NO328128B1 - Antigenisk formulering som omfatter et humant papillomaviruskapsomer for anvendelse som en vaksine, samt anvendelse derav for fremstilling av en farmasoytisk sammensetning for behandling og forebygging av HPV infeksjon og tilstander beslektet dermed. - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en antigenisk formulering som omfatter et humant papillomaviruskapsomer for anvendelse som en vaksine.

Bakgrunn og teknikkens stilling

Infeksjoner med bestemte høyrisikostammer av genitale papillomavirus i mennesker (HPV), f.eks. HPV 16,18, eller 45, antas å være hovedrisikofaktor for dannelse av maligne tumorer i den anogenitale trakt. Av de mulig maligniteter er cervikale carcinomer i særdeleshet den mest hyppige, ifølge et estimat av Verdens Helseorganisasjon (WHO) med ca. 500.000 nye tilfeller av sykdommen årlig. På grunn av hyppigheten som denne patologi forekommer med har forbindelsen mellom HPV-infeksjon og cervikal carcinom blitt under-søkt i utstrakt grad, og dette har ført til et antall generaliseringer.

F.eks. er skader i precursor i cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) kjent å være forårsaket av papillomavirus-infeksjoner [Crum., New Eng. J. Med., Vol 310, 1984, p

880-883]. DNA fra genomene av visse HPV-typer, inkluderende f.eks. stammer 16, 18, 33, 35, og 45, har blitt detektert i mere enn 95% av tumor-biopsier fra pasienter med denne lidelse, og likeledes i primære cellelinjer dyrket fra disse tumorer. Ca. 50 til 70% av de biopserte CIN-tumorceller har blitt funnet å inkludere DNA avledet kun fra HPV 16.

Proteinproduktene av HPV 16 og HPV 18 tidlige gener E6 og E7 har blitt detektert i cervikale carcinom-cellelinjer, og likeledes i humane keratinocytter transformert in vitro [Wettstein et al., i PAPILLOMA VIRUSES AND HUMAN CANCER, Pfister (ed.), CRC Press: Boca Raton, FL 1990, p 155-179], og en signifikant andel av pasienter med cervikal carcinom har anti-E6 eller anti-E7-antistoff. E6- og E7-proteinene har vist å ta del i induksjon av cellulær DNA-syntese i humane celler, og transformasjon av humane keratinocytter og andre celletyper, og tumor-dannelse i transgen mus (Arbelt et al., J. Virol, Vol 68, 1994, p 4358-4364; Auewarakul et al., Mol. Cell. Biol., Vol 14,1994, p 8250-8258; Barbosa et al., J. Virol, Vol 65, 1991, p 292-298; Kaur et al., J. Gen. Virol, Vol 70, 1989, p 1261-1266; Schlegel et al., EMBO J., Vol 7, 1988, p 3181-3187]. Den konstitutive uttrykking av E6/E7-proteiner synes å være nødvendig for å opprettholde den transformerte tilstand av HPV-positive tumorer.

Til tross for kapasiteten av noen HPV-stammer til å indusere neoplastiske fenotyper in vivo og in vitro, fører andre HPV-typer til benigne genitale vorter så som condylomata acuminata, og er kun sjelden assosiert med maligne tumorer [Ikenberg, i Gross et al., (eds.) GENITAL PAPILLOMAVIRUS INFECTIONS, Springer Verlag; Berlin, p

87-112]. Lavrisikostammer av denne type inkluderer f.eks. HPV 6 og 11.

Som oftest overføres genitale papillomavirus mellom mennesker under samleie, og dette fører i mange tilfeller til vedvarende infeksjon i den anogenitale mukøse membran. Mens disse observasjoner antyder at enten den primære infeksjon induserer en inadekvat immunrespons, eller at viruset har utviklet evnen til å unngå immunovervåking, tyder andre observasjoner på at immunsystemet er aktivt under primær manifestasjon og likeledes under malign progresjon av papillomavirusinfeksjoner [Altmann et al., i VIRUSES AND CANCER, Minson et al., (eds.) Cambridge University Press, 1994, p 71-80].

F.eks. kan den kliniske manifestasjon av primær infeksjon av kanin og bovin papillomavirus hindres med vaksiner med vorteekstrakter av virale strukturelle proteiner [Altmann et al., ovenfor, Campo, Curr. Top, i Microbial and Immunol., Vol 186, 1994, p 255-266; Yindle og Frazer, Curr. Top, i Microbial. and Immunol., Vol 186, 1994, p 217-2534]. Gnagere som tidligere har blitt vaksinert med vaccinia rekombinanter som koder for HPV 16 tidlige proteiner E6 eller E7, eller med syntetiske E6- eller E7-peptider, er tilsvarende beskyttet fra dannelse av tumor etter inokkulering av HPV 16 transformerte autologe celler [Altman et al., ovenfor, Campo et al., ovenfor; Yindle og Frazer et al., ovenfor]. Regresjon av vorter kan induseres ved overføring av lymfocytter fra regressordyr etterfulgt av infeksjon av papillomavirus fra dyr. Til slutt, i immunoundertrykte pasienter, så som f.eks. mottakere av organtransplantasjon eller individer infisert med HIV, er forekomsten av genitale vorter, CIN, og anogenital kreft forhøyet.

WO 9611272, som er den nærmeste kjente teknikk for den foreliggende søknaden, tilveiebringer VLPer og vaksinesammensetninger som inneholder VLPer, ikke kapsomerer. WO9420137 og EP 1588714 tilveiebringer viruslignende partikler og fragmenter som er dannet fra papillomavirus kapsid proteiner. VLPene i WO9420137 og EP 1588714 er ulike VLPene i WO 9611272. WO9420137 og EP 1588714 tilveiebringer antigeniske egenskaper til VLPer, ikke kapsomerer. Kapsomerer og VLPer er strukturelt forskjellige, og innehar forskjellige egenskaper når det gjelder effektivitet i å frembringe antistoffer som er anvendbare i vaksiner, selv om kapsomerene og VLPene er dannet av de samme fusjonsproteinene. US 6013262 omhandler multimeriske strukturer av rekombinante papillomavirus L1 protein som kan fremkalle en immunrespons som gjenkjenner papillomavirus VLP.

Opptil i dag har ingen HPV-vaksiner blitt beskrevet som omfatter humant papillomavirus sene L1 -protein i form av kapsomerer som er hensiktsmessig både for profylaktisk og terapeutiske formål. Siden L1 -proteinet ikke foreligger i maligne genitale lesjoner, så har vaksinering med L1 -proteiner ikke noe terapeutisk potensiale for disse pasienter. Konstruksjon av chimeriske proteiner, omfattende aminosyreenheter fra L1-protein, og f.eks. E6- eller E7-protein, som gir opphav til chimeriske kapsomerer, kombinerer profylaktiske og terapeutiske funksjoner for en vaksine. En fremgangsmåte for produksjon av høye nivåer av chimeriske kapsomerer vil derfor være spesielt ønskelig, i lys av de mulige fordeler som muliggjøres av en slik vaksine for profylaktisk og terapeutisk intervensjon.

Det eksisterer således et behov innen fagfeltet for å fremskaffe vaksineformuleringer som kan hindre eller behandle HPV-infeksjon. Fremgangsmåter for å produsere vaksineformuleringer som løser de problemer som er kjent innen fagfeltet å være assosiert med rekombinant HPV-proteinekspresjon og rensing, vil manifestere seg til å være anvendelig for å behandle populasjoner av individer som allerede er infisert med HPV, og likeledes å være anvendelig for å immunisere populasjonen av individer som er mottakelig for HPV-infeksjon.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer terapeutiske og profylaktiske vaksineformuleringer omfattende chimeriske humane papillomakapsomerer. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelser av denne formuleringen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning å behandle HPV infiserte pasienter og for å hindre HPV-infeksjon i et mottakelig individ.

Således kjennetegnes den antigeniske formuleringen i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at kapsomeret omfatter et fusjonsprotein omfattende et trunkert humant papillomavirus L1 -protein tilgrensende aminosyreenheter fra et andre protein, hvor L1-proteinet og aminosyreenhetene fra det andre proteinet posisjoneres for å inhibere viruslignende partikkelformasjon, hvor formuleringen fremkaller en immunrespons som nøytraliserer humane papillomavirus virioner.

Ytteligere utførelser av den antigeniske formuleringen i følge den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i uselvstendige krav 2-14.

Således kjennetegnes anvendelse av formuleringen i samsvar med et av krav 1-14 i følge den foreliggende oppfinnelsen ved at den anvendes for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling og/eller forebygging av HPV infeksjon og tilstander beslektet dermed.

Et aspekt av oppfinnelsen omfatter profylaktiske vaksiner for å hindre HPV-infeksjon som inkorporerer de strukturelle proteiner L1 og L2 fra papillomavirus. Utvikling av en vaksine av denne type møter betydelige problemer på grunn av at papillomavirus ikke kan propageres til adekvate titer i cellekulturer eller andre eksperimentelle systemer for å tilveiebringe virale proteiner i tilstrekkelig mengde for økonomisk produksjon av vaksine. Videre er rekombinante metoder for å uttrykke proteiner ikke alltid rett frem, og resulterer ofte i lave proteinutbytter. Nylig har virus-lignende partikler (VLPer), tilsvarende til virale kapsidstrukturer, blitt beskrevet, og disse er dannet av Sf-9-insektsceller ved uttrykking av de virale proteiner L1 og L2 (eller L1 alene) ved anvendelse av rekombinant vaksine eller baculovirus. Rensing av VLPene kan oppnås svært enkelt ved hjelp av sentrifugering i CsCI- eller sukrose-gradienter [Kimbauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, Vol 99,1992, p 12180-12814; Kirnbaurer et al., J. Virol, Vol 67, 1994, p 6929-6936; Proso et al., J. Virol, Vol 6714, 1992, p 1936-1944; Sasagawa et al., Virology, Vol 2016, 1995, p 126-195; Volpers et al., J. Virol, Vol 69, 1995, p 3258-3264; Zhou et al., J. Gen. Virol., Vol 7 4, 1993, p 762-769; Zhou et al., Virology, Vol 185, 1991, p 251-257]. WO 93/02184 beskriver en fremgangsmåte hvor papilloma-viruslignende partikler (VLPer) anvendes for diagnostiske applikasjoner, eller som en vaksine mot infeksjoner forårsaket av papillomavirus. WO 94/00152 beskriver rekombinant produksjon av L1-protein som etterligner den konformasjonsnøytraliserende epitop av humane og animale papillomavirioner.

I et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes terapeutiske vaksiner for å lindre komplikasjoner av f.eks. cervikale carcinomer eller precursor-lesjoner som et resultat av papillomavirusinfeksjon, og representerer dermed et alternativ til profylaktisk intervensjon. Vaksiner av denne type kan omfatte tidlige papillomavirusproteiner, i hovedsak E6 eller E7, som uttrykkes i persistent infekterte celler. Det antas at, etter administrering av en vaksine av denne type, kan cytotoksiske T-celler aktiveres mot persistent infiserte celler i genitale lesjoner. Målpopulasjonen for terapeutisk intervensjon er pasienter med HPV-assosierte pre-maligne eller maligne genitale lesjoner. PCT-patent-søknad WO 93/20844 beskriver at de tidlige protein E7 og antigeniske fragmenter derav av papillomavirus fra HPV eller BPV er terapeutisk effektive i regresjon, men ikke i å hindre, papillomavirus-tumorer i pattedyr. Mens tidlige HPV-proteiner har blitt produsert ved rekombinant uttrykking i E. coli eller egnete eukaryotiske celletyper, har rensing av de rekombinante proteiner vist seg å være vanskelig på grunn av iboende lav løselighet, og komplekse renseprosedyrer som generelt krever en kombinasjon av flere trinn, inkluderende ionebyttekromatografi, gelfiltrering og affinitetskromatografi.

Derved tilveiebringes vaksineformuleringer omfattende papillomavirus-kapsomerer som omfatter enten: (i) et første protein som er et intakt viralt protein uttrykt som et fusjonsprotein som delvis omfatter aminosyreenheter fra et andre protein, (ii) et trunkert viralt protein, (iii) et trunkert viralt protein uttrykt som et fusjonsprotein omfattet i del av aminosyreenheter fra et andre protein, eller (iv) en kombinasjon av de tre typer proteiner. Der tilveiebringes også vaksineformuleringer omfattende kapsomerer av bovint papillomavirus (BPV) og humant papillomavirus. Foretrukne bovine viruskapsomerer i følge den foreligggende oppfinnelsen omfatter protein fra bovint papillomavirus type I. Foretrukne humant viruskapsomerer omfatter proteiner fra enhver type humane papillomavirus-stammer HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 og HPV45. De mest foretrukne vaksineformuleringer omfatter kapsomerer omfattende proteiner fra HPV16.

I et aspekt omfatter kapsomer-vaksineformuleringene ifølge oppfinnelsen et første intakt viralt protein uttrykt som et fusjonsprotein med ytterligere aminosyreenheter fra et andre protein. Foretrukne intakte virale proteiner er de strukturelle papillomavirale proteinet L1. Kapsomerer som er omfattet av intakte virale proteinfusjoner kan produseres ved anvendelse av L1- og L2-proteiner sammen, eller L1 -proteinet alene. Foretrukne kapsomerer lages fullstendig av L1-fusjonsproteiner, hvis aminosyresekvens er angitt i SEQ ID NO. 2, og som er kodet for av polynukleotidsekvensen ifølge SEQ ID NO. 1. Aminosyrer av det andre protein kan være avledet fra forskjellige kilder (inkluderende aminosyreenheter fra det første protein) så lengde addisjonen av aminosyreenhetene i det andre protein til det første protein muliggjør dannelse av kapsomerer. Fortrinnsvis, addisjon av aminosyreenhetene fra det andre protein inhiberer muligheten for at intakte virale proteiner danner virus-lignende partikkelstrukturer, og mest fortrinnsvis så fremmer aminosyreenhetene fra det andre protein dannelse av kapsomerer. I en utførelse av oppfinnelsen kan det andre protein være ethvert humant tumor-antigen, viralt antigen, eller bakterielt antigen som er viktig ved stimulering av immunrespons i neoplastiske eller infeksjons-sykdomsformer. I en foretrukket utførelse er det andre protein også et papillomavirusprotein. Det er også foretrukket at det andre protein er ekspresjonsproduktet av papillomavirus tidlig gen. Det er imidlertid også foretrukket at det andre protein velges fra gruppen av E1, E2, E3, E4, E5, E6 og E7 - tidlige genprodukter kodet for i genomet av papillomavirusstammer HPV6, HPV11, HPV18, HPV33, HPV35 eller HPV45. Det er mest foretrukket at det andre protein kodes for av HPV16 E7-genet, hvis åpne leseramme er angitt i SEQ ID NO. 3. Kapsomerer sammenstilt av fusjonsprotein-subenheter be-nevnes heri som chimeriske kapsomerer. I en utførelse omfatter vaksineformuleringen ifølge oppfinnelsen chimeriske kapsomerer hvor L1-protein-aminosyreenheter utgjør ca. 50 til 99% av de totale fusjonsprotein-aminosyreenheter. I en annen utførelse utgjør L1 -aminosyreenhetene ca. 60 til 90% av de totale fusjonsprotein-aminosyreenheter, og i en spesielt foretrukket utførelse omfatter L1-aminosyrene ca. 80% av fusjonsprotein-aminosyreenhetene.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes kapsomere vaksineformuleringer som er omfattet av trunkerte virale proteiner som har en deletering av én eller flere aminosyreenheter som er nødvendig for dannelse av en virus-lignende partikkel. Det er foretrukket at aminosyre-deleteringen ikke inhiberer dannelse av kapsomerer av det trunkerte protein, og det er særdeles foretrukket at deleteringen favoriserer dannelse av kapsomerer. Foretrukne vaksineformuleringer av denne type inkluderer kapsomerer omfattet av trunkert L1 med eller L2 virale proteiner. Trunkerte proteiner som vurderes ifølge oppfinnelsen inkluderer de som har én eller flere aminosyreenheter deletert fra karboksyl-terminus i proteinet, eller én eller flere aminosyreenheter deletert fra amino-terminus i proteinet, eller én eller flere aminosyreenheter deletert fra en indre region (dvs. ikke fra én av sidene) av proteinet. Foretrukne kapsomere vaksineformuleringer er omfattet av proteiner trunkert ved karboksyterminus. I formuleringer som inkluderer L1-protein avledet fra HPV16 er det foretrukket at fra 1 til 34 karboksy-terminale aminosyreenheter er deletert. Relativt kortere deleteringer er også vurdert, og disse gir muligheten for mindre modifisering av de antigeniske egenskaper av L1 -proteinene og kapsomerene dannet derav. Det er imidlertid svært foretrukket at 34 aminosyreenheter deleteres fra L1-sekvensen, korresponderende til aminosyrer 472 til 505 i HPV16 som angitt i SEQ ID NO. 2, og som kodes for av polynukleotidsekvensen korresponderende til nukleotider 1414 til 1516 i humant HPV16 L1 kodende sekvens angitt i SEQ ID NO. 1.

Når en kapsomer-vaksineformulering fremstilles av proteiner som bærer en indre deletering, er det foretrukket at den deleterte aminosyresekvens omfatter den nukleære lokaliseringsregion i proteinet. I L1-proteinet av HPV16 er det nukleære lokaliseringssignal fra ca. aminosyreenhet 499 til ca. aminosyreenhet 505. Etter ekspresjon av L1-proteinene hvor NLS har blitt deletert, vil sammenstilling av kapsomerstrukturer forekomme i cytoplasma i vertscellen. Som en konsekvens er rensing av kapsomerene mulig fra cytoplasma istedetfra kjernen hvor intakte L1 -proteiner sammenstilles til kapsomerer. Kapsomerer som resulterer fra sammenstilling av trunkerte proteiner hvor ytterligere aminosyresekvenser ikke erstatter de deleterte proteinsekvenser er nødvendigvis ikke chimeriske i naturlig form.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes kapsomere vaksineformuleringer omfattende trunkert viralt protein uttrykt som et fusjonsprotein tilgrensende aminosyreenheter fra et andre protein. Foretrukne trunkerte virale proteiner ifølge oppfinnelsen er de strukturelle papilloma-virale protein L1. Kapsomerer omfattet av trunkerte virale proteinfusjoner kan produseres ved anvendelse av L1 -protein alene. Trunkerte virale proteinkomponenter av fusjonsproteinene inkluderer de som har én eller flere aminosyreenheter deletert fra karboksyterminus av proteinet, eller én eller flere aminosyreenheter deletert fra aminoterminus av proteinet, eller én eller flere aminosyreenheter deletert fra en indre region (dvs. ikke fra noen av endene) av proteinet. Foretrukne kapsomere vaksineformuleringer er omfattet av proteiner trunkert ved karboksyterminus. I de formuleringer som inkluderer L1 -protein avledet fra HPV16, er det foretrukket at fra 1 til 34 karboksyterminal-aminosyreenheter er deletert. Relativt kortere deleteringer vurderes også idet disse kan muliggjøre mindre modifiseringer av de antigeniske egenskaper av L1-proteinkomponenten av fusjonsproteinet og kapsomerene dannet derav. Det er imidlertid svært foretrukket at de 34 aminosyreenheter deleteres fra L1-sekvensen, korresponderende til aminosyrer 472 til 505 i HPV16 angitt i SEQ ID NO. 2, og kodet for av polynukleotidsekvensen korresponderende til nukleotider 1414 til 1516 i humant HPV16 L1 kodende sekvens som angitt i SEQ ID NO. 1. Når vaksineformuleringen er omfattet av kapsomerer fremstilt av proteiner som bærer en indre deletering, er det foretrukket at den deleterte aminosyresekvens omfatter det nukleære lokaliseringsregion, eller sekvens, av proteinet.

Aminosyrer av det andre protein kan være avledet fra forskjellige kilder så lenge addisjonen av det andre protein aminosyreenheter til det første protein muliggjør dannelse av kapsomerer. Fortrinnsvis fremmer addisjon av det andre protein aminosyreenheter dannelse av kapsomerer. Aminosyreenheter av det andre protein kan være avledet fra forskjellige kilder, inkluderende aminosyreenheter fra det første protein. Det er også foretrukket at det andre protein er ekspresjonsproduktet av papillomavirus tidlig gen. Det er imidlertid svært foretrukket at det andre protein er valgt fra gruppen av tidlige genprodukter som kodes for av papillomavirus E1, E2, E3, E4, E5, E6 og E7 gener. I en utførelse omfatter vaksineformuleringen ifølge oppfinnelsen chimeriske kapsomerer hvor L1-protein-aminosyreenhetene utgjør ca. 50 til 99% av de totale fusjonsprotein-aminosyreenheter. I en annen utførelse utgjør L1-aminosyreenhetene ca. 60 til 90% av de totale fusjonsprotein-aminosyreenheter, og i en spesielt foretrukket utførelse utgjør L1-aminosyrene ca. 80% av fusjonsprotein-aminosyreenhetene.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen produseres proteiner av vaksineformuleringene ved rekombinante metoder, men i formuleringer omfattende intakte virale proteiner kan proteinene være isolert fra naturlige kilder. Intakte proteiner isolert fra naturlige kilder kan være modifisert in vitro til å inkludere ytterligere aminosyreenheter for å tilveiebringe et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av kovalente modifikasjonsteknikker som er godt kjente og som rutinemessig praktiseres innen fagfeltet. Tilsvarende, i formuleringer som omfatter trunkerte virale proteiner kan proteinene være isolert fra naturlige kilder som intakte proteiner, og hydrolysert in vitro ved anvendelse av kjemisk hydrolyse eller enzymatisk oppkutting med ethvert av et antall sete-spesifikke eller generelle proteaser idet det trunkerte protein som således ble modifisert til å inkludere ytterligere aminosyreenheter som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe et trunkert fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen.

Ved produksjon av kapsomerer kan rekombinante molekylære biologiske teknikker benyttes for å produsere DNA som koder enten for det ønskede intakte protein, det trunkerte protein, eller det trunkerte fusjonsprotein. Rekombinante metoder som er nødvendig for å produsere en DNA som koder for et ønsket protein er godt kjente og praktiseres rutinemessig innen fagfeltet. Laboratoriemanualer, f.eks. Sambrook et al., (utg.) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, NY, 1989, og Ausebel et al., (utg.), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons Inc., 1994-1997, beskriver i detalj teknikker som er nødvendig for å utføre de nødvendige DNA-manipulasjoner. For storskalaproduksjon av chimeriske kapsomerer kan proteinuttrykking utføres ved anvendelse enten av virale eller eukaryote vektorer. Foretrukne vektorer inkluderer alle de kjente prokaryotiske ekspresjonsvektorer, rekombinante baculoviruser, COS-celle-spesifikke vektorer, vaccinia-rekombinanter, eller gjær-spesifikke ekspresjonskonstrukter. Når rekombinante proteiner anvendes for å produsere kapsomerer ifølge oppfinnelsen kan proteinene først isoleres fra vertscellen for dets ekspresjon, og deretter inkuberes under betingelser som muliggjøre selv-assosiering for å tilveiebringe kapsomerer. Alternativt kan proteinene uttrykkes under betingelser hvor kapsomerene dannes i vertscellen.

Her beskrives også prosesser for å produsere kapsomerer i vaksine-fomuleringer. L1 -proteiner uttrykkes fra DNA som koder for ytterligere seks histidiner ved karboksyterminal av L1-protein-kodende sekvens. L1-proteiner uttrykt med ytterligere histidiner (His L1-proteiner) uttrykkes mest fortrinnsvis i E. coli, og His L1-proteinene kan renses ved anvendelse av nikkel-affinitetskromatografi. His L1 -proteiner i cellelysater suspenderes i en denaturerende buffer, f.eks. 6 M guanidinhydroklorid eller en buffer av tilsvarende denaturerende kapasitet, og underlegges deretter nikkelkromatografi. Proteiner eluert fra nikkelkromatograferingstrinnet renatureres, f.eks. i 150 mM NaCI, 1 mM CaCl2, 0,01% Triton-X 100, 10 mM HEPES (N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonisk syre), pH 7,4.1 samsvar med en foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen forekommer sammenstilling av kapsomerer etter dialyse av de rensete proteiner, fortrinnsvis etter dialyse mot 150 mM NaCI, 25 mM Ca2+, 10% DMSO (dimetylsulfoksid), 0,1% Triton-X 100,10 mM Tris [tris(hydroksymetyl)aminometan]eddiksyre, med en pH-verdi på 5,0.

Dannelse av kapsomerer kan monitoreres ved elektronmikroskopi, og i tilfeller hvor kapsomerene er omfattet av fusjonsproteiner, vil nærvær av forskjellige proteinkomponenter i de sammenstilte kapsomerer kunne bekreftes med Western blot analyser ved anvendelse av spesifikke antisera.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes anvendelse av formuleringen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av individer infisert med HPV. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av formuleringen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for forebygging av individer infisert med HPV. Mens infiserte individer enkelt kan identifiseres ved anvendelse av standard diagnostiske teknikker, kan mottakelige individer identifiseres f.eks. som de som er involvert i seksuelle forhold med et infisert individ. Imidlertid, på grunn av den høye frekvens av HPV-infeksjon vil alle seksuelt aktive personer være mottagelig for papillomavirusinfeksjon.

Administrering av en vaksineformulering kan inkludere én eller flere ytterligere komponenter så som farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler, adjuvanser og/eller bufre. Vaksinene kan administreres én enkelt gang eller flere ganger. Vaksineformuleringen ifølge oppfinnelsen kan avgis via forskjellige ruter, inkluderende f.eks. oral, intravenøs, intramuskulær, nasal, rektal, transdermal, vaginal, subkutanøs og intraperitoneal administrering.

Vaksineformuleringer ifølge oppfinnelsen tilbyr flere muligheter sammenlignet med konvensjonelle vaksinepreparater. Som del av en terapeutisk vaksinering kan kapsomerer fremme eliminering av persistent infiserte celler, f.eks. i pasienter med CIN eller cervikal carcinom. Videre kan terapeutiske vaksiner av denne type også fungere profylaktisk ved å beskytte pasienter med CIN-lesjonerfra reinfisering. Som en ytterligere fordel kan kapsomerer unnslippe nøytralisering av pre-eksisterende anti-kapsid-antistoff, og dermed oppvise lengre sirkuleringshalvtider sammenlignet med chimeriske virus-lignende partikler.

Vaksineformuleringer omfattende chimeriske kapsomerer kan tilveiebringe den ytterligere fordel å øke antigenisitet av begge proteinkomponenter av fusjonsproteinet hvorfra kapsomeren er dannet. F.eks.,

i en VLP, kan proteinkomponenter for det underleggende kapsomer være skjult i en total struktur som et resultat av internalisert posisjonering innen selve VLPen. Tilsvarende kan epitoper av proteinkomponentene være sterisk hindret som et resultat av kapsomer-til-kapsomer-kontakt, og derfor ikke tilgjengelige for utvising av en immunrespons. Innledende resultater der det ble benyttet L1/E7-fusjonsproteiner for å produsere VLPer støtter denne posisjon idet ingen antistoffrespons ble detektert mot E7-komponenten. Denne observasjon er samsvarende med tidligere resultater som indikerer at karboksy-terminalregionen av L1 danner inter-pentameriske arm-strukturer som muliggjør sammenstilling av kapsomerer til kapsider [Garcia et al., J. Virol., Vol 71, 1997, p 2988-2995]. Sannsynligvis, i en chimerisk kapsomerstruktur, er begge proteinkomponenter av fusjonsprotein-substrukturen aksessbar for å danne en immunrespons. Kapsomer-vaksiner vil derfor gi ytterligere fordel med økt antigenisitet mot enhver proteinkomponent, inkluderende f.eks. nøytralisering av epitoper fra andre virusproteiner, uttrykt som en fusjon med L1 - aminosyresekvenser.

Foreliggende oppfinnelse er illustrert ved hjelp av følgende eksempler. Eksempel 1 beskriver konstruksjon av ekspresjonsvektorer for å produsere fusjons-, eller chimeriske-, virale proteiner. Eksempel 2 vedrører dannelse av rekombinante baculovirus for ekspresjon av virale proteiner. Eksempel 3 beskriver rensing av kapsomerer. Eksempel 4 beskriver en immuniseringsprotokoll for produksjon av antisera og monoklonale antistoff. Eksempel 5 tilveiebringer en peptid-ELISA for å kvantifisere dannelse av kapsomer. Eksempel 5 beskriver en antigen-opptakt-ELISAfor å kvantifisere dannelse av kapsomer. Eksempel 7 beskriver en hemagglutinin-analyse for å analysere induksjon av nøytraliserende antistoff.

Eksempel 1

Konstruksjon av chimeriske L1 gener

DNA som koder for HPV 16 L1 åpen leseramme ble utkuttet fra plasmid 16-114/k-L1/L2-pSynxtVr [Kirnbaueret al., J. Virol, Vol 67, 1994, p 6929-6936] ved anvendelse av BglW, og det resulterende fragment ble subklonet inn i pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA), tidligere linearisert ved det unike BamHI restriksjonssete. To hovedekspresjonskonstrukter ble først generert for å muliggjøre påfølgende innsetting av DNA for å muliggjøre ekspresjon av fusjonsprotein. Et konstrukt kodet for HPV 16 L1A310 som har en deletering på ni aminosyrer; hvor den deleterte region var kjent å vise lave nivåer av homologi med alle andre papillomavirus L1 -proteiner. Det andre konstrukt, HPV 16 L1 AC, kodet for et protein som hadde en deletering på 34 aminosyrer ved karboksyterminal L1-enhetene. Andre konstrukter inkluderte et EcoRV-restriksjonssete ved posisjonen for deleteringen for å muliggjøre innsetting av DNA som koder for andre proteinsekvenser. Addisjon av EcoRV-setet koder for to ikke-L1-proteinaminosyrer, aspartat og isoleucin.

A. Dannelse av et HPV 16 L1A310 ekspresionskonstrukt

To primere (SEQ ID NO. 5 og 6) ble konstruert for å mangfoldiggjøre pUC19-vektoren og den fullstendige HPV 16 L1 kodende sekvens, med unntak av nukleotider 916 til 942 i SEQ ID NO. 1. Primere ble syntetisert til også å introdusere et unikt EcoRV-restriksjonssete (understreket i SEQ ID NO. 5 og 6) ved slutten av mangfoldiggjøringsproduktet.

Det resulterende PCR-produkt ble oppkuttet med EcoRV for å tilveiebringe komplementære ender, og det oppkuttete produkt ble sirkularisert ved ligering.

Ligert DNA ble transformert inn i E. coli ved anvendelse av standardteknikker, og plasmider fra resulterende kolonier ble screenet for nærvær av et EcoRV-restriksjonssete. Én klon angitt som HPV 16 L1 A310 ble identifisert til å ha den hensiktsmessige 27-nukleotiddeletering, og dette konstrukt ble anvendt for å innsette DNA-fragmenter som koder for andre HPV 16 proteiner ved EcoRV-setet som diskutert nedenfor.

B. Dannelse av et HPV 16 L1 AC ekspresionskonstrukter

To primere (SEQ ID NO. 7 og 8) ble oppkuttet komplementært til HPV 16 L1 åpen leseramme slik at primerne "abuntet" hverandre for å muliggjøre mangfoldiggjøring i reverse retninger på templatet DNA omfattende HPV 16 L1-kodende sekvenser i pUC19, beskrevet ovenfor.

Hver primer introduserte et EcoRV-restriksjonssete ved enden av mangfoldiggjøringsproduktet. I downstream primer (SEQ ID NO. 8), ble EcoRV-setet etterfulgt av en TAA-translasjonsstoppkodon posisjonert slik at mangfoldiggjøringsproduktet, ved ligering av EcoRV-endene for sirkulering, ville inkludere deletering av de 34 karboksyterminale L1-aminosyrer. PCR ble utført for å mangfoldiggjøre den partielle L1 åpne leseramme og den fullstendige vektor. Mangfoldiggjøringsproduktet ble spaltet med EcoRV, sirkulert med T4 DNA-ligase, og transformert inn i E. coli DH5 a-celler. Plasmider fra levedyktige kloner ble analysert for nærvær av EcoRV-setet som ville linearisere plasmider. Ett positivt konstrukt angitt som pUCHPV16L1 AC ble identifisert og anvendt for å innsette DNA fra andre HPV 16 proteiner ved anvendelse av EcoRV-setet.

C. Innsetting av DNA- fragmenter inn i HPV 16 L1 A310 og HPV16L1 AC

DNA-fragmenter av HPV 16 E7 kodende aminosyrer 1-50, 1-60, 1-98, 25-75,40-98, 50-98 i SEQ ID NO. 4 ble mangfoldiggjort ved anvendelse av primere som introduserte terminal 5' EcoRV-restriksjonsseter for å muliggjøre

innsetting av fragmentet inn i enten HPV 16 L1 A310 og HPV16L1AC modifisert sekvens. I de forskjellige mangfoldiggjøringsreaksjoner ble primer E7.1 (SEQ ID NO. 9) anvendt i kombinasjon med primer E7.2 (SEQ ID NO. 10) for å danne et DNA-fragment som koder for E7-aminosyrer 1-50; med primer E7.3 (SEQ ID

NO. 11) for å generere et DNA-fragment som koder for E7-aminosyrer 1-60; eller med primer E7.4 (SEQ ID NO. 12) for å danne et DNA-fragment som koder for E7-aminosyrer 1-98.1 andre mangfoldiggjøringsreaksjoner ble primer-par E7.5 (SEQ ID NO. 13) og E7.6 (SEQ ID NO. 14) anvendt for å mangfoldiggjøre et DNA-fragment som koder for E7-aminosyrer 25-75; E7.7 (SEQ ID NO. 15) og E7.4 (SEQ ID NO. 12) ble anvendt for å mangfoldiggjøre et DNA-fragment som koder for E7-aminosyrer 40-98; og E7.8 (SEQ ID NO. 16) og E7.4 (SEQ ID NO. 12) ble anvendt for å mangfoldiggjøre et DNA-fragment som koder for E7-aminosyrer 50-98.

Tilsvarende ble nukleotider fra DNA som koder for influensamatriksproteinet (SEQ ID NO. 17) mangfoldiggjort ved anvendelse av primer-par angitt i SEQ ID NO. 19 og 29. Begge primere introduserte et EcoRV-restriksjonssete i mangfoldiggjøringsproduktet.

PCR-produkter fra hver mangfoldiggjøringsreaksjon ble spaltet med EcoRV og innsatt inn i EcoRV-setet av hver av HPV 16 L1 A310 og

HPV16L1 AC-sekvensene tidligere linearisert med det samme enzym. For å bestemme orienteringen av innskuddene i plasmidene som koder for E7-aminosyrer 25-75 og 50-98 og plasmider som omfatter influensamatriksproteinet, ble C/a/-oppkutting benyttet der en anvender et restriksjonssete som overlapper det nylig dannete EcoRV-restriksjonssete (GATATCGAT) og inkludert i en upstream-primer. For de tre ekspresjonskonstrukter som omfatter initierende metionin av HPV 16 E7, ble innskuddsorienteringen bestemt ved anvendelse av /Vs//-restriksjonssetet innen den E7-kodende region.

Straks ekspresjonskonstrukter som har egnete innskudd ble identifisert, ble den proteinkodende region for både L1 og innsatte aminosyrer utkuttet ved en enhet ved anvendelse av restriksjonsenzymene Xbal og Smal, og det isolerte DNA ble ligert inn i plasmid pVL1393 (Invitrogen) for å danne rekombinante baculoviruser.

D. Eliminering av EcoRV- restriksionssetet i ekspresjonskonstrukter

HPV 16 L1 AC-sekvensen inkluderer DNA fra EcoRV-setet som resulterer i translasjon av aminosyrer som ikke normalt finnes i vildtype L1-polypeptider. En serie ekspresjonskonstrukter ble dermed konstruert hvor det artifisielle EcoRV-sete var eliminert. L1-sekvensen for denne serie av ekspresjonskonstrukter ble benevnt HPV 16L1 AC<*>.

For å generere et ekspresjonskonstrukt som inneholdt HPV 16L1 AC-sekvensen, ble to PCR-reaksjoner utført for å mangfoldiggjøre to overlappende fragmenter fra pUC-HPV16 L1AC kodende E7-aminosyrer 1-50. De resulterende DNA-fragmenter overlappet ved posisjonen av L1/E7-grensen, men inneholdt ikke de to EcoRV-restriksjonsseter. Fragment 1 ble dannet ved anvendelse av primere P1 (SEQ ID NO. 21) og P2 (SEQ ID NO. 22) og fragment 2 ved anvendelse av primere P3 (SEQ ID NO. 23) og P4 (SEQ ID NO.

24).

Etter de to første mangfoldiggjøringsreaksjoner ble de to rensete produkter anvendt som templater i en annen PCR-reaksjon ved anvendelse av kun primere P1 og P4. Det resulterende mangfoldiggjøringsprodukt ble oppkuttet med enzymer EcoNI og Hind\\\ innsatt inn i HPV 16L1AC-ekspresjonskonstrukt beskrevet ovenfor etter oppkutting med de samme enzymer. Det resulterende ekspresjonskonstrukt var forskjellig fra det opprinnelige HPV16L1 AC-konstrukt med DNA som koder for L1 og E7-aminosyrer 1-50 ved tap av to indre EcoRV-restriksjonsseter. Det første EcoRV-sete ble erstattet av DNA som koder for nativt L1 -alanin og glysinamino-syrer i denne posisjon, og det andre ble erstattet av et translasjonsstoppsignal.

I tillegg inneholdt ekspresjonskonstruktet angitt som HPV 16 L1 AC<*> E7 1-52 de første 52 aminosyrer av HPV 16 E7 som et resultat av anvendelse av primer P4 som også koder for E7-aminosyreenhetene histidin ved posisjon 51 og tyrosin ved posisjon 52. HPV 16 L1 AC<*> E7 1-52 ble deretter anvendt for å danne ytterligere HPV 16 L1 AC-ekspresjonskonstrukter som videre inkluderte DNA som koder for E7-aminosyrer 1-55 ved anvendelse av primer P1 (SEQ ID NO.

21) i kombinasjon med primer P5 (SEQ ID NO. 25), E7-aminosyrer 1-60 med primerpar P1 og P6 (SEQ ID NO. 26), og E7-aminosyrer 1-65 med primerpar P1 og P7 (SEQ ID NO. 27). De ytterligere aminosyrekodende DNA-sekvenser i mangfoldiggjøringsproduktet kom fra konstruksjon av primerne for å inkludere ytterligere nukleotider for de ønskede aminosyrer.

Etter hver PCR-reaksjon ble mangfoldiggjøringsproduktene oppkuttet med EcoNI og Hind\\\, og innsatt inn i HPV16L1AC tidligere oppkuttet med de samme enzymer. Sekvensene av hvert konstrukt ble bestemt ved anvendelse av Applied Biosystems Prism 377 sekvenserende instrument med fluorescerende kjedeterminering dideoksynukleotider [Prober et al., Science, Vol 238, 1987, p 336-341].

Eksempel 2

Dannelse av rekombinante baculovirus

Spodoptera frugiperda (Sf9) celler fikk vokse i suspensjon eller monolagkulturer ved 27°C i TNMFH-medium (Sigma) tilsatt 10% føtalt kalveserum og 2 mM glutamin. For HPV 16 L1-basert rekombinant baculoviruskonstruksjon ble Sf9-celler transfektert med 10 yg av transferplasmid sammen med 2 jig linearisert Baculu-gull DNA (PharMingen, San Diego, SA). Rekombinante virus ble renset i samsvar med produsentens foreslåtte protokoll.

For å teste for ekspresjon av HPV 16 L1-protein, ble 10^ Sf9-celler infisert med baculovirus rekombinant ved en multiplisitet av infeksjon (m.o.i) på 5 til 10. Etter inkubasjon i tre til fire dager ved 28°C ble media fjernet og cellene ble vasket med PBS. Cellene ble lysert i SDS-prøvebuffer, og analysert med SDS-PAGE og Western blotting ved anvendelse av anti-HPV16 L1 og anti-HPV16 E7 antistoff.

For å bestemme hvilke av de chimeriske L1-proteinekspre-sjonskonstrukter som sannsynligvis ville produsere kapsomerer ble ekstrakter fra transfekterte celler underlagt gradientsentrifugering. Fraksjoner opptatt fra gradienten ble analysert for L1-proteininnhold ved Western blotting, og for VLP-dannelse ved elektronmikroskopi. Resultatene er vist i tabell 1.

Det intakte HPV L1-protein, og likeledes ekspresjonsproduktene HPV 16 L1A310 og HPV 16 L1 AC, viste begge evne til å produsere kapsomerer og virus-lignende partikler i like proporsjoner. Når E7-kodende sekvenser ble innsatt inn i HPV 16 L1 A310-vektor, ga kun fusjonsproteiner inkluderende E7-aminosyrer 1-50 som ble produsert opphav til detekterbar dannelse av kapsomer.

Når E7-kodende DNA ble innsatt inn i HPV 16 L1 AC-vektor ble alle fusjonsproteiner funnet å produsere kapsomerer, chimeriske proteiner inkluderende E7-aminosyreenheter 40-98 produserte det høyeste nivå av eksklusive kapsomerstrukturer. Chimeriske proteiner inkluderende E7-aminosyrer 1-98 og 25-75 produserte begge i hovedsak kapsomerer, selv om virus-lignende partikkeldannelse også ble observert. Det chimeriske protein inkluderende E7-aminosyrer 1-60 resulterte i nær tilsvarende nivåer av kapsomerer og virus-lignende partikkelproduksjon.

Når E7-sekvensene ble innsatt inn i HPV 16 L1 A<*>C-vektoren, ble alle fusjonsproteiner vist å produsere kapsomerer. Innsetting av DNA-kodende E7-enheter 1-52, 1-55 og 1-60 produserte de høyeste nivåer av kapsomerer, men tilsvarende nivåer av virus-lignende partikkelproduksjon ble observert. Mens innsetting av DNA-kodende E7 DNA for enheter 1-65, 1-70, 25-75, 40-98 og 1-98 resulterte i sammenlignbart lavere nivåer eller ikke detekterbare nivåer av kapsid, ble kapsomerer produsert i høye kvanta.

Eksempel 3

Rensing av kapsomerer

Trichopulsia ni (TN) High Five celler fikk vokse til en tetthet på ca. 2 x 1fj6 celler per ml i Ex-Cell 405 serumfritt medium (JRH Biosciences). Ca. 2 x 10^ celler ble pellettert ved sentrifugering ved 1.000 x g i 15 minutter, resuspendert i 20 ml medium, og infisert med rekombinant baculovirus ved m.o.i på 2 til 5 i 1 time ved romtemperatur. Etter tilsetning av 200 ml medium ble cellene utsådd og inkubert i 3 til 4 dager ved 27°C. Etter inkubering ble cellene høstet, pellettert og resuspendert i 10 ml ekstraheringsbuffer.

De følgende trinn ble utført ved 4^. Cellene ble sonikert i 45 sekunder ved 60 watt, og det resulterende cellelysat ble sentrifugert ved 10.000 rpm i en Sorval SS34 rotor. Supernatanten ble fjernet, og tatt vare på, mens den resulterende pellet ble resuspendert i 6 ml ekstraheringsbuffer, sonikert for ytterligere 3 sekunder ved 60 watt, og igjen sentrifugert. De to supernatanter ble kombinert, applisert på en to-trinns gradient inneholdende 14 ml 40% sukrose på toppen av 8 ml CsCI-løsning (4,6 g CsCI per 8 ml i ekstraheringsbuffer), og sentrifugert i en Sorval AH629 svingende bucket rotor i 2 timer ved 27.000 rpm ved 10°C. Grenseflateregionen mellom CsCI og sukrosen langs med CsCI komplett sjikt ble innsamlet i 13,4 ml Quickseal-rør (Beckman) og ekstraheringsbuffer tilsatt for å justere volumet til 13,4 ml. Prøvene ble sentrifugert over natten ved 50.000 rpm ved 20°C i en Beckman 70 Tl rotor. Gradientene ble fraksjonert (1 ml per fraksjon) ved å punktuere rørene på topp og bunn med en 21-gange nål. Fraksjoner ble innsamlet fra hvert rør, og 2,5 yl av hver fraksjon ble analysert med en 10% SDS-polyakrylamidgel, og Western blotting ved anvendelse av anti-HPV 16 L1-antistoff.

Virus-lignende partikler og kapsomerer ble separert fra fraksjonene identifisert ovenfor ved sedimentering på 10 til 50% sukrosegradienter. Toppfraksjoner fra CsCI-gradienter ble slått sammen og dialysert i 2 timer mot 5 mM HEPES (pH 7,5). Halvparten av dialysatet ble anvendt for å produsere kapsomerer ved fraskillelse av intakte VLPer over natten ved tilsetning av EDTA (final konsentrasjon på 50 mM), EGTA (50 mM), DTT (30 mM), NaCI (100 mM) og Tris/HCI, pH 8,0, (10 mM). Som kontroll ble NaCI og Tris/HCI tilsatt til den andre halvparten.

For analyse av kapsomerer produsert fra fraskilte VLPer, ble EDTA, EGTA og DTT (final konsentrasjon på hver 5 mM) tilsatt til sukroseløsningen som ble sentrifugert ved 250.000 x g i 2 til 4 timer ved 4<<>,C. Fraksjoner ble innsamlet ved å punktuere rør fra bunnen. En 1:10-fortynning av hver fraksjon ble deretter analysert ved antigen capture ELISA.

Eksempel 4

Immuniseringsprotokoll for produksjon av polvklonale antisera og monoklonale antistoff

Balb/c-mus immuniseres subkutanøst tre ganger, hver fjerde uke med ca. 60 yg HPV chimeriske kapsomerer blandet 1:1 med komplett eller ukomplett Freund's adjuvans i et totalt volum på 100 yl. Seks uker etter den tredje immunisering ble musene ofret og blodet innsamlet ved kardia-punktering.

Eksempel 5

Peptid- ELISA for å kvantifisere dannelse av kapsomer

Mikrotiterplater (Dynatech) ble belagt over natten med 50 yl peptid E701 [Muller et al., 1982] av en konsentrasjon på 10 yg/ml i PBS. Brønnene ble blokkert i 2 timer ved 37°C med 100 yl buffer inneholdende 5% BSA og 0,05% Tween 20 i PBS, og vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween 20. Etter den tredje vasking ble 50 yl sera fortynnet 1:5.000 i BSA/Tween 20/PBS som ble tilsatt hver brønn og inkuberingen fikk foregå i 1 time. Platene ble igjen vasket som tidligere, og 50 yl av anti-musperoksidasekonjugat fra geit tilsatt til en 1:5.000-fortynning. Etter 1 time ble platene vasket og farget ved anvendelse av ABTS-substrat (0,2 mg/ml, 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolin-ft-sulfonisk syre i 0,1 M Na-acetat-fosfat-buffer (pH 4,2) med 4 yl 30% H202 per 10 ml). Ekstinksjon måles etter 1 time ved 490 nm i en automatisk plateleser av typen Dynatech.

Eksempel 6

Antigen Capture ELISA for å kvantifisere dannelse av kapsomer

For å muliggjøre relativ kvantifisering av virus-lignende partikler og kapsomerer i fraksjoner av CsCI-gradienter, ble antigen capture ELISA benyttet. Mikrotiterplater ble belagt over natten med 50 yl/brønn av en 1:500-fortynning (final konsentrasjon 2 yg per ml, i PBS) med et protein A renset muse-monoklonalt antistoff som er immunospesifikt for HPV 16 L1 (antistoff 25/C, MM07 og Ritti 1 ble opptatt fra mus immunisert med HP V 16 VLPer). Plater ble blokkert med 5% melk/PBS i 1 time, og 50 yl fraksjoner av CsCI-gradienter ble tilsatt i 1 time ved 37°C ved anvendelse av en 1:300-fortynning (i 5% melk/PBS). Etter tre vaskinger med PBS/0,05% Tween 20 ble 50 yl av et polyklonalt kanin-antiserum (1:3.000-fortynning i melk/ PBS), reist mot HPV 16 VLPer, tilsatt og platene ble inkubert ved 37°C i 1 time. Platene ble deretter vasket igjen og ytterligere inkubert med 50 yl geit-anti-kaninperoksidase-konjugat (Sigma) fortynnet 1:5.000 i PBS inneholdende 5% melk i 1 time. Etter endelig vasking ble platene farget med ABTS-substrat i 30 minutter, og ekstinksjon målt ved 490 nm i en automatisk plateleser av typen Dynatech. Som negativ kontroll inneholdt analysen også brønner belagt kun med PBS.

For å teste monoklonale antistoff for kapsomer-spesifisitet, ble det benyttet VLPer med EDTA/DTT for å fraskille partikler. Behandlete partikkelpreparater ble analysert i antigen capture ELISA, og avlesninger sammenlignet med ikke behandlete kontroller. For fraskillelse ble 40 yl VLPer inkubert over natten ved 4°C i 500 yl fraskillelsesbuffer inneholdende 30 mM DTT, 50 mM EGTA, 60 mM EDTA, 100 mM NaCI og 100 mM Tris/HCI, pH 8,0. Alikvoter av behandlet og ikke behandlete partikler ble anvendt i den ovenfor beskrevne capture ELISA i en 1:20-1:40-fortynning.

Eksempel 7

Hemagglutinin- inhiberingsanalvse

For å bestemme graden av hvordan chimeriske kapsomer-vaksiner fremmer produksjon av nøytraliserende antistoff, ble en

hemagglutineringsinhiberingsanalyse utført som kort beskrevet nedenfor. Denne analyse er basert på tidligere observasjoner at virus-lignende partikler er i stand til å hemagglutinisere røde blodceller.

Mus immuniseres med en chimerisk kapsomervaksine, og sera innsamlet som beskrevet ovenfor i eksempel 4. Som positive kontroller analyseres HPV 16 L1 virus-lignende partikler (VLPer) og bovin PV1 (BPV) L1 VLPer analyseres parallelt med et chimerisk kapsomerpreparat. For å etablere en positiv grunnlinje, inkuberes HPV 16 eller BPV1 VLPer først med eller uten sera innsamlet fra immunisert mus hvoretter røde blodceller tilsettes. I hvilken grad preinkubering med musesera inhiberer hemagglutinisering av røde blodceller er en indikasjon på den nøytraliserende kapasitet for musesera. Eksperimentene repeteres deretter ved anvendelse av chimeriske kapsomerer for å bestemme nøytraliseringseffekten av musesera på vaksinen. En kort protokoll for hemagglutineringsinhiberingsanalysen er beskrevet nedenfor.

100 yl heparin (1.000 usp-enheter/ml) tilsettes til 1 ml ferskt museblod. Røde blodceller vaskes tre ganger med PBS, etterfulgt av sentrifugering og resuspensjon i et volum på 10 ml. Deretter resuspenderes erytrocyttene i 0,5 ml PBS, og lagres ved 4°C i opptil tre dager. For hemagglutininanalysen benyttes 70 yl av suspensjonen per brønn på en 96-brønns plate.

Chimeriske kapsomeralikvoter fra CsCI-gradienter dialyseres i 1 time mot mM Hepes (pH 7,5), og 100 yl to-gangers seriefortynninger i PBS tilsettes til muse-erytrocytter i rundbunnete 96-brønns mikrotiterplater som videre inkuberes i 3-16 timer ved 4X. For hemagglutineringsinhiberingen, inkuberes kapsomerene med fortynninger av antistoff i PBS i 60 minutter ved romtemperatur, og tilsettes deretter til erytrocytter. Nivået av erytrocytt-hemagglutinering, og derfor nærvær av nøytraliserende antistoff, bestemmes med standardmetoder.

I innledende resultater ble musesera generert mot chimeriske kapsomerer omfattende HPV16L1AC-protein i assosiasjon med E7-aminosyreenhetene 1-98 observert til å inhibere hemagglutinering av HPV16 VLPer, av BPV VLPer. Musesera ble derfor positiv for nøytraliserende antistoff mot de humane VLPer, og denne differensielle nøytralisering ble mest sannsynlig resultatet av antistoffspesifisiteten for epitoper som antistoffene ble rettet mot.

Claims (16)

1. Antigenisk formulering som omfatter et humant papillomaviruskapsomer for anvendelse som en vaksine, karakterisert ved at kapsomeret omfatter et fusjonsprotein omfattende et trunkert humant papillomavirus L1-protein tilgrensende aminosyreenheter fra et andre protein, hvor L1-proteinet og aminosyreenhetene fra det andre proteinet posisjoneres for å inhibere viruslignende partikkelformasjon, hvor formuleringen fremkaller en immunrespons som nøytraliserer humane papillomavirus virioner.

2. Antigenisk formulering som omfatter et humant papillomaviruskapsomer for anvendelse som en vaksine, karakterisert ved at kapsomeret omfatter et et trunkert humant papillomavirus L1 -protein som haren deletering på én eller flere aminosyreenheter som er nødvendig for dannelse av en virus-lignende partikkel, hvor formuleringen fremkaller en immunrespons som nøytraliserer humane papillomavirus virioner.

3. Antigenisk formulering i samsvar med krav 2, karakterisert ved at nevnte kapsomer omfatter et fusjonsprotein omfattende et trunkert humant papillomavirus L1-protein tilgrensende aminosyreenheter fra et andre protein.

4. Antigenisk formulering i samsvar med et av kravene 1-3, ka rakte ri sert ved at L1-proteinet kodes for i genomet av et humant papillomavirus valgt fra gruppen som består av HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35 og HPV45.

5. Antigenisk formulering i samsvar med krav 4, karakterisert ved at papillomaviruset er HVP16.

6. Antigenisk formulering i samsvar med et av kravene 1,2,3 eller 5, kar akterisert ved at karboksyterminal-aminosyreenhetene er deletert fra L1-proteinet.

7. Antigenisk formulering i samsvar med krav 6, karakterisert ved at 1 til 34 karboksyterminal-aminosyreenheter er deletert fra L1-proteinet.

8. Antigenisk formulering i samsvar med krav 7, karakterisert ved at 34 karboksyterminal-aminosyreenheter er deletert fra L1-proteinet.

9. Antigenisk formulering i samsvar med et av kravene 1,2,3 eller 5, kar akterisert ved at aminoterminal-aminosyreenheter er deletert fra L1-proteinet.

10. Antigenisk formulering i samsvar med et av kravene 1, 2, 3 eller 5, kar akterisert ved at indre aminosyreenheter er deletert fra L1-proteinet.

11. Antigenisk formulering i samsvar med krav 10, karakterisert ved at aminosyreenhetene deletert fra L1-proteinet omfatter et nukleært lokaliseringssignal.

12 Antigenisk formulering i samsvar med krav 1, 2 eller 3, karakteris ert ved at aminosyreenhetene fra det andre protein er avledet fra et HPV-protein.

13. Antigenisk formulering i samsvar med krav 12, karakterisert ved at HPV-proteinet er et tidlig HPV-protein.

14. Antigenisk formulering i samsvar med krav 12, karakterisert ved at det tidlige HPV-protein er valgt fra gruppen som består av E1, E2, E3, E4, E5, E6 og E7.

15 Anvendelse av formuleringen i samsvar med et av krav 1-14 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av HPV infeksjon og tilstander beslektet dermed.

16. Anvendelse av formuleringen i samsvar med et av krav 1-14 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for forebygging av HPV infeksjon og tilstander beslektet dermed.