JP2006507797A - L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス16l1タンパク質、それから調製したウイルス様粒子および該粒子の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト・パピローマウイルスのポリペプチド、詳細にはウイルス様粒子(VLP)またはキャプソメアを調製する方法に関する。
本発明の第1の形態によれば、
HPV L2ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドの配列を含むDNA配列を、中で該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)、またはその修飾体もしくは誘導体である配列を有し得、但し、その修飾配列または誘導配列は、配列番号:1の配列に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起するペプチドをコードする配列である。
異種ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよび異種ペプチドの配列を含むDNA配列を、該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
キメラ構築物の設計
HPVの少ない方のキャプシドタンパク質、L2の領域(aa)108−120のHPV6および16に対する共通の中和エピトープであるペプチド:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
をコードするプライマーを合成した。
A: E−Fループ(配列番号:4および5)
C: D−Eループ(配列番号:6および7)
E: L1のh4へリックスとJ領域との間の領域(配列番号:8および9)
F: h4へリックス(配列番号:10および11)
H: 内部C−Dループ(配列番号:12および13)
キメラ構築物は、L2ペプチドをコードする3'末端を用いて設計したプライマーを用いるPCRによって調製した。pSKプラスミドベクターにクローン化したHPV 16SA−optL1遺伝子(配列番号:3および4)をテンプレートとして用いた。以下のDNA配列:
TGGTGCACCA−3'(配列番号:14)
ウェスタンブロットは、ウサギにおいてペプチドに対して作らせたポリクローナルL2抗体(The Jake Gittlen Cancer Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey Pennsylvania, USAのNeil Christensen博士から得た)がキメラL1粒子(55kD)に結合することを示し、これはL2エピトープがキメラ構築物によって発現されていることを示している。
電子顕微鏡観察の結果は、キメラ構築物から形成された粒子が野生型HPV L1遺伝子によって生成されたものと同一でないことを示した。形成された粒子は主として部分的に分解されているかまたは部分的にバラバラになった状態であり、一般的に互いに凝集しているように見える。
6セットの5匹のBalb/cマウスを動物実験に用いて、キメラVLPの接種が免疫応答を誘起するかを判定した。5のキメラ構築物から生成したキメラVLPおよび非キメラHPV16 L1(SA−opt)から生成したキメラVLPを100μgの濃度で2の皮下部位に注射した。0、2および4週目に動物に接種した。血液試料および膣洗液を種々の期間に採取した。
結果は、高い免疫応答が達成されたことを示している。
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Claims (29)
- HPV L2ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドの配列を含むDNA配列を、中で該DNA配列を発現することができる宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法。 - 該HPV L1ポリペプチドおよび/または該HPV L2ペプチドが、HPV−16のポリペプチドまたはペプチドである請求項1記載の方法。
- 該HPV L2ペプチドが、以下のアミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)またはその修飾体もしくは誘導体である配列を有し、但し、その修飾配列または誘導配列は、配列番号:1の配列に対して少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるペプチドをコードする請求項1または2記載の方法。 - 該L1 DNA配列の1またはそれを超えるヌクレオチドが、L2 DNA配列の導入の点において欠失している、請求項1ないし3いずれか1項記載の方法。
- 該L1 DNA配列から欠失したヌクレオチドの数が、挿入したL2ヌクレオチドの数に対応する請求項4記載の方法。
- 該ポリペプチドの発現が、原核生物または真核生物の発現システムのいずれかにおいてである請求項1ないし5いずれか1項記載の方法。
- 該キメラ・ポリペプチドが、図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)、または配列番号:5、7、9、11および13に記載の配列のいずれか1に少なくとも80%相同であって、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができる配列を有する請求項1ないし6いずれか1項記載の方法。
- 該キメラ・ポリペプチドをコードするDNA配列が、図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のDNA配列(配列番号:4、6、8、10および12)、またはこれらの配列のいずれか1に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるポリペプチドをコードする配列を有する請求項1ないし6いずれか1項記載の方法。
- 該キメラL1ポリペプチドが、ウイルス様粒子および/またはキャプソメアに会合することができる請求項1ないし8いずれか1項記載の方法。
- 該ウイルス様粒子またはキャプソメアが免疫原性である請求項9記載の方法。
- 中にHPV L2ペプチドをコードするDNA配列(配列番号:1)が挿入されており、かつ、該HPV L2ペプチドを発現することができるキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1 DNA配列。
- 該L1 DNA配列の1またはそれを超えるヌクレオチドが、L2 DNA配列の導入の点で欠失している請求項11記載のHPV L1 DNA配列。
- L1配列から欠失したヌクレオチドの数が、挿入したL2ヌクレオチドの数に対応する請求項12記載のHPV L1 DNA配列。
- 図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のDNA配列(配列番号:4、6、8、10および12)、またはその修飾体または誘導体であるDNA配列を有し、但し、その修飾DNA配列または誘導DNA配列は配列番号:4、6、8、10および12のいずれか1に少なくとも80%相同性を有し、かつ、免疫原性HPVペプチド配列を提示するキメラL1ペプチドをコードし、ここに該キメラL1ペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス(HPV)核酸配列。
- 請求項11ないし14いずれか1項記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項15記載のベクターを含む宿主細胞。
- アミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
を有するペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチド。 - キメラHPV L1ウイルス様粒子またはキャプソメアである請求項17記載のポリペプチド。
- 図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)、またはその修飾体または誘導体である配列を有し、但し、その修飾アミノ酸配列または誘導アミノ酸配列は配列番号:5、7、9、11および13に記載の配列のいずれか1に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス(HPV)ポリペプチド。
- 異種ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
該L1ポリペプチドおよび異種ペプチドの配列を含むDNA配列を、該DNA配列を発現することができる宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法。 - 該異種ペプチド配列が、いずれか他のHPV配列またはB−細胞もしくはT−細胞特異的ないずれかの免疫原性エピトープに由来する請求項20記載の方法。
- 該L1 DNA配列の1またはそれを超えるヌクレオチドが、該異種DNA配列の導入の点で欠失している請求項20または21記載の方法。
- 該L1配列から欠失したヌクレオチドの数が、挿入した異種ヌクレオチドの数に対応する請求項22記載の方法。
- 請求項17ないし19のいずれか1に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドまたは請求項11ないし14いずれか1項記載のDNA配列を含むワクチン。
- HPV感染症の予防的または治療的処置に使用するための請求項24記載のワクチン。
- HPV6、16または18の処置に使用するための請求項25記載のワクチン。
- 好適な宿主中のHPVおよび/または導入したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項24ないし26いずれか1項記載のワクチン。
- さらに、医薬上の賦形剤および/または補助剤を含む請求項24ないし27いずれか1項記載のワクチン。
- 実質的に本明細書中に記載し、図示した異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルスL1ポリペプチドを作製する新たな方法。
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