΔZF),30%的质粒pENV。
II. 免疫系统的细胞的转导
1. U937系(ATCC®CRL-1593.2™)
在实施例4(II,第1段)中描述的条件下培养U937细胞系。
1.1. 用含有肿瘤抗原和免疫调节蛋白(RLP-PS-MAGE A3/IL-12)混合物的颗粒转 导U937细胞
根据在实施例4(II,第1.1段)中描述的方法进行U937细胞的转导。
1.2. 细胞的回收
在转导后5小时和20小时,根据实施例4(II,第1.2段)中描述的方法回收和处理细胞。
1.3. 总RNA的提取
根据实施例4(II,1.3段)中描述的方法处理每个干燥沉淀物以提取和纯化总RNA。
1.4. RNA的逆转录
根据实施例4(II,第1.4段)中描述的方法,将RNA逆转录成互补DNA。
1.5. 通过RT-qPCR扩增cDNA
在200nM有义和反义寡核苷酸存在下,用实时PCR混合物SYBR®Premix Ex Taq(Takara-cat RR420L)对5μl在超纯水中稀释至1/10的cDNA进行扩增,最终体积为20μl。向每个孔中加入5μl稀释至1/10的cDNA。
实时PCR使用具有SYBR®Green化学的StepOnePlus热循环仪(AppliedBiosystems)根据以下方案进行实施:1个循环:在95.0℃下30秒,然后40个循环:包括在95.0℃下5秒和在60.0℃下30秒。
使用的有义寡核苷酸是:
- Q-hGAPDH-S (GACAAGCTTCCCGTTCTCAG) (SEQ ID No.4)
- Q-PSMAGEDC-F (TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA) (SEQ ID No.6)
- Q-IL12ap35-F (CGGATCTAGGGTCATTCCAGTCT) (SEQ ID No.13)。
使用的反义寡核苷酸是:
- Q-hGAPDH-AS (GAGTCAACGGATTTGGTCGT) (SEQ ID No.9)
- Q- PSMAGETyrDC-R (GGTAGGCAATGAGGACGATGA) (SEQ ID No.11)
- Q- IL12ap35-R (GTTTTTCTCTGGCCGTCTTCA) (SEQ ID No.14)。
根据目标,要使用的寡核苷酸对的关联如下:
-靶hGAPDH与Q-hGAPDH-S和Q-hGAPDH-AS
-靶PS-MAGEDC与Q-PSMageDC-F和Q-PSMAGETyrDC-R
-靶IL12ap35与Q-IL12ap35-F和Q-IL12ap35-R。
已经预先进行了关于寡核苷酸特异性的验证实验。
2. 未成熟人树突状细胞(hDC)的制备
根据与实施例1中描述的方法相同的方法(部分II,第2.1段)进行未成熟人树突状细胞的制备。
2.1 用含有肿瘤抗原和免疫调节蛋白(RLP-PS-MAGE A3/IL-12)的混合物的颗粒 转导人树突状细胞
根据与实施例1(第II部分,第2.3节)中描述的方法相同的方法进行人树突状细胞的转导。细胞用4pg p24/细胞进行转导,并在不同时间(转导后5小时,20小时)进行分析。
用仅含有4μg/mL的Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备阴性转导对照。在转导当天和在不同分析时间,通过RT-qPCR对来自转导细胞沉淀物的RNA来分析树突状细胞。
2.2. 细胞的回收
为了分析RNA表达,在转导后在不同时间的人树突状细胞的回收根据实施例4(II,第2.2节)中描述的方案进行实施。将细胞以干燥沉淀物的形式冷冻至-80℃。为了IL12分泌分析,在转导后20小时和48小时取细胞培养的上清液。
将上清液储存在-20℃。
2.3. 总RNA的提取
根据与实施例4(II,第2.3段)中描述的方法相同的方法进行RNA的制备。
2.4. RNA的逆转录
根据实施例4(II,第2.4段)中描述的方法,在500ngRNA上进行RNA逆转录成互补DNA。
2.5. 通过RT-qPCR扩增cDNA
通过RT-qPCR扩增cDNA是根据实施例4(II,第2.5段)中描述的方法进行的。
2.6. 用于IL12分泌的ELISA测试
用于定量在细胞培养上清液中IL12分泌的ELISA测试根据与试剂盒“Human IL-12Standard ABTS ELISA Development Kit”(Peprotech)提供的方案进行。
III. 结果:
通过RT-qPCR的特异性分析允许证明在转导后第5小时和第20小时,通过RLP颗粒将编码抗原和免疫调节蛋白的RNA转移到APC中,特别是转移到U937细胞中和转移到未成熟的人树突状细胞(hDC)中(分别为图XXXII和XXXIII,XXXIV和XXXV)。根据在实时定量PCR(RT-qPCR)期间是否存在显著特异性扩增来分析和解释获得的结果。将结果相对于对于未转导的对照细胞(U937 NT和hDC NT)获得的值进行标准化。这些对照表达编码IL12的内源RNA(结果未显示)。已知树突状细胞产生IL12,其在体内T淋巴细胞的反应中起作用。
在U937细胞系的情况下,不同RNA的相对量在转导后5小时(图XXXII)和转导后20小时(图XXXIII)是显著的。
在hDC原代细胞的情况下,相对特异性RNA水平在20小时是显著的(图XXXV),即使它们在5小时不太明显(图XXXIV)。最后,通过ELISA分析培养物上清液(图XXXVI)证实在转导RLP-PS-MAGE A3/IL-12颗粒后48小时,由hDC分泌的IL12水平大幅增加。
因此,RLP颗粒有效地对于将编码抗原肽和免疫调节蛋白(如IL-12)的不同RNA分子转移到APC(细胞系和原代细胞)中是有效的。因此,RLP颗粒被包括在免疫治疗策略(基于通过将编码抗原和免疫调节蛋白的RNA转移到APC中来调节免疫应答的特异性)中。
因此,一方面在其特异性水平上,通过使用如实施例4中所示的含有编码不同抗原的RNA的RLP颗粒,以及另一方面通过免疫调节蛋白将该策略与诱导刺激反应相结合,可以精确调节免疫应答。因此,在单次干预中同时将抗原和免疫调节剂递送到离体或体内靶细胞中提供了明显的临床优势。
实施例7:PP7(NC)-RLP慢病毒颗粒在免疫细胞中的有效性
I. 根据本发明的病毒颗粒和对比系统的制备
1. 质粒的构建
· 目标序列的表达质粒:表达质粒带有如图XXIII所述的表达盒,有或没有内含子序列或RNA稳定序列。为了将mRNA转运到慢病毒颗粒中,将PP7 RNA的茎环基序的2次重复:序列ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag (SEQ ID No.2),接着序列ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag (SEQ ID No.3)插入到在报告基因下游的表达盒中(图XXIII)。
使用的启动子可以是CMV或EF1启动子(图XXIII)。目标序列可以是编码报告蛋白的DNA,例如天然萤火虫荧光素酶(图XV),绿色荧光蛋白(ZsGreen1),红色荧光蛋白(mCherry)或蓝色荧光蛋白(mtBFP),或编码蛋白的cDNA,例如蛋白 CRE。优选地,cDNA编码免疫原性蛋白或免疫调节蛋白。目标序列也可以是shRNA,miRNA,sgRNA,LncRNA或circRNA的序列。
· 衣壳化质粒:将慢病毒颗粒进行修饰以在核衣壳蛋白中而不是第二个Zn指结构域中含有PP7噬菌体的“外壳”蛋白序列(图XXXVII)。带有编码用于产生PP7RLP颗粒的结构和功能蛋白(Gag,Pol)的基因的p8.74衣壳化质粒按照以下策略进行修饰:该p8.74质粒用于通过装配PCR产生缺乏p8.74ΔZF核衣壳蛋白的第二个锌指的质粒。第二个锌指通过HpaI克隆将用MS2噬菌体的外壳蛋白进行取代,以产生质粒p8.74ΔZF-PP7-外壳。编码Pol的序列可以在某些功能元件中缺失或突变,例如编码逆转录酶(RT)或整合酶(IN)的序列,而不改变PP7RLP的功能。
· 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(其表达盒如图III所述)。
2. 慢病毒颗粒的生产、浓缩/纯化和滴定
根据方法P2,使用图XXIII中描述的pcDNA-EF1.ReporterFluorescent.PP7 2X表达质粒,如实施例1中所述制备慢病毒颗粒。
II. 鼠树突状细胞(BMDC)的转导
通过与实施例1中描述的方法相同的方法制备鼠树突状细胞。
1. 用PP7(NC)-RLP.ZsGreen1转导鼠树突状细胞
如实施例1(II,第2.4段)所述,以每个细胞1pg p24的剂量,通过PP7(NC)-RLP.ZsGreen1载体转导树突状细胞,并通过流式细胞术在不同分析时间(转导后1、2和3天)对它们的存活力和ZsGreen1荧光的表达进行分析。仅使用含有4μg/ mL Polybrene®转导剂(Sigma)的培养基制备转导的阴性对照。
通过用“ViobilityTM 485/520”(Miltenyi Biotec)进行特异性免疫标记测定树突状细胞的存活力,并通过流式细胞术进行分析。
2. 细胞的表型和表征
2.1 鼠树突状细胞的免疫标记
在每个分析时间,将细胞转移到锥形底96孔培养板的孔中。用PBS 1X pH 7.4的溶液洗涤细胞,并以300g离心5分钟。通过翻转除去上清液。
通过用“ViobilityTM 485/520”(Miltenyi Biotec)的特异性免疫标记,根据与实施例1中第II.3.3段中描述的方法相同的方法测定树突状细胞的存活力。
2.2 流式细胞术
通过流式细胞术(Miltenyi Biotec)分析免疫标记的树突状细胞并进行分析。样品根据它们的大小(SSC)和粒度(FSC)进行校准。用ViobilityTM标记的细胞死亡,因此活细胞是阴性细胞(通过排除标记)。细胞在MacsQuantVYB(Miltenyi Biotec)上表征,并用MacsQuant软件(Miltenyi Biotec)分析。
III. 结果:ZsGreen1的表达动力学和BMDC的存活力
图XXXVIII显示用1pg p24 /细胞的PP7(NC)-RLP颗粒转导的鼠BMDC自转导后24小时开始表达ZsGreen1(它们中的50%)。转导后3天,BMDC的存活力较低,只有它们中的20%表达ZsGreen1,并且荧光强度较低。这通过以下事实进行解释:与MS2RLP或PP7(IN)-RLP颗粒相比,PP7(NC)-RLP颗粒以较低浓度产生,因此以相同剂量转导BMDC需要使用更大体积的慢病毒悬浮液,它进一步稀释含有对细胞至关重要的营养素的培养基。这对于培养敏感的原代细胞如鼠BMDC更为明显的。然而,仍然可以将RNA转运到在核衣壳中用PP7-外壳修饰的慢病毒颗粒中。
实施例8:野生型GAG-POL前体对于生产MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒的影响,以优化
MS2RLP,PP7RLP和/或PP7(IN)-RLP颗粒
I. 根据本发明的病毒颗粒和对比系统的制备
1. 质粒的构建
1.1 用于产生根据本发明的MS2RLP慢病毒颗粒的质粒
·目标序列的表达质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒相同(其表达盒如图1所述)。
·衣壳化质粒:这些质粒与实施例1中描述的质粒相同:p8.74ΔZF-MS2-外壳(其表达盒在图II中说明)和p8.74质粒(其表达盒如图V所示)。
·包膜质粒(pENV):该质粒与实施例1中描述的质粒相同(其表达盒如图III中所述)。
1.2 用于产生整合型慢病毒载体ILV的质粒
·目标序列的表达质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒相同(其表达盒如图IVb所述)。
·衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒相同(其表达盒如图V中所述)。
·包膜质粒(pENV):该质粒与实施例1中描述的质粒相同(其表达盒如图III中所述)。
2. 批次的生产
2.1 慢病毒颗粒和慢病毒载体的生产
在具有HEK293T生产细胞(ATCC,CRL-11268)的10层CellSTACK(6360cm2,Corning)中进行该生产,生产细胞在37℃,具有5% CO2的潮湿气氛中,在Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中培养,其补充有1%青霉素/链霉素和1%的超谷氨酰胺(PAA)。
通过转染以下四种质粒产生MS2RLP颗粒:
- 上述表达质粒,其表达盒如图I所示;
- p8.74ΔZF-MS2-外壳(其表达盒在图II中说明)和p8.74质粒(其表达盒在图V中说明),使用四种不同比例的两种衣壳化质粒,分别为[ 100%-0%]; [90%-10%];[80%-20%]和[50%-50%];
- 带有包膜VSV-G的pENV(其表达盒如图III所示)。
如实施例1中所述地制备MS2RLP-ZsGreen1 12X慢病毒颗粒,即具有以下各自的质粒比例:40%的表达质粒,30%的p8.74(或p8.74ΔZF)质粒,30%pENV质粒(比率[100%-0%])。
- 更具体地,质粒的各自比例为如下:
- 比率[90%-10%]:40%的表达质粒,27%的p8.74ΔZF质粒,3%的p8.74质粒,30%的pENV质粒;
- 比率[80%-20%]:40%的表达质粒,24%的p8.74ΔZF质粒,6%的p8.74质粒,30%的pENV质粒
- 比率[50%-50%]:40%的表达质粒,15%的p8.74ΔZF质粒,15%的p8.74质粒,30%的pENV质粒。
在产生RLP-AAT慢病毒颗粒的情况下,上述质粒的比例保持不变。
用磷酸钙标准转染24小时后,用新鲜的未补充的DMEM培养基替换培养上清液。将生产细胞在37℃/ 5% CO2下温育。更换培养基后,收集上清液四次(转染后32小时,48小时,56小时和72小时)。每次收集物通过在3000g下离心5分钟进行澄清,然后在0.45μm过滤器(Stericup®,Millipore)上微滤。然后混合所有收集物以组成粗制上清液。
如实施例1中所述,产生含有EF1-ZsGreen1表达盒的ILV-ZsGreen1整合型慢病毒载体作为对照。
2.2慢病毒颗粒的浓缩和纯化
根据实施例1中描述的方法P1浓缩和纯化慢病毒颗粒和慢病毒载体.
3. 滴定
如实施例1中所述滴定慢病毒颗粒和慢病毒载体。
II. 转导
1. Jurkat靶细胞的制备和通过根据本发明的慢病毒颗粒MS2RLP 12X的转导
在4μg/mL Polybrene®存在下,将Jurkat靶细胞(ATCC TIB-152)以200000个细胞/ mL接种于96孔板中,通过MS2RLP颗粒以两个剂量(2和10pg p24 /细胞)转导,或通过ILV-ZsGreen1对照慢病毒载体以MOI 40转导,然后在37℃ / 5% CO2下温育。在MS2RLP颗粒的情况下,细胞防御机制抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。5小时后去除转导上清液,并用新鲜补充培养基替换。转导后24小时,回收靶细胞,并通过细胞计量术(Macs QuantVYB,Miltenyi Biotec)定量表达ZsGreen1的细胞的百分比。
2. 通过抗p24蛋白印迹分析MS2RLP病毒颗粒的成熟
在用生产MS2RLP颗粒的质粒转染生产细胞(HEK293T)后48小时,回收培养上清液,然后按照方法P1浓缩(如实施例1所述),并通过定量p24蛋白进行滴定(如实施例1所述)。对于p8.74ΔZF-MS2-外壳/p8.74质粒在变性凝胶SDS-PAGE 4/12%上的比例的每种条件,加载15ng p24的当量,然后在MOPS1X缓冲液中以200V迁移1h。转移到尼龙膜上后,将蛋白与抗p24抗体(克隆39 / 5.4A,Abcam)杂交。使用PierceTM Fast Western Blot Kit,ECLSubstrate(Pierce)开发Western印迹。通过放射自显影胶片上的化学发光使条带可视化。
III. 结果
该实施例旨在表明可以改善MS2RLP和PP7RLP颗粒的功能,以转移编码不同抗原的RNA或转移编码抗原的RNA和免疫调节蛋白。这通过在颗粒生产期间改善GAG前体的成熟来进行,通过MS2RLP颗粒生产的概念证明得到证实。 p8.74ΔZF-MS2质粒允许表达包含噬菌体的外壳蛋白的GAG前体代替核衣壳蛋白的第二个锌指。当它被切割成三种蛋白:基质蛋白,衣壳蛋白和核衣壳蛋白时,这种外壳蛋白可能会扰乱GAG前体的成熟。这三种蛋白对于病毒颗粒的结构是必不可少的。
在生产MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒期间,除了p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒外,还通过p8.74质粒提供野生型GAG前体,这可能会增加GAG前体的成熟(当它由p8.74ΔZF-MS2质粒表达时),因此增加了MS2RLP和PP7RLP颗粒的功能。
这种实验的目标是评估p8.74质粒的影响(当它在MS2RLP和PP7RLP颗粒的生产细胞中与允许改善GAG前体的成熟的p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒同时共转染时),从而使最终的颗粒对于靶细胞的转导更具功能性。
在该实施例中,测试了四种比例的p8.74ΔZF-MS2-外壳/p8.74衣壳化质粒:100/0;90/10;80/20和50/50。表达ZsGreen1的整合载体ILV用作对照。以两种量的p24/ml转导细胞:2pg p24/细胞(图XXXIX)和10pg p24/细胞(图XXXX)。
首先,在图XXXIX中显示的结果表明,对于非转导细胞,荧光细胞的百分比非常接近0,而通过MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒转导的细胞具有99%以上的荧光,无论使用的衣壳化质粒的比例如何。值得注意的是,ZsGreen1的荧光强度随着p8.74质粒量的增加而增加。用50%的p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒和50%p8.74质粒产生的由MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒转导的细胞的荧光强度为7.76,而由仅用p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒产生的MS2RLPZs Green1 12X颗粒转导的细胞的荧光强度为是3.5。
图XXXX显示了在转导细胞百分比方面的相同结果。关于荧光强度,p8.74质粒的量增加越多,荧光强度增加越多,如图XXXIX所示。由50% p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒和50% p8.74质粒产生的MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒转导的细胞的荧光强度为60.67,而由仅用p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒产生的MS2RLPZs Green1 12X颗粒转导的细胞的荧光强度是11.48。
这意味着在剂量为2pg和10pg p24/细胞时,当颗粒用50%的p8.74ΔZF-MS2-外壳衣壳化质粒和50%的p8.74质粒产生时,获得的荧光分别是当颗粒仅用p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒产生时获得的荧光的两倍和五倍。
因此,与p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒共转染后,p8.74质粒在MS2RLP颗粒生产中的使用为改善MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒的功能提供了益处(从优化MS2RLP颗粒以转移编码不同抗原的RNA或转移编码抗原和免疫调节蛋白的RNA观点看)。
图XXXXI显示了MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒在生化水平上的成熟,通过检测含有颗粒的生产上清液中的p24蛋白。它对应于通过抗p24蛋白印迹分析病毒上清液,按照在放射自显影胶片的两个曝光时间:一分钟(图XXXXIa)和十五秒(图XXXXIb)。
在来自HIV的整合慢病毒颗粒(仅用p8.74质粒作为衣壳化质粒产生)的情况下,p24蛋白在四个水平上是可检测的:
- 在p160蛋白前体(GAG-POL)中
- 在p55蛋白前体(GAG)中,
- 处于成熟蛋白状态(p24),
- 在成熟过程中的其它中间蛋白前体(在p160和p55之间,以及在p55和p24之间)。
如果正常发生成熟,则应在成熟状态(p24)中检测到比在蛋白前体(p160,p55)或中间蛋白前体状态下更大量的p24蛋白。事实上,病毒颗粒的成熟发生在由生产细胞释放颗粒之后。换句话说,在它们的生产过程中,颗粒在生产细胞的表面发芽,然后以未成熟颗粒的状态从细胞中释放出来。只有在上清液中的颗粒释放后,GAG-POL和GAG蛋白前体才会成熟为确定的蛋白。
在衍生自HIV的MS2RLP或PP7RLP颗粒(仅用p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒作为衣壳化质粒产生)的情况下,p24蛋白在四个水平上可检测到:
- 在p172蛋白前体(GAGΔZF-MS2-外壳-POL)中
- 在p67蛋白前体(GAGΔZF-MS2-外壳)中,
- 处于成熟蛋白状态(p24),
- 在成熟过程中的其它中间蛋白前体中(在p172和p67之间,以及在p67和p24之间)。
在该MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒中,每种前体重12kDa,这对应于插入在核衣壳蛋白的第二锌指中的MS2噬菌体的外壳蛋白的大小。
图XXXXI显示,在ILV轨道上,不同形式的蛋白前体,p160(GAG-POL),p55(GAG)以及完全成熟的p24蛋白。与蛋白前体形式相比,存在主要量的成熟p24蛋白。在轨道100/0上,对应于仅用p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒作为衣壳化质粒产生的MS2RLP-ZsGreen1 12X颗粒,前体/成熟p24蛋白的比例相对于ILV增加,表明插入MS2噬菌体的外壳蛋白减少了病毒颗粒的成熟。在轨道90/10、80/20和50/50上,p172和p67蛋白前体的比例分别降低至p160和p55蛋白前体的益处,以达到轨道50/50的同一个表达水平。将p8.74质粒添加到p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒中,作为用于产生颗粒的衣壳化质粒,导致成熟p24蛋白的比例增加(图XXXXIb,15秒曝光)。该结果表明,为了促进MS2RLP颗粒中蛋白前体的成熟,除了p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒作为用于产生颗粒的衣壳化质粒外,还可以添加至少10%的p8.74质粒。除了p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒作为衣壳化质粒外,使用至少10%的p8.74质粒生产MS2RLP颗粒不仅允许增加前体成熟为成熟蛋白,而且还允许在转导靶细胞后增加颗粒的功能。
总之,在制备本发明的颗粒期间使用p8.74质粒,与p8.74ΔZF-MS2-外壳质粒共转染,允许优化根据本发明的颗粒用于转移编码不同抗原的RNA或用于转移编码抗原和免疫调节蛋白的RNA。
实施例9:由两种不同的衣壳化序列(MS2和PP7)引导的非病毒RNA的募集,以优化
使编码不同抗原的RNA的有效转移或用于转移编码抗原和免疫调节蛋白的RNA(通过RLP颗
粒(调节衣壳化RNA的类型))
I. 根据本发明的病毒颗粒和对比系统的制备
1. 质粒的构建
1.1 用于产生根据本发明的MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X慢病毒颗粒的质粒
·目标序列的表达质粒:这些质粒与实施例1所述的质粒(其表达盒如图I所述)和实施例7中所述的质粒(其表达盒如图XXIII所述)相同。
·衣壳化质粒:这些质粒与实施例1所述的质粒(其表达盒如图II中所述)和实施例7中所述的质粒(其表达盒如图XXXVII中所述)相同。
· 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水泡性口炎病毒包膜蛋白的VSV-G(图III)。
优选地,这些质粒用于产生MS2 / PP7-RLP-mCherry 12X-ZsGreen1 2X慢病毒颗粒。
1.2 用于产生根据本发明的对照MS2-(NC)RLP 12X慢病毒颗粒的质粒
·目标序列的表达质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒(其表达盒如图1所述)相同。
·衣壳化质粒:该质粒与实施例1中描述的质粒(其表达盒如图II中所述)相同。
·包膜质粒(pENV):该质粒与实施例1中描述的质粒(其表达盒如图III中所述)相同。
优选地,这些质粒用于产生MS2RLP-mCherry 12X慢病毒颗粒。
1.3 用于产生根据本发明的慢病毒对照颗粒PP7-(NC)RLP 2X的质粒
·目标序列的质粒表达:该质粒与实施例7中描述的质粒相同(其表达盒如图XXIII中所述)。
· 衣壳化质粒:该质粒与实施例7中描述的质粒相同(其表达盒如图XXXVII中所述)。
· 包膜质粒(pENV):该质粒携带编码包膜蛋白的基因,其可以是编码水泡性口炎病毒的包膜蛋白的VSV-G(图III)。
优选地,这些质粒用于生产慢病毒颗粒PP7RLP-ZsGreen1 2X。
2. 批次的制备
在生产细胞上转染质粒后,收获上清液,并且原样地进行使用或根据先前提及的并在申请WO2013/014537中描述的方法P1或P2之一进行浓缩/纯化。
2.1慢病毒颗粒的生产
所述生产在10层CellSTACK(6360cm2,Corning)中用HEK293T生产细胞(ATCC,CRL-1268)进行实施,所述生产细胞在补充有1%青霉素/链霉素和1%超谷氨酰胺(PAA)的Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM,Gibco,Paisley,UK)中在37℃,含5% CO2的潮湿气氛中进行培育。
通过转染以下五种质粒进行慢病毒颗粒MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X,优选MS2/PP7-RLP-mCherry 12X-ZsGreen1 2X的生产:
- 上述两种表达质粒,包括质粒pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X(其表达盒如图1所示)和质粒pcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X(其表达盒如图XXIII所示),它们以单量或双倍量使用;
- p8.74ΔZF-PP7-外壳 (50%),其表达盒如图XXXVII所示,和p8.74ΔZF-MS2-外壳(50%),其表达盒如图II所示;
- 带有包膜VSV-G的pENV,其表达盒如图III所示。
通过转染以下三种质粒进行对照慢病毒颗粒MS2-(NC)RLP 12X,优选MS2-RLP-mCherry 12X的生产:
- 上述表达质粒pcDNA.EF1.mCherry.MS2 12X(其表达盒如图I所示);
- p8.74ΔZF-MS2-外壳,其表达盒如图II所示;
- 带有包膜VSV-G的pENV,其表达盒如图III所示。
通过转染以下三种质粒进行对照慢病毒颗粒PP7-(NC)RLP 2X,优选PP7-RLP-ZsGreen1 2X的生产:
- 上述表达质粒pcDNA.EF1.ZsGreen1.PP7 2X(其表达盒如图XXIII所示);
- p8.74ΔZF-PP7-外壳,其表达盒如图XXXVII所示;
-带有包膜VSV-G的pENV,其表达盒如图III所示。
在标准磷酸钙转染后24小时,用新鲜和未补充的DMEM培养基替换培养上清液。将生产细胞在37℃/5% CO2下温育。在更换培养基后,收集上清液四次(转染后32小时,48小时,56小时和72小时)。每次回收物通过在3000g离心5分钟进行澄清,然后在0.45μm过滤器(Steripup®,Millipore)上微过滤。然后将所有回收物混合以形成粗制上清液。
2.2 慢病毒颗粒的浓缩和纯化
慢病毒颗粒根据实施例1中描述的方法P1进行浓缩和纯化。
3. 慢病毒颗粒批次的滴定
如实施例1中所述滴定慢病毒颗粒。
4. 通过根据本发明用慢病毒颗粒MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X的转导
该实施例使用MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X颗粒进行,该颗粒允许转移数种类型的RNA并因此表达数种不同的蛋白(ZsGreen1 + mCherry)。
将HCT116靶细胞(ATCC,CCL-247)接种在24孔板中并在37℃/5% CO2下温育24小时,并通过颗粒MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X以10pg p24/细胞的剂量进行转导。
执行的控制如下:
-用慢病毒颗粒MS2RLP-mCherry 12X和PP7RLP-ZsGreen1 2X转导,剂量为10pg p24/细胞;
-用单独慢病毒颗粒MS2RLP-mCherry 12X转导,剂量为10pg p24/细胞;
-用单独慢病毒颗粒PP7RLP-ZsGreen1 2X转导,剂量为10pg p24/细胞。
通过慢病毒颗粒的转导在8μL/ml Polybrene®的存在下进行。在颗粒MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X,MS2RLP-mCherry 12X和PP7RLP-ZsGreen1 2X的情况下,细胞防御机制的抑制剂BX795(Invivogen)以6μM的浓度使用。在转导后48小时回收靶细胞,并通过细胞计量术(Macs Quant VYB,Miltenyi Biotec)定量该表达ZsGreen1和mCherry的细胞的百分比。
II. 结果
图XXXXI说明了MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X颗粒用于通过来自MS2和PP7噬菌体的衣壳化序列将衣壳化RNA转移到HCT116靶细胞中的有效性。该图显示,双荧光细胞的比例为97%(在转导颗粒MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X后)和为98%(在以20pg p24/细胞转导颗粒MS2RLP-mCherry 12X和PP7RLP-ZsGreen1 2X后)。因此,对于半剂量的MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X,使用MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X颗粒观察到相同级别的转导有效性。
通过单独MS2RLP-mCherry 12X颗粒或用单独PP7RLP-ZsGreen1 2X转导的靶细胞具有与通过颗粒MS2/PP7-(NC)RLP 12X 2X转导靶细胞后获得的百分比相似的转导有效性的百分比(对于单荧光蛋白)。结果因此显示:RLP颗粒能够在单次靶细胞转导中通过两种不同系统(PP7和MS2)转运和转移至少两种类型的衣壳化RNA。
在同一批次的RLP的单次转导中,转移由两种不同的通过衣壳化序列MS2和PP7定向的不同类型RNA的能力的证实代表了对衣壳化RNA类型的调节的显著增加,特别是对于有效转移编码不同抗原的RNA或对于转移编码抗原和免疫调节蛋白的RNA。
Claims (22)
1.逆转录病毒颗粒,其包含来自Gag多蛋白的蛋白、包膜蛋白、任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,衣壳化的非病毒RNA每种包含与衣壳化序列结合的目标RNA序列,每种衣壳化序列由被引入到来自Gag多蛋白的蛋白中和/或整合酶中的结合结构域识别,并且衣壳化的非病毒RNA的所述目标序列的至少一个包含编码至少一个表位的部分和/或至少一种特异性识别表位的分子结构。
2.根据权利要求1所述的逆转录病毒颗粒,其包含核衣壳蛋白,包膜蛋白,任选的整合酶和至少两种衣壳化的非病毒RNA,所述衣壳化的非病毒RNA各自包含与衣壳化序列结合的目标RNA序列,每种衣壳化序列通过被引入到核衣壳蛋白中和/或整合酶中的结合结构域识别。
3.根据权利要求2的逆转录病毒颗粒,其中所述至少两种衣壳化的非病毒RNA的目标序列是相同的。
4.根据权利要求2的逆转录病毒颗粒,其中所述至少两种衣壳化的非病毒RNA通过它们的RNA序列区分。
5.根据权利要求4的颗粒,其中其它衣壳化的非病毒RNA的目标序列编码免疫调节蛋白。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的逆转录病毒颗粒,还包含第三衣壳化非病毒RNA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的逆转录病毒颗粒,其中所述至少一种表位和/或至少一种特异性识别表位的分子结构是免疫原性的。
8.根据权利要求2至7中任一项的逆转录病毒颗粒,其中结合结构域被引入到核衣壳蛋白中,并且第二结合结构域能够被引入核衣壳和/或整合酶中。
9.根据权利要求1至7中任一项的逆转录病毒颗粒,其中结合结构域被引入到整合酶中,并且第二结合结构域能够被引入到核衣壳和/或整合酶中。
10.根据权利要求2至9中任一项的逆转录病毒颗粒,其是慢病毒颗粒。
11.根据权利要求10的慢病毒颗粒,其中:
- 结合结构域是MS2噬菌体的“外壳”蛋白的序列,
- 非病毒RNA的衣壳化序列是MS2的茎-环序列,
- 核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二个锌指处突变以插入MS2噬菌体的“外壳”蛋白的序列。
12.根据权利要求10的慢病毒颗粒,其中:
- 结合结构域是PP7噬菌体的“外壳”蛋白的序列,
- 非病毒RNA的衣壳化序列是PP7茎-环序列,
- 核衣壳蛋白是属于Gag多蛋白的HIV的核衣壳蛋白(NC),所述NC在第二锌指处突变以插入PP7噬菌体的“外壳”蛋白的序列。
13.包含根据权利要求1至12中任一项的颗粒的组合物。
14.用于生产根据权利要求1至12中任一项所述的颗粒的试剂盒,其包括:
(i) 包含至少一个目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码来自嵌合Gag多蛋白的蛋白和/或整合酶的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒。
15.根据权利要求14所述的生产试剂盒,还包含第二种衣壳化质粒,其编码:
- 来自野生型Gag多蛋白的蛋白,当第一种衣壳化质粒编码来自嵌合Gag多蛋白的蛋白时,和/或
- 野生型整合酶,当第一种衣壳化质粒编码嵌合整合酶时。
16.用于制备根据权利要求14所述的试剂盒的方法,包括:
(i) 制备包含至少一种目标序列的表达质粒,其中在所述序列的上游或下游插入衣壳化序列
(ii) 制备编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或嵌合整合酶的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 制备编码包膜蛋白的包膜质粒。
17.用于制备根据权利要求1至12中任一项所述的颗粒的方法,包括用以下物质共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少一个目标序列的表达质粒,其中在该序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码来自Gag多蛋白的蛋白和/或嵌合整合酶的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒;
并收获包含颗粒的转染细胞的上清液。
18.用于制备根据权利要求4-12中任一项的颗粒的方法,包括用以下物质共转染细胞的步骤:
(i) 包含至少两种不同的非病毒RNA序列的表达质粒,每种RNA序列包含目标序列,其中在所述目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,或者第一和第二表达质粒各自包含目标序列,在目标序列的上游或下游插入衣壳化序列,
(ii) 编码嵌合核衣壳蛋白的衣壳化质粒,其包含允许识别衣壳化序列的结合结构域,和
(iii) 编码包膜蛋白的包膜质粒,
并收获包含颗粒的转染细胞的上清液。
19.根据权利要求17或18的制备方法,其中使上清液澄清,然后任选地浓缩和/或纯化。
20.根据权利要求17-19中任一项的制备方法,其中共转染步骤另外用第二种衣壳化质粒进行实施,第二种衣壳化质粒编码:
- 来自野生型Gag多蛋白的蛋白,当第一种衣壳化质粒编码来自嵌合Gag多蛋白的蛋白时,和/或
- 野生型整合酶,当第一种衣壳化质粒编码嵌合整合酶时。
21.能够通过根据权利要求17-20任一项的方法获得的组合物。
22.根据权利要求1至12中任一项的颗粒或根据权利要求13或21的组合物的用途,用于转导免疫系统的细胞。
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