ES2294778T3 - Vacunas para el virus del papiloma. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTA UNA PROTEINA RECOMBINANTEMENTE PRODUCIDA QUE IMITA LOS EPITOPES NEUTRALIZANTES EN VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y ANIMALES. LAS PROTEINAS RECOMBINANTES SON UTILES COMO VACUNAS PROTECTORAS CONTRA LA INFECCION POR VIRUS DEL PAPILOMA. TAMBIEN SE SUMINISTRAN ANTICUERPOS PARA LAS PROTEINAS RECOMBINANTES. DICHOS ANTICUERPOS SON UTILES EN LA DIAGNOSIS Y TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES.
Description
\global\parskip0.900000\baselineskip
Vacunas para el virus del papiloma.
La invención se refiere a la diagnosis,
serotipo, prevención y tratamiento de enfermedades virales,
particularmente infecciones del virus del papiloma.
Los virus del papiloma (PV) son miembros de la
familia de los papovavirus y contienen un genoma de doble cadena
circular con un tamaño típico de alrededor de 7.900 pares de bases
(bp). Se reconoce a los virus del papiloma humanos (HPV) como la
causa de varias lesiones epiteliales tales como las verrugas,
condilomas y displasias. Véase, Gissman, L. Cancer Survey
3:161 (1984); Boshart et al, ENBO J. 3:1151 (1984);
Romanczuk et al, J. Virol.
65:2739-2744 (1991); Jenson et al, en
"Papillomaviruses and human cancer" (H. Pfister. Ed.), páginas
11-43, CRC Press (1990); Schlegel, R.,
"Papillomaviruses and human cancer" en: Viral
pathogenesis (ed. Fujinami, R.), Seminars in Virology
1:297-306 (1990); y Jenson et al, "Human
Papillomaviruses" en Belshe, R. ed. Textbook of human virology,
Segunda Edición: MASS:PSG, 1989:951.
Los HPVs se agrupan en tipos basados en la
semejanza de su secuencia de ADN. Se clasifican dos HPVs
taxonómicamente como que son del mismo tipo si sus ADNs se
entrecruzan por hibridación hasta más del 50% medido por hibridación
en solución en condiciones de hibridación moderadamente
severas.
Se ha mostrado que un número de virus del
papiloma diferentes infectan a los seres humanos. Los virus del
papiloma son altamente específicos en cuanto a la especie y al
tejido, y se caracterizan por una forma de interacción específica
con el epitelio escamoso al que infectan. Estos virus tumorales de
ADN corto colonizan varios epitelios estratificados como la piel y
la mucosa oral y genital, e inducen la formación de tumores
benignos auto limitativos conocidos como papilomas (verrugas) o
condilomas. Se cree que estos tumores se forman a partir de un
evento inicial en el ciclo infeccioso donde el virus aumenta la
velocidad de división de las células madre infectadas en la capa
basal del epitelio, antes de que se repliquen como el queratinocito
diferenciado.
El término virus del papiloma cubre un gran
número de virus a los que se considera responsables de varias
formas de infecciones virales que están en el intervalo de desde
verrugas relativamente benignas de la piel o membranas de la mucosa
a hiperplasias susceptibles de progresar a displasias o neoplasmas
intraepiteliales, y de conversión maligna a varias formas de
cáncer, el más significativo es el femenino del cérvix del
útero.
Se han identificado un número de tipos de HPVs.
Además, la asociación preferencial de ciertos tipos de HPV con
lugares anatómicos y tipos claros de lesiones dan soporte a la
hipótesis de que lesiones distintivas inducidas por HPV constituyen
enfermedades distintivas, y que los patrones clínicos de las
lesiones expresan propiedades biológicas específicas de tipos
distintivos de HPVs. Se han asociado aspectos histológicos
distintivos con la infección de la piel o de las membranas de la
mucosa por tipos diferentes de HPVs.
Se han clonado y caracterizado los genomas de
tipos diferentes de HPVs. En particular, se ha encontrado que los
genomas de dos tipos de HPVs, HPV 16 y HPV 18, están asociados con
alrededor del 70% de carcinomas invasivos de la cérvix del
útero.
Los virus del papiloma humanos que infectan la
mucosa del tracto genital tienen un papel crítico en el desarrollo
del cáncer cervical. Véase, Lorincz et al, Obstetrics
& Gynecology, 79:328-337 (1992); Beaudenon
et al, Nature, 321:246-249 (1986); y
Holloway et al, Gynecol. Onc.,
41:123-128 (1991). Por ejemplo, la mayoría de los
carcinomas cervicales humanos (95%) contienen y expresan AND de HPV
y es la expresión de dos oncoproteínas virales, E6 y E7, lo que
parece ser crítico para la transformación celular y el mantenimiento
del estado transformado. A pesar del conocimiento detallado que
concierne al mecanismo de acción molecular de estas oncoproteínas,
hay poca información en cuanto a la biología de la infección del
virus del papiloma, incluyendo la identidad de los receptores
virales, control de la replicación y ensamblaje viral, y la
respuesta inmune del hospedante a los virus y a las células
transformadas por los virus. Una vacuna eficaz contra la infección
por HPV podría reducir potencialmente la incidencia de displasia
cervical humana y carcinoma el 90-95%. Sin embargo,
no hay sistema de cultivo de tejidos que permita suficiente
diferenciación de los queratinocitos para propagar PV in vitro.
Debido a la amplia incidencia de la infección por HPV, se necesitan
métodos para detectar, prevenir y tratar la infección viral.
Carter et al (Virology 182,
513-521 (1991)) describen la expresión de proteínas
de HPV en la levadura.
Roseto et al (J. Gen. Virol. 65,
1319-1324 (1984) describen los anticuerpos
monoclonales que reconocen el polipéptido viral estructural más
importante de HPV-1.
Se proporciona la proteína cápsida más
importante L1 producida con técnicas recombinantes que mimetiza los
epítopos neutralizantes conformacionales de los viriones de papiloma
humano y animal. La proteína recombinante reproduce la
antigenicidad de las partículas virales infecciosas intactas. La
proteína recombinante puede utilizarse para inmunoprecipitar
anticuerpos del suero de pacientes infectados o vacunados con PV. Se
proporcionan también anticuerpos neutralizantes de la proteína
recombinante. Los anticuerpos son útiles en el diagnóstico y
tratamiento de la infección viral de papiloma. La invención
proporciona además vacunas subvirales para la prevención de la
infección por el virus del papiloma humano y animal.
La invención proporciona una proteína L1 aislada
de virus de papiloma humano (PV) producida con técnicas
recombinantes o fragmentos de la misma, en donde dicha proteína o
fragmento de la misma proporciona los epítopos conformacionales
presentes en los viriones intactos del virus del papiloma humano, y
reacciona con los anticuerpos monoclonales que reaccionan con los
viriones HPV intactos pero no reacciona con los viriones HPV
alterados, y en donde dicha proteína o fragmento de la misma es
capaz de inducir anticuerpos neutralizantes de los viriones de virus
de papiloma.
Se desnaturalizaron viriones purificados de
HPV-1 con SDS y se separaron sus proteínas
constitutivas por electroforesis de gel en poliacrilamida SDS. Las
proteínas de HPV-1 fueron después transferidas por
electroforesis a nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con
diluciones 1:100 de antisuero de conejo o anticuerpos monoclonales
(fluido de ascitis). MAB45, que se produjo como un sobrenadante del
hibridoma, se diluyó solo 1:10. Se detectó la reactividad primaria
de los anticuerpos usando IgG de carnero anti-conejo
o anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina
(BIO-Rad) a una dilución de 1:1000 en PBSA. Se
encontró que solo el antisuero de conejo #3 y MAB45, ambos
reconocen viriones de HPV-1 desnaturalizados por
ELISA, reaccionaban significativamente con la proteína L1
desnaturalizada (véase la flecha).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se amplificó el gen L1 a partir de ADN de
HPV-1 clonado usando primers de oligonucleótidos 5'
y 3' que contenían los lugares de restricción de los enzimas XhoI y
BamHI, respectivamente. El plásmido, designado
pSJ-1, contenía el gen L1 de HPV-1
expresado por el promotor SV40 tardío. El plásmido también contenía
el origen de la replicación (ori) de SV40 así como el intrón de VP1
de SV40 y las señales de la poliadenilación tardía. Se secuenció el
gen completo de L1 de pSJ-1 en su totalidad y se
encontró que era idéntico a la secuencia genómica de L1 de
HPV-1.
Se transfectaron células cos, cultivadas en
placas de plástico de 10 cm de diámetro, cuando eran 80% confluentes
con 10 \mug de ADN de plásmido pSJ-1 usando una
técnica de precipitación con fosfato cálcico (Gram., F.L., y van
der Eb., A.J., Virology 52:456-467 (1973). 48 horas
más tarde, se marcaron las células metabólicamente con 500
\muCi/ml de ^{35}S-metionina durante 4 horas en
2,5 ml de medio sin cisteína y metionina. Después se lavaron las
células con PBS, se extrajeron con tampón de RIPA, y se
inmunoprecipitaron con el anticuerpo de conejo indicado o los
anticuerpos monoclonales de ratón. Las proteínas inmunoprecipitadas
se analizaron entonces por SDS electroforesis de gel y
autoradiografía. Todos los antisueros policlonales inmunes y
anticuerpos monoclonales fueron capaces de inmunoprecipitar la
proteína L1 (véase la flecha).
Los canales 1 y 4 muestran la ausencia de la
proteína L1 cuando se precipitaron los extractos tanto con suero no
inmune de conejo (canal 1) como con suero no inmune de ratón (canal
4).
Células cos cultivadas en cubreobjetos se
transfectaron con 10 \mug de pSJ-1 como se
describe en la figura 3. Después de 48 horas, se lavaron los
cubreobjetos con PBS, se fijaron con acetona fría, y se hicieron
reaccionar con diluciones 1:250 de antisuero de conejo o
anticuerpos monoclonales de ratón. Los anticuerpos primarios
reaccionados se tiñeron con anti-IgG de carnero
marcada con FITC a la dilución de 1:10 en PBS (Cappel). Los núcleos
de aproximadamente 5-10% de las células cos
transfectadas fueron positivos para la inmunofluorescencia. Los
anticuerpos evaluados fueron R#3 (recuadro a), R#7 (recuadro b),
MAB45 (recuadro c), 334B6 (recuadro d), 339B6 (recuadro e), D54G10
(recuadro f), y 405D5 (recuadro g). Todos los antisueros fueron no
reactivos con las células cos transfectadas con el vector de origen
pSVL que carecía del gen L1 de HPV-1, incluyendo R#3
(recuadro h).
Se proporcionan métodos y composiciones para la
prevención, detección y tratamiento de la infección con el virus
del papiloma (PV). Los métodos están basados en la producción de la
proteína cápsida más importante recombinante L1 que es capaz de
reproducir los epítopos neutralizantes conformacionales de los
viriones del papiloma humano y animal. La invención se extiende
además a fragmentos antigénicos de dichas proteínas recombinantes
L1.
Aunque los virus del papiloma infectan a una
amplia variedad de especies de vertebrados, muestran una
conservación remarcable de organización genómica y composición de
proteínas cápsidas. Los virus del papiloma consisten en viriones
pequeños (alrededor de 55 nm), desnudos que rodean un genoma de ADN
de doble cadena, circular. El genoma es de aproximadamente 8.000
pares de bases de longitud y puede dividirse en regiones
"tempranas" y "tardías" de igual longitud. La región
"temprana" codifica a de 7-8 genes envueltos en
procesos tales como la replicación del ADN viral (los genes E1 y
E2), transcripción de ARN (el gen E2), y transformación celular
(los genes E5, E6 y E7). La región "tardía" codifica dos
proteínas estructurales, L1 y L2, que representan la proteína
cápsida más importante y menos importante, respectivamente. Todos
los genes "tempranos" y "tardíos" se transcriben de la
misma cadena de ADN viral.
Hay una variedad de tipos de PV conocidos en la
técnica. Además, tipos particulares de PVs están asociados con
infecciones particulares tales como verrugas planas, verrugas
cutáneas, epidermodisplasia verruciformis, lesiones y cáncer
cervical. Se han identificado más de 50 tipos diferentes de tipos de
HPV en lesiones clínicas con estudios de homología de secuencias de
nucleótidos virales. Véase, por ejemplo, Jenson et al,
"Human papillomaviruses" en Belshe, R. Ed., Textbook of human
virology, Segunda Edición, MASS: PSG, 1989:951 y Kremsdorf et
al, J. Virol., 52:1013-1018 (1984). El
tipo de HPV determina, en parte, el lugar de la infección, los
aspectos patológicos y la apariencia clínica así como el curso
clínico de la lesión respectiva.
La proteína L1 representa la proteína más
altamente conservada de todas las proteínas del virus del papiloma,
La secuencia de nucleótidos de los marcos de lectura abierta de L1
de BPV-1, HPV-1a, y
HPV-6B se dan en el documento de patente de Estados
Unidos número 5.057.411, cuya descripción se incorpora aquí como
referencia. Además, se establece que las proteínas L1 y las
proteínas de fusión se han producido de forma recombinante. Sin
embargo, antes de la presente invención, no se conocía que podían
producirse proteínas L1 con suficiente fidelidad para mantener una
conformación equivalente a la encontrada en viriones intactos del
virus de papiloma. Anteriormente, se producían proteínas L1
recombinantes como moléculas lineales que eran incapaces de proteger
contra la infección del virus del papiloma. La presente invención,
por el contrario, proporciona una proteína conformacionalmente
correcta que es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes que
protegen contra los virus del papiloma animal y humano.
Puesto que se cree que hay poca o ninguna
inmunidad cruzada para los tipos de PV y la inmunidad a la infección
por PV es específica al tipo de PV, será necesario producir
proteína recombinante L1 para cada tipo específico de PV para el
que se necesite protección o tratamiento. Sin embargo, debido a la
homología entre las proteínas de L1 y los genes, pueden utilizarse
técnicas de hibridación para aislar los genes L1 particulares de
interés. Pueden utilizarse sondas de nucleótido seleccionadas de
regiones de la proteína L1 que se ha demostrado que muestran
homología de secuencia para aislar otros genes L1. Se conocen
métodos de hibridación en la técnica. Véase, por ejemplo,
Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press,
Washington, D.C. (1985); Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, Maniatis et al. eds., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); y Molecular Cloning.
A Laboratory Manual, Sambrook et al. eds., Cold Spring
Harbor Laboratory, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Alternativamente, pueden utilizarse métodos de PCR para amplificar
genes L1 o fragmentos de genes. Véase, por ejemplo, los documentos
de patente de Estados Unidos números 4.683.195; 4.683.202; y
4.800.159.
Pueden también aislarse partículas virales de un
tipo particular de virus del papiloma, clonar el ADN, y aislar las
secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas L1
aisladas. Se han descrito métodos para aislar partículas virales y
clonar el ADN de los virus. Véase, por ejemplo, Heilman et al
(1980) J. Virology 36:395-407; Beaudenon
et al (1986) Nature 321:246-249;
Georges et al (1984) J. Virology
51:530-538; Kremsdorf et al (1984) J.
Virology 52:1013-1018; Clad et al (1982)
Virology 118:254-259; DeVilliers et al
(1981) J. Virology 40:932-935; y la
solicitud de patente europea número 0133123.
Alternativamente, puede aislarse la proteína L1
de un virus de papiloma particular, determinar la secuencia de
aminoácidos y construir sondas de ácido nucleico basadas en la
secuencia de ADN predicha. Dichas sondas pueden utilizarse para
aislar el gen L1 de una librería de ADN de virus del papiloma.
Véase, por ejemplo, Suggs et al (1981) PNAS
78(11):6613-6617. Véase también, Young y
Davis (1983) PNAS 80(11):1194.
Puesto que la proteína recombinante L1 debe ser
de conformación adecuada para mimetizar la de la partícula viral
intacta, el sistema de expresión es crucial en la invención. Debe
utilizarse un sistema de expresión que produce proteína L1 con la
conformación correcta. O sea, la proteína recombinante L1 reproduce
la antigenicidad de las partículas virales infecciosas intactas.
Dichos sistemas de expresión deberían producir también altos
niveles de proteína cápsida. Generalmente, el sistema de expresión
comprenderá un vector que tiene la proteína L1 de interés y las
regiones regulatorias apropiadas así como una célula hospedante
adecuada. Típicamente una célula hospedante adecuada será una que
proporcione mecanismos eucarióticos para procesar las proteínas.
\newpage
Idealmente, se usa un promotor fuerte para una
expresión grande de la proteína recombinante. De interés particular
es el vector pSVL. El vector pSVL contiene un origen SV40 de
replicación y cuando es transfectado en células COS, que expresan
el antígeno Large T, se replica en un número de copias grande.
Alternativamente, pueden utilizarse vectores de
baculovirus. Un sistema de baculovirus ofrece la ventaja de que un
gran porcentaje de células pueden ser inducidas a expresar proteína
debido al uso de la infección más que a las técnicas de
transfección. Mientras que los baculovirus son virus de los insectos
y crecen en las células de los insectos (SF9), estas células
retienen muchos de los mecanismos eucarióticos para el procesamiento
de proteínas incluyendo la glicosilación y la fosforilación que
pueden ser importantes para generar proteínas de la conformación
adecuada. Se conocen sistemas de vectores de baculovirus en la
técnica. Véase, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural
Experimental Bulletin Nº 1555 (1987); Smith et al, Mol.
Cell Biol. 3:2156-2165 (1985); Posse, Virus
Research 5:4359 (1986); y Matsuura, J. Gen. Virol.
68:1233-1250 (1987).
Para expresión en un sistema de expresión
apropiado, se une de forma operable el gen L1 a un vector de
expresión y se introduce en una célula hospedante para permitir la
expresión de la proteína L1 por esa célula. El gen con las regiones
regulatorias apropiadas se proporcionará en la orientación y marco
de lectura adecuados para permitir la expresión. Se conocen métodos
para la construcción de genes en la técnica. Véase, en particular,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Sambrook et al, eds.,
Cold Spring Harbor Laboratory, Segunda Edición, Cold Spring Harbor,
NY (1989) y las referencias citadas allí.
Pueden emplearse una amplia variedad de
secuencias regulatorias translacionales y transcripcionales. Las
señales pueden derivarse de fuentes virales, donde se asocian las
señales regulatorias con un gen particular que tiene un nivel de
expresión alto. O sea, se utilizarán promotores fuertes, por
ejemplo, de fuentes virales o de mamíferos. De esta forma, las
condiciones óptimas para realizar la invención incluyen la clonación
del gen L1 en un vector de expresión que sobreexpresará epítopos
dependientes de la conformación de la proteína L1 en células diana
transfectadas o infectadas.
La proteína recombinante L1 se confirma por
reacción con anticuerpos o anticuerpos monoclonales que reaccionan
con o reconocen epítopos conformacionales presentes en el virión
intacto. De esta forma, puede verificarse que la proteína L1 tiene
la conformación adecuada. Así, pueden probarse otros vectores de
expresión y sistemas de expresión para uso en la invención.
Una vez que se ha expresado la proteína L1 de
conformación adecuada, pueden obtenerse anticuerpos contra la
proteína recombinante o los fragmentos antigénicos de la misma. Los
anticuerpos de la presente invención pueden prepararse usando
técnicas conocidas. Se preparan anticuerpos monoclonales usando
tecnología de hibridoma como se describe por Kohler et al,
Nature 256:495 (1975); Kohler et al, Eur. J.
Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al, Eur. J.
Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al, en:
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,
Elsevier, NY, páginas 563-681 (1981). Dichos
anticuerpos producidos por los métodos de la invención son capaces
de proteger contra la infección de PV.
El término "anticuerpo" incluye tanto
anticuerpos policlonales como monoclonales, así como fragmentos de
los mismos, tales como, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab y
F(ab)_{2} que son capaces de unir antígeno o
hapteno. Dichos fragmentos se producen típicamente por ruptura
proteolítica, tal como con papaína, para producir fragmentos Fab o
pepsina para producir fragmentos F(ab)_{2}.
Alternativamente, puede producirse fragmentos que se unen al
hapteno por medio de la aplicación de tecnología de ADN recombinante
o por medio de la química sintética.
Como se ha indicado, pueden emplearse ambos
anticuerpos policlonales y monoclonales según la presente invención.
De interés especial en la presente invención son anticuerpos que
son producidos en seres humanos o que son "humanizados" (o
sea, no inmunogénicos en un ser humano) por tecnología recombinante
u otras tecnologías. Pueden producirse anticuerpos humanizados, por
ejemplo, colocando una parte inmunogénica de un anticuerpo con una
parte correspondiente, pero no inmunogénica, anticuerpos quiméricos.
Véase, por ejemplo, Robinson et al, documento de patente
internacional PCT/US86/02269; Akira et al, solicitud de
patente europea 184.187; Taniguchi, M. solicitud de patente europea
171.496; Morrison et al, solicitud de patente europea
173.494; Neuberger et al, documento de solicitud de patente
internacional PCT WO86/01533; Cabilly et al, solicitud de
patente europea 125.023; Better et al, Science
240:1041-1043 (1988); Liu et al, PNAS
84:3439-3443 (1987); Liu et al, J. Immunol.
139:3521-3526 (1987); Sun et al, PNAS
84:214-218 (1987); Nishimura et al, Cancer
Research 47:999-1005 (1987); Word et al,
Nature 314:446-449 (1985); y Shaw et al,
J. National Cancer Inst. 80:1553-1559
(1988). Revisiones generales de anticuerpos quiméricos
"Humanizados" se proporcionan en Morrison, S.L. Science
229:1202-1207 (1985) y en Oi et al,
BioTechniques 4:214 (1986).
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de
la presente invención pueden utilizarse para detectar, diagnosticar,
serotipar y tratar infecciones de virus del papiloma. De esta
forma, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son
particularmente adecuados para uso en inmunoensayos.
Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos,
pueden ser marcados usando cualquiera de una variedad de marcas y
métodos de marcaje. Ejemplos de tipos de marcas que pueden usarse en
la presente invención incluyen, pero no están limitados a, marcas
enzimáticas, marcas de radioisótopos, marcas de isótopos no
radioactivos, marcas de fluorescencia, marcas de toxinas, y marcas
de quimiluminiscencia.
Ejemplos de marcas enzimáticas adecuadas
incluyen la hidrogenasa de malato, nucleasa de estafilococo,
isomerasa de delta-5-esteroide,
deshidrogenasa de alcohol de levadura, fosfatodeshidrogenasa de
alfa-glicerol, isomerasa de triosafosfato,
peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosaoxidasa,
betagalactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
glucoamilasa, estearasa de acetilcolina, etc.
Ejemplos de marcas de radioisótopos adecuadas
incluyen ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{35}S,
^{14}C, ^{51}Cr, ^{57}To, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{75}Se,
^{152}Eu, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{217}Ci, ^{211}At,
^{212}Pb, ^{47}Sc, y ^{109}Pd.
Ejemplos de marcas de fluorescencia adecuadas
incluyen una marca ^{152}Eu, una marca de fluoresceína, una marca
de isotiocianato, una marca de rodamina, una marca de ficoeritrina,
una marca de ficocianina, una marca de haloficocianina, una marca
de o-ftaldehído, una marca de fluorescamina,
etc.
Ejemplos de marcas de toxinas adecuadas incluyen
la toxina de la difteria, ricino, y cólera. Ejemplos de marcas de
quimiluminiscencia incluyen una marca luminal, una marca isoluminal,
una marca de un éster de acridinio aromático, una marca de
imidazol, una marca de sal de acridinio, una marca de éster de
oxalato, una marca de luciferina, una marca de luciferasa, una
marca de aecuorin, etc.
Aquellos con conocimientos ordinarios de la
técnica conocerán otras marcas adecuadas que puedan emplearse según
la presente invención. La unión de estas marcas a anticuerpos o
fragmentos de los mismos puede conseguirse usando técnicas
estándares conocidas corrientemente a aquellos con conocimientos
ordinarios de la técnica. Técnicas típicas se describen por
Kennedy, J.H., et al, Clin. Chim Acta. 70;
1-31 (1976), y Schurs, A.H.W.M., et al,
Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977). Las técnicas
de acoplamiento mencionadas en la referencia anterior son el método
del glutaraldehído, el método del periodato, el método de la
dimaleimida, el método del éster de la
m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida,
todos estos métodos se incorporan aquí como referencia.
La detección de los anticuerpos (o fragmentos de
los anticuerpos) de la presente invención puede mejorarse por medio
del uso de vehículos. Vehículos bien conocidos incluyen el vidrio,
poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon,
amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas,
agarosas y magnetita. Para los propósitos de la presente invención,
la naturaleza del vehículo puede ser tanto soluble hasta un cierto
grado como insoluble. Aquellos con conocimiento de la técnica
conocerán muchos otros vehículos adecuados para unir anticuerpos
monoclonales, o serán capaces de identificar los mismos con el uso
de experimentación rutinaria.
Cuando se obtienen anticuerpos contra las
proteínas L1 que mimetizan la antigenicidad de los viriones del
virus del papiloma, los anticuerpos obtenidos contra dichas
proteínas recombinantes son anticuerpos neutralizantes y
protectores. Los anticuerpos son capaces de prevenir la infección
subsiguiente del mismo tipo de virus del papiloma de los que se
derivó la proteína L1. O sea, si se utiliza una proteína
recombinante L1 del virus del papiloma tipo 16 para obtener
anticuerpos, estos anticuerpos protegerán de infecciones
subsiguientes del virus del papiloma tipo 16. Así, el método de la
presente invención proporciona la prevención, tratamiento o
detección de cualquier tipo de HPV.
Los anticuerpos de la invención pueden
utilizarse para determinar tipos de HPV por medio de serotipo como
se describe en Jenson et al, J. Cutan. Pathol.
16:54-59 (1989). La determinación del tipo de HPV
puede ser clínicamente importante para determinar el potencial
biológico putativo de algunas lesiones asociadas con HPV infectadas
productivamente, particularmente lesiones del tracto anogenital
benignas y premalignas de grado bajo. Así, la presente invención
posibilita tratar y prevenir infecciones de cualquier tipo de PV del
cual pueda obtenerse el gen L1 y obtenerse anticuerpos
neutralizantes.
La invención proporciona también composiciones
farmacéuticas ya que los anticuerpos pueden también utilizarse para
tratar infecciones de virus del papiloma en mamíferos. Los
anticuerpos o anticuerpos monoclonales pueden usarse en
composiciones farmacéuticas para dirigir terapias de fármacos a los
lugares de infección de PV. De esta manera, los fármacos o
compuestos de interés están unidos al anticuerpo lo que permite
dirigir los fármacos o los compuestos. Hay métodos disponibles para
unir anticuerpos a fármacos o compuestos. Véase, por ejemplo, el
documento de patente europea EP 0.146.050; el documento de patente
europea 0.187.658; y los documento de patente de Estados Unidos
números 4.673.573, 4.368.149, 4.671.958 y 4.545.988.
Dichas terapias de fármacos incluyen agentes
antivirales, agentes tóxicos y compuestos activados por la luz,
tales como cumarinas, psoraleno, ftalocianinas, azul de metileno,
eosina, tetraciclinas, clorofilas, porfirinas y similares. Dichos
grupos pueden unirse a los anticuerpos con grupos de unión
apropiados. Los conjugados de anticuerpos que contienen un
compuesto activados por la luz se administran seguidos de la
irradiación de las células diana.
Los anticuerpos o conjugados de anticuerpos de
la presente invención pueden formularse según métodos conocidos
para preparar composiciones farmacéuticamente útiles tales como por
una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos
adecuados y su formulación se describen, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences (16ª edición, Osol, A. Ed., Mack Easton PA
(1980)). Para formar una composición farmacéuticamente aceptable
adecuada para una administración eficaz, dichas composiciones
contendrán una cantidad eficaz de anticuerpo, tanto solo, como con
una cantidad adecuada de vehículo.
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Las composiciones terapéuticas o de diagnóstico
de la invención se administrarán a un individuo en cantidades
terapéuticamente eficaces. Esto es, en una cantidad suficiente para
diagnosticar o tratar la infección de PV. La cantidad eficaz
variará según el peso, sexo, edad e historia médica del individuo.
Otros factores incluyen, la severidad del trastorno del paciente,
el tipo de PV, la forma de administración, y similares.
Generalmente, las composiciones se administrarán en dosis en el
intervalo de alrededor de 0,01 a alrededor de 2 picomoles/ml, más
generalmente alrededor de 0,001 a alrededor de 20 picomoles/ml.
Las composiciones preparadas farmacéuticamente
pueden proporcionarse a un paciente por cualquier medio cono-
cido en la técnica incluyendo vía oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarterial, parenteral, etc.
cido en la técnica incluyendo vía oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarterial, parenteral, etc.
Otro aspecto de la presente invención envuelve
el desarrollo de vacunas específicas para un tipo de PV. Las
vacunas de la invención son aquellas que contienen los determinantes
antigénicos necesarios para inducir la formación de anticuerpos
neutralizantes en el hospedante; poseen un gran potencial
inmunogénico; son lo bastante seguras para ser administradas sin
peligro de infección clínica; no tienen efectos secundarios tóxicos;
son adecuadas para su administración por una ruta eficaz, por
ejemplo, oral, intranasal, tópica o parenteral; mimetizan las
circunstancias de la infección natural; son estables en condiciones
de almacenaje a largo plazo; y son compatibles con los vehículos
inertes de vacunas habituales.
Las vacunas de la presente invención incluyen
las proteínas recombinantes L1 de conformación correcta o fragmentos
de las mismas que proporcionan los epítopos conformacionales
presentes en los viriones intactos. Dichas secuencias de
aminoácidos de la proteína L1 comprenden el componente antigénico de
la vacuna. Puede ser necesario o preferible unir covalentemente el
antígeno a un vehículo inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero
bovino o hemocianina de lapa de ojo de cerradura. Las vacunas de la
invención pueden administrarse a cualquier mamífero susceptible de
infección con el virus del papiloma. Seres humanos y mamíferos no
animales pueden beneficiarse como hospedantes.
La administración de las vacunas puede ser
parenteral, pero preferiblemente es oral o intranasal, dependiendo
de la ruta natural de la infección. La dosis administrada puede
depender de la edad, estado de salud, peso, tipo de tratamiento
concurrente, si lo hay, y naturaleza y tipo de virus del papiloma.
La vacuna puede emplearse en formas de dosificación tales como
cápsulas, soluciones líquidas, suspensiones, o elixires, para
administración oral, o formulaciones líquidas estériles tales como
soluciones o suspensiones para uso parenteral o intranasal. Se usa
preferiblemente un vehículo inerte, inmunológicamente aceptable, tal
como solución salina o solución salina tamponada con fosfato.
Las vacunas se administrarán en cantidades
terapéuticamente eficaces. Esto es, en cantidades suficientes para
producir una respuesta inmunológica protectora. Generalmente, las
vacunas se administrarán en dosis en el intervalo de alrededor de
0,1 mg de proteína a alrededor de 20 mg de proteína, más
generalmente alrededor de 0,01 mg a alrededor de 100 mg de
proteína. Puede administrarse una dosis única o múltiples dosis.
El método de la presente invención hace posible
la preparación de vacunas subvirales para prevenir la infección por
el virus del papiloma. Además, siguiendo los métodos de la
invención, pueden hacerse vacunas para cualquier tipo inmunogénico
de virus del papiloma específico.
Como más de un tipo de PV puede estar asociado
con las infecciones de PV, las vacunas pueden comprender aminoácidos
antigénicos L1 de más de un tipo de PV. Por ejemplo, como HPV16 y
18 están asociados con los carcinomas cervicales, una vacuna para
las neoplasias cervicales puede comprender proteína L1 de HPV16; de
HPV18; o de ambos HPV16 y 18.
De hecho, se sabe que una variedad de neoplasias
están asociadas con infecciones de PV. Por ejemplo, HPVs 3a y 10
han sido asociados con las verrugas planas. Se ha descrito que un
número de tipos de HPV están asociados con la epidermodisplasia
verruciformis (EV) incluyendo HPVs 3a, 5, 8, 9, 10, y 12. Se ha
descrito que los HPVs 1, 2, 4, y 7 están asociados con verrugas
cutáneas y los HPVs 6b, 11a, 13, y 16 están asociados con lesiones
de las membranas mucosas. Véase, por ejemplo, Kremsdorf et
al, J. Virol. 52:1013-1018 (1984); Beaudenon
et al, Nature 321:246-249 (1986); Heilman
et al, J. Virol. 36:395-407 (1980); y
DeVilliers et al, J. Virol. 40:932-935
(1981). Así, las formulaciones de vacunas pueden comprender una
mezcla de proteínas L1 de distintos tipos de PV dependiendo de la
protección deseada.
De la misma manera, las composiciones
farmacéuticas pueden contener una mezcla de anticuerpos a distintos
tipos de PV.
Como se ha indicado, la proteína L1 de la
invención puede ser utilizada para serotipar. O sea, pueden
producirse anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar con
proteína L1 de conformación correcta que pueden usarse para
serotipar PV. De esta manera, puede obtenerse tejido o suero de un
paciente y analizarlos en cuanto a su habilidad para
inmunoprecipitar dichos anticuerpos.
En un sentido más amplio, pueden usarse los
anticuerpos como criba serológica. De esta manera, pueden ensayarse
poblaciones de individuos en cuanto a su habilidad para
inmunoprecipitar anticuerpos con la conformación correcta. Pueden
determinarse respuestas específicas a anticuerpos de tipo HPV.
La invención se presta a la formulación de kits,
particularmente para la detección y serotipo de HPV. Dichos kits
comprenderían un transportador compartamentalizado para recibir en
un empaquetado compacto uno o más recipientes, cada recipiente
contendría anticuerpos para un tipo HPV particular o una mezcla de
anticuerpos para una variedad de tipos HPV conocidos. Otros
recipientes pueden contener los medios de detección tales como
sustratos de enzimas, antígenos/anticuerpos marcados y
similares.
Para pruebas serológicas, los kits comprenderán
la proteína recombinante L1 de conformación correcta. Dicho kit
podría también utilizarse para vacunas.
Habiendo hasta ahora descrito la invención en
general, se ofrecen los siguientes ejemplos como ilustración y no
se intenta que sean limitantes a no ser que se especifique de otra
manera.
Los ratones hembra atímicos (nu/nu) se
comercializaron por Harlan Sprague Dawley, Madison WI, y se usaron
para transplantes de xenoinjertos cuando tenían de 6 a 8 semanas de
edad.
Se purificó BPV-1 a partir de
fibropapilomas cutáneos bovinos inducidos experimentalmente como se
describe por Lancaster, W. D. y Olson, D., Demonstration of two
distinct classes of bovine papillomavirus. Virology, 89,
372-279 (1978) Se almacenó el virus a -80ºC hasta
que se usó.
Se inactivaron todas las muestras de suero por
calefacción a 56ºC durante 30 minutos. Se evaluó cada preparación
de anticuerpos en cuanto a su reactividad con partículas intactas y
alteradas de BPV-1 (Tabla I) antes de las pruebas
de transformación de las células C127 inducida por la neutralización
de BPV-1 y las pruebas de xenoinjertos.
Anticuerpos policlonales bovinos. Se obtuvo
suero bovino de terneras tanto vacunadas con proteínas de fusión L1
de BPV-1 como infectadas experimentalmente con
BPV-1.
Se inmunizaron terneras de Holstein X Angus con
diferentes formulaciones de una vacuna recombinante
L1::B-galactosidasa de BPV-1 (Jin,
X. W., Cowsert, L., Marshall D., Reed, D., Pilacinski, W., Lim, L. y
Jenson, A.B., Bovine serological response to a recombinant
BPV-1 major capsid protein vaccine.
Intervirology, 31, 345-354 (1990)). El gen L1
clonado empieza 76 pares de bases por debajo del codon de empiece
del marco de lectura abierto de L1 en el nucleótido 5686 y es unido
terminalmente al gen B-galactosidasa de E.
coli (Pilacinski, W. P., Glassman, D. L., Richard, A. K.
Sadowski, P. L. y Alan, K. R., Cloning and expresión in
Escherichia coli of the bovine papillomavirus L1 and L2 open
reading frames. Bio/Techonol., 2, 356-360
(1984)). Se vacunaron las terneras en los días 0 a 21, y se
enfrentaron por inoculación intradérmica de 2 lugares con 10^{10}
partículas de BPV-1 en el día 56 (Jin, X. W.,
Cowsert, L., Marshall D., Reed, D., Pilacinski, W., Lim, L. y
Jenson, A.B., Bovine serological response to a recombinant
BPV-1 major capsid protein vaccine.
Intervirology, 31, 345-354 (1990)). Se
sangraron las terneras en los días 3 (designado como
pre-sangrado), 55 (sangrado 1) y 104 (sangrado 2)
del ensayo y se probó el suero en cuanto a su reactividad con
partículas intactas y alteradas de BPV-1 por ELISA.
Aunque el 90% y 58% de las terneras desarrollaron respuestas de
anticuerpos a los epítopos cápsidos internos y externos de
BPV-1 respectivamente, todas las terneras
desarrollaron fibromas.
Se inocularon dos novillos (926 y 921),
adquiridos como terneros de una manada secuestrada de reses sin
exposición previa a BPV-1 o BPV-2,
en varios lugares con homogenatos muy finos de fibropapilomas
inducidos por BPV-1. Se desarrollaron
fibropapilomas en los lugares escarificados y persistieron durante
periodos de tiempo variables antes de sufrir una regresión
espontánea. El suero usado en este experimento se recogió durante
los signos más tempranos de regresión del fibropapiloma en ambos
animales.
Anticuerpos policlonales de conejo. Se preparó
antisuero de conejo por inoculación con viriones intactos o de
BPV-1 o BPV-2, o partículas de
BPV-1 desnaturalizadas y después se sangró 2 semanas
después de la inmunización final (Jenson, A.B. Rosenthal, J.D.,
Olson, C., Pass, F.W., Lancaster W.D. y Shah, K., Inmunologic
relatedness of papillomaviruses from different species. J. Nat.
Cancer Inst., 64, 495-500 (1980), Jenson, A.B.
Kurman, R.J. y Lancaster W.D., Detection of papillomavirus
common antigens in lesions of the skin and mucosa. Clinics In
Dermatol., 3, 56-63 (1985); Cowsert, L.M., Lake,
P. y Jenson, A.B., Topographical and conformational epitopes of
bovine papillomavirus type 1 defined by monoclonal antibodies. J.
Nat. Cancer Inst., 79, 1053-1057 (1987)).
Anticuerpos murinos monoclonales. Se usaron
también dos MAbs murinos, 13D6 y JG, para ensayar la neutralización.
El 13D6 reconoce epítopos conformacionales en partículas intactas
de BPV-1, BPV-2 y virus del papiloma
de ciervos (DPV) (Cowsert, L.M., Lake, P. y Jenson, A.B.,
Topographical and conformational epitopes of bovine
papillomavirus type 1 defined by monoclonal antibodies. J. Nat.
Cancer Inst., 79, 1053-1057 (1987)), mientras
que JG reconoce el epítopo tipo BPV-1 específico
lineal interno al cápsido (no se muestran los datos).
Se compararon dos ensayos (xenoinjertos en
ratones atímicos y cultivos de células C127 murinas) en cuanto a su
especificidad para detectar la neutralización mediada por los
anticuerpos de los viriones PV infecciosos.
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Ensayo del xenoinjerto. Para probar la
neutralización de la infectividad de BPV-1, se
añadió una dilución 1:10 de antisuero policlonal en PBS a alícuotas
de BPV-1 infeccioso en PBS y se incubaron durante 1
hora a 37ºC. Se incluyó BPV-1 en PBS solo como
control positivo para la infectividad. Se añadieron a cada dilución
piezas pequeñas de piel fetal bovina (piezas de 5 a 10 de 2- x 2-
mm) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC.
Se transplantaron las piezas pequeñas bajo la
cápsula renal de ratones atímicos y se determinó el tamaño del
quiste (en mm) y morfología de su epitelio de cubierta después de 60
días. Los tamaños de los quistes se calcularon como la media
geométrica de los diámetros (GMDs) calculando la raíz cúbica de la
longitud x anchura x altura de los quistes en mm.
Se realizó el análisis estadístico determinando
las medias de los GMDs de los quistes y fibropapilomas para cada
antisuero y se compararon con los de los controles no tratados
usando la prueba t de Student's.
Ensayo de células C127. Se obtuvieron células
C127 murinas de ATCC, Rockville, MD, y se cultivaron como se
describe por (Dvoretzky, I., Shober, R., Chattopadhy, S.K. y Lowy,
D.R., A quantitative in vitro
focus-forming assay for bovine papillomavirus.
Virology, 103, 369-375 (1980)). Los ensayos de
neutralización se llevaron a cabo en placas Petri (100 mm). Se
sembraron las células C127 a aproximadamente 10^{5} a 5 x 10^{5}
células, a las que se permitió convertirse en de 75 a 80%
confluentes, entonces se incubaron viriones BPV-1
(10^{3} unidades formadoras de focos [FFU]) con o 0,5 ml de DMEM
como control positivo de la infectividad o un volumen igual del MAb
o antisuero policlonal (diluido 1:5) a 37ºC durante 1 hora antes de
la inoculación de las células C127. Después de
1-1/2 horas de adsorción se añadió MEM suplementado
con 10% FBS a cada placa. Se añadió más medio al día siguiente y
después 3 veces cada semana durante de 17 a 19 días, cuando se
fijaron las placas y se tiñeron con azul de metileno al 0,1% en
metanol para contar el número de FF por placa. Los controles
incluyeron suero fetal de ternera y suero de un novillo que no tenía
ningún antecedente de fibropapilomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha comparado la especificidad de 2 sistemas
de ensayo diferentes, xenoinjertos y células C127, para medir la
neutralización de la infección por BPV-1 usando
sueros animales seleccionados y MAbs murinos. Los sueros y MAbs
probados fueron: (1) sueros de conejos y ganado inmunizados y/o
infectados con viriones BPV-1 y
BPV-2 intactos (el sistema inmune estuvo expuesto a
epítopos de superficie del cápsido, tanto conformacionales como
lineales); (2) sueros de conejos y ganado inmunizados con viriones
BPV-1 desnaturalizados y proteínas de fusión L1
respectivamente (el sistema inmune estuvo expuesto a
BPV-1 epítopos de cápsido
desnaturalizados/lineales); (3) sueros seleccionados de seres
humanos que reaccionaron con BPV-1 intacto; y (4)
MAbs que definen epítopos de superficie conformacionales de
BPV-1 y epítopos que son internos al cápsido de
BPV-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sueros evaluados en nuestro estudio fueron
probados inicialmente en cuanto a la reactividad con cápsidos de
BPV-1 tanto intactos como rotos, definiendo así la
situación topográfica de los epítopos correspondientes como externa
o interna al cápsido de BPV-1 como se ha descrito
anteriormente (Cowsert, L.M., Lake, P. y Jenson, A.B.,
Topographical and conformational epitopes of bovine
papillomavirus type 1 defined by monoclonal antibodies. J. Nat.
Cancer Inst., 79, 1053-1057 (1987)). (Tabla
1).
Sueros de conejo producidos contra viriones
BPV-1 o BPV-2 intactos y sueros de
novillos inoculados en sitios múltiples con homogenatos infecciosos
de fibropapilomas inducidos de BPV-1 así como MAb
13D6 reaccionaron primariamente con viriones intactos. Los dos
sueros humanos seleccionados para este estudio reaccionaron
primariamente con partículas de BPV-1 intactas.
Sueros de conejo preparados frente a partículas
víricas BPV-1 alteradas con SDS, y sueros (sangrado
2) de las terneras 163 y 173 al final del ensayo de la vacuna, 48
días después del enfrentamiento con viriones BPV-1,
reaccionaron tanto con las partículas víricas intactas como con las
alteradas. El suero de la ternera 163 (sangrado 1), inmediatamente
antes del enfrentamiento con viriones infecciosos
BPV-1, reaccionó solo con partículas
BPV-1 alteradas. MAb JG reaccionó solo con vriones
BPV-1 alterados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compararon dos ensayos diferentes para la
neutralización de la infectividad de BPV-1 por suero
hiperinmune y MAbs: (i) xenoinjertos en ratones atímicos, y (ii)
cultivos de células C127.
Ensayo de neutralización de xenoinjerto. Se
ensayó antisuero policlonal (no-absorbido) así como
suero de control negativo en cuanto a la neutralización de la
infectividad de BPV-1 de piel fetal bovina
transplantada debajo de la cápsula renal de ratones atímicos. La
neutralización eficaz se determinó por comparación del tamaño del
quiste y por la morfología microscópica (Tabla II).
Partículas pequeñas de piel fetal bovina se
incubaron con BPV-1 que se había preincubado durante
1 hora con diluciones de varios antisueros policlonales. Las
partículas se injertaron subrenalmente en ratones atímicos, y se
determinaron los diámetros de la media geométrica media de los
tamaños de los quistes 60 días más tarde (Tabla II). Se obtuvo una
reducción grande y significativa en el tamaño del quiste con los
sueros de 2 conejos inoculados con BPV-1 o
BPV-2 intactos y con ambos
anti-sueros policlonales de novillos procedentes de
animales con fibropapilomas inducidos por BPV-1 en
estado de regresión.
Ni el anti-suero policlonal de
conejos inoculados con partículas de BPV-1
desnaturalizado ni el suero de pre-sangrado, ni el
suero bovino enfrentado o post-enfrentado del
estudio de vacunación recombinante en terneras tuvieron un efecto
significativo sobre el tamaño del quiste en la dilución probada. El
suero humano y los MAbs reactivos con partículas intactas de
BPV-1 o reactivos con epítopos lineales de
BPV-1 no produjeron la reducción del tamaño del
quiste.
Ensayo de neutralización de células C127. Suero
del pre-sangrado de los conejos y suero del
pre-sangrado de las terneras 163 y 173, suero de
conejo hiperinmune obtenido frente a viriones BPV-1
alterados con SDS, ambos sueros humanos, y los sueros de ternera
(163 y 173) después de su vacunación pero inmediatamente antes del
enfrentamiento con BPV-1, no neutralizaron FF de
células C127 por viriones BPV-1 (Tabla III). Sin
embargo, el suero de conejo producido por inmunización con
BPV-1 y BPV-2 intactos tuvieron
valoraciones de neutralización de 10^{6} y 10^{4}
respectivamente, y el suero de novillo hiperinmune tuvo un título de
neutralización de 10^{6}(926) a 10^{3} (921). Los sueros
de las terneras 163 y 173 al final de la prueba de vacunación
tuvieron un título de neutralización de menos de 10^{1},
probablemente debido a la exposición al virus infeccioso del
enfrentamiento, más que a una respuesta inmune madura frente a la
vacuna.
Ni el suero de ternera fetal ni el suero de
novillo adulto seleccionado de animales no inmunes inhibieron FF en
células C127.
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El sistema de xenoinjerto ha proporcionado un
modelo eficaz para la detección de la neutralización mediada por
anticuerpos de infecciones de PV productivas, que incluye
BPV-1 (Christensen, N. y Kreider, J. W.,
Antibody-mediated neutralization in vitro
of infectious papillomaviruses. J. Virol,
64:3151-3156 (1990). Sin embargo los anticuerpos
neutralizantes también previenen a los viriones de
BPV-1 de inducir FF en células C127 murinas no
productivamente infectadas en cultivos (Dvoretzky, I., Shober, R.,
Chattopadhy, S.K. y Lowy, D.R., A quantitative in vitro
focus-forming assay for bovine papillomavirus.
Virology 103:369-375 (1980)). Para comparar la
especificidad de los dos métodos, y para determinar los epítopos
responsables de la neutralización, se probaron sueros seleccionados
de ganado, conejos y humanos y MAbs murinos en cuanto a su actividad
neutralizante.
Los genomas del virus del papiloma están
encapsidados por las proteínas L1 (cápsido más importante) y L2
(cápsido menos importante) (Banks, L. Matlashewski, G. Pim, D.,
Churcher, M., Roberts, C. y Crawford, L., Expression of human
papillomavirus type-6 and type-15
capsid protein in bacteria and their antigenic characterization. J.
Gen. Virol. 69:3031-3089 (1987), Christensen, N.
Kreider, J. W., Cladel, N. M. y Galloway, D.A., Immunological
cross-reactivity to
laboratory-produced HPV-11 virions
of polysera raised against bacterially derived fusion proteins and
synthetic peptides of HPV-6b and
HPV-16 capsid proteins. Virology
175:1-9 (1990), Cowsert, L. M., Lake, P. y Jenson,
A. B., Topographical and conformational epitopes of bovine
papillomavirus type 1 defined by monoclonal antibodies. J. Nat.
Cancer Inst. 79:1053-1057 (1987), Cowsert, L.M.,
Pilacinski, W.P. y Jenson, A.B., Identification of the bovine
pqpillomavirus L1 gene product using monoclonal antibodies.
Virology 165:613-615 (1988), Doobar, J. y
Gallimore, P.H., Identification of proteins encoded by the L1 and
L2 open reading frames of human pqpillomavirus 1a. J. Virol.
61:2793-2799 (1987), Jin. X.W., Cowsert, L.,
Pilacinski, W. and Jenson, A.B., Identification of L2 open
reading frame gene products of bovine papillomavirus type 1 by
monoclonal antibodies. J. Gen. Virol.
70:1133-1140 (1989), Komly, C.A., Breitburd, F.,
Croissant, O. y Streeck, R.E., The L2 open reading frame of
human papillomavirus type 1a encodes a minor structural protein
carrying type specific antigens. J. Virol. 60:813,816 (1986),
Kreider, J.W., Howett, M.K., Wolfe, S.A., Barlett, G.L., Zaino,
R.J., Sedlacek, T.V. and Mortel, R., Morphological transformation
in vitro of human uterine cervix with papillomavirus from
condylomata acuminata. Nature (Lond.)
317:639-640 (1985), Nakai, Y., Lancaster, W.D.,
Lim, L.Y. y Jenson, A.B., Monoclonal antibodies to genus- and
type-specific papillomavirus structural antigens.
Intervirology 25:30-37 (1986), Roseto, A.,
Pothier, P., Guillemin, M.C., Peries, J., Breitburd, F., Bonneaud,
N. and Orth, G., Monoclonal antibody to the major capsid protein
of human papillomavirus type 1. J. Gen. Virol.
65:1319-1324 (1984)), para formar viriones en los
núcleos de los queratinocitos diferenciados terminalmente.
(Firzlaff, J.M., Kiviat, N.B., Beckmann, A.M., Jenison, A. and
Galloway, D .A., Detection of human pqpillomavirus capsid
antigens in various squamous epithelial lesions using antibodies
directed against the L1 and L2 open reading frames. Virology
164:467-477 (1988), Jenson, A.B., Rhosenthal,J.D.,
Olson, C., Pass, F.W., Lancaster, W.D. and Shah, K., Immunologic
relatedness of papillomaviruses from different species. J. Nat.
Cancer Inst. 64:495-500 (1980), Lim, P.S.,
Jenson, A.B., Cowsert, L., Nakai, Y., Lim, L. Y. and Sundberg, J.,
Distribution and specific identification of papillomavirus major
capsid protein epitopes by immunocytochemistry and epitope scanning
of synthetic peptides. J. Infect. Dis.
162:1263-1269 (1990), Sandberg, J.P., Junge, R.E. y
Lancaster, W.D., Immunoperoxidase localization of
papillomaviruses in hyperplastic and neoplastic epithelial lesions
of animals. Amer. J. Vet. Res. 45:1441-1446
(1984)). La proteína cápsida L1 de PV en contraste con la proteína
L2, está altamente conservada a través del genero PV (Baker, C.C.,
Sequence analysis of papillomavirus genomes. En: N.P.
Salzman y P.M. Howley (eds.), The papoviridae, Vol. 2, The
papillomaviruses, páginas 321-385, Plenum, New York
(1987). Sin embargo, solamente epítopos lineales y conformacionales
de tipo específico y mínimamente interreactivos de la proteína L1
se han detectado en la superficie del virión por MAbs, Cowsert,
L.M., Lake, P. y Jenson, A.B., Topografical and conformational
epitopes of bovine papillomavirus type 1 defined by monoclonal
antibodies. J. Nat. Cancer Inst. 79:1053-1057
(1987), Cowsert, L.M., Pilacinski, W.P. y Jenson, A.B
Identification of the bovine papillomavirus L1 gene product
using monoclonal antibodies. Virology
165:613-615 (1988) mientras que epítopos lineales
de tipo específico de la proteína L2 parecen ser internos al
cápsido. (Jin. X. W., Cowsert, L., Pilacimki, W. y Jenson, A.B.,
Identification of L2 open reading frame gene products of bovine
papillomavirus type 1 by monoclonal antibodies. J. Gen. Virol.
70:1133-1140 (1989), Komly, C.A., Breitburd, F.,
Croissant, O. y Streeck, R.E., The L2 open reading frame of
humanpapillomavirus type 1a encodes a minor structural protein
carrying type-specific antigens. J. Virol.
60:813,816 (1986), Tomita, Y., Shirasawa, H., Sekine, H. y Simizu,
B., Expression of human papillomavirus type 6b L2 open reading
frame in Escherichia
coli::L2-\beta-galactosidase
fusion proteins and their antigenic properties. Virology
158:8-14 (1987)). En este estudio, solamente los
sueros de conejos inmunizados con viriones intactos de
BPV-l o BPV-2 y el ganado infectado
con homogenatos de fibropapilomas productivamente infectados fueron
capaces de neutralizar la infectividad de BPV-l
tanto en células C127 murinas como en los xenoinjertos.
Aunque el ensayo de neutralización en células
murinas C127 puede ser más cuantitativo, principalmente porque el
ensayo envuelve FF de células únicas en una monocapa, no es más
específico que el sistema de xenoinjerto (Christensen, N. y
Kreider, J.W., Antibody-mediated neutralization
in vitro of infectious papillomaviruses. J. Virol.
64:3151-3156 (1990)), que es mas análogo a la
neutralización de la infección de BPV -1 en el hospedante natural
por vacunación previa con viriones intactos (Jarrett, W.F.H.,
O'Neill, B.W., Gaukroger, J.M., Laird, H.M., Smith K.T. y Campo,
M.S., studies on vaccination against papillomaviruses: a
comparison of purified virus, tumour extract and transformed cells
in prophylactic vaccination. Vet. Rec.
126:449-452 (1990a), Jarrett, W.F.H., O'Neill,
B.W., Gaukroger, J.M., Laird, H.M., Smith, K.T. y Campo, M.S.,
Studies on vaccination against papillomaviruses: the immunity
after infection and vaccination with bovine papillomaviruses of
different types. Vet. Rec. 126:473-475
(1990b)). Los sueros bovinos de terneras vacunadas casi dos meses
después del enfrentamiento con viriones de BPV-1
neutralizaron FF de células C127 inducido por BPV-1,
pero no previnieron el desarrollo de fibropapilomas en los
xenoinjertos. Aunque ambos ensayos se llevaron a cabo usando
alícuotas del mismo suero, las diferencias en personal, manejo de
las muestras, condiciones de infección y neutralización, que se
llevaron a cabo en localizaciones separadas, podrían explicar las
pequeñas diferencias en los resultados.
Los sueros de los conejos y bovino que se
prepararon o frente a cápsidos de BPV-1
desnaturalizado o vacuna de L1 de BPV-1
recombinante, respectivamente, no neutralizaron la infectividad de
BPV-1 en ninguno de los dos ensayos de
neutralización. Ya que estos sueros solamente reconocieron epítopos
L1 de BPV-1 continuos, se concluyó que epítopos de
superficie de BPV-1 linealizados no fueron capaces
de inducir anticuerpos neutralizantes. La actividad neutralizante
en este estudio parece ser grandemente dependiente de los epítopos
conformacionales.
Los 2 sueros humanos que reaccionaron con las
partículas intactas de BPV-1 no previnieron FF
inducido por BPV-1 en células C127 o la
trasformación de la piel fetal bovina en el modelo del xenoinjerto.
Esto sugiere que el suero humano o reconoció un mimeótopo no
neutralizante o epítopos conformacionales de BPV-1
definidos que no están asociados con la neutralización de la
infectividad de BPV-1. No obstante, estos resultados
soportan el concepto de que la exposición significativa a
partículas virales de BPV-1 intactas es necesaria
para la producción de anticuerpos neutralizantes (Jarrett, W.F.H.,
O'Neill, B,W., Gaukroger, J.M., Laird, H.M., Smith, K.T. y Campo,
M.S., studies on vaccination against papillomaviruses: a
comparison of purified virus, tumour extract and transformed cells
in prophylactic vaccination. Vet. Rec.
126:449-452 (1990a), Jarrett, W.F.H., O'Neill,
B.W., Gaukroger, J.M., Laird, H.M., Smith, K.T. y Campo, M.S.,
Studies on vaccination against papillomaviruses: the immunity
after infection and vaccination with bovine papillomaviruses of
different types. Vet. Rec. 126:473-475
(1990b)).
Nuestro estudio revela que la neutralización de
la infectividad de BPV-1 por los anticuerpos del
suero puede medirse o por medio de la prevención de FF en células
C127 o por trasformación de la piel fetal bovina en el modelo de
xenoinjerto. Dado que los resultados de los 2 ensayos fueron
concordantes, se concluye que (1) la neutralización de FF de las
células C127 y la trasformación de la piel fetal bovina en los
xenoinjertos parecen ser ambos verdaderos indicadores de la
capacidad de los anticuerpos para neutralizar la infectividad de
BPV-1, esto es, los anticuerpos reaccionan con la
proteína L1 conformacionalmente correcta; y (2) la neutralización
de FF por células C127 puede usarse para
los estudios de interacción temprana de célula hospedante - virión de BPV-1 para definir los epítopos funcionales.
los estudios de interacción temprana de célula hospedante - virión de BPV-1 para definir los epítopos funcionales.
La proteína L1 de HPV-1 se
expresó debido a que existen varios anticuerpos monoclonales frente
a HPV-1 que reaccionan con epítopos
conformacionales presentes en el virión intacto. Nosotros razonamos
que si hubiéramos sido exitosos en generar la proteína L1 de
HPV-1 con la conformación nativa, estos anticuerpos
monoclonales podrían reaccionar con la proteína L1 expresada,
aislada. Esto confirmaría la habilidad para producir la proteína L1
de conformación adecuada para mimetizar la proteína presente en la
partícula de virus intacta. Para producir un anticuerpo
neutralizante es crítico generar una respuesta inmune frente a los
epítopos conformacionales de los virus del papiloma.
La elección del vector estuvo basada en varios
criterios. Deseábamos tener vectores de expresión que produjeran
niveles altos de la proteína cápsida lo que no solo facilitaría su
uso para vacunas sino que también potencialmente ayudaría a lograr
la formación de cápsido vacío en el núcleo. El vector pSVL y los
vectores de baculovirus ambos usan promotores muy fuertes y se han
usado extensivamente para expresar proteínas. Además, el vector
pSVL contiene un origen SV40 de replicación y, cuando se transfecta
a células cos que expresan el antígeno Large T, se replica a gran
número de copias. La replicación del vector de entrada, combinado
con la gran actividad del promotor viral, produce niveles
extremadamente altos de la proteína expresada. Las células cos son
también permisivas para el ensamblaje de los viriones SV40 y
podrían potencialmente facilitar el ensamblaje de las partículas
PV. El sistema de baculovirus también ofrece la ventaja de que un
mayor porcentaje de células pueden ser inducidas a expresar la
proteína (debido al uso de la infección más que a las técnicas de
transfección). Mientras que el baculovirus es un virus de insecto y
crece en células de insecto (Sf9), estas células retienen muchos de
los mecanismos eucarióticos para el procesamiento de proteínas
(glicosilación y fosforilación) que podrían ser importantes para
generar proteínas de la conformación apropiada.
El esquema para el clonado de la proteína L1 de
HPV-1 en pSVL se muestra en la Fig. 1.
La expresión de la proteína L1 de
HPV-1 por pSVL se ensayó primero por
inmunofluorescencia. Las células cos se transfectaron con
1-10 \mug del plásmido mostrado en la Fig. 1.
Después de 48 horas, las células se fijaron con metanol frío y
después reaccionaron con o ascitos de ratón no inmunes (a),
antisuero de conejo generado frente a BPV-1
alterado por SDS (b), o con el anticuerpo monoclonal de ratón 405D5
que reconoce un tipo específico, el epítopo conformacional en
HPV-1. Se observó un teñido nuclear positivo con
ambos anticuerpos y estaba ausente en las células no transfectadas.
Además, las células que expresaban L1 fueron también reactivas con
varios anticuerpos monoclonales adicionales que reaccionan
específicamente con epítopos conformacionales independientes (datos
no mostrados). Después de la transfección las células cos se fijaron
con metanol y se tiñeron para reactividad con cualquier suero de
conejo control, el antisuero Dako generado frente a viriones de
BPV-1 alterados con SDS, o el anticuerpo monoclonal
de ratón 405D5 que reacciona específicamente con epítopos
conformacionales de viriones HPV-1. Cuatro
anticuerpos monoclonales adicionales específicos para la
conformación dieron un patrón de inmunofluorescencia idéntico y
claramente indican que la proteína L1 sintetizada en las células
cos retienen los epítopos conformacionales. Además, la proteína L1
muestra la localización intranuclear anticipada, reflejando el
procesamiento y la traslocación apropiada de esta proteína. Este
resultado demuestra que el epítopo conformacional identificado por
el anticuerpo 405D está presente enteramente en la proteína L1 (más
que en la L2 o una combinación de L1/L2) Más importante, la
reactividad de L1 con este anticuerpo monoclonal demuestra que la
proteína L1 ha retenido un epítopo conformacional idéntico al
encontrado en su estado asociado al virión. Experimentos de
microscopía de electrones están actualmente siendo llevados a cabo
para evaluar si la proteína L1 se ensambla en las partículas
virales vacías. Por tanto, el vector pSVL es exitoso en producir la
proteína L1 de HPV-1 con una conformación nativa
para generar respuestas de anticuerpos que reaccionan con
partículas de virus intactas.
La síntesis de la proteína L1 se determinó
también por inmunoprecipitación de células cos transfectadas.
Después de 48 horas de la transfección, las células cos se marcaron
metabólicamente con metionina S-35 y cisteína
durante 4 horas, se extrajeron con tampón RIPA, y se
inmunoprecipitaron con antisuero de conejo generado frente a
BPV-1 alterado con SDS (Dako). Usamos este
anticuerpo para inmunoprecipitaciones ya que la solubilización de
la proteína L1 con detergentes desnaturalizantes puede impedir su
reconocimiento por el anticuerpo L1 dependiente de la conformación
descrito anteriormente. Un SDS-PAGE de los
inmunoprecipitados indica que la proteína L1 sintetizada es de
longitud completa (55 kD). Esta serie de experimentos de
inmunofluorescencia e inmunoprecipitación demuestran por tanto que
el vector pSVL podrá generar la proteína L1 que será adecuada para
inducir anticuerpos dependientes de la conformación.
Las infecciones del virus del papiloma causan
verrugas cutáneas y condiloma de la mucosa en una amplia variedad
de animales vertebrados (Olson, C., en "The papovaviridae"
(N.P. Salzman y P. M. Howley, Eds.), páginas 39-66,
Plenum Press (1987) y, en seres humanos, están fuertemente asociadas
con el desarrollo de displasia cervical y carcinoma (Jenson, A. B.,
y Lancaster, W. D., en "Papillomaviruses and Human cancer" (H.
Pfister, Ed.) páginas 11-43, CRC Press (1990)).
Cada tipo de virus del papiloma es altamente específico para la
especie y preferiblemente infecta el epitelio escamoso en un número
restringido de localizaciones anatómicas. La replicación del ADN
viral vegetativo ocurre en el núcleo de queratinocitos diferenciados
terminalmente donde el genoma viral es encapsidado por las
proteinas cápsidas más importante (L1) y menos importante (L2),
formando viriones de 55 nm de diámetro. Desafortunadamente, no hay
sistemas de cultivo tisular que permitan la diferenciación de
queratinocitos suficiente para propagar los virus del papiloma
in vitro y esta limitación ha comprometido el análisis de la
expresión tardía de los genes de L1 y L2 así como también la
caracterización de la respuesta inmune del hospedante para sus
productos génicos.
Debido al papel etiológico que los virus del
papiloma humano (HPV's) juegan en algunas malignidades humanas, se
ha focalizado la atención recientemente en el desarrollo de una
vacuna de proteína cápsida recombinante para reducir la incidencia
de la infección de HPV y sus secuelas neoplásicas. El primer modelo
animal para una vacuna potencial utilizó el virus de papiloma
bovino tipo 1 (BPV-1). La proteína L1 de
BPV-1 se expresó en bacterias (Pilacinski, W.P.,
Glassmam, D. L., Krzyzek, R.A., Sadowsky, P. L., y Robbins, A.K.,
Biotechnology 2:356-360 (1984) y se usó para
inmunizar al ganado frente al enfrentamiento viral subsiguiente
(Pilacinski, W.P., Glassmam, D. L., Glassman, K.L., Read, D.E.,
Lum, M.A., Marshall, R.F., y Muscoplat, C.C., en
"Papillomaviruses: molecular and clinical aspects" (T.R.
Broker y P.M. Howley, Eds., páginas 257-271, Alan R.
Liss, Inc., New York (1985)). Sin embargo, puesto que la proteína
L1 expresada aparentemente carecía de la conformación nativa
(debido a las proteínas de fusión insolubles en forma agregada
sobreexpresadas en las bacterias), no indujo anticuerpos que
pudieran reconocer o neutralizar los viriones de BPV intactos (Jin,
X.W., Cowsert, L., Marshall, D., Reed, D., Pilacinski, W., Lim,
L.Y., y Jenson, A.B., Intervirology 31:345-354
(1990); y Ghim, S., Christensen, N.D., Kreider, J.W., y Jenson,
A.B., Int. J. Cancer 49:285-289 (1991)).
La habilidad de los anticuerpos para neutralizar
los virus del papiloma parece estar relacionada con su habilidad
para reaccionar con epítopos conformacionales de tipo específico en
la superficie del virión (Ghim, S., Christensen, N.D., Kreider,
J.W., y Jenson, A.B., Int. J. Cancer 49:285-289
(1991); Christensen, N.D. y Kreider, J.W., J. Virol.
64:3151-3165 (1990); Christensen, N.D., Kreider,
J.W., Cladel, N.M., Patrick, S.D., y Welsh, P.A., J. Virol.
64:5678-5681 (1990); y Jarrett, W.F.H., O'neil,
B.W., Gaukroger, J.M., Smith, K.T., Laird, H.M., y Campo, M.S.,
Vet. Rec. 126:437-475 (1990)) y, realmente los
estudios previos han demostrado que la respuesta predominante de
los anticuerpos detectada frente a HPV-1 en seres
humanos está dirigida contra tales epítopos conformacionales
(Steele, J.C., y Gallimore, P.H., Virology
174:388-398 (1990); y Anisimová, E., Bartak, P.,
Vlcek, D., Hirsch, I., Brichácek, B., y Vonka, V., J. Gen. Virol.
71:419-422 (l990)). En el estudio actual,
caracterizamos una serie de anticuerpos en cuanto a su reactividad
con epítopos conformacionales de HPV-1 y
demostramos que la proteína L1 de HPV-1 sintetizada
en las células cos expresa estos epítopos conformacionales del
virión. Esta proteína expresada puede, por tanto, ser usada para el
desarrollo de la vacuna así como para técnicas de cribado
serológico.
Los experimentos iniciales se designaron para
caracterizar una serie de anticuerpos policlonales y monoclonales
en cuanto a su reactividad con los viriones HPV-1
que estaban o en un estado intacto (conformación nativa) o en
estado desnaturalizado por SDS (no conformacional). Fue esencial
caracterizar estos anticuerpos con detalle para que pudieran usarse
para evaluar el estado conformacional de la proteína L1 de
HPV-1 expresada. Un compendio de los experimentos
de ELISA y los detalles para el aislamiento y purificación de los
viriones de HPV-1 se presenta en la Tabla IV.
Brevemente, pocillos de placa de microtítulo
fueron recubiertos o con viriones HPV-1 intactos o
alterados con SDS como se describió previamente (Cowsert, L. M.,
Lake, P., y Jenson, A. B., J. Natl. Cancer Inst.
79:1053-1057 (1987) y se usaron para cribar los
antisueros indicados o los anticuerpos monoclonales. Los dos sueros
de conejo hiperinmunes producidos frente a HPV-1
han sido descritos previamente (Pass, F., y Maizal, J. V., J.
Invest. Dermatol. 60:307-311 (1973)); el antisuero
de conejo (R#3) fue generado frente a partículas de
HPV-1 alteradas y el antisuero de conejo (R#7)
frente a partículas intactas. Los cuatro anticuerpos monoclonales
que reconocen epítopos conformacionales en la superficie de las
partículas de HPV-1 fueron amablemente
proporcionados por Dr. P. Pothier (Bourgogn University,
France).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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^{a} Los viriones de HPV-1 se
extrajeron de verrugas plantares productivamente infectadas (Jenson,
A. B., Lim, L.Y., y Singer, E., J. Cutan. Pathol.
16:54-59 (1989)) y fueron purificados por
centrifugación de equilibrio en un gradiente de CsCl (Cowsert,
L.M., Lake, P., y Jenson, A.B., J. Natl. Cancer Inst. 79:
1053-1057 (1987). Los viriones (1,34 g/ml) y las
partículas vacías (1,29 g/ml) se recogieron separadamente, se
dializaron frente a tampón Tris (20 mM Tris, 10 mM PMSF, pH 7,5) y
se almacenaron a -70ºC. Pocillos de placa de microtítulo (Immunolon
II, Dynatech) se recubrieron o con viriones HPV-1
intactos o con viriones HPV-1 alterados por SDS
como se describió previamente (Cowsert, L. M., Lake, P., y Jenson,
A. B., J. Natl. Cancer Inst. 79: 1053-1057 (1987)).
Las placas se lavaron después con PBS conteniendo 0,05% Tween 20
(PBST). Los pocillos de microtítulo se incubaron adicionalmente con
PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (PBSA) durante 1
hora a 37º C para prevenir la unión de la proteína no específica.
Las placas se lavaron nuevamente con PBST e incubaron primero o con
anticuerpos policlonales de conejo o con anticuerpos monoclonales
murinos como anticuerpo primario y subsecuentemente con
anti-IgG de carnero apropiada conjugada con
fosfatasa alcalina diluida 1:1000 en PBSA (Bio-Rad)
durante 1 hora a 37ºC. Después de varios lavados, las placas de
microtítulo se desarrollaron con sustrato de fosfatasa de SIGMA 104
(Sigma) en tampón de dietanolamina (Voller, A., Bidwell, D., y
Barlett, A., en "Manual of clinical inmunology" (N. Rose y H.
Freedman, Eds.) páginas. 359-371. American Society
of Microbiology, Washington, DC (1980) durante 30 minutos a 37ºC.
La absorbancia se midió a 410 nm usando un lector de
Micro-elisa de Dynatech.
^{b}MAB45 es una designación abreviada para
MABDW45 (Yaegashi, N., Jenison, S.A., Valentine, J. M., Dunn, M.,
Taichman, L. B., Baker, D.A., y Galloway, D. A., J. Virol.
65:1578-1583 (1991)).
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo monoclónico (MAB45) define un
epítopo lineal en la superficie del virión HPV-1
(Yaegashi, N., Jenison, S.A., Valentine, J.M., Dunn, M., Taichman,
L.B., Baker, D.A., y Galloway, D. A., J. Virol.
65:1578-1583 (1991) y se obtuvo por la generosidad
del Dr. D. A. Baker (State University de Nueva York, Stony Brook).
Los datos del ELISA indican que el antisuero R#7 indudablemente es
específico para epítopos conformacionales en la superficie del
virión HPV-1 ya que reacciona solamente con viriones
intactos HPV-1. Esto es también cierto para los
anticuerpos monoclonales 334B6, 339B6, 405D5, y D54G10. Por otra
parte, el antisuero R#3 y el monoclónico MAB45 reaccionan también
con viriones desnaturalizados por SDS, demostrando su reactividad
con epítopos no conformacionales lineales (Cowsert, L.M., Lake, P.,
y Jenson, A. B., Natl. Cancer Inst. 79:1053-1057
(1987)).
Para confirmar los resultados del ELISA
mostrados en la Tabla IV, también evaluamos los mismos anticuerpos
en cuanto a su reactividad con viriones HPV-1
alterados como se determinó por Western blotting (Figura 1). Esta
figura demuestra que solamente los anticuerpos que reconocieron los
viriones HPV-1 desnaturalizados por ELISA (R#3 y
MAB45) mostraron reactividad significativa por inmunoblotting con
proteínas de viriones desnaturalizadas por SDS. Sin embargo, los
anticuerpos mostrados en la Tabla IV que reconocen solamente
viriones intactos (R#7, 334B6, 339B6, D54G10, y 405D5) no
exhibieron o exhibieron poca reactividad por análisis de
immunoblotting. Así, dos técnicas independientes verifican la
especificidad de los anticuerpos anteriormente mencionados para
epítopos conformacionales y no conformacionales en el virion
HPV-1.
En un intento de producir proteína L1 aislada
que retuviera los epítopos de conformación del virión críticos,
expresamos la proteína L1 de HPV-1 en células de
mamífero. El gen de HPV-L1 fue amplificado por PCR y
clonado en el vector pSVL como se describió en la Figura 2 usando
técnicas moleculares estándares (Maniatis, T., Frisch, E. F., y
Sambrook, J., en "Molecular cloning: A laboratory manual" Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)).
El plásmido resultante, pSJ1-L1, expresa el gen L1
de HPV-1 a partir de un promotor fuerte tardío de
SV40. Además, el plásmido también contiene el origen de la
replicación de SV40 y, cuando se transfecta en células cos por
precipitación de fosfato cálcico (Graham, F.L., y van der Eb, A.J.,
Virology 52;456-467 (1973)), replica a un alto
número de copias.
Las células cos se evaluaron primeramente en
cuanto a síntesis de la proteína L-1 por técnicas de
inmunoprecipitación usando los anticuerpos anteriores. Después de
48 horas de la transfección, las células cos se marcaron con
metionina S^{35} (NEN, Express ^{35}S Protein Labelling Mix)
durante 4 horas, se lavaron con tampón, y se solubilizaron en
tampón RIPA (que contiene una mezcla de detergentes al 1%
NP-40, DOC, y 0,1% SDS). Los extractos de la célula
fueron entonces inmunoprecipitados con los anticuerpos indicados y
analizados por electroforesis de gel de SDS como se ha descrito
previamente (Goldstein, D. J., y Schlegel, R., EMBO 9;
137-146 (1990). Los datos en la Figura 3 indican
que la proteína L1 pudo ser eficientemente precipitada por
anticuerpos dependientes de la conformación (tales como R#7, 334B6,
339B6, D54G10 y 405D5). En adición, la proteína L1 pudo también ser
inmunoprecipitada con anticuerpos que reconocían epítopos no
conformacionales en la superficie del virión (R#3). Estos
descubrimientos indican que la proteína L1 expresada en células cos
mostró epítopos conformacionales observados previamente solamente
en los viriones intactos. Es también obvio que las condiciones de
extracción de L1 no desnaturalizaron significativamente la
proteína. Como es característico de la proteína L1 aislada de los
viriones directamente, la proteína L1 sintetizada fue
aproximadamente de un tamaño de 57 kD (Doorbar, J., y Gallimore,
P.H. J. Virol. 61:2793-2799 (1987). La retención de
los epítopos conformacionales en tampón RIPA y la habilidad de los
anticuerpos dependientes de la conformación para reaccionar con L1
indican que la purificación por afinidad de la proteína L1 de las
células transfectadas será posible.
Las células cos fueron también evaluadas en
cuanto a síntesis de proteínas de L1 por microscopía de
inmunofluorescencia (Figura 4). Las células, colocadas sobre
cubreobjetos de vidrio en medio de Eagles modificado por Dulbecco
(DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%, se
transfectaron con 10 \mug de ADN de plásmido, 48 horas más tarde
fueron paralizadas con glicerol, lavadas con tampón de fosfato
salino (PBS), y fijadas durante 5 minutos con acetona fría. Las
células se hicieron reaccionar después con las diluciones apropiadas
del anticuerpo primario seguido por IgG de carnero anti conejo o
antiratón conjugada con fluoresceína. Las incubaciones con
anticuerpos primarios o secundarios se llevaron a cabo a temperatura
ambiente durante 1 hora. Después de un lavado de PBS final, los
cubreobjetos se montaron en Elvanol y se observaron con un
microscopio de fluorescencia Olimpus. La presencia de la proteína
L1 en los núcleos de las células fue claramente discernible en
5-10% de las células transfectadas 48 horas después
de la transfección, independientemente de si el anticuerpo primario
reaccionó con los epítopos conformacionales y/o no conformacionales.
Todos los anticuerpos que fueron capaces de inmunoprecipitar L1
fueron también exitosos por inmunofluorescencia. Como se mencionó
previamente, los anticuerpos producidos frente a viriones alterados
reconocen ambos epítopos lineales del virión externo e interno y
por tanto son capaces de reaccionar con partículas intactas (por
ejemplo R#3). Sin embargo, tales anticuerpos no reconocen los
epítopos conformacionales y no son neutralizantes (Guim, S.,
Christensen, N. D., Kreider, J. W., y Jenson, A.B., Int. J. Cancer
49:285-289 (1991)). Así, el patrón de teñido
obtenido con antisuero de conejo para viriones de
HPV-1 nativo (R#7) o viriones de
HPV-1 desnaturalizado (R#3) son indistinguibles.
Estos resultados, por tanto, demuestran inequívocamente que la
proteína L1 sintetizada en las células cos fue de una conformación
similar a aquella encontrada en viriones intactos. En adición, la
proteína claramente translocó al núcleo en un modo normal (Zhou,
J., Doorbar, J., Sun, X.Y., Crawford, L.V., Malean, C.S., y Franzer,
I.H., Virology 185:625-632 (1991)).
Los descubrimientos anteriores sugieren que la
proteína cápsida más importante de HPV-1, cuando se
expresa en la ausencia de otras proteínas virales, puede
precisamente reproducir/mimetizar la antigenicidad de las
partículas virales intactas. Mientras que no podemos estar seguros
de que ninguna partícula viral ensamblada esté presente en las
células cos transfectadas, no hemos sido exitosos en visualizar
tales estructuras por examen microscópico de electrones tanto de
las células transfectadas como de los inmunoprecipitados que
contienen la proteína L1 (datos no mostrados). Aparentemente no es
esencial que haya formación de partícula viral para reproducir los
epítopos conformacionales característicos virales.
Ya que los lugares de neutralización presentes
en los viriones del virus del papiloma consisten predominantemente
en epítopos conformacionales, se infiere de nuestros estudios que la
proteína L1 sintetizada en las células cos podría servir
exitosamente como una vacuna o para la detección serológica y
clasificación de las infecciones del virus del papiloma. Debido a
las similitudes entre los virus del papiloma con respecto a la
organización genética, la estructura del virión, y la secuencia de
aminoácidos de sus proteínas cápsidas, es también probable que
nuestros descubrimientos con L1 de HPV-1 tendrán
aplicación directa para el estudio de otros HPV tales como
HPV-16 y HPV-18 que tienen
importantes papeles de contribución para el desarrollo del carcinoma
cervical.
\newpage
Se inocularon cuatro conejos con homogenatos de
células cos que contenían L1 de BPV-1 intranuclear
conformacionalmente correcto. Cada uno de los 4 conejos recibió
homogenatos de 1X10^{6} células en adyuvante completo de Freund
en el día 0, y 1 X 10^{6} células en adyuvante incompleto de
Freund en los días 14 y 28, y fueron después desangrados en el día
38. El suero presangrado de los 4 conejos dio negativo para
reactividad con viriones de BPV-1 desnaturalizados
e intactos por ELISA. En el día 38, los conejo #1, 2, 3 y 4 se
probaron en cuanto a reactividad con partículas de
BPV-1 intactas y alteradas después de 25 minutos de
incubación con el sustrato como se muestra en la Tabla V.
Claims (22)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Una proteína L1 aislada del virus del papiloma (PV) humano producida con técnicas recombinantes o un fragmento de la misma, en donde dicha proteína o fragmento de la misma proporciona los epítopos conformacionales presentes en los viriones del virus del papiloma humano intactos, y que reacciona con los anticuerpos monoclonales que reaccionan con los viriones intactos HPV pero que no reaccionan con los viriones modificados HPV, y en donde dicha proteína o fragmento de la misma es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes frente a los viriones del virus del papiloma. - 2. La proteína o fragmento de la misma de la reivindicación 1, en donde dicha proteína es la proteína L1 de un virus del papiloma humano o fragmento del mismo que se selecciona del grupo que consiste en HPV 1, 2, 3a, 4, 5, 6b, 7, 8, 9, 10, 11a, 12, 13, 16 y 18.
- 3. La proteína o fragmento de la misma de la reivindicación 2, en donde dicho HPV es 16 o 18.
- 4. La proteína o fragmento de la misma de la reivindicación 2, en donde dicho HPV es 6b o 11a.
- 5. La proteína o fragmento de la misma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína o fragmento de la misma se produce en una célula hospedante eucariota.
- 6. La proteína o fragmento de la misma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína o fragmento de la misma se produce en una célula hospedante de mamífero.
- 7. La proteína o fragmento de la misma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína o fragmento de la misma se produce en un sistema de expresión de baculovirus.
- 8. La proteína o fragmento de la misma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína o fragmento de la misma se produce en células cos.
- 9. Una vacuna para la prevención de la infección del virus del papiloma, dicha vacuna comprende al menos una proteína L1 producida con técnicas recombinantes del virus del papiloma (PV) humano o fragmento de la misma, cuya proteína o fragmento de la misma proporciona los epítopos conformacionales presentes en los viriones del virus del papiloma humano intacto, y reacciona con anticuerpos monoclonales que reaccionan con viriones HPV intactos pero no reacciona con viriones HPV alterados, y en donde dicha proteína o fragmento de la misma es capaz de inducir anticuerpos neutralizantes frente a los viriones del virus del papiloma.
- 10. La vacuna de la reivindicación 9, en donde dicha proteína o fragmento de la misma es producida en un sistema de expresión de baculovirus.
- 11. La vacuna de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que además comprende un vehículo inmunogénico.
- 12. La vacuna de la reivindicación 11, en donde dicho vehículo es albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa de ojo de cerradura.
- 13. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde dicho PV se selecciona de HPV 1, 2, 3a, 4, 5, 6b, 7, 8, 9, 10, 11a, 12, 13, 16 y 18.
- 14. La vacuna de la reivindicación 13, en donde dicha vacuna comprende la proteína L1 o un fragmento de la misma de HPV 16.
- 15. La vacuna de la reivindicación 13, en donde dicha vacuna comprende la proteína L1 o un fragmento de la misma de HPV 18.
- 16. La vacuna de la reivindicación 13, en donde dicha vacuna comprende la proteína L1 o un fragmento de la misma de HPV 16 y HPV 18.
- 17. La vacuna de la reivindicación 13 en donde dicha vacuna comprende la proteína L1 o un fragmento de la misma de HPV-6b o HPV-11a.
- 18. Un método para producir la proteína recombinante o fragmento de la misma de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, que comprende:(a) transformar una célula hospedante que es capaz de expresar una proteína L1 del virus del papiloma o fragmento antigénico en una conformación equivalente a las proteínas L1 expresadas en la superficie de los viriones del virus del papiloma intacto; y(b) cultivar dicha célula hospedante en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína cápsida mayor L1 o un fragmento antigénico de la misma.
- 19. El método de la reivindicación 18, en donde el sistema de expresión comprende un vector de baculovirus.
- 20. El método de la reivindicación 19, en donde la célula hospedante es una célula hospedante eucariota.
- 21. El método de la reivindicación 19, en donde la célula hospedante es una célula de mamífero.
- 22. El método de la reivindicación 19, en donde la célula hospedante es una célula cos.
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