CN102497880A

CN102497880A - 新的人乳头状瘤病毒(hpv)蛋白构建体及其在预防hpv疾病中的用途

Info

Publication number: CN102497880A
Application number: CN2010800386242A
Authority: CN
Inventors: G·J·M·F·P·鲍多瓦; B·D·A·科劳; N·登杜加; S·吉安尼尼; N·P·F·勒克雷尼耶
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2010-06-24
Publication date: 2012-06-13
Also published as: DOP2011000396A; PE20120563A1; WO2010149752A3; CR20120026A; BRPI1014718A2; US20120087937A1; KR20120098580A; CO6480995A2; ZA201109453B; CA2768172A1; SG177269A1; MA33440B1; IL217094A0; MX2011013744A; EA201190327A1; WO2010149752A2; JP2012530505A; EP2445525A2; EA022213B1; CL2011003271A1

Abstract

本说明书提供新的人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白构建体及其在预防HPV疾病中的用途。所述构建体是包含L1蛋白的嵌合蛋白，其中HPVL2肽插入L1蛋白中。可将这类嵌合蛋白质配制成免疫原性例如疫苗组合物，任选与基于HPV L1 VLP的疫苗一起配制。

Description

新的人乳头状瘤病毒(HPV)蛋白构建体及其在预防HPV疾病中的用途

背景

本说明书涉及人疫苗领域。更具体而言，本说明书涉及用于预防或治疗人乳头状瘤病毒(HPV)感染或疾病的药物组合物和免疫原性组合物。

乳头状瘤病毒是高物种特异性的小的DNA肿瘤病毒。人乳头状瘤病毒是感染基底上皮(皮肤或粘膜)细胞的DNA病毒。已经描述了100多种独特的人乳头状瘤病毒(HPV)基因型。HPV一般对皮肤(例如HPV-1和HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)的扁平上皮有特异性，并且通常引起持续数月或数年的良性肿瘤(疣)。

致癌性人乳头状瘤病毒(HPV)型的持续感染是全球女性癌症死亡第二最常见原因子宫颈癌的必然原因。国际间已有共识，即“高危”基因型，包括基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66，可导致子宫颈癌，并且与其它粘膜肛门生殖器癌和头颈癌有关。全世界，HPV-16和HPV-18是主要的致癌型，累计占全部侵袭性子宫颈癌病例的70-80％以上。

被称为“低危”的其它基因型感染，可引起良性或轻度子宫颈组织改变和生长在女性子宫颈、阴道、外阴和肛门以及男性阴茎、阴囊或肛门上的生殖器疣(尖锐湿疣)。它们还会引起需要外科手术的儿童和成人声带上的上皮生长(青少年呼吸道乳头状瘤病或复发性呼吸道乳头状瘤病)。

两种预防性HPV疫苗目前已在许多国家得到许可。两者均使用由独特HPV型的重组L1衣壳蛋白组成的病毒样颗粒(VLP)以预防HPV-16和HPV-18子宫颈癌前病变和癌症。Cervarix^TM(GlaxoSmithKline Biologicals)含有使用杆状病毒表达载体系统在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞底物中产生并用免疫刺激剂3-O-脱酰基-4’-单磷酰脂质A(MPL)和氢氧化铝盐配制的HPV-16和HPV-18VLP。Gardasil^TM(Merck)含有在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中产生并用非晶形羟基磷酸硫酸铝盐(amorphous aluminiumhydroxyphosphate sulphate salt)配制的HPV-16和HPV-18VLP。另外，Gardasil^TM含有涉及75-90％生殖器疣的得自非致癌型HPV-6和HPV-11的VLP。在随机临床试验中已证实，两种疫苗对致癌型HPV-16和HPV-18感染以及相关癌前病变有特定保护作用。

造成引发子宫颈癌的致癌性HPV型的清单至少包括存在于子宫颈癌中的HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和73型(Mahdavi等，2005；Quint等，2006)。

现有疫苗能够提供针对由这些HPV型中的一些所致感染和/或疾病提供不同程度的特定保护。然而具有含有其它HPV型的抗原以进一步提高针对所有引起子宫颈癌的HPV型的覆盖范围，或者可诱导针对相关和无关HPV型的广泛交叉保护的疫苗，可能具有潜在益处。具有进一步有效针对引起皮肤癌的HPV型(例如HPV 5或HPV 8或HPV 38或者这些中的两种或更多种的任何组合)的疫苗，可能具有潜在益处。

除了目前已获批准的L1VLP疫苗外，在例如以下文献中提出将L2的肽用于HPV疫苗：WO 2003/097673；WO 2004/052395；WO2006/083984；WO 2009/001867；Kondo等，2008J Med Virol 80，841-846；Kondo等，2006Virology 358，266-272；Schellenbacher等，2009 25^th International Papillomavirus Conference(2009年第二十五届乳头状瘤病毒国际会议)，5月8-14日，Malmo，Sweden；Coursaget等，25^th International Papillomavirus Conference(第二十五届乳头状瘤病毒国际会议)，5月8-14日，Malmo，Sweden；Slupetzky等，2007Vaccine 25，2001-2010；Xu等，2006 Arch Virol 151，2133-2148；Gambhira等，2007 J Virol 81，13927-13931；Alphs等，2008 PNAS105，5850-5；Kawana等，2003 Vaccine 21，4256-60；Kawana等，2001Vaccine 19，1496-1502。

简述

本说明书涉及含有抗原的针对人乳头状瘤病毒的改进疫苗，所述疫苗提供针对引发其它癌症的HPV型和/或与生殖器疣有关的低危HPV型的保护。改进的疫苗含有嵌合L1多肽，其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽。

在本发明的一个实施方案中，提供人乳头状瘤病毒(HPV)L118型多肽或其片段，其包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。在一个实施方案中，所述多肽包含L2多肽的至少两个肽。

在一个备选实施方案中，本发明提供人乳头状瘤病毒(HPV)L116型多肽或其片段，其含有包含插入HPV L1多肽内的HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。

本发明的嵌合多肽可以壳粒或病毒样颗粒(VLP)提供。这类多肽、壳粒和VLP可配制成免疫原性组合物。本文描述了其制备方法，及其例如在配制用于预防HPV感染的药物中的用途。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含：

(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1病毒样颗粒(VLP)；和

(ii)至少一种嵌合HPV L1多肽、壳粒或VLP，其在L1序列中包含L2肽。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含两种或更多种嵌合HPV L1多肽、壳粒或VLP的组合，各L1在L1序列中包含L2肽。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含：

(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1病毒样颗粒(VLP)；和

(ii)至少一种在L1序列中包含L2肽的嵌合HPV L1多肽、壳粒或VLP，用于预防或治疗HPV感染相关病症。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含两种或更多种在L1序列中包含L2肽的嵌合人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽、壳粒或VLP的组合，用于预防或治疗HPV感染相关病症。

本发明还提供以下用途：

(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1病毒样颗粒(VLP)；和

(ii)至少一种在L1序列中包含L2肽的嵌合HPV L1多肽、壳粒或VLP在制备用于预防或治疗HPV感染相关病症的药物中的用途。

本发明还提供两种或更多种在L1序列中包含L2肽的嵌合HPVL1多肽、壳粒或VLP的组合在制备用于预防或治疗HPV感染相关病症的药物中的用途。

本发明还提供在L1序列中包含两个或更多个L2肽的嵌合HPVL1多肽、壳粒或VLP。

在另一个方面，本发明提供用于诱导人的抗HPV抗体的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。

在另一个方面，本发明提供用于诱导人的抗HPV中和抗体的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。这类方法还可诱导交叉中和抗体。

在另一个方面，本发明提供用于诱导人的针对HPV的细胞免疫的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。

在另一个方面，本发明提供用于诱导人的针对HPV的中和抗体和细胞免疫的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的免疫原性组合物给予人。这类方法还可诱导交叉中和抗体。

本发明还提供用于预防HPV感染或与HPV感染有关的HPV疾病的方法，所述方法包括将本发明的免疫原性组合物给予人。

本发明还提供用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括：将(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1病毒样颗粒(VLP)与(ii)至少一种在L1序列中包含L2肽的嵌合HPV L1多肽、壳粒或VLP和(iii)药学上可接受的稀释剂或载体和任选(iv)佐剂混合，以产生本文所述的免疫原性组合物。本发明还提供用于纯化本文所述嵌合多肽的方法，所述方法包括阴离子交换层析和羟磷灰石层析。

本发明还提供用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将两种或更多种在L1序列中包含L2肽的嵌合HPV L1多肽、壳粒或VLP混合。

本发明还提供制备组合物的方法，所述方法包括将包含插入L1多肽内的L2多肽的肽表位的HPV L1多肽和药学上可接受的稀释剂或载体混合。

附图简述

图1表示HPV 16和HPV 18的C端截短的L1序列。图1(a)和(b)的HPV 16序列和HPV 18序列的氨基酸编号在本说明书全文中分别与HPV 16和HPV 18的L1相关地使用。

图2表示HPV 16和HPV 18L1的暴露环和L2肽插入L1序列的示例性位置。

图3表示在暴露环区和C端侵入臂(invading arm)区中HPV 16、18和其它型的L1序列的比对。最上面的序列是图1所示的HPV 16L1序列。

图4表示各种不同的HPV型的L2肽。

图5表示嵌合L1/L2多肽纯化的流程图。

详述

导言

本说明书涉及用于预防和治疗人乳头状瘤病毒(HPV)感染引发的疾病的组合物和方法。更具体而言，本说明书涉及含有主要衣壳蛋白L1和命名为L2的次要衣壳蛋白的免疫原性组分的嵌合多肽。本文公开的嵌合多肽包括其中插入至少一个L2肽的L1多肽。选择包含L2多肽的至少一个表位的L2肽。

在一个实施方案中，L1多肽是HPV 18型L1多肽。因此，嵌合L1/L2多肽包括其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽的HPV 18型L1多肽或其片段。例如，L2肽可来自18型以外的HPV型(即非HPV 18型L2肽)。有利的是，L1/L2多肽能够诱导对包含L2多肽(从中选出肽)的天然蛋白质的免疫应答。另外，L1/L2多肽可能能够诱导对至少一种其它天然L2蛋白的免疫应答。

在一个实施方案中，L2肽选自HPV L2多肽N端的氨基酸1-200，例如选自HPV L2多肽N端的氨基酸1-150。在具体实施方案中，L2肽选自：包含HPV L2多肽的氨基酸残基17-36的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸残基56-75的肽；包含HPV L2多肽的氨基酸残基96-115的肽；以及包含HPV L2多肽的氨基酸残基108-120的肽。在不同的实施方案中，L2肽包括由SEQ ID NO：1-31表示的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，L2肽由HPV 33型L2的氨基酸17-36(其与HPV11型L2的氨基酸17-36相同)组成。在另一个示例性实施方案中，L2肽由HPV 58型L2的氨基酸56-75(其与HPV 6型L2的氨基酸56-75相同)组成。更概括地讲，可选择包含与至少两种不同HPV型的L2多肽相同的至少8个连续氨基酸(也就是说两种或更多种HPV型之间的共有序列)的L2肽。

在另一个实施方案中，嵌合L1/L2多肽包括其中插入包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽的HPV L116型多肽或其片段。例如，L2肽可包含HPV致癌型(例如HPV 58型)的HPV L2多肽的氨基酸56-75。

在某些实施方案中，与天然L2多肽相比，插入L1多肽以形成嵌合L1/L2多肽的L2肽包含至少一个氨基酸插入、缺失或取代。在一个实施方案中，L2肽具有至少一个氨基酸插入、缺失或取代，其去除两个半胱氨酸之间的二硫键或去除能够形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸。有利的是，包含具有氨基酸插入、缺失或取代的L2肽的多肽能够诱导针对至少一种天然L2蛋白(或天然存在的L2多肽)的免疫应答。

在一个实施方案中，HPV L1蛋白具有一个或多个氨基酸的C端缺失。在某些实施方案中，将L2肽插入L1多肽的暴露区。在不同的实施方案中，暴露环可以是L1多肽的DE环(例如介于氨基酸132-142之间)；FG环(例如介于氨基酸172-182之间)；HI环(例如介于氨基酸345-359之间)；和/或C端(例如介于氨基酸429和445之间)。在一个实施方案中，将两个或更多个L2肽插入L1多肽内。例如，可将两个或更多个L2肽插入相同位点(例如作为一连串的氨基酸或多联体(concatamer))，或者插入不同的位点，例如插入L1多肽的DE环和C端。任选在插入相同位点时，两个或更多个L2肽可通过至少一个其它氨基酸连接，例如通过包含多个氨基酸的间隔基连接。在将两个或更多个L2肽插入L1多肽时，L2肽可相同或不同。通常，L2肽包含天然L2多肽的至少8个连续氨基酸。

在某些实施方案中，将L2肽插入L1多肽而又不缺失L1多肽的氨基酸。在其它实施方案中，将L2肽插入L1多肽同时缺失L1多肽的一个或多个氨基酸。

在一些实施方案中，嵌合L1/L2呈嵌合多肽的超分子装配体(supramolecular assembly)，例如呈多肽颗粒，例如非晶形聚集体，或者更有序的结构，例如壳粒或病毒样颗粒(VLP)或小的非VLP结构。

本说明书的另一个方面涉及编码上述嵌合L1/L2多肽的核酸分子。这类核酸可存在于原核或真核表达载体中。合适的表达载体包括例如重组杆状病毒。可将重组核酸(例如表达载体)导入(例如感染、转染或转化)宿主细胞。这类宿主细胞也是本说明书的特征。可使用这些宿主细胞产生嵌合L1/L2多肽，例如通过使宿主细胞在适于表达重组多肽的条件下复制。然后可任选对多肽进行分离和/或纯化，例如在配制到免疫原性组合物中之前。

本文公开的任何嵌合L1/L2多肽可用于医学，例如作为用于预防或治疗由HPV引起的感染或疾病的免疫原性组合物(例如疫苗)。这些组合物适用于通过将免疫原性组合物给予人受试者而诱导人的抗HPV抗体的方法。有利的是，将免疫原性组合物给予人受试者诱导预防、改善或治疗HPV感染或疾病的抗体。

因此，本说明书还提供用于预防、改善或治疗HPV感染或疾病的免疫原性组合物。这类免疫原性组合物包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的上述嵌合L1/L1多肽(例如蛋白质)、壳粒或VLP。在一些实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。合适的佐剂包括铝盐(例如氢氧化铝)和/或3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。

在一个实施方案中，所述组合物包含：(i)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段或者由之组成的病毒样颗粒(VLP)；和(ii)至少一种含有其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽的人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段的嵌合多肽。本文公开的任何嵌合L1/L2多肽(包括上述超分子装配体、多肽颗粒、壳粒和/或VLPS)适用于含有与嵌合L1/L2多肽组合的VLP的组合物。

在一个实施方案中，用于与嵌合L1/L2多肽组合的VLP由L1多肽或其片段组成。在具体实施方案中，HPV L1VLP是HPV 16 L1 VLP和/或HPV 18 L1 VLP。同样，嵌合多肽还可包含HPV 16 L1多肽或其片段和/或HPV 18 L1多肽或其片段。

在一个实施方案中，示例性实施方案中的这类组合物包含(ii)的至少一种嵌合多肽，其由L2肽插入其中的HPV 16 L1多肽或其片段、HPV 18 L1多肽或其片段或者L2肽插入其中的HPV 16 L1多肽或其片段和HPV 18 L1多肽或片段两者组成。上文公开的嵌合肽可包含L1多肽的C端缺失一个或多个氨基酸的L1多肽。在一个具体实施方案中，免疫原性组合物包含HPV 16 L1 VLP和HPV 18 L1 VLP两者以及具有HPV 16 L1多肽和HPV 18 L1多肽两者的嵌合多肽。在这类实施方案中，具有HPV 16 L1多肽的嵌合多肽和具有HPV 18多肽的嵌合多肽可包含不同的L2肽。示例性L1片段包括没有C端34个氨基酸的HPV 16 L1或没有C端35个氨基酸的HPV 18 L1。

同样，在另一个实施方案中，免疫原性组合物可包含两种或更多种嵌合多肽的组合，所述嵌合多肽包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段与至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。例如，所述组合可包括具有相同或不同L1组分的嵌合多肽。同样，组合中的嵌合多肽可包含相同或不同的L2组分。在一个具体实施方案中，嵌合多肽包含相同HPV型的L1多肽，而L2肽不同。

在示例性制剂中，免疫原性组合物包括10-50μg的各VLP和/或嵌合多肽/人剂量。在一个实施方案中，各VLP和/或嵌合多肽存在的量约20μg。

可通过将至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段和至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的插入肽的嵌合多肽，与至少一种其它嵌合多肽，或与至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1病毒样颗粒(VLP)以及药学上可接受的稀释剂或载体和任选佐剂混合，来制备本文所述免疫原性组合物。

术语

为了便于回顾本说明书的各种实施方案，提供下列术语解释。其它术语和解释可提供于本说明书的上下文中。

除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语具有本说明书所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学的常见术语的定义可参见Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(主编)，The Encyclopedia ofMolecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(主编)，Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

单数术语包括复数的对象，除非上下文另有明确规定。同样，词语“或”意指包括“和”，除非上下文另有明确规定。术语“多种(个)”是指两种(个)或更多种(个)。还要进一步理解的是，对于核酸或多肽，给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似值，为了描述给出。另外，给出的有关物质(例如抗原)的浓度或水平的数值限制意指近似值。因此，如果指明浓度为至少(例如)200pg，则是指此浓度应理解为至少大约(或“约”或“～”)200pg。

虽然类似于或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于实施或检验本说明书，但下面描述了合适的方法和材料。术语“包含”是指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和各种变化应理解为表示含有规定的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤，或一类化合物或一系列步骤，而非排除任何其它的化合物、组合物、步骤或化合物类、组合物类、系列步骤。缩写词“e.g.”源于拉丁文exempli gratia，本文用来表示非限制性实例。因此，缩写词“e.g.”是术语“例如”的同义词。

缩写“HPV”的术语“人乳头状瘤病毒”是指能够感染人的乳头状瘤病毒属(Papillomavirus)的成员。有两大类的HPV(生殖器类和皮肤类)，其每一类都含有按遗传相似性分类的多个病毒“型”或“株”(例如HPV16、HPV 18、HPV 33、HPV 58等)。在本说明书的情况下，术语“型”可用来命名HPV和/或指定HPV型的多肽。在以术语“非”作为开头时，命名的HPV或多肽是所提及的HPV或多肽以外的至少一种其它或另外的HPV型。例如，“HPV 18型L1多肽”是指HPV 18型的L1多肽。相比之下，“非HPV 18型L1多肽”是指HPV 18型以外的任何型的L1多肽。

术语“多肽”是指其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。本文使用的术语“多肽”或“蛋白质”意指包括任何氨基酸序列并包括修饰序列(例如糖蛋白)。术语“多肽”具体是指涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的蛋白质。提及多肽时，术语“片段”是指多肽的部分(即亚序列)。术语“免疫原性片段”是指保留全长参比蛋白质或多肽的至少一个主要免疫原性表位的所有多肽片段。多肽内的方向一般以N端至C端方向列举，由各个氨基酸的氨基和羧基部分的方向确定。多肽从N端或氨基端向C端或羧基端解读。

术语“多核苷酸”和“核酸序列”是指核苷酸长度至少为10个碱基的聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或之一的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。所谓“分离的多核苷酸”是指不与从中得到该多核苷酸的生物的天然存在的基因组中两个与之直接邻接的编码序列(一个位于5′端，一个位于3′端)直接邻接的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。通过参照各个核苷酸单位的连接性定义核酸的5′和3′方向，并根据脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置命名。以5′-3′方向读取多核苷酸序列的信息(编码)内容。

对于核酸、多肽或其它细胞组分，术语“异源”表示该组分存在于非在自然界中正常存在之处和/或它来源于不同的来源或物种。

术语“天然”和“天然存在的”是指在与其天然状态相同的状态下存在的成分，例如蛋白质、多肽或核酸。也就是未经人工修饰的成分。应当理解的是，在本说明书的情况下，有许多天然/天然存在的HPV型(和HPV蛋白和多肽)，例如得自不同的天然存在的HPV型。

在提及核酸或多肽(例如HPV L1或L2核酸或多肽)时，“变体”是不同于参比核酸或多肽的核酸或多肽。通常，变体和参比核酸或参比多肽之间的差异构成与参比物相比按比例为少量的差异。变体核酸可因一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，或者因人工核苷酸类似物的取代而不同于与其进行比较的参比核酸。同样，变体多肽可因一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，或者因氨基酸类似物的取代而不同于与其进行比较的参比多肽。

“抗原”是可以刺激动物产生抗体和/或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射、吸收或以其它方式引入动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指B细胞和/或T细胞对之产生应答的抗原上的位点。“优势抗原表位”或“优势表位”是对其产生功能上重要的宿主免疫应答(例如抗体应答或T细胞应答)的表位。因此，对于针对病原体的保护性免疫应答，优势抗原表位是当被宿主免疫系统识别时产生免遭由该病原体引起的疾病的保护的抗原部分。术语“T细胞表位”是指当与合适的MHC分子结合时被T细胞(通过T细胞受体)特异性结合的表位。“B细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。

“免疫应答”是免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的应答。免疫应答可以是B细胞应答，其导致特异性抗体(例如抗原特异性中和抗体)的产生。免疫应答也可以是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在某些情况下，应答对特定抗原有特异性(即“抗原特异性应答”)。如果抗原来源于病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、降低病原体的感染或减少因病原体感染产生的症状(包括死亡)的免疫应答。可通过例如在噬斑减少测定或ELISA中和测定中抑制病毒复制或噬斑形成，或者体内测定抗病原体攻击的抗性，来测定保护性免疫应答。

“佐剂”是以非特异性方式增强免疫应答产生的物质。常见佐剂包括抗原吸附在其上的无机物(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬浮液；乳液，包括油包水和水包油乳液(及其变化，包括复合乳液和可逆乳液)、脂糖(liposaccharide)、脂多糖、免疫刺激性核酸(例如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll样受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)和这类组分的各种组合。

“免疫原性组合物”是适于给予人或动物受试者(例如在实验情况下)的能够诱导例如针对病原体(例如人乳头状瘤病毒)的特异性免疫应答的物质的组合物。因此，免疫原性组合物包含一种或多种抗原(例如病毒的抗原亚基，例如其多肽)或抗原表位。免疫原性组合物还可包含一种或多种能够诱导或提高免疫应答的其它组分，例如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，给予免疫原性组合物诱导防止受试者免遭由病原体引起的症状或病况的免疫应答。在某些情况下，在受试者暴露于病原体后，通过抑制病原体(例如人乳头状瘤病毒)的复制来预防(或治疗，例如减轻或改善)由病原体引起的症状或疾病。例如，在本说明书的情况下，旨在给予受试者或受试者群以诱导针对人乳头状瘤病毒的保护性或治标性免疫应答的某些实施方案的免疫原性组合物是疫苗组合物或疫苗。

嵌合L1/L2多肽

本发明涉及多肽，所述多肽可配制成疫苗组合物，并且满足对提供针对HPV感染和/或疾病的保护且不同于现有市售疫苗的安全有效的疫苗组合物的需要。具体而言，本发明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽包含其中插入至少一个肽的HPV L1多肽，所述至少一个肽包含HPV L2多肽的抗原表位。

本文公开的HPV L1和L2多肽可来自HPV的任何基因型，特别包括高危的引起癌症的HPV型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68或73和引起生殖器疣的HPV型(例如HPV 6或11)及引起皮肤疣的型，例如HPV5型和HPV8型，甚至与普通疣有关的2型和3型，以及与良性皮肤疣有关的HPV76。

例如，在一个实施方案中，本发明提供人乳头状瘤病毒(HPV)L118型多肽或其片段，其包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。L2多肽的表位是这样的肽，即在适当提供时，其能够诱导可识别人乳头状瘤病毒(例如天然存在的人乳头状瘤病毒)的天然(例如全长)L2多肽的免疫应答。

在另一个实施方案中，提供人乳头状瘤病毒(HPV)L1 16型多肽或其片段，其包含至少一个包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。

L1多肽可以是全长L1多肽。在某些实施方案中，L1多肽是L1的片段，例如通过缺失N端或C端的一个或多个氨基酸而截短的片段。因此，在某些实施方案中，L1多肽是与天然蛋白质(即自然界存在的蛋白质)相比，从其一端或两端除去一个或多个氨基酸的截短物。在一个具体的实施方案中，L1多肽具有C端缺失。图1a中给出示例性的L1 HPV 16序列。图1b中给出示例性的L1 HPV 18序列。

截短的L1蛋白也许能够自组装成例如壳粒或VLP。在电子显微镜下，病毒样颗粒通常类似于HPV病毒。病毒样颗粒通常由72个壳粒组成，而壳粒由呈五聚体单位的5个L1多肽组成。本文使用的至少一种L1蛋白适宜包含截短的L1蛋白，如果多种HPV VLP、嵌合多肽或壳粒存在，则组合物中适宜全部L1蛋白是截短的L1蛋白。截短适宜除去核定位信号。截短适宜为C端截短。C端截短适宜除去少于50个氨基酸，例如少于40个氨基酸。在一个具体的实施方案中，C端截短除去HPV 16的34个氨基酸和HPV 18的35个氨基酸。

本文使用的截短L1蛋白适宜为功能性L1蛋白衍生物或变体。功能性L1蛋白衍生物或变体能够引起免疫应答(任选在适当加入佐剂时)，所述免疫应答能够识别包含全长L1蛋白和/或从中得到L1蛋白的HPV型的病毒(或由全长L1蛋白和/或从中得到L1蛋白的HPV型组成的VLP)。

本文公开的嵌合HPV L1多肽中的L2肽的位置很重要。

在本文公开的任何实施方案中，L2肽可位于L1蛋白的暴露环之一或C端侵入臂上。当L1呈壳粒或病毒样颗粒形式时，存在环和侵入臂(Chen等2000 Mol Cell 5，557-567)。

在本文公开的任何实施方案中，L2肽可位于选自其中位置与图1所示HPV 16和HPV 18 L1参比序列有关的下列L1序列区域的位置上，或者位于另一HPV L1序列的等同位置上：

(i)氨基酸50-61中的BC环

(ii)氨基酸132-142(例如氨基酸132-141，特别是氨基酸137-138)中的DE环

(iii)氨基酸172-182(例如176-182，特别是176-179)中的EF环

(iv)氨基酸271-290(例如272-275，特别是272-273)中的FG环

(v)氨基酸345-359(例如347-350，特别是349-350)中的HI环

(vi)氨基酸429-445(例如HPV 16的423-440，特别是423-424、431-433或437-438和HPV 18的424-425、432-433或439-440)中的C端臂。

在本文公开的任何实施方案中，可将HPV L2肽插入L1序列而又不除去L1氨基酸。或者可将L2肽插入L1序列同时在插入位置除去L1序列的一个或多个氨基酸，例如可以在插入L2肽的位置除去L1序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。因此，L2肽可取代L1序列的一个或多个氨基酸，例如L2肽可将相等长度的L1序列置换成L2肽序列。

如果嵌合L1/L2多肽中存在两个或更多个L2肽，则它们可以是相同HPV型的不同L2肽，或者它们可以是不同HPV型的肽，在这种情况下，它们可来自不同HPV型的相应区域。

在一个实施方案中，将L2肽插入允许装配嵌合多肽的超分子装配体的位点，例如在多肽颗粒中，例如壳粒或病毒样颗粒(VLP)或小的非VLP样结构。例如，为了保持VLP结构，将L2肽在这样的位点插入L1多肽中，即不干扰参与形成参与维持壳粒间相互作用并由此维持VLP构象的二硫桥的位点。可通过电子显微镜术评价这类超分子结构，例如参见Sadeyen等，2003，Virology 309，32-40；Slupetzky等，2007 Vaccine 25，2001-2010；Varsani等，2003，J of Virology 77，8386-8393；Chen等，2000，Deschuyteneer M等，2010，Human Vaccines6：5，407-419。通常，与天然VLP(即其中L1蛋白是全长或截短的，但不含L2肽的VLP)相比，嵌合VLP具有相似或相同的大小。嵌合VLP的直径可为50nm的范围。在备选实施方案中，形成直径20-35nm的小的非VLP结构。

插入L2肽的位点可允许待维持的构象依赖性中和表位的存在。可通过使用以下单克隆抗体来检测中和表位：如HPV 16的V5、H16、E70和U4(Christensen等，2001；Carter等，2003，2006；Day等，2007)和HPV 16的J4(Combita等，2002)。其它中和表位是本领域已知的，并且同样可使用单克隆抗体来鉴定其存在与否。

然而，维持L1多肽上的所有L1中和表位可能不是必需的，例如，尤其在本文所述的还含有非嵌合L1 VLP的组合物中。用于插入L2肽的合适位点将L2肽暴露在L1多肽的表面，特别是当作为VLP提供时，例如表1所示位点。

表1和表2表示可提供合适的L2肽插入位点的HPV L1暴露区(Carter等，2003；Bishop等，2007；Chen等，2000)和这些区内的超变区。适宜将L2肽插入C端侵入臂中，或者插入DE环或FG环或HI环中。适宜将L2肽插入环或C端臂的超变区中。表1所示各区为HPV 16的各区；可在其它HPV型的L1中鉴定类似区，表2中给出了HPV 18 L2的类似区。

表1HPV 16的HPV L1暴露环

L1序列中环内超变区的位置	环名称
		AA 50-61	BC环
AA 132-142	DE环
		AA 172-182	EF环(壳粒桥：Cys 175和Cys 428)
AA 271-290	FG环
		AA 345-359	HI环
AA 429-445	C端(Ct)侵入臂

表2HPV 18L1暴露环

L1序列中环内超变区的位置	环名称
			BC环
AA 132-142	DE环
			EF环(壳粒桥：Cys 175和Cys 428)
AA 271-290	FG环
		AA 345-359	HI环
AA 429-445	C端(Ct)侵入臂

在本文所述的嵌合L1多肽、壳粒或VLP中将L2肽插入或插在免疫显性表位的区域可能是有利的，例如通过V5单克隆抗体识别的HPV 16的表位。这可导致免疫显性表位丧失其免疫显性，使得另一个L1表位可变成免疫显性的，这进而可导致更好的交叉保护。例如在通过V5抗体识别的表位的区域中插入FG环的L2肽可导致该表位丧失其免疫显性，而次显性表位变成免疫显性的。

如果两种或更多种L2肽存在于本文所述组合物中的单独的多肽(或壳粒或VLP)中，则L2肽可在不同HPV型的L1中，或在相同HPV型的L1中。

在一个多肽(或壳粒或VLP)中包含两个或更多个L2肽的实施方案中，可将L2肽插入L1序列中的相同或不同的位点。如果将L2肽插入相同位点，则这可以在相同环中，并且可以在相同环的相同超变区中。在L2肽之间具有短序列段的氨基酸可能是有利的，例如在L2肽之间有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。

选择包含至少一个抗原表位的L2肽。所选择的表位(掺入L1多肽中)一般能够诱导对至少一种天然L2多肽(例如包含存在于选定表位中的氨基酸的L2多肽)的免疫应答。有利的是，嵌合L1/L2多肽能够诱导针对至少一种其它天然L2蛋白的免疫应答。

按照本文所述使用的L2肽可选自下列肽：

包含L2的氨基酸残基17-36的肽；

包含L2的氨基酸残基56-75的肽；

包含L2的氨基酸残基96-115的肽；

包含L2的氨基酸残基108-120的肽。

例如，按照本文所述使用的L2肽可选自下列肽：

由L2的氨基酸残基17-36组成的肽；

由L2的氨基酸残基56-75组成的肽；

由L2的氨基酸残基96-115组成的肽；

由L2的氨基酸残基108-120组成的肽。

图3表示L2氨基酸序列第17-36、56-75、96-115和108-120位的HPV16L2肽以及各种其它HPV型相应区域的L2肽的HPV L2序列。可按照HPV 16L2序列作为参比序列，利用文献中可得到的其它已知HPV型的序列，从其它HPV型设计相应的L2肽(参见SwissProt(Boeckmann等，2003)或Genbank(Benson等，2008))。

本说明书全文中，HPV 16的L2序列用作参比序列以确定从中得到L2序列的区域。编号自N端的氨基酸1开始，其中N端位于本文出现的任何序列的左手端，C端位于右端。在下面具体肽的列表中，还给出了其它HPV型的某些等同肽的实际编号。

L2肽适宜包含任选如本文所述修饰的L2 56-75肽或由之组成，例如SEQ ID NO：8-15或SEQ ID NO：29。L256-75肽在HPV型之间具有显著的序列同一性，即同源性。

本说明书的L2肽可包含SEQ ID NO：1-31所表示的一个或多个或者两个或更多个序列，或者由之组成。

L2肽可选自氨基酸17-36之间的氨基酸的区段(例如20聚体)，例如：

16型：17-QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV-36[SEQ ID NO：1]

52型：16-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV-35[SEQ ID NO：2]

51型：16-QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV-35[SEQ ID NO：3]

6型：16-QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV-35[SEQ ID NO：4]

11型：15-QLYQTCKATGTCPPDVIPKV-34[SEQ ID NO：5]

31型：17-QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI-36[SEQ ID NO：6]

45型：16-DLYRTCKQSGTCPPDVINKV-35[SEQ ID NO：7]

5型：17-HIYQTCKQAGTCPPDVINKV-36[SEQ ID NO：33]

56型：17-QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI-36[SEQ ID NO：34]

L2肽还可选自氨基酸56-75之间的氨基酸的区段(例如20聚体)，例如：

16型：56-GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL-75[SEQ ID NO：8]

6型：55-GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL-74[SEQ ID NO：9]

31型：56-GGLGIGSGSGTGGRTGYVPL-75[SEQ ID NO：10]

33型：55-GGLGIGTGSGSGGRTGYVPI-74[SEQ ID NO：11]

45型：55-GGLGIGTGSGSGGRTGYVPL-74[SEQ ID NO：12]

11型：55-GGLGIGTGAGSGGRAGYIPL-74[SEQ ID NO：13]

35型：56-GGLGIGSGSGTGGRSGYVPL-75[SEQ ID NO：14]

52型：55-GGLGIGTGAGSGGRAGYVPL-74[SEQ ID NO：15]

5型：56-GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL-75[SEQ ID NO：35]

L2肽也可短于20个氨基酸，例如，L2肽可以是大于或等于8个氨基酸的任何数量的氨基酸，例如9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸或至多30个氨基酸(或8和30之间的氨基酸整数)。例如，L2肽可以是氨基酸56-75之间的8个氨基酸的区段，例如下列示例性8聚体。

16型：56-GGLGIGTG-63 [SEQ ID NO：29]

L2肽还可选自氨基酸96-115之间的氨基酸的区段(例如20聚体)，例如：

6型：95-EPVAPSDPSIVSLIEESAII-114[SEQ ID NO：16]

52型：95-EPIGPLEPSIVSMIEETTFI-114[SEQ ID NO：17]

31型：96-DPVGPLDPSIVSLVEESGIV-115[SEQ ID NO：18]

16型：96-DPVGPSDPSIVSLVEETSFI-115[SEQ ID NO：19]

58型：95-DTVGPLDSSIVSLIEESSFI-114[SEQ ID NO：20]

45型：94-EPVGPTDPSIVTLVEDSSVV-113[SEQ ID NO：21]

L2肽还可选自氨基酸108-120之间的氨基酸的区段(例如13聚体)，例如：

16型：108-LVEETSFIDAGAP-120[SEQ ID NO：22]

18型：106-LIEDSSVVTSGAP-118[SEQ ID NO：23]

可通过至少一个氨基酸的添加、缺失或取代，例如通过1、2或若干氨基酸的添加、缺失或取代，来修饰任何上述肽。例如在L2肽17-36中，可缺失两个半胱氨酸之间的区域(22-28)和一个或两个半胱氨酸。给出了HPV 16肽(SEQ ID NO.24和25)的这种修饰。在另一个实例中，位于HPV 51型肽17-36的离C端4个氨基酸(即第32位)的缬氨酸(V)可用异亮氨酸(I)取代，该异亮氨酸是存在于所有上文显示的其它HPV型中这个位置上的氨基酸。

在另一个实例中，可减小56-75的L2肽的大小(例如在SEQ IDNO：29中)，前提条件是维持C端的区域GGLGI(SEQ ID NO：32)，因为已表明这对HPV型之间的交叉反应性很重要(Kondo等，2007)。因此，本文所述L2肽可包含序列GGGLGI。

任选在L2肽的N端或C端还可包含一个或多个氨基酸(例如甘氨酸残基)的间隔基。例如，所述肽还可包含一个或两个或三个添加的间隔基氨基酸，例如在氨基端或羧基端(或在存在两个或更多个L2肽的情况下在连接肽之间)添加的一个或两个或三个氨基酸残基。间隔基一般不具有特殊的生物活性，而是将免疫原性肽与L1序列连接，或保持它们之间的某种最小距离或其它空间关系。与不存在间隔基相比，间隔基对保持L1VLP的正确构象和/或插入L2肽的有效或改进的呈递可能是必需的或有帮助的。

可修饰任何上述肽，例如通过插入(添加)、缺失或取代一个或多个氨基酸。例如，L2肽可掺入不同于天然(即天然存在的)HPV L2序列的L2序列的氨基酸。例如，与天然序列相比，该肽在序列内可具有一个或两个氨基酸插入或取代，或缺失一个或两个或若干氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8个或至多10个氨基酸，例如以除去存在的两个半胱氨酸之间的二硫键和/或半胱氨酸之间的区域。在具体实例中，与天然L2序列相比，本说明书的L2肽中存在的修饰限于1或2个氨基酸插入、缺失或取代，和/或两个半胱氨酸残基之间至多10个连续氨基酸的缺失。

如果在本文所述肽中对L2序列进行修饰，可限制这类修饰，使得该肽中相当比例或至少50％或至少70％或至少90％或至少95％的氨基酸与天然L2序列的氨基酸一致。

备选地或此外，任何特定的L2肽可以是两个或三个或更多个本文所述L2肽的嵌合体。在对L2序列进行任何这些修饰的情况下，维持L2序列的免疫原性特征。也就是说，维持该肽内诱导所需要的免疫应答的L2表位。修饰的目的可以是改进L2肽的性质，例如改进与其它HPV型的L2的交叉反应性。

因此，L2肽可选自下列肽：

(a)相当于L2的氨基酸残基17-36的肽，其包含一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代；

(b)相当于L2的氨基酸残基56-75的肽，其包含一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代；

(c)相当于L2的氨基酸残基96-115的肽，其包含一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代；

(d)相当于L2的氨基酸残基108-120的肽，其包含一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代；其中一个或多个插入、缺失和/或取代是与天然L2多肽相比而言。

以下为具有修饰的L2肽的实例。

16型：17-QLYKTCPPDIIPKV-36[SEQ ID NO：24]

(无两个半胱氨酸之间的可变区(23-28)并缺失1个半胱氨酸)

16型：17-QLYKTCPPDVIPKV-36[SEQ ID NO：25]

(无两个半胱氨酸之间的可变区，缺失1个半胱氨酸，且32位上的Ile被Val取代(I32V)

16型：17-QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV-36[SEQ ID NO：26]

(含有I32V)

51型：16-QLYSTCKAAGTCPPDVINKV-35[SEQ ID NO：27]

(含有V33I)

45型：16-DLYRTCKQSGTCPPDVIPKV-35[SEQ ID NO：28]

(含有N34P)

L2肽还可以是选自两个不同氨基酸区段的多联体，例如选自氨基酸17-36和氨基酸56-75(20聚体)，例如：

16型：17-QLYKTPPDIIPKVGGLGIGTG-63[SEQ ID NO：30]

16型：17-QLYKTPPDVIPKVGGLGIGTG-63[SEQ ID NO：31]

(具有I32V)

由SEQ ID NO：30和31表示的两个肽是两个上述肽的嵌合体，并含有既无半胱氨酸也无半胱氨酸之间的区域(22-28)的肽17-36的区域，以及56-75肽的56-63区域(HPV之间是保守的)。可由其它HPV型构建类似肽。

将是显而易见的是，可在本文所述L1序列中的任何位点上，将任何上文列举的肽包含在本文所述的HPV L1、多肽、壳粒或VLP中。

如果多个L2肽存在于本说明书的组合物中，则它们可以是相同HPV型的两个或更多个不同L2肽，即L2的不同(包括重叠)区域的肽，或者可以是不同HPV型的相同区域(例如17-36区)的两个或更多个不同的L2肽。如果存在多于两个的L2肽，则这可包含相同HPV型的多个肽和不同HPV型的多个肽。

如果本说明书的组合物中存在两个或更多个不同的L2肽，则各肽可存在于不同HPV型的HPV L1 VLP(例如HPV 16 L1 VLP和HPV18 L1 VLP)中，或者它们可存在于相同HPV型的HPV L1 VLP(例如HPV 16 L1 VLP或HPV 18 L1 VLP)中。本文所述L2肽适宜存在于HPV 16和/或HPV 18的HPV VLP中。

在本文公开的任何实施方案中，L2肽适宜包含L2蛋白的至少8个连续氨基酸残基。在本文公开的任何实施方案中，HPV L2肽的长度可为至多30个氨基酸残基。

在本文公开的任何实施方案中，L2肽可选自HPV L2N端的氨基酸1-200，特别是HPV L2的氨基酸1-150。因此，L2肽可包含HPV L2的1-200或1-150区的8个或更多个氨基酸残基，其可以是1-200或1-150区的8个或更多个连续氨基酸残基。

本文使用的术语‘L2肽可包含至少8个氨基酸残基’，是指来源于L2的任何8个或更多个氨基酸的肽，但是肽的长度适宜为至少9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个氨基酸。在一个实施方案中，本说明书的L2肽是少于100个氨基酸、适宜少于50个氨基酸或少于40个氨基酸的短肽。例如该肽的长度可为至多30个氨基酸，或者长度至多20或21个氨基酸。在本文公开的嵌合L1/L2多肽的情况下，全长L2蛋白不被视为L2的肽。

本说明书的L2肽的最低要求是能够诱导对天然L2蛋白的免疫应答的肽。因此，L2肽通常包含L2多肽的至少8个连续氨基酸，并且包含至少一个表位。本说明书的组合物中的一个或多个不同L2肽的长度可为至多25个氨基酸或至多30个或至多40个氨基酸。在一个实施方案中，用于本说明书的组合物的所有不同L2肽的长度为至多25个氨基酸或至多30个或至多40个氨基酸。

本说明书的L2肽适宜能够诱导针对同源HPV感染(即针对所述序列来源于其中的HPV型的感染)的免疫应答。

L2肽适宜能够诱导针对至少两种不同的HPV型的免疫应答。根据核酸相似性按型对HPV进行分类。文献中描述了许多HPV型。因此，在本说明书的情况下，L2肽能够诱导针对指定HPV型的免疫应答，例如特别引用的HPV型，例如HPV 18型(或任何其它引用的HPV型)。另外，在本文公开的嵌合L1/L2多肽的情况下提供的L2肽，还能够诱导针对所引用的HPV型以外的HPV型的免疫应答。为了易于引用，所引用的HPV型以外的HPV型称为“非HPV型”。例如，当所引用的HPV型为HPV 18时，HPV 18以外的任何其它型可称为非HPV18型肽(或多肽或病毒)。同样，对于任何所引用的HPV型，所引用的HPV型以外的任何其它型均可称为非HPV型。

例如，L2肽可诱导针对不同HPV型的一个或多个其它L2蛋白的免疫应答。在本文公开的任何实施方案中，HPV L2肽可能能够诱导针对另一种HPV型的交叉反应性、交叉中和性和/或交叉保护性应答。适宜选择HPV型之间具有高水平(两个(或更多个)型之间大于80％)的序列同一性(“同源性”)的L2肽。在某些情况下，L2肽在型之间的序列同一性大于85％，或型之间的序列同一性大于90％，或型之间的序列同一性大于95％。在某些实施方案中，选择在至少两个HPV型之间的序列同一性为100％的L2肽。这类L2肽在本文称为L2“共有”序列。

例如，在一个具体的实施方案中，L2肽为在HPV 33型和HPV 11型之间是相同(即具有100％序列同一性)的共有序列。例如，在一个具体的示例性实施方案中，共有序列在L2的氨基酸17-36之间是相同的。在另一个实施方案中，L2肽是在HPV 58型和HPV 6型之间是相同的共有序列。例如，在一个具体的示例性实施方案中，共有序列在HPV58型和HPV 6型的氨基酸56-75之间是相同的。

可按照本说明书鉴定能够诱导针对其它HPV型的免疫应答的交叉反应性L2肽。如本文所示，可对不同HPV型的L2序列进行比对以鉴定在HPV型之间具有高相似性的区域(参见图3和本文所示的其它序列)。可获得多个序列程序进行这类比对和鉴定什么位置有序列同源性。这可供选择在目标HPV型中最相似并因此在一些或所有这些HPV型之间有潜在交叉反应性的L2肽。

本说明书的L2肽可以是任何合适的免疫原性L2肽。可通过本领域众所周知的标准技术测试L2肽的免疫原性和交叉反应性。例如，可将肽或含有该肽的嵌合L1多肽、壳粒或VLP注射给模型动物或人，可分别通过例如ELISA或细胞因子分析/测量，进行抗体和/或细胞免疫应答的测量。筛选抗体的方法是本领域众所周知的。ELISA可用来评价抗体的交叉反应性。可采用例如假病毒中和测定，来测试抗体的中和性质和交叉中和性质。合适的假病毒中和测定参见Dessy等，2008和Pastrana等，2004。

另外，已鉴定出许多交叉反应性L2肽。例如已在HPV 16 L2的区域(aa)108-120中发现了HPV 6和16的共有中和表位(Kawana等，1998，1999，2001)。在另一个实例中，用HPV 16的(aa)17-36、56-75、96-115 L2肽对兔免疫可产生交叉中和抗体(Kondo等，2007，2008)。在另一个实例中，在BALB/c小鼠中，在被动免疫和攻击后，HPV 16L2的(aa)17-36被鉴定为保护性和广泛交叉中和表位(Gambhira等，2007)。Alphs等人(2008)在用含有HPV 16 L2的aa 17-36的合成脂肽疫苗进行接种后，在BALB/C小鼠中显示出类似保护。

L2肽适宜为交叉反应性肽，使得它们能够诱导这样的免疫应答，其不仅识别从中得到L2肽的HPV基因型的L2，而且还识别从中得到L2肽的HPV基因型以外的HPV基因型的L2蛋白或L2肽。所述肽适于与一种或两种或更多种其它基因型有交叉反应性，所述其它基因型适宜为与子宫颈癌(例如HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68或73型)或者生殖器疣(例如HPV 6或11)或者皮肤癌(例如HPV 5、8或38)起因有关的基因型。

在一个实施方案中，一种或多种L2肽选自HPV 16型或其修饰形式，并且针对至少一种其它的引起癌症的HPV型(例如选自HPV 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68或73的类型)和/或至少一种引起生殖器疣的HPV型(例如HPV 6或11)和/或至少一种引起皮肤癌的HPV型(例如HPV 5、8或38)有交叉反应性。在另一个实施方案中，一种或多种L2肽选自HPV 18型或其修饰形式。

用于本发明的L2肽适宜能够产生交叉中和免疫应答，即能够中和与从中得到L2肽的HPV型不同的HPV型的HPV的免疫应答。可通过本领域已知测定(例如实施例3中的本文所述假中和测定)测试交叉中和。

L2肽适宜能够提供交叉保护，并且适宜包含适宜为以下HPV型的交叉中和表位：选自HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68或73的与子宫颈癌有关的一种或多种HPV型和/或至少一种引起生殖器疣的HPV型(例如HPV 6或11)和/或至少一种引起皮肤癌的HPV型(例如HPV 5、8或38)。

当L2肽能够产生针对由至少两种HPV型引起的感染/疾病的保护性免疫应答时，适于产生交叉保护。例如，当在嵌合L1/L2多肽的情况下提供时，L2可诱导保护免受L2肽获自其中的HPV型和至少一种其它HPV型的应答。如上所述，当在嵌合L1/L2多肽的情况下选择和提供共有L2肽时，也可发生交叉保护。可使用动物模型，例如Alphs等人(2008)描述的小鼠模型，鉴定针对不同于从中得到L2肽或L1VLP的不同PV型的交叉保护。

可与未接种组相比，通过比较用给定的L2肽接种的个体中一组HPV型感染和/或疾病的发生率(感染为偶发感染或持续感染)，来评价交叉保护。按照本说明书，不需要针对某一型或一组型的完全交叉保护；的确，任何水平的交叉保护均提供益处。观察到的交叉保护水平适宜为，接种组的与非疫苗HPV型有关的感染和/或疾病比类似的非接种组低5％，更适宜感染和/或疾病低高达10％、高达15％、高达20％、高达25％、高达30％、高达35％、高达40％、高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达70％、高达80％、高达90％或甚至高达100％。

可通过检测疫苗组和对照组中对各种HPV型有特异性的核酸的存在情况，来评价交叉保护。可采用例如WO03/014402(US2007031828A1)及其中的参考文献描述的技术进行检测，特别对于HPV DNA的非特异性扩增和DNA类型的随后检测，采用WO99/14377(US6482588B1)和Kleter等(Journal of Clinical Microbiology(1999)，37(8)：2508-2517)中描述的LiPA系统进行，所述文献的全部内容通过引用结合到本文中。然而，可采用任何合适的方法检测样品中的HPV DNA，例如使用对各目标HPV型有特异性的引物的型特异性PCR。合适的引物为技术人员所知，或者只要不同HPV型的序列是已知的，便可容易地构建。

适宜在男性和/或女性群体中观察交叉保护，适宜为对HPV感染呈血清反应阴性或对HPV 16和18呈血清反应阴性的女性，适宜为性活动前青春期女性。

适宜针对以下致癌型观察交叉保护(通过在接种组与对照组中观察到的保护来进行评价)，例如高危癌症型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68或73型组中的任一种，或者高危癌症型组例如任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或甚至全部这些高危癌症型的组合。特别预期这些高危癌症型中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的全部可能组合。

编码L1/L2多肽的核酸

本说明书的另一个特征是编码任何上述嵌合L1/L2多肽的核酸分子。

这类核酸可以是“重组”核酸，其具有不是天然存在的序列或具有由两个本来分开的序列区段的人工组合构成的序列。例如，重组嵌合L1/L2核酸包含与编码HPV L1多肽(或其片段)的至少一个(通常至少两个)核酸区段有效连接的编码HPV L2肽的至少一个核酸序列。可通过化学合成，或者更通常通过人工操作核酸的分离区段，例如通过遗传工程技术，来实现这种人工组合。为保持一致，“重组”蛋白是由重组核酸编码的蛋白质(并且可被导入宿主细胞，例如细菌或真核细胞)。

在某些实施方案中，编码嵌合L1/L2多肽的重组核酸是优化用于在选定的原核或真核宿主细胞中进行表达的密码子。

为了促进复制和表达，可将编码嵌合L1/L2多肽的核酸掺入原核或真核表达载体等载体中。包含编码嵌合L1/L2多肽的核酸的宿主细胞也是本说明书的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，以及许多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母)细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如CHO、VERO和HEK293细胞)。

为了促进复制和表达，可将核酸掺入原核或真核表达载体等载体中。虽然本文公开的核酸可包含在多种载体(包括例如细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；得自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，病毒DNA，例如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒等等)的任一种中，但是最常见的载体为适于产生多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码嵌合L1/L2多肽的核酸通常排列在相对于指导mRNA合成的合适转录控制序列(启动子和任选一个或多个增强子)的附近和取向上。即目标多核苷酸序列与合适的转录控制序列有效连接。这类启动子的实例包括：CMV的即时早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多角体蛋白启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体T7和λP_L启动子以及已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其它启动子。表达载体通常还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包含用于扩增表达的合适序列。另外，表达载体任选包含一个或多个选择标记基因以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状，例如二氢叶酸还原酶或真核细胞培养的新霉素抗性，或例如大肠杆菌的卡那霉素、四环素或氨苄西林抗性。

表达载体还可包含例如改进翻译的效率的其它表达元件。这些信号可包括例如ATG起始密码子和邻接序列。在某些情况下，例如，将翻译起始密码子和相关序列元件与目标多核苷酸序列一起同时插入合适的表达载体中(例如天然起始密码子)。在这类情况下，不需要其它翻译控制信号。然而，在仅插入多肽编码序列或其部分的情况下，提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号用于翻译编码嵌合L1/L2多肽的核酸。将起始密码子置于正确的读框中以确保目标多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以是各种来源的，既可以是天然的也可以是合成的。如有需要，可通过包含对使用中的细胞系统合适的增强子，来进一步提高表达效率(Scharf等(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Bitter等(1987)Methods in Enzymol153：516-544)。

在某些情况下，编码嵌合L1/L2多肽的核酸(例如载体)包含所选择的在导入宿主细胞时增加和/或优化所编码的多肽的表达的一个或多个其它序列元件。例如，在某些实施方案中，编码嵌合L1/L2多肽的核酸包含内含子序列，例如人疱疹病毒5内含子序列(参见例如SEQID NO：13)。已经再三表明，内含子在适当置于重组构建体中时，提高同源和异源核酸的表达。

足以指导本领域普通技术人员产生编码嵌合L1/L2多肽的重组核酸的示例性方法可参见Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates，1992(和2003的增刊)；以及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology：ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，第4版，Wiley&Sons，1999。

编码不同HPV型的HPV L1和L2多肽的示例性核酸序列是本领域众所周知的，例如，许多实例描述于文献中，并且可从GenBank数据库中公开获得。这些可容易地由本领域技术人员使用术语人乳头状瘤病毒(或HPV)和特定蛋白质(例如L1或L2)和目标型，通过适当查询进行确定。可使用这些L1和L2核酸产生编码上文公开的重组嵌合L1/L2多肽的核酸。

编码与示例性L1和L2多肽具有序列同一性的嵌合L1/L2核酸变体(nucleic variant)的其它核酸可由本领域技术人员产生。核酸变体通常编码不同的多肽，这种不同不多于嵌合L1/L2多肽(例如在L1多肽部分中)存在的氨基酸残基的1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％。即编码的多肽与参比嵌合多肽具有至少80％、或85％、更通常至少约90％或更多(例如95％或甚至98％或99％)的序列同一性。本领域技术人员可立即意识到，编码嵌合L1/L2多肽的多核苷酸序列由于遗传密码的丰余性而自身可共有较少的序列同一性。在某些情况下，与其从中衍生的天然存在的多肽的氨基酸序列相比，编码的L1/L2多肽具有一个或多个氨基酸修饰。这类差异可导致一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。变体通常因不多于约1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％的核苷酸残基而不同。例如，编码变体嵌合L1/L2多肽的核酸可包含1个、或2个、或多达5个、或多达约10个、或多达约15个、或多达约50个、或多达约100个核苷酸差异(例如在L1部分中和/或以便编码上述修饰的L2肽)。因此，在编码本文公开的嵌合L1/L2多肽的核酸的情况下，变体与由天然存在的L1和L2组分组成的参比序列通常具有至少80％、或85％、更通常至少约90％或更高(例如95％或甚至98％或99％)的序列同一性。

除了上述变体核酸以外，与编码具有与天然存在的L1和L2多肽相应的L1和L2序列的嵌合L1/L2多肽的一个或多个核酸杂交的核酸，也可用于编码嵌合L1/L2多肽。本领域技术人员应理解的是，除了上述％序列同一性度量以外，两个核酸间的序列相似性的另一个标识是杂交的能力。两个核酸的序列越相似，它们杂交的条件越严格。杂交条件的严格性是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。因此，导致特定严格性程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其Na⁺和/或Mg⁺⁺浓度)决定杂交的严格性，但是洗涤次数也影响严格性。一般选择在规定的离子强度和pH下比特定序列的热解链温度(T_m)低约5℃-20℃的严格条件。T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。核酸杂交的条件和严格性的计算可参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，2001；Tijssen，Hybridization With Nucleic Acid Probes，PartI：Theory and Nucleic Acid Preparation(与核酸探针杂交第I部分：理论与核酸制备)，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993；以及Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology，第4版，John Wiley&Sons，Inc.，1999。

对于本说明书的目的，“严格条件”包括只有杂交分子和靶序列之间的错配小于25％时才可发生杂交的条件。可将“严格条件”分成特定的严格性水平用于更精确的定义。因此，本文使用的“适度严格性(moderate stringency)”条件是错配超过25％序列的分子将不会杂交的条件；“中等严格性(medium stringency)”条件是错配超过15％的分子将不会杂交的条件，而“高严格性”条件是错配超过10％的序列将不会杂交的条件。“极高严格性”条件是错配超过6％的序列将不会杂交的条件。相比之下，在“低严格性”条件下杂交的核酸包括具有少得多的序列同一性或只在核酸短的亚序列内具有序列同一性的核酸。

用于产生L1/L2多肽的方法

可采用用于表达和纯化重组蛋白的已充分完善的方法来产生本文公开的嵌合L1/L2多肽。足以指导本领域技术人员的方法可参见下列参考文献：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，200；以及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，JohnWiley&Sons，Inc.，999。下文提供其它和具体细节。

通过多种众所周知的方法中的任一种，将编码嵌合L1/L2多肽的重组核酸导入宿主细胞，例如电穿孔、脂质体介导的转染(例如使用市售的脂质体转染试剂，例如LIPOFECTAMINE^TM2000或TRANSFECTIN^TM)、磷酸钙沉淀、感染、转染等，这取决于选择的载体和宿主细胞。

因此，包含嵌合L1/L2多肽编码核酸的宿主细胞也是本说明书的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞，例如大肠杆菌，以及许多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母，例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Picchia pastoris))细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(例如CHO和HEK293细胞)。将编码嵌合L1/L2多肽的重组核酸通过例如载体(例如表达载体)导入(例如转导、转化或转染)宿主细胞。如上所述，载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体、杆状病毒等。合适表达宿主的实例包括：细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，例如酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙脉胞菌(Neurosporacrassa)；昆虫细胞，例如Trichoplusia、果蝇属(Drosophila)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)；哺乳动物细胞，例如3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293或鲍斯黑色素瘤(Bowes melanoma)；植物细胞，包括藻类细胞等。

可将宿主细胞培养在为激活启动子、选择转化体或扩增插入多核苷酸序列而酌情改良的常规营养培养基中。例如温度、pH等培养条件，通常为之前与选择以进行表达的宿主细胞一起使用的条件，对本领域技术人员而言是显而易见的并存在于本文所引述的参考文献中，包括例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of BasicTechnique，第3版，Wiley-Liss，New York及其中引用的参考文献。与本发明的核酸对应的表达产物还可在非动物细胞中产生，例如植物、酵母、真菌、细菌等。除Sambrook、Berger和Ausubel以外，有关细胞培养的详情可参见Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culturein Liquid Systems John Wiley&Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(主编)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；FundamentalMethods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)以及Atlas和Parks(主编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。

在细菌系统中，可根据所表达产物的预期用途选择多个表达载体。例如，当需要大量的多肽或其片段以产生抗体时，最好使用指导高水平表达易于纯化的嵌合L1/L2多肽的载体。这类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Straagene)，其中可将目标编码序列(例如上述本发明的多核苷酸)与氨基端翻译起始甲硫氨酸和随后7个产生催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白的β-半乳糖苷酶的残基的序列符合读框地连接到载体中；pIN载体(VanHeeke和Schuster(1989)J Biol Chem 264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)，其中氨基端甲硫氨酸与组氨酸标签符合读框地连接；等等。

同样，在酵母(例如酿酒酵母)中，可以使用含有组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的多个载体以产生所需要的表达产物。有关综述参见Berger、Ausubel和例如Grant等(1987；Methodsin Enzymology 153：516-544)。在哺乳动物宿主细胞中，可使用多个表达系统，包括基于质粒(plasmis)和病毒的系统两者。

任选选择宿主细胞以所需方式调节插入序列表达或加工所表达的蛋白质的能力。蛋白质的这类修饰包括但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂化和酰化)。不同的宿主细胞(例如3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等)具有用于这类翻译后活动的特殊细胞机器和特有机制，可选择以确保导入外源蛋白的正确修饰和加工。

在某些实例中，通过适于在原核细胞(例如大肠杆菌细胞)中导入和表达的载体，将核酸导入细胞。将表达载体导入(例如通过电穿孔)合适的细菌宿主。可获得许多合适的大肠杆菌株，并且本领域的技术人员可选择合适的大肠杆菌株(例如已证实Rosetta和BL21(DE3)株有利于含有编码嵌合L1/L2多肽的多核苷酸序列的重组载体的表达)。

更通常将编码嵌合L1/L2多肽的多核苷酸掺入适于在真核(例如昆虫或哺乳动物细胞)中导入和表达的表达载体。有利的是，这类核酸是经优化的在选定载体/宿主细胞中表达的密码子。

在一个实例中，使用杆状病毒表达载体系统(BaculovirusExpression Vector System，BEVS)将编码嵌合L1/L2多肽的多核苷酸序列导入昆虫细胞。能够感染昆虫细胞的重组杆状病毒可使用市售载体、试剂盒和/或系统产生，例如BD BioScience的BD BaculoGold系统。简单地说，将编码嵌合L1/L2多肽的多核苷酸序列插入pAcSG2转移载体中。然后，宿主细胞SF9(草地贪夜蛾)用pAcSG2-嵌合质粒和含有杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)的线性化基因组DNA的BDBaculoGold共转染。转染后，在pACSG2质粒和杆状病毒基因组之间发生同源重组以产生重组病毒。在一个实例中，嵌合L1/L2多肽抗原在多角体蛋白启动子(pH)的调节控制下表达。可采用其它启动子，例如basic(Ba)和p10启动子，来产生类似转移载体。同样，可采用备选的昆虫细胞，例如与Sf9密切相关的SF21和甘蓝银纹夜蛾(粉纹夜蛾)衍生的High Five细胞系。

对于本文公开的重组嵌合L1/L2多肽的长期高产率生产，通常使用稳定的表达系统。例如，使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体，将稳定表达嵌合L1/L2多肽的细胞系导入宿主细胞。在导入载体后，使细胞在富集培养基中生长1-2天后，将其转移到选择培养基中。选择标记的目的是赋予选择抗性，并且选择标记的存在可供成功表达导入序列的细胞生长和回收。例如，可采用适于所述细胞类型的组织培养技术，使稳定转化细胞的抗性群或集落增殖。任选将用编码嵌合L1/L2多肽的核酸转化的宿主细胞培养在适于表达和从细胞培养中回收编码蛋白质的条件下。

在合适的宿主细胞系转导和宿主细胞生长到适当细胞密度后，通过合适的方法(例如温度变化或化学诱导)诱导选定的启动子，并再将细胞培养一段时间。

然后，回收分泌的多肽产物和/或从培养基中纯化出来。术语“纯化”(例如有关嵌合L1/L2多肽或编码这类多肽的核酸)是指从组合物中除去不需要存在的组分的过程。纯化是相对术语，并不需要从组合物中除去所有痕量的不需要的组分。在蛋白质产生的情况下，纯化包括例如离心、透析、离子交换层析和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀等方法。术语“纯化的”不要求绝对纯度；而是意指相对术语。因此，例如，纯化的多肽(或壳粒或VLP)制备物是其中所述多肽比在其产生环境(例如在其被天然复制或在人工环境中复制的细胞或细胞群内)中更富集的制备物。可以纯化基本纯的嵌合L1/L2多肽的制备物，使得所需要的嵌合多肽占制备物总蛋白含量的至少50％。在某些实施方案中，嵌合L1/L2多肽占制备物总蛋白含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多。

在嵌合L1/L2多肽的产生和纯化中，可通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破坏细胞，并保留所得到的粗制提取物用于进一步纯化。用于蛋白质表达的真核或微生物细胞可通过任何合宜的方法破坏，包括冻融循环、超声处理、机械破坏、或使用细胞裂解剂或本领域技术人员熟知的其它方法。

然后，可通过本领域熟知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物中回收和纯化表达的嵌合L1/L2多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析(例如使用本文所述任何标签系统)、羟磷灰石层析和凝集素层析。在完成成熟蛋白质的构型时，可按需使用蛋白质再折叠步骤。最后，在最终的纯化步骤中可采用高效液相层析(HPLC)。除了上述参考文献以外，多种纯化方法是本领域众所周知的，包括例如以下文献提供的方法：Sandana(1997)Bioseparationof Proteins，Academic Press，Inc.；和Bollag等(1996)Protein Methods，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The Protein Protocols HandbookHumana Press，NJ，Harris and Angal(1990)Protein PurificationApplications：A Practical Approach，Oxford的IRL Press，Oxford，U.K.；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，第2版，Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press，NJ。WO2010/012780(通过引用结合到本文中)描述了纯化HPV 16VLP和HPV 18VLP的方法。可将类似方法应用于本文所述嵌合多肽的纯化中。因此可在还原β巯基乙醇(BME)butter中从宿主细胞中提取嵌合多肽，然后进行阴离子和羟磷灰石层析，然后通过除去BME使所得产物成熟。通过无菌过滤，得到无菌的所得产物。

免疫原性组合物和方法

本说明书的另一个方面涉及含有嵌合L1/L2多肽(或由嵌合L1/L2多肽组成的壳粒或VLP)的免疫原性组合物。这类免疫原性组合物可只包含所述嵌合L1/L2多肽或者包含其与例如其它嵌合L1/L2多肽和/或与VLP(例如L1 VLP)的组合。

在某些实施方案中，上述任何嵌合L1/L2多肽是免疫原性组合物的组分。例如，免疫原性组合物可包含嵌合L1/L2多肽，该多肽包含其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽(例如非HPV 18型L2肽)的HPV 18型L1多肽或其片段。同样，免疫原性组合物可包含嵌合L1/L2多肽，该多肽包含其中插入至少一个包含L2多肽的表位的肽(例如非HPV 16型L2肽)的HPV 16型L1多肽或其片段。在具体实例中，插入HPV 16L1多肽的L2肽包含L2多肽的(就与HPV 16L2的比对命名的)氨基酸56-75(例如由之组成)。用于免疫原性组合物的其它合适的嵌合L1/L2多肽包括任何上述的嵌合L1/L2多肽。

在某些实施方案中，嵌合L1/L2多肽与HPV VLP组合存在于免疫原性组合物中。例如，在一个实施方案中，免疫原性组合物包含：

(i)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段的病毒样颗粒(VLP)；和

(ii)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1或其片段的嵌合多肽，其包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。

在一个实施方案中，嵌合多肽是本文所述多肽。

在一个有利的实施方案中，至少一种VLP包含HPV 16 VLP L1多肽或其片段。在另一个实施方案中，至少一种VLP包含HPV 18 L1多肽或其片段。有利的是在这类组合物中，嵌合多肽装配成超分子装配体(例如壳粒或病毒样颗粒或小的非VLP样结构)。

在一个实施方案中，组合物包含(i)至少一种HPV L1 VLP；和(ii)两种嵌合HPV L1 VLP、多肽或壳粒，其各在L1序列中包含L2肽。在一个有利的实施方案中，两种嵌合L1多肽(或壳粒或VLP)可在相同HPV型(例如HPV 16或HPV 18)的L1多肽中包含不同的L2肽。或者两种嵌合L1多肽、壳粒或VLP可在两种不同的HPV型(例如HPV 16和HPV 18)的L1多肽中包含相同的L2肽。在又一个实施方案中，两种嵌合L1多肽或壳粒或VLP，可在两种不同的HPV型(例如HPV 16和HPV 18和/或HPV 33和HPV 58)的L1多肽中包含不同的L2肽。在具体实施方案中，L2肽可来自HPV 33或HPV 58，并可插入HPV 18L1中。在这类实施方案中，可将不同的L2肽单独插入两种不同的HPV18型L1多肽中，或可将它们插入相同HPV 18型L1多肽的相同或不同的位点中。

在某些实施方案中，包含在本说明书的组合物中的HPV VLP(特别是仅HPV L1的VLP)和嵌合VLP、多肽或壳粒，可包括HPV 6 VLP、HPV 11 VLP、HPV 16 VLP和HPV 18 L1 VLP中的一种或多种。例如它们可包括HPV 16和18、或HPV 6和11、或所有4种HPV型的VLP。HPV L1 VLP和嵌合HPV L1多肽适宜来自HPV 16和/或HPV18。

按照本文使用的嵌合或非嵌合的HPV VLP还可由L2装配，或者它们可以是仅L1的VLP。例如，VLP可由L1和L2多肽的混合物装配(因此与本文公开的其中L2肽插入L1序列的嵌合L1/L2 VLP不同)。或者，VLP可以是本文公开的L1/L2多肽以外的嵌合VLP。例如，这类非L1/L2多肽可包含L1多肽和至少一个L1以外的HPV多肽的其它序列(例如E7)。

可采用本领域的标准方法，例如通过引用结合到本文中的WO03/077942(US7416846)或WO99/13056(US7351533)中公开的方法，由全长HPV L1蛋白或某些L1衍生物(例如片段)形成VLP中的HPV L1或来自本文公开的嵌合多肽的HPV L1。

在本文公开的组合物的一个具体实施方案中，HPV L1 VLP包含HPV 16 VLP和HPV 18 VLP或由之组成，而嵌合HPV L1 VLP包含嵌合HPV 16 L1 VLP或嵌合HPV 18 L1 VLP或两者或者由之组成。如果HPV 16和HPV 18嵌合L1 VLP两者均存在，则各自的L2肽可相同或不同，且可以是本文公开的任何L2肽。

本文公开的免疫原性组合物通常包含至少一种药学上可接受的稀释剂或载体和任选佐剂。免疫原性组合物是当给予动物或人时引起免疫应答的组合物，所述免疫应答可以是保护性免疫应答，其不必完全保护免遭感染或疾病，但却至少降低感染或疾病的发生率。

按本文所述使用的佐剂可包含铝盐。合适的还有刺激Th1型应答的佐剂，例如3脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D MPL)或QS21。佐剂适宜为铝盐，适宜与3D MPL组合，例如氢氧化铝和3D MPL。包含这类佐剂的本说明书的组合物可按例如WO 00/23105(通过引用结合到本文中)所述方法制备。

按本文所述使用的HPV L1 VLP和嵌合HPV L1 VLP可吸附到含铝佐剂上。可将佐剂加入不同的VLP中预吸附后，将不同的VLP混合形成最终的疫苗产品。

免疫原性组合物还可包含铝或铝化合物作为稳定剂，本说明书还涉及稳定化的组合物，其中VLP吸附在铝盐上。VLP适宜在吸附到铝盐上后比不存在铝时随时间变化更稳定。

本文所述免疫原性组合物可作为疫苗通过以下各种途径的任一种给予：例如口服、局部、皮下、粘膜(通常阴道内)、静脉内、肌内、鼻内、舌下、真皮内和通过栓剂。优选肌内和真皮内递送。

多肽和/或壳粒和/或VLP和其它蛋白质的剂量可随个体的状况、性别、年龄和体重、疫苗的给药途径和HPV而变化。

本文所述组合物中存在的多肽和/或VLP的剂量可随个体的状况、性别、年龄和体重、疫苗的给药途径和HPV而变化。量还可随VLP型的数目而变化。适宜递送的VLP量适于产生免疫保护性应答。每个疫苗剂量适宜包含1-100μg的各种VLP，适宜至少5μg，或至少10μg，例如5-50μg的各种VLP，最适宜10-50μg的各种VLP，例如5μg、6μg、10μg、15μg、20μg、40μg或50μg。在某些实施方案中，如果嵌合和非嵌合VLP两者均存在，则这些量反映出各种HPV型存在的总的VLP，即含L2肽的嵌合L1 VLP和不含L2肽的L1 VLP。

例如本说明书的组合物可在单剂量中包含：

30μg HPV 16 VLP

30μg HPV 18 VLP

10μg具有L2肽的嵌合HPV 16 VLP

10μg具有L2肽的嵌合HPV 18 VLP，

其中嵌合HPV 16 VLP和HPV 18 VLP中的L2肽相同或不同，可选自上文所述的来自相同或不同HPV型的L2 56-75和L2 17-36。

在另一个实例中，本说明书的组合物在单剂量中可包含：

20μg HPV 16 VLP

20μg HPV 18 VLP

10-20μg具有L2肽的嵌合HPV 18 VLP

10-20μg具有L2肽的嵌合HPV 16 VLP，

上述组合物适宜还包含佐剂，适宜为铝盐，适宜为氢氧化铝，适宜与Th1佐剂(例如3D-MPL)组合。

本文所述组合物适宜在人或动物受试者中产生针对1、2种或更多种HPV基因型的免疫应答，所述HPV基因型适宜为选自HPV 5、6、8、11、16、18、31、33、35、38、39、45、51、52、56、58、59、66、68和73的任何1、2或3、4、5种或更多种。有利的是，组合物可产生针对HPV 2、3和73型中的一种或多种的免疫应答。

本文所述组合物适宜提供针对1、2种或更多种HPV基因型引起的感染和/或疾病的保护，所述HPV基因型适宜为选自HPV 5、6、8、11、16、18、31、33、35、38、39、45、51、52、56、58、59、66、68和73的任何1、2种或更多种。组合物适宜提供针对至少HPV 16或18的保护，更适宜提供针对HPV 16和18两者的保护。

本文所述组合物适宜提供针对HPV 16和18以及至少一种选自以下的其它HPV型的保护：引起癌症的HPV型、引起生殖器疣的HPV型和引起皮肤癌的HPV型。组合物适宜提供除针对HPV 16和HPV 18以外还针对一种或多种以下HPV型的保护：HPV 5、6、8、11、31、33、35、38、39、45、51、52、56、58、59、66、68和73。

本文所述免疫原性组合物和疫苗可用来治疗或预防HPV感染和/或疾病。例如，免疫原性组合物可在治疗上用于降低导致子宫颈癌或CIN III后遗症的病毒载量和/或感染。因此，本说明书涉及本文所述免疫原性组合物在治疗性治疗HPV感染相关疾病和预防感染或疾病中的用途。本说明书的疫苗的用途适宜用于预防感染和/或疾病。本文使用的术语‘感染’适宜涉及偶发感染(incident infection)和/或持续感染。可通过例如PCR评价感染。本文使用的术语‘疾病’可以是与HPV感染有关的细胞学异常、ASCUS、CIN1、CIN2、CIN3或子宫颈癌。可通过例如，组织学检查或生物标记(例如p16)的分析来评价疾病。

任选免疫原性组合物或疫苗还可与其它HPV抗原(例如早期抗原)或非HPV抗原一起配制或共同给予。这些非HPV抗原适宜地可提供针对其它疾病(最适宜为性传播疾病例如单纯疱疹病毒、衣原体和HIV)的保护。在一个具体实施方案中，疫苗包含HSV的gD或其截短物。这样，疫苗提供针对HPV和HSV两者的保护。

对于本文所述的所有疫苗，该疫苗适宜用于10-15岁、适宜10-13的岁青春期少女的接种。该疫苗还适宜地适于给予0-10岁大的儿科群体。还可在阴道涂片异常后或在去除HPV引起的病变的手术之后，将疫苗给予女性。因此，该疫苗适宜适用于血清反应阴性群体作为预防性疫苗和/或在治疗背景下的血清反应阳性群体。还可将疫苗给予男性。

适宜以2或3次剂量方案，例如分别以0、1月或0、2月或0、3月或0、4月或0、5月或0、6月的方案，或0、1和6月或0、2、6月方案，递送疫苗。接种方案适宜在5-10年、适宜10年后加入加强注射。还可采用具有4次或更多次剂量的其它方案。

疫苗适宜为液体疫苗制剂，但可将疫苗冻干并在给药前复溶。

实施例

实施例1：示例性嵌合L1/L2多肽

采用分子生物学方法产生包含编码下列示例性嵌合L1/L2多肽的核酸的表达载体，并将其概括于下表3中。

表3：

嵌合体1：HPV 18 L1 HPV 58 L2 DE嵌合多肽，其中将L2肽GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL(HPV 58/HPV 6)插入HPV 18的C端截短的L1的第137和138位之间。

嵌合体2：HPV 18 L1 HPV 58 L2 CT嵌合多肽，其中将L2肽GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL(HPV 58/HPV 6)插入HPV 18的C端截短的L1的第432-433位之间。

嵌合体3：HPV 18 L1 HPV 33L2和HPV 58 L2嵌合多肽，其中将L2肽QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(HPV 33/HPV 11)插入HPV 18的C端截短的L1的第137和138位之间，并将L2肽GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL(来自HPV 58或HPV 6)插入HPV 18的C端截短的L1的第432-433位之间。

嵌合体4：HPV 16 L1 HPV 58 L2 CT嵌合多肽，其中将L2肽GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL(HPV 58/HPV 6)插入HPV 16的C端截短的L1的第431和432位之间。

嵌合体5：HPV 16 L1 HPV 33 L2 CT嵌合多肽，其中将L2肽QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(HPV 33/HPV 11)插入HPV 16的C端截短的L1的第137和138位之间。

嵌合体6：HPV 16 L1 HPV 33 L2 P/D嵌合多肽，其中将L2肽QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(HPV 33/HPV 11)插入HPV 16的C端截短的L1的第272和273位之间。

嵌合体7：HPV 16 L1 HPV 33L2和HPV 58L2嵌合多肽，其中将L2肽QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(HPV 33/HPV 11)插入HPV 16的C端截短的L1的第137和138位之间，并将L2肽GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL插入HPV 16的C端截短的L1的第431-432位之间。

嵌合体8：HPV 18 L1 HPV 33 L2 DE嵌合多肽，其中将L2肽QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(HPV 33/HPV 11)插入HPV 18的C端截短的L1的第137和138位之间。

嵌合体9：HPV 18 L1 HPV 33CT嵌合多肽，其中将L2肽QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(HPV 33/HPV 11)插入HPV 18的C端截短的L1的第432-433位之间。

嵌合体10：HPV 16 L1 HPV58 L2嵌合多肽，其中将L2肽GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL(HPV 58/HPV 6)插入HPV 16的C端截短的L1的第431-431位。

实施例2：示例性嵌合体的合成表达、纯化和表征

重组核酸的产生。通过基因合成得到编码实施例1中描述的示例性嵌合L1/L2多肽的核酸后，通过标准遗传操作将其克隆至杆状病毒表达载体中。插入位点概括于表3中。每种L1多肽的C端截短旨在除去核定位信号以及每种L1多肽C端存在的DNA结合结构域(对于HPV 16、18，分别C端缺失34、35个氨基酸)。本文使用的HPV 16和18 L1截短物的氨基酸序列分别见图1a和b。HPV 33和HVP58 L2肽的氨基酸序列见图2(分别为图2(a)、图2(b))。SEQ ID NO：36-45中提供示例性嵌合体的氨基酸序列。

细胞收获。使示例性嵌合多肽在用编码目标HPV 16或18L1/L2嵌合多肽的重组杆状病毒(MOI为0.05-0.5)感染的粉纹夜蛾(HighFive^TM)细胞(以约2 000 000细胞/ml的密度)中表达。在感染后第4天通过低速离心收获细胞。将所得细胞沉淀物保存于-70℃。

抗原提取。在提取和澄清两步方法中，从High Five^TM细胞中提取示例性嵌合多肽。细胞的提取步骤用还原的低渗缓冲液(Tris 20mM+4％β巯基乙醇(BME)，pH 8.5)进行。或者，当提取缓慢时，pH可为8.7，并加入洗涤剂Empigen 2％。使用等于培养物体积一半或相等的体积进行提取。采用在室温下最少半个小时的接触时间。澄清通过离心进行；如果上清液混浊，任选通过Millistak COHC滤器(Millipore)或等同滤器进行过滤。

纯化和表征。对于不同嵌合L1/L2多肽、嵌合多肽，纯化方案非常类似，包括以下步骤：阴离子交换层析((二甲基氨基乙基或三甲基氨基乙基-DMAE或TMAE)和羟磷灰石层析。

超分子形成方案在嵌合多肽之间略有变化，因涉及以下步骤加入NaCl和吐温而略有不同：缓冲液交换和通过Sephadex G25上的凝胶过滤除去BME、过夜成熟和0.22μm除菌过滤。

纯化过程在室温下进行，只是在+4℃下过夜发生的VLP成熟除外。将BME 4％v/v加到除最终以外的缓冲液中以防止VLP形成。将所使用的全部缓冲液在0.22μm滤器上过滤。在各纯化运行前，对凝胶基质进行卫生处理，并在加样前用合适的缓冲液平衡。

阴离子交换层析TMAE或DMAE：将澄清的提取物加到之前在Tris 20mM|NaCl 50mM|4％β巯基乙醇BME缓冲液(pH 8.0±0.2)中平衡的阴离子交换柱(二甲基氨基乙基)上。在洗去未结合多肽后，用线性梯度的Tris 20mM|NaCl 50-250mM|4％β巯基乙醇BME缓冲液(pH 8.0±0.2)进行洗脱。在NaCl梯度内洗脱抗原，在280nm下监测洗脱曲线。通过SDS-PAGE分析所收集的流分。合并L1/L2阳性流分，并在下一柱前保存在+4℃下。

羟磷灰石层析：将前述步骤的洗脱物加到之前在(TRIS20mM|NaCl 180mM|4％BME)缓冲液(pH 8.0±0.2)中平衡的羟磷灰石I型(HA)柱中。

加入样品后，将凝胶用平衡缓冲液洗涤，并用约10倍柱体积(磷酸钠100mM |NaCl 30mM|4％BME)缓冲液(pH 6.0±0.2)洗脱。立即将HA洗脱物用洗脱缓冲液稀释直到40ml后，在室温下保存过夜。

然后，将HA洗脱物加到在(20mM磷酸钠|500mM NaCl，pH 6.0)缓冲液中平衡的Sephadex G25(M)凝胶过滤柱(145ml柱床体积)上。在某些情况下，将缓冲液改变为100mM的NaCl含量)。在280nm(对于多肽)和254nm(对于BME)下监测洗脱曲线。在空体积中收集嵌合L1/L2抗原，而BME在较晚阶段洗脱出来并具有不同于总体积(Vt)的谱。通过在+4℃下保存过夜来进行成熟。成熟后，将含有嵌合L1/L2抗原的Sephadex合并物通过0.22μm无菌滤器过滤并保存在-70℃下。在某些情况下，在过滤前加入0.05％(V/V)吐温80。用于从800ml培养物中纯化嵌合L1/L2抗原的方法的简化流程图见图5a)-e)。

嵌合L1/L2抗原的电子显微镜术(EM)表征。使用电子显微镜术表征正从纯化的嵌合L1/L2多肽形成的颗粒，例如多肽颗粒和/或壳粒和/或VLP，其与由用作对照的C端截短的HPV-16 L1蛋白和HPV-18L1蛋白产生的类似。嵌合VLP的大小可比对照小或大。在其各自的缓冲液(如表3所示)中将纯化的嵌合L1/L2多肽颗粒稀释到50μg/ml。制备样品用于EM负染色分析，该分析按照标准两步负染色方法(Hayat M.A.和Miller S.E.，1990)，使用乙酸双氧铀(UAc)作为造影剂。简单地说，使具有碳包覆的formvar薄膜的镍网格(400目)在室温下浮在样品滴上持续10分钟以供吸附材料。除去过量的溶液，使材料风干少于2分钟。然后将网格短暂(少于30秒钟)浮在蒸馏水滴上以除去可能产生染色沉淀物的盐。将网格转移到按照Harris(Harris，J.R.，1994)制备的染料滴上：补充了1％海藻糖(w/v)的2％UAc(w/v)的水溶液。30秒钟后将网格吸干。使材料完全干燥(超过1小时)，并在LEO ZeissEM912Ω下以100kV检查。以标准100K原始放大倍数对代表性视野拍照，并概括于表4中，EM结果表明，所形成的嵌合L1/L2多肽与#5-L1-HPV16/L2^DE17-36和#8-L1-HPV18/L2^DE17-36以外的由野生型HPV-16或HPV-18 L1 VLP所产生的嵌合L1/L2多肽不同。所形成的颗粒或为VLP期、非晶形结构或小的相对均一的非VLP结构。

表4EM结果概述：嵌合L1/L2多肽

^*洗脱缓冲液

嵌合L1/L2抗原的抗体表征。通过用作包层的从由NeilChristensen博士(Chistensen等，1996，2001)提供的杂交瘤中纯化的H16.V5(中和和构象特异性单克隆抗体；对结合HPV-16 L1 VLP是关键的aa 266-297和339-365)、H18.J4(中和和构象特异性单克隆抗体，HPV-18 L1 VLP上的表位位置未知)或H16.U4(中和和构象特异性单克隆抗体，HPV-16 L1 VLP上的表位未知)，用夹心ELISA进行纯化的L1/L2嵌合构建体的L1组分的抗原表征。该测定用来证实与HPV-16 VLP或HPV-18 VLP的天然制备物相比，各种嵌合L1/L2抗原上的HPV-16或HPV-18构象特异性表位的存在情况。采用直接ELISA，通过用嵌合构建体包被板，接着用抗L2肽氨基酸17-36HPV33/HPV11或56-75 HPV 58/HPV 6的兔多克隆抗体检测，来表征纯化的L1/L2嵌合构建体的L2组分。该测定表明，除#9-L1-HPV18/L2^Ct17-36以外，L2表位充分暴露于嵌合L1/L2多肽的表面上。

表5概括了数据。

ND：未检测。

实施例3：在动物模型中测试嵌合L1/L2抗原的免疫原性和交叉反应性的方法

用单独或与Cervarix一起给予的2或10μg前述嵌合L1/L2多肽肌内免疫(例如以第0、14和42天三次的多剂量方案)BALB/c小鼠(通常每组至少15只小鼠)，接着两周和六周后两次加强免疫。在最后一次免疫后的适当时间之后(例如在第14天)，通过肽和/或蛋白质-ELISA监测由接种诱导的特异性L1抗体应答。可通过肽和/或蛋白质-ELISA监测由接种诱导的特异性和交叉反应性L2抗体应答。通过SoftMaxPro(采用4参数方程)从参照计算ELISA滴度，并表示为EU/ml。

或者，通过肌内单独或与Cervarix一起给予20或100μg前述嵌合L1/L2多肽(例如以在第0、14、28和42天4次的多剂量方案)，对2只新西兰白兔(NZW，1.5-2kg)进行免疫。将嵌合体与按照生产商的方案制备的Specol(得自Cedi Diagnostic)一起配制，Specol是一种用作弗氏佐剂替代品的油包水乳液用于兔的超免疫。

抗VLP血清学(Ig应答)。使用HPV 16 VLP或HPV 18 VLP作为包被抗原，通过ELISA进行抗VLP16或VLP18抗体的定量测定。

表6和7分别概括了小鼠和兔中的数据。

表6：在最后一次免疫后第14天嵌合L1/L2多肽诱导的小鼠抗血清与HPV-16、18 L1 VLP的结合(ELISA)。

LL＝下限；UL＝上限，CI95＝置信区间

100％小鼠血清与HPV16和HPV18 L1 VLP反应，这就表明L2表位的插入不影响HPV-L1应答。

表7：在最后一次免疫后第14天嵌合L1/L2多肽诱导的兔抗血清与HPV-16、18 L1 VLP的结合(ELISA)

100％兔血清与HPV16和HPV18 L1 VLP反应，这就表明L2表位的插入不影响HPV-L1应答。

抗L2肽血清学(Ig应答)。使用同源(L2肽氨基酸17-36HPV33/HPV11或L2肽氨基酸56-75HPV58/HPV6)或异源HPV型的L2肽(2ug/ml)通过ELISA进行抗L2抗体的定量测定，以评价特异性和交叉反应性应答。对于交叉L2抗体应答，使用下列合成的L2肽：HPV-5、6、16、31、35、52和56的氨基酸17-36或HPV-58、45、33、52、5、11、56和35的氨基酸56-75。

HPV-L2-肽ELISA测定

将L2肽(由Eurogentec生产)在PBS中稀释至2μg/ml的终浓度，并在4℃下过夜吸附到96孔微量滴定板(Maxisorp Immuno-plate，Nunc，Denmark)的孔中。然后将板于37℃与PBS+0.1％吐温20+1％BSA(饱和缓冲液)一起温育1小时。将稀释于饱和缓冲液中的血清加入HPV L2肽包被的板中，并于37℃温育1小时30分钟。将板用PBS0.1％吐温20洗涤，并将稀释于饱和缓冲液中的生物素缀合的抗Ig加入各孔中，对于抗小鼠试剂(Dako，UK)于37℃温育1小时，或者对于抗兔试剂(Amersham，UK)于37℃温育1小时30分钟。在洗涤步骤后，在37℃下加入稀释于饱和缓冲液中的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(Dako，UK)，再持续30分钟。按上述所示将板洗涤，并在室温下与0.1％吐温20、0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中的0.04％邻苯二胺(Sigma)0.03％H₂O₂溶液温育20分钟。用2N H2SO4终止反应，并在492/620nm下读数。通过SoftMaxPro(采用4参数方程)从参照计算ELISA滴度，并以EU/ml表示。

HPV-L1ELISA测定

将HPV-16/18L1VLP在PBS中稀释至1μg/ml的终浓度，并于4℃过夜吸附在96孔微量滴定板(Maxisorp Immuno-plate，Nunc，Denmark)的各孔上。然后将板于37℃与PBS+0.1％吐温20+1％BSA(饱和缓冲液)一起温育1小时。将稀释于饱和缓冲液中的血清加入HPV L1肽包被的板中，并于37℃温育1小时30分钟。将板用PBS 0.1％吐温20洗涤4次，并将稀释于饱和缓冲液中的生物素缀合的抗小鼠Ig(Dako，UK)或抗兔Ig(Amersham UK)加到各孔中，并于37℃温育1小时30分钟。在洗涤步骤后，在37℃下加入稀释于饱和缓冲液中的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(Dako，UK)，持续另外30分钟。按上述所示将板洗涤，并在室温下与0.1％吐温20、0.05M柠檬酸缓冲液(pH4.5)中的0.04％邻苯二胺(Sigma)0.03％H₂O₂的溶液温育20分钟。用2N H2SO4终止反应，并在492/620nm下读数。通过SoftMaxPro(采用4参数方程)从参照计算ELISA滴度，并以EU/ml表示。

表8概括了小鼠中的免疫原性数据。

所有嵌合L1/L2多肽抗原在小鼠中诱导显著的剂量依赖性L2抗体应答(滴度范围为1687-18873)。结果表明，第三次免疫后和第四次免疫后之间的免疫原性得到改进(数据未显示)。

表8：在最后一次免疫后第14天嵌合L1/L2多肽诱导的小鼠抗血清与同源L2肽17-36HPV 33或L2-肽56-75肽HPV 58的结合(ELISA)

LL＝下限；UL＝上限，CI95＝置信区间

表9和10分别概括了肽序列17-36和56-75在兔中的ELISA数据。

所有嵌合L1/L2多肽抗原在兔中诱导显著的剂量依赖性特异性和交叉反应性L2抗体应答。L2应答是特异性的，因为用含有L2的氨基酸17-36的嵌合L1/L2多肽免疫的兔的抗血清不与L2的合成L2肽氨基酸56-75交叉反应，反之亦然(数据未显示)。

对于得自L2序列的17-36氨基酸的大部分合成L2肽，观察到良好的交叉反应性(表9)。反应性可能取决于30位的氨基酸：在具有低交叉反应性或无交叉反应性的所有合成氨基酸中，Pro(P)被不同的氨基酸类别(例如S或E)置换(L2-氨基酸17-36HPV-31和-56)。同样，对于所有L2的56-75氨基酸序列的合成L2肽，观察到较好的交叉反应性(表10)。反应性可能取决于70位的氨基酸：被不同氨基酸(例如Ala(A))置换的Thr(T)无交叉反应性(L2-氨基酸56-75 HPV-11、-52和-56)。

表9：在最后一次免疫后第14天嵌合L1/L2多肽诱导的兔抗血清与L2肽17-36的结合(ELISA)

^*17-36HPV11/HPV33表示同源L2肽＝型特异性的

表10：在最后一次免疫后第14天嵌合L1/L2多肽诱导的兔抗血清与L2肽56-75的结合(ELISA)

^*56-75HPV58/HPV6表示同源L2肽＝型特异性的

中和实验。第三和/或第四次免疫后两周，将血清用中和测定缓冲液稀释(8次4倍系列稀释—对于兔血清以1/10开始稀释，而小鼠为1/40)，并与来自与免疫期间使用的HPV型相同和不同的HPV型的感染性假病毒(PsV)混合。使混合物在4℃下反应1小时后，加到之前已接种至少2小时但不超过4.5小时的293TT细胞(30 000细胞/孔)中。用5％CO₂培养72小时后。回收上清液，并测定分泌的碱性磷酸酶(SeAP)活性(中和测定基本按Pastrana等(2004)所述，修改为将相对光单位优化以在线性范围内(例如介于75-100RLU之间)。中和滴度表示为导致不存在血清时由PsV感染产生的SeAP活性信号降低50％的血清稀释度的倒数。低于40的中和滴度被视为低于截止值(Cut-off)。

表11概括了小鼠中的数据。

表11第三次免疫后第14天小鼠中由嵌合L1/L2多肽诱导的抗血清对HPV-6、11、16、18、33、58假病毒体的中和

^*HPV33/11和HPV58/6PsV分别表示对L2肽17-36HPV33/HPV11和L2肽56-75HPV58/HPV6有型特异性

当在小鼠中测试时，单独免疫的嵌合L1/L2多肽抗原#5-L1-HPV16/L2^DE17-36和#8-L1-HPV18/L2^DE17-36诱导可检测的特异性中和抗体(滴度范围为262-696)(表10)，#2-L1-HPV18/L2^Ct56-75除外。当与HPV16/18L1VLP组合时，嵌合L1/L2多肽抗原#5-L1-HPV16/L2^DE17-36和#8-L1-HPV18/L2^DE17-36仍诱导可检测的中和抗体，但只到较低程度(滴度范围为61-633)。

表11b第三次免疫后第14天小鼠中由嵌合L1/L2多肽诱导的抗血清对HPV-6、11、16、18、33、58假病毒体的中和

表12和表13分别概括了第III次后和第IV次后第14天兔中的中和数据。

所测试的大部分嵌合L1/L2多肽抗原在兔中诱导可检测的特异性的交叉中和抗体(表12和表13)，L1/L2嵌合体#2(100mM NaCl中)除外。L2肽56-75HPV58/HPV11的提供可能不是最适宜诱导中和抗体的，但是观察到这种嵌合体诱导ELISA滴度。L2肽插入嵌合L1/L2多肽不会干扰诱导针对HPV-16 L1或HPV-18 L1的高滴度中和抗体(表11和表12)。与Alum-MPL制剂相比，在Specol中配制的嵌合L1/L2多肽#8诱导约2倍较高的中和滴度(表13)。单独用L1/L2嵌合体免疫诱导显著高的抗HPV16或HPV-18的中和抗体，这反映了对载体蛋白HPV-16 L1 VLP或HPV-18 L1 VLP的抗体应答。此外，对于嵌合L1/L2多肽#5，观察到高危HPV-33、58的良好中和，而嵌合L1/L2多肽#8的程度较低。此外，两种兔血清均检出低危HPV-6和11的中和(表13)。

表12：第三次免疫后第14天在兔中嵌合L1/L2多肽诱导的抗血清对HPV-6、11、16、18、33、58假病毒体的中和。

^*HPV33/11和HPV58/6PsV分别表示对L2肽17-36 HPV33/HPV11和L2肽56-75HPV58/HPV6有型特异性

表13：在第四次免疫后第14天在兔中嵌合L1/L2多肽诱导的抗血清对HPV-6、11、33、58假病毒体的中和

在另一项实验中，将作为小的非VLP纯化的嵌合体#2和嵌合体3配制到AS04佐剂(alum 3D-MPL)中，并分别给予兔后，在ELISA中测试抗肽17-36、抗肽56-75和抗HPV L1应答。在第二次免疫后，得到下面的数据。

表14：L1/L2嵌合体在兔中的免疫原性-抗L2^17-36(第二次免疫)

表15：L1/L2嵌合体在兔中的免疫原性—抗L2^56-75(第二次免疫)

表16：L1/L2嵌合体在兔中的免疫原性—抗HPV 18 L1(第二次免疫)

附录：参考文献清单

Alphs HH，Gambhira R，Karanam B，Roberts JN，Jagu S，Schiller JT，Zeng W，Jackson DC，Roden RB.Protection against heterologous humanpapillomavirus challenge by a synthetic lipopeptide vaccine containing abroadly cross-neutralizing epitope of L2(通过含有L2的广泛交叉中和表位的合成脂肽疫苗针对异源人乳头状瘤病毒攻击的保护).Proc NatlAcad Sci U S A.2008年4月15日；105(15)：5850-5.电子版2008年4月14日。

Benson DA，Karsch-Mizrachi I，Lipman DJ，Ostell J，Wheeler DL.GenBank.Nucleic Acids Res.36(数据库特刊)：D25-30(2008)。

Bishop B，Dasgupta J，Klein M，Garcea RL，Christensen ND，Zhao R，Chen XS.Crystal structures of four types of human papillomavirus L1capsid proteins：understanding the specificity of neutralizing monoclonalantibodies(4种类型的人乳头状瘤病毒L1衣壳蛋白的晶体结构：了解中和单克隆抗体的特异性).J Biol Chem.2007年10月26日；282(43)：31803-11.电子版2007年9月4日。

Boeckmann B.，Bairoch A.，Apweiler R.，Blatter M.-C.，EstreicherA.，Gasteiger E.，Martin M.J.，Michoud K.，O′Donovan C.，Phan I.，PilboutS.，Schneider M.The SWISS-PROT protein knowledgebase and itssupplement TrEMBL in 2003(SWISS-PROT蛋白质知识库及其2003年的补遗TrEMBL).Nucleic Acids Res.31：365-370(2003)。

Carter JJ，Wipf GC，Benki SF，Christensen ND，Galloway DA.Identification of a human papillomavirus type 16-specific epitope on theC-terminal arm of the major capsid protein L1(主要衣壳蛋白L1C端臂上人乳头状瘤病毒16型特异性表位的鉴定).J Virol.2003年11月；77(21)：11625-32。

Carter JJ，Wipf GC，Madeleine MM，Schwartz SM，Koutsky LA，Galloway DA.Identification of human papillomavirus type 16 L1 surfaceloops required for neutralization by human sera(人血清中和所需要的人乳头状瘤病毒16型L1表面环的鉴定).J Virol.2006年5月；80(10)：4664-72。

Chen X.S，Garcea R.L，Goldberg I，Casini G，Harrison S.C.Structureof small virus-like particles assembled from the L1 protein of humanpapillomavirus 16(由人乳头状瘤病毒16的L1蛋白装配的小病毒样颗粒的结构).Mol Cell 2000，5，557-567。

Christensen ND，Cladel NM，Reed CA，Budgeon LR，Embers ME，Skulsky DM，McClements WL，Ludmerer SW，Jansen KU.Hybridpapillomavirus L1 molecules assemble into virus-like particles thatreconstitute conformational epitopes and induce neutralizing antibodies todistinct HPV types(杂合乳头状瘤病毒L1分子装配成重建构象表位并诱导抗不同HPV型的中和抗体的病毒样颗粒).Virology.2001年12月20日；291(2)：324-34。

Christensen N D，Dilner J，Eklund C，Carter J J，Wipf GC，Reed CA，Cladel，N M，Galloway DA Surface，Linear and Conformational epitopeson HPV-16 and HPV-18 virus-like particles as defined by monoclonalantibodies(通过单克隆抗体定义的HPV-16和HPV-18病毒样颗粒上的表面、线性和构象表位)，Virology，223，174-184(1996)。

Combita AL，TouzéA，Bousarghin L，Christensen ND，Coursaget P.Identification of two cross-neutralizing linear epitopes within the L1 majorcapsid protein of human papillomaviruses(人乳头状瘤病毒的L1主要衣壳蛋白中的两个交叉中和线性表位的鉴定).J Virol.2002年7月；76(13)：6480-6

Day PM，Thompson CD，Buck CB，Pang YY，Lowy DR，Schiller JT.Neutralization of human papillomavirus with monoclonal antibodiesreveals different mechanisms of inhibition(用单克隆抗体中和人乳头状瘤病毒揭示不同的抑制机制).J Virol.2007年8月；81(16)：8784-92.电子版2007年6月6日。

Deschuyteneer M，Elouahabi A，Plainchamp D，Plisnier M，Soete D，Corazza Y，Lockman L，Giannini S and Deschamps M.Molecular andstructural characterization of the L1-Virus Like Particles that are used asvaccine antigens in CervarixTM，the AS04-adjuvanted HPV-16 and-18cervical cancer vaccine(在AS04为佐剂的HPV-16和HPV-18子宫颈癌疫苗CervarixTM中用作疫苗抗原的L1-病毒样颗粒的分子和结构表征)。

Dessy FJ，Giannini SL，Bougelet CA，Kemp TJ，David MP，PonceletSM，Pinto LA，Wettendorff MA.Correlation between direct ELISA，single epitope-based inhibition ELISA and pseudovirion-basedneutralization assay for measuring anti-HPV-16 and anti-HPV-18antibody response after vaccination with the AS04-adjuvanted HPV-16/18cervical cancer vaccine(在用AS04为佐剂的HPV-16/18子宫颈癌疫苗接种后用于测定抗HPV-16和抗HPV-18抗体应答的直接ELISA、基于单一表位的抑制ELISA和基于假病毒体的中和测定之间的相关性).Hum Vaccin.2008年11-12月；4(6)：425-34.电子版2008年11月11日。

Embers ME，Budgeon LR，Pickel M，Christensen ND.Protectiveimmunity to rabbit oral and cutaneous papillomaviruses by immunizationwith short peptides of L2，the minor capsid protein(用次要衣壳蛋白L2的短肽免疫对兔口腔和皮肤乳头状瘤病毒的保护性免疫).J Virol.2002 Oct；76(19)：9798-805。

Gambhira R，Karanam B，Jagu S，Roberts JN，Buck CB，Bossis I，Alphs H，Culp T，Christensen ND，Roden RB.A protective and broadlycross-neutralizing epitope of human papillomavirus L2(人乳头状瘤病毒L2的保护性和广泛交叉中和表位).J Virol.2007年12月；81(24)：13927-31.电子版2007年10月10日。

Harris，J.R.，1994，Proc.ICEM XIII，Les Editions de Physique，主编，第557页。

Hayat M.A.和Miller S.E.，1990，Negative Staining，Mc Graw-Hill主编。

Kawana K，Matumoto K，Yoshikawa H，Kawana T，Yoshiike K，Kanda T.A surface immunodeterminant of human papillomavirus type 16minor capsid protein L2(人乳头状瘤病毒16型次要衣壳蛋白L2的表面免疫决定因素).Virology 1998，245，353-359。

Kawana K，Yoshikawa H，Takentani Y，Yoshiike K，Kanda T.Invitro construction of pseudovirions of human papillomavirus type 16：incorporation of plasmid DNA into reassembled L1/L2 capsids(体外构建人乳头状瘤病毒16型的假病毒体：将质粒DNA掺入重新装配的L1/L2衣壳中).Journal of Virology 1999，73，6188-6190。

Kawana K，Kawana Y，Yoshikawa H，Taketani Y，Yoshiike K，Kanda T.Nasal immunization of mice with peptide having across-neutralization epitope on minor capsid protein L2 of humanpapillomavirus type 16 elicit systemic and mucosal antibodies(用具有人乳头状瘤病毒16型的次要衣壳蛋白L2上的交叉中和表位的肽对小鼠鼻内免疫诱导全身性抗体和粘膜抗体).Vaccine.2001年1月8日；19(11-12)：1496-502。

Kawana K，Yasugi T，Kanda T，Kino N，Oda K，Okada S，Kawana Y，Nei T，Takada T，Toyoshima S，Tsuchiya A，Kondo K，Yoshikawa H，Tsutsumi O，Taketani Y.Safety and immunogenicity of a peptidecontaining the cross-neutralization epitope of HPV 16 L2 administerednasally in healthy volunteers(健康志愿者中鼻内给予的含有HPV16 L2的交叉中和表位的肽的安全性和免疫原性).Vaccine.2003年10月1日；21(27-30)：4256-60。

Kondo K，Ishii Y，Ochi H，Matsumoto T，Yoshikawa H，Kanda T.Neutralization of HPV 16，18，31，and 58 pseudovirions with antiserainduced by immunizing rabbits with synthetic peptides representingsegments of the HPV16 minor capsid protein L2 surface region(用表示HPV16次要衣壳蛋白L2表面区的区段的合成肽对兔免疫诱导的抗血清对HPV16、18、31和58假病毒体的中和).Virology.2007年2月20日；358(2)：266-72.电子版2006年9月28日。

Kondo K，Ochi H，Matsumoto T，Yoshikawa H，Kanda T.Modification of human papillomavirus-like particle vaccine by insertionof the cross-reactive L2-epitopes(通过插入交叉反应性L2-表位改良的人乳头状瘤病毒样颗粒疫苗).J Med Virol.2008年5月；80(5)：841-6。

Pastrana DV，Buck CB，Pang YY，Thompson CD，Castle PE，FitzGerald PC，Krüger Kjaer S，Lowy DR，Schiller JT.Reactivity ofhuman sera in a sensitive，high-throughput pseudovirus-basedpapillomavirus neutralization assay for HPV16 and HPV18(在用于HPV16和HPV18的灵敏的高通量基于假病毒的乳头状瘤病毒中和测定中人血清的反应性).Virology.2004年4月10日；321(2)：205-16。

Mahdavi A，Monk BJ.Vaccines against human papillomavirus andcervical cancer：promises and challenges(针对人乳头状瘤病毒和子宫颈癌的疫苗：前景与挑战).Oncologist.2005年8月；10(7)：528-38.综述。

Quint WG，Pagliusi SR，Lelie N，de Villiers EM，Wheeler CM；World Health Organization Human Papillomavirus DNA InternationalCollaborative Study Group.Results of the first World Health Organizationinternational collaborative study of detection of human papillomavirusDNA Results of the first World Health Organization internationalcollaborative study ofdetection of human papillomavirus DNA(世界卫生组织人乳头状瘤病毒DNA国际协作研究组。人乳头状瘤病毒DNA检测首次世界卫生组织国际协作研究结果).J Clin Microbiol.2006年2月；44(2)：571-9。

Sadeyen J.R，Tourne S，Shkreli M，Sizaret P.Y，Coursaget P.Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of humanpapillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induceneutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizingepitope(人乳头状瘤病毒16型病毒样颗粒的衣壳表面环上外源序列的插入降低其诱导中和抗体和形成构象中和表位的能力).Virology 309(2003)32-40。

Slupetzky K，Shafti-Keramat，Lenz P，Brandt S，Grassauer A，SaraM和Kirnbauer R.Chimeric papillomavirus-like particles expressing aforeign epitope on capsid surface loops(衣壳表面环上表达外源表位的嵌合乳头状瘤病毒样颗粒).Journal of General Virology 2001，82，2799-2804。

Slupetzky K，Gambhira R，Culp T，Shafti-Keramat S，SchellenbacherC，Christensen N.D，Roden R，Kirnbauer R.A papillomavirus-like particle(VLP)vaccine displaying HPV 16 L2 epitopes induces cross-neutralizingantibodies to HPV11(呈现HPV16 L2表位的乳头状瘤病毒样颗粒(VLP)疫苗诱导HPV11的交叉中和抗体).Vaccine 25(2007)2001-2010。

Varsani A，Williamson AL，de Villiers D，Becker I，Christensen ND，Rybicki EP.Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)L1particles presenting the common neutralizing epitope for the L2 minorcapsid protein of HPV-6 and HPV-16(呈现HPV-6和HPV-16的L2次要衣壳蛋白的共有中和表位的嵌合人乳头状瘤病毒16型(HPV-16)L1颗粒).J Virol.2003年8月；77(15)：8386-93。

Y.-F.Xul，Y.-Q.Zhang2，X.-M.Xul，and G.-X.Song1.Papillomavirus virus-like particles as vehicles for the delivery of epitopesor genes(作为递送表位或基因的载体的乳头状瘤病毒病毒样颗粒).Arch Virol(2006)151：2133-2148。

示例性嵌合L1/L2多肽的氨基酸序列

HPVchim01(SEQ ID NO：36)

HPVchim02(SEQ ID NO：37)

HPVchim03(SEQ ID NO：38)

HPVchim04(SEQ ID NO：39)

HPVchim05(SEQ ID NO：40)

HPVchim06(SEQ ID NO：41)

HPVchim07(SEQ ID NO：42)

HPVchim08(SEQ ID NO：43)

HPVchim09(SEQ ID NO：44)

HPVchim10(SEQ ID NO：45)

Claims

1.一种人乳头状瘤病毒(HPV)18型L1多肽或其片段，其包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。

2.权利要求1的多肽，其中所述L2多肽的肽是非HPV 18型肽。

3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽能够诱导对包含L2多肽的天然蛋白质的免疫应答。

4.权利要求3的多肽，其中所述多肽能够诱导对至少一种其它天然L2蛋白的免疫应答。

5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述HPV L1蛋白包含一个或多个氨基酸的C端缺失。

6.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入L1多肽的暴露区内。

7.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入L1蛋白的DE环内。

8.权利要求7的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸132-142之间。

9.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入L1蛋白的FG环。

10.权利要求9的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸172-182之间。

11.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入L1蛋白的HI环中。

12.权利要求11的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸345-359之间。

13.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入L1多肽的C端内。

14.权利要求13的多肽，其中将至少一个L2肽插入氨基酸429和445之间。

15.前述权利要求中任一项的多肽，其包含两个或更多个插入L1多肽内的L2肽。

16.权利要求15的多肽，其中将两个或更多个L2肽插入不同位点。

17.权利要求16的多肽，其中将第一L2肽插入DE环，将第二L2肽插入L1多肽的C端。

18.权利要求15-17中任一项的多肽，其中所述两个或更多个L2肽不同。

19.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含天然L2多肽的至少8个连续氨基酸。

20.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽选自HPVL2多肽N端的氨基酸1-200。

21.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽选自HPVL2多肽N端的氨基酸1-150。

22.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽选自：

包含HPV L2多肽的氨基酸残基17-36的肽；

包含HPV L2多肽的氨基酸残基56-75的肽；

包含HPV L2多肽的氨基酸残基96-115的肽；和

包含HPV L2多肽的氨基酸残基108-120的肽。

23.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽由HPV33型L2的氨基酸17-36组成。

24.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽由HPV58型L2的氨基酸56-75组成。

25.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含由SEQ ID NO：1-31表示的氨基酸序列。

26.前述权利要求中任一项的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代。

27.权利要求26的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的插入。

28.权利要求26的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的缺失。

29.权利要求26的多肽，其中与天然L2多肽相比，至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的取代。

30.权利要求26-29中任一项的多肽，其中至少一个氨基酸插入、缺失或取代除去两个半胱氨酸之间的二硫键或除去能够形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸。

31.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含两个或更多个L2肽。

32.权利要求31的多肽，其中两个或更多个L2肽是邻接的。

33.权利要求31的多肽，其中两个或更多个L2肽通过至少一个其它氨基酸连接。

34.权利要求33的多肽，其中两个或更多个L2肽通过包含多个氨基酸的间隔基连接。

35.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述L2肽包含至少8个连续氨基酸，所述至少8个连续氨基酸包含与至少两种HPV型的L2多肽相同的序列。

36.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少一个L2肽插入L1多肽内而又不缺失L2多肽的氨基酸。

37.前述权利要求中任一项的多肽，其中将至少L2肽插入L1多肽内同时又缺失L2多肽的一个或多个氨基酸。

38.一种多肽，其包含序列ID No.32-45中任一个表示的氨基酸序列。

39.一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1 16型多肽或其片段，其含有插入HPV L1多肽内的包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽。

40.权利要求39的多肽，其中所述包含HPV L2多肽的氨基酸56-75的肽选自致癌HPV型。

41.权利要求39或40的多肽，其中将包含HPV 58型L2多肽的氨基酸56-75的肽插入HPV L1多肽内。

42.前述权利要求中任一项的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含至少一个氨基酸插入、缺失或取代。

43.权利要求42的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的插入。

44.权利要求42的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的缺失。

45.权利要求42的多肽，其中与天然L2多肽序列相比，所述至少一个L2肽包含一个或多个氨基酸的取代。

46.权利要求42-45中任一项的多肽，其中至少一个氨基酸插入、缺失或取代除去两个半胱氨酸之间的二硫键或除去能够形成二硫键的两个半胱氨酸之间的氨基酸。

47.前述权利要求中任一项的多肽，其中至少一个L2肽包含两个或更多个L2肽。

48.权利要求47的多肽，其中两个或更多个L2肽是邻接的。

49.权利要求47的多肽，其中两个或更多个L2肽通过至少一个其它氨基酸连接。

50.权利要求49的多肽，其中两个或更多个L2肽通过包含多个氨基酸的间隔基连接。

51.权利要求42-50中任一项的多肽，其中包含至少一个含有至少一个氨基酸插入、缺失或取代的L2肽的多肽能够诱导对包含L2多肽的天然蛋白质的免疫应答。

52.前述权利要求中任一项的多肽，其中L2肽包含至少8个连续氨基酸，所述至少8个连续氨基酸是与至少两种HPV型的L2多肽相同的序列。

53.一种壳粒，其包含权利要求1-52中任一项的多肽。

54.一种病毒样颗粒(VLP)，其包含权利要求1-52中任一项的多肽。

55.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-54中任一项的蛋白质、壳粒或VLP和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

56.权利要求55的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

57.权利要求56的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝盐。

58.权利要求57的免疫原性组合物，其中所述铝盐是氢氧化铝。

59.权利要求57或58的免疫原性组合物，其还包含3D-MPL。

60.一种核酸分子，其编码权利要求0-52中任一项的多肽。

61.一种表达载体，其包含权利要求59的核酸。

62.权利要求61的表达载体，其中所述表达载体是重组杆状病毒。

63.一种用权利要求59的核酸或权利要求61的载体转化的宿主细胞。

64.用于药物的权利要求1-52中任一项的多肽。

65.一种用于产生权利要求1-52中任一项的多肽的方法，所述方法包括将权利要求61或62的表达载体导入细胞，并在产生多肽的条件下使细胞复制。

66.一种组合物，其包含：

(ii)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段的嵌合多肽，所述嵌合多肽包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。

67.权利要求66的组合物，其中(i)的VLP由L1多肽或其片段组成。

68.权利要求66或67的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽是权利要求1-52中任一项的多肽、权利要求53的壳粒或权利要求54的VLP。

69.权利要求66-68中任一项的组合物，其中(i)中的HPV VLP包含HPV 16 L1 VLP和/或HPV 18 L1 VLP。

70.权利要求66-69中任一项的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽包含HPV 16 L1多肽或其片段和/或HPV 18 L1多肽或其片段。

71.权利要求66-70中任一项的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽由HPV 16 L1多肽或其片段、HPV 18 L1多肽或其片段或者HPV16 L1多肽或其片段和HPV 18 L1多肽或其片段两者组成。

72.权利要求66-71中任一项的组合物，其中(ii)的至少一种嵌合多肽包含L1多肽的一个或多个氨基酸的C端缺失。

73.权利要求66-72中任一项的组合物，其中(i)中的VLP包含HPV 16 L1 VLP和HPV 18 L1 VLP两者，且其中(ii)的嵌合多肽包含至少一种包含HPV 16 L1多肽的嵌合多肽和至少一种包含HPV 18 L1多肽的嵌合多肽。

74.权利要求73的组合物，其中包含HPV 16 L1多肽的嵌合多肽和包含HPV 18多肽的嵌合多肽包含不同的L2肽。

75.一种包含两种或更多种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段的嵌合多肽的组合的组合物，所述嵌合多肽包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽。

76.权利要求75的组合物，其中所述嵌合多肽是权利要求1-52中任一项的嵌合多肽。

77.权利要求75-76的组合物，其中所述嵌合多肽包含相同HPV型的L1多肽，而L2肽不同。

78.权利要求66-77中任一项的组合物，其中各VLP和/或嵌合多肽存在的量为10-50μg/人剂量。

79.权利要求78的组合物，其中各VLP和/或嵌合多肽存在的量为约20μg。

80.权利要求66-79中任一项的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

81.权利要求80的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

82.权利要求81的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝盐。

83.权利要求82的免疫原性组合物，其中所述铝盐是氢氧化铝。

84.权利要求82或83的免疫原性组合物，其还包含3D-MPL。

85.一种用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将以下成分混合以产生权利要求80-84中任一项的免疫原性组合物：

(i)至少一种人乳头状瘤病毒(HPV)L1病毒样颗粒(VLP)，与

(ii)至少一种包含人乳头状瘤病毒(HPV)L1多肽或其片段的嵌合多肽，其包含至少一个插入HPV L1多肽内的包含L2多肽的表位的肽，和

(iii)药学上可接受的稀释剂或载体，和任选

(iv)佐剂。

86.一种诱导人的抗HPV抗体的方法，所述方法包括将权利要求55-59或66-84中任一项的免疫原性组合物给予人。

87.权利要求86的方法，其中针对HPV诱导抗体预防、改善或治疗HPV感染或疾病。

88.权利要求55-59或66-84中任一项的组合物，其用于预防、改善或治疗HPV感染或疾病。