JP2001506844A

JP2001506844A - Ｈｐｖタンパク質を発現する弱毒化微生物株

Info

Publication number: JP2001506844A
Application number: JP51730298A
Authority: JP
Inventors: ヘーフリジャー，デニス・ナルデリ; クラエアンブール，ジャン―ピエール
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 1997-10-07
Publication date: 2001-05-29
Also published as: US6458368B1; US6251406B1; EP0932683A1; AU4566897A; AU730733B2; CA2268283A1; US20020025328A1; US20010029043A1; US20040115212A1; WO1998015631A1; GB9621091D0; BR9711881A

Abstract

(57)【要約】本発明は、HPV感染およびそれに付随した癌の危険に対するワクチンとしてHPVタンパク質をコードする核酸を発現する弱毒化した原核微生物株（例えばSalmonella）の使用に関連する。特に、本件は原核微生物におけるVLPの集合が可能であること、およびHPV特異的株によるマウスの鼻を介する免疫は構造依存性であること、および血清および生殖分泌物における抗体の中和について示している。本明細書中に記載した実験は、融合相手を含むHPVのキメラVLPの会合も可能であることおよび癌の予防が可能であることを示す。

Description

【発明の詳細な説明】 HPVタンパク質を発現する弱毒化微生物株発明の分野本発明は、パピローマウィルスのウィルスタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核微生物、特にサルモネラの弱毒化された(attenuated)株、これらの微生物を含む組成物、特にそのワクチンとしての利用、およびこれらの株の医療への利用に関連している。さらなる側面においては、本発明は会合したパピローマウィルスのウィルス様粒子（VLP）を産生する方法を提供する。発明の背景ヒトパピローマウィルス（HPV）16は、補因子と協同して子宮頸癌を引き起こし得るHPVの主要なタイプである（49）。HPVについての研究は培養液中でウィルスを増殖させることができないこと、モデル動物の欠如、および臨床上の病変（ lesion）障害部位におけるビリオン（成熟ウィルス粒子）の不足により妨げられてきた。このため、免疫学的研究として抗体の産生方法代わりとなる手法が開発される結果となった。実験動物のパピローマウィルスの系において観察されたように（8，22）、中和エピトープの構造的な依存性は、臨床的に関連した免疫反応の誘導および検出にとって適当に会合したHPV粒子が不可欠であることを示唆している。 HPVキャプシッドはT7の二十面体の格子上に配列したL1タンパク質の72個の５量体キャプソマーにより形成されている（15）。最近、多数の研究者がバキュロウィルス、痘疹ウィルス、または酵母の発現系を用いて、HPVキャプシッド、即ちウィルス様粒子（VLP）の産生を証明した（15，22，45，48，61）。サブユニットのワクチンとしてのVLPの能力は、ワタオウサギのパピローマウィルス（CRP V）（4）、イヌの口内パピローマウィルス（COPV）（57）、およびHPV11モデル（45）を用いて実証されてきた。 HPV16は良性の増殖性病変を（限定的に）含んだ（confined）性器の粘膜を介して感染する。そのような病原体の感染に対する防御は、性器の分泌液中の特異的な（抗VPL）分泌性免疫グロブリンA（sIgA）または免疫グロブリンG（IgG）により提供され得る。現行のモデル動物との類似により、子宮頸部の分泌液中のHPV1 6のVLPに特異的な抗体は、女性におけるHPV16の性行為を介した感染を防ぐのに役立つかもしれない。しかしながら、このことは、性器におけるPVの感染についての実験的なモデルがないことから正式には証明することができず、細胞を介した免疫を必要とする他のシナリオを無視することはできない。さらには、HPVの感染の基礎をなしている機構は明らかにされていない。HPVは裂傷の発生部位の層状の子宮頸部の基底上皮細胞に直接感染するかもしれない。あるいは、HPVの感染はまた、無傷の上皮のランゲルハンス細胞を介して直接に、またはHPVを産生するケラチン生成細胞より間接的に起こる可能性があり、従って中和抗体は他のウィルスについて示されたようには機能しないと思われる。このことは、さらにHPVの感染に対して効果的なワクチンを提供することの難しさに加わっている。免疫反応を抑制された個体は、免疫適格な（immunocompetent）個体と比較して子宮頚癌がより発生しやすい傾向があり、これは免疫療法が利用できる可能性を示唆している。定着したHPVの感染またはHPVに関連した前癌状態および癌化した病変の治療を目的とした治療ワクチン（87）がここ10年の間に研究されてきた（59）。子宮頸癌に対するHPV-抗体特異的免疫療法の証拠は、実験的（13），（ 34），（83）および天然の（82）PVに関連した腫瘍がE6およびE7の調製物を用いた免疫により制御可能であるという観察から生じた。これらの研究は、CTLが最も効果的な免疫学的エフェクター機構になり得ることを示唆した。E6およびE7の調製物は、ペプチド（13）、細菌を使って調製した融合タンパク質（82）、トランスフェクションされた真核生物細胞（83）、または組換え体痘疹ウィルス（34 ）のいずれかに存在していた。最近、L2との融合として17kDのE7タンパク質を有するキメラ体VLPが、L1および/またはE7のORFを発現するように設計された同系の脛瘍細胞（84）（即ちC3細胞（13）およびTC1細胞（85））の拒否反応を誘導することが示されてきた。このデータは、同一のワクチンの調製物により予防および治療の効果が提供される可能性を証明する。弱毒化されているが依然として侵襲性のサルモネラは、異質の抗原を粘膜および全身の免疫系に輸送することが提唱されてきた（10）。抗原は生きたサルモネラによって粘膜の誘導部位に輸送され、そこでプライミングの後、抗原特異的な BおよびT細胞は誘導部位から移動し、そしてエフェクター細胞へと成熟する。移動中のIgAを発現しているB細胞は生殖管を含む別の粘膜の部位に向かって進み、その部位においてそれらの細胞はIgAを分泌する形質細胞へと分化する（32）。このように、口または鼻を介した免疫処置により、性器の分泌液中に防御用の抗体を提供することができる。最近、本発明者らおよび他の研究者達は、組換え体のサルモネラで粘膜を免疫処置することにより、マウスおよびヒトの性器の粘膜において抗体反応を誘導することができることを示している（18，37，56）。発明の概要 HPVに対する予防のためのワクチンを開発するために、我々はSalmonella typh imuriumの弱毒化株PhoP^c（35）においてHPV16の主要タンパク質L1を発現させた。驚いたことに、原核生物においてVLPを会合することが可能なこと、およびHPV 16-L1/サルモネラ組換え体株でマウスを鼻腔免疫処置することにより、血清および性器分泌液中においてHPV16特異的な構造に依存し、且つ中和作用のある抗体を誘導することを研究者達は初めて見い出した。本明細書中に記載されている実験はまた、HPVタンパク質のキメラ体VLPおよび融合相手を会合させることができることも示している。従って、最初の側面においては、本発明はパピローマウィルスの主要キャプシッドタンパク質をコードする核酸で形質転換された原核微生物の弱毒化株を提供するが、当該タンパク質はその微生物内で会合してウィルス様粒子（VLP）を形成する。このように、本発明はサルモネラ等の原核微生物の弱毒化株において適当に会合したパピローマウィルスのVLPを、それらが患者の免疫反応を高めるためのワクチンとして使用できるように生産する方法を提供する。好ましくは、VLPは粘膜の部位に輸送されるが、これは感染が実際に起こる場所およびその他の粘膜の表面で、パピローマウィルスのVLPに対して免疫反応を生じさせるという利点を有する。本明細書中で使用されている”パピローマウィルス”という用語はヒトおよび動物のPVの両方を含んでいる。しかしながら、好ましくは、パピローマウィルスはヒトのパピローマウィルス（HPV）である。約70種類の異なる型のHPVがクローン化され、その特性が記述されており（HPV1からHPV70..．と表される）、それら全てが異なる初期産物および二種の後期産物L1およびL2をコードする8kbの二本鎖ゲノムを有し、上皮刺激性かまたは粘膜刺激性のいずれかである。L1は主要キャプシッドタンパク質であり、異なるHPVのタイプの間で比較的よく保存されている。HPVのタイプおよびそれらの核酸およびアミノ酸の配列の概説については、Human Papillomaviruses，"A Compilation and Analysis of Nucleic Acid andAmino Acid Sequences"，1994，Myersら編，Theoretical and Biophysics Gr oup T-10，Los Alamos National Laboratory、を参照されたい。臨床上は、最も重要なHPVのタイプは肛門性器管に感染し、そして高い癌化率および高い罹患率を有するものである。このグループにはHPV16，18，31，45および56が含まれ、H PV16単独で肛門性器管における侵襲性腫瘍の50%以上の原因となっており、そして最も優勢なHPVの一種となっている。パピローマウィルスのタンパク質は野生型の主要キャプシッドタンパク質（例えばL1および/またはL2）に相当するか、もしくはHPVタンパク質の全てまたは一部と融合相手とのキメラ体であってもよい。融合相手はそれに対して特異的なCT Lが標的となるどんな免疫原性タンパク質であってもよい。このタンパク質はHPV タンパク質（例えば、任意のHPVのタイプのE7，E6またはE2）、別の病原体由来のタンパク質、または任意の腫瘍特異的な抗原であってもよい。ある態様においては、HPVタンパク質は、L2と共発現されたL1タンパク質であり、この融合相手はそれがL2タンパク質に連結されるように発現される。キメラ体のVLPは、担体およびHPV16の腫瘍モデルに挿入されたタンパク質に対する抗腫瘍免疫性を引き出すことができることが示された。このように、E7特異的CTLを誘導するキメラ体VPLは、すでにHPVに感染した細胞またはHPVに関連した前癌状態の病変を殺傷することを目的としていた。それゆえ、この場合においては、すでにHPVに感染した細胞を排除するためのCTLの誘導は中和抗体の誘導を補体に促しているように思われ、従ってキメラ体VPLは両方の機能を誘導することが示された。このように、発明のある態様においては、キメラ体VPLの発現により中和抗体およびCTLを誘導することのできるサルモネラの株は、少なくともより進行した腫瘍で観察されるMHC Iまたは他の因子の負の制御が未だ起こっていないような、あるいは初期または前癌状態のHPV病変にとっては治療に役立つであろう。好ましくは、原核微生物はサルモネラの弱毒化株である。しかしながら、sche richia coli，Shigella，Yersinia，Lactobacillus，Mycobacteria，ListeriaまたはVibrioの弱毒化株等の他の原核微生物も利用することができるだろう。適当な微生物株の例には、Salmonella typhimurium，Salmonella typhi，Salmonella dublin，Salmonella enteretidis，Escherichia coli，Shigella flexeneri，S higella sonnei，Vjbrio choleraおよびMycobacterium bovis（BC6）が含まれる。弱毒化されたサルモネラ株は最もよく特性の記載された粘膜のワクチンの担体の一つである。弱毒化されているが依然として侵襲性の組換え体サルモネラ株は、いくつかの病原体の保護エピトープを粘膜に関連したリンパ組織へ運搬し、これによって担体および外来の抗原の両方に対する粘膜、全身およびCTLの免疫反応が誘導されるような、経口ワクチンのベクターとして利用されてきた（58，65 ，67,69，75-77）。 3回の腸溶性カプセル（10⁹CFU/カプセル）の摂生として投与される、現在認可されている腸チフスS．typhi Ty21aに対する経口ワクチン（72）は、3年以上にわたり67%の効力を提供した。しかしながら、S．typhi Ty21aが高い効果を得るためには液体の処方において多量および複数の摂生を必要とし、その突然変異が未だ全ては特性化されていないため（63，64，70，71，78）、最近新たな弱毒化されたサルモネラ株が開発され、ヒトで試験が行われている。これらには芳香族化合物の生合成経路が遮断されている栄養要求性株（Δaro変異株）が含まれる。S．typhiのΔaroA，ΔpurA変異株がヒトの志願者で試験され（32）、細胞を介した免疫反応を引き出すが、体液性の反応は僅かにしか引き起こさないことが示された。他のaro変異株（aroCおよびaroD）は弱毒化が不十分であり、発熱および菌血症を引き起こした（79）。ΔaroC ΔaroD Ty2（CVD 908）二重変異株は安全であり、且つ免疫処置された成人の志願者の80%においてLPSに対するIgG抗体を誘導した（73，80）。アデニル酸シクラーゼ（cya）およびcAMP受容体（crp）遺伝子が欠失しているS．typhi変異株もまた作製された。これらの遺伝子産物は輸送過程、繊毛（fimbriae）、鞭毛、およびいくつかの膜外タンパク質の発現を制御する多くの遺伝子およびオペロンの転写に必要である。一つの変異体χ3927（Δcya Δ crp Ty2）が試験され、免疫原性であることが示されたが、何人かの志願者は発熱およびワクチン菌血症を引き起こした（79）。それゆえ、新たな株、χ4073が深層組織の群体化の原因となる第三の遺伝子（cdt）を欠失することにより作製された（66，68，74）。この株は志願者に投与され、5×10⁸CFUまでの量ならば完全に安全であり、志願者の80%において血清変換が起こった（66）。他の弱毒化されたサルモネラの株には、二成分調節系、phoP/phoQ遺伝子の変異株が含まれる。これらの遺伝子は他の多数の遺伝子の発現に影響し、リン酸の量およびマクロファージ内に存在するサルモネラにより経験されるように期待される環境条件に反応性である。これらの変異株の一つの例が下記の実施例において使用されているPhoP^c株である。最近、PhoP/PhoQを欠失したSalmonella typhi （ty800）がヒトに安全で且つ免疫原性のあることが示された（81）。上述したように、原核微生物の弱毒化された株は、一つまたはそれ以上の主要パピローマウィルスキャプシッドタンパク質をコードする核酸で形質転換する。発明者達は、この核酸を微生物内で発現させると、生成したキャプシッドタンパク質が適当に会合してVLPを形成し、これがそれらを患者のパピローマウィルスに対する予防接種に特に適したものにさせていることを初めて見い出した。好ましくは、主要ウィルスキャプシッドタンパク質はL1であり、所望によりL2タンパク質をコードする核酸を付加的に含む。上記のように、キャプシッドタンパク質は別の抗原等の融合相手に連結しても差し支えない。さらなる側面として、本発明は一つまたはそれ以上の上述の弱毒化された原核微生物を含み、所望により生理学的に受容できる担体と組合わせた組成物を提供する。好ましくは、組成物はワクチン、特に粘膜の免疫処置のため、例えば口、直腸、鼻、膣または性器の経路からの投与のためのワクチンである。B型肝炎ウィルス抗原を発現する組換え体サルモネラを用いた我々の以前の研究（18）により、これらのどの経路を介した予防接種でも、他の部位の粘膜の分泌液におけるsIgA の反応を生じさせることが示された。都合のよいことに、予防接種については、組成物は多数の異なるVLP、例えば異なるタイプのパピローマウィルス由来のVLP を発現するサルモネラの一つまたはそれ以上の株を含んでいる。これは異なるタイプのパピローマウィルスによる一連の攻撃に対するワクチンの防御効果が向上するという利点を有する。治療の予防接種のためには、次のキメラ体VLP構築物が様々なHPVタイプのL1キャプシッドと同じL2の融合相手との融合産物を含み得る。さらなる側面においては、本発明は薬剤として、特にワクチンとしての使用される上記の原核微生物の弱毒化株を提供する。さらなる側面においては、本発明は、パピローマウィルスの主要キャプシッドタンパク質をコードする核酸で形質転換した原核微生物の弱毒化株の、パピローマウィルスの感染または肛門性器の腫瘍、特に子宮頸癌の予防または治療の処置のための薬剤の調製のための使用、ここにおいて前記タンパク質は微生物内で会合してウィルス様粒子を形成する、を提供する。一般的には、本発明の微生物またはVLPは単離された形および/または精製された形、即ち実質的に純粋なものとして提供される。これには、それが少なくとも約90%有効な成分を示し、より好ましくは少なくとも約95%、さらに好ましくは少なくとも約98%有効な組成物中に存在することが含まれる。しかしながら、そのような組成物は不活性な担体物質または他の薬学的および生理学的に受容できる賦形剤を含み得る。本発明の組成物は、開示されているような微生物またはVLP に加えて、抗癌剤等の治療への利用のための一つまたはそれ以上の有効な成分を含んでいても差し支えない。本発明の組成物は”予防にとって効果的な量”または”治療にとって効果的な量”（場合によっては、予防法は治療法とも考えられるが）を個体に与えるのが好ましく、これは個体にとって有益であることを示すのに十分であるということである。投与する実際の量、および投与の割合および時間経過は、治療されているものの性質および重度に依存するであろう。治療法の処方、例えば投与量等の決定は一般開業医および他の医師の責任の範疇にある。組成物は単独でまたは他の治療剤と共に、治療しているものの状態に応じて同時または順次に組合わせて投与することができる。本発明の薬剤組成物、および本発明の使用には、有効成分に加えて薬学的に受容できる賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者でよく知られている他の物質が含まれ得る。そのような物質は、無毒であるべきであり、且つ有効成分の効力には干渉してはならない。担体または他の物質の正確の性質は投与の経路に依存するであろう。上記の手法およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences ，第16版，Osol編，A．1980、に記載されている。さらなる側面においては、本発明は、会合したパピローマウィルスのウィルス様粒子を生産するための方法であって、パピローマウィルスのウィルス主要キャプシッドタンパク質をコードする核酸で形質転換した原核微生物の弱毒化株を培養する、ここにおいて、当該タンパク質は微生物内で発現され、会合してウィルス様粒子を形成する、ことを含む前記方法を提供する。好ましくは、本方法は付加的に原核微生物からVLPを回収する工程を含む。さらなる側面においては、本発明は、VLPをコードする核酸で弱毒化した原核微生物を形質転換し、そして会合したVLPを産生するように核酸を発現させることによって入手可能なパピローマウィルスのVLPの、診断方法における使用を提供する。ある態様においては、本発明は、対象由来の試料において抗パピローマウィルス抗体の存在を検出するための方法であって、HPVのVLPを固体の支持体に固定し、その支持体を試料に曝露し、そして例えばELISAを用いて抗体の存在を検出する、ことを含む前記方法を提供する。本発明のより好ましい態様が本明細書中に実施例として記載されているが、付随の図に関して限定するものではない。図面の簡単な説明図1. PhoP^c/HPV株におけるHPV16のL1の発現。サルモネラは終夜培養し、材料および方法に示されたようにして調製した。A.10% SDSPAGEゲルのクマシーブルー染色；レーンM：分子量マーカー；レーン1：PhoP^c株の全溶解物レーン2：Ph oP^c/HPV株の全溶解物、単一の57kDaのタンパク質を矢印で示してある。B. PhoP^c/HPVの全溶解物および分画した溶解物の抗HPV16-L1 mAbを用いた免疫ブロット。レーンtot：全溶解物，レーン1から25：10-40%のショ糖密度勾配にかけた PhoP^c/HPVの溶解物の分画後に得られたそれぞれの画分。密度勾配の重い方の画分がレーン1である。L1であると同定された57kDaのタンパク質のバンドを示す（矢印）。図2. HPV16のL1はVLPへと会合する。（A）PhoP^c/HPV16のVLPおよび（B）バキュロウィルス由来のHPV16のVLPの電子顕微鏡写真。Aにおいては、PhoP^c/HPVの溶解物の画分7から13（図1）を回収した。試料はリンタングステン酸を用いて陰性染色した。バーは53nmを示す。図3. PhoP^c/HPV株で鼻腔免疫した後の抗HPV16VLPおよび抗LPSの全身性および粘膜性の抗体反応。3匹の6週齢のBALB/cの雌マウスを5×10⁷CFUで免疫し、示された週に試料を採取し、27週目に殺して採血した。データは血清中の特定のIgG 、および分泌液中の全IgAの１μｇ当たりの特定のIgA、または全IgGの１μｇ当たりの特定のIgGの相互の希釈の相乗平均として表されている。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。図4. HPVのウィルス生活環および予防接種の戦略。図の左部分においては、ケラチン生成細胞の分化の際にHPVを生産するウィルスのサイクルを概略図で描いてある（初期感染-CIN I）。HPVのDNAが宿主のゲノムに挿入される感染の後期（CIN III-腫瘍）を右に描いてある。様々な防御免疫機構を、活動部位を示す矢印で示した。ウィルスの抗原が細胞の表面で発現されるのを必要とする抗体依存的な細胞障害（ADCC）機構は示していない。図5. マウスC127細胞のHPV16擬型ウィルスのin vitroにおける中和。（A）ウィルスを加えなかったもの。（B-H）抽出物を含むHPV16(BPV1)擬型ウィルスの等量の分注液を加えた。分注液は（B）抗体なし、（C）MoAb B1.A1を中和するBPV1 、（D）MoAb H16.E70を中和するHPV16(BPV1)、（E）マウスの免疫前の血清、（F ）マウス#4の抗血清（２７週）、（G）マウス#5の抗血清（２７週）、（H）マウス#4の抗血清（２７週）で予めインキュベーションした分注液。図6はサルモネラのHPV産生株で免疫したマウスにおける腫瘍増殖実験の結果を示す。鼻腔免疫を週3回、（A）20μlのPBS、または（E）5μgの精製したHPV16の VLP＋5μgのコレラ毒素（CT）のいずれかで、および0週目および第2目に2回、（ b）10 CFUのPhoPc/HPV16 L1，（C）χ4550/pYA34L1、および（D）χ4550/pYA32L 1を用いて行った。全てのマウスを5 105 C3細胞を用いて最終の免疫後から次の二週間免疫性をテストした。各グループにおける腫瘍の平均体積を示すが、ここでは、17日目の腫瘍を有するマウスの数/注射されたマウスの数が示されている。図7はPhoP^c/HPV16のL1-L2におけるL1およびL2の共発現を示す。ブロットAは抗 L2抗体で検出し、一方ブロットBは抗L1抗体で検出した（Camvir）。図8はE．coliのBL12 pET3D-L1におけるL1の発現を示す。IPTGと共に3時間培養した後、等量の細菌（3×10⁶CFU）をのせ、ブロットを抗L1抗体で検出した。詳細な説明材料および方法プラスミドの構築および使用した細菌株プラスミドpFS14nsd HPV16-L1は、プラスミドpFS14 NSD（54）のB型肝炎のヌクレオキャプシッド遺伝子（HBcAg，NcoI-HindIII断片）を、HPV16-L1のオープンリーディングフレームをコードするNcoI-HindIII断片で置換することにより構築した。HPV 16-L1のNcoI-HindIII断片はバキュロウィルスの発現プラスミドpSy nwtVI-HPV16 114/B-L1+L2（23）を鋳型とし、NcoI部位を含む28マー：5'-GGGCCA TGGCTCTTTGGCTGCCTTAGTGA-3'およびHindIII部位を含む27マー、5'-GGGAAGCTTCAA TACTTAAGCTTACG-3'を用いた複製連鎖反応（PCR）により作製した。Tacプロモーターを含む最終構築物は、Shine-Dalgarno配列に対して+8の位置にHPV16-L1のAT Gが配置し、二番目のアミノ酸が元の配列にコードされていたセリンの代わりにアラニンになるという変異が導入されている。完全長のL1のオープンリーディングフレームの配列決定を行ったが（MycrosynthAG）、さらなるヌクレオチドの変化は観察されなかった。プラスミドpFS14nsd HPV16-L1をE．coli JM105で増幅し、続いて以前に記載されたようにして（50）細菌株CS022にエレクトロポレーションした。この株はATCC 14028株より誘導されたもので、この株にはP22形質導入により pho-24変異が導入されているため、in vitroにおいて毒性およびマクロファージ内における生存性が弱められている（PhoP^c，(35)）。作製された組換え体株は以降PhoP^c/HPVと呼ぶ。サルモネラにおけるHPV16-L1の発現およびVIPの精製 37℃で終夜培養した後、組換え体の細菌を5%SDSを含むLaemmli緩衝液中で煮沸することにより溶菌させた。溶解物は10% SDS/PAGEゲルで分離し、並びにL1の発現は、一次抗体としてHPV16-L1 mAb CAMVIR-1（33）、二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG（Sigma）、および基質としてBCIP/NBT（Bo ehringer）を用いたウェスタンブロットにより分析した。 VLPを調製するためには、細菌を超音波処理により溶菌させ、溶解物を、1M Na Clを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中10%-40%のショ糖密度勾配で、TST41.14 ローターを用いて40Krpmで1時間分画した。続いて勾配の画分を、ウェスタンブロットによりL1タンパク質の存在について分析した。L1タンパク質を含む高い沈降度の画分を回収し、PBS/0.5M NaClに対して透析した。VLPはTST65.1ローターを用いて50Krpmで1時間沈澱させ、炭素でコーティングしたグリッドに吸着させた後、リンタングステン酸で陰性染色し、フィリップス電子顕微鏡で分析した。昆虫細胞内で組換え体バキュロウィルスにより発現されたHPV16 VLPの精製形質転換ベクターpSynwtVIHPV16 114/B-L1+L2（23）を、バキュロウィルスの直線化ゲノム（Baculo-Gold，Pharmingen）と共に、リン酸カルシウム法を用いてSF9細胞に共トランスフェクションした。組換え体バキュロウィルスをプラーク精製し、標準的な方法（39）により増殖させた。バキュロ由来のHPV16のVLPは、以前に記載されたようにして（23）精製した。マウスの免疫および試料採取 6週齢の雌のBALB/cマウスを、0日目および14週目に5×10⁷CFUの接種原で鼻腔から免疫処置した。血液、唾液、および性器の試料を以前に記載されたようにして（18）採取した。全ての試料は-70℃に保存した。 ELISA 試料中の全IgA、抗LPS IgAおよびIgG抗体の量は、以前に記載されたようにして（18）酵素結合免疫吸着分析（ELISA）により決定した。抗HPV16のVLPについては、 ELISAプレートをPBSに溶解したバキュロ由来のHPV16のVLPの調製物10ng（全タンパク質量はBSAを標準として用いたBioRad Proteinassayで決定した）でコーティングした。このVLPの量は我々のELISA検定においては飽和状態であった。試料の端点希釈を行った。特異的なIgAおよびIgGの量は免疫前の試料のOD₄₉₂の４倍の0 D₄₉₂を示す最大の希釈度の逆数となるように発現させた。これらの逆数希釈は、唾液および性器の洗浄液中の全IgAまたはIgGの量に対して標準化した。ELISAプレートはまた、折り畳まれていないVLPを認識する抗体（14）の力価を決定するために、0.2M炭酸緩衝液pH9.5に溶解させたバキュロ由来のHPV16のVLP 10ngでコーティングした。 in vitroにおけるHPV16中和分析 HPV16（BPV1）と命名された、ウシのパピローマウィルスの1型（BPV1）のゲノムを取り巻くL1およびL2より成るHPVキャプシッドから構成される感染性の擬ビリオンは、最近記載されたようにして作製された（43）。簡潔に言えば、自己複製するBPV1のゲノムを有するBPHE-1ハムスター細胞を、HPV16のL1およびL2ビリオンキャプシッドタンパク質を発現する変異型（defective）組換え体セムリキ（Semliki）森林ウィルスで共感染させた。細胞抽出物中の感染性の擬型HPVl6ウィルスは、一層のマウスC127細胞中の形質転換された病巣の誘導により定量した。中和活性は細胞抽出物を培地で1:50（最終体積1.0ml）に希釈したマウスの血清を用いて細胞抽出物を予めインキュベーションした後に測定した。マウスのモノクローナル抗体H16.E70およびB1A1は、それぞれHPV16 L1 VLPおよびBPV16 VLP を発現する組換え体バキュロウィルスに対して作製し、1:100の希釈で使用した。H16.E70およびB1.A1はそれぞれHPV16（BPV1）の中和に対する正および負の対照として役立った。結果 HPV16-L1はPhoP^cにおいて発現され、VLPは会合する HPV16の主要タンパク質L1のオープンリーディングフレームはプラスミドpFS14 NSD（53）にクローン化した。L1はS．typhimuriumにおいてTacプロモーターの制御下で構成的に発現される。PhoP^c/HPVの終夜培養液の溶解物において検出された単一の57kDaのタンパク質（図1A）は、抗HPV16-L1モノクローナル抗体を用いたウェスタン免疫ブロットによりHPV16のL1として同定された（CAMVIR，(33)，図1 B）。PhoP^c/HPVにより発現されたL1タンパク質がVLPへと会合するかどうかを決定するために、細菌の溶解物を10-40%のショ糖密度勾配にかけて分画し、L1タンパク質を含むより重い画分（図1B）を電子顕微鏡で分析した。PVキャプシッドに典型的な球状の粒子が細菌の調製物より回収された（図2A）が、細菌のVLPは、昆虫細胞で発現させた〜55nmのVLP（図2B）と比較すると、40から55nmに渡る直径で、大きさがより多種であるように思われた（図2A）。 PhoP^c/HPV株を用いた鼻腔免疫により全身性および粘膜性の抗体反応が誘導される組換え体サルモネラを用いた鼻腔免疫は、発現された外来の抗原に対して強力な膣のsIgA反応を引き出すことが示されたことから（18）、我々はPhoP^c/HPV株（5×10⁷ CFU）でマウスを鼻腔免疫した。血液、唾液および膣の洗浄液の試料を免疫処置後0、2、4、および6週間で採取した。担体、即ち抗LPSならびに輸送される抗原、即ち抗HPV16 VLPの両方に対する免疫反応を測定した。血清のHPV16 V LP特異的IgG（図3）は一匹のマウスにおいて2週間後に検出し、並びに4週間後に全てのマウスにおいて検出した。反応は比較的低い力価で6週間後にピークを迎え、少なくとも14週目までは持続した。その時期においては、一匹のマウスで唾液に低い力価のIgAが検出されたが、膣の分泌液中にはHPVl6のVLP特異的な抗体は検出されなかった。LPSに対する全身性および粘膜性の免疫反応は比較的弱い（図3）が、PhoP^c/HBc株（18）により誘導される反応に類似しており、マウスによるPhoP^c/HPVサルモネラの正常な取り込みが起こっていることが示唆された。鼻腔免疫後に観察される弱い抗LPS反応は、追加免疫を行う必要を感じさせた。従って、二回目の鼻腔免疫を14週目に行い、試料を5および10週間後（それぞれ1 9および24週目）に採取した。二回目の免疫により、5週間後（19週目）に３匹のマウス由来の膣の洗浄液（図3）において抗HPV16 VLP IgAと同様に、血清においても抗HPV16 VLP IgGの15倍の増加が誘導された。抗HPV16 VLP IgGは膣の洗浄液中にも見い出されたが、19週目の2匹のマウスにおいてのみであり、24週目には力価が再びほとんど検出不能となった（図3）。抗HPV16 VLP IgAおよびIgGはまた、3匹のマウスの唾液において、膣の洗浄液に見られるものよりもかなりまたは僅かに多い量が検出された。抗HPV16 VLP抗体は折り畳まれたVLPのみ認識する PhoP^c/HPV株により誘導される免疫応答が、折り畳まれていないVLPではなく天然のVLPに対して標的化された構造依存的な抗体を生成させるかどうかを調べるために、我々はPBS中（天然の形状）または炭酸緩衝液中（pH9.5，折り畳まれていないVLP，(14)）において、免疫したマウス由来の試料中の抗体のバキュロ由来のVLPに対する結合をELISAにより測定した（表1）。PhoP^c/HPV株により誘導される特異的なIgGまたはIgAは折り畳まれていないVLPをごく僅かにしか認識せず、PhoP^c/HPVにおいて発現されれば、L1の大多数は高度に整った構造に折り畳まれることが示唆された（表1）。 in vitroにおける抗血清の中和活性バキュロ由来のVLPの以前の研究において、中和活性および実験上の感染からの保護は一般的に天然のVLPに対するELISAの反応性と関連していた。それゆえ、我々はサルモネラの生ワクチンにより誘導される構造依存的な抗VLP抗体もまた中和活性があるのかどうか決定することを試みた。真正のHPV16についての感染性分析またはウィルスの原型は現在は存在しないが、最近、HPV16キャプシッドタンパク質が自己複製するBPV1のゲノムをキャプシッドに包むことができ、その結果感染性がマウスの培養線維芽細胞の病巣形質転換によりモニター可能なHPV1 6(BPV1)擬型ビリオンを生じることが示された（43）。それゆえ、我々は上記のようにして生成したマウスの血清の中和活性を調べるために、HPV16(BPV1)の感染性分析を行った。三つの抗血清のそれぞれがHPV16(BPV1)に対する強い中和活性を示した（図5）が、BPV1ビリオンは中和しなかった（未発表データ）。免疫前の血清は中和活性をもたなかった。抗血清の中和活性は、血清は一度の希釈で調べただけであるが、天然のVLPのELISAにおいて力価と関連しているように思われた。 HPV16の腫瘍モデルマウスにおける腫瘍防御分析最近、C57BL/6マウスのわき腹に注入した成長と協力作用のある腫瘍細胞（C3 ）が、精製したHPV16細胞での皮下免疫により抑制されることが示された（84）。我々は、精製したVLPおよび組換え体サルモネラ/HPV株による鼻腔免疫で同様の効果を引き出せるかどうかを検証した。特に我々は以下の株を検証した：PhoP c/HPV1 6 L1（86）並びにHPV16のL1を高レベル（χ4550/pYA34L1）または低レベル（χ4 550/pYA32L1）のいずれかで発現するχ4550（56）。マウスの様々なグループにおける腫瘍の増殖を図6に示す。我々の予備的な結果は、精製したVLPを用いた鼻腔免疫が効果的であること、および検証したサルモネラ/HPV株の全てが部分的な腫瘍の防御を誘導することを証明している。4/10のマウスにおいて完全に腫瘍の増殖を阻害した株χ4550/pYA34L1は興味深い。 L2タンパク質のPhoPc/RPV16への共発現 L2 OR17はプラスミドpPSnsdHPV16 L1（86）のL1のORFの下流にPCRを用いてクローン化した。PCR反応にはポリシストロンのL1-L2 RNAから12の位置の翻訳を行うようにするために、合成したShine-Dalgarno配列を含む5'特異的なオリゴヌクレオチドが含まれる。作製したPhoPC/HPV16 L1+L2組換え体株はL1およびL2を発現し、VLPはサンドイッチELISAにより評価されたような親株PhoPC/HPV16 L1と同様な量で会合した。このことは、PhoP^c/HPV16 L1+L2株においてE7のORFをL2のOR Fと融合することにより、キメラ体VLPもまた会合し、そのような組換え体サルモネラ株がHPV16のE7-CTLを誘導するのに利用できることを示唆している。誘導可能なE．coliのPET発現系における高レベルのL1の発現 L1のORFはプラスミドpET3（Novagen）にクローン化した。T7プロモーターにより誘導されるL1の発現は、BL21apLysS株（IPTG誘導によりT7ポリメラーゼを発現する）において評価した。IPTGによる誘導の後、サルモネラのPhoP^c株と比較して10倍高いレベルのL1の発現/細菌が得られた（図8を参照のこと）。この組換え体E．coliの溶解物はCsCl密度勾配においてVLPの密度のところにバンドを形成し、この細菌内でVLPが自己会合することを示唆した。論考本研究において、我々はHPV16の主要キャプシッドタンパク質を発現する弱毒化されたサルモネラの菌株が、この組換え体細菌により会合したVLPが、血清並びに性器のVLP特異的な構造依存性の抗体を誘導することができるように、HPV16 の感染に対して将来有望なワクチンの候補であることを証明する。上記の結果はまた、抗体がHPV16ウィルスを中和することができることを示している。これらの結果は、当業者により他のHPVのタイプまたは他のパピローマウィルス、または他の原核微生物へと容易に解釈されていくであろう。パピローマウィルスの生活環は、皮膚または口内および性器の粘膜における上皮細胞の分化と密接に関連している（5，19，40，62）。ウィルスは粘膜の擦傷を通して基底上皮細胞への進入路を得ていると考えられている（21）。例えば、子宮頸部の上皮への感染では、基底細胞の細胞質中に放出されたウィルスDNAは核へと移動し、そこでそれはエピソームとして維持され、初期遺伝子が転写されて低い割合で細胞増殖が起こり、並びに基底層が厚くなる（子宮頸部上皮内腫瘍 I型，CIN I）。感染した上皮細胞が基底膜上層を通って移動し、分化を始めるにつれて、エピソームのウィルスゲノムは複製し、一細胞当たり〜1000コピーに達する（29）。ウィルスDNAの増幅に付随して、最終的に分化したケラチン生成細胞において後期遺伝子が発現されるようになり、キャプシッドが会合し（図4）、こうして新たな感染の繰り返しが促進される。高度の障害（CIN IIIおよび腫瘍）においては、全上皮は未分化の基底細胞から構成され、その細胞内でウィルスDNAは細胞のDNAに挿入される。これらの細胞においては、E6/E7遺伝子産物は発現される主要なHPVタンパク質を構成し、ウィルスはもはや産生されない。 HPVの病原に関する我々の知識に基づいて、免疫の二つの能力（体液性および細胞性）はウィルスの感染を防ぐため、局所的なウィルスの経路を減少させるため、または腫瘍を治療するために効果的でなくてはならないように思われる（図 4，(59)もまた参照のこと）。細胞の反応は未形質転換のまたは形質転換された感染細胞の排除に貢献しているかもしれないが、中和抗体による局所的または全身性の体液の免疫反応は、初期感染を妨げるように思われる。防御および治療の免疫学的な関連性はこれまでのところ明らかにされていないが、理想的なワクチンは二つのタイプの反応を引き起こすべきである。型依存的な構造性（抗VLP）中和抗体を誘導する予防ワクチンが、それぞれワタオウサギ（4）またはイヌ（57）においてCRPVまたはCOPVの感染を防ぐことが示されている。どちらの場合においても、血清中和抗体は自己会合したPVキャプシッドを用いた予防接種により生成した。類推から、子宮頸部の分泌液中のHPV1 6キャプシッドに対する中和抗体は感染を防ぐことが期待される。HPVの初期感染の起こる正確な粘膜の部位が知られていないため、内腔の部位から機能するsIgA抗体、または基底層まで届く循環IgG抗体のどちらが最も効果的であるのかを予測するのは困難である。 HPV感染細胞または腫瘍細胞の排除は、MHCクラスI分子により感染細胞表面に提示されるウィルス抗原を認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）による細胞性免疫反応を必要とする。HPVにより誘導される腫瘍の排除を目的とした治療用ワクチンは、E6/E7癌遺伝子またはE6/E7を発現する種痘ウィルス由来のT細胞抗原に相当するペプチドのいずれかを用いて作製されてきた。どちらもCTLを排除することが示され、いくつかの場合においては腫瘍の縮小が観察された（3，6，7，1 2，13，34）。しかしながら、ウィルスを産生する分化したケラチン生成細胞、または腫瘍細胞においては、MHCクラスI分子が負に制御される（9）というのが一つの大きな問題点である。体液性および細胞性免疫はどちらもHPVの感染を制御していると考えられており、そして局所的および全身性の反応が望まれることから、効果的なワクチンは粘膜の表面および/または抹消リンパ節に関連した誘導部位に届かなくてはならない。細菌の生ワクチンは粘膜の表面に行き渡り、体液性または細胞性の反応を引き起こすことが知られている（41）。サルモネラ等の組換え体および弱毒化された腸病原性細菌は、それらが粘膜形成リンパ組織（MALT）または濾過リンパ節への進入路を得るように全ての粘膜表面に効果的に行き渡るため、理想的な抗原輸送系の代表である。それらは、一層および層状の上皮において、一層の上皮および樹状細胞中のＭ細胞を含む粘膜に投与された抗原の取り込みを媒介する、二つの基本的な試料採取系を利用する（38）。我々は、外来抗原を発現する組換え体細菌の鼻、口、直腸または膣を介した一度の投与により持続性の高い抗体反応が誘導されたことから（18）、マクロファージの生存のために弱毒化したSalmon ella typ himuriumの株を選択した。その研究において、性器における最大の反応は鼻腔免疫後に得られた。気管においては、抗原の取り込みはNALT、即ち鼻関連リンパ組織（25）またはBALT、即ち気管支関連リンパ節（55）に見られるM細胞を介して起こる。続いてプライミングの終わったIgA発現リンパ球は子宮頸部または子宮の組織へと移動し、そこでそれらは多量体のIgA抗体を産生し、それが多量体Ig受容体によって上皮を横切って輸送される（26-28）。気管支の上皮における内皮の樹状細胞はまた、呼吸上皮において抗原を取り込むこと、およびそれらをプライミングが起こる離れた濾過リンパ節に輸送することにより、抗原の提示に主要な役割を果たす（17）。これは、おそらく、局所的および全身性の両方の抗体反応を誘導するのになぜ鼻腔免疫がそれほど効果的であるかを説明している。サルモネラ株で発現される抗原はまた、特異的なCTLにより細胞性の反応を誘導することも可能である（1，16，58）。どのウィルス抗原が発現されるかに依存して、分化の異なる段階において感染細胞を認識する特異的なCTLを作製することが可能である（図4）。例えば、E7特異的CTLは、HPV16のE7エピトープを発現する組換え体サルモネラでマウスを免疫することにより生成した（31）。組換え体サルモネラを用いて中和抗体を誘導するためには、抗原がその天然の構造を保持していることが必要不可欠である。HPVについては、これはL1タンパク質がVLPを形成することを必要とする。パピローマのVLPは真核細胞内では会合することが示されているが（15，22，45，48，61）、原核生物では示されていない。細菌においては、主にL1融合タンパク質が発現されており（2，20，24）、真正のL1タンパク質が発現された場合のVLPの会合は調べられていない（11）。本明細書で示されているように、おそらく我々の実験において得られる発現レベルが高く、キャプシッドの会合がグリコシル化を必要としないため（60）、HPV1 6のVLPはサルモネラ内で会合する。細菌におけるキャプシッドの生産はまた、B 型肝炎ウィルスのヌクレオキャプシッド（52）、およびポリオーマウィルスのキャプシッド（30，46）等の他のウィルスについても報告されている。HPVのL1に類似した、ポリオーマウィルスのVP1主要キャプシッドタンパク質はE．coliで発現させるとキャプソマーを形成し、続いてそれはin vitroにおいてVLPへと自己会合する（46）。VLPではなくキャプソマーだけが回収されるという事実は、おそらく精製の間に存在する、キャプシッドを破壊することが知られている還元剤が原因である（47）。 PhoP^c/HPV株による鼻腔免疫は、天然のHPV16のVLPに対しては全身性および粘膜性の抗体を誘導したが、変性したVLPに対しては誘導しなかった。対照的に、H PV1のキャプシッドタンパク質を発現する組換え体の痘疹ウィルスは、折り畳まれたVLPおよび折り畳まれていないVLPの両方を認識する血清抗体を誘導したが、これはおそらく、粘膜の経路でない免疫に期待されるように、異なる形式のウィルスタンパク質の発現、およびHPV特異的な性器のIgA抗体の低い力価（14）を反映している。 PhoP^c/HBcのサルモネラと比較して、PhoP^c/HPVにより誘導される外来の抗原に対する抗体の力価は、約10倍低い（18）。このことは、二つのウィルス抗原の間の免疫原性の違い（51）、またはより可能性のあることとして、プラスミドの安定性の違いを反映している可能性がある。HBcのDNAと対照的に、HPV16-L1のDNA を有するプラスミドは、免疫後2週間の異なる組織から回収したサルモネラの1% 以下しか依然としてL1を含むプラスミドを有していなかった（未発表データ）ことから、サルモネラ内でin vivoにおいて選択圧がない状態では不安定であった。プラスミドの安定性を増すために、我々は現在、in vivoにおいて選択圧を保持するβ-アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（asd）を組み込んだベクターにL1遺伝子を再クローン化している（36，56）。上記の研究はまた、以下の点を証明した：（a）精製したVLPおよびサルモネラ/HPV株は、HPV16の腫瘍モデルマウスにおいて腫瘍の防御を提供することができる。（b） HPVタンパク質および融合相手のキメラ体は原核生物内で会合してVLP を形成する。（c）会合してVLPを形成するHPVタンパク質の高レベルの発現がE．coliにおいて得られ、それが本発明がサルモネラ以外の原核生物においても適用可能であることを証明している。結論として、我々はHPV16-L1キャプシッドタンパク質を発現し、且つVLPを認識する構造的な血清IgGおよび膣のsIgA抗体を誘導するVLPを会合させる組換え体サルモネラ株を作製した。これらの抗体の中和活性を検証し、HPV16(BPV1)感染性分析において強い中和活性を示すことを示した。表１：PhoP^c/HPVで免疫したマウスにおける天然のおよび非折り畳みHPV16 VLPに対するIgG（血清中）またはIgA（膣洗浄液）の力価試料抗HPV16 VLP 非折り畳み ^aHPV16 VLP IgG力価^b #4血清（27週） 60,000 100 #5血清（27週） 80,000 200 #6血清（27週） 20,000 100 Camvir^c 16,000 80,000 IgA力価 #4膣洗浄液（19週） 40 <1 #5膣洗浄液（19週） 20 <1 #6膣洗浄液（19週） 40 1^a ELISAのプレートは炭酸塩緩衝液pH9.5中でVLPでコートした。^b 力価は免疫する前の試料の４倍のOD₄₉₂が出る試料の希釈物の逆数として表す。^c 抗HPV16 L1モノクローナルIgG(35μg/ml),30)はポジティブコントロールとして使用した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＬＧ０１Ｎ 33/569 33/574 Ｃ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．パピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする核酸で形質転換した原核微生物の弱毒化した株であって、前記タンパク質は微生物内で会合してウイルス様の粒子（ＶＬＰ）を形成する、前記株。２．弱毒化した株がＳａｌｍｏｎｅｌｌａである、請求項１の弱毒化した微生物株。３．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株がＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｄｕｂｌｉｎ，またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｅｔｉｄｉｓである、請求項２の弱毒化した微生物株。４．弱毒化した株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａまたはＬｉｓｔｅｒｉａである、請求項１の弱毒化した微生物株。５．核酸がヒトのパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする、請求項１ないし４のいずれか１項の弱毒化した微生物株。６．ＨＰＶ株がＨＰＶ１６，１８，３１，４５または５６である、請求項５の弱毒化した微生物株。７．パピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質がＬ１タンパク質である、請求項１ないし６のいずれか１項の弱毒化した微生物株。８．パピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質を融合相手とのキメラとして発現させた、請求項１ないし７のいずれか１項の弱毒化した微生物株。９．パピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をＬ２タンパク質と共発現させ、Ｌ２タンパク質は融合相手と融合させている、請求項８の弱毒化した微生物株。１０．融合相手が、Ｅ６，Ｅ７もしくはＥ２ＨＰＶタンパク質、非ＨＰＶ病原体由来の免疫性タンパク質、または腫瘍特異的な抗原である、請求項８または９の弱毒化した微生物株。１１．微生物が、２つまたはそれ以上のパピローマウイルスの主要キャプシドタンパク質をコードする核酸で形質転換されている、請求項１ないし１０のいずれか１項の弱毒化した微生物株。１２．１種またはそれ以上の請求項１から１１の微生物を、生理的に受容可能なキャリヤーと組み合わせて含む組成物。１３．１種またはそれ以上の請求項１から１１の微生物を、生理的に受容可能なキャリヤーと組み合わせて含むワクチン。１４．粘膜免疫用に処方した請求項１３のワクチン。１５．粘膜免疫が口、直腸、鼻、または生殖経路を介する請求項１４のワクチン。１６．ワクチンが、パピローマウイルスの感染または生殖器の管の癌に対する予防を提供する、請求項１３から１５のいずれか１項のワクチン。１７．医学的処方に使用する、請求項１から１１のいずれか１項の原核微生物の弱毒化した微生物株。１８．請求項１から１１のいずれか１項の原核微生物の弱毒化した株の、パピローマウイルスの感染に対する予防的または治療的処方に用いる薬剤の調製における使用。１９．請求項１から１１のいずれか１項の原核微生物の弱毒化した株の、生殖器の管の癌の処方に用いる薬剤の調製における使用。２０．請求項１から１１のいずれか１項の弱毒化した微生物株を培養し、そして、産生された会合したウイルス様粒子を回収する、ことを含む、会合したパピローマウイルス様粒子を産生する方法。２１．対象由来の試料において抗パピローマウィルス抗体の存在を検出するための方法であって、ＨＰＶＶＬＰを固体の支持体に固定し、その支持体を試料に曝露し、そして固定化されたＨＰＶＶＬＰに結合した抗体を検出する、ここにおいて、前記ＨＰＶＶＬＰは請求項１から１１のいずれ１項の弱毒化した微生物株によって産生される、ことを含む前記方法