CN107188966A - 一种乳头瘤病毒嵌合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳头瘤病毒嵌合蛋白及其用途，具体公开了一种乳头瘤病毒嵌合蛋白，其骨架是乳头瘤病毒的L1蛋白或乳头瘤病毒的L1蛋白的突变体，所述的骨架上嵌合至少一个来自人乳头瘤病毒33型L2蛋白或乳头瘤病毒33型L2蛋白突变体的多肽。该乳头瘤病毒嵌合蛋白可用于制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乳头瘤病毒嵌合蛋白，及由其形成的病毒样颗粒，以及乳头瘤病毒嵌合蛋白或乳头瘤病毒嵌合病毒样颗粒在制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。
背景技术
目前已分离鉴定了200多型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，分为嗜黏膜组和嗜皮肤组。黏膜组的HPV主要感染泌尿生殖道、肛门肛周及口咽部的黏膜及周围皮肤，诱发各种良恶性病变。根据诱发病变的性质不同，可分为诱发恶性肿瘤的高危型(包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等)；可疑高危型(HPV26、30、53、66、67、69、70、73、82、85等)；尚未确定型(HPV34、42、43、54、71、81、83、97、102、114等)；及诱发疣状增生等良性病变的低危型(HPV6、7、11、13、32、40、42、44、61、62、72、74、81、83、84、86、87、89、90、91、106等)。嗜皮肤组主要感染上述部位之外的皮肤组织，诱发皮肤疣状增生，并与某些皮肤癌的发生密切相关。
高危型HPV感染相关的恶性肿瘤目前已确定的有：宫颈癌、阴道癌、阴唇癌、阴茎癌、肛门肛周癌、口咽癌、扁桃体癌、口腔癌，其中以宫颈癌的危害最大。宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤，年发病约52.7万，其中亚洲地区28.5万；中国的年发病数7.5万。
HPV16是全球范围内的优势流行株，在HPV相关的肿瘤如宫颈癌、肛周癌、阴茎癌、外阴癌等相关癌及癌前病变中的检出率都是最高的。例如，HPV16感染相关的宫颈癌约占中国宫颈癌总数的58.7％，占世界宫颈癌发病总数的53.5％，其余41.3％-46.5％的宫颈癌由其余约19种高危型HPV感染合并引起。目前已经上市了多种以HPV L1蛋白的病毒样颗粒(VLP)为基础的混合性预防疫苗，如葛兰素史克公司的二价苗Cervarix(HPV16/18)，默沙东公司的四价苗Gardasil(HPV6/11/16/18)及九价苗Gardasil 9(HPV6/11/16/18/31/33/35/45/52/58)。由于这类疫苗诱发的免疫保护反应主要是针对疫苗构成型别的，因此这类疫苗多为HPV多价疫苗，如要获得广谱疫苗的预防效果需要继续扩大疫苗的价次。鉴于HPV的型别目前已鉴定了200多型，高危型已鉴定多达20型，因此通过单纯扩大VLP型别种类研发广谱疫苗在经济成本及人体所能承受的最大接种量方面都带来了许多挑战。
病毒次要衣壳蛋白L2可诱发交叉中和抗体，且具有体内交叉保护活性。研究发现，诱发交叉保护活性的中和抗体表位主要分布在L2蛋白的N端多个保守区域，如HPV16L2蛋白的氨基酸(aa.)17-36多肽的免疫血清可高滴度中和HPV16/18，同时还可有效中和HPV5/6/45/52/58(Gambhira R,Karanam B,et al.J.Virol.2007；81(24):13927–13931)，针对HPV16L2aa.17-36的单抗RG-1亦具有交叉中和活性(Gambhira R,Karanam B,et al.J.Virol.2007；81(24):13927–13931)，因此，L2蛋白的与HPV16L2的aa.17-36多肽同源区又被称为RG-1表位。
采用不同疫苗载体，如硫氧还蛋白(Trx)、噬菌体VLP、植物病毒VLP及感染哺乳类的病毒VLP(腺相关病毒、牛乳头瘤病毒-1、HPV16)，构建以HPV16L2aa.17-36多肽为基础的融合蛋白疫苗，可显著提高多肽的免疫原性，提高中和抗体的滴度及交叉中和或保护范围(Christina S,Richard R,et al.J.Virol.2009；83(19):10085-10095；Seitz H,Canali E,et al.Vaccine 2014；32:2610–2617；TumbanE,Peabody J,et al.PLoS One 2011；6(8):e23310；Nieto K,Weghofer M,et al.PLoSOne 2012；7(6):e39741)。
HPV L2aa.17-36多肽区域在不同种属的乳头瘤病毒之间，氨基酸序列同源性很高。现有的以不同HPV型别RG-1表位为基础的疫苗研究如下：将HPV31/51型RG-1表位插入细菌蛋白Trx的表面，获得的免疫血清有交叉中和活性，但中和型别相对较少(Seitz H,Canali E,et al.Vaccine 2014；32:2610–2617)；将HPV16/31型RG-1表位联合插入腺相关病毒VLP表面，获得的免疫血清合计中和6个HPV型别(Nieto K,Weghofer M,et al.PLoS One 2012；7(6):e39741)；将HPV45型RG-1表位插入HPV18VLP表面，获得的免疫血清合计中和4个HPV型别(Huber B,Schellenbacher C,et al.PLoS One 2015；10(3):e0120152)。这些结果表明，上述型别的RG-1表位均有诱发交叉中和抗体的活性。此外，多种型别的RG-1区域的截短型多肽(HPV1/5/6/11/16/18/45/58L2aa.17-31)分别插入噬菌体VLP表面，形成的8种嵌合VLP(Chimeric VLP,cVLP)混合免疫后的小鼠可产生针对8种型别病毒的免疫保护反应(Tumban E,Peabody J,et al.PLoS One 2011；6(8):e23310)，由于缺乏对每种RG-1截短多肽cVLP免疫活性的具体分析，因此不能判断各型截短型的RG-1表位多肽的免疫活性。从上述文献报道的中和型别分析来看，HPV16型RG-1表位的免疫原性最强，无论是插入HPV及噬菌体的VLP表面均可诱发广谱中和抗体反应；HPV31/45/51型的可能次之，其他型别的不明(缺乏报道)；值得注意的是8种型别(HPV1/5/6/11/16/18/45/58)RG-1区域的截短型多肽(L2aa.17-31)噬菌体cVLP混合免疫获得的抗血清，其中和的型别不多，提示其中某些型别截短多肽可能是没有活性的或是活性很弱，具体比较分析不同型别RG-1表位多肽及截短型多肽免疫原性，可望明确其免疫原性及免疫原性的差异。因此，除HPV16外，目前对其他不同型别的RG-1表位区的免疫原性研究欠深入或者缺乏研究；而且缺乏针对不同型别RG-1表位区的免疫原性的比较分析；重要的是，在相关的载体疫苗研究中，RG-1表位型别的选择不是依据其免疫原性的强弱，而是依据其他因素，如该型别的病毒是否优势流行及感染相关疾病的危害程度是否严重。因此现有以RG-1表位为基础的疫苗研究有待提高。
HPV33的感染率及在HPV感染相关肿瘤中的检出率较高，在世界范围内，其在宫颈癌标本中的检出率为2.6％；在亚洲和中国均为3.8％，仅次于HPV16/18/58型(X.Castellsaguéet al.Vaccine 25S(2007)C1–C26)。但是HPV33L2蛋白RG-1表位的免疫原性缺乏研究，该表位是否能诱发中和抗体及诱发抗体的中和范围及特点都不明确。基于目前的研究进展及认知，HPV33型RG-1表位疫苗的免疫活性是无法预测的。
研究发现，HPV16L1VLP是一个极具研发前景的HPV16L2RG-1表位疫苗载体，在HPV16L1蛋白表面区的特定位置按照一定的方式插入HPV16L2RG-1表位后，可在VLP表面展示，免疫后可诱发广谱中和抗体及保护反应。如在HPV16L1蛋白DE环(aa 136/137)位点，直接插入HPV16L2aa.17-36形成的嵌合VLP(cVLP)可诱发广谱中和抗体反应，可中和至少14个HPV型别(SchellenbacherC,Roden R,et al 2009；J.Virol.2009；83(19):10085–10095)；在h4区域的430/433位点，采用非等长置换法插入HPV16L2aa.18-38，可以诱发交叉中和HPV18及31型的中和抗体(Kondo K,Ochi H,et al.J.Med.Virol.2008；80:841–846)。目前尚未见有将HPV33L2蛋白表位嵌合在乳头瘤病毒VLP表面的报道。由于HPV33RG-1表位与HPV16RG-1表位的氨基酸序列有一定差异(同源性约80％)，在上述位点插入后是否能形成VLP尚不清楚。另外，采用其他不同的插入方式，如在DE环135-138区域，采用非等长置换合并插入片段两端引入氨基酸修饰，获得的融合蛋白是否能形成VLP，插入的表位是否能在表面有效呈递尚不清楚，插入后是否影响骨架自身的主要中和抗体表位也不清楚。最后，在上述区域插入截短型的HPV33L2多肽，是否能形成VLP，形成VLP以后是否具有诱发交叉保护反应的活性，是否影响骨架自身的主要中和抗体表位，对其表达量的影响如何，同样也是不清楚的。上述不清楚的问题是无法预测的。
因此，本发明选用了HPV33型RG-1表位及截短型的RG-1表位，用于HPV 16型cVLP的研究，结果显示，本发明获得的HPV33型RG-1长表位及短表位的cVLP的免疫原性很强(可中和至少10个HPV型别)，可与文献报道的HPV16型RG-1VLP的相媲美，但中和型别的范围有所不同(Schellenbacher C,Roden R,et al 2009；J.Virol.2009；83(19):10085–10095；Schellenbacher C,Kwak K,et al.J.Invest.Derma.2013；doi:10.1038/jid.2013.253)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乳头瘤病毒嵌合蛋白，用于制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗。
本发明人经研究出人意料地发现，在全长或截短型HPV16L1蛋白的表面区插入HPV33L2蛋白多肽，可提高HPV33L2多肽的免疫原性，获得的嵌合蛋白在大肠杆菌或昆虫细胞表达系统中可高水平表达，该嵌合蛋白可组装成VLP，并可诱发针对来自不同属/亚属的多种型别HPV的广谱保护性免疫反应。本发明基于以上发现，现已完成，在本文实施例中提供数据。
基于上述目的，本发明一方面提供了一种乳头瘤病毒嵌合蛋白，其骨架是乳头瘤病毒的L1蛋白或乳头瘤病毒的L1蛋白的突变体，所述的骨架上嵌合至少一个来自HPV33L2蛋白的多肽。
可选地，所述的多肽选自HPV33L2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.7所示)的aa.1-200区域内的任意连续8-33个氨基酸的片段。进一步优选地，所述的多肽为HPV33L2蛋白RG-1表位区。
优选地，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
可选地，所述的多肽是在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端延长或截短1-5个氨基酸和/或C端延长或截短1-5个氨基酸所获得的多肽。
优选地，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2或者SEQ ID No.3所示。
可选地，所述的多肽还可以是与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同源性大于60％的多肽，优选是同源性大于70％的多肽、同源性大于80％的多肽、同源性大于90％的多肽，甚至更优选是同源性大于95％的多肽。
可选地，所述的骨架是HPV16L1蛋白或HPV16L1蛋白的突变体。
优选地，所述的HPV16L1蛋白选自高危型HPV L1蛋白或高危型HPV L1蛋白的突变体；进一步优选地，本发明涉及的嵌合蛋白骨架选自HPV16L1蛋白(例如NCBI数据库AAC09292.1序列)或HPV16L1蛋白突变体。HPV16L1蛋白骨架可来自但不限于HPV16Phi1、Tha7、Alg1、Sen32、Fra25、Fra63、114K、114B、Z-1194等变异株的L1蛋白(Touze A,Mehdaoui SE,et al.J.Clin.Micr.1998；36(7):2046-2051)。优选地，所述的HPV16L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
可选地，所述的HPV16L1蛋白的突变体是在所述的HPV16L1蛋白的N端截短0-9个氨基酸和/或C端截短0-34个氨基酸的所获得的蛋白。
可选地，所述的来自HPV33型L2蛋白的多肽嵌合于所述的HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的表面区，优选为嵌合于所述的HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的DE环，更优选为通过直接插入的方式嵌合于所述的HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸136和氨基酸137之间，或者通过非等长置换的方式嵌合于所述的HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸135-138区域，其中，在所述的非等长置换的方式中，所述的来自HPV33L2蛋白的多肽的N端和/或C端含有1-3个氨基酸的连接子。
可选地，所述的连接子由选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)及脯氨酸(P)的氨基酸任意组合构成。优选地，N端选用G(甘氨酸)P(脯氨酸)连接子，C端选用P(脯氨酸)连接子。
可选地，在所述直接插入的方式中，所述来自HPV33L2多肽的氨基酸序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，插入位点为所述的HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸136和氨基酸137之间。
可选地，在所述非等长置换的方式中，删除所述HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸135-138区域后，在HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸134及139之间插入如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
可选地，所述的来自HPV33L2蛋白的多肽嵌合于所述的HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的表面区，优选为嵌合于所述的HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的h4区，更优选为通过非等长置换的方式嵌合于HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸431-432区域，可选地，在所述的非等长置换的方式中，所述的来自HPV33L2多肽的N端和/或C端含有1-3个氨基酸的连接子。
可选地，在所述非等长置换的方式中，删除所述HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸431-433区域后，在HPV16L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16L1蛋白的突变体的氨基酸430及434之间插入如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及编码上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸。
本发明还提供了包含上述的多核苷酸的载体，以及包含所述的载体的细胞。
本发明涉及的编码上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸序列适用于不同的表达系统。可选地，这些核苷酸序列采用大肠杆菌密码子进行全基因优化，可在大肠杆菌表达系统中高水平表达；或采用昆虫细胞密码子进行全基因优化，可在昆虫细胞表达系统中高水平表达。
本发明还提供了一种乳头瘤病毒外壳蛋白多聚物，优选地，该多聚物为乳头瘤病毒嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒，其含有上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，或者由上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白所形成。
本发明还提供了上述的乳头瘤病毒嵌合蛋白、乳头瘤病毒嵌合五聚体或上述的乳头瘤病毒嵌合病毒样颗粒在制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。
本发明还提供了一种用于预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗，其包含上述的乳头瘤病毒嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒、佐剂、以及疫苗用赋形剂或载体，优选地，还包含至少一种嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的HPV的病毒样颗粒或嵌合病毒样颗粒。其中，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
可选地，所述佐剂为人用佐剂，优选是铝佐剂、水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激剂的佐剂组合物、氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物或者MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
发明中相关术语的说明及解释
根据本发明，术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组Bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞，在此举例但不限于：Sf9，Sf21，High Five。
根据本发明，术语“原核表达系统”包括但不限于大肠杆菌表达系统。其中表达宿主菌来源于市场上可得到的菌株，在此举例但不限于：BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，C43(DE3)，Rosetta-gami B(DE3)。
根据本发明，术语“全长HPV16型L1蛋白”的例子包括但不限于NCBI数据库中编号为AAC09292.1的蛋白等长的全长L1蛋白。
“截短型HPV16型L1蛋白”的基因片段指的是其与野生型HPV 16型L1蛋白基因相比，在其5’端和/或3’端缺失编码1个或多个氨基酸的核苷酸，其中“野生型HPV16型L1蛋白”的全长序列例如但不限于NCBI数据库中的如下序列:AAC09292.1、AIQ82817.1、AAC61736.1等。
根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂，举例但不限于聚山梨酯80(Tween-80)，离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“人用佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂，包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。
根据本发明，术语“乳剂”是指由水相成分、油相成分及乳化剂按适当比例混合，经乳化后形成的非均相液体分散体系。其中水相成分包括但不限于磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲系统；油相成分为可代谢脂类，包括但不限于植物油、鱼油、动物油、合成油及其他脂类成分(例如但不限于角鲨烯、生育酚)；乳化剂为适宜的表面活性剂，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(Span-85)、聚山梨酯80(Tween-80)。
根据本发明，术语“稳定剂”是指可与佐剂中的聚肌苷酸-聚胞苷酸结合并起到稳定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、无机盐(例如但不限于氯化钙、氯化镁、磷酸钙)、阳离子的有机复合物(例如但不限于硬脂酸钙、葡萄糖酸钙)。
根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
根据本发明，本发明疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中蛋白病毒样颗粒的剂量为5μg-100μg，优选30μg-60μg。
附图说明
图1A-图1B：本发明实施例5中嵌合蛋白在大肠杆菌及昆虫细胞中的表达鉴定。结果显示，12种嵌合蛋白均可在大肠杆菌或昆虫细胞中高水平表达。
图1A：嵌合蛋白在大肠杆菌中的表达鉴定：1为HPV16L1DE136-137/33dE；2为HPV16L1DE136-137/33dEs；3为HPV16L1DE135-138/33dE；4为HPV16L1DE135-138/33dEs；5为HPV16L1h4/33dE；6为HPV16L1h4/33dEs；
图1B：嵌合蛋白在昆虫细胞中的表达鉴定：1为HPV16L1ΔCDE136-137/33dE；2为HPV16L1ΔCDE136-137/33dEs；3为HPV16L1ΔCDE135-138/33dE；4为HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs；5为HPV16L1ΔCh4/33dE；6为HPV16L1ΔCh4/33dEs。
图2A-图2B：本发明实施例6中纯化后获得的cVLP的动态光散射分析结果。结果显示HPV16L1ΔCDE135-138/33dE及HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs重组蛋白形成的病毒样颗粒水化动力学直径分别为91.6nm和97.9nm，颗粒组装的百分比均为100％。
图2A：HPV16L1ΔCDE135-138/33dE；图2B：HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs。
图3A-图3F：本发明实施例7中纯化后获得的cVLP的透射电镜观察结果。视野中可见大量的病毒样颗粒，颗粒均一度好。其中在DE区域插入L2蛋白的多肽的cVLP直径为50nm左右，与L1蛋白的VLP的大小相似；在h4区域插入L2蛋白的多肽的cVLP直径较小，在35-40nm之间。Bar＝200nm。
图3A：HPV16L1ΔCDE136-137/33dE VLP；图3B：HPV16L1ΔCDE136-137/33dEsVLP；图3C：HPV16L1ΔCDE135-138/33dE VLP；图3D：HPV16L1ΔCDE135-138/33dEsVLP；图3E：HPV16L1ΔCh4/33dE VLP；图3F：HPV16L1ΔCh4/33dEs VLP。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。
实施例1：嵌合L1蛋白的基因的合成及表达载体构建
12种嵌合L1蛋白，分别为：
1)嵌合L1蛋白HPV16L1DE136-137/33dE：骨架为全长HPV16L1蛋白(序列如SEQ ID No.4所示)，在其DE环aa.136/137位点，直接插入HPV33L2蛋白的aa.16-37多肽(插入片段序列如SEQ ID No.1所示)。编码HPV16L1DE136-137/33dE的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，构建方式为在HPV16L1大肠杆菌密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.8所示)的核苷酸408/409之间插入HPV33型L2蛋白的aa.16-37的大肠杆菌密码子优化基因(序列如SEQ ID No.9所示)；
2)嵌合L1蛋白HPV16L1DE136-137/33dEs：骨架为全长的HPV16L1蛋白(序列如SEQ ID No.4所示)，在其DE环aa.136/137位点，直接插入HPV33L2蛋白的aa.17-32的多肽(插入片段序列如SEQ ID No.2所示)。编码HPV16L1DE136-137/33dEs的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，构建方式为在HPV16L1大肠杆菌密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.8所示)的核苷酸408/409之间插入HPV33L2蛋白的aa.17-32的大肠杆菌密码子优化基因(序列如SEQ IDNo.10所示)；
3)嵌合L1蛋白HPV16L1DE135-138/33dE：骨架为全长的HPV16L1蛋白(序列如SEQ ID No.4所示)，删除其aa.135-138区域，并在aa.134/139之间融合包含连接子的HPV33L2蛋白的aa.16-37多肽(在HPV16L1蛋白的aa.135-138区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。其中，HPV33L2aa.16-37多肽的N端融合G(甘氨酸)P(脯氨酸)连接子且C端融合P(脯氨酸)连接子。编码HPV16L1DE135-138/33dE的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1大肠杆菌密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.8所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之间插入序列SEQ ID No.11；
4)嵌合L1蛋白HPV16L1DE135-138/33dEs：骨架为全长HPV16L1蛋白(序列如SEQ ID No.4所示)，删除其aa.135-138区域，并在aa.134/139之间融合包含连接子的HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽(在HPV16L1蛋白的aa.135-138区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。其中，HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽的N端融合G(甘氨酸)P(脯氨酸)连接子且C端融合P(脯氨酸)连接子。编码HPV16L1DE135-138/33dEs的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1大肠杆菌密码子优化基因骨架(序列如SEQID No.8所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之间插入序列SEQ ID No.12；
5)嵌合L1蛋白HPV16L1h4/33dE：骨架为全长的HPV16L1蛋白(序列如SEQ ID No.4所示)，在其h4区域的aa.430-433区域非等长置换插入HPV33L2蛋白的aa.17-37多肽，即删除HPV16L1蛋白的aa.431-432区域，并在aa.430/433之间融合aa.17-37多肽，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。编码HPV16L1h4/33dE的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1大肠杆菌密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.8所示)的核苷酸1291-1296，并在核苷酸1290/1297之间插入序列SEQ ID No.13；
6)嵌合L1蛋白HPV16L1h4/33dEs：骨架为全长的HPV16L1蛋白(序列如SEQ ID No.4所示)，在其h4区域的aa.430-433区域非等长置换插入HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽，即删除HPV16L1蛋白的aa.431-432区域，并在aa.430/433之间融合aa.17-32多肽，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码HPV16L1h4/33dEs的多核苷酸序列经大肠杆菌密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1大肠杆菌密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.8所示)的核苷酸1291-1296，并在核苷酸1290/1297之间插入序列SEQ ID No.10；
7)嵌合L1蛋白HPV16L1ΔCDE136-137/33dE：骨架为C端截短31个氨基酸的HPV16L1蛋白(即在序列SEQ ID No.4的C端截短31个氨基酸)，在其DE环aa.136/137位点，直接插入HPV33L2蛋白aa.16-37多肽(插入片段序列如SEQ IDNo.1所示)。编码HPV16L1ΔCDE136-137/33dE的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，构建方式为在HPV16L1昆虫细胞密码子优化基因骨架(序列如SEQ IDNo.14所示)的核苷酸408/409之间插入HPV33L2蛋白的aa.16-37的昆虫密码子优化基因(序列如SEQ ID No.15所示)；
8)嵌合L1蛋白HPV16L1ΔCDE136-137/33dEs：骨架为C端截短31个氨基酸的HPV16型L1蛋白(即在序列SEQ ID No.4的C端截短31个氨基酸)，在其DE环aa.136/137位点，直接插入HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽(插入片段序列如SEQ ID No.2所示)。编码HPV16L1ΔCDE136-137/33dEs的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，构建方式为在HPV16L1昆虫细胞密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.14所示)的核苷酸408/409之间插入HPV33L2蛋白的aa.17-32的昆虫密码子优化基因(序列如SEQ ID No.16所示)；
9)嵌合L1蛋白HPV16L1ΔCDE135-138/33dE：骨架为C端截短31个氨基酸的HPV16L1蛋白(即在序列SEQ ID No.4的C端截短31个氨基酸)，删除其aa.135-138区域，并在aa.134/139之间融合包含连接子的HPV33L2蛋白的aa.16-37多肽(在HPV16型L1蛋白的aa.135-138区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。其中，HPV33L2蛋白的aa.16-37多肽的N端融合G(甘氨酸)P(脯氨酸)连接子且C端融合P(脯氨酸)连接子。编码HPV16L1ΔCDE135-138/33dE的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1昆虫细胞密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.14所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之间插入序列SEQ ID No.17；
10)嵌合L1蛋白HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs：骨架为C端截短31个氨基酸的HPV16L1蛋白(即在序列SEQ ID No.4的C端截短31个氨基酸)，删除其aa.135-138区域，并在aa.134/139之间融合包含连接子的HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽(在HPV16L1蛋白的aa.135-138区域非等长置换插入)，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。其中，HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽的N端融合G(甘氨酸)P(脯氨酸)连接子且C端融合P(脯氨酸)连接子。编码HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1昆虫细胞密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.14所示)的核苷酸403-414，并在核苷酸402/415之间插入序列SEQ ID No.18；
11)嵌合L1蛋白HPV16L1ΔCh4/33dE：骨架为C端截短31个氨基酸的HPV16L1蛋白(即在序列SEQ ID No.4的C端截短31个氨基酸)，在其h4区域的aa.430-433区域非等长置换插入HPV33L2蛋白的aa.17-37多肽，即删除HPV16L1蛋白的aa.431-432区域，并在aa.430/433之间融合HPV33L2蛋白的aa.17-37多肽，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。编码HPV16L1ΔCh4/33dE的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1昆虫细胞密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.14所示)的核苷酸1291-1296，并在核苷酸1290/1297之间插入序列SEQ ID No.19；
12)嵌合L1蛋白HPV16L1ΔCh4/33dEs：骨架为C端截短31个氨基酸的HPV16L1蛋白(即在序列SEQ ID No.4的C端截短31个氨基酸)，在其h4区域的aa.430-433区域非等长置换插入HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽，即删除HPV16型L1蛋白的aa.431-432区域，并在aa.430/433之间融合HPV33L2蛋白的aa.17-32多肽，插入片段的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码HPV16L1ΔCh4/33dEs的多核苷酸序列经昆虫细胞密码子优化设计，构建方式为删除HPV16L1昆虫细胞密码子优化基因骨架(序列如SEQ ID No.14所示)的核苷酸1291-1296，并在核苷酸1290/1297之间插入序列SEQ ID No.16。
依据大肠杆菌密码子及依据昆虫细胞密码子优化的嵌合L1基因采用全基因合成的方式，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
大肠杆菌密码子优化的嵌合蛋白基因经NdeI/XhoI酶切后，分别插入商业化的表达载体pET22b(Novagen公司生产)。昆虫细胞密码子优化的嵌合蛋白基因经EcoRI/Xba I酶切后，分别插入商业化表达载体pFastBac1(Invitrogen公司生产)中。得到包含嵌合蛋白基因的表达载体，分别为：pET22b-16L1DE136-137/33dE，pET22b-16L1DE136-137/33dEs，ET22b-16L1DE135-138/33dE，pET22b-16L1DE135-138/33dEs，pET22b-16L1h4/33dE，pET22b-16L1h4/33dEs，pFastBac1-16L1ΔCDE136-137/33dE，pFastBac1-16L1ΔCDE136-137/33dEs，pFastBac1-16L1ΔCDE135-138/33dE，pFastBac1-16L1ΔCDE135-138/33dEs，pFastBac1-16L1ΔCh4/33dE，pFastBac1-16L1ΔCh4/33dEs。上述酶切、连接及克隆构建的方法都是公知的，例如专利CN101293918B。
实施例2：嵌合L1蛋白的基因的重组Bacmid及重组杆状病毒的构建
分别使用包含嵌合L1基因的重组表达载体pFastBac1-16L1ΔCDE136-137/33dE，pFastBac1-16L1ΔCDE136-137/33dEs，pFastBac1-16L1ΔCDE135-138/33dE，pFastBac1-16L1ΔCDE135-138/33dEs，pFastBac1-16L1ΔCh4/33dE，pFastBac1-16L1ΔCh4/33dEs转化大肠杆菌DH10Bac感受态，筛选获得重组Bacmid，然后用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利CN101148661B。
实施例3：嵌合L1蛋白的基因在Sf9细胞中的表达
Sf9细胞分别接种6种嵌合L1基因的重组杆状病毒，进行嵌合L1蛋白的表达，27℃培养约88h后收发酵液，3000rpm离心15min，弃上清，用PBS洗涤细胞后，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，例如专利CN 101148661B。
实施例4：嵌合L1蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
分别使用包含嵌合L1基因的重组表达载体pET22b-16L1DE136-137/33dE，pET22b-16L1DE136-137/33dEs，pET22b-16L1DE135-138/33dE，pET22b-16L1DE135-138/33dEs，pET22b-16L1h4/33dE，pET22b-16L1h4/33dEs转化大肠杆菌BL21(DE3)。
挑单克隆接种到3ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜。将过夜培养的菌液按1：100的比例加入LB培养基中，37℃培养3h左右，待OD600达到0.8-1.0之间，加IPTG至终浓度0.5μM，16℃培养约12h，收取菌液。
实施例5：嵌合L1蛋白的表达鉴定
取实施例3及实施例4中所述表达不同嵌合L1蛋白的细胞各1×106个，重悬于200μl PBS溶液中，加入6×Loading Buffer 50μl，75℃变性8分钟，分别取10μl进行SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。结果如图1所示，12种嵌合L1蛋白均可在昆虫细胞或原核表达系统中高水平表达，其中HPV16L1DE136-137/33dE、HPV16L1DE136-137/33dEs、HPV16L1DE135-138/33dE、HPV16L1DE135-138/33dEs、HPV16L1h4/33dE、HPV16L1h4/33dEs大小约55kDa，其余6种蛋白大小约50kDa。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定的方法是公开的，例如专利CN101148661B。
实施例6：嵌合L1蛋白的纯化及动态光散射粒径分析
取嵌合L1的细胞发酵液适量，使用10ml PBS重悬细胞，加PMSF至终浓度1mg/ml，超声破碎(宁波新芝超声破碎仪，6#探头，200W，超声5s，间隔7s，总时间10min)，取破碎上清进行纯化，纯化步骤在室温进行。在裂解液中加入4％β-巯基乙醇(w/w)对VLP进行解聚，然后使用0.22μm滤器过滤样品，依次使用DMAE阴离子交换层析或CM阳离子交换层析(20mM Tris,180mM NaCl,4％β-ME,pH 7.9洗脱)、TMAE阴离子交换层析或Q阳离子交换层析(20mM Tris,180mM NaCl,4％β-ME,pH 7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mM NaH2PO4，30mMNaCl，4％β-ME，pH 6.0洗脱)纯化。纯化产物采用Planova超滤系统进行浓缩，并更换缓冲液(20mM NaH2PO4，500mM NaCl，pH 6.0)促使VLP组装。以上纯化方法均是公开的，例如专利CN101293918B、CN1976718A等。
取纯化后的嵌合蛋白溶液进行DLS粒径分析(Zetasizer Nano ZS 90动态光散射仪，Malvern公司)，结果如表1所示，其中HPV16L1ΔCDE135-138/33dE及HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs的DLS分析图如图2所示。
表1嵌合L1蛋白DLS分析
| 蛋白名称 | 水力学直径(nm) | PDI |
| HPV16L1DE136-137/33dE | 92.5 | 0.131 |
| HPV16L1DE136-137/33dEs | 98.4 | 0.142 |
| HPV16L1DE135-138/33dE | 91.4 | 0.133 |
| HPV16L1DE135-138/33dEs | 95.2 | 0.142 |
| HPV16L1h4/33dE | 89.4 | 0.176 |
| HPV16L1h4/33dEs | 82.6 | 0.188 |
| HPV16L1ΔCDE136-137/33dE | 99.4 | 0.142 |
| HPV16L1ΔCDE136-137/33dEs | 98.8 | 0.136 |
| HPV16L1ΔCDE135-138/33dE | 91.6 | 0.177 |
| HPV16L1ΔCDE135-138/33dEs | 97.9 | 0.143 |
| HPV16L1ΔCh4/33dE | 88.6 | 0.144 |
| HPV16L1ΔCh4/33dEs | 90.8 | 0.152 |
实施例7：嵌合VLP的透射电镜观察
按实施例6所述的层析纯化方法，对嵌合VLP分别进行纯化，使用透析后的VLP制备铜网，并用1％醋酸铀进行染色，充分干燥后使用JEM-1400电镜(奥林巴斯)进行观察。结果如图3所示，昆虫细胞表达的在DE区嵌合L2抗原多肽的cVLP直径约为50nm，在h4区域嵌合L2抗原的多肽的cVLP直径约35-40nm。原核表达的cVLP与昆虫细胞表达的cVLP大小规律一致，在DE区嵌合L2抗原多肽的cVLP直径约为50nm，在h4区域嵌合L2抗原多肽的cVLP直径约35-40nm。铜网制备及电镜观察的方法均是公开的，例如专利CN 101148661B。
实施例8：嵌合VLP的小鼠免疫及中和抗体滴度测定
取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，用cVLP 10μg，Al(OH)3 50μg及PIKA佐剂50μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，2，4，6周免疫，共4次。
第4次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
使用12种HPV假病毒对免疫血清的中和抗体滴度进行检测，结果如表2所示，结果显示大肠杆菌及昆虫细胞表达体系生产的cVLP免疫小鼠后均可有效诱发交叉中和抗体，中和范围广。其中HPV16L1ΔCDE136-137/33dE等昆虫细胞表达的cVLP免疫血清可中和至少12个型别的假病毒。假病毒制备及假病毒中和实验的方法均是公开的，例如专利CN 104418942A。
此外，本发明包括的在DE区域或h4区域采用其他柔性连接子连接L2蛋白的多肽构建的嵌合蛋白，均能形成的cVLP，采用上述策略免疫小鼠后，诱发的交叉中和抗体水平与表2所示的cVLP相比没有差异。由前述12种嵌合L1蛋白分别构成的五聚体，采用上述策略免疫小鼠后，也可诱发交叉中和抗体。
表2不同cVLP在小鼠中诱发的中和抗体滴度
Claims (11)
1.一种乳头瘤病毒嵌合蛋白，其骨架是乳头瘤病毒的L1蛋白或乳头瘤病毒的L1蛋白的突变体，其特征在于，所述骨架上嵌合至少一个来自HPV33型L2蛋白或HPV33型L2蛋白突变体的多肽。
2.根据权利要求1所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述多肽来自HPV33型L2蛋白的氨基酸1-200区域内的任意连续8-33个氨基酸的片段，优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或者，所述多肽是在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端延长或截短1-5个氨基酸和/或C端延长或截短1-5个氨基酸所获得的多肽，优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2或者SEQ IDNo.3所示。
3.根据权利要求1所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述骨架是HPV16型L1蛋白或HPV16型L1蛋白的突变体，优选地，所述HPV16型L1蛋白的突变体是在所述的HPV16型L1蛋白的N端截短0-9个氨基酸和/或C端截短0-34个氨基酸的所获得的蛋白，更优选地，所述骨架的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示,或在如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的C端截短31个氨基酸。
4.根据权利要求3所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述来自HPV33型L2蛋白的多肽嵌合于所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的表面区，优选为嵌合于所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的DE环，更优选为：
通过直接插入的方式嵌合于所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸136和137之间，在所述直接插入的方式中，所述来自HPV33型L2蛋白的多肽的氨基酸序列是SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2；或者，
通过非等长置换的方式嵌合于所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸135-138区域；其中，在所述非等长置换的方式中，所述来自HPV33型L2蛋白的多肽的N端和/或C端含有1-3个氨基酸的连接子，优选地，所述连接子由选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸及脯氨酸的氨基酸任意组合构成，更优选地，N端选用甘氨酸和脯氨酸连接子，C端选用脯氨酸连接子；可选地，在所述非等长置换的方式中，删除所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸135-138区域后，在HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸134及139之间插入如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，其特征在于，所述来自HPV33型L2蛋白的多肽嵌合于所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的表面区；优选为嵌合于所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的h4区；更优选为通过非等长置换的方式嵌合于HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸431-432区域，可选地，所述非等长置换的方式中，所述来自HPV33型L2蛋白的多肽的N端和/或C端含有1-3个氨基酸的连接子；可选地，在所述非等长置换的方式中，删除所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸431-432区域后，在所述HPV16型L1蛋白或C端截短31个氨基酸的所述HPV16型L1蛋白的突变体的氨基酸430及433之间插入如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
6.一种多核苷酸，其编码权利要求1-5中任一项所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，优选地，所述多核苷酸的序列采用大肠杆菌密码子进行全基因优化或采用昆虫细胞密码子进行全基因优化。
7.一种载体，其包含如权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种细胞，其包含如权利要求7所述的载体。
9.一种乳头瘤病毒外壳蛋白构成的多聚物，优选地，该多聚物为嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒，其含有权利要求1至5中任一项所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白，或者由权利要求1至5中任一项所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白所形成。
10.如权利要求1-5中任一项所述的乳头瘤病毒嵌合蛋白或如权利要求9所述的乳头瘤病毒嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒在制备预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。
11.一种用于预防乳头瘤病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗，其包含如权利要求9所述的乳头瘤病毒嵌合五聚体或嵌合病毒样颗粒、佐剂、以及疫苗用赋形剂或载体，优选地，还包含至少一种嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的HPV的病毒样颗粒或嵌合病毒样颗粒，更优选地，所述佐剂为人用佐剂，甚至优选地，所述人用佐剂是铝佐剂、水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激剂的佐剂组合物、氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物或者MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
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